CN109071597A - 治疗性膜囊泡 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从细胞外囊泡或细胞器中产生膜囊泡的方法和通过此类方法产生的治疗性膜囊泡。本发明进一步涉及治疗性膜囊泡、通过使用此类囊泡治疗代谢紊乱的方法和用于治疗，如用于治疗代谢紊乱的此类囊泡。本发明进一步涉及从细胞器中产生膜囊泡的方法。此外，本发明涉及从细胞外囊泡体中分离细胞外囊泡亚群的方法。

Description

治疗性膜囊泡
技术领域
本发明涉及膜囊泡的产生的领域，具体地说是治疗性膜囊泡的产生。此外，本发明涉及此类膜囊泡用于靶向递送治疗性化合物的治疗用途。
背景技术
已知外泌体(exosome)、核外颗粒体(ectosome)、微囊泡和凋亡小体等细胞外囊泡由人体内的许多细胞释放，并且可以将功能性RNA分子以及蛋白质穿梭至其它细胞。通过脂质膜双分子层保护这些细胞外囊泡的负荷(cargo)免受细胞外酶和免疫系统的影响。先前已经提出，细胞外囊泡如外泌体可以用于将功能性分子包括治疗性核苷酸递送至患病细胞，如癌细胞、癌组织和炎性细胞。
已经提出几种技术用于加载外泌体或微囊泡，用例如用于递送到受体细胞内部的治疗性RNA负荷(Alvarez-Erviti L.等，《自然生物技术(Nat Biotechnol.)》2011年4月；29(4)：341-5；Ohno S.等，《分子治疗(Mol Ther.)》2013年1月；21(1)：185-91；EP2010663)。所有这些技术的共同点是其利用相对“完整”的囊泡。可以认为囊泡是完整的，因为除了其已经加载有的任何特异性负荷例如siRNA或微小RNA(microRNA)以外，所述囊泡携带其通常携带的分子。
虽然此前已经做了很多工作，但细胞外囊泡领域尚未完全探索。此类囊泡的全部治疗性潜力仍有待实现。
发明内容
本公开的目的是提供可以用于靶向递送治疗性化合物的新型治疗性膜囊泡。另一目的是在治疗中使用如此提供的囊泡。
本公开的目的是提供可以用于靶向递送治疗性化合物的新型治疗性膜囊泡。另一目的是在治疗中使用如此提供的囊泡。
本公开的目的是提供产生膜囊泡包括用于治疗用途的那些膜囊泡的新方法。此类方法尤其包括分离特异性膜囊泡和提供具有预定分子含量的膜囊泡的方法。
对技术人员而言从本公开中显而易见的这些和其它目的以如所附权利要求书中要求保护的和如本文一般性公开的本发明的不同方面的方式得到满足。
如本文所用，术语“细胞外囊泡”是指包含包围内部空间的膜的细胞衍生的囊泡。细胞外囊泡包含所有膜结合的囊泡，其直径小于衍生其的细胞的直径。通常，细胞外囊泡的直径在20nm至1000nm范围内，并且可以包含在内部空间内显示在细胞外囊泡的外表面上的和/或跨越膜的各种大分子负荷。所述负荷可以包含核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。作为实例而非限制，细胞外囊泡包括凋亡小体、细胞碎片、通过直接或间接操作(例如，通过连续挤出或用碱性溶液处理)衍生自细胞的囊泡、囊泡化细胞器和由活细胞产生的囊泡(例如，通过直接质膜出芽或晚期内体与质膜融合)。细胞外囊泡可以衍生自活的或死的生物体、外植的组织或器官和/或培养的细胞。
如本文所用，术语“纳米囊泡”是指包含包围内部空间的膜的细胞衍生的小(直径在20-250nm，更优选地直径在30-150nm之间)囊泡，并且所述小囊泡通过直接或间接操作由所述细胞生成，使得在没有所述操作的情况下，所述纳米囊泡不会由所述生产细胞产生。所述生产细胞的适当操作包括但不限于连续挤出、用碱性溶液处理、超声处理或其组合。在某些情况下，纳米囊泡的产生可以导致所述生产细胞的破坏。优选地，纳米囊泡群基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期内体与质膜融合的方式衍生自生产细胞的囊泡。纳米囊泡包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效负载(例如治疗剂)、接收体(例如靶向部分)、多核苷酸(例如核酸、RNA或DNA)、糖(例如单糖、多糖或聚糖)或其它分子。一旦根据所述操作纳米囊泡衍生自生产细胞，则所述纳米囊泡可以基于其尺寸、密度、生化参数或其组合从生产细胞中分离。除非另有说明，否则术语“膜囊泡”或“治疗性膜囊泡”是指一种纳米囊泡。
如本文所用，术语“外泌体”是指包含包围内部空间的膜的细胞衍生的小(直径在20-300nm，更优选地直径在40-200nm之间)囊泡，并且所述小囊泡通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜的融合由所述细胞生成。通常，核外体的产生不会导致生产细胞的破坏。外泌体包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效负载(例如治疗剂)、接收体(例如靶向部分)、多核苷酸(例如核酸、RNA或DNA)、糖(例如单糖、多糖或聚糖)或其它分子。外泌体可以衍生自生产细胞，并且基于其尺寸、密度、生化参数或其组合从生产细胞中分离。
如本文所用，术语“细胞器”意指细胞内具有特异性功能的特定亚基。单个细胞器通常分别封闭在其自己的脂质双分子层即膜中。非限制性的示例性细胞器包括叶绿体、内质网、鞭毛、高尔基体(Golgi apparatus)、线粒体、内体、溶酶体、液泡和细胞核。
如本文所用，术语“表位特异性结合物”意指结合到特异性表位的分子。表位是由免疫系统，具体地说是由抗体、B细胞或T细胞、噬菌体或适体识别的抗原的一部分。“表位特异性结合物”可以或不可以进一步结合到例如珠粒的表面上。表位特异性结合物的实例包括抗体、B细胞或T细胞或适体。
如本文所用，术语“膜”意指生物膜，即允许某些化合物通过的细胞和细胞器的外覆盖物。在某些情形下，术语“膜”可以指脂质双分子层，其同时结合细胞外囊泡或细胞器并封闭囊泡内或细胞器内含物，并且随后将所述膜打开以暴露细胞外囊泡或细胞器的内含物并将所述内含物从开膜中离解。
根据一个方面，提供产生膜囊泡的方法，所述方法包含：
a.提供细胞外囊泡或细胞器；
b.通过用pH为9至14的水性溶液处理来打开所述细胞外囊泡或所述细胞器以获得膜；
c.去除囊泡内或细胞器内含物；和
d.重新组装所述膜以形成膜囊泡。
上述方法提供由已被打开的细胞外囊泡或细胞器产生的、从其囊泡内或细胞器内含物释放并且然后重新组装的膜囊泡。以这种方式产生的膜囊泡缺乏其可以天然含有的有害负荷，包括有害的内源性分子如DNA或核膜组分、或任何不希望的RNA种类、酶或其它蛋白质，以及感染性组分，如病毒、病毒组分，包括病毒基因组材料和或朊病毒蛋白或类似的感染性成分。从细胞外囊泡中去除任何天然存在的囊泡内含物降低了由此类囊泡内含物引起的可能副作用，并且因此降低不希望的效果的风险。类似地，从细胞器中去除任何天然存在的细胞器内含物降低了由此类细胞器内含物引起的可能副作用，并且因此降低不希望的效果的风险。
通过去除任何天然存在的内含物，膜囊泡可以加载有治疗性化合物，并且从而用于诱导纯粹的治疗效果。虽然避免了囊泡内或细胞器内含物可以提供的任何潜在的负面副作用，但是保持了表面分子的作用。以此方式去除任何内含物优选地将不会影响膜结合的/表面结合的分子的功能。优选地维持所述膜结合/表面结合分子，因此优选地维持其功能。此类膜/表面分子的功能可以是靶向功能或治疗功能。
如本文所公开的治疗性膜囊泡可能通过例如优化膜囊泡的产量(与细胞外囊泡相比)来解决当前细胞外囊泡治疗的多个问题。
根据本方面的一个实施例，所述方法限于细胞外囊泡。
根据本方面的一个实施例，所述方法限于细胞器。
在一些实施例中，可以通过超声处理、机械振动、通过多孔膜挤出、电流和其组合中的一种或多种完成本文描述的方法的步骤d。因此，可以通过超声处理、机械振动、通过多孔膜挤出、电流或其组合完成重新组装打开的细胞外囊泡或细胞器的膜。可以采用这些技术中的一种或多种。
在一些实施例中，本文描述的方法的步骤d可以通过超声处理来完成。通常，打开的细胞外囊泡或细胞器的膜的重新组装通过超声处理来完成。
本文描述的方法的步骤c的所述囊泡内或细胞内负荷分子的去除可以通过超速离心法或密度梯度超速离心法来完成。
在一些方面，所述方法进一步包含：
e.将负荷加载到所述膜囊泡中，其中步骤e可以伴随步骤d或在步骤d之后来实行。
伴随着重新组装清空的囊泡或细胞器的步骤或在所述步骤之后，新形成的膜囊泡可以加载有非常特异的负荷，包括具有细胞内或细胞外靶标的不同类型的合成分子和/或蛋白质或多肽，或可以影响细胞功能、表型、增殖或存活力的核苷酸，或具有类似功能的蛋白质、肽或激素。具有细胞内或细胞外靶标的蛋白质或多肽包括生物活性或抑制性多肽，如激素、细胞因子、趋化因子、受体和酶。负荷的更多实例定义如下。
在一些实施例中，可以在步骤d之后通过物理操作完成本文描述的方法的步骤e，其中所述物理操作选自电穿孔、超声处理、机械振动、通过多孔膜挤出、电流和其组合。将负荷加载到由来自打开的细胞外囊泡或细胞器的膜形成的囊泡中可以在此类膜的重新组装之后，通过混合、共孵育、电穿孔、超声处理、机械振动、通过多孔膜挤出、电流和其组合来完成。
在一些实施例中，步骤e的所述加载可以伴随步骤d来完成。例如，将特异性分子的负荷与打开的(膜)形式的细胞外囊泡或细胞器混合，接着使用例如以上定义的方法中的任何一种重新组装以形成膜囊泡。
所述负荷可以选自合成生物活性化合物、天然生物活性化合物、抗菌化合物、抗病毒化合物、蛋白质或多肽、核苷酸、基因组编辑系统、微小RNA、siRNA、长链非编码RNA、反义寡核苷酸(antago-miR)、吗啉基、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模拟物、DNA和其组合。伴随膜的重新组装或在膜的重新组装之后，加载到膜囊泡中的负荷可以是许多特异性类型，如RNA-干扰分子(RNAi：微小RNA或siRNA或长链非编码RNA、反义寡核苷酸、吗啉基或可以具有RNA干扰功能或可以阻断细胞中RNA或蛋白质功能的任何其它分子，包括转录因子)、mRNA全长或缩短以在受体细胞中产生功能性蛋白质)、t-RNA、y-RNA、RNA模拟物、DNA分子(用以递送功能性短DNA探针或整个DNA基因序列以替代或抑制受体细胞中的功能障碍)酶抑制剂或其它小分子药物。所述负荷也可以是天然的或合成的激素，用以例如优化细胞内递送，以及在细胞质或细胞器或细胞核内具有药理功能的合成小分子。预期这些特异性类型的分子中的一种或多种可以在其形成期间或在其形成之后加载到膜囊泡中。
所述负荷可以是与消炎功能、促炎功能或细胞迁移相关的化合物。在一个实施例中，所述负荷是TGF-β。
所述负荷可以是基因组编辑系统。基因组编辑系统包括但不限于大范围核酸酶系统、锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)系统和规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)系统。CRISPR系统可以是CRISPR-Cas9系统。CRISPR-Cas9系统包含编码Cas9蛋白质的核苷酸序列、编码与靶序列(crRNA)杂交的CRISPR RNA的核苷酸序列、和编码反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的核苷酸序列。crRNA和tracrRNA可以融合成一个向导RNA。CRISPR-Cas系统的组分可以位于相同的媒介物中或位于不同的媒介物中。CRISPR-Cas9系统可以进一步包含核定位信号(nuclear localization signal，NLS)。
所述负荷可以是特异性地结合到编码突变型或非突变型致癌基因的转录物中的微小RNA或siRNA。微小RNA或siRNA的结合可以抑制致癌基因的mRNA译码和蛋白质合成。此类致癌基因包括但不限于ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES。在一个实施例中，致癌基因是突变型KRAS，例如KRAS G12D、KRAS G12C或KRAS G12V。在另一实施例中，致癌基因是Myc，如N-Myc、c-Myc或L-Myc。
治疗性膜囊泡可以具有至少一种不同于衍生所述膜囊泡的细胞外囊泡或细胞器群的生理特性，其中所述生理特性与以下各项中的一种或多种相关：生物分布、细胞摄取、半衰期、药效动力学、效力、剂量、免疫应答、加载效率、稳定性或对其它化合物的反应性。可以通过本领域中已知的各种方法测量不同的生理特性。不同的生理特性可以是改善的靶向效率，改善的递送，或对受体细胞、器官或受试者的治疗性负荷的增加。可以比将负荷加载到衍生所述膜囊泡的细胞外囊泡或细胞器中更有效地将负荷加载到膜囊泡中。
所述细胞外囊泡可以是衍生自细胞外囊泡体的细胞外囊泡亚群，或其中所述细胞器是衍生自多个细胞器的细胞器的一种亚型。
来自任何细胞、或来自任何组织的释放的囊泡包括具有不同内含物、不同表面分子并且在一些情况下来自不同细胞来源的囊泡云。细胞外囊泡亚群可以具有关于例如表面分子、功能和靶标的非常特异的特征。此类细胞外囊泡可以源自细胞膜、高尔基体、内质网、细胞核或线粒体。
类似地，细胞器的特异性亚型可以衍生自存在于细胞中的多种细胞器类型。例如，可以通过常规技术如密度梯度方法从细胞裂解物中去除多个细胞器。随后可以分离一种或多种特异性细胞器亚型，例如通过采用如本文所公开的技术。预期用于本方法的特异性细胞器亚型包括高尔基体、内质网、溶酶体、内体、细胞核或线粒体。
在一些方面，所述方法在步骤a之前包含：
使表位特异性结合物与所述细胞外囊泡体或所述细胞器接触；并且从所述细胞外囊泡体或多个细胞器中分离细胞外囊泡亚群或细胞器亚型。
由于每个囊泡亚组可以在其表面以及囊泡内负荷两者上携带截然不同的分子，因此其可以通过表位特异性结合技术，通过阳性分离和/或阴性分离与其它囊泡分离。通常，用于分离的表位特异性结合物可以是特异性抗体、噬菌体或适体中的一种或多种。不同亚细胞来源的细胞器或囊泡的彼此分离可以提供具有特异性特征的纯化的细胞外囊泡或细胞器。此类特异性特征可以包括如上所述期望的分子负荷，和/或由靶向细胞吸收以将例如表面分子和/或负荷分子递送至所述靶向细胞的能力。还可以选择表位特异性结合物，使得结合不希望的亚群，因此可以通过所谓的阴性分离从细胞外体中去除所述亚群。
所述表位特异性结合物可以是针对至少一种线粒体膜蛋白，优选地MTCO2蛋白的抗体。通过使用针对线粒体膜蛋白，优选地MTCO2的抗体作为表位特异性结合物，分离的细胞外囊泡亚群具有增加的ATP合酶活性。
所述表位特异性结合物可以是针对表面标志物CD63的抗体。通过使用针对CD63的抗体作为表位特异性结合物，与细胞外囊泡体相比，分离的细胞外囊泡亚群可以具有减少的RNA含量。
包括在本公开范畴内的是治疗性膜囊泡，所述治疗性膜囊泡包含：
由膜形成的囊泡，所述膜衍生自细胞外囊泡或细胞器。
如本文公开的治疗性膜囊泡通过例如改善对受体细胞、器官或目标物的靶向效能来解决当前细胞外囊泡治疗的多个问题。治疗性膜囊泡通过其经由其表面分子与受体细胞相互作用的能力来模拟细胞外囊泡，如核外体。应理解，治疗性膜囊泡由衍生自细胞外囊泡或细胞器的膜形成。例如，所述膜可以通过打开此类细胞外囊泡或细胞器而衍生自细胞外囊泡或细胞器。因此，得到的清空的治疗性膜囊泡可以缺乏天然细胞外囊泡或细胞器含有的有害内含物，包括有害的内源性分子如DNA或核膜组分，或任何不希望的RNA种类、酶或其它蛋白质，以及感染性组分如病毒、病毒组分，包括病毒基因组材料和或朊病毒蛋白或类似的感染性成分。
治疗性膜囊泡可以加载有治疗性负荷。包含加载的负荷的治疗性膜囊泡模拟天然存在的细胞外囊泡，因为所述治疗性膜囊泡具有通过其表面分子与受体细胞相互作用，并将其负荷递送至所述受体细胞的能力。根据此方面的可以包含在治疗性膜囊泡内的治疗性负荷的实例在本文其它地方公开，但通常可以包括合成生物活性化合物、抗菌化合物、抗病毒化合物、天然生物活性化合物、蛋白质、核苷酸、基因组编辑系统、微小RNA、siRNA、长链非编码RNA、反义寡核苷酸、吗啉基、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模拟物、DNA和其组合中的一种或多种。
所述治疗性负荷可以包含催化ATP产生的酶。包含催化ATP产生的酶如ATP合酶的治疗性膜囊泡可以对代谢病症具有有益效果。
所述治疗性负荷可以包含具有影响间充质干细胞的表型和/或功能如增加所述间充质干细胞的消炎功能的能力的化合物。使间充质干细胞与包含TGF-β的治疗性膜囊泡接触可以增加迁移活性、伤口愈合活性和此类干细胞的治疗效率。将间充质干细胞暴露于治疗性膜囊泡中，所述治疗性膜囊泡包含具有影响此类干细胞的表型和/或功能的能力的化合物，可以因此增加此类干细胞的消炎功能。例如，此类治疗性膜囊泡可以减轻气喘小鼠模型中的炎症。
所述治疗性负荷可以包含与消炎功能相关的化合物，或与促炎功能相关的化合物。与消炎功能相关的化合物的实例包括IL-10、干扰素α、干扰素γ和消炎微小RNA。所述消炎微小RNA是例如miR-146。与促炎功能相关的化合物的实例包括TGF-β、TNF-α、IL-4、IL-6、toll样受体配体和促炎微小RNA。所述促炎微小RNA是例如miR-10、-29或-155)。
负荷可以包含基因组编辑系统，如CRISPR-Cas9系统。加载有CRISPR-Cas9系统的治疗性膜囊泡可以用于改变疾病处理、再生医学和组织工程的基因表达和功能。
可以比将负荷加载到衍生所述膜囊泡的细胞外囊泡或细胞器中更有效地将负荷加载到膜囊泡中。去除膜囊泡的任何天然存在的内含物如不希望的RNA种类、酶或其它蛋白质，以及感染性组分如病毒、包括病毒基因组材料和/或朊病毒蛋白或类似的感染成分的病毒组分，可以避免对治疗性负荷的污染或损害。
所述细胞外囊泡可以表示具有与细胞外囊泡体不同的膜和表面分子子集的细胞外囊泡体亚群。具有与细胞外囊泡体不同的膜和表面分子子集的细胞外囊泡体亚群可以具有更特异的效果并因此具有更小的副作用。细胞外囊泡体亚群的实例在本文其它地方公开。预期衍生自特异性细胞外囊泡亚群的膜囊泡可以是特别有用的，例如由于特异性膜和/或表面分子的存在，或用于特异性治疗性负荷的靶向递送。
在一些方面，本文描述的细胞器代表衍生自多个细胞器的细胞器亚型。衍生自多个细胞器的细胞器亚型的实例在本文其它地方公开。预期源自特异性细胞器亚型的膜囊泡可以是特别有用的，例如由于特异性膜和/或表面分子的存在，用于特异性治疗性负荷的靶向递送。
膜囊泡可以通过以下中的至少一项来表征：
i.表面膜分子经倒置；
ii.至少一种类型的具有影响间充质干细胞的表型和功能的能力使得所述间充质干细胞的所述消炎功能增加的表面分子；
iii.存在或不存在至少一种类型的与细胞外囊泡共有的表面标志物；
iv.存在至少一种类型的线粒体膜表面分子；
v.存在至少一种类型的核膜表面分子；和
vi.存在至少一种类型的高尔基体和/或内质网的膜分子。
治疗性膜囊泡(使其表面膜分子倒置)可以允许其直接递送具有第二信息的表面分子，如细胞内信号传输。此外，具有能够影响间充质干细胞的表型和/或功能的表面分子的治疗性膜囊泡可以增加间充质干细胞的消炎功能。
参考实例4和共有表面标志物CD63，CD63阴性细胞外囊泡含有大量RNA，而CD63阳性细胞外囊泡缺乏RNA，这表明每个细胞外囊泡亚群都具有不同的负荷并因此具有潜在诱导特异性效果的能力。
参考实例3，在膜囊泡上存在一种类型的线粒体膜表面分子MTCO2，产生更高的ATP合酶活性。因此，假设其它细胞器来源如核、高尔基体或内质网来源的膜囊泡，以类似的方式显示其它特性或功能，取决于其不同的膜表面分子。具有如上所阐述的特异性特征中任何一项的治疗性膜囊泡可以进一步衍生自特定细胞外囊泡亚群或特定细胞器亚型。
在如本文公开的一些方面，所述治疗性膜囊泡具有通过组织迁移的能力。已经表明，在某些情况下，治疗性膜囊泡具有改善的运动性，因为其可以在仍未固定时改变其形状。这导致活体外无细胞囊泡的可见形状变化。这与某些囊泡、运动蛋白、肌动蛋白和相关蛋白亚群/亚型存在相关，其存在可以使用囊泡蛋白质组学方法来确定。
与衍生所述膜囊泡的细胞外囊泡或细胞器相比，治疗性膜囊泡可具有增加的运动性。
细胞外囊泡或细胞器可以源自癌细胞、癌细胞系、炎性细胞、结构细胞、神经/神经胶质细胞/少突胶质细胞或间充质/胚胎干细胞。
细胞外囊泡或细胞器可以从正常或患病组织中分离，包括肿瘤、骨髓或免疫细胞从血液、淋巴结或脾中分离。
膜囊泡可以通过如本文公开的方面中任何一项定义的方法获得。
根据如本文公开的方面的治疗性膜囊泡可以用于治疗。根据本发明的治疗性膜囊泡可以通过例如改善靶向效能、递送和增加对受体细胞/器官/目标物的治疗性负荷来解决当前细胞外囊泡治疗的多个问题。可以认为治疗性膜囊泡模拟外泌体或任何其它细胞外囊泡，通过以所述细胞外囊泡通过其表面分子与受体细胞相互作用和/或将治疗性负荷递送至受体细胞的能力来模拟后者。同时，治疗性膜囊泡与核外体和其它天然存在的细胞外囊泡不同，不同之处在于：前者可以减轻具有可能的负面副作用的不希望的细胞外囊泡的可能的污染，以及其可以天然含有的任何有害内含物。此外，治疗性膜囊泡还可以加载有抗生素或抗病毒分子，以处理细胞内感染，如细胞内细菌、病毒或朊病毒蛋白，包括Epstein-Barr病毒、HIV或任何其它感染性种类。
治疗性膜囊泡可以用于代谢紊乱的处理。治疗性膜囊泡可以具有递送对ATP的产生而言重要的酶如酶ATP合酶的能力。
治疗性膜囊泡可以用于处理紊乱的方法，所述方法包含向有此需要的患者施用根据本发明的治疗性膜囊泡。
治疗性膜囊泡可以用于处理代谢紊乱的方法，所述方法包含向有此需要的患者施用根据本发明的治疗性膜囊泡。
治疗性膜囊泡可以用于所述治疗性负荷的靶向递送。由细胞外囊泡或细胞器亚群产生的治疗性膜囊泡可以具有使得其能够到达特异性靶标并递送其治疗性负荷的特异性表面分子，导致更加特异的处理以及特异性治疗性负荷的递送。治疗性负荷可以例如靶向细胞内功能，如恶性疾病中的突变型或非突变型致癌基因，或任何其它细胞内过程或功能，包括转录因子、蛋白质产生、激素受体、细胞因子、膜折叠、能量产生、增殖、DNA复制、或任何其它细胞内功能。治疗性膜囊泡还可以加载有抗生素或抗病毒分子，以处理细胞内感染，例如细胞内细菌，病毒或朊病毒，包括Epstein-Barr病毒，HIV或任何其它感染性物种。
包括在本公开范畴内的是从细胞器中产生膜囊泡的方法，所述方法包含：
a.使细胞裂解以释放细胞内含物；
b.将所述细胞器与所述细胞内含物分离；和
c.通过用pH 9-14的水性溶液处理所述细胞器来打开所述细胞器以获得膜；和
d.重新组装所述膜以形成膜囊泡。
已经清空细胞器内含物的细胞器将缺乏其可以天然含有的有害负荷，包括有害的内源性分子如DNA或核膜组分、或任何不希望的RNA种类、酶或其它蛋白质，以及感染性组分，如病毒、病毒组分，包括病毒基因组材料和/或朊病毒蛋白或类似的传染性成分。从细胞器中去除内含物可以降低由此类内含物引起的可能的副作用，并且因此减少可能的不良影响。
所述细胞器可以是线粒体。
此方法可以进一步包含：
e.将负荷加载到所述膜囊泡，其中步骤e可以伴随步骤d或在步骤d之后来实行。
伴随着重新组装清空的细胞器的过程或在所述过程之后，新形成的囊泡可以加载有特异性负荷，包括具有细胞内或细胞外靶标的不同类型的合成分子/化学物质和或蛋白质(包括生物活性或抑制性分子，如激素、细胞因子、趋化因子、受体或酶)，或可以影响细胞功能、表型、增殖或存活力的核苷酸，或具有类似功能的蛋白质、肽或激素。结合其它方面公开可以并入膜囊泡中的负荷的其它实例。根据此方面产生的膜囊泡可以用于治疗，例如用于特定治疗性负荷的靶向递送。
包括在本公开范畴内的是从细胞器中产生膜囊泡的方法，所述方法包含：
a.通过用pH 9-14的水性溶液处理所述细胞来打开细胞以获得膜的混合物；
b.从所述膜的混合物中分离细胞器膜；和
c.重新组装所述细胞器膜以形成膜囊泡。
此方法可以进一步包含：
d.将负荷加载到所述膜囊泡中，其中步骤d可以伴随步骤c或在步骤c之后来实行。
可以加载到膜囊泡中的负荷的实例在本文其它地方公开。通过所述方法获得的膜囊泡可以优选地用于治疗。同样，本文公开从混合物中分离细胞器膜的示例性方法，例如通过使用表位特异性结合物。在一个实施例中，所述分离进一步包含从所述混合物中分离一种或多种细胞器亚型。
包括在本公开范畴内的是从细胞外囊泡体中分离细胞外囊泡亚群的方法，所述方法包含：
使表位特异性结合物与所述细胞外囊泡体接触；和
从所述细胞外囊泡体中分离所述细胞外囊泡亚群。
来自任何细胞、或来自任何组织的释放的囊泡包括具有不同内含物、表面分子并且具有不同细胞来源的囊泡云。细胞外囊泡的亚群可以具有关于例如表面分子、功能和靶标方面的非常特异的特征和较少的多样性。细胞外囊泡亚群可以通过表位特异性结合物的阳性和/或阴性分离来分离。通常，表位特异性结合物可以是抗体、噬菌体或适体。
表位特异性结合物可以是针对至少一种线粒体膜蛋白，优选地MTCO2蛋白的抗体。通过使用针对线粒体膜蛋白的抗体，优选地针对MTCO2的抗体作为表位特异性结合物，分离的细胞外囊泡亚群可以具有增加的ATP合酶活性。具有增加的ATP合酶活性的分离的亚群可以用于处理代谢紊乱。
表位特异性结合物可以是针对表面标志物CD63的抗体。与细胞外囊泡体相比，分离的CD63阳性细胞外囊泡亚群可以具有减少的RNA含量。具有减少的RNA含量的分离的亚群可以用于递送具有最小RNA污染的负荷。
可以分离细胞外囊泡亚群以用于治疗。具体地说，细胞外囊泡亚群可以通过如上文公开的方法来分离。
可以产生细胞外囊泡亚群以用于代谢紊乱的处理。具体地说，细胞外囊泡亚群可以通过如上文公开的方法来分离。
附图说明
从以下实例和附图中，将变得更加全面地理解本发明，所述实例和附图仅作为说明给出，并且因此不是本发明的限制，并且其中：
图1.通过特异性结合技术分离细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)亚群的示意图。
图2.在EV分离株中用ELISA检测的线粒体膜蛋白和经典EV标志物蛋白，表明存在含有EV亚群的线粒体蛋白。
图3.EV亚群的蛋白质组学结果。含有EV亚群的MTCO2显示出不同的蛋白质谱和生物过程。图3A显示各个EV亚群中鉴定的蛋白质的数量和每个亚群的独特或存在于一个以上亚群中的鉴定的蛋白质的数量。FACL4-EV和MTCO2-EV分别表示由FACL4和MTCO2抗体分离的EV亚群。图3B显示EV亚群中鉴定的蛋白质的热图分析。图3C显示基于蛋白质的相对定量的不同组中的基因本体(gene ontology，GO)分析。
图4.线粒体蛋白富集于含有EV亚群的MTCO2中和蛋白质的相互作用。图4A显示不同的EV亚群中线粒体蛋白的相对丰度。图4B显示线粒体蛋白与能量产生机制蛋白包括突出显示的ATP合酶的亚基的相互作用。
图5.EV亚群的ATP合酶活性测量。含有EV亚群的MTCO2具有比未分离的EV更高的ATP合酶活性。
图6.CD63阳性EV的分离和CD63阳性EV的RNA谱。图6A显示CD63阳性EV和CD63阴性EV的分离的示意图。图6B显示CD63阳性和CD63阴性EV的RNA谱。CD63阴性EV含有RNA，而CD63阳性EV不含RNA。图6C呈现CD63和RNA信号的第1轮与第4轮之间的相对倍数变化。
图7.EV亚群在表面上含有活性TGF-β。TGF-β与EV标志物共定位，并且可以在间充质干细胞上诱导细胞内信号传输。图7A显示通过蛋白质印迹法(Western Blot)测量的囊泡标志物TSG101和CD81以及通过ELISA在相应洗脱份中测量的TGF-β含量。图7B呈现洗脱份2中TGF-β的总形式和活性形式的量。图7C显示TGF-β和CD63的两种荧光信号的检测。图7D呈现在用含TGF-β的EV处理之后，间充质干细胞中SMAD2磷酸化的检测。
图8.含TGF-β的EV诱导活体外间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的迁移。图8A呈现在有或没有处理含TGF-β的EV的情况下MSC形态变化的显微图像。图8B呈现在有或没有处理含TGF-β的EV的情况下MSC迁移的显微图像。图8C显示使用48孔Boyden室的MSC迁移结果。图8D显示使用48孔Boyden室的MSC侵入结果。
图9.对于间充质干细胞迁移和信号传输而言，EV上的TGF-β比游离TGF-β更有效。图9A显示用含TGF-β的EV处理的迁移MSC数量与用相同量的游离TGF-β处理的迁移MSC数量的比较。图9B显示用含TGF-β的EV处理的MSC中SMAD2的磷酸化与用相同量的游离TGF-β处理的比较。
图10.含TGF-β的EV增加活体内间充质干细胞的迁移和治疗潜力。图10A呈现在接受EV处理或未处理的MSC之后，OVA攻击的小鼠模型或对照小鼠的生物发光图像。图10B呈现在接受EV处理或未处理的MSC之后，OVA攻击的小鼠模型或对照小鼠的嗜酸性粒细胞(eosinophil)计数。
图11.通过荧光显微镜揭示的EV运动性。
图12.通过去除囊泡内负荷生成的清空EV的示意图。
图13.通过去除细胞外囊泡的囊泡内负荷生成的清空EV的特征。图13A呈现由PMX110测量的EV和清空EV的尺寸。图13B呈现EV和清空EV中所选蛋白质的蛋白质印迹法结果。图13C显示如通过安捷伦生物分析仪(Agilent Bioanalyzer)测量的EV中的RNA含量。图13D显示如通过安捷伦生物分析仪测量的清空EV中的RNA含量。
图14.用高pH处理的EV配制物的电子显微照片(图14A)或超声处理后重新囊泡化的电子显微照片(图14B)
图15.膜囊泡由培养的细胞通过活性内吞作用过程吸收。图15A呈现与DiO标记的EV孵育后HEK293细胞的FACS分析结果。图15B呈现与DiO标记的膜囊泡孵育后HEK293细胞的FACS分析结果。图15C呈现在37℃下与DiO标记的膜囊泡孵育后HEK293细胞的FACS分析结果。图15D呈现在4℃下与DiO标记的膜囊泡孵育后HEK293细胞的FACS分析结果。
图16.培养的细胞与荧光标记的EV或荧光标记的膜囊泡孵育后的共焦显微镜图像。箭头指示绿色荧光。
图17.用高pH处理的siRNA分子的加载与用PBS处理的比较。siRNA加载到膜囊泡中比加载到EV中更有效。
图18.膜囊泡包含腔内空间中的siRNA负荷。图18A呈现随着培养基中siRNA浓度的增加，加载到膜囊泡中的siRNA的数量的图。图18B显示加载到EV和膜囊泡中的siRNA的数量。图18C显示具有或不具有核糖核酸酶A(RNase A)处理的EV和膜囊泡中的siRNA的数量。
图19.培养的细胞与荧光标记的胆固醇siRNA孵育后的共焦显微镜图像。加载有荧光siRNA负荷的膜囊泡由培养的细胞吸收。箭头指示红色荧光。
图20.分离的细胞器的RNA谱显示RNA含量类似于EV的RNA含量。
缩略语列表
缩略语 含义
PBS 磷酸盐缓冲盐水(Phosphate-buffered saline)
Tris 三(羟甲基)氨基甲烷
EDTA 乙二胺四乙酸
EV 细胞外囊泡
BSA 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin)
CD9 CD9抗原，一种细胞表面糖蛋白
CD63 CD63分子，CD63抗原
CD81 分化簇81
FACL4 脂肪酸-辅酶A连接酶4(Fatty acid-CoA ligase 4)
MTCO2 线粒体编码的细胞色素c氧化酶II
HRP 辣根过氧化物酶
HEPES 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
MES 2-(N-吗啉基)乙磺酸
M 摩尔，毫摩尔/升
mM 毫摩尔的，毫摩尔/升
SDS 十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)
RNA 核糖核酸
DNA 脱氧核糖核酸
TSG101 肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101)
TGF-β 转化生长因子β(transforming growth factor β)
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
TBS 三乙醇胺缓冲盐水
Tween-20 聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯
AF647 Alexa647染料
PE 藻红蛋白
HMC-1 人肥大细胞系-1
Triton X-100 聚氧乙烯辛基苯基醚
SMAD2 母亲针对decapentaplegic同系物2(mothers against
decapentaplegic homolog 2)
DAPI 4',6-二脒基-2-苯基吲哚
qPCR 定量聚合酶链反应
cDNA 互补DNA
EF1 延伸因子1(elongation factor 1)
LY2157299 Gulunisertib
MEM 最小必需培养基(minimum essential medium)
ECM 细胞外基质
OVA 卵清蛋白
NP40 壬基苯氧基聚乙氧基乙醇
16s rRNA 16S核糖体RNA
18s rRNA 18S核糖体RNA
实例
实例1.通过特异性结合技术使用线粒体膜蛋白分离细胞外囊泡亚群
材料和方法：
通过差异超速离心法从人肥大细胞系(HMC-1)中分离细胞外囊泡(EV)。简而言之，细胞在含有10％外泌体清除的胎牛血清的培养基中生长3天。将细胞培养上清液以300×g离心10分钟并以16,500×g离心20分钟以分别去除细胞和较大的囊泡。将上清液以118,000×g进一步超速离心3.5小时以获得外泌体富集的EV。为了获得更高纯度的EV，用OptiPrepTM(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))进行浮力密度梯度。将EV在PBS(1ml)中与60％的碘克沙醇(3ml)混合并置于超速离心管的底部。覆盖0.25M蔗糖、10mM Tris和1mM EDTA中的不连续碘克沙醇梯度(35、30、28、26、24、22、20％；各1ml，但对于22％而言是2ml)，并且最后用约400μl的PBS将管填满。将样品以178,000×g超速离心16小时。将洗脱份2和3的混合物(从顶部)用PBS(至多94ml)稀释并以118,000×g超速离心3.5小时。将粒化EV重新悬浮于PBS中。
首先，通过ELISA确认EV分离株中线粒体膜蛋白的存在。将EV包被在96孔板上在4℃下过夜。然后用PBS中1％BSA将板在室温下封闭1小时，并进一步与针对CD9、CD81、FACL4或MTCO2的抗体在室温下孵育2小时。用PBS洗涤之后，将HRP接合的第二抗体在室温下孵育1小时。将板用PBS洗涤，并且然后通过HRP的比色反应显影。
为了分离含有EV亚群的线粒体蛋白，使用针对线粒体膜蛋白的特异性抗体，如图1中所示。根据制造商的说明书(赛默飞世尔(Thermo Fischer))，将FACL4和MTCO2的抗体偶联至Dynabeads。将抗体偶联的珠粒与EV在室温下孵育2小时。去除未结合的EV并用PBS洗涤两次。将珠粒结合的EV用酸性洗涤缓冲液(10mM HEPES，10mM MES，120mM NaCl，0.5mMMgCl2，0.9mM CaCl2，pH5)洗脱。
结果：
用ELISA检测EV的标志物——CD9和CD81，其由光密度(O.D.)指示。此外，检测到线粒体膜蛋白FACL4和MTCO2(图2)。此结果显示线粒体膜蛋白存在于EV分离株中并且可以检测并用所述抗体分离。
实例2.细胞外囊泡亚群的蛋白质组学分析
材料和方法：
通过LC-MS/MS鉴定含有EV亚群的分离的线粒体蛋白的蛋白质组。简而言之，用2％SDS裂解并声波处理10μg的未分离的囊泡(EV)，即FACL4-分离物(FACL4-EV)和MTCO2-分离的(MTCO2-EV)EV。通过过滤辅助样品制备(Filter Aided Sample Preparation)进行蛋白质的胰蛋白酶消化。用OrbiTrap质谱仪分析消化的肽。生成MS数据的峰值列表，并使用MaxQuant定量工具与Andromeda搜索引擎(版本1.5.2.8)鉴定和定量肽/蛋白质。使用的搜索参数如下：酶特异性，胰蛋白酶；可变修饰，甲硫氨酸的氧化(15.995Da)和半胱氨酸的氨甲酰甲基化(57.021Da)；两个不完全裂解(two missed cleavages)；20ppm的前体离子耐受性和4.5ppm的碎片离子耐受性。智人(Homo sapiens)参考来自Swiss-Prot数据库的蛋白质组(20196个条目)、污染物并且反向序列用于搜索。对于肽和蛋白质鉴定而言，通过累积1％的反向数据库命中来确定1％的错误发现率。为了获得定量数据，应用具有最少两个比率计数的无标记定量(label-free quantification，LFQ)。获得归一化的LFQ强度。可在david.ncifcrf.gov网站(https://david.ncifcrf.gov/)下使用DAVID获得基因本体(GO)分析的生物过程术语。
结果：
总共分别从EV、FACL4-EV和MTCO2-EV鉴定出449、646、839种蛋白质。样品之间的重叠蛋白质呈现在图3A中。此外，囊泡的热图分析显示在图3B中。基于蛋白质的相对定量，将蛋白质分类成5个不同的组。其中，用基因本体进一步分析‘共有’、‘FACL4-EV富集’、‘MTCO2-EV富集’和‘FACL4/MTCO2-EV富集’(图3C)。大多数蛋白质在所有3个囊泡中都是共有的，并且EV和FACL4-EV非常类似。然而，MTCO2-EV与其它2种类型的囊泡不同。重要的是，与未分离的EV相比，含有EV的线粒体蛋白富含代谢过程相关的蛋白质。这些结果指示，EV亚群具有不同的蛋白质负荷，并且因此可以介导不同的生物功能。
与其它2种类型的囊泡相比，鉴定出线粒体蛋白质具有更高的MTCO2-EV丰度(图4A)，并且彼此物理结合(图4B)。重要的是，在MTCO2-EV中发现能量产生机械蛋白，包括ATP合酶的亚基(图4B)。
实例3.细胞外囊泡亚群的ATP合酶活性
材料和方法：
从LC-MS/MS中发现的MTCO2-EV富集的线粒体蛋白中的一种是ATP合酶。根据制造商的说明书，用ATP合酶酶活性微板化验试剂盒(艾博抗(Abcam))测试ATP合酶的活性。使未分离的EV、MTCO2-EV和MTCO2未结合的EV受试于所述测试，并且测量相对活性。
结果：
与未分离的EV的相比，MTCO2-EV具有高约2倍的ATP合酶活性(图5)。此外，MTCO2未结合的EV具有略微降低的ATP合酶活性，尽管这没有统计学意义。此结果表明含有EV亚群的线粒体蛋白富含活性ATP合酶。
实例4.CD63-阳性细胞外囊泡的分离和RNA谱
材料和方法：
CD63是EV的典型标志物。我们使用抗-CD63包被的磁珠来捕获CD63阳性EV子集。将100μg EV与107个磁珠(生命科技(Life-technology)，10606D)以轻轻旋转4度孵育过夜(图6A)。去除珠粒并加入新鲜珠粒。将这些步骤再重复3次。之后，根据制造商的建议，使用Exiqon总植物和动物细胞试剂盒使珠粒上的CD63阳性EV和CD63阴性上清液受试于RNA分离。使用具有纳米芯片的生物分析仪比较RNA尺寸谱。通过测量EV结合的珠粒中CD63荧光信号和来自第一轮和第四轮捕获的RNA测量值的增益来评估结合在CD63珠粒上的EV相关的蛋白或EV相关的RNA信号的增益。
结果：
我们的发现指示，生物分析仪RNA谱显示CD63阳性EV中没有RNA/不可检测的RNA痕量(图6B)。这表明CD63阳性EV子集的存在不含任何可检测的RNA。而CD63阴性EV具有以珠粒未结合的形式存在的大多数RNA核苷酸。
为了进一步证实在珠粒上捕获CD63阳性EV，我们使用流式细胞仪和来自第一轮捕获和第4轮捕获的RNA测量CD63的平均荧光信号。从第1轮与第4轮的CD63和RNA信号之间的比率分别显示～50％和～0.3％的增加(图6C)。总之，此数据指示CD63阳性EV缺乏通常认为是EV的一部分的RNA。
实例5.细胞外囊泡亚群包含TGF-β
材料、方法和结果：
如实例1中所述，通过差异超速离心法从HMC-1中分离EV。在OptiPrepTM梯度之后，获得每个洗脱份。通过蛋白质印迹法和ELISA分别测量囊泡标志物(TSG101和CD81)和TGF-β含量。对于蛋白质印迹法而言，使OptiPrepTM梯度的每个洗脱份受试于SDS-PAGE并转移到硝化纤维素膜上。用含有0.05％Tween-20的TBS中5％BSA将膜封闭，并与第一抗体在4度下孵育过夜。用含有0.05％Tween-20的TBS洗涤之后，HRP在室温下接合第二抗体1小时。使免疫反应带可视化。根据制造商的说明，使用TGFβ1ELISA准备就绪的试剂盒(eBioscience,Affymetrix,Inc)实行囊泡中TGF-β1(总形式和活性形式)的含量。
TSG101和CD81两者均主要在洗脱份2中发现，但也在其它洗脱份中发现(图7A)。此外，大多数TGF-β在具有活性形式的TGF-β的洗脱份2中发现(图7A和7B)。这些结果显示EV隐匿活性TGF-β。
进行EV和TGF-β的共定位、荧光相关光谱测定术。用TGFβ-AF647和CD63-PE标记新鲜分离的EV。将标记的EV从底部加载到OptiPrepTM垫(0、20、30、50％)上并以40,000rpm离心4小时(SW40-Ti转子)，以将其从游离未结合的染料中分离。收集20-30％的脂质标记的囊泡，并在PBS中以120,000×g洗涤3.5小时。使洗涤的球粒受试于定制的配置有显微镜系统的双色荧光相关光谱系统。如图7C中所示，在相同的时间点检测到来自TGF-β和CD63的两个荧光信号，暗示EV在其表面上隐匿TGF-β。
接下来，囊泡上TGF-β的活性通过将其处理至间充质干细胞(MSC)中来检查。MSC生长至70-80％汇合。用PBS洗涤之后，处理来自HMC-1细胞(100μg/ml)的EV。处理后0、5、15和30分钟，通过蛋白质印迹法分析TGF-β的下游信号。重要的TGF-β下游信号分子之一SMAD2用时间依赖性方式磷酸化(图7D)。
总之，EV在其表面上隐匿活性TGF-β。TGF-β可以通过TGF-β类型-1受体和SMAD2诱导细胞间信号传输。
实例6.含TGF-β的细胞外囊泡亚群诱导具有比游离TGF-β高的活性的活体外MSC的迁移
材料、方法和结果：
用EV处理MSC，并用显微镜观察其形态变化(图8A)。处理后细胞更加伸长。MSC在6孔板中生长至70-80％汇合，并用1ml移液管尖端穿过孔中心刮擦单层细胞。用PBS洗涤之后，将具有或不具有来自HMC-1细胞(100μg/ml)的EV的MEM普通培养基加入板中。划痕边界的迁移细胞在24和48小时后成像。与未处理的MSC相比，EV处理的MSC显示出增加的伤口愈合活性(图8B)。
使用48孔Boyden室(Neuroprobe Inc)评估MSC迁移和侵入。将细胞(5000细胞/孔)接种到底部隔室，并且通过具有8μm孔隙的聚碳酸酯膜与上部分离。用来自Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤(西格玛奥德里奇)的0.1％明胶或200μg/ml ECM凝胶预包被所述膜。接种后，通过将腔室组件倒置3.5小时允许细胞粘附在膜上。之后，将腔室放置在正确的方向上，并且将EV加入上部隔室中。在37℃下孵育12小时之后，去除膜，并且将迁移侧上的细胞固定在甲醇中(10分钟)，并且用吉姆萨(Giemsa)(Histolab)染色1小时。将未迁移侧的细胞在成像之前擦除。成像40倍放大率下的三个视野。通过EV处理以剂量依赖性方式显著增加MSC的迁移和侵入(图8C和8D)。与相同量的游离TGF-β相比，如果用EV处理MSC，则此迁移活性更高(图9A)。此外，在EV处理的MSC中SMAD2的磷酸化延长(图9B)。
总体而言，含TGF-β的EV亚群诱导活体外MSC迁移活性，并且如果TGF-β定位于EV中，则此活性更有效。
实例7.含TGF-β的细胞外囊泡亚群增加活体内MSC的迁移和治疗效能
材料和方法：
OVA攻击的肺炎小鼠模型用于评估EV处理的MSC的迁移和治疗潜力。在第1天，对敏化小鼠实行腹膜内(Intra-peritoneal，i.p)注射OVA(8微克/体)。连续三天(14、15和16天)，将小鼠鼻内(intra-nasally，i.n)暴露于100微克/体OVA(OVA/OVA组)或具有PBS(OVA/PBS)中。在第17天，来自每组的后致敏小鼠接受0.5百万个MSC(表达组成型荧光素酶和绿色荧光蛋白)，其与EV孵育或不孵育48小时。10分钟、30分钟和60分钟后，用IVIS光谱(CaliperLife Sciences)获取小鼠全身的生物发光(光子/秒/平方厘米)。三天后，牺牲小鼠并计数支气管肺泡灌洗(BAL)液中的嗜酸性粒细胞。
结果：
在10分钟、30分钟和60分钟时，与OVA/OVA组中的未处理的MSC相比，在EV处理的MSC中MSC向发炎肺组织的迁移更高(图10A)。然而，在OVA/PBS组中EV处理的和未处理的MSC之间没有差异。注射3天后，通过计数BAL液中嗜酸性粒细胞来评估MSC的治疗活性。与注射未处理的MSC的小鼠相比，注射EV处理的MSC的小鼠在OVA/OVA组中显示较低的嗜酸性粒细胞数量(图10B)。这些结果表明含TGF-β的EV增加MSC向发炎组织的迁移活性，从而增强MSC的治疗效能。
实例8.细胞外囊泡亚群的运动性
材料和方法：
将EV以16,500×g向下粒化，重新悬浮并在PBS中进一步稀释。然后将100μl体积置于玻璃底培养皿(35mm佩特里培养皿，14mm微孔，1.0号盖玻片(1.13-1.16mm)，MatTekCorporation)的中心并在室温下沉淀15分钟。然后用PBS轻轻洗涤玻璃底皿三次。将1:1000PKH67染料稀释在稀释剂C(西格玛奥德里奇)中以500μl的体积加入玻璃底皿的中心，并且在室温下孵育5分钟。然后再次用PBS轻轻洗涤所述皿三次，此后立即在显微镜(AxioObserver.Z1，蔡司(Zeiss))下评估样品。历经8分钟的时间段，以30秒间隔获取延时照片，以监测样品中囊泡的运动性。
结果：
用绿色荧光信号使用PKH67染料标记的EV可视化并历经一段时间改变所述EV的形态(图11)。此结果指示EV亚群具有运动活性。
实例9.通过去除细胞外囊泡的囊泡内负荷生成清空的EV
材料和方法：
图12中显示生成治疗性膜囊泡的示意图。将来自HMC-1细胞的EV与高pH溶液(200mM碳酸钠，在pH 11下)在室温下孵育2小时。为了仅收集膜，进行OptiPrepTM密度梯度。将样品与60％OptiPrepTM混合以制作45％OptiPrepTM。将混合的45％OptiPrepTM置于底部，并且用10和30％OptiPrepTM覆盖。将样品以100,000×g超速离心2小时。从10和30％OptiPrep的界面获得膜。通过超声处理使分离的膜重新囊泡化。
结果：
使用PMX110(颗粒基质)测量的EV和清空EV的尺寸相似，并且分别显示124和122nm处的中值粒径(图13A)。通过蛋白质印迹法和生物分析仪分别分析囊泡内负荷、蛋白质和RNA。清空的EV具有减少的囊泡内蛋白质、β-肌动蛋白和TSG101，但仍含有膜蛋白CD81(图13B)。此外，EV含有丰富的RNA(图13C)，但是如通过安捷伦生物分析仪测量的，EV几乎不含RNA(图13D)。另外，电子显微镜证实在高pH处理后收集的EV膜不形成囊泡(图14A)，而通过超声处理处理和重新囊泡化的EV容易形成具有典型外泌体特征的囊泡(图14B)。从这些结果中，我们可以得出结论，没有囊泡内负荷的EV膜可以通过高pH处理来获得并且可以重新组装。
实例10.重新囊泡化膜囊泡的细胞摄取
材料和方法：
将来自HEK293T细胞的EV与高pH溶液(200mM碳酸钠(当量)，在pH 11下)在室温下孵育2小时。为了标记膜，加入亲脂性染料DiO(5μM)并在室温下孵育1小时。随后将样品与60％(重量/体积)碘克沙醇混合以获得含有45％(重量/体积)碘克沙醇的样品溶液。将样品溶液置于离心管底部，并且在样品溶液顶部加入10％(重量/体积)碘克沙醇溶液，接着加入30％(重量/体积)碘克沙醇溶液，以形成密度梯度。随后将所述管与其内含物以100,000×g超速离心2小时，以从10％(重量/体积)与30％(重量/体积)碘克沙醇层之间的界面获得膜。使分离的膜受试于超声处理以重新组装膜囊泡。同时，将来自HEK293T细胞的EV与DiO(5μM)孵育，并且通过如上所述的碘克沙醇密度梯度纯化，但不进行高pH处理。通过仪器测量膜囊泡和EV的数量。
对于FACS分析而言，将HEK293T细胞(1×105个细胞)接种在24孔板上并孵育过夜。将不同数目的DiO标记的膜囊泡或EV与细胞在37或4℃下孵育1小时。用PBS洗涤细胞一次，胰蛋白酶化，并且然后在室温下通过4％多聚甲醛固定10分钟。通过FACS分析细胞中的DiO信号。
对于共焦显微镜而言，将HEK293T细胞(1×105个细胞)接种在24孔板上的玻璃盖玻片上并孵育过夜。将DiO标记的膜囊泡(1×108/ml)或EV(1×108/ml)在37℃下孵育不同的时间点(3、6、12、24小时)。将细胞用CellMask深红色质膜染色染料在37℃下染色10分钟。用PBS洗涤细胞一次，并且在室温下通过4％多聚甲醛固定10分钟。用具有DAPI的钻石抗衰减封固剂将玻璃盖玻片安装在载玻片上。通过共焦显微镜观察荧光。
结果：
FACS数据显示，孵育1小时后，EV和膜囊泡两者均由受体HEK293T细胞有效地吸收。与EV相比，膜囊泡显示出更高的荧光信号(图15A-B)。4℃孵育完全消除这种摄取，这表明摄取与活性内吞作用机制有关(图15C-D)。
共焦数据显示，膜囊泡和EV均由HEK293T细胞摄取，但膜囊泡的摄取比EV快(图16)。
实例11.将胆固醇-siRNA加载到膜囊泡中
材料和方法：
将来自HEK293细胞的EV稀释至1×1012/ml，并且在室温下在PBS或0.1M碳酸氢钠pH11中孵育两小时。将制剂在4℃下以100,000×g粒化15分钟，并且将得到的球粒洗涤一次并重新悬浮于PBS中。将两种制剂与范围为0.5μM至5μM的增加量的Alexa 647-标记的siRNA靶向荧光素酶孵育。对于悬浮于PBS中的EV而言，将制剂在37℃下以450RPM混合1小时。然后将每个样品以100,000×g旋转15分钟以使EV粒化，去除上清液，并将球粒重新悬浮于PBS中。对于在ph11下处理的EV而言，将制剂超声处理30分钟，并且如上文实例10中所述在碘克沙醇梯度上纯化。将所有样品均重新悬浮于PBS中并等分在96孔板中，分析其总荧光信号(647nm处激发，675nm处发射)并相对于Alexa 647标准曲线作图。
结果：
如图17中所示，两种EV均重新悬浮于PBS中，并且在pH11下处理的EV以剂量依赖性方式结合荧光siRNA。在测量的所有浓度下，在pH 11下处理的EV具有比PBS中EV更高的荧光信号。在使用的最高siRNA浓度(5μM)下，与PBS囊泡的每个囊泡含有约800个siRNA分子相比，pH11囊泡的每个囊泡含有约1,100个siRNA分子。这些结果指示，处理具有高pH的EV允许比未改性的EV更高的加载效率。
实例12.高pH处理的膜囊泡中的siRNA的腔内保护
材料和方法：
将来自HEK293T细胞的EV与高pH溶液(200mM碳酸钠(当量)，在pH 11下)在室温下孵育2小时。加入不同浓度(0、0.6、2、6、20、60μM)的针对cMyc的Cy3标记的胆固醇-siRNA，并且在37℃下孵育1小时。通过如上所述的碘克沙醇密度梯度分离膜。使分离的膜受试于超声处理以重新组装膜囊泡。通过仪器测量膜囊泡的数量。使用通过拟合到荧光强度标准曲线来计算膜囊泡上的siRNA的数量，所述荧光强度标准曲线通过Varioscan仪器在650nm/670nm的激发/发射下测量。
将来自HEK293T细胞的EV与Cy3标记的胆固醇-siRNA(60μM)在37℃下孵育1小时，并且通过如上所述的碘克沙醇梯度纯化。用如上述相同的方法计算siRNA的数量。
将加载有Cy3标记的胆固醇-siRNA(60μM)的膜囊泡和EV与核糖核糖核酸酶A(10μg/ml)在37℃下孵育20分钟，并且然后通过碘克沙醇密度梯度进一步分离。测量剩余的荧光强度并计算siRNA的数量。
结果：
膜囊泡的加载高度依赖于siRNA浓度。如图18A中所示，当膜囊泡以60μM的最高浓度使用时，每个膜囊泡的siRNA分子的平均数量达到～10,000之高。在此浓度下，膜囊泡比EV更有效地加载siRNA(图18B)。重要的是，在核糖核酸酶A处理之后，去除与EV相关的显著量的siRNA信号，而在核糖核酸酶A处理之后，来自膜囊泡的siRNA信号更适度地降低(图18C)。这些结果表明，膜囊泡将siRNA并入囊泡表面上以及囊泡的腔内，而EV仅将siRNA并入其外表面上。此方法证明膜囊泡可以比EV更有效地加载大分子负荷。
实例13.摄取胆固醇-siRNA加载的膜囊泡
材料和方法：
如上文实例12中所述，膜囊泡加载有Cy3标记的胆固醇-siRNA(60μM)。将HEK293T细胞(1×105个细胞)接种在24孔板上的玻璃盖玻片上并孵育过夜。将加载有siRNA(5×108/ml)的膜囊泡在37℃下孵育不同的持续时间(3、6、12、24小时)。用PBS洗涤细胞一次，并且在室温下通过4％多聚甲醛固定10分钟。用具有DAPI的钻石抗衰减封固剂将玻璃盖玻片安装在载玻片上。在共焦显微镜上观察到荧光。
结果：
在处理后3小时和6小时时，观察到受体细胞的细胞质中的荧光信号最强烈，但在12和24小时时降低(图19)。如上文实例10中所述，荧光siRNA摄取信号的动力学类似于膜囊泡的摄取。此结果指示，加载有siRNA的膜囊泡被有效地递送至受体细胞的细胞质。
实例14.从细胞中分离细胞器
材料和方法：
从HMC-1细胞中制作粗制细胞器制剂。简而言之，用PBS洗涤细胞，并且在冰冷的缓冲液-I(150mM NaCl，50mM HEPES pH 7.4和25μg/ml Digitonin)中在冰中悬浮20分钟，并且然后以2,000×g离心以使细胞粒化。将此球粒与缓冲液-II(150mM NaCl，50mM HEPES pH7.4和1％NP40)在冰中孵育40分钟，并且以7,000×g离心以使核和细胞碎片粒化。含有粗制膜结合的细胞器的上清液富含内质网(Endoplasmic reticulum，ER)、高尔基体、线粒体和一些核腔蛋白。将此馏分与60％碘克沙醇混合并加载到不同百分比的OptiPrepTM以下以形成密度梯度(0、20、22、24、26、28、30、35和50％)，并且以178,000×g超速离心16小时。收集十个洗脱份(顶部到底部)，并且使用Exiqon总植物和动物细胞试剂盒(Exiqon)受试于RNA分离。通过生物分析仪谱确定RNA痕量沿各种浮动密度的分布。
结果：
如图20中所示，梯度中RNA的分布非常宽，并且沿梯度发现RNA痕量。有趣的是，长RNA(16s和18s rRNA)序列富集于低密度洗脱份中，但短RNA延伸高度富集于高密度洗脱份中。粗制细胞器的总体分布类似于从EV制剂中看到的RNA谱。这种基于RNA的分布数据显示，细胞器有助于混合EV群中的EV子集。

Claims (48)

1.一种产生膜囊泡的方法，其包含：
a.提供细胞外囊泡或细胞器；
b.通过用pH在9至14范围内的水性溶液处理来打开所述细胞外囊泡或所述细胞器以获得膜；
c.去除囊泡内或细胞器内含物；和
d.重新组装所述膜以形成膜囊泡。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d是通过超声处理、机械振动、通过多孔膜挤出、电流和其组合中的一种或多种来完成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包含：
e.将负荷加载到所述膜囊泡中，其中步骤e可以伴随步骤d或在步骤d之后来进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤e是在步骤d之后通过物理操作来完成，其中所述物理操作选自电穿孔、超声处理、机械振动、通过多孔膜挤出、施加电流和其组合。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述负荷选自合成生物活性化合物、天然生物活性化合物、抗菌化合物、抗病毒化合物、蛋白质、核苷酸、基因组编辑系统、微小RNA、siRNA、长链非编码RNA、反义寡核苷酸、吗啉基、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模拟物、DNA和其组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述负荷是TGF-β。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述基因组编辑系统是CRISPR系统。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述CRISPR系统是CRISPR-Cas9系统。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述微小RNA或所述siRNA特异性地结合到编码突变型或非突变型致癌基因的转录物中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述致癌基因是KRAS G12D、KRAS G12C、KRASG12V、N-Myc、c-Myc或L-Myc。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述膜囊泡具有至少一种不同于衍生所述膜囊泡的细胞外囊泡或细胞器群的生理特性，其中所述生理特性与以下各项中的一种或多种相关：生物分布、细胞摄取、半衰期、药效动力学、效力、剂量、免疫应答、加载效率、稳定性或对其它化合物的反应性。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述不同的生理特性是改善的靶向效率，改善的递送，或对受体细胞、器官或受试者的治疗性负荷的增加。
13.根据权利要求3至12中任一项所述的方法，其中相比于将所述负荷加载到衍生所述膜囊泡的细胞外囊泡或细胞器中，所述负荷更有效地加载到所述膜囊泡中。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡是衍生自细胞外囊泡体的细胞外囊泡亚群，或其中所述细胞器是衍生自多个细胞器的一种细胞器亚型。
15.根据权利要求14所述的方法，其在步骤a之前进一步包含：
使表位特异性结合物与所述细胞外囊泡体或所述细胞器接触；并且从所述细胞外囊泡体或多个细胞器中分离所述细胞外囊泡亚群或亚细胞器亚型。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述表位特异性结合物是抗体、噬菌体或适体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述表位特异性结合物是针对至少一种线粒体膜蛋白、优选地MTCO2蛋白的抗体。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述表位特异性结合物是针对表面标记物CD63的抗体。
19.一种治疗性膜囊泡，其包含：
由膜形成的囊泡，所述膜衍生自细胞外囊泡或细胞器。
20.根据权利要求19所述的治疗性膜囊泡，其中所述膜囊泡加载有治疗性负荷。
21.根据权利要求20所述的治疗性膜囊泡，其中所述治疗性负荷包含选自以下各项的一种或多种治疗性化合物：合成生物活性化合物、天然生物活性化合物、抗菌化合物、抗病毒化合物、蛋白质、核苷酸、基因组编辑系统、微小RNA、siRNA、长链非编码RNA、反义寡核苷酸、吗啉基、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模拟物、DNA和其组合。
22.根据权利要求20或21所述的治疗性膜囊泡，其中所述治疗性负荷包含催化ATP产生的酶。
23.根据权利要求22所述的治疗性膜囊泡，其中所述酶是ATP合酶。
24.根据权利要求20或21所述的治疗性膜囊泡，其中所述治疗性负荷包含具有影响间充质干细胞的表型和/或功能，如增加所述间充质干细胞的迁移或消炎功能的能力的化合物。
25.根据权利要求20或21所述的治疗膜性囊泡，其中所述治疗性负荷包含与消炎功能相关的化合物，或与促炎功能相关的化合物。
26.根据权利要求24或25所述的治疗性膜囊泡，其中所述治疗性负荷是TGF-β。
27.根据权利要求20或21所述的治疗膜性囊泡，其中所述治疗性负荷包含基因组编辑系统。
28.根据权利要求27所述的治疗性膜囊泡，其中所述基因组编辑系统是CRISPR系统。
29.根据权利要求28所述的治疗性膜囊泡，其中所述CRISPR系统是CRISPR-Cas9系统。
30.根据权利要求20至29中任一项所述的治疗性膜囊泡，其中相比于将所述负荷加载到衍生所述膜囊泡的细胞外囊泡或细胞器中，所述负荷更有效地加载到所述膜囊泡中。
31.根据权利要求19至30中任一项所述的治疗性膜囊泡，其中所述细胞外囊泡是细胞外囊泡体亚群，其具有与所述细胞外囊泡体不同的膜和表面分子子集，或其中所述细胞器是一种细胞器体亚型，其具有与所述细胞器体不同的膜和表面分子子集。
32.根据权利要求31所述的治疗性膜囊泡，其中所述膜囊泡通过以下中的至少一项来表征：
i.表面膜分子经倒置；
ii.至少一种类型的具有影响间充质干细胞的表型和功能的能力，使得所述间充质干细胞的所述消炎功能增加的表面分子；
iii.存在或不存在至少一种类型的与细胞外囊泡共有的表面标志物；
iv存在至少一种类型的线粒体膜表面分子；
v.存在至少一种类型的核膜表面分子；和
vi.存在至少一种类型的高尔基体和/或内质网的膜分子。
33.根据权利要求19至32中任一项所述的治疗性膜囊泡，其中所述治疗性膜囊泡具有通过组织迁移的能力。
34.根据权利要求19至33中任一项所述的治疗性膜囊泡，其中与衍生所述膜囊泡的所述细胞外囊泡或细胞器相比，所述膜囊泡具有增加的运动性。
35.根据权利要求19至34中任一项所述的治疗膜性囊泡，其中所述细胞外囊泡或细胞器源自癌细胞、癌细胞系、炎性细胞、结构细胞、神经/神经胶质细胞/少突胶质细胞或间充质/胚胎干细胞。
36.根据权利要求19至35中任一项所述的治疗性膜囊泡，其中所述细胞外囊泡或细胞器已经从正常或患病组织中分离，包括从血液、淋巴结或脾中分离的肿瘤、骨髓或免疫细胞。
37.根据权利要求19至36中任一项所述的治疗性膜囊泡，其中所述膜囊泡可通过如权利要求1至18中任一项所定义的方法获得。
38.根据权利要求19至37中任一项所述的治疗性膜囊泡，其用于治疗。
39.根据权利要求19至38中任一项所述的治疗性膜囊泡，其用于治疗代谢紊乱。
40.一种治疗代谢紊乱的方法，其包含向有需要的患者施用根据权利要求19至39中任一项所述的治疗性膜囊泡。
41.一种根据权利要求20至40中任一项所述的治疗性膜囊泡的用途，其用于靶向递送所述治疗性负荷。
42.一种从细胞外囊泡体中分离细胞外囊泡亚群的方法，其包含：
使表位特异性结合物与所述细胞外囊泡体接触；并且从细胞外囊泡体中分离所述细胞外囊泡亚群。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述表位特异性结合物是抗体、噬菌体或适体。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述表位特异性结合物是针对至少一种线粒体膜蛋白、优选地MTCO2蛋白的抗体。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述表位特异性结合物是针对CD63的抗体。
46.根据权利要求45所述的方法，其中与所述细胞外囊泡体相比，所述细胞外囊泡亚群具有减少的RNA含量。
47.一种根据权利要求42至46中任一项产生的细胞外囊泡亚群，其用于治疗。
48.一种根据权利要求42至46中任一项产生的细胞外囊泡亚群，其用于治疗代谢紊乱。
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