CN108113961B - 亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的三棱柱的纳米制剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的三棱柱的纳米制剂和应用,所述自组装方法是通过亚精胺三盐酸盐取代传统TAE‑Mg2+在恒温下、梯度退火以及慢退火介导核酸纳米材料的自组装,所制备的核酸纳米材料细胞对于其摄取的效率要高于传统方法制备的核酸纳米材料,在血清中以及37℃下具有更好地稳定性。采用该方法得到的携带siRNA的纳米三棱柱,可用于治疗肺癌的纳米制剂。该制剂使得更多完整的siRNA会被运输到细胞中,发挥其生物学效用,调控细胞自噬及增殖,能更加有效地抑制肿瘤细胞的异常生长,可用于制备治疗肺癌的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装的方法,特别涉及一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的携带siRNA的三棱柱的纳米制剂和应用。
背景技术
开发通用的药物载体是纳米医学最重要的研究主题。过往的已经开发了多种药物递送载体,例如:环糊精材料,阳离子脂质体,病毒衣壳,高分子聚合物材料等,但是这些往往都是的物质,存在免疫原性以及一些潜在的毒性,因此并不能很好地投入医学实用。面对上述问题,近来在新兴的DNA纳米技术提供了很好的解决方法,DNA是人体内的天然组分,短链DNA不存在免疫原性以及潜在毒性,且容易被生物降解,与此同时根据其碱基互补配对的原则,DNA纳米材料可以实现很好的可编程性,可能存在潜在的实现靶向性治疗,因此自组装的DNA纳米材料在疾病的基因治疗领域存在巨大的潜力。
随着技术的发展,将DNA纳米材料用于疾病的基因治疗又面临着一些新的挑战,传统的方式是镁离子介导DNA纳米材料的合成,往往合成需要很复杂的退火过程,且维持纳米材料稳定性的体系与生理条件存在很大的差异。同时由于传统的合成体系需要较高浓度的盐溶液体系,高的镁离子浓度对酶的活性有伤害。DNA 纳米材料自身带有高负电性,细胞对于材料的摄取效率往往也是不够理想的,一定程度上限制了自组装核酸纳米材料的应用.因此上述问题都亟待解决。
亚精胺是一种内源性多胺类物质。内源性多胺类物质是一种天然的DNA 缩合剂。亚精胺三盐酸盐易溶于水,在水中带正电荷,同时再低剂量下并不存在细胞毒性。在生理条件下,生物体中的多胺类物质如腐胺、亚精胺、精胺是线性的、质子化的高价离子化合物,因而可以通过静电相互作用与负电性的DNA或RNA相互作用。多胺类物质作为DNA的体外缩合剂已被大量研究。其本身由于质子化的多胺中和了核酸的负电性。因此,可以作为一种天然的阳离子化合物来替代镁离子来中和DNA之间的负电性,从而来介导DNA纳米材料的自组装。亚精胺三盐酸盐介导的DNA 自组装纳米材料通过结构的位阻效应提高材料在生理条件下的稳定性,其次亚精胺三盐酸盐介导的DNA 自组装纳米材料无需额外的纳米递送系统,其本身由于质子化的多胺中和了核酸的负电性,更易为细胞所摄取。
肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高,对于肺癌的治疗一直都是全世界关注的焦点,以前的研究表明,控制肿瘤细胞的恶行增殖往往就可以控制肺癌的进一步发展,从而达到治疗的效果。
哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR),一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是细胞应对生理条件及环境压力时调控自噬及生长的关键成分。哺乳动物雷帕霉素蛋白已被证实与肿瘤的发生、发展,心血管疾病,自身免疫性疾病,代谢性疾病等多种疾病密切相关。因此,将哺乳动物雷帕霉素蛋白作为靶标可以用来做关于多种疾病的基因治疗。研究表明哺乳动物雷帕霉素蛋白激活可以导致肿瘤细胞的大量增殖,相应的若我们抑制其激活,可以抑制肿瘤细胞的生长。小干扰RNA(small interfering RNA ,siRNA),可高效、特异地抑制靶基因翻译过程,实现靶基因的表达下调。因此,如何设计开发临床适用的针对肺癌治疗的siRNA递送系统仍然具有巨大的挑战。
基于上述原因,我们发明了一种通过亚精胺三盐酸盐,并使用三种不同的控制时间和温度的方式(包括:梯度退火,恒温自组装以及慢退火)来介导核酸纳米材料的自组装。我们又设计了一种新型的DNA三棱柱纳米材料,应用我们发明的制备方法,并将功能基因mTOR siRNA由特定的摩尔比,通过碱基互补配对到纳米三棱柱结构上形成新型的纳米复合体制剂。我们发明的这种新型纳米材料,不但保留了传统核算纳米材料所有的,可编程性,良好的生物相容性以及生物稳定性等特点,而且在生理条件下的体系中有着良好的稳定性,更好的血清稳定性,并能更好的被细胞摄取,从而可以释放更多交联系统中的siRNA,使其更好地发挥生物学效应。基于亚精胺三盐酸盐介导核酸自组装纳米载体的多种优势,其在基因研究和治疗中具有巨大的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装的方法及采用该方法制备的携带siRNA的三棱柱的纳米制剂和应用,该方法可以在恒温下、梯度退火以及慢退火实现自组装,肺癌细胞对其的摄取效率显著提高,制备成的核酸纳米材料较传统可以更稳定的存在于生理体系下,并且在血清中可以稳定存在更久,同时该制剂能有效抑制肺癌细胞的增殖。
本发明的技术方案是:
一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装的方法,其特征在于,有方法如下:
1)取需合成纳米材料的DNA冻干粉,分别加H2O稀释,混匀,得到DNA溶液;
2)取DNA溶液均按需要组装核酸的数量设置摩尔比(根据不同DNA 纳米材料的结构,设计DNA链的摩尔比),在亚精胺三盐酸盐水溶液中恒温下、梯度退火以及慢退火介导核酸纳米材料的自组装合成。
步骤2)所述的恒温为37°C或45℃。
步骤2)所述恒温合成为,恒温下放置30~90 min,将DNA溶液混合,再在恒温下放置30~90 min。
步骤2)所述梯度退火合成为,95°C放置5 min, 65°C放置30 min,50°C放置30min,37°C放置30 min, 22°C 放置30 min,将DNA溶液混合, 37°C放置60 min,然后在 22°C放置60min。
步骤2)所述慢退火合成为,密封DNA溶液,放入100℃的水中缓慢降温,两天降至室温。
步骤2)所述亚精胺三盐酸盐水溶液的pH值为6.0-10.0。
步骤2)所述亚精胺三盐酸盐水溶液的介导核酸纳米材料自组装的浓度范围50μM-300μM。
采用上述方法制备的携带siRNA的三棱柱的纳米制剂,所述的纳米材料由序列如SEQ ID NO:2所示的P1、序列如SEQ ID NO:3所示的P2、序列如SEQ ID NO:4所示的P2’,通过单链分子碱基互补配对合成。
所述的P1、P2、P2’ 的摩尔比2:3:3,mTOR siRNA、P1、P2、P2’的摩尔比为6:2:3:3,。
携带siRNA的三棱柱的纳米制剂的制备方法,有以下步骤:
1)取P1、P2、P2’的冻干干粉,分别加H2O稀释,混匀,得到P1、P2、P2’溶液;
2)取P1、P2与P1、P2’溶液均按照1:3的比例在亚精胺三盐酸盐水溶液中分别化合,DNA三棱柱在恒温下或梯度退火或慢退火合成,得到P1、P2、P2’的摩尔比为2:3:3的纳米材料溶液,将mTOR siRNA添加到纳米材料溶液中,再次放置30 min,得到mTOR siRNA、P1、P2、P2’的摩尔比的纳米制剂溶液。
步骤2)所述的亚精胺三盐酸盐溶液的pH值分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。
携带siRNA的三棱柱的纳米制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。
携带siRNA的三棱柱的纳米制剂分子量为149,679.5。
与传统方法制备而成的核酸纳米材料相比较,亚精胺三盐酸盐介导的纳米材料自组装具有以下优点:1)可以在恒温下介导核酸纳米材料的自组装,从而使得合成方法更加简单。2)其可以在不借助转染剂的辅助,使得细胞有所摄取,并且细胞摄取率与转染剂辅助传统镁离子介导自组装核酸纳米材料的摄取率相当。3)亚精胺三盐酸盐介导自组装的核酸纳米材料可以稳定的存在于生理条件下的体系中,使其应用于临床的可能性大大提高。4)亚精胺三盐酸盐介导自组装的核酸纳米材料可以在稳定存在与血清中更长时间,从而保证在到达靶细胞之前不被降解,更好地发挥效应。5)从而可以更安全以及有效地发挥效能。
采用本发明所述亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装的方法制备的携带siRNA的三棱柱的纳米制剂,通过亚精胺三盐酸盐介导单链核酸分子碱基互补配对(adenine简写A,代表腺嘌呤;cytonine简写为C,代表胞嘧啶;guanine简写为G,代表鸟嘌呤;thymine简写T,代表胸腺嘧啶;uracil简写为U代表尿嘧啶;其中 A可以与T或U互补配对,G和C互补配对)进行纳米自组装。由两个基础的半三棱柱结构拼接而成三棱柱状结构,三棱柱的6个顶点是6个功能位点,可以携带siRNA,此DNA三棱柱结构可靶向递送六个siRNA的DNA纳米粒子(参见图1),并由亚精胺三盐酸盐代替镁离子作为介导核酸纳米城材料的自组装。
三棱柱状核酸纳米制剂由序列SEQ ID NO:1所示的mTOR siRNA、序列如SEQ IDNO:2所示的P1、序列如SEQ ID NO:3所示的P2、序列如SEQ ID NO:4所示的P2’和亚精胺三盐酸盐酸水溶液。通过亚精胺三盐酸盐介导单链核酸分子碱基互补配对合成。随后将siRNA包裹于纳米管纳米结构内,siRNA与DNA单链结合,提高siRNA的稳定性,使其不易被核酸酶降解。其在血清中的稳定性也通过血清稳定性实验进一步证实,同时在使用转染剂辅助的情况下,仍有细胞仍有较高的摄取率,为进一步证实用DNA携带siRNA可以保护siRNA生物学活性并发挥作用;我们通过实验,其结果表明该自组装核酸纳米材料可显著降低mTOR的mRNA表达水平,并通过MTT实验发现,抑制肺癌细胞的增殖。
申请人的实验验证,采用本发明所述方法制备的DNA纳米材料相比于传统方法具有更好地血清稳定性以及肿瘤细胞对其摄取的效率更高。
本发明所述亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装的方法,可用于多种核酸纳米材料的自组装,如:DNA纳米管以及DNA纳米三棱柱,以及不同设计方案所设计出的不同形状的核酸纳米材料。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂,下文特举较佳实施例,并配合附图,作详细说明如下。
附图说明
图1亚精胺三盐酸盐介导三棱柱状核酸纳米制剂自组装的结构示意图;
图2亚精胺三盐酸盐介导三棱柱状核酸纳米材料自组装结构动态光散射表征图;
图3亚精胺三盐酸盐梯度退火介导三棱柱状核酸纳米材料自组装的PAGE图;
图4不同浓度亚精胺三盐酸盐梯度退火下介导三棱柱状核酸纳米材料自组装的PAGE图;
图5不同温度下亚精胺三盐酸盐恒温介导三棱柱状核酸纳米材料自组装的PAGE图;
图6亚精胺三盐酸盐慢退火介导三棱柱状核酸纳米材料自组装的PAGE图;
图7不同pH值的亚精胺三盐酸盐介导三棱柱状核酸纳米材料自组装的PAGE图;
图8A亚精胺三盐酸盐介导三棱柱状核酸纳米制剂的血清稳定性的PAGE图;
图8B亚精胺三盐酸盐介导三棱柱状核酸纳米制剂的37℃的PAGE图;
图9A激光共聚焦观察亚精胺三盐酸盐介导与镁离子介导的三棱柱状核酸纳米制剂的细胞摄取情况;
图9B荧光酶标板分析亚精胺三盐酸盐介导与镁离子介导的三棱柱状核酸纳米制剂的细胞摄取情况;
图10 亚精胺三盐酸盐介导的三棱柱状核酸纳米制剂对A549细胞mTOR mRNA表达水平及定量分析;
图11检测三棱柱状核酸纳米制剂对A549细胞的生长抑制;
图12 不同浓度亚精胺三盐酸盐梯度退火介导核酸纳米管材料自组装的PAGE图;
图13(A)不同浓度亚精胺三盐酸盐恒温37℃下介导核酸纳米管材料自组装的PAGE图;
图13(B)亚精胺三盐酸盐恒温22℃下介导核酸纳米管材料自组装的PAGE图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一.材料
A549细胞购自美国模式培养物研究所;
胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Hyclone公司;
mTOR siRNA序列由上海吉玛基因有限公司合成
P1、P2、P2’序列均由上海生工有限公司合成;
0.25%胰蛋白酶购自Hyclone公司;
Hoechst 33432购自上海生工有限公司;
F12K培养基、胰蛋白酶、OPTI-MEM为Gibco公司产品;
X-tremeGENE siRNA 转染试剂为瑞士Roche公司产品;
NaOH、NaCl、KCl、Tris碱、乙酸、EDTA、乙酸镁、HCl、酚购自上海时代生物科技有限公司;
mTOR和β-actin引物由上海生工公司合成;
RT-PCR试剂盒由美国Thermo公司提供。
磁力搅拌器购自英国Jenway公司。
二甲基亚砜、MTT购自美国Sigma公司
二.实施例
实施例1:亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱携带mTOR siRNA 纳米制剂通过梯度退火的自组装
称量取一定质量的亚精胺三盐酸盐,并将其溶解于去离子水中,使得最终浓度为1mM。将mTOR siRNA(SEQ ID NO:1)、P1(SEQ ID NO:2)、P2(SEQ ID NO:3)、和P2’ (SEQ IDNO:4)各序列干粉样品用灭菌灭酶的去离子水稀释,随后使用Nanndrop测每一管的浓度,根据浓度计算相应比例所需要的量,P1、P2以及P1、P2’按照1:3的比例加入到灭酶的离心管中,并加入一定量的亚精胺三盐酸盐水溶液,使得亚精胺三盐酸盐在体系中的浓度为100μM,其余加水补足,最终制备成30μL的体系,半三棱柱结构在以下条件下自组装合成:95°C放置5 min, 65°C放置30 min,50°C放置30 min,37°C放置30 min,然后 22°C 放置30 min。随后将两份三角板混合,并在以下条件下自组装:37°C放置60 min,然后 22°C 放置30 min。再将确定剂量的mTOR siRNA添加进入体系中,再次放置30 min。得到mTOR siRNA、P1、P2、P2’的摩尔比为6:2:3:3的治疗肺癌的纳米制剂溶液。简称DNA三棱柱纳米制剂。DNA三棱柱纳米制剂结构的动态光散射测粒径的数据分析图见图2。将合成的少量样品在6%非变性PAGE胶中冰浴(4℃)下电泳,通过扫描仪扫描图片,DNA三棱柱纳米制剂电泳图片见图3,具有较高的纯度。
实施例2:不同浓度的亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱的自组装
称量取一定质量的亚精胺三盐酸盐,并将其溶解于去离子水中,使得母液的浓度为100mM,再分别用去离子水稀释到10mM、1mM以及100μM。将P1(SEQ ID NO:2)、P2(SEQ IDNO:3)、和P2’ (SEQ ID NO:4)各序列干粉样品用灭菌灭酶的去离子水稀释,随后使用Nanndrop测每一管的浓度,根据浓度计算相应比例所需要的量,P1、P2以及P1、P2’按照1:3的比例加入到灭酶的离心管中,并加入一定量的亚精胺三盐酸盐水溶液,使得亚精胺三盐酸盐在体系中的浓度为50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM,其余加去离子水制备成30μL的体系,制备5组不同浓度亚精胺三盐酸盐介导半三棱柱结构在以下条件下自组装合成:95°C放置5 min, 65°C放置30 min,50°C放置30 min,37°C放置30 min,然后 22°C 放置30 min。随后将两份半三棱柱结构混合,并在以下条件下自组装:37°C放置60 min,然后 22°C 放置30 min。将合成的少量样品在6%非变性PAGE胶[丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(19:1)溶液(40%):3.6mL,10×TAE-Mg2+:2.4mL,10%过硫酸铵(APS):400uL,TEMED:40μL,水:18.2mL]中冰浴(4℃)下电泳,通过扫描仪扫描图片,DNA三棱柱电泳图片见图4,在亚精胺三盐酸盐浓度为50μM、100μM具有较高纯度。
实施例3:不同温度下亚精胺三盐酸盐恒温介导DNA三棱柱的自组装
将P1(SEQ ID NO:2)、P2(SEQ ID NO:3)、和P2’ (SEQ ID NO:4)各序列干粉样品用灭菌灭酶的去离子水稀释,随后使用Nanndrop测每一管的浓度,根据浓度计算相应比例所需要的量,P1、P2以及P1、P2’按照1:3的比例加入到灭酶的离心管中,并加入一定量的亚精胺三盐酸盐水溶液,使得亚精胺三盐酸盐在体系中的浓度为100μM,其余加去离子水制备成30μL的体系,制备五组半三棱柱结构,分别在4℃放置60 min,22°C放置60 min,37°C放置60min,45°C放置60 min以及按照实施例1中的梯度退火,随后将两份半三棱柱混合,分别在4℃放置30 min,22°C放置30 min,37°C放置30 min,45°C放置30 min以及37°C放置30 min,然后 22°C 放置30 min,随后将五组合成的样品,取少量在6%非变性PAGE胶中冰浴(4℃)下电泳,通过扫描仪扫描图片,DNA三棱柱电泳图片见图5,在37°C、45°C恒温下自组装具有较高纯度。
实施例4:亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱慢退火的自组装
取P1、P2、P2’的冻干干粉,分别加H2O稀释,混匀,得到P1、P2、P2’溶液;取P1、P2、P2’溶液在亚精胺三盐酸盐水溶液中分别化合,DNA三棱柱在以下条件下合成:封口膜密封制备好的溶液,将其放入100℃的水中,整个体系置于保温装置中,两天后将其取出。得到P1、P2、P2’的摩尔比为2:3:3的治疗肺癌的纳米制剂溶液。取少量在6%非变性PAGE胶中冰浴(4℃)下电泳,通过扫描仪扫描图片,DNA三棱柱电泳图片见图6,可见具有较高的纯度。
实施例5:不同pH值的亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱的自组装
称量取一定质量的亚精胺三盐酸盐,并将其溶解于去离子水中,使得最终浓度为1mM。用pH计以及配置好的100μM NaOH水溶液进行pH的调节,分别将pH调节为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。 将P1(SEQ ID NO:2)、P2(SEQ ID NO:3)、和P2’ (SEQ ID NO:4)各序列干粉样品用灭菌灭酶的去离子水稀释,随后使用Nanndrop测每一管的浓度,根据浓度计算相应比例所需要的量,P1、P2以及P1、P2’按照1:3的比例加入到灭酶的离心管中,并加入一定量的不同pH值的亚精胺三盐酸盐水溶液,使得亚精胺三盐酸盐在体系中的浓度为100μM,其余加去离子水制备成30μL的体系,制备六组不同pH值亚精胺三盐酸盐水溶液介导半三棱柱结构在以下条件下自组装合成:95°C放置5 min, 65°C放置30 min,50°C放置30 min,37°C放置30min,然后 22°C 放置30 min。随后将两份半三棱柱结构混合,并在以下条件下自组装:37°C放置60 min,然后 22°C 放置30 min。随后将五组合成的样品,取少量在6%非变性PAGE胶中冰浴(4℃)下电泳,通过扫描仪扫描图片,DNA三棱柱电泳图片见图7,在以上6种pH值下亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱合成都具有较高纯度。
实施例6:亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱的自组装的37℃以及血清稳定性
按照实施例1中的方法,合成一定量的亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米制剂以及相应量的TAE-Mg2+介导DNA三棱柱纳米制剂,取少量按照1:9的比例加入到含有10%FBS(胎牛血清)的体系中,并放入37°C的孵箱中,设置实验组时间分别为:0h,3h,6h,12h,24h以及48h,到时间后取出,并在6%非变性PAGE胶中跑电泳,通过扫描仪扫描图片,见图8(A),亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米制剂在血清中可以稳定存在24h甚至48h,而TAE-Mg2+介导DNA三棱柱纳米材料在血清中24h就有所分解。
按照实施例1中的方法,合成一定量的亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米制剂,取少量在6%非变性PAGE胶中37℃水浴中跑电泳,通过扫描仪扫描托i按,见图8(B),可见亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米制剂可在37℃下稳定存在。
实施例7:细胞对亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱的自组装与TAE-Mg2+介导的核酸纳米材料摄取情况的比较
将处于对数生长期的A549用0.25%胰蛋白酶消化,细胞爬片,细胞接种于24孔板内(内置盖玻片),置于37℃、5% CO2孵箱中培养48小时后,待细胞密度达50%~60%时即可用于核酸纳米材料的摄取;实验分组为:亚精胺三盐酸盐三盐酸盐介导纳纳米材料(150nM)、TAE-Mg2+介导DNA三棱柱纳米材料(150nM)以及空白对照组。按照材料与培养基的比例1:10与培养基混合,加入纳米制剂后置于37℃、5% CO2孵箱中培养24小时。之后,每孔加入5uL的Hoechst染液于37℃、5% CO2孵箱中40min后取出,将24孔板培养基弃掉,用37℃ PBS轻轻漂洗3min×3次;沿着培养板壁加入4%多聚甲醛1ml,室温固定5分钟;PBS冲洗5min×3次,弃去PBS液体;取出盖玻片,使用抗淬灭封片剂(约10 μl)封片,避光保存;激光共聚焦显微镜下照相。
由激光共聚焦图9(A)可见,在相同时间以及浓度下,DNA三棱柱纳米载体携带的Cy3-PM1在细胞中呈红色荧光分布,可见亚精胺三盐酸盐介导纳米材料自组装的摄取量要远高于传统的TAE-Mg2+介导的,即亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米材料自组装显著提高了A549细胞对其的摄取。
将处于对数生长期的A549用0.25%胰蛋白酶消化,进行细胞计数,制成细胞悬液,接种于96孔荧光酶标板中,每孔加入100 μL细胞悬液,细胞密度为1×104 细胞/孔。设施实验组为:空白对照,亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米材料(150nM)以及TAE-Mg2+介导DNA三棱柱纳米材料(150nM)。每组设置5个复孔,另设调零孔。置于37℃、5% CO2孵箱中培养24小时后,加入相应纳米制剂与培养基混合液,置于37℃、5% CO2孵箱中培养12小时后,每孔加入5uL的Hoechst染液于37℃、5% CO2孵箱中40min后取出,吸弃培养基,每孔用200μL PBS洗5min×3,再每孔加入100μL PBS,在荧光酶标仪上进行测量发射波长调节为546nm和461nm。得到相应的数据进行归一化的处理,得到统计图如图9(B),可见亚精胺三盐酸盐介导纳米材料自组装的摄取量要高于传统的TAE-Mg2+介导的。
实施例8:亚精胺三盐酸盐介导自组装的DNA三棱柱纳米制剂对细胞mTOR mRNA表达的影响
处理前一天,计数A549细胞,细胞爬片,接种于6孔板中,相应的纳米制剂浓度为100mol/ml,设置实验组为:空白对照,双链mTOR siRNA,TAE-Mg2+介导DNA三棱柱纳米制剂加转染剂,TAE-Mg2+介导棱柱状核酸纳米材料,亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米材料(不携带单链mTOR siRNA),亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米材料(携带单链NC siRNA)以及亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米制剂。之后置于37℃、5% CO2孵箱中培养36小时后,用PBS冲洗2 遍;加入TRIzol 试剂(美国Invitrogen公司) 1ml,按照TRIzol 试剂提取说明书进行RNA 提取。应用核酸定量分析仪测定RNA 浓度和纯度。所有RNA 的A260/A280比值均在1.8~2.0 之间。然后用逆转录PCR(RT-PCR)试剂检测各时间点mTOR mRNA的情况,β-actin作为阳性对照。引物设计如下:
mTOR (195 bp),
F:5' ACTGGAGGCTGATGGACACA 3',(SEQ ID NO:5)
R:5' GGCTCTCCAAGTTCCACACC 3';(SEQ ID NO:6)
β-actin (432 bp),
F:5'TCAGGTCATCACTATCGGCAAT3' (SEQ ID NO:7)
R:5'AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA3'(SEQ ID NO:8)。
RT反应条件:42℃、60 分钟,72℃、5分钟,12℃、10 分钟,反应体积为20 μl;qPCR反应条件为:94℃、3 分钟变性,循环条件为94℃ 、30 秒,54℃ 、45秒,72℃、30 秒,40次循环,72℃延伸10 分钟,反应体积为10 μl。
检测发现DNA三棱柱纳米制剂携带的mTOR siRNA能够显著下调细胞mTOR mRNA的表达,显著低于空白对照组组(*代表p<0.05),且亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米制剂相比TAE-Mg2+介导DNA三棱柱纳米制剂,mTOR mRNA的表达下降相对较多(见图10)。
实施例9:亚精胺三盐酸盐介导自组装的棱柱状核酸纳米制剂对细胞增殖的影响
将处于对数生长期的PASMC用0.25%胰蛋白酶消化,进行细胞计数,制成细胞悬液,接种于96孔培养板中,每孔加入100 μl细胞悬液,细胞密度为1×104 细胞/孔。设置实验组为:空白对照,双链mTOR siRNA,TAE-Mg2+介导DNA三棱柱纳米制剂加转染剂,TAE-Mg2+介导棱柱状核酸纳米材料,亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米材料(不携带单链mTOR siRNA),亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米材料(携带单链NC siRNA)以及亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米制剂。置于37℃、5% CO2孵箱中培养36小时后,取出,每孔加入5 mg/ml MTT溶液10μl,继续培养4小时后终止培养; 吸尽孔内液体,每孔加入150 ul DMSO,置于水平摇床振荡摇匀10min,使结晶充分溶解;酶标仪检测在490 nm 波长处各孔的吸光度(A 值),重复实验3次;
MTT法检测结果显示DNA三棱柱纳米制剂携带的mTOR siRNA能够显著且亚精胺三盐酸盐介导DNA三棱柱纳米制剂相比TAE-Mg2+介导DNA三棱柱核酸纳米制剂,抑制细胞增殖效果相对较好(见图11)。
实施例10 不同浓度的亚精胺三盐酸盐介导DNA纳米管的自组装
称量取一定质量的亚精胺三盐酸盐,并将其溶解于去离子水中,使得母液的浓度为100mM,再分别用去离子水稀释到10mM、1mM以及100μM。将N1(SEQ ID NO:9)、N2(SEQ IDNO:10)、和N2’(SEQ ID NO:11)各序列干粉样品用灭菌灭酶的去离子水稀释,随后使用Nanndrop测每一管的浓度,根据浓度计算相应比例所需要的量,N1、N2、N2’按照1:3:3的比例加入到灭酶的离心管中,并加入一定量的亚精胺三盐酸盐水溶液,使得亚精胺三盐酸盐在体系中的浓度为50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM,其余加去离子水制备成30μL的体系,制备5组不同浓度亚精胺三盐酸盐介导纳米管结构在以下条件下自组装合成:95°C放置5min, 65°C放置30 min,50°C放置30 min,37°C放置30 min,然后 22°C 放置30 min。将合成的少量样品在6%非变性PAGE胶[丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(19:1)溶液(40%):3.6mL,10×TAE-Mg2+:2.4mL,10%过硫酸铵(APS):400uL,TEMED:40μL,水:18.2mL]中冰浴(4℃)下电泳,通过扫描仪扫描图片,DNA纳米管电泳图片见图12,在亚精胺三盐酸盐浓度为100μM到200μM这个区间具有较高纯度。
实施例11 不同温度下亚精胺三盐酸盐恒温介导DNA纳米管的自组装
将N1(SEQ ID NO:9)、N2(SEQ ID NO:10)、和N2’(SEQ ID NO:11)各序列干粉样品用灭菌灭酶的去离子水稀释,随后使用Nanndrop测每一管的浓度,根据浓度计算相应比例所需要的量,N1、N2、N2’按照1:3:3的比例加入到灭酶的离心管中,并加入一定量的亚精胺三盐酸盐水溶液,使得亚精胺三盐酸盐在体系中的浓度为100μM,其余加去离子水制备成30μL的体系,制备三组纳米管状结构,分别在22°C放置60 min,37°C放置60 min以及按照本发明所述的梯度退火方法合成,随后将五组合成的样品,取少量在6%非变性PAGE胶中冰浴(4℃)下电泳,通过扫描仪扫描图片,DNA三棱柱电泳图片见图13(A)、(B),在37°C、22°C恒温下自组装具有较高纯度。
因此,本发明所述亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装的方法,可用于多种核酸纳米材料的自组装,不仅包括实施例中的DNA三棱柱,DNA纳米管,还包括DNA纳米坏,DNA纳米飞镖等等,可广泛应用于核酸纳米材料自组装。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上,然其并非用以限定本发明,任何所属技术领域的技术人员,在不脱离本发明之精神和范围内,当可作些许之更动与改进,因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院
<120> 亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的三棱柱的纳米制剂和应用
<130> 2017
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
augguucaug guaucuugg 19
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ttcaatctct atcattccgt ccttcaatct ctatcattcc gtccttcaat ctctatcatt 60
ccgtcc 66
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gataccatga accatttaga gattgaagga cggaatgtat cagtgtcact ctcgcttgc 59
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ccgaacgtgt cacgtttaga gattgaagga cggaatgtgc aagcgagagt gacactgat 59
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
actggaggct gatggacaca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggctctccaa gttccacacc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tcaggtcatc actatcggca at 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
aaagaaaggg tgtaaaacgc a 21
<210> 9
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
aggcaccatc gtaggttatt taatcttgcc aggcaccatc gtaggttatt taatcttgcc 60
aggcaccatc gtaggttatt taatcttgcc 90
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tagcaacctg cctgagcgct tttgcgctgt gcaagcctac gatggacacg gtaacgac 58
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
accgtgtggt tgctagtcgt t 21
Claims (5)
1.一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装的方法,其特征在于,有方法如下:
1)取需合成纳米材料的DNA冻干粉,分别加H2O稀释,混匀,得到DNA溶液;
2)DNA溶液中加入亚精胺三盐酸盐水溶液,混匀, DNA溶液均按需要组装核酸的数量设置摩尔比,在亚精胺三盐酸盐水溶液中梯度退火或恒温或慢退火下介导核酸纳米材料的自组装合成;
所述的恒温为37°C或45℃,恒温下放置30~90 min;
所述梯度退火合成为,95°C放置5 min, 65°C放置30 min,50°C放置30 min,37°C放置30 min, 22°C 放置30 min;
所述慢退火合成为,密封DNA溶液,放入100℃的水中缓慢降温,两天降至室温;
所述亚精胺三盐酸盐水溶液的pH值为6.0-10.0;
所述亚精胺三盐酸盐水溶液的浓度范围50μM-300μM。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2)采用亚精胺三盐酸盐水溶液介导核酸纳米材料制备三棱柱纳米材料时,用梯度退火后得到半三棱柱结构溶液;将两份半三棱柱结构溶液混合,37°C放置60 min,然后在 22°C 放置30min。
3.采用权利要求1-2任一所述方法制备的携带siRNA的三棱柱的纳米制剂,其特征在于:所述的纳米材料由序列如SEQ ID NO:2所示的P1、序列如SEQ ID NO:3所示的P2、序列如SEQ ID NO:4所示的P2’, 在恒温下或梯度退火或慢退火下,通过单链分子碱基互补配对合成,所述的P1、P2、P2’ 的摩尔比2:3:3,mTOR siRNA、P1、P2、P2’的摩尔比为6:2:3:3。
4.权利要求3所述的纳米制剂的制备方法,其特征在于,有以下步骤:
1)取P1、P2、P2’的冻干干粉,分别加H2O稀释,混匀,得到P1、P2、P2’溶液;
2)取P1、P2与P1、P2’溶液均按照1:3的比例在亚精胺三盐酸盐水溶液中分别化合,DNA三棱柱在恒温下或梯度退火或慢退火合成,得到P1、P2、P2’的摩尔比为2:3:3的纳米材料溶液,将mTOR siRNA添加到纳米材料溶液中,再次放置30 min,得到mTOR siRNA、P1、P2、P2’的摩尔比的纳米制剂溶液。
5.权利要求3所述的制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。
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