JP2022513040A - コンパートメント特異的カーゴ送達のための組成物および方法 - Google Patents

コンパートメント特異的カーゴ送達のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

フソソーム組成物および方法が、本明細書に記載されている。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月１４日に出願された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＯＭＰＡＲＴＭＥＮＴ－ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＣＡＲＧＯ ＤＥＬＩＶＥＲＹ」と題された米国仮出願第６２／７６７，３９４号の優先権を主張し、その内容は全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
配列表の参照による組込み
本出願は、電子形式の配列表と共に提出されている。配列表は、２０１９年１１月１４日に作成された１８６１５２００２６４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴと題されたファイルとして提供され、サイズは８０７キロバイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により組み込まれる。
細胞間融合は、受精、発達、免疫応答、および腫瘍形成などの多様な生物学的プロセスで必要とさf
本開示は、フソソームおよび膜タンパク質を標的細胞に送達するためのそれらの使用に関連する技術を提供する。幾つかの実施形態では、フソソームは、脂質二重層、脂質二重層に囲まれた内腔、フソゲン、および膜タンパク質ペイロード剤を含むカーゴを含む。幾つかの実施形態では、そのようなカーゴは、膜タンパク質をコードする（もしくはコードする核酸に相補的である）核酸であり得るか、またはそれを含み得る。
実施形態の列挙
膜送達
１．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する）であって、
ｉ）キメラ抗原受容体、
ｉｉ）例えば、表７から選択されるインテグリン膜タンパク質ペイロード、
ｉｉｉ）表８から選択されるイオンチャネルタンパク質、
ｉｖ）例えば、表９および１０から選択される孔形成タンパク質、
ｖ）例えば、表１１から選択されるＴｏｌｌ様受容体、
ｖｉ）例えば、表１２から選択されるインターロイキン受容体ペイロード、
ｖｉｉ）表１３～１４から選択される細胞接着タンパク質、
ｖｉｉｉ）表１７から選択される輸送タンパク質、
ｉｘ）天然に存在する膜タンパク質に対して異種であるシグナル配列、もしくは
ｘ）表６に列挙されているシグナル配列のうちの１つ以上を含むか、またはコードする膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
２．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）Ｔ細胞受容体を含むか、またはコードする膜タンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する）と、を含み、
任意に、フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
３．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する膜タンパク質ペイロード剤と、
を含み、
ｉ）フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれに含まれる、
ｉｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、例えば、フソソームあたり少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、例えば、フソソームあたり少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で治療薬を含む、
ｉｖ）フソソームが、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの７５％以内である脂質を含む、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも１０％多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取込みが可能である、
ｖｉｉ）フソソームが、被験体、例えばマウスに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば実施例８７または１００のアッセイにより、例えば投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％または１０％が、２４時間後に標的組織内に存在する、あるいは
ｖｉｉｉ）ソース細胞が、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、のうちの１つ以上である、フソソーム。
４．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤であって、
ｉ）膜タンパク質をコードするＤＮＡを含む、または
ｉｉ）ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現する膜タンパク質をコードするＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含む、膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
５．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）哺乳動物のフソゲンが、アルツハイマー病のβアミロイドペプチドまたはフェルチリンではない、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する非ウイルス性、例えば、哺乳動物のフソゲンと、
（ｄ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
任意に、フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
６．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
フソソームが、除核細胞を含み、
任意に、フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
ｉ）フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれに含まれる、
ｉｉ）フソソームが、除核細胞を含む、
ｉｉｉ）フソソームが、不活化核を含む、
ｉｖ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い割合で融合する、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的フソソームとよりも標的細胞と、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い割合で融合する、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の膜タンパク質ペイロード剤が、２４、４８、または７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
ｖｉｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、
ｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で膜タンパク質ペイロード剤を含む、
ｉｘ）フソゲンのコピー数と膜タンパク質ペイロード剤のコピー数との比が、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００の間である、
ｘ）フソソームが、ソース細胞のそれと実質的に同様の脂質組成物を含むか、またはＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％以内である、
ｘｉ）フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
ｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質とタンパク質との比率を含む、
ｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるタンパク質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を含む、
ｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を含む、
ｘｖ）フソソームが、被験体、例えば、マウスにおいて、例えば、実施例７５のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の半減期を有する、
ｘｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く、グルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を膜を横切って輸送する、
ｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
ｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性（例えば、クエン酸合成酵素活性）の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の代謝活性（例えば、クエン酸合成酵素活性）レベルを含む、
ｘｉｘ）フソソームが、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベル（例えば、酸素消費率）の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の呼吸レベル（例えば、酸素消費率）を含む、
ｘｘ）フソソームが、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含む、
ｘｘｉ）フソソームが、例えば、実施例３９のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ含有量レベルを有する、
ｘｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４７のアッセイにより、ソース細胞のそれの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内、もしくはそれ以上、または例えば、ソース細胞のそれの１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、もしくは８０％～９０％以内である可溶性：不溶性タンパク質の比率を有する、
ｘｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４８に記載されるような質量分析によって測定した場合、ソース細胞のＬＰＳ含有量の５％、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％、またはそれ以下のＬＰＳレベルを有する、
ｘｘｉｖ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取込みが可能である、
ｘｘｖ）フソソームが、被験体、例えば哺乳動物、例えば、実験用哺乳動物（例えば、マウス）、飼育動物（例えば、ペットもしくは家畜）、またはヒトに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば、実施例８７または１００のアッセイにより、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、２４、４８、または７２時間後に標的組織内に存在する、
ｘｘｖｉ）フソソームが、例えば、実施例７１のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７２のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７３のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内のレベルでアクチンを重合する、
ｘｘｉｘ）フソソームが、例えば、実施例７４のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約－２０～－１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ、もしくは－１００～－１５０ｍＶの膜電位を有する、
ｘｘｘ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例５７のアッセイを使用して、例えば、ソース細胞の血管外漏出の速度の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の速度で、血管からの血管外漏出が可能であり、ソース細胞が、好中球、リンパ球、Ｂ細胞、マクロファージ、またはＮＫ細胞である、
ｘｘｘｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、細胞膜、例えば、内皮細胞膜または血液脳関門を通過することができる、
ｘｘｘｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞またはソース細胞よりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％大きい割合でタンパク質を分泌することができる、
ｘｘｘｉｉｉ）フソソームが、医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）基準を満たしている、
ｘｘｘｉｖ）フソソームが、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｘｘｘｖ）本明細書に記載の複数のフソソームを含む医薬製剤が、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、
ｘｘｘｖｉ）本明細書に記載の複数のフソソームを含む医薬製剤が、所定の参照値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、汚染物質を実質的に含まない、
ｘｘｘｖｉｉ）本明細書に記載の複数のフソソームを含む医薬製剤が、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
ｘｘｘｖｉｉｉ）ソース細胞が、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、あるいは
ｘｘｘｉｘ）ソース細胞が、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または幹細胞以外のものである、のうちの１つ以上である、フソソーム。
８．フソソームであって、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤、例えば、ソース細胞に対して外因性の膜タンパク質と、を含み、
フソソームが、ソース細胞に由来し、
フソソームが、部分的または完全な核不活化を有する（例えば、ソース細胞に見られるような無傷の核を欠く、核の除去／除核、機能しない核等）、フソソーム。
９．フソソームであって、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）標的細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている（例えば、フソゲンが、ソース細胞に対して内因性または外因性である）フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する）であって、
ｉ）キメラ抗原受容体を含むか、またはコードする、
ｉｉ）例えば、表７から選択されるインテグリン膜タンパク質ペイロードを含むか、またはコードする、
ｉｉｉ）表８から選択されるイオンチャネルタンパク質を含むか、またはコードする、
ｉｖ）例えば、表９および１０から選択される孔形成タンパク質を含むか、またはコードする、
ｖ）例えば、表１１から選択されるＴｏｌｌ様受容体を含むか、またはコードする、
ｖｉ）例えば、表１２から選択されるインターロイキン受容体ペイロードを含むか、またはコードする、
ｖｉｉ）表１３～１４から選択される細胞接着タンパク質を含むか、またはコードする、
ｖｉｉｉ）表１７から選択される輸送タンパク質を含むか、またはコードする、
ｉｘ）天然に存在する膜タンパク質に対して異種であるシグナル配列を含むか、またはコードする、
ｘ）表６に列挙されているシグナル配列を含むか、またはコードする、膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
フソソームが、ウイルスカプシドまたはウイルスエンベロープタンパク質を含まない、フソソーム。
１０．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する）であって、
ｉ）脂質アンカータンパク質、
ｉｉ）膜貫通タンパク質に結合する細胞外タンパク質、
ｉｉｉ）膜貫通ドメインを欠く細胞外タンパク質、
ｉｖ）膜に部分的に及ぶタンパク質（例えば、標的細胞もしくはフソソームの膜）、および膜に完全には及ばないタンパク質（例えば、タンパク質が、面内膜ヘリックスを含むか、もしくはタンパク質が、膜に完全には及ばない疎水性ループを含む）のうちの１つ以上を含むか、または
ｖ）タンパク質が、膜貫通ドメインを含まず、タンパク質が、例えば、静電相互作用もしくはイオン相互作用を介して、膜表面と相互作用する、膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
フソソームが、ウイルス構造タンパク質、例えば、ウイルスカプシドタンパク質またはウイルスエンベロープタンパク質を含まない、フソソーム。
１１．フソソームであって、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるフソゲンまたは過剰発現したフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤と、
（ｅ）機能核と、を含み、
フソソームが、ソース細胞に由来する、フソソーム。
１２．複数のフソソームが、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下で標的細胞集団と接触した場合、およびエンドサイトーシスの阻害剤で処理されていない参照標的細胞集団と接触した場合、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団中の細胞数の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％にカーゴを送達する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１３．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
（ｉ）複数のフソソームが標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触する場合、カーゴが、標的細胞において非標的細胞よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、もしくは１００倍多く存在する、または
（ｉｉ）複数のフソソームが、非標的細胞よりも標的細胞と少なくとも５０％高い割合で融合する、フソソーム。
１４．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、または
ｉｉ）フソゲンのコピー数と膜タンパク質ペイロード剤のコピー数との比が、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００の間である、フソソーム。
１５．フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数で膜タンパク質ペイロード剤を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１６．膜タンパク質ペイロード剤が、フソソーム脂質二重層内に配置された膜タンパク質である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１７．膜タンパク質ペイロード剤が、膜タンパク質をコードする、フソソーム内腔に配置された核酸である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１８．核酸が、ＲＮＡであるか、またはそれを含む、実施形態１７に記載のフソソーム。
１９．ＲＮＡが、ｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡであるか、またはそれを含む、実施形態１８に記載のフソソーム。
２０．核酸が、ＤＮＡであるか、またはそれを含む、実施形態１７に記載のフソソーム。
２１．ＤＮＡが、ｇＤＮＡもしくはｃＤＮＡであるか、またはそれを含む、実施形態２０に記載のフソソーム。
２２．核酸が、１つ以上のシグナル配列をコードする１つ以上の配列を更に含み、例えば、標的細胞が、シグナル配列を含むタンパク質を標的細胞の細胞膜に転位させる、実施形態１７～２１のいずれかに記載のフソソーム。
２３．１つ以上のシグナル配列が、表６から選択される配列であるか、またはそれを含む、実施形態２２に記載のフソソーム。
２４．核酸が、標的細胞による膜タンパク質をコードする配列の発現を指示する１つ以上の調節エレメントを含む、実施形態１７～２３のいずれかに記載のフソソーム。
２５．膜タンパク質ペイロード剤が、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４～１６１３１の配列であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２６．膜タンパク質ペイロード剤が、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４～１６１３１の配列のフラグメント、バリアント、もしくはホモログであるか、またはそれを含む、実施形態１～２４のいずれかに記載のフソソーム。
２７．膜タンパク質ペイロード剤が、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４～１６１３１の配列を含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、実施形態１～２４のいずれかに記載のフソソーム。
２８．膜タンパク質ペイロード剤が、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４～１６１３１の配列のフラグメント、バリアント、もしくはホモログを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、実施形態１～２４のいずれかに記載のフソソーム。
２９．膜タンパク質ペイロード剤が、表７～１７から選択されるタンパク質であるか、またはそれを含む、実施形態１～２４のいずれかに記載のフソソーム。
３０．膜タンパク質ペイロード剤が、表７～１７から選択されるタンパク質のフラグメント、バリアント、もしくはホモログであるか、またはそれを含む、実施形態１～２４のいずれかに記載のフソソーム。
３１．膜タンパク質ペイロード剤が、表７～１７から選択されるタンパク質であるか、またはそれを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、実施形態１～２４のいずれかに記載のフソソーム。
３２．膜タンパク質ペイロード剤が、表７～１７から選択されるタンパク質のフラグメント、バリアント、もしくはホモログを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、実施形態１～２４のいずれかに記載のフソソーム。
３３．膜タンパク質ペイロード剤が、抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であるか、またはそれを含む、実施形態１～２４のいずれかに記載のフソソーム。
３４．ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む第一世代のＣＡＲであるか、またはそれを含む、実施形態３３に記載のフソソーム。
３５．ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および２つのシグナル伝達ドメインを含む第二世代のＣＡＲであるか、またはそれを含む、実施形態３３に記載のフソソーム。
３６．ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む第三世代のＣＡＲであるか、またはそれを含む、実施形態３３に記載のフソソーム。
３７．ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、およびＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む第四世代のＣＡＲであるか、またはそれを含む、実施形態３３に記載のフソソーム。
３８．抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖもしくはＦａｂであるか、またはそれを含む、実施形態３３～３７のいずれかに記載のフソソーム。
３９．抗原結合ドメインが、新生物細胞に特徴的な抗原を標的とする、実施形態３３～３８のいずれかに記載のフソソーム。
４０．新生物細胞に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８、およびＦＧＦ２１を含む）血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、およびＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体およびＥｐｈ受容体ファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、およびＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ－１、ＣＩＣ－２、ＣＩＣ－４、ＣＩＣ－５、ＣＩＣ－７、ＣＩＣ－Ｋａ、ＣＩＣ－Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣトランスポーター、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン－１－リン酸受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通タンパク質、マルチスパン膜貫通タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ；Ｔ細胞α鎖；Ｔ細胞β鎖；Ｔ細胞γ鎖；Ｔ細胞δ鎖；ＣＣＲ７；ＣＤ３；ＣＤ４；ＣＤ５；ＣＤ７；ＣＤ８；ＣＤ１１ｂ；ＣＤ１１ｃ；ＣＤ１６；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２１；ＣＤ２２；ＣＤ２５；ＣＤ２８；ＣＤ３４；ＣＤ３５；ＣＤ４０；ＣＤ４５ＲＡ；ＣＤ４５ＲＯ；ＣＤ５２；ＣＤ５６；ＣＤ６２Ｌ；ＣＤ６８；ＣＤ８０；ＣＤ９５；ＣＤ１１７；ＣＤ１２７；ＣＤ１３３；ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）；ＣＤ１６３；Ｆ４／８０；ＩＬ－４Ｒａ；Ｓｃａ－１；ＣＴＬＡ－４；ＧＩＴＲ；ＧＡＲＰ；ＬＡＰ；グランザイムＢ；ＬＦＡ－１；トランスフェリン受容体；ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋；Ｔｈ１；Ｔｈ２；Ｔｈ１７；Ｔｈ４０；Ｔｈ２２；Ｔｈ９；Ｔｆｈ、古典的Ｔｒｅｇ．ＦｏｘＰ３＋；Ｔｒ１；Ｔｈ３；Ｔｒｅｇ１７；ＴＲＥＧ；ＣＤＣＰ１、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、炭酸アンヒドラーゼＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２）、Ｌｅｗｉｓ－γ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ－ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ－１、ＢＡＦＦ、ＨＤＡＣ、ＡＢＬ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ－１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、またはＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体α（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ－１３Ｒａ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３Ｒα１、Ｌ１－ＣＡＭ、ＴｎＡｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン－１１受容体ａ（ＩＬ－１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、テロメラーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰＩＢＩ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、新生抗原、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ、あるいはそれらの抗原性フラグメントまたは抗原性部分から選択される、実施形態３９に記載のフソソーム。
４１．抗原結合ドメインが、Ｔ細胞に特徴的な抗原を標的とする、実施形態３３～３８のいずれかに記載のフソソーム。
４２．Ｔ細胞に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、膜輸送タンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質、孔形成タンパク質などの能動もしくは受動輸送タンパク質）、膜貫通受容体、膜酵素、および／またはＴ細胞に特徴的な細胞接着タンパク質から選択される、実施形態４１に記載のフソソーム。幾つかの実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、ＡＫＴ１；ＡＫＴ２；ＡＫＴ３；ＡＴＦ２；ＢＣＬ１０；ＣＡＬＭ１；ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３δ）；ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３ε）；ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３γ）；ＣＤ４；ＣＤ８；ＣＤ２８；ＣＤ４５；ＣＤ８０（Ｂ７－１）；ＣＤ８６（Ｂ７－２）；ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）；ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）；ＥＬＫ１；ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）；ＥＲＫ２；ＦＯＳ；ＦＹＮ；ＧＲＡＰ２（ＧＡＤＳ）；ＧＲＢ２；ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＨＬＡ－ＤＲＢ１；ＨＬＡ－ＤＲＢ３；ＨＬＡ－ＤＲＢ４；ＨＬＡ－ＤＲＢ５；ＨＲＡＳ；ＩＫＢＫＡ（ＣＨＵＫ）；ＩＫＢＫＢ；ＩＫＢＫＥ；ＩＫＢＫＧ（ＮＥＭＯ）；ＩＬ２；ＩＴＰＲ１；ＩＴＫ；ＪＵＮ；ＫＲＡＳ２；ＬＡＴ；ＬＣＫ；ＭＡＰ２Ｋ１（ＭＥＫ１）；ＭＡＰ２Ｋ２（ＭＥＫ２）；ＭＡＰ２Ｋ３（ＭＫＫ３）；ＭＡＰ２Ｋ４（ＭＫＫ４）；ＭＡＰ２Ｋ６（ＭＫＫ６）；ＭＡＰ２Ｋ７（ＭＫＫ７）；ＭＡＰ３Ｋ１（ＭＥＫＫ１）；ＭＡＰ３Ｋ３；ＭＡＰ３Ｋ４；ＭＡＰ３Ｋ５；ＭＡＰ３Ｋ８；ＭＡＰ３Ｋ１４（ＮＩＫ）；ＭＡＰＫ８（ＪＮＫ１）；ＭＡＰＫ９（ＪＮＫ２）；ＭＡＰＫ１０（ＪＮＫ３）；ＭＡＰＫ１１（ｐ３８β）；ＭＡＰＫ１２（ｐ３８γ）；ＭＡＰＫ１３（ｐ３８δ）；ＭＡＰＫ１４（ｐ３８α）；ＮＣＫ；ＮＦＡＴ１；ＮＦＡＴ２；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＦＫＢＩＡ；ＮＲＡＳ；ＰＡＫ１；ＰＡＫ２；ＰＡＫ３；ＰＡＫ４；ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ；ＰＩＫ３Ｃ３（ＶＰＳ３４）；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３ＣＤ；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＫＣＡ；ＰＫＣＢ；ＰＫＣＭ；ＰＫＣＱ；ＰＬＣＹ１；ＰＲＦ１（パーフォリン）；ＰＴＥＮ；ＲＡＣ１；ＲＡＦ１；ＲＥＬＡ；ＳＤＦ１；ＳＨＰ２；ＳＬＰ７６；ＳＯＳ；ＳＲＣ；ＴＢＫ１；ＴＣＲＡ；ＴＥＣ；ＴＲＡＦ６；ＶＡＶ１；ＶＡＶ２；またはＺＡＰ７０であり得る。
４３．抗原結合ドメインが、自己免疫または炎症性障害に特徴的な抗原を標的とする、実施形態３３～３８のいずれかに記載のフソソーム。
４４．自己免疫性または炎症性障害が、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ループス、関節炎、免疫複合体糸球体腎炎、グッドパスチャー、ブドウ膜炎、肝炎、全身性硬化症または強皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、寒冷凝集素疾患、尋常性ペンフィガス、グレイブス病、自己免疫性溶血性貧血、血小板減少症Ａ、原発性シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、神経骨髄性視神経症、エバン症候群、ＩｇＭ媒介性神経障害、サイログロブリン血症、皮膚筋炎、特発性血小板減少症、強直性脊椎炎、水疱性類天疱瘡、後天性血管浮腫、慢性蕁麻疹、抗リン脂質脱髄性多発神経障害、および自己免疫性血小板減少症または好中球減少症または純粋な赤血球形成不全から選択され、一方、同種免疫疾患の例示的な非限定的な例には、同種感作（例えば、Ｂｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１５（４）：９３１－４１を参照）または造血器もしくは実質臓器移植からの異種感作、輸血、胎児同種感作を伴う妊娠、新生児同種免疫性血小板減少症、新生児溶血性疾患、酵素またはタンパク質補充療法、血液製品、および遺伝子治療で治療される先天性もしくは後天性欠損障害の置換により起こり得るような外来抗原に対する感作が挙げられる、実施形態４３に記載のフソソーム。
４５．自己免疫または炎症性障害に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体から選択される、実施形態４３または実施形態４４に記載のフソソーム。幾つかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、Ｂ細胞、形質細胞、形質芽細胞、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２８、ＴＮＦ、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ、ＺＡＰ－７０、ＬＦＡ－１、ＣＤ３γ、ＣＤ５、またはＣＤ２上で発現されるリガンドに結合する。
４６．抗原結合ドメインが、感染症に特徴的な抗原を標的とする、実施形態３３～３８のいずれかに記載のフソソーム。
４７．感染症が、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ））、ヒトＴ－リンパ球栄養性ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、エプトスタイン・バーウイルス、ＣＭＶ、ヒトパピローマウイルスから選択される、実施形態４６に記載のフソソーム。
４８．感染症に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ｇｐｌ２０、またはＨＩＶ－１ Ｅｎｖ上のＣＤ４誘導性エピトープから選択される、実施形態４６または実施形態４７に記載のフオソーム。
４９．膜貫通ドメインが、少なくともＴ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはそれらの機能的バリアントのα、β、もしくはζ鎖の膜貫通領域を含む、実施形態３３～４８のいずれかに記載のフソソーム。
５０．膜貫通ドメインが、少なくともＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、およびＦＧＦＲ２Ｂ、またはそれらの機能的バリアントの膜貫通領域（複数可）を含む、実施形態３３～４９のいずれかに記載のフソソーム。
５１．ＣＡＲが、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、ＰＤＣＤ６）、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－α、ＴＮＦＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、イカロス、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＣＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ３ζドメイン、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの機能的フラグメントのうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む、実施形態３３～５０のいずれかに記載のフソソーム。
５２．ＣＡＲが、ＣＤ３ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアントを含む、実施形態３３～５１のいずれかに記載のフソソーム。
５３．ＣＡＲが、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、および（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、もしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントを含む、実施形態３３～５１のいずれかに記載のフソソーム。
５４．ＣＡＲが、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント；（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント；および（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む、実施形態３３～５１のいずれかに記載のフソソーム。
５５．ＣＡＲが、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント；（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント；（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアント；および（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む、実施形態３３～５３のいずれかに記載のフソソーム。
５６．ＣＡＲが、１つ以上のスペーサーを更に含む、実施形態３３～５３のいずれかに記載のフソソーム。
５７．スペーサーが、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間の第１のスペーサーである、実施形態５６に記載のフソソーム。
５８．第１のスペーサーが、免疫グロブリン定常領域またはそのバリアントもしくは修飾バージョンの少なくとも一部を含む、実施形態５６または実施形態５７に記載のフソソーム。
５９．スペーサーが、膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間の第２のスペーサーである、実施形態５６～５８のいずれかに記載のフソソーム。
６０．第２のスペーサーが、オリゴペプチドである、実施形態５９に記載のフソソーム。
６１．オリゴペプチドが、グリシン－セリンダブレットを含む、実施形態６０に記載のフソソーム。
６２．膜タンパク質が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８、およびＦＧＦ２１を含む）血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、およびＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体およびＥｐｈ受容体ファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、およびＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ－１、ＣＩＣ－２、ＣＩＣ－４、ＣＩＣ－５、ＣＩＣ－７、ＣＩＣ－Ｋａ、ＣＩＣ－Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣトランスポーター、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン－１－リン酸受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通タンパク質、マルチスパン膜貫通タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ；Ｔ細胞α鎖；Ｔ細胞β鎖；Ｔ細胞γ鎖；Ｔ細胞δ鎖；ＣＣＲ７；ＣＤ３；ＣＤ４；ＣＤ５；ＣＤ７；ＣＤ８；ＣＤ１１ｂ；ＣＤ１１ｃ；ＣＤ１６；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２１；ＣＤ２２；ＣＤ２５；ＣＤ２８；ＣＤ３４；ＣＤ３５；ＣＤ４０；ＣＤ４５ＲＡ；ＣＤ４５ＲＯ；ＣＤ５２；ＣＤ５６；ＣＤ６２Ｌ；ＣＤ６８；ＣＤ８０；ＣＤ９５；ＣＤ１１７；ＣＤ１２７；ＣＤ１３３；ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）；ＣＤ１６３；Ｆ４／８０；ＩＬ－４Ｒａ；Ｓｃａ－１；ＣＴＬＡ－４；ＧＩＴＲ；ＧＡＲＰ；ＬＡＰ；グランザイムＢ；ＬＦＡ－１；トランスフェリン受容体；ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋；Ｔｈ１；Ｔｈ２；Ｔｈ１７；Ｔｈ４０；Ｔｈ２２；Ｔｈ９；Ｔｆｈ、古典的Ｔｒｅｇ．ＦｏｘＰ３＋；Ｔｒ１；Ｔｈ３；Ｔｒｅｇ１７；ＴＲＥＧ；ＣＤＣＰ１、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、炭酸アンヒドラーゼＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２）、Ｌｅｗｉｓ－γ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ－ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ－１、ＢＡＦＦ、ＨＤＡＣ、ＡＢＬ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ－１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、またはＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体α（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ－１３Ｒａ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３Ｒα１、Ｌ１－ＣＡＭ、ＴｎＡｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン－１１受容体ａ（ＩＬ－１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、テロメラーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰＩＢＩ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、新生抗原、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢ、またはｔｒｋＣから選択される、実施形態１８～３２のいずれかに記載のフソソーム。
６３．フソソームが、エンドサイトーシスによって標的細胞に入り、例えば、所与のフソソームのエンドサイトーシス経路を介して送達される膜タンパク質ペイロード剤のレベルが、例えば、実施例９１のアッセイを使用して、０．０１～０．６、０．０１～０．１、０．１～０．３もしくは０．３～０．６であるか、またはクロロキン処理された参照細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上大きい、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
６４．フソソームが、非エンドサイトーシス経路によって標的細胞に入り、例えば、所与のフソソームの非エンドサイトーシス経路を介して送達される膜タンパク質ペイロード剤のレベルが、例えば、実施例９０のアッセイを使用して、０．１～０．９５、０．１～０．２、０．２～０．３、０．３～０．４、０．４～０．５、０．５～０．６、０．６～０．７、０．７～０．８、０．８～０．９、０．９～０．９５であるか、またはクロロキン処理された参照細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上大きい、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
６５．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）膜タンパク質ペイロード剤が、膜タンパク質、または膜タンパク質、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コードするものをコードするか、またはそれに相補的な核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ）である、
ｉｉ）膜タンパク質が、抗原受容体などの受容体であるか、またはそれを含み、これは、幾つかの実施形態では、天然受容体または操作された受容体、例えば、ＣＡＲであり得る、
ｉｉｉ）膜タンパク質が、インテグリンであるか、またはそれを含む、
ｉｖ）膜タンパク質が、Ｔ細胞受容体であるか、またはそれを含む、
ｖ）膜タンパク質が、イオンチャネルタンパク質または孔形成タンパク質（例えば、溶血素もしくはコリシン）などの膜輸送タンパク質であるか、またはそれを含む、
ｖｉ）膜タンパク質が、トール様受容体であるか、またはそれを含む、
ｖｉｉ）膜タンパク質が、インターロイキン受容体であるか、またはそれを含む、
ｖｉｉｉ）膜タンパク質が、膜酵素であるか、またはそれを含む、あるいは
ｉｘ）膜タンパク質が、細胞接着タンパク質（例えば、カドヘリンタンパク質、セレクチンタンパク質、ムチンタンパク質等）であるか、またはそれを含む、フソソーム。
６６．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）膜タンパク質が、内在性膜タンパク質であり、
ｉｉ）膜タンパク質が、表在性膜タンパク質であり、
ｉｉｉ）膜タンパク質が、一時的に膜と会合し、
ｉｖ）膜タンパク質が、標的細胞の膜と会合する、および／または（例えば、膜貫通タンパク質として）全体的もしくは部分的に及ぶタンパク質であり、
ｖ）膜タンパク質が、内在性モノトピックタンパク質であり（すなわち、膜の片側のみに会合している）、
ｖｉ）膜タンパク質が、標的細胞の膜の外面と会合しているか、または会合するようになり（例えば、外面に部分的または全体的に存在する）、あるいは
ｖｉｉ）膜タンパク質が、標的細胞の膜の内面と会合しているか、または会合するようになる（例えば、内面に部分的または全体的に存在する）、フソソーム。
６７．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）膜タンパク質が、治療用膜タンパク質である、または
ｉｉ）膜タンパク質が、受容体（例えば、細胞表面受容体および／または膜貫通受容体）、細胞表面リガンド、膜輸送タンパク質（例えば、例えば、イオンチャネルタンパク質、孔形成タンパク質（例えば、毒素タンパク質）等）、膜酵素、および／または細胞接着タンパク質）であるか、またはそれを含む、フソソーム。
６８．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）膜タンパク質が、天然に存在する膜タンパク質の配列を含む、
ｉｉ）膜タンパク質が、天然に存在する膜タンパク質のバリアントもしくは修飾バージョンであるか、またはそれを含む、
ｉｉｉ）膜タンパク質が、操作された膜タンパク質であるか、またはそれを含む、あるいは
ｉｖ）膜タンパク質が、融合タンパク質であるか、またはそれを含む、フソソーム。
６９．フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、膜タンパク質ペイロード剤を標的細胞の膜に送達する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
７０．フソソームが更に、１つ以上の作用物質、例えば、タンパク質、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）、オルガネラ、またはおよび／または代謝産物を標的細胞の細胞質ゾルに送達することができる（例えば、送達する）、実施形態６９に記載のフソソーム。
７１．複数のフソソームを含む、フソソーム組成物または調製物であって、少なくとも１つのフソソームが、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）例えば、本明細書に記載されるような膜タンパク質ペイロード剤と、を含む、フソソーム組成物または調製物。
７２．本明細書に記載の膜タンパク質ペイロード剤を含む複数のフソソームを含む凍結精製フソソーム組成物または調製物であって、調製物が、４、０、－４、－１０、－１２、－１６、－２０、－８０、または－１６０℃以下の温度で凍結される、凍結精製フソソーム組成物または調製物。
７３．複数のフソソームのうちの少なくとも１つのフソソームが、ソース細胞に由来する、実施形態７１または実施形態７２に記載のフソソーム組成物。
７４．フソソームが、４、０、－４、－１０、－１２、－１６、－２０、－８０、または－１６０℃未満の温度にある、実施形態７１～７３のいずれかに記載のフソソーム組成物。
７５．複数のフソソームが、少なくとも約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５フソソームを含む、実施形態７１～７４のいずれかに記載のフソソーム組成物。
７６．複数のフソソームが同じである、実施形態７１～７５のいずれかに記載のフソソーム組成物。
７７．フソソーム組成物中のフソソームの少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、もしくは８０％～９０％が、
同じフソゲンを含む、
同じタイプのソース細胞を使用して産生される、または
同じ膜タンパク質ペイロード剤を含む、から選択される少なくとも１つの特性を共有する場合、複数のフソソームが同じである、実施形態７６に記載のフソソーム組成物。
７８．複数のフソソームが異なる、実施形態７１～７５のいずれかに記載のフソソーム組成物。
７９．複数のフソソームが、２つ以上のタイプのソース細胞に由来する、実施形態７１～７７のいずれかに記載のフソソーム組成物。
８０．少なくとも１μＬ、２μＬ、５μＬ、１０μＬ、２０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、５００μＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、または１０ｍＬの体積を有する、実施形態７１～７９のいずれかに記載のフソソーム組成物。
８１．複数のフソソームが、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、これらは機能的核を含まない、実施形態７１～８０のいずれかに記載のフソソーム組成物。
８２．複数のフソソームが、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、これらは核を含まない、実施形態７１～８１のいずれかに記載のフソソーム組成物。
８３．複数のフソソームが、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、これらは核ＤＮＡを実質的に含まない、実施形態７１～８２のいずれかに記載のフソソーム組成物。
８４．複数のフソソームが、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、これらは機能的ミトコンドリアを含まない、実施形態７１～８３のいずれかに記載のフソソーム組成物。
８５．複数のフソソームが、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、これらはミトコンドリアを含まない、実施形態７１～８４のいずれかに記載のフソソーム組成物。
８６．タンパク質質量で０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、もしくは１０％未満のソース細胞、または０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、もしくは１０％未満の、機能的核を有するソース細胞を含む、実施形態７１～８５のいずれかに記載のフソソーム組成物。
８７．フソソーム組成物が、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、
ｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、または
ｉｉ）フソソームあたりのフソゲンのコピー数と膜タンパク質ペイロード剤のコピー数との比が、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００の間である、実施形態７１～８６のいずれかに記載のフソソーム組成物。
８８．フソソーム組成物が、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、膜タンパク質ペイロード剤が、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、実施形態７１～８７のいずれかに記載のフソソーム組成物。
８９．複数のフソソームが、少なくとも約５０ｎｍ、約８０ｎｍ、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１０００ｎｍ、約１２００ｎｍ、約１４００ｎｍ、または約１５００ｎｍの平均径を有する、実施形態７１～７７のいずれかに記載のフソソーム組成物。
９０．複数のフソソームが、約１０ｎｍ～約１００μｍの範囲内の直径を有するフソソームを含む、実施形態７１～８９のいずれかに記載のフソソーム組成物。
９１．複数が、約２０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、または約１００ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲内のサイズを有するフソソームを含む、実施形態７１～８９のいずれかに記載のフソソーム組成物。
９２．複数のフソソームの少なくとも５０％が、フソソーム組成物中のフソソームの平均径の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内の直径を有する、実施形態７１～９１のいずれかに記載のフソソーム組成物。
９３．複数が、約５００ｎｍ３～約０．０００６ｍｍ３、または約４，０００ｎｍ３～約０．００５μｍ３、約６５，０００ｎｍ３～約０．００５μｍ３、約６５，０００ｎｍ３～約０．０００６μｍ３、約６５，０００ｎｍ３～約０．００２μｍ３、または約０．０００６μｍ３～約０．００２μｍ３の範囲内の体積を有するフソソームを含む、実施形態７１～９２のいずれかに記載のフソソーム組成物。
９４．複数のフソソームの少なくとも５０％が、フソソーム組成物中のフソソームの平均体積の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内の体積を有する、実施形態７１～９３のいずれかに記載のフソソーム組成物。
９５．複数のフソソームの少なくとも５０％が、フソソーム組成物中のフソソームの平均フソゲンコピー数の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内のフソゲンのコピー数を有する、実施形態７１～９４のいずれかに記載のフソソーム組成物。
９６．複数のフソソームの少なくとも５０％が、フソソーム組成物中のフソソームの平均タンパク質膜ペイロードコピー数の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内のタンパク質膜ペイロードのコピー数を有する、実施形態７１～９５のいずれかに記載のフソソーム組成物。
９７．上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物または薬学的組成物であって、
ｉ）膜タンパク質ペイロード剤が、部分的または全体的にフソソーム内腔に配置されている、
ｉｉ）膜タンパク質ペイロード剤が、フソソームの脂質二重層と会合している（例えば、部分的または全体的にその中に位置している）、あるいは
ｉ）関連する膜タンパク質が、フソソームの外面と会合している、および／または部分的もしくは全体的に表示されている、フソソーム組成物または薬学的組成物。
９８．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）例えば、フソゲンを発現することを含む、ソース細胞を提供することと、
ｂ）ソース細胞からフソソームを産生することであって、フソソームが、脂質二重層、内腔、フソゲン、および膜タンパク質ペイロード剤を含み、それによりフソソームを作製する、産生することと、
ｃ）フソソームを、例えば、被験体への投与に適した薬学的組成物として製剤化することと、を含み、
ｉ）ソース細胞が、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞以外のものである、
ｉｉ）フソゲンが、ウイルスタンパク質以外のものである、
ｉｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、１．０８ｇ／ｍＬ～１．１２ｇ／ｍＬの間以外の密度を有する、
ｉｖ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例３３のアッセイによって測定した場合、１．２５ｇ／ｍＬ＋／－０．０５の密度を有する、
ｖ）フソソームが、循環中のスカベンジャー系または肝臓の洞内のクッパー細胞によって捕捉されない、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例７６のアッセイにより、被験体の細網内皮系（ＲＥＳ）によって捕捉されない、
ｖｉｉ）複数のフソソームが被験体に投与される場合、複数の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満が、例えば、実施例７６のアッセイにより、２４時間後にＲＥＳによって捕捉されない、
ｖｉｉｉ）フソソームが、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、または２００μｍを超える直径を有する、
ｉｘ）フソソームが、細胞生物学的物質を含む、
ｘ）フソソームが、除核細胞を含む、あるいは
ｘｉ）フソソームが、不活化核を含む、のうちの１つ以上である、方法。
９９．フソゲンを発現するソース細胞を提供することが、ソース細胞において外因性フソゲンを発現させること、またはソース細胞において内因性フソゲンの発現を上方調節することを含む、実施形態９８に記載の方法。
１００．ソース細胞の核を不活化することを含む、実施形態９８または実施形態９９に記載の方法。
１０１．例えば、エレクトロポレーションによって、膜タンパク質ペイロード（例えば、核酸またはタンパク質）をフソソームに導入することを含む、実施形態９８～１００のいずれかに記載の方法。
１０２．フソソーム医薬品組成物を製造する方法であって、
ａ）例えば、実施形態１～７０のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態７１～９７のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態９７に記載の薬学的組成物を提供することと、
ｂ）以下の基準のうちの１つ以上（例えば、２、３、または全て）が満たされているかどうかを決定するために、複数からの１つ以上のフソソームをアッセイすることと、
ｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１０％高い割合で融合する、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームよりも標的細胞と、例えば、少なくとも５０％高い割合で融合する、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、２４時間後に、標的細胞の少なくとも１０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
ｉｖ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数の膜タンパク質ペイロード剤を含む、
ｖｉ）フソゲンのコピー数と膜タンパク質ペイロード剤のコピー数との比が、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００の間である、
ｖｉｉ）フソソームが、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの７５％以内である脂質組成物を含む、
ｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
ｉｘ）フソソームが、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質とタンパク質との比率を含む、
ｘ）フソソームが、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるタンパク質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を含む、
ｘｉ）フソソームが、例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を含む、
ｘｉｉ）フソソームが、被験体、例えば、マウスにおいて、例えば、実施例７５のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の９０％以内の半減期を有する、
ｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％多く、グルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を膜を横切って輸送する、
ｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の９０％以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
ｘｖ）フソソームが、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性（例えば、クエン酸合成酵素活性）の９０％以内の代謝活性レベルを含む、
ｘｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの９０％以内の呼吸レベル（例えば、酸素消費率）を含む、
ｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含む、
ｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例３９のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも１％のｍｉＲＮＡ含有量レベルを有する、
ｘｉｘ）フソソームが、例えば、実施例４７のアッセイにより、ソース細胞のそれの９０％以内である可溶性：不溶性タンパク質比を有する、
ｘｘ）フソソームが、例えば、実施例４８のアッセイによって測定した場合、フソソームの脂質含有量の５％未満のＬＰＳレベルを有する、
ｘｘｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも１０％多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取込みが可能である、
ｘｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７１のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも５％大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７２のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも５％大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例７３のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、５％以内のレベルでアクチンを重合する、
ｘｘｖ）フソソームが、例えば、実施例７４のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約５％以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約－２０～－１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ、もしくは－１００～－１５０ｍＶの膜電位を有する、
ｘｘｖｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも少なくとも５％大きい割合でタンパク質を分泌することができる、あるいは
ｘｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
ｃ）（任意に）基準のうちの１つ以上が満たされた場合に、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含み、
それにより、フソソーム医薬品組成物を製造する、方法。
１０３．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）例えば、フソゲンを発現することを含む、ソース細胞を提供することと、
ｂ）ソース細胞からフソソームを産生することであって、フソソームが、脂質二重層、内腔、フソゲン、および膜タンパク質ペイロード剤を含み、それによりフソソームを作製する、産生することと、
ｃ）フソソームを、例えば、被験体への投与に適した薬学的組成物として製剤化することと、を含む、方法。
１０４．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）本明細書に記載の複数のフソソームまたはフソソーム調製物を提供する、例えば、産生することと、
ｂ）１つ以上（例えば、２、３、またはそれ以上）の基準が満たされているかどうかを決定するために、複数の（例えば、調製物の）試料を分析することと、を含む、方法。
１０５．基準（複数可）が、
ｉ）試料中のフソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い割合で融合する、
ｉｉ）試料中のフソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い割合で融合する、
ｉｉｉ）試料中のフソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の膜タンパク質ペイロード剤が、２４、４８、または７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
ｉｖ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり（例えば、試料中の平均で）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、
ｖ）膜タンパク質ペイロード剤が、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、試料のフソソーム中（試料中の平均で）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で検出可能である、
ｖｉ）フソゲンのコピー数と膜タンパク質ペイロード剤のコピー数との比が、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００の間である、
ｖｉｉ）試料のフソソームが、ソース細胞のそれと実質的に同様の脂質組成物を特徴とするか、またはＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、もしくは７５％以内である、
ｖｉｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を特徴とする、
ｉｘ）試料のフソソームが、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質とタンパク質との比率を特徴とする、
ｘ）試料のフソソームが、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるタンパク質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を特徴とする、
ｘｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を特徴とする、
ｘｉｉ）試料のフソソームが、被験体、例えば、マウスなどの実験用動物において、例えば、実施例７５のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の半減期を特徴とする、
ｘｉｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く、グルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を膜を横切って輸送する、
ｘｉｖ）試料のフソソームが、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の内腔におけるエステラーゼ活性を特徴とする、
ｘｖ）試料のフソソームが、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性、例えば、クエン酸合成酵素活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の代謝活性（例えば、クエン酸合成酵素活性）レベルを特徴とする、
ｘｖｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の呼吸レベル（例えば、酸素消費率）を特徴とする、
ｘｖｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシンＶ染色レベルを特徴とするか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含む、
ｘｖｉｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例３９のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ含有量レベルを特徴とする、
ｘｉｘ）フソソームが、例えば、実施例４７のアッセイにより、ソース細胞のそれの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内であるか、もしくはそれ以上大きい、または例えば、ソース細胞のそれの１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、もしくは８０％～９０％以内の可溶性：不溶性タンパク質の比率を有する、
ｘｘ）試料のフソソームが、例えば、実施例４８のアッセイによって測定した場合、ソース細胞または参照細胞のＬＰＳ含有量の５％、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％、またはそれ以下のＬＰＳレベルを特徴とする、
ｘｘｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取込みが可能である、
ｘｘｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例７１のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを特徴とする、
ｘｘｉｉｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例７２のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％大きいパラクリンシグナル伝達レベルを特徴とする、
ｘｘｉｖ）試料のフソソームが、例えば、実施例７３のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内のレベルでアクチンを重合することを特徴とする、
ｘｘｖ）試料のフソソームが、例えば、実施例７４のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の膜電位を特徴とするか、またはフソソームが、約－２０～－１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ、もしくは－１００～－１５０ｍＶの膜電位を有する、
ｘｘｖｉ）試料のフソソームが、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％大きい割合でタンパク質を分泌することができる、
ｘｘｖｉｉ）試料のフソソームが、例えば、本明細書に記載されているように、低い免疫原性を特徴とする、から選択される、実施形態１０４に記載の方法。
１０６．
ｃ）基準のうちの１つ以上が満たされた場合に複数のフソソームもしくはフソソーム組成物の放出を承認するか、または（任意に）基準のうちの１つ以上が満たされた場合に複数のフソソームもしくはフソソーム調製物を医薬品として製剤化することを更に含む、実施形態１０４または１０５に記載の方法。
１０７．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）例えば、フソゲンを発現することを含む、ソース細胞を提供することと、
ｂ）ソース細胞からフソソームを産生することであって、フソソームが、脂質二重層、内腔、フソゲン、および膜タンパク質ペイロード剤を含み、それによりフソソームを作製する、産生することと、
ｃ）フソソームを、例えば、被験体への投与に適した薬学的組成物として製剤化することと、を含み、
ｉ）ソース細胞が、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞以外のものである、
ｉｉ）フソゲンが、ウイルスタンパク質以外のものである、
ｉｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、１．０８ｇ／ｍＬ～１．１２ｇ／ｍＬの間以外の密度を有する、
ｉｖ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例３３のアッセイによって測定した場合、１．２５ｇ／ｍＬ＋／－０．０５の密度を有する、
ｖ）フソソームが、循環中のスカベンジャー系または肝臓の洞内のクッパー細胞によって捕捉されない、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例７６のアッセイにより、被験体の細網内皮系（ＲＥＳ）によって捕捉されない、
ｖｉｉ）複数のフソソームが被験体に投与される場合、該複数の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満が、例えば、実施例７６のアッセイにより、２４時間後にＲＥＳによって捕捉されない、
ｖｉｉｉ）フソソームが、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、または２００μｍを超える直径を有する、
ｉｘ）フソソームが、細胞生物学的物質を含む、
ｘ）フソソームが、除核細胞を含む、あるいは
ｘｉ）フソソームが、不活化核を含む、のうちの１つ以上である、方法。
１０８．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）本明細書に記載の複数のフソソーム、フソソーム組成物、または薬学的組成物を提供することと、
ｂ）以下の基準のうちの１つ以上（例えば、２、３、または全て）が満たされているかどうかを決定するために、複数からの１つ以上のフソソームをアッセイすることと、
ｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１０％高い割合で融合する、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームよりも標的細胞と、例えば、少なくとも５０％高い割合で融合する、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、２４時間後に、標的細胞の少なくとも１０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
ｉｖ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数の膜タンパク質ペイロード剤を含む、
ｖｉ）フソゲンのコピー数と膜タンパク質ペイロード剤のコピー数との比が、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００の間である、
ｖｉｉ）フソソームが、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの７５％以内である脂質組成物を含む、
ｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
ｉｘ）フソソームが、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質とタンパク質との比率を含む、
ｘ）フソソームが、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるタンパク質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を含む、
ｘｉ）フソソームが、例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を含む、
ｘｉｉ）フソソームが、被験体、例えば、マウスにおいて、例えば、実施例７５のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の９０％以内の半減期を有する、
ｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％多く、グルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を膜を横切って輸送する、
ｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の９０％以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
ｘｖ）フソソームが、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性（例えば、クエン酸合成酵素活性）の９０％以内の代謝活性レベルを含む、
ｘｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの９０％以内の呼吸レベル（例えば、酸素消費率）を含む、
ｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含む、
ｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例３９のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも１％のｍｉＲＮＡ含有量レベルを有する、
ｘｉｘ）フソソームが、例えば、実施例４７のアッセイにより、ソース細胞のそれの９０％以内である可溶性：不溶性タンパク質比を有する、
ｘｘ）フソソームが、例えば、実施例４８のアッセイによって測定した場合、フソソームの脂質含有量の５％未満のＬＰＳレベルを有する、
ｘｘｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも１０％多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取込みが可能である、
ｘｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７１のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも５％大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７２のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも５％大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例７３のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、５％以内のレベルでアクチンを重合する、
ｘｘｖ）フソソームが、例えば、実施例７４のアッセイによって、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約５％以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約－２０～－１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ、もしくは－１００～－１５０ｍＶの膜電位を有する、
ｘｘｖｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも少なくとも５％大きい割合でタンパク質を分泌することができる、あるいは
ｘｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
ｃ）（任意に）基準のうちの１つ以上が満たされた場合に、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含み、
それにより、フソソーム医薬品組成物を製造する、方法。
１０９．膜タンパク質ペイロード剤を被験体に送達する方法であって、実施形態１～７０のいずれかによる複数のフソソームを含むフソソーム組成物、実施形態７１～９７のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態９７に記載の薬学的組成物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物が、膜タンパク質ペイロード剤が送達されるような量および／または時間で投与される、方法。
１１０．例えば、本明細書に記載されるように、膜タンパク質ペイロード剤を含むフソソーム組成物または調製物を、ヒト被験体、標的組織、または細胞に送達する方法であって、該方法は、ヒト被験体に投与すること、または標的組織もしくは細胞を、本明細書に記載される複数のフソソームを含むフソソーム組成物、本明細書に記載されるフソソーム組成物、もしくは本明細書に記載される薬学的組成物と接触させ、それにより、フソソーム組成物を被験体に投与することを含む、方法。
１１１．膜タンパク質ペイロード剤を被験体、標的組織、または細胞に送達する方法であって、被験体に投与すること、または標的組織もしくは細胞を本明細書に記載のフソソーム組成物もしくは調製物（例えば、本明細書に記載の薬学的組成物）と接触させることを含み、フソソーム組成物または調製物が、膜タンパク質ペイロード剤が送達されるような量および／または時間で投与される、方法。
１１２．膜タンパク質ペイロード剤を被験体に送達する方法であって、例えば、
ａ）被験体の１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第１のフソゲンを被験体に投与することであって、
ｉ）第１のフソゲンを投与することが、１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第１のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの１つ以上である、投与することと、
ｂ）第２のフソゲンおよび膜タンパク質ペイロード剤を含む複数のフソソームを含む、本明細書に記載されるようなフソソーム組成物または調製物をヒト被験体に投与することと、を含み、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤を更に含み、
それにより、膜タンパク質ペイロード剤を被験体に送達する、方法。
１１３．被験体における生物学的機能を調節する、例えば、増強する方法であって、
ａ）被験体の１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第１のフソゲンを被験体に投与することであって、
ｉ）第１のフソゲンを投与することが、１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第１のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの１つ以上である、投与することと、
ｂ）第２のフソゲンを含む複数のフソソームを含む、本明細書に記載されるようなフソソーム組成物または調製物をヒト被験体に投与することと、を含み、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤を更に含み、
それにより、被験体における生物学的機能を調節する、方法。
１１４．膜タンパク質機能を被験体に送達または標的化する方法であって、膜タンパク質ペイロード剤を含む本明細書に記載のフソソーム組成物または調製物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物または調製物が、膜タンパク質機能が被験体において送達または標的化されるような量および／または時間で投与され、任意に、被験体が癌、炎症性障害、自己免疫疾患、慢性疾患、炎症、臓器機能の損傷、感染症、変性障害、遺伝性疾患を、または傷害を有する、方法。
１１５．フソソーム組成物をヒト被験体に投与する方法であって、
ａ）被験体の１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第１のフソゲンを被験体に投与することであって、
ｉ）第１のフソゲンを投与することが、１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第１のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの１つ以上である、投与することと、
ｂ）第２のフソゲンを含む複数のフソソームを含む、フソソーム組成物をヒト被験体に投与することと、を含み、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤を更に含み、
それにより、フソソーム組成物を被験体に投与する、方法。
１１６．膜タンパク質ペイロード剤を被験体に送達する方法であって、
ａ）被験体の１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第１のフソゲンを被験体に投与することであって、
ｉ）第１のフソゲンを投与することが、１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第１のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの１つ以上である、投与することと、
ｂ）第２のフソゲンおよび治療薬を含む複数のフソソームを含む、フソソーム組成物をヒト被験体に投与することと、を含み、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤を更に含み、
それにより、膜タンパク質ペイロード剤を被験体に送達する、方法。
１１７．被験体における生物学的機能を調節する、例えば、増強する方法であって、
ａ）被験体の１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第１のフソゲンを被験体に投与することであって、
ｉ）第１のフソゲンを投与することが、１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第１のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの１つ以上である、投与することと、
ｂ）第２のフソゲンを含む複数のフソソームを含む、フソソーム組成物をヒト被験体に投与することと、を含み、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤を更に含み、
それにより、被験体における生物学的機能を調節する、方法。
１１８．生物学的機能が、
ａ）２つの細胞間の相互作用を調節する、例えば、増加または減少させる、
ｂ）免疫応答を調節する、例えば、増加または減少させる、
ｃ）標的組織への細胞の動員を調節する、例えば、増加または減少させる、
ｄ）癌の成長率を低下させる、または
ｅ）被験体における癌細胞の数を低減する、から選択される、実施形態１１７に記載の方法。
１１９．膜タンパク質ペイロード剤が、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する、実施形態１１５～１１８のいずれかに記載の方法。
１２０．膜タンパク質ペイロード剤が、
ｉ）キメラ抗原受容体、
ｉｉ）例えば、表７から選択されるインテグリン膜タンパク質ペイロード、
ｉｉｉ）表８から選択されるイオンチャネルタンパク質、
ｉｖ）例えば、表９および１０から選択される孔形成タンパク質、
ｖ）例えば、表１１から選択されるＴｏｌｌ様受容体、
ｖｉ）例えば、表１２から選択されるインターロイキン受容体ペイロード、
ｖｉｉ）表１３～１４から選択される細胞接着タンパク質、
ｖｉｉｉ）表１７から選択される輸送タンパク質、
ｉｘ）天然に存在する膜タンパク質に対して異種であるシグナル配列、もしくは
ｘ）表６に列挙されているシグナル配列のうちの１つ以上を含むか、またはコードする、実施形態１１５～１１９のいずれかに記載の方法。
１２１．膜タンパク質ペイロード剤が、コネキシン、ＣＦＴＲ、チロトロピン受容体、ミエリンタンパク質ゼロ、メラコルチン４、ミエリンプロテオリピドタンパク質、低密度リポタンパク質受容体、ＡＢＣトランスポーター、ＣＤ８１、ｍＣＡＴ－１、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４、ＣＣＲ５、シアル酸に富むタンパク質、クローディン、ＣＤ２１、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、ＴＮＦＲ１、ＣＤ６３、ＧＬＵＴ４、ＶＥＧＦ、またはＩＣＡＭ以外であるか、それを含まないか、コードしないか、またはコードする配列に相補的でない、実施形態１１５～１２０のいずれかに記載の方法。
１２２．膜タンパク質ペイロード剤が、標的細胞の細胞表面マーカーまたは標的細胞部分に結合せず、蛍光タンパク質を含まないキメラタンパク質を含むか、またはコードする、実施形態１１５～１２１のいずれかに記載の方法。
１２３．膜タンパク質ペイロード剤が、
ａ）治療用タンパク質、例えば、本明細書に記載の治療用タンパク質を含む、
ｂ）ゴルジ装置タンパク質、分泌タンパク質、もしくは小胞体タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、
ｃ）ダイマー（例えば、ソース細胞に対して外因性であるダイマー）、ヘテロダイマー（例えば、ソース細胞に対して外因性であるヘテロダイマー）、または二量体化ドメイン（例えば、ソース細胞に対して外因性であるポリペプチドの二量体化ドメイン）のうちの１つ以上を含まない、
ｄ）膜タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む、実施形態１１５～１２２のいずれかに記載の方法。
１２４．膜タンパク質ペイロード剤が、
ａ）膜貫通ドメインを含む膜タンパク質、
ｂ）脂質アンカータンパク質、
ｃ）膜貫通タンパク質に結合するタンパク質（例えば、膜貫通タンパク質の細胞外部分に結合する細胞外タンパク質、もしくは膜貫通タンパク質の細胞内部分に結合する細胞内タンパク質）、
ｄ）膜貫通ドメインを欠くタンパク質、
ｅ）膜に部分的に及ぶタンパク質（例えば、標的細胞もしくはフソソームの膜）、および膜に完全には及ばないタンパク質（例えば、面内膜ヘリックスを含むか、もしくはタンパク質が、膜に完全には及ばない疎水性ループを含む）、または
ｆ）膜貫通ドメインを含まないタンパク質を含むか、もしくはコードし、タンパク質が、例えば、静電相互作用もしくはイオン相互作用を介して、膜表面と相互作用する、実施形態１１５～１２３のいずれかに記載の方法。
１２５．第１のフソゲンが、リポペプチドではない、実施形態１１５～１２４のいずれかに記載の方法。
１２６．
癌の進行、腫瘍の後退、腫瘍の体積、新生物細胞数の減少、融合細胞の量、膜タンパク質ペイロード剤を含む融合細胞の量、核酸タンパク質ペイロードを発現する融合細胞の量、および融合細胞の膜に配置された膜タンパク質の量をモニターする工程を更に含む、実施形態１０９～１２５のいずれかに記載の方法。
１２７．膜タンパク質ペイロード剤が、
Ａ）米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４～１６１３１の配列、
ｂ）米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４～１６１３１の配列のフラグメント、バリアント、もしくはホモログ、
ｃ）米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４～１６１３１の配列を含むタンパク質をコードする核酸、または
ｄ）米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４～１６１３１の配列のフラグメント、変異体、もしくはホモログを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
１２８上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法であって、膜タンパク質ペイロード剤が、
ａ）表７～１７から選択されるタンパク質、
ｂ）表７～１７から選択されるタンパク質のフラグメント、バリアント、もしくはホモログ、
ｃ）表７～１７から選択されるタンパク質であるか、もしくはそれを含むタンパク質をコードする核酸、または
ｄ）表７～１７から選択されるタンパク質のフラグメント、バリアント、もしくはホモログを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
１２９．膜タンパク質ペイロード剤が、 抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
１３０．本明細書に記載の膜タンパク質ペイロード剤によって、または膜タンパク質ペイロード剤として提供される膜タンパク質が、免疫グロブリン部分または実体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦＶ、ｓｃＦａｂ、ｓｄＡｂ、デュオボディ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、ザイボディ、ラクダ抗体、ＢｉＴＥ、クアドローマ、もしくはｂｓＤｂ）であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
１３１．本明細書に記載の膜タンパク質ペイロード剤によって、または膜タンパク質ペイロード剤として提供される膜タンパク質が、１つ以上の細胞表面リガンド（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、５０、もしくはそれ以上の細胞表面リガンド）であるか、またはそれを含む、および／あるいは本明細書に記載の膜タンパク質ペイロード剤によって、または膜タンパク質ペイロード剤として提供される膜タンパク質が、１つ以上の細胞表面リガンドを、例えば、標的細胞に提示する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
１３２．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、複数の作用物質（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、もしくは５０の作用物質）を含み（標的細胞に送達することができる）、少なくとも１つの作用物質が、膜タンパク質ペイロードであるか、またはそれを含み、任意に、作用物質のうちの１つ以上が、阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）および／またはｍＲＮＡであるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
１３３．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞を再プログラミングまたは分化転換することができる膜タンパク質ペイロード剤を含み（例えば、標的細胞に送達することができる）、例えば、フソソーム（および／またはその組成物）が、標的細胞の再プログラミングまたは分化転換を誘導する１つ以上の作用物質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
１３４．上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法であって、
ａ）フソソームが、フソソームによって構成される膜タンパク質ペイロード剤（例えば、治療薬、例えば、ソース細胞に対して内因性もしくは外因性である治療薬）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を標的細胞に送達する、
ｂ）標的細胞（複数可）と融合するフソソームが、標的細胞（複数可）と融合するフソソームによって構成される膜タンパク質ペイロード剤（例えば、治療用膜タンパク質ペイロード剤、例えば、内因性の治療用膜タンパク質ペイロード剤もしくはソース細胞に対して外因性である治療用膜タンパク質ペイロード剤）の平均で少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を標的細胞に送達する、および／あるいは
ｃ）フソソーム組成物が、フソソーム組成物によって構成される膜タンパク質ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤剤、例えば、ソース細胞に対して外因性である治療用膜タンパク質ペイロード剤）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を標的組織に送達する、フソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
１３５．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、膜タンパク質ペイロード剤（例えば、フソソームの半減期よりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、２倍、５倍、または１０倍長い、被験体における半減期を特徴とする膜タンパク質ペイロード剤（例えば、治療薬）を送達するか、または送達することができる（例えば送達する）、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
１３６．フソソームが治療薬を標的細胞に送達し、任意に、フソソームがもはや存在しないか、または検出可能でなくなった後に作用物質が存在する、実施形態３０６に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
１３７．フソソームが、治療用膜タンパク質ペイロード剤、例えば、治療用膜タンパク質ペイロード剤、例えば、ソース細胞に対して外因性もしくは内因性である治療用膜タンパク質ペイロード剤、任意に、治療用膜タンパク質ペイロード剤が、タンパク質、例えば、膜貫通タンパク質、細胞表面タンパク質、分泌タンパク質、受容体、抗体、核酸、例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡのうちの１つ以上から選択される、フソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
核への送達
１３８．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）核ペイロード剤、例えば、核タンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する）と、を含み、
ｉ）標的細胞が複数のフソソームと接触すると、核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、例えば、実施例１１７～１２２のいずれかのアッセイにより、標的細胞の核において標的細胞の細胞質中の核タンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高いレベルで存在するようになる、
ｉｉ）標的細胞の集団が複数のフソソームと接触すると、例えば、実施例１１７～１２２のいずれかのアッセイにおいて測定した場合、核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、標的細胞の集団における少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の細胞の核において豊富化される（例えば、標的細胞の細胞質中の核タンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも５０％高いレベルで標的細胞の核に存在するようになる）、
ｉｉｉ）標的細胞の集団が複数のフソソームと接触すると、核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、標的細胞の集団の亜集団（「融合集団」）に存在するようになり、核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、例えば、実施例１１７～１２２のいずれかのアッセイにおいて測定した場合、融合集団における少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の細胞中の核において豊富化される（例えば、標的細胞の細胞質ゾル中の核タンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも５０％高いレベルで標的細胞の核に存在するようになる）、
ｉｖ）標的細胞の集団が複数のフソソームと接触すると、核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、標的細胞の集団の亜集団（「レシピエント細胞集団」）に存在するようになり、核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、例えば、実施例１１７～１２２のいずれかのアッセイにおいて測定した場合、レシピエント細胞集団中の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の細胞中の核において豊富化される（例えば、標的細胞の細胞質中の核タンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも５０％高いレベルで標的細胞の核内に存在するようになる）、
ｖ）少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１，０００コピーの核タンパク質ペイロード剤、または核酸核タンパク質ペイロード剤によってコードされるタンパク質が、例えば、実施例１１７または１１８のアッセイで測定される場合、標的細胞中の核に存在する、
ｖｉ）核タンパク質ペイロード剤が、転写活性化因子、転写抑制因子、エピジェネティック修飾因子、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡニッカーゼ、部位特異的ＤＮＡ編集酵素、例えば、デアミナーゼ、ＤＮＡトランスポサーゼ、ＤＮＡインテグラーゼ、ＲＮＡエディター、ＲＮＡスプライシング因子、ＰＩＷＩタンパク質のうちの１つ以上を含むか、またはコードする、
ｖｉｉ）核タンパク質ペイロード剤が、基本的なヘリックスループヘリックスモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックスターンヘリックスモチーフ、ホメオドメインモチーフ、翼状ヘリックスモチーフ、翼状ヘリックスターンモチーフ、ＨＭＧ－ボックスドメイン、Ｗｏｒ３ドメイン、ＯＢフォールドドメイン、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、またはＢ３ドメインのうちの１つ以上を含むか、またはコードする、
ｖｉｉｉ）核タンパク質ペイロード剤が、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、またはヘテロ四量体を含む複合体を含む、
ｉｘ）核タンパク質ペイロード剤が、異種核局在化シグナルを含むか、またはコードし、核タンパク質ペイロード剤が、Ｃｒｅなどの部位特異的ヌクレアーゼを含まない、
ｘ）核タンパク質ペイロード剤が、表６－１に列挙されている核局在化シグナルを含むか、またはコードし、任意に、ＮＬＳが、配列番号１２８～５０７および６０５～６２６のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、あるいは
ｘｉ）核タンパク質ペイロード剤が、核質、核小体、核小体周辺領域、カハール体、クラストソーム、ジェム核内構造体、ヒストン遺伝子座体（ＨＬＢ）、核スペックル、核ストレス体、パラスペックル、ＰＭＬ体、ポリコーム体を含むか、またはコードする、あるいは
ｘｉｉ）核タンパク質ペイロード剤が、標的細胞の細胞質に（少なくとも部分的に）存在する内因性タンパク質に結合する第１のドメイン、および核移入を促進する第２のドメイン、例えば、ＮＬＳを含むタンパク質を含むか、またはコードする、フソソーム。
１３９．エンドサイトーシス小胞にあるペイロードが、標的細胞の細胞質にある、実施形態１３８に記載のフソソーム。
１４０．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）核ペイロード剤、例えば、核タンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する）と、を含み、
ｉ）フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれに含まれる、
ｉｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数の治療薬を含む、
ｉｖ）フソソームが、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの７５％以内である脂質を含む、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも１０％多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取込みが可能である、
ｖｉｉ）フソソームが、被験体、例えば、マウスに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば、実施例８７または１００のアッセイにより、例えば、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％または１０％が、２４時間後に標的組織内に存在する、あるいは
ｖｉｉｉ）ソース細胞が、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、フソソーム。
１４１．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）（ｉ）核酸、および（ｉｉ）核酸の核移入を促進するタンパク質を含む核ペイロード剤と、を含む、フソソーム。
１４２．核タンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する）が、
ｉ）転写活性化因子、例えば、表１７－１の転写活性化因子、
ｉｉ）転写抑制因子、例えば、表１７－１の転写抑制因子、
ｉｉｉ）エピジェネティック修飾因子、例えば、表１７－１のエピジェネティック修飾因子、
ｉｖ）ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、例えば、表１７－１のヒストンアセチルトランスフェラーゼ、
ｖ）ヒストンデアセチラーゼ、例えば、表１７－１のヒストンデアセチラーゼ、
ｖｉ）ヒストンメチルトランスフェラーゼ、例えば、表１７－１のヒストンメチルトランスフェラーゼ、
ｖｉｉ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、例えば、表１７－１のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、
ｖｉｉｉ）ＤＮＡニッカーゼ、例えば、本明細書に記載のＤＮＡニッカーゼ、
ｉｘ）部位特異的ＤＮＡ編集酵素、例えば、表１７－１のデアミナーゼ、
ｘ）ＤＮＡトランスポザーゼ、例えば、本明細書に記載のＤＮＡトランスポザーゼ、
ｘｉ）ＤＮＡインテグラーゼ、例えば、本明細書に記載のＤＮＡインテグラーゼ、
ｘｉｉ）ＲＮＡエディター、例えば、表１７－１のＲＮＡエディター、
ｘｉｉｉ）ＲＮＡスプライシング因子、例えば、表１７－１のＲＮＡスプライシング因子、または
ｘｉｖ）ＰＩＷＩタンパク質、例えば、本明細書に記載のＰＩＷＩタンパク質、のうちの１つ以上を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１４３．核タンパク質ペイロード剤が、ＮＬＳを有するタンパク質を含むか、またはコードし、ＮＬＳが、タンパク質の天然に存在する対応物中のＮＬＳと同じである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１４４．核タンパク質ペイロード剤が、タンパク質の天然に存在する対応物によって含まれないＮＬＳを有するタンパク質を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１４５．核タンパク質ペイロード剤が、転写因子、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、エピジェネティック因子、転写後ＲＮＡ修飾因子（例えば、ｍＲＮＡスプライシング因子）、非コードＲＮＡ（例えば、ｓｎＲＮＡもしくはｓｎｏＲＮＡ）、またはリボ核酸タンパク質（例えば、ｓｎＲＮＰもしくはｓｎｏＲＮＰ）、構造タンパク質（例えば、ラミンもしくはカリソケレタル（ｋａｒｙｓｏｋｅｌｅｔａｌ）タンパク質）を含むか、またはそれをコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１４６．核タンパク質ペイロード剤が、抗体分子、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｓｄＡｂ、デュオボディ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、ザイボディ、ラクダ抗体、ＢｉＴＥ、クアドローマ、またはｂｓＤｂを含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１４７．核タンパク質ペイロード剤が、エフェクタードメインおよび局在化ドメインを含む融合タンパク質を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１４８．局在化ドメインが、ＴＡＬドメイン、ジンクフィンガードメイン、Ｃａｓ９ドメイン、またはメガヌクレアーゼドメインを含む、実施形態１４７に記載のフソソーム。
１４９．エフェクタードメインが、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、塩基エディター（デアミナーゼ）、転写因子、またはエピジェネティック修飾因子を含む、実施形態１４７または１４８に記載のフソソーム。
１５０．核タンパク質ペイロード剤が、遺伝子編集タンパク質または核酸、例えば、Ｃａｓ９またはガイドＲＮＡを含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１５１．核ペイロード剤が、機能性ＲＮＡを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１５２．核ペイロード剤が、核タンパク質ペイロード剤、例えば、タンパク質またはタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１５３．核ペイロード剤が、（ｉ）核酸、および（ｉｉ）核酸の核移入を促進するタンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１５４．核酸が、結合部位を含み、核移入を促進するタンパク質が、結合部位に結合する、実施形態１５３に記載のフソソーム。
１５５．結合部位が、ＴｅｔＲ結合部位を含み、タンパク質が、ＴｅｔＲを含む、実施形態１５４に記載のフソソーム。
１５６．核ペイロード剤が、合成転写因子、例えば、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、特定のＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＴＡＬドメイン、ＺＦドメイン、またはＣａｓ９ドメイン、および（ｉｉ）転写活性化因子ドメインまたは転写抑制ドメインを含む融合タンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１５７．核ペイロード剤が、合成エピジェネティック修飾因子、例えば、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメインおよび（ｉｉ）エピジェネティック修飾因子ドメインを含む融合タンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１５８．核タンパク質ペイロード剤が、表１７－１から選択されるタンパク質であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１５９．核タンパク質ペイロード剤が、表１７－１から選択されるタンパク質のフラグメント、バリアント、もしくはホモログであるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１６０．核タンパク質ペイロード剤が、表１７－１から選択されるタンパク質であるか、またはそれを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１６１．核タンパク質ペイロード剤が、表１７－１から選択されるタンパク質のフラグメント、バリアント、またはホモログを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
オルガネラ送達
１６２．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）オルガネラペイロード剤、例えば、オルガネラタンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現する）と、を含み、標的細胞が複数のフソソームと接触すると、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドが、標的細胞のミトコンドリアにおいて、細胞質または標的細胞原形質膜中のオルガネラタンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高いレベルで豊富化される、フソソーム。
１６３．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）標的細胞の細胞質オルガネラにおいて、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドを豊富化するのに十分なオルガネラタンパク質ペイロード剤に対する異種シグナル配列（例えば、表６もしくは６－１のシグナル配列）を含むか、またはコードするオルガネラタンパク質ペイロード剤と、を含み、任意に、異種シグナル配列が、配列番号３９～１２７および６０５～６２６のうちのいずれか１つに記載されている、フソソーム。
１６４．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔であって、内腔がオルガネラを含まない、内腔と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）オルガネラタンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現する）と、を含み、標的細胞が複数のフソソームと接触すると、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドが、標的細胞のシオゾル（ｃｙｏｓｏｌ）または原形質膜に対して、標的細胞のゴルジ装置、小胞体、液胞、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロメノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、またはストレス顆粒のうちの１つ以上において豊富化される、フソソーム。
１６５．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔であって、内腔がオルガネラを含まない、内腔と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）ポリペプチドをコードする核酸を含む、オルガネラタンパク質ペイロード剤と、を含み、標的細胞が、複数のフソソームと接触すると、コードされたポリペプチドが、標的細胞の細胞質ゾルまたは原形質膜に対して、リソソームおよび／またはエンドソームにおいて豊富化される、フソソーム。
１６６．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）外因性であるか、または過剰発現するオルガネラタンパク質ペイロード剤と、を含み、オルガネラタンパク質ペイロード剤が、ミトコンドリア膜タンパク質、ミトコンドリア外膜タンパク質、ミトコンドリア内膜タンパク質、ミトコンドリア内境界膜タンパク質、ミトコンドリア結晶膜タンパク質、ミトコンドリアＤＮＡタンパク質、ミトコンドリア膜間腔タンパク質、ミトコンドリアマトリックスタンパク質、ミトコンドリアマトリックス顆粒タンパク質、ミトコンドリアクリステタンパク質、ミトコンドリアリボソームタンパク質、ミトコンドリアクリステル内タンパク質、ミトコンドリア末梢空間タンパク質、膜タンパク質、ペルオキシソーム晶質コアタンパク質、ペルオキシソームマトリックスタンパク質、ペルオキシンから選択されるポリペプチドを含むか、またはコードする、フソソーム。
１６７．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）外因性であるか、または過剰発現するオルガネラタンパク質ペイロード剤と、を含み、オルガネラタンパク質ペイロード剤が、
ｉ）代謝タンパク質（例えば、電子伝達系タンパク質もしくはＡＴＰ合成酵素）、
ｉｉ）プロテアーゼ、
ｉｉｉ）シャペロン、
ｉｖ）タンパク質輸送タンパク質、
ｖ）ミトコンドリアリボソームタンパク質、
ｖｉ）ミトコンドリア転写タンパク質、または
ｖｉｉ）ミトコンドリア複製タンパク質から選択されるポリペプチドを含むか、またはコードする、フソソーム。
１６８．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）標的細胞の細胞質ゾルまたは核に（少なくとも部分的に）存在する内因性タンパク質に結合する第１のドメイン、および標的細胞の細胞質オルガネラへの移入を促進する第２のドメインを含むか、またはコードするオルガネラタンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現する）と、を含む、フソソーム。
１６９．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）（ｉ）核酸、および（ｉｉ）細胞質オルガネラへの核酸の移入を促進するタンパク質を含む、オルガネラタンパク質ペイロード剤と、を含む、フソソーム。
１７０．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）オルガネラタンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現する）と、を含み、オルガネラタンパク質ペイロード剤が、核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、例えば、機能性ＲＮＡまたはタンパク質をコードする核酸を含む、フソソーム。
１７１．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）オルガネラペイロード剤、例えば、オルガネラタンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する）と、を含み、
ｉｘ）フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれに含まれる、
ｉｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、
ｘｉ）フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数の治療薬を含む、
ｘｉｉ）フソソームが、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの７５％以内である脂質を含む、
ｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
ｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも１０％多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取込みが可能である、
ｘｖ）フソソームが、被験体、例えば、マウスに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば、実施例８７または１００のアッセイにより、例えば、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％または１０％が、２４時間後に標的組織内に存在する、あるいは
ｘｖｉ）ソース細胞が、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、フソソーム。
１７２．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）オルガネラペイロード剤、例えば、オルガネラタンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する）と、を含み、
ｉ）フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれに含まれる、
ｉｉ）フソソームが、除核細胞を含む、
ｉｉｉ）フソソームが、不活化核を含む、
ｉｖ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で融合する、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で融合する、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、２４、４８、または７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
ｖｉｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、
ｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４３または１５６のアッセイによって測定した場合、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で治療薬を含む、
ｉｘ）フソゲンのコピー数と治療薬のコピー数との比が、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００の間である、
ｘ）フソソームが、ソース細胞のそれと実質的に同様の脂質組成物を含むか、またはＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％以内である、
ｘｉ）フソソームが、例えば、実施例４２または１５５のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
ｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質とタンパク質との比率を含む、
ｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるタンパク質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を含む、
ｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例５１または１５９のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を含む、
ｘｖ）フソソームが、被験体、例えば、マウスにおいて、例えば、実施例７５のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の半減期を有する、
ｘｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く（例えば、約１１．６％多く）グルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を、膜を横切って輸送する、
ｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
ｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞におけるクエン酸合成酵素活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の代謝活性レベルを含む、
ｘｉｘ）フソソームが、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の呼吸レベル（例えば、酸素消費率）を含む、
ｘｘ）フソソームが、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含む、
ｘｘｉ）フソソームが、例えば、実施例３９のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ含有量レベルを有する、
ｘｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４７のアッセイにより、ソース細胞のそれの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内、もしくはそれ以上大きい、または例えば、ソース細胞のそれの１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、もしくは８０％～９０％以内の可溶性：不溶性タンパク質の比率を有する、
ｘｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４８のアッセイにおいて、ソース細胞のＬＰＳ含有量の５％、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％未満、またはそれ以下のＬＰＳレベルを有する、
ｘｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取込みが可能である、
ｘｘｖ）フソソームが、被験体、例えば、マウスに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば、実施例８７または１００のアッセイにより、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、２４、４８、または７２時間後に標的組織内に存在する、
ｘｘｖｉ）フソソームが、例えば、実施例７１のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７２のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７３のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内のレベルでアクチンを重合する、
ｘｘｉｘ）フソソームが、例えば、実施例７４のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約－２０～－１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ、もしくは－１００～－１５０ｍＶの膜電位を有する、
ｘｘｘ）フソソームが、例えば、実施例５７のアッセイを使用して、例えば、ソース細胞またはソース細胞と同じタイプの細胞の血管外漏出の速度の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の速度で、血管からの血管外漏出が可能であり、ソース細胞が、好中球、リンパ球、Ｂ細胞、マクロファージ、またはＮＫ細胞である、
ｘｘｘｉ）フソソームが、細胞膜、例えば、内皮細胞膜または血液脳関門を通過することができる、
ｘｘｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％大きい割合でタンパク質を分泌することができる、
ｘｘｘｉｉｉ）フソソームが、医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）基準を満たしている、
ｘｘｘｉｖ）フソソームが、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｘｘｘｖ）フソソームが、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、
ｘｘｘｖｉ）フソソームが、所定の参照値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない、
ｘｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
ｘｘｘｖｉｉｉ）ソース細胞が、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、あるいは
ｘｘｘｉｘ）ソース細胞が、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または幹細胞以外のものである、フソソーム。
１７３．細胞質オルガネラが、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、またはストレス顆粒から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１７４．細胞質オルガネラが、膜結合オルガネラである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１０ａ．オルガネラペイロード剤が、ミトコンドリアマトリックス、ミトコンドリア膜間腔、ミトコンドリア外膜、ミトコンドリア内膜、またはミトコンドリアクリステのうちの１つ以上において豊富化される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１７５．オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドが、表１７－２のタンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１７６．標的細胞の集団が複数のフソソームと接触すると、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドが、例えば、実施例１２３または１２４のアッセイにおいて測定されるように、標的細胞の集団中の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の細胞の細胞質オルガネラにおいて豊富化される（例えば、標的細胞の細胞質中のオルガネラタンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも５０％高いレベルで標的細胞の細胞質オルガネラに存在するようになる）、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１７７．標的細胞の集団が複数のフソソームと接触すると、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、標的細胞の集団の亜集団（「融合集団」）に存在するようになり、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、例えば、実施例１２３～１２４のアッセイにおいて測定した場合、融合集団における少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の細胞の細胞質オルガネラにおいて豊富化される（例えば、標的細胞の細胞質ゾル中のオルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドのレベルよりも少なくとも５０％高いレベルで標的細胞の細胞質に存在するようになる）、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１７８．少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１，０００コピーのオルガネラタンパク質ペイロード剤、またはそこにコードされるポリペプチドが、複数のフソソームと接触した標的細胞中の細胞質オルガネラに存在する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１７９．オルガネラタンパク質ペイロード剤が、基本的なヘリックス・ループヘリックスモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフ、ホメオドメインモチーフ、翼状ヘリックスモチーフ、翼状ヘリックス・ターンモチーフ、ＨＭＧ－ボックスドメイン、Ｗｏｒ３ドメイン、ＯＢフォールドドメイン、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、またはＢ３ドメインのうちの１つ以上を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１８０．オルガネラタンパク質ペイロード剤が、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、またはヘテロ四量体を含むタンパク質複合体を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１８１．オルガネラタンパク質ペイロード剤が、タンパク質の天然に存在する対応物中のシグナル配列と同じシグナル配列を有するタンパク質を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１８２．オルガネラタンパク質ペイロード剤が、タンパク質の天然に存在する対応物によって含まれないシグナル配列を有するタンパク質を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１８３．オルガネラタンパク質ペイロード剤が、抗体分子、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｓｄＡｂ、デュオボディ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、ザイボディ、ラクダ抗体、ＢｉＴＥ、クアドローマ、またはｂｓＤｂを含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１８４．オルガネラペイロード剤が、機能性ＲＮＡを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１８５．オルガネラペイロード剤が、オルガネラタンパク質ペイロード剤、例えば、タンパク質またはタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１８６．オルガネラペイロード剤が、レポータータンパク質または蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰを含まないか、またはコードしない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１８７．内腔が、オルガネラを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１８８．オルガネラタンパク質ペイロード剤、またはそこにコードされるタンパク質が、細胞膜タンパク質または分泌タンパク質ではない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１８９．フソソーム組成物中のウイルスカプシドタンパク質の量が、総タンパク質の１％未満である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１９０．コンドリソームおよびフソゲンを含む、フソソーム。
１９１．部分的または完全な核不活化（例えば、核除去）を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１９２．ソース細胞が、付着または懸濁条件下で増殖した細胞である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１９３．ソース細胞が、初代細胞、培養細胞、不死化細胞、または細胞株（例えば、ミエロバスト（ｍｙｅｌｏｂａｓｔ）細胞株、例えば、Ｃ２Ｃ１２）である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１９４．ソース細胞が、内皮細胞、線維芽球、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯からの幹細胞、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆細胞（例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球）、前駆細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ９０、ＩＭＲ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、もしくはＢＪ細胞）である、上記実施のいずれかに記載のフソソーム。
１９５．ソース細胞が、同種異系である、例えば、標的細胞と同じ種の異なる生物から得られる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１９６．ソース細胞が、自己由来である、例えば、標的細胞と同じ生物から得られる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１９７．ソース細胞が、異種である、例えば、標的細胞とは異なる種の生物から得られる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１９８．ソース細胞が、白血球または幹細胞から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
１９９．ソース細胞が、好中球、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）、マクロファージ、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または骨髄芽球から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２００．ソース細胞が、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または幹細胞以外のものである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２０１．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
ｉ）ソース細胞が、形質転換もしくは不死化されていない、または
ｉｉ）ソース細胞が、アデノウイルスを介した不死化以外の方法を使用して形質転換または不死化され、例えば、自然突然変異もしくはテロメラーゼ発現によって不死化される、フソソーム。
２０２．フソソームが、修飾されたゲノムを有する、例えば、（例えば、ＭＨＣ複合体を除去するためのゲノム編集によって）免疫原性が低下したソース細胞に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２０３．ソース細胞が、抗炎症シグナルで処理された細胞培養物に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２０４．ソース細胞が、例えば、本明細書に記載のアッセイを使用して、実質的に非免疫原性である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２０５．ソース細胞が、組換え細胞である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２０６．ソース細胞が、ソース細胞に対して外因性である第２の作用物質、例えば、治療薬、例えば、タンパク質または核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）を更に含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２０７．第２の作用物質が、フソソームによって含まれる少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、もしくは１，０００，０００コピー、またはそれ以下で存在するか、あるいはフソソームあたり少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、もしくは１，０００，０００コピー、またはそれ以下の平均レベルで存在する、実施形態２０６に記載のフソソーム。
２０８．フソソームが、ソース細胞、例えば、哺乳動物ソース細胞をｓｉＲＮＡまたは遺伝子編集酵素で処理することにより、ソース細胞、例えば、タンパク質または核酸と比較して、改変した、例えば増加または減少したレベルの１つ以上の内因性分子を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２０９．フソソームが、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、もしくは１，０００，０００コピー、またはそれ以下の内因性分子を含むか、あるいはフソソームあたり少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、もしくは１，０００，０００コピー、またはそれ以下の平均レベルで存在する、実施形態２０８に記載のフソソーム。
２１０．内因性分子（例えば、ＲＮＡもしくはタンパク質）が、ソース細胞におけるその濃度よりも少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、または１．０×１０８高い濃度で存在する、実施形態２０８または実施形態２０９に記載のフソソーム。
２１１．内因性分子（例えば、ＲＮＡもしくはタンパク質）が、ソース細胞におけるその濃度よりも少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、または１．０×１０８低い濃度で存在する、実施形態２０８または実施形態２０９に記載のフソソーム。
２１２．例えば、実施例３９のアッセイにより、フソソームが、ソース細胞のそれよりも少なくとも１％のｍｉＲＮＡ含有量レベルを有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２１３．第２の作用物質、例えば、治療薬が、タンパク質、タンパク質複合体（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、もしくは５０個のタンパク質、例えば、少なくとも少なくとも２、３、４、５、１０、２０、もしくは５０個の異なるタンパク質）ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体、もしくはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ）、または小分子から選択される、実施形態２０６または２０７に記載のフソソーム。
２１４．フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２１５．フソソームが、例えば、実施例４７のアッセイにより、フソソームが、ソース細胞のそれの９０％以内の可溶性：不溶性タンパク質比を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２１６．例えば、実施例３０のアッセイによって測定した場合、ソース細胞のサイズの約０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％未満である直径を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２１７．フソソームが、例えば、実施例３０のアッセイによって測定した場合、ソース細胞のそれの約０．０１％または１％未満である直径を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２１８．ソース細胞の体積の約０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％％未満である体積を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２１９．フソゲンが、タンパク質フソゲンである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２２０．フソゲンが、哺乳動物フソゲンまたはウイルスフソゲンである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２２１．フソゲンが、ソース細胞からの小胞形成を促進しない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２２２．フソゲンが、除核細胞を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２２３．フソゲンが、
ｉ）ウイルスタンパク質以外のものである、
ｉｉ）フソゲンが、フソゲン糖タンパク質以外のものである、
ｉｉｉ）フソゲンが、フェルチリン－β以外の哺乳動物のタンパク質である、
ｉｖ）フソゲンが、ＶＳＶＧ、ＳＮＡＲＥタンパク質、もしくは分泌顆粒タンパク質以外のものである、または
ｖ）フソゲンが、ＴＡＴ、ＴＡＴ－ＨＡ２、ＨＡ－２、ｇｐ４１、アルツハイマー病のβアミロイドペプチド、センダイウイルスタンパク質、または両親媒性の正味の負電荷（ｎｅｔ－ｎｅｇａｔｉｖｅ）ペプチド（ＷＡＥ １１）以外のものである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２２４．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、あるいは
ｉｉ）フソゲンのコピー数とペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）のコピー数との比が、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００の間である、フソソーム。
２２５．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
フソソームが、フソソームに治療用または診断用物質をロードすることによって作製されたものではなかった、
ｉｉ）ソース細胞には、治療用または診断用物質はロードされていなかった、
ｉｉｉ）フソソームが、ドキソルビシン、デキサメタゾン、シクロデキストリン；ポリエチレングリコール、マイクロＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ１２５、ＶＥＧＦ受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｅ－セレクチン、酸化鉄、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰもしくはＲＦＰ、ナノ粒子、もしくはＲＮａｓｅを含まないか、またはソース細胞に対して外因性である上記のうちのいずれの形態も含まない、あるいは
ｉｖ）フソソームが、ソース細胞に対して外因性であり、１つ以上の翻訳後修飾、例えば、グリコシル化を含む治療薬を更に含む、フソソーム。
２２６．フソゲンが、ウイルス性フソゲン、例えば、ＨＡ、ＨＩＶ－１ ＥＮＶ、ｇｐ１２０、もしくはＶＳＶ－Ｇであるか、またはフソゲンが、哺乳動物フソゲン、例えば、ＳＮＡＲＥ、シンシチン、ミオメーカー（ｍｙｏｍａｋｅｒ）、ミオミキサー（ｍｙｏｍｉｘｅｒ）、ミオマージャー（ｍｙｏｍｅｒｇｅｒ）、もしくはＦＧＦＲＬ１である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２２７．フソゲンが、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、または９～１０のｐＨで活性である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソームまたはフソソーム。
２２８．フソゲンが、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、または９～１０のｐＨでは活性でない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２２９．フソゲンが、脂質フソゲン、例えば、オレイン酸、モノオレイン酸グリセロール、グリセリド、ジアシルグリセロール、または修飾された不飽和脂肪酸である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２３０．フソゲンが、化学フソゲン、例えば、ＰＥＧである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２３１．フソゲンが、小分子フソゲン、例えば、ハロタン、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、およびクロルプロマジンなどのＮＳＡＩＤである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２３２．フソゲンが、組換えである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２３３．フソゲンが、生化学的に組み込まれる、例えば、フソゲンが、精製タンパク質として提供され、フソゲンと脂質二重層との会合を可能にする条件下でフソソーム脂質二重層と接触する、または生合成的に組み込まれる、例えば、フソゲンがフソソーム脂質二重層と会合することを可能にする条件下でソース細胞で発現される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２３４．フソソームが、以下の特性のうちの１つ以上を有する、
ｉ）フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、もしくはそれに含まれる、
ｉｉ）フソソームが、除核細胞を含むか、もしくはそれに含まれる、または
ｉｉｉ）フソソームが、不活化核を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２３４Ａ．フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数でペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２３５．フソソームが、以下の特性のうちの１つ以上を有する、
ｉ）フソソームが、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの７５％以内である脂質を含む、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質とタンパク質との比率を含む、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるタンパク質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を含む、
ｉｖ）フソソームが、例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２３６．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％（例えば、１０％）高い割合で融合する、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、５０％）高い割合で融合する、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、２４、４８、または７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、１０％）に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％多く、グルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を膜を横切って輸送する、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の９０％以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性（例えば、クエン酸合成酵素活性）の９０％以内の代謝活性レベルを含む、
ｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの９０％以内の呼吸レベル（例えば、酸素消費率）を含む、
ｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含む、
ｉｘ）フソソームが、例えば、実施例４８のアッセイによって測定した場合、フソソームの脂質含有量の５％未満のＬＰＳレベルを有する、
ｘ）フソソームが、例えば、実施例７１のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも５％大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｉ）フソソームが、例えば、実施例７２のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも５％大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７３のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、５％以内のレベルでアクチンを重合する、
ｘｉｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも少なくとも５％大きい割合でタンパク質を分泌することができる、のうちの１つ以上である、フソソーム。
２３７．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）フソソームが、例えば、実施例７４のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約５％以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約－２０～－１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ、もしくは－１００～－１５０ｍＶの膜電位を有する、
ｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例５７のアッセイを使用して、例えば、ソース細胞と同じタイプの細胞の血管外漏出の速度の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の速度で、血管からの血管外漏出が可能であり、ソース細胞が、好中球、リンパ球、Ｂ細胞、マクロファージ、またはＮＫ細胞である、
ｉｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、細胞膜、例えば、内皮細胞膜または血液脳関門を、例えば、ソース細胞と同じタイプの細胞のそれの少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の速度で通過することができる、
ｉｖ）フソソームが、医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）基準を満たしている、
ｖ）フソソームが、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｖｉ）フソソームが、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、
ｖｉｉ）フソソームが、所定の参照値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない、あるいは
ｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、のうちの１つ以上である、フソソーム。
２３８．フソソームが、コンドリソームであるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２３９．フソソームが、例えば、実施例７５のアッセイにより、被験体、例えば、マウスにおいて、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の９０％以内の半減期を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２４０．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、１．０８ｇ／ｍＬ～１．１２ｇ／ｍＬの間以外の密度を有する、
ｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例３３のアッセイによって測定した場合、１．１２ｇ／ｍＬ超、例えば、１．２５ｇ／ｍＬ＋／－０．１、１．２５ｇ／ｍＬ＋／－０．０５の密度を有する、
ｉｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例３３のアッセイにより、１未満、１～１．１、１．０５～１．１５、１．１～１．２、１．１５～１．２５、１．２～１．３、１．２５～１．３５、または１．３５ｇ／ｍＬ超の密度を有する、フソソーム。
２４１．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）フソソームが、循環中のスカベンジャー系または肝臓の洞内のクッパー細胞によって捕捉されない、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７６のアッセイにより、被験体の細網内皮系（ＲＥＳ）によって捕捉されない、
ｉｉｉ）複数のフソソームが被験体に投与される場合、複数の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満が、例えば、実施例７６のアッセイにより、２４時間後にＲＥＳによって捕捉されない、のうちの１つ以上である、フソソーム。
２４２．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）フソソームが、医薬品もしくは適正製造基準（ＧＭＰ）基準を満たしている、
ｉｉ）フソソームが、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｉｉｉ）フソソームが、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、または
ｉｖ）フソソームが、所定の参照値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない、フソソーム。
２４３．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
ｉ）フソソームが、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、または２００μｍを超える直径を有する、
ｉｉ）フソソームが、４０～１５０ｎｍの間以外、例えば、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、または５００ｎｍを超える直径を有する、
ｉｉｉ）フソソームが、少なくとも８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、または１５００ｎｍの直径を有する、
ｉｖ）フソソームが、８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、または１５００ｎｍ未満の直径を有する、あるいは
ｖ）フソソームが、例えば、実施例３２のアッセイによって測定した場合、少なくとも約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、または２００ｎｍの直径を有する、フソソーム。
２４４．フソソームが、その内腔に、酵素、抗体、または抗ウイルスポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２４５．フソソームが、ＣＤ６３またはＧＬＵＴ４を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２４６．フソソームが、
ｉ）ウイルスを含まない、感染性ではない、もしくは宿主細胞内で増殖しない、
ｉｉ）ＶＬＰ（ウイルス様粒子）ではない、
ｉｉｉ）ウイルス構造タンパク質、例えば、ウイルスカプシドタンパク質、例えば、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質を含まないか、またはウイルスカプシドタンパク質の量が、例えば、実施例５３のアッセイにより、総タンパク質の１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、もしくは０．１％未満である、
ｉｖ）ウイルスマトリックスタンパク質を含まない、
ｖ）ウイルスの非構造タンパク質を含まない、
ｖｉ）１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピー未満のウイルス構造タンパク質を含む、あるいは
ｖｉｉ）ビロゾームではない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２４７．フソソームが、ウイルス構造タンパク質および／またはウイルスマトリックスタンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２４８．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
ｉ）フソゲンのコピー数とフソソーム上のウイルス構造タンパク質のコピー数との比が、少なくとも１，０００，０００：１、１００．０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、または１：１である。
ｉｉ）フソゲンのコピー数とフソソーム上のウイルスマトリックスタンパク質のコピー数との比が、少なくとも１，０００，０００：１、１００．０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、または１：１である、フソソーム。
２４９．フソソームが、単層または多層である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２５０．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
ｉ）フソソームが、水不混和性の液滴を含まない、
ｉｉ）フソソームが、水性内腔および親水性外部を含む、フソソーム。
２５１．フソソームが、以下のオルガネラ：ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒のうちの１つ以上を実質的に含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２５２．フソソームが、ソース細胞と比較して少数のオルガネラを有し、オルガネラが、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２５３．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
ｉ）フソソームが、エクソソームではない、
ｉｉ）フソソームが、微小胞である、
ｉｉｉ）フソソームが、非哺乳動物のフソゲンを含む、
ｉｖ）フソソームが、フソゲンを組み込むように操作されている、
ｖ）フソソームが、ソース細胞に対して外因性であるフソゲンを含む、
ｖｉ）フソソームが、１つ以上のオルガネラ、例えば、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、ストレス顆粒、またはそれらの組み合わせを含む、
ｖｉｉ）フソソームが、細胞骨格またはその成分、例えば、アクチン、Ａｒｐ２／３、フォルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、またはチューブリンを含む、
ｖｉｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，″Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．″Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２に記載される、例えばショ糖勾配遠心分離アッセイにおいて、１．０８～１．２２ｇ／ｍｌの浮遊密度を有しないか、または少なくとも１．１８～１．２５ｇ／ｍｌ、もしくは１．０５～１．１２ｇ／ｍＬの密度を有する、
ｉｘ）フソソーム脂質二重層が、ソース細胞と比較して、セラミドもしくはスフィンゴミエリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されているか、あるいはフソソーム脂質二重層が、ソース細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、もしくはホスファチジルセリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されていない（例えば、枯渇している）、
ｘ）フソソームが、実施例５２のアッセイにおいて測定した場合、ホスファチジルセリン（ＰＳ）もしくはＣＤ４０リガンド、またはＰＳおよびＣＤ４０リガンドの両方を含む、
ｘｉ）フソソームが、ソース細胞と比較して、ＰＳについて豊富化されており、例えば、複数のフソソームにおいて、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、ＰＳに対して陽性である、
ｘｉｉ）フソソームが、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を実質的に含まないか、または例えば、実施例６７のアッセイにより、０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００ ＡＣｈＥ活性単位／タンパク質ｕｇ未満を含む、
ｘｉｉｉ）フソソームが、テトラスパニンファミリータンパク質（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、もしくはＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（例えば、ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ－Ｂ、もしくはＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン－４、ミトフィリン、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン－１、熱ショック７０－ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）、またはそれらの任意の組み合わせを実質的に含まないか、あるいは例えば、実施例４４のアッセイにより、任意の個々のエクソソームマーカータンパク質の０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、５％、もしくは１０％未満、および／または前述のタンパク質のうちのいずれかの総エクソソームマーカータンパク質の０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、もしくは２５％未満を含むか、あるいはこれらのタンパク質のうちのいずれか１つ以上について豊富化されていない、
ｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例４５のアッセイを使用して、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、もしくは１ｎｇ ＧＡＰＤＨ／総タンパク質μｇを下回る、またはソース細胞中のＧＡＰＤＨのレベルを下回る、例えば、ソース細胞中の総タンパク質あたりのＧＡＰＤＨのレベル（ｎｇ／μｇ）よりも１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％未満低いレベルのグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を含む、
ｘｖ）フソソームが、１つ以上の小胞体タンパク質（例えば、カルネキシン）、１つ以上のプロテアソームタンパク質、もしくは１つ以上のミトコンドリアタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせについて豊富化され、例えば、カルネキシンの量が、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、もしくは１ｎｇカルネキシン／総タンパク質μｇを超えるか、あるいはフソソームが、例えば、実施例４６のアッセイを使用して、ソース細胞と比較して、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多い総タンパク質あたりのカルネキシン（ｎｇ／μｇ）を含む、
ｘｖｉ）フソソームが、例えば、実施例３９または４０のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞に対して外因性である作用物質（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ）を含む、あるいは
ｘｖｉｉ）フソソームが、原子間力顕微鏡により、雲母表面に少なくとも３０分間固定化され得る、フソソーム。
２５４．上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
ｉ）フソソームが、エクソソームである、
ｉｉ）フソソームが、微小胞ではない、
ｉｉｉ）フソソームが、オルガネラを含まない、
ｉｖ）フソソームが、細胞骨格またはその成分、例えば、アクチン、Ａｒｐ２／３、フォルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、またはチューブリンを含まない、
ｖ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、ショ糖勾配遠心分離アッセイにおいて、１．０８～１．２２ｇ／ｍＬの浮遊密度を有する、
ｖｉ）フソソーム脂質二重層が、ソース細胞と比較して、セラミドもしくはスフィンゴミエリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されていない（例えば、枯渇している）か、あるいはフソソーム脂質二重層が、ソース細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、もしくはホスファチジルセリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されている、
ｖｉｉ）フソソームが、実施例５２のアッセイにおいて測定した場合、ホスファチジルセリン（ＰＳ）もしくはＣＤ４０リガンド、またはＰＳおよびＣＤ４０リガンドの両方を含まないか、ソース細胞に対して枯渇している、
ｖｉｉｉ）フソソームが、ソース細胞と比較して、ＰＳについて豊富化されていない（例えば、枯渇している）、例えば、複数のフソソームにおいて、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満が、ＰＳに対して陽性である、
ｉｘ）フソソームが、例えば、実施例６７のアッセイにより、例えば、少なくとも０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００ ＡＣｈＥ活性単位／タンパク質ｕｇのアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を含む、
ｘ）フソソームが、テトラスパニンファミリータンパク質（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、もしくはＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（例えば、ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ－Ｂ、もしくはＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン－４、ミトフィリン、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン－１、熱ショック７０－ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、例えば、実施例４４のアッセイにより、ソース細胞と比較して、任意の個々のエクソソームマーカータンパク質の０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、５％、もしくは１０％超、および／または前述のタンパク質のうちのいずれかの総エクソソームマーカータンパク質の０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、もしくは２５％未満を含むか、あるいはこれらのタンパク質のうちのいずれか１つ以上について豊富化されている、
ｘｉ）フソソームが、例えば、実施例４５のアッセイを使用して、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、もしくは１ｎｇ ＧＡＰＤＨ／総タンパク質μｇを上回る、またはソース細胞中のＧＡＰＤＨのレベルを下回る、例えば、ソース細胞中の総タンパク質あたりのＧＡＰＤＨのレベルよりも少なくとも１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％多いレベルのグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を含む、
ｘｉｉ）フソソームが、１つ以上の小胞体タンパク質（例えば、カルネキシン）、１つ以上のプロテアソームタンパク質、もしくは１つ以上のミトコンドリアタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせについて豊富化されず（例えば、枯渇している）、例えば、カルネキシンの量が、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、もしくは１ｎｇカルネキシン／総タンパク質μｇ未満であるか、あるいはフソソームが、例えば、実施例４６のアッセイを使用して、ソース細胞と比較して、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少ない総タンパク質あたりのカルネキシン（ｎｇ／μｇ）を含む、あるいは
ｘｉｉｉ）フソソームを、原子間力顕微鏡により、雲母表面に少なくとも３０分間固定化することができない、フソソーム。
２５５．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）フソソームが、ＶＬＰを含まない、
ｉｉ）フソソームが、ウイルスを含まない、
ｉｉｉ）フソソームが、複製能ウイルスを含まない、
ｉｖ）フソソームが、ウイルスタンパク質、例えば、ウイルス構造タンパク質、例えば、カプシドタンパク質もしくはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、
ｖ）フソソームが、エンベロープウイルス由来のカプシドタンパク質を含まない、
ｖｉ）フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質を含まない、または
ｖｉｉ）フソゲンが、ウイルスフソゲンではない、フソソーム。
２５６．フソソームが、細胞質ゾルを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２５７．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）フソソームが、例えば、実施例１０２のアッセイにより、被験体に移植されたときに奇形腫を形成しない、
ｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例５８のアッセイを使用して、参照細胞、例えばマクロファージと比較して、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の速度で走化性が可能である、
ｉｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、傷害の部位にホーミングすることができ、フソソームが、例えば、実施例５９のアッセイを使用して、ヒト細胞に由来し、例えば、ソース細胞が、好中球である、あるいは
ｉｖ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、食作用が可能であり、例えば、フソソームによる食作用が、実施例６０のアッセイを使用して、０．５、１、２、３、４、５、または６時間以内に検出可能であり、例えば、ソース細胞が、マクロファージである、フソソーム。
２５８．フソソームが、以下の特徴のうちの１つ以上を有する、
ａ）ソース細胞からの１つ以上の内因性タンパク質、例えば、膜タンパク質もしくは細胞質ゾルタンパク質を含む、
ｂ）少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、もしくは５０００個の異なるタンパク質を含む、
ｃ）少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、もしくは１００個の異なる糖タンパク質を含む、
ｄ）フソソーム中のタンパク質の少なくとも１０質量％、２０質量％、３０質量％、４０質量％、５０質量％、６０質量％、７０質量％、８０質量％、もしくは９０質量％が、天然に存在するタンパク質である、
ｅ）少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、もしくは５０００個の異なるＲＮＡを含む、または
ｆ）少なくとも２、３、４、５、１０、もしくは２０個の異なる脂質を含み、例えば、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧから選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２５９．フソソームが、以下の特性のうちの１、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上を有するように操作されているか、またはフソソームが、天然に存在する細胞ではなく、以下の特性のうちの１、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上を有するか、または核が、天然に、以下の特性のうちの１、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上ではない、
ｉ）部分的な核の不活化が、核機能、例えば、転写もしくはＤＮＡ複製、または両方の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上の低下をもたらし、例えば、転写が、実施例１９のアッセイにより測定され、ＤＮＡ複製が、実施例２０のアッセイにより測定される、
ｉｉ）フソソームが、転写ができないか、または例えば、実施例１９のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞の転写活性のそれの１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％未満の転写活性を有する、
ｉｉｉ）フソソームが、核ＤＮＡ複製ができないか、または例えば、実施例２０のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞の核ＤＮＡ複製の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％未満の核ＤＮＡ複製を有する、
ｉｖ）フソソームが、クロマチンを欠いているか、または例えば、実施例３７のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞のクロマチン含有量の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％未満のクロマチン含有量を有する、
ｖ）フソソームが、核膜を欠いているか、または例えば、実施例３６のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはＪｕｒｋａｔ細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満の核膜の量を有する、
ｖｉ）フソソームが、機能的な核膜孔複合体を欠いているか、または例えば、実施例３６のアッセイにより、移入もしくは移出活性が少なくとも５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％％、３％、２％、もしくは１％低減したか、あるいはフソソームが、核孔タンパク質、例えば、ＮＵＰ９８またはインポーチン７のうちの１つ以上を欠いている、
ｖｉｉ）フソソームが、ヒストンを含まないか、または例えば、実施例３７のアッセイにより、ソース細胞（例えば、Ｈ１、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３、もしくはＨ４）の１％未満のヒストンレベルを有する、
ｖｉｉｉ）フソソームが、２０、１０、５、４、３、２、または１未満の染色体を含む、
ｉｘ）核機能が、排除されている、
ｘ）フソソームが、除核された哺乳動物細胞である、
ｘｉ）核が、除去または不活化される、例えば、機械的力によって、放射線によって、もしくは化学的アブレーションによって押し出される、あるいは
ｘｉｉ）フソソームが、例えば、間期または有糸分裂中に完全にまたは部分的に除去されるＤＮＡを有する哺乳動物細胞に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２６０．フソソームが、ｍｔＤＮＡまたはベクターＤＮＡを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２６１．ＤＮＡを含まないか、または実質的にＤＮＡを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２６２．フソソームが、機能的核を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２６３．フソソームが、核を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２６４．フソソームが、核ＤＮＡを実質的に含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２６５．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉｉ）フソソームが、ＣｒｅもしくはＧＦＰ、例えばＥＧＦＰを含まない、または
ｉｉｉ）フソソームが、ソース細胞に対して外因性であり、ＣｒｅもしくはＧＦＰ、例えば、ＥＧＦＰ以外であるタンパク質を更に含む、フソソーム。
２６６．フソソームが、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ）またはタンパク質（例えば、抗体）を更に含み、核酸またはタンパク質が、例えば、内腔において、ソース細胞に対して外因性である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２６７．フソソームが、ミトコンドリアを含まないか、またはミトコンドリアを実質的に含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２６８．被験体、例えばヒト被験体への投与後、５日以内、例えば、４日以内、３日以内、２日以内、１日以内、例えば、約１２～７２時間にわたって、いずれかの特徴のうちの１、２、３、４、５、６つ、またはそれ以上を保持する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２６９．標的細胞または標的細胞の表面特徴部と会合および／または結合する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２７０．標的細胞の表面で標的細胞に融合する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２７１．リソソームに依存しない方法で標的細胞への融合を促進する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２７２．フソソームおよび／またはフソソーム内容物が、エンドサイトーシスによって、または非エンドサイトーシス経路を介して標的細胞に入る、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２７３．フソソーム脂質二重層の少なくとも一部が、標的細胞膜に組み込まれるようになる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２７４．フソソームが、エンドサイトーシスによって標的細胞に入り、例えば、所与のフソソームのエンドサイトーシス経路を介して送達されるペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）のレベルが、例えば、実施例９１のアッセイを使用して、０．０１～０．６、０．０１～０．１、０．１～０．３、もしくは０．３～０．６であるか、またはクロロキン処理された参照細胞よりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上大きい、実施形態２７３に記載のフソソーム。
２７５．フソソームが、非エンドサイトーシス経路によって標的細胞に入り、例えば、所与のフソソームの非エンドサイトーシス経路を介して送達されるペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）のレベルが、例えば、実施例９０のアッセイを使用して、０．１～０．９５、０．１～０．２、０．２～０．３、０．３～０．４、０．４～０．５、０．５～０．６、０．６～０．７、０．７～０．８、０．８～０．９、０．９～０．９５であるか、またはクロロキン処理された参照細胞よりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上大きい、実施形態２７３に記載のフソソーム。
２７６．標的細胞が、生物内にある、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２７７．標的細胞が、生物から単離された初代細胞である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２７８．標的細胞が、内皮細胞、線維芽球、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯からの幹細胞、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆細胞（例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球）、前駆細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ９０、ＩＭＲ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、もしくはＢＪ細胞）から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２７９．標的細胞が、ＨｅＬａ細胞以外であるか、または標的細胞が、形質転換もしくは不死化されていない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２８０．標的細胞が、形質転換または不死化されている、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２８１．標的細胞が、白血球または幹細胞から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２８２．標的細胞が、好中球、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）、マクロファージ、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または骨髄芽球から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２８３．フソソームが、フソソームを標的細胞に局在化させる標的化ドメインを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２８４．標的化ドメインが、標的細胞上の標的細胞部分と相互作用する、実施形態２８３に記載のフソソーム。
２８５．標的細胞部分が、細胞表面の特徴である、実施形態２８４に記載のフソソーム。
２８６．フソソームが、前述の標的細胞部分を含まない、実施形態２８４または実施形態２８５に記載のフソソーム。
２８７．フソソームが、標的細胞上のフソゲン結合パートナーと相互作用し、それによりフソソームが標的細胞に結合または融合することを可能にするフソゲンを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２８８．フソソームが、前述のフソゲン結合パートナーを含まない、実施形態２８７に記載のフソソーム。
２８９．標的化ドメインが、フソゲンの一部ではない、実施形態２８３～２８８のいずれかに記載のフソソーム。
２９０．フソゲンが、標的化ドメインを含む、実施形態２８３～２８８のいずれかに記載のフソソーム。
２９１．フソゲン結合パートナーが、標的細胞部分とは異なる実体であるか、またはその一部である、実施形態２８３～２８９のいずれかに記載のフソソーム。
２９２．フソゲン結合パートナーが、標的細胞部分であるか、またはその一部である、実施形態２８３～２８９のいずれかに記載のフソソーム。
２９３．内腔内に配置されたオルガネラ、例えば、治療上有効な数のオルガネラを更に含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２９４．上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ｉ）ソース細胞が、樹状細胞または腫瘍細胞以外のものあり、例えば、ソース細胞が、内皮細胞、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞）、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、
ｉｉ）フソゲンが、フソゲン糖タンパク質以外のものである、
ｉｉｉ）フソゲンが、フェルチリン－β以外の哺乳動物のタンパク質である、
ｉｖ）フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
ｖ）フソソームが、医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）基準を満たしている、
ｖｉ）複数のフソソームを含む医薬製剤が、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｖｉｉ）複数のフソソームを含む医薬製剤が、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、または
ｖｉｉｉ）複数のフソソームを含む医薬製剤が、所定の参照値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２９５．上記実施形態のいずれかによる複数のフソソームを含む、フソソーム組成物またはフソソーム調製物。
２９６．複数のフソソームを含む、フソソーム組成物であって、少なくとも１つのフソソームが、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）、例えば、本明細書に記載される、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、またはオルガネラタンパク質ペイロード剤と、を含む、フソソーム組成物。
２９７．複数のフソソームのうちの少なくとも１つのフソソームが、ソース細胞に由来する、実施形態２９５または実施形態２９６に記載のフソソーム組成物。
２９８．フソソームが、４、０、－４、－１０、－１２、－１６、－２０、－８０、または－１６０℃未満の温度にある、実施形態２９５～２９７のいずれかに記載のフソソーム組成物。
２９９．複数のフソソームが、少なくとも約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５フソソームを含む、実施形態２９５～２９８のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３００．複数のフソソームが同じである、実施形態２９５～２９９のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３０１．フソソーム組成物中のフソソームの少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、もしくは８０％～９０％が、
同じフソゲンを含む、
同じタイプのソース細胞を使用して産生される、または
同じペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）を含む、から選択される少なくとも１つの特性を共有する場合、複数のフソソームが同じである、実施形態３００に記載のフソソーム組成物。
３０２．複数のフソソームが異なる、実施形態２９５～２９９のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３０３．複数のフソソームが、２つ以上のタイプのソース細胞に由来する、実施形態２９５～３０２のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３０４．少なくとも１μＬ、２μＬ、５μＬ、１０μＬ、２０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、５００μＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、または１０ｍＬの体積を有する、実施形態２９５～３０３のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３０５．複数のフソソームが、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、これらは機能的核を含まない、実施形態２９５～３０４のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３０６．複数のフソソームが、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、これらは核を含まない、実施形態２９５～３０５のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３０７．複数のフソソームが、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、これらは実質的に核ＤＮＡを含まない、実施形態２９５～３０６のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３０８．複数のフソソームが、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、これらは機能的ミトコンドリアを含まない、実施形態２９５～３０７のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３０９．複数のフソソームが、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、これらはミトコンドリアを含まない、実施形態２９５～３０８のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３１０．タンパク質質量で０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、もしくは１０％未満のソース細胞、または０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、もしくは１０％未満の機能的核を有するソース細胞を含む、実施形態２９５～３０９のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３１１．フソソーム組成物が、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、
ｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、または
ｉｉ）フソゲンのコピー数とフソゲンあたりのペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）のコピー数との比が、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００の間である、実施形態２９５～３１０のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３１２．フソソーム組成物が、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）が、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、実施形態２９５～３１１のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３１３．複数のフソソームが、少なくとも約５０ｎｍ、約８０ｎｍ、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１０００ｎｍ、約１２００ｎｍ、約１４００ｎｍ、または約１５００ｎｍの平均径を有する、実施形態２９５～３１２のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３１４．複数のフソソームが、約１０ｎｍ～約１００μｍの範囲内の直径を有するフソソームを含む、実施形態２９５～３１３のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３１５．複数が、約２０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、または約１００ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲内のサイズを有するフソソームを含む、実施形態２９５～３１４のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３１６．複数のフソソームの少なくとも５０％が、フソソーム組成物中のフソソームの平均径の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内の直径を有する、実施形態２９５～３１５のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３１７．複数が、約５００ｎｍ３～約０．０００６ｍｍ３、または約４，０００ｎｍ３～約０．００５μｍ３、約６５，０００ｎｍ３～約０．００５μｍ３、約６５，０００ｎｍ３～約０．０００６μｍ３、約６５，０００ｎｍ３～約０．００２μｍ３、または約０．０００６μｍ３～約０．００２μｍ３の範囲内の体積を有するフソソームを含む、実施形態２９５～３１６のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３１８．複数のフソソームの少なくとも５０％が、フソソーム組成物中のフソソームの平均体積の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内の体積を有する、実施形態２９５～３１７のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３１９．複数のフソソームの少なくとも５０％が、フソソーム組成物中のフソソームの平均フソゲンコピー数の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内のフソゲンのコピー数を有する、実施形態２９５～３１８のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３２０．複数のフソソームの少なくとも５０％が、フソソーム組成物中のフソソームの平均ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）コピー数の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内のペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）のコピー数を有する、実施形態２９５～３１９のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３２１．組成物中のフソソームの１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が、内腔にオルガネラを含み、例えば、内腔が、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、ミトコンドリア、空胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、セントリオール、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、または顆粒のうちの１つ以上を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３２２．上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物または調製物、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
３２３．所定の温度で少なくとも１、２、３、６、もしくは１２時間；１、２、３、４、５、もしくは６日間；１、２、３、もしくは４週間；１、２、３、もしくは６ヶ月間；または１、２、３、４、もしくは５年間維持されている、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
３２４．所定の温度が、約４、０、－４、－１０、－１２、－１６、－２０、－８０、または－１６０℃から選択される、実施形態３２３に記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
３２５．例えば、以下のうちの１つ以上により、前述の温度で維持される前に、複数の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の活性を有する、
ｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１０％高い割合で融合する、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも５０％高い割合で融合する、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、２４時間後に、標的細胞の少なくとも１０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、または
ｉｖ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、前述の温度で維持する前に、複数のフソゲンコピー数の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％のコピー数で存在する、実施形態３２３または実施形態３２４に記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
３２６．４℃未満の温度で少なくとも１、２、３、６、もしくは１２時間；１、２、３、４、５、もしくは６日間；１、２、３、もしくは４週間；１、２、３、もしくは６ヶ月間；または１、２、３、４、もしくは５年間貯蔵安定である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
３２７．－２０℃未満の温度で少なくとも１、２、３、６、もしくは１２時間；１、２、３、４、５、もしくは６日間；１、２、３、もしくは４週間；１、２、３、もしくは６ヶ月間；または１、２、３、４、もしくは５年間貯蔵安定である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
３２８．－８０℃未満の温度で少なくとも１、２、３、６、もしくは１２時間；１、２、３、４、５、もしくは６日間；１、２、３、もしくは４週間；１、２、３、もしくは６ヶ月間；または１、２、３、４、もしくは５年間貯蔵安定である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
３２９．例えば、以下のうちの１つ以上により、組成物が、前述の温度で前述の期間にわたって貯蔵する前に、複数の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の活性を有する場合、組成物が安定であると見なされる、
ｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１０％高い割合で融合する、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも５０％高い割合で融合する、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、２４時間後に、標的細胞の少なくとも１０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、または
ｉｖ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、前述の温度で維持する前に、複数のフソゲンコピー数の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％のコピー数で存在する、実施形態３２６～３２８のいずれかに記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
３３０．以下の特徴のうちの１つ以上を有する、
ａ）薬学的組成物が、医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）基準を満たしている、
ｂ）薬学的組成物が、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｃ）薬学的組成物が、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、
ｄ）薬学的組成物が、所定の参照値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない、または
ｅ）薬学的組成物が、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、実施形態３２２～３２９のいずれかに記載の薬学的組成物。
３３１．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）例えば、フソゲンを発現することを含む、ソース細胞を提供することと、
ｂ）ソース細胞からフソソームを産生することであって、フソソームが、脂質二重層、内腔、フソゲン、およびペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、またはオルガネラタンパク質ペイロード剤を含み、それによりフソソームを作製する、産生することと、
ｃ）フソソームを、例えば、被験体への投与に適した薬学的組成物として製剤化することと、を含み、
ｘｉｉ）ソース細胞が、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞以外のものである、
ｘｉｉｉ）フソゲンが、ウイルスタンパク質以外のものである、
ｘｉｖ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、１．０８ｇ／ｍＬ～１．１２ｇ／ｍＬの間以外の密度を有する、
ｘｖ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例３３のアッセイによって測定した場合、１．２５ｇ／ｍＬ＋／－０．０５の密度を有する、
ｘｖｉ）フソソームが、循環中のスカベンジャー系または肝臓の洞内のクッパー細胞によって捕捉されない、
ｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７６のアッセイにより、被験体の細網内皮系（ＲＥＳ）によって捕捉されない、
ｘｖｉｉｉ）複数のフソソームが被験体に投与される場合、複数の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満が、例えば、実施例７６のアッセイにより、２４時間後にＲＥＳによって捕捉されない、
ｘｉｘ）フソソームが、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、または２００μｍを超える直径を有する、
ｘｘ）フソソームが、細胞生物学的物質を含む、
ｘｘｉ）フソソームが、除核細胞を含む、あるいは
ｘｘｉｉ）フソソームが、不活化核を含む、のうちの１つ以上である、方法。
３３２．フソゲンを発現するソース細胞を提供することが、ソース細胞において外因性フソゲンを発現させること、またはソース細胞において内因性フソゲンの発現を上方調節することを含む、実施形態３３１に記載の方法。
３３３．ソース細胞の核を不活化することを含む、実施形態３３１または実施形態３３２に記載の方法。
３３４．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ｉ）実施形態１～７０のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態７１～９７のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態９７に記載の薬学的組成物を提供することと、
ｉｉ）複数のフソソーム、フソソーム組成物、または薬学的組成物を、例えば、被験体への投与に適したフソソーム製剤として製剤化することと、を含む、方法。
３３５．フソソーム組成物が、少なくとも約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５フソソームを含む、実施形態３３１～３３４のいずれかに記載の方法。
３３６．フソソーム組成物が、少なくとも１０ｍＬ、２０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、または５０Ｌの量を含む、実施形態３３１～３３５のいずれかに記載の方法。
３３７．ソース細胞、例えば哺乳動物細胞を、例えば、化学的除核、機械的力の使用、例えば、フィルターまたは遠心分離機の使用、細胞骨格の最小部分破壊によって除核することを含む、実施形態３３１～３３６のいずれかに記載の方法。
３３８．ソース細胞においてフソゲンまたは他の膜タンパク質を発現することを含む、実施形態３３１～３３７のいずれかに記載の方法。
３３９．小胞形成、低張処理、押出し、または遠心分離のうちの１つ以上を含む、実施形態３３１～３３８のいずれかに記載の方法。
３４０．細胞内で外因性作用物質を遺伝的に発現させること、または外因性作用物質をソース細胞もしくはフソソームにロードすることを含む、実施形態３３１～３３９のいずれかに記載の方法。
３４１．例えば、核を不活化する、例えば、ソース細胞を除核する前に、ソース細胞を、ポリペプチド剤をコードするＤＮＡと接触させることを含む、実施形態３３１～３４０のいずれかに記載の方法。
３４２．例えば、核を不活化する、例えば、ソース細胞を除核する前または後に、ソース細胞を、ポリペプチド剤をコードするＲＮＡと接触させることを含む、実施形態３３１～３４１のいずれかに記載の方法。
３４３．ペイロード、例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤（例えば、核酸またはタンパク質）を、例えば、エレクトロポレーションによって、フソソームに導入することを含む、実施形態３３１～３４２のいずれかに記載の方法。
３４４．ソース細胞が、内皮細胞、線維芽球、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯からの幹細胞、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆細胞（例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球）、前駆細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ９０、ＩＭＲ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、もしくはＢＪ細胞）である、実施形態３３１～３４３のいずれかに記載の方法。
３４５．フソソームが、修飾されたゲノムを有する、例えば、（例えば、ＭＨＣ複合体を除去するためのゲノム編集によって）免疫原性が低下した哺乳動物細胞に由来する、実施形態３３１～３４４のいずれかに記載の方法。
３４６．ソース細胞が、抗炎症シグナルで処理された細胞培養物に由来する、実施形態３３１～３４５のいずれかに記載の方法。
３４７．例えば、核を不活化する、例えば、細胞を除核する前または後に、工程ａ）のソース細胞を、抗炎症シグナルと接触させることを更に含む、実施形態３３１～３４６のいずれかに記載の方法。
３４８．フソソーム医薬品組成物を製造する方法であって、
ａ）例えば、実施形態１～７０のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態７１～９７のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態９７に記載の薬学的組成物を提供することと、
ｂ）以下の基準のうちの１つ以上（例えば、２、３、または全て）が満たされているかどうかを決定するために、複数からの１つ以上のフソソームをアッセイすることと、
ｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１０％高い割合で融合する、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームよりも標的細胞と、例えば、少なくとも５０％高い割合で融合する、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、２４時間後に、標的細胞の少なくとも１０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
ｉｖ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数でペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）を含む、
ｖｉ）フソゲンのコピー数とペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）のコピー数との比が、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００の間である、
ｖｉｉ）フソソームが、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの７５％以内である脂質組成物を含む、
ｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
ｉｘ）フソソームが、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質とタンパク質との比率を含む、
ｘ）フソソームが、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるタンパク質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を含む、
ｘｉ）フソソームが、例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率を含む、
ｘｉｉ）フソソームが、被験体、例えば、マウスにおいて、例えば、実施例７５のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の９０％以内の半減期を有する、
ｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％多く、グルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を膜を横切って輸送する、
ｘｉｖ）フソソームが、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の９０％以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
ｘｖ）フソソームが、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性（例えば、クエン酸合成酵素活性）の９０％以内の代謝活性レベルを含む、
ｘｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの９０％以内の呼吸レベル（例えば、酸素消費率）を含む、
ｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ＭＦＩのアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％低いアネキシンＶ染色レベルを含む、
ｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例３９のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも１％のｍｉＲＮＡ含有量レベルを有する、
ｘｉｘ）フソソームが、例えば、実施例４７のアッセイにより、ソース細胞のそれの９０％以内である可溶性：不溶性タンパク質比を有する、
ｘｘ）フソソームが、例えば、実施例４８のアッセイによって測定した場合、フソソームの脂質含有量の５％未満のＬＰＳレベルを有する、
ｘｘｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも１０％多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取込みが可能である、
ｘｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７１のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも５％大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例７２のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも５％大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
フソソームは、例えば、実施例７３のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、５％以内のレベルでアクチンを重合する、
フソソームは、例えば、実施例７４のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約５％以内の膜電位を有するか、またはフソソームは、約－２０～－１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ、もしくは－１００～－１５０ｍＶの膜電位を有する、
ｘｘｖｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも少なくとも５％大きい割合でタンパク質を分泌することができる、あるいは
ｘｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する；
ｃ）（任意に）基準のうちの１つ以上が満たされた場合に、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含み、
それにより、フソソーム医薬品組成物を製造する、方法。
３４９．フソソーム医薬品組成物を製造する方法であって、
ａ）例えば、実施形態１～７０のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態７１～９７のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態９７に記載の薬学的組成物を提供する、例えば、産生する、提供することと、
ｂ）以下の因子のうちの１つ以上の存在またはレベルを決定するために、複数からの１つ以上のフソソームをアッセイすることと、
ｉ）免疫原性分子、例えば、免疫原性タンパク質、例えば、本明細書に記載されるようなもの、
ｉｉ）病原体、例えば、細菌もしくはウイルス、または
ｉｉｉ）汚染物質、
ｃ）（任意に）因子のうちの１つ以上が参照値を下回る場合に、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含み、
それにより、フソソーム医薬品組成物を製造する、方法。
３５０．検出可能なレベル、例えば、参照値を超える値が決定される場合、複数のフソソームまたはフソソーム組成物を含有する試料が廃棄される、実施形態３４９に記載の方法。
３５１．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）本明細書に記載の複数のフソソームまたは本明細書に記載のフソソーム組成物を提供することと、
ｂ）フソソームを、例えば、被験体への投与に適した薬学的組成物として製剤化することと、を含む、方法。
３５２．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）例えば、本明細書に記載の複数のフソソームまたはフソソーム調製物を提供する、例えば、産生することと、
ｂ）１つ以上（例えば、２、３、またはそれ以上）の基準が満たされているかどうかを決定するために、複数の（例えば、調製物の）試料を分析することと、を含む、方法。
３５３．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）本明細書に記載の複数のフソソーム、または本明細書に記載のフソソーム組成物もしくは調製物を提供する、例えば、産生することと、
ｂ）複数または調製物の試料をアッセイして、以下の因子のうちの１つ以上の存在またはレベルを決定することと、
ｉ）免疫原性分子、例えば、免疫原性タンパク質、例えば、本明細書に記載されるようなもの、
ｉｉ）病原体、例えば、細菌もしくはウイルス、または
ｉｉｉ）汚染物質（例えば、核構造もしくは核ＤＮＡなどの成分）、
ｃ）（任意に）因子のうちの１つ以上が参照値から大幅に（例えば、指定された量を超えて）逸脱している場合に、複数のフソソームもしくはフソソーム調製物を放出することを承認するか、または（任意に）１つ以上の因子が参照値から大幅に逸脱していない（例えば、指定された約を超えて逸脱していない）場合に、複数のフソソームもしくはフソソーム調製物を医薬品として製剤化することと、を含む、方法。
３５４．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ｉ）本明細書に記載の複数のフソソーム、フソソーム組成物、または薬学的組成物を提供することと、
ｉｉ）複数のフソソーム、フソソーム組成物、または薬学的組成物を、例えば、被験体への投与に適したフソソーム製剤として製剤化することと、を含む、方法。
３５５．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）本明細書に記載の複数のフソソーム、フソソーム組成物、または薬学的組成物を提供することと、
ｂ）以下の因子のうちの１つ以上の存在またはレベルを決定するために、複数からの１つ以上のフソソームをアッセイすることと、
ｉ）免疫原性分子、例えば、免疫原性タンパク質、例えば、本明細書に記載されるようなもの、
ｉｉ）病原体、例えば、細菌もしくはウイルス、または
ｉｉｉ）汚染物質、
ｃ）（任意に）因子のうちの１つ以上が参照値を下回る場合に、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含み、
それにより、フソソーム医薬品組成物を製造する、方法。
３５６．以下のうちの１つ以上が存在する、
ｉ）ソース細胞が、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞以外のものである、
ｉｉ）フソゲンが、ウイルスタンパク質以外のものである、
ｉｉｉ）複数のフソソームを含む調製物が、１．０８ｇ／ｍＬ～１．１２ｇ／ｍＬ以外の密度を有する、
ｉｖ）複数のフソソームを含む調製物が、例えば、実施例３３のアッセイによって測定した場合、１．２５ｇ／ｍＬ＋／－０．０５の密度を有する、
ｖ）フソソームが、循環中のスカベンジャー系または肝臓の洞内のクッパー細胞によって実質的に捕捉されない、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例７６のアッセイにより、被験体の細網内皮系（ＲＥＳ）によって実質的に捕捉されない、
ｖｉｉ）複数のフソソームが被験体に投与される場合、該複数の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満が、例えば、実施例７６のアッセイにより、２４、４８、または７２時間後にＲＥＳによって捕捉される、
ｖｉｉｉ）フソソームが、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、または２００μｍを超える直径を有する、
ｉｘ）フソソームが、細胞生物学的物質を含む、
ｘ）フソソームが、除核細胞を含む、あるいは
ｘｉ）フソソームが、不活化核を含む、のうちの１つ以上である、実施形態１０２～３５６のいずれかに記載の方法。
３５７．フソソーム組成物を被験体、例えば、ヒト被験体に送達する方法であって、実施形態１～７０のいずれかによる複数のフソソームを含むフソソーム組成物、実施形態７１～９７のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態９７に記載の薬学的組成物を被験体に投与することを含み、それによりフソソーム組成物を被験体に投与する、方法。
３５８．ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）を被験体に送達する方法であって、実施形態１～７０のいずれかによる複数のフソソームを含むフソソーム組成物、実施形態７１～９７のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態９７に記載の薬学的組成物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物が、ペイロードが送達されるような量および／または時間で投与される、方法。
３５９．被験体における生物学的機能を調節する、例えば、増強する方法であって、被験体に投与すること、または標的組織もしくは細胞を、実施形態１～７０のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態７１～９７のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態９７に記載の薬学的組成物と接触させることを含み、それにより被験体における生物学的機能を調節する、方法。
３６０．生物学的機能が、
ａ）２つの細胞間の相互作用を調節する、例えば、増加または減少させる、
ｂ）免疫応答を調節する、例えば、増加または減少させる、
ｃ）標的組織への細胞の動員を調節する、例えば、増加または減少させる、
ｄ）癌の成長率を低下させる、または
ｅ）被験体における癌細胞の数を低減する、から選択される、実施形態３５９に記載の方法。
３６１．機能を被験体に送達する方法であって、実施形態１～７０のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態７１～９７のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態９７に記載の薬学的組成物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物が、被験体における機能が送達されるような量および／または時間で投与される、方法。
３６２．機能を被験体に標的化する方法であって、実施形態１～７０のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態７１～９７のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態９７に記載の薬学的組成物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物が、被験体における機能が標的化されるような量および／または時間で投与される、方法。
３６３．機能を被験体に送達または標的化する方法であって、本明細書に記載される複数のフソソームを含むフソソーム組成物、フソソーム組成物、または薬学的組成物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物が、被験体における機能が送達または標的化されるような量および／または時間で投与される、方法。
３６４．患者における疾患または障害を治療する方法であって、実施形態１～７０のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態７１～９７のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態９７に記載の薬学的組成物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物が、疾患または障害が治療されるような量および／または時間で投与される、方法。
３６５．疾患または障害が、癌、自己免疫障害、または感染症から選択される、実施形態３６４に記載の方法。
３６６．複数のフソソームが、局所効果を有する、実施形態３５７～３６５のいずれかに記載の方法。
３６７．複数のフソソームが、遠位効果を有する、実施形態３５７～３６５のいずれかに記載の方法。
３６８．複数のフソソームが、全身効果を有する、実施形態３５７～３６５のいずれかに記載の方法。
３６９．被験体が、癌を有する、実施形態３５７～３６８のいずれかに記載の方法。
３７０．被験体が、癌を有し、フソソームが、新生抗原を含む、実施形態３６９に記載の方法。
３７１．フソソーム組成物が、被験体に少なくとも１、２、３、４、または５回投与される、実施形態３５７～３７０のいずれかに記載の方法。
３７２．フソソーム組成物が、全身的に（例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内に）または局所的に被験体に投与される、実施形態３５７～３７０のいずれかに記載の方法。
３７３．フソソーム組成物が、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼から選択される標的組織に到達するように、フソソーム組成物が被験体に投与される、実施形態３５７～３７２のいずれかに記載の方法。
３７４．フソソーム組成物が、免疫抑制物質、例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、またはイムノフィリンモジュレーターと同時投与される、実施形態３５７～３７３のいずれかに記載の方法。
３７５．フソソーム組成物が、免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと同時投与される、実施形態３５７～３７４のいずれかに記載の方法。
３７６．方法が、標的細胞の細胞質ゾルに作用物質を送達することを含み、任意に、細胞質ゾルが送達される作用物質が、タンパク質（またはタンパク質をコードするか、もしくはタンパク質をコードするものに相補的である核酸、例えば、例えば、タンパク質をコードするＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）である、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３７７．フソソーム組成物をヒト被験体に投与する方法であって、
ａ）被験体の１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第１のフソゲンを被験体に投与することであって、
ｉ）第１のフソゲンを投与することが、１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第１のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの１つ以上である、投与することと、
ｂ）第２のフソゲンを含む複数のフソソームを含む、フソソーム組成物をヒト被験体に投与することと、を含み、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）を更に含み、
それにより、フソソーム組成物を被験体に投与する、方法。
３７８．ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）を被験体に送達する方法であって、
ａ）被験体の１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第１のフソゲンを被験体に投与することであって、
ｉ）第１のフソゲンを投与することが、１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第１のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの１つ以上である、投与することと、
ｂ）第２のフソゲンおよび治療薬を含む複数のフソソームを含む、フソソーム組成物をヒト被験体に投与することと、を含み、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）を更に含み、
それにより、ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）を被験体に送達する、方法。
３７９．被験体における生物学的機能を調節する、例えば増強する方法であって、
ａ）被験体の１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第１のフソゲンを被験体に投与することであって、
ｉ）第１のフソゲンを投与することが、１つ以上の標的細胞における第１のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第１のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ｉｉ）第１のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの１つ以上である、投与することと、
ｂ）第２のフソゲンを含む複数のフソソームを含む、フソソーム組成物をヒト被験体に投与することと、を含み、第２のフソゲンが、第１のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）を更に含み、
それにより、被験体における生物学的機能を調節する、方法。
３８０．ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）が、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する、実施形態３７７～３７９のいずれかに記載の方法。
３８１．ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）が、
ｉ）転写活性化因子、例えば、表１７－１の転写活性化因子、
ｉｉ）転写抑制因子、例えば、表１７１の転写抑制因子、
ｉｉｉ）エピジェネティック修飾因子、例えば、表１７－１のエピジェネティック修飾因子、
ｉｖ）ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、例えば、表１７－１のヒストンアセチルトランスフェラーゼ、
ｖ）ヒストンデアセチラーゼ、例えば、表１７－１のヒストンデアセチラーゼ、
ｖｉ）ヒストンメチルトランスフェラーゼ、例えば、表１７－１のヒストンメチルトランスフェラーゼ、
ｖｉｉ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、例えば、表１７－１のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、
ｖｉｉｉ）ＤＮＡニッカーゼ、例えば、本明細書に記載のＤＮＡニッカーゼ、
ｉｘ）部位特異的ＤＮＡ編集酵素、例えば、表１７－１のデアミナーゼ、
ｘ）ＤＮＡトランスポザーゼ、例えば、本明細書に記載のＤＮＡトランスポザーゼ、
ｘｉ）ＤＮＡインテグラーゼ、例えば、本明細書に記載のＤＮＡインテグラーゼ、
ｘｉｉ）ＲＮＡエディター、例えば、表１７－１のＲＮＡエディター、
ｘｉｉｉ）ＲＮＡスプライシング因子、例えば、表１７－１のＲＮＡスプライシング因子、または
ｘｉｖ）ＰＩＷＩタンパク質、例えば、本明細書に記載のＰＩＷＩタンパク質、のうちの１つ以上を含むか、もしくはコードする、実施形態３７７～３７９のいずれかに記載の方法。
３８２．複数のフソソームが、局所効果を有するか、または遠位効果を有する、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３８３．フソゲンを発現するソース細胞を提供すること（ソース細胞における外因性フソゲンを発現することを含む）、またはソース細胞における内因性フソゲンの発現を上方調節することを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３８４．ソース細胞の核を不活化することを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３８５．例えば、化学的除核、機械的力の使用、例えば、フィルターもしくは遠心分離機の使用、細胞骨格の少なくとも部分的破壊、またはそれらの組み合わせによって、哺乳動物細胞を除核することを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３８６．ソース細胞においてフソゲンまたは他の膜タンパク質を発現することを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３８７．小胞形成、低張処理、押出し、または遠心分離のうちの１つ以上を含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３８８．ソース細胞内で外因性作用物質を遺伝的に発現させること、または外因性作用物質をソース細胞もしくはフソソームにロードすることを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３８９．例えば、核を不活化する、例えば、細胞を除核する前に、細胞を、ポリペプチド剤をコードするＤＮＡと接触させることを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３９０．例えば、核を不活化する、例えば、細胞を除核する前または後に、細胞を、ポリペプチド剤をコードするＲＮＡと接触させることを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３９１．例えば、エレクトロポレーションによって、治療薬（例えば、核酸またはタンパク質）をフソソームに導入することを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３９２．フソソームが、例えば、免疫原性を低下させるために（例えば、ゲノム編集によって、例えば、ＭＨＣタンパク質を除去するために）修飾されたゲノムを有する哺乳動物細胞に由来し、任意に、方法が、例えば、核を不活化する、例えば、細胞を除核する前または後に、工程ａ）のソース細胞を免疫抑制物質と接触させることを更に含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３９３．検出可能なレベル、例えば、参照値を超える値が決定される場合、複数のフソソームまたはフソソーム組成物もしくは調製物を含有する試料が廃棄される、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
３９４．上記実施形態のいずれかに記載の方法であって、
ａ）癌の進行、腫瘍の後退、腫瘍の体積、新生物細胞数の減少、融合細胞の量、ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）を含む融合細胞の量、核酸タンパク質ペイロードを発現する融合細胞の量、および融合細胞の膜に配置された膜タンパク質の量をモニターする工程、ならびに／または
ｂ）生物の有害事象をモニターする工程を更に含み、任意に、有害事象には、サイトカイン放出症候群、発熱、頻脈、寒気、食欲不振、悪心、嘔吐、筋痛、頭痛、毛細血管漏出症候群、低血圧、肺水腫、凝固障害、腎機能障害、腎障害、マクロファージ活性化症候群、血球貪食性リンパ組織球症、臓器不全、脳浮腫、Ｔ細胞活性化によるバイスタンダー炎症、神経症状、脳症、混乱、幻覚、せん妄、昏睡、失語症、発作、Ｂ細胞形成不全、腫瘍溶解症候群、および移植片対宿主疾患のうちの１つ以上が含まれる、方法。
３９５．第１のフソゲンが、リポペプチドではない、実施形態３７７～３７９のいずれかに記載の方法。
３９６．
融合細胞の量、ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）を含む融合細胞の量、ペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）を発現する融合細胞の量、および融合細胞の核内に配置された膜タンパク質の量のうちの１つ以上をモニターする工程を更に含む、実施形態３５７～３９５のいずれかに記載の方法。
３９７．生物における有害事象をモニターする工程を更に含む、実施形態３５７～３９６のいずれかに記載の方法。
３９８．有害事象には、サイトカイン放出症候群、発熱、頻脈、寒気、食欲不振、悪心、嘔吐、筋痛、頭痛、毛細血管漏出症候群、低血圧、肺水腫、凝固障害、腎機能障害、腎障害、マクロファージ活性化症候群、血球貪食性リンパ組織球症、臓器不全、脳浮腫、Ｔ細胞活性化によるバイスタンダー炎症、神経症状、脳症、混乱、幻覚、せん妄、昏睡、失語症、発作、Ｂ細胞形成不全、腫瘍溶解症候群、および移植片対宿主疾患のうちの１つ以上が含まれる、実施形態３９７に記載の方法。
３９９．生物が、ヒトである、実施形態３５７～３９８のいずれかに記載の方法。
４００．ヒトが、疾患、障害、または状態を有する、実施形態３９９に記載の方法。
４０１．標的細胞の細胞膜脂質二重層中のペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、またはオルガネラタンパク質ペイロード剤）の存在が、疾患、障害、または状態の１つ以上の症状を改善する、実施形態４００に記載の方法。
４０２．ＣＡＲが、
ａ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメイン（例えば、１つ、２つ、または３つのシグナル伝達ドメイン）を含む第一世代のＣＡＲ、
ｂ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む第三世代のＣＡＲ、
ｃ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、およびＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む第四世代のＣＡＲであるか、またはそれらを含み、
任意に、抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖまたはＦａｂである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４０３．ＣＡＲ抗原結合ドメインが、Ｂ細胞、形質細胞、形質芽細胞、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２８、ＴＮＦ、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ、ＺＡＰ－７０、ＬＦＡ－１、ＣＤ３γ、ＣＤ５、またはＣＤ２上で発現されるリガンドに結合する、実施形態４０１または４０２に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４０４．ＣＡＲ膜貫通ドメインが、少なくともＴ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはそれらの機能的バリアントのα、β、もしくはζ鎖の膜貫通領域を含む、実施形態４０１～４０３のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４０５．膜貫通ドメインが、少なくともＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、およびＦＧＦＲ２Ｂ、またはそれらの機能的バリアントの膜貫通領域（複数可）を含む、実施形態４０１～４０４のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４０６．ＣＡＲが、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、ＰＤＣＤ６）、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－α、ＴＮＦＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、イカロス、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＣＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ３ζドメイン、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの機能的フラグメントのうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む、実施形態４０１～４０５のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４０７．ＣＡＲが、ＣＤ３ζドメイン、または免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアントを含む、実施形態４０１～４０６のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント；（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、もしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアント；および（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。
４０８．ＣＡＲが、１つ以上のスペーサーを更に含み、例えば、スペーサーが、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間の第１のスペーサーであり、任意に、第１のスペーサーが、免疫グロブリン定常領域またはそのバリアントもしくは修飾バージョンの少なくとも一部を含み、任意に、スペーサーが、膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間の第２のスペーサーであり、任意に、第２のスペーサーが、オリゴペプチドであり、例えば、オリゴペプチドが、グリシン－セリンダブレットを含む、実施形態４０１～４０７のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４０９．抗原結合ドメインが、新生物細胞に特徴的な抗原を標的とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４１０．新生物細胞に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８、およびＦＧＦ２１を含む）血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、およびＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体およびＥｐｈ受容体ファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、およびＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ－１、ＣＩＣ－２、ＣＩＣ－４、ＣＩＣ－５、ＣＩＣ－７、ＣＩＣ－Ｋａ、ＣＩＣ－Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣトランスポーター、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン－１－リン酸受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通タンパク質、マルチスパン膜貫通タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ。Ｔ細胞アルファ鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１６３、Ｆ４／８０、ＩＬ－４Ｒａ、Ｓｃａ－１、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ－１、トランスフェリン受容体、ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ４０、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｆｈ、古典的Ｔｒｅｇ、ＦｏｘＰ３＋、Ｔｒ１、Ｔｈ３、Ｔｒｅｇ１７、ＴＲＥＧ、ＣＤＣＰ１、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、炭酸アンヒドラーゼＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２など）、ルイス－γ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ－ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ－１、ＢＡＦＦ、ＨＤＡＣ、ＡＢＬ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ－１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、またはＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体アルファ（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ－１３Ｒａ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３Ｒα１、Ｌ１－ＣＡＭ、ＴｎＡｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン－１１受容体ａ（ＩＬ－１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲベータ）、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、テロメラーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰＩＢＩ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、新生抗原、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ、あるいはそれらの抗原性フラグメントまたは抗原性部分から選択される、実施形態４０９に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４１１．抗原結合ドメインが、Ｔ細胞に特徴的な抗原を標的とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４１２．Ｔ細胞に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、膜輸送タンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質、孔形成タンパク質等の能動もしくは受動輸送タンパク質）、膜貫通受容体、膜酵素、および／またはＴ細胞に特徴的な細胞接着タンパク質から選択される、実施形態４１１に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４１３．Ｔ細胞に特徴的な抗原が、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、ＡＫＴ１；ＡＫＴ２；ＡＫＴ３；ＡＴＦ２；ＢＣＬ１０；ＣＡＬＭ１；ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３δ）；ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３ε）；ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３γ）；ＣＤ４；ＣＤ８；ＣＤ２８；ＣＤ４５；ＣＤ８０（Ｂ７－１）；ＣＤ８６（Ｂ７－２）；ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）；ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）；ＥＬＫ１；ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）；ＥＲＫ２；ＦＯＳ；ＦＹＮ；ＧＲＡＰ２（ＧＡＤＳ）；ＧＲＢ２；ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＨＬＡ－ＤＲＢ１；ＨＬＡ－ＤＲＢ３；ＨＬＡ－ＤＲＢ４；ＨＬＡ－ＤＲＢ５；ＨＲＡＳ；ＩＫＢＫＡ（ＣＨＵＫ）；ＩＫＢＫＢ；ＩＫＢＫＥ；ＩＫＢＫＧ（ＮＥＭＯ）；ＩＬ２；ＩＴＰＲ１；ＩＴＫ；ＪＵＮ；ＫＲＡＳ２；ＬＡＴ；ＬＣＫ；ＭＡＰ２Ｋ１（ＭＥＫ１）；ＭＡＰ２Ｋ２（ＭＥＫ２）；ＭＡＰ２Ｋ３（ＭＫＫ３）；ＭＡＰ２Ｋ４（ＭＫＫ４）；ＭＡＰ２Ｋ６（ＭＫＫ６）；ＭＡＰ２Ｋ７（ＭＫＫ７）；ＭＡＰ３Ｋ１（ＭＥＫＫ１）；ＭＡＰ３Ｋ３；ＭＡＰ３Ｋ４；ＭＡＰ３Ｋ５；ＭＡＰ３Ｋ８；ＭＡＰ３Ｋ１４（ＮＩＫ）；ＭＡＰＫ８（ＪＮＫ１）；ＭＡＰＫ９（ＪＮＫ２）；ＭＡＰＫ１０（ＪＮＫ３）；ＭＡＰＫ１１（ｐ３８β）；ＭＡＰＫ１２（ｐ３８γ）；ＭＡＰＫ１３（ｐ３８δ）；ＭＡＰＫ１４（ｐ３８α）；ＮＣＫ；ＮＦＡＴ１；ＮＦＡＴ２；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＦＫＢＩＡ；ＮＲＡＳ；ＰＡＫ１；ＰＡＫ２；ＰＡＫ３；ＰＡＫ４；ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ；ＰＩＫ３Ｃ３（ＶＰＳ３４）；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３ＣＤ；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＫＣＡ；ＰＫＣＢ；ＰＫＣＭ；ＰＫＣＱ；ＰＬＣＹ１；ＰＲＦ１（パーフォリン）；ＰＴＥＮ；ＲＡＣ１；ＲＡＦ１；ＲＥＬＡ；ＳＤＦ１；ＳＨＰ２；ＳＬＰ７６；ＳＯＳ；ＳＲＣ；ＴＢＫ１；ＴＣＲＡ；ＴＥＣ；ＴＲＡＦ６；ＶＡＶ１；ＶＡＶ２；またはＺＡＰ７０であり得る、実施形態４１１または４１２に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４１４．抗原結合ドメインが、自己免疫または炎症障害に特徴的な抗原を標的とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４１５．自己免疫性または炎症性障害が、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ループス、関節炎、免疫複合体糸球体腎炎、グッドパスチャー、ブドウ膜炎、肝炎、全身性硬化症または強皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、寒冷凝集素疾患、尋常性ペンフィガス、グレイブス病、自己免疫性溶血性貧血、血小板減少症Ａ、原発性シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、神経骨髄性視神経症、エバン症候群、ＩｇＭ媒介性神経障害、サイログロブリン血症、皮膚筋炎、特発性血小板減少症、強直性脊椎炎、水疱性類天疱瘡、後天性血管浮腫、慢性蕁麻疹、抗リン脂質脱髄性多発神経障害、および自己免疫性血小板減少症または好中球減少症または純粋な赤血球形成不全から選択され、一方、同種免疫疾患の例示的な非限定的な例には、同種感作（例えば、Ｂｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１５（４）：９３１－４１を参照）または造血器もしくは実質臓器移植からの異種感作、輸血、胎児同種感作を伴う妊娠、新生児同種免疫性血小板減少症、新生児溶血性疾患、酵素またはタンパク質補充療法、血液製品、および遺伝子治療で治療される先天性もしくは後天性欠損障害の置換により起こり得るような外来抗原に対する感作が挙げられ、任意に、自己免疫または炎症障害に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型じゅようたい、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体から選択される、実施形態４１４に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４１６．抗原結合ドメインが、感染症に特徴的な抗原を標的とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４１７．感染症が、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ））、ヒトＴリンパ球向性ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、エプトスタイン・バーウイルス、ＣＭＶ、ヒトパピローマウイルスから選択され、任意に、感染症に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、ＨＩＶ、Ｅｎｖ、ｇｐｌ２０、またはＨＩＶ－１ Ｅｎｖ上のＣＤ４誘導性エピトープから選択される、実施形態４１６に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４１８．標的細胞が、凝集またはミスフォールド膜タンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４１９．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞における凝集もしくはミスフォールドタンパク質のレベルを低下させることができる（例えば、レベルを低下させる）か、または本明細書の方法が、標的細胞における凝集もしくはミスフォールドタンパク質のレベルを低下させることを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４２０．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞の細胞膜に膜タンパク質を送達することができる（例えば、送達する）、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４２１．タンパク質を送達することが、タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）を標的細胞に送達することを含み、それにより標的細胞が、タンパク質を産生し、それを膜に局在化する、実施形態４２０に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４２２．フソソームが、タンパク質を含むか、または方法が、タンパク質を送達することを含み、フソソームと標的細胞との融合が、標的細胞の細胞膜にタンパク質を運ぶ、実施形態４２０または４２１に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４２３．タンパク質が、細胞表面リガンドまたは細胞表面受容体に結合する抗体を含む、実施形態４２０～４２２のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４２４．フソソームが、細胞表面受容体に結合する第２の細胞表面リガンドまたは抗体を含むか、またはコードし、任意に、細胞表面受容体に結合する１つ以上の追加の細胞表面リガンドまたは抗体（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、５０、もしくはそれ以上）を更に含むか、またはコードする、第２の作用物質を更に含むか、あるいは方法が、それを送達することを更に含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４２５．第１の作用物質および第２の作用物質が、複合体を形成し、任意に、複合体が、１つ以上の追加の細胞表面リガンドを更に含む、実施形態４２４に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４２６．作用物質が、細胞表面受容体、例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する細胞表面を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４２７．フソソームが、第２の細胞表面受容体を含むか、またはコードし、任意に、１つ以上の追加の細胞表面受容体（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、５０、もしくはそれ以上の追加の細胞表面受容体）を更に含むか、またはコードする、第２の作用物質を更に含むか、あるいは方法が、それを送達することを更に含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４２８．第２の作用物質、例えば、治療薬が、タンパク質、タンパク質複合体（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、もしくは５０個のタンパク質、例えば、少なくとも少なくとも２、３、４、５、１０、２０、もしくは５０個の異なるタンパク質）ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体、もしくはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ）、または小分子から選択される、実施形態４２７に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４２９．第１の作用物質および第２の作用物質が、複合体を形成し、任意に、複合体が、１つ以上の追加の細胞表面受容体を更に含み、任意に、作用物質が、抗原または抗原提示タンパク質を含むか、またはコードする、実施形態４２７または４２８に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４３０．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、標的細胞がタンパク質を産生および分泌することを可能にする条件下で、タンパク質を標的細胞にコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）を標的細胞に送達することによって、分泌された作用物質、例えば、分泌されたタンパク質を標的部位（例えば、細胞外領域）に送達するか、または送達することができる（例えば、送達する）、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４３１．分泌されたタンパク質が、ソース細胞に対して、または標的細胞に対して内因性または外因性である、実施形態４３０に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４３２．分泌されたタンパク質が、治療用タンパク質、例えば、抗体分子、サイトカイン、酵素、オートクリンシグナル伝達分子、パラクリンシグナル伝達分子、または分泌顆粒を含む、実施形態４３０または４３１に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４３３．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、膜タンパク質、または抗原であるか、もしくはそれを含む分泌された細胞を送達するか、または送達することができる（例えば、送達する）、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４３４．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、膜タンパク質、または任意に、抗原と一緒に（例えば、複合体として）、抗原抗原提示タンパク質であるか、もしくはそれを含む膜タンパク質もしくは分泌タンパク質を送達するか、または送達することができる（例えば、送達する）、実施形態４３３に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４３５．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、１つ以上の細胞表面受容体を標的細胞（例えば、免疫細胞）に供与するか、または供与することができる（例えば、供与する）、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４３６．標的細胞が、腫瘍細胞であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４３７．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、免疫刺激リガンド、抗原提示タンパク質、腫瘍抑制タンパク質、アポトーシス促進タンパク質、または前述のうちのいずれかの受容体もしくは結合パートナーであるか、またはそれを含む膜もしくは分泌タンパク質を送達するか、もしくは送達することができる（例えば、送達する）、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４３８．フソソームが、免疫調節性、例えば、免疫刺激性である作用物質（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤、および任意に、少なくとも１つの第２の作用物質）を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４３９．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞に抗原を提示させるか、または提示させることができる（例えば、提示させる）、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４４０．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、標的細胞における遺伝子発現を一時的に修飾するために、または例えば、標的細胞のゲノムへの組込みによって修飾する、例えば、本明細書に記載の膜タンパク質（または分泌タンパク質）の発現を引き起こすために、核酸を標的細胞に送達するか、または送達することができる（例えば、送達する）、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４４１．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、タンパク質（例えば、トランスポータータンパク質などの膜タンパク質、もしくは免疫抑制タンパク質などの分泌タンパク質）を標的細胞に送達するか、または送達することができ（例えば、送達する）、それにより標的細胞のタンパク質欠損が、少なくとも一時的に救済されるようにする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４４２．膜タンパク質が、例えば、１つ以上の炭水化物部分、脂質部分、ポリエチレングリコール部分、小分子等の１つ以上の共有結合した非ペプチド部分、およびそれらの組み合わせを含み得る、実施形態４４１に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４４３．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞にタンパク質、例えば、治療用タンパク質を分泌させるか、または分泌させることができる（例えば、分泌させる）、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４４４．細胞表面リガンドを有するフソソームが、好中球（例えば、および標的細胞が腫瘍浸潤リンパ球である）、樹状細胞（例えば、および標的細胞がナイーブＴ細胞である）、または好中球（例えば、および標的が腫瘍細胞またはウイルス感染細胞である）から選択されるソース細胞に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４４５．フソソームが、膜複合体、例えば、少なくとも２、３、４、または５つのタンパク質を含む複合体、例えば、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、またはヘテロ四量体を含む、実施形態４４４に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４４６．フソソームが、抗体、例えば、毒性抗体を含み、例えば、フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、標的部位にホーミングすることによって、抗体を標的部位に送達することができる（例えば、送達する）、実施形態４４４または４４５に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４４７．ソース細胞が、ＮＫ細胞または好中球である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４４８．膜タンパク質が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８、およびＦＧＦ２１を含む）血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、およびＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体およびＥｐｈ受容体ファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、およびＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ－１、ＣＩＣ－２、ＣＩＣ－４、ＣＩＣ－５、ＣＩＣ－７、ＣＩＣ－Ｋａ、ＣＩＣ－Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣトランスポーター、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン－１－リン酸受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通タンパク質、マルチスパン膜貫通タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ。Ｔ細胞アルファ鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１６３、Ｆ４／８０、ＩＬ－４Ｒａ、Ｓｃａ－１、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ－１、トランスフェリン受容体、ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ４０、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｆｈ、古典的Ｔｒｅｇ、ＦｏｘＰ３＋、Ｔｒ１、Ｔｈ３、Ｔｒｅｇ１７、ＴＲＥＧ、ＣＤＣＰ１、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、炭酸アンヒドラーゼＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２など）、ルイス－γ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ－ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ－１、ＢＡＦＦ、ＨＤＡＣ、ＡＢＬ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ－１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、またはＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体アルファ（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ－１３Ｒａ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３Ｒα１、Ｌ１－ＣＡＭ、ＴｎＡｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン－１１受容体ａ（ＩＬ－１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲベータ）、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、テロメラーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰＩＢＩ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、新生抗原、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢ、またはｔｒｋＣから選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４４９．フソソームが、標的細胞または標的細胞の表面特徴部と会合および／または結合する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４５０．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞からのタンパク質の分泌または標的細胞の表面上のリガンド提示を引き起こすか、または引き起こすことができる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４５１．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞の細胞死を引き起こすか、または引き起こすことができる、実施形態４５０に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４５２．フソソームが、ＮＫソース細胞に由来する、実施形態４５０または４５１に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４５３．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、１つ以上の局所環境の特徴、例えば、代謝物、インターロイキン、抗原等、もしくはそれらの組み合わせを、感知および／または応答するか、あるいは送信および／または応答することができる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４５４．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、走化性、血管外遊出、および／または１つ以上の代謝活性（例えば、キニューリニン、糖新生、プロスタグランジン脂肪酸酸化、アデノシン代謝、尿素回路、および熱発生呼吸）が可能である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４５５．ソース細胞が、以下である、
ａ）好中球、ならびにフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、損傷部位にホーミングすることができる、
ｂ）マクロファージ、ならびにフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、食作用が可能であるか、あるいは
ｃ）褐色脂肪組織細胞、ならびにフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、脂肪分解が可能である、実施形態４５４に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４５６．フソソームが、以下である、
ａ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い割合で融合する、
ｂ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い割合で融合する、
ｃ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、２４、４８、または７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４５７．フソソームが、以下である、
ａ）例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、または
ｂ）例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４５８．フソソームによって含まれるフソゲンの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、細胞膜内に配置されている、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４５９．フソソームがまた、内部、例えば、細胞質またはオルガネラ内にフソゲンを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４６０．フソソームが、
ａ）例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数での治療薬（例えば、治療用膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤）、
ｂ）例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数でのタンパク質治療薬、
ｃ）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数での核酸治療薬、
ｄ）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数でのＤＮＡ治療薬、
ｅ）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数でのＲＮＡ治療薬、
ｆ）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数でのソース細胞に対して外因性である治療薬、
ｇ）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数でのソース細胞に対して外因性であるタンパク質治療薬、および／あるいは
ｈ）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数でのソース細胞に対して外因性である核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）治療薬を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４６１．フソゲンのコピー数と治療薬のコピー数との比が、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４６２．フソソームが、
ａ）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーの治療薬（例えば、治療用膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）、
ｂ）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのタンパク質治療薬、
ｃ）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーの核酸治療薬、
ｄ）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのＲＮＡ治療薬、および／あるいは
ｅ）少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのＤＮＡ治療薬を標的細胞に送達する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４６３．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、
ａ）フソソーム中の総タンパク質１ｍｇあたり０．０００００００１ｍｇのフソゲン～１ｍｇのフソゲン、例えば、フソソーム中の総タンパク質１ｍｇあたり０．０００００００１～０．００００００１、０．００００００１～０．０００００１、０．０００００１～０．００００１、０．００００１～０．０００１、０．０００１～０．００１、０．００１～０．０１、０．０１～０．１、もしくは０．１～１ｍｇのフソゲン、または
ｂ）フソソーム中の脂質１ｍｇあたり０．０００００００１ｍｇのフソゲン～５ｍｇのフソゲン、例えば、フソソーム中の脂質１ｍｇあたり０．０００００００１～０．００００００１、０．００００００１～０．０００００１、０．０００００１～０．００００１、０．００００１～０．０００１、０．０００１～０．００１、０．００１～０．０１、０．０１～０．１、０．１～１、もしくは１～５ｍｇのフソゲンを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４６４．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、ソース細胞のそれと実質的に同様の脂質組成物を特徴とするか、あるいはＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％、例えば、７５％以内である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４６５．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、ソース細胞内のカルジオリピン：セラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：セラミドの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：ジアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：ジアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：ヘキソシルセラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：ヘキソシルセラミドの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：リゾホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：リゾホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のカルジオリピン：リゾホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：リゾホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：リゾホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：リゾホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：リゾホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：リゾホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：リゾホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：リゾホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：コレステロールエステルの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：コレステロールエステルの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：スフィンゴミエリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：スフィンゴミエリンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：トリアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：トリアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：セラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：セラミドの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：ヘキソシルセラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：ヘキソシルセラミドの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジル酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：ホスファチジル酸塩の比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：ホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：ホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：ホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：コレステロールエステルの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：コレステロールエステルの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：スフィンゴミエリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：スフィンゴミエリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン：トリアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルコリン：トリアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：セラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：セラミドの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：ジアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：ジアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：ヘキソシルセラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：ヘキソシルセラミドの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルグリセロールの比、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：コレステロールエステルの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：コレステロールエステルの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：スフィンゴミエリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内の、ホスファチジルエタノールアミン：スフィンゴミエリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：トリアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：トリアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：セラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：セラミドの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：ヘキソシルセラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：ヘキソシルセラミドの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内の、ホスファチジルセリ


ン：リゾホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：ホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：ホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：ホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：ホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：コレステロールエステルの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：コレステロールエステルの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：スフィンゴミエリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：スフィンゴミエリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン：トリアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のホスファチジルセリン：トリアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：セラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：セラミドの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：ジアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：ジアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：ヘキソシルセラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：ヘキソシルセラミドの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：ホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：ホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：ホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：ホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：コレステロールエステルの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：コレステロールエステルの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン：トリアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のスフィンゴミエリン：トリアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：セラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：セラミドの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：ジアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：ジアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：ヘキソシルセラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：ヘキソシルセラミドの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：リゾホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：リゾホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：ホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：ホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：ホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：ホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：ホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：ホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル：トリアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％以内のコレステロールエステル：トリアシルグリセロールの比を特徴とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４６６．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、
ａ）例えば、実施例４２のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物、
ｂ）例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％以内である脂質とタンパク質との比率、
ｃ）例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％以内であるタンパク質と核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）との比率、
ｄ）例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％超のソース細胞における対応する比率よりも大きいタンパク質とＤＮＡとの比率、
ｅ）例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％以内であるタンパク質と核酸（例えば、ＤＮＡ）との比率、および／または
ｆ）例えば、実施例５１のアッセイを使用して測定した場合、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％超のソース細胞における対応する比率よりも大きいタンパク質とＤＮＡとの比率を特徴とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４６７．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、
ａ）被験体、例えば、マウスにおける、例えば、実施例７５のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の半減期、または
ｂ）例えば、実施例７５のアッセイにより、例えば、ヒト被験体またはマウスにおいて、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、もしくは２４時間の被験体、例えば、マウスにおける半減期を特徴とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４６８．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く、グルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を膜を横切って輸送するか、または輸送することができる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４６９．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、
ａ）例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の内腔におけるエステラーゼ活性、
ｂ）例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性レベルの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の代謝活性レベル（例えば、クエン酸合成酵素活性）、
ｃ）例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の代謝活性レベル（例えば、クエン酸合成酸素活性）、
ｄ）例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の呼吸レベル（例えば、酸素消費率）、
ｅ）例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の呼吸レベル（例えば、酸素消費率）、ならびに／あるいは
ｆ）例えば、実施例７０のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、もしくは１０，０００ ＭＦＩのアネキシンＶ染色レベルを特徴とするか、またはフソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソーム、またはその組成物もしくは調製物のアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低いアネキシンＶ染色レベルを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４７０．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物、フソソームが、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低いアネキシンＶ染色レベルを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４７１．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、
ａ）例えば、実施例３９のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上のｍｉＲＮＡ含有量、
ｂ）例えば、実施例３９のアッセイにより、ソース細胞のｍｉＲＮＡ含有量レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上（例えば、ソース細胞のｍｉＲＮＡ含有量レベルの最大１００％）のｍｉＲＮＡ含有量レベル、
ｃ）例えば、実施例１０８のアッセイによって測定した場合、ソース細胞の総ＲＮＡ含有量レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上（例えば、ソース細胞の総ＲＮＡ含有量レベルの最大１００％）の総ＲＮＡ含有量レベル、
ｄ）例えば、実施例４７のアッセイにより、ソース細胞のそれの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内、もしくはそれ以上、例えば、ソース細胞のそれの１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、もしくは８０％～９０％以内である可溶性：不溶性タンパク質の比率、および／または
ｅ）例えば、実施例４８のアッセイによって測定した場合、フソソームの脂質含有量の５％、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％未満、またはそれ以下のＬＰＳレベルを特徴とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４７２．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取込みが可能である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４７３．フソソームが、被験体、例えばマウスに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば、実施例８７または１００のアッセイにより、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、２４、４８、または７２時間後に標的組織内に存在する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４７４．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、
ａ）例えば、実施例７１のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくは骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベル、
ｂ）例えば、実施例７１のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくは骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％（例えば、最大１００％）のジャクスタクリンシグナル伝達レベル、
ｃ）例えば、実施例７２のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％大きいパラクリンシグナル伝達レベル、
ｄ）例えば、実施例７２のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％（例えば、最大１００％）のパラクリンシグナル伝達レベル、
ｅ）例えば、実施例７３のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％以内のレベルの重合アクチン、および／または
ｆ）例えば、実施例７４のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の膜電位を特徴とするか、あるいは提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、約－２０～－１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ、または－１００～－１５０ｍＶの膜電位を特徴とし、フソソームが、－１ｍＶ、－５ｍＶ、－１０ｍＶ、－２０ｍＶ、－３０ｍＶ、－４０ｍＶ、－５０ｍＶ、－６０ｍＶ、－７０ｍＶ、－８０ｍＶ、－９０ｍＶ、－１００ｍＶ未満の膜電位を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４７５．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例５７のアッセイを使用して、ソース細胞の血管外遊出率の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の速度で血管から血管外遊出することができ、例えば、ソース細胞が、好中球、リンパ球、Ｂ細胞、マクロファージ、またはＮＫ細胞であり、任意に、提供されるフソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例５８のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マクロファージと比較して、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、最大１００％）の走化性が可能である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４７６．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例６０のアッセイを使用して、参照細胞、例えばマクロファージと比較して、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、最大１００％）での食作用が可能である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４７７．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、細胞膜、例えば、内皮細胞膜または血液脳関門を通過することができる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４７８．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、
ａ）例えば、実施例６２のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％大きい割合でタンパク質を分泌することができる、または
ｂ）例えば、実施例６２のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞と比較して、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％（例えば、最大１００％）大きい割合でタンパク質を分泌することができる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４７９．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、
ａ）転写ができないか、または例えば、実施例１９のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞の転写活性の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％未満の転写活性を有する、あるいは
ｂ）核ＤＮＡ複製ができないか、または例えば、実施例２０のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞の核ＤＮＡ複製の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％未満の核ＤＮＡ複製を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４８０．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、クロマチンを欠いているか、または例えば、実施例３７のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞のクロマチン含有量の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％未満のクロマチン含有量を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４８１．フソソーム、および／またはその組成物または調製物が、医薬品もしくは適正製造基準（ＧＭＰ）基準を満たすか、またはＧＭＰに従って作製された、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４８２．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、
ａ）所定の参照値を下回る病原体レベルを特徴とし、例えば、病原体を実質的に含まない、
ｂ）所定の基準値を下回る汚染物質（例えば、核ＤＮＡなどの核成分）レベルを含み、例えば、１つ以上の特定の汚染物質を実質的に含まない、および／または
ｃ）例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を特徴とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４８３．ソース細胞または標的細胞が、内皮細胞、線維芽球、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯からの幹細胞、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆細胞（例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球）、前駆細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ９０、ＩＭＲ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、もしくはＢＪ細胞）であり、任意に、ソース細胞が、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または幹細胞以外のものであり、任意に、ソース細胞または標的細胞が、好中球、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）、マクロファージ、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または骨髄芽球から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４８４．ソース細胞が、
ａ）付着もしくは懸濁条件下で増殖した細胞、
ｂ）初代細胞、培養細胞、不死化細胞、もしくは細胞株（例えば、骨髄バスト細胞株、例えば、Ｃ２Ｃ１２）、
ｃ）例えば、標的細胞と同じ種の異なる生物から得られた同種異系細胞、
ｄ）例えば、標的細胞と同じ生物から得られた自家細胞、または
ｅ）例えば、標的細胞とは異なる種の生物から得られた異種細胞である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４８５．ソース細胞が、ソース細胞に対して外因性である第２の作用物質、例えば、治療薬、例えば、タンパク質または核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４８６．第２の作用物質が、フソソームによって含まれる少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下で存在するか、あるいはフソソームあたり少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、もしくは１，０００，０００コピー、またはそれ以下の平均レベルで存在する、実施形態４８５に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４８７．標的細胞が、生物、例えば、生物から単離された初代細胞内にある、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４８８．標的化ドメインが、標的細胞上の標的細胞部分、例えば、細胞表面特徴部と相互作用する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４８９．フソソームが、前述の標的細胞部分を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４９０．フソソームが、標的細胞上のフソゲン結合パートナーと相互作用し、それによりフソソームが標的細胞に結合または融合することを可能にするフソゲンを含み、任意にフソソームが、前述のフソゲン結合パートナーを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４９１．標的化ドメインが、フソゲンの一部でないか、またはフソゲンが、標的化ドメインを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４９２．フソゲン結合パートナーが、標的細胞部分とは異なる実体であるか、もしくはその一部であるか、またはフソゲン結合パートナーが、標的細胞部分であるか、もしくはその一部である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４９３．フソソームが、エンドサイトーシスによって標的細胞に入り、例えば、エンドサイトーシス経路を介して送達される作用物質（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤、および任意に第２の作用物質）のレベルが、例えば、実施例９１のアッセイを使用して、０．０１～０．６、０．０１～０．１、０．１～０．３、または０．３～０．６であるか、あるいは同様のフソソームと接触したクロロキン処理された参照細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより大きい、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４９４．標的細胞に入るフソソーム組成物または調製物中のフソソームの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％が、非エンドサイトーシス経路に入り、例えば、フソソームが、細胞表面との融合を介して標的細胞に入り、任意に、標的細胞に入るフソソーム組成物または調製物中のフソソームの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％が、細胞質に入る（例えば、エンドソームもしくはリソソームには入らない）、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４９５．標的細胞に入るフソソーム組成物または調製物中のフソソームの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が、エンドソームまたはリソソームに入る、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４９６．フソソームが、非エンドサイトーシス経路によって標的細胞に入り、例えば、送達される作用物質（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤、および任意に第２の作用物質）のレベルが、例えば、実施例９１のアッセイを使用して、クロロキン処理された参照細胞のレベルの少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４９７．フソソームが、作用物質（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤、および任意に第２の作用物質）を、ダイナミン媒介経路を介して標的細胞に送達し、例えば、ダイナミン媒介経路を介して送達される作用物質（例えば、膜タンパク質ペイロード剤および／もしくは第２の作用物質）のレベルが、例えば、実施例９２のアッセイにおいて測定した場合、０．０１～０．６の範囲内であるか、または同様のフソソームと接触したＤｙｎａｓｏｒｅ処理細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上大きい、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４９８．フソソームが、作用物質（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤、および任意に第２の作用物質）を、マクロピノサイトーシスを介して標的細胞に送達し、例えば、マクロピノサイトーシスを介して送達される作用物質（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤、および任意に第２の作用物質）のレベルが、例えば、実施例９２のアッセイにおいて測定した場合、０．０１～０．６の範囲内であるか、または同様のフソソームと接触したＥＩＰＡ処理標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上大きい、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
４９９．フソソームが、作用物質（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤、および任意に第２の作用物質）を、アクチン媒介経路を介して標的細胞に送達し、例えば、アクチン媒介経路を介して送達される作用物質（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤、および任意に第２の作用物質）のレベルが、例えば、実施例９２のアッセイにおいて測定した場合、０．０１～０．６の範囲内であるか、または同様のフソソームと接触したラトランクリンＢ処理参照細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上大きいであろう、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５００．フソソームおよび／またはその組成物または調製物が、例えば、実施例３３のアッセイにより、＜１、１～１．１、１．０５～１．１５、１．１～１．２、１．１５～１．２５、１．２～１．３、１．２５～１．３５、または＞１．３５ｇ／ｍＬの密度を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５０１．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、タンパク質質量で０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、もしくは１０％未満のソース細胞を含むか、または０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、もしくは１０％未満の細胞が、機能的核を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５０２．フソソーム組成物または調製物中のフソソームの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が、オルガネラ、例えば、ミトコンドリアを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５０３．フソソームおよび／またはその組成物または調製物が、ソース細胞に対して外因性である治療薬を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５０４．
ａ）治療薬が、標的細胞に対して外因性である、および／または
ｂ）外因性治療薬が、タンパク質、例えば、膜貫通タンパク質、分泌タンパク質、受容体、抗体、核酸、例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくは小分子のうちの１つ以上から選択される、実施形態５０３に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５０５．フソソームが、エンドサイトーシスまたは非エンドサイトーシス経路によって細胞に入る、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５０６．フソソームおよび／またはその組成物または調製物が、核を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５０７．フソソームが、核ＤＮＡを実質的に含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５０８．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、
ａ）冷蔵または冷凍されている、
ｂ）機能的核を含まない、および／または提供されるフソソーム組成物もしくは調製物が、機能的核のない１つ以上のフソソームを含む、
ｃ）タンパク質質量で０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、もしくは１０％未満のソース細胞を含むか、または０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、もしくは１０％未満の細胞が、機能的核を有する、
ｄ）前述の温度で少なくとも１、２、３、６、もしくは１２時間；１、２、３、４、５、もしくは６日間；１、２、３、もしくは４週間；１、２、３、もしくは６ヶ月間；または１、２、３、４、もしくは５年間維持されている、あるいは
ｅ）例えば、
ｉ）例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い割合で融合する、
ｉｉ）例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％高い割合で融合する、
ｉｉｉ）例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、２４、４８、または７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、または
ｉｖ）例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、もしくは１，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数でのフソゲンのレベルのうちの１つ以上によって、前述の温度で維持される前に、集団の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の活性を特徴とする、実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５０９．フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、以下の温度で安定である、
ａ）４℃未満で少なくとも１、２、３、６、もしくは１２時間；１、２、３、４、５、もしくは６日間；１、２、３、もしくは４週間；１、２、３、もしくは６ヶ月間；または１、２、３、４、もしくは５年間、
ｂ）－２０℃未満で少なくとも１、２、３、６、もしくは１２時間；１、２、３、４、５、もしくは６日間；１、２、３、もしくは４週間；１、２、３、もしくは６ヶ月間；または１、２、３、４、もしくは５年間、あるいは
ｃ）－８０℃未満で少なくとも１、２、３、６、もしくは１２時間；１、２、３、４、５、もしくは６日間；１、２、３、もしくは４週間；１、２、３、もしくは６ヶ月間；または１、２、３、４、もしくは５年間、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５１０．以下のうちの１つ以上が、真である、
ｉ）ソース細胞が、２９３細胞以外である、
ｉｉ）ソース細胞が、形質転換もしくは不死化されていない、
ｉｉｉ）ソース細胞が、アデノウイルスを介した不死化以外の方法を使用して形質転換または不死化され、例えば、自然突然変異もしくはテロメラーゼ発現によって不死化される、
ｉｖ）フソゲンが、ＶＳＶＧ、ＳＮＡＲＥタンパク質、もしくは分泌顆粒タンパク質以外のものである、
ｖ）治療薬が、ＣｒｅまたはＧＦＰ、例えば、ＥＧＦＰ以外である、
ｖｉ）治療薬が、例えば、内腔内の核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ）またはソース細胞（例えば、抗体、例えば、抗体）に対して外因性のタンパク質である、あるいは
ｖｉｉ）フソソームが、ミトコンドリアを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５１１．以下のうちの１つ以上が、真である、
ｉ）ソース細胞が、２９３もしくはＨＥＫ細胞以外である、
ｉｉ）ソース細胞が、形質転換もしくは不死化されていない、
ｉｉｉ）ソース細胞が、アデノウイルスを介した不死化以外の方法を使用して形質転換もしくは不死化され、例えば、自然突然変異もしくはテロメラーゼ発現によって不死化される、
ｉｖ）フソゲンが、ウイルス性フソゲンではない、または
ｖ）フソソームが、４０～１５０ｎｍの間以外、例えば、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、もしくは５００ｎｍを超える直径を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５１２．以下のうちの１つ以上が、真である、
ｉ）膜タンパク質が、ソース細胞によって発現される、
ｉｉ）フソゲンが、ＴＡＴ、ＴＡＴ－ＨＡ２、ＨＡ－２、ｇｐ４１、アルツハイマー病のβアミロイドペプチド、センダイウイルスタンパク質、もしくは両親媒性ネットネガティブ（ｎｅｔ－ｎｅｇａｔｉｖｅ）ペプチド（ＷＡＥ １１）以外のものである、
ｉｉｉ）フソゲンが、哺乳動物フソゲンである、
ｉｖ）フソソームが、その内腔に、酵素、抗体、もしくは抗ウイルスポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む、
ｖ）フソソームは、治療用膜貫通タンパク質、例えば、ソース細胞に対して外因性である治療用膜貫通タンパク質を含まない、または
ｖｉ）フソソームが、ＣＤ６３またはＧＬＵＴ４を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５１３．以下のうちの１つ以上が、真である、
ｉ）ウイルスを含まない、感染性ではない、もしくは宿主細胞内で増殖しない、
ｉｉ）ＶＬＰ（ウイルス様粒子）ではない、
ｉｉｉ）ウイルス構造タンパク質、例えば、ウイルスカプシドタンパク質、例えば、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質を含まないか、またはウイルスカプシドタンパク質の量が、例えば、実施例５３のアッセイにより、総タンパク質の１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、もしくは０．１％未満である、
ｉｖ）ウイルスマトリックスタンパク質を含まない、
ｖ）ウイルスの非構造タンパク質を含まない、
ｖｉ）ウイルス構造タンパク質の小胞あたり１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピー未満のウイルス構造タンパク質を含む、あるいは
ｖｉｉ）フソソームが、微小胞ではない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５１４．フソゲンのコピー数とフソソーム上のウイルス構造タンパク質のコピー数との比が、少なくとも１，０００，０００：１、１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１１、２０：１、１０：１、５：１、もしくは１：１であるか、または、フソゲンのコピー数とフソソーム上のウイルスマトリックスタンパク質のコピー数との比が、少なくとも１，０００，０００：１、１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、もしくは１：１である、である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５１５．以下のうちの１つ以上が、真である、
ｉ）フソソームが、水不混和性の液滴を含まない、
ｉｉ）フソソームが、水性内腔および親水性外部を含む、
ｉｉｉ）フソゲンが、タンパク質フソゲンである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５１６．以下のうちの１つ以上が、真である、
ｉ）フソゲンが、哺乳動物のフソゲンもしくはウイルスのフソゲンである、
ｉｉ）フソソームが、フソソームに治療用または診断用物質をロードすることによって作製されたものではなかった、
ｉｉｉ）ソース細胞には、治療用または診断用物質がロードされていなかった、
ｉｖ）フソソームが、ドキソルビシン、デキサメタゾン、シクロデキストリン；ポリエチレングリコール、マイクロＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ１２５、ＶＥＧＦ受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｅ－セレクチン、酸化鉄、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰもしくはＲＦＰ、ナノ粒子、もしくはＲＮａｓｅを含まないか、またはソース細胞に対して外因性である上記のうちのいずれの外因性形態も含まない、あるいは
ｖ）フソソームが、ソース細胞に対して外因性であり、１つ以上の翻訳後修飾、例えば、グリコシル化を有する治療薬を更に含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５１７．フソソームが、単層または多層である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５１８．フソソーム、フソソーム組成物、またはフソソーム調製物が、以下を特徴とする、
ａ）例えば、実施例３０のアッセイによって測定した場合、ソース細胞のそれの約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内の直径、
ｂ）例えば、実施例３０のアッセイによって測定した場合、ソース細胞のそれの約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満である直径、
ｃ）例えば、実施例３０のアッセイによって測定した場合、ソース細胞の直径の約０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、もしくは８０％～９０％以内である直径、
ｄ）例えば、実施例３０のアッセイによって測定した場合、ソース細胞の直径の約０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％未満である直径、
ｅ）例えば、実施例３２のアッセイによって測定した場合、少なくとも約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、もしくは２５０ｎｍである直径、
ｆ）例えば、実施例３２のアッセイによって測定した場合、約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、もしくは２５０ｎｍ（例えば、±２０％）である直径、
ｇ）例えば、実施例３２のアッセイによって測定した場合、少なくとも約５００ｎｍ、７５０ｎｍ、１，０００ｎｍ、１，５００ｎｍ、２，０００ｎｍ、２，５００ｎｍ、３，０００ｎｍ、５，０００ｎｍ、１０，０００ｎｍ、もしくは２０，０００ｎｍである直径、
ｈ）例えば、実施例３２のアッセイによって測定した場合、約５００ｎｍ、７５０ｎｍ、１，０００ｎｍ、１，５００ｎｍ、２，０００ｎｍ、２，５００ｎｍ、３，０００ｎｍ、５，０００ｎｍ、１０，０００ｎｍ、もしくは２０，０００ｎｍ（例えば、±２０％）である直径、および／または
ｉ）５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、もしくは２００μｍを超える直径を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５１９．フソソーム、フソソーム組成物、またはフソソーム調製物が、ソース細胞の体積の約０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％未満である体積を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５２０．フソソーム、フソソーム組成物、またはフソソーム調製物が、１．０８ｇ／ｍＬ～１．１２ｇ／ｍＬ以外の密度を有し、任意に、フソソーム、フソソーム組成物、またはフソソーム調製物が、１．０８ｇ／ｍＬ～１．１２ｇ／ｍＬ以外の密度を有し、任意に、例えば、実施例３３のアッセイにより、密度が、＜１、１～１．１、１．０５～１．１５、１．１～１．２、１．１５～１．２５、１．２～１．３、１．２５～１．３５、または＞１．３５ｇ／ｍＬである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５２１．以下のうちの１つ以上が、真である、
ｉ）フソソームが、エクソソームではない、
ｉｉ）フソソームが、微小胞である、
ｉｉｉ）フソソームが、非哺乳動物のフソゲンを含む、
ｉｖ）フソソームが、フソゲンを含むように操作されている、
ｖ）フソソームが、ソース細胞または過剰発現したフソゲンに対して外因性であるフソゲンを含む、
ｖｉ）フソソームが、少なくとも８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、もしくは１５００ｎｍの直径を有するか、またはフソソームの集団もしくは複数のフソソームが、少なくとも８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、もしくは１５００ｎｍの平均直径を有する、
ｖｉｉ）フソソームが、１つ以上のオルガネラ、例えば、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒を含む、
ｖｉｉｉ）フソソームが、細胞骨格またはその成分、例えば、アクチン、Ａｒｐ２／３、フォルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、またはチューブリンを含む、
ｉｘ）複数のフソソームを含む調製物が、例えば、Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，″Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．″Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２に記載される、例えば、ショ糖勾配遠心分離アッセイにおいて、１．０８～１．２２ｇ／ｍＬの浮遊密度を有しないか、または少なくとも１．１８～１．２５ｇ／ｍｌ、もしくは１．０５～１．１２ｇ／ｍＬの密度を有する、
ｘ）脂質二重層が、ソース細胞と比較して、セラミドもしくはスフィンゴミエリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されているか、あるいは脂質二重層が、ソース細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、もしくはホスファチジルセリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されていない（例えば、枯渇している）、
ｘｉ）フソソームが、実施例５２のアッセイにおいて測定した場合、ホスファチジルセリン（ＰＳ）もしくはＣＤ４０リガンド、またはＰＳおよびＣＤ４０リガンドの両方を含む、
ｘｉｉ）フソソームが、ソース細胞と比較して、ＰＳについて豊富化されており、例えば、フソソームの集団において、Ｋａｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１４３３－Ｅ１４４２のアッセイにより、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、ＰＳに対して陽性である、
ｘｉｉｉ）フソソームが、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を実質的に含まないか、または例えば、実施例６７のアッセイにより、０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００ ＡＣｈＥ活性単位／タンパク質ｕｇ未満を含む、
ｘｉｖ）フソソームが、テトラスパニンファミリータンパク質（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、もしくはＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（例えば、ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ－Ｂ、もしくはＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン－４、ミトフィリン、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン－１、熱ショック７０－ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）、またはそれらの任意の組み合わせを実質的に含まないか、あるいは例えば、実施例４４のアッセイにより、任意の個々のエクソソームマーカータンパク質の０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、５％、もしくは１０％未満、および／または前述のタンパク質のうちのいずれかの総エクソソームマーカータンパク質の０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、もしくは２５％未満を含むか、あるいはこれらのタンパク質のうちのいずれか１つ以上について豊富化されていない、
ｘｖ）フソソームが、例えば、実施例４５のアッセイを使用して、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、もしくは１ｎｇ ＧＡＰＤＨ／総タンパク質μｇを下回るか、またはソース細胞中のＧＡＰＤＨのレベルを下回る、例えば、ソース細胞中の総タンパク質あたりのＧＡＰＤＨのレベル（ｎｇ／μｇ）よりも１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％未満低いレベルのグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を含む、
ｘｖｉ）フソソームが、１つ以上の小胞体タンパク質（例えば、カルネキシン）、１つ以上のプロテアソームタンパク質、もしくは１つ以上のミトコンドリアタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせについて豊富化され、例えば、カルネキシンの量が、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、もしくは１ｎｇカルネキシン／総タンパク質μｇ未満であるか、あるいはフソソームが、例えば、実施例４６のアッセイを使用して、ソース細胞と比較して、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多い総タンパク質あたりのカルネキシン（ｎｇ／μｇ）を含む、
ｘｖｉｉ）フソソームが、例えば、実施例３９または４０のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞に対して外因性である作用物質（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ）を含む、あるいは
ｘｖｉｉｉ）フソソームが、例えば、Ｋａｎａｄａ Ｍ， ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１４３３－Ｅ１４４２のアッセイにより、原子間力顕微鏡法によって少なくとも３０分間、雲母の表面に固定化され得る、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５２２．以下のうちの１つ以上が、真である、
ｉ）フソソームが、エクソソームである、
ｉｉ）フソソームが、微小胞ではない、
ｉｉｉ）フソソームが、８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、もしくは１５００ｎｍ未満の直径を有するか、またはフソソームの集団が、少なくとも８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、もしくは１５００ｎｍの平均直径を有する、
ｉｖ）フソソームが、オルガネラを含まない、
ｖ）フソソームが、細胞骨格またはその成分、例えば、アクチン、Ａｒｐ２／３、フォルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、またはチューブリンを含まない、
ｖｉ）複数のフソソームを含む調製物が、例えば、Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，″Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．″Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２に記載される、例えば、ショ糖勾配遠心分離アッセイにおいて、１．０８～１．２２ｇ／ｍＬの浮遊密度を有する、
ｖｉｉ）脂質二重層が、ソース細胞と比較して、セラミドもしくはスフィンゴミエリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されていない（例えば、枯渇している）か、あるいは脂質二重層が、ソース細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、もしくはホスファチジルセリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されている、
ｖｉｉｉ）フソソームが、実施例５２のアッセイにおいて測定した場合、ホスファチジルセリン（ＰＳ）もしくはＣＤ４０リガンド、またはＰＳおよびＣＤ４０リガンドの両方を含まないか、ソース細胞に対して枯渇している、
ｉｘ）フソソームが、ソース細胞と比較して、ＰＳについて豊富化されておらず（例えば、枯渇しており）、例えば、フソソームの集団において、Ｋａｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１４３３－Ｅ１４４２のアッセイにより、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満が、ＰＳに対して陽性である、
ｘ）フソソームが、例えば、実施例６７のアッセイにより、例えば、少なくとも０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００ ＡＣｈＥ活性単位／タンパク質ｕｇのアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を含む、
ｘｉ）フソソームが、テトラスパニンファミリータンパク質（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、もしくはＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（例えば、ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ－Ｂ、もしくはＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン－４、ミトフィリン、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン－１、熱ショック７０－ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、例えば、実施例４４のアッセイにより、ソース細胞と比較して、任意の個々のエクソソームマーカータンパク質の０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、５％、もしくは１０％超、および／または前述のタンパク質のうちのいずれかの総エクソソームマーカータンパク質の０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、もしくは２５％未満を含むか、あるいはこれらのタンパク質のうちのいずれか１つ以上について豊富化されている、
ｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４５のアッセイを使用して、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、もしくは１ｎｇ ＧＡＰＤＨ／総タンパク質μｇを上回る、またはソース細胞中のＧＡＰＤＨのレベルを下回る、例えば、ソース細胞中の総タンパク質あたりのＧＡＰＤＨのレベル（ｎｇ／μｇ）よりも少なくとも１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％多いレベルのグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を含む、
ｘｉｉｉ）フソソームが、１つ以上の小胞体タンパク質（例えば、カルネキシン）、１つ以上のプロテアソームタンパク質、もしくは１つ以上のミトコンドリアタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせについて豊富化されず（例えば、枯渇している）、例えば、カルネキシンの量が、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、もしくは１ｎｇカルネキシン／総タンパク質μｇ未満であるか、あるいはフソソームが、例えば、実施例４６のアッセイを使用して、ソース細胞と比較して、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少ない総タンパク質あたりのカルネキシン（ｎｇ／μｇ）を含む、
ｘｉｖ）フソソームが、例えば、Ｋａｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１４３３－Ｅ１４４２のアッセイにより、原子間力顕微鏡法によって少なくとも３０分間、雲母の表面に固定化され得ない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５２３．以下のうちの１つ以上が、真である、
ｉ）フソソームが、ＶＬＰを含まない、
ｉｉ）フソソームが、ウイルスを含まない、
ｉｉｉ）フソソームが、複製能ウイルスを含まない、
ｉｖ）フソソームが、ウイルスタンパク質、例えば、ウイルス構造タンパク質、例えば、カプシドタンパク質もしくはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、
ｖ）フソソームが、エンベロープウイルス由来のカプシドタンパク質を含まない、
ｖｉ）フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質を含まない、または
ｖｉｉ）フソゲンが、ウイルスフソゲンではない、フソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５２４．フソソームが、細胞質ゾルを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５２５．フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれによって構成される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５２６．フソソームが、除核細胞を含むか、またはそれによって構成される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５２７．フソソームが、コンドリソームを含むか、またはそれによって構成される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５２８．以下のうちの１つ以上が、真である、
ｉ）フソソームまたはソース細胞が、例えば、実施例１０２のアッセイにより、被験体に移植されたときに奇形腫を形成しない、
ｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例５８のアッセイを使用して、参照細胞、例えばマクロファージよりも、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内、またはそれより優れた走化性が可能である、
ｉｉｉ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、例えば、傷害の部位にホーミングすることができ、細胞生物学的物質が、例えば、実施例５９のアッセイを使用して、ヒト細胞に由来し、例えば、ソース細胞が、好中球である、あるいは
ｉｖ）フソソームおよび／またはその組成物もしくは調製物が、食作用が可能であり、例えば、フソソームによる食作用が、実施例６０のアッセイを使用して、０．５、１、２、３、４、５、または６時間以内に検出可能であり、例えば、ソース細胞が、マクロファージである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５２９．フソソーム、フソソーム組成物、またはフソソーム調製物が、被験体、例えば、ヒト被験体への投与後、５日以内、例えば、４日以内、３日以内、２日以内、１日以内、例えば、約１２～７２時間にわたって、いずれかの特徴のうちの１、２、３、４、５、６つ、またはそれ以上を保持する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５３０．フソソームが、以下の特徴のうちの１つ以上を有する、
ａ）ソース細胞からの１つ以上の内因性タンパク質、例えば、膜タンパク質もしくは細胞質ゾルタンパク質を含む、
ｂ）少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、もしくは５０００個の異なるタンパク質を含む、
ｃ）少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、もしくは１００個の異なる糖タンパク質を含む、
ｄ）フソソーム中のタンパク質の少なくとも１０質量％、２０質量％、３０質量％、４０質量％、５０質量％、６０質量％、７０質量％、８０質量％、もしくは９０質量％が、天然に存在するタンパク質である、
ｅ）少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、もしくは５０００個の異なるＲＮＡを含む、または
ｆ）少なくとも２、３、４、５、１０、もしくは２０個の異なる脂質を含み、例えば、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧから選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５３１．フソソームが、以下の特性のうちの１、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上を有するように操作されているか、またはフソソームが、天然に存在する細胞ではなく、以下の特性のうちの１、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上を有するか、または核が、天然に、以下の特性のうちの１、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上を有しない、
ａ）部分的な核の不活化が、核機能、例えば、転写もしくはＤＮＡ複製、またはその両方の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上の低下をもたらし、例えば、転写が、実施例１９のアッセイにより測定され、ＤＮＡ複製が、実施例２０のアッセイにより測定される、
ｂ）フソソームが、転写ができないか、または例えば、実施例１９のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞の転写活性の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％未満の転写活性を有する、
ｃ）フソソームが、核ＤＮＡ複製ができないか、または例えば、実施例２０のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞の核ＤＮＡ複製の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％未満の核ＤＮＡ複製を有する、
ｄ）フソソームが、クロマチンを欠いているか、または例えば、実施例３７のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞のクロマチン含有量の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％未満のクロマチン含有量を有する、
ｅ）フソソームが、核膜を欠いているか、または例えば、実施例３６のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはＪｕｒｋａｔ細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満の核膜の量を有する、
ｆ）フソソームが、機能的な核膜孔複合体を欠いているか、または例えば、実施例３６のアッセイにより、少なくとも５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％低減した移入もしくは移出活性を有するか、あるいはフソソームが、核孔タンパク質、例えば、ＮＵＰ９８またはインポーチン７のうちの１つ以上を欠いている、
ｇ）フソソームが、ヒストンを含まないか、または例えば、実施例３７のアッセイにより、ソース細胞の（例えば、Ｈ１、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３、もしくはＨ４の）ヒストンレベルの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満のヒストンレベルを有する、
ｈ）フソソームが、２０、１０、５、４、３、２、または１未満の染色体を含む、
ｉ）核機能が、排除されている、
ｊ）フソソームが、除核された哺乳動物細胞である、
ｋ）核が、除去または不活化される、例えば、機械的力によって、放射線によって、もしくは化学的アブレーションによって押し出される、あるいは
ｌ）フソソームが、例えば、間期または有糸分裂中に完全にまたは部分的に除去されるＤＮＡを有する哺乳動物細胞に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５３２．フソソームが、ｍｔＤＮＡまたはベクターＤＮＡを含む、例えば、フソソームが、ＤＮＡを含まないか、または実質的にＤＮＡを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５３３．ソース細胞が、初代細胞、不死化細胞、または細胞株（例えば、ミエロバスト（ｍｙｅｌｏｂａｓｔ）細胞株、例えば、Ｃ２Ｃ１２）である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５３４．フソソームが、修飾されたゲノムを有する、例えば、（例えば、ＭＨＣタンパク質、例えば、ＭＨＣ複合体を除去するためのゲノム編集によって）免疫原性が低下したソース細胞に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５３５．ソース細胞が、免疫抑制物質で処理された細胞培養物に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５３６．ソース細胞が、例えば、本明細書に記載のアッセイを使用して、実質的に非免疫原性である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５３７．ソース細胞が、外因性作用物質、例えば、治療薬である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５３８．ソース細胞が組換え細胞である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５３９．ソース細胞が、抗炎症シグナルで処理された細胞培養物に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５４０．フソソームが、ソース細胞に対して外因性である作用物質、例えば、治療用膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤、例えば、タンパク質または核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）を更に含み、例えば、外因性作用物質が、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下で存在する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５４１．フソソームが、例えば、ソース細胞、例えば、哺乳動物ソース細胞をｓｉＲＮＡまたは遺伝子編集酵素で処理することにより、改変した、例えば増加または減少したレベルの１つ以上の内因性分子、例えば、タンパク質または核酸（例えば、幾つかの実施形態では、ソース細胞に対して内因性、および幾つかの実施形態では、標的細胞に対して内因性）を有する、実施形態３８１に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５４２．内因性分子が、
ａ）少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下で存在する、
ｂ）ソース細胞におけるその濃度よりも少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、または１．０×１０８高い濃度で存在する、
ｃ）ソース細胞におけるその濃度よりも少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、または１．０×１０８低い濃度で存在する、実施形態５４０または５４１に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５４３．フソゲンが、
ａ）ウイルス性フソゲン、例えば、ＨＡ、ＨＩＶ－１ ＥＮＶ、ｇｐ１２０、またはＶＳＶ－Ｇである、
ｂ）哺乳動物のフソゲン、例えば、ＳＮＡＲＥ、Ｓｙｎｃｙｔｉｎ、ｍｙｏｍａｋｅｒ、ｍｙｏｍｉｘｅｒ、ｍｙｏｍｅｒｇｅｒ、またはＦＧＦＲＬ１である、
ｃ）４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、または９～１０のｐＨで活性である、
ｄ）４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、または９～１０のｐＨでは活性でない、
ｅ）標的細胞の表面で標的細胞に融合する、
ｆ）リソソームに依存しない方法で融合を促進する、
ｇ）タンパク質フソゲンである、
ｈ）脂質フソゲン、例えば、オレイン酸、モノオレイン酸グリセロール、グリセリド、ジアシルグリセロール、または修飾された不飽和脂肪酸である、
ｉ）化学フソゲン、例えば、ＰＥＧであり、任意に、フソゲンが、小分子フソゲン、例えば、ハロタン、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、およびクロルプロマジンなどのＮＳＡＩＤである、
ｊ）組換え体である、
ｋ）生化学的に組み込まれ、例えば、フソゲンが、精製されたタンパク質として提供され、フソゲンと脂質二重層との会合を可能にする条件下で脂質二重層と接触する、ならびに／あるいは
ｌ）生合成的に組み込まれ、例えば、フソゲンが脂質二重層と会合するのを可能にする条件下で、ソース細胞において発現される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５４４．フソゲンが、標的細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞以外の標的細胞、例えば、形質転換または不死化されていない標的細胞に結合する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５４５．形質転換されていない細胞が、接触阻害を示し、かつ／またはその増殖が、同じタイプの正常細胞と同じ生存因子もしくは成長因子に依存する、実施形態５４４に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５４６．複数のフソソームが、同じであるか、または異なる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
５４７．複数のフソソームが、
ａ）１つ、２つ、もしくはそれ以上のタイプのソース細胞に由来する、および／または
ｂ）フソソーム組成物中のフソソームの少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％が、同じフソゲンを含む、同じタイプのソース細胞を使用して産生される、または同じペイロード（例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤）を含む、から選択される少なくとも１つの特性を共有する、実施形態５４６に記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
５４８．
ａ）複数のフソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％が、フソソーム組成物もしくは調製物中のフソソームの平均径の１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％以内の直径を有する、または
ｂ）複数のフソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％が、フソソーム組成物もしくは調製物中のフソソームの平均体積の１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％以内の体積を有する、実施形態５４６または５４７に記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
５４９．フソソーム組成物または調製物が、例えば、実施例３１に基づいて、直径分布におけるソース細胞集団の変動の１０％、５０％、または９０％以内で、約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満の直径分布における変動を有する、実施形態５４６～５４８のいずれかに記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
５５０．複数のフソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が、フソソーム組成物または調製物におけるフソソーム中の平均フソゲンコピー数の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以内のコピー数のフソゲンを有する、実施形態５４６～５４９のいずれかに記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
５５１．複数のフソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が、フソソーム組成物または調製物におけるフソソーム中の平均治療薬コピー数の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以内のコピー数の治療薬を有する、実施形態５４６～５５０のいずれかに記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
５５２．フソソーム組成物または調製物が、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、もしくは１０１０、またはフソソームを含む、実施形態５４６～５５１のいずれかに記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物または調製物は、少なくとも１μＬ、２μＬ、５μＬ、１０μＬ、２０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、５００μＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、または１０ｍＬの量である。
５５３．複数のフソソームが、少なくとも０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のフソソームを含み、これらは以下の特徴のうちの１つ以上を有する、
（ｉ）核もしくは機能的核を含まない、
（ｉｉ）核ＤＮＡを実質的に含まない、または
（ｉｉｉ）ミトコンドリアもしくは機能的ミトコンドリアを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
５５４．以下のうちの１つ以上が、真である、
ａ）薬学的組成物が、医薬品もしくは適正製造基準（ＧＭＰ）基準を満たしている、
ｂ）薬学的組成物が、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｃ）薬学的組成物が、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、
ｄ）薬学的組成物が、所定の参照値を下回る汚染物質レベル（例えば、核ＤＮＡ）を有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない、または
ｅ）薬学的組成物が、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、上記実施形態のいずれかに記載の薬学的組成物。
５５５．生物学的機能が、
ａ）酵素を調節する、例えば、阻害または刺激する、
ｂ）例えば、合成を阻害または刺激することによって、または因子の分解を阻害もしくは刺激することによって、被験体における分子（例えば、タンパク質、核酸、もしくは代謝物、薬物、もしくは毒素）のレベルを調節する、例えば、増加または減少させる、
ｃ）標的細胞または組織の生存率を調節する、例えば、増加または減少させる、あるいは
ｄ）タンパク質の状態を調節する、例えば、タンパク質のリン酸化を増加もしくは減少させる、またはタンパク質立体配座を調節する、
ｅ）傷害の治癒を促進する、
ｆ）２つの細胞間の相互作用を調節する、例えば、増加または減少させる、
ｇ）細胞分化を調節する、例えば、促進または阻害する、
ｈ）被験体における因子（例えば、タンパク質、核酸、代謝産物、薬物、または毒素）の分布を変化させる、
ｉ）免疫応答を調節する、例えば、増加または減少させる、あるいは
ｊ）標的組織への細胞の動員を調節する、例えば、増加または減少させる、から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５５６．被験体が、癌、炎症性障害、自己免疫疾患、慢性疾患、炎症、臓器機能の損傷、感染症、代謝性疾患、変性障害、遺伝性疾患（例えば、遺伝性欠損症もしくは優勢な遺伝性障害）、または傷害を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５５７．被験体が、感染症を有し、フソソームが、感染症の抗原を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５５８．被験体が、遺伝的欠損を有し、フソソームが、被験体が欠損しているタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）、またはタンパク質をコードするＤＮＡ、またはタンパク質をコードする染色体、またはタンパク質をコードする核酸を含む核を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５５９．被験体が、優性遺伝性障害を有し、フソソームが、優性変異体対立遺伝子の核酸阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５６０．被験体が、優性遺伝性障害を有し、フソソームが、優性変異体対立遺伝子の核酸阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を含み、フソソームがまた、核酸阻害剤によって標的とされない変異遺伝子の非変異対立遺伝子をコードするｍＲＮＡを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５６１．被験体が、ワクチン接種を必要としている、および／または、例えば、損傷部位の再生を必要としている、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５６２．フソソームが、１つ以上のシグナル配列をコードする１つ以上の配列を更に含む核酸を含み、例えば、標的細胞が、シグナル配列を含むタンパク質を標的細胞の細胞膜に転位させる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５６３．フソソーム組成物または調製物が、
ａ）被験体に少なくとも１、２、３、４、もしくは５回投与される、
ｂ）被験体に全身的に（例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内に）もしくは局所的に投与される、
ｃ）フソソーム組成物もしくは調製物が、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、もしくは眼から選択される標的組織に到達するように、被験体に投与される、
ｄ）免疫抑制物質、例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、もしくはイムノフィリンモジュレーターと同時投与される、および／または
ｅ）免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、もしくはケモカインと同時投与される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５６４．フソソーム組成物または調製物の投与が、被験体の標的細胞における遺伝子の上方調節または下方調節をもたらし、例えば、フソソームが、転写活性化因子もしくは抑制因子、翻訳活性化因子もしくは抑制因子、またはエピジェネティック活性化因子もしくは抑制因子を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５６５．フソソーム調製物が、
ａ）少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、もしくは１０１５フソソーム、および／または
ｂ）少なくとも１０ｍＬ、２０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、もしくは５０Ｌを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５６６．第１のフソゲンが、リポペプチドではない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５６７．フソソーム、フソソーム組成物、またはフソソーム調製物が、部分的または完全な核不活化（例えば、核除去）を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５６８．ソース細胞が、
ａ）付着または懸濁条件下で増殖した細胞、
ｂ）初代細胞、培養細胞、不死化細胞、または細胞株（例えば、ミエロバスト（ｍｙｅｌｏｂａｓｔ）細胞株、例えば、Ｃ２Ｃ１２）、
ｃ）例えば、標的細胞と同じ種の異なる生物から得られた同種異系細胞、
ｄ）例えば、標的細胞とは異なる種の生物から得られた異種細胞である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５６９．フソソームが、
ａ）循環中のスカベンジャー系もしくは肝臓の洞内のクッパー細胞、または
ｂ）例えば、実施例７６のアッセイによる、被験体における細網内皮系（ＲＥＳ）によって捕捉されない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５７０．複数のフソソームが被験体に投与される場合、複数の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満が、例えば、実施例７６のアッセイにより、２４時間後にＲＥＳによって捕捉されない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５７１．フソソームが、ウイルス構造タンパク質および／またはウイルスマトリックスタンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５７２．フソソームが、例えば、ソース細胞と比較して、以下のオルガネラ：ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒のうちの１つ以上を実質的に含まないか、または少数を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５７３．フソソームが、ＣｒｅまたはＧＦＰ、例えば、ＥＧＦＰを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５７４．フソソーム組成物または薬学的組成物が、所定の温度で少なくとも１、２、３、６、もしくは１２時間；１、２、３、４、５、もしくは６日間；１、２、３、もしくは４週間；１、２、３、もしくは６ヶ月間；または１、２、３、４、もしくは５年間維持されている、かつ／あるいは所定の温度が、約４、０、－４、－１０、－１２、－１６、－２０、－８０、または－１６０℃から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５７５．フソソーム組成物または薬学的組成物が、例えば、以下のうちの１つ以上によって、前述の温度で維持する前に、複数の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の活性を有する、
ｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１０％高い割合で融合する、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも５０％高い割合で融合する、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、２４時間後に、標的細胞の少なくとも１０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、または
ｉｖ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、前述の温度で維持する前に、複数のフソゲンコピー数の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％のコピー数で存在する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５７６．フソソーム組成物または薬学的組成物が、例えば、以下のうちの１つ以上によって、前述の期間にわたって前述の温度で保存する前に、複数の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の活性を有する場合、安定であると見なされる、
ｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１０％高い割合で融合する、
ｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも５０％高い割合で融合する、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、２４時間後に、標的細胞の少なくとも１０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、または
ｉｖ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、前述の温度で維持する前に、複数のフソゲンコピー数の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％のコピー数で存在する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５７７．疾患または障害が、癌、自己免疫障害、または感染症から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５７８．フソソームが、新生抗原を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５７９．フソソーム組成物が、
ａ）被験体に少なくとも１、２、３、４、もしくは５回、
ｂ）被験体に全身的（例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内）もしくは局所的に、および／または
ｃ）フソソーム組成物が、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、もしくは眼から選択される標的組織に到達するように、被験体に投与される、上記実施形態のいずれかのフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５８０．フソソーム組成物が、
ａ）免疫抑制物質、例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、もしくはイムノフィリンモジュレーター、および／または
ｂ）免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、もしくはケモカインと同時投与される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５８１．複数のフソソームが、局所的、遠位的、または全身的効果を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５８２．生物が、ヒトであり、例えば、ヒトが、疾患、障害、または状態を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
５８３．標的細胞の細胞膜脂質二重層における膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤の存在が、疾患、障害、または状態のうちの１つ以上の症状を改善する、実施形態５８２に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
本明細書の態様のうちのいずれか、例えば、上記のフソソーム、フソソーム組成物、調製物、および方法を、本明細書の実施形態のうちの１つ以上、例えば、本明細書に記載される実施形態のうちの１つまたはと組み合わせることができる。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、本明細書において、例えば、いずれかの表で言及される全てのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、およびＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み込まれる。特に明記されていない限り、本明細書の表を含め、本明細書で指定されている配列受託番号は、２０１８年５月１７日現在のデータベースエントリを参照している。１つの遺伝子またはタンパク質が複数の配列受託番号を参照する場合、全ての配列バリアントが含まれる。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示であり、限定することを意図していない。
本発明の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的で、ここに例示されている本明細書に記載の特定の実施形態が、本明細書に記載される。ただし、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置および手段に限定されないことを理解されたい。
小胞体の色素によるフソソームの染色を定量化する。 ミトコンドリアの色素によるフソソームの染色を定量化する。 リソソームの色素によるフソソームの染色を定量化する。 Ｆ－アクチンの色素によるフソソームの染色を定量化する。 ＣｒｅおよびＧＦＰを発現するフソゲンと接触した細胞を光退色させた後のＧＦＰ蛍光の回復を示すグラフ。 フソソームまたは陰性対照と接触した後、ＲＦＰを発現している標的細胞のパーセンテージを示すグラフ。 ドナーとレシピエントのＨｅＬａ細胞との間の融合による陽性のオルガネラ送達の画像。白色で示された細胞内領域は、ドナーとレシピエントのミトコンドリアとの間の重複を示す。灰色の細胞内領域は、ドナーおよびレシピエントのオルガネラが重なっていない場所を示す。 ドナーとレシピエントのＨｅＬａ細胞との間の融合による陽性のオルガネラ送達の画像。白色で示された細胞内領域は、ドナーとレシピエントのミトコンドリアとの間の重複を示す。灰色の細胞内領域は、ドナーおよびレシピエントのオルガネラが重なっていない場所を示す。 フソソームを注射したマウスからの示された組織の顕微鏡画像を示す。白色は、ＲＦＰ蛍光細胞を表し、インビボでの細胞へのタンパク質カーゴの送達を示す。 標的細胞によるルシフェラーゼの発現をもたらす、指定された投与経路によるインビボでのマウス組織へのフソソームの送達の成功を示す一連の画像。 マウスの筋肉組織におけるｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の顕微鏡画像を示し、細胞生物学による筋肉細胞へのタンパク質カーゴの送達を示す。
本発明は、膜タンパク質ペイロード剤を含むフソソーム、および関連する方法を記載する。
定義
作用物質：一般に、本明細書で使用される「作用物質」という用語は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、糖類もしくは多糖類、脂質、低分子、またはそれらの組み合わせもしくは複合体を含む、化合物または実体を指すために使用され得る。この用語は、オルガネラ、またはその画分、抽出物、もしくは成分であるか、またはそれを含む実体を指す場合がある。
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の標的抗原への特異的結合を与えるのに十分な正規型免疫グロブリン配列エレメントを含むポリペプチドを指す。本発明の目的のために、ある特定の実施形態では、抗原への特異的結合を与えるのに十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、そのようなポリペプチドが天然に産生される（例えば、抗原に反応する生物によって生成される）、あるいは組換え工学、化学合成、または他の人工的なシステムもしくは方法論によって産生されるかにかかわらず、「抗体」と称され、および／または使用され得る。幾つかの実施形態では、抗体は、ポリクローナルであり、幾つかの実施形態では、抗体は、モノクローナルである。幾つかの実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的な定常領域配列を有する。幾つかの実施形態では、抗体配列エレメントは、ヒト化、霊長類化、キメラ等である。実施形態では、本発明に従って利用される抗体が、限定されないが、無傷のＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体；二重特異性または多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）等）；Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、および単離されたＣＤＲまたはそれらのセットなどの抗体フラグメント；単鎖Ｆｖｓ；ポリペプチド－Ｆｃ融合物；単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはそのフラグメントなどのサメ単一ドメイン抗体）；ラクダ科抗体；マスクされた抗体（例、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））；小モジュラー免疫薬（「ＳＭＩＰ（商標）」）；単鎖またはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ＶＨＨ；Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）；Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；ミニボディ；ＢｉＴＥ（登録商標）；アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）；Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）；ＤＡＲＴ；ＴＣＲ様抗体；Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）；Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）；微小タンパク質（ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ）；Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）；およびＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択される形式である。幾つかの実施形態では、抗体は、それが自然に産生された場合に有するであろう共有結合修飾（例えば、グリカンの付着）を欠き得る。幾つかの実施形態では、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカンの付着、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療部分、触媒部分等］、または他のペンダント基［例えば、ポリエチレングリコール等］を含み得る。幾つかの実施形態では、上記の形式のいずれかの抗体は、１つ以上の補体決定領域、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤ２、および／またはＣＤＲ３を含む。
抗原結合ドメイン：本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原に結合する抗体またはキメラ抗原受容体のその部分を指す。幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインは、細胞の細胞表面抗原に結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインは、癌に特徴的な抗原、例えば、新生物細胞における腫瘍関連抗原に結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインは、感染症に特徴的な抗原、例えば、ウイルス感染した細胞におけるウイルス関連抗原に結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインは、自己免疫疾患、例えば、自己抗原において、被験体の免疫系によって標的とされる細胞に特徴的な抗原に結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合部分であるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖまたはＦａｂであるか、またはそれを含む。
と会合した：幾つかの実施形態では、２つ以上の実体は、それらが直接的または間接的に相互作用する場合、互いに物理的に「会合され」、それによりそれらは互いに物理的に近接している、および／またはその状態のままである。幾つかの実施形態では、互いに物理的に会合している２つ以上の実体は、互いに共有結合している。幾つかの実施形態では、互いに物理的に会合している２つ以上の実体は、互いに共有結合していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、およびそれらの組み合わせによって非共有結合的に会合している。
癌：「癌」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍」、および「癌腫」という用語は、本明細書では、比較的異常な、制御されていない、および／または自律的な増殖を示す細胞を指すために使用され、それによりそれらは、細胞増殖の制御の有意な喪失を特徴とする異常な成長表現型を示す。幾つかの実施形態では、腫瘍は、前癌性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性、および／または非転移性である細胞であるか、またはそれらを含み得る。本開示は、その教示が特に関連し得る、ある特定の癌を具体的に特定する。幾つかの実施形態では、関連する癌は、固形腫瘍を特徴とし得る。幾つかの実施形態では、腫瘍は、分散性腫瘍または液体腫瘍であり得る。幾つかの実施形態では、関連する癌は、血液学的腫瘍を特徴とし得る。一般に、当該技術分野で知られている異なるタイプの癌の例には、例えば、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、骨髄腫および骨髄増殖性疾患；肉腫、黒色腫、腺腫、固形組織の癌腫、口、喉、喉頭、および肺の扁平上皮癌、肝臓癌、前立腺、子宮頸部、膀胱、子宮などの泌尿生殖器癌、および内分泌癌と腎細胞癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、皮膚または眼内黒色腫、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、頭頸部癌、乳癌、胃腸癌、および神経系癌、良性病変乳頭腫などの良性病変等が含まれる。
カーゴ：本明細書で使用される場合、「カーゴ」または「ペイロード」は、フソソームによって標的細胞に送達され得る作用物質を含む。幾つかの実施形態では、カーゴは、治療薬、例えば、ソース細胞に対して内因性または外因性である治療薬のうちの１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、治療薬は、タンパク質、例えば、酵素、膜貫通タンパク質、受容体、抗体；核酸、例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または小分子のうちの１つ以上から選択される。幾つかの実施形態では、カーゴは、膜タンパク質ペイロード剤であるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、カーゴは、オルガネラであるか、またはそれを含む。
ＣＤＲ：本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」は、例えば、抗体可変領域内に位置することができる相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の各可変領域には３つのＣＤＲがあり、可変領域ごとにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。「ＣＤＲのセット」または「ＣＤＲセット」は、抗原に結合することができる単一の可変領域または抗原に結合することができる同族の重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲのいずれかで生じる３つまたは６つのＣＤＲの群を指す。ＣＤＲ境界を定義するための、ある特定のシステムが当該技術分野で確立されており（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ等）、当業者は、これらのシステム間の違いを理解し、特許請求される発明を理解し、実施するために必要な範囲でＣＤＲ境界を理解することができる。
細胞膜：本明細書で使用される場合、「細胞膜」は、細胞、例えば、ソース細胞または標的細胞に由来する膜を指す。
細胞生物学的物質：本明細書で使用される場合、「細胞生物学的物質」は、内腔および細胞膜を含む細胞の一部、または部分的もしくは完全な核不活化を有する細胞を指す。幾つかの実施形態では、細胞生物学的物質は、細胞骨格成分、細胞小器官、およびリボソームのうちの１つ以上を含む。実施形態では、細胞生物学的物質は、除核細胞、微小胞、または細胞ゴーストである。
細胞質ゾル：本明細書で使用される場合、「細胞質ゾル」は、細胞の細胞質の水性成分を指す。細胞質ゾルは、タンパク質、ＲＮＡ、代謝物、およびイオンを含み得る。
内因性：本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、関連するシステム（例えば、細胞、組織、生物、ソース細胞、もしくは標的細胞等）に自然に見出される作用物質、例えば、タンパク質または脂質を指す。例えば、幾つかの実施形態では、フソソームまたは膜封入調製物は、関連する脂質および／またはタンパク質が、フソソームまたは膜封入調製物が得られるか、または誘導されるソース細胞（例えば、フソソームもしくは膜封入調製物のソース細胞）において自然に見出される場合、１つ以上の「内因性」脂質および／またはタンパク質を含むと言われ得る。幾つかの実施形態では、内因性作用物質は、ソース細胞において過剰発現する。
外因性：本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、関連するシステム（例えば、細胞、組織、生物、ソース細胞、もしくは標的細胞等）に自然に見出されない作用物質、例えば、タンパク質または脂質を指す。実施形態では、作用物質は、操作され、かつ／または関連システムに導入される。例えば、幾つかの実施形態では、フソソームまたは膜封入調製物は、関連する脂質および／またはタンパク質が、フソソームまたは膜封入調製物が得られるか、または誘導されるソース細胞（例えば、フソソームもしくは膜封入のソース細胞）において自然に見出されない場合、１つ以上の「外因性」脂質および／またはタンパク質を含むと言うことができる。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、内因性作用物質のバリアント、例えば、アミノ酸配列、翻訳後修飾等の１つ以上の構造的側面において参照内因性タンパク質等）とは異なるタンパク質バリアントである。
機能的バリアント：「機能的バリアント」という用語は、参照アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされ、参照アミノ酸配列の１つ以上の活性を有することができるポリペプチドを指す。
融合細胞：本明細書で使用される場合、「融合細胞」は、１つ以上のフソソームと標的細胞との接触によって産生される細胞を指す。融合細胞の幾つかの実施形態では、１つ以上のフソソームの脂質二重層の少なくとも一部は、標的細胞の膜と会合している。
フソゲン：本明細書で使用される場合、「フソゲン」は、内腔を囲む２つの膜の間に相互作用を生じる作用物質または分子を指す。実施形態では、フソゲンは、膜の融合を促進する。他の実施形態では、フソゲンは、２つの内腔（例えば、フソソームの内腔および標的細胞の細胞質）の間に接続、例えば、孔を生じる。幾つかの実施形態では、フソゲンは、２つ以上のタンパク質の複合体を含み、例えば、いずれのタンパク質も、融合活性のみを有するものではない。
フソゲン結合パートナー：本明細書で使用される場合、「フソゲン結合パートナー」は、フソゲンと相互作用して２つの膜間の融合を促進する作用物質または分子を指す。幾つかの実施形態では、フソゲン結合パートナーは、細胞の表面特徴部であり得るか、またはそれを含み得る。
フソソーム組成物：本明細書で使用される場合、「フソソーム組成物」は、１つ以上のフソソームを含む組成物を指す。
膜タンパク質ペイロード剤：本明細書で使用される場合、「膜タンパク質ペイロード剤」は、膜タンパク質および／または膜タンパク質をコードする核酸であるか、またはそれらを含むカーゴを指し、このカーゴは、本明細書に記載されるように（例えば、標的細胞への送達のために）フソソームまたは膜封入調製物に含まれ得る。膜タンパク質は、細胞膜と会合する（例えば、内および／もしくは上に局在する）か、または細胞膜と会合することができるタンパク質である。幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、膜貫通タンパク質である。幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、膜、例えば、細胞膜に少なくとも部分的に（例えば、完全に）及ぶドメインを含む。幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、膜脂質二重層の内部（例えば、細胞質ゾル）部分と関連している。幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、膜脂質二重層の外部部分（例えば、細胞表面、または本明細書に記載のフソソームもしくは膜封入調製物の表面）と関連している。幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、細胞表面タンパク質である膜脂質二重層の外部部分と関連している。幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、膜脂質二重層を通過し、分泌される。幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、天然に存在するタンパク質である。幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、操作されたおよび／または合成タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体）である。幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、治療薬である。
核ペイロード剤：本明細書で使用される場合、「核ペイロード剤」は、核に局在する作用物質であるか、またはそれを含むか、またはコードするカーゴを指し、このカーゴは、本明細書に記載されるように（例えば、標的細胞への送達のために）フソソームまたは膜封入調製物に含まれ得る。幾つかの実施形態では、核ペイロード剤は、核質、核小体、核小体周辺領域、カハール体、クラストソーム、ジェム核内構造体、ヒストン遺伝子座体（ＨＬＢ）、核スペックル、核ストレス体、パラスペックル、ＰＭＬ体、ポリコーム体において優先的に豊富化される。幾つかの実施形態では、核ペイロード剤は、核タンパク質ペイロード剤である。幾つかの実施形態では、核ペイロード剤は、機能的核酸および／または非コード核酸を含む。
核タンパク質ペイロード剤：本明細書で使用される場合、「核タンパク質ペイロード剤」は、核タンパク質および／または核タンパク質をコードする核酸であるか、またはそれらを含むカーゴを指し、このカーゴは、本明細書に記載されるように（例えば、標的細胞への送達のために）フソソームまたは膜封入調製物に含まれ得る。核タンパク質は、核と会合する、または核と会合することができるタンパク質である。幾つかの実施形態では、核タンパク質は、核質、核小体、核小体周辺領域、カハール体、クラストソーム、ジェム核内構造体、ヒストン遺伝子座体（ＨＬＢ）、核スペックル、核ストレス体、パラスペックル、ＰＭＬ体、ポリコーム体において優先的に豊富化される。幾つかの実施形態では、核タンパク質は、天然に存在するタンパク質である。幾つかの実施形態では、核タンパク質は、操作されたおよび／または合成タンパク質である。幾つかの実施形態では、核タンパク質は、治療薬である。
オルガネラペイロード剤：本明細書で使用される場合、「オルガネラペイロード剤」は、細胞質ゾルオルガネラに局在する作用物質であるか、またはそれを含むか、またはコードするカーゴを指し、このカーゴは、本明細書に記載されるように（例えば、標的細胞への送達のために）フソソームまたは膜封入調製物に含まれ得る。核は、細胞質ゾルオルガネラではない。幾つかの実施形態では、オルガネラは、膜結合オルガネラである。他の実施形態では、オルガネラは、膜結合オルガネラではない。幾つかの実施形態では、細胞質ゾルオルガネラは、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体、液胞、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロメノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、ストレス顆粒、リソソーム、またはエンドソームである。幾つかの実施形態では、オルガネラペイロード剤は、オルガネラタンパク質ペイロード剤である。幾つかの実施形態では、オルガネラペイロード剤は、機能的核酸および／または非コード核酸を含む。
オルガネラタンパク質ペイロード剤：本明細書で使用される場合、「オルガネラタンパク質ペイロード剤」は、細胞質ゾルオルガネラおよび／または前述のタンパク質をコードする核酸において優先的に豊富化されるタンパク質であるか、またはそれらを含むカーゴを指し、このカーゴは、本明細書に記載されるように（例えば、標的細胞への送達のために）フソソームまたは膜封入調製物に含まれ得る。幾つかの実施形態では、タンパク質は、操作および／または合成タンパク質である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、治療薬である。
薬学的組成物：本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、１つ以上の薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された活性剤を指す。幾つかの実施形態では、活性剤は、関連する被験体への治療レジメンでの投与に適切な単位投与量で存在する。幾つかの実施形態では、薬学的組成物は、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射によって、例えば、無菌溶液または懸濁液、または徐放性製剤として、非経口投与のために特別に製剤化され得る。
薬学的に許容される担体：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、液体または固体の充填剤、希釈剤、または賦形剤などの薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。
優先的に豊富化される：本明細書で使用される場合、標的細胞の特定の領域に「優先的に豊富化される」作用物質は、細胞の少なくとも１つの参照領域と比較して特定の領域により高濃度で存在する作用物質を指す。幾つかの実施形態では、参照領域は、細胞質ゾルである。幾つかの実施形態では、標的細胞の特定の領域において優先的に豊富化される作用物質は、細胞の他の全ての領域と比較して、特定の領域においてより高い濃度で存在する。幾つかの実施形態では、標的細胞の特定の領域において優先的に豊富化される作用物質は、参照領域、例えば、シソゾル（ｃｙｓｏｓｏｌ）または原形質膜中の濃度よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、５倍、または１０倍高い。「優先的に豊富化された」および「豊富化された」は、本明細書では交換可能に使用される。
精製された：本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、自然状態から改変または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に自然に存在する細胞または細胞フラグメントは「精製」されないが、その自然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ細胞または細胞フラグメントは「精製」される。精製されたフソソーム組成物は、実質的に純粋な形態で存在することができるか、または、例えば、細胞を含む培養培地などの培養培地などの非天然環境に存在し得る。
ソース細胞：本明細書で使用される場合、「ソース細胞」は、フソソームが由来する、例えば、得られた細胞を指す。幾つかの実施形態では、由来するとは、ソース細胞から膜封入調製物を得ること、およびフソゲンを付加することを含む。
実質的に同一：ヌクレオチド配列の文脈において、「実質的に同一」という用語は、本明細書では、第１および第２のヌクレオチド配列が、共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするか、または共通の構造的ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードするように、第２の核酸配列中の整列されたヌクレオチドと同一である十分な数または最少数のヌクレオチドを含有する第１の核酸配列を指すように使用され、例えば、ヌクレオチド配列は、参照配列、例えば、本明細書に提供される配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。本明細書における組成物および方法は、指定された配列、またはそれと実質的に同一または類似の配列、例えば、指定された配列と少なくとも８５％、９０％、または９５％以上同一の配列を有するポリペプチドおよび核酸を包含する。アミノ酸配列の文脈において、「実質的に同一」という用語は、本明細書では、第１および第２のアミノ酸配列が、共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有することができるように、第２のアミノ酸配列の整列されたアミノ酸残基と、ｉ）同一であるか、またはｉｉ）その保存的置換である十分な数または最小数のアミノ酸残基を含む、第１のアミノ酸を指すように使用され、例えば、共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、参照配列、例えば、本明細書で提供される配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
標的細胞部分：本明細書で使用される場合、「標的細胞部分」という用語は、細胞に対してフソソームを特異的に（関連するシステム内の少なくとも１つの他の細胞に対して）標的とするために使用され得る細胞（例えば、標的細胞）の特徴を指すために使用される。幾つかの実施形態では、標的細胞部分は、標的細胞の表面特徴部である。幾つかの実施形態では、標的細胞部分は、標的細胞の細胞膜と会合したタンパク質であるか、またはその一部である。幾つかの実施形態では、標的細胞部分は、標的細胞の膜と会合したペプチドまたはタンパク質であるか、またはその一部である。幾つかの実施形態では、標的細胞部分は、標的細胞の膜と会合した脂質であるか、またはその一部である。幾つかの実施形態では、標的細胞部分は、標的細胞の膜と会合した糖であるか、またはその一部である。
標的化ドメイン：本明細書で使用される場合、「標的化ドメイン」という用語は、標的細胞部分と会合または相互作用するフソソームの特徴である。幾つかの実施形態では、標的化ドメインは、標的細胞部分と特異的に（曝露条件下で）会合または相互作用する。幾つかの実施形態では、標的化ドメインは、標的細胞上に存在する標的細胞部分に特異的に結合する。幾つかの実施形態では、標的化ドメインは、フソゲンのドメインであるか、またはそれを含み、例えば、フソゲンに共有結合している、例えば、フソゲンポリペプチドの一部である。幾つかの実施形態では、標的化ドメインは、任意のフソゲンとは別個の実体であり、例えば、フソゲンに共有結合しておらず、例えば、フソゲンポリペプチドの一部ではない。
安定：「安定」という用語は、本明細書の組成物に適用される場合、組成物が、指定された一連の条件下で一定期間にわたってそれらの物理的構造および／または活性の１つ以上の側面を維持することを意味する。幾つかの実施形態では、指定された条件は、冷蔵下にある（例えば、約４℃、－２０℃、または－８０℃以下）。
標的細胞：本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、フソソームが融合する細胞を指す。
バリアント：「バリアント」という用語は、参照アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを指す。幾つかの実施形態では、バリアントは、機能的バリアントである。
フソソーム
本明細書に記載のフソソーム組成物および方法は、（ａ）脂質二重層、（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）、（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲン（例えば、フソゲンが脂質二重層内に配置されている場合）、および（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤を含む。実施形態では、フソソームは、非植物細胞、例えば、哺乳動物細胞、またはその誘導体（例えば、ミトコンドリア、コンドリソーム、オルガネラ、小胞、もしくは除核細胞）に由来し、フソゲン、例えば、タンパク質、脂質、または化学融合物質を含む。
カプセル化
本明細書に記載の組成物および方法の幾つかの実施形態では、フソソーム、例えば、両親媒性脂質とフソゲンとの天然由来の二重層が含まれる。フソソームは、幾つかの異なるタイプの脂質、例えば、リン脂質などの両親媒性脂質を含み得る。フソソームは、最外面として脂質二重層を含み得る。そのような組成物は、驚くべきことに、本発明の方法で使用することができる。場合によっては、膜は、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｍｉｒｏ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ＆ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｓｃｕｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ．ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．３３（９）：９９４－１０１０に記載されているように、自家、同種、異種、または操作された細胞の形態をとり得る。幾つかの実施形態では、組成物は、例えば、Ｏｒｉｖｅ．ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｄｖａｎｃｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；３６（８）：５３７－４６；ａｎｄ ｉｎ Ｍｉｓｈｒａ．２０１６．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓに記載されているように、操作された膜を含む。幾つかの実施形態では、組成物は、天然に存在する膜を含む（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ａ Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｐａｔｈｗａｙ Ｓｈｕｔｔｌｅｓ Ｃａｒｇｏ ｆｒｏｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｏ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２：１３５－１４１）。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、天然由来の膜、例えば、細胞または組織から調製された膜小胞を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、ＭＳＣまたは星状細胞に由来する小胞である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、エクソソームである。
例示的なエクソソームおよび他の膜封入体は、例えば、ＵＳ２０１６／１３７７１６に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、細胞から得られる小胞、例えば、微小胞、エクソソーム、アポトーシス小体（アポトーシス細胞から）、微粒子（例えば、血小板に由来し得る）、エクトソーム（例えば、血清中の好中球および単球から誘導可能）、プロスタトソーム（前立腺癌細胞から取得可能）、カーディオソーム（心臓細胞から誘導可能）等を含む。
例示的なエクソソームおよび他の膜封入体はまた、ＷＯ／２０１７／１６１０１０、ＷＯ／２０１６／０７７６３９、ＵＳ２０１６／０１６８５７２、ＵＳ２０１５／０２９０３４３、およびＵＳ２００７／０２９８１１８に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞外小胞、ナノ小胞、またはエクソソームを含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞外小胞、例えば、内部空間を取り囲み、それが由来する細胞よりも小さい直径を有する膜を含む細胞由来の小胞を含む。実施形態では、細胞外小胞は、２０ｎｍ～１０００ｎｍの直径を有する。実施形態では、フソソームは、アポトーシス小体、細胞のフラグメント、直接的または間接的な操作によって細胞に由来する小胞、小胞化されたオルガネラ、および生細胞によって（例えば、直接的な原形質膜の出芽もしくは後期エンドソームと原形質膜との融合によって）産生される小胞）を含む。実施形態では、細胞外小胞は、生きているもしくは死んでいる生物、外植された組織もしくは臓器、または培養細胞に由来する。実施形態では、フソソームは、ナノ小胞、例えば、内部空間を取り囲み、直接または間接的操作によって前述の細胞から生成される膜を含む、細胞由来の小さな（例えば、直径２０～２５０ｎｍ、もしくは直径３０～１５０ｎｍの間）小胞を含む。ナノ小胞の産生は、場合によっては、ソース細胞の破壊をもたらし得る。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸およびポリペプチドを含み得る。実施形態では、フソソームは、エクソソームを含む。実施形態では、エクソソームは、内部空間を取り囲む膜を含み、直接原形質膜の出芽または後期エンドソームと原形質膜との融合によって前述の細胞から生成される膜を含む、細胞由来の小さな（例えば、直径２０～３００ｎｍ、もしくは直径４０～２００ｎｍの間）小胞である。実施形態では、エクソソームの産生は、ソース細胞の破壊をもたらさない。実施形態では、エクソソームは、脂質または脂肪酸およびポリペプチドを含む。
例示的なエクソソームおよび他の膜封入体はまた、ＵＳ２０１６／０３５４３１３に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施形態では、フソソームは、生体適合性送達モジュール、エキソソーム（例えば、直径約３０ｎｍ～約２００ｎｍ）、微小胞（例えば、直径約１００ｎｍ～約２０００ｎｍ）、アポトーシス体（例えば、直径約３００ｎｍ～約２０００ｎｍ）、膜粒子、膜小胞、エキソソーム様小胞、エクトソーム様小胞、エクトソーム、またはエキソベシクルを含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、微小胞である。幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞ゴーストである。幾つかの実施形態では、小胞は、原形質膜小胞、例えば、巨大な原形質膜小胞である。
フソソームは、幾つかの異なるタイプの脂質、例えば、リン脂質などの両親媒性脂質から作製され得る。フソソームは、最外面として脂質二重層を含み得る。この二重層は、同じまたは異なるタイプの１つ以上の脂質から構成され得る。例には、ホスホコリンおよびホスホイノシトールなどのリン脂質が含まれるが、これらに限定されない。具体的な例には、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、およびＤＳＰＣが含まれるが、これらに限定されない。
フソゲン
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム（例えば、小胞または細胞の一部を含む）は、フソソームと膜、例えば、細胞膜との融合を促進するために、１つ以上のフソゲンを含む。また、これらの組成物は、１つ以上のフソゲンを含むように合成中または合成後に行われる表面修飾を含み得る。表面修飾は、膜への修飾、例えば、脂質またはタンパク質の膜への挿入を含み得る。
幾つかの実施形態では、フソソームは、特定の細胞または組織タイプ（例えば、心筋細胞）を標的とするために、それらの外面上に（例えば、細胞膜に組み込まれた）１つ以上のフソゲンを含む。フソソームは、標的化ドメインを含み得る。フソゲンには、タンパク質ベース、脂質ベース、および化学ベースのフソゲンが含まれるが、これらに限定されない。フソゲンは、パートナー、例えば、標的細胞の表面上の特徴部に結合し得る。幾つかの実施形態では、標的細胞の表面上のパートナーは、標的細胞部分である。幾つかの実施形態では、フソゲンを含むフソソームは、膜を標的細胞の脂質二重層に組み込むであろう。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のフソゲンは、フソソームに含まれ得る。
タンパク質フソゲン
幾つかの実施形態では、フソゲンは、タンパク質フソゲン、例えば、哺乳動物タンパク質または哺乳動物タンパク質のホモログ（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の同一性を有する）、ウイルスタンパク質またはウイルスタンパク質のホモログ等の非哺乳動物タンパク質（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の同一性を有する）、天然タンパク質または天然タンパク質の誘導体、合成タンパク質、そのフラグメント、そのバリアント、フソゲンまたはフラグメントのうちの１つ以上を含むタンパク質融合、およびそれらの任意の組み合わせである。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、フソソーム中の脂質と標的細胞内の脂質との間の混合をもたらす。幾つかの実施形態では、フソゲンは、フソソームの内腔と標的細胞の細胞質ゾルとの間に１つ以上の孔の形成をもたらし、例えば、フソソームは、本明細書に記載されるコネキシンであるか、またはそれを含む。
（ｉ）哺乳動物タンパク質
幾つかの実施形態では、フソゲンは、哺乳動物タンパク質を含み得、表１を参照する。哺乳動物のフソゲンの例には、限定されないが、ｖＳＮＡＲＥおよびｔＳＮＡＲＥなどのＳＮＡＲＥファミリータンパク質、シンシチン－１（ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７６．１３．６４４２－６４５２．２００２）およびシンシチン－２などのシンシチンタンパク質、ミオメーカー（ｍｙｏｍａｋｅｒ）（ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｅａｒｌｙ／２０１７／０４／０２／１２３１５８、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１２３１５８、ｄｏｉ：１０．１０９６／ｆｊ．２０１６００９４５Ｒ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４３）、ミオミキサー（ｍｙｏｍｉｘｅｒ）（ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ４９９／ｎ７４５８／ｆｕｌｌ／ｎａｔｕｒｅ１２３４３．ｈｔｍｌ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４３）、ミオマージャー（ｍｙｏｍｅｒｇｅｒ）（ｓｃｉｅｎｃｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｅａｒｌｙ／２０１７／０４／０５／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ９３６１、ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ９３６１）、ＦＧＦＲＬ１（線維芽細胞成長因子受容体様１）、ミニオン（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１２２６９７）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のアイソフォーム（例えば、米国特許第６，０９９，８５７Ａ号に開示されている）、コネキシン４３、コネキシン４０、コネキシン４５、コネキシン３２、またはコネキシン３７などのギャップ結合タンパク質（例えば、米国特許第２００７／０２２４１７６号に開示されている、Ｈａｐ２、異種細胞間でシンシチン形成を誘導することができる任意のタンパク質（表２を参照）、フソゲン特性を有する任意のタンパク質（表３を参照）、それらのホモログ、それらのフラグメント、それらのバリアント、およびそれらの１つ以上のタンパク質またはフラグメントを含むタンパク質融合物が含まれ得る。幾つかの実施形態では、フソゲンは、ヒトゲノムに見出されるヒト内在性レトロウイルスエレメント（ｈＥＲＶ）によってコードされる。追加の例示的なフソゲンは、ＵＳ６，０９９，８５７Ａ号およびＵＳ２００７／０２２４１７６号に開示されており、その全容は、参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2022513040000001
Figure 2022513040000002
Figure 2022513040000003
Figure 2022513040000004
幾つかの実施形態では、フソソームは、湾曲生成タンパク質、例えば、エプシン１、ダイナミン、またはＢＡＲドメインを含むタンパク質を含む。例えば、Ｋｏｚｌｏｖら、ＣｕｒｒＯｐ ＳｔｒｕｃＢｉｏ ２０１５，Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇら．Ｎａｔ Ｒｅｖ ２００６、Ｒｉｃｈａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２０１１を参照。
（ｉｉ）非哺乳動物タンパク質
ウイルスタンパク質
幾つかの実施形態では、フソゲンは、非哺乳動物タンパク質、例えば、ウイルスタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、ウイルスフソゲンは、クラスＩウイルス膜融合タンパク質、クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質、ウイルス膜糖タンパク質、または他のウイルス融合タンパク質、あるいはそれらのホモログ、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらの１つ以上のタンパク質もしくはフラグメントを含むタンパク質融合物である。
幾つかの実施形態では、クラスＩウイルス膜融合タンパク質には、バキュロウイルスＦタンパク質、例えば、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）属のＦタンパク質、例えば、シロイチモジヨトウＭＮＰＶ（ＳｅＭＮＰＶ）Ｆタンパク質およびマイマイガＭＮＰＶ（ＬｄＭＮＰＶ）が含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態では、クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質には、ラブドウイルスＧ（例えば、小胞性胃炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）の融合性タンパク質Ｇ）、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂ（例えば、単純ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルス１（ＨＳＶ－１）ｇＢ））、エプスタインバーウイルス糖タンパク質Ｂ（ＥＢＶ ｇＢ）、トゴトウイルスＧ、バキュロウイルスｇｐ６４（例えば、オートグラファ・カリフォルニカマルチプルＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ）（ＡｃＭＮＰＶ）ｇｐ６４）、およびボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）糖タンパク質（ＢＤＶ Ｇ）が含まれるが、これらに限定されない。
他のウイルスフソゲン、例えば、膜糖タンパク質およびウイルス融合タンパク質の例には、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）もしくは変異体などのウイルス合胞体タンパク質、またはそれらの融合タンパク質；ヒト免疫不全ウイルス１型エンベロープタンパク質（ＨＩＶ－１ＥＮＶ）、リンパ球合胞体を形成するＨＩＶ結合ＬＦＡ－１由来のｇｐ１２０、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇｐ１６０、またはＨＩＶ転写トランスアクチベーター（ＴＡＴ）；ウイルス糖タンパク質ＶＳＶ－Ｇ、ラブドウイルス科の水疱性口内炎ウイルス由来のウイルス糖タンパク質；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の糖タンパク質ｇＢおよびｇＨ－ｇＬ；ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）－１０Ａ１；テナガザル白血病ウイルス糖タンパク質（ＧａＬＶ）；狂犬病、モコラ、水疱性口内炎ウイルスおよびトガウイルスのＧ型糖タンパク質；ネズミ肝炎ウイルスＪＨＭ表面突起タンパク質；ブタ呼吸器コロナウイルススパイクおよび膜糖タンパク質；鳥類伝染性気管支炎スパイク糖タンパク質とその前駆体；ウシ腸コロナウイルススパイクタンパク質；麻疹ウイルスのＦおよびＨ、ＨＮまたはＧ遺伝子；イヌジステンパーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス３、シミアンウイルス４１、センダイウイルスおよびヒト呼吸器合胞体ウイルス、シャペロンタンパク質ｇＬを有するヒトヘルペスウイルス１型および水痘帯状疱疹ウイルスのｇＨ；ヒト、ウシ、およびオナガザルヘルペスウイルスｇＢ；フレンドネズミ白血病ウイルスおよびメイソンファイザーモンキーウイルスのエンベロープ糖タンパク質；おたふく風邪ウイルス血球凝集素ノイラミニダーゼ、およびグリオプロテインＦ１およびＦ２；ベネズエラウマ脳脊髄炎の膜糖タンパク質；パラミクソウイルスＦタンパク質；ＳＩＶｇｐ１６０タンパク質；エボラウイルスＧタンパク質；またはセンダイウイルス融合タンパク質、あるいはそれらのホモログ、それらのフラグメント、それらのバリアント、ならびにそれらの１つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含むタンパク質融合が含まれるが、これらに限定されない。
非哺乳動物フソゲンには、ウイルスフソゲン、そのホモログ、そのフラグメント、および１つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含む融合タンパク質が含まれる。ウイルス性フソゲンには、クラスＩフソゲン、クラスＩＩフソゲン、クラスＩＩＩフソゲン、およびクラスＩＶフソゲンが含まれる。実施形態では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ４１等のクラスＩフソゲンは、中央のコイルドコイル構造を有するαヘリックスヘアピンの特徴的な三量体との特徴的な融合後コンフォメーションを有する。クラスＩウイルス融合タンパク質には、中央の融合後６ヘリックスバンドルを有するタンパク質が含まれる。クラスＩウイルス融合タンパク質には、インフルエンザＨＡ、パラインフルエンザＦ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｅｂｏｌａ ＧＰ、オルトミクソウイルス由来の血球凝集素、パラミクソウイルス由来のＦタンパク質（例えば、麻疹、（Ｋａｔｏｈら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１０，１０：３７））、レトロウイルスに由来するＥＮＶタンパク質、およびフィロウイルスとコロナウイルスのフソゲンが含まれる。実施形態では、デング熱Ｅ糖タンパク質などのクラスＩＩウイルスフソゲンは、ヘアピンの三量体をもたらすようにリフォールディングする細長い外部ドメインを形成するβシートの構造的シグナチャーを有する。実施形態では、クラスＩＩウイルスフソゲンは、中央のコイルドコイルを欠いている。クラスＩＩウイルスフソゲンは、αウイルス（例えば、Ｅ１タンパク質）およびフラビウイルス（例えば、Ｅ糖タンパク質）に見られる。クラスＩＩウイルス性フソゲンには、セムリキ森林ウイルス、シンビス、風疹ウイルス、およびデング熱ウイルスに由来するフソゲンが含まれる。実施形態において、水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質などのクラスＩＩＩウイルスフソゲンは、クラスＩおよびＩＩに認められる構造的シグナチャーを組み合わせる。実施形態において、クラスＩＩＩウイルスフソゲンは、αヘリックス（例えば、クラスＩウイルスフソゲンと同様にタンパク質を折り返すために６ヘリックスバンドルを形成する）、およびその末端に両親媒性融合ペプチドを有するβシートを含み、クラスＩＩウイルスを暗示させる。クラスＩＩＩウイルスフソゲンは、ラブドウイルスおよびヘルペスウイルスに認められ得る。実施形態では、クラスＩＶウイルスフソゲンは、無エンベロープレオウイルスによってコードされる、融合関連小膜貫通（ＦＡＳＴ）タンパク質である（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｅｍｂｏｊ．７６００７６７，Ｎｅｓｂｉｔｔ，Ｒａｅ Ｌ．，「Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＦＡＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（２０１２）．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ．Ｐａｐｅｒ ３８８）。実施形態では、クラスＩＶウイルスフソゲンは、ヘアピンを形成しないほど小さい（ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｃｅｌｌｂｉｏ－１０１５１２－１２２４２２、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｅｖｃｅｌ．２００７．１２．００８）。
追加の例示的なフソゲンは、ＵＳ９，６９５，４４６、ＵＳ２００４／００２８６８７、ＵＳ６，４１６，９９７、ＵＳ７，３２９，８０７、ＵＳ２０１７／０１１２７７３、ＵＳ２００９／０２０２６２２、ＷＯ２００６／０２７２０２、および米ＵＳ２００４／０００９６０４に開示されており、これら全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、表４のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは、配列の一部、例えば、長さが１００、２００、３００、４００、５００、もしくは６００個のアミノ酸の部分と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、表４の任意のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の核酸配列は、表４のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列の一部、例えば、長さが４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸の部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、配列番号６２７～６８３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列の一部、例えば、長さが１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸の部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、配列番号６２７～６８３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の核酸配列は、配列番号６２７～６８３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列の一部、例えば、長さが４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくは６００個のアミノ酸の部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
表４．パラミクソウイルスＦ配列クラスター。列１、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤには、クラスターの重心配列であるウイルスの全ゲノム配列のＧｅｎｂａｎｋ ＩＤが含まれる。列２、ＣＤＳのヌクレオチドは、全ゲノムの遺伝子のＣＤＳに対応するヌクレオチドを提供する。列３、完全な遺伝子名は、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ、ウイルス種、株、およびタンパク質名を含む遺伝子の完全な名前を提供する。列４、配列は、遺伝子のアミノ酸配列を提供する。列５、配列数／クラスターは、この重心配列でクラスター化する配列の数を提供する。
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幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、表５のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは、配列の一部、例えば、長さが１００、２００、３００、４００、５００、もしくは６００個のアミノ酸の部分と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、表５の任意のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の核酸配列は、表５のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列の一部、例えば、長さが４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくは６００個のアミノ酸の部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、配列番号６８４～７５９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列の一部、例えば、長さが１００、２００、３００、４００、５００、または６００個のアミノ酸の部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、配列番号６８４～７５９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の核酸配列は、配列番号６８４～７５９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列の一部、例えば、長さが４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくは６００個のアミノ酸の部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
表５．パラミクソウイルスプロテインＧ、Ｈ、およびＨＮ配列クラスター。列１、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤには、クラスターの重心配列であるウイルスの全ゲノム配列のＧｅｎｂａｎｋ ＩＤが含まれる。列２、ＣＤＳのヌクレオチドは、全ゲノムの遺伝子のＣＤＳに対応するヌクレオチドを提供する。列３、完全な遺伝子名は、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ、ウイルス種、株、およびタンパク質名を含む遺伝子の完全な名前を提供する。列４、配列は、遺伝子のアミノ酸配列を提供する。列５、配列数／クラスターは、この重心配列でクラスター化する配列の数を提供する。
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（ｉｉｉ）他のタンパク質
幾つかの実施形態では、フソゲンは、ｐＨ依存性（例えば、虚血性傷害の場合と同様）タンパク質、そのホモログ、そのフラグメント、および１つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含むタンパク質融合物を含み得る。フソゲンは、細胞表面、またはエンドソーム内、または別の細胞膜結合空間内で膜融合を媒介する可能性がある。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、ＥＦＦ－１、ＡＦＦ－１、ギャップ結合タンパク質、例えば、コネキシン（Ｃｎ４３、ＧＡＰ４３、ＣＸ４３など）（ＤＯＩ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．６ｂ０５１９１）、他の腫瘍結合タンパク質、それらのホモログ、それらのフラグメント、それらのバリアント、およびそれらの１つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含むタンパク質融合物を含む。
タンパク質フソゲンに対する修飾
幾つかの実施形態では、タンパク質フソゲンは、免疫応答性を低減するように改変することができる。例えば、タンパク質フソゲンは、ＰＥＧなどの免疫相互作用を低減する分子で装飾され得る（ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７８．２．９１２－９２１．２００４）。したがって、幾つかの実施形態では、フソゲンは、ＰＥＧを含み、例えば、ＰＥＧ化ポリペプチドである。免疫系の標的となるフソゲンのアミノ酸残基は、免疫系によって認識されないように改変することができる（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２０１４．０１．０２７、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４６６６７）。幾つかの実施形態では、フソゲンのタンパク質配列は、ヒト（ヒト化）に見られるアミノ酸配列に類似するように改変される。幾つかの実施形態では、フソゲンのタンパク質配列は、ＭＨＣ複合体とわずかな強さで結合するタンパク質配列に変更される。幾つかの実施形態では、タンパク質フソゲンは、ヒトに感染しない（そしてヒトがワクチン接種されていない）ウイルスまたは生物に由来し、患者の免疫系がタンパク質フソゲンに対してナイーブである可能性を高める（例えば、フソゲンに対する無視できるほどの体液性または細胞媒介性の適応免疫応答がある）（ｄｏｉ：１０．１００６／ｍｔｈｅ．２００２．０５５０、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００５６４１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１１．２０９、ＤＯＩ１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１４－０２－５５８１６３）。理論に拘束されることを望まないが、幾つかの実施形態では、ヒトに感染しないウイルスまたは生物に由来するタンパク質フソゲンは、患者において天然の融合標的を持たず、したがって高い特異性を有する。
脂質フソゲン
幾つかの実施形態では、フソソームは、飽和脂肪酸などの融合性化学物質で処理され得る。幾つかの実施形態では、飽和脂肪酸は、１０～１４個の炭素を有する。幾つかの実施形態では、飽和脂肪酸は、より長鎖のカルボン酸を有する。幾つかの実施形態では、飽和脂肪酸はモノエステルである。
幾つかの実施形態では、フソソームは、不飽和脂肪酸で処理され得る。幾つかの実施形態では、不飽和脂肪酸は、Ｃ１６～Ｃ１８の不飽和脂肪酸を有する。幾つかの実施形態では、不飽和脂肪酸には、オレイン酸、モノオレイン酸グリセロール、グリセリド、ジアシルグリセロール、修飾不飽和脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
理論に拘束されることを望まないが、幾つかの実施形態では、負の湾曲脂質は膜融合を促進する。幾つかの実施形態では、フソソームは、膜内に１つ以上の負の湾曲脂質、例えば、膜内のソース細胞に対して外因性である負の湾曲脂質を含む。実施形態では、負の湾曲脂質またはその前駆体は、ソース細胞またはフソソームを含む培地に添加される。実施形態では、ソース細胞は、１つ以上の脂質合成遺伝子を発現または過剰発現するように操作される。負の湾曲脂質は、例えば、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、コレステロール、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、または脂肪酸（ＦＡ）であり得る。
理論に拘束されることを望まないが、幾つかの実施形態では、正の湾曲脂質は膜融合を阻害する。幾つかの実施形態では、フソソームは、膜において、１つ以上の正の湾曲脂質、例えば、外因性の正の湾曲脂質のレベルの低下を含む。実施形態では、レベルは、例えば、ソース細胞における脂質合成遺伝子のノックアウトまたはノックダウンによって、脂質の合成を阻害することによって低減される。正の湾曲脂質は、例えば、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、またはモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）であり得る。
化学物質フソゲン
幾つかの実施形態では、フソソームは、融合性化学物質で処理され得る。幾つかの実施形態では、融合性化学物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体である。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは、２つの膜の間に局所的な脱水を誘導し、それは、二重層の好ましくない分子パッキングにつながる。幾つかの実施形態では、化学フソゲンは、脂質二重層付近の領域の脱水を誘導し、細胞間の水性分子の排除を引き起こし、２つの膜間の相互作用を可能にする。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは陽イオンである。陽イオンの幾つかの非限定的な例としては、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｌａ３＋、Ｓｒ３＋、およびＨ＋が挙げられる。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは、表面極性を修飾することによって標的膜に結合し、これは、水和依存性の膜間反発を改変する。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは、可溶性で脂溶性である。幾つかの非限定的な例には、オレオイルグリセロール、ジオレオイルグリセロール、トリオレオイルグリセロール、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体が含まれる。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは水溶性化学物質である。幾つかの非限定的な例には、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体が含まれる。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは小さな有機分子である。非限定的な例には、ｎ－ヘキシルブロミドが含まれる。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは、フソゲンまたは標的膜の構成、細胞生存率、またはイオン輸送特性を改変しない。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは、ホルモンまたはビタミンである。幾つかの非限定的な例には、アブシジン酸、レチノール（ビタミンＡ１）、トコフェロール（ビタミンＥ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体が含まれる。
幾つかの実施形態では、フソソームは、アクチンおよび重合されたアクチンを安定化する作用物質を含む。理論に拘束されることを望まないが、フソソーム中の安定化されたアクチンは、標的細胞との融合を促進することができる。実施形態では、重合化アクチンを安定化させる作用物質は、アクチン、ミオシン、ビオチン－ストレプトアビジン、ＡＴＰ、神経性ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（Ｎ－ＷＡＳＰ）、またはフォルミンから選択される。例えば、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１１ Ａｕｇ １６；２７（１６）：１００６１－７１およびＷｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６ Ａｕｇ ３１；７を参照されたい。実施形態では、フソソームは、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するアクチン、例えば、野生型アクチンまたは重合を促進する突然変異を含むアクチンを含む。実施形態では、フソソームは、ＡＴＰまたはホスホクレアチン、例えば、外因性ＡＴＰまたはホスホクレアチンを含む。
小分子フソゲン
幾つかの実施形態では、フソソームは、融合性小分子で処理され得る。幾つかの非限定的な例としては、ハロタン、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、およびクロルプロマジンなどの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。
幾つかの実施形態では、小分子フソゲンは、ミセル様凝集体中に存在するか、または凝集体を含まない場合がある。
フソゲン修飾
幾つかの実施形態では、フソゲンは、切断可能なタンパク質に連結されている。場合によっては、切断可能なタンパク質は、プロテアーゼへの曝露によって切断され得る。操作された融合タンパク質は、膜貫通タンパク質の任意のドメインに結合し得る。操作された融合タンパク質は、切断ペプチドによって、膜間腔内に位置するタンパク質ドメインに連結され得る。切断ペプチドは、膜間プロテアーゼのうちの１つまたは組み合わせによって切断され得る（例えば、位置Ｐ１で非極性脂肪族アミノ酸を必要とするＨＴＲＡ２／ＯＭＩ（バリン、イソロイシン、またはメチオニンが好ましい）、ならびにＰ２およびＰ３位置での親水性残基（アルギニンが好ましい））。
幾つかの実施形態では、フソゲンタンパク質は、当該技術分野で知られている任意の方法または本明細書に記載の任意の方法によって操作されて、タンパク質分解配列、例えば、ミトコンドリアまたは細胞質ゾル分解配列を含む。融合タンパク質は、限定されないが、タンパク質分解配列、例えば、カスパーゼ２タンパク質配列（例えば、Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｓｐ－｜－）（配列番号６０４）または他のタンパク質分解配列（例えば、Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ；２００５：５７１－６０７を参照）、野生型タンパク質分解配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の同一性を有する修飾されたタンパク質分解配列、細胞質タンパク質分解配列（例えば、ユビキチン）、または野生型タンパク質分解物に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の同一性を有する修飾された細胞質ゾルタンパク質分解配列を含むように操作することができる。幾つかの実施形態では、組成物は、タンパク質分解配列（例えば、野生型タンパク質分解配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の同一性）、細胞質ゾルタンパク質分解配列（例えば、ユビキチン）、または野生型タンパク質分解配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の同一性を有する修飾された細胞質ゾルタンパク質分解配列で修飾されたタンパク質を含むソース細胞またはコンドリソーム中にミトコンドリアを含む。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、特定のタンパク質、例えば、プロテアーゼの過剰発現、例えば、プロテアーゼ活性を有する操作された融合タンパク質を認識するプロテアーゼドメインで修飾され得る。例えば、プロテアーゼまたはプロテアーゼからのプロテアーゼドメイン、例えば、ＭＭＰ、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、ミトコンドリア中間ペプチダーゼ、内膜ペプチダーゼ。
Ａｌｆｏｎｚｏ，Ｊ．Ｄ．＆Ｓｏｌｌ，Ｄ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔＲＮＡ ｉｍｐｏｒｔ－ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｈａｓ ｊｕｓｔ ｂｅｇｕｎ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９０：７１７－７２２．２００９、Ｌａｎｇｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ．Ｖｏｌ．２８０，Ｎｏ．４．２６９１－２６９９，２００５、Ｖｌｉｅｇｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｍａｒｋｅｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ．１５（１／２）．２０１０、Ｑｕｉｒｏｓ Ｐ．Ｍ．ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ，ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖ１６，２０１５、Ｗｅｂｅｒ－Ｌｏｔｆｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ ｉｍｐｏｒｔ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌ．３０．Ｎ１．７１－７３，２０１４を参照されたい。
標的細胞への非エンドサイトーシス侵入
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームまたはフソソーム組成物は、非エンドサイトーシス経路を介してカーゴを標的細胞に送達する。理論に拘束されることを望まないが、非エンドサイトーシス送達経路は、細胞、例えば、細胞の所望のコンパートメントに送達されるカーゴの量またはパーセンテージを改善することができる。
したがって、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される複数のフソソームが、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下で標的細胞集団と接触した場合、およびエンドサイトーシスの阻害剤で処理されていない参照標的細胞集団と接触した場合、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団中の細胞数の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％にカーゴを送達する。
幾つかの実施形態では、カーゴの１０％未満がエンドサイトーシスによって細胞に入る。
幾つかの実施形態では、エンドサイトーシスの阻害剤は、リソソーム酸性化阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１である。
幾つかの実施形態では、送達されるカーゴは、エンドサイトーシス阻害アッセイ、例えば、実施例１２５のアッセイを使用して決定される。
幾つかの実施形態では、カーゴは、ダイナミン非依存性経路またはリソソーム酸性化非依存性経路、マクロ飲作用非依存性経路、またはアクチン非依存性経路を介して細胞に入る。
幾つかの実施形態（例えば、カーゴの非エンドサイトーシス送達をアッセイするための実施形態）では、カーゴ送達は、以下の工程：（ａ）３０，０００個のＨＥＫ－２９３Ｔ標的細胞を、１００ｎＭバフィロマイシンＡ１を含む９６ウェルプレートの第１のウェルに入れ、同数の同様の細胞を、バフィロマイシンＡ１を欠く９６ウェルプレートの第２のウェルに入れる工程、（ｂ）標的細胞を、ＤＭＥＭ培地中３７℃および５％ＣＯ２で４時間培養する工程、（ｃ）標的細胞を、カーゴを含む１０ｕｇのフソソームと接触させる工程、（ｄ）標的細胞およびフソソームを、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする工程、ならびに（ｅ）カーゴを含む第１のウェルおよび第２のウェルの細胞のパーセンテージを決定する工程のうちの１つ以上（例えば、全て）を使用してアッセイされる。工程（ｅ）は、顕微鏡法を使用して、例えば免疫蛍光法を使用してカーゴを検出することを含み得る。工程（ｅ）は、カーゴを間接的に検出すること、例えば、カーゴの下流効果、例えば、レポータータンパク質の存在を検出することを含み得る。幾つかの実施形態では、上記の工程（ａ）～（ｅ）のうちの１つ以上は、実施例１２５に記載されるように実施される。
幾つかの実施形態では、エンドサイトーシスの阻害剤（例えば、クロロキンまたはバフィロマイシンＡ１）は、エンドソームの酸性化を阻害する。幾つかの実施形態では、カーゴ輸送は、リソソーム酸性化とは無関係である。幾つかの実施形態では、エンドサイトーシスの阻害剤（例えば、ダイナソアル）は、ダイナミンを阻害する。幾つかの実施形態では、カーゴ輸送は、ダイナミン活性とは無関係である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、エンドサイトーシスによって標的細胞に入り、例えば、エンドサイトーシス経路を介して送達される治療薬のレベルは、例えば、実施例９１のアッセイを使用して、０．０１～０．６、０．０１～０．１、０．１～０．３、もしくは０．３～０．６であるか、または同様のフソソームと接触したクロロキン処理された参照細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上大きい。幾つかの実施形態では、標的細胞に入るフソソーム組成物中のフソソームの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のフソソームが、非エンドサイトーシス経路を介して入り、例えば、フソソームは、細胞表面との融合を介して標的細胞に入る。幾つかの実施形態では、所与のフソソームの非エンドサイトーシス経路を介して送達される治療薬のレベルが、例えば、実施例９０のアッセイを使用して、０．１～０．９５、０．１～０．２、０．２～０．３、０．３～０．４、０．４～０．５、０．５～０．６、０．６～０．７、０．７～０．８、０．８～０．９、０．９～０．９５であるか、またはクロロキン処理された参照細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上大きい。幾つかの実施形態では、標的細胞に入るフソソーム組成物中のフソソームの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のフソソームが、細胞質に入る（例えば、エンドソームまたはリソソームに入らない）。幾つかの実施形態では、標的細胞に入るフソソーム組成物中のフソソームの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％未満、または１％が、エンドソームまたはリソソームに入る。幾つかの実施形態では、フソソームは、非エンドサイトーシス経路によって標的細胞に入り、例えば、送達される治療薬のレベルは、例えば、実施例９１のアッセイを使用して、クロロキンで処理された参照細胞のレベルの少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％である。一実施形態では、フソソームは、ダイナミン媒介経路を介して作用物質を標的細胞に送達する。一実施形態では、ダイナミン媒介経路を介して送達される作用物質のレベルは、例えば、実施例９２のアッセイにおいて測定した場合、０．０１～０．６の範囲であるか、または同様のフソソームと接触させたＤｙｎａｓｏｒｅ処理された標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上大きい。一実施形態では、フソソームは、マクロピノサイトーシスを介して作用物質を標的細胞に送達する。一実施形態では、マクロピノサイトーシスを介して送達される作用物質のレベルは、例えば、実施例９２のアッセイにおいて測定した場合、０．０１～０．６の範囲であるか、または同様のフソソームと接触させたＥＩＰＡ処理された標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上大きい。一実施形態では、フソソームは、アクチン媒介経路を介して作用物質を標的細胞に送達する。一実施形態では、アクチン媒介経路を介して送達される作用物質のレベルは、０．０１～０．６の範囲となるか、または例えば、実施例９２のアッセイにおいて測定した場合、同様のフソソームと接触させたラトランクリンＢ処理された標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上大きくなるであろう。
幾つかの実施形態では、送達されるカーゴは、エンドサイトーシス阻害アッセイ、例えば、実施例９０、９２、または１２５のアッセイを使用して決定される。
幾つかの実施形態では、カーゴは、ダイナミン非依存性経路またはリソソーム酸性化非依存性経路、マクロピノサイトーシス非依存性経路（例えば、エンドサイトーシスの阻害剤が、例えば、２５μＭの濃度のマクロピノサイトーシス阻害剤、例えば、５－（Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル）アミロリド（ＥＩＰＡ）である）、またはアクチン非依存性経路（例えば、エンドサイトーシスの阻害剤が、例えば、６μＭの濃度のアクチン重合の阻害剤、例えば、ラトランクリンＢである）を介して標的細胞に入る。
幾つかの実施形態では、フソソームは、標的細胞集団と接触すると、エンドソームまたはリソソーム以外の標的細胞位置、例えば、細胞質ゾル、オルガネラ、または細胞膜にカーゴを送達する。実施形態では、カーゴの５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満がエンドソームまたはリソソームに送達される。
標的細胞への特異的送達
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物は、非標的細胞と比較して、標的細胞に優先的にカーゴを送達する。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、以下の特性の一方または両方を有する：（ｉ）複数のフソソームが、標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触する場合、カーゴは、非標的細胞よりも標的細胞に少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、もしくは１００倍多く存在する、または（ｉｉ）複数のフソソームが、非標的細胞とよりも標的細胞と、少なくとも少なくとも５０％高い割合で融合する。
幾つかの実施形態では、カーゴの存在は、例えば、実施例１２６のアッセイを使用して、顕微鏡検査によって測定される。幾つかの実施形態では、融合は、例えば、実施例５４のアッセイを使用して、顕微鏡検査によって測定される。幾つかの実施形態では、標的化部分は、標的細胞上の細胞表面マーカーに特異的である。幾つかの実施形態では、細胞表面マーカーは、皮膚細胞、心筋細胞、肝細胞、腸細胞（例えば、小腸の細胞）、膵臓細胞、脳細胞、前立腺細胞、肺細胞、結腸細胞、または骨髄細胞の細胞表面マーカーである。
幾つかの実施形態（例えば、標的細胞と非標的細胞へのカーゴの特異的送達の実施形態）では、カーゴ送達は、以下の工程：（ａ）ＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂを過剰発現する３０，０００個のＨＥＫ－２９３Ｔ標的細胞を、９６ウェルプレートの第１のウェルに入れ、ＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂを過剰発現しない３０，０００個のＨＥＫ－２９３Ｔ非標的細胞、９６ウェルプレートの第２のウェルに入れる工程、（ｂ）標的細胞をＤＭＥＭ培地で３７℃および５％ＣＯ２で４時間培養する工程、（ｃ）標的細胞を、カーゴを含む１０ｕｇのフソソームと接触させる工程、（ｄ）標的細胞およびフソソームを、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする工程、ならびに（ｅ）カーゴを含む第１のウェルおよび第２のウェルの細胞のパーセンテージを決定する工程のうちの１つ以上（例えば、全て）を使用してアッセイされる。工程（ｅ）は、顕微鏡法を使用して、例えば免疫蛍光法を使用してカーゴを検出することを含み得る。工程（ｅ）は、カーゴを間接的に検出すること、例えば、カーゴの下流効果、例えば、レポータータンパク質の存在を検出することを含み得る。幾つかの実施形態では、上記の工程（ａ）～（ｅ）のうちの１つ以上は、実施例１２６に記載されるように実施される。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で融合する、幾つかの実施形態では、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い割合で融合する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、２４、４８、または７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する。実施形態では、標的化融合の量は、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、約３０％～７０％、３５％～６５％、４０％～６０％、４５％～５５％、または４５％～５０％、例えば、約４８．８％である。実施形態では、標的化融合の量は、例えば、実施例５５のアッセイにおいて、約２０％～４０％、２５％～３５％、または３０％～３５％、例えば、約３２．２％である。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照標的細胞集団または非標的細胞集団と比較して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のカーゴを標的細胞集団に送達する。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照標的細胞集団または非標的細胞集団と比較して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％多くのカーゴを標的細胞集団に送達する。
フソソーム生成
細胞から生成されたフソソーム
フソソームの組成物は、培養中の細胞、例えば、培養された哺乳動物細胞、例えば、培養されたヒト細胞から生成され得る。細胞は、始原細胞または非始原（例えば、分化した）細胞であり得る。細胞は、初代細胞または細胞株（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、本明細書に記載の細胞株）であり得る。実施形態では、培養細胞は、始原細胞、例えば、骨髄間質細胞、骨髄由来成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、芽細胞、脳室下帯に形成された中間前駆細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞、衛星細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、骨髄間質細胞、表皮幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、前駆細胞、筋肉前駆細胞、筋芽細胞、心筋芽球、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経前駆細胞、肝芽球である。
幾つかの実施形態では、ソース細胞は、内皮細胞、線維芽球、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯からの幹細胞、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆細胞（例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球）、前駆細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ９０、ＩＭＲ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、もしくはＢＪ細胞）である。
培養細胞は、上皮、結合、筋肉、または神経の組織または細胞、およびそれらの組み合わせに由来する細胞であり得る。フソソームは、任意の真核生物の（例えば哺乳動物）器官系に由来する培養細胞から、例えば、心臓血管系（心臓、血管系）；消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸および肛門）；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体または松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎）；排泄システム（腎臓、尿管、膀胱）；リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃腺、咽頭扁桃、胸腺、脾臓）；外皮系（皮膚、髪、爪）；筋肉系（例えば、骨格筋）；神経系（脳、脊髄、神経）；生殖器系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）；呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）；骨格系（骨、軟骨）、ならびにそれらの組み合わせから生成され得る。実施形態では、細胞は、高度に有糸分裂する組織（例えば、上皮、胚組織、骨髄、腸陰窩等の高度に有糸分裂する健康な組織）に由来する。実施形態では、組織試料は、代謝性の高い組織（例えば、骨格組織、神経組織、心筋細胞）である。
幾つかの実施形態では、細胞は、浮遊細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、付着細胞である。
幾つかの実施形態では、細胞は、若いドナー、例えば、２５歳、２０歳、１８歳、１６歳、１２歳、１０歳、８歳、５歳、１歳以下のドナーに由来する。幾つかの実施形態では、細胞は胎児組織に由来する。
幾つかの実施形態では、細胞は、被験体に由来し、同じ被験体または類似の遺伝的特徴（例えば、ＭＨＣ適合）を有する被験体に投与される。
ある特定の実施形態では、細胞は、長さが３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００ヌクレオチドを超える（例えば、長さが４，０００～１０，０００ヌクレオチド、長さが６，０００～１０，０００ヌクレオチド）平均サイズのテロメアを有する。
フソソームは、当該技術分野で知られている方法に従って一般に培養される細胞から生成することができる。幾つかの実施形態では、細胞は、２つ以上の「段階」、例えば、細胞が培養物のバイオマスを増殖および増加させる条件下で培養される成長段階、ならびに細胞が細胞表現型を改変する条件下で培養される（例えば、ミトコンドリアの表現型を最大化する、ミトコンドリアの数または直径を増加させる、酸化的リン酸化状態を増加させる）「産生」段階で培養され得る。細胞膜上で、ソース細胞に対して外因性のタンパク質フソゲンまたは作用物質の発現を最大化し、他の段階での望ましくない融合を制限する条件下で細胞を培養する、「発現」段階もあり得る。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、成長段階または産生段階の間に同期化された細胞から生成される。例えば、細胞は、培養培地からの血清の除去（例えば、約１２～２４時間）によって、またはチミジン、アミノプテリン、ヒドロキシ尿素、およびシトシンアラビノシドなどのＤＮＡ合成阻害剤の培養培地での使用によって、Ｇ１段階で同期化され得る。哺乳動物の細胞周期同期化のための追加の方法が知られており、例えば、Ｒｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８：６０２－６２６（具体的にはＲｏｓｎｅｒの表１）に開示されている。
幾つかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載されるようなフソソーム組成物の供給源として使用するための望ましい表現型または遺伝子型について評価され、必要に応じて豊富化され得る。例えば、細胞は、例えば、培養前、培養中（例えば、成長段階もしくは産生段階中）、または培養後、しかしフソソーム産生の前に、例えば、膜電位（例えば、－５～－２００ｍＶの膜電位；カルジオリピン含有量（例えば、総脂質の１～２０％）；コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジグリセリド（ＤＡＧ）、ホスファチジル酸（ＰＡ）、または脂肪酸（ＦＡ）含有量；遺伝的品質＞８０％、＞８５％、＞９０％；フソゲンの発現または含有量；カーゴの発現または含有量のうちの１つ以上について評価され、任意に豊富化され得る。
幾つかの実施形態では、フソソームは、本明細書に記載のフソソーム組成物の供給源として使用するための望ましい表現型または遺伝子型に基づいて、同定、選択、または選出された細胞クローンから生成される。例えば、細胞クローンは、低いミトコンドリア突然変異ロード、長いテロメア長、分化状態、または特定の遺伝的特徴（例えば、レシピエントに一致する遺伝的特徴）に基づいて同定、選択、または選出される。
本明細書に記載のフソソーム組成物は、１つの細胞もしくは組織源からの、または供給源の組み合わせからのフソソームで構成され得る。例えば、フソソーム組成物は、異種供給源（例えば、動物、前述の種の細胞の組織培養物）、同種、自家、異なるタンパク質濃度および分布をもたらす特定の組織（肝臓、骨格、中性、脂肪等）、異なる代謝状態の細胞（例えば、糖分解、呼吸）からのフソソームを含み得る。組成物はまた、本明細書の他の場所に記載されているように、例えば、結合または非結合など、異なる代謝状態のフソソームを含み得る。
幾つかの実施形態では、フソソームは、フソゲン、例えば、本明細書に記載のフソゲンを発現するソース細胞から生成される。幾つかの実施形態では、フソゲンは、ソース細胞の膜、例えば、脂質二重層膜、例えば、細胞表面膜、または細胞内膜（例えば、リソソーム膜）に配置される。幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞表面膜に配置されたフソゲンを有するソース細胞から生成される。
幾つかの実施形態では、フソソームは、エキソソーム、マイクロベシクル、膜ベシクル、細胞外膜ベシクル、原形質膜ベシクル、巨大原形質膜ベシクル、アポトーシス小体、マイト粒子、ピレノサイト、リソソーム、または他の膜封入ベシクルの出芽を誘導することによって生成される。
幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞除核を誘導することによって生成される。除核は、遺伝的、化学的（例えば、アクチノマイシンＤを使用、Ｂａｙｏｎａ－Ｂａｆａｌｕｙｅｔ ａｌ．，″Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｔｏ ρ°ｃｅｌｌｓ″Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ａｕｇ １５；３１（１６）：ｅ９８を参照）、機械的方法（例えば、圧搾もしくは吸引、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，″Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｗｏ ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｐｉｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｓｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ．″Ａｎｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；１９（２）：７１－９））、またはそれらの組み合わせなどのアッセイを使用して実施され得る。除核とは、核を完全に除去するだけでなく、細胞が核を含むが非機能的であるように、その典型的な位置から核を移動させることも意味する。
実施形態では、フソソームを作製することは、細胞ゴースト、巨大な原形質膜小胞、またはアポトーシス小体を産生することを含む。実施形態では、フソソーム組成物は、細胞ゴースト、巨大な原形質膜小胞、およびアポトーシス小体のうちの１つ以上を含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞断片化を誘導することによって生成される。幾つかの実施形態では、細胞断片化は、化学的方法、機械的方法（例えば、遠心分離（例えば、超遠心分離、もしくは密度遠心分離）、凍結融解、または超音波処理）、あるいはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない以下の方法を使用して実施することができる。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、本明細書に記載されるように、以下の方法のうちのいずれか１つ、全て、または組み合わせによって、フソゲンを発現するソース細胞から生成され得る：
ｉ）マイト粒子、エクソソーム、または他の膜封入された小胞の出芽を誘導する、
ｉｉ）以下の方法のうちのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、核の不活化、例えば、除核を誘導する：
ａ）遺伝的方法、
ｂ）例えば、アクチノマイシンＤを使用する化学的方法、または
ｃ）機械的方法、例えば、圧搾もしくは吸引、または
ｉｉｉ）例えば、以下の方法のうちのいずれかまたはそれらの組み合わせによって、細胞断片化を誘導する：
ａ）化学的方法、
ｂ）機械的方法、例えば、遠心分離（例えば、超遠心分離もしくは密度遠心分離）、凍結融解、または超音波処理。
誤解を避けるために、多くの場合、フソソームを作製するために実際に使用されたソース細胞は、フソソームが作製された後、試験に利用できないことが理解される。したがって、ソース細胞とフソソームとの間の比較は、フソソームを作製するために実際に修飾された（例えば、除核された）ソース細胞をアッセイする必要はない。むしろ、例えば、同じ培養物、同じ遺伝子型、同じ組織型、またはそれらの任意の組み合わせからの、他の点ではソース細胞に類似している細胞を、代わりにアッセイすることができる。
フソソーム生成前の細胞への修飾
幾つかの態様では、修飾は、フソソーム生成の前に、被験体、組織、または細胞の修飾などの細胞に対して行われる。そのような修飾は、例えば、融合、フソゲンの発現もしくは活性、カーゴの構造もしくは機能、または標的細胞の構造もしくは機能を改善するのに効果的であり得る。
（ｉ）物理的な修飾
幾つかの実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に物理的に修飾される。例えば、本明細書の他の場所に記載されているように、フソゲンは、細胞の表面に連結され得る。
幾つかの実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に化学薬品で処理される。例えば、細胞は、化学的または脂質フソゲンで処理され得、その結果、化学的または脂質フソゲンは、細胞の表面と非共有結合的もしくは共有結合的に相互作用するか、または細胞の表面内に埋め込まれる。幾つかの実施形態では、細胞は、細胞膜中の脂質の融合特性を増強するために作用物質で処理される。
幾つかの実施形態では、細胞は、臓器、組織、または細胞型へのフソソームの標的化を増強する細胞表面上の合成または内因性小分子または脂質の１つ以上の共有結合または非共有結合部位を有するフソソームを生成する前に、物理的に修飾される。
実施形態では、フソソームは、内因性分子のレベルの増加または減少を含む。例えば、フソソームは、天然に存在するソース細胞にも天然に存在するが、フソソームよりも高いまたはより低いレベルで存在する内因性分子を含み得る。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、ソース細胞またはフソソームにおける外因性核酸から発現される。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、供給源から単離され、ソース細胞またはフソソームにロードされるか、またはコンジュゲートされる。
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞内の内因性フソゲン（例えば、幾つかの実施形態では、ソース細胞に対して内因性であり、幾つかの実施形態では、標的細胞に対して内因性である）の発現または活性を増加させるために、フソソームを生成する前に化学剤、例えば、小分子で処理される。幾つかの実施形態では、小分子は、内因性フソゲンの転写活性化因子の発現または活性を増加させ得る。幾つかの実施形態では、小分子は、内因性フソゲンの転写抑制因子の発現または活性を低下させ得る。幾つかの実施形態では、小分子は、内因性フソゲンの発現を増加させるエピジェネティック修飾因子である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、融合停止化合物、例えば、リゾホスファチジルコリンで処理された細胞から生成される。幾つかの実施形態では、フソソームは、フソゲン、例えば、アキュターゼを切断しない解離試薬で処理された細胞から生成される。
幾つかの実施形態では、ソース細胞は、フソソームを生成してフソゲンの濃度を追加または増加させる前に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ活性化因子で物理的に修飾される。
幾つかの実施形態では、細胞は、量を増加もしくは減少させるか、またはオルガネラ、例えば、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体、細胞内小胞（リソソーム、オートファゴソームなど）の構造または機能を増強するように物理的に修飾される。
（ｉｉ）遺伝子修飾
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞内の内因性フソゲン（例えば、幾つかの実施形態では、ソース細胞に対して内因性であり、幾つかの実施形態では、標的細胞に対して内因性である）の発現を増加させるために、フソソームを生成する前に遺伝子修飾される。幾つかの実施形態では、遺伝子修飾は、内因性フソゲンの転写活性化因子の発現または活性を増加させ得る。幾つかの実施形態では、遺伝子修飾は、内因性フソゲンの転写抑制因子の発現または活性を低下させ得る。幾つかの実施形態では、活性化因子または抑制因子は、ガイドＲＮＡによって内因性フソゲンを標的とする転写活性化因子または抑制因子に連結されたヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。幾つかの実施形態では、遺伝子修飾は、内因性フソゲン遺伝子エピジェネティックに修飾して、その発現を増加させる。幾つかの実施形態では、エピジェネティック活性化因子は、ガイドＲＮＡによって内因性フソゲンを標的とするエピジェネティック修飾因子に連結されたヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞内の外因性フソゲンの発現、例えば、導入遺伝子の送達を増加させるために、フソソームを生成する前に遺伝子修飾される。幾つかの実施形態では、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、例えば、臓器、組織、または細胞標的化に使用される細胞表面分子（タンパク質、グリカン、脂質、もしくは低分子量分子）の発現を増加または減少させるために、フソソームを生成する前に細胞に移される。幾つかの実施形態では、核酸は、フソゲンの抑制因子、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ構築物を標的とする。幾つかの実施形態では、核酸は、フソゲン抑制因子の阻害剤をコードする。
幾つかの実施形態では、この方法は、フソゲンをコードするソース細胞に対して外因性である核酸をソース細胞に導入することを含む。外因性核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。幾つかの実施形態では、外因性核酸は、例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等であり得る。幾つかの実施形態では、外因性ＤＮＡは、線状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、または人工染色体であり得る。幾つかの実施形態では、ＤＮＡは、エピソーム的に維持される。幾つかの実施形態では、ＤＮＡは、ゲノムに組み込まれる。外因性ＲＮＡは、化学的に修飾されたＲＮＡであり得、例えば、１つ以上の骨格修飾、糖修飾、非正規型塩基、またはキャップを含み得る。骨格修飾には、例えば、ホスホロチオエート、Ｎ３’ホスホルアミダイト、ボラノホスフェート、ホスホノアセテート、チオ－ＰＡＣＥ、モルフォリノホスホルアミダイト、またはＰＮＡが含まれる。糖修飾には、例えば、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’Ｆ、２’Ｆ－ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＵＮＡ、および２’－Ｏ－ＭＯＥが含まれる。非正規型塩基には、例えば、５－ブロモ－Ｕ、および５－ヨード－Ｕ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ－５プロピニルピリミジン、ジフルオロトルエン、ジフルオロベンゼン、ジクロロベンゼン、２－チオウリジン、シュードウリジン、およびジヒドロウリジンが含まれる。キャップには、例えば、ＡＲＣＡが含まれる。追加の修飾は、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，″Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ″Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ８，２４ Ａｕｇｕｓｔ ２０１２，Ｐａｇｅｓ ９３７－９５４において議論されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞内のソース細胞に対して外因性であるフソゲンの発現または活性を増加させるために、フソソームを生成する前に化学剤、例えば小分子で処理される。幾つかの実施形態では、小分子は、外因性フソゲンの転写活性化因子の発現または活性を増加させ得る。幾つかの実施形態では、小分子は、外因性フソゲンの転写抑制因子の発現または活性を低下させ得る。幾つかの実施形態では、小分子は、外因性フソゲンの発現を増加させるエピジェネティック修飾因子である。
幾つかの実施形態では、核酸は、修飾されたフソゲンをコードする。例えば、調節可能な融合活性、例えば、特定の細胞型、組織型、または局所的な微小環境活性を有するフソゲン。そのような調節可能な融合活性には、低ｐＨ、高ｐＨ、熱、赤外光、細胞外酵素活性（真核生物もしくは原核生物）、あるいは小分子、タンパク質、または脂質の曝露による融合活性の活性化および／または開始が含まれ得る。幾つかの実施形態では、小分子、タンパク質、または脂質は、標的細胞上に表示される。
幾つかの実施形態では、細胞は、シグナル伝達経路（例えば、Ｗｎｔ／βカテニン経路）の発現を改変する（すなわち、上方調節または下方調節する）ために、フソソームを生成する前に遺伝子修飾される。幾つかの実施形態では、細胞は、対象の１つまたは複数の遺伝子の発現を改変する（例えば、上方調節または下方調節する）ために、フソソームを生成する前に遺伝子修飾される。幾つかの実施形態では、細胞は、対象の１つまたは複数の核酸（例えば、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の発現を改変する（例えば、上方調節または下方調節する）ために、フソソームを生成する前に遺伝子修飾される。幾つかの実施形態では、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡは、例えば、シグナル伝達経路、遺伝子、または核酸の発現を増加または減少させるために、フソソームを生成する前に細胞に移される。幾つかの実施形態では、核酸は、シグナル伝達経路、遺伝子、もしくは核酸の抑制因子を標的とするか、またはシグナル伝達経路、遺伝子、もしくは核酸を抑制する。幾つかの実施形態では、核酸は、シグナル伝達経路、遺伝子、または核酸を上方調節または下方調節する転写因子をコードする。幾つかの実施形態では、活性化因子または抑制因子は、ガイドＲＮＡによってシグナル伝達経路、遺伝子、または核酸を標的とする転写活性化因子または抑制因子に連結されたヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。幾つかの実施形態では、遺伝子修飾は、内因性シグナル伝達経路、遺伝子、または核酸を、その発現に対してエピジェネティックに修飾する。幾つかの実施形態では、エピジェネティック活性化因子は、ガイドＲＮＡによってシグナル伝達経路、遺伝子、または核酸を標的とするエピジェネティック修飾因子に連結されたヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）。幾つかの実施形態では、細胞のＤＮＡは、シグナル伝達経路（例えば、Ｗｎｔ／β－カテニン経路）、遺伝子、または核酸の発現を改変（例えば、上方調節または下方調節）するために、フソソームを生成する前に編集される。幾つかの実施形態では、ＤＮＡは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１または他の遺伝子編集技術を使用して編集される。
細胞は、組換え法を使用して遺伝子修飾することができる。所望の遺伝子をコードする核酸配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることによって、それを含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、または標準的な技法を使用して、それを含有する細胞および組織から直接単離することによってなどの組換え法を使用して得ることができる。代替として、対象の遺伝子は、クローン化するのではなく、合成的に産生することができる。
天然または合成の核酸の発現は、典型的に、対象の遺伝子をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物での複製および組込みに好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにプロモーターを含む。
幾つかの実施形態では、細胞は、１つ以上の発現領域、例えば、遺伝子で遺伝子修飾され得る。幾つかの実施形態では、細胞は、外因性遺伝子（例えば、ＲＮＡもしくはポリペプチド産物などの外因性遺伝子産物を発現することができる）および／または外因性調節核酸で遺伝子修飾され得る。幾つかの実施形態では、細胞は、標的細胞に対して内因性である遺伝子産物および／または内因性遺伝子の発現を調節することができる外因性調節核酸をコードする外因性配列で遺伝子修飾され得る。幾つかの実施形態では、細胞は、外因性遺伝子および／または外因性遺伝子の発現を調節する調節核酸で遺伝子修飾され得る。幾つかの実施形態では、細胞は、外因性遺伝子および／または内因性遺伝子の発現を調節する調節核酸で遺伝子修飾され得る。本明細書に記載の細胞は、例えば、標的細胞の内因性または外因性ゲノムの遺伝子産物に作用し得るタンパク質または調節分子をコードする様々な外因性遺伝子を発現するように遺伝子修飾され得ることが、当業者によって理解されるであろう。幾つかの実施形態では、そのような遺伝子は、フソソームに特徴を付与し、例えば、標的細胞との融合を調節する。幾つかの実施形態では、細胞は、内因性遺伝子および／または調節核酸を発現するように遺伝子修飾され得る。幾つかの実施形態では、内因性遺伝子または調節核酸は、他の内因性遺伝子の発現を調節する。幾つかの実施形態では、細胞は、他の染色体上の内因性遺伝子および／または調節核酸のバージョンとは異なって（例えば、誘導的に、組織特異的に、構成的に、もしくはより高いかより低いレベルで）発現される内因性遺伝子および／または調節核酸を発現するように遺伝子修飾され得る。
プロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的に、これらは、開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近、多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であるため、エレメントが互いに反転または移動したときにプロモーター機能が維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐ離して増やすことができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントが協調的または独立して機能し、転写を活性化できるようである。
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる、強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、鳥類白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターを含むがこれらに限定されない他の構成的プロモーター配列、ならびに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターもまた使用され得る。
更に、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図されている。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望まれるときにそれが作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が望まれないときに発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、組織特異的プロモーター、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、フソソームが生成される前に、例えば、フソソームが生成される３、６、９、１２、２４、２６、４８、６０、または７２時間前に、フソゲンの発現が上方調節される。
ソースに導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染されることが求められる細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれか、または両方を含むことができる。他の態様では、選択可能なマーカーは、別個のＤＮＡ片に運ばれ、同時トランスフェクション手順において使用され得る。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子の両方に、宿主細胞での発現を可能にする適切な調節配列を隣接させることができる。有用な選択可能なマーカーには、例えば、ネオ等の抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を特定し、調節配列の機能を評価するために使用することができる。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント源に存在しないか、またはそれによって発現されない遺伝子であり、その発現が幾つかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって現れるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時期にアッセイされる。好適なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。好適な発現システムはよく知られており、既知の技法を使用して調製するか、または商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物が、プロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子にリンクされ、プロモーター駆動型転写を調節する能力について作用物質を評価するために使用され得る。
幾つかの実施形態では、細胞は、１つ以上のタンパク質の発現を改変するために遺伝子修飾され得る。１つ以上のタンパク質の発現は、特定の時間、例えば、供給源の発達または分化状態のために修飾され得る。幾つかの実施形態では、フソソームは、１つ以上のタンパク質、例えば、融合活性、構造、または機能に影響を与えるフソゲンタンパク質または非フソゲンタンパク質の発現を改変するように遺伝子修飾された細胞の供給源から生成される。１つ以上のタンパク質の発現は、特定の場所（複数可）に制限されるか、または供給源全体に広まる可能性がある。
幾つかの実施形態では、フソゲンタンパク質の発現が修飾される。幾つかの実施形態では、フソソームは、フソゲンタンパク質の発現が修飾された細胞から生成され、例えば、フソゲンの発現が、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、またはそれ以上増加または減少する。
幾つかの実施形態では、細胞は、フソゲンタンパク質を標的とする細胞質ゾル酵素（例えば、プロテアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、デメチラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチラーゼ）を発現するように操作され得る。幾つかの実施形態では、細胞質ゾル酵素は、翻訳後修飾を改変することによって、１つ以上のフソゲンに影響を与える。タンパク質の翻訳後タンパク質修飾は、栄養素の利用可能性と酸化還元条件、およびタンパク質間相互作用に対する応答性に影響を与える可能性がある。幾つかの実施形態では、フソソームは、改変された翻訳後修飾、例えば、翻訳後修飾の少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、またはそれ以上の増加または減少を伴うフソゲンを含む。
細胞に修飾を導入する方法には、物理的、生物学的、および化学的方法が含まれる。例えば、Ｇｅｎｇ．＆Ｌｕ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ．１３（１９）：３８０３－２１．２０１３、Ｓｈａｒｅｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｖｅｃｔｏｒ－ｆｒｅｅ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＰＮＡＳ ｖｏｌ．１１０ ｎｏ．６．２０１３、Ｙｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１５：５４１－５５５．２０１４を参照されたい。本明細書に記載のフソソームの生成に使用するために細胞を修飾するための好適な方法には、例えば、拡散、浸透圧、浸透圧パルス、浸透圧ショック、低張溶解、低張透析、イオノフォレシス、エレクトロポレーション、超音波処理、マイクロインジェクション、カルシウム沈殿、膜挿入、脂質媒介トランスフェクション、洗浄剤処理、ウイルス感染、受容体媒介エンドサイトーシス、タンパク質伝達ドメインの使用、粒子発火、膜融合、凍結融解、機械的破壊、および濾過が含まれる。
遺伝子修飾の存在を確認するには、様々なアッセイが含まれる。そのようなアッセイには、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲなどの分子生物学的アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）または本明細書に記載のアッセイによって特定のペプチドの存在または不在を検出するなどの生化学的アッセイが含まれる。
フソソーム修飾
幾つかの態様では、修飾は、フソソームに対して行われる。そのような修飾は、例えば、標的化、機能、または構造を改善するのに効果的であり得る。
幾つかの実施形態では、フソソームは、膜の表面に非共有結合または共有結合し得る、フソゲン、例えば、本明細書に記載の化学フソゲンで処理される。幾つかの実施形態では、フソソームは、非共有結合的もしくは共有結合的に結合するか、またはそれ自体を膜に埋め込むことができる、フソゲン、例えば、タンパク質または脂質フソゲンで処理される。
幾つかの実施形態では、リガンドは、フソソームの表面に存在する官能性化学基（カルボン酸、アルデヒド、アミン、スルフヒドリル、およびヒドロキシル）を介してフソソームの表面にコンジュゲートしている。
そのような反応性基には、マレイミド基が含まれるが、これに限定されない。一例として、フソソームは、限定されないが、ＤＳＰＥ－ＭａＬ－ＰＥＧ２０００などのマレイミドコンジュゲートリン脂質を含むように合成され得る。
幾つかの実施形態では、合成または天然の小分子または脂質は、フソソームの表面に共有結合または非共有結合し得る。幾つかの実施形態では、フソソーム中の膜脂質は、融合特性を促進、誘導、または増強するように修飾され得る。
幾つかの実施形態では、フソソームは、修飾タンパク質をロードすることによって修飾される（例えば、新規機能を可能にする、翻訳後修飾を改変する、ミトコンドリア膜および／もしくはミトコンドリア膜タンパク質に結合する、異種機能を有する切断可能なタンパク質を形成する、タンパク質分解を目的としてタンパク質を形成する、作用物質の位置およびレベルを分析する、または作用物質を担体として送達する）。幾つかの実施形態では、フソソームには、１つ以上の修飾されたタンパク質がロードされる。
幾つかの実施形態では、ソース細胞に対して外因性のタンパク質は、フソソームに非共有結合している。タンパク質は、放出のための切断可能なドメインを含み得る。幾つかの実施形態では、本発明は、切断可能なドメインを有する外因性タンパク質を含むフソソームを含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、タンパク質分解を目的としたタンパク質で修飾されている。様々なプロテアーゼが特定のタンパク質アミノ酸配列を認識し、タンパク質を分解の標的にする。これらのタンパク質分解酵素を使用して、タンパク質分解配列を有するタンパク質を特異的に分解することができる。幾つかの実施形態では、フソソームは、１つ以上のタンパク質分解酵素の調節されたレベル、例えば、タンパク質分解酵素の少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、またはそれ以上の増加または減少を含む。
本明細書に記載されるように、非フソゲン添加剤をフソソームに添加して、それらの構造および／または特性を修飾することができる。例えば、コレステロールまたはスフィンゴミエリンのいずれかを膜に添加して、構造を安定させ、内部カーゴの漏れを防ぐことができる。更に、膜は、水素化された卵ホスファチジルコリンまたは卵ホスファチジルコリン、コレステロール、およびリン酸ジセチルから調製することができる。（例えば、レビューには、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、特定の細胞または組織タイプ（例えば、心筋細胞）を標的化するために、外面上に１つ以上の標的化基（例えば、標的化タンパク質）を含む。これらの標的化基には、受容体、リガンド、抗体等が含まれるが、これらに限定されない。これらの標的化群は、標的細胞の表面でそれらのパートナーに結合する。実施形態では、標的化タンパク質は、本明細書に記載の標的細胞、例えば、皮膚細胞、心筋細胞、肝細胞、腸細胞（例えば、小腸の細胞）、膵臓細胞、脳細胞、前立腺細胞、肺細胞、結腸細胞、または骨髄細胞上の細胞表面マーカーに特異的である。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、診断薬で機能化されている。診断薬の例には、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピューター支援断層撮影（ＣＡＴ）、単一光子放出コンピューター断層撮影、Ｘ線、透視、および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で使用される市販のイメージング剤、ならびに造影剤が含まれるが、これらに限定されない。ＭＲＩで造影剤として使用するのに適した材料の例には、ガドリニウムキレート、ならびに鉄、マグネシウム、マンガン、銅、およびクロムが含まれる。
フソソームに官能基を導入する別の例は、ホモまたはヘテロ二官能性架橋剤でフソソームおよびリガンドを直接架橋することによる、後調製中のものである。この手順は、好適な化学およびクラスの架橋剤（本明細書で論じられるようなＣＤＩ、ＥＤＡＣ、グルタルアルデヒド等）または調製後のフソソーム表面の化学修飾を介してリガンドをフソソーム表面に結合する任意の他の架橋剤を使用し得る。これには、脂肪酸、脂質、または機能安定剤などの両親媒性分子を受動的に吸着してフソソーム表面に付着させ、それによりリガンドにつなぐための機能性末端基を導入するプロセスも含まれる。
カーゴ
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、膜タンパク質ペイロード剤であるか、またはそれを含むカーゴを含む。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、治療用タンパク質であり得るか、またはそれをコードし得る。フソソームは、他のカーゴを更に含み得、例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、治療薬であるか、またはそれを含むカーゴを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、複数の膜ペイロード剤を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、複数の治療薬であるか、またはそれを含むカーゴを含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、１つ以上の膜タンパク質ペイロード剤および１つ以上の治療剤を含むカーゴを含む。幾つかの実施形態では、カーゴは、ソース細胞に対して外因性または内因性である治療薬であり得る。
幾つかの実施形態では、フソソームは、フソソーム脂質二重層と会合したカーゴを含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、フソソームの内腔内に配置されたカーゴを含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、フソソーム脂質二重層と会合したカーゴ、およびフソソームの内腔内に配置されたカーゴを含む。
幾つかの実施形態では、カーゴは、フオソスメ（ｆｕｏｓｏｓｍｅ）が由来する細胞において自然に発現されない。幾つかの実施形態では、カーゴは、フソソームが由来する細胞において自然に発現される。幾つかの実施形態では、カーゴは、フソソームが由来する細胞で自然に発現される野生型核酸またはタンパク質の変異体であるか、またはフソソームが由来する細胞で自然に発現される野生型の変異体である。
幾つかの実施形態では、カーゴは、フソソームが由来する細胞における発現（例えば、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションを介して導入されたＤＮＡからの発現）を介してフソソームにロードされる。幾つかの実施形態では、カーゴは、フソソームが由来する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡから発現されるか、またはフソソームが由来する細胞においてエピソソーム的に維持される。幾つかの実施形態では、カーゴの発現は、フソソームが由来する細胞において構成的である。幾つかの実施形態では、フソソームが由来する細胞におけるカーゴの発現が誘導される。幾つかの実施形態では、カーゴの発現は、フソソームを生成する直前に、フソソームが由来する細胞において誘導される。幾つかの実施形態では、フソソームが由来する細胞におけるカーゴの発現は、フソソームが由来する細胞におけるフソゲンの発現と同時に誘導される。
幾つかの実施形態では、カーゴは、エレクトロポレーションを介して、フソソーム自体またはフソソームが由来する細胞へのエレクトロポレーションを介してフソソームにロードされる。幾つかの実施形態では、カーゴは、フソソーム自体へのトランスフェクションを介してフソソームにロードされるか、またはフソソームが由来する細胞にロードされる。
幾つかの態様では、本開示は、（ｉ）１つ以上のコンドリソーム（例えば、国際出願、ＰＣＴ／ＵＳ１６／６４２５１に記載される）、ミトコンドリア、オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、リソソーム、核、細胞膜、細胞質、小胞体、リボソーム、空胞、エンドソーム、スプライスソーム、ポリメラーゼ、カプシド、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、筋原線維、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、ストレス顆粒、およびオルガネラのネットワーク）、または除核細胞、例えば、前述のいずれかを含む除核細胞、ならびに（ｉｉ）フソゲン、例えば、ミオメーカータンパク質を含むフソソーム組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。
実施形態では、フソゲンは、ミトコンドリアまたはコンドリソームの外部の脂質二重層に存在する。実施形態では、コンドリソームは、例えば、国際出願において、本発明の実施例および要約を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１６／６４２５１に記載されるような特性のうちの１つ以上を有する。
幾つかの実施形態では、カーゴは、１つ以上の核酸配列、１つ以上のポリペプチド、核酸配列および／またはポリペプチドの組み合わせ、１つ以上のオルガネラ、ならびにそれらの任意の組み合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、カーゴは、１つ以上の細胞成分を含み得る。幾つかの実施形態では、カーゴは、１つ以上の細胞質ゾルおよび／または核成分を含む。
幾つかの実施形態では、カーゴは、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｎＤＮＡ（核ＤＮＡ）、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ）、タンパク質コードＤＮＡ、遺伝子、オペロン、染色体、ゲノム、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、ウイルスゲノム、イントロン、エクソン、修飾ＤＮＡ、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、修飾ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｔｍＲＮＡ（トランスファーメッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍｔＲＮＡ（ミトコンドリアＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（低分子核ＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＳｍＹ ＲＮＡ（ｍＲＮＡトランススプライシングＲＮＡ）、ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）、ＴＥＲＣ（テロメラーゼＲＮＡ成分）、ａＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）、ｃｉｓ－ＮＡＴ（Ｃｉｓ天然アンチセンス転写物）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（短鎖ヘアピンＲＮＡ）、ｔａｓｉＲＮＡ（トランス作用ｓｉＲＮＡ）、ｅＲＮＡ（エンハンサーＲＮＡ）、サテライトＲＮＡ、ｐｃＲＮＡ（タンパク質コードＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ（干渉ＲＮＡ）、ｃｉｒｃＲＮＡ（環状ＲＮＡ）、リプログラミングＲＮＡ、アプタマー、およびそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、核酸は、野生型核酸である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、変異体核酸である。幾つかの実施形態では、核酸は、多数の核酸配列の融合またはキメラである。
幾つかの実施形態では、フソソーム中のＤＮＡまたはフソソームが由来する細胞内のＤＮＡは、遺伝子編集技術、例えば、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１を使用して、または異なる標的エンドヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用して、遺伝子突然変異を修正するように編集される。幾つかの実施形態では、遺伝子突然変異は、被験体における疾患に関連している。ＤＮＡの編集の例には、小さな挿入／欠失、大きな欠失、テンプレートＤＮＡによる遺伝子修正、またはＤＮＡの大きな挿入が含まれる。幾つかの実施形態では、遺伝子編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性指向修復（ＨＤＲ）によって達成される。幾つかの実施形態では、編集は、ノックアウトである。幾つかの実施形態では、編集は、ノックインである。幾つかの実施形態では、ＤＮＡの両方の対立遺伝子が編集される。幾つかの実施形態では、単一の対立遺伝子が編集される。幾つかの実施形態では、多数の編集が行われる。幾つかの実施形態では、フソソームまたは細胞は、被験体に由来するか、または被験体に遺伝的に一致するか、または被験体と免疫学的に適合性がある（例えば、同様のＭＨＣを有する）。
幾つかの実施形態では、カーゴは、核酸を含み得る。例えば、カーゴは、内因性タンパク質（例えば、幾つかの実施形態では、ソース細胞に対して内因性であり、幾つかの実施形態では、標的細胞に対して内因性）の発現を増強するためのＲＮＡ、または内因性タンパク質のタンパク質発現を阻害するｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡを含み得る。例えば、内因性タンパク質は、標的細胞の構造または機能を調節することができる。幾つかの実施形態では、カーゴは、標的細胞における構造または機能を調節する操作されたタンパク質をコードする核酸を含み得る。幾つかの実施形態では、カーゴは、標的細胞の構造または機能を調節する転写活性化因子を標的とする核酸である。
幾つかの実施形態では、カーゴは、例えば、本明細書に記載されるように、自己複製ＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡおよび／または線状ＲＮＡである。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、１つ以上のタンパク質、例えば、本明細書に記載のタンパク質、例えば、膜タンパク質、分泌タンパク質、核タンパク質、またはオルガネラタンパク質をコードする。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、アルテリウイルスまたはαウイルス、あるいはそれらのバリアントからの部分的または完全なゲノムを含む。
幾つかの実施形態では、カーゴは、標的細胞に送達され得るＲＮＡを含み得、ＲＮＡは、標的細胞内で複製される。自己複製ＲＮＡの複製は、宿主細胞に外因性であるＲＮＡ複製機構、および／または宿主細胞に内因性であるＲＮＡ複製機構を含み得る。
幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ウイルスゲノム、またはその自己複製部分もしくは類似体を含む。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスに由来する。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、部分的または完全なアルテリウイルスゲノム、またはそのバリアントを含む。幾つかの実施形態では、アルテリウイルスは、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ呼吸生殖症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、およびシミアン出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）を含む。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、部分的もしくは完全なαウイルスゲノム、またはそのバリアントを含む。幾つかの実施形態では、αウイルスは、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶグループ（例えば、ベネズエラ馬脳炎ウイルス）、ＳＦグループ、またはＳＩＮグループに属する。
幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡを含むフソソームは、（ｉ）ＲＮＡの複製を促進する１つ以上のタンパク質、または（ｉｉ）ＲＮＡの複製を促進する１つ以上のタンパク質をコードする核酸を、例えば、自己複製ＲＮＡの一部として、または別個の核酸分子中に更に含む。
幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、対応する野生型ゲノムと比較して、１つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも１つの機能的遺伝子を欠いている。例えば、幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質のための１つ以上の遺伝子を完全に欠いているか、またはウイルス構造タンパク質のための非機能的変異体遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質のためのいかなる遺伝子も含まない。
幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＷＯ２０１８／１０６６１５号に記載されるように、ウイルスカプシドエンハンサーを含む。幾つかの実施形態では、ウイルスカプシドエンハンサーは、例えば、コード配列のｅＩＦ２α非依存性翻訳を可能にすることによって、シスにおけるコード配列の翻訳を増加させるＲＮＡ構造である。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、例えば、ｅＩＦ２αのＰＫＲを介したリン酸化のために、翻訳が損なわれている。実施形態では、ウイルスカプシドエンハンサーは、ウイルスカプシドタンパク質からのダウンストリームループ（ＤＬＰ）、またはＤＬＰのバリアントを含む。幾つかの実施形態では、ウイルスカプシドエンハンサーは、トガウイルス科に属するウイルス、例えば、トガウイルス科のアルファウイルス属に由来する。幾つかの実施形態では、ウイルスカプシドエンハンサーは、ＷＯ２０１８／１０６６１５の配列番号１の配列（その配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性を有する配列を有する。幾つかの実施形態では、配列は、ＷＯ２０１８／１０６６１５の図１に示されるのと同じ二次構造を有する。
幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＷＯ２０１７／１８０７７０号に記載されるように、１つ以上のアルテリウイルス配列を含む。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ＯＲＦ７（またはその機能的フラグメントもしくはバリアント）を含み、かつ／あるいは自己複製ＲＮＡは、アルテリウイルスの機能的ＯＲＦ２ａを欠いている（例えば、ＯＲＦ２ａを完全に欠いているか、またはＯＲＦ２ａの非機能的変異体を含む）。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、機能的ＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５ａ、ＯＲＦ５、もしくはＯＲＦ６、またはそれらの任意の組み合わせを欠いている（例えば、配列（複数可）を完全に欠いているか、または配列（複数可）の非機能的変異体を含む）。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ＯＲＦ２ａ、ＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５ａ、ＯＲＦ５、またはＯＲＦ６のうちの１つ以上の一部を欠いている。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、例えば、非天然部位に位置する１つ以上のサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む。幾つかの実施形態では、プロモーターは、ｓｇプロモーター１、ｓｇプロモーター２、ｓｇプロモーター３、ｓｇプロモーター４、ｓｇプロモーター５、ｓｇプロモーター６、ｓｇプロモーター７、またはそれらの機能的フラグメントもしくはバリアントを含む。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、１つ以上の転写終結シグナル、例えば、Ｔ７転写終結シグナル、例えば、変異体Ｔ７転写終結シグナル、例えば、Ｔ９００１Ｇ、Ｔ３１８５Ａ、またはＧ３１８８Ａのうちの１つ以上（例えば、いずれか２つ、もしくは全て）を含む。
幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、５’ＵＴＲ、例えば、国際出願第ＷＯ２０１８／０７５２３５号に記載されているような変異体αウイルス５’ＵＴＲを含み、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態では、変異体αウイルス５’ＵＴＲは、位置１、２、４、またはそれらの組み合わせにおける１つ以上のヌクレオチド置換を含む。幾つかの実施形態では、変異体αウイルス５’ＵＴＲは、位置２にＵ－＞Ｇ置換を含む。
幾つかの実施形態では、カーゴは、ポリペプチド、例えば、酵素、構造ポリペプチド、シグナル伝達ポリペプチド、調節ポリペプチド、輸送ポリペプチド、感覚ポリペプチド、モーターポリペプチド、防御ポリペプチド、貯蔵ポリペプチド、転写因子、抗体、サイトカイン、ホルモン、異化ポリペプチド、同化ポリペプチド、タンパク質分解ポリペプチド、代謝ポリペプチド、キナーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、酵素モジュレーターポリペプチド、タンパク質結合ポリペプチド、脂質結合ポリペプチド、膜融合ポリペプチド、細胞分化ポリペプチド、エピジェネティックポリペプチド、細胞死ポリペプチド、核輸送ポリペプチド、核酸結合ポリペプチド、再プログラミングポリペプチド、ＤＮＡ編集ポリペプチド、ＤＮＡ修復ポリペプチド、ＤＮＡ組換えポリペプチド、トランスポターゼポリペプチド、ＤＮＡ組込みポリペプチド、標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｃａｓ９とそのホモログ）、リコンビナーゼ、およびそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、タンパク質は、分解のために細胞内のタンパク質を標的とする。幾つかの実施形態では、タンパク質は、タンパク質をプロテアソームに局在させることによる分解のために細胞内のタンパク質を標的とする。幾つかの実施形態では、タンパク質は、野生型タンパク質である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、変異体タンパク質である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、融合タンパク質またはキメラタンパク質である。
幾つかの実施形態では、カーゴは、小分子、例えば、イオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｃｌ－、Ｆｅ２＋）、炭水化物、脂質、活性酸素種、活性窒素種、イソプレノイド、シグナル伝達分子、ヘム、ポリペプチド補因子、電子受容化合物、電子供与化合物、代謝物、リガンド、およびそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、小分子は、細胞内の標的と相互作用する医薬品である。幾つかの実施形態では、小分子は、分解のために細胞内のタンパク質を標的とする。幾つかの実施形態では、小分子は、タンパク質をプロテアソームに局在させることによる分解のために細胞内のタンパク質を標的とする。幾つかの実施形態では、その小分子は、タンパク質分解標的化キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）である。
幾つかの実施形態では、カーゴは、タンパク質、核酸、または代謝産物の混合物、例えば、複数のポリペプチド、複数の核酸、複数の小分子；核酸、ポリペプチド、および小分子の組み合わせ；リボ核タンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体）；複数の転写因子、複数のエピジェネティック因子、リプログラミング因子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、およびＫｌｆ４）；複数の調節ＲＮＡ；ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。
幾つかの実施形態では、カーゴは、１つ以上のオルガネラ、例えば、コンドリソーム、ミトコンドリア、リソソーム、核、細胞膜、細胞質、小胞体、リボソーム、空胞、エンドソーム、スプライスソーム、ポリメラーゼ、カプシド、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロメノソーム、メラノソーム、マイトソーム、筋原線維、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、ストレス顆粒、オルガネラのネットワーク、およびそれらの任意の組み合わせを含む。
幾つかの実施形態では、カーゴは、フソソームまたは細胞膜で豊富化される。幾つかの実施形態では、カーゴは、ペプチドシグナル配列を介して膜を標的とすることによって豊富化される。幾つかの実施形態では、カーゴは、膜関連タンパク質、脂質、または小分子と結合することによって豊富化される。幾つかの実施形態では、カーゴは、膜関連タンパク質、脂質、または小分子と二量体化することによって豊富化される。幾つかの実施形態では、カーゴは、キメラ（例えば、キメラタンパク質もしくは核酸）であり、膜会合タンパク質、脂質、または小分子との結合または二量体化を媒介するドメインを含む。対象の膜会合タンパク質には、限定されないが、細胞膜に安定して会合する、例えば、結合する、組み込まれる等のドメインを有する任意のタンパク質（すなわち、膜会合ドメイン）が含まれ、そのようなドメインは、ミリストイル化ドメイン、ファルネシル化ドメイン、膜貫通ドメイン等を含み得る。対象の特定の膜関連タンパク質には、ミリストイル化タンパク質、例えば、ｐ６０ｖ－ｓｒｃ等；ファルネシル化タンパク質、例えば、Ｒａｓ、Ｒｈｅｂ、およびＣＥＮＰ－Ｅ、Ｆ、細胞膜二重層等の脂質成分であるホスファチジルセリンに結合することによって、特定の脂質二重層成分、例えば、ＡｎｎｅｘｉｎＶに結合するタンパク質；膜アンカータンパク質；膜貫通タンパク質、例えば、トランスフェリン受容体およびその一部；ならびに膜融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、膜会合タンパク質は、第１の二量体化ドメインを含む。第１の二量体化ドメインは、例えば、カーゴの第２の二量体化ドメインに直接結合するか、または二量体化メディエーターを介して第２の二量体化ドメインに結合するドメインであり得る。幾つかの実施形態では、カーゴは、第２の二量体化ドメインを含む。第２の二量体化ドメインは、例えば、直接または二量体化メディエーターを介して膜関連タンパク質の第１の二量体化ドメインと二量体化する（例えば、非共有結合相互作用などによって、直接またはメディエーターを介して安定して会合する）ドメインであり得る。二量体化ドメインに関して、これらのドメインは、直接または二量体化メディエーターを介して結合事象に関与するドメインであり、結合事象は、所望の多量体、例えば、膜関連タンパク質および標的タンパク質の複合体である二量体の産生をもたらす。第１および第２の二量体化ドメインは、それらが同じアミノ酸配列から構成されるようにホモ二量体であり得るか、またはそれらが異なるアミノ酸配列から構成されるようにヘテロ二量体であり得る。二量体化ドメインは変化する可能性があり、対象のドメインには、対象の特定のタンパク質に特異的に結合するリガンドなどの標的生分子のイガンド（例えば、タンパク質：タンパク質相互作用ドメイン）、例えば、ＳＨ２ドメイン、Ｐａｚドメイン、ＲＩＮＧドメイン、転写活性化因子ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、酵素触媒ドメイン、酵素調節ドメイン、酵素サブユニット、定義された細胞位置への局在化のためのドメイン、局在ドメインの認識ドメイン、ＵＲＬ：ｐａｗｓｏｎｌａｂ．ｍｓｈｒｉ．ｏｎ．ｃａ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｏｐｔｉｏｎ＝ｃｏｍ＿ｃｏｎｔｅｎｔ＆ｔａｓｋ＝ｖｉｅｗ＆ｉｄ＝３０＆Ｉｔｅｍｉｄ＝６３／において列挙されるドメイン等が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、第１の二量体化ドメインは、核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ）に結合し、第２の二量体化ドメインは、カーゴ上に存在する核酸配列である（例えば、第１の二量体化ドメインは、ＭＳ２であり、第２の二量体化ドメインは、ＭＳ２ ＲＮＡの高親和性結合ループである）。二量体化メディエーターとして機能する任意の便利な化合物を用いることができる。天然に存在する物質および合成物質の両方を含む多種多様な化合物を、二量体化メディエーターとして使用することができる。二量体化メディエーターを選択するための適用可能かつ容易に観察可能または測定可能な基準には、以下が含まれる：（Ａ）リガンドは、生理学的に許容可能である（すなわち、それが使用される細胞または動物に対する過度の毒性を欠く）；（Ｂ）それは妥当な治療投与量範囲を有する；（Ｃ）必要に応じて、細胞膜および他の膜を通過することができる（場合によっては、細胞の外側から二量体化を媒介することができる）、（Ｄ）所望の適用に適度な親和性で設計されているキメラタンパク質の標的ドメインに結合する。第１の望ましい基準は、化合物が比較的生理学的に不活性であるが、その二量体化メディエーター活性のためであるということである。場合によっては、リガンドは、非ペプチドおよび非核酸になるであろう。追加の二量体化ドメインは、例えば、ＵＳ２０１７／００８７０８７およびＵＳ２０１７／０１３０１９７に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ペイロード剤
本明細書に記載の方法および組成物を使用して、ペイロード（例えば、ペイロード剤）を標的とすることができる。例えば、ペイロード剤は、例えば、同時翻訳小胞体（ＥＲ）シグナルの使用を通じて、細胞膜を標的にすることができる。細胞膜は、例えば、ＥＲ膜、原形質膜、分泌および／もしくは分泌小胞の膜、またはリソソーム膜であり得る。幾つかの実施形態では、ペイロード剤は、分泌の標的とされる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、ＥＲでの翻訳後、ペイロードをオルガネラ（例えば、ゴルジ装置、分泌小胞、またはリソソーム）の内腔に標的とすることができる。幾つかの実施形態では、ペイロード剤は、例えば、核局在化シグナルを使用することにより、核を標的とすることができる。別の例では、ペイロード剤は、例えば、ミトコンドリアまたはペルオキシソーム局在化シグナルをそれぞれ使用することにより、ミトコンドリアまたはペルオキシソームを標的とすることができる。
タンパク質ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤もしくは分泌タンパク質ペイロード剤）は、例えば、核周囲膜タンパク質、内核膜タンパク質、核質タンパク質、核小体タンパク質、核小体周辺タンパク質、カジャル体タンパク質、クラストソームタンパク質、ジェム核体タンパク質、ヒストン体タンパク質、核スペックルタンパク質、核ストレス体タンパク質、パラスペックルタンパク質、ＰＭＬ体タンパク質、ポリコーム体タンパク質、膜貫通タンパク質、細胞表面タンパク質、膜の細胞質ゾル側と会合するタンパク質、小胞体タンパク質、リソソームタンパク質、ゴルジ装置タンパク質、分泌タンパク質、分泌小胞タンパク質、ミトコンドリア膜タンパク質、ミトコンドリア外膜タンパク質、ミトコンドリア内膜タンパク質、ミトコンドリア内境界膜タンパク質、ミトコンドリア結晶膜タンパク質、ミトコンドリアＤＮＡタンパク質、ミトコンドリア膜間腔タンパク質、ミトコンドリアマトリックスタンパク質、ミトコンドリアマトリックス顆粒タンパク質、ミトコンドリアクリステタンパク質、ミトコンドリアリボソームタンパク質、ミトコンドリア結晶内タンパク質、ミトコンドリア末梢空間タンパク質、ペルオキシソーム膜タンパク質、ペルオキシソームタンパク質コアタンパク質、ペルオキシソームマトリックスタンパク質、ペルオキシン、またはエンドソームタンパク質、あるいはそれらの組み合わせから選択されるタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸であり得るか、またはそれを含み得る。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、標的膜に天然に存在するか、またはそれを標的とするタンパク質の外因性バージョンである。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、天然に存在しないか、または標的膜を標的としない。幾つかの実施形態では、タンパク質ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤または分泌タンパク質ペイロード剤）は、例えば、細胞表面受容体タンパク質、トランスポーター、イオンチャネル、膜結合酵素、細胞接着タンパク質、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、小胞体タンパク質、リソソームタンパク質、ゴルジ装置タンパク質、分泌タンパク質、分泌小胞タンパク質、エンドソームタンパク質から選択されるタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸であり得るか、またはそれを含み得る。膜タンパク質ペイロード剤は、例えば、天然に存在する膜タンパク質の組換えバージョン、または合成タンパク質、例えば、自然界に見出されない配列を有するタンパク質、または自然界に一緒に見出されないドメイン、例えば、キメラ膜タンパク質、例えば、第１の天然に存在するタンパク質に由来する細胞外ドメインと、第２の天然に存在するタンパク質、例えば、キメラ抗原受容体に由来する膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインを有する膜貫通タンパク質であり得る。
幾つかの実施形態では、核タンパク質ペイロード剤は、核内に天然に存在するか、またはそれを標的とするタンパク質の外因性バージョンである。幾つかの実施形態では、核タンパク質ペイロード剤は、天然に存在しないか、または核を標的としない。幾つかの実施形態では、タンパク質ペイロード剤（例えば、核タンパク質ペイロード剤）は、例えば、転写因子、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、エピジェネティック因子、転写後ＲＮＡ修飾因子（例えば、ｍＲＮＡスプライシング因子）、非コードＲＮＡ（例えば、ｓｎＲＮＡもしくはｓｎｏＲＮＡ）またはリボ核酸タンパク質（例えば、ｓｎＲＮＰもしくはｓｎｏＲＮＰ）、構造タンパク質（例えば、ラミンもしくは核骨格タンパク質）から選択されるタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸であり得るか、またはそれを含み得る。核タンパク質ペイロード剤は、例えば、天然に存在する核タンパク質の組換えバージョン、または合成タンパク質、例えば、自然界に見出されない配列を有するタンパク質、または自然界に一緒に見出されないドメイン、例えば、キメラ核タンパク質、例えば、ジンクフィンガー、ＴＡＬ、もしくはＲＮＡ誘導タンパク質に由来するＤＮＡ結合ドメイン、または当該技術分野で知られている他のＤＮＡ結合ドメインと、第２のタンパク質からの核酸修飾ドメイン、例えば、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、塩基エディター（例えば、デアミナーゼ）、ニッカーゼ、転写因子（例えば、活性化因子もしくは抑制因子）、ＤＮＡ調節を改変するウイルスモチーフ（例えば、ＶＰ１６もしくはＶＰ６４）、エピジェネティック修飾因子（例えば、デメチラーゼ）、または当該技術分野で知られている核酸修飾ドメインとの間の翻訳融合または会合から構成される核タンパク質であり得る。
オルガネラタンパク質ペイロード剤は、例えば、天然に存在する核タンパク質の組換えバージョン、または合成タンパク質、例えば、自然界に見出されない配列を有するタンパク質、または自然界に一緒に見出されないドメイン、例えば、キメラミトコンドリアまたはペルオキシソームタンパク質、例えば、ジンクフィンガー、ＴＡＬ、もしくはＲＮＡ誘導タンパク質に由来するｍｔＤＮＡ結合ドメイン、または当該技術分野で知られている他のｍｔＤＮＡ結合ドメインと、第２のタンパク質からの核酸修飾ドメイン、例えば、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、塩基エディター（例えば、デアミナーゼ）、ニッカーゼ、転写因子（例えば、活性化因子もしくは抑制因子）、または当該技術分野で知られている核酸修飾ドメインとの間の翻訳融合または会合から構成されるミトコンドリアまたはペルオキシソームタンパク質であり得る。
幾つかの実施形態では、ミトコンドリアまたはペルオキシソームタンパク質ペイロード剤は、ミトコンドリアまたはペルオキシソームに天然に存在するか、または標的とされるタンパク質の外因性バージョンである。幾つかの実施形態では、ミトコンドリアまたはペルオキシソームタンパク質ペイロード剤は、ミトコンドリアまたはペルオキシソームに天然に存在しないか、または標的とされない。幾つかの実施形態では、タンパク質ペイロード剤（例えば、ミトコンドリアまたはペルオキシソームタンパク質ペイロード剤）は、例えば、ミトコンドリア膜タンパク質、ミトコンドリア外膜タンパク質、ミトコンドリア内膜タンパク質、ミトコンドリア内境界膜タンパク質、ミトコンドリア結晶膜タンパク質、ミトコンドリアＤＮＡタンパク質、ミトコンドリア膜間腔タンパク質、ミトコンドリアマトリックスタンパク質、ミトコンドリアマトリックス顆粒タンパク質、ミトコンドリアクリステタンパク質、ミトコンドリアリボソームタンパク質、ミトコンドリア内結晶タンパク質、ミトコンドリア末梢空間タンパク質、ペルオキシソーム膜タンパク質、ペルオキシソーム晶質コアタンパク質、ペルオキシソームマトリックスタンパク質、ペルオキシン、転写因子、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、エピジェネティック因子、非コードＲＮＡもしくはリボ核酸タンパク質、構造タンパク質、酵素、トランスポーター、呼吸複合体、融合もしくは核分裂タンパク質、シトクロム、シグナル伝達タンパク質、アポトーシスタンパク質もしくは因子、ミトコンドリア移入タンパク質、ミトコンドリア移出タンパク質、または電子伝達タンパク質から選択されるタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸であり得るか、またはそれらを含み得る。
幾つかの実施形態では、ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、ミトコンドリアタンパク質ペイロード剤、またはペリキソソームタンパク質ペイロード剤）は、局在化ドメインに連結されたエフェクタードメイン（例えば、ＴＡＬ、ＺＦ、Ｃａｓ９、もしくはメガヌクレアーゼ）を含むタンパク質（例えば、合成タンパク質）を含む。例示的なエフェクタードメインには、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、塩基エディター（例えば、デアミナーゼ）、転写因子、およびエピジェネティック修飾因子が含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、本明細書に記載される、タンパク質ペイロード剤（例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、オルガネラタンパク質ペイロード剤、ミトコンドリアタンパク質ペイロード剤、もしくはペルオキシソームタンパク質ペイロード剤、または分泌タンパク質ペイロード剤）を含む。幾つかの実施形態では、タンパク質ペイロード剤は、それをコードするタンパク質および／または核酸である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、細胞株において発現され、次いで、フソソームに組み込まれる。当業者は、そのようなタンパク質が細胞株によって発現される範囲で、細胞株がタンパク質を作製するために必要な任意の翻訳後プロセシングが可能であることを理解するであろう。幾つかの実施形態では、翻訳後プロセシングは、タンパク質スプライシング、タンパク質切断、タンパク質フォールディング、タンパク質グリコシル化、二量体化等のうちの１つ以上を含む。
幾つかの実施形態では、タンパク質（例えば、本明細書に記載される、例えば、膜タンパク質、核タンパク質、オルガネラタンパク質ペイロード剤、ミトコンドリアタンパク質ペイロード剤、もしくはペルオキシソームタンパク質ペイロード剤、または分泌タンパク質）は、フソソームが由来するソース細胞によって発現される。当業者は、任意のそのようなタンパク質がソース細胞によって発現される範囲で、ソース細胞株がタンパク質を作製するために必要な任意の翻訳後プロセシングが可能であることを理解するであろう。幾つかの実施形態では、翻訳後プロセシングは、タンパク質スプライシング、タンパク質切断、タンパク質フォールディング、タンパク質グリコシル化、二量体化等のうちの１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、タンパク質ペイロード剤は、核酸である。幾つかの実施形態では、核酸は、細胞表面または核タンパク質をコードする。幾つかの実施形態では、核酸は、核外膜タンパク質、核周囲膜タンパク質、核内膜タンパク質、核質タンパク質、核小体タンパク質、小胞体タンパク質、リソソームタンパク質、ゴルジ装置タンパク質、分泌タンパク質、分泌小胞タンパク質、オルガネラタンパク質、ミトコンドリアタンパク質、もしくはペルオキシソームタンパク質、またはエンドソームタンパク質をコードする。幾つかの実施形態では、タンパク質ペイロード剤、例えば、本明細書に記載される、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、またはオルガネラタンパク質ペイロード剤は、本明細書に記載の細胞表面抗原から選択されるタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸である。幾つかの実施形態では、核酸は、操作された細胞表面タンパク質をコードする。幾つかの実施形態では、操作された細胞表面タンパク質は、キメラ抗原受容体である。幾つかの実施形態では、核酸は、ミトコンドリア膜タンパク質、ミトコンドリア外膜タンパク質、ミトコンドリア内膜タンパク質、ミトコンドリア内境界膜タンパク質、ミトコンドリア結晶膜タンパク質、ミトコンドリアＤＮＡタンパク質、ミトコンドリア膜間腔タンパク質、ミトコンドリアマトリックスタンパク質、ミトコンドリアマトリックス顆粒タンパク質、ミトコンドリアクリステタンパク質、ミトコンドリアリボソームタンパク質、ミトコンドリア結晶内タンパク質、ミトコンドリア末梢空間タンパク質、ペルオキシソーム膜タンパク質、ペルオキシソーム晶質コアタンパク質、ペルオキシソームマトリックスタンパク質、またはペロキシニンをコードする。幾つかの実施形態では、タンパク質ペイロード剤、例えば、ミトコンドリアまたはペルオキシソームタンパク質ペイロード剤は、本明細書に記載のミトコンドリアまたはペルオキシソームタンパク質から選択されるタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸である。
幾つかの実施形態では、タンパク質ペイロード剤（例えば、本明細書に記載される、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、オルガネラタンパク質ペイロード剤、ミトコンドリアタンパク質ペイロード剤、もしくはペルオキシソームタンパク質ペイロード剤、または分泌タンパク質ペイロード剤）は、融合した標的細胞によって発現される核酸を含む。通常の技術者は、核酸タンパク質ペイロード剤（例えば、本明細書に記載される、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、オルガネラタンパク質ペイロード剤、ミトコンドリアタンパク質ペイロード剤、またはペルオキシソームタンパク質ペイロード）の発現によって産生される任意のタンパク質が翻訳後プロセシングを必要とする範囲で、そのような翻訳後プロセシングは、融合された標的細胞において実施されるであろう。幾つかの実施形態では、翻訳後修飾は、タンパク質スプライシング、タンパク質切断、タンパク質フォールディング、タンパク質グリコシル化、二量体化等のうちの１つ以上を含み得る。幾つかの実施形態では、翻訳後修飾は、脂肪酸、イソプレノイド、ステロール、リン脂質、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、コレステロール、ファルネシル、ゲラニルゲラニル、ミリストイル、パルミトイルなどの脂質の共有結合であり、これらは、幾つかの実施形態では、タンパク質を原形質膜に標的化する。幾つかの実施形態では、翻訳後修飾は、核局在化配列の直接リン酸化である。
幾つかの実施形態では、タンパク質ペイロード剤（例えば、本明細書に記載される、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、オルガネラタンパク質ペイロード剤、ミトコンドリアタンパク質ペイロード剤、もしくはペルオキシソームタンパク質ペイロード剤、または分泌タンパク質ペイロード剤）は、核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。幾つかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然の核酸残基であるか、それを含むか、またはそれからなる。幾つかの実施形態では、核酸は、１つ以上の核酸類似体であるか、それを含むか、またはそれからなる。幾つかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。幾つかの実施形態では、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。幾つかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補的テンプレート（インビボもしくはインビトロ）に基づく重合による酵素的合成、組換え細胞またはシステムにおける複製、および化学合成のうちの１つ以上によって調製される。幾つかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１ １０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、またはそれ以上の残基長である。幾つかの実施形態では、核酸は、部分的または全体的に一本鎖であり、幾つかの実施形態では、核酸は、部分的または全体的に二本鎖である。幾つかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、またはコードする配列の相補体である少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。核酸は、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の参照核酸との全体的な配列同一性を有するバリアントを含み得る。幾つかの実施形態では、バリアント核酸は、少なくとも１つの特徴的な配列エレメントを参照核酸と共有しない。幾つかの実施形態では、バリアント核酸は、参照核酸の生物学的活性のうちの１つ以上を共有する。幾つかの実施形態では、核酸バリアントは、参照のそれと同一であるが、特定の位置での少数の配列改変のための核酸配列を有する。幾つかの実施形態では、参照と比較して、バリアント内の残基の約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、または約２％未満が、置換、挿入、または欠失される。幾つかの実施形態では、バリアント核酸は、参照と比較して、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、または約１の置換残基を含む。幾つかの実施形態では、バリアント核酸は、参照に対して特定の生物活性に関与する非常に少数（例えば、約５、約４、約３、約２、もしくは約１未満）の置換、挿入、または欠失された機能的残基を含む。幾つかの実施形態では、バリアント核酸は、参照と比較して、約１５、約１２、約９、約３、または約１以下の付加または欠失を含み、幾つかの実施形態では、付加または欠失を含まない。幾つかの実施形態では、バリアント核酸は、参照と比較して、約２７、約２４、約２１、約１８、約１５、約１２、約９、約６、約３未満、または約９、約６、約３、もしくは約２未満の付加または欠失を含む。
幾つかの実施形態では、タンパク質ペイロード剤（例えば、本明細書に記載される、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、オルガネラタンパク質ペイロード剤、ミトコンドリアタンパク質ペイロード剤、もしくはペルオキシソームタンパク質ペイロード剤、または分泌タンパク質ペイロード剤）は、タンパク質を含む。タンパク質は、アミノ酸以外の部分（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン等）を含み得、かつ／または他の方法で処理もしくは修飾され得る。タンパク質は、時として、例えば、１つ以上のジスルフィド結合によって連結されているか、または他の手段によって会合されている、複数のポリペプチド鎖を含み得る。タンパク質は、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはその両方を含み得、様々なアミノ酸修飾もしくは類似体のいずれかを含み得る。幾つかの実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびそれらの組み合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体フラグメント、それらの生物学的に活性な部分、および／またはそれらの特徴的な部分である。ポリペプチドは、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の参照ポリペプチドとの全体的な配列同一性を有する、そのバリアントを含み得る。幾つかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも１つの特徴的な配列エレメントを参照ポリペプチドと共有しない。幾つかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドの生物学的活性のうちの１つ以上を共有する。幾つかの実施形態では、ポリペプチドバリアントは、参照のそれと同一であるが、特定の位置での少数の配列改変のためのアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態では、参照と比較して、バリアント内の残基の約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、または約２％未満が、置換、挿入、または欠失される。幾つかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照と比較して、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、または約１の置換残基を含む。幾つかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照に対して特定の生物活性に関与する非常に少数（例えば、約５、約４、約３、約２、もしくは約１未満）の置換、挿入、または欠失された機能的を含む。幾つかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照と比較して、約５、約４、約３、約２、または約１以下の付加または欠失を含み、幾つかの実施形態では、付加または欠失を含まない。幾つかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照と比較して、約２５未満、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６未満、および一般に約５、約４、約３、または約２未満の付加または欠失を含む。
シグナル配列
幾つかの実施形態では、タンパク質ペイロード剤（例えば、本明細書に記載される、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、オルガネラタンパク質ペイロード剤、ミトコンドリアタンパク質ペイロード剤、もしくはペルオキシソームタンパク質ペイロード剤、または分泌タンパク質ペイロード剤）は、タンパク質を特定の部位または位置（例えば、細胞表面、核、オルガネラ、ミトコンドリア、もしくはペルオキシソーム）に向けるシグナル配列を含むか、または含まれるタンパク質（もしくはそれをコードする核酸）である。当業者は、ある特定の例において、細胞が、タンパク質を特定の細胞内位置に（例えば、標的細胞の特定のオルガネラまたは表面膜に）標的化するために、少なくとも一時的にタンパク質の一部である（例えば、最初に産生されたとき）アミノ酸モチーフである「選別シグナル」を使用することを理解するであろう。幾つかの実施形態では、選別シグナルは、シグナル配列、シグナルペプチド、またはリーダー配列であり、タンパク質を小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、またはペルオキシソームと呼ばれるオルガネラに向け、幾つかのそのような実施形態では、タンパク質は、次いで原形質膜に送達される。ＵＳ２０１６／０２８９６７４Ａ１を参照されたい。幾つかのそのような実施形態では、次いで、タンパク質が分泌される。幾つかのそのような実施形態では、次いで、タンパク質がリソソームに輸送される。幾つかのそのような実施形態では、次いで、タンパク質がゴルジ装置に輸送される。幾つかのそのような実施形態では、次いで、タンパク質が分泌小胞に輸送され、次いで細胞から分泌され得る。幾つかのそのような実施形態では、次いで、タンパク質がエンドソームに輸送される。幾つかの実施形態では、選別シグナルは、タンパク質を核に向けるシグナル配列、シグナルペプチド、またはリーダー配列（例えば、核局在化配列）であり、幾つかのそのような実施形態では、次いで、タンパク質が核に送達される。
幾つかの実施形態では、ＥＲを標的とするタンパク質は、同時翻訳的である。幾つかの実施形態では、タンパク質転座および膜挿入は、タンパク質合成と結び付けられる。幾つかの実施形態では、シグナル配列は、疎水性であり得る。幾つかの実施形態では、シグナル配列は、部分的に疎水性であり得る。幾つかの実施形態では、シグナル配列は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）によって認識される。幾つかの実施形態では、ＳＲＰは、それがリボソームから出現するときにシグナル配列を認識する。幾つかの実施形態では、新生ペプチド鎖－リボソーム複合体は、ＳＲＰ受容体に結合することによってＥＲを標的とする。幾つかの実施形態では、シグナル配列は、トランスロコンのＳｅｃ６１αサブユニットと相互作用し、膜タンパク質または当該膜タンパク質の部分鎖の転座を開始する。
幾つかの実施形態では、ミトコンドリアを標的とするタンパク質は、ミトコンドリアへの転位を可能にするミトコンドリア局在化配列（ミトコンドリアシグナル配列または前駆配列としても知られている）を介する。正規型ミトコンドリア移入経路は、多くの場合、外膜（ＴＯＭ）複合体のトランスロカーゼのチャネルを構成する、Ｔｏｍ４０タンパク質の存在を必要とする。チャネル自体とは別に、ＴＯＭ複合体には、Ｔｏｍ２０、Ｔｏｍ２２、およびＴｏｍ７０など、入ってくる前駆体タンパク質の認識に関与する多くの受容体タンパク質が含まれている。ＴＯＭ複合体を介した移入は、ＴＯＭ複合体のサブユニットによって曝露される受容体ドメインと前駆体タンパク質との間の相互作用に依存する。ある特定のクラスの前駆体タンパク質は、ＴＯＭ複合体と異なって相互作用する。前駆配列と呼ばれる、切断可能なミトコンドリア標的化シグナルによってミトコンドリアを標的とする前駆体タンパク質は、Ｔｏｍ２２と相互作用する前に、Ｔｏｍ２０によって最初に認識される。内在性標的化シグナルを含むキャリアタンパク質の疎水性前駆体は、Ｔｏｍ７０受容体の存在を必要とする。Ｔｏｍ４０のチャネルを通過する途中で、両方のタイプのタンパク質前駆体が、孔と相互作用するが、Ｔｏｍ４０の相互作用する残基のパターンは、前駆配列とキャリア前駆体で異なる。幾つかの実施形態では、ミトコンドリアタンパク質は、翻訳後または同時翻訳的に輸送される。ミトコンドリア標的化エレメントは、前駆体の長さに沿って散在する個々のまたは複数のユニットとして存在することができ、代替のミトコンドリア選別経路におけるそれらの役割を反映して、配列、構造、および位置に関して著しく変化し得る。「古典的な」ミトコンドリア標的化シグナルは、切断可能なＮ末端の正電荷を帯びた配列であり、前駆配列と呼ばれ、タンパク質をミトコンドリアマトリックス、内膜、場合によってはミトコンドリア膜間腔に指向する。幾つかの実施形態では、ミトコンドリア前駆配列は、１５～５５アミノ酸の間の長さの正味の正電荷を有するαヘリックスセグメントであるＮ末端伸長を含む。しかしながら、外膜、膜間腔、および内膜に存在するミトコンドリアタンパク質の大部分は、古典的な前駆配列を欠いているが、成熟タンパク質内に内部の潜在的な標的化配列を含む。幾つかの実施形態では、ミトコンドリア局在化配列は、ＴＯＭ複合体によって認識される。幾つかの実施形態では、ミトコンドリアタンパク質は、ＴＩＭシャペロンまたはミトコンドリア外膜インサーターゼの助けを借りて、ミトコンドリア外膜に更に移植される。幾つかの実施形態では、ミトコンドリアタンパク質は、ミトコンドリア膜間腔の移入および組み立て機構によって、ミトコンドリア膜間腔に更に輸送される。幾つかの実施形態では、ミトコンドリアタンパク質は、ミトコンドリアマトリックスまたは内膜へのＴＩＭ２３複合体に更に輸送される。幾つかの実施形態では、ミトコンドリアタンパク質は、ミトコンドリアマトリックスまたは内膜へのＴＩＭ２２複合体に更に輸送される。
幾つかの実施形態では、ペルオキシソームへのタンパク質標的化は、ペルオキシソームへの転位を可能にするペルオキシソーム局在化配列（ペルオキシソーム標的化シグナルとしても知られている）を介する。ペルオキシソーム局在化配列には２つの主要なクラスがある。ペルオキシソーム標的化シグナル１は、コンセンサス配列（Ｓ／Ａ／Ｃ）－（Ｋ／Ｒ／Ｈ）－（Ｌ／Ａ）を有るＣ末端トリペプチドを特徴とする。一般的なのは、セリン－リジン－ロイシン（ＳＫＬ）である。ペルオキシソーム標的化配列２は、コンセンサス配列（Ｒ／Ｋ）－（Ｌ／Ｖ／Ｉ）－ＸＸＸＸＸ－（Ｈ／Ｑ）－（Ｌ／Ａ／Ｆ）を有するＮ末端近くに位置するノナペプチドを特徴とし、ここでＸは、任意のアミノ酸である。一部のタンパク質には、これらのシグナルのうちのいずれも含まれておらず、それらの輸送は、ペルオキシソーム標的化シグナルを含むタンパク質との会合に基づいている。幾つかの実施形態では、ペルオキシソーム局在化配列は、ＰＥＸ遺伝子と相互作用する。幾つかの実施形態では、ペルオキシソーム局在化配列は、ＰＥＸ５遺伝子によってコードされるＰＴＳ１受容体と相互作用する。幾つかの実施形態では、ペルオキシソーム局在化配列は、ＰＥＸ７遺伝子によってコードされるＰＴＳ２受容体と相互作用する。幾つかの実施形態では、ペルオキシソーム局在化配列は、「ｍＰＴＳ」モチーフであり、これは、より不十分に定義され、不連続なサブドメインからなり得る。これらのうちの１つは通常、マトリックスに面するタンパク質のループ内（すなわち、膜スパン間）の塩基性アミノ酸（アルギニンおよびリジン）のクラスターである。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、膜貫通タンパク質のコード配列への対象のタンパク質のインフレーム融合、またはタンパク質の膜貫通ドメインもしくは膜アンカリングドメインへの対象のタンパク質のインフレーム融合（例えば、トランスフェリン受容体膜アンカードメインへの融合）を含む。例えば、Ｗｉｎｎｄａｒｄ，Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ．１２：１８８９－１８９９（２００７）を参照されたい。
幾つかの実施形態では、選別シグナルまたはシグナルペプチドは、タンパク質（例えば、膜タンパク質もしくは分泌タンパク質）のＮまたはＣ末端に付加される。Ｇｏｄｅｒ，Ｖ．＆Ｓｐｉｅｓｓ，Ｍ．，Ｔｏｐｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．５０４（３）：８７－９３（２００１）を参照されたい。幾つかの実施形態では、タンパク質は、天然タンパク質である。幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、合成タンパク質である。
幾つかの実施形態では、ミトコンドリアまたはペルオキシソームタンパク質ペイロード剤は、ミトコンドリアもしくはペルオキシソームタンパク質のコード配列への対象のタンパク質のインフレーム融合、またはタンパク質のミトコンドリアもしくはペルオキシソーム局在化配列への対象のタンパク質のインフレーム融合を含む。
幾つかの実施形態では、ミトコンドリアまたはペルオキシソーム局在化配列は、タンパク質（例えば、ミトコンドリアもしくはペルオキシソームタンパク質）のＮまたはＣ末端に付加される。幾つかの実施形態では、タンパク質は、天然タンパク質である。幾つかの実施形態では、ミトコンドリアまたはペルオキシソームタンパク質は、合成タンパク質である。
幾つかの実施形態では、シグナルは、転写物の翻訳が終止コドンに到達した後にのみリボソームから出現する。幾つかの実施形態では、膜タンパク質の挿入は、翻訳後である。
幾つかの実施形態では、シグナル配列は、表６から選択される。幾つかの実施形態では、シグナル配列は、表６から選択される配列を含む。幾つかの実施形態では、表６のシグナル配列は、タンパク質、例えば、膜タンパク質または分泌タンパク質のＮ末端に付加され得る。幾つかの実施形態では、表６のシグナル配列は、タンパク質、例えば、膜タンパク質または分泌タンパク質のＣ末端に付加され得る。当業者は、以下のシグナル配列が、それぞれの天然に会合したタンパク質での使用に限定されないことを理解するであろう。
Figure 2022513040000066
Figure 2022513040000067
Figure 2022513040000068
Figure 2022513040000069
Figure 2022513040000070
Figure 2022513040000071
Figure 2022513040000072
幾つかの実施形態では、核を標的とするタンパク質は、核膜孔複合体を介した核エンベロープによる転座を可能にする核局在化配列（核局在化シグナルとしても知られる）を介する。核膜孔複合体は、ヌクレオポリンで構成されている。ヌクレオポリンは、カリオフェリンとして知られる輸送分子と相互作用する。カリオフィンは、核局在化配列を含むタンパク質に結合し、核膜孔複合体を越えてタンパク質を輸送する。幾つかの実施形態では、核局在化配列は、塩基性アミノ酸の１つ以上の短い（例えば、５０個未満のアミノ酸残基）配列からなる。幾つかの実施形態では、核局在化配列は、リジンまたはアルギニンの１つ以上の短い（例えば、５０個未満のアミノ酸残基）配列からなる。幾つかの実施形態では、核局在化配列は、単節型または双節型である。幾つかの実施形態では、核局在化配列は、タンパク質ペイロード剤のＮまたはＣ末端にある。幾つかの実施形態では、核局在化配列は、タンパク質ペイロード剤のアミノ酸配列の中央にあり、タンパク質表面に露出している。幾つかの実施形態では、核局在化配列は、カリオフィンによって認識される。幾つかの実施形態では、核局在化配列は、１つ以上のカリオフェリンと相互作用する。幾つかの実施形態では、カリオフィンは、リボソームから出現するときに核局在化配列を認識する。幾つかの実施形態では、カリオフィンは、完全に翻訳されたタンパク質上の核局在化配列を認識する。
幾つかの実施形態では、核タンパク質ペイロード剤は、核タンパク質のコード配列への対象のタンパク質のインフレーム融合、またはタンパク質の核局在化配列への対象のタンパク質のインフレーム融合を含む。
幾つかの実施形態では、核局在化配列は、タンパク質（例えば、核タンパク質）のＮまたはＣ末端に付加される。幾つかの実施形態では、タンパク質は、天然タンパク質である。幾つかの実施形態では、核タンパク質は合成タンパク質である。
幾つかの実施形態では、核局在化配列は、表６－１から選択される。幾つかの実施形態では、核局在化配列は、表６－１から選択される配列を含む。幾つかの実施形態では、表６－１の核局在化配列は、タンパク質、例えば、核タンパク質のＮ末端に付加され得る。幾つかの実施形態では、表６－１のシグナル配列は、タンパク質、例えば、核タンパク質のＣ末端に付加され得る。当業者は、以下のシグナル配列が、それぞれの天然に会合したタンパク質での使用に限定されないことを理解するであろう。幾つかの実施形態では、核局在化配列は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１５／０２４６１３９の表６に列挙されたタンパク質からの核局在化配列として定義される。幾つかの実施形態では、核局在化シグナルは、配列番号１２８～５０７および６０５～６２６のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列を有する。
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Figure 2022513040000090
幾つかの実施形態では、核タンパク質ペイロード剤は、標的タンパク質または標的核酸を核に局在化する。幾つかの実施形態では、核タンパク質ペイロード剤は、核局在化配列および標的結合ドメインを含むタンパク質から構成される。幾つかの実施形態では、標的結合ドメインは、抗体、ナノボディ、ｓｃＦｖ、または任意の他のタンパク質結合ドメインである。幾つかの実施形態では、標的結合ドメインは、核酸結合ドメインである。幾つかの実施形態では、核タンパク質ペイロード剤は、核タンパク質ペイロード剤を有しない細胞上の標的タンパク質または標的核酸の核における局在化を増加させる。
幾つかの実施形態では、ミトコンドリアまたはペルオキシソーム局在化配列は、表６－２から選択される。幾つかの実施形態では、核局在化配列は、表６－２から選択される配列を含む。幾つかの実施形態では、表６－２のミトコンドリアまたはペルオキシソーム局在化配列は、タンパク質、例えば、ミトコンドリアまたはペルオキシソームタンパク質のＮ末端に付加され得る。幾つかの実施形態では、表６－２のシグナル配列は、タンパク質、例えば、ミトコンドリアまたはペルオキシソームタンパク質のＣ末端に付加され得る。当業者は、以下のシグナル配列が、それぞれの天然に会合したタンパク質での使用に限定されないことを理解するであろう。
Figure 2022513040000091
Figure 2022513040000092
Figure 2022513040000093
Figure 2022513040000094
Figure 2022513040000095
Figure 2022513040000096
膜タンパク質ペイロード剤
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、細胞の膜表面上（例えば、原形質膜の表面上）に自然に見出されるタンパク質（またはそれをコードする核酸）である。
例示的な膜タンパク質（および／またはそれらをコードする核酸）は、例えば、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号に見出すことができ、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤（および／もしくはそれをコードする核酸）は、米国特許公開番号２０１６／０２８９６７４の配列番号８１４４～１６１３１のうちのいずれか１つに、またはその機能的フラグメントに示されるような配列を有する。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、米国特許公開第２０１６／０２８９６７４号の配列番号８１４４～１６１３１のうちのいずれか１つに示されるような原形質膜タンパク質（それをコードする核酸）、あるいはの原形質膜タンパク質のフラグメント、バリアント、もしくはホモログ（またはそれをコードする核酸）である。
幾つかの実施形態では、本開示に関連する膜タンパク質は、治療用膜タンパク質である。幾つかの実施形態では、本開示に関連する膜タンパク質は、細胞表面受容体、膜輸送タンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質、孔形成タンパク質［例えば、毒素タンパク質］等）、膜酵素、および／もしくは細胞接着タンパク質などの能動的もしくは受動的輸送タンパク質）であるか、またはそれらを含む。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、単一のスパン膜タンパク質である。幾つかの実施形態では、１回膜貫通型膜タンパク質は、細胞質Ｎ末端および細胞質外Ｃ末端（Ｎｃｙｔ／Ｃｅｘｏ）または反対の向き（Ｎｅｘｏ／Ｃｃｙｔ）を有する最終トポロジーを想定することができる。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、Ｎ末端切断可能シグナル配列および停止転移配列（Ｎｅｘｏ／Ｃｃｙｔ）を含むＩ型膜タンパク質である。幾つかの実施形態では、シグナルは、Ｃ末端にある。幾つかの実施形態では、Ｎ末端切断可能シグナル配列は、新生ペプチドをＥＲに標的化する。幾つかの実施形態では、Ｎ末端切断可能シグナル配列は、典型的には７～１５の主に無極性残基の疎水性ストレッチを含む。幾つかの実施形態では、Ｉ型膜タンパク質は、ポリペプチドのさらなる転座を停止し、膜貫通アンカーとして作用する透過停止配列を含む。幾つかの実施形態では、透過停止配列は、約２０個の疎水性残基のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、Ｉ型膜タンパク質のＮ末端は細胞外であり、Ｃ末端は細胞質である。幾つかの実施形態では、Ｉ型膜タンパク質は、グリコホリンまたはＬＤＬ受容体であり得る。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、シグナルアンカー配列（Ｎ ｃｙｔ／Ｃｅｘｏ）を含むＩＩ型膜タンパク質である。幾つかの実施形態では、シグナルは、Ｃ末端にある。幾つかの実施形態では、シグナルアンカー配列は、ＩＩ型膜タンパク質の挿入およびアンカリングの両方に関与する。幾つかの実施形態では、シグナルアンカー配列は、約１８～２５の主に無極性の残基を含む。幾つかの実施形態では、シグナルアンカー配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位を欠いている。幾つかの実施形態では、シグナルアンカー配列は、ポリペプチド鎖の内部に位置付けられ得る。幾つかの実施形態では、シグナルアンカー配列は、細胞膜を横切るタンパク質のＣ末端の転座を誘導する。幾つかの実施形態では、ＩＩ型膜タンパク質のＣ末端は細胞外であり、Ｎ末端は細胞質である。幾つかの実施形態では、ＩＩ型膜タンパク質は、トランスフェリン受容体またはガラクトシルトランスフェラーゼ受容体であり得る。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、逆シグナルアンカー配列（Ｎ ｅｘｏ／Ｃｃｙｔ）を含むＩＩＩ型膜タンパク質である。幾つかの実施形態では、シグナルは、Ｎ末端にある。幾つかの実施形態では、逆シグナルアンカー配列は、ＩＩＩ型膜タンパク質の挿入およびアンカリングの両方に関与する。幾つかの実施形態では、逆シグナルアンカー配列は、約１８～２５の主に無極性の残基を含む。幾つかの実施形態では、シグナルアンカー配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位を欠いている。幾つかの実施形態では、シグナルアンカー配列は、ポリペプチド鎖の内部に位置付けられ得る。幾つかの実施形態では、シグナルアンカー配列は、細胞膜を横切るタンパク質のＮ末端の転座を誘導する。幾つかの実施形態では、ＩＩＩ型膜タンパク質のＮ末端は細胞外であり、Ｃ末端は細胞質である。幾つかの実施形態では、Ｉ型膜タンパク質は、シナプトガミン、ニューレグリン、またはシトクロムＰ－４５０であり得る。
幾つかの実施形態では、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型膜タンパク質は、ＳＲＰ、ＳＲＰ受容体、およびＳｅｃ６１トランスロコンを含む細胞経路を介して膜化された細胞に挿入される。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質は、主に細胞質ゾルに曝露され、Ｃ末端シグナル配列によって膜にアンカーされているが、これはＳＲＰと相互作用しない。幾つかの実施形態では、タンパク質は、シトクロムｂ５、またはＳＮＡＲＥタンパク質（例えば、シナプトブレビン）である。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、ペイロード膜タンパク質を細胞膜に局在化させるシグナル配列を含む。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、核酸が、核酸によってコードされるペイロード膜タンパク質を細胞膜に局在化するシグナル配列をコードする核酸である。
（ｉ）インテグリン膜タンパク質のペイロード
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、インテグリンまたはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表７から選択されるインテグリン、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表７のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表７の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。
Figure 2022513040000097
（ｉｉ）イオンチャネルタンパク質
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、イオンチャネルタンパク質またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表８から選択されるイオンチャネルタンパク質、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表８のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表８の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。
Figure 2022513040000098
Figure 2022513040000099
Figure 2022513040000100
Figure 2022513040000101
Figure 2022513040000102
Figure 2022513040000103
（ｉｉｉ）孔形成タンパク質
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、孔形成タンパク質またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、孔形成タンパク質は、溶血素またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であり得る。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表９から選択される溶血素、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、孔形成タンパク質は、コリシンまたはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であり得る。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１０から選択されるコリシン、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。
実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表９のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表９の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。
実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１０のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１０の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。
Figure 2022513040000104
Figure 2022513040000105
（ｉｖ）Ｔｏｌｌ様受容体
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、トール様受容体（ＴＬＲ）またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１１から選択されるトール様受容体、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１１のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１１の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。
Figure 2022513040000106
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、インターロイキン受容体またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１２から選択されるインターロイキン受容体、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１２のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１２の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。
（ｖ）インターロイキン受容体のペイロード
Figure 2022513040000107
Figure 2022513040000108
Figure 2022513040000109
（ｖｉ）細胞接着タンパク質のペイロード
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、細胞接着タンパク質またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１３から選択される細胞接着タンパク質、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、細胞接着タンパク質は、カドヘリンまたはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であり得る。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１４から選択されるカドヘリン、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、細胞接着タンパク質は、セレクチンまたはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であり得る。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１５から選択されるセレクチン、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、細胞接着タンパク質は、ムチンまたはその機能的フラグメント、バリアント、またはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であり得る。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１６から選択されるムチン、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。
実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１３のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１３の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。
実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１４のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１４の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。
実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１５のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１５の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。
実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１６のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１６の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。
Figure 2022513040000110
Figure 2022513040000111
Figure 2022513040000112
Figure 2022513040000113
Figure 2022513040000114
（ｖｉｉ）輸送タンパク質ペイロード
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、輸送タンパク質またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１７から選択される輸送タンパク質、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１７のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表１７の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。
Figure 2022513040000115
Figure 2022513040000116
Figure 2022513040000117
Figure 2022513040000118
Figure 2022513040000119
Figure 2022513040000120
Figure 2022513040000121
（ｖｉｉｉ）キメラ抗原受容体ペイロード
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、ＣＡＲ、例えば、第一世代のＣＡＲもしくは第一世代のＣＡＲをコードする核酸であるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、第一世代のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。幾つかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流のシグナル伝達を媒介する。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、第二世代のＣＡＲまたは第二世代のＣＡＲをコードする核酸であるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、第二世代のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および２つのシグナル伝達ドメインを含む。幾つかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流のシグナル伝達を媒介する。幾つかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。幾つかの実施形態では、共刺激ドメインは、サイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、およびまたはＴ細胞活性化中のＣＡＲ Ｔ細胞持続性を増強する。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、第三世代のＣＡＲまたは第三世代のＣＡＲをコードする核酸であるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、第三世代のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む。幾つかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流のシグナル伝達を媒介する。幾つかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。幾つかの実施形態では、共刺激ドメインは、サイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、およびまたはＴ細胞活性化中のＣＡＲ Ｔ細胞持続性を増強する。幾つかの実施形態では、第三世代のＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つの共刺激ドメインは、同じではない。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、第四世代のＣＡＲまたは第四世代のＣＡＲをコードする核酸であるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、第四世代のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも２つ、３つ、または４つのシグナル伝達ドメインを含む。幾つかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流のシグナル伝達を媒介する。幾つかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。幾つかの実施形態では、共刺激ドメインは、サイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、およびまたはＴ細胞活性化中のＣＡＲ Ｔ細胞持続性を増強する。
幾つかの実施形態では、第一、第二、第三、または第四世代のＣＡＲは、ＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを更に含む。幾つかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含むＣＡＲを含む標的細胞に対して内因性または外因性である。幾つかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、炎症誘発性サイトカインをコードする。幾つかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＮＦ、もしくはＩＦＮ－γ、またはその機能的フラグメントをコードする。幾つかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子またはその機能的ドメインもしくはフラグメントであるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子またはその機能的ドメインもしくはフラグメントであるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、転写因子またはその機能的ドメインもしくはフラグメントは、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、ＮＦ－ｋＢ、またはそれらの機能的ドメインもしくはフラグメントであるか、またはそれを含む。例えば、Ｚｈａｎｇ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５：２２（２０１７）、ＷＯ２０１６／１２６６０８、Ｓｈａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｍａｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｓｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｊａｎ ２７，２０１７，３７（１）を参照されたい。
（ａ）ＣＡＲ抗原結合ドメイン
幾つかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、抗体もしくはその抗原結合部分であるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖもしくはＦａｂであるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）抗体、ＣＤ１６３抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ－４Ｒａ抗体、Ｓｃａ－１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ－１抗体、またはトランスフェリン受容体抗体のｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。
幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインは、細胞の細胞表面抗原に結合する。幾つかの実施形態では、細胞表面抗原は、１つのタイプの細胞に特徴的である。幾つかの実施形態では、細胞表面抗原は、２つ以上のタイプの細胞に特徴的である。
幾つかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、Ｔ細胞に特徴的な細胞表面抗原に結合する。幾つかの実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、細胞表面受容体、膜輸送タンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質、孔形成タンパク質等の能動もしくは受動輸送タンパク質）、膜貫通受容体、膜酵素、および／またはＴ細胞に特徴的な細胞接着タンパク質であり得る。幾つかの実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体であり得る。
幾つかの実施形態では、Ｔ細胞に特徴的な抗原は、Ｔ細胞受容体であり得る。幾つかの実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＴＦ２、ＢＣＬ１０、ＣＡＬＭ１、ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３δ）、ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３ε）、ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３γ）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）、ＥＬＫ１、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＥＲＫ２、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＧＲＡＰ２（ＧＡＤＳ）、ＧＲＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＨＲＡＳ、ＩＫＢＫＡ（ＣＨＵＫ）、ＩＫＢＫＢ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＢＫＧ（ＮＥＭＯ）、ＩＬ２、ＩＴＰＲ１、ＩＴＫ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ２、ＬＡＴ、ＬＣＫ、ＭＡＰ２Ｋ１（ＭＥＫ１）、ＭＡＰ２Ｋ２（ＭＥＫ２）、ＭＡＰ２Ｋ３（ＭＫＫ３）、ＭＡＰ２Ｋ４（ＭＫＫ４）、ＭＡＰ２Ｋ６（ＭＫＫ６）、ＭＡＰ２Ｋ７（ＭＫＫ７）、ＭＡＰ３Ｋ１（ＭＥＫＫ１）、ＭＡＰ３Ｋ３、ＭＡＰ３Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ５、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＡＰ３Ｋ１４（ＮＩＫ）、ＭＡＰＫ８（ＪＮＫ１）、ＭＡＰＫ９（ＪＮＫ２）、ＭＡＰＫ１０（ＪＮＫ３）、ＭＡＰＫ１１（ｐ３８β）、ＭＡＰＫ１２（ｐ３８γ）、ＭＡＰＫ１３（ｐ３８δ）、ＭＡＰＫ１４（ｐ３８α）、ＮＣＫ、ＮＦＡＴ１、ＮＦＡＴ２、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲＡＳ、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＫ４、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＰＩＫ３Ｃ３（ＶＰＳ３４）、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＫＣＡ、ＰＫＣＢ、ＰＫＣＭ、ＰＫＣＱ、ＰＬＣＹ１、ＰＲＦ１（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、ＰＴＥＮ、ＲＡＣ１、ＲＡＦ１、ＲＥＬＡ、ＳＤＦ１、ＳＨＰ２、ＳＬＰ７６、ＳＯＳ、ＳＲＣ、ＴＢＫ１、ＴＣＲＡ、ＴＥＣ、ＴＲＡＦ６、ＶＡＶ１、ＶＡＶ２、またはＺＡＰ７０であり得る。
幾つかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、癌に特徴的な抗原に結合する。幾つかの実施形態では、癌に特徴的な抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ関連受容体、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８、およびＦＧＦ２１を含む）血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、およびＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体およびＥｐｈ受容体ファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、およびＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ－１、ＣＩＣ－２、ＣＩＣ－４、ＣＩＣ－５、ＣＩＣ－７、ＣＩＣ－Ｋａ、ＣＩＣ－Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣトランスポーター、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン－１－リン酸受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通タンパク質、マルチスパン膜貫通タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ。Ｔ細胞アルファ鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１６３、Ｆ４／８０、ＩＬ－４Ｒａ、Ｓｃａ－１、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ－１、トランスフェリン受容体、ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ４０、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｆｈ、古典的Ｔｒｅｇ、ＦｏｘＰ３＋；Ｔｒ１；Ｔｈ３；Ｔｒｅｇ１７；ＴＲＥＧ；ＣＤＣＰ１、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、炭酸アンヒドラーゼＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２）、Ｌｅｗｉｓ－γ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ－ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ－１、ＢＡＦＦ、ＨＤＡＣ、ＡＢＬ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ－１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、またはＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体α（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ－１３Ｒａ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３Ｒα１、Ｌ１－ＣＡＭ、ＴｎＡｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン－１１受容体ａ（ＩＬ－１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、テロメラーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰＩＢＩ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、新生抗原、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ、あるいはそれらの抗原性フラグメントまたは抗原性部分から選択される。
幾つかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、感染症（例えば、ウイルス感染または細菌感染）に特徴的な抗原に結合する。幾つかの実施形態では、抗原は、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ））、ヒトＴ－リンパ球栄養性ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、エプスタイン・バーウイルス、ＣＭＶ、ヒトパピローマウイルスから選択される感染症に特徴的である。幾つかの実施形態では、感染症に特徴的な抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体から選択される。幾つかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、感染症に特徴的な抗原に結合し、抗原は、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ｇｐｌ２０、またはＨＩＶ－１ Ｅｎｖ上のＣＤ４誘導性エピトープから選択される。例えば、ＷＯ２０１５／０７７７８９（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。幾つかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、ＣＤ４またはそのＨＩＶ結合フラグメントを含む。
幾つかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、自己免疫または炎症性障害に特徴的な抗原に結合する。幾つかの実施形態では、抗原は、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ループス、関節炎、免疫複合体糸球体腎炎、グッドパスチャー、ブドウ膜炎、肝炎、全身性硬化症または強皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、寒冷凝集素疾患、尋常性ペンフィガス、グレイブス病、自己免疫性溶血性貧血、血小板減少症Ａ、原発性シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、神経骨髄性視神経症、エバン症候群、ＩｇＭ媒介性神経障害、サイログロブリン血症、皮膚筋炎、特発性血小板減少症、強直性脊椎炎、水疱性類天疱瘡、後天性血管浮腫、慢性蕁麻疹、抗リン脂質脱髄性多発神経障害、および自己免疫性血小板減少症または好中球減少症または純粋な赤血球形成不全から選択され、一方、同種免疫疾患の例示的な非限定的な例には、同種感作（例えば、Ｂｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１５（４）：９３１－４１を参照）または造血器もしくは実質臓器移植からの異種感作、輸血、胎児同種感作を伴う妊娠、新生児同種免疫性血小板減少症、新生児溶血性疾患、酵素またはタンパク質補充療法、血液製品、および遺伝子治療で治療される先天性もしくは後天性欠損障害の置換により起こり得るような外来抗原に対する感作から選択される自己免疫性または炎症性障害に特徴的である。幾つかの実施形態では、自己免疫または炎症性障害に特徴的な抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体から選択される。幾つかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、Ｂ細胞、形質細胞、または形質芽細胞上に発現されるリガンドに結合する。幾つかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、自己免疫または炎症性障害に特徴的な抗原に結合し、抗原は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２８、ＴＮＦ、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ、ＺＡＰ－７０、ＬＦＡ－１、ＣＤ３γ、ＣＤ５、またはＣＤ２から選択される。ＵＳ２００３／００７７２４９、ＷＯ２０１７／０５８７５３、ＷＯ２０１７／０５８８５０（それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（ｂ）ＣＡＲ膜貫通ドメイン
幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲ膜貫通ドメインは、少なくともＴ細胞受容体のα、β、またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはその機能的バリアントの膜貫通領域を含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくともＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、およびＦＧＦＲ２Ｂ、またはその機能的バリアントの膜貫通領域を含む。
（ｃ）ＣＡＲシグナル伝達ドメイン
幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、ＰＤＣＤ６）、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－α、ＴＮＦＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、イカロス、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＣＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ３ζドメイン、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはそれらの機能的バリアントのうちの１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインであるシグナル伝達ドメインを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、第２の共刺激ドメインを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも３つの共刺激ドメインを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドのうちの１つ以上から選択される共刺激ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアントを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、および（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント；（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、またはその機能的バリアント；および（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント；（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント；（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアント；および（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。
（ｄ）ＣＡＲスペーサー
幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上のスペーサーを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサーを含む。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間にスペーサーを含む。
（ｅ）ＣＡＲ膜タンパク質ペイロード剤
本明細書に記載のＣＡＲに加えて、様々なキメラ抗原受容体およびそれをコードするヌクレオチド配列が、当該技術分野で知られており、本明細書に記載のインビボおよびインビトロでの標的細胞のフソソーム送達および再プログラミングに適している。例えば、ＷＯ２０１３／０４０５５７、ＷＯ２０１２／０７９０００、ＷＯ２０１６／０３０４１４、Ｓｍｉｔｈ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
幾つかの実施形態では、ＣＡＲまたはＣＡＲをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ－ＭＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）であるか、またはそれを含む膜タンパク質ペイロード剤を含むフソソームが、標的細胞に送達される。幾つかの実施形態では、標的細胞は、エフェクター細胞、例えば、１つ以上のＦｃ受容体を発現し、１つ以上のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞である。幾つかの実施形態では、標的細胞は、限定されないが、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、大きな顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、天然キラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球（例えば、Ｔ細胞）、γδＴ細胞、Ｂリンパ球（例えば、Ｂ細胞）のうちの１つ以上を含み得、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むがこれらに限定されない任意の生物に由来し得る。
核タンパク質ペイロード剤
幾つかの実施形態では、ペイロード剤は、核タンパク質ペイロード剤またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、核タンパク質ペイロード剤は、表１７－１から選択されるタンパク質、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、核タンパク質ペイロード剤は、表１７－１のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、核タンパク質ペイロード剤は、表１７－１の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。幾つかの実施形態では、ペイロード剤は、核小体もしくは核体に局在するタンパク質、またはそれをコードする核酸であるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、ペイロード剤は、構造タンパク質、転写活性化因子、転写抑制因子、エピジェネティック修飾因子、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ＤＮＡ修飾酵素、ＲＮＡスプライシング因子、もしくはゲノムホメオスタシスタンパク質、またはそれをコードする核酸であるか、またはそれを含む。
Figure 2022513040000122
Figure 2022513040000123
Figure 2022513040000124
オルガネラタンパク質ペイロード剤
幾つかの実施形態では、ペイロード剤は、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、表１７－２から選択されるタンパク質、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、表１７－２のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９９％同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、表１７－２の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％同一の配列を有する核酸を含む。実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、例えば、本明細書に記載されるように（例えば、表１７－２に列挙されるように）、細胞内コンパートメントに局在化する。実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、小胞体、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、ゴルジ装置、脂肪滴、原形質膜、ストレス顆粒、または細胞骨格に局在化する。実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、例えば、本明細書に記載されるように（例えば、表１７－２に列挙されるように）、細胞内コンパートメントの局在化シグナルを含む。実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、小胞体、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、ゴルジ装置、脂肪滴、原形質膜、ストレス顆粒、または細胞骨格のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、もしくは４つ）の局在化シグナルを含む。
Figure 2022513040000125
Figure 2022513040000126
Figure 2022513040000127
Figure 2022513040000128
分泌ペイロード剤、例えば、分泌タンパク質ペイロード剤
ペイロード剤、例えば、タンパク質ペイロード剤もまた、分泌の標的にすることができる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、ＥＲでの翻訳後、ペイロードをオルガネラ（例えば、ゴルジ装置、分泌小胞）の内腔に標的化することができる。幾つかの実施形態では、分泌タンパク質ペイロード剤は、分泌タンパク質またはそれをコードする核酸を含む。
コンドリソーム
幾つかの実施形態では、フソソームまたはフソソーム組成物は、コンドリソームまたはコンドリソーム調製物を更に含む。幾つかの実施形態では、フソソームまたはフソソーム組成物は、ミトコンドリアの細胞源に由来する修飾されたコンドリソーム調製物を含む。幾つかの実施形態では、フソソームまたはフソソーム組成物は、外因性タンパク質を発現するコンドリソーム調製物を含む。幾つかの実施形態では、外因性タンパク質は、前述のミトコンドリアに対して外因性である。幾つかの実施形態では、外因性タンパク質は、前述のミトコンドリアの細胞源に対して外因性である。コンドリソーム、コンドリソーム調製物、方法、および使用を含む追加の特徴および実施形態は、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６４２５１号に記載されているように、本発明によって企図されている。
免疫原性
本明細書に記載の態様のうちのいずれかの実施形態では、フソソーム組成物は、実質的に非免疫原性である。免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように定量化することができる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、実質的に非免疫原性であるか、または実質的に非免疫原性であることが知られている細胞、例えば、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、または網膜色素上皮細胞の膜対称性を有する。幾つかの実施形態では、フソソームは、本明細書に記載のアッセイによって測定して、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、または網膜色素上皮細胞の免疫原性よりも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以下高い免疫原性を有する。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、高レベルの免疫抑制剤を含む。幾つかの実施形態では、高レベルは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍である。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞に存在しない免疫抑制物質を含む。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、低下したレベルの免疫活性化剤を含む。幾つかの実施形態では、低減したレベルは、参照細胞と比べて、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。幾つかの実施形態では、免疫活性化剤は、フソソームに実質的に存在しない。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、例えば、プロテオミクスによって測定されるように、ソース細胞、例えば、実質的に非免疫原性のソース細胞の組成と実質的に類似する組成を有する膜を含む。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ソース細胞の膜タンパク質の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を含む膜を含む。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ソース細胞の膜上の膜タンパク質の発現レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％で発現される膜タンパク質を含む膜を含む。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物、またはフソソーム組成物が由来するソース細胞は、以下の特徴のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上を有する：
ａ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＨｅＬａ細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｂ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、または本明細書に記載の参照細胞と比較して、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７－Ｈ３、またはＢ７－Ｈ４を含むが、これらに限定されない１つ以上の共刺激タンパク質の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｃ．マクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質（例えば、ＣＤ４７）の発現、例えば、本明細書に記載の方法によって検出可能な発現、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、マクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質（例えば、ＣＤ４７）の１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍超、またはそれ以上多い発現、
ｄ．可溶性免疫抑制サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０）の発現、例えば、本明細書に記載の方法によって検出可能な発現、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、可溶性免疫抑制サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０）の１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍超、またはそれ以上多い発現、
ｅ．可溶性免疫抑制タンパク質（例えば、ＰＤ－Ｌ１）の発現、例えば、本明細書に記載の方法によって検出可能な発現、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、可溶性免疫抑制タンパク質（例えば、ＰＤ－Ｌ１）の１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍超、またはそれ以上多い発現、
ｆ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＵ－２６６細胞と比較して、可溶性免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γもしくはＴＮＦ－ａ）の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｇ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＡ５４９細胞もしくはＳＫ－ＢＲ－３細胞と比較して、内因性免疫刺激抗原（例えば、Ｚｇ１６もしくはＨｏｒｍａｄ１）の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｈ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、例えば、本明細書に記載の方法によって検出可能な発現、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇの発現、
ｉ．例えば、ＮＫ細胞の活性化を抑制するように作用する、例えば、シアル酸を含む、表面グリコシル化プロファイル、
ｊ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＴＣＲα／βの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｋ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＨｅＬａ細胞と比較して、ＡＢＯ結合基の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｌ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、マイナー組織適合抗原（ＭＨＡ）の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、あるいは
ｍ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、ミトコンドリアＭＨＡの１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満、もしくはそれ以下の発現を有するか、または検出可能なミトコンドリアＭＨＡを有しない。
実施形態では、共刺激タンパク質は、４－１ＢＢ、Ｂ７、ＳＬＡＭ、ＬＡＧ３、ＨＶＥＭ、またはＬＩＧＨＴであり、参照細胞は、ＨＤＬＭ－２である。幾つかの実施形態では、共刺激タンパク質はＢＹ－Ｈ３であり、参照細胞はＨｅＬａである。幾つかの実施形態では、共刺激タンパク質は、ＩＣＯＳＬまたはＢ７－Ｈ４であり、参照細胞は、ＳＫ－ＢＲ－３である。幾つかの実施形態では、共刺激タンパク質は、ＩＣＯＳまたはＯＸ４０であり、参照細胞はＭＯＬＴ－４である。幾つかの実施形態では、共刺激タンパク質はＣＤ２８であり、参照細胞はＵ－２６６である。幾つかの実施形態では、共刺激タンパク質は、ＣＤ３０ＬまたはＣＤ２７であり、参照細胞はＤａｕｄｉである。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、免疫系、例えば、自然免疫系による免疫原性応答を実質的に誘発しない。実施形態では、免疫原性応答は、例えば、本明細書に記載されるように、定量化することができる。幾つかの実施形態では、自然免疫系による免疫原性応答は、自然免疫細胞による応答を含み、限定されないが、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、マスト細胞、またはγ／δＴ細胞が含まれる。幾つかの実施形態では、自然免疫系による免疫原性応答は、可溶性血液成分および膜結合成分を含む補体系による応答を含む。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、免疫系、例えば、適応免疫系による免疫原性応答を実質的に誘発しない。実施形態では、免疫原性応答は、例えば、本明細書に記載されるように、定量化することができる。幾つかの実施形態では、適応免疫系による免疫原性応答は、限定されるものではないが、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、およびもしくはγ－δＴ細胞）、またはＢリンパ球の数もしくは活性の変化、例えば、増加を含む、適応免疫細胞による免疫原性応答を含む。幾つかの実施形態では、適応免疫系による免疫原性応答は、限定されるものではないが、サイトカインまたは抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤ）の数または活性の変化、例えば、増加を含む、可溶性血液成分のレベルの増加を含む。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、免疫原性を低減するように修飾されている。免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように定量化することができる。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞よりも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％未満の免疫原性を有する。
本明細書に記載される態様のうちのいずれかの幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ソース細胞、例えば、修飾ゲノムを有する、例えば、免疫原性を低減する（例えば、低下させる）ように本明細書に記載の方法を使用して修飾された哺乳動物細胞に由来する。免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように定量化することができる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、
ａ．ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、またはＭＨＡ、
ｂ．限定されないが、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７－Ｈ３、またはＢ７－Ｈ４を含む、１つ以上の共刺激タンパク質、
ｃ．可溶性免疫刺激サイトカイン、例えば、ＩＦＮ－γまたはＴＮＦ－ａ、
ｄ．内因性免疫刺激抗原、例えば、Ｚｇ１６またはＨｏｒｍａｄ１、
ｅ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、
ｆ．ＡＢＯ式血液型をコードする遺伝子、例えばＡＢＯ遺伝子、
ｇ．免疫活性化を促進する転写因子、例えば、ＮＦｋＢ、
ｈ．ＭＨＣ発現を制御する転写因子、例えば、クラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、Ｘｂｏｘ５の調節因子（ＲＦＸ５）、ＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸＡＰ）、またはＲＦＸアンキリン反復（ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＢとしても知られている）、あるいは
ＴＡＰタンパク質、例えば、ＭＨＣクラスＩの発現を低下させるＴＡＰ２、ＴＡＰ１、ＴＡＰＢＰ、のうちの１、２、３、４、５、６、７つ、またはそれ以上を枯渇した、例えば、ノックアウトを有する、哺乳動物細胞に由来する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、免疫抑制物質、例えば、
ａ．マクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質、例えばＣＤ４７、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、増加したＣＤ４７の発現、
ｂ．可溶性免疫抑制性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０、例えば、他の点ではソース細胞と同様である未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して増加したＩＬ－１０の発現、
ｃ．可溶性免疫抑制タンパク質、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはＢＴＬＡ、例えば、参照細胞、例えば、他の点では細胞ソースと同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、増加した免疫抑制タンパク質の発現、あるいは
ｄ．免疫寛容原性タンパク質、例えば、ＩＬＴ－２もしくはＩＬＴ－４アゴニスト、例えば、ＨＬＡ－ＥもしくはＨＬＡ－Ｇ、または任意の他の内因性ＩＬＴ－２もしくはＩＬＴ－４アゴニスト、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して増加したＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬＴ－２、またはＩＬＴ－４の発現のうちの１、２、３つ、またはそれ以上の発現の増加をもたらす遺伝子修飾を伴うソース細胞に由来する（例えば、遺伝子修飾の前に、細胞は因子を発現しなかった）。
幾つかの実施形態では、増加した発現レベルは、参照細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い。
幾つかの実施形態では、フソソームは、免疫活性化物質、例えば、
ａ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＨｅＬａ細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｂ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、または本明細書に記載される参照細胞と比較して、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７－Ｈ３、またはＢ７－Ｈ４を含むが、これらに限定されない１つ以上の共刺激タンパク質の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｃ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＵ－２６６細胞と比較して、可溶性免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γもしくはＴＮＦ－ａ）の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｄ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＡ５４９細胞もしくはＳＫ－ＢＲ－３細胞と比較して、内因性免疫刺激抗原（例えば、Ｚｇ１６もしくはＨｏｒｍａｄ１）の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｅ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｆ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＨｅＬａ細胞と比較して、ＡＢＯ式血液型の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｇ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、免疫活性化を促進する転写因子、例えば、ＮＦｋＢの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、
ｈ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＭＨＣ発現を制御する転写因子、例えば、クラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、Ｘｂｏｘ５（ＲＦＸ５）の調節因子、ＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸＡＰ）、またはＲＦＸアンキリン反復（ＲＦＸＡＮＫ；ＲＦＸＢとしても知られる）の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現、あるいは
ｉ．参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはＨｅＬａ細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩの発現を低減するＴＡＰタンパク質、例えば、ＴＡＰ２、ＴＡＰ１、またはＴＡＰＢＰの５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満、またはそれ以下の発現のうちの１、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれ以上の発現を減少させるように修飾されたソース細胞に由来する。
幾つかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ発現を減少させるようにｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスを使用して修飾された哺乳動物細胞、例えば、間葉系幹細胞は、未修飾細胞、例えば、修飾されていない間葉系幹細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩの発現が少ない。幾つかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇの発現を増加させるためにＨＬＡ－Ｇを発現するレンチウイルスを使用して修飾された哺乳動物細胞、例えば、間葉系幹細胞は、未修飾細胞、例えば、修飾されていない間葉系幹細胞と比較して、増加したＨＬＡ－Ｇの発現を有する。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ソース細胞、例えば、実質的に免疫原性ではない哺乳動物細胞に由来し、ソース細胞は、Ｔ細胞ＩＦＮ－γ分泌を、例えば、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってインビトロでアッセイされた場合、０ｐｇ／ｍＬ～＞０ｐｇ／ｍＬのレベルで刺激する、例えば、誘導する。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ソース細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、細胞増殖抑制剤（例えば、メトトレキサート）、抗体（例えば、ムロモナブ－ＣＤ３）、またはイムノフィリンモジュレーター（例えば、シクロスポリンもしくはラパマイシン）によって処理された細胞培養からのものである。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ソース細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、外因性作用物質、例えば、治療薬を含む。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ソース細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、組換え細胞である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、ウイルスイムノエバシン、例えば、ｈＣＭＶ ＵＳ２またはＵＳ１１を発現するように遺伝子修飾された哺乳動物細胞に由来する。
幾つかの実施形態では、フソソームの表面、またはフソソームが由来する哺乳動物細胞の表面は、ポリマー、例えば、免疫原性および免疫媒介性クリアランスを低減する生体適合性ポリマー、例えば、ＰＥＧで共有結合的または非共有結合的に修飾される。
幾つかの実施形態では、フソソームの表面、またはフソソームが由来する哺乳動物細胞の表面は、シアル酸、例えば、ＮＫ抑制グリカンエピトープを含む糖ポリマーを含むシアル酸で共有結合的または非共有結合的に修飾される。
幾つかの実施形態では、フソソームの表面、またはフソソームが由来する哺乳動物細胞の表面は、ＡＢＯ血液型を取り除くために、例えば、グリコシダーゼ酵素、例えば、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼで酵素的に処理される。
幾つかの実施形態では、フソソームの表面、またはフソソームが由来する哺乳動物細胞の表面は、酵素的に処理されて、レシピエントの血液型に一致するＡＢＯ血液型の発現を生じさせる、例えば、誘導する。
免疫原性を評価するためのパラメーター
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、実質的に免疫原性でないか、または免疫原性が低下するように修飾された、例えば、本明細書に記載の方法を使用して修飾された、ソース細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来する。ソース細胞およびフソソーム組成物の免疫原性は、本明細書に記載のアッセイのうちのいずれかによって決定することができる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、インビボ移植片生着の増加、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の増加を有する。幾つかの実施形態では、移植片の生存は、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおいて、本明細書に記載のインビボ移植片生存を測定するアッセイによって決定される。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、奇形腫形成の増加、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の増加を有する。幾つかの実施形態では、奇形腫形成は、適切な動物モデルにおいて、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおいて、本明細書に記載されるように奇形腫形成を測定するアッセイによって決定される。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、奇形腫生存の増加、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の増加を有する。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、奇形腫生存のアッセイにおいて１日以上生存する。幾つかの実施形態では、奇形腫生存は、適切な動物モデルにおいて、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおいて、本明細書に記載されるように奇形腫生存を測定するアッセイによって決定される。一実施形態では、奇形腫形成は、実施例に記載されるように、固定組織、例えば、凍結またはホルマリン固定の画像解析、例えば、ＩＨＣ染色、蛍光染色、またはＨ＆Ｅによって測定される。幾つかの実施形態では、固定組織は、以下の抗体：抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ４、または抗ヒトＣＤ８のうちのいずれか１つまたは全てで染色することができる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、移植片または奇形腫へのＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の低減、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低減を有する。幾つかの実施形態では、ＣＤ８ Ｔ細胞浸潤は、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおいて、本明細書に記載のＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を測定するアッセイ、例えば、組織学的分析によって決定される。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物に由来する奇形腫は、組織学的組織切片の５０倍の画像フィールドの０％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％においてＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を有する。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、移植片または奇形腫へのＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤の低減、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低減を有する。幾つかの実施形態では、ＣＤ４ Ｔ細胞浸潤は、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおいて、本明細書に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤を測定するアッセイ、例えば、組織学的分析によって決定される。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物に由来する奇形腫は、組織学的組織切片の５０倍の画像フィールドの０％、０．１％、１％５％、１０％、２０％、３０％、４０％５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％においてＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤を有する。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、移植片または奇形腫へのＣＤ３＋ＮＫ細胞浸潤の低減、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低減を有する。幾つかの実施形態では、ＣＤ３＋ＮＫ細胞浸潤は、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおいて、本明細書に記載のＣＤ３＋ＮＫ細胞浸潤を測定するアッセイ、例えば、組織学的分析によって決定される。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物に由来する奇形腫は、組織学的組織切片の５０倍の画像フィールドの０％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％においてＣＤ３＋ＮＫ Ｔ細胞浸潤を有する。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、適切な動物、例えば、本明細書に記載の動物モデルへの参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞の１つ以上の移植後の体液性応答と比較して、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルへの誘導されたフソソームの１つ以上の移植後の体液性応答の低減によって測定して、免疫原性の低減を有する。幾つかの実施形態では、体液性応答の低減は、血清試料において、抗細胞抗体力価、例えば、抗フソソーム抗体力価によって、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定される。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物を投与された動物からの血清試料は、未修飾細胞を投与された動物からの血清試料と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低減を有する。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物を投与された動物からの血清試料は、例えば、ベースラインから１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、または４０％増加した、抗細胞抗体力価の増加を有し、例えば、ベースラインは、フソソーム組成物の投与前の同じ動物からの血清試料を指す。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、マクロファージ食作用における低減、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、マクロファージ食作用における１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低減を有し、マクロファージ食作用における低減は、インビトロでの食作用指数を、例えば、実施例８２に記載されるようにアッセイすることによって決定される。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、マクロファージ食作用のインビトロアッセイにおいてマクロファージと共にインキュベートされた場合、例えば、実施例８２のアッセイによって測定して、０、１、１０、１００、またはそれ以上の食作用指数を有する。
幾つかの実施形態では、ソース細胞は、ＰＢＭＣによる細胞毒性媒介細胞溶解の低減、例えば、実施例８３のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、または間葉系幹細胞と比較して、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の細胞毒性媒介の細胞溶解の低減を有する。実施形態では、ソース細胞は、外因性ＨＬＡ－Ｇを発現する。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ＮＫ媒介細胞溶解の低減、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のＮＫ媒介細胞溶解の低減を有し、ＮＫ媒介細胞溶解は、クロミウム放出アッセイまたはユーロピウム放出アッセイによってインビトロでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介細胞溶解の低減、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低減を有し、ＣＤ８ Ｔ細胞媒介細胞溶解は、クロミウム放出アッセイまたはユーロピウム放出アッセイによってインビトロでアッセイされる。実施形態では、活性化および／または増殖は、実施例８５に記載されるように測定される。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖および／または活性化の低減、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低減を有し、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖は、例えば、実施例８６に記載されるように、インビトロでアッセイされる（例えば、修飾または未修飾哺乳動物ソース細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙａｎｂｅａｄｓを用いた共培養アッセイ）。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、Ｔ細胞ＩＦＮ－γ分泌の低減、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のＴ細胞ＩＦＮ－γ分泌の低減を有し、Ｔ細胞ＩＦＮ－γ分泌は、例えば、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴによってインビトロでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、免疫原性サイトカイン分泌の低減、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の免疫原性サイトカイン分泌の低減を有し、免疫原性サイトカインの分泌は、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴを使用してインビトロでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、免疫抑制性サイトカイン分泌の増加、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の免疫抑制性サイトカイン分泌の増加をもたらし、免疫抑制性サイトカインの分泌は、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴを使用してインビトロでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｅの発現における増加、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－の発現における増加を有し、ＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｅの発現は、フローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳを使用してインビトロでアッセイされる。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、例えば、未修飾細胞と比較して、ＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｅの発現における増加、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－の発現における増加を有するように修飾されるソース細胞に由来し、ＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｅの発現は、フローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳを使用してインビトロでアッセイされる。幾つかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇ発現が増加した修飾細胞に由来するフソソーム組成物は、例えば、奇形腫形成アッセイ、例えば、本明細書に記載の奇形腫形成アッセイにおいて、免疫細胞浸潤の低減によって測定して、低減した免疫原性を示す。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、Ｔ細胞阻害剤リガンド（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１）の発現の増加、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のＴ細胞阻害剤リガンドの発現における増加を有し、Ｔ細胞阻害剤リガンドの発現は、フローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳを使用してインビトロでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、供刺激リガンドの発現における減少、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の供刺激リガンドの発現の減少を有し、供刺激リガンドの発現は、フローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳを使用してインビトロでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの発現の減少、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの発現の減少を有し、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩの発現は、フローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳを使用してインビトロでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、実質的に非免疫原性である細胞源、例えば、哺乳動物細胞源に由来する。幾つかの実施形態では、免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように、定量化することができる。幾つかの実施形態では、哺乳動物細胞源は、以下の特徴のうちのいずれか１つ、全て、または組み合わせを含む：
ａ．ソース細胞が、自家細胞源、例えば、フソソーム組成物を受ける、例えば、投与されるレシピエントから得られる細胞から得られる、
ｂ．ソース細胞が、フソソーム組成物を受ける、例えば、投与されるレシピエント、例えば、本明細書に記載のレシピエントと一致する、例えば、同一の性別のものである同種異系細胞源から得られる、
ｃ．ソース細胞が、レシピエントのＨＬＡと、例えば、１つ以上の対立遺伝子で、一致するＨＬＡである同種異系細胞源から得られる、
ｄ．ソース細胞が、ＨＬＡホモ接合体である同種異系細胞源から得られる、
ｅ．ソース細胞が、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩを欠いている（または参照細胞と比較して低下したレベルを有する）同種異系細胞源から得られる、あるいは
ｆ．ソース細胞が、限定されないが、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、または網膜色素上皮細胞を含む、実質的に非免疫原性であることが知られている細胞源から得られる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物を投与されるべき被験体は、フソソームと反応性である既存の抗体（例えば、ＩｇＧもしくはＩｇＭ）を有するか、または有することが知られるか、またはそれについて試験される。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物を投与されるべき被験体は、フソソームと反応性である既存の抗体の検出可能なレベルを有しない。抗体の試験は、例えば、実施例７８に記載されている。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物を受けた被験体は、フソソームと反応性である抗体（例えば、ＩｇＧもしくはＩｇＭ）を有するか、または有することが知られるか、またはそれについて試験される。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物を（例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上）受けた被験体は、フソソームと反応性である抗体の検出可能なレベルを有しない。実施形態では、抗体のレベルは、２つの時点である、フソソームの最初の投与前である第１の時点と、フソソームの１回以上の投与後である第２の時点との間で、１％、２％、５％、１０％、２０％、または５０％を超えて上昇しない。抗体の試験は、例えば、実施例７９に記載されている。
追加の治療薬
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、追加の作用物質、例えば、治療薬と共に、被験体、例えば、レシピエント、例えば、本明細書に記載のレシピエントに同時投与される。幾つかの実施形態では、同時投与される治療薬は、免疫抑制物質、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、細胞増殖抑制物質（例えば、メトトレキサート）、抗体（例えば、ムロモナブ－ＣＤ３）、またはイムノフィリンモジュレーター（例えば、シクロスポリンもしくはラパマイシン）である。実施形態では、免疫抑制物質は、フソソームの免疫介在性クリアランスを減少させる。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、免疫賦活物質、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと同時投与される。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物および免疫抑制物質は、同じ時に投与され、例えば、同時に投与される。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、免疫抑制物質の投与の前に投与される。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、免疫抑制物質の投与後に投与される。
幾つかの実施形態では、免疫抑制物質は、イブプロフェン、アセトアミノフェン、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸、シクロホスファミド、グルココルチコイド、シロリムス、アザスリオピン、またはメトトレキサートなどの小分子である。
幾つかの実施形態では、免疫抑制物質は、ムロノマブ（抗ＣＤ３）、ダクリズマブ（抗ＩＬ１２）、バシリキシマブ、インフリキシマブ（抗ＴＮＦａ）、またはリツキシマブ（抗ＣＤ２０）を含むがこれらに限定されない抗体分子である。
幾つかの実施形態では、免疫抑制物質とのフソソーム組成物の同時投与は、フソソーム組成物のみの投与と比較して、被験体におけるフソソーム組成物の持続性の増強をもたらす。幾つかの実施形態では、同時投与におけるフソソーム組成物の増強された持続性は、単独で投与された場合のフソソーム組成物の持続性と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上である。幾つかの実施形態では、同時投与におけるフソソーム組成物の増強された持続性は、単独で投与されたときのフソソーム組成物の生存と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、または３０日以上である。
送達
幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、タンパク質、脂質、もしくは化学フソゲン）またはフソゲン結合パートナーは、フソソームの送達の前、同時、または後に、標的細胞または組織に送達される。
幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、タンパク質、脂質、もしくは化学フソゲン）またはフソゲン結合パートナーは、フソソームの送達の前、同時、または後に、非標的細胞または組織に送達される。
幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、タンパク質、もしくは脂質フソゲン）またはフソゲン結合パートナーをコードする核酸は、フソソームの送達の前、同時、または後に、標的細胞または組織に送達される。
幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、タンパク質、脂質、もしくは化学フソゲン）またはフソゲン結合パートナーの発現を上方調節または下方調節するポリペプチド、核酸、リボ核タンパク質、または小分子は、フソソームの送達の前、同時、または後に、標的細胞または組織に送達される。
幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、タンパク質、脂質、もしくは化学フソゲン）またはフソゲン結合パートナーの発現を上方調節または下方調節するポリペプチド、核酸、リボ核タンパク質、または小分子は、フソソームの送達の前、同時、または後に、非標的細胞または組織に送達される。
幾つかの実施形態では、標的細胞または組織は、フソソームの送達の前、同時、または後に、融合の速度を増加させることによって（例えば、ストレスもしくは細胞分裂を誘導することによって）修飾される。幾つかの非限定的な例には、虚血の誘導、化学療法による治療、抗生物質、照射、毒素、炎症、炎症性分子、抗炎症性分子、酸損傷、基本的損傷、火傷、ポリエチレングリコール、神経伝達物質、骨髄毒性薬、成長因子、またはホルモン、組織切除、飢餓、および／または運動が含まれる。
幾つかの実施形態では、標的細胞または組織は、血管拡張剤（例えば、一酸化窒素（ＮＯ）、一酸化炭素、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）、ニトログリセリン、フェントラミン）または血管収縮剤（例えば、アンジオテンシン（ＡＧＴ）、エンドセリン（ＥＤＮ）、ノルエピネフリン））で処理され、標的組織へのフソソーム輸送の速度を増加させる。
幾つかの実施形態では、標的細胞または組織は、化学剤、例えば、化学療法剤で処理される。そのような実施形態では、化学療法剤は、標的細胞または組織への損傷を誘導し、それが標的細胞または組織の融合活性を増強する。
幾つかの実施形態では、標的細胞または組織は、物理的ストレス、例えば、電気融合で処理される。そのような実施形態では、物理的ストレスは、標的細胞または組織の膜を不安定化して、標的細胞または組織の融合活性を増強する。
幾つかの実施形態では、標的細胞または組織は、フソソームとの融合を増強するために作用物質で処理され得る。例えば、特定のニューロン受容体を抗うつ剤で刺激して、融合特性を増強することができる。
本明細書に記載のフソソームを含む組成物は、循環系、肝系、腎系、心肺系、中枢神経系、末梢神経系、筋骨格系、リンパ系、免疫系、感覚神経系（視覚、聴覚、臭覚、触覚、味覚）、消化器系、内分泌系（脂肪組織の代謝調節を含む）、および生殖系に投与され得るか、または標的とされ得る。
実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物は、細胞または組織、例えば、ヒトの細胞または組織にエクスビボで送達される。幾つかの実施形態では、組成物は、損傷状態にあるエクスビボ組織に送達される（例えば、外傷、疾患、低酸素症、虚血、または他の損傷から）。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、生体外移植（例えば、移植のための組織外植片もしくは組織、例えば、ヒト静脈、骨もしくは腱などの筋骨格移植片、角膜、皮膚、心臓弁、神経）、または単離もしくは培養された臓器、例えば、ヒトに移植される臓器、例えば、ヒトの心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、胸腺、眼）に送達される。組成物は、移植片の生存能力、呼吸、または他の機能を改善する。組成物は、移植前、移植中、および／または移植後に組織または臓器に送達することができる。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物は、被験体に由来する細胞または組織にエクスビボで送達される。幾つかの実施形態では、細胞または組織は、被験体に再投与される（すなわち、細胞または組織は、自家である）。
フソソームは、任意の哺乳動物（例えば、ヒト）組織、例えば、上皮、結合、筋肉、または神経組織または細胞、およびそれらの組み合わせからの細胞と融合し得る。フソソームは、任意の真核生物の（例えば哺乳動物）器官系に由来する培養細胞から、例えば、心臓血管系（心臓、血管系）；消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸および肛門）；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体または松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎）；排泄システム（腎臓、尿管、膀胱）；リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃腺、咽頭扁桃、胸腺、脾臓）；外皮系（皮膚、髪、爪）；筋肉系（例えば、骨格筋）；神経系（脳、脊髄、神経）；生殖器系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）；呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）；骨格系（骨、軟骨）、ならびにそれらの組み合わせに送達され得る。
実施形態では、フソソームは、被験体に投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、脂肪組織（例えば、褐色脂肪組織もしくは白色脂肪組織）、または眼を標的とし、例えば、実施例８７または１００のアッセイにより、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、２４、４８、または７２時間後に標的組織内に存在する。
実施形態では、フソソームは、幹細胞または始原細胞のソースからの細胞、例えば、骨髄間質細胞、骨髄由来成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、芽細胞、脳室下帯に形成された中間前駆細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞、衛星細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、骨髄間質細胞、表皮幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、前駆細胞、筋肉前駆細胞、筋芽細胞、心筋芽球、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経前駆細胞、肝芽球と融合し得る。
例えば、ランディングパッドの実施形態のためのフソゲン結合パートナー
ある特定の態様では、本開示は、被験体の標的細胞にフソソームを送達する方法を提供する。幾つかの実施形態では、この方法は、フソゲン、例えば、ミオメーカータンパク質をコードする核酸を含むフソソームを、被験体に投与することを含み、フソゲンが被験体におけるフソソームの表面上に発現されるのを可能にする条件下で、細胞内に存在しないか、または発現されない（例えば、存在するが、転写れないかまたは翻訳されない）。幾つかの実施形態では、方法は、フソソーム上のフソゲンとフソゲン結合パートナーとの融合を可能にする条件下で、作用物質、例えば、治療薬、およびフソゲン結合パートナーを含む、任意に、担体、例えば、膜を含む、組成物を被験体に投与することを更に含む。幾つかの実施形態では、担体は、膜、例えば、脂質二重層を含み、例えば、作用物質は、脂質二重層内に配置される。幾つかの実施形態では、脂質二重層は、標的細胞と融合し、それにより、被験体の標的細胞に作用物質を送達する。
幾つかの実施形態では、フソゲン結合パートナーは、標的細胞、例えば、本明細書に開示される標的細胞の膜（例えば、脂質二重層）に配置された部分、例えば、タンパク質分子である。幾つかの実施形態では、膜は、細胞表面膜、またはオルガネラの細胞内膜、例えば、ミトコンドリア、リソソーム、もしくはゴルジ装置であり得る。幾つかの実施形態では、フソゲン結合パートナーは、内因的に発現し得る、過剰発現し得る、または外因的に発現し得る（例えば、本明細書に記載の方法によって）。幾つかの実施形態では、フソゲン結合パートナーは、膜において他のフソゲン結合パートナーとクラスター化することができる。
幾つかの実施形態では、標的細胞の膜におけるフソゲン結合パートナー、または複数のフソゲン結合パートナーの存在は、標的細胞上のフソゲン結合パートナー（例えば、本明細書に記載の細胞）とフソソーム上のフソゲン（例えば、本明細書に記載のフソソーム）との間の相互作用、例えば、結合を促進することができるインターフェースを作成する。幾つかの実施形態では、フソソーム上のフソゲンは、標的細胞上の、例えば、標的細胞の膜（例えば、脂質二重層）上のフソゲン結合パートナーと相互作用し、例えば、結合して、フソソームと標的膜との融合を誘導する。幾つかの実施形態では、フソゲンは、ミトコンドリアを含む細胞内小器官上のランディングパッド上のフソゲン結合パートナーと相互作用し、例えば結合して、フソソームと細胞内小器官との融合を誘導する。
フソゲン結合パートナーは、以下に論じられる方法のうちのいずれかによって、標的細胞、例えば、本明細書に開示される標的細胞に導入することができる。
幾つかの実施形態では、フソゲン結合パートナーを標的細胞に導入する方法は、被験体（例えば、本明細書に記載の被験体）からの標的細胞の除去、例えば、抽出（例えば、アフェレーシスまたは生検による）、および例えば、フソゲン結合パートナーが標的細胞の膜上に発現されることを可能にする条件下でのフソゲン結合パートナーへの曝露を含む。幾つかの実施形態では、方法は、エクスビボでフソゲン結合パートナーを発現する標的細胞を、フソソームを含むフソソームと接触させて、フソソームと標的細胞膜との融合を誘導することを含む。幾つかの実施形態では、フソソームに融合された標的細胞は、例えば、静脈内に、被験体に再導入される。
幾つかの実施形態では、フソゲン結合パートナーを発現する標的細胞は、例えば、静脈内に、被験体に再導入される。幾つかの実施形態では、方法は、フソゲンを含むフソソームを被験体に投与して、フソソーム上のフソゲンと標的細胞上のフソゲン結合パートナーとの相互作用、例えば、結合、およびフソソームと標的細胞膜との融合を可能にすることを含む。
幾つかの実施形態では、標的細胞は、内因性細胞表面分子（例えば、幾つかの実施形態では、標的細胞に対して内因性）、例えば、フソゲン結合パートナー、例えば、臓器、組織、または細胞標的分子の発現を増加または減少させるために、エピジェネティック修飾因子、例えば、小分子エピジェネティック修飾因子で処理され、細胞表面分子は、タンパク質、グリカン、脂質、または低分子量分子である。幾つかの実施形態では、標的細胞は、内因性細胞表面分子、例えば、フソゲン結合パートナー、例えば、臓器、組織、または細胞標的化分子の発現を増加させるように遺伝子修飾され、細胞表面分子は、タンパク質、グリカン、脂質、または低分子量分子である。幾つかの実施形態では、遺伝子修飾は、内因性細胞表面分子の転写活性化因子、例えば、フソゲン結合パートナーの発現を減少させ得る。
幾つかの実施形態では、標的細胞は、外因性細胞表面分子、例えば、フソゲン結合パートナーを発現する、例えば、過剰発現するように遺伝子修飾され、細胞表面分子は、タンパク質、グリカン、脂質、または低分子量分子である。
幾つかの実施形態では、標的細胞は、細胞における外因性フソゲンの発現、例えば、導入遺伝子の送達を増加させるように遺伝子修飾されている。幾つかの実施形態では、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、例えば、細胞表面分子（タンパク質、グリカン、脂質、または低分子量分子）の発現を増加または減少させるために、標的細胞に移される。幾つかの実施形態では、核酸は、フソゲン結合パートナーの抑制因子、例えば、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ構築物を標的とする。幾つかの実施形態では、核酸は、フソゲン結合パートナー抑制因子の阻害剤をコードする。
使用方法
本明細書に記載の薬学的組成物の投与は、経口、吸入、経皮または非経口（静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、腔内、および皮下を含む）投与によるものであり得る。フソソームは、単独で投与することも、薬学的組成物として製剤化することもできる。
フソソームは、単位用量の経口、非経口、経皮、または吸入組成物などの単位用量組成物の形態で投与することができる。そのような組成物は、混和物によって調製され、経口、吸入、経皮、または非経口投与に適切に適合され、それ自体、錠剤、カプセル、経口液体製剤、粉末、顆粒、トローチ、再構成可能粉末、注射可能および注入可能な溶液、または懸濁液、または坐剤、またはエアロゾルの形態であり得る。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物を介した膜タンパク質ペイロード剤の送達は、細胞分化、脱分化、または分化転換を誘導またはブロックし得る。標的哺乳動物細胞は、前駆細胞であり得る。あるいは、標的哺乳動物細胞は、分化した細胞であり得、細胞運命の改変は、多能性前駆細胞への脱分化を促進すること、またはそのような脱分化をブロックすることを含む。細胞運命の変化が望まれる状況では、細胞運命の改変が誘導されるような条件下で、細胞運命誘導分子またはシグナルをコードする本明細書に記載の有効量のフソソームが、標的細胞に導入される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、細胞の亜集団を第１の表現型から第２の表現型に再プログラムするのに有用である。そのような再プログラミングは、一時的または永続的であり得る。任意に、再プログラミングにより、標的細胞が中間表現型を採用するように誘導される。
標的細胞集団における細胞分化を低減する方法も提供される。例えば、１つ以上の前駆細胞型を含む標的細胞集団は、組成物が前駆細胞の分化を低減するような条件下で、本明細書に記載のフソソーム組成物と接触させられる。ある特定の実施形態では、標的細胞集団は、哺乳動物被験体の損傷組織または外科的処置によって影響を受けた組織を含む。前駆細胞は、例えば、間質前駆細胞、神経前駆細胞、または間葉前駆細胞である。
膜タンパク質ペイロード剤を含む、本明細書に記載のフソソーム組成物を使用して、そのような作用物質を細胞組織または被験体に送達することができる。本明細書に記載のフソソーム組成物の投与による膜タンパク質ペイロード剤の送達は、細胞タンパク質発現レベルを修飾し得る。ある特定の実施形態では、投与されるものは、膜タンパク質ペイロード剤が送達される細胞には実質的に存在しないか、または低減される、機能的活性を提供する１つ以上の膜タンパク質ペイロード剤（例えば、ポリペプチドもしくは核酸）の（細胞内での発現、細胞内での送達、もしくは細胞内での誘導を介した）上方調節を指示する。例えば、欠落している機能的活性は、本質的に酵素的、構造的、シグナル伝達、または調節的であり得る。関連する実施形態では、投与された組成物は、膜タンパク質ペイロード剤が上方制御される細胞に存在するが、実質的に欠損している機能的活性を（例えば、相乗的に）増加させる１つ以上の膜タンパク質ペイロード剤の上方制御を指示する。関連する実施形態では、投与された組成物は、ポリペプチドが下方調節されている細胞に存在するかまたは上方調節される機能的活性を（例えば、相乗的に）減少させる１つ以上のポリペプチドの下方調節を指示する。ある特定の実施形態では、投与された組成物は、ある特定の機能的活性の上方調節および他の機能的活性の下方調節を指示する。
実施形態では、フソソーム組成物は、標的細胞に対する効果を媒介し、効果は、少なくとも１、２、３、４、５、６、もしくは７日間、２、３、もしくは４週間、または１、２、３、６、もしくは１２ヶ月間持続する。幾つかの実施形態（例えば、フソソーム組成物が外因性タンパク質を含む場合）では、効果は、１、２、３、４、５、６もしくは７日未満、２、３もしくは４週間未満、または１、２、３、６、もしくは１２ヶ月間未満持続する。
エクスビボ適用
実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物は、細胞または組織、例えば、ヒトの細胞または組織にエクスビボで送達される。実施形態では、組成物は、エクスビボで細胞または組織の機能を改善し、例えば、細胞生存率、シグナル伝達、呼吸、または他の機能（例えば、本明細書に記載の別の機能）を改善する。
幾つかの実施形態では、組成物は、損傷状態にあるエクスビボ組織に送達される（例えば、外傷、疾患、低酸素症、虚血、または他の損傷から）。
幾つかの実施形態では、組成物は、生体外移植（例えば、移植のための組織外植片もしくは組織、例えば、ヒト静脈、骨もしくは腱などの筋骨格移植片、角膜、皮膚、心臓弁、神経）、または単離もしくは培養された臓器、例えば、ヒトに移植される臓器、例えば、ヒトの心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、胸腺、眼）に送達される。組成物は、移植前、移植中、および／または移植後に組織または臓器に送達することができる。
幾つかの実施形態では、組成物は、細胞、例えば、細胞調製物に対して送達、投与、または接触される。細胞調製物は、細胞治療調製物（ヒト被験体への投与を目的とした細胞調製物）であり得る。実施形態では、細胞調製物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞、例えば、組換えＣＡＲを発現する細胞を含む。ＣＡＲを発現する細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞であり得る。実施形態では、細胞調製物は、神経幹細胞調製物である。実施形態では、細胞調製物は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）調製物である。実施形態では、細胞調製物は、造血幹細胞（ＨＳＣ）調製物である。実施形態では、細胞調製物は、膵島細胞調製物である。
インビボでの使用
本明細書に記載のフソソーム組成物を、被験体、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに投与することができる。そのような実施形態では、被験体は、特定の疾患または状態（例えば、本明細書に記載の疾患もしくは状態）のリスクがあり得るか、症状があり得るか、または診断され得るか、またはそうであると識別され得る。一実施形態では、被験体は、癌を有する。一実施形態では、被験体は、感染症を有する。
幾つかの実施形態では、フソソームのソースは、フソソーム組成物が投与される同一の被験体に由来する。他の実施形態では、供給源と被験体は異なる。例えば、フソソームおよびレシピエント組織のソースは、自家（同じ被験体に由来）または異種（異なる被験体に由来）であり得る。いずれの場合も、本明細書に記載のフソソーム組成物のドナー組織は、レシピエント組織とは異なる組織タイプであり得る。例えば、ドナー組織は筋肉組織であり得て、レシピエント組織は結合組織（例えば、脂肪組織）であり得る。他の実施形態では、ドナー組織およびレシピエント組織は、同じまたは異なるタイプであり得るが、異なる器官系からのものであり得る。
本明細書に記載のフソソーム組成物は、癌、自己免疫疾患、感染症、代謝性疾患、神経変性疾患、または遺伝性疾患（例えば、酵素欠損症）を有する被験体に投与することができる。幾つかの実施形態では、被験体の組織は、再生を必要としている。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の治療有効量のフソソーム組成物が、被験体に投与される。幾つかの実施形態では、物質の治療有効量は、疾患、障害、および／または状態を有するか、または感受性である被験体に投与された場合、疾患、障害、および／または状態を治療および／またはその発症を遅らせるのに十分な量である。例えば、実施形態では、疾患、障害、および／または状態を治療するための製剤中のフソソームの有効量は、疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状または特徴を軽減する、改善する、緩和する、阻害する、その発症を遅らせる、その重症度を低減する、および／またはその発生率を低減する量である。
幾つかの実施形態では、被験体は、フソソーム組成物で治療される。幾つかの実施形態では、治療は、特定の疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状、特徴、および／または原因を部分的または完全に軽減する、改善する、緩和する、阻害する、その発症を遅らせる、その重症度を低減する、および／またはその発生率を低減する。幾つかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、および／または状態に罹患していると診断された被験体のものであり得る。幾つかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、および／または状態の発症のリスクの増加と統計的に相関する１つ以上の感受性因子を有することが知られている被験体のものであり得る。幾つかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、および／または状態の根本原因を部分的または完全に改善する。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、疾患、例えば、癌を治療するのに効果的である。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、投与前の被験体における癌細胞の数と比較して、被験体における癌細胞の数を低減するのに効果的である。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、治療なしで予想される疾患の経過と比較して、被験体における癌細胞の数を低減するのに効果的である。幾つかの実施形態では、被験体は、フソソーム組成物の投与後に完全な応答または部分的な応答を経験する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、膜融合を阻害するタンパク質の阻害剤と同時投与される。例えば、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｙｎは細胞間融合を阻害するヒトタンパク質である（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３：１４６２ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０１４６２）。したがって、幾つかの実施形態では、フソソームは、シプレッシン（ｓｙｐｒｅｓｓｙｎ）の阻害剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたは阻害性抗体と同時投与される。
非ヒト適用
本明細書に記載の組成物はまた、限定されるものではないが、以下を含む様々な他の生物の細胞または組織の機能または生理学を同様に調節するために使用され得る：家畜または使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリ等）、ペットまたは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、トリ、ライオン、トラ、クマ等）、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキ等）、植物種（樹木、作物、観賞用花等）、発酵種（サッカロミセス等）。本明細書に記載のフソソーム組成物は、かかる非ヒト供給源から作製され、非ヒト標的細胞もしくは組織、または被験体に投与され得る。
フソソーム組成物は、標的に対して自家、同種異系、または異種である可能性がある。
本明細書で引用されている全ての参考文献および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、本発明の幾つかの実施形態を更に説明するために提供されているが、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、それらの例示的な性質により、当業者に知られている他の手順、方法論、または技法を代替的に使用できることが理解されるであろう。
実施例１．化学処理（ＰＥＧ）を介して除核された融合細胞を生成する
ドナーＨｅＬａ細胞を発現するＭｉｔｏ－ＤｓＲｅｄ（ミトコンドリア特異的標的色素）を、０．２５％トリプシンでトリプシン処理し、収集し、５００ｘｇで５分間回転させ、ＰＢＳで１回洗浄し、カウントした。続いて、１０ｘ１０６細胞を、１０ｕｇ／ｍＬサイトカラシンＢで補足された完全ＭＥＭ－α（＋１０％ＦＢＳ、＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン、＋グルタミン）中の３ｍＬの１２．５％フィコールに１５分間再懸濁した。細胞を除核するために、それらを次のフィコール画分（上から下）：２ｍＬの１２．５％フィコール、０．５ｍＬの１５％フィコール、０．５ｍＬの１６％フィコール、２ｍＬの１７％フィコール勾配、２ｍＬの２５％フィコールからなる不連続フィコール勾配に移した。全てのフィコール勾配画分を、１０ｕｇ／ｍＬサイトカラシンＢで補足された完全ＤＭＥＭ中で作製した。勾配を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ－４０超遠心機、Ｔｉ－７０ローター上で１０７９７１ｘｇ、３７℃で１時間回転させた。遠心分離後、除核されたＨｅＬａ細胞を、１７％フィコール画分の１２．５％、１５％、１６％、および２分の１から収集し、完全ＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ、＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン、＋グルタミン）に再懸濁し、５００ｘｇで５分間回転させてペレット化した。除核されたＭｉｔｏ－ＤｓＲｅｄドナー細胞を、ＤＭＥＭで２回洗浄した。同時に、レシピエントＨｅＬａ細胞を発現するＭｉｔｏ－ＧＦＰ（ミトコンドリア特異的標的色素）をトリプシン処理し、カウントし、融合のために調製した。
融合のために、除核されたＭｉｔｏ－ＤｓＲｅｄドナーＨｅＬａ細胞を、１：１の比率でＭｉｔｏ－ＧＦＰレシピエントＨｅＬａ細胞（各２００，０００）と、５０％ポリエチレングリコール溶液（１０％ＤＭＳＯを含む完全ＤＭＥＭにおいて調製された５０％ｗ／ｖのＰＥＧ）中、３７℃で１分間複合した。その後、細胞を、１０ｍＬの完全ＤＭＥＭで３回洗浄し、各四分円が１．９ｃｍ２の面積を有する四分円あたり５０ｋ細胞の密度で３５ｍｍガラス底四分円撮像皿上にプレーティングした。
実施例２．化学処理（ＰＥＧ）を介して有核融合細胞を生成する
ドナーＨｅＬａ細胞を発現するＭｉｔｏ－ＤｓＲｅｄ（ミトコンドリア特異的標的色素）を、０．２５％トリプシンでトリプシン処理し、収集し、５００ｘｇで５分間回転させ、ＰＢＳで１回洗浄し、カウントした。続いて、２ｘ１０６細胞を、完全ＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ、＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン、＋グルタミン）に再懸濁し、カウントし、融合のために調製した。
Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄドナー細胞を、ＤＭＥＭで３回洗浄した。同時に、レシピエントＨｅＬａ細胞を発現するＭｉｔｏ－ＧＦＰ（ミトコンドリア特異的標的色素）をトリプシン処理し、カウントし、融合のために調製した。
融合のために、Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄドナーＨｅＬａ細胞を、１：１の比率でＭｉｔｏ－ＧＦＰレシピエントＨｅＬａ細胞（各２００，０００）と、５０％ポリエチレングリコール溶液（１０％ＤＭＳＯを含む完全ＤＭＥＭにおいて調製された５０％ｗ／ｖのＰＥＧ）中、３７℃で１分間複合した。その後、細胞を、１０ｍＬの完全ＤＭＥＭで３回洗浄し、各四分円が１．９ｃｍ２の面積を有する四分円あたり５０ｋ細胞の密度で３５ｍｍガラス底四分円撮像皿上にプレーティングした。
実施例３．外因性フソゲンを発現するＨｅＬａ細胞の作成
この実施例では、外因性のフソゲンを発現する組織培養細胞の作成について説明する。以下の実施例は、いかなるタンパク質ベースのフソゲンにも等しく適用可能であり、初代細胞（懸濁液または付着物）および組織での産生にも等しく適用可能である。場合によっては、フソゲンペアを使用して融合を誘導することができる（フソゲンおよびフソゲン結合パートナーとして描写される）。
フソゲン遺伝子、融合失敗１（ＥＦＦ－１）を、ｐＩＲＥＳ２－ＡｃＧＦＰ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングし、次いで、この構築物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ－２（商標）、ＡＴＣＣ）にトランスフェクトする。フソゲン結合パートナー遺伝子、アンカー細胞融合失敗１（ＡＦＦ－１）を、ｐＩＲＥＳ２ ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローン化し、次いで、この構築物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ－２（商標）、ＡＴＣＣ）にトランスフェクトする。トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ）、１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ）、および５００ｍｇ／ｍＬのゼオシンで補足されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２で保持する。ＥＦＦ－１発現細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を選別することによって単離して、ＥＦＦ－１フソゲンを発現するＧＦＰ＋Ｈｅｌａ細胞の純粋な集団を得る。ＡＦＦ－１発現細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を選別することによって単離して、ＡＦＦ－１フソゲン結合パートナーを発現するＤＳＲＥＤ＋Ｈｅｌａ細胞の純粋な集団を得る。
実施例４．化学的に増強された融合性除核細胞を介したオルガネラ送達
実施例１に記載のように産生および融合された融合細胞（Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄドナー除核細胞およびＭｉｔｏ－ＧＦＰレシピエントＨｅＬａ細胞）を、イメージングディッシュに沈着してから２４時間後に、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０倒立共焦点顕微鏡で６３倍で画像化した。Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄのみとＭｉｔｏ－ＧＦＰのみを発現する細胞を別々にイメージングして、Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄおよびＭｉｔｏ－ＧＦＰの両方が存在し、同時に取得された条件で２つのチャネル間で信号が重複しないように取得設定を構成した。対象の１０の領域を、各ＲＯＩ内に最低１０個の細胞が含まれるという唯一の基準で、完全に偏りのない方法で選択し、その結果、最低１００個の細胞を、下流分析に使用できるようにした。これらの画像の所与のピクセルは、いずれかのチャネル（ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄおよびｍｉｔｏ－ＧＦＰ）の強度が、３つのＲＯＩ全てでそれぞれのチャネルの最大強度値の１０％を超えている場合、ミトコンドリアに対して陽性であると判断された。
オルガネラ送達を伴う融合事象は、細胞中のミトコンドリア（ｍｉｔｏ－ＧＦＰ＋またはｍｉｔｏ－Ｄｓ－Ｒｅｄ＋のいずれかである全てのピクセルによって同定された）の５０％超が、上記の示されたしきい値に基づいてｍｉｔｏＤｓ－Ｒｅｄおよびｍｉｔｏ－ＧＦＰの両方に対して陽性であるという条件に基づいて識別され、これらのタンパク質を含むオルガネラ（この場合、ミトコンドリア）が、送達、融合され、それらの内容物が混ざり合ったことを示す。図７に示されるように、２４時間の時点で、複数の細胞が融合によるオルガネラの送達に陽性を示した。これは、ドナーとレシピエントのＨｅＬａ細胞と間の融合を介したオルガネラの陽性送達の画像である。白色で示された細胞内領域は、ドナーとレシピエントのミトコンドリアとの間の重複を示す。灰色の細胞内領域は、ドナーおよびレシピエントのオルガネラが重なっていない場所を示す。
実施例５．化学的に増強された融合性有核細胞を介したオルガネラ送達
実施例２に記載のように産生および複合された融合細胞（Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄドナー細胞およびＭｉｔｏ－ＧＦＰレシピエントＨｅＬａ細胞）を、イメージングディッシュに沈着してから２４時間後に、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０倒立共焦点顕微鏡で６３倍で画像化した。Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄのみとＭｉｔｏ－ＧＦＰのみを発現する細胞を別々にイメージングして、Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄとＭｉｔｏ－ＧＦＰの両方が存在し、同時に取得された条件で２つのチャネル間で信号が重複しないように取得設定を構成した。対象の１０の領域を、各ＲＯＩ内に最低１０個の細胞が含まれるという唯一の条件で、完全に偏りのない方法で選択し、その結果、最低１００個の細胞を、下流分析に使用できるようにした。これらの画像の所与のピクセルは、いずれかのチャネル（ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄおよびｍｉｔｏ－ＧＦＰ）の強度が、３つのＲＯＩ全てでそれぞれのチャネルの最大強度値の２０％を超えている場合、ミトコンドリアに対して陽性であると判断された。
オルガネラ送達を伴う融合事象は、細胞中のミトコンドリア（ｍｉｔｏ－ＧＦＰ＋またはｍｉｔｏ－Ｄｓ－Ｒｅｄ＋のいずれかである全てのピクセルによって同定された）の５０％超が、上記の示されたしきい値に基づいてｍｉｔｏＤｓ－Ｒｅｄおよびｍｉｔｏ－ＧＦＰの両方に対して陽性であるという条件に基づいて識別され、これらのタンパク質を含むオルガネラ（この場合、ミトコンドリア）が、送達、融合され、それらの内容物が混ざり合ったことを示す。図８に示されるように、２４時間の時点で、複数の細胞が融合によるオルガネラの送達に陽性を示した。これは、ドナーとレシピエントのＨｅＬａ細胞との間の融合を介したオルガネラの陽性送達の画像である。白色で示された細胞内領域は、ドナーとレシピエントのミトコンドリアとの間の重複を示す。灰色の細胞内領域は、ドナーおよびレシピエントのオルガネラが重なっていない場所を示す。
実施例６．タンパク質増強融合性除核細胞を介したミトコンドリアの送達
実施例３に記載されるように産生および複合された融合細胞は、イメージングディッシュに沈着してから２４時間後に、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０倒立共焦点顕微鏡で６３倍の倍率で画像化される。Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄのみとＭｉｔｏ－ＧＦＰのみを発現する細胞を別々に画像化して、Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄとＭｉｔｏ－ＧＦＰの両方が存在し、同時に取得された条件で２つのチャネル間で信号が重複しないように取得設定を構成する。対象の１０の領域を、各ＲＯＩ内に最低１０個の細胞が含まれるという唯一の条件で、完全に偏りのない方法で選択し、その結果、最少数の細胞を、下流分析に使用できるようにする。これらの画像の所与のピクセルは、いずれかのチャネル（ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄおよびｍｉｔｏ－ＧＦＰ）の強度が、３つのＲＯＩ全てでそれぞれのチャネルの最大強度値の１０％を超えている場合、ミトコンドリアに対して陽性であると判断される。
オルガネラ送達を伴う融合事象は、細胞中のミトコンドリア（ｍｉｔｏ－ＧＦＰ＋またはｍｉｔｏ－Ｄｓ－Ｒｅｄ＋のいずれかである全てのピクセルによって同定された）の５０％超が、上記の示されたしきい値に基づいてｍｉｔｏＤｓ－Ｒｅｄおよびｍｉｔｏ－ＧＦＰの両方に対して陽性であるという条件に基づいて識別され、これらのタンパク質を含むオルガネラ（この場合、ミトコンドリア）が、送達、融合され、それらの内容物が混ざり合うことを示す。２４時間の時点で、複数の細胞が融合を介して正のオルガネラ送達を示すと予想される。
実施例７：核酸エレクトロポレーションによるフソソームの生成
この実施例では、フソゲンをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡもしくはＤＮＡ）を用いた細胞または小胞のエレクトロポレーションによるフソソームの生成について説明する。
ピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームと、クローン化フラグメントのオープンリーディングフレーム（例えば、小胞性口内炎ウイルス［ＶＳＶ－Ｇ］からの糖タンパク質、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＃ＯＧ５９２）とを含むトランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を、エレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）および２９３Ｔ細胞株特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して２９３Ｔにエレクトロポレーションする。
２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で３～５日間、１μｇ／μＬピューロマイシンで選択した後、細胞を１ｘＰＢＳ、氷冷溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０１１１７））で洗浄し、１回あたり１０～１５秒で３回超音波処理し、１６，０００×ｇで２０分間遠心分離する。安定的にトランスフェクトされた細胞または対照細胞から調製され、ＶＳＶ－Ｇタンパク質の標準と比較されたフソソームからＶＳＶ－Ｇの非膜特異的濃度を決定するために、ＶＳＶ－Ｇに特異的なプローブを用いて回収された上清画分に対してウエスタンブロットを行う。
実施形態では、安定的にトランスフェクトされた細胞からのフソソームは、安定的にトランスフェクトされなかった細胞から生成されたフソソームよりも多くのＶＳＶ－Ｇを有するであろう。
実施例８：タンパク質エレクトロポレーションによるフソソームの生成
この実施例では、フソソームを生成するためのフソゲンのエレクトロポレーションについて説明する。
およそ５×１０６個の細胞または小胞を、エレクトロトランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するエレクトロポレーションのために使用する。マスターミックスを設定するには、２４μｇの精製タンパク質フソゲンを再懸濁バッファー（キットで提供される）に添加する。混合物を室温で１０分間インキュベートする。その間、細胞または小胞を、滅菌試験管に移し、５００×ｇで５分間遠心分離する。上清を吸引し、ペレットをＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まない１ｍＬのＰＢＳに再懸濁する。次いで、フソゲンを含むバッファーを使用して、細胞または小胞のペレットを再懸濁する。細胞または小胞懸濁液は、パルス電圧、パルス幅、およびパルス数が変化する最適化条件にも使用される。エレクトロポレーション後、フソゲンを含むエレクトロポレーションした細胞または小胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上に保持する。
例えば、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０８：４４－５３，２０１５を参照されたい。
実施例９：小胞形成および遠心分離によりフソソームを生成および単離する
この実施例では、小胞形成および遠心分離によるフソソームの生成および単離について説明する。これは、フソソームを単離することができる方法のうちの１つである。
フソソームは、以下のように調製される。およそ４×１０６のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）の１０ｃｍディッシュに播種する。播種の１日後、１５μｇのフソゲン発現プラスミドまたはウイルスが、細胞に送達される。フソゲン発現に十分な時間が経過した後、培地を１００μＭ ＡＴＰで補足された新鮮な培地と慎重に交換する。フソゲン発現の４８～７２時間後に上清を採取し、０．４５μｍフィルターでのろ過によって清澄化し、１５０，０００×ｇで１時間超遠心分離する。ペレット化した材料を、氷冷ＰＢＳに一晩再懸濁する。フソソームを、実験のために所望のバッファーに再懸濁する。
例えば、Ｍａｎｇｅｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９ ｎｏ．９，１６５６－１６６６，Ｓｅｐｔ．２０１１を参照されたい。
実施例１０：巨大な原形質膜フソソームを生成および単離する
この実施例では、小胞形成および遠心分離によるフソソームの生成および単離について説明する。これは、フソソームを単離することができる方法のうちの１つである。フソソームは、以下のように調製される。
簡単に説明すると、フソゲンを発現するＨｅＬａ細胞を、バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、溶液（ＧＰＭＶバッファー中１ｍＭのＤＴＴ、１２．５ｍＭのパラホルムアルデヒド、および１ｍＭのＮ－エチルマレイミド）に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートする。フソソームを、最初に１００×ｇで１０分間遠心分離して細胞を除去し、次いで２０，０００×ｇで１時間、４℃で採取することによって細胞から清澄化する。フソソームを、実験のために所望のバッファーに再懸濁する。
例えば、Ｓｅｚｇｉｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｕｓｉｎｇ ｇｉａｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｌａｓｍａ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．７（６）：１０４２－５１ ２０１２を参照されたい。
実施例１１：フソソームゴーストを生成および単離する
この実施例では、低張処理および遠心分離によるフソソームの生成および単離について説明する。これは、フソソームを産生することができる方法のうちの１つである。
最初に、フソソームは、主に細胞破裂およびフソソームが形成されるように低張処理を使用することによって、フソゲン（１０９細胞）を発現する間葉系幹細胞から単離される。細胞を、低浸透圧溶液、トリス－マグネシウムバッファー（ＴＭ、例えば、４℃でｐＨ７．４またはｐＨ８．６、ＨＣｌを用いて行われたｐＨ調整）に再懸濁する。細胞の膨潤を、位相差顕微鏡によってモニターする。細胞が膨潤してフソソームが形成されると、懸濁液をホモジナイザーに入れる。典型的に、細胞カウントおよび標準的なＡＯＰＩ染色で測定した場合、約９５％の細胞破裂で十分である。次いで、膜／フソソームを、保存のためにスクロース（０．２５Ｍ以上）に入れる。あるいは、フソソームを、当該技術分野において知られている他のアプローチ、例えば、穏やかな超音波処理（Ａｒｋｈｉｖ ａｎａｔｏｍｉｉ，ｇｉｓｔｏｌｏｇｉｉ ｉ ｅｍｂｒｉｏｌｏｇｉｉ；１９７９，Ａｕｇ，７７（８）５－１３；ＰＭＩＤ：４９６６５７）、凍結融解（Ｎａｔｕｒｅ．１９９９，Ｄｅｃ ２；４０２（６７６１）：５５１－５；ＰＭＩＤ：１０５９１２１８），Ｆｒｅｎｃｈ－ｐｒｅｓｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ ５４１，２０１４，Ｐａｇｅｓ １６９－１７６；ＰＭＩＤ：２４４２３２６５）、針通過（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ－ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｎｕｃｌｅａｒ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）または界面活性剤含有溶液中の溶解（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／８９９００）によって形成して、細胞を溶解することができる。
付着を避けるために、フソソームをプラスチックチューブに入れて遠心分離する。最上部の明るい灰色の薄層が主にフソソームを含む、積層ペレットが産生される。しかしながら、収量を増やすために、ペレット全体が処理される。遠心分離（例えば、４℃で１５分間、３，０００ｒｐｍ）および洗浄（例えば、２０倍量のトリスマグネシウム／ＴＭ－スクロース ｐＨ７．４）を繰り返すことができる。
次の工程では、フソソーム画分は、不連続なショ糖密度勾配での浮遊によって分離される。洗浄したペレットには少量の過剰な上清が残っており、これにはフソソーム、核、および不完全に破裂した全細胞が含まれている。ＴＭ ｐＨ８．６中の追加の６０％ｗ／ｗショ糖を懸濁液に添加して、屈折計で４５％ショ糖の読み取り値を取得する。この工程の後、全ての溶液は、ＴＭ ｐＨ８．６である。１５ｍＬの懸濁液を、ＳＷ－２５．２硝酸セルロースチューブに入れ、それぞれ４０％および３５％ｗ／ｗショ糖の１５ｍＬ層を添加し、次いで５ｍＬのＴＭ－ショ糖（０．２５Ｍ）を添加することによって、懸濁液上に不連続勾配を形成する。次いで、試料を２０，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離する。核沈殿物は、ペレットを形成し、不完全に破裂した全細胞は、４０％～４５％の界面で収集され、フソソームは、３５％～４０％の界面で収集される。複数のチューブからのフソソームを収集し、プールする。例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１１／０２４１７２Ａ２号を参照されたい。
実施例１２：押し出しによりフソソームを生成する
この実施例では、膜を介した押し出しによるフソソームの製造について説明する。
簡単に説明すると、フソゲンを発現する造血幹細胞は、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する無血清培地（Ｓｅｔ Ｖ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ５３９１３７－１ＭＬ）中、１×１０６ 細胞／ｍＬの密度で３７℃の懸濁液中にある。細胞を、ルアーロックシリンジで吸引し、使い捨ての５ ｍｍシリンジフィルターを１回通してきれいなチューブに入れる。膜が汚れて目詰まりした場合は、それを破棄し、新しいフィルターを取り付ける。細胞懸濁液全体がフィルターを通過した後、５ｍＬの無血清培地を、残りの物質をフィルター（複数可）を通して洗浄するプロセスで使用される全てのフィルターを通過させる。次いで、溶液を、濾液中の押し出されたフソソームと複合する。
フソソームは、５ｍｍ～０．２ｍｍの範囲のフィルター孔径がますます小さくなる同じ方法に従って押し出しを継続することにより、直径を更に小さくすることができる。最終的な押し出しが完了すると、懸濁液を遠心分離によってペレット化し（必要な時間および速度はサイズによって異なる）、培地に再懸濁される。
更に、このプロセスは、押し出しに対する既存の細胞骨格構造の影響を減らすために、アクチン細胞骨格阻害剤の使用で補うことができる。簡単に説明すると、１×１０６ 細胞／ｍＬ懸濁液を、５００ｎＭのラトランクリンＢ（ａｂ１４４２９１、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含む無血清培地でインキュベートし、３７℃ で３０分間、５％ＣＯ２の存在下でインキュベートする。インキュベーション後、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し、細胞をルアーロックシリンジに吸引し、前述のように押出しを行う。
フソソームをペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄して細胞骨格阻害剤を除去した後、培地に再懸濁する。
実施例１３：タンパク質を用いた化学処理によるフソソームの生成
この実施例では、フソソームを生成するための化学物質を介したフソゲンの送達について説明する。およそ５×１０６個の細胞または小胞が、フソゲンの化学物質を介した送達のために使用される。細胞または小胞を、５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に懸濁する。マスターミックスを設定するには、２４μｇの精製タンパク質フソゲンを、２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地と混合し、続いて２μＬの脂質トランスフェクション試薬３０００を含有する２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを添加する。細胞または小胞およびフソゲン溶液を、プレートを穏やかに回転させ、３７℃で６時間インキュベートすることによって混合し、その結果、フソゲンを細胞または小胞膜に組み込むであろう。次いで、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上に保持する。
Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０８：４４－５３，２０１５も参照されたい。
実施例１４：フソゲン含有リポソームでの処理によるフソソームの生成
この実施例は、フソソームを生成するためのソース細胞へのフソゲンのリポソーム媒介送達を説明している。およそ５×１０６個の細胞または小胞が、フソゲンのリポソーム媒介送達のために使用される。細胞または小胞を、５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に懸濁する。融合タンパク質を、ｎ－オクチルｂ－Ｄ－グルコピラノシドの存在下で細胞から精製する。ｎ－オクチルｂ－Ｄ－グルコピラノシドは、内在性膜タンパク質を溶解するために使用される中性界面活性剤である。次いで、フソゲンタンパク質を、Ｔｏｐ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２４：２９８０－２９８８，２００５に記載されるように、ｎ－オクチルｂ－Ｄ－グルコピラノシド懸濁タンパク質を、ｎ－オクチルｂ－Ｄ－グルコピラノシドで事前飽和されたＬＵＶと混合し、続いてｎ－オクチルｂ－Ｄ－グルコピラノシドを除去することによって、大きな（直径４００ｎｍ）単層小胞（ＬＵＶ）に再構築する。マスターミックスを設定するには、２４μｇの総フソゲンタンパク質を含むリポソームの塊を、５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地と混合する。次いで、リポソームおよびソース細胞または小胞の溶液を組み合わせ、プレートを穏やかに回転させ、フソゲン含有リポソームおよびソース細胞または小胞との融合を可能にする条件下、３７℃で６時間インキュベートすることにより、溶液全体を混合し、その結果、フソゲンタンパク質が、ソース細胞または小胞膜に組み込まれるであろう。次いで、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上に保持する。Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０８：４４－５３，２０１５も参照されたい。
実施例１５：細胞から自由に放出されたフソゲン微小胞を単離する
この実施例では、遠心分離によるフソソームの単離について説明する。これは、フソソームを単離することができる方法のうちの１つである。
フソソームは、分画遠心分離によってフソゲンを発現する細胞から単離される。最初に＞１００，０００×ｇで１時間の超遠心分離により、培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清）から小さな粒子を除去する。次いで、清澄化した培地を使用して、フソゲンを発現するマウス胚性線維芽細胞を増殖させる。２００×ｇで１０分間遠心分離することにより、細胞を培養培地から分離する。上清を収集し、５００×ｇで１０分間を２回、２，０００×ｇで１５分間を１回、１０，０００×ｇで３０分間を１回、および７０，０００×ｇで６０分間を１回、順次遠心分離した。自由に放出されたフソソームを、最後の遠心分離工程中にペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、７０，０００×ｇで再ペレット化した。最終的なペレットをＰＢＳに再懸濁する。
また、Ｗｕｂｂｏｌｔｓ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１０９６３－１０９７２ ２００３を参照されたい。
実施例１６：フソソームの物理的除核
この実施例では、細胞骨格の不活化および遠心分離によるフソソームの除核について説明する。これは、フソソームを修飾することができる方法のうちの１つである。
フソソームは、フソゲンを発現する哺乳動物の初代または不死化細胞株から単離される。細胞は、アクチン骨格阻害剤での処理および超遠心分離によって除核される。簡単に説明すると、Ｃ２Ｃ１２細胞を収集し、ペレット化し、１２．５％フィコール４００（Ｆ２６３７、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）および５００ｎＭラトランクリンＢ（ａｂ１４４２９１、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含むＤＭＥＭに再懸濁し、３７℃＋５％ＣＯ２で３０分間インキュベートする。懸濁液を、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で一晩平衡化された、ＤＭＥＭに溶解した漸増濃度のフィコール４００（１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、層あたり３ｍＬ）を含有する超遠心分離チューブに慎重に層状化する。フィコール勾配をＴｉ－７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ，ＣＡ）において、３２，３００ＲＰＭ、３７℃で６０分間回転させる。超遠心分離後、１６～１８％のフィコールで見出されたフソソームを取り除き、ＤＭＥＭで洗浄し、ＤＭＥＭに再懸濁する。
実施例３５に記載されているようにＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で核内容物を染色し、続いてフローサイトメトリーおよび／またはイメージングを使用して、核の排出を確認する。
実施例１７：照射によりフソソームを修飾する
次の実施例では、γ線照射によるフソソームの修飾について説明する。理論に拘束されることなく、γ線照射は、ＤＮＡに二本鎖切断を引き起こし、細胞をアポトーシスに駆り立てる可能性がある。
最初に、フソゲンを発現する細胞を、組織培養フラスコまたはプレート上でコンフルエントな密度以下で単層で培養する（例えば、細胞を培養またはプレーティングすることにより）。次いで、培地をコンフルエントなフラスコから取り出し、細胞をＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＨＢＳＳですすぎ、トリプシン処理して細胞を培養マトリックスから除去する。次いで、細胞ペレットをペニシリン／ストレプトマイシンを含まない１０ｍＬの組織培養培地に再懸濁し、１００ｍｍペトリ皿に移す。ペレット内の細胞数は、１５０ｃｍ２フラスコでの１０～１５個のコンフルエントなＭＥＦ培養から得られるものと同等である必要がある。次いで、細胞をγ線源から４０００ラドに曝露して、フソソームを生成する。次いで、フソソームを洗浄し、使用される最終バッファーまたは培地に再懸濁する。
実施例１８：化学処理によりフソソームを修飾する
次の実施例では、マイトマイシンＣ処理によるフソソームの修飾について説明する。いかなる特定の理論にも拘束されることなく、マイトマイシンＣ処理は、細胞周期を不活化することによってフソソームを修飾する。
最初に、フソゲンを発現する細胞を、組織培養フラスコまたはプレートにおいてコンフルエントな密度で単層から培養する（例えば、細胞を培養またはプレーティングすることにより）。１ｍｇ／ｍＬのマイトマイシンＣストック溶液を培地に添加して、最終濃度を１０μｇ／ｍＬにする。次いで、プレートを２～３時間インキュベーターに戻す。次いで、培地をコンフルエントなフラスコから取り出し、細胞をＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＨＢＳＳですすぎ、トリプシン処理して細胞を培養マトリックスから除去する。次いで、細胞を洗浄し、使用される最終バッファーまたは培地に再懸濁する。
例えば、Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＭＥＦ）Ｆｅｅｄｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｄａｖｉｄ Ａ．Ｃｏｎｎｅｒ ２００１を参照されたい。
実施例１９：フソソームにおける転写活性の欠如
この実施例は、フソソーム生成に使用される親細胞、例えば、ソース細胞と比較したフソソームにおける転写活性を定量化する。幾つかの実施形態では、転写活性は、親細胞、例えば、ソース細胞と比較して、フソソームでは低いか、または存在しないであろう。
フソソームは、治療薬を送達するためのシャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）である。細胞または局所組織環境に高効率で送達できるｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、および／または細胞小器官などの治療薬を使用して、通常は活性ではない、またはレシピエント組織の病理学的低レベルもしくは高レベルで活性ではない経路を調節することができる。幾つかの実施形態では、フソソームが転写することができない、またはフソソームがそれらの親細胞よりも低い転写活性を有するという観察は、核物質の除去が十分に起こったことを実証するであろう。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。次いで、フソソームを生成するために使用される十分な数のフソソームおよび親細胞を、２０％ウシ胎仔血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、および蛍光タグ付け可能なアルキン－ヌクレオシドＥＵを含むＤＭＥＭの６ウェル低付着マルチウェルプレートに、３７℃および５％ＣＯ２で１時間プレーティングする。陰性対照の場合、十分な数のフソソームおよび親細胞もまた、２０％ウシ胎仔血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むが、アルキン－ヌクレオシドＥＵを含まないＤＭＥＭのマルチウェルプレートにもプレーティングする。
１時間のインキュベーション後、イメージングキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の製造元の指示に従って試料を処理する。陰性対照を含む細胞およびフソソーム試料を１×ＰＢＳバッファーで３回洗浄し、１×ＰＢＳバッファーに再懸濁し、励起用の４８８ｎｍアルゴンレーザーおよび５３０＋／－３０ｎｍ発光を使用してフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で分析する。取得および分析にはＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用した。光散乱チャネルを線形ゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールで設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を分析する。
幾つかの実施形態では、陰性対照において５３０＋／－３０ｎｍの発光によって測定される転写活性は、アルキン－ヌクレオシドＥＵの省略のためにヌルになるであろう。幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞よりも約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の転写活性を有するであろう。
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００８， Ｏｃｔ １４；１０５（４１）：１５７７９－８４．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０８４８０１０５．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｏｃｔ ７．も参照されたい。
実施例２０：ＤＮＡ複製または複製活性の欠如
この実施例では、フソソームでのＤＮＡ複製を定量化する。幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞と比較して低い割合でＤＮＡを複製する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソームおよび親細胞のＤＮＡ複製活性を、蛍光タグ付け可能なヌクレオチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 番号Ｃ１０６３２）の組み込みによって評価する。ジメチルスルホキシドを含むＥｄＵ原液を調製した後、フソソームおよび同数の細胞を、最終濃度１０μＭのＥｄＵと共に２時間インキュベートする。次いで、試料を３．７％ＰＦＡを使用して１５分間固定し、１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄し、１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中の０．５％界面活性剤溶液で１５分間透過処理する。
透過処理後、０．５％界面活性剤を含むＰＢＳバッファーに懸濁したフソソームおよび細胞を、１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄し、１×ＰＢＳバッファー、ＣｕＳＯ４（成分Ｆ）、アジド－ｆｌｕｏｒ ４８８、１×反応バッファー添加剤の反応カクテル中、２１℃で３０分間インキュベートする。
フソソームおよび細胞ＤＮＡ複製活性の陰性対照を、上記と同じように処理された試料で作製するが、１×反応カクテルにアジド－ｆｌｕｏｒ ４８８は含まれていない。
次いで、細胞およびフソソームの試料を洗浄し、１×ＰＢＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析する。フローサイトメトリーを、４８８ｎｍのアルゴンレーザー励起でＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行い、発光スペクトルを５３０＋／－３０ｎｍで収集する。取得および分析には、ＦＡＣＳ分析ソフトウェアを使用する。光散乱チャネルを線形ゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールで設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を分析する。相対的なＤＮＡ複製活性を、各試料のアジド－ｆｌｕｏｒ ４８８の強度の中央値に基づいて計算する。全ての事象を、前方および側方散乱チャネルで捕捉する（あるいは、ゲートを適用して、フソソーム集団のみを選択することもできる）。フソソームの正規化された蛍光強度値は、フソソームの中央値蛍光強度値から、それぞれの陰性対照試料の中央値蛍光強度値を差し引くことによって決定される。次いで、フソソーム試料の正規化された相対的なＤＮＡ複製活性は、ＤＮＡ複製活性の定量的測定値を生成するために、それぞれの有核細胞試料に対して正規化される。
幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞よりも少ないＤＮＡ複製活性を有する。
Ｓａｌｉｃ，２４１５－２４２０，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７１２１６８１０５も参照されたい。
実施例２１：核酸カーゴでフソソームを修飾するためのエレクトロポレーション
この実施例では、核酸カーゴを用いたフソソームのエレクトロポレーションについて説明する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。およそ１０９個のフソソームおよび１μｇの核酸、例えば、ＲＮＡを、エレクトロポレーションバッファー（水中１．１５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）、２５ｍＭの塩化カリウム、６０％ｗ／ｖのイオジキサノール）中で混合する。エレクトロポレーションシステム（ＢｉｏＲａｄ，１６５－２０８１）を使用し、単一の４ｍｍキュベットを使用してフソソームをエレクトロポレーションする。フソソームおよび核酸を、４００Ｖ、１２５μＦ、および∞オームでエレクトロポレーションし、キュベットを速やかに氷に移す。エレクトロポレーション後、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上に保持する。
例えば、Ｋａｍｅｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ＫＲＡＳ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７を参照されたい。
実施例２２：タンパク質カーゴでフソソームを修飾するためのエレクトロポレーション
この実施例では、タンパク質カーゴを用いたフソソームのエレクトロポレーションについて説明する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。およそ５×１０６個のフソソームを、エレクトロトランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するエレクトロポレーションのために使用する。マスターミックスを設定するには、２４μｇの精製タンパク質カーゴを再懸濁バッファー（キットで提供される）に添加する。混合物を室温で１０分間インキュベートする。その間、フソソームを、滅菌試験管に移し、５００×ｇで５分間遠心分離する。上清を吸引し、ペレットをＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まない１ｍＬのＰＢＳに再懸濁する。次いで、タンパク質カーゴを含むバッファーを使用して、フソソームのペレットを再懸濁する。次いで、フソソーム懸濁液を、パルス電圧、パルス幅、およびパルス数が変化する最適化条件に使用する。エレクトロポレーション後、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上に保持する。
例えば、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０８：４４－５３，２０１５を参照されたい。
実施例２３：核酸カーゴで修飾するためのフソソームの化学処理
この実施例では、化学処理による核酸カーゴのフソソームへのロードについて説明する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。およそ１０６個のフソソームを、４℃で５分間１０，０００ｇでの遠心分離によってペレット化する。次いで、ペレット化したフソソームを、２０μｇのＤＮＡを含むＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁する。フソソーム：ＤＮＡ溶液を中性界面活性剤で処理して、フソソーム膜を通過するＤＮＡ透過性を高める（試薬Ｂ、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、カタログ番号ＩＳＫ－ＧＮ－００１－ＥＸ）。溶液を再度遠心分離し、ペレットを硫酸プロタミンなどの正電荷を帯びたペプチドを含むバッファーに再懸濁して、ＤＮＡをロードしたフソソームと標的レシピエント細胞との間の親和性を高める（試薬Ｃ、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，ＬＴＤ、カタログ番号ＩＳＫ－ＧＮ－００１－ＥＸ）。ＤＮＡをロードした後、ロードされたフソソームを使用前に氷上に保持する。
Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｓｉｇｅｎｉｃ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，２００３も参照されたい。
実施例２４：タンパク質カーゴで修飾するためのフソソームの化学処理
この実施例では、化学処理によるタンパク質カーゴのフソソームへのロードについて説明する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。およそ１０６個のフソソームを、４℃で５分間１０，０００ｇでの遠心分離によってペレット化する。次いで、ペレット化したフソソームを、硫酸プロタミンなどの正電荷を帯びたペプチドを含むバッファーに再懸濁して、フソソームとカーゴタンパク質との間の親和せを高める（試薬Ａ、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，ＬＴＤ、カタログ番号ＩＳＫ－ＧＮ－００１－ＥＸ）。次に、１０μｇのカーゴタンパク質をフソソーム溶液に添加し、続いて中性界面活性剤を添加して、フソソーム膜を通過するタンパク質の透過性を高める（試薬Ｂ、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，ＬＴＤ、カタログ番号ＩＳＫ－ＧＮ－００１－ＥＸ）。溶液を再度遠心分離し、ペレットを硫酸プロタミンなどの正電荷を帯びたペプチドを含むバッファーに再懸濁して、タンパク質をロードしたフソソームと標的レシピエント細胞との間の親和性を高める（試薬Ｃ、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，ＬＴＤ、カタログ番号ＩＳＫ－ＧＮ－００１－ＥＸ）。タンパク質をロードした後、ロードされたフソソームを使用前に氷上に保持する。
Ｙａｓｏｕｋａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＶＪ－Ｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｌｌｅｒｇｅｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００７も参照されたい。
実施例２５：核酸カーゴで修飾するためのフソソームのトランスフェクション
この実施例では、核酸カーゴのフソソームへのトランスフェクションについて説明する。フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。
５×１０６個のフソソームが、Ｏｐｔｉ－Ｍｅｍに維持される。０．５μｇの核酸を２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地と混合した後、２μＬの脂質トランスフェクション試薬２０００を含有する２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを添加する。核酸、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、および脂質トランスフェクション試薬の混合物を室温で１５分間維持した後、フソソームに添加する。プレートを穏やかに回転させ、３７℃で６時間インキュベートすることにより、溶液全体を混合する。次いで、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上に保持する。
Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０８：４４－５３，２０１５も参照されたい。
実施例２６：タンパク質カーゴで修飾するためのフソソームのトランスフェクション
この実施例では、タンパク質カーゴのフソソームへのトランスフェクションについて説明する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。５×１０６個のフソソームが、Ｏｐｔｉ－Ｍｅｍに維持される。０．５μｇの精製タンパク質を２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地と混合した後、２μＬの脂質トランスフェクション試薬３０００を含有する２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを添加する。タンパク質、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、および脂質トランスフェクション試薬の混合物を室温で１５分間維持した後、フソソームに添加する。プレートを穏やかに回転させ、３７℃で６時間インキュベートすることにより、溶液全体を混合する。次いで、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上に保持する。
Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０８：４４－５３，２０１５も参照されたい。
実施例２７：脂質二重層構造を有するフソソーム
この実施例では、フソソームの組成について説明する。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、中心に内腔を有する脂質二重層構造を含むであろう。
理論に拘束されることを望まないが、フソソームの脂質二重層構造は、標的細胞との融合を促進し、フソソームが異なる治療法をロードするのを可能にする。
フソソームは、前の実施例に記載された方法を使用して新たに調製される。陽性対照は、ネイティブ細胞株（ＨＥＫ２９３）であり、陰性対照は、冷ＤＰＢＳおよび膜破壊ＨＥＫ２９３細胞調製物であり、これは３６ゲージ針を５０回通過させた。
試料をエッペンドルフチューブ内で遠心沈殿させ、上清を慎重に取り除く。次いで、予熱した固定液（０．１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含む０．０５Ｍのカコジル酸バッファー中の２．５％グルタルアルデヒド、使用前に３７℃で３０分間保持）を試料ペレットに添加し、室温で２０分間保持する。固定後、試料をＰＢＳで２回洗浄する。四酸化オスミウム溶液を試料ペレットに添加し、３０分間インキュベートする。ＰＢＳで１回すすいだ後、３０％、５０％、７０％、および９０％のヘキシレングリコールを添加し、各々１５分間回転させながら洗浄する。次いで、１００％ヘキシレングリコールを３回、１０分ずつ回転させながら添加する。
樹脂をヘキシレングリコールと１：２の比で複合し、次いで試料に添加して、室温で２時間インキュベートする。インキュベーション後、溶液を１００％樹脂と交換し、４～６時間インキュベートする。この工程を、新鮮な１００％樹脂でもう一度繰り返す。次いで、新鮮な１００％樹脂と交換し、レベルを深さ約１～２ｍｍに調整し、８～１２時間焼成する。エッペンドルフチューブを切断し、試料と一緒にキャストしたエポキシ片を更に１６～２４時間焼成する。次いで、エポキシキャストを細かく切断して、細胞のある側をメモする。細片を、市販の５分間エポキシ接着剤を使用して、セクショニングのためにブロックに接着する。透過型電子顕微鏡（ＪＯＥＬ、ＵＳＡ）を使用して、８０ｋＶの電圧で試料を画像化する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、陽性対照（ＨＥＫ２９３細胞）と同様の脂質二重層構造を示し、ＤＰＢＳ対照では明らかな構造は観察されない。幾つかの実施形態では、破壊された細胞調製物において内腔構造は観察されないであろう。
実施例２８：フソゲンの発現を検出する
この実施例では、フソソームにおけるフソゲンの発現を定量化する。
ピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームと、クローン化フラグメントのオープンリーディングフレーム（例えば、小胞性口内炎ウイルス［ＶＳＶ－Ｇ］からの糖タンパク質、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＃ＯＧ５９２）とを含むトランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を、エレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）および２９３Ｔ細胞株特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して２９３Ｔにエレクトロポレーションする。
２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで３～５日間、１μｇ／μＬピューロマイシンで選択した後、前の実施例に記載される方法のうちのいずれか１つにより、安定して発現する細胞株から、または対照細胞からフソソームを調製する。
次いで、フソソームを１×ＰＢＳ、氷冷溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０１１１７））で洗浄し、毎回１０～１５秒で３回超音波処理し、１６，０００×ｇで２０分間遠心分離した。安定的にトランスフェクトされた細胞または対照細胞から調製され、ＶＳＶ－Ｇタンパク質の標準と比較されたフソソームからＶＳＶ－Ｇの非膜特異的濃度を決定するために、ＶＳＶ－Ｇに特異的なプローブを用いて回収された上清画分に対してウエスタンブロットを行う。
幾つかの実施形態では、安定的にトランスフェクトされた細胞からのフソソームは、安定的にトランスフェクトされなかった細胞から生成されたフソソームよりも多くのＶＳＶ－Ｇを有するであろう。
実施例２９：フソゲンの定量化
この実施例では、フソソームあたりのフソゲンの絶対数の定量化について説明する。
フソソーム組成物を、前の実施例に記載のように操作してＧＦＰでタグ付けされたフソゲン（ＶＳＶ－Ｇ）を発現することを除いて、前の実施例に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生する。更に、陰性対照のフソソームは、フソゲン（ＶＳＶ－Ｇ）またはＧＦＰが存在しない状態で操作される。
次いで、ＧＦＰタグ付きフソゲンを含むフソソームおよび陰性対照（複数可）を、以下のようにフソゲンの絶対数についてアッセイする。市販の組換えＧＦＰを段階希釈して、タンパク質濃度の検量線を作成する。次いで、検量線のＧＦＰ蛍光と既知量のフソソームの試料を、ＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルターおよび５２５／３９発光フィルター）を使用して蛍光光度計で測定しフソソーム調製物中のＧＦＰ分子の平均モル濃度を計算する。次いで、モル濃度をＧＦＰ分子の数に変換し、試料あたりのフソソームの数で割って、フソソームあたりのＧＦＰタグ付きフソゲン分子の平均数を求め、これにより、フソソームあたりのフソゲンの数の相対的な推定値が得られる。
幾つかの実施形態では、ＧＦＰ蛍光は、フソゲンまたはＧＦＰが存在しない陰性対照と比較して、ＧＦＰタグを有するフソソームで高くなるであろう。幾つかの実施形態では、ＧＦＰ蛍光は、存在するフソゲン分子の数に関連している。
あるいは個々のフソソームは、製造元の指示に従って単一細胞分取システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用して単離され、ｑＲＴ－ＰＣＲは、Ｃｔ値に基づいてフソゲンまたはＧＦＰのｃＤＮＡレベルを定量化するように設計された市販のプローブセット（Ｔａｑｍａｎ）およびマスターミックスを使用して実施される。フソゲン遺伝子またはＧＦＰ遺伝子のクローン化されたフラグメントと同じ配列のＲＮＡ標準を合成（Ａｍｓｂｉｏ）により生成した後、段階希釈で単一細胞分取システムｑＲＴ－ＰＣＲ実験反応に添加して、フソゲンまたはＧＦＰのＲＮＡの濃度に対するＣｔの標準曲線を確立する。
フソソームからのＣｔ値を、フソソームあたりのフソゲンまたはＧＦＰ ＲＮＡの量を決定するために、標準曲線と比較する。
幾つかの実施形態では、フソゲンおよびＧＦＰ ＲＮＡは、フソゲンまたはＧＦＰが存在しない陰性対照と比較して、フソゲンを発現するように操作されたフソソームで高くなるであろう。
フソゲンは、前述のように脂質二重層構造を分析し、本明細書の他の実施例に記載されるようにＬＣ－ＭＳによって脂質二重層中のフソゲンを定量化することによって、脂質二重層内で更に定量化され得る。
実施例２８：フソソームの平均径を測定する
この実施例では、フソソームの平均径の測定について説明する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソームを測定して、市販のシステム（ｉＺＯＮ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、平均径を決定した。このシステムは、製造元の指示に従って、ソフトウェアおよび４０ｎｍ～１０μｍの直径範囲内の粒子を分析するように設計されたナノポアと共に使用される。フソソームおよび親細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁して、最終濃度範囲を０．０１～０．１μｇタンパク質／ｍＬにする。他の機器設定を、以下の表に示すように調整する：
Figure 2022513040000129
全てのフソソームを単離から２時間以内に分析する。幾つかの実施形態では、フソソームは、親ソース細胞よりも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内で大きい直径を有するであろう。
実施例３１：フソソームの平均径分布を測定する
この実施例では、フソソームの径分布の測定について説明する。
フソソームを、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって生成し、前の実施例に記載されたような市販のシステムを使用して平均粒径を決定するために試験する。幾つかの実施形態では、中央値を中心とするフソソームの１０％、５０％、および９０％の直径しきい値を親細胞と比較して、フソソームの径分布を評価する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、試料の１０％、５０％、または９０％以内で、親細胞の径分布の変動の約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満、またはそれ以下を有するであろう。
実施例３２：フソソームの平均量
この実施例では、フソソームの平均量の測定について説明する。理論に拘束されることを望まないが、フソソームのサイズ（例えば、直径、量、表面積等）を変えることは、それらを別個のカーゴ積載、治療計画、または適用に関して用途の広いものにすることができる。
フソソームを、前の実施例に記載されているように調製する。陽性対照は、既知のサイズのＨＥＫ２９３細胞またはポリスチレンビーズである。陰性対照は、３６ゲージの針を約５０回通過するＨＥＫ２９３細胞である。
前の実施例で説明したように、透過型電子顕微鏡による分析を使用して、フソソームのサイズを決定する。フソソームの直径を測定し、次に体積を計算する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、直径およそ５０ｎｍ以上の平均サイズを有するであろう。
実施例３３：フソソームの平均密度
フソソーム密度を、Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２に記載されているように連続ショ糖勾配遠心分離アッセイを介して測定する。フソソームは、前の実施例に記載されているように得られる。
最初に、ショ糖勾配を調製する。２Ｍおよび０．２５ショ糖溶液は、４ｍＬのＨＥＰＥＳ／スクロース原液と１ｍＬのＨＥＰＥＳ原液または０．５ｍＬのＨＥＰＥＳ／スクロース原液と４．５ｍＬのＨＥＰＥＳ原液とをそれぞれ混合することによって生成される。これらの２つの画分は、全てのシャッターを閉じた状態でグラジエントメーカーにロードされ、マグネチックスターラーを備えた近位コンパートメントには２Ｍスクロース溶液、および遠位コンパートメントには０．２５Ｍスクロース溶液がロードされる。グラジエントメーカーをマグネチックスターラープレートに置き、近位コンパートメントと遠位コンパートメントの間のシャッターを開き、マグネチックスターラープレートをオンにする。ＨＥＰＥＳ原液を次のように作製する：２．４ｇのＮ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、最終２０ｍＭ）、３００ Ｈ２Ｏを、１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整し、最後にＨ２Ｏで容量を５００ｍＬに調整する。ＨＥＰＥＳ／ショ糖原液を次のように作製する：２．４ｇのヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、最終２０ｍＭ）、４２８ｇのプロテアーゼ不含ショ糖（ＩＣＮ、最終２．５Ｍ）、１５０ｍＬのＨ２Ｏを、１０ＮのＮａＯＨでｐＨ７．４に調整し、最後にＨ２Ｏで容量を５００ｍＬに調整する。
フソソームを２ｍＬのＨＥＰＥＳ／ショ糖原液に再懸濁し、ＳＷ ４１遠心分離チューブの底に注ぐ。外側のチューブを、２ｍＬのフソソームのすぐ上にあるＳＷ ４１チューブに配置する。外側のシャッターを開き、２Ｍ（下）から０．２５Ｍ（上）の連続したショ糖勾配をフソソームの上にゆっくりと注ぐ。ＳＷ ４１チューブは、勾配が注がれるときに下げられるため、チューブは常に液体の上部よりわずかに上になる。
勾配のある全てのチューブは、互いに、または同じ重量のスクロース溶液を有する他のチューブとバランスが取れている。勾配を、ブレーキを低く設定したＳＷ ４１スイングバケットローターで、２１０，０００×ｇ、４℃で一晩（≧１４時間）遠心分離する。
マイクロピペッターを用いて、上から下に１１個の１ｍＬ画分を収集し、ＴＬＡ－１００．３ローター用の３ｍＬチューブに入れる。試料を取っておき、９６ウェルプレートの別々のウェルで、各画分５０μＬを使用して屈折率を測定する。プレートを蒸発を防ぐために粘着ホイルで覆い、室温で１時間以内で保管する。屈折計を使用して、９６ウェルプレートに保存された材料からの各画分１０～２０μＬの屈折率（したがって、スクロース濃度、および密度）を測定する。
屈折率をｇ／ｍＬに変換するための表は、Ｂｅｃｋｍａｎのウェブサイトからダウンロードできる超遠心分離カタログにおいて入手可能ある。
次に、各画分をタンパク質含有量分析のために調製する。２ミリリットルの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を各１ｍＬの勾配画分に添加し、２～３回ピペッティングして混合する。各チューブの片側に油性ペンでマークを付け、チューブをＴＬＡ－１００．３ローターにマークされた側を上にして配置する。
希釈画分を含む３ｍＬチューブを、１１０，０００×ｇ、４℃で１時間遠心分離する。ＴＬＡ－１００．３ローターは６本のチューブを保持するため、他のチューブを遠心分離できるようになるまで４℃に保ったまま、勾配ごとに２回の遠心分離を行う。
上清を３ｍＬチューブの各々から吸引し、ペレットの上に滴を残す。ペレットはおそらく見えないが、その位置はチューブのマークから推測できる。目に見えないペレットを再懸濁し、マイクロ遠心管に移す。各再懸濁画分の半分を、別の実施例に記載されているビシンコニン酸アッセイによるタンパク質含有量分析に使用する。これにより、フソソーム調製物の様々な勾配画分にわたり分布が得られる。この分布を、フソソームの平均密度を決定するために使用する。後半の体積画分を－８０℃で保存し、タンパク質分析で画分全体のフソソーム分布が明らかになると、他の目的（例えば、機能分析または免疫分離による更なる精製）に使用される。
幾つかの実施形態では、このアッセイまたは同等物を使用して、複数のフソソームを含む調製物の平均密度は、１．２５ｇ／ｍＬ ＋／－０．０５標準偏差となるであろう。幾つかの実施形態では、調製物の平均密度は、１～１．１、１．０５～１．１５、１．１～１．２、１．１５～１．２５、１．２～１．３、または１．２５～１．３５ｇ／ｍＬの範囲にあるであろう。幾つかの実施形態では、調製物の平均密度は、１未満または１．３５を超えるであろう。
実施例３４：フソソーム中のオルガネラ含有量を測定する
この実施例では、フソソーム中のオルガネラの検出について説明する。
フソソームを、本明細書に記載されるように調製した。小胞体（ＥＲ）およびミトコンドリアの検出のために、フソソームまたはＣ２Ｃ１２細胞を１μＭのＥＲ染色（Ｅ３４２５１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）および１μＭのミトコンドリア染色（Ｍ２２４２６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で染色した。リソソームの検出のために、フソソームまたは細胞を、５０ｎＭのリソソーム染色液（Ｌ７５２６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で染色した。
染色されたフソソームを、フローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で実行し、以下の表に従って各色素の蛍光強度を測定した。オルガネラの存在の検証は、染色されたフソソームの蛍光強度を、染色されていないフソソーム（陰性対照）および染色された細胞（陽性対照）と比較することによって行った。
除核後５時間で、小胞体（図１）、ミトコンドリア（図２）、およびリソソーム（図３）に対して陽性に染色されたフソソーム。
Figure 2022513040000130
実施例３５：フソソームの核含有量を測定する
この実施例では、フソソーム中の核含有量の測定について説明する。フソソームに核が含まれていないことを検証するために、フソソームを１μｇｍＬ－１ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２および１μＭ ＣａｌｃｅｉｎＡＭ（Ｃ３１００ＭＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で染色し、染色したフソソームを、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で実行し、以下の表に従って、各色素の蛍光強度を決定する。幾つかの実施形態では、細胞質ゾルの存在（ＣａｌｃｅｉｎＡＭ）および核の不在（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）の検証は、染色されたフソソームの平均蛍光強度を、染色されていないフソソームおよび染色された細胞と比較することによって行われる。
Figure 2022513040000131
実施例３６：核エンベロープ含有量を測定する
この実施例では、除核されたフソソームの核エンベロープ含有量の測定について説明する。核エンベロープは、細胞の細胞質からＤＮＡを分離する。
幾つかの実施形態では、精製されたフソソーム組成物は、本明細書に記載のように除核されたＨＥＫ－２９３Ｔ（２９３［ＨＥＫ－２９３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））などの哺乳動物細胞を含む。この実施例では、フソソーム生成後に残っている無傷の核膜の量を測定するためのプロキシとして、様々な核膜タンパク質の定量化について説明する。
この実施例では、１０×１０６ＨＥＫ－２９３Ｔおよび１０×１０６ＨＥＫ－２９３Ｔから調製された等量のフソソームを、３．７％ＰＦＡを使用して１５分間固定し、１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄し、同時に透過処理した後、１％ウシ血清アルブミンおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（ｐＨ７．４）を含む１×ＰＢＳバッファーを使用して１５分間ブロックする。透過処理後、フソソームおよび細胞を、様々な一次抗体、例えば、１％ウシ血清アルブミンおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（ｐＨ７．４）を含む１×ＰＢＳバッファーで希釈した製造元推奨濃度の（抗ＲａｎＧＡＰ１抗体［ＥＰＲ３２９５］（Ａｂｃａｍ－ａｂ９２３６０）、抗ＮＵＰ９８抗体［ＥＰＲ６６７８］－核膜孔マーカー（Ａｂｃａｍ－ａｂ１２４９８０）、抗核膜孔複合体タンパク質抗体［Ｍａｂ４１４］－（Ａｂｃａｍ－ａｂ２４６０９）、抗インポーチン７抗体（Ａｂｃａｍ－ａｂ２１３６７０）と共に、４℃で１２時間インキュベートする。次いで、フソソームおよび細胞を１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄し、１％ウシ血清アルブミンおよび０．５％界面活性剤（ｐＨ７．４）を含む１×ＰＢＳバッファーで希釈した製造元推奨濃度の、先に指定した一次抗体を検出する適切な蛍光二次抗体と共に、２１℃で２時間インキュベートする。次いで、フソソームおよび細胞を１×ＰＢＳバッファーで洗浄し、１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を含む３００Ｌの１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に再懸濁して、２０μｍのＦＡＣＳチューブで濾過し、フローサイトメトリーで分析する。
陰性対照は、同じ染色手順を使用して生成されるが、一次抗体は追加されない。フローサイトメトリーは、４８８ｎｍのアルゴンレーザー励起でＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で実施し、５３０＋／－３０ｎｍの発光スペクトルを収集する。取得および分析には、ＦＡＣＳ取得ソフトウェアを使用する。光散乱チャネルを線形ゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールで設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を分析する。相対的な無傷の核膜含有量を、各試料の蛍光強度の中央値に基づいて計算する。全ての事象を、前方および側方散乱チャネルで捕捉する。
フソソームの正規化された蛍光強度値は、フソソームの中央値蛍光強度値から、それぞれの陰性対照試料の中央値蛍光強度値を差し引くことによって決定される。次いで、無傷の核膜含有量の定量的測定値を生成するために、フソソーム試料の正規化された蛍光をそれぞれの有核細胞試料に対して正規化する。
幾つかの実施形態では、除核されたフソソームは、有核親細胞と比較して１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満の蛍光強度または核エンベロープ含有量を含むであろう。
実施例３７：クロマチンレベルを測定する
この実施例では、除核されたフソソームのクロマチンの測定について説明する。
ＤＮＡを凝縮してクロマチンにし、核内に収めることができる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生される精製フソソーム組成物は、低レベルのクロマチンを含むであろう。
前述の方法のうちのいずれかによって調製された除核フソソームおよび陽性対照細胞（例えば、親細胞）を、ヒストンタンパク質Ｈ３またはヒストンタンパク質Ｈ４に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡを使用してクロマチン含有量についてアッセイする。ヒストンはクロマチンの主要なタンパク質成分であり、Ｈ３およびＨ４が主要なヒストンタンパク質である。
ヒストンは、市販のキット（例えば、Ａｂｃａｍヒストン抽出キット（ａｂ１１３４７６））または当技術分野で知られている他の方法を使用して、フソソーム調製物および細胞調製物から抽出される。これらのアリコートを、使用するまで－８０℃で保存する。標準液の段階希釈は、精製ヒストンタンパク質（Ｈ３またはＨ４）をアッセイバッファーの溶液で１～５０ｎｇ／μＬに希釈することによって調製する。アッセイバッファーは、製造元が提供するキット（例えば、Ａｂｃａｍ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ４ Ｔｏｔａｌ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ａｂ１５６９０９）またはＡｂｃａｍ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３ ｔｏｔａｌ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ａｂ１１５０９１））から入手することができる。アッセイバッファーを、抗ヒストンＨ３または抗Ｈ４抗体でコーティングされた４８ウェルまたは９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、試料または標準対照をウェルに添加して、各ウェルの総量を５０μＬにする。次にプレートを覆い、３７度で９０～１２０分間インキュベートする。
インキュベーション後、プレートに付着した抗ヒストン抗体に結合したヒストンを検出用に調製する。上清を吸引し、プレートを１５０μＬの洗浄バッファーで洗浄する。次いで、抗ヒストンＨ３または抗Ｈ４捕捉抗体を含む捕捉バッファーを、５０μＬの量および１μｇ／ｍＬの濃度でプレートに添加する。次に、プレートをオービタルシェーカー上で室温で６０分間インキュベートする。
次に、プレートを吸引し、洗浄バッファーを使用して６回洗浄する。次に、捕捉抗体によって活性化可能なシグナルレポーター分子を各ウェルに添加する。プレートを覆い、室温で３０分間インキュベートする。次に、プレートを吸引し、洗浄バッファーを使用して４回洗浄する。停止液を加えることにより反応を停止させる。プレートの各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取り、各試料のヒストン濃度を、４５０ｎｍでの吸光度対標準試料中のヒストン濃度の標準曲線に従って計算する。
幾つかの実施形態では、フソソーム試料は、有核親細胞のヒストン濃度の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満を含むであろう。
実施例３８：フソソーム中のＤＮＡ含有量を測定する
この実施例では、有核の対応物と比較した、フソソーム中のＤＮＡ量の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、有核の対応物よりも少ないＤＮＡを有するであろう。核酸レベルは、全ＤＮＡまたは特定のハウスキーピング遺伝子のレベルを測定することによって決定される。幾つかの実施形態では、ＤＮＡ含有量が減少している、またはＤＮＡを実質的に欠いているフソソームは、遺伝子を複製、分化、または転写することができず、被験体に投与されたときにそれらの用量および機能が変化しないことを保証する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソームおよびソース細胞のタンパク質によって測定されたものと同じ質量の調製物を使用して、全ＤＮＡを単離し（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙカタログ番号６９５０４などのキットを使用）、続いて標準的な分光法を使用してＤＮＡ濃度を決定し、（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて）ＤＮＡによる吸光度を評価する。
幾つかの実施形態では、除核されたフソソーム中のＤＮＡの濃度は、親細胞中よりも約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、またはそれ以下であろう。
あるいは、ＧＡＰＤＨなどの特定のハウスキーピング遺伝子の濃度を、半定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて有核細胞とフソソームとの間で比較することができる。全ＤＮＡを親細胞から単離し、フソソームおよびＤＮＡ濃度を、本明細書に記載されるように測定する。ＲＴ－ＰＣＲを、次の反応テンプレートを使用してＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３０９１５５）で実行する。
ＳＹＢＲグリーンマスターミックス：１０μＬ
０．４５μＭ順方向プライマー：１μＬ
０．４５μＭ逆方向プライマー：１μＬ
ＤＮＡテンプレート：１０ｎｇ
ＰＣＲ－グレード水：可変
順方向および逆方向プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手する。下の表に、プライマーペアおよびそれらに関連する配列の詳細を示す。
Figure 2022513040000132
リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、次のプロトコルで増幅および検出を実施する。
変性、９４℃ ２分
次のシーケンスの４０サイクル：
変性、９４℃ １５秒
アニーリング、拡張、６０℃ １分
Ｃｔ対ＤＮＡ濃度の標準曲線を、ＧＡＰＤＨ ＤＮＡの段階希釈で調製し、それを使用してフソソームＰＣＲの結果から特定の量（ｎｇ）のＤＮＡにＣｔ核値を正規化する。
幾つかの実施形態では、除核されたフソソーム中のＧＡＰＤＨ ＤＮＡの濃度は、親細胞中よりも約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、またはそれ以下であろう。
実施例３９：フソソーム中のｍｉＲＮＡ含有量を測定する
この実施例では、フソソーム中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の定量について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、ｍｉＲＮＡを含む。
ｍｉＲＮＡは、他の活性の中でも、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がタンパク質に翻訳される速度を制御する調節エレメントである。幾つかの実施形態では、ｍｉＲＮＡを運ぶフソソームを使用して、ｍｉＲＮＡを標的部位に送達することができる。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソームまたは親細胞からのＲＮＡは前述のように調製される。少なくとも１つのｍｉＲＮＡ遺伝子は、ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｒｆａｍ／ｍｉｒｎａ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌにおいてＳａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ｍｉＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙから選択される。ｍｉＲＮＡは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３（２０），２００５に記載されるように調製される。全てのＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡアッセイは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ａ２５５７６、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から入手できる。
ｑＰＣＲは、ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡに関する製造元の仕様に従って実行され、ＣＴ値は、本明細書に記載されているように、リアルタイムＰＣＲシステムを用いて生成および分析される。
幾つかの実施形態では、フソソームのｍｉＲＮＡ含有量は、それらの親細胞の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上となるであろう。
実施例４０：フソソームにおける内因性ＲＮＡまたは合成ＲＮＡの発現を定量化する
この実施例では、発現が変化した内因性ＲＮＡ、またはフソソームで発現する合成ＲＮＡのレベルの定量化について説明する。
フソソームまたは親細胞は、フソソームへの細胞機能を媒介する内因性または合成ＲＮＡの発現を改変するように操作されている。
トランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）には、ピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレーム、およびタンパク質作用物質のクローン化フラグメントのオープンリーディングフレームが含まれている。ベクターエレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）および２９３Ｔ細胞株特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して２９３Ｔにエレクトロポレーションする。
２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで３～５日間ピューロマイシンで選択した後、前の実施例に記載される方法のうちのいずれか１つにより、安定して発現する細胞株からフソソームを調製する。
個々のフソソームを単離し、フソソームあたりのタンパク質作用物質またはＲＮＡを、前の実施例で説明したように定量化する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、またはそれ以上のフソソームあたりのＲＮＡを有するであろう。
実施例４１：フソソーム中の脂質組成を測定する
この実施例では、フソソームの脂質組成の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームの脂質組成は、それらが由来する細胞に類似している。脂質組成は、フソソームおよび細胞の重要な生物物理学的パラメーター、例えば、サイズ、静電相互作用、およびコロイド挙動に影響を与える。
脂質測定は、質量分析に基づいている。フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。
質量分析に基づく脂質分析は、記載されているように脂質分析サービス（Ｄｒｅｓｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施される（Ｓａｍｐａｉｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，２０１１，Ｆｅｂ １；１０８（５）：１９０３－７）。２段階のクロロホルム／メタノール手順を使用して、脂質を抽出する（Ｅｊｓｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，２００９，Ｍａｒ １７；１０６（７）：２１３６－４１）。試料を、カルジオリピン１６：１／１５：０／１５：０／１５：０（ＣＬ）、セラミド１８：１；２／１７：０（Ｃｅｒ）、ジアシルグリセロール１７：０／１７：０（ＤＡＧ）、ヘキソシルセラミド１８：１；２／１２：０（ＨｅｘＣｅｒ）、リゾホスファチジル酸１７：０（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルコリン１２：０（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルエタノールアミン１７：１（ＬＰＥ）、リゾホスファチジルグリセロール１７：１（ＬＰＧ）、リゾホスファチジルイノシトール１７：１（ＬＰＩ）、リゾホスファチジルセリン１７：１（ＬＰＳ）、ホスファチデート１７：０／１７：０（ＰＡ）、ホスファチジルコリン１７：０／１７：０（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン１７：０／１７：０（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール１７：０／１７：０（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール１６：０／１６：０（ＰＩ）、ホスファチジルセリン１７：０／１７：０（ＰＳ）、コレステロールエステル２０：０（ＣＥ）、スフィンゴミエリン１８：１；２／１２：０；０（ＳＭ）、およびトリアシルグリセロール１７：０／１７：０／１７：０（ＴＡＧ）の内部脂質標準混合物でスパイクする。
抽出後、有機相を注入プレートに移し、高速真空濃縮器で乾燥させる。第１段階の乾燥抽出物を、クロロホルム／メタノール／プロパノール（１：２：４、Ｖ：Ｖ：Ｖ）中の７．５ｍＭ酢酸アンモニウムに再懸濁し、第２段階の乾燥抽出物を、クロロホルム／メタノール中のメチルアミンの３３％エタノール溶液（０．００３：５：１；Ｖ：Ｖ：Ｖ）に再懸濁する。全ての液体処理工程は、ピペッティング用の液滴防止制御機能（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｂｏｔｉｃｓ）を備えた有機溶媒用のロボットプラットフォームを使用して実施する。
試料を、イオン源（Ａｄｖｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えた質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に直接注入することによって分析する。試料を、ＭＳの場合はＲｍ／ｚ＝２００＝２８００００、タンデムＭＳ／ＭＳ実験の場合はＲｍ／ｚ＝２００＝１７５００の分解能で、正イオンモードと負イオンモードの両方で１回の取得で分析した。ＭＳ／ＭＳを、１Ｄａの増分でスキャンされた対応するＭＳ質量範囲を含むインクルージョンリストによってトリガーする（Ｓｕｒｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ ｌｉｐｉｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１５，Ｏｃｔ；１１７（１０）：１５４０－９）。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳの両方のデータを組み合わせて、ＣＥ、ＤＡＧ、およびＴＡＧイオンをアンモニウム付加物として、ＰＣ、ＰＣ Ｏ－を酢酸付加物として、ＣＬ、ＰＡ、ＰＥ、ＰＥ Ｏ－、ＰＧ、ＰＩ、およびＰＳを脱プロトン化陰イオンとしてモニターする。ＭＳのみを使用して、ＬＰＡ、ＬＰＥ、ＬＰＥ Ｏ－、ＬＰＩ、およびＬＰＳを脱プロトン化陰イオンとして、Ｃｅｒ、ＨｅｘＣｅｒ、ＳＭ、ＬＰＣ、およびＬＰＣ Ｏ－を酢酸塩としてモニターする。
データは、以下の参考文献に記載されているように、社内で開発された脂質同定ソフトウェアを使用して分析する（Ｈｅｒｚｏｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ，２０１１，Ｊａｎ １９；１２（１）：Ｒ８、Ｈｅｒｚｏｇ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１２，Ｊａｎ；７（１）：ｅ２９８５１）。更なるデータ分析のため、シグナル対ノイズ比が５を超え、シグナル強度が対応するブランク試料よりも５倍高い脂質同定のみを検討する。
フソソーム脂質組成を、親細胞の脂質組成と比較する。幾つかの実施形態では、親細胞における同定された脂質の５０％超がフソソームに存在する場合、フソソームおよび親細胞は、同様の脂質組成を有し、それらの同定された脂質のうち、フソソームにおけるレベルは、親細胞の対応する脂質レベルの２５％超となるであろう。
実施例４２：フソソーム中のプロテオミクス組成を測定する
この実施例では、フソソームのタンパク質組成の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームのタンパク質組成は、それらが由来する細胞に類似している。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソームを溶解バッファー（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中の４％（ｗ／ｖ））に再懸濁し、時々ボルテックスしながら室温で１５分間インキュベートする。次いで、混合物を氷浴中で５分間超音波処理して溶解し、１３，０００ＲＰＭで５分間遠心沈殿させる。タンパク質含有量を比色分析（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定し、各試料のタンパク質を新しいチューブに移し、容量を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８で均等化する。
タンパク質を、１０ｍＭ ＤＴＴを使用して６５℃で１５分間還元し、１５ｍＭヨードアセトアミドを使用して室温、暗所で３０分間アルキル化する。６倍量の冷（－２０℃）アセトンを徐々に添加してタンパク質を沈殿させ、－８０℃で一晩インキュベートする。タンパク質ペレットを冷（－２０℃）メタノールで３回洗浄する。タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）に再懸濁する。
次に、３７℃で撹拌しながら消化の最初の４時間にトリプシン／ｌｙｓＣをタンパク質に添加する。試料を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で希釈し、０．１％デオキシコール酸ナトリウムに更にトリプシン／ｌｙｓＣを添加して、３７℃で一晩撹拌しながら消化する。消化を停止し、２％ｖ／ｖギ酸を添加してデオキシコール酸ナトリウムを除去する。試料をボルテックスし、１３，０００ＲＰＭで１分間遠心分離して清澄化する。ペプチドを逆相固相抽出（ＳＰＥ）によって精製し、乾燥する。試料を２０μＬの３％ＤＭＳＯ、０．２％ギ酸水溶液で再構成し、ＬＣ－ＭＳで分析する。
定量測定を行うために、タンパク質標準も機器で実行する。標準ペプチド（Ｐｉｅｒｃｅ、等モル、ＬＣ－ＭＳグレード、８８３４２番）を、４、８、２０、４０、および１００ｆｍｏｌ／μＬに希釈し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析する。タンパク質あたり５つの最良のペプチド（３ ＭＳ／ＭＳ遷移／ペプチド）の平均ＡＵＣ（曲線下面積）を濃度ごとに計算して、標準曲線を作成する。
取得は、２５μｍ ｉＤキャピラリーを備えたエレクトロスプレーインターフェースを装備し、マイクロ超高速液体クロマトグラフィー（μＵＨＰＬＣ）（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）と連結した高分解能質量分析計（ＡＢＳｃｉｅｘ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）により実施する。分析ソフトウェアを、機器の制御、ならびにデータ処理および取得に使用する。ソース電圧は５．２ｋＶに設定され、２２５℃に維持され、カーテンガスは２７ｐｓｉに設定され、ガス１は１２ｐｓｉおよびガス２は１０ｐｓｉに設定される。取得は、タンパク質データベースの場合は情報依存取得（ＩＤＡ）モードで、試料の場合はＳＷＡＴＨ取得モードで実施される。分離は、６０℃に維持された逆相カラム内径０．３μｍ、２．７μｍ粒子、長さ１５０ｍｍ（Ａｄｖａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）で実施される。試料を、５μＬループにループを過剰充填することによって注入する。１２０分の（試料）ＬＣ勾配では、移動相は、３μＬ／分の流速で、次の溶媒Ａ（水中の０．２％ｖ／ｖギ酸および３％ＤＭＳＯ ｖ／ｖ）ならびに溶媒Ｂ（ＥｔＯＨ中の０．２％ｖ／ｖギ酸および３％ＤＭＳＯ）を含む。
タンパク質の絶対定量では、タンパク質あたり５つの最良のペプチド（ペプチドあたり３ ＭＳ／ＭＳイオン）のＡＵＣの合計を使用して、標準曲線（５点、Ｒ２＞０．９９）を生成する。試料分析用のデータベースを生成するために、ＤＩＡＵｍｐｉｒｅアルゴリズムが１２個の試料の各々で実行され、出力ＭＧＦファイルと組み合わされて１つのデータベースになる。このデータベースは、ソフトウェア（ＡＢＳｃｉｅｘ）と共に使用され、５つの遷移／ペプチドと５つのペプチド／タンパク質の最大値を使用して、各試料のタンパク質を定量化する。計算されたスコアが１．５を超えるか、ＦＤＲが１％未満の場合、ペプチドは適切に測定されたと見なされる。適切に測定された各ペプチドのＡＵＣの合計を標準曲線にマッピングし、ｆｍｏｌとして報告する。
次いで、得られたタンパク質定量データを分析して、既知のクラスのタンパク質のタンパク質レベルおよび割合を次のように決定する：酵素は、酵素委員会（ＥＣ）番号で注釈が付けられたタンパク質として同定される；ＥＲ関連タンパク質は、ミトコンドリアではなく、ＥＲの遺伝子オントロジー（ＧＯ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）細胞内コンパートメント分類を持つタンパク質として同定される；エクソソーム関連タンパク質は、ミトコンドリアではなく、エクソソームの遺伝子オントロジー細胞内コンパートメント分類を持つタンパク質として同定される；ならびにミトコンドリアタンパク質は、ＭｉｔｏＣａｒｔａデータベース（Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２０１５ｌ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ１００３）でミトコンドリアとして同定されるタンパク質として同定される。これらの各カテゴリーのモル比は、各クラスの全てのタンパク質のモル量の合計を、各試料で特定された全てのタンパク質のモル量の合計で割ったものとして決定される。
フソソームプロテオミクス組成を、親細胞のプロテオミクス組成と比較する。幾つかの実施形態では、特定されたタンパク質の５０％超がフソソームに存在する場合、フソソームと親細胞との間で同様のプロテオミクス組成が観察され、それらの特定されたタンパク質のうち、そのレベルは、親細胞において対応するタンパク質レベルの２５％超である。
実施例４３：フソソームあたりの内因性または合成タンパク質レベルを定量化する
この実施例では、フソソームの内因性または合成タンパク質カーゴの定量について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、内因性または合成タンパク質カーゴを含む。
フソソームまたは親細胞は、内因性タンパク質の発現を改変するか、または治療的なもしくは新規の細胞機能を媒介する合成カーゴを発現するように操作される。
トランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）には、ピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームと共に、タンパク質作用物質のクローン化フラグメントのオープンリーディングフレームが含まれ、任意に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のオープンリーディングフレームに翻訳的に融合されている。ベクターは、エレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）および２９３Ｔ細胞株特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して２９３Ｔにエレクトロポレーションする。
２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで３～５日間ピューロマイシンで選択した後、前の実施例に記載される方法のうちのいずれか１つにより、安定して発現する細胞株からフソソームを調製する。
内因性タンパク質の改変した発現レベルまたはＧＦＰに融合されていない合成タンパク質の発現レベルは、上記のように質量分析によって定量化される。幾つかの実施形態では、フソソームは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、またはそれ以上のフソソームあたりのタンパク質作用物質分子を有するであろう。
あるいは、精製されたＧＦＰを、２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで段階希釈して、タンパク質濃度の標準曲線を作成する。標準曲線のＧＦＰ蛍光およびフソソームの試料を、ＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルターおよび５２５／３９発光フィルター）を使用して蛍光光度計（ＢｉｏＴｅｋ）で測定し、フソソーム中のＧＦＰ分子の平均モル濃度を計算する。次いで、モル濃度をＧＦＰ分子の数に変換し、試料あたりのフソソームの数で割って、フソソームあたりのタンパク質作用物質分子の平均数を求める。
幾つかの実施形態では、フソソームは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、またはそれ以上のフソソームあたりのタンパク質作用物質分子を有するであろう。
実施例４４：フソソーム中のエクソソームタンパク質のマーカーを測定する
このアッセイは、試料調製物のプロテオミクス構成の定量化について説明し、エクソソームの特異的マーカーであることが知られているタンパク質の割合を定量化する。
フソソームをペレット化し、標準的な生物学的試料の処理手順に従って、凍結状態でプロテオミクス分析センターに出荷する。
フソソームを、タンパク質の抽出および分析のために解凍する。最初に、それらを溶解バッファー（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中の４％（ｗ／ｖ））に再懸濁し、時々ボルテックスしながら室温で１５分間インキュベートする。次いで、混合物を氷浴中で５分間超音波処理して溶解し、１３，０００ＲＰＭで５分間遠心沈殿させる。総タンパク質含有量を比色分析（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定し、各試料からの１００μｇのタンパク質を新しいチューブに移し、量を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８で調整する。
タンパク質を、１０ｍＭ ＤＴＴを用いて６５℃で１５分間還元し、１５ｍＭヨードアセトアミドを用いて室温、暗所で３０分間アルキル化する。次いで、６倍量の冷（－２０℃）アセトンを徐々に添加してタンパク質を沈殿させ、－８０℃で一晩インキュベートする。
タンパク質をペレット化し、冷（－２０℃）メタノールで３回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８に再懸濁する。３．３３μｇのトリプシン／ｌｙｓＣを、３７℃で撹拌しながら消化の最初の４時間にタンパク質に添加する。試料を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８で希釈し、０．１％デオキシコール酸ナトリウムを、更に３．３μｇのトリプシン／ｌｙｓＣと共に添加して、３７℃で一晩撹拌しながら消化する。消化を停止し、２％ｖ／ｖギ酸を添加してデオキシコール酸ナトリウムを除去する。試料をボルテックスし、１３，０００ＲＰＭで１分間遠心分離して清澄化する。
タンパク質を逆相固相抽出（ＳＰＥ）によって精製し、乾燥させる。試料を、水中の３％ＤＭＳＯ、０．２％ギ酸水溶液で再構成し、前述のようにＬＣ－ＭＳで分析する。
得られたタンパク質定量データを分析して、既知のエクソソームマーカータンパク質のタンパク質レベルおよび割合を決定する。具体的には、テトラスパニンファミリータンパク質（ＣＤ６３、ＣＤ９、またはＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ－Ｂ、またはＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン－４、ミトフィリン、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン－１、熱ショック７０－ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）。測定された全てのタンパク質に対するこれらのエキソソームマーカータンパク質のモル比は、上記の各特定のエキソソームマーカータンパク質のモル量を、各試料で同定された全てのタンパク質のモル量の合計で割ったものとして決定され、パーセントで表される。
同様に、測定された全てのタンパク質に対する全てのエキソソームマーカータンパク質のモル比は、上記の全ての特定のエキソソームマーカータンパク質のモル量の合計を、各試料で同定された全てのタンパク質のモル量の合計で割ったものとして決定され、全体のパーセントで表される。
幾つかの実施形態では、試料は、任意の個々のエクソソームマーカータンパク質の５％未満および総エクソソームマーカータンパク質の１５％未満を含むであろう。
幾つかの実施形態では、個々のエクソソームマーカータンパク質は、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、または１０％未満で存在するであろう。
幾つかの実施形態では、全てのエクソソームマーカータンパク質の合計は、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％未満である。
実施例４５：フソソーム中のＧＡＰＤＨを測定する
このアッセイでは、フソソーム中のグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベル、および親細胞と比較したフソソーム中のＧＡＰＤＨの相対レベルの定量化について説明する。
ＧＡＰＤＨを、ＧＡＰＤＨ用の標準的な市販のＥＬＩＳＡ（ａｂ１７６６４２、Ａｂｃａｍ）を製造元の指示に従って使用して、親細胞およびフソソームで測定する。
総タンパク質レベルは、ＧＡＰＤＨの測定に使用されたのと同じ量の試料で前述したように、ビシンコニン酸アッセイを介して同様に測定される。実施形態では、このアッセイを使用すると、フソソーム中の総タンパク質あたりのＧＡＰＤＨのレベルは、総タンパク質１μｇあたり１００ｎｇ ＧＡＰＤＨ未満となるであろう。同様に、実施形態では、親細胞からフソソームへの総タンパク質と比較したＧＡＰＤＨレベルの減少は、１０％の減少よりも大きいであろう。
幾つかの実施形態では、ｎｇ ＧＡＰＤＨ／μｇ総タンパク質単位の調製物中のＧＡＰＤＨ含有量は、５００未満、２５０未満、１００未満、５０未満、２０未満、１０未満、５未満、または１未満となるであろう。
幾つかの実施形態では、親細胞から調製物までの総タンパク質あたりのＧＡＰＤＨ（ｎｇ／μｇ）の減少は、１％超、２．５％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超となるであろう。
実施例４６：フソソーム中のカルネキシンを測定する
このアッセイでは、フソソーム中のカルネキシン（ＣＮＸ）のレベル、および親細胞と比較したフソソーム中のＣＮＸの相対レベルの定量化について説明する。
カルネキシンを、製造元の指示に従って、カルネキシン用の標準的な市販のＥＬＩＳＡ（ＭＢＳ７２１６６８、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を使用して、開始細胞および調製物で測定する。
総タンパク質レベルは、カルネキシンの測定に使用されたのと同じ量の試料で前述したように、ビシンコニン酸アッセイを介して同様に測定される。実施形態では、このアッセイを使用すると、フソソーム中の総タンパク質あたりのカルネキシンのレベルは、総タンパク質１μｇあたり１００ｎｇ未満のカルネキシンとなるであろう。同様に、実施形態では、親細胞からフソソームへの総タンパク質と比較したカルネキシンレベルの増加は、１０％の増加よりも大きいであろう。
幾つかの実施形態では、ｎｇカルネキシン／μｇ総タンパク質単位の調製物中のカルネキシン含有量は、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、または１未満となるであろう。
幾つかの実施形態では、ｎｇ／μｇ単位の親細胞から調製物までの総タンパク質あたりのカルネキシンの減少は、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超となるであろう。
実施例４７：可溶性タンパク質と不溶性タンパク質との質量の比較
この実施例では、フソソーム中のタンパク質質量の可溶性：不溶性比の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソーム中のタンパク質質量の可溶性：不溶性の比は、有核細胞と同様となるであろう。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソーム調製物を、標準的なビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）を使用して（例えば、市販のＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ製品番号２３２２５を使用して）試験し、可溶性：不溶性タンパク質比を決定する。可溶性タンパク質試料は、調製したフソソームまたは親細胞を１×１０７細胞またはフソソーム／ｍＬの濃度でＰＢＳに懸濁し、１６００ｇで遠心分離してフソソームまたは細胞をペレット化することにより調製する。上清を可溶性タンパク質画分として収集する。
ペレット中のフソソームまたは細胞を、２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を含むＰＢＳで激しくピペッティングおよびボルテックスすることにより溶解する。溶解画分は不溶性タンパク質画分を表す。
付属のＢＳＡを使用して、ウェルあたり０～２０μｇのＢＳＡの標準曲線を作成する（３回行う）。フソソームまたは細胞調製物を、測定量が標準の範囲内になるように希釈する。フソソーム調製物を３回分析し、平均値を使用する。可溶性タンパク質濃度を不溶性タンパク質濃度で割って、可溶性：不溶性タンパク質比を算出する。
幾つかの実施形態では、フソソーム可溶性：不溶性タンパク質比は、親細胞と比較して１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内、またはそれ以上となるであろう。
実施例４８：フソソーム中のＬＰＳを測定する
この実施例では、親細胞と比較したフソソーム中のリポ多糖（ＬＰＳ）のレベルの定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞と比較してより低いレベルのＬＰＳを有するであろう。
ＬＰＳは細菌膜の成分であり、自然免疫応答の強力な誘導因子である。
ＬＰＳ測定は、前の例で説明した質量分析に基づいている。
幾つかの実施形態では、フソソームの脂質含有量の５％、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％未満、またはそれ以下が、ＬＰＳとなるであろう。
実施例４９：フソソーム中の脂質とタンパク質との比率
この実施例では、フソソーム中の脂質質量とタンパク質質量の比率の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、有核細胞と同様の脂質質量とタンパク質質量との比率を有するであろう。
総脂質含有量は、前の実施例で概説したリピドミクスデータセットで特定された全ての脂質のモル含有量の合計として計算される。フソソームの総タンパク質含有量を、本明細書に記載されているようにビシンコニン酸アッセイを介して測定する。
あるいは、脂質とタンパク質との比率は、特定の脂質種と特定のタンパク質の比率として説明することができる。特定の脂質種は、前の実施例で産生されたリピドミクスデータから選択される。特定のタンパク質は、前の実施例で産生されたプロテオミクスデータから選択される。選択した脂質種とタンパク質の様々な組み合わせを使用して、特定の脂質：タンパク質の比率を定義する。
実施例５０：フソソーム中のタンパク質とＤＮＡとの比率
この実施例では、フソソーム中のタンパク質質量とＤＮＡの比率の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、タンパク質質量と細胞よりもはるかに大きいＤＮＡ質量との比率を有するであろう。
フソソームおよび細胞の総タンパク質含有量は、前の実施例に記載されているように測定される。フソソームおよび細胞のＤＮＡ質量は、前の実施例に記載されているように測定される。次いで、総核酸に対するタンパク質の比率を、総タンパク質含有量を総ＤＮＡ含有量で割って、典型的なフソソーム調製物の所与の範囲内の比率をもたらすことによって決定する。
あるいは、タンパク質と核酸との比率は、半定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、ＧＡＰＤＨ等の特定のハウスキーピング遺伝子のレベルとして核酸レベルを定義することによって決定される。
次いで、ＧＡＰＤＨ核酸に対するタンパク質の比率は、総タンパク質含有量を総ＧＡＰＤＨ ＤＮＡ含有量で割って、典型的なフソソーム調製物のタンパク質：核酸比の特定の範囲を定義することによって決定される。
実施例５１：フソソーム中の脂質とＤＮＡとの比率
この実施例では、親細胞と比較したフソソームの脂質とＤＮＡとの比率の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞と比較してより高い脂質とＤＮＡとの比率を有するであろう。
この比率は、総脂質含有量（上記の例で概説）または特定の脂質種として定義される。特定の脂質種の場合、範囲は、選択した特定の脂質種によって異なる。特定の脂質種は、前述の実施例で産生されたリピドミクスデータから選択される。核酸含有量は、前述の実施例に記載されているように決定される。
核酸含有量に対して正規化された選択された脂質種の異なる組み合わせを使用して、特定のフソソーム調製物の特徴である特定の脂質：核酸比を定義する。
実施例５２：フソソーム上の表面マーカーを分析する
このアッセイでは、フソソーム上の表面マーカーの同定について説明する。
フソソームをペレット化し、標準的な生物学的試料の処理手順に従って、凍結状態でプロテオミクス分析センターに出荷する。
フソソーム上の表面マーカーの有無を同定するために、ホスファチジルセリンおよびＣＤ４０リガンドに対するマーカーで染色し、ＦＡＣＳシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用したフローサイトメトリーによって分析する。表面ホスファチジルセリンを検出するために、製造元によって説明されるように、産生物をアネキシンＶアッセイ（５５６５４７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。
簡単に説明すると、フソソームを冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１×１０６フソソーム／ｍＬの濃度で１Ｘ結合バッファーに再懸濁する。再懸濁物の１０％を５ｍＬの培養チューブに移し、５μＬのＦＩＴＣアネキシンＶを添加する。細胞を穏やかにボルテックスし、暗所で室温（２５℃）で１５分間インキュベートする。
並行して、再懸濁物の別の１０％を異なるチューブに移し、染色されていない対照として機能させる。１Ｘ結合バッファーを各チューブに添加する。試料を、１時間以内にフローサイトメトリーによって分析する。
幾つかの実施形態では、このアッセイを使用して、染色されたフソソームの集団の平均は、染色されていない細胞の平均よりも高いと決定され、フソソームがホスファチジルセリンを含むことを示す。
同様に、ＣＤ４０リガンドの場合、次のモノクローナル抗体を、製造元の指示に従って、洗浄されたフソソームの別の１０％：ＰＥ－ＣＦ５９４マウス抗ヒトＣＤ１５４クローンＴＲＡＰ１（５６３５８９、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）に添加する。簡単に説明すると、飽和量の抗体を使用する。並行して、フソソームの別の１０％を異なるチューブに移し、染色されていない対照として機能させる。チューブを室温で４００×ｇで５分間遠心分離する。上清をデカントし、ペレットをフローサイトメトリー洗浄液で２回洗浄する。０．５ｍＬの１％パラホルムアルデヒド固定液を各チューブに添加する。各々を短時間ボルテックスし、フローサイトメーターで分析するまで４℃で保存する。
幾つかの実施形態では、このアッセイまたは同等物を使用して、染色されたフソソームの集団の平均は、染色されていない細胞の平均を上回り、フソソームがＣＤ４０リガンドを含むことを示す。
実施例５３：フソソーム中のウイルスカプシドタンパク質の分析
このアッセイは、試料調製物の構成の分析を説明し、ウイルスカプシド源に由来するタンパク質の割合を評価する。
フソソームをペレット化し、標準的な生物学的試料の処理手順に従って、凍結状態でプロテオミクス分析センターに出荷する。
フソソームを、タンパク質の抽出および分析のために解凍する。最初に、それらを溶解バッファー（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中の４％（ｗ／ｖ））に再懸濁し、時々ボルテックスしながら室温で１５分間インキュベートする。次いで、混合物を氷浴中で５分間超音波処理して溶解し、１３，０００ＲＰＭで５分間遠心沈殿させる。総タンパク質含有量を比色分析（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定し、各試料からの１００μｇのタンパク質を新しいチューブに移し、量を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８で調整する。
タンパク質を、１０ｍＭ ＤＴＴを用いて６５℃で１５分間還元し、１５ｍＭヨードアセトアミドを用いて室温、暗所で３０分間アルキル化する。次いで、６倍量の冷（－２０℃）アセトンを徐々に添加してタンパク質を沈殿させ、－８０℃で一晩インキュベートする。
タンパク質をペレット化し、冷（－２０℃）メタノールで３回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８に再懸濁する。３．３３μｇのトリプシン／ｌｙｓＣを、３７℃で撹拌しながら消化の最初の４時間にタンパク質に添加する。試料を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８で希釈し、０．１％デオキシコール酸ナトリウムを、更に３．３μｇのトリプシン／ｌｙｓＣと共に添加して、３７℃で一晩撹拌しながら消化する。消化を停止し、２％ｖ／ｖギ酸を添加してデオキシコール酸ナトリウムを除去する。試料をボルテックスし、１３，０００ＲＰＭで１分間遠心分離して清澄化する。
タンパク質を逆相固相抽出（ＳＰＥ）によって精製し、乾燥させる。試料を、水中の３％ＤＭＳＯ、０．２％ギ酸水溶液で再構成し、前述のようにＬＣ－ＭＳで分析する。
測定された全てのタンパク質に対するウイルスカプシドタンパク質のモル比は、全てのウイルスカプシドタンパク質のモル量を各試料で同定された全てのタンパク質のモル量の合計で割ったものとして決定され、パーセントとして表される。
幾つかの実施形態では、このアプローチまたは同等のものを使用して、試料は、１０％未満のウイルスカプシドタンパク質を含むであろう。幾つかの実施形態では、試料は、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満のウイルスカプシドタンパク質を含むであろう。
実施例５４：標的細胞との融合を測定する
この実施例では、非標的細胞と比較した標的細胞とのフソソーム融合の定量化について説明する。
幾つかの実施形態では、標的細胞とのフソソーム融合は、フソソームの内腔内で運ばれるカーゴの、レシピエント細胞の細胞質ゾルへの細胞特異的送達を可能にする。本明細書に記載の方法によって産生されたフソソームを、以下のように標的細胞との融合速度についてアッセイする。
この実施例では、フソソームは、原形質膜上にＭｙｏｍａｋｅｒを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む。更に、フソソームはｍＴａｇＢＦＰ２蛍光タンパク質およびＣｒｅリコンビナーゼを発現する。標的細胞は、ＭｙｏｍａｋｅｒとＭｙｏｍｉｘｅｒの両方を発現する筋芽細胞であり、非標的細胞は、ＭｙｏｍａｋｅｒもＭｙｏｍｉｘｅｒも発現しない線維芽細胞である。Ｍｙｏｍａｋｅｒを発現するフソソームは、ＭｙｏｍａｋｅｒおよびＭｙｏｍｉｘｅｒの両方を発現する標的細胞と融合するが、非標的細胞とは融合しないと予測されている（Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８，１５６６５．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５６６５）（Ｍｉｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ，４９９（７４５８），３０１－３０５．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４３）。標的細胞型と非標的細胞型の両方をマウスから単離し、ＣＭＶプロモーターの下でＣｒｅによる組換えによりｔｄＴｏｍａｔｏ発現をオンにして、融合を示す、「ＬｏｘＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｔｄＴｏｍａｔｏ」カセットを安定して発現する。
標的または非標的レシピエント細胞を、黒色の透明底９６ウェルプレートにプレーティングする。標的細胞と非標的細胞の両方を、異なる融合群に対してプレーティングする。次に、レシピエント細胞をプレーティングしてから２４時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質およびＭｙｏｍａｋｅｒを発現するフソソームをＤＭＥＭ培地中の標的または非標的レシピエント細胞に適用する。フソソームの用量は、ウェルにプレーティングしたレシピエント細胞の数と相関している。フソソームを適用した後、細胞プレートを４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞との間の接触を開始するのを助ける。
フソソーム適用の４時間後に開始し、細胞ウェルを画像化して、フィールドまたはウェル内のＲＦＰ陽性細胞およびＧＦＰ陽性細胞を明確に同定する。
この実施例では、自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して細胞プレートを画像化する。所与のウェルの総細胞集団を、最初にＤＭＥＭ培地中のＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で１０分間細胞を染色することによって決定する。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡにインターカレートすることで細胞核を染色するため、個々の細胞を同定するために使用される。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を通常のＤＭＥＭ培地に交換する。
Ｈｏｅｃｈｓｔを、４０５ｎｍ ＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化する。ＧＦＰを、４６５ｎｍ ＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化し、ＲＦＰを５２３ｎｍ ＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化する。標的細胞および非標的細胞のウェルの画像を、最初に陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって取得する。
取得設定は、ＲＦＰおよびＧＦＰの強度が最大ピクセル強度値になるが、飽和しないように設定される。次に、確立された設定を使用して、対象のウェルを画像化する。融合活性の経時的データを取得するために、ウェルを４時間ごとに画像化する。
ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性ウェルの分析を、蛍光顕微鏡または他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，１９９７－２００７）を備えたソフトウェアを用いて実施する。
画像を、幅６０μｍのローリングボールバックグラウンド除去アルゴリズムを使用して前処理する。総細胞マスクは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定されている。バックグラウンド強度を大幅に超えるＨｏｅｃｈｓｔ強度の細胞をしきい値処理し、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞には小さすぎる、または大きすぎる領域を除外する。
総細胞マスク内で、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞を、バックグラウンドを大幅に超える細胞に再度しきい値処理を行い、細胞領域全体のＨｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを拡張して、ＧＦＰおよびＲＦＰ細胞の蛍光全体を含めることによって同定する。標的または非標的レシピエント細胞を含む対照ウェルで同定されたＲＦＰ陽性細胞の数を使用して、フソソームを含むウェルのＲＦＰ陽性細胞の数から差し引く（非特異的ＬｏｘＰ組換えを差し引く）。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（融合したレシピエント細胞）の数を、各時点でのＧＦＰ陽性細胞（融合していないレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、レシピエント細胞集団内のフソソーム融合の速度を定量化する。速度は、レシピエント細胞に適用されたフソソームの所与の用量に対して正規化されている。標的融合（標的細胞へのフソソーム融合）の速度については、標的融合の速度を定量化するため、非標的細胞への融合速度を標的細胞への融合速度から差し引く。
幾つかの実施形態では、標的細胞とのフソソームの平均融合速度は、標的細胞融合の場合、１時間あたり０．０１～４．０ ＲＦＰ／ＧＦＰ細胞の範囲、またはフソソームを含む非標的レシピエント細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上多くなるであろう。幾つかの実施形態では、フソソームが適用されていない群は、１時間あたり０．０１ ＲＦＰ／ＧＦＰ細胞未満のバックグラウンド率を示すであろう。
実施例５５：膜タンパク質を送達するためのインビトロ融合
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞への活性膜タンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、フソソームは、センダイウイルスＨＶＪ－Ｅタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から生成される（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４），１－８．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．１２）。幾つかの実施形態では、フソソームは、主に筋肉および脂肪組織に見られ、細胞へのグルコースのインスリン調節輸送に関与する膜タンパク質である、ＧＬＵＴ４を発現するように生成される。ＧＬＵＴ４を含む場合と含まない場合のフソソームは、前の実施例に記載される方法のうちのいずれかによって説明したように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から調製される。
次いで、Ｃ２Ｃ１２細胞などの筋肉細胞を、ＧＬＵＴ４を発現するフソソーム、ＧＬＵＴ４を発現しないフソソーム、ＰＢＳ（陰性対照）、またはインスリン（陽性対照）で処理する。Ｃ２Ｃ１２細胞に対するＧＬＵＴ４の活性は、蛍光２－デオキシグルコース類縁体である２－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジオキサール－４－イル）アミノ］－２－デオキシグルコース（２－ＮＢＤＧ）の取込みによって測定される。Ｃ２Ｃ１２細胞の蛍光を、前の実施例に記載された方法を使用する顕微鏡法によって評価する。
幾つかの実施形態では、ＧＬＵＴ４およびインスリンを発現するフソソームで処理されたＣ２Ｃ１２細胞は、ＰＢＳまたはＧＬＵＴ４を発現しないフソソームで処理されたＣ２Ｃ１２細胞と比較して増加した蛍光を示すと予想される。また、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２９，１６０５６０４，２０１７も参照されたい。
実施例５６：膜タンパク質のインビボ送達
この実施例では、インビボでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、インビボでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞への活性膜タンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、前の実施例と同様に、センダイウイルスＨＶＪ－Ｅタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からフソソームが生成される。幾つかの実施形態では、フソソームは、膜タンパク質、ＧＬＵＴ４を発現するために生成される。ＧＬＵＴ４を含む場合と含まない場合のフソソームは、前の実施例に記載される方法のうちのいずれかによって説明したように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から調製される。
ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕマウスに、ＧＬＵＴ４を発現するフソソーム、ＧＬＵＴ４を発現しないフソソーム、またはＰＢＳ（陰性対照）を投与する。マウスの前脛骨筋にフソソームまたはＰＢＳを筋肉内注射する。フソソーム投与の直前に、マウスを１２時間絶食させ、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴイメージング）を可能にするグルコースの類似体である［１８Ｆ］２－フルオロ－２デオキシ－ｄ－グルコース（１８Ｆ－ＦＤＧ）を注射する。マウスに、麻酔（２％イソフルラン）下で尾静脈を介して１８Ｆ－ＦＤＧを注射する。ＰＥＴイメージングは、ナノスケールイメージングシステム（１Ｔ、Ｍｅｄｉｓｏ，Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用して実施する。イメージングは、フソソーム投与の４時間後に行う。イメージングの直後に、マウスを犠牲にし、前脛骨筋の重さを量る。ＰＥＴ画像は、完全検出器モードの３Ｄイメージングシステムを使用して再構成され、全ての補正がオンになり、高い正則化が行われ、８回の反復が行われる。再構成された画像の３次元関心体積（ＶＯＩ）分析は、イメージングソフトウェアパッケージ（Ｍｅｄｉｓｏ，Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用し、標準取込値（ＳＵＶ）分析を適用して実施される。直径２ｍｍの球で固定されたＶＯＩは、前脛骨筋部位について描かれる。各ＶＯＩ部位のＳＵＶは、次の式を使用して計算する：ＳＵＶ＝（対象の体積の放射能、Ｂｑ／ｃｃ×体重として測定）／注入された放射能。
幾つかの実施形態では、ＧＬＵＴ４を発現するフソソームを投与されたマウスは、ＰＢＳまたはＧＬＵＴ４を発現しないフソソームを投与されたマウスと比較して、ＶＯＩにおいて増加した放射性シグナルを示すと予想される。また、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２９，１６０５６０４，２０１７も参照されたい。
実施例５７：血管からの血管外漏出を測定する
この実施例では、インビトロマイクロ流体システム（Ｊ．Ｓ Ｊｏｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３，ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｐｌｏｓ．ｏｒｇ／ｐｌｏｓｏｎｅ／ａｒｔｉｃｌｅ？ｉｄ＝１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５６９１０）で試験した内皮単層を通過するフソソーム血管外漏出の定量化について説明する。
細胞は血管系から周囲の組織に血管外漏出する。理論に拘束されることを望まないが、血管外漏出は、フソソームが血管外組織に到達するための１つの方法である。
このシステムには、ＥＣＭ模倣ゲルを注入できるチャンバーによって分離された３つの独立してアドレス指定可能なメディアチャネルが含まれる。簡単に言えば、マイクロ流体システムは、成形されたＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン；Ｓｉｌｇａｒｄ １８４；Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＭＩ）を有し、これを介してアクセスポートが開けられ、カバーガラスに結合されてマイクロ流体チャネルが形成される。チャネルの断面寸法は、１ｍｍ（幅）×１２０μｍ（高さ）である。マトリックスの接着を強化するために、ＰＤＭＳチャネルをＰＤＬ（ポリ－Ｄ－リジンヒドロブロミド；１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液でコーティングする。
次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）およびＮａＯＨを含むＩ型コラーゲン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）を、４つの別々の充填ポートを介してデバイスのゲル領域に注入し、３０分間インキュベートしてヒドロゲルを形成する。ゲルが重合すると、内皮細胞培地（ＬｏｎｚａまたはＳｉｇｍａなどの供給業者から入手）をすぐにチャネルにピペットで移し、ゲルの脱水を防ぐ。培地を吸引すると、希釈されたヒドロゲル（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅ）溶液（３．０ｍｇ／ｍＬ）を細胞チャネルに導入し、過剰なヒドロゲル溶液を冷培地を使用して洗い流す。
内皮細胞を中央チャネルに導入し、沈降させて内皮を形成させる。内皮細胞の播種から２日後、内皮細胞が完全な単層を形成した同じチャネルにフソソームまたはマクロファージ細胞（陽性対照）を導入する。フソソームは、単層に付着し、単層を越えてゲル領域に移動するように導入される。培養物を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで維持する。フソソームのＧＦＰ発現バージョンを、蛍光顕微鏡による生細胞の画像化を可能にするために使用する。翌日、細胞を固定し、チャンバー内でＤＡＰＩ染色を使用して核を染色し、共焦点顕微鏡を使用して複数の関心領域を画像化して、内皮単層を通過したフソソームの数を決定する。
幾つかの実施形態では、ＤＡＰＩ染色は、フソソームおよび陽性対照細胞が、播種後に内皮バリアを通過できることを示すであろう。
実施例５８：走化性細胞移動度を測定する
この実施例では、フソソーム走化性の定量化について説明する。細胞は、走化性を介して化学勾配に向かって、または化学勾配から離れて移動することができる。幾つかの実施形態では、走化性は、フソソームが傷害部位にホーミングすること、または病原体を追跡することを可能にする。前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された精製フソソーム組成物を、その走化性について以下のとおりアッセイする。
十分な数のフソソームまたはマクロファージ細胞（陽性対照）を、ＤＭＥＭ培地中で、製造元が提供するプロトコルに従ってマイクロスライドウェルにロードする（ｉｂｉｄｉ．ｃｏｍ／ｉｍｇ／ｃｍｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌａｂｗａｒｅ／ｃｈａｎｎｅｌ＿ｓｌｉｄｅｓ／Ｓ＿８０３２Ｘ＿Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ／ＩＮ＿８０３２Ｘ＿Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ．ｐｄｆ）。フソソームを３７℃、５％ＣＯ２で１時間放置して付着させる。細胞接着に続いて、ＤＭＥＭ（陰性対照）またはＭＣＰ１走化性物質を含むＤＭＥＭを中央チャネルの隣接するリザーバーにロードし、Ｚｅｉｓｓ倒立広視野顕微鏡を使用して、フソソームを２時間連続して画像化する。画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．、ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，１９９７－２００７）を使用して分析する。観察された各フソソームまたは細胞の移動調整データを、手動追跡プラグイン（Ｆａｂｒｉｃｅ Ｃｏｒｄｅｌｉｅｒｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｃｕｒｉｅ、Ｏｒｓａｙ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して取得する。走化性プロットおよび移動速度を、Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ａｎｄ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ（ｉｂｉｄｉ）を使用して決定する。
幾つかの実施形態では、フソソームの平均累積距離および移動速度は、ケモカインに対する陽性対照細胞の応答よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内、またはそれ以上となるであろう。ケモカインに対する細胞の応答は、例えば、Ｈｏｗａｒｄ Ｅ．Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４（１）：４７－５９，２００９に記載されている。
実施例５９：ホーミング電位を測定する
この実施例では、傷害の部位へのフソソームのホーミングについて説明する。細胞は、遠位部位から移動することができる、および／または特定の部位に蓄積し得る、例えば、ある部位にホーミングし得る。通常、その部位は傷害部位である。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、傷害部位に移動するか、またはそこに蓄積するようにホーミングするであろう。
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、滅菌生理食塩水中の筋毒素であるノテキシン（ＮＴＸ）（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ）を、右前脛骨筋（ＴＡ）に３０Ｇ針を使用して２μｇ／ｍＬの濃度で筋肉内（ＩＭ）注射することにより投与する。前脛骨筋（ＴＡ）の皮膚を、化学脱毛剤を使用して４５秒間脱毛した後、水で３回すすいで準備する。この濃度を、筋線維の最大の変性、ならびにそれらの衛星細胞、運動軸索および血管への最小の損傷を確保するように選択する。
ＮＴＸ注射後１日目に、マウスはホタルルシフェラーゼを発現するフソソームまたは細胞のＩＶ注射を受ける。フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによってホタルルシフェラーゼを安定して発現する細胞から産生される。生物発光イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、注射後０、１、３、７、２１、および２８での動物全体の生物発光画像を取得する。
画像化の５分前に、ルシフェラーゼを可視化するために、マウスに生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を１５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射する。イメージングシステムは、全てのデバイス設定を補正するように調整されている。生物発光シグナルは、放射輝度光子を使用して測定され、測定値として総フラックスが使用される。光子／秒で値を与えるため、ＲＯＩのシグナルを囲むことによって関心領域（ＲＯＩ）を生成する。ＲＯＩは、ＮＴＸで処理されたＴＡ筋肉と反対側のＴＡ筋肉の両方で評価され、ＮＴＸ処理とＮＴＸ未処理のＴＡ筋肉間の光子／秒の比率は、ＮＴＸ処理筋肉へのホーミングの尺度として計算される。
幾つかの実施形態では、フソソームおよび細胞におけるＮＴＸ処理およびＮＴＸ未処理のＴＡ筋肉間の光子／秒の比は、１より大きく、傷害時のルシフェラーゼ発現フソソームの部位特異的蓄積を示す。
例えば、Ｐｌａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ３４（５）Ｌ ５７７－８５，２００６を参照されたい。
実施例６０：食作用活性を測定する
この実施例は、フソソームの食作用を実証する。幾つかの実施形態では、フソソームは、食作用活性を有し、例えば、食作用が可能である。細胞は食作用に関与し、粒子を貪食し、バクテリアまたは死細胞等の外来侵入者の隔離および破壊を可能にする。
部分的または完全な核不活化を有する哺乳動物マクロファージからのフソソームを含む、前の実施例に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生される精製フソソーム組成物は、病原体生体粒子を介してアッセイされる食作用が可能であった。この推定は、以下のプロトコルに従って蛍光食作用アッセイを使用することによって行われた。
マクロファージ（陽性対照）およびフソソームを、採取直後に別々の共焦点ガラス底皿にプレーティングした。マクロファージおよびフソソームをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓで１時間インキュベートして付着させた。フルオレセイン標識Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２および非フルオレセイン標識Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２（陰性対照）を、製造元のプロトコルに示されているようにマクロファージ／フソソームに添加し、２時間インキュベートした（ｔｏｏｌｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｍｐ０６６９４．ｐｄｆ）。２時間後、トリパンブルーを加えることにより遊離蛍光粒子を消光させた。貪食された粒子によって放出された細胞内蛍光を、４８８励起で共焦点顕微鏡によって画像化した。食作用陽性フソソームの数をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して定量化した。
食作用性フソソームの平均数は、生体粒子導入後２時間で少なくとも３０％であり、陽性対照マクロファージでは３０％を超えていた。
実施例６１：細胞膜または血液脳関門を通過する能力を測定する
この実施例では、血液脳関門を通過するフソソームの定量について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、中枢神経系への送達のために、血液脳関門を通過する、例えば、出入りする。
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、ホタルルシフェラーゼを発現するフソソームまたは白血球（陽性対照）を静脈内注射する。フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによってホタルルシフェラーゼを安定して発現する細胞またはルシフェラーゼを発現しない細胞（陰性対照）から産生される。生物発光イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、フソソームまたは細胞の注射後１、２、３、４、５、６、８、１２、および２４時間で生物発光の動物全体の画像を取得する。
画像化の５分前に、ルシフェラーゼを可視化するために、マウスに生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を１５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射する。イメージングシステムは、全てのデバイス設定を補正するように調整されている。生物発光シグナルは、総フラックスを測定値として使用して測定する。光子／秒で値を与えるため、ＲＯＩのシグナルを囲むことによって関心領域（ＲＯＩ）を生成する。選択されたＲＯＩは、脳を含む領域の周りのマウスの頭である。
幾つかの実施形態では、ＲＯＩの光子／秒は、ルシフェラーゼを発現しない陰性対照フソソームよりも、ルシフェラーゼを発現する細胞またはフソソームを注射した動物で大きくなり、脳内または脳周辺のルシフェラーゼ発現フソソームの蓄積を示す。
実施例６２：タンパク質分泌の可能性を測定する
この実施例では、フソソームによる分泌の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、分泌、例えば、タンパク質分泌が可能である。細胞は分泌物を介して物質を処分または排出することができる。幾つかの実施形態では、フソソームは、分泌を介してそれらの環境において化学的に相互作用し、通信する。
所定の速度でタンパク質を分泌するフソソームの能力を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのガウシアルシフェラーゼフラッシュアッセイ（カタログ番号１６１５８）を使用して決定する。前の実施例に記載される方法のうちのいずれか１つによって産生されたマウス胚性線維芽細胞（陽性対照）またはフソソームを成長培地でインキュベートし、最初にフソソームを１６００ｇで５分間ペレット化し、次いで上清を収集することにより、培地の試料を収集することによって１５分毎に培地の試料を収集する。収集した試料を、ピペットで透明底９６ウェルプレートに入れる。次いで、製造元の指示に従って、アッセイバッファーの希釈標準溶液を調製する。
簡単に説明すると、ルシフェリンまたは発光分子であるセレンテラジンをフラッシュアッセイバッファーと混合し、試料を含む９６ウェルプレートの各ウェルに混合物をピペットで移す。細胞またはフソソームを欠く陰性対照ウェルには、バックグラウンドのガウシアルシフェラーゼシグナルを測定するための成長培地またはアッセイバッファーが含まれる。更に、発光シグナルを１時間あたりのガウシアルシフェラーゼ分泌分子に変換するために、精製されたガウシアルシフェラーゼの標準曲線（Ａｔｈｅｎａ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号０３０８）を準備する。
５００ミリ秒の積算時間を使用して、プレートの発光をアッセイする。バックグラウンドがウシアルシフェラーゼシグナルを全ての試料から差し引いた後、ガウシアルシフェラーゼ標準曲線を計算する。試料の測定値が標準曲線に収まらない場合は、適切に希釈して再分析する。このアッセイを使用して、フソソームがガウシアルシフェラーゼを所定の範囲内の速度（分子／時間）で分泌する能力を決定する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、陽性対照細胞よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上の速度でタンパク質を分泌することができるであろう。
実施例６３：シグナル伝達電位を測定する
この実施例では、フソソームにおけるシグナル伝達の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、シグナル伝達が可能である。細胞は、シグナル伝達として知られるプロセスで、リン酸化等のシグナル伝達カスケードを介して細胞外環境から分子シグナルを送受信できる。部分的または完全な核不活化を有する哺乳動物細胞からのフソソームを含む、前の実施例に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生される精製フソソーム組成物は、インスリンによって誘導されるシグナル伝達が可能である。インスリンによって誘導されるシグナル伝達は、ＡＫＴリン酸化レベル、インスリン受容体シグナル伝達カスケードの重要な経路、およびインスリンに応答したグルコース取込みを測定することによって評価される。
ＡＫＴリン酸化を測定するために、細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）（陽性対照）、およびフソソームを４８ウェルプレートにプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに２時間放置する。細胞接着に続いて、インスリン（例えば、１０ｎＭ）、またはインスリンを含まない陰性対照溶液を、細胞またはフソソームを含むウェルに３０分間添加する。３０分後、タンパク質溶解物がフソソームまたは細胞から作製され、リン酸化ＡＫＴレベルをインスリン刺激および対照非刺激試料でのウエスタンブロッティングによって測定する。
インスリンまたは陰性対照溶液に応答したグルコース取込みは、標識グルコース（２－ＮＢＤＧ）を使用することにより、グルコース取込みの欄で説明されているように測定される。（Ｓ．Ｇａｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５（２）：８１９－８２９，２００５）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、インスリンに応答して、ＡＫＴリン酸化およびグルコース取込みを陰性対照に対して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上増強するであろう。
実施例６４：細胞膜を横切ってグルコースを輸送する能力を測定する
この実施例では、生細胞でのグルコース取込みをモニターし、したがって脂質二重層を通過する能動輸送を測定するために使用できる蛍光グルコース類似体である、２－ＮＢＤＧ（２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース）のレベルの定量化について説明する。幾つかの実施形態では、このアッセイまたは同等物を使用して、グルコース取込みおよびフソソームの脂質二重層を横切る能動輸送のレベルを測定することができる。
フソソーム組成物は、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生される。次いで、十分な数のフソソームを、グルコースを含まず、２０％ウシ胎仔血清、および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートする。２時間のグルコース飢餓期間の後、培地を、グルコースを含まず、２０％ウシ胎仔血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、および２０ｕＭ ２－ＮＢＤＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むＤＭＥＭを含むように交換し、３７℃および５％ＣＯ２で更に２時間インキュベートする。
陰性対照のフソソームを、２－ＮＢＤＧの代わりに同量のＤＭＳＯを添加することを除いて、同じように処理する。
次いで、フソソームを１×ＰＢＳで３回洗浄し、適切なバッファーに再懸濁し、９６ウェルのイメージングプレートに移す。次いで、ＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルターおよび５２５／３９発光フィルター）を使用して蛍光光度計で２－ＮＢＤＧ蛍光を測定し、１時間のロード期間で、フソソーム膜を通過してフソソームに蓄積された２－ＮＢＤＧの量を定量化する。
幾つかの実施形態では、２－ＮＢＤＧ蛍光は、陰性（ＤＭＳＯ）対照と比較して、２－ＮＢＤＧ処理を有するフソソームで高くなるであろう。５２５／３９発光フィルターを用いた蛍光測定は、存在する２－ＮＢＤＧ分子の数と相関するであろう。
実施例６５：フソソームの内腔は水溶液と混和性である
この実施例では、水などの水溶液とのフソソーム内腔の混和性を評価する。
フソソームを、前の実施例に記載されているように調製する。対照は、低浸透圧液、高浸透圧溶液、または通常の浸透圧溶液のいずれかを含む透析膜である。
フソソーム、陽性対照（通常の浸透圧溶液）および陰性対照（低浸透圧溶液）を、低浸透圧溶液（１５０ｍＯｓｍｏｌ）とインキュベートする。各試料を水溶液に曝露した後、顕微鏡下で細胞サイズを測定する。幾つかの実施形態では、低浸透圧溶液中のフソソームおよび陽性対照のサイズは、陰性対照と比較して増加する。
フソソーム、陽性対照（通常の浸透圧溶液）および陰性対照（高浸透圧溶液）を、高浸透圧溶液（４００ｍＯｓｍｏｌ）とインキュベートする。各試料を水溶液に曝露した後、顕微鏡下で細胞サイズを測定する。幾つかの実施形態では、高浸透圧溶液中のフソソームおよび陽性対照のサイズは、陰性対照と比較して減少するであろう。
フソソーム、陽性対照（低浸透圧または高浸透圧溶液）および陰性対照（通常の浸透圧）を、通常の浸透圧溶液（２９０ｍＯｓｍｏｌ）とインキュベートする。各試料を水溶液に曝露した後、顕微鏡下で細胞サイズを測定する。幾つかの実施形態では、通常の浸透圧溶液中のフソソームおよび陽性対照のサイズは、陰性対照と比較して実質的に同じままである。
実施例６６：細胞質ゾル中のエステラーゼ活性を測定する
この実施例は、フソソームにおける代謝活性の代用としてのエステラーゼ活性の定量化を説明している。フソソームの細胞質ゾルエステラーゼ活性は、カルセイン－ＡＭ染色の定量的評価によって決定される（Ｂｒａｔｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ６６（１）：７８－８４，２００５）。
膜透過性色素であるカルセイン－ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ，ＵＳＡ）を、ジメチルスルホキシド中の１０ｍＭの原液、およびＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中の１００ｍＭの希釈標準溶液として調製する。前の実施例に記載される方法のうちのいずれか１つによって産生されたフソソームまたは陽性対照の親マウス胚性線維芽細胞をＰＢＳバッファーに懸濁し、カルセイン－ＡＭ希釈標準溶液（カルセイン－ＡＭ中の最終濃度：５ｍＭ）と共に暗所で３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳバッファーで希釈して、カルセイン蛍光保持の即時フローサイトメトリー分析を行う。
フソソームおよび対照の親マウス胚性線維芽細胞を（Ｊａｃｏｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １２（６）：５５０－５５８，１９９１）に記載されているように、サポニンによるゼロエステラーゼ活性の陰性対照として実験的に透過処理する。フソソームおよび細胞を、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中の１％サポニン溶液中で１５分間インキュベートする。原形質膜透過性の可逆性により、サポニンを更なる染色および洗浄工程に使用される全てのバッファーに含める。サポニン透過処理後、フソソームおよび細胞を、０．１％サポニンおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳバッファーに懸濁し、カルセイン－ＡＭと最終濃度５ｍＭまでインキュベートし（３７℃、暗所で４５分間）、０．１％サポニンおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含む同じＰＢＳバッファーで３回洗浄して、フローサイトメトリーにより分析する。フローサイトメトリー分析を、４８８ｎｍのアルゴンレーザー励起でＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で実施し、発光を５３０＋／－３０ｎｍで収集する。取得および分析にはＦＡＣＳソフトウェアを使用する。光散乱チャネルを線形ゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールで設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を分析する。相対的なエステラーゼ活性を、各試料のカルセイン－ＡＭの強度に基づいて計算する。全ての事象を、前方および側方散乱チャネルで捕捉する（あるいは、ゲートを適用して、フソソーム集団のみを選択することもできる）。フソソームの蛍光強度（ＦＩ）値は、それぞれの陰性対照のサポニン処理試料のＦＩ値を差し引くことによって決定される。フソソーム試料の正規化されたエステラーゼ活性は、細胞質ゾルのエステラーゼ活性の定量的測定値を生成するために、それぞれの陽性対照細胞試料に対して正規化されている。
幾つかの実施形態では、フソソーム調製物は、陽性対照細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内、またはそれ以上のエステラーゼ活性を有するであろう。
Ｂｒａｔｏｓｉｎ Ｄ，Ｍｉｔｒｏｆａｎ Ｌ，Ｐａｌｉｉ Ｃ，Ｅｓｔａｑｕｉｅｒ Ｊ，Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ Ｊ．Ｎｏｖｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｇｉｎｇ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．２００５ Ｊｕｌ；６６（１）：７８－８４、およびＪａｃｏｂ ＢＣ，Ｆａｖｒｅ Ｍ，Ｂｅｎｓａ ＪＣ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓａｐｏｎｉｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １９９１；１２：５５０－５５８も参照されたい。
実施例６７：フソソーム中のアセチルコリンエステラーゼ活性を測定する
アセチルコリンエステラーゼ活性を、以前に記載された手順（Ｅｌｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７，８８，１９６１）および製造元の推奨事項に従うキット（ＭＡＫ１１９、ＳＩＧＭＡ）を使用して測定する。
簡単に説明すると、フソソームを、ＰＢＳ、ｐＨ８中の１．２５ｍＭアセチルチオコリンに懸濁し、ＰＢＳ、ｐＨ７中の０．１ｍＭ ５，５－ジチオ－ビス（２－ニトロ安息香酸）と混合する。インキュベーションは室温で実施するが、光学密度の読み取りを開始する前に、フソソームおよび基質溶液を３７℃で１０分間予熱する。
吸光度の変化を、プレートリーダー分光光度計（ＥＬＸ８０８、ＢＩＯ－ＴＥＫ機器、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）を用いて４５０ｎｍで１０分間モニターする。これとは別に、試料を、正規化のためのビシンコニン酸アッセイを介してフソソームのタンパク質含有量を決定するために使用する。このアッセイを使用して、フソソームは、１００ ＡＣｈＥ活性単位／μｇ未満のタンパク質を有すると決定される。
幾つかの実施形態では、ＡＣｈＥ活性単位／μｇのタンパク質値は、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００、または１０００未満となるであろう。
実施例６８：代謝活性レベルを測定する
この実施例では、フソソームにおけるクエン酸合成酵素活性の測定の定量化について説明する。
クエン酸合成酵素は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路内の酵素であり、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）とアセチルＣｏＡの間の反応を触媒してクエン酸を生成する。アセチルＣｏＡが加水分解されると、チオール基を持つＣｏＡ（ＣｏＡ－ＳＨ）が放出される。チオール基は化学試薬５，５－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と反応して、５－チオ－２－ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）を形成し、これは、４１２ｎｍで分光光度的に測定できる黄色の生成物（Ｇｒｅｅｎ２００８）である。Ａｂｃａｍヒトクエン酸合成酵素活性アッセイキット（製品番号ａｂ１１９６９２）などの市販のキットは、この測定を実施するために必要な全ての試薬を提供する。
アッセイを製造元の推奨に従って実施する。フソソーム試料溶解物を、前の実施例に記載される方法のうちのいずれか１つによって産生されたフソソームを収集し、それらを抽出バッファー（Ａｂｃａｍ）に氷上で２０分間可溶化することによって調製する。遠心分離後に上清を収集し、タンパク質含有量をビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で評価し、次の定量プロトコルが開始されるまで調製物を氷上に置く。
簡単に説明すると、フソソーム溶解物試料を、提供されたマイクロプレートウェル内の１×インキュベーションバッファー（Ａｂｃａｍ）で希釈し、１セットのウェルは１×インキュベーションバッファーのみを受ける。プレートを密封し、３００ｒｐｍで振とうしながら室温で４時間インキュベートする。次いで、バッファーをウェルから吸引し、１×洗浄バッファーを添加する。この洗浄工程をもう一度繰り返す。次いで、１×活性溶液を各ウェルに添加し、プレートを、読取りの間に振とうしながら、２０秒ごとに３０分間、４１２ｎｍでの吸光度を測定することによりマイクロプレートリーダーで分析する。
バックグラウンド値（１×インキュベーションバッファーのみを含むウェル）を、全てのウェルから差し引き、クエン酸合成酵素活性を、ロードしたフソソーム溶解物試料１μｇあたりの１分あたりの吸光度の変化として表す（ΔｍＯＤ＠４１２ｎｍ／分／μｇタンパク質）。運動測定の１００～４００秒の線形部分のみを活性の計算に使用する。
幾つかの実施形態では、フソソーム調製物は、対照細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内、またはそれ以上の合成酵素活性を有するであろう。
例えば、Ｇｒｅｅｎ ＨＪ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ，ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｕｓｃｌｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｄａｙｓ ｏｆ ｅｘｅｒｃｉｓｅ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９５：Ｒ１２３８－Ｒ１２５０，２００８を参照されたい。
実施例６９：呼吸レベルを測定する
この実施例では、フソソームの呼吸レベルの測定の定量化について説明する。細胞内の呼吸レベルは、代謝を促進する酸素消費量の尺度になり得る。Ｓｅａｈｏｒｓｅ細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）により、酸素消費率のフソソーム呼吸を測定する（Ｚｈａｎｇ ２０１２）。
前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生されたフソソームを、９６ウェルのＳｅａｈｏｒｓｅマイクロプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ）に播種する。マイクロプレートを短時間遠心分離して、ウェルの底にあるフソソームおよび細胞をペレット化する。酸素消費量アッセイを、成長培地を除去し、２５ｍＭグルコースおよび２ｍＭグルタミン（Ａｇｉｌｅｎｔ）を含む低緩衝ＤＭＥＭ最小培地で交換して、マイクロプレートを３７℃で６０分間インキュベートして、温度およびｐＨの平衡を可能にすることによって開始する。
次いで、マイクロプレートを細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分析し、付着したフソソームおよび細胞のすぐ周囲の培地中の細胞外酸素およびｐＨの変化を測定する。定常状態の酸素消費量（基礎呼吸数）および細胞外酸性化率を取得した後、ＡＴＰ合成酵素を阻害するオリゴマイシン（５μＭ）およびミトコンドリアを脱共役するプロトンイオノフォアＦＣＣＰ（カルボニルシアニド４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン；２μＭ）を、マイクロプレートの各ウェルに添加し、最大酸素消費率の値を取得する。
最後に、５μＭのアンチマイシンＡ（ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害剤）を添加して、呼吸の変化が主にミトコンドリアの呼吸によるものであることを確認する。アンチマイシンＡ添加後の最小酸素消費率を、全ての酸素消費測定値から差し引いて、ミトコンドリア以外の呼吸成分を除去する。オリゴマイシン（基礎からの酸素消費率の少なくとも２５％の減少）またはＦＣＣＰ（オリゴマイシン後の酸素消費率の少なくとも５０％の増加）に適切に応答しない細胞試料を分析から除外する。次に、フソソームの呼吸レベルをＯ２／分／１ｅ４フソソームとして測定する。
次に、この呼吸レベルを、それぞれの細胞呼吸レベルに正規化する。幾つかの実施形態では、フソソームは、それぞれの細胞試料と比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上の呼吸レベルを有するであろう。
例えば、Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｎｕｅｂｅｌ Ｅ，Ｗｉｓｉｄａｇａｍａ ＤＲＲ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２０１２；７（６）：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．０４８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．０４８を参照されたい。
実施例７０：フソソームのホスファチジルセリンレベルを測定する
この実施例は、フソソームの表面に結合するアネキシンＶのレベルの定量化について説明する。
死にかけている細胞は、プログラムされた細胞死経路におけるアポトーシスのマーカーであるホスファチジルセリンを細胞表面に表示し得る。アネキシンＶはホスファチジルセリンに結合するため、アネキシンＶ結合は細胞内での生存能力の代用となる。
フソソームを、本明細書に記載されるように産生した。アポトーシスシグナルを検出するために、フソソームまたは陽性対照細胞を５％アネキシンＶ蛍光５９４（Ａ１３２０３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で染色した。各群（下記表に詳述）には、アポトーシス誘導物質であるメナジオンで処理した実験群を含めた。メナジオンを１００μＭで４時間添加した。全ての試料をフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で実行し、蛍光強度を波長５６１ｎｍのＹＬ１レーザーおよび５８５／１６ｎｍの発光フィルターで測定した。細胞外ホスファチジルセリンの存在を、全ての群でアネキシンＶの蛍光強度を比較することによって定量化した。
陰性対照の未染色フソソームは、アネキシンＶ染色に対して陽性ではなかった。
幾つかの実施形態では、フソソームは、メナジオンに応答して細胞表面上のホスファチジルセリン表示を上方調節することができ、非メナジオン刺激フソソームがアポトーシスを受けていないことを示している。幾つかの実施形態では、メナジオンで刺激された陽性対照細胞は、メナジオンで刺激されなかったフソソームよりも高レベルのアネキシンＶ染色を示した。
Figure 2022513040000133
実施例７１：ジャクスタクリンシグナル伝達レベルを測定する
この実施例では、フソソームにおけるジャクスタクリンシグナル伝達の定量化について説明する。
細胞は、ジャクスタクリンシグナル伝達を介して細胞接触依存性シグナル伝達を形成することができる。幾つかの実施形態では、フソソームにおけるジャクスタクリンシグナル伝達の存在は、フソソームがそれらのすぐ近くの細胞を刺激し、抑制し、および一般には通信できることを示すであろう。
部分的または完全な核不活化を有する哺乳動物骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）から前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生されたフソソームは、マクロファージにおけるジャクスタクリンシグナル伝達を介してＩＬ－６分泌を誘発する。一次マクロファージおよびＢＭＳＣを共培養する。骨髄由来マクロファージを最初に６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした後、初代マウスＢＭＳＣ由来フソソームまたはＢＭＳＣ細胞（陽性対照親細胞）を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地のマクロファージに置く。上清を様々な時点（２、４、６、２４時間）で収集し、ＥＬＩＳＡアッセイによってＩＬ－６分泌について分析する。（Ｃｈａｎｇ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
幾つかの実施形態では、ＢＭＳＣフソソームによって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルは、培地中のマクロファージ分泌ＩＬ－６レベルの増加によって測定される。幾つかの実施形態では、ジャクスタクリンシグナル伝達のレベルは、陽性対照の骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上大きくなるであろう。
実施例７２：パラクリンシグナル伝達レベルを測定する
この実施例では、フソソームにおけるパラクリンシグナル伝達の定量化について説明する。
細胞は、パラクリンシグナル伝達を介して局所微小環境内の他の細胞と通信することができる。幾つかの実施形態では、フソソームは、パラクリンシグナル伝達が可能であり、例えば、それらの局所環境内の細胞と通信することができる。幾つかの実施形態では、パラクリン由来の分泌を介して内皮細胞においてＣａ２＋シグナル伝達を誘発するフソソームの能力は、以下のプロトコルにより、カルシウムインジケーター、ｆｌｕｏ－４ ＡＭを介したＣａ２＋シグナル伝達を測定する。
実験プレートを調製するため、マウス肺微小血管内皮細胞（ＭＰＭＶＥＣ）を０．２％ゼラチンコーティング２５ｍｍガラス底共焦点皿（８０％コンフルエンス）にプレーティングする。ＭＰＭＶＥＣを、２％ＢＳＡおよび０．００３％プルロン酸を含むＥＣＭ中で、最終濃度５μＭ ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温で３０分間インキュベートし、ｆｌｕｏ－４ ＡＭのロードを可能にする。ロード後、ＭＰＭＶＥＣは、色素の損失を最小限に抑えるために、スルフィンピラゾンを含む実験用イメージング溶液（０．２５％ＢＳＡを含むＥＣＭ）で洗浄する。ｆｌｕｏ－４をロードした後、５００μＬの予熱した実験用イメージング溶液をプレートに添加し、プレートをＺｅｉｓｓ共焦点イメージングシステムで画像化する。
別のチューブで、新たに単離したマウスマクロファージを培養培地中の１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で処理するか、またはＬＰＳで処理しない（陰性対照）。刺激後、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによってマクロファージからフソソームが生成される。
次いで、フソソームまたは親マクロファージ（陽性対照）を、２％ＢＳＡおよび０．００３％プルロン酸を含むＥＣＭ中のｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ ｒｅｄ、ＣＭＴＰＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識する。次いで、フソソームおよびマクロファージを洗浄し、実験用イメージング溶液に再懸濁する。標識されたフソソームおよびマクロファージを、共焦点プレートのｆｌｕｏ－４ ＡＭをロードしたＭＰＭＶＥＣに添加する。
緑色および赤色の蛍光シグナルは、ｆｌｕｏ－４ ＡＭおよびｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ ｒｅｄの蛍光に対してそれぞれ４８８および５６１ｎｍで励起される、アルゴンイオンレーザー光源を備えたＺｅｉｓｓ共焦点イメージングシステムを使用して、３秒ごとに１０～２０分間記録される。Ｆｌｕｏ－４の蛍光強度の変化を、イメージングソフトウェアを使用して分析する（Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（５８）：３５１１，２０１１）。陰性対照のフソソームおよび細胞群で測定されたＦｌｕｏ－４強度のレベルを、ＬＰＳで刺激されたフソソームおよび細胞群から差し引く。
幾つかの実施形態では、フソソーム、例えば、活性化フソソームは、陽性対照細胞群よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上のＦｌｕｏ－４蛍光強度の増加を誘導する。
実施例７３：移動性についてのアクチンを重合する能力を測定する
この実施例では、フソソームにおけるアクチンなどの細胞骨格成分の定量について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、アクチンなどの細胞骨格成分を含み、アクチン重合が可能である。
細胞は、細胞骨格成分であるアクチンを、運動性および他の細胞質プロセスに使用する。細胞骨格は、運動駆動力を生み出し、運動のプロセスを調整するために不可欠である
Ｃ２Ｃ１２細胞を、本明細書に記載されるように除核した。１２．５％および１５％のフィコール層から得られたフソソームをプールして「軽」とラベル付けし、１６～１７％の層から得られたフソソームをプールして「中」とラベル付けした。フソソームまたは細胞（親Ｃ２Ｃ１２細胞、陽性対照）を、ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）に再懸濁し、２４ウェル超低付着プレート（３４７３番、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）にプレーティングし、３７℃＋５％ＣＯ２でインキュベートした。試料を定期的に採取し（５．２５時間、８．７５時間、２６．５時間）、１６５Ｍローダミンファロイジンで染色し（陰性対照は染色されなかった）、Ｆ－アクチン細胞骨格含有量を測定するために、ＦＣレーザーＹＬ１（５８５／１６フィルターで５６１ｎｍ）を用いてフローサイトメーター（Ａ２４８５８番、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で測定する。フソソーム中のローダミンファロイジンの蛍光強度を、未染色のフソソームおよび染色された親Ｃ２Ｃ１２細胞と共に測定した。
フソソームの蛍光強度は、全ての時点で陰性対照よりも大きく（図４）、フソソームは、親のＣ２Ｃ１２細胞と同様の速度でアクチンを重合することができた。
下記表に列挙される追加の細胞骨格成分を、製造元の指示に従って、市販のＥＬＩＳＡシステム（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を介して測定する。
Figure 2022513040000134
次いで、マイクロウェルストリップから１００μＬの適切に希釈された溶解物を適切なウェルに添加する。マイクロウェルをテープで密封し、３７℃で２時間インキュベートする。インキュベーション後、密封テープを剥がし、内容物を廃棄する。各マイクロウェルを、２００μＬの１×洗浄バッファーで４回洗浄する。個々に洗浄した後、プレートを吸収性の布に打ち付けて、残りの洗浄液を各ウェルから除去する。ただし、実験中はいつでもウェルが完全に乾燥しているわけではない。
次に、陰性対照ウェルを除いて、１００μＬの再構成された検出抗体（緑色）を個々のウェルに添加する。次いで、ウェルを密閉し、３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーションが完了した後、洗浄手順を繰り返す。１００μＬの再構成されたＨＲＰ結合二次抗体（赤色）を、各ウェルに添加する。ウェルをテープで密封し、３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、密封テープを剥がし、洗浄手順を繰り返す。次いで、１００μＬのＴＭＢ基質を各ウェルに添加する。ウェルをテープで密封し、次いで、３７℃で１０分間インキュベートする。この最後のインキュベーションが完了したら、１００μＬの停止溶液を各ウェルに添加し、プレートを数秒間穏やかに振とうする。
アッセイの分光光度分析を、停止溶液を添加してから３０分以内に実施する。ウェルの下側をリントフリーティッシュで拭き、次いで、４５０ｎｍで吸光度を読み取る。幾つかの実施形態では、検出抗体で染色されたフソソーム試料は、陰性対照のフソソーム試料よりも４５０ｎｍでより多くの光を吸収し、検出抗体で染色された細胞試料よりも少ない光を吸収する。
実施例７４：平均膜電位を測定する
この実施例では、フソソームのミトコンドリア膜電位の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、ミトコンドリア膜を含むフソソームは、ミトコンドリア膜電位を維持するであろう。
ミトコンドリアの代謝活性を、ミトコンドリアの膜電位によって測定することができる。フソソーム調製物の膜電位を、ミトコンドリア膜電位を評価するための市販の色素、ＴＭＲＥ（ＴＭＲＥ：テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩、Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ｔ６６９）を使用して定量化する。
フソソームは、前の実施例で説明した方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームまたは親細胞を成長培地（１０％ウシ胎仔血清を含むフェノールレッドフリーのＤＭＥＭ）で６アリコート（未処理およびＦＣＣＰ処理で３連）で希釈する。試料の１つのアリコートを、ミトコンドリア膜電位を排除し、ＴＭＲＥ染色を防ぐ脱共役剤であるＦＣＣＰと共にインキュベートする。ＦＣＣＰで処理した試料の場合、２μＭのＦＣＣＰを試料に添加し、分析前に５分間インキュベートする。次いで、フソソームと親細胞を３０ｎＭ ＴＭＲＥで染色する。各試料について、未染色（ＴＭＲＥなし）の試料も並行して調製する。試料を３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、試料を４８８ｎｍアルゴンレーザーを備えたフローサイトメーターで分析し、励起および発光を５３０＋／－３０ｎｍで収集する。
膜電位値（ミリボルト、ｍＶ）は、ＴＭＲＥの強度に基づいて計算される。全ての事象を、前方および側方散乱チャネルで捕捉する（あるいは、ゲートを適用して、小さな破片を排除することもできる）。未処理の試料およびＦＣＣＰで処理した試料の両方の蛍光強度（ＦＩ）値を、未処理の試料およびＦＣＣＰで処理した試料の幾何平均から未染色試料の蛍光強度の幾何平均を差し引くことによって正規化される。各調製物に関する膜電位状態は、ＴＭＲＥ蛍光に基づいてフソソームまたは細胞のミトコンドリア膜電位を決定するために使用できる修正ネルンスト方程式（以下を参照）で正規化された蛍光強度値を使用して計算される（ＴＭＲＥはネルンスト様式でミトコンドリアに蓄積するため）。
フソソームまたは細胞膜電位を次の式で計算する：（ｍＶ）＝－６１．５＊ｌｏｇ（ＦＩ未処理－正規化／ＦＩＦＣＣＰ－処理－正規化）。幾つかの実施形態では、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞からのフソソーム調製物に対してこのアッセイまたは同等物を使用すると、フソソーム調製物の膜電位状態は、親細胞よりも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内、またはそれ以上大きくなるであろう。幾つかの実施形態では、膜電位の範囲は、約－２０～－１５０ｍＶである。
実施例７５：被験体における持続性半減期を測定する
この実施例では、フソソーム半減期の測定について説明する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生されたガウシアルシフェラーゼを発現する細胞に由来し、純粋、１：２、１：５、および１：１０の希釈をバッファー溶液中で行う。フソソームを欠くバッファー容器を陰性対照として使用する。
各用量を、３匹の８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に静脈内投与する。フソソームの静脈内投与の１、２、３、４、５、６、１２、２４、４８、および７２時間後に、眼窩後静脈から血液を採取する。動物を実験の終わりにＣＯ２吸入によって犠牲にする。
血液を、室温で２０分間遠心分離する。血清試料を、バイオアナリシスまで－８０℃で直ちに凍結する。次いで、各血液試料を使用して、試料をガウシアルシフェラーゼ基質（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ、Ｐｉｎｅｔｏｐ，ＡＺ）と混合した後、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイを実行する。簡単に説明すると、ルシフェリンまたは発光分子であるセレンテラジンをフラッシュアッセイバッファーと混合し、混合物を、９６ウェルプレートの血液試料を含むウェルにピペットで移す。血液を欠く陰性対照ウェルは、バックグラウンドのガウシアルシフェラーゼシグナルを測定するためのアッセイバッファーを含む。
更に、発光シグナルを１時間あたりのガウシアルシフェラーゼ分泌分子に変換するために、陽性対照の精製されたガウシアルシフェラーゼの標準曲線（Ａｔｈｅｎａ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号０３０８）を準備する。５００ミリ秒の積算時間を使用して、プレートの発光をアッセイする。バックグラウンドガウシアルシフェラーゼシグナルを全ての試料から差し引いた後、線形近似曲線を、ガウシアルシフェラーゼ標準曲線に対して計算する。試料の測定値が標準曲線に収まらない場合は、適切に希釈して再分析する。１、２、３、４、５、６、１２、２４、４８、および７２時間に採取した試料からのルシフェラーゼシグナルを、標準曲線に内挿する。消失速度定数ｋｅ（ｈ－１）は、次の１コンパートメントモデルの等式を使用して計算される：Ｃ（ｔ）＝Ｃ０×ｅ－ｋｅｘｔ、式中、Ｃ（ｔ）（ｎｇ／ｍＬ）は、時間ｔ（ｈ）のフソソームの濃度であり、Ｃ０は、時間＝０（ｎｇ／ｍＬ）のフソソームの濃度である。消失半減期ｔ１／２、ｅ（ｈ）を、ｌｎ（２）／ｋｅとして計算する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、陰性対照細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上の半減期を有するであろう。
実施例７６：循環中のフソソームの保持を測定する
この実施例では、循環へのフソソーム送達と臓器での保持の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは循環に送達され、臓器部位に捕捉および保持されない。
幾つかの実施形態では、末梢循環に送達されたフソソームは、高効率で標的部位に到達するために、細網内皮系（ＲＥＳ）による捕捉および保持を回避する。ＲＥＳは、脾臓、リンパ節、および肝臓などの実質臓器に存在する細胞、主にマクロファージのシステムで構成されている。これらの細胞は、通常、赤血球などの「古い」細胞の除去を任務としている。
フソソームは、ＣＲＥリコンビナーゼを発現している細胞（作用物質）、またはＣＲＥを発現していない細胞（陰性対照）に由来する。これらのフソソームは、実施例６２のようにインビボ注射用に調製される。
レシピエントマウスは、ルシフェラーゼの発現をブロック解除するために、フソソームによって送達されたｍＲＮＡから作られたＣＲＥタンパク質によって修飾されたｌｏｘｐ－ルシフェラーゼゲノムＤＮＡ遺伝子座を有する（ＪＡＸ＃００５１２５）。ルシフェラーゼは、生きている動物の生物発光イメージングによって検出することができる。この実施例の陽性対照は、同じタンパク質を、それ自体のゲノムからマクロファージおよび単球細胞でのみ発現するマウス系統と交配したレシピエントマウスの子孫である（Ｃｘ３ｃｒ１－ＣＲＥ ＪＡＸ＃０２５５２４）。この交配からの子孫は、各対立遺伝子（ｌｏｘｐ－ルシフェラーゼ、Ｃｘ３ｃｒ１－ＣＲＥ）の１つを有する。
フソソームは、ＣＲＥタンパク質による作用を受けてルシフェラーゼの発現をもたらす遺伝子座を有するマウスへの尾静脈注射（ＩＶ、実施例＃４８）を介して末梢循環に注射される。ＲＥＳの非特異的捕捉機序は、本質的に食細胞であり、ＣＲＥタンパク質の一部をフソソームからマクロファージに放出してゲノム組換えを引き起こす。ＩＶＩＳ測定（実施例６２に記載される）は、非フソゲン対照が蓄積および融合する場所を特定する。脾臓、リンパ節、および肝臓での蓄積は、ＲＥＳを介した非特異的なフソソームの捕捉を示す。ＩＶＩＳは、フソソーム注射の２４、４８、および９６時間後に実行される。
マウスを安楽死させ、脾臓、肝臓、および腸内の主要なリンパ鎖を採取する。
ゲノムＤＮＡは、これらの臓器から単離され、組換えられたゲノムＤＮＡの残骸に対して定量的ポリメラーゼ連鎖反応を受ける。試料中の細胞数の測定値を提供するために、代替ゲノム遺伝子座（ＣＲＥによって標的とされない）も定量化される。
実施形態では、低い生物発光シグナルは、動物全体、特に肝臓および脾臓部位において、作用物質および陰性対照の両方について観察されるであろう。実施形態では、陽性対照は、肝臓における増加したシグナル（陰性対照および作用物質よりも）および脾臓における高いシグナルおよびリンパ節と一致する分布を示すであろう。
幾つかの実施形態では、これらの組織のゲノムＰＣＲ定量化は、調べた全ての組織における陽性対照における代替遺伝子座に対する組換えシグナルの高い割合を示し、一方、または作用物質および陰性対照については、組換えのレベルは全ての組織において無視できるであろう。
幾つかの実施形態では、この実施例の結果は、非フソゲン対照がＲＥＳによって保持されず、広い分布を達成し、高い生物学的利用能を示すことができることを示すであろう。
実施例７７：免疫抑制を伴うフソソームの寿命
この実施例では、フソソーム組成物が免疫抑制薬と同時投与された場合の免疫原性の定量化について説明する。
免疫応答を賦活する治療法は、時として治療効果を低下させるか、またはレシピエントに毒性を引き起こす可能性がある。幾つかの実施形態では、フソソームは、実質的に非免疫原性となるであろう。
前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生されたフソソームの精製された組成物は、免疫抑制薬と同時投与され、免疫原性特性は、インビボでのフソソームの寿命によってアッセイされる。ルシフェラーゼで標識された十分な数のフソソームが、タクロリムス（ＴＡＣ、４ｍｇ／ｋｇ／日；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはビヒクル（陰性対照）、または任意の追加の作用物質（陽性対照）の正常なマウスの腓腹筋に局所的に注射される。次いで、注射の１、２、３、４、５、６、１２、２４、４８、および７２時間後にマウスをインビボでイメージングに供する。
簡単に説明すると、マウスをイソフルランで麻酔し、Ｄ－ルシフェリンを、体重１キログラムあたり３７５ｍｇの用量で腹腔内投与する。イメージング時には、動物を遮光チャンバーに入れ、動物に移植されたルシフェラーゼ発現フソソームから放出された光子を、生物発光の強度に応じて、５秒から５分の積分時間で収集する。同じマウスを、上記の様々な時点で繰り返し走査する。ＢＬＩ信号は、１秒あたりの光子数（全フラックス）の単位で定量化され、ｌｏｇ［１秒あたりの光子数］として表される。データは、ＴＡＣを使用した場合と使用しない場合の強度とフソソーム注射を比較することによって分析する。
実施形態では、アッセイは、最終時点で、フソソーム単独およびビヒクル群と比較して、ＴＡＣ同時投与群におけるフソソーム寿命の増加を示すであろう。フソソーム寿命の増加に加えて、幾つかの実施形態では、各時点で、フソソーム＋ＴＡＣアーム対フソソーム＋ビヒクルまたはフソソーム単独からのＢＬＩシグナルの増加が観察される。
実施例７８：フソソームに対して反応性のある既存のＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を測定する
この実施例では、フローサイトメトリーを使用して測定された既存の抗フソソーム抗体価の定量化について説明する。
フソソームの免疫原性の尺度は、抗体応答である。フソソームを認識する抗体は、フソソームの活性または寿命を制限し得る方法で結合することができる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるフソソームの幾つかのレシピエントは、フソソームに結合して認識する既存の抗体を有する。
この実施例では、抗フソソーム抗体力価は、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって、異種ソース細胞を使用して産生されたフソソームを使用して試験される。この実施例では、フソソームナイーブマウスを、抗フソソーム抗体の存在について評価する。特に、本明細書に記載の方法は、プロトコルに最適化されたヒト、ラット、サルに等しく適用可能である可能性がある。
陰性対照は、ＩｇＭおよびＩｇＧが枯渇したマウス血清であり、陽性対照は、異種ソース細胞から生成されたフソソームの注射を複数回受けたマウスに由来する血清である。
フソソームに結合する既存の抗体の存在を評価するために、フソソームナイーブマウスからの血清を最初に３０分間５６℃に加熱することによって補体除去し、続いて３％ＦＣＳおよび０．１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳで３３％希釈する。等量の血清およびフソソーム（１ｍＬあたり１×１０２～１×１０８フソソーム）懸濁液を、４℃で３０分間インキュベートし、仔ウシ血清クッション（ｃｕｓｈｉｏｎ）を介してＰＢＳで洗浄する。
ＩｇＭ異種反応性抗体は、細胞をマウスＩｇＭのＦｃ部分に特異的なＰＥ複合ヤギ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と４℃で４５分間インキュベートすることによって染色される。特に、抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２二次抗体を使用することもできる。全ての群の細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析する。蛍光データは、対数増幅を使用して収集され、平均蛍光強度として表される。幾つかの実施形態では、陰性対照血清は、無血清または二次単独対照に匹敵する無視できる蛍光を示すであろう。一実施形態では、陽性対照は、陰性対照よりも多く、無血清または二次単独対照よりも多い蛍光を示すであろう。一実施形態では、免疫原性が生じる場合、フソソームナイーブマウスからの血清は、陰性対照よりも強い蛍光を示すであろう。一実施形態では、免疫原性が生じない場合、フソソームナイーブマウスからの血清は、陰性対照と比較して同様の蛍光を示すであろう。
実施例７９：フソソームの複数回投与後のＩｇＧおよびＩｇＭ抗体応答を測定する
この実施例では、修飾フソソームの複数回投与後の修飾フソソームの体液性応答の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、例えば、本明細書に記載される方法によって修飾された修飾フソソームは、修飾フソソームの複数回（例えば１回超、例えば２回以上）の投与後に、低下した（例えば、非修飾フソソームの投与と比較して低下した）体液性応答を有するであろう。
フソソームの免疫原性の尺度は、抗体応答である。幾つかの実施形態では、フソソームの反復注射は、抗フソソーム抗体、例えば、フソソームを認識する抗体の発生につながり得る。幾つかの実施形態では、フソソームを認識する抗体は、フソソームの活性または寿命を制限し得る方法で結合することができる。
この実施例では、抗フソソーム抗体力価を、フソソームの１回以上の投与後に調べる。フソソームを、前の実施例のうちのいずれか１つによって産生する。フソソームは、修飾されていない間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ）、ＨＬＡ－Ｇのレンチウイルス媒介発現で修飾された間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、および空ベクター（以下、ＭＳＣ－空ベクター）のレンチウイルス媒介発現で修飾された間葉系幹細胞から生成される。血清を、異なるコホートから採取する：ビヒクル（フソソームナイーブ群）、ＭＳＣフソソーム、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇフソソーム、またはＭＳＣ－空ベクターフソソームを１、２、３、５、１０回全身および／または局所注射したマウス。
抗フソソーム抗体の存在および量を評価するために、マウスからの血清を最初に５６℃で３０分間加熱して補体除去し、続いて３％ＦＣＳおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳで３３％希釈する。等量の血清およびフソソーム（１ｍＬあたり１×１０２～１×１０８フソソーム）を、４℃で３０分間インキュベートし、仔ウシ血清クッション（ｃｕｓｈｉｏｎ）を介してＰＢＳで洗浄する。
フソソーム反応性ＩｇＭ抗体は、細胞をマウスＩｇＭのＦｃ部分に特異的なＰＥ複合ヤギ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と４℃で４５分間インキュベートすることによって染色される。特に、抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２二次抗体を使用することもできる。全ての群の細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析する。蛍光データは、対数増幅を使用して収集され、平均蛍光強度として表される。
幾つかの実施形態では、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇフソソームは、ＭＳＣフソソームまたはＭＳＣ－空ベクターフソソームと比較して、注射後に抗フソソームＩｇＭ（またはＩｇＧ１／２）抗体力価（ＦＡＣＳの蛍光強度によって測定される）が減少するであろう。
実施例８０：免疫原性を低下させるための寛容原性タンパク質を発現するためのフソソームソース細胞の修飾
この実施例では、修飾された細胞源に由来するフソソームにおける免疫原性の定量化について記載する。幾つかの実施形態では、修飾された細胞源に由来するフソソームは、修飾されていない細胞源に由来するフソソームと比較して、免疫原性が低下している。
免疫応答を賦活する治療法は、時として治療効果を低下させるか、またはレシピエントに毒性を引き起こす可能性がある。幾つかの実施形態では、実質的に非免疫原性のフソソームが被験体に投与される。幾つかの実施形態では、細胞源の免疫原性は、フソソーム免疫原性の代用としてアッセイされ得る。
レンチウイルスを介したＨＬＡ－Ｇの発現または空ベクター（陰性対照）の発現を使用して修飾されたｉＰＳ細胞を、以下のように免疫原性特性についてアッセイする。潜在的なフソソーム細胞源としての十分な数のｉＰＳ細胞を、Ｃ５７／Ｂ６マウスの後方脇腹に皮下注射し、奇形腫が形成されるのに適切な時間を与える。
奇形腫が形成されると、組織を採取する。蛍光染色用に調製された組織をＯＣＴで凍結し、免疫組織化学およびＨ＆Ｅ染色用に調製された組織を、１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋する。組織切片を、一般的な免疫組織化学プロトコルに従い、抗体、ポリクローナルウサギ抗ヒトＣＤ３抗体（ＤＡＫＯ）、マウス抗ヒトＣＤ４ ｍＡｂ（ＲＰＡ－Ｔ４、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、マウス抗ヒトＣＤ８ ｍＡｂ（ＲＰＡ－Ｔ８、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で染色する。これらは、適切な検出試薬、すなわち抗マウス二次ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）または抗ウサギ二次ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して検出される。
検出は、ペルオキシダーゼベースの視覚化システム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して行う。データを、光学顕微鏡を使用して２０倍の視野で調べた２５、５０、または１００の組織切片に存在する浸潤性ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＮＫ細胞の平均数を取得することによって分析する。実施形態では、修飾されていないｉＰＳＣまたは空ベクターを発現するｉＰＳＣは、ＨＬＡ－Ｇを発現するｉＰＳＣと比較して、調べたフィールドに存在する浸潤性ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＮＫ細胞の数が多くなるであろう。
幾つかの実施形態では、フソソームの免疫原性特性は、ソース細胞のそれと実質的に同等となるであろう。幾つかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇで修飾されたｉＰＳ細胞に由来するフソソームは、それらの修飾されていない対応物と比較して、免疫細胞浸潤が低下するであろう。
実施例８１：免疫原性を低下させるための免疫原性タンパク質をノックダウンするためのフソソームソース細胞の修飾
この実施例では、免疫原性である分子の発現を低下させるように修飾された細胞源に由来するフソソーム組成物の生成の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、免疫原性である分子の発現を低下させるように修飾されている細胞源に由来することができる。
免疫応答を賦活する治療法は、治療効果を低下させるか、またはレシピエントに毒性を引き起こす可能性がある。そのため、免疫原性は、安全かつ効果的な治療用フソソームにとって重要な特性である。ある特定の免疫活性化剤の発現は、免疫応答を引き起こす可能性がある。ＭＨＣクラスＩは、免疫活性化剤の一例である。
この実施例では、フソソームは、前の実施例で説明した方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、修飾されていない間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ、陽性対照）、ＭＨＣクラスＩを標的とするｓｈＲＮＡのレンチウイルス媒介発現で修飾された間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ－ｓｈＭＨＣクラスＩ）、および非標的スクランブルｓｈＲＮＡのレンチウイルス媒介発現で修飾された間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣスクランブル、陰性対照）から生成される。
フソソームを、フローサイトメトリーを使用してＭＨＣクラスＩの発現についてアッセイする。適切な数のフソソームを洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、ＭＨＣクラスＩに対する蛍光標識モノクローナル抗体（Ｈａｒｌａｎ Ｓｅｒａ－Ｌａｂ、Ｂｅｌｔｏｎ，ＵＫ）の１：１０＝１：４０００希釈液と共に氷上で３０分間保持する。フソソームをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁する。非特異的蛍光は、同等の希釈率で適切な蛍光標識アイソタイプ対照抗体とインキュベートしたフソソーム調製物の等量を使用して決定される。フソソームをフローサイトメーター（ＦＡＣＳｏｒｔ、Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でアッセイし、データをフロー分析ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析する。
ＭＳＣ、ＭＳＣ－ｓｈＭＨＣクラスＩ、ＭＳＣ－スクランブルに由来するフソソームの平均蛍光データを比較する。幾つかの実施形態では、ＭＳＣ－ｓｈＭＨＣクラスＩに由来するフソソームは、ＭＳＣおよびＭＳＣスクランブルと比較して、ＭＨＣクラスＩのより低い発現を有するであろう。
実施例８２：マクロファージ食作用を回避するためのフソソームソース細胞の修飾
この実施例では、修飾フソソームによる食作用の回避の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、修飾されたフソソームは、マクロファージによる食作用を回避するであろう。
細胞は食作用に関与し、粒子を貪食し、バクテリアまたは死細胞等の外来侵入者の隔離および破壊を可能にする。幾つかの実施形態では、マクロファージによるフソソームの食作用は、それらの活性を低下させる。
フソソームは、前の実施例で説明した方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、ＣＤ４７を欠くＣＳＦＥ標識哺乳類細胞（以下、ＮＭＣ、陽性対照）、ＣＤ４７ ｃＤＮＡのレンチウイルス媒介発現を使用してＣＤ４７を発現するように操作されたＣＳＦＥ標識細胞（以下、ＮＭＣ－ＣＤ４７）、および空ベクター対照（以下、ＮＭＣ－空ベクター、陰性対照）のレンチウイルス媒介発現を使用して操作されたＣＳＦＥ標識細胞から作成される。
マクロファージを媒介した免疫クリアランスの低下は、以下のプロトコルに従った食作用アッセイによって決定される。マクロファージを、採取後すぐに共焦点ガラス底皿にプレーティングする。マクロファージをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓで１時間インキュベートして付着させる。ＮＭＣ、ＮＭＣ－ＣＤ４７、ＮＭＣ－空ベクターに由来する適切な数のフソソームを、プロトコルに示されるようにマクロファージに添加し、２時間インキュベートする（ｔｏｏｌｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｍｐ０６６９４．ｐｄｆ）。
２時間後、ディッシュを穏やかに洗浄し、細胞内蛍光を調べる。貪食された粒子によって放出された細胞内蛍光を、４８８励起で共焦点顕微鏡によって画像化する。食作用陽性マクロファージの数を、イメージングソフトウェアを使用して定量化する。データは、食作用指数＝（貪食された細胞の総数／カウントされたマクロファージの総数）×（貪食された細胞を含むマクロファージの数／カウントされたマクロファージの総数）×１００として表される。
幾つかの実施形態では、食作用指数は、マクロファージがＮＭＣ－ＣＤ４７に由来するフソソームとインキュベートされるとき、ＮＭＣまたはＮＭＣ空ベクターに由来するものと比べて低下するであろう。
実施例８３：ＰＢＭＣ細胞溶解によって媒介される細胞毒性を減少させるためのフソソームソース細胞の修飾
この実施例では、ＰＢＭＣによる細胞溶解のために細胞毒性が減少するように修飾された細胞に由来するフソソームの生成について説明した。
幾つかの実施形態では、ＰＢＭＣによるソース細胞またはフソソームの細胞毒性媒介細胞溶解は、溶解がフソソームの活性を低下させる、例えば、阻害または停止することから、フソソームの免疫原性の尺度である。
この実施例では、フソソームは、前の実施例で説明した方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、修飾されていない間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ、陽性対照）、ＨＬＡ－Ｇのレンチウイルス媒介発現で修飾された間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、および空ベクター（以下、ＭＳＣ－空ベクター、陰性対照）のレンチウイルス媒介発現で修飾された間葉系幹細胞から生成される。
ＰＭＢＣを介したフソソームの溶解は、Ｂｏｕｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（２）：８５－９２；１９９２＆ｖａｎ Ｂｅｓｏｕｗ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７０（１）：１３６－１４３；２０００に記載されるユーロピウム放出アッセイによって決定される。ＰＢＭＣ（以下、エフェクター細胞）を適切なドナーから単離し、丸底９６ウェルプレート中で同種異系のガンマ線照射したＰＭＢＣおよび２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ ＢＶ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって３７℃で７日間刺激する。フソソームは、ユーロピウム－ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）（ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で標識化する。
７日目に、細胞毒性媒介溶解アッセイを、６３Ｅｕで標識されたフソソームをエフェクター細胞と９６ウェルプレートで、１０００：１～１：１および１：１．２５～１：１０００の範囲のエフェクター／標的比でプレーティングした後、１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間インキュベートすることによって実施する。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、上清の試料をバックグラウンド蛍光の低い９６ウェルプレート（フルオロイムノプレート、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に移す。
続いて、エンハンスメントソリューション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を各ウェルに添加する。放出されたユーロピウムを、時間分解蛍光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ １４２０マルチラベルカウンター、ＬＫＢ－Ｗａｌｌａｃ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定する。蛍光は１秒あたりのカウント数（ＣＰＳ）で表される。標的フソソームによるユーロピウムの最大放出パーセントは、適切な数（１×１０２～１×１０８）のフソソームを１％トリトン（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）と適切な時間インキュベートすることによって決定される。標的フソソームによるユーロピウムの自発的放出は、エフェクター細胞が添加されない標識化された標的フソソームのインキュベーションによって測定される。次いで、漏れ率は次のように計算される：（自然放出／最大放出）×１００％。最後に、細胞毒性媒介溶解のパーセンテージは、溶解％＝［（測定された溶解－自発的溶解－自発的放出）／（最大放出－自発的放出）］×１００％として計算される。データを異なるエフェクターターゲット比の関数として溶解のパーセンテージを調べることによって分析する。
幾つかの実施形態では、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ細胞から生成されたフソソームは、ＭＳＣまたはＭＳＣスクランブル生成されたフソソームと比較して、特定の時点で、標的細胞による溶解のパーセンテージが減少するであろう。
実施例８４：ＮＫ溶解活性を減少させるためのフソソームソース細胞の修飾
この実施例では、ＮＫ細胞による細胞毒性媒介細胞溶解を減少させるように修飾されている細胞源に由来するフソソーム組成物の生成について説明する。幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞によるソース細胞またはフソソームの細胞毒性媒介性細胞溶解は、フソソームの免疫原性の尺度である。
この実施例では、フソソームは、前の実施例で説明した方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、修飾されていない間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ、陽性対照）、ＨＬＡ－Ｇのレンチウイルス媒介発現で修飾された間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、および空ベクター（以下、ＭＳＣ－空ベクター、陰性対照）のレンチウイルス媒介発現で修飾された間葉系幹細胞から生成される。
ＮＫ細胞を介したフソソームの溶解は、Ｂｏｕｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（２）：８５－９２；１９９２＆ｖａｎ Ｂｅｓｏｕｗ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７０（１）：１３６－１４３；２０００に記載されるユーロピウム放出アッセイによって決定される。ＮＫ細胞（以下、エフェクター細胞）を、Ｃｒｏｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０）：１５４７－１５５９；２０１１における方法に従って適切なドナーから単離し、丸底９６ウェルプレート中で同種異系のγ線照射したＰＭＢＣおよび２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ ＢＶ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって３７℃で７日間刺激する。フソソームは、ユーロピウム－ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）（ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で標識化する。
７日目に、細胞毒性媒介溶解アッセイを、６３Ｅｕで標識されたフソソームをエフェクター細胞と９６ウェルプレートで、１０００：１～１：１および１：１．２５～１：１０００の範囲のエフェクター／標的比でプレーティングした後、１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間インキュベートすることによって実施する。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、上清の試料をバックグラウンド蛍光の低い９６ウェルプレート（フルオロイムノプレート、Ｎｕｎｃ、デンマーク国ロスキレ）に移す。
続いて、エンハンスメントソリューション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、オランダ国フローニンゲン）を各ウェルに加える。放出されたユーロピウムを、時間分解蛍光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ １４２０マルチラベルカウンター、ＬＫＢ－Ｗａｌｌａｃ、フィンランド国）で測定する。蛍光は１秒あたりのカウント数（ＣＰＳ）で表される。標的フソソームによるユーロピウムの最大放出パーセントは、適切な数（１×１０２～１×１０８）のフソソームを１％トリトン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と適切な時間インキュベートすることによって決定される。標的フソソームによるユーロピウムの自発的放出は、エフェクター細胞が添加されない標識化された標的フソソームのインキュベーションによって測定される。次いで、漏れ率は次のように計算される：（自然放出／最大放出）×１００％。最後に、細胞毒性媒介溶解のパーセンテージは、溶解％＝［（測定された溶解－自発的溶解－自発的放出）／（最大放出－自発的放出）］×１００％として計算される。データを様々なエフェクターターゲット比の関数として溶解のパーセンテージを調べることによって分析する。
幾つかの実施形態では、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ細胞から生成されたフソソームは、ＭＳＣまたはＭＳＣスクランブル生成されたフソソームと比較して、適切な時点で溶解のパーセンテージが減少するであろう。
実施例８５：ＣＤ８キラーＴ細胞溶解を減少させるためのフソソームソース細胞の修飾
この実施例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞毒性媒介細胞溶解を減少させるように修飾されている細胞源に由来するフソソーム組成物の生成について説明する。幾つかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるソース細胞またはフソソームの細胞毒性媒介性細胞溶解は、フソソームの免疫原性の尺度である。
この実施例では、フソソームは、前の実施例で説明した方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、修飾されていない間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ、陽性対照）、ＨＬＡ－Ｇのレンチウイルス媒介発現で修飾された間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、および空ベクター（以下、ＭＳＣ－空ベクター、陰性対照）のレンチウイルス媒介発現で修飾された間葉系幹細胞から生成される。
ＣＤ８＋Ｔ細胞を介したフソソームの溶解は、Ｂｏｕｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（２）：８５－９２；１９９２＆ｖａｎ Ｂｅｓｏｕｗ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７０（１）：１３６－１４３；２０００に記載されるユーロピウム放出アッセイによって決定される。ＣＤ８＋細胞（以下、エフェクター細胞）を、Ｃｒｏｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０）：１５４７－１５５９；２０１１における方法に従って適切なドナーから単離し、丸底９６ウェルプレート中で同種異系のγ線照射したＰＭＢＣおよび２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ ＢＶ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって３７℃で７日間刺激する。フソソームは、ユーロピウム－ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）（ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で標識化する。
７日目に、細胞毒性媒介溶解アッセイを、６３Ｅｕで標識されたフソソームをエフェクター細胞と９６ウェルプレートで、１０００：１～１：１および１：１．２５～１：１０００の範囲のエフェクター／標的比でプレーティングした後、１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間インキュベートすることによって実施する。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、２０μＬの上清をバックグラウンド蛍光の低い９６ウェルプレート（フルオロイムノプレート、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に移す。
続いて、エンハンスメントソリューション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、オランダ国フローニンゲン）を各ウェルに加える。放出されたユーロピウムを、時間分解蛍光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ １４２０マルチラベルカウンター、ＬＫＢ－Ｗａｌｌａｃ、フィンランド国）で測定する。蛍光は１秒あたりのカウント数（ＣＰＳ）で表される。標的フソソームによるユーロピウムの最大放出パーセントは、適切な数（１×１０２～１×１０８）のフソソームを１％トリトン（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）と適切な時間インキュベートすることによって決定される。標的フソソームによるユーロピウムの自発的放出は、エフェクター細胞が添加されない標識化された標的フソソームのインキュベーションによって測定される。次いで、漏れ率は次のように計算される：（自然放出／最大放出）×１００％。最後に、細胞毒性媒介溶解のパーセンテージは、溶解％＝［（測定された溶解－自発的溶解－自発的放出）／（最大放出－自発的放出）］×１００％として計算される。データを異なるエフェクターターゲット比の関数として溶解のパーセンテージを調べることによって分析する。
幾つかの実施形態では、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ細胞から生成されたフソソームは、ＭＳＣまたはＭＳＣスクランブル生成されたフソソームと比較して、適切な時点で溶解のパーセンテージが減少するであろう。
実施例８６：Ｔ細胞活性化を減少させるためのフソソームソース細胞の修飾
この実施例では、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって評価されるように、Ｔ細胞の活性化および増殖が低下する修飾フソソームの生成について説明する。
Ｔ細胞の増殖および活性化は、フソソームの免疫原性の尺度である。フソソーム組成物によるＭＬＲ反応におけるＴ細胞増殖の刺激は、インビボでのＴ細胞増殖の刺激を示唆し得る。
幾つかの実施形態では、修飾されたソース細胞から生成されたフソソームは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって評価されるように、Ｔ細胞の活性化および増殖を低下させた。幾つかの実施形態では、修飾されたソース細胞から生成されたフソソームは、インビボで免疫応答を生成せず、したがって、フソソーム組成物の有効性を維持する。
この実施例では、フソソームは、前の実施例で説明した方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、修飾されていない間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ、陽性対照）、ＩＬ－１０のレンチウイルス媒介発現で修飾された間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ－ＩＬ－１０）、および空ベクターのレンチウイルス媒介発現で修飾された間葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ－空ベクター、陰性対照）から生成される。
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６脾細胞は、刺激細胞または応答細胞として使用される。特に、これらの細胞の供給源は、一般的に使用されているヒト由来の刺激細胞／応答細胞と交換することができる。更に、任意の哺乳動物の精製された同種異系ＣＤ４＋Ｔ細胞集団、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団、またはＣＤ４－／ＣＤ８－をレスポンダー集団として使用することができる。
マウス脾細胞は、完全につや消ししたスライドを使用した機械的解離と、それに続く溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ－Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）による赤血球溶解によって単離される。実験の前に、刺激細胞に２０Ｇｙのγ線を照射して、応答細胞との反応を防ぐ。次いで、完全ＤＭＥＭ－１０培地の丸底９６ウェルプレートに同数の刺激細胞および応答細胞（または１：１の比率を維持しながら代替濃度）を添加することによって、共培養を行う。適切な数のフソソーム（１ｘ１０１～１×１０８範囲からの幾つかの濃度）が、異なる時間間隔、ｔ＝０、６、１２、２４、３６、４８時間で共培養物に添加される。
増殖を、１μＣｉの［３Ｈ］－チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を添加して取込みを可能にすることによって評価する。［３Ｈ］－チミジンを、ｔ＝２、６、１２、２４、３６、４８、７２時間でＭＬＲに添加し、２、６、１２、１８、２４、３６および４８時間の長期培養後に、９６ウェル細胞ハーベスター（Ｉｎｏｔｅｃｋ，Ｂｅｒｔｏｌｄ，Ｊａｐａｎ）を使用して、細胞をガラス繊維フィルター上に採取する。全てのＴ細胞増殖実験を３回行う。［３Ｈ］－チミジンの取込みは、マイクロベータＩＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を使用して測定する。結果を、１分あたりのカウント（ｃｐｍ）として表すことができる。
幾つかの実施形態では、ＭＳＣ－ＩＬ１０フソソームは、ＭＳＣ－空ベクターまたはＭＳＣ未修飾フソソーム対照と比較して、Ｔ細胞増殖の減少を示すであろう。
実施例８７：被験体における標的化電位を測定する
この実施例では、特定の身体部位を標的とするフソソームの能力を評価する。幾つかの実施形態では、フソソームは、特定の身体部位を標的にすることができる。標的化は、治療薬の活性を１つ以上の関連する治療部位に制限する方法である。
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、ホタルルシフェラーゼを発現するフソソームまたは細胞を静脈内注射する。フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによってホタルルシフェラーゼを安定して発現する細胞またはルシフェラーゼを発現しない細胞（陰性対照）から産生される。マウスのグループは、フソソームまたは細胞注射の１、２、３、４、５、６、８、１２、および２４時間後に安楽死させる。
安楽死の５分前に、ルシフェラーゼを可視化するために、マウスに生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を１５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射する。生物発光イメージングシステムは、全てのデバイス設定を補正するように調整される。次いで、マウスを安楽死させ、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、および腎臓を収集する。イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、これらのエクスビボの臓器の生物発光の画像を取得する。生物発光シグナルは、放射輝度光子を使用して測定され、測定値として総フラックスが使用される。光子／秒で値を与えるために、エクスビボの臓器を囲むことによって関心領域（ＲＯＩ）を生成する。標的臓器（例えば、肝臓）と非標的臓器（例えば、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、および腎臓からの光子／秒の合計）との間の光子／秒の比率は、肝臓への標的化の尺度として計算される。
幾つかの実施形態では、フソソームおよび細胞の両方において、肝臓と他の臓器との間の光子／秒の比は１より大きくなり、これは、フソソームが肝臓を標的とすることを示すであろう。幾つかの実施形態では、陰性対照動物は、全ての臓器においてはるかに低い光子／秒を示すであろう。
実施例８８：被験体における外因性作用物質の送達を測定する
この実施例では、被験体における外因性作用物質を含むフソソームの送達の定量化について説明する。フソソームは、ガウシアルシフェラーゼを発現する細胞から、またはルシフェラーゼを発現しない細胞（陰性対照）から、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。
陽性対照細胞またはフソソームをマウスに静脈内注射する。フソソームまたは細胞は、２６ゲージのインスリン注射針を使用して５～８秒以内に送達される。インビボ生物発光イメージングは、インビボイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用して、注射の１、２、または３日後にマウスで実施される。
使用直前に、ルシフェリンまたは発光分子であるセレンテラジン（５ｍｇ／ｍＬ）を酸性化メタノールで調製し、マウスの尾静脈に直ちに注射する。ＸＧＩ－８ガス麻酔システムを使用して、加熱ステージでマウスを継続的に麻酔する。
生物発光イメージングは、セレンテラジン（４μｇ／ｇ体重）の静脈内尾静脈注射の直後に５分間にわたって光子数を取得することによって得られる。取得したデータは、ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して、ライトビュー画像にオーバーレイして分析する。関心領域（ＲＯＩ）は、自動シグナル強度輪郭ツールを使用して作成され、同じ動物のバックグラウンド除去で正規化される。５８０、６００、および６２０ｎｍの波長、３～１０分の露光時間で３つのフィルターを使用した連続データ取得を実施して、マウス内の生物発光光源の位置を特定する。
更に、各時点で、腹部の触診によって尿試料を収集する。
血液試料（５０μＬ）は、各マウスの尾静脈からヘパリン処理されたチューブまたはＥＤＴＡチューブに採取する。血漿単離のために、血液試料を４℃、１．３×ｇで２５分間遠心分離する。
次いで、５μＬの血液、血漿、または尿試料を使用して、試料をガウシアルシフェラーゼ基質（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ、Ｐｉｎｅｔｏｐ，ＡＺ）と混合した後、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイを実行する。
幾つかの実施形態では、陰性対照試料は、ルシフェラーゼに対して陰性となり、陽性対照試料は、細胞を投与された動物からのものとなるであろう。幾つかの実施形態では、ガウシアルシフェラーゼを発現するフソソームを投与された動物からの試料は、各試料においてルシフェラーゼに対して陽性となるであろう。
例えば、Ｅｌ－Ａｍｏｕｒｉ ＳＳ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５３（１）：６３－７３，２０１３を参照されたい。
実施例８９：フソソームの脂質二重層を横切る能動輸送
この実施例では、生細胞でのグルコース取込みをモニターし、脂質二重層を通過する能動輸送を測定するために使用できる蛍光グルコース類似体である、２－ＮＢＤＧ（２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース）のレベルの定量化について説明する。幾つかの実施形態では、このアッセイまたは同等物を使用して、グルコース取込みおよびフソソームの脂質二重層を横切る能動輸送のレベルを測定することができる。
フソソーム組成物は、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生される。次いで、十分な数のフソソームを、グルコースを含まず、２０％ウシ胎仔血清、および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートする。２時間のグルコース飢餓期間の後、培地を、グルコースを含まず、２０％ウシ胎仔血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、および２０μＭ ２－ＮＢＤＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むＤＭＥＭを含むように交換し、３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートする。陰性対照のフソソームを、２－ＮＢＤＧの代わりに同量のＤＭＳＯ、２－ＮＢＤＧのビヒクルを添加することを除いて、同じように処理する。
次いで、フソソームを１×ＰＢＳで３回洗浄し、適切なバッファーに再懸濁し、９６ウェルのイメージングプレートに移す。次いで、ＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルターおよび５２５／３９発光フィルター）を使用して蛍光光度計で２－ＮＢＤＧ蛍光を測定し、１時間のロード期間で、フソソーム膜を通過してフソソームに蓄積された２－ＮＢＤＧの量を定量化する。
幾つかの実施形態では、２－ＮＢＤＧ蛍光は、陰性（ＤＭＳＯ）対照と比較して、２－ＮＢＤＧ処理を有するフソソームで高くなるであろう。５２５／３９発光フィルターを用いた蛍光測定は、存在する２－ＮＢＤＧ分子の数と相関するであろう。
実施例９０：非エンドサイトーシス経路を介したフソソームの送達
この実施例では、非エンドサイトーシス経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達の定量化について説明する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、フソソーム媒介非エンドサイトーシス経路を介して作用物質を送達する。理論に拘束されることを望まないが、エンドサイトーシスを介したフソソーム取込みを全く必要とせずに、フソソームの内腔内で運ばれる作用物質、例えばＣｒｅのレシピエント細胞の細胞質ゾルへの直接の送達は、フソソーム媒介非エンドサイトーシス経路送達により起こるであろう。
この実施例では、フソソームは、その原形質膜上にセンダイウイルスＨおよびＦタンパク質タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４），１－８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．１２３）。更に、フソソームは、ｍＴａｇＢＦＰ２蛍光タンパク質およびＣｒｅリコンビナーゼを発現する。標的細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを安定して発現するＲＰＭＩ８２２６細胞であり、Ｃｒｅによる組換えによりＧＦＰからＲＦＰ発現に切り替わり、融合およびマーカーとしてのＣｒｅの送達を示す。
本明細書に記載の方法によって産生されたフソソームを、以下のように非エンドサイトーシス経路を介したＣｒｅの送達についてアッセイする。レシピエント細胞を、黒色の透明底９６ウェルプレートにプレーティングする。次に、レシピエント細胞をプレーティングしてから２４時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、ＤＭＥＭ培地でレシピエント細胞に適用する。非エンドサイトーシス経路を介したＣｒｅ送達のレベルを決定するために、フソソームを受けるレシピエント細胞の並行群を、エンドソーム酸性化の阻害剤であるクロロキン（３０μｇ／ｍＬ）で処理する。フソソームの用量は、ウェルにプレーティングしたレシピエント細胞の数と相関している。フソソームを適用した後、細胞プレートを４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞との間の接触を開始するのを助ける。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、作用物質の送達、Ｃｒｅを画像化によって評価する。
細胞を、フィールドまたはウェル内のＲＦＰ陽性細胞とＧＦＰ陽性細胞を明確に同定するために画像化する。この実施例では、自動蛍光顕微鏡を使用して細胞プレートを画像化している。所与のウェルの総細胞集団を、最初にＤＭＥＭ培地中のＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で１０分間細胞を染色することによって決定する。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡにインターカレートすることで細胞核を染色するため、個々の細胞を同定するために使用される。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を通常のＤＭＥＭ培地に交換する。
Ｈｏｅｃｈｓｔを、４０５ｎｍ ＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化する。ＧＦＰを、４６５ｎｍ ＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化し、ＲＦＰを５２３ｎｍ ＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化する。異なる細胞群の画像を、最初に陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって取得する。
取得設定は、ＲＦＰおよびＧＦＰの強度が最大ピクセル強度値になるが、飽和しないように設定される。次いで、確立された設定を使用して、対象のウェルを画像化する。
ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性ウェルの分析を、蛍光顕微鏡または他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，１９９７－２００７）を備えたソフトウェアを用いて実施する。画像を、幅６０μｍのローリングボールバックグラウンド除去アルゴリズムを使用して前処理する。総細胞マスクは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定されている。バックグラウンド強度を大幅に超えるＨｏｅｃｈｓｔ強度の細胞を使用してしきい値を設定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞には小さすぎるか、または大きすぎる領域を除外する。
総細胞マスク内で、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞を、バックグラウンドを大幅に超える細胞に再度しきい値を設定し、細胞領域全体のＨｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを拡張して、ＧＦＰおよびＲＦＰ細胞の蛍光全体を含めることによって同定する。
レシピエント細胞を含む対照ウェルで同定されたＲＦＰ陽性細胞の数を使用して、フソソームを含むウェルのＲＦＰ陽性細胞の数から差し引く（非特異的ＬｏｘＰ組換えを差し引くため）。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受けたレシピエント細胞）の数をＧＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受けていないレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、レシピエント細胞集団に送達されたフソソームＣｒｅの割合を定量化する。レベルは、レシピエント細胞に適用されたフソソームの所与の用量に対して正規化されている。非エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの値を計算するために、クロロキンの存在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）と並んで、クロロキンの不在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ－ＣＱ）を決定する。非エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの正規化された値を決定するために、次の式を使用する：［（ＦｕｓＬ－ＣＱ）－（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）］／（ＦｕｓＬ－ＣＱ）。
幾つかの実施形態では、所与のフソソームについて非エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの平均レベルは、０．１～０．９５の範囲内、またはクロロキンで処理されたレシピエント細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上となるであろう。
実施例９１：エンドサイトーシス経路を介したフソソームの送達
この実施例では、エンドサイトーシス経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達について説明する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、フソソーム媒介エンドサイトーシス経路を介して作用物質を送達する。理論に拘束されることを望まないが、エンドサイトーシスに依存する取込み経路を有するレシピエント細胞への、フソソームの内腔で運ばれる作用物質、例えばカーゴの送達は、フソソーム媒介エンドサイトーシス経路送達を介して起こるであろう。
この実施例では、フソソームは、その原形質膜上にフソゲンタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２μｍフィルターを通して押し出すことによって産生された微小胞を含む（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，１８（３）．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１０５４４－０１６－００６６－ｙ）（Ｒｉｅｄｅｌ，Ｋｏｎｄｏｒ－Ｋｏｃｈ，＆ Ｇａｒｏｆｆ，１９８４，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，３（７），１４７７－８３．ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／６０８６３２６から取得）。更に、フソソームは、ｍＴａｇＢＦＰ２蛍光タンパク質およびＣｒｅリコンビナーゼを発現する。標的細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを安定して発現するＰＣ３細胞であり、Ｃｒｅによる組換えによりＧＦＰからＲＦＰ発現に切り替わり、融合およびマーカーとしてのＣｒｅの送達を示す。
本明細書に記載の方法によって産生されたフソソームを、以下のようにエンドサイトーシス経路を介したＣｒｅの送達についてアッセイする。レシピエント細胞を、使用するイメージングシステムと互換性のある細胞培養マルチウェルプレートにプレーティングする（この実施例では、細胞を黒色の透明底９６ウェルプレートにプレーティングする）。次に、レシピエント細胞をプレーティングしてから２４時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、ＤＭＥＭ培地でレシピエント細胞に適用する。エンドサイトーシス経路を介したＣｒｅ送達のレベルを決定するために、フソソームを受けるレシピエント細胞の並行群を、エンドソーム酸性化の阻害剤であるクロロキン（３０μｇ／ｍＬ）で処理する。フソソームの用量は、ウェルにプレーティングしたレシピエント細胞の数と相関している。フソソームを適用した後、細胞プレートを４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞との間の接触を開始するのを助ける。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、作用物質の送達、Ｃｒｅを画像化によって評価する。
細胞を、フィールドまたはウェル内のＲＦＰ陽性細胞とＧＦＰ陽性細胞を明確に同定するために画像化する。この実施例では、自動蛍光顕微鏡を使用して細胞プレートを画像化している。所与のウェルの総細胞集団を、最初にＤＭＥＭ培地中のＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で１０分間細胞を染色することによって決定する。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡにインターカレートすることで細胞核を染色するため、個々の細胞を同定するために使用される。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を通常のＤＭＥＭ培地に交換する。
Ｈｏｅｃｈｓｔを、４０５ｎｍ ＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化する。ＧＦＰを、４６５ｎｍ ＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化し、ＲＦＰを５２３ｎｍ ＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化する。異なる細胞群の画像を、最初に陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって取得する。
取得設定は、ＲＦＰおよびＧＦＰの強度が最大ピクセル強度値になるが、飽和しないように設定される。次いで、確立された設定を使用して、対象のウェルを画像化する。
ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性ウェルの分析を、蛍光顕微鏡または他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，１９９７－２００７）を備えたソフトウェアを用いて実施する。画像を、幅６０μｍのローリングボールバックグラウンド除去アルゴリズムを使用して前処理する。総細胞マスクは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定されている。バックグラウンド強度を大幅に超えるＨｏｅｃｈｓｔ強度の細胞をしきい値処理し、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞には小さすぎる、または大きすぎる領域を除外する。
総細胞マスク内で、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞を、バックグラウンドを大幅に超える細胞に再度しきい値処理を行い、細胞領域全体のＨｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを拡張して、ＧＦＰおよびＲＦＰ細胞の蛍光全体を含めることによって同定する。
レシピエント細胞を含む対照ウェルで同定されたＲＦＰ陽性細胞の数を使用して、フソソームを含むウェルのＲＦＰ陽性細胞の数から差し引く（非特異的ＬｏｘＰ組換えを差し引くため）。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受けたレシピエント細胞）の数をＧＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受けていないレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、レシピエント細胞集団に送達されたフソソームＣｒｅの割合を定量化する。レベルは、レシピエント細胞に適用されたフソソームの所与の用量に対して正規化されている。エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの値を計算するために、クロロキンの存在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）と並んで、クロロキンの不在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ－ＣＱ）を決定する。エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの正規化された値を決定するために、次の式を使用する：（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）／（ＦｕｓＬ－ＣＱ）。
幾つかの実施形態では、所与のフソソームについてエンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの平均レベルは、０．０１～０．６の範囲内、またはクロロキンで処理されたレシピエント細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上となるであろう。
実施例９２：ダイナミン媒介経路、マクロピノサイトーシス経路、またはアクチン媒介経路を介したフソソームの送達
この実施例では、ダイナミン媒介経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達について説明する。微小胞を含むフソソームを、前の実施例で説明したように産生することができる。フソソームを受けるレシピエント細胞の群をダイナミンの阻害剤であるダイナソア（１２０μＭ）で処理することを除いて、フソソームを、前の実施例に従って、ダイナミン媒介経路を介したＣｒｅの送達についてアッセイする。ダイナミン媒介経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの値を計算するために、ダイナソアの存在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ＋ＤＳ）と並んで、ダイナソアの不在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ－ＤＳ）を決定する。送達されたフソソームＣｒｅの正規化された値を、前の実施例で説明したように計算することができる。
この実施例では、マクロピノサイトーシスによるレシピエント細胞へのＣｒｅの送達について説明する。微小胞を含むフソソームを、前の実施例で説明したように産生することができる。フソソームを受けるレシピエント細胞の群をマクロピノサイトーシスの阻害剤である５－（Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル）アミロリド（ＥＩＰＡ）（２５μＭ）で処理することを除いて、フソソームを、前の実施例に従って、マクロピノサイトーシスを介したＣｒｅの送達についてアッセイする。マクロピノサイトーシスを介して送達されるフソソームＣｒｅの値を計算するために、ＥＩＰＡの存在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ＋ＥＰＩＡ）と並んで、ＥＰＩＡの不在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ－ＥＩＰＡ）を決定する。送達されたフソソームＣｒｅの正規化された値を、前の実施例で説明したように計算することができる。
この実施例では、アクチン媒介経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達についても説明する。微小胞を含むフソソームを、前の実施例で説明したように産生することができる。フソソームを受けるレシピエント細胞の群をアクチン重合の阻害剤であるラトランクリンＢ（６μＭ）で処理することを除いて、フソソームを、前の実施例に従って、マクロピノサイトーシスを介したＣｒｅの送達についてアッセイする。アクチン媒介経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの値を計算するために、ラトランクリンＢの存在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ＋ＬａｔＢ）と並んで、ラトランクリンＢの不在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ－ＬａｔＢ）を決定する。送達されたフソソームＣｒｅの正規化された値を、前の実施例で説明したように計算することができる。
実施例９３：オルガネラの送達
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞へのフソソームミトコンドリアカーゴの送達をもたらし得る。
本明細書に記載の方法によって記載された方法によって産生されたフソソームを、そのミトコンドリアをレシピエント細胞に送達するその能力について、以下のようにアッセイした。
この特定の実施例では、フソソームは、その膜上に融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞、およびミトコンドリアを標識するためのミトコンドリア標的ＤｓＲＥＤ（ｍｉｔｏ－ＤｓＲＥＤ）タンパク質であった。レシピエント細胞を、使用するイメージングシステムと互換性のある細胞培養マルチウェルプレートにプレーティングした（この実施例では、細胞をガラス底イメージングディッシュにプレーティングした）。レシピエント細胞は、細胞質ゾルＧＦＰを安定して発現した。
次に、レシピエント細胞をプレーティングしてから２４時間後、ｍｉｔｏ－ＤｓＲＥＤを発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、ＤＭＥＭ培地でレシピエント細胞に適用した。フソソームの用量は、ウェルにプレーティングしたレシピエント細胞の数と相関していた。フソソームを適用した後、細胞プレートを４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞との間の接触を開始するのを助けた。次いで、細胞を４時間インキュベートし、ＶＳＶＧ媒介融合を、ｐＨ６．０のリン酸緩衝生理食塩水に１分間曝露することによって誘導した（または対照細胞をｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水に曝露する）。融合の誘導に続いて、細胞を更に１６時間インキュベートし、ミトコンドリア送達をイメージングによって評価した。
この実施例では、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２に維持した状態で、６３倍の油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡で画像化する。ＧＦＰを４８８ｎｍのレーザー励起に供し、発光をバンドパス４９５～５３０ｎｍフィルターを通して記録した。ＤｓＲＥＤを５４３ｎｍのレーザー励起に供し、発光を５６０～６１０ｎｍのバンドパスフィルターを介して記録した。細胞を走査して、細胞質ゾルＧＦＰ蛍光およびｍｉｔｏ－ＤｓＲＥＤ蛍光に陽性の細胞を確実に同定した。
細胞質ゾルＧＦＰおよびｍｉｔｏ－ＤｓＲＥＤミトコンドリアの両方の存在が同じ細胞で見られ、細胞がＶＳＶＧ媒介融合を受けたことを示しており、したがってミトコンドリアは、フソソームからレシピエント細胞に送達されている。
実施例９４：ＤＮＡのインビトロ送達
この実施例では、フソソームを使用したＤＮＡの、インビトロでの細胞への送達について説明する。この実施例では、代理治療カーゴである外因性遺伝子ＧＦＰをコードするプラスミドを使用してＤＮＡを送達するフソソームの能力を定量化する。
フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームであるようにフソソームが操作されることを除いて、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じる、フソソーム組成物。フソソームの産生に続いて、それをＧＦＰをコードする配列を有するプラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）で更にヌクレオフェクトする。
例えば、Ｃｈｅｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｉｓ．２０１５ Ｍａｒ；２（１）：９６－１０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１を参照されたい。
陰性対照として、フソソームを、βアクチンをコードする配列を持つプラスミドでヌクレオフェクトする。
次いで、十分な数のフソソームを、ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞株と一緒に、２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間の期間にわたってインキュベートする。４８時間のインキュベーション後、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を、５６１ｎｍのレーザー励起でＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳを介して単離し、発光を５９０＋／－２０ｎｍで収集する。次いで、ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して全ＤＮＡを単離し、６００ｂｐフラグメントを増幅するＧＦＰに特異的なプライマー（表２２２を参照）を使用してＰＣＲを実施する。次いで、ゲル電気泳動後にゲル上に存在する６００ｂｐのフラグメントは、レシピエント細胞へのＤＮＡ送達の存在を実証する。
Figure 2022513040000135
幾つかの実施形態では、インビトロでのフソソームを伴う核酸カーゴの送達は、陰性対照と比較して、ＧＦＰプラスミドを有するフソソームにおいてより高い。陰性対照では、ごくわずかなＧＦＰ蛍光が検出される。
実施例９５：ＤＮＡのインビトロ送達
この実施例では、フソソームを介したインビボでの細胞へのＤＮＡの送達について説明する。インビボでの細胞へのＤＮＡの送達は、レシピエント細胞内のタンパク質の発現をもたらす。
インビボでのフソソームＤＮＡ送達は、生物（マウス）内のレシピエント細胞におけるＤＮＡおよびタンパク質発現の送達を実証するであろう。
肝臓に向けられたフソゲンを発現するフソソームは、本明細書に記載されるように調製される。フソソームの産生に続いて、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする配列を有するプラスミドで更にヌクレオフェクトされる。
フソソームを、インビボ送達用に調製する。フソソーム懸濁液を、遠心分離に供する。フソソームのペレットを、注射用の滅菌リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁する。
フソソームは、核酸検出方法、例えば、ＰＣＲを使用してＤＮＡを含むことが確認されている。
レシピエントマウスは、ルシフェラーゼの発現をブロック解除するために、フソソームによって送達されたＤＮＡから作られたＣＲＥタンパク質によって修飾されたｌｏｘｐ－ルシフェラーゼゲノムＤＮＡ遺伝子座を有する（ＪＡＸ＃００５１２５）。この実施例の陽性対照は、同じタンパク質を自身のゲノムから肝臓でのみ発現するマウス系統と交配したレシピエントマウスの子孫である（アルブミン－ＣＲＥ ＪＡＸ＃００３５７４）。この交配からの子孫は、各対立遺伝子（ｌｏｘｐ－ルシフェラーゼ、アルブミン－ＣＲＥ）のうちの１つを有する。陰性対照は、レシピエントマウスに、フソゲンを発現していないフソソーム、またはフソゲンを含むがＣｒｅＤＮＡを含まないフソソームを注射することによって行う。
フソソームを、静脈内（ＩＶ）尾静脈投与によってマウスに送達する。マウスを、市販のマウス拘束装置（ハーバード装置）に入れる。拘束する前に、ケージを循環水浴に入れることによって動物を温める。拘束装置の中に入れた後、動物を順応させる。３０Ｇの針先、３インチ長のＰＥ－１０チューブ、および２８Ｇの針からなるＩＶカテーテルを準備し、ヘパリン化生理食塩水で洗い流す。尾を、７０％アルコールプレップパッドで清浄する。次いで、カテーテル針を鉗子で保持し、血液がチューブ内に見えるようになるまで尾の外側静脈にゆっくりと導入する。フソソーム溶液（～５００Ｋ－５Ｍフソソーム）を１ｃｃツベルクリン注射器に吸引し、輸液ポンプに接続する。フソソーム溶液を、用量に応じて、毎分２０μＬの速度で３０秒～５分間送達する。注入が完了すると、カテーテルを取り外し、出血が止まるまで注射部位に圧力を加える。マウスをケージに戻し、回復させる。
融合後、ＤＮＡを転写してＣＲＥタンパク質に翻訳し、次いで、これは核に転位して組換えを行い、ルシフェラーゼの構成的発現をもたらすであろう。Ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により、生物発光の産生を介したルシフェラーゼ発現の検出が可能になる。動物が動かないように、コーン麻酔器（イソフルラン）を収容するインビボ生物発光イメージングチャンバー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に動物を入れる。Ｄ－ルシフェリンの薬物動態クリアランスによる生物発光の最大値を観察するために、注射後８～２０分の間に光子収集を行う。肝臓の特定領域を、計数率が（この領域で）６００を超えるように設定されたソフトウェアおよび収集曝露時間で作成して、解釈可能な放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）の測定値を得る。生物発光放射輝度の最大値を、生物発光分布の画像として記録する。肝臓組織を、バックグラウンド（未処置の動物）および陰性対照の放射輝度測定値について特にモニターする。ルシフェラーゼ活性を観察するために、注射の２４時間後に測定を行う。次いで、マウスを安楽死させ、肝臓を採取する。
採取したばかりの組織を、４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）に４℃で１～３時間浸漬することにより、固定および包埋に供する。次いで、組織を、４℃で滅菌１５％スクロース／１×ＰＢＳに（３時間～一晩）浸漬する。次いで、組織をＯ．Ｃ．Ｔ．に包埋する（Ｂａｘｔｅｒ Ｎｏ．Ｍ７１４８－４）。組織を、セクショニング（断面）に適したブロック内で配向する。次いで、組織を、次の方法を使用して液体窒素で凍結させる：ブロックの下３分の１を液体窒素に入れ、Ｏ．Ｃ．Ｔ．の中心を除く全てが凍結するまで凍結させ、ドライアイスで凍結を終了させる。ブロックを、クリオスタットによってスライド上に配置された５～７ミクロンのセクションに切断し、染色のために再凍結する。
インサイチュハイブリダイゼーションを、ジゴキシゲニン標識核酸プローブ（ＣＲＥ ＤＮＡおよびルシフェラーゼｍＲＮＡ検出用）を使用して組織切片上で（標準的な方法を使用して）行い、抗ジゴキシゲニン蛍光抗体によって標識し、共焦点顕微鏡によって観察する。
幾つかの実施形態では、陽性対照動物（フソソーム注射なしの繁殖による組換え）は、未処置の動物（ＣＲＥなしおよびフソソームなし）ならびに陰性対照と比較して肝臓で生物発光強度を示し、一方、作用物質を注射した動物は、陰性対照（フソゲンを含まないフソソーム）および未処置の動物と比較して、肝臓で生物発光を示すであろう。
実施形態では、作用物質を注射した動物の組織切片における核酸の検出は、組織内の細胞における陰性対照および未処置の動物と比較したＣＲＥリコンビナーゼおよびルシフェラーゼｍＲＮＡの検出を明らかにし、一方、陽性対照は、組織全体でルシフェラーゼｍＲＮＡおよびＣＲＥリコンビナーゼＤＮＡの両方のレベルを示すであろう。
フソソームによるＤＮＡ送達の証拠は、ＤＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションベースの検出および動物のレシピエント組織におけるその共局在化によって検出されるであろう。ＤＮＡから発現したタンパク質の活性は、生物発光イメージングによって検出されるであろう。実施形態では、フソソームは、タンパク質の産生および活性をもたらすＤＮＡを送達するであろう。
実施例９６：ｍＲＮＡのインビトロ送達
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、特定のｍＲＮＡのレシピエント細胞への送達をもたらす。
本明細書に記載の方法によって産生されたフソソームを、以下のように、特定のｍＲＮＡをレシピエント細胞に送達するその能力についてアッセイした。この特定の実施例では、フソソームは、細胞生物学的（核を欠いている）であり、ＣｒｅおよびＧＦＰを発現する３Ｔ３マウス線維芽細胞から生成した。次いで、細胞生物学をＨＶＪ－Ｅフソゲンタンパク質で処理して、フソソームを産生した。
レシピエントマウスマクロファージ細胞を、使用されるイメージングシステムと互換性のある細胞培養マルチウェルプレートにプレーティングした（この実施例では、細胞をガラス底イメージングディッシュにプレーティングする）。レシピエント細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「ＬｏｘＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ」カセットを安定して発現し、Ｃｒｅによる組換えの際にｔｄＴｏｍａｔｏ発現を誘導し、レシピエント細胞へのＣｒｅタンパク質の送達を示す。
次に、レシピエント細胞をプレーティングしてから２４時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、ＤＭＥＭ培地でレシピエント細胞に適用した。フソソームの用量は、ウェルにプレーティングしたレシピエント細胞の数と相関していた。フソソームを適用した後、細胞プレートを４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞との間の接触を開始するのを助けた。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、ｍＲＮＡの送達をイメージングによって評価した。
細胞を、イメージングの前に、ＤＭＥＭ培地中１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で１０分間染色した。この実施例では、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２に維持した状態で、６３倍の油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡で画像化した。Ｈｏｅｃｈｓｔを４０５ｎｍのレーザー励起に供し、発光をバンドパス４３０～４６０ｎｍフィルターを通して記録した。ＧＦＰを、４８８ｎｍのレーザー励起に供し、発光をバンドパス４９５～５３０ｎｍフィルターを通して記録した。ｔｄＴｏｍａｔｏを、５４３ｎｍのレーザー励起に供し、発光をバンドパス５６０～６１０ｎｍフィルターを通して記録した。
最初に、細胞を走査して、単核のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を確実に同定した。ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞の存在は、融合を受けた細胞を示し、単核は、融合が細胞生物学的フソソームドナーによるものであることを示した。これらの同定された細胞を、最初に画像化し、続いて４８８ｎｍレーザーを使用して光退色し、ＧＦＰ蛍光を部分的に消光した。次いで、細胞を経時的に画像化して、ＧＦＰ蛍光の回復を評価し、これは、新しいＧＦＰタンパク質の翻訳、したがってドナーフソソームによって送達されたＧＦＰ ｍＲＮＡの存在を示す。
対象の細胞におけるＨｏｅｃｈｓｔ、ＧＦＰ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ、ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，１９９７－２００７）を使用して実施した。最初に、画像を、幅６０μｍのローリングボールバックグラウンド除去アルゴリズムを使用して前処理した。光退色した細胞内で、ＧＦＰ蛍光をしきい値処理してバックグラウンドを除去した。次いで、光退色した細胞のＧＦＰ平均蛍光強度を、光退色の前後の異なる時間に分析した。
この特定の実施例では、ＣｒｅおよびＧＦＰを発現し、適用されたフソゲンＨＶＪ－Ｅ（＋フソゲン）を保有する３Ｔ３マウス線維芽細胞の細胞生物学を、「ＬｏｘＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ」カセットを発現するレシピエントマウスマクロファージ細胞に適用した。代表的な画像およびデータを図５に示す。この特定の実施例では、ＧＦＰ蛍光強度は、光退色の１０時間後に元の強度の２５％まで回復し、レシピエント細胞における活発に翻訳されたｍＲＮＡの送達を示す。
実施例９７：ｓｉＲＮＡのインビトロ送達
この実施例では、フソソームを介したインビトロでの細胞への短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達について説明する。インビトロでの細胞へのｓｉＲＮＡの送達は、レシピエント細胞内のタンパク質の発現の抑制をもたらす。これを使用して、発現が細胞に有害であるタンパク質の活性を阻害することができ、したがって細胞が正常に振る舞うことを可能にする。
本明細書に記載の方法によって産生されたフソソームを、以下のように、特定のｓｉＲＮＡをレシピエント細胞に送達するその能力についてアッセイする。フソソームを、本明細書に記載されるように調製する。フソソームの産生に続いて、ＧＦＰを特異的に阻害する配列を有するｓｉＲＮＡを更にエレクトロポレーションする。ＧＦＰを標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡの配列は、５’ＧＡＣＧＵＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＵＵＣ３’およびその補体３’ＣＧＣＵＧＣＡＵＵＵＧＣＣＧＧＵＧＵＵＣＡ５’である（ｓｉＲＮＡ配列の３’末端に２塩基対の長さのオーバーハングがあることに注意されたい）。陰性対照として、フソソームにルシフェラーゼを特異的に阻害する配列を有するｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションする。ルシフェラーゼを標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡの配列は、５’ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＴＴ３’およびその補体３’ＴＴＧＡＡＵＧＣＧＡＣＵＣＡＵＧＡＡＧＣＵ５’である（ｓｉＲＮＡ配列の３’末端に２塩基対の長さのオーバーハングがあることに注意されたい）。
次いで、フソソームを、ＧＦＰを構成的に発現するレシピエント細胞に適用する。レシピエント細胞を、黒色の透明底９６ウェルプレートにプレーティングする。次に、レシピエント細胞をプレーティングしてから２４時間後、発現するフソソームを、ＤＭＥＭ培地でレシピエント細胞に適用する。フソソームの用量は、ウェルにプレーティングしたレシピエント細胞の数と相関している。フソソームを適用した後、細胞プレートを４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞との間の接触を開始するのを助ける。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、作用物質の送達、ｓｉＲＮＡをイメージングによって評価する。
細胞を画像化して、フィールドまたはウェル内のＧＦＰ陽性細胞を明確に同定する。この実施例では、自動蛍光顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して、細胞プレートを画像化する。所与のウェルの総細胞集団を、最初にＤＭＥＭ培地中のＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で１０分間細胞を染色することによって決定する。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡにインターカレートすることで細胞核を染色するため、個々の細胞を同定するために使用される。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を通常のＤＭＥＭ培地に交換する。
Ｈｏｅｃｈｓｔを、４０５ｎｍ ＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化する。ＧＦＰを、４６５ｎｍ ＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化する。異なる細胞群の画像は、最初に未処理のウェルでＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって取得される。すなわち、レシピエント細胞は、いかなるフソソームでも処理されなかった。
取得設定は、ＧＦＰの強度が最大ピクセル強度値になるが、飽和しないように設定される。次いで、確立された設定を使用して、対象のウェルを画像化する。
ＧＦＰ陽性ウェルの分析を、蛍光顕微鏡または他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／、１９９７－２００７）を備えたソフトウェアを用いて実施する。画像を、幅６０μｍのローリングボールバックグラウンド除去アルゴリズムを使用して前処理する。総細胞マスクは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定されている。バックグラウンド強度を大幅に超えるＨｏｅｃｈｓｔ強度の細胞をしきい値処理し、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞には小さすぎる、または大きすぎる領域を除外する。
総細胞マスク内で、ＧＦＰ陽性細胞を、バックグラウンドを大幅に超える細胞に再度しきい値処理を行い、細胞領域全体のＨｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを拡張して、ＧＦＰ細胞の蛍光全体を含めることによって同定する。総細胞中のＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを計算する。
実施形態では、ＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを含むフソソームで処理されたウェル中のＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを含むフソソームで十分に処理されたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％少なくなるであろう。
実施例９８：ｍＲＮＡのインビボ送達
この実施例では、フソソームを介したインビボでの細胞へのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達について説明する。幾つかの実施形態では、インビボでの細胞へのｍＲＮＡの送達は、レシピエント細胞内のタンパク質の発現をもたらす。幾つかの実施形態では、この送達方法を使用して、遺伝子突然変異のために存在しないタンパク質を補充することができ、細胞が正常に振る舞うことを可能にし、または機能、例えば治療機能を行うために細胞の活性を再指向する。
幾つかの実施形態では、インビボでのフソソームｍＲＮＡ送達は、生物（例えば、マウス）内のレシピエント細胞におけるメッセンジャーＲＮＡの送達およびタンパク質発現を実証する。
幾つかの実施形態では、肝臓に向けられたフソゲンを発現し、Ｃｒｅを発現するｍＲＮＡを産生するフソソームを、インビボ送達のために調製する。
フソソームを、本明細書に記載されるように調製する。フソソーム懸濁液を、遠心分離に供する。フソソームのペレットを、注射用の滅菌リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁する。
フソソームは、核酸検出方法、例えば、ＰＣＲを使用してｍＲＮＡを発現することが確認されている。
レシピエントマウスは、ルシフェラーゼの発現をブロック解除するために、フソソームによって送達されたｍＲＮＡから作られたＣＲＥタンパク質によって修飾されたｌｏｘｐ－ルシフェラーゼゲノムＤＮＡ遺伝子座を有する（ＪＡＸ＃００５１２５）。この実施例の陽性対照は、同じタンパク質を自身のゲノムから肝臓でのみ発現するマウス系統と交配したレシピエントマウスの子孫である（アルブミン－ＣＲＥ ＪＡＸ＃００３５７４）。この交配からの子孫は、各対立遺伝子（ｌｏｘｐ－ルシフェラーゼ、アルブミン－ＣＲＥ）のうちの１つを有する。陰性対照は、レシピエントマウスに、フソゲンを発現していないフソソーム、またはフソゲンを含むがＣｒｅ ｍＲＮＡを発現していないフソソームを注射することによって行う。
フソソームを、静脈内（ＩＶ）尾静脈投与によってマウスに送達する。マウスを、市販のマウス拘束装置（ハーバード装置）に入れる。拘束する前に、ケージを循環水浴に入れることによって動物を温める。拘束装置の中に入れた後、動物を順応させる。３０Ｇの針先、３インチ長のＰＥ－１０チューブ、および２８Ｇの針からなるＩＶカテーテルを準備し、ヘパリン化生理食塩水で洗い流す。尾を、７０％アルコールプレップパッドで清浄する。次いで、カテーテル針を鉗子で保持し、血液がチューブ内に見えるようになるまで尾の外側静脈にゆっくりと導入する。フソソーム溶液（～５００Ｋ－５Ｍフソソーム）を１ｃｃツベルクリン注射器に吸引し、輸液ポンプに接続する。フソソーム溶液を、用量に応じて、毎分２０μＬの速度で３０秒～５分間送達する。注入が完了すると、カテーテルを取り外し、出血が止まるまで注射部位に圧力を加える。マウスをケージに戻し、回復させる。
融合後、ｍＲＮＡをレシピエントの細胞質内でＣＲＥタンパク質に翻訳し、次いでこれを核に転位して組換えを行い、ルシフェラーゼの構成的発現をもたらす。Ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により、生物発光の産生を介したルシフェラーゼ発現の検出が可能になる。動物が動かないように、コーン麻酔器（イソフルラン）を収容するインビボ生物発光イメージングチャンバー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に動物を入れる。Ｄ－ルシフェリンの薬物動態クリアランスによる生物発光の最大値を観察するために、注射後８～２０分の間に光子収集を行う。肝臓の特定領域を、計数率が（この領域で）６００を超えるように設定されたソフトウェアおよび収集曝露時間で作成して、解釈可能な放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）の測定値を得る。生物発光放射輝度の最大値を、生物発光分布の画像として記録する。肝臓組織を、バックグラウンド（未処置の動物）および陰性対照の放射輝度測定値について特にモニターする。ルシフェラーゼ活性を観察するために、注射の２４時間後に測定を行う。次いで、マウスを安楽死させ、肝臓を採取する。
採取したばかりの組織を、４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）に４℃で１～３時間浸漬することにより、固定および包埋に供する。次いで、組織を、４℃で滅菌１５％スクロース／１×ＰＢＳに（３時間～一晩）浸漬する。次いで、組織をＯ．Ｃ．Ｔ．に包埋する（Ｂａｘｔｅｒ Ｎｏ．Ｍ７１４８－４）。組織を、セクショニング（断面）に適したブロック内で配向する。次いで、組織を、次の方法を使用して液体窒素で凍結させる：ブロックの下３分の１を液体窒素に入れ、Ｏ．Ｃ．Ｔ．の中心を除く全てが凍結するまで凍結させ、ドライアイスで凍結を終了させる。ブロックを、クリオスタットによってスライド上に配置された５～７ミクロンのセクションに切断し、染色のために再凍結する。
インサイチュハイブリダイゼーションを、ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブ（ＣＲＥ ｍＲＮＡおよびルシフェラーゼｍＲＮＡ検出用）を使用して、組織切片上で（標準的な方法を使用して）行い、抗ジゴキシゲニン蛍光抗体によって標識し、共焦点顕微鏡によって観察する。
幾つかの実施形態では、陽性対照動物（例えば、フソソーム注射なしの繁殖による組換え）は、未処置の動物（例えば、ＣＲＥまたはフソソームなし）および陰性対照と比較して、肝臓における生物発光強度を示す。幾つかの実施形態では、フソソームを注射された動物は、陰性対照（例えば、フソゲンを含まないフソソーム）および未処置の動物と比較して、肝臓において生物発光を示すであろう。
幾つかの実施形態では、フソソームを投与された動物の組織切片におけるｍＲＮＡの検出は、陰性対照、および組織内の細胞における未処置の動物と比較して、ＣＲＥリコンビナーゼおよびルシフェラーゼｍＲＮＡの検出を明らかにする。幾つかの実施形態では、陽性対照は、組織全体のルシフェラーゼｍＲＮＡおよびＣＲＥリコンビナーゼｍＲＮＡの両方のレベルを示すであろう。
幾つかの実施形態では、フソソームによるｍＲＮＡ送達の証拠は、ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションベースの検出、および動物のレシピエント組織におけるその共局在化によって検出されるであろう。幾つかの実施形態では、フソソームによって送達されたｍＲＮＡから発現されたタンパク質の活性は、生物発光イメージングによって検出される。幾つかの実施形態では、フソソームは、タンパク質の産生および活性をもたらすｍＲＮＡを送達する。
実施例９９：タンパク質のインビトロ送達
この実施例は、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について実証する。この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞へのＣｒｅタンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、センダイウイルスＨＶＪ－Ｅタンパク質を保有する３Ｔ３マウス線維芽細胞（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４），１－８．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．１２）からフソソームを生成した。更に、フソソームは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現した。標的細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを安定して発現する初代ＨＥＫ２９３Ｔ細胞であり、Ｃｒｅによる組換えの際に、ＧＦＰからＲＦＰ発現に切り替わり、融合およびマーカーとしてのＣｒｅの送達を示す。
本明細書に記載の方法によって産生されたフソソームを、以下のようにレシピエント細胞にＣｒｅタンパク質を送達する能力についてアッセイした。レシピエント細胞を、使用するイメージングシステムと互換性のある細胞培養マルチウェルプレートにプレーティングした（この実施例では、細胞を黒色の透明底９６ウェルプレートにプレーティングした）。次に、レシピエント細胞をプレーティングしてから２４時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、ＤＭＥＭ培地でレシピエント細胞に適用した。フソソームの用量は、ウェルにプレーティングしたレシピエント細胞の数と相関していた。フソソームを適用した後、細胞プレートを４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞との間の接触を開始するのを助けた。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、タンパク質の送達をイメージングによって評価した。
細胞を、フィールドまたはウェル内のＲＦＰ陽性細胞とＧＦＰ陽性細胞を明確に同定するために画像化した。この実施例では、細胞プレートを、自動顕微鏡を使用して画像化した。所与のウェルの総細胞集団を、最初にＤＭＥＭ培地中１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で１０分間細胞を染色することによって決定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡにインターカレートすることで細胞核を染色するため、個々の細胞を同定するために使用される。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を通常のＤＭＥＭ培地に交換した。Ｈｏｅｃｈｓｔを、４０５ｎｍ ＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化した。ＧＦＰを、４６５ｎｍ ＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化し、ＲＦＰを５２３ｎｍ ＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化した。異なる細胞群の画像を、最初に陽性対照ウェル、すなわち、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理された細胞のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって取得した。取得設定を、ＲＦＰおよびＧＦＰの強度が最大ピクセル強度値になるが、飽和しないように設定した。次いで、確立された設定を使用して、対象のウェルを画像化した。
Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＧＦＰ、およびＲＦＰ陽性ウェルの分析を、ＬｉｏｎＨｅａｒｔ ＦＸを備えたＧｅｎ５ソフトウェアにおいて、またはＩｍａｇｅＪソフトウェアによって実施した（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，１９９７－２００７）。最初に、画像を、幅６０μｍのローリングボールバックグラウンド除去アルゴリズムを使用して前処理した。次に、総細胞マスクを、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定した。バックグラウンド強度を大幅に超えるＨｏｅｃｈｓｔ強度を持つ細胞をしきい値処理し、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞には小さすぎるか、または大きすぎる領域を除外した。全細胞マスク内で、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞を、バックグラウンドを大幅に超える細胞に再度しきい値処理を行い、細胞領域全体のＨｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを拡張して、ＧＦＰおよびＲＦＰ細胞の蛍光全体を含めることによって同定した。
レシピエント細胞を含む対照ウェルで同定されたＲＦＰ陽性細胞の数を使用して、フソソームを含むウェルのＲＦＰ陽性細胞の数から差し引いた（非特異的ＬｏｘＰ組換えを差し引いた）。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（作用物質を受けたレシピエント細胞）の数をＧＦＰ陽性細胞（作用物質を受けていないレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞との合計で割って、レシピエント細胞集団内のフソソーム剤送達の割合を定量化した。
この特定の実施例では、Ｃｒｅを発現し、適用されたフソゲンＨＶＪ－Ｅを保有するか（＋フソゲン）、または保有しない（－フソゲン）３Ｔ３マウス線維芽細胞を、「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを発現するレシピエント２９３Ｔ細胞に適用した。Ｃｒｅタンパク質の送達は、レシピエント細胞におけるＲＦＰ発現の誘導によって評価する。図６のグラフは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性に染色された全細胞（各ペアの左端のバー）のうち、ＲＦＰ陽性細胞（各ペアの右端のバー）の定量化を示す。この特定の実施例では、レシピエント細胞へのフソソーム送達の割合は、ＨＶＪ－Ｅフソゲンを保有する３Ｔ３ Ｃｒｅ細胞では０．４４である。
実施例１００：タンパク質のインビトロ送達
この実施例では、フソソームによる眼への治療薬の送達について説明する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれかを使用して造血幹細胞および始原細胞に由来し、マウスノックアウトが不足しているタンパク質がロードされている。
フソソームを、タンパク質が不足しているマウスの右眼の網膜下に注射し、ビヒクル対照を、マウスの左眼に注射する。マウスのサブセットは、生後２か月に達したときに安楽死させる。
採取した網膜組織の組織学およびＨ＆Ｅ染色を実施して、マウスの各網膜で救出された細胞の数を数える（Ｓａｎｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２６（８）：３１０４－３１１６，２０１６に記載）。
注入されたタンパク質のレベルを、ＰＤＥ６Ｂタンパク質に特異的な抗体を用いたウエスタンブロットを介して、２ヶ月齢で安楽死させたマウスから採取した網膜で測定する。
幾つかの実施形態では、フソソームを投与されるマウスの左眼は、ビヒクルで処置されるマウスの右眼と比較して、網膜の外核レベルに存在する核の数が増加するであろう。タンパク質の増加は、変異したＰＢＥ６Ｂタンパク質の相補性を示唆している。
実施例１０１：レシピエントＤＮＡを編集するための送達
この実施例では、ゲノムＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集機構をインビトロで細胞に送達するためのフソソームについて説明する。幾つかの実施形態では、フソソームを介したインビトロでの細胞へのゲノムＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集機構の送達は、レシピエント細胞における特定のタンパク質の機能の喪失をもたらす。この実施例で言及されているゲノム編集機構は、ＧＦＰに特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、治療薬の送達のシャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）である。幾つかの実施形態では、高い特異性および効率で細胞に送達することができるゲノム編集機構などの治療薬を使用して、遺伝子を不活化し、したがってその後の遺伝子産物（例えばタンパク質）は、高レベルでまたは間違った細胞型で発現される場合に病的になる。
前の実施例に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生されるフソソーム組成物は、フソソームが、Ａ．Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＥＧＦＰの配列に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列と複合体を形成したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質も含むように操作される。これは、Ｐ２Ａ切断配列によって分離されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のオープンリーディングフレームとのインフレーム融合であるネオマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを有するＰｉｇｇｙＢａｃベクターを共ヌクレオフェクトすることによって達成される。追加の共ヌクレオフェクトされたＰｉｇｇｙＢａｃベクターには、Ｕ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ配列（ＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣ）も含まれる。陰性対照として、フソソームは、フソソームがマウスゲノム内のどの標的にも特異的ではないスクランブルｇＲＮＡ（ＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡ）配列と複合体を形成したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質を含むように操作される。
十分な数のフソソームを、ＮＩＨ／３Ｔ３ ＧＦＰ＋細胞と一緒に、３７℃および５％ＣＯ２で、２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で中で４８時間の期間にわたってインキュベートする。４８時間のインキュベーション後、ゲノムＤＮＡを調製し、ＧＦＰ遺伝子の予測ｇＲＮＡ切断部位から５００ｂｐ以内の領域に特異的なプライマーを含むテンプレートとして使用する（表２５を参照）。
Figure 2022513040000136
次いで、ＰＣＲアンプリコンを精製し、キャピラリー配列決定によって配列決定した後、ガイドＲＮＡによって決定された標的遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によるゲノム編集を迅速に評価するウェブツールであるＴｉｄｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒにアップロードする。２つの標準的なキャピラリー配列決定反応からの定量的配列トレースデータに基づいて、ソフトウェアは編集効率を定量化する。ＧＦＰ遺伝子座を有する予測されたｇＲＮＡ切断部位でのインデル（挿入または削除）を、細胞内のＧＦＰ発現の喪失をもたらし、４８８ｎｍアルゴンレーザー励起でＦＡＣＳ分析（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＦＡＣＳを介して定量化し、発光を５３０＋／－３０ｎｍで収集する。取得および分析にはＦＡＣＳソフトウェアを使用する。光散乱チャネルを線形ゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールで設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を分析する。インデルとそれに続くＧＦＰ機能の喪失は、各試料におけるＧＦＰシグナルの強度に基づいて計算する。
幾つかの実施形態では、陰性対照と比較して、ＧＦＰ遺伝子座を有する予測されたｇＲＮＡ切断部位でのインデル（挿入または欠失）および細胞内のＧＦＰ蛍光の喪失は、ＤＮＡを編集し、インビトロでタンパク質機能の喪失をもたらすフソソームの能力を示すであろう。幾つかの実施形態では、スクランブルｇＲＮＡ配列を有するフソソームは、インデルまたはその後のタンパク質機能の喪失を示さないであろう。
実施例１０２：フソソーム投与後の奇形腫形成の評価
この実施例では、フソソームによる奇形腫形成がないことを説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、被験体に投与されたときに奇形腫の形成をもたらさないであろう。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生される。フソソーム、腫瘍細胞（陽性対照）またはビヒクル（陰性対照）をＰＢＳでマウスの左側腹部（１２～２０週齢）に皮下注射する。奇形腫、例えば、腫瘍の成長を、フソソーム、腫瘍細胞、またはビヒクル注射後８週間のキャリパー測定による腫瘍体積の決定によって週に２～３回分析する。
幾つかの実施形態では、フソソームまたはビヒクルを投与されたマウスは、キャリパー測定を介して、測定可能な腫瘍形成、例えば、奇形腫を有しないであろう。幾つかの実施形態では、腫瘍細胞で処置された陽性対照動物は、８週間の観察にわたってキャリパーによって測定されるように、明らかな腫瘍、例えば、奇形腫のサイズを示すであろう。
実施例１０３：フソソームは、インビボで被験体のレシピエント細胞に活性タンパク質を送達する
この実施例は、フソソームがインビボで被験体にタンパク質を送達できることを示す。これは、核編集タンパク質Ｃｒｅの送達によって例示される。細胞内に入ると、Ｃｒｅは核に転位し、そこで２つのＬｏｘＰ部位間でＤＮＡを再結合して切除する。Ｃｒｅを介した組換えは、２つのＬｏｘＰ部位間のＤＮＡが終止コドンであり、赤色蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏなどの遠位蛍光タンパク質の上流にある場合に顕微鏡で測定することができる。
ＣＲＥおよびＴａｋａｒａから購入したフソゲンＶＳＶ－Ｇ（Ｃｒｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｇｅｓｉｃｌｅｓ，Ｔａｋａｒａ製品６３１４４９）を含むフソソームを、Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ株００７９０９）に注射した。表２６に記載されているような解剖学的部位、注射量、および注射部位で動物に注射した。ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＦＶＢ．１２９Ｓ６（Ｂ６）－ＧＴ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（Ｌｕｃ）Ｋａｅｌ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ株００５１２５）を持たず、フソソームを注射したマウス、およびフソソームを注射していないＢ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウスを陰性対照として使用した。
Figure 2022513040000137
注射の２日後、動物を犠牲にし、試料を収集した。試料を２％ＰＦＡで８時間固定し、３０％スクロースで一晩固定し、速やかにＯＣＴに埋め込んでスライドに切断するために出荷した。スライドを、ＤＡＰＩを用いて核を染色した。ＤＡＰＩおよびｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を顕微鏡で画像化した。
表２６に列挙されている全ての解剖学的部位は、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を示した（図９）。更に、筋肉組織への送達を、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光顕微鏡を使用して確認した（図１１）。陰性対照マウスには、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を発する組織はなかった。この結果は、フソソームが様々な解剖学的部位でマウスの細胞内のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光をオンにすることができ、マウスがフソソームで処置されていない場合、またはマウスがそれらのゲノムにｔｄＴｏｍａｔｏを有しない場合は発生しないことを示している。したがって、フソソームは、インビボでマウス細胞の核に活性なＣｒｅリコンビナーゼを送達する。
異なる投与経路がインビボで組織に送達フソソームを送達できることも示された。ＣＲＥおよびＴａｋａｒａから購入したフソゲンＶＳＶ－Ｇ（Ｃｒｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｇｅｓｉｃｌｅｓ，Ｔａｋａｒａ製品６３１４４９）を含むフソソームを、ＦＶＢ．１２９Ｓ６（Ｂ６）－ＧＴ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（Ｌｕｃ）Ｋａｅｌ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ株００５１２５）に筋肉内（右前脛骨筋まで５０μＬ）、腹腔内（腹腔まで５０μＬ）、および皮下（背部皮下５０μＬ）注射した。
脚、腹側、および背部の皮膚は、化学脱毛剤を使用して４５秒間その領域を脱毛し、続いて水で３回すすぐことにより、それぞれ筋肉内、腹腔内、および皮下注射用に調製した。
注射後３日目に、インビボイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、生物発光の動物全体の画像を取得した。画像化の５分前に、ルシフェラーゼを可視化するために、マウスに生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を１５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射した。イメージングシステムを、全てのデバイス設定を補正するように調整した。
３つの経路全てによる投与は、インビボでのマウス細胞への活性Ｃｒｅリコンビナーゼの送達の成功を示すルミネセンス（図１０）をもたらした。
結論として、フソソームは、インビボで被験体の細胞に活性タンパク質を送達することができる。
実施例１０４：超音波処理を介したフソソームへの核酸のロード
この実施例では、超音波処理による核酸ペイロードのフソソームへのロードについて説明する。超音波処理法は、例えば、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ，ＴＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｖｉａ Ａｃｔｉｖｅ Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｉｎｔｏ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，（２０１６）に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。およそ１０６個のフソソームを５～２０μｇの核酸と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、フソソーム／核酸混合物を、４０ｋＨｚで作動する水浴ソニケーター（Ｂｒａｓｏｎモデル＃１５１０Ｒ－ＤＴＨ）を使用して、室温で３０秒間超音波処理する。次いで、混合物を氷上に１分間置き、続いて４０ｋＨｚで３０秒間超音波処理を２回行う。次いで、混合物を１６，０００ｇで５分間、４℃で遠心分離して、核酸を含むフソソームをペレット化する。組み込まれなかった核酸を含む上清を除去し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁する。ＤＮＡをロードした後、フソソームを使用前に氷上に保持する。
実施例１０５：超音波処理を介したフソソームへのタンパク質のロード
この実施例では、超音波処理によるタンパク質ペイロードのフソソームへのロードについて説明する。超音波処理法は、例えば、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ，ＴＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｖｉａ Ａｃｔｉｖｅ Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｉｎｔｏ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，（２０１６）に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。およそ１０６個のフソソームを５～２０μｇのタンパク質と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、フソソーム／タンパク質混合物を、４０ｋＨｚで作動する水浴ソニケーター（Ｂｒａｓｏｎモデル＃１５１０Ｒ－ＤＴＨ）を使用して、室温で３０秒間超音波処理する。次いで、混合物を氷上に１分間置き、続いて４０ｋＨｚで３０秒間超音波処理を２回行う。次いで、混合物を１６，０００ｇで５分間、４℃で遠心分離して、タンパク質を含むフソソームをペレット化する。組み込まれなかったタンパク質を含む上清を除去し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁する。タンパク質をロードした後、フソソームを使用前に氷上に保持する。
実施例１０６：疎水性担体を介したフソソームへの核酸のロード
この実施例では、疎水性担体を介した核酸ペイロードのフソソームへのロードについて説明する。疎水性ロードの例示的な方法は、例えば、Ｄｉｄｉｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ ｆｏｒ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｍＲＮＡ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（１０）：１８３６－１８４７，（２０１６）に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。ＲＮＡ分子の３’末端は、生物活性のある疎水性コンジュゲート（トリエチレングリコール－コレステロール）にコンジュゲートされる。およそ１０６個のフソソームを、５００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で９０分間インキュベートすることにより、ＰＢＳ中１０μｍｏｌ／ＬのｓｉＲＮＡコンジュゲートを含む１ｍＬに混合する。疎水性担体は、ＲＮＡとフソソームの膜との会合を媒介する。幾つかの実施形態では、幾つかのＲＮＡ分子は、フソソームの内腔に組み込まれ、幾つかは、フソソームの表面に存在する。アンロードされたフソソームは、ＴＬＡ－１１０ローターを使用した卓上超遠心分離機で１００，０００ｇ、４℃で１時間超遠心分離することにより、ＲＮＡロードされたフソソームから分離される。アンロードされたフソソームは上清に残り、ＲＮＡがロードされたフソソームはペレットを形成する。ＲＮＡをロードしたフソソームを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、使用前に氷上に保持する。
実施例１０７：フソソームを処理する
この実施例では、フソソームの処理について説明した。前の実施例に記載された方法のうちのいずれかを介して産生されたフソソームは、更に処理され得る。
幾つかの実施形態では、フソソームは、最初に、例えば、超音波処理によって均質化される。例えば、超音波処理プロトコルには、振幅設定８のマイクロプローブを備えたＭＳＥソニケーター（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｎ．Ｙ．）を使用した５秒の超音波処理が含まれる。幾つかの実施形態では、この短期間の超音波処理は、フソソームの原形質膜を均一なサイズのフソソームに分解させるのに十分である。これらの条件下では、オルガネラ膜は破壊されず、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１５分４℃）によって除去される。次いで、実施例１６に記載されているように、フソソームを分画遠心分離によって精製する。
Ｐａｌｌ Ｅｘｅｃｉａ（Ｆｒａｎｃｅ）から市販されている市販のポリカーボネート膜（例えば、Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）または非対称セラミック膜（例えば、Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ）を介したフソソームの押出しは、フソソームのサイズを比較的明確なサイズ分布に縮小するための効果的な方法である。典型的には、懸濁液は、所望のフソソームサイズ分布が達成されるまで、膜を１回以上循環する。フソソームは、サイズの漸進的な縮小および均一な分布を達成するために、連続的に小さい孔膜（例えば、４００ｎｍ、１００ｎｍ、および／または５０ｎｍの孔径）を通して押し出され得る。
幾つかの実施形態では、フソソーム産生の任意の工程で（ただし、典型的には均質化、超音波処理、および／または押出し工程の前）、得られるフソソームが医薬品をカプセル化するように、医薬品（治療薬など）を反応混合物に添加することができる。
実施例１０８：フソソームおよびソース細胞における全ＲＮＡを測定する
この実施例では、ソース細胞と比較したフソソーム中のＲＮＡの量を定量化する方法を説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、ソース細胞と同様のＲＮＡレベルを有するであろう。このアッセイでは、ＲＮＡレベルは全ＲＮＡを測定することによって決定される。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソームおよびソース細胞のタンパク質によって測定されたものと同じ質量の調製物を使用して、全ＲＮＡを単離し（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙカタログ番号７４１０４などのキットを使用）、続いて標準的な分光法を使用してＲＮＡ濃度を決定して、ＲＮＡ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐを使用）による吸光度を評価する。
幾つかの実施形態では、フソソーム中のＲＮＡの濃度は、タンパク質の質量あたりソース細胞の濃度の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％となるであろう。
実施例１０９：インビトロでのＴ細胞へのフソスメ融合
ａ．ＤＮＡペイロード
この実施例では、フソソームを使用したＤＮＡの、インビトロでのＣＤ３＋Ｔ細胞への送達について説明する。この実施例では、治療用カーゴであるＣＤ１９に対して指向されたキメラ抗原受容体である外因性遺伝子をコードするプラスミドを使用して、フソソームがＤＮＡを送達する能力を定量化する。
フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームであるが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離されるようにフソソームが操作されることを除いて、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じる、フソソーム組成物。フソソームの産生に続いて、ＣＡＲをコードする配列を有するプラスミドで更にヌクレオフェクトされる。
例えば、Ｃｈｅｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｉｓ．２０１５ Ｍａｒ；２（１）：９６－１０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１を参照されたい。
陰性対照として、フソソームは、ＧＦＰをコードするプラスミドでヌクレオフェクトされる。
次いで、十分な数のフソソームを、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ＬＡＸ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１００Ｕ ｍＬ－１ペニシリン、１００μｇ ｍＬ－１ストレプトマイシン、１．２５μｇ ｍＬ－１アンホテリシンＢ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、および１００Ｕ ｍＬ－１ｈＩＬ－２（ＰｅｒｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＣＴ，ＵＳＡ）で補足されたＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，ＣＨ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＴ細胞培地中で、４８時間の期間にわたって、ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＣＤ３＋ Ｔ細胞と一緒に、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＣＤ３＋Ｔ細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をブロックする停止コドンをＤＮＡから切り出すＣｒｅリコンビナーゼによりｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。４８時間のインキュベーション後、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を、５６１ｎｍのレーザー励起でＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳを介して単離し、発光を５９０＋／－２０ｎｍで収集する。次いで、ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して全ＤＮＡを単離する。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ｎｇのＤＮＡテンプレート、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（Ｔａｑｍａｎオンラインプライマーおよびプローブ設計プログラムを使用して設計された）の可変領域に特異的なプライマーおよびプローブセットを使用して実施される。ｃＡ標準曲線は、ＣＡＲをコードするプラスミドの段階希釈を行うことにより、抗ＣＤ１９ＣＡＲ導入遺伝子ＤＮＡコピーの絶対定量のために調製される。β－ラクタマーゼ（ＡＭＰｒ遺伝子）に特異的なプライマーおよびプローブのセットを使用して、ＤＮＡ量を正規化した。Ｃｔ値を使用して、ＣＡＲプラスミドまたは陰性対照を含むフソソームで処理されたＣＤ３＋Ｔ細胞内のＣＡＲ ＤＮＡの量を比較する。
幾つかの実施形態では、インビトロでのフソソームを用いたＤＮＡカーゴの送達は、陰性対照と比較して、ＣＡＲプラスミドを有するフソソームにおいてより高い。
ｂ．ｍＲＮＡペイロード
この実施例では、フソソームを使用したｍＲＮＡの、インビトロでのＣＤ３＋Ｔ細胞への送達について説明する。この実施例では、フソソームが、治療用カーゴであるＣＤ１９に対して指向されたキメラ抗原受容体である、外因性遺伝子をコードするｍＲＮＡを送達する能力を定量化する。
フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームであるが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離されるようにフソソームが操作されることを除いて、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じる、フソソーム組成物。フソソームの産生に続いて、ＣＡＲをコードする配列を有するｍＲＮＡで更にヌクレオフェクトされる。例えば、Ｃｈｅｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｉｓ．２０１５ Ｍａｒ；２（１）：９６－１０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１を参照されたい。
陰性対照として、フソソームは、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡでヌクレオフェクトされる。
次いで、十分な数のフソソームを、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ＬＡＸ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１００Ｕ ｍＬ－１ペニシリン、１００μｇ ｍＬ－１ストレプトマイシン、１．２５μｇ ｍＬ－１アンホテリシンＢ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、および１００Ｕ ｍＬ－１ｈＩＬ－２（ＰｅｒｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＣＴ，ＵＳＡ）で補足されたＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，ＣＨ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＴ細胞培地中で、４８時間の期間にわたって、ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＣＤ３＋ Ｔ細胞と一緒に、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＣＤ３＋Ｔ細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をブロックする停止コドンをＤＮＡから切り出すＣｒｅリコンビナーゼによりｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。４８時間のインキュベーション後、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を、５６１ｎｍのレーザー励起でＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳを介して単離し、発光を５９０＋／－２０ｎｍで収集する。
全ＲＮＡを（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙカタログ＃７４１０４などのキットを使用して）単離し、続いて標準的な分光法を使用してＲＮＡ濃度を決定して、ＲＮＡによる吸光度を評価する（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐを使用）。逆転写は、ＲＴ－ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓスーパーミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施され、ＲＮＡ（１００ｎｇ）は、ｃＤＮＡに逆転写される。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ｎｇのＤＮＡテンプレート、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（Ｔａｑｍａｎオンラインプライマーおよびプローブ設計プログラムを使用して設計された）の可変領域に特異的なプライマーおよびプローブセット、ならびに内因性ロード対照としてβ－アクチンを増幅させるように設計されたプライマープローブセットを使用して実施される。Ｃｔ値を使用して、ＣＡＲ ｍＲＮＡを含むフソソームで処理されたＣＤ３＋Ｔ細胞と陰性対照を含むフソソームで処理されたＣＤ３＋Ｔ細胞との間のｑＲＴ－ＰＣＲ反応におけるＣＡＲ ｃＤＮＡの量を比較する。相対的発現は、ΔΔＣｔ法を使用して計算される。ＣＡＲの相対的発現レベルが高いのは、選別されたＣＤ３＋Ｔ細胞から精製されたＣＡＲ ｍＲＮＡのレベルが高いためである。
幾つかの実施形態では、インビトロでのフソソームを伴うｍＲＮＡカーゴの送達は、陰性対照フソソームと比較して、ＣＡＲ ｍＲＮＡを含むフソソームにおいてより高い。
ｃ．タンパク質／ｍＲＮＡペイロード、ペイロードはドナー細胞によって発現される
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、インビトロでのＣＤ３＋Ｔ細胞とのフソソーム融合は、キメラ抗原受容体タンパク質の、ＣＤ３＋Ｔ細胞の膜への送達をもたらす。
フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームと、およびＣＤ１９を標的とするＣＡＲのオープンリーディングフレームとインフレームであり、それぞれＰ２ＡおよびＴ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離されるようにフソソームが操作されることを除いて、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じる、フソソーム組成物。陰性対照のフソスメは、フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームおよび青色蛍光タンパク質ｍＴａｇＢＦＰ２のオープンリーディングフレームとインフレームであり、各々がＰ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離されるように操作される。例えば、Ｃｈｅｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｉｓ．２０１５ Ｍａｒ；２（１）：９６－１０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１を参照されたい。
次いで、十分な数のフソソームを、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ＬＡＸ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１００Ｕ ｍＬ－１ペニシリン、１００μｇ ｍＬ－１ストレプトマイシン、１．２５μｇ ｍＬ－１アンホテリシンＢ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、および１００Ｕ ｍＬ－１ｈＩＬ－２（ＰｅｒｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＣＴ，ＵＳＡで補足されたＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，ＣＨ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＴ細胞培地中で、４８時間の期間にわたって、ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＣＤ３＋ Ｔ細胞と一緒に、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＣＤ３＋Ｔ細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をブロックする停止コドンをＤＮＡから切り出すＣｒｅリコンビナーゼによりｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。４８時間のインキュベーション後、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を、５６１ｎｍのレーザー励起でＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳを介して単離し、発光を５９０＋／－２０ｎｍで収集する。
選別されたＴ細胞へのｍＲＮＡ送達をアッセイする。全ＲＮＡを（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙカタログ＃７４１０４などのキットを使用して）単離し、続いて標準的な分光法を使用してＲＮＡ濃度を決定して、ＲＮＡによる吸光度を評価する（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐを使用）。逆転写は、ＲＴ－ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓスーパーミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施され、ＲＮＡ（１００ｎｇ）は、ｃＤＮＡに逆転写される。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ｎｇのＤＮＡテンプレート、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（Ｔａｑｍａｎオンラインプライマーおよびプローブ設計プログラムを使用して設計された）の可変領域に特異的なプライマーおよびプローブセット、ならびに内因性ロード対照としてβ－アクチンを増幅させるように設計されたプライマープローブセットを使用して実施される。Ｃｔ値を使用して、ＣＡＲ ｍＲＮＡを含むフソソームで処理されたＣＤ３＋Ｔ細胞と陰性対照を含むフソソームで処理されたＣＤ３＋Ｔ細胞との間のｑＲＴ－ＰＣＲ反応におけるＣＡＲ ｃＤＮＡの量を比較する。相対的発現は、ΔΔＣｔ法を使用して計算される。ＣＡＲの相対的発現レベルが高いのは、選別されたＣＤ３＋Ｔ細胞から精製されたＣＡＲ ｍＲＮＡのレベルが高いためである。
幾つかの実施形態では、インビトロでのフソソームを伴うＣＡＲ ｍＲＮＡカーゴの送達は、ＣＦＰを発現する細胞に由来する陰性対照フソスムと比較して、ＣＡＲを発現する細胞に由来するフソソームにおいてより高い。
選別された細胞の表面でのＣＡＲ発現をアッセイする。選別されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＣＤ３＋細胞を、Ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １１：２３，２０１３に記載されているように、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＣＤ１９ｓＩｇ１－４：ＡＦ４８８）にコンジュゲートされたＣＤ１９ｓＩｇ１－４とインキュベートする。ＣＤ１９ｓＩｇ１－４：ＡＦ４８８は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を標識する。ＡＢ血漿からのヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって１０分間ブロックされた後、２×１０５個の細胞を、４５０ｎｇのＣＤ１９ｓＩｇ１－４：ＡＦ４８８と４℃で３０分間、暗所でインキュベートする。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を実行するＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析する。陰性対照フソゲンとインキュベートしたｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＣＤ３＋細胞細胞を使用して、ＣＤ１９ｓＩｇ１－４：ＡＦ４８８シグナルの陰性ゲートを設定する。このゲートは、ＣＤ１９ｓＩｇ１－４：ＡＦ４８８の陽性事象の％が０．０％に等しくなるように選択される。ＣＤ１９ｓＩｇ１－４：ＡＦ４８８に陽性である事象のパーセントは、ＣＡＲを発現する細胞に由来するフソソームで処理された選別細胞内で測定される。
幾つかの実施形態では、表面ＣＡＲ発現を有する選別細胞のパーセントは、ｍＴａｇＢＦＰ２を発現する細胞に由来する陰性対照フソスムと比較して、ＣＡＲを発現する細胞に由来するフソソームで処理された細胞においてより高い。
実施例１１０：インビトロでのＴ細胞へのＴ細胞特異的フソスメ融合
この実施例では、インビトロでＣＤ３＋Ｔ細胞に優先的なフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、そのペイロードを、代替の細胞型よりも高い効率でＣＤ３＋Ｔ細胞に送達する。
フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームであるが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離されるようにフソソームが操作されることを除いて、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じる、フソソーム組成物。
次いで、十分な数のフソソームを、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ＬＡＸ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１００Ｕ ｍＬ－１ペニシリン、１００μｇ ｍＬ－１ストレプトマイシン、１．２５μｇ ｍＬ－１アンホテリシンＢ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、および１００Ｕ ｍＬ－１ｈＩＬ－２（ＰｅｒｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＣＴ，ＵＳＡで補足されたＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，ＣＨ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＴ細胞培地中で、４８時間の期間にわたって、ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＣＤ３＋ Ｔ細胞と一緒に、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＣＤ３＋Ｔ細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をブロックする停止コドンをＤＮＡから切り出すＣｒｅリコンビナーゼによりｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。
別個の実験では、同じ数のフソソームを、ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞株と一緒に、３７℃および５％ＣＯ２で、２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で中で４８時間の期間にわたってインキュベートする。ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をブロックする停止コドンをＤＮＡから切り出すＣｒｅリコンビナーゼによりｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。
４８時間のインキュベーション後、細胞を、５６１ｎｍのレーザー励起でＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で実行し、発光を５９０＋／－２０ｎｍで収集する。陽性ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を測定するためにゲートを設定する。ゲートは、フソスムと接触していないＣＤ＋Ｔ細胞およびＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞が全て陰性になるように選択される。ｔｄＴｏｍａｔｏの発現に対して陽性である細胞のパーセントを、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびフソソームが接触したＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞中で測定する。
幾つかの実施形態では、ｔｄＴｏｍａｔ発現に対して陽性である細胞のパーセントは、フソソームと接触したＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞よりもフソソームと接触したＣＤ３＋細胞においてより高く、これは、フソソームが標的ＣＤ３＋細胞と優先的に融合することを示す。
実施例１１１：インビボでのＴ細胞へのＴ細胞特異的フソスメ融合
この実施例では、インビボでＣＤ３＋Ｔ細胞に優先的なフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、そのペイロードを、任意の代替の細胞型よりも高い効率でＣＤ３＋Ｔ細胞に送達する。
フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームであるが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離されるようにフソソームが操作されることを除いて、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じる、フソソーム組成物。
次いで、３×１０１１個のフソソームまたはＰＢＳを、プログラム可能なＢＳ－３００注入ポンプ（両方ともＢｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して、げっ歯類の尾静脈カテーテルから２０分かけてゆっくりと５日間、Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ株００７９０９）に投与する。最終治療の３日後、末梢血を、フソソーム治療されたマウスおよびＰＢＳ治療を受けたマウスから収集する。血液を５μＭのＥＤＴＡを含む１ｍＬのＰＢＳに集め、凝固を防ぐためにすぐに混合する。チューブを氷上に保持し、赤血球を緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して除去する。細胞をボブシン（ｂｏｖｓｉｎｅ）血清アルブミンで１０分間ブロッキングした後、マウスＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：１１－００３２－８２）、によって、４℃で３０分間、暗所で染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、４８８ｎｍのレーザー励起でＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で分析し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を実行して、発光を５３０＋／－３０ｎｍで収集する。ＰＢＳ処置を受けたマウスの未染色細胞を使用して、ＦＩＴＣ陰性およびｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光陰性のゲートを描く。
幾つかの実施形態では、ｔｄＴｏｍａｔ蛍光に対して陽性である細胞のパーセントは、ＰＢＳで処置されたマウスよりもフソソームで処置されたマウスにおいてより高い。幾つかの実施形態では、ＦＩＴＣに対して陽性に染色されるｔｄＴｏｍａｔ陽性細胞のパーセントは、フソソームで処置されたマウスにおいて、ＦＩＴＣに対して陰性に染色される細胞よりも大きい。これは、ＣＤ３＋細胞を標的とするフソソームが、インビボでＣＤ３＋細胞と特異的に融合することを示す。
実施例１１２：インビトロで操作されたＴ細胞は、インビトロで標的抗原と会合した細胞を溶解する
この実施例は、前の実施例における方法のうちのいずれか１つに記載されるように、フソソームと接触した後にＣＡＲを発現するＣＤ３＋Ｔ細胞が、インビトロで、標的抗原、例えば、ＣＤ１９と会合した細胞を溶解できることを示す。
ＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現するＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋Ｅμ－ＡＬＬ０１白血病細胞（標的）またはＣＤ１９－Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞（対照）とインキュベートする。インキュベーションの前に、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＣＤ３およびＣＤ２８特異的磁気ビーズを使用して１細胞あたり３ビーズで活性化され（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ、Ｅμ－ＡＬＬ０１白血病細胞およびＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞を、膜色素で標識し、１０％胎仔血清を含有するＲＰＭＩで専用し、１ｍＬあたり１×１０５個の腫瘍細胞の濃度で同じ培地に再懸濁する。次いで、Ｔ細胞を、９６ウェルプレート（最終量、２００μＬ）において、Ｔ細胞と腫瘍細胞との様々な比率、０Ｔ細胞：１腫瘍細胞～１００Ｔ細胞：１腫瘍細胞の範囲で懸濁液に添加し、３７℃で３時間インキュベートする。次いで、細胞をＶ底９６ウェルプレートに移し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色する。ＰＢＳでの洗浄に続いて、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を実行しているＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）マシンでフローサイトメトリーによって細胞を分析する。０Ｔ細胞：１腫瘍細胞のインキュベーションからの細胞、およびＴ細胞の別個のバッチを、最初にフローサイトメーターで実行する。ＰＫＨ－２６蛍光に基づいて、Ｔ細胞と腫瘍細胞とを区別するために最初にゲートを描画する。ゲートは、Ｔ細胞が陰性であり、ＰＫＨ－２６とインキュベートされた腫瘍細胞が陽性であるように描かれる。次に、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１染色を測定するためのゲートが描かれる。ゲートは、０Ｔ細胞：１腫瘍細胞のインキュベーションからの細胞が、全てＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－Ｂｒｉｌｌｉａｔｎ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１に対して陰性になるように描かれる。これらの２つのゲートを使用して、腫瘍細胞に対するＴ細胞の様々な比率の各インキュベーションからの細胞を、フローサイトメーターで実行する。
幾つかの実施形態では、ＰＫＨ－２６およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１に対して陽性である細胞のパーセントは、Ｅμ－ＡＬＬ０１白血病細胞についての腫瘍細胞に対するＴ細胞の比率の増加と共に増加し、ＰＫＨおよびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１に対して陽性である細胞のパーセントは、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞の腫瘍細胞に対するＴ細胞の比率が増加に伴って増加しない。これは、フソームと接触した後にＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞が、ＣＤ１９陽性である細胞を特異的に溶解できることを示す。
例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７を参照されたい。
実施例１１３：インビボで操作されたＴ細胞は、インビトロで標的抗原と会合した細胞を溶解する
この実施例は、インビボでフソソームと接触した後にＣＡＲを発現するように操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞が、インビトロで標的抗原と会合した細胞を溶解できることを示す。
フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームであるが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離されるようにフソソームが操作されることを除いて、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じる、フソソーム組成物。更に、フソソームは、前の実施例で説明したように、ＣＤ－１９を標的とするＣＡＲを標的細胞に送達するように操作される。
次いで、３×１０１１個のフソソームまたはＰＢＳを、プログラム可能なＢＳ－３００注入ポンプ（両方ともＢｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して、げっ歯類の尾静脈カテーテルから２０分かけてゆっくりと５日間、Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ株００７９０９）に投与する。最終治療の３日後、末梢血を、フソソーム治療されたマウスおよびＰＢＳ治療を受けたマウスから収集する。血液を５μＭのＥＤＴＡを含む１ｍＬのＰＢＳに集め、凝固を防ぐためにすぐに混合する。チューブを氷上に保持し、赤血球を緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して除去する。細胞をボブシン（ｂｏｖｓｉｎｅ）血清アルブミンで１０分間ブロッキングした後、マウスＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：１１－００３２－８２）、によって、４℃で３０分間、暗所で染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、４８８ｎｍのレーザー励起でＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で分析し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を実行して、発光を５３０＋／－３０ｎｍで収集する。次いで、フソソームまたはＰＢＳで処置されたマウスから選別された細胞を、ＣＤ１９＋Ｅμ－ＡＬＬ０１白血病細胞とインキュベートする。インキュベーションの前に、Ｅμ－ＡＬＬ０１白血病細胞を、膜色素ＰＫＨ－２６（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識し、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩで洗浄し、１ｍＬあたり１×１０５腫瘍細胞の濃度で同じ培地に再懸濁する。次いで、Ｔ細胞を、９６ウェルプレート（最終量、２００μＬ）において、Ｔ細胞と腫瘍細胞との様々な比率、０Ｔ細胞：１腫瘍細胞～１００Ｔ細胞：１腫瘍細胞の範囲で懸濁液に添加し、３７℃で３時間インキュベートする。次いで、細胞をＶ底９６ウェルプレートに移し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色する。ＰＢＳでの洗浄に続いて、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を実行しているＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）マシンでフローサイトメトリーによって細胞を分析する。０Ｔ細胞：１腫瘍細胞のインキュベーションからの細胞、および選別されたＴ細胞の別個のバッチを、最初にフローサイトメーターで実行する。ＰＫＨ－２６蛍光に基づいて、Ｔ細胞と腫瘍細胞とを区別するために最初に第１のゲートを描画する。ゲートは、Ｔ細胞が陰性であり、ＰＫＨ－２６とインキュベートされた腫瘍細胞が陽性であるように描かれる。次に、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１染色を測定するためのゲートが描かれる。ゲートは、０Ｔ細胞：１腫瘍細胞のインキュベーションからの細胞が、全てＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－Ｂｒｉｌｌｉａｔｎ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１に対して陰性になるように描かれる。これらの２つのゲートを使用して、腫瘍細胞に対するＴ細胞の様々な比率の各インキュベーションからの細胞を、フローサイトメーターで実行する。
幾つかの実施形態では、ＰＫＨ－２６およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１に対して陽性である細胞のパーセントは、フソソームで処置されたマウスからのＥμ－ＡＬＬ０１白血病細胞に対するＴ細胞の比率の増加と共に増加し、ＰＫＨ－２６およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１は、ＰＢＳで処置されたマウスのＥμ－ＡＬＬ０１白血病細胞に対するＴ細胞の比率が増加と共に増加しない。これは、フソソームで処理した後にＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞が、ＣＤ１９に関連する細胞を溶解できることを示す。例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７を参照されたい。
実施例１１４：インビボで操作されたＴ細胞は、インビボで標的抗原と会合した腫瘍細胞を溶解する
この実施例は、インビボでフソソームと接触した後にＣＡＲを発現するように操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞がインビボで腫瘍を治療できることを示す。
フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームであるが、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離されるようにフソソームが操作されることを除いて、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じる、フソソーム組成物。更に、フソソームは、前の実施例に記載されるように、ＣＤ－１９を標的とするＣＡＲを送達するように操作される。
白血病のモデルは、ルシフェラーゼを発現するＥμ－ＡＬＬ０１白血病細胞を４～６週齢の雌アルビノＢ６（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｙｒ＜ｃ－２Ｊ＞）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に全身注射し、それらを１週間発達させることによって確立する。次いで、マウスを実験コホートにランダムに割り当てる。次いで、３×１０１１個のフソソームまたはＰＢＳを、プログラム可能なＢＳ－３００注入ポンプ（両方ともＢｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して、げっ歯類の尾静脈カテーテルを通して２０分かけてゆっくりと５日間投与する。
次いで、生きている白血病細胞の数の代用としての発光を毎日測定する。ＰＢＳ（１５ｍｇ ｍＬ－１）中のＤ－ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を、白血病細胞によって発現されるＦ－ｌｕｃの基質として使用する。生物発光画像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて収集する。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアバージョン４．３．１（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して、１５０ｍｇ ｋｇ－１の２％イソフルラン（Ｆｏｒａｎｅ、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で麻酔した動物にＤ－ルシフェリンを腹腔内注射した後、１０～３５分の範囲で得られたデータを取得（および後で定量化）する。取得時間は、１０秒～５分の範囲である。バックグラウンド生物発光を補正するために、腫瘍のないマウス（Ｄ－ルシフェリンを注射）から取得したシグナルを、測定関心領域（ＲＯＩ）から差し引く。
実施形態では、ルシフェラーゼシグナルは、ＰＢＳで処置されたマウスでは２１日間にわたって増加し、ルシフェラーゼシグナルは、フソソームで処置されたマウスでは２１日間にわたって減少する。
ＰＢＳまたはフソソームを受けたマウスの生存も追跡する。実施形態では、ＰＢＳを受けたマウスは、フソソームで処置されたマウスよりも生存期間の中央値が低い。
これは、フソソームがインビボで腫瘍細胞を標的とするようにＴ細胞を操作できることを示す。例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７を参照されたい。
実施例１１５：フソソームは膜貫通タンパク質をレシピエント細胞に送達する
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、フソソーム融合は、レシピエント細胞への膜貫通タンパク質の送達をもたらす。
フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレーム、およびヒトインスリン受容体のオープンリーディングフレームとインフレームであり、それぞれＰ２ＡおよびＴ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離されるようにフソソームが操作されることを除いて、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じるフソソーム組成物。陰性対照のフソスメは、フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームおよび青色蛍光タンパク質ｍＴａｇＢＦＰ２のオープンリーディングフレームとインフレームであり、各々がＰ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離されるように操作される。例えば、Ｃｈｅｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｉｓ．２０１５ Ｍａｒ；２（１）：９６－１０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１を参照されたい。
次いで、十分な数のフソソームを、ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＨＥＫ２９３細胞と共に、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間の期間にわたって、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）でインキュベートする。ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＨＥＫ２９３細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をブロックする停止コドンをＤＮＡから切り出すＣｒｅリコンビナーゼによりｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。４８時間のインキュベーション後、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を、５６１ｎｍのレーザー励起でＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳを介して単離し、発光を５９０＋／－２０ｎｍで収集する。
選別されたＨＥＫ２９３細胞へのｍＲＮＡ送達をアッセイする。全ＲＮＡを（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙカタログ＃７４１０４などのキットを使用して）単離し、続いて標準的な分光法を使用してＲＮＡ濃度を決定して、ＲＮＡによる吸光度を評価する（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐを使用）。逆転写は、ＲＴ－ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓスーパーミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施され、ＲＮＡ（１００ｎｇ）は、ｃＤＮＡに逆転写される。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ｎｇのＤＮＡテンプレート、ヒトインスリン受容体の（Ｔａｑｍａｎオンラインプライマーおよびプローブ設計プログラムを使用して設計された）可変領域に特異的なプライマーおよびプローブセット、ならびに内因性ロード対照としてβ－アクチンを増幅させるように設計されたプライマープローブセットを使用して実施される。Ｃｔ値を使用して、インスリン受容体ｍＲＮＡを含むフソソームで処理されたＨＥＫ２９３細胞と陰性対照を含むフソソームで処理されたＨＥＫ２９３細胞との間のｑＲＴ－ＰＣＲ反応におけるインスリン受容体ｃＤＮＡの量を比較する。相対的発現は、ΔΔＣｔ法を使用して計算される。インスリン受容体の相対的発現レベルが高いのは、選別されたＨＥＫ２９３ Ｔ細胞から精製されたインスリン受容体ｍＲＮＡのレベルが高いためである。
幾つかの実施形態では、インビトロでのフソソームを伴うインスリン受容体ｍＲＮＡカーゴの送達は、ＣＦＰを発現する細胞に由来する陰性対照フソスムと比較して、インスリン受容体を発現する細胞に由来するフソソームにおいてより高い。
選別された細胞の表面でのインスリン受容体の発現をアッセイする。選別されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＨＥＫ２９３細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｂｉｏｓｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、カタログ番号ｂｓ－０２６０Ｒ－Ａ４８８）にコンジュゲートしたインスリン受容体α抗体とインキュベートする。抗体は、インスリン受容体の発現量に比例してインスリン受容体を発現する細胞を標識する。２×１０５個の細胞を、ＡＢ血漿（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）からのヒト血清によって１０分間ブロックした後、４５０ｎｇのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒにコンジュゲートしたインスリン受容体α抗体と、４℃で３０分間、暗所でインキュベートする。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を実行するＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析する。陰性対照のフソゲンとインキュベートしたｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＨＥＫ２９３細胞を使用して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８シグナルにコンジュゲートしたインスリン受容体α抗体の陰性ゲートを設定する。ゲートは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートしたインスリン受容体α抗体の陽性事象のパーセントが、０．０％に等しくなるように選択される。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートしたインスリン受容体α抗体に対して陽性である事象のパーセントは、インスリン受容体を発現する細胞に由来するフソソームで処理された選別細胞において測定される。
幾つかの実施形態では、表面インスリン受容体発現を有する選別された細胞のパーセントは、ｍＴａｇＢＦＰ２を発現する細胞に由来する陰性対照フソスムと比較して、インスリン受容体を発現する細胞に由来するフソソームで処理された細胞においてより高い。
実施例１１６：フソソームは異種のシグナルペプチド標的化膜貫通タンパク質をレシピエント細胞に送達する
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、レシピエント細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞の原形質膜への異種膜タンパク質ペイロードの送達をもたらす。
フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームと、および膜標的ＧＦＰのオープンリーディングフレームとインフレームであり、それぞれＰ２ＡおよびＴ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離されるようにフソソームが操作されることを除いて、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じる、フソソーム組成物。膜標的ＧＦＰは、ＧＦＰのコード配列のＮ末端をＬＣＫの最初の２６アミノ酸、２つのパルミトイル化ドメインと１つのミリストイル化ドメインを含むＳｒｃファミリーチロシンキナーゼに融合することによって生成される。陰性対照フソスメは、フソゲンがＣｒｅのオープンリーディングフレームおよび細胞質ゾルＧＦＰ（いかなる追加の標的化ペプチド配列も含まないＧＦＰのコード配列）のオープンリーディングフレームとインフレームであり、各々がＰ２Ａ自己開裂ペプチド配列によって分離されるように操作される。例えば、Ｃｈｅｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｉｓ．２０１５ Ｍａｒ；２（１）：９６ １０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１、およびＢｅｎｅｄｉｋｔｓｓｏｎ Ａ，ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５ １４１，４１－５３を参照されたい。
次いで、十分な数のフソソームを、ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＨＥＫ２９３細胞と共に、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間の期間にわたって、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）でインキュベートする。ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するＨＥＫ２９３細胞とのフソソーム融合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をブロックする停止コドンをＤＮＡから切り出すＣｒｅリコンビナーゼによりｔｄＴｏｍａｔｏ発現をもたらす。４８時間のインキュベーション後、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を、５６１ｎｍのレーザー励起でＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳを介して単離し、発光を５９０＋／－２０ｎｍで収集する。
選別されたＨＥＫ２９３細胞の原形質膜におけるＧＦＰの膜局在化を、共焦点顕微鏡を介してアッセイする。共焦点顕微鏡検査の前に、選別されたＨＥＫ２９３細胞を、原形質膜を標識する試薬（例えば、ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔａｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ１００４６）で染色する。イメージング実験を、Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ６３×１．４開口数油浸対物レンズを使用して、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０倒立顕微鏡を用いて実施する。４８８ｎｍのアルゴンレーザーを使用して、ＧＦＰ／ＥＧＦＰを励起し、６３２ｎｍのヘリウム－ネオンレーザーを使用して、原形質膜の染色を励起する。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを作成して、各細胞の原形質膜および細胞質ゾルの平均ＧＦＰ強度を決定する。スクリプトでは、原形質膜（原形質膜染色によって定義される原形質膜の両側の６ピクセルによって定義される）および細胞質ゾル（原形質膜領域内の領域）の平均強度を計算する。次いで、各細胞の原形質膜および細胞質ゾル強度の値を使用して、原形質膜局在化％を計算する。原形質膜局在化％は、次の式で計算される：全（原形質膜＋細胞質ゾル）強度に対する原形質膜強度×１００％。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６：１９１２５（２０１５）を参照されたい。
幾つかの実施形態では、原形質膜局在化ＧＦＰを含むフソソームで処理された選別細胞は、細胞質ゾルＧＦＰを含むフソソームで処理された選別細胞よりも高いＧＦＰの原形質膜局在化％を有する。
実施例１１７：核標的タンパク質のフソソーム送達
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞核へのタンパク質の送達をもたらす。
前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じるフソソーム組成物は、ＬＲＨ－１をコードするｍＲＮＡを含む（例えば、Ｍａｍｒｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ ３：ｅ０１６９４，２０１４に記載される）。陰性対照として、フソソーム組成物には、ＬＲＨ－１の翻訳を妨げるミスセンス突然変異を有するｍＲＮＡが含まれている。
次いで、十分な数のフソソームを、２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で、レシピエントＨＥＫ２９３細胞株と、３７℃および５％ＣＯ２で１２時間の期間にわたってインキュベートする。
１２時間のインキュベーション後、細胞をイメージング用に調製する。細胞を固定し、透過処理し、ブロックし、抗ＬＲＨ－１抗体コンジュゲートＦＩＴＣ（例えば、ＬｓＢｉｏカタログ番号ＬＣ－Ｃ４２３４０１－１００）で免疫染色する。免疫染色後、細胞をＤＡＰＩで対比染色して核を標識する。
この実施例では、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２に維持した状態で、６３倍の油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡で画像化する。ＤＡＰＩを、４０５ｎｍのレーザー励起に供し、ＦＩＴＣを、４８８ｎｍのレーザー励起に供する。
ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを作成して、視野内の核の平均ＦＩＴＣ強度を決定する。スクリプトでは、核内の平均強度（ＤＡＰＩ染色によって定義された核の両側の６ピクセルによって定義される）。核の外側のいかなるＦＩＴＣシグナルも、非核として定義される。次いで、各視野の核強度および非核強度の値を使用して、核局在化％を計算する。核局在化％を、次の式で計算する：総（核＋非核）強度に対する核局在化強度×１００％。
幾つかの実施形態では、ＬＲＨ－１ ｍＲＮＡを含むフソソームで処理された細胞は、ミスセンスＬＲＨ－１ ｍＲＮＡを含むフソソームで処理された細胞よりも高いＦＩＴＣシグナルの核局在化％を有するであろう。このアッセイを使用して、治療用タンパク質をレシピエント細胞の核に送達するフソソームを示す。
実施例１１８：自然には核に到達しないが、核局在化配列の追加時に核を標的とするＧＦＰの送達
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞核へのタンパク質の送達をもたらす。
前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じるフソソーム組成物は、ＥＧＦＰと核局在化配列（例えば、表６－１の核局在化配列のうちの１つ）との間の翻訳融合をコードするｍＲＮＡを含む。陰性対照として、フソソーム組成物は、核局在化配列のないＥＧＦＰをコードするｍＲＮＡを含む。
次いで、十分な数のフソソームを、２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で、レシピエントＨＥＫ２９３細胞株と、３７℃および５％ＣＯ２で１２時間の期間にわたってインキュベートする。
１２時間のインキュベーション後、細胞を画像化する。イメージングの前に、細胞を、核を標識するための１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、および原形質膜を標識する染色（例えば、ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔａｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ１００４６）で染色する。この実施例では、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２に維持した状態で、６３倍の油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡で画像化する。Ｈｏｅｃｈｓｔを、４０５ｎｍのレーザー励起に供し、ＥＧＦＰを、４８８ｎｍのレーザー励起に供し、原形質膜染色を、６３２ｎｍのヘリウム－ネオンレーザー励起に供する。
ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを作成して、各細胞の核および細胞質ゾルの平均ＥＧＦＰ強度を決定する。スクリプトでは、核（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色により定義される核の両側の６ピクセルにより定義される）および細胞質ゾル（原形質膜領域内および核の外側の領域）の平均強度を計算する。次いで、各細胞の核および細胞質ゾル強度の値を使用して、核局在化％を計算する。核局在化％を、次の式で計算する：総（核＋非核）強度に対する核局在化強度×１００％。
幾つかの実施形態では、ＥＧＦＰ－ＮＬＳ融合タンパク質を含むフソソームで処理された細胞は、ＥＧＦＰを含むフソソームで処理された細胞よりも高いＥＧＦＰの核局在化％を有するであろう。このアッセイを使用して、タンパク質をレシピエント細胞の核に送達するフソソームを示す。
実施例１１９：内因性細胞質ゾルタンパク質の、レシピエント細胞内の核への局在化を駆動する核局在化配列を含むナノボディの送達
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、核局在化配列を含むナノボディの送達をもたらし、これは、その後、内因性細胞質ゾルタンパク質をレシピエント細胞内の核に駆動する。
前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じるフソソーム組成物は、ＧＦＰタンパク質を認識するナノボディをコードするＤＮＡプラスミドを含み、ナノボディはまた、核局在化配列（例えば、表６－１の核局在化配列のうちの１つ）を含む。陰性対照として、フソソーム組成物は、同じＧＦＰ標的ナノボディを含むが、核局在化配列を欠いている。
次いで、十分な数のフソソームを、１０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で、ＧＦＰを内在的に発現するレシピエントＨＥＫ２９３細胞株と、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間の期間にわたってインキュベートする。
２４時間のインキュベーション後、細胞を画像化する。イメージングの前に、細胞を、核を標識するための１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、および原形質膜を標識する染色（例えば、ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔａｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ１００４６）で染色する。この実施例では、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２に維持した状態で、６３倍の油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡で画像化する。Ｈｏｅｃｈｓｔを、４０５ｎｍのレーザー励起に供し、ＧＦＰを、４８８ｎｍのレーザー励起に供し、原形質膜染色を、６３２ｎｍのヘリウム－ネオンレーザー励起に供する。
ＩｍａｇｅＪマクロを作成して、各細胞の核および細胞質ゾルの平均ＥＧＦＰ強度を決定する。マクロでは、核（バックグラウンドを適切にしきい値処理し、除去した後にＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色により定義される核の両側の６ピクセルにより定義される）および細胞質ゾル（原形質膜領域内および核の外側の領域）の平均強度を計算する。次いで、各細胞の核および細胞質ゾルの集積ピクセル強度の値を使用して、核局在化％を計算する。核局在化％を、次の式で計算する：総（核＋細胞質ゾル）強度に対する核局在化積分強度×１００％。
幾つかの実施形態では、核局在化配列を有するＧＦＰ標的ナノボディを含むフソソームで処理された細胞は、核局在化配列を有しないＧＦＰ標的ナノボディを含むフソソームで処理された細胞よりも高いＧＦＰの核局在化％を有する。このアッセイを使用して、内因性タンパク質の局在化をレシピエント細胞の核に駆動することができる標的ナノボディを送達するフソソームを示すことができる。
実施例１２０：核標的タンパク質の存在下の不在下でのＤＮＡの送達
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、細胞の核へのＤＮＡの送達をもたらす。
前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じるフソソーム組成物は、ＴｅｔＲ－ＮＬＳに沿ってテトラサイクリン抑制因子（ＴｅｔＲ）結合部位およびＤＮＡプローブ結合部位を含むＤＮＡプラスミドを含み、ＴｅｔＲ－ＮＬＳは、核局在化配列（表６－１の核局在化配列のうちの１つ）に翻訳的に融合したＴｅｔＲタンパク質である。陰性対照として、フソソーム組成物は、テトラサイクリン抑制因子（ＴｅｔＲ）結合部位およびＤＮＡプローブ結合部位を含むＤＮＡプラスミド上に含まれている。幾つかの実施形態では、ＴｅｔＲ－ＮＬＳは、プラスミド上のＴｅｔＲ結合部位に結合し、タンパク質がそのＮＬＳのために核エンベロープを横切って輸送されるときに、プラスミドをそれに沿って核に運ぶ。
次いで、十分な数のフソソームを、２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で、レシピエントＨＥＫ２９３細胞株と、３７℃および５％ＣＯ２で１２時間の期間にわたってインキュベートする。
１２時間のインキュベーション後、細胞をインサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）での蛍光用に調製する。ＦＩＳＨを、ＦＩＳＨ Ｔａｇ ＤＮＡ Ｏｒａｎｇｅキットと、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ５５５染料（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ｆ３２９４８）を使用して実行する。簡単に説明すると、プラスミド上のＤＮＡプローブ結合部位に結合するＤＮＡプローブを、キットのマニュアルに記載されているニック翻訳、色素標識、および精製の手順によって生成する。次いで、キットのマニュアルに記載されているように、細胞をＤＮＡプローブで標識する。ＤＮＡプローブで標識した後、細胞を１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色して核を標識する。
次に、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２に維持した状態で、６３倍の油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡で画像化する。Ｈｏｅｃｈｓｔを、４０５ｎｍのレーザー励起に供し、ＤＮＡプローブを、５５５ｎｍのレーザー励起に供してＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒを刺激する。
ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを作成して、各細胞の核のＡｌｅｘ Ｆｌｏｕｒ強度の局在化を測定する。スクリプトでは、核内の平均強度は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２株によって定義された核の両側の６ピクセルによって定義される。
幾つかの実施形態では、プラスミドおよびＴｅｔＲ－ＮＬＳを含むフソソームで処理された細胞は、プラスミドのみを含むフソソームで処理された細胞よりも核内でより高い蛍光強度を有するであろう。このアッセイを使用して、ＤＮＡペイロードをレシピエント細胞の核に局在化させるタンパク質を送達するフソソームを示すことができる。
実施例１２１：遺伝子発現を上方調節する合成転写因子の送達
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞核への転写因子の送達をもたらす。
前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じるフソソーム組成物は、ヌクレアーゼヌルＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｃａｓ９のＣ末端に翻訳的に融合されたＶＰ６４－ｐ６５－ＲｔａをコードするｍＲＮＡ、およびプロトスペーサーを標的とするガイドＲＮＡを含む。陰性対照として、フソソーム組成物は、スクランブルガイドＲＮＡと共に、ＶＰＲ－ｄＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを含む。ＶＰ６４－ｐ６５－ＲＴＡは、転写機構を遺伝子に動員する３つの転写活性化因子（ＶＰ６４、ｐ６５、およびＲＴＡ）の翻訳融合である。この実施例では、ＶＰ６４－ｐ６５－ＲＴＡの影響を受ける遺伝子は、ガイドＲＮＡの指示に従って、例えば、Ｃｈａｖｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１５ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３３１２に記載されるように、ｄＣａｓ９結合ＤＮＡの位置によって決定される。
次いで、十分な数のフソソームを、２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で中で、ｍｉｎｉ－ＣＭＶプロモーターおよびｔｄＴｏｍａｔｏの上流のプロトスペーサーをゲノムに組み込んだレシピエントＨＥＫ２９３細胞株と、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間の期間にわたってインキュベートする。追加の陰性対照として、同じＨＥＫ２９３細胞は、いかなるフソソームにも曝露されない。
４８時間のインキュベーション後、細胞を画像化する。イメージングの前に、細胞を１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色して核を標識する。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２に維持した状態で、６３倍の油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡で画像化する。Ｈｏｅｃｈｓｔを、４０５ｎｍのレーザー励起に供し、ｔｄＴｏｍａｔｏを、５６１ｎｍのレーザー励起に供する。細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔの存在に基づいて同定し、細胞あたりのｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の量を測定する。
幾つかの実施形態では、ＶＰＲ－ｄＣａｓ９およびプロトスペーサーを標的とするガイドＲＮＡを含むフソソームで処理された細胞は、ＶＰＲ－ｄＣａｓ９およびスクランブルガイドＲＮＡで処理された細胞またはフソソームで処理されなかった細胞よりも高いｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を有するであろう。このアッセイを使用して、標的遺伝子の転写レベルを改変するレシピエント細胞の核にタンパク質を送達するフソソームを示すことができる。
実施例１２２：遺伝子発現を改変する合成エピジェネティック因子の送達
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞核へのエピジェネティック調節因子の送達をもたらす。
前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じるフソソーム組成物は、ヌクレアーゼヌルＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｃａｓ９（Ｔｅｔ１－ｄＣａｓ９）のＣ末端に翻訳的に融合されたＴｅｔ１酵素ドメインをコードするｍＲＮＡ、およびＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とするガイドｍＲＮＡを含む。陰性対照として、フソソーム組成物は、スクランブルガイドＲＮＡと共に、Ｔｅｔ１－ｄＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを含む。５－ヒドロキシメチルシトシンを形成し、次いで修飾されていないシトシンに復元される、５－シトシン上のＴｅｔ１（１０～１１転座）ジオキシゲナーゼメチル基。５－シトシンでのメチル化は、隣接するＤＮＡ配列の転写を抑制するため、Ｔｅｔ１は、これらのメチル基を除去することによって転写を活性化する。この実施例では、Ｔｅｔ１の影響を受ける遺伝子は、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６７（１）：２３３－２４７，２０１６に記載されるように、ガイドＲＮＡによって指示されたｄＣａｓ９結合ＤＮＡの位置によって決定される。
次いで、十分な数のフソソームを、２０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンをレポーター株と共に含むＤＭＥＭ中で中で、３７℃および５％ＣＯ２で７２時間の期間にわたってインキュベートする。レポーター株は、ＧＦＰの発現を制御する合成メチル化感知プロモーター（刷り込み遺伝子Ｓｎｒｐｎのプロモーターからの保存された配列エレメント）を、Ｄａｚｌプロモーター遺伝子座のゲノムに組み込んだＨＥＫ２９３細胞株である（Ｓｔｅｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３：２１８－２２９，２０１５）。Ｄａｚｌプロモーターは高メチル化されているため、Ｓｎｒｐｎプロモーターは活性ではなく、ＧＦＰはこれらの細胞では発現しない。追加の陰性対照として、同じＨＥＫ２９３細胞は、いかなるフソソームにも曝露されない。
７２時間のインキュベーション後、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光をフローサイトメトリーで測定する。細胞を、５６１ｎｍのレーザー励起によりＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で実行し、発光を５９０＋／－２０ｎｍで収集する。陽性ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を測定するためにゲートを設定する。ゲートは、いかなるフソソームにも曝露されていないＨＥＫ２９３細胞が、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現に対して陰性になるように選択される。次いで、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現に対して陽性である細胞のパーセントを測定する。
幾つかの実施形態では、Ｔｅｔ１－ｄＣａｓ９およびＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とするガイドＲＮＡを含むフソソームで処理された細胞は、Ｔｅｔ１－ｄＣａｓ９およびスクランブルガイドＲＮＡで処理された細胞またはフソソームで処理されなかった細胞よりも高いｔｄＴｏｍａｔ蛍光を有するであろう。このアッセイを使用して、標的遺伝子のエピジェネティック状態を改変するレシピエント細胞の核にタンパク質を送達するフソソームを示すことができる。
実施例１２３：ミトコンドリアを自然に標的とするタンパク質の送達
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞ミトコンドリアへのタンパク質の送達をもたらす。
前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じるフソソーム組成物は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）をコードするｍＲＮＡを含む。陰性対照として、フソソーム組成物には、ＯＴＣの翻訳を妨げるミスセンス突然変異を有するｍＲＮＡが含まれている。
次いで、十分な数のフソソームを、１０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で中で、レシピエントＨＥＫ２９３細胞株と、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間の期間にわたってインキュベートする。
２４時間のインキュベーション後、細胞をイメージング用に調製する。細胞をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｍ２２４２６）で染色し、固定し、透過処理し、ブロックし、抗ＯＴＣ抗体（例えば、ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ９１４１８）で免疫染色する。免疫染色後、細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に結合した二次抗体（例えば、ａｂｃａｍ カタログ番号ａｂ１５００７７）で対比染色する。
この実施例では、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２に維持した状態で、６３倍の油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡で画像化する。Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭを、６３２ｎｍのレーザー励起に供して、発光を６６５±２０ｎｍで捕捉し、またＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒを、４８８ｎｍのレーザー励起に供して、発光を５１０±１５ｎｍで捕捉する。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＯＴＣシグナル）とＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ標識ミトコンドリアの共局在化は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ蛍光に基づいてミトコンドリア領域をマスキングし、ミトコンドリア領域内およびミトコンドリア領域外のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８平均蛍光強度を決定することによって計算される。全ての画像を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で処理し、ミトコンドリア領域を、モーメントしきい値アルゴリズムを使用してしきい値処理し、バックグラウンドを差し引いた後に領域を同定する。
平均ミトコンドリアＯＴＣシグナルは、ミトコンドリア領域内のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の平均蛍光強度として定義され、平均非ミトコンドリアＯＴＣシグナルは、ミトコンドリア領域外（但し、平行位相コントラスト画像によって示される細胞境界内）のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の平均蛍光強度として定義される。所与の細胞の正規化されたミトコンドリアＯＴＣシグナルは、非ミトコンドリアＯＴＣシグナルに正規化された平均ミトコンドリアＯＴＣシグナルとして計算する。各群について、少なくとも３０～４０個の細胞を画像化および分析する。
幾つかの実施形態では、ＯＴＣ ｍＲＮＡを含むフソソームで処理された細胞は、ミスセンスＯＴＣ ｍＲＮＡを含むフソソームで処理された細胞よりも、ミトコンドリア領域内のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８のより高い平均蛍光強度を有するであろう。幾つかの実施形態では、ＯＴＣ ｍＲＮＡを含むフソソームで処理された細胞は、ミスセンスＯＴＣ ｍＲＮＡを含むフソソームで処理された細胞よりも高い正規化されたミトコンドリアＯＴＣシグナルを有するであろう。このアッセイを使用して、治療用タンパク質をレシピエント細胞のミトコンドリアに送達するフソソームを示す。
実施例１２４：ミトコンドリア局在化配列の付加を除いてミトコンドリアを自然に標的としないタンパク質の送達
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞ミトコンドリアへのタンパク質の送達をもたらす。
前の実施例に記載された方法のうちのいずれか１つによって産生された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じるフソソーム組成物は、ＥＧＦＰとミトコンドリア局在化配列（例えば、表６－２のミトコンドリア局在化配列のうちの１つ）との間の翻訳融合をコードするｍＲＮＡを含む。陰性対照として、フソソーム組成物は、ミトコンドリア局在化配列のないＥＧＦＰをコードするｍＲＮＡを含む。
次いで、十分な数のフソソームを、１０％ウシ胎仔血清および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で中で、レシピエントＨＥＫ２９３細胞株と、３７℃および５％ＣＯ２で１２時間の期間にわたってインキュベートする。
２４時間のインキュベーション後、細胞を画像化する。イメージングの前に、細胞をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｍ２２４２６）で染色してミトコンドリアを標識し、原形質膜を標識する染色（例えば、ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｏｒａｎｇｅ原形質膜染色、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ１００４５）で染色する。この実施例では、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２に維持した状態で、６３倍の油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡で画像化する。原形質膜染色を、５５４ｎｍのレーザー励起に供して、発光を５８０±２０ｎｍで捕捉し、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭを、６３２ｎｍのレーザー励起に供して、発光を６６５±２０ｎｍで捕捉し、ＥＧＦＰを、４８８ｎｍのレーザー励起に供して、発光を５１０±１５ｎｍで捕捉する。
ＥＧＦＰとＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ標識ミトコンドリアの共局在化は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ蛍光に基づいてミトコンドリア領域をマスキングし、続いてミトコンドリア領域内およびミトコンドリア領域外のＥＧＦＰ平均蛍光強度を決定することによって決定される。全ての画像を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で処理し、ミトコンドリア領域を、モーメントしきい値アルゴリズムを使用してしきい値処理し、バックグラウンドを差し引いた後に領域を同定する。
平均ミトコンドリアＥＧＦＰシグナルは、ミトコンドリア領域内のＥＧＦＰの平均蛍光強度として定義され、平均非ミトコンドリアＥＧＦＰシグナルは、ミトコンドリア領域外（但し、原形質膜染色によって示される細胞境界内）のＥＧＦＰの平均蛍光強度として定義される。所与の細胞の正規化されたミトコンドリアＥＧＦＰシグナルは、非ミトコンドリアＥＧＦＰシグナルに正規化された平均ミトコンドリアＥＧＦＰシグナルとして計算する。各群について、少なくとも３０～４０個の細胞を画像化および分析する。
幾つかの実施形態では、ミトコンドリア標的ＥＧＦＰ ｍＲＮＡを含むフソソームで処理された細胞は、非ミトコンドリア標的ＥＧＦＰ ｍＲＮＡを含むフソソームで処理された細胞よりも高い平均ミトコンドリアＥＧＦＰシグナルを有するであろう。幾つかの実施形態では、ミトコンドリア標的ＥＧＦＰ ｍＲＮＡを含むフソソームで処理された細胞は、非ミトコンドリア標的ＥＧＦＰ ｍＲＮＡを含むフソソームで処理された細胞よりも高い正規化ミトコンドリアＥＧＦＰシグナルを有するであろう。このアッセイを使用して、タンパク質をレシピエント細胞のミトコンドリアに送達するフソソームを示す。
実施例１２５：リソソーム酸性化とは独立した経路を介したフソソームの送達
多くの場合、標的細胞への複雑な生物学的カーゴの侵入は、エンドサイトーシスによって達成される。エンドサイトーシスでは、カーゴがエンドソームに入る必要があり、エンドソームは成熟して酸性化したリソソームになる。不利なことに、エンドサイトーシスを介して細胞に入るカーゴは、エンドソームまたはリソソームに捕捉され、細胞質または標的細胞の他の所望のコンパートメントに到達できなくなる場合がある。カーゴはまた、リソソームの酸性条件によって損傷を受ける可能性がある。一部のウイルスは、標的細胞への非エンドサイトーシス侵入が可能であるが、このプロセスは完全には理解されていない。この実施例は、ウイルスのフソゲンを残りのウイルスから単離し、他のウイルスタンパク質を欠くフソソームに非エンドサイトーシスの侵入を与えることができることを示している。
細胞表面にニパウイルス受容体結合Ｇタンパク質および融合Ｆタンパク質（ＮｉｖＧ＋Ｆ）を発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、フィコール勾配による超遠心分離の標準的な手順に従って生成し、本明細書に記載される小さな粒子のフソソームを得た。非エンドサイトーシス経路を介したレシピエント細胞へのフソソームの送達を実証するために、ＮｉｖＧ＋Ｆフソソームを使用してレシピエントＣＭＶプロモーター下で「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作されたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を処理した。ＮｉｖＦタンパク質は、ｐＨ非依存性エンベロープ糖タンパク質であり、活性化とその後の融合活性のために環境酸性化を必要としないことが示されている（Ｔａｍｉｎ，２００２）。
レシピエント細胞を３０，０００細胞／ウェルで黒色の透明底９６ウェルプレートにプレーティングした。レシピエント細胞をプレーティングしてから４～６時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＮｉｖＧ＋Ｆフソソームを、ＤＭＥＭ培地中の標的または非標的レシピエント細胞に適用した。フソソーム試料を、最初に、製造元の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。レシピエント細胞を１０μｇのフソソームで処理し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＮｉｖＧ＋Ｆフソソームを介したＣｒｅ送達が非エンドサイトーシス経路を介したことを実証するために、ＮｉｖＧ＋Ｆフソソーム処理を受けたレシピエント細胞の平行ウェルを、エンドソーム／リソソーム酸性化の阻害剤であるバフィロマイシンＡ１（Ｂａｆ；１００ｎＭ；Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｂ１７９３）で同時処理した。
自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して細胞プレートを画像化した。所与のウェルの総細胞集団は、ＤＭＥＭ培地中のＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で１０分間細胞を染色することによって決定された。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡにインターカレートすることで細胞核を染色するため、個々の細胞を同定するために使用された。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を、４０５ｎｍ ＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化した。ＧＦＰを、４６５ｎｍ ＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化し、ＲＦＰを５２３ｎｍ ＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化した。標的細胞および非標的細胞のウェルの画像を、最初に、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞を含む陽性対照ウェルのＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって取得した。
取得設定は、Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＲＦＰ、およびＧＦＰの強度が最大ピクセル強度値になるが、飽和しないように設定された。次に、確立された設定を使用して、対象のウェルを画像化した。Ｈｏｅｃｈｓｔチャネルにオートフォーカスした後、ＧＦＰおよびＲＦＰチャネルに確立された焦点面を使用することにより、各ウェルにフォーカスを設定した。ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡を備えたＧｅｎ５ソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／）を用いて実施した。
画像を、幅６０μｍのローリングボールバックグラウンド除去アルゴリズムを使用して前処理した。バックグラウンド強度を大幅に超えるＧＦＰ強度を持つ細胞をしきい値処理し、ＧＦＰ陽性細胞には小さすぎるか、または大きすぎる領域を除外した。同じ分析工程をＲＦＰチャネルに適用した。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを投与されたレシピエント細胞）の数をＧＦＰ陽性細胞（送達を示さなかったレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、レシピエント細胞とのフソソーム融合の量を示す、ＲＦＰ変換のパーセンテージを定量化した。
このアッセイでは、表面にＮｉｖＧ＋Ｆを発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームは、リソソーム非依存性経路を介した有意な送達を示し、これは、エンドサイトーシスを介した取込みを阻害するためにレシピエント細胞をＢａｆで同時処理した場合でも、ＮｉｖＧ＋ＦフソソームによるＣｒｅカーゴの有意な送達によって証明されるように、非エンドサイトーシス経路を介した侵入と一致している（下記の表２７）。この場合、Ｂａｆ同時処理によるカーゴ送達の抑制は２３．４％であった。
Figure 2022513040000138
実施例１２６：標的細胞との融合を測定する
麻疹ウイルス（ＭｖＨ）の操作されたヘマグルチニン糖タンパク質および融合タンパク質（Ｆ）を細胞表面に発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームを、本明細書に記載されるように生成した。ＭｖＨは、その天然の受容体結合が除去され、細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を介して標的細胞の特異性が提供されるように操作されており、この場合、ｓｃＦｖは、Ｔ細胞受容体に対する供受容体、ＣＤ８を標的とするように設計されている。表面にフソゲンＶＳＶ－Ｇを発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来する対照フソソームを使用した。標的細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作されると共に、共受容体ＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂを過剰発現するように操作されたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞であった。非標的細胞は、「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現しているがＣＤ８ａ／ｂの過剰発現がない同じＨＥＫ－２９３Ｔ細胞であった。標的または非標的レシピエント細胞を、３０，０００細胞／ウェルで黒色の透明底９６ウェルプレートにプレーティングし、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地中、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。レシピエント細胞をプレーティングしてから４～６時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するフソソームおよびＭｖＨ＋Ｆを、ＤＭＥＭ培地中の標的または非標的レシピエント細胞に適用した。レシピエント細胞を１０μｇのフソソームで処理し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して細胞プレートを画像化した。所与のウェルの総細胞集団は、ＤＭＥＭ培地中のＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で１０分間細胞を染色することによって決定された。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡにインターカレートすることで細胞核を染色するため、個々の細胞を同定するために使用される。Ｈｏｅｃｈｓｔを、４０５ｎｍ ＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化した。ＧＦＰを、４６５ｎｍ ＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化し、ＲＦＰを５２３ｎｍ ＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化した。標的細胞および非標的細胞のウェルの画像を、最初に陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって取得した。
取得設定を、Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＲＦＰ、およびＧＦＰの強度が最大ピクセル強度値になるが、飽和しないように設定する。次いで、確立された設定を使用して、対象のウェルを画像化した。Ｈｏｅｃｈｓｔチャネルにオートフォーカスした後、ＧＦＰおよびＲＦＰチャネルに確立された焦点面を使用することにより、各ウェルにフォーカスを設定した。ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡を備えたＧｅｎ５ソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／）を用いて実施した。
画像を、幅６０μｍのローリングボールバックグラウンド除去アルゴリズムを使用して前処理した。バックグラウンド強度を大幅に超えるＧＦＰ強度を持つ細胞をしきい値処理し、ＧＦＰ陽性細胞には小さすぎるか、または大きすぎる領域を除外した。同じ分析工程をＲＦＰチャネルに適用した。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを投与されたレシピエント細胞）の数をＧＦＰ陽性細胞（送達を示さなかったレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、標的および批評的レシピエント細胞集団とのフソソーム融合の量を説明する、パーセントＲＦＰ変換を定量化した。標的融合（標的レシピエント細胞へのフソソーム融合）の量について、パーセントＲＦＰ変換値は、標的レシピエント細胞である（すなわち、ＣＤ８を発現する）レシピエント細胞のパーセンテージに正規化され、これは、フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートされた抗ＣＤ８抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析することによって評価された。最後に、標的融合の絶対量を、標的細胞融合量から非標的細胞融合の量を差し引くことによって決定した（０未満の任意の値は０であると見なした）。
このアッセイでは、操作されたＭｖＨ（ＣＤ８）＋Ｆを表面に発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームは、レシピエント細胞が、「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現する標的ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の場合、２５．２＋／－６．４％のＲＦＰ変換率を示し、これらのレシピエント細胞の５１．１％がＣＤ８陽性であることが観察された。これらの結果から、ＲＦＰ変換の正規化された割合または標的融合の量を、標的融合について４９．３＋／－１２．７％であると決定した。同じフソソームは、レシピエントが「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」を発現しているがＣＤ８を発現していない非標的ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞である場合、０．５＋／－０．１％のＲＦＰ変換割合を示した。上記に基づいて、ＭｖＨ（ＣＤ８）＋Ｆフソソームの標的融合の絶対量は４８．８％であると決定され、対照ＶＳＶ－Ｇフソソームの標的融合の絶対量を０％であると決定した。

Claims (60)

  1. フソソームであって、
    （ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
    （ｂ）前記脂質二重層に囲まれた内腔と、
    （ｃ）前記ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、前記フソゲンが、前記脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
    （ｄ）標的細胞の核に送達するための核ペイロード剤と、を含む、フソソーム。
  2. 前記核ペイロード剤が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を有するタンパク質を含むか、またはコードし、前記ＮＬＳが、前記タンパク質の天然に存在する対応物中のＮＬＳと同じである、請求項１に記載のフソソーム。
  3. 前記核タンパク質ペイロード剤が、ＮＬＳを有するタンパク質を含むか、またはコードし、前記ＮＬＳが、前記タンパク質の天然に存在する対応物によって含まれない、請求項１に記載のフソソーム。
  4. 前記核タンパク質ペイロード剤が、配列番号１２８～５０７および６０５～６２６のうちのいずれか１つに記載の核局在化シグナルを含む、請求項１～３のいずれかに記載のフソソーム。
  5. ｉ）標的細胞が複数の前記フソソームと接触すると、前記核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、前記標的細胞の核において、前記標的細胞の細胞質中の前記核タンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高いレベルで存在するようになり、
    ｉｉ）標的細胞の集団が複数の前記フソソームと接触すると、前記核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、前記標的細胞の集団中の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の細胞の核において豊富化され、
    ｉｉｉ）標的細胞の集団が複数の前記フソソームと接触すると、前記核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、前記標的細胞の集団のレシピエント細胞集団である亜集団に存在するようになり、前記核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、前記レシピエント細胞集団中の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の細胞の核において豊富化され、かつ／あるいは
    ｉｖ）前記核タンパク質ペイロード剤、または核酸核タンパク質ペイロード剤によってコードされるタンパク質の少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１，０００コピーが、標的細胞中の核内に存在する、請求項１～４のいずれかに記載のフソソーム。
  6. 前記核ペイロード剤が、転写活性化因子、転写抑制因子、エピジェネティック修飾因子、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡニッカーゼ、部位特異的ＤＮＡ編集酵素、任意にデアミナーゼ、ＤＮＡトランスポサーゼ、ＤＮＡインテグラーゼ、ＲＮＡエディター、ＲＮＡスプライシング因子、またはＰＩＷＩタンパク質のうちの１つ以上を含むか、またはコードする、請求項１～５のいずれかに記載のフソソーム。
  7. 前記核ペイロード剤が、転写因子、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、エピジェネティック因子、転写後ＲＮＡ修飾因子、非コードＲＮＡもしくはリボ核酸タンパク質、または構造タンパク質を含むか、またはコードする、請求項１～６のいずれかに記載のフソソーム。
  8. 前記核ペイロード剤が、抗体分子、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｓｄＡｂ、デュオボディ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、ザイボディ、ラクダ抗体、ＢｉＴＥ、クアドローマ、またはｂｓＤｂを含むか、またはコードする、請求項１～５のいずれかに記載のフソソーム。
  9. 前記核タンパク質ペイロード剤が、エフェクタードメインおよび局在化ドメインを含む融合タンパク質を含むか、またはコードする、請求項１～６のいずれかに記載のフソソーム。
  10. 前記局在化ドメインが、ＴＡＬドメイン、ジンクフィンガードメイン、Ｃａｓ９ドメイン、またはメガヌクレアーゼドメインを含む、請求項９に記載のフソソーム。
  11. 前記エフェクタードメインが、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、塩基エディター（デアミナーゼ）、転写因子、またはエピジェネティック修飾因子を含む、請求項９または請求項１０に記載のフソソーム。
  12. 前記核ペイロード剤が、遺伝子編集タンパク質または核酸、任意にＣａｓ９またはガイドＲＮＡを含むか、またはコードする、請求項１～６のいずれかに記載のフソソーム。
  13. 前記核ペイロード剤が、機能性ＲＮＡを含む、請求項１～６のいずれかに記載のフソソーム。
  14. 前記核ペイロード剤が、（ｉ）核酸、および（ｉｉ）前記核酸の核移入を促進するタンパク質を含む、請求項１～６のいずれかに記載のフソソーム。
  15. 前記核酸が、結合部位を含み、核移入を促進する前記タンパク質が、前記結合部位に結合する、請求項１４に記載のフソソーム。
  16. 前記結合部位が、ＴｅｔＲ結合部位を含み、前記タンパク質が、ＴｅｔＲを含む、請求項１５に記載のフソソーム。
  17. 前記核ペイロード剤が、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメインであって、任意に、ＴＡＬドメイン、ＺＦドメイン、またはＣａｓ９ドメインである、ＤＮＡ結合ドメイン、および（ｉｉ）転写活性化因子ドメインまたは転写抑制因子ドメインを含む融合タンパク質である合成転写因子を含む、請求項１～６のいずれかに記載のフソソーム。
  18. 前記核ペイロード剤が、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメインおよび（ｉｉ）エピジェネティック修飾因子ドメインを含む融合タンパク質である合成エピジェネティック修飾因子を含む、請求項１～６のいずれかに記載のフソソーム。
  19. 前記核タンパク質ペイロード剤が、フィブリラリン；ＫＲＩ１ホモログ；核小体タンパク質１１；上流結合転写因子；ＥＢＮＡ１結合タンパク質２；コイリン；前骨髄球性白血病；ＰＲＭＴ１のクロマチン標的；ＴＥＲＦ１相互作用核因子２；ＡＢＬ癌原遺伝子１；非受容体チロシンキナーゼ；ラミンＢ１；セントロメアタンパク質Ｂ；Ｈ１ヒストンファミリーメンバー０；動原体足場１；ＲＢ結合タンパク質７；クロマチンリモデリング因子；シグナル伝達物質および転写の活性化因子３；フォークヘッドボックスＰ３；肝細胞核因子４α；ｒｕｎｔ関連転写因子１；リンパ系エンハンサー結合因子１；フォークヘッドボックスＰ１；ｃｕｔ様ホメオボックス２；ＰＯＵクラス２ホメオボックス１；ＳＩＸホメオボックス３；ＲＥＬＡ癌原遺伝子、ＮＦ－ｋＢサブユニット；ＳＷＩ／ＳＮＦ関連、マトリックス関連、アクチン依存性のクロマチン調節因子、サブファミリーｂ、メンバー１；クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質７；クロマチンアクセシビリティ複合体サブユニット１；ＡＰＯＢＥＣ１補完因子；ブロモドメイン含有４；Ｇｌｕ／Ａｓｐリッチカルボキシ末端ドメイン１を有するＣｂｐ／ｐ３００相互作用トランスアクチβー；リジンアセチルトランスフェラーゼ２Ａ；ヒストンアセチルトランスフェラーゼ１；ＴＡＴＡ－ボックス結合タンパク質関連因子５様；リジンアセチルトランスフェラーゼ５；サーチュイン１；サーチュイン２；ヒストンデアセチラーゼ１１；ヒストンデアセチラーゼ３；ヒストンデアセチラーゼ６；ＡＳＨ１様ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；ＤＯＴ１様ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；核内受容体結合ＳＥＴドメインタンパク質１；ＳＥＴ核癌原遺伝子；リジンメチルトランスフェラーゼ２Ａ；リジンデメチラーゼ２Ａ；リジンデメチラーゼ１Ａ；リジンデメチラーゼ３Ａ；リジンデメチラーゼ４Ｂ；リジンデメチラーゼ５Ｃ；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３α；アデノシンデアミナーゼ２；アデノシンデアミナーゼ、ＲＮＡ特異的；アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒サブユニット１；スプライセオソーム関連因子３、Ｕ４／Ｕ６リサイクリングタンパク質；サイクリン依存性キナーゼ１９；サイクリンＬ１；ｐｒｅ－ｍＲＮＡプロセッシング因子３１；スプライシング因子３ａサブユニット３；ＤＮＡ損傷チェックポイント１のメディエーター；ＡＴＭセリン／スレオニンキナーゼ；ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ１；ＤＮＡトポイソメラーゼＩ；またはＤＮＡリガーゼ４から選択されるタンパク質であるか、またはそれを含む、請求項１～６のいずれかに記載のフソソーム。
  20. フソソームであって、
    （ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
    （ｂ）前記脂質二重層に囲まれた内腔であって、前記内腔がオルガネラを含まない、内腔と、
    （ｃ）前記ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、前記フソゲンが、前記脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
    （ｄ）標的細胞の細胞質オルガネラに送達するためのオルガネラペイロード剤と、を含み、標的細胞が複数の前記フソソームと接触すると、前記オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドが、前記標的細胞のシオゾル（ｃｙｏｓｏｌ）または原形質膜に対して、前記標的細胞のゴルジ装置、小胞体、液胞、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロメノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、またはストレス顆粒のうちの１つ以上において豊富化される、フソソーム。
  21. 前記オルガネラペイロード剤が、前記タンパク質の天然に存在する対応物中のシグナル配列と同じシグナル配列を有するタンパク質を含むか、またはコードする、請求項２０に記載のフソソーム。
  22. 前記オルガネラペイロード剤が、前記タンパク質の天然に存在する対応物によって含まれないシグナル配列を有するタンパク質を含むか、またはコードする、請求項２０に記載のフソソーム。
  23. フソソームであって、
    （ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
    （ｂ）前記脂質二重層に囲まれた内腔と、
    （ｃ）前記ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、前記フソゲンが、前記脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
    （ｄ）標的細胞の細胞質オルガネラにおいてオルガネラペイロード剤を豊富化するのに十分な前記オルガネラペイロード剤に対する異種シグナル配列を含むか、またはコード化する、オルガネラペイロード剤と、を含む、フソソーム。
  24. 前記細胞質オルガネラが、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、またはストレス顆粒から選択される、請求項２３に記載のフソソーム。
  25. 前記異種シグナル配列が、配列番号３９～１２７および６０５～６２６のいずれか１つに記載されている、請求項２０～２４のいずれかに記載のフソソーム。
  26. 標的細胞が複数の前記フソソームと接触すると、前記オルガネラペイロード剤が、前記標的細胞のシオゾル（ｃｙｏｓｏｌ）または原形質膜に対して、前記標的細胞のゴルジ装置、小胞体、液胞、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、またはストレス顆粒のうちの１つ以上において豊富化される、請求項２０～２５のいずれかに記載のフソソーム。
  27. 前記細胞質オルガネラが、分泌経路オルガネラであり、前記異種シグナル配列が、配列番号１０８～１２０のうちのいずれか１つに記載されている、請求項２０～２６のいずれかに記載のフソソーム。
  28. 前記細胞質オルガネラが、小胞体であり、前記異種シグナル配列が、配列番号７２～９３および１２１～１２７のうちのいずれか１つに記載されている、請求項２０～２６のいずれかに記載のフソソーム。
  29. 前記細胞質オルガネラが、ゴルジ装置であり、前記異種シグナル配列が、配列番号９４～１０７および６０９～６１０のうちのいずれか１つに記載されている、請求項２０～２６のいずれかに記載のフソソーム。
  30. 標的細胞が複数の前記フソソームと接触すると、前記コードされたポリペプチドが、前記標的細胞の細胞質ゾルまたは原形質膜に対して、前記リソソームおよび／またはエンドソームにおいて豊富化される、請求項２３～２５のいずれかに記載のフソソーム。
  31. 前記細胞質オルガネラが、リソソームであり、前記異種シグナル配列が、配列番号３９～７１および６０５～６０８のうちのいずれか１つに記載されている、請求項２３～２５、および３０のいずれかに記載のフソソーム。
  32. 前記オルガネラペイロード剤が、前記標的細胞のミトコンドリアにおいて、前記細胞質または前記標的細胞原形質膜中の前記オルガネラペイロード剤のレベルよりも少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高いレベルで豊富化される、請求項２３～２５のいずれかに記載のフソソーム。
  33. 前記オルガネラペイロード剤が、ミトコンドリア膜タンパク質、ミトコンドリア外膜タンパク質、ミトコンドリア内膜タンパク質、ミトコンドリア内境界膜タンパク質、ミトコンドリア結晶膜タンパク質、ミトコンドリアＤＮＡタンパク質、ミトコンドリア膜間腔タンパク質、ミトコンドリアマトリックスタンパク質、ミトコンドリアマトリックス顆粒タンパク質、ミトコンドリアクリステタンパク質、ミトコンドリアリボソームタンパク質、ミトコンドリア結晶内タンパク質、ミトコンドリア末梢空間タンパク質、ペルオキシソーム膜タンパク質、ペルオキシソーム晶質コアタンパク質、ペルオキシソームマトリックスタンパク質、ペルオキシンから選択されるポリペプチドを含むか、またはコードする、請求項２０～３２のいずれかに記載のフソソーム。
  34. 前記オルガネラペイロード剤が、
    ｖｉｉｉ）代謝タンパク質、
    ｉｘ）プロテアーゼ、
    ｘ）シャペロン、
    ｘｉ）タンパク質輸送タンパク質、
    ｘｉｉ）ミトコンドリアリボソームタンパク質、
    ｘｉｉｉ）ミトコンドリア転写タンパク質、または
    ｘｉｖ）ミトコンドリア複製タンパク質から選択されるポリペプチドを含むか、またはコードする、請求項２０～３３のいずれかに記載のフソソーム。
  35. 前記オルガネラペイロード剤が、Ｂ細胞受容体関連タンパク質３１；カルネキシン；ＫＤＥＬ小胞体タンパク質保持受容体３；レチクロン４；Ｓｅｃ６１トランスロコンα１サブユニット；筋形質／小胞体カルシウムＡＴＰａｓｅ １；Ｄｅｒｌｉｎ－２；ストレス関連小胞体タンパク質２；Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃａｌｂｉｎ－２；アトラスチン－３；シトクロムｃ、体細胞；ミトコンドリア内膜のトランスロカーゼ４４；ミトコンドリア外膜のトランスロカーゼ４０；電位依存性アニオンチャネル２；補酵素Ｑ８Ｂ；アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ミトコンドリア；クエン酸合成酵素、ミトコンドリア；シトクロムｃオキシダーゼサブユニット７Ａ関連タンパク質、ミトコンドリア；フマル酸ヒドラターゼ、ミトコンドリア；ＮＡＤＰＨ：アドレノドキシンオキシドレダクターゼ、ミトコンドリア；骨髄性白血病細胞分化誘導タンパク質Ｍｃｌ－１；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１αサブコンプレックスサブユニット１３；転写因子Ａ、ミトコンドリア；脂肪アシル－ＣｏＡレダクターゼ１；アセチル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ１；ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー３；ヒドロキシステロイド１７－βデヒドロゲナーゼ４；ペルオキシソーム生合成因子１４；非特異的脂質転移タンパク質；ペルオキシソーム生合成因子１９；エノイル－ＣｏＡδイソメラーゼ２；アシル－ＣｏＡ結合ドメイン含有タンパク質５；ｇｏｌｇｉｎ Ａ１；ゴルジ膜内在性タンパク質４；ゴルジ関連ＰＤＺおよびコイルドコイルモチーフ含有；トランス－ゴルジネットワーク小胞タンパク質２３ホモログＣ；７を含有するジンクフィンガーＤＨＨＣ型；コートマーサブユニットδ；ＢＳＤドメイン含有タンパク質１；血小板糖タンパク質４；保存されたオリゴマーゴルジ複合体サブユニット７；コートマーサブユニットε；タンパク質ＦＡＭ３Ｃ；α－（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ；一般的な小胞輸送因子ｐ１１５；膜貫通タンパク質１６５；液胞タンパク質選別関連タンパク質５４；タンパク質ＹＩＰＦ３；Ｆａｓ関連因子ファミリーメンバー２；リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ２；ＮＡＤ（Ｐ）依存性ステロイドデヒドロゲナーゼ様；ペリリピン３；２を含有するパタチン様ホスホリパーゼドメイン；カドヘリン４；カテニンβ１；上皮成長因子受容体；エズリン；シンタキシン４；ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２；Ｃａｓｋｉｎ－２；ジャンクションプラコグロビン；神経細胞接着分子１；パネキシン－１；溶質担体ファミリー２、促進されたグルコーストランスポーターメンバー１；ストマチン様タンパク質３；ＦＵＳ ＲＮＡ結合タンパク質；ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質；ＴＡＴＡ－ボックス結合タンパク質関連因子１５；ＥＷＳ ＲＮＡ結合タンパク質１；ＤＥＡＤ－ボックスヘリカーゼ４；ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３；異種核リボヌクレオプロテインＡ１；異種核リボ核タンパク質Ａ２／Ｂ１；Ｎｕｃｌｅｏｌｙｓｉｎ ＴＩＡ－１アイソフォームｐ４０；中心体タンパク質１６４；２を含有するダブルコルチンドメイン；ケラチン８；ミオシン重鎖１０；アクチンベット；コイルドコイルドメイン含有タンパク質１４；ケラチン、Ｉ型細胞骨格１８；ペリセントリン；チューブリンα－１Ａ鎖；またはアクチン、α骨格筋から選択されるタンパク質を含む、請求項２０～３４のいずれかに記載のフソソーム。
  36. 前記オルガネラペイロード剤が、抗体分子、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦＶ、ｓｃＦａｂ、ｓｄＡｂ、デュオボディ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、ザイボディ、ラクダ抗体、ＢｉＴＥ、クアドローマ、またはｂｓＤｂを含むか、またはコードする、請求項２０～３４のいずれかに記載のフソソーム。
  37. 前記オルガネラペイロード剤が、機能性ＲＮＡを含む、請求項２０～３４のいずれかに記載のフソソーム。
  38. 標的細胞の集団が複数の前記フソソームと接触すると、前記オルガネラペイロード剤が、前記標的細胞の集団における少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の細胞の前記細胞質オルガネラにおいて豊富化される、請求項２０～３７のいずれかに記載のフソソーム。
  39. 前記ソース細胞が、初代細胞、培養細胞、不死化細胞、または細胞株であり、任意に前記細胞株が、アミエロバスト（ａｍｙｅｌｏｂａｓｔ）細胞株、任意にＣ２Ｃ１２である、請求項１～３８のいずれかに記載のフソソーム。
  40. 前記ソース細胞が、内皮細胞、線維芽球、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児の皮膚、青年期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織からの幹細胞）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆細胞（例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球）、前駆細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ９０、ＩＭＲ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、もしくはＢＪ細胞）である、請求項１～３９のいずれかに記載のフソソーム。
  41. 前記ソース細胞が、同種異系である、例えば、前記標的細胞と同じ種の異なる生物から得られる、請求項１～４０のいずれかに記載のフソソーム。
  42. 前記ソース細胞が、自己由来である、例えば、前記標的細胞と同じ生物から得られる、請求項１～４０のいずれかに記載のフソソーム。
  43. 前記ソース細胞が、白血球または幹細胞から選択される、請求項１～４２のいずれかに記載のフソソーム。
  44. 前記ソース細胞が、好中球、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）、マクロファージ、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または骨髄芽球から選択される、請求項１～４３のいずれかに記載のフソソーム。
  45. 前記フソソームが、任意に、ＭＨＣ複合体を除去するためのゲノム編集によって、免疫原性の低下を示す修飾されたゲノムを有するソース細胞に由来する、請求項１～４４のいずれかに記載のフソソーム。
  46. 前記フソソームが、前記ソース細胞の直径の約０．０１％または１％未満の直径を有する、請求項１～４５のいずれかに記載のフソソーム。
  47. 前記フソゲンが、哺乳動物フソゲンまたはウイルスフソゲンである、請求項１～４６のいずれかに記載のフソソーム。
  48. 前記フソゲンが、ｐＨ６～８で活性である、請求項１～４７のいずれかに記載のフソソーム。
  49. 前記フソソームが、前記フソソームを標的細胞に局在化させる標的化ドメインを含む、請求項のいずれかに記載のフソソーム。
  50. 前記標的化ドメインが、前記標的細胞上の標的細胞部分と相互作用する、請求項４９に記載のフソソーム。
  51. 前記標的細胞が、生物内にある、請求項１～５０のいずれか一項に記載のフソソーム。
  52. 前記標的細胞が、生物から単離された初代細胞である、請求項１～５０のいずれか一項に記載のフソソーム。
  53. 前記標的細胞が、内皮細胞、線維芽球、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児の皮膚、青年期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織からの幹細胞）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆細胞（例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球）、前駆細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ９０、ＩＭＲ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、もしくはＢＪ細胞）から選択される、請求項１～５２のいずれか一項に記載のフソソーム。
  54. 請求項１～５３のいずれかに記載のフソソームを含む、薬学的組成物。
  55. フソソーム組成物を製造する方法であって、
    ｉ）請求項１～５３のいずれかに記載の複数のフソソームを提供することと、
    ｉｉ）前記複数のフソソーム、フソソーム組成物、または薬学的組成物を、例えば、被験体への投与に適したフソソーム製剤として製剤化することと、を含む、方法。
  56. フソソーム組成物を被験体に投与する方法であって、請求項１～５３のいずれかに記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物を前記被験体に投与することによって、前記フソソーム組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
  57. タンパク質膜ペイロードを被験体に送達する方法であって、請求項１～５３のいずれかに記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物を前記被験体に投与することを含み、前記フソソーム組成物が、前記タンパク質ペイロード遺伝子が送達されるような量および／または時間で投与される、方法。
  58. 患者における疾患または障害を治療する方法であって、請求項１～５３のいずれかに記載の複数のフソソームを前記被験体に投与することを含み、前記フソソーム組成物が、前記疾患または障害が治療されるような量および／または時間で投与される、方法。
  59. 前記疾患または障害が、癌、自己免疫障害、または感染症から選択される、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記被験体が、ヒト被験体である、請求項５６～５９のいずれかに記載の方法。

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