JP2022513040A - コンパートメント特異的カーゴ送達のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年11月14日に出願された「COMPOSITIONS AND METHODS FOR COMPARTMENT-SPECIFIC CARGO DELIVERY」と題された米国仮出願第62/767,394号の優先権を主張し、その内容は全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表と共に提出されている。配列表は、2019年11月14日に作成された186152002641SEQLIST.TXTと題されたファイルとして提供され、サイズは807キロバイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により組み込まれる。
膜送達
1.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)膜タンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する)であって、
i)キメラ抗原受容体、
ii)例えば、表7から選択されるインテグリン膜タンパク質ペイロード、
iii)表8から選択されるイオンチャネルタンパク質、
iv)例えば、表9および10から選択される孔形成タンパク質、
v)例えば、表11から選択されるToll様受容体、
vi)例えば、表12から選択されるインターロイキン受容体ペイロード、
vii)表13~14から選択される細胞接着タンパク質、
viii)表17から選択される輸送タンパク質、
ix)天然に存在する膜タンパク質に対して異種であるシグナル配列、もしくは
x)表6に列挙されているシグナル配列のうちの1つ以上を含むか、またはコードする膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
2.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)T細胞受容体を含むか、またはコードする膜タンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する)と、を含み、
任意に、フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
3.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する膜タンパク質ペイロード剤と、
を含み、
i)フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれに含まれる、
ii)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、例えば、フソソームあたり少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、
iii)フソソームが、例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、例えば、フソソームあたり少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下のコピー数で治療薬を含む、
iv)フソソームが、CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGのうちの1つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの75%以内である脂質を含む、
v)フソソームが、例えば、実施例42のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
vi)フソソームが、例えば、実施例63のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも10%多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したAKTリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)の取込みが可能である、
vii)フソソームが、被験体、例えばマウスに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば実施例87または100のアッセイにより、例えば投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも0.1%または10%が、24時間後に標的組織内に存在する、あるいは
viii)ソース細胞が、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、のうちの1つ以上である、フソソーム。
4.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)膜タンパク質ペイロード剤であって、
i)膜タンパク質をコードするDNAを含む、または
ii)ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現する膜タンパク質をコードするRNA、例えばmRNAを含む、膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
5.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)哺乳動物のフソゲンが、アルツハイマー病のβアミロイドペプチドまたはフェルチリンではない、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する非ウイルス性、例えば、哺乳動物のフソゲンと、
(d)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
任意に、フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
6.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
フソソームが、除核細胞を含み、
任意に、フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
i)フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれに含まれる、
ii)フソソームが、除核細胞を含む、
iii)フソソームが、不活化核を含む、
iv)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%高い割合で融合する、
v)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的フソソームとよりも標的細胞と、例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%高い割合で融合する、
vi)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の膜タンパク質ペイロード剤が、24、48、または72時間後に、標的細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
vii)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、
viii)フソソームが、例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下のコピー数で膜タンパク質ペイロード剤を含む、
ix)フソゲンのコピー数と膜タンパク質ペイロード剤のコピー数との比が、1,000,000:1~100,000:1、100,000:1~10,000:1、10,000:1~1,000:1、1,000:1~100:1、100:1~50:1、50:1~20:1、20:1~10:1、10:1~5:1、5:1~2:1、2:1~1:1、1:1~1:2、1:2~1:5、1:5~1:10、1:10~1:20、1:20~1:50、1:50~1:100、1:100~1:1,000、1:1,000~1:10,000、1:10,000~1:100,000、または1:100,000~1:1,000,000の間である、
x)フソソームが、ソース細胞のそれと実質的に同様の脂質組成物を含むか、またはCL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGのうちの1つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、または75%以内である、
xi)フソソームが、例えば、実施例42のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
xii)フソソームが、例えば、実施例49のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質とタンパク質との比率を含む、
xiii)フソソームが、例えば、実施例50のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内であるタンパク質と核酸(例えば、DNA)との比率を含む、
xiv)フソソームが、例えば、実施例51のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質と核酸(例えば、DNA)との比率を含む、
xv)フソソームが、被験体、例えば、マウスにおいて、例えば、実施例75のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%以内の半減期を有する、
xvi)フソソームが、例えば、実施例64のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%多く、グルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)を膜を横切って輸送する、
xvii)フソソームが、例えば、実施例66のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
xviii)フソソームが、例えば、実施例68に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性(例えば、クエン酸合成酵素活性)の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内の代謝活性(例えば、クエン酸合成酵素活性)レベルを含む、
xix)フソソームが、例えば、実施例69に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベル(例えば、酸素消費率)の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内の呼吸レベル(例えば、酸素消費率)を含む、
xx)フソソームが、例えば、実施例70のアッセイを使用して、最大で18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、もしくは10,000MFIのアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含む、
xxi)フソソームが、例えば、実施例39のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上のmiRNA含有量レベルを有する、
xxii)フソソームが、例えば、実施例47のアッセイにより、ソース細胞のそれの1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以内、もしくはそれ以上、または例えば、ソース細胞のそれの1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、もしくは80%~90%以内である可溶性:不溶性タンパク質の比率を有する、
xxiii)フソソームが、例えば、実施例48に記載されるような質量分析によって測定した場合、ソース細胞のLPS含有量の5%、1%、0.5%、0.01%、0.005%、0.0001%、0.00001%、またはそれ以下のLPSレベルを有する、
xxiv)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例63のアッセイを使用して、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したAKTリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)の取込みが可能である、
xxv)フソソームが、被験体、例えば哺乳動物、例えば、実験用哺乳動物(例えば、マウス)、飼育動物(例えば、ペットもしくは家畜)、またはヒトに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば、実施例87または100のアッセイにより、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%が、24、48、または72時間後に標的組織内に存在する、
xxvi)フソソームが、例えば、実施例71のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞(BMSC)によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
xxvii)フソソームが、例えば、実施例72のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
xxviii)フソソームが、例えば、実施例73のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはC2C12細胞における重合アクチンのレベルと比較して、1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内のレベルでアクチンを重合する、
xxix)フソソームが、例えば、実施例74のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはC2C12細胞の膜電位の約1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約-20~-150mV、-20~-50mV、-50~-100mV、もしくは-100~-150mVの膜電位を有する、
xxx)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例57のアッセイを使用して、例えば、ソース細胞の血管外漏出の速度の少なくとも1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の速度で、血管からの血管外漏出が可能であり、ソース細胞が、好中球、リンパ球、B細胞、マクロファージ、またはNK細胞である、
xxxi)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、細胞膜、例えば、内皮細胞膜または血液脳関門を通過することができる、
xxxii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例62のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞またはソース細胞よりも、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%大きい割合でタンパク質を分泌することができる、
xxxiii)フソソームが、医薬品または適正製造基準(GMP)基準を満たしている、
xxxiv)フソソームが、適正製造基準(GMP)に従って作製された、
xxxv)本明細書に記載の複数のフソソームを含む医薬製剤が、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、
xxxvi)本明細書に記載の複数のフソソームを含む医薬製剤が、所定の参照値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、汚染物質を実質的に含まない、
xxxvii)本明細書に記載の複数のフソソームを含む医薬製剤が、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
xxxviii)ソース細胞が、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、あるいは
xxxix)ソース細胞が、293細胞、HEK細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または幹細胞以外のものである、のうちの1つ以上である、フソソーム。
8.フソソームであって、
(a)脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)膜タンパク質ペイロード剤、例えば、ソース細胞に対して外因性の膜タンパク質と、を含み、
フソソームが、ソース細胞に由来し、
フソソームが、部分的または完全な核不活化を有する(例えば、ソース細胞に見られるような無傷の核を欠く、核の除去/除核、機能しない核等)、フソソーム。
9.フソソームであって、
(a)脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)標的細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている(例えば、フソゲンが、ソース細胞に対して内因性または外因性である)フソゲンと、
(d)膜タンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する)であって、
i)キメラ抗原受容体を含むか、またはコードする、
ii)例えば、表7から選択されるインテグリン膜タンパク質ペイロードを含むか、またはコードする、
iii)表8から選択されるイオンチャネルタンパク質を含むか、またはコードする、
iv)例えば、表9および10から選択される孔形成タンパク質を含むか、またはコードする、
v)例えば、表11から選択されるToll様受容体を含むか、またはコードする、
vi)例えば、表12から選択されるインターロイキン受容体ペイロードを含むか、またはコードする、
vii)表13~14から選択される細胞接着タンパク質を含むか、またはコードする、
viii)表17から選択される輸送タンパク質を含むか、またはコードする、
ix)天然に存在する膜タンパク質に対して異種であるシグナル配列を含むか、またはコードする、
x)表6に列挙されているシグナル配列を含むか、またはコードする、膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
フソソームが、ウイルスカプシドまたはウイルスエンベロープタンパク質を含まない、フソソーム。
10.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)膜タンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する)であって、
i)脂質アンカータンパク質、
ii)膜貫通タンパク質に結合する細胞外タンパク質、
iii)膜貫通ドメインを欠く細胞外タンパク質、
iv)膜に部分的に及ぶタンパク質(例えば、標的細胞もしくはフソソームの膜)、および膜に完全には及ばないタンパク質(例えば、タンパク質が、面内膜ヘリックスを含むか、もしくはタンパク質が、膜に完全には及ばない疎水性ループを含む)のうちの1つ以上を含むか、または
v)タンパク質が、膜貫通ドメインを含まず、タンパク質が、例えば、静電相互作用もしくはイオン相互作用を介して、膜表面と相互作用する、膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
フソソームが、ウイルス構造タンパク質、例えば、ウイルスカプシドタンパク質またはウイルスエンベロープタンパク質を含まない、フソソーム。
11.フソソームであって、
(a)脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるフソゲンまたは過剰発現したフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)膜タンパク質ペイロード剤と、
(e)機能核と、を含み、
フソソームが、ソース細胞に由来する、フソソーム。
12.複数のフソソームが、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下で標的細胞集団と接触した場合、およびエンドサイトーシスの阻害剤で処理されていない参照標的細胞集団と接触した場合、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団中の細胞数の少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、または80%にカーゴを送達する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
13.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
(i)複数のフソソームが標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触する場合、カーゴが、標的細胞において非標的細胞よりも少なくとも2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、もしくは100倍多く存在する、または
(ii)複数のフソソームが、非標的細胞よりも標的細胞と少なくとも50%高い割合で融合する、フソソーム。
14.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数で存在する、または
ii)フソゲンのコピー数と膜タンパク質ペイロード剤のコピー数との比が、1,000,000:1~100,000:1、100,000:1~10,000:1、10,000:1~1,000:1、1,000:1~100:1、100:1~50:1、50:1~20:1、20:1~10:1、10:1~5:1、5:1~2:1、2:1~1:1、1:1~1:2、1:2~1:5、1:5~1:10、1:10~1:20、1:20~1:50、1:50~1:100、1:100~1:1,000、1:1,000~1:10,000、1:10,000~1:100,000、または1:100,000~1:1,000,000の間である、フソソーム。
15.フソソームが、例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数で膜タンパク質ペイロード剤を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
16.膜タンパク質ペイロード剤が、フソソーム脂質二重層内に配置された膜タンパク質である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
17.膜タンパク質ペイロード剤が、膜タンパク質をコードする、フソソーム内腔に配置された核酸である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
18.核酸が、RNAであるか、またはそれを含む、実施形態17に記載のフソソーム。
19.RNAが、pre-mRNAもしくはmRNAであるか、またはそれを含む、実施形態18に記載のフソソーム。
20.核酸が、DNAであるか、またはそれを含む、実施形態17に記載のフソソーム。
21.DNAが、gDNAもしくはcDNAであるか、またはそれを含む、実施形態20に記載のフソソーム。
22.核酸が、1つ以上のシグナル配列をコードする1つ以上の配列を更に含み、例えば、標的細胞が、シグナル配列を含むタンパク質を標的細胞の細胞膜に転位させる、実施形態17~21のいずれかに記載のフソソーム。
23.1つ以上のシグナル配列が、表6から選択される配列であるか、またはそれを含む、実施形態22に記載のフソソーム。
24.核酸が、標的細胞による膜タンパク質をコードする配列の発現を指示する1つ以上の調節エレメントを含む、実施形態17~23のいずれかに記載のフソソーム。
25.膜タンパク質ペイロード剤が、米国特許公開第2016/0289674号の配列番号8144~16131の配列であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
26.膜タンパク質ペイロード剤が、米国特許公開第2016/0289674号の配列番号8144~16131の配列のフラグメント、バリアント、もしくはホモログであるか、またはそれを含む、実施形態1~24のいずれかに記載のフソソーム。
27.膜タンパク質ペイロード剤が、米国特許公開第2016/0289674号の配列番号8144~16131の配列を含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、実施形態1~24のいずれかに記載のフソソーム。
28.膜タンパク質ペイロード剤が、米国特許公開第2016/0289674号の配列番号8144~16131の配列のフラグメント、バリアント、もしくはホモログを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、実施形態1~24のいずれかに記載のフソソーム。
29.膜タンパク質ペイロード剤が、表7~17から選択されるタンパク質であるか、またはそれを含む、実施形態1~24のいずれかに記載のフソソーム。
30.膜タンパク質ペイロード剤が、表7~17から選択されるタンパク質のフラグメント、バリアント、もしくはホモログであるか、またはそれを含む、実施形態1~24のいずれかに記載のフソソーム。
31.膜タンパク質ペイロード剤が、表7~17から選択されるタンパク質であるか、またはそれを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、実施形態1~24のいずれかに記載のフソソーム。
32.膜タンパク質ペイロード剤が、表7~17から選択されるタンパク質のフラグメント、バリアント、もしくはホモログを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、実施形態1~24のいずれかに記載のフソソーム。
33.膜タンパク質ペイロード剤が、抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)であるか、またはそれを含む、実施形態1~24のいずれかに記載のフソソーム。
34.CARが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む第一世代のCARであるか、またはそれを含む、実施形態33に記載のフソソーム。
35.CARが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および2つのシグナル伝達ドメインを含む第二世代のCARであるか、またはそれを含む、実施形態33に記載のフソソーム。
36.CARが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも3つのシグナル伝達ドメインを含む第三世代のCARであるか、またはそれを含む、実施形態33に記載のフソソーム。
37.CARが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、3つまたは4つのシグナル伝達ドメイン、およびCARのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む第四世代のCARであるか、またはそれを含む、実施形態33に記載のフソソーム。
38.抗原結合ドメインが、scFvもしくはFabであるか、またはそれを含む、実施形態33~37のいずれかに記載のフソソーム。
39.抗原結合ドメインが、新生物細胞に特徴的な抗原を標的とする、実施形態33~38のいずれかに記載のフソソーム。
40.新生物細胞に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Gタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン/スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、表皮成長因子受容体(EGFR)(ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3、およびErbB4/HER4を含む)、線維芽細胞成長因子受容体(FGFR)(FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18、およびFGF21を含む)血管内皮成長因子受容体(VEGFR)(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、およびPIGFを含む)、RET受容体およびEph受容体ファミリー(EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、およびEphB6を含む)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、ベストロフィン、TMEM16A、GABA受容体、グリシン受容体、ABCトランスポーター、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、スフィンゴシン-1-リン酸受容体(S1P1R)、NMDAチャネル、膜貫通タンパク質、マルチスパン膜貫通タンパク質、T細胞受容体モチーフ;T細胞α鎖;T細胞β鎖;T細胞γ鎖;T細胞δ鎖;CCR7;CD3;CD4;CD5;CD7;CD8;CD11b;CD11c;CD16;CD19;CD20;CD21;CD22;CD25;CD28;CD34;CD35;CD40;CD45RA;CD45RO;CD52;CD56;CD62L;CD68;CD80;CD95;CD117;CD127;CD133;CD137(4-1BB);CD163;F4/80;IL-4Ra;Sca-1;CTLA-4;GITR;GARP;LAP;グランザイムB;LFA-1;トランスフェリン受容体;NKp46、パーフォリン、CD4+;Th1;Th2;Th17;Th40;Th22;Th9;Tfh、古典的Treg.FoxP3+;Tr1;Th3;Treg17;TREG;CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG-72、炭酸アンヒドラーゼIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド(例えば、CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ2、VEGF、VEGFR1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、テネイシン、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、Smoothened、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR、またはANTXR1、葉酸受容体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、上皮成長因子受容体(EGFR)、メソテリン、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、TnAg、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、インターロイキン-11受容体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板由来成長因子受容体β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、プロスターゼ、PAP、ELF2M、エフリンB2、IGF-1受容体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、テロメラーゼ、フコシルGM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-アセチル-GD2、葉酸受容体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、ポリシアル酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、レグマイン、HPVE6、E7、ETV6-AML、精子タンパク質17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos関連抗原1、p53、p53変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、PCTA-1/ガレクチン8、MelanA/MART1、Ras変異体、hTERT、肉腫転座ブレークポイント、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2、腸内カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新生抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C)CD49f、CD151、CD340、CD200、tkrA、trkB、trkC、あるいはそれらの抗原性フラグメントまたは抗原性部分から選択される、実施形態39に記載のフソソーム。
41.抗原結合ドメインが、T細胞に特徴的な抗原を標的とする、実施形態33~38のいずれかに記載のフソソーム。
42.T細胞に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、膜輸送タンパク質(例えば、イオンチャネルタンパク質、孔形成タンパク質などの能動もしくは受動輸送タンパク質)、膜貫通受容体、膜酵素、および/またはT細胞に特徴的な細胞接着タンパク質から選択される、実施形態41に記載のフソソーム。幾つかの実施形態では、T細胞に特徴的な抗原は、Gタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン/スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、AKT1;AKT2;AKT3;ATF2;BCL10;CALM1;CD3D(CD3δ);CD3E(CD3ε);CD3G(CD3γ);CD4;CD8;CD28;CD45;CD80(B7-1);CD86(B7-2);CD247(CD3ζ);CTLA4(CD152);ELK1;ERK1(MAPK3);ERK2;FOS;FYN;GRAP2(GADS);GRB2;HLA-DRA;HLA-DRB1;HLA-DRB3;HLA-DRB4;HLA-DRB5;HRAS;IKBKA(CHUK);IKBKB;IKBKE;IKBKG(NEMO);IL2;ITPR1;ITK;JUN;KRAS2;LAT;LCK;MAP2K1(MEK1);MAP2K2(MEK2);MAP2K3(MKK3);MAP2K4(MKK4);MAP2K6(MKK6);MAP2K7(MKK7);MAP3K1(MEKK1);MAP3K3;MAP3K4;MAP3K5;MAP3K8;MAP3K14(NIK);MAPK8(JNK1);MAPK9(JNK2);MAPK10(JNK3);MAPK11(p38β);MAPK12(p38γ);MAPK13(p38δ);MAPK14(p38α);NCK;NFAT1;NFAT2;NFKB1;NFKB2;NFKBIA;NRAS;PAK1;PAK2;PAK3;PAK4;PIK3C2B;PIK3C3(VPS34);PIK3CA;PIK3CB;PIK3CD;PIK3R1;PKCA;PKCB;PKCM;PKCQ;PLCY1;PRF1(パーフォリン);PTEN;RAC1;RAF1;RELA;SDF1;SHP2;SLP76;SOS;SRC;TBK1;TCRA;TEC;TRAF6;VAV1;VAV2;またはZAP70であり得る。
43.抗原結合ドメインが、自己免疫または炎症性障害に特徴的な抗原を標的とする、実施形態33~38のいずれかに記載のフソソーム。
44.自己免疫性または炎症性障害が、慢性移植片対宿主病(GVHD)、ループス、関節炎、免疫複合体糸球体腎炎、グッドパスチャー、ブドウ膜炎、肝炎、全身性硬化症または強皮症、I型糖尿病、多発性硬化症、寒冷凝集素疾患、尋常性ペンフィガス、グレイブス病、自己免疫性溶血性貧血、血小板減少症A、原発性シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、神経骨髄性視神経症、エバン症候群、IgM媒介性神経障害、サイログロブリン血症、皮膚筋炎、特発性血小板減少症、強直性脊椎炎、水疱性類天疱瘡、後天性血管浮腫、慢性蕁麻疹、抗リン脂質脱髄性多発神経障害、および自己免疫性血小板減少症または好中球減少症または純粋な赤血球形成不全から選択され、一方、同種免疫疾患の例示的な非限定的な例には、同種感作(例えば、Blazar et al.,2015,Am.J.Transplant,15(4):931-41を参照)または造血器もしくは実質臓器移植からの異種感作、輸血、胎児同種感作を伴う妊娠、新生児同種免疫性血小板減少症、新生児溶血性疾患、酵素またはタンパク質補充療法、血液製品、および遺伝子治療で治療される先天性もしくは後天性欠損障害の置換により起こり得るような外来抗原に対する感作が挙げられる、実施形態43に記載のフソソーム。
45.自己免疫または炎症性障害に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Gタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン/スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体から選択される、実施形態43または実施形態44に記載のフソソーム。幾つかの実施形態では、CAR抗原結合ドメインは、B細胞、形質細胞、形質芽細胞、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、インターフェロン受容体、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5、またはCD2上で発現されるリガンドに結合する。
46.抗原結合ドメインが、感染症に特徴的な抗原を標的とする、実施形態33~38のいずれかに記載のフソソーム。
47.感染症が、HIV、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス8(HHV-8、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV))、ヒトT-リンパ球栄養性ウイルス-1(HTLV-1)、メルケル細胞ポリオーマウイルス(MCV)、シミアンウイルス40(SV40)、エプトスタイン・バーウイルス、CMV、ヒトパピローマウイルスから選択される、実施形態46に記載のフソソーム。
48.感染症に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Gタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン/スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、HIV Env、gpl20、またはHIV-1 Env上のCD4誘導性エピトープから選択される、実施形態46または実施形態47に記載のフオソーム。
49.膜貫通ドメインが、少なくともT細胞受容体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、またはそれらの機能的バリアントのα、β、もしくはζ鎖の膜貫通領域を含む、実施形態33~48のいずれかに記載のフソソーム。
50.膜貫通ドメインが、少なくともCD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS、およびFGFR2B、またはそれらの機能的バリアントの膜貫通領域(複数可)を含む、実施形態33~49のいずれかに記載のフソソーム。
51.CARが、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6)、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BBリガンド/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFFR/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27リガンド/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30リガンド/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40リガンド/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITRリガンド/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、リンホトキシン-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40リガンド/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α、TNFRII/TNFRSF1B)、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150)、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLAクラスI、HLA-DR、イカロス、インテグリンα4/CD49d、インテグリンα4β1、インテグリンα4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、CAP12、デクチン-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLPR、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、NKG2C、CD3ζドメイン、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、またはそれらの機能的フラグメントのうちの1つ以上から選択される少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む、実施形態33~50のいずれかに記載のフソソーム。
52.CARが、CD3ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)、またはその機能的バリアントを含む、実施形態33~51のいずれかに記載のフソソーム。
53.CARが、(i)CD3ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)、またはその機能的バリアント、および(ii)CD28ドメイン、もしくは4-1BBドメイン、またはその機能的バリアントを含む、実施形態33~51のいずれかに記載のフソソーム。
54.CARが、(i)CD3ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)、またはその機能的バリアント;(ii)CD28ドメインまたはその機能的バリアント;および(iii)4-1BBドメイン、もしくはCD134ドメイン、またはその機能的バリアントを含む、実施形態33~51のいずれかに記載のフソソーム。
55.CARが、(i)CD3ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)、またはその機能的バリアント;(ii)CD28ドメインまたはその機能的バリアント;(iii)4-1BBドメイン、もしくはCD134ドメイン、またはその機能的バリアント;および(iv)サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む、実施形態33~53のいずれかに記載のフソソーム。
56.CARが、1つ以上のスペーサーを更に含む、実施形態33~53のいずれかに記載のフソソーム。
57.スペーサーが、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間の第1のスペーサーである、実施形態56に記載のフソソーム。
58.第1のスペーサーが、免疫グロブリン定常領域またはそのバリアントもしくは修飾バージョンの少なくとも一部を含む、実施形態56または実施形態57に記載のフソソーム。
59.スペーサーが、膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間の第2のスペーサーである、実施形態56~58のいずれかに記載のフソソーム。
60.第2のスペーサーが、オリゴペプチドである、実施形態59に記載のフソソーム。
61.オリゴペプチドが、グリシン-セリンダブレットを含む、実施形態60に記載のフソソーム。
62.膜タンパク質が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Gタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン/スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、表皮成長因子受容体(EGFR)(ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3、およびErbB4/HER4を含む)、線維芽細胞成長因子受容体(FGFR)(FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18、およびFGF21を含む)血管内皮成長因子受容体(VEGFR)(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、およびPIGFを含む)、RET受容体およびEph受容体ファミリー(EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、およびEphB6を含む)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、ベストロフィン、TMEM16A、GABA受容体、グリシン受容体、ABCトランスポーター、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、スフィンゴシン-1-リン酸受容体(S1P1R)、NMDAチャネル、膜貫通タンパク質、マルチスパン膜貫通タンパク質、T細胞受容体モチーフ;T細胞α鎖;T細胞β鎖;T細胞γ鎖;T細胞δ鎖;CCR7;CD3;CD4;CD5;CD7;CD8;CD11b;CD11c;CD16;CD19;CD20;CD21;CD22;CD25;CD28;CD34;CD35;CD40;CD45RA;CD45RO;CD52;CD56;CD62L;CD68;CD80;CD95;CD117;CD127;CD133;CD137(4-1BB);CD163;F4/80;IL-4Ra;Sca-1;CTLA-4;GITR;GARP;LAP;グランザイムB;LFA-1;トランスフェリン受容体;NKp46、パーフォリン、CD4+;Th1;Th2;Th17;Th40;Th22;Th9;Tfh、古典的Treg.FoxP3+;Tr1;Th3;Treg17;TREG;CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG-72、炭酸アンヒドラーゼIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド(例えば、CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ2、VEGF、VEGFR1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、テネイシン、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、Smoothened、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR、またはANTXR1、葉酸受容体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、上皮成長因子受容体(EGFR)、メソテリン、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、TnAg、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、インターロイキン-11受容体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板由来成長因子受容体β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、プロスターゼ、PAP、ELF2M、エフリンB2、IGF-1受容体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、テロメラーゼ、フコシルGM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-アセチル-GD2、葉酸受容体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、ポリシアル酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、レグマイン、HPVE6、E7、ETV6-AML、精子タンパク質17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos関連抗原1、p53、p53変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、PCTA-1/ガレクチン8、MelanA/MART1、Ras変異体、hTERT、肉腫転座ブレークポイント、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2、腸内カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新生抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C)CD49f、CD151、CD340、CD200、tkrA、trkB、またはtrkCから選択される、実施形態18~32のいずれかに記載のフソソーム。
63.フソソームが、エンドサイトーシスによって標的細胞に入り、例えば、所与のフソソームのエンドサイトーシス経路を介して送達される膜タンパク質ペイロード剤のレベルが、例えば、実施例91のアッセイを使用して、0.01~0.6、0.01~0.1、0.1~0.3もしくは0.3~0.6であるか、またはクロロキン処理された参照細胞よりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくはそれ以上大きい、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
64.フソソームが、非エンドサイトーシス経路によって標的細胞に入り、例えば、所与のフソソームの非エンドサイトーシス経路を介して送達される膜タンパク質ペイロード剤のレベルが、例えば、実施例90のアッセイを使用して、0.1~0.95、0.1~0.2、0.2~0.3、0.3~0.4、0.4~0.5、0.5~0.6、0.6~0.7、0.7~0.8、0.8~0.9、0.9~0.95であるか、またはクロロキン処理された参照細胞よりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくはそれ以上大きい、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
65.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)膜タンパク質ペイロード剤が、膜タンパク質、または膜タンパク質、例えば、キメラ抗原受容体(CAR)コードするものをコードするか、またはそれに相補的な核酸(例えば、DNA、gDNA、cDNA、RNA、pre-mRNA、mRNA)である、
ii)膜タンパク質が、抗原受容体などの受容体であるか、またはそれを含み、これは、幾つかの実施形態では、天然受容体または操作された受容体、例えば、CARであり得る、
iii)膜タンパク質が、インテグリンであるか、またはそれを含む、
iv)膜タンパク質が、T細胞受容体であるか、またはそれを含む、
v)膜タンパク質が、イオンチャネルタンパク質または孔形成タンパク質(例えば、溶血素もしくはコリシン)などの膜輸送タンパク質であるか、またはそれを含む、
vi)膜タンパク質が、トール様受容体であるか、またはそれを含む、
vii)膜タンパク質が、インターロイキン受容体であるか、またはそれを含む、
viii)膜タンパク質が、膜酵素であるか、またはそれを含む、あるいは
ix)膜タンパク質が、細胞接着タンパク質(例えば、カドヘリンタンパク質、セレクチンタンパク質、ムチンタンパク質等)であるか、またはそれを含む、フソソーム。
66.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)膜タンパク質が、内在性膜タンパク質であり、
ii)膜タンパク質が、表在性膜タンパク質であり、
iii)膜タンパク質が、一時的に膜と会合し、
iv)膜タンパク質が、標的細胞の膜と会合する、および/または(例えば、膜貫通タンパク質として)全体的もしくは部分的に及ぶタンパク質であり、
v)膜タンパク質が、内在性モノトピックタンパク質であり(すなわち、膜の片側のみに会合している)、
vi)膜タンパク質が、標的細胞の膜の外面と会合しているか、または会合するようになり(例えば、外面に部分的または全体的に存在する)、あるいは
vii)膜タンパク質が、標的細胞の膜の内面と会合しているか、または会合するようになる(例えば、内面に部分的または全体的に存在する)、フソソーム。
67.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)膜タンパク質が、治療用膜タンパク質である、または
ii)膜タンパク質が、受容体(例えば、細胞表面受容体および/または膜貫通受容体)、細胞表面リガンド、膜輸送タンパク質(例えば、例えば、イオンチャネルタンパク質、孔形成タンパク質(例えば、毒素タンパク質)等)、膜酵素、および/または細胞接着タンパク質)であるか、またはそれを含む、フソソーム。
68.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)膜タンパク質が、天然に存在する膜タンパク質の配列を含む、
ii)膜タンパク質が、天然に存在する膜タンパク質のバリアントもしくは修飾バージョンであるか、またはそれを含む、
iii)膜タンパク質が、操作された膜タンパク質であるか、またはそれを含む、あるいは
iv)膜タンパク質が、融合タンパク質であるか、またはそれを含む、フソソーム。
69.フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、膜タンパク質ペイロード剤を標的細胞の膜に送達する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
70.フソソームが更に、1つ以上の作用物質、例えば、タンパク質、核酸(例えば、DNA、gDNA、cDNA、RNA、pre-mRNA、mRNA等)、オルガネラ、またはおよび/または代謝産物を標的細胞の細胞質ゾルに送達することができる(例えば、送達する)、実施形態69に記載のフソソーム。
71.複数のフソソームを含む、フソソーム組成物または調製物であって、少なくとも1つのフソソームが、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)例えば、本明細書に記載されるような膜タンパク質ペイロード剤と、を含む、フソソーム組成物または調製物。
72.本明細書に記載の膜タンパク質ペイロード剤を含む複数のフソソームを含む凍結精製フソソーム組成物または調製物であって、調製物が、4、0、-4、-10、-12、-16、-20、-80、または-160℃以下の温度で凍結される、凍結精製フソソーム組成物または調製物。
73.複数のフソソームのうちの少なくとも1つのフソソームが、ソース細胞に由来する、実施形態71または実施形態72に記載のフソソーム組成物。
74.フソソームが、4、0、-4、-10、-12、-16、-20、-80、または-160℃未満の温度にある、実施形態71~73のいずれかに記載のフソソーム組成物。
75.複数のフソソームが、少なくとも約103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、または1015フソソームを含む、実施形態71~74のいずれかに記載のフソソーム組成物。
76.複数のフソソームが同じである、実施形態71~75のいずれかに記載のフソソーム組成物。
77.フソソーム組成物中のフソソームの少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、もしくは80%~90%が、
同じフソゲンを含む、
同じタイプのソース細胞を使用して産生される、または
同じ膜タンパク質ペイロード剤を含む、から選択される少なくとも1つの特性を共有する場合、複数のフソソームが同じである、実施形態76に記載のフソソーム組成物。
78.複数のフソソームが異なる、実施形態71~75のいずれかに記載のフソソーム組成物。
79.複数のフソソームが、2つ以上のタイプのソース細胞に由来する、実施形態71~77のいずれかに記載のフソソーム組成物。
80.少なくとも1μL、2μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1mL、2mL、5mL、または10mLの体積を有する、実施形態71~79のいずれかに記載のフソソーム組成物。
81.複数のフソソームが、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、これらは機能的核を含まない、実施形態71~80のいずれかに記載のフソソーム組成物。
82.複数のフソソームが、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、これらは核を含まない、実施形態71~81のいずれかに記載のフソソーム組成物。
83.複数のフソソームが、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、これらは核DNAを実質的に含まない、実施形態71~82のいずれかに記載のフソソーム組成物。
84.複数のフソソームが、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、これらは機能的ミトコンドリアを含まない、実施形態71~83のいずれかに記載のフソソーム組成物。
85.複数のフソソームが、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、これらはミトコンドリアを含まない、実施形態71~84のいずれかに記載のフソソーム組成物。
86.タンパク質質量で0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、もしくは10%未満のソース細胞、または0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、もしくは10%未満の、機能的核を有するソース細胞を含む、実施形態71~85のいずれかに記載のフソソーム組成物。
87.フソソーム組成物が、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、
i)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも1,000コピーのコピー数で存在する、または
ii)フソソームあたりのフソゲンのコピー数と膜タンパク質ペイロード剤のコピー数との比が、1,000,000:1~100,000:1、100,000:1~10,000:1、10,000:1~1,000:1、1,000:1~100:1、100:1~50:1、50:1~20:1、20:1~10:1、10:1~5:1、5:1~2:1、2:1~1:1、1:1~1:2、1:2~1:5、1:5~1:10、1:10~1:20、1:20~1:50、1:50~1:100、1:100~1:1,000、1:1,000~1:10,000、1:10,000~1:100,000、または1:100,000~1:1,000,000の間である、実施形態71~86のいずれかに記載のフソソーム組成物。
88.フソソーム組成物が、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、膜タンパク質ペイロード剤が、例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも1,000コピーのコピー数で存在する、実施形態71~87のいずれかに記載のフソソーム組成物。
89.複数のフソソームが、少なくとも約50nm、約80nm、約100nm、約200nm、約500nm、約1000nm、約1200nm、約1400nm、または約1500nmの平均径を有する、実施形態71~77のいずれかに記載のフソソーム組成物。
90.複数のフソソームが、約10nm~約100μmの範囲内の直径を有するフソソームを含む、実施形態71~89のいずれかに記載のフソソーム組成物。
91.複数が、約20nm~約200nm、約50nm~約200nm、約50nm~約100nm、約50nm~約150nm、または約100nm~約150nmの範囲内のサイズを有するフソソームを含む、実施形態71~89のいずれかに記載のフソソーム組成物。
92.複数のフソソームの少なくとも50%が、フソソーム組成物中のフソソームの平均径の10%、20%、30%、40%、または50%以内の直径を有する、実施形態71~91のいずれかに記載のフソソーム組成物。
93.複数が、約500nm3~約0.0006mm3、または約4,000nm3~約0.005μm3、約65,000nm3~約0.005μm3、約65,000nm3~約0.0006μm3、約65,000nm3~約0.002μm3、または約0.0006μm3~約0.002μm3の範囲内の体積を有するフソソームを含む、実施形態71~92のいずれかに記載のフソソーム組成物。
94.複数のフソソームの少なくとも50%が、フソソーム組成物中のフソソームの平均体積の10%、20%、30%、40%、または50%以内の体積を有する、実施形態71~93のいずれかに記載のフソソーム組成物。
95.複数のフソソームの少なくとも50%が、フソソーム組成物中のフソソームの平均フソゲンコピー数の10%、20%、30%、40%、または50%以内のフソゲンのコピー数を有する、実施形態71~94のいずれかに記載のフソソーム組成物。
96.複数のフソソームの少なくとも50%が、フソソーム組成物中のフソソームの平均タンパク質膜ペイロードコピー数の10%、20%、30%、40%、または50%以内のタンパク質膜ペイロードのコピー数を有する、実施形態71~95のいずれかに記載のフソソーム組成物。
97.上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物または薬学的組成物であって、
i)膜タンパク質ペイロード剤が、部分的または全体的にフソソーム内腔に配置されている、
ii)膜タンパク質ペイロード剤が、フソソームの脂質二重層と会合している(例えば、部分的または全体的にその中に位置している)、あるいは
i)関連する膜タンパク質が、フソソームの外面と会合している、および/または部分的もしくは全体的に表示されている、フソソーム組成物または薬学的組成物。
98.フソソーム組成物を製造する方法であって、
a)例えば、フソゲンを発現することを含む、ソース細胞を提供することと、
b)ソース細胞からフソソームを産生することであって、フソソームが、脂質二重層、内腔、フソゲン、および膜タンパク質ペイロード剤を含み、それによりフソソームを作製する、産生することと、
c)フソソームを、例えば、被験体への投与に適した薬学的組成物として製剤化することと、を含み、
i)ソース細胞が、293細胞、HEK細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞以外のものである、
ii)フソゲンが、ウイルスタンパク質以外のものである、
iii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、1.08g/mL~1.12g/mLの間以外の密度を有する、
iv)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例33のアッセイによって測定した場合、1.25g/mL+/-0.05の密度を有する、
v)フソソームが、循環中のスカベンジャー系または肝臓の洞内のクッパー細胞によって捕捉されない、
vi)フソソームが、例えば、実施例76のアッセイにより、被験体の細網内皮系(RES)によって捕捉されない、
vii)複数のフソソームが被験体に投与される場合、複数の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%未満が、例えば、実施例76のアッセイにより、24時間後にRESによって捕捉されない、
viii)フソソームが、5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm、または200μmを超える直径を有する、
ix)フソソームが、細胞生物学的物質を含む、
x)フソソームが、除核細胞を含む、あるいは
xi)フソソームが、不活化核を含む、のうちの1つ以上である、方法。
99.フソゲンを発現するソース細胞を提供することが、ソース細胞において外因性フソゲンを発現させること、またはソース細胞において内因性フソゲンの発現を上方調節することを含む、実施形態98に記載の方法。
100.ソース細胞の核を不活化することを含む、実施形態98または実施形態99に記載の方法。
101.例えば、エレクトロポレーションによって、膜タンパク質ペイロード(例えば、核酸またはタンパク質)をフソソームに導入することを含む、実施形態98~100のいずれかに記載の方法。
102.フソソーム医薬品組成物を製造する方法であって、
a)例えば、実施形態1~70のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態71~97のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態97に記載の薬学的組成物を提供することと、
b)以下の基準のうちの1つ以上(例えば、2、3、または全て)が満たされているかどうかを決定するために、複数からの1つ以上のフソソームをアッセイすることと、
i)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも10%高い割合で融合する、
ii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、他のフソソームよりも標的細胞と、例えば、少なくとも50%高い割合で融合する、
iii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、24時間後に、標的細胞の少なくとも10%に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
iv)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数で存在する、
v)フソソームが、例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数の膜タンパク質ペイロード剤を含む、
vi)フソゲンのコピー数と膜タンパク質ペイロード剤のコピー数との比が、1,000,000:1~100,000:1、100,000:1~10,000:1、10,000:1~1,000:1、1,000:1~100:1、100:1~50:1、50:1~20:1、20:1~10:1、10:1~5:1、5:1~2:1、2:1~1:1、1:1~1:2、1:2~1:5、1:5~1:10、1:10~1:20、1:20~1:50、1:50~1:100、1:100~1:1,000、1:1,000~1:10,000、1:10,000~1:100,000、または1:100,000~1:1,000,000の間である、
vii)フソソームが、CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGのうちの1つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの75%以内である脂質組成物を含む、
viii)フソソームが、例えば、実施例42のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
ix)フソソームが、例えば、実施例49のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質とタンパク質との比率を含む、
x)フソソームが、例えば、実施例50のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内であるタンパク質と核酸(例えば、DNA)との比率を含む、
xi)フソソームが、例えば、実施例51のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質と核酸(例えば、DNA)との比率を含む、
xii)フソソームが、被験体、例えば、マウスにおいて、例えば、実施例75のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の90%以内の半減期を有する、
xiii)フソソームが、例えば、実施例64のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも10%多く、グルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)を膜を横切って輸送する、
xiv)フソソームが、例えば、実施例66のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の90%以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
xv)フソソームが、例えば、実施例68に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性(例えば、クエン酸合成酵素活性)の90%以内の代謝活性レベルを含む、
xvi)フソソームが、例えば、実施例69に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの90%以内の呼吸レベル(例えば、酸素消費率)を含む、
xvii)フソソームが、例えば、実施例70のアッセイを使用して、最大で18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、もしくは10,000MFIのアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含む、
xviii)フソソームが、例えば、実施例39のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも1%のmiRNA含有量レベルを有する、
xix)フソソームが、例えば、実施例47のアッセイにより、ソース細胞のそれの90%以内である可溶性:不溶性タンパク質比を有する、
xx)フソソームが、例えば、実施例48のアッセイによって測定した場合、フソソームの脂質含有量の5%未満のLPSレベルを有する、
xxi)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例63のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも10%多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したAKTリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)の取込みが可能である、
xxii)フソソームが、例えば、実施例71のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞(BMSC)によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも5%大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
xxiii)フソソームが、例えば、実施例72のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも5%大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
xxiv)フソソームが、例えば、実施例73のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはC2C12細胞における重合アクチンのレベルと比較して、5%以内のレベルでアクチンを重合する、
xxv)フソソームが、例えば、実施例74のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはC2C12細胞の膜電位の約5%以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約-20~-150mV、-20~-50mV、-50~-100mV、もしくは-100~-150mVの膜電位を有する、
xxvi)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例62のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも少なくとも5%大きい割合でタンパク質を分泌することができる、あるいは
xxvii)フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
c)(任意に)基準のうちの1つ以上が満たされた場合に、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含み、
それにより、フソソーム医薬品組成物を製造する、方法。
103.フソソーム組成物を製造する方法であって、
a)例えば、フソゲンを発現することを含む、ソース細胞を提供することと、
b)ソース細胞からフソソームを産生することであって、フソソームが、脂質二重層、内腔、フソゲン、および膜タンパク質ペイロード剤を含み、それによりフソソームを作製する、産生することと、
c)フソソームを、例えば、被験体への投与に適した薬学的組成物として製剤化することと、を含む、方法。
104.フソソーム組成物を製造する方法であって、
a)本明細書に記載の複数のフソソームまたはフソソーム調製物を提供する、例えば、産生することと、
b)1つ以上(例えば、2、3、またはそれ以上)の基準が満たされているかどうかを決定するために、複数の(例えば、調製物の)試料を分析することと、を含む、方法。
105.基準(複数可)が、
i)試料中のフソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%高い割合で融合する、
ii)試料中のフソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%高い割合で融合する、
iii)試料中のフソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の膜タンパク質ペイロード剤が、24、48、または72時間後に、標的細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
iv)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり(例えば、試料中の平均で)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、
v)膜タンパク質ペイロード剤が、例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、試料のフソソーム中(試料中の平均で)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下のコピー数で検出可能である、
vi)フソゲンのコピー数と膜タンパク質ペイロード剤のコピー数との比が、1,000,000:1~100,000:1、100,000:1~10,000:1、10,000:1~1,000:1、1,000:1~100:1、100:1~50:1、50:1~20:1、20:1~10:1、10:1~5:1、5:1~2:1、2:1~1:1、1:1~1:2、1:2~1:5、1:5~1:10、1:10~1:20、1:20~1:50、1:50~1:100、1:100~1:1,000、1:1,000~1:10,000、1:10,000~1:100,000、または1:100,000~1:1,000,000の間である、
vii)試料のフソソームが、ソース細胞のそれと実質的に同様の脂質組成物を特徴とするか、またはCL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGのうちの1つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、もしくは75%以内である、
viii)試料のフソソームが、例えば、実施例42のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を特徴とする、
ix)試料のフソソームが、例えば、実施例49のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質とタンパク質との比率を特徴とする、
x)試料のフソソームが、例えば、実施例50のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内であるタンパク質と核酸(例えば、DNA)との比率を特徴とする、
xi)試料のフソソームが、例えば、実施例51のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質と核酸(例えば、DNA)との比率を特徴とする、
xii)試料のフソソームが、被験体、例えば、マウスなどの実験用動物において、例えば、実施例75のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%以内の半減期を特徴とする、
xiii)試料のフソソームが、例えば、実施例64のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%多く、グルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)を膜を横切って輸送する、
xiv)試料のフソソームが、例えば、実施例66のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内の内腔におけるエステラーゼ活性を特徴とする、
xv)試料のフソソームが、例えば、実施例68に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性、例えば、クエン酸合成酵素活性の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内の代謝活性(例えば、クエン酸合成酵素活性)レベルを特徴とする、
xvi)試料のフソソームが、例えば、実施例69に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内の呼吸レベル(例えば、酸素消費率)を特徴とする、
xvii)試料のフソソームが、例えば、実施例70のアッセイを使用して、最大で18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、もしくは10,000MFIのアネキシンV染色レベルを特徴とするか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含む、
xviii)試料のフソソームが、例えば、実施例39のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上のmiRNA含有量レベルを特徴とする、
xix)フソソームが、例えば、実施例47のアッセイにより、ソース細胞のそれの1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以内であるか、もしくはそれ以上大きい、または例えば、ソース細胞のそれの1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、もしくは80%~90%以内の可溶性:不溶性タンパク質の比率を有する、
xx)試料のフソソームが、例えば、実施例48のアッセイによって測定した場合、ソース細胞または参照細胞のLPS含有量の5%、1%、0.5%、0.01%、0.005%、0.0001%、0.00001%、またはそれ以下のLPSレベルを特徴とする、
xxi)試料のフソソームが、例えば、実施例63のアッセイを使用して、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したAKTリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)の取込みが可能である、
xxii)試料のフソソームが、例えば、実施例71のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞(BMSC)によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを特徴とする、
xxiii)試料のフソソームが、例えば、実施例72のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%大きいパラクリンシグナル伝達レベルを特徴とする、
xxiv)試料のフソソームが、例えば、実施例73のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはC2C12細胞における重合アクチンのレベルと比較して、1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内のレベルでアクチンを重合することを特徴とする、
xxv)試料のフソソームが、例えば、実施例74のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはC2C12細胞の膜電位の約1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%以内の膜電位を特徴とするか、またはフソソームが、約-20~-150mV、-20~-50mV、-50~-100mV、もしくは-100~-150mVの膜電位を有する、
xxvi)試料のフソソームが、例えば、実施例62のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%大きい割合でタンパク質を分泌することができる、
xxvii)試料のフソソームが、例えば、本明細書に記載されているように、低い免疫原性を特徴とする、から選択される、実施形態104に記載の方法。
106.
c)基準のうちの1つ以上が満たされた場合に複数のフソソームもしくはフソソーム組成物の放出を承認するか、または(任意に)基準のうちの1つ以上が満たされた場合に複数のフソソームもしくはフソソーム調製物を医薬品として製剤化することを更に含む、実施形態104または105に記載の方法。
107.フソソーム組成物を製造する方法であって、
a)例えば、フソゲンを発現することを含む、ソース細胞を提供することと、
b)ソース細胞からフソソームを産生することであって、フソソームが、脂質二重層、内腔、フソゲン、および膜タンパク質ペイロード剤を含み、それによりフソソームを作製する、産生することと、
c)フソソームを、例えば、被験体への投与に適した薬学的組成物として製剤化することと、を含み、
i)ソース細胞が、293細胞、HEK細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞以外のものである、
ii)フソゲンが、ウイルスタンパク質以外のものである、
iii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、1.08g/mL~1.12g/mLの間以外の密度を有する、
iv)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例33のアッセイによって測定した場合、1.25g/mL+/-0.05の密度を有する、
v)フソソームが、循環中のスカベンジャー系または肝臓の洞内のクッパー細胞によって捕捉されない、
vi)フソソームが、例えば、実施例76のアッセイにより、被験体の細網内皮系(RES)によって捕捉されない、
vii)複数のフソソームが被験体に投与される場合、該複数の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%未満が、例えば、実施例76のアッセイにより、24時間後にRESによって捕捉されない、
viii)フソソームが、5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm、または200μmを超える直径を有する、
ix)フソソームが、細胞生物学的物質を含む、
x)フソソームが、除核細胞を含む、あるいは
xi)フソソームが、不活化核を含む、のうちの1つ以上である、方法。
108.フソソーム組成物を製造する方法であって、
a)本明細書に記載の複数のフソソーム、フソソーム組成物、または薬学的組成物を提供することと、
b)以下の基準のうちの1つ以上(例えば、2、3、または全て)が満たされているかどうかを決定するために、複数からの1つ以上のフソソームをアッセイすることと、
i)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも10%高い割合で融合する、
ii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、他のフソソームよりも標的細胞と、例えば、少なくとも50%高い割合で融合する、
iii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、24時間後に、標的細胞の少なくとも10%に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
iv)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数で存在する、
v)フソソームが、例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数の膜タンパク質ペイロード剤を含む、
vi)フソゲンのコピー数と膜タンパク質ペイロード剤のコピー数との比が、1,000,000:1~100,000:1、100,000:1~10,000:1、10,000:1~1,000:1、1,000:1~100:1、100:1~50:1、50:1~20:1、20:1~10:1、10:1~5:1、5:1~2:1、2:1~1:1、1:1~1:2、1:2~1:5、1:5~1:10、1:10~1:20、1:20~1:50、1:50~1:100、1:100~1:1,000、1:1,000~1:10,000、1:10,000~1:100,000、または1:100,000~1:1,000,000の間である、
vii)フソソームが、CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGのうちの1つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの75%以内である脂質組成物を含む、
viii)フソソームが、例えば、実施例42のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
ix)フソソームが、例えば、実施例49のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質とタンパク質との比率を含む、
x)フソソームが、例えば、実施例50のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内であるタンパク質と核酸(例えば、DNA)との比率を含む、
xi)フソソームが、例えば、実施例51のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質と核酸(例えば、DNA)との比率を含む、
xii)フソソームが、被験体、例えば、マウスにおいて、例えば、実施例75のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の90%以内の半減期を有する、
xiii)フソソームが、例えば、実施例64のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも10%多く、グルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)を膜を横切って輸送する、
xiv)フソソームが、例えば、実施例66のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の90%以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
xv)フソソームが、例えば、実施例68に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性(例えば、クエン酸合成酵素活性)の90%以内の代謝活性レベルを含む、
xvi)フソソームが、例えば、実施例69に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの90%以内の呼吸レベル(例えば、酸素消費率)を含む、
xvii)フソソームが、例えば、実施例70のアッセイを使用して、最大で18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、もしくは10,000MFIのアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含む、
xviii)フソソームが、例えば、実施例39のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも1%のmiRNA含有量レベルを有する、
xix)フソソームが、例えば、実施例47のアッセイにより、ソース細胞のそれの90%以内である可溶性:不溶性タンパク質比を有する、
xx)フソソームが、例えば、実施例48のアッセイによって測定した場合、フソソームの脂質含有量の5%未満のLPSレベルを有する、
xxi)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例63のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも10%多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したAKTリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)の取込みが可能である、
xxii)フソソームが、例えば、実施例71のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞(BMSC)によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも5%大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
xxiii)フソソームが、例えば、実施例72のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも5%大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
xxiv)フソソームが、例えば、実施例73のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはC2C12細胞における重合アクチンのレベルと比較して、5%以内のレベルでアクチンを重合する、
xxv)フソソームが、例えば、実施例74のアッセイによって、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはC2C12細胞の膜電位の約5%以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約-20~-150mV、-20~-50mV、-50~-100mV、もしくは-100~-150mVの膜電位を有する、
xxvi)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例62のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも少なくとも5%大きい割合でタンパク質を分泌することができる、あるいは
xxvii)フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
c)(任意に)基準のうちの1つ以上が満たされた場合に、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含み、
それにより、フソソーム医薬品組成物を製造する、方法。
109.膜タンパク質ペイロード剤を被験体に送達する方法であって、実施形態1~70のいずれかによる複数のフソソームを含むフソソーム組成物、実施形態71~97のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態97に記載の薬学的組成物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物が、膜タンパク質ペイロード剤が送達されるような量および/または時間で投与される、方法。
110.例えば、本明細書に記載されるように、膜タンパク質ペイロード剤を含むフソソーム組成物または調製物を、ヒト被験体、標的組織、または細胞に送達する方法であって、該方法は、ヒト被験体に投与すること、または標的組織もしくは細胞を、本明細書に記載される複数のフソソームを含むフソソーム組成物、本明細書に記載されるフソソーム組成物、もしくは本明細書に記載される薬学的組成物と接触させ、それにより、フソソーム組成物を被験体に投与することを含む、方法。
111.膜タンパク質ペイロード剤を被験体、標的組織、または細胞に送達する方法であって、被験体に投与すること、または標的組織もしくは細胞を本明細書に記載のフソソーム組成物もしくは調製物(例えば、本明細書に記載の薬学的組成物)と接触させることを含み、フソソーム組成物または調製物が、膜タンパク質ペイロード剤が送達されるような量および/または時間で投与される、方法。
112.膜タンパク質ペイロード剤を被験体に送達する方法であって、例えば、
a)被験体の1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第1のフソゲンを被験体に投与することであって、
i)第1のフソゲンを投与することが、1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第1のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ii)第1のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの1つ以上である、投与することと、
b)第2のフソゲンおよび膜タンパク質ペイロード剤を含む複数のフソソームを含む、本明細書に記載されるようなフソソーム組成物または調製物をヒト被験体に投与することと、を含み、第2のフソゲンが、第1のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤を更に含み、
それにより、膜タンパク質ペイロード剤を被験体に送達する、方法。
113.被験体における生物学的機能を調節する、例えば、増強する方法であって、
a)被験体の1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第1のフソゲンを被験体に投与することであって、
i)第1のフソゲンを投与することが、1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第1のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ii)第1のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの1つ以上である、投与することと、
b)第2のフソゲンを含む複数のフソソームを含む、本明細書に記載されるようなフソソーム組成物または調製物をヒト被験体に投与することと、を含み、第2のフソゲンが、第1のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤を更に含み、
それにより、被験体における生物学的機能を調節する、方法。
114.膜タンパク質機能を被験体に送達または標的化する方法であって、膜タンパク質ペイロード剤を含む本明細書に記載のフソソーム組成物または調製物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物または調製物が、膜タンパク質機能が被験体において送達または標的化されるような量および/または時間で投与され、任意に、被験体が癌、炎症性障害、自己免疫疾患、慢性疾患、炎症、臓器機能の損傷、感染症、変性障害、遺伝性疾患を、または傷害を有する、方法。
115.フソソーム組成物をヒト被験体に投与する方法であって、
a)被験体の1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第1のフソゲンを被験体に投与することであって、
i)第1のフソゲンを投与することが、1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第1のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ii)第1のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの1つ以上である、投与することと、
b)第2のフソゲンを含む複数のフソソームを含む、フソソーム組成物をヒト被験体に投与することと、を含み、第2のフソゲンが、第1のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤を更に含み、
それにより、フソソーム組成物を被験体に投与する、方法。
116.膜タンパク質ペイロード剤を被験体に送達する方法であって、
a)被験体の1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第1のフソゲンを被験体に投与することであって、
i)第1のフソゲンを投与することが、1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第1のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ii)第1のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの1つ以上である、投与することと、
b)第2のフソゲンおよび治療薬を含む複数のフソソームを含む、フソソーム組成物をヒト被験体に投与することと、を含み、第2のフソゲンが、第1のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤を更に含み、
それにより、膜タンパク質ペイロード剤を被験体に送達する、方法。
117.被験体における生物学的機能を調節する、例えば、増強する方法であって、
a)被験体の1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第1のフソゲンを被験体に投与することであって、
i)第1のフソゲンを投与することが、1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第1のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ii)第1のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの1つ以上である、投与することと、
b)第2のフソゲンを含む複数のフソソームを含む、フソソーム組成物をヒト被験体に投与することと、を含み、第2のフソゲンが、第1のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、膜タンパク質ペイロード剤を更に含み、
それにより、被験体における生物学的機能を調節する、方法。
118.生物学的機能が、
a)2つの細胞間の相互作用を調節する、例えば、増加または減少させる、
b)免疫応答を調節する、例えば、増加または減少させる、
c)標的組織への細胞の動員を調節する、例えば、増加または減少させる、
d)癌の成長率を低下させる、または
e)被験体における癌細胞の数を低減する、から選択される、実施形態117に記載の方法。
119.膜タンパク質ペイロード剤が、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する、実施形態115~118のいずれかに記載の方法。
120.膜タンパク質ペイロード剤が、
i)キメラ抗原受容体、
ii)例えば、表7から選択されるインテグリン膜タンパク質ペイロード、
iii)表8から選択されるイオンチャネルタンパク質、
iv)例えば、表9および10から選択される孔形成タンパク質、
v)例えば、表11から選択されるToll様受容体、
vi)例えば、表12から選択されるインターロイキン受容体ペイロード、
vii)表13~14から選択される細胞接着タンパク質、
viii)表17から選択される輸送タンパク質、
ix)天然に存在する膜タンパク質に対して異種であるシグナル配列、もしくは
x)表6に列挙されているシグナル配列のうちの1つ以上を含むか、またはコードする、実施形態115~119のいずれかに記載の方法。
121.膜タンパク質ペイロード剤が、コネキシン、CFTR、チロトロピン受容体、ミエリンタンパク質ゼロ、メラコルチン4、ミエリンプロテオリピドタンパク質、低密度リポタンパク質受容体、ABCトランスポーター、CD81、mCAT-1、CXCR4、CD4、CCR5、シアル酸に富むタンパク質、クローディン、CD21、T細胞受容体、B細胞受容体、TNFR1、CD63、GLUT4、VEGF、またはICAM以外であるか、それを含まないか、コードしないか、またはコードする配列に相補的でない、実施形態115~120のいずれかに記載の方法。
122.膜タンパク質ペイロード剤が、標的細胞の細胞表面マーカーまたは標的細胞部分に結合せず、蛍光タンパク質を含まないキメラタンパク質を含むか、またはコードする、実施形態115~121のいずれかに記載の方法。
123.膜タンパク質ペイロード剤が、
a)治療用タンパク質、例えば、本明細書に記載の治療用タンパク質を含む、
b)ゴルジ装置タンパク質、分泌タンパク質、もしくは小胞体タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、
c)ダイマー(例えば、ソース細胞に対して外因性であるダイマー)、ヘテロダイマー(例えば、ソース細胞に対して外因性であるヘテロダイマー)、または二量体化ドメイン(例えば、ソース細胞に対して外因性であるポリペプチドの二量体化ドメイン)のうちの1つ以上を含まない、
d)膜タンパク質をコードする核酸(例えば、DNAまたはRNA)を含む、実施形態115~122のいずれかに記載の方法。
124.膜タンパク質ペイロード剤が、
a)膜貫通ドメインを含む膜タンパク質、
b)脂質アンカータンパク質、
c)膜貫通タンパク質に結合するタンパク質(例えば、膜貫通タンパク質の細胞外部分に結合する細胞外タンパク質、もしくは膜貫通タンパク質の細胞内部分に結合する細胞内タンパク質)、
d)膜貫通ドメインを欠くタンパク質、
e)膜に部分的に及ぶタンパク質(例えば、標的細胞もしくはフソソームの膜)、および膜に完全には及ばないタンパク質(例えば、面内膜ヘリックスを含むか、もしくはタンパク質が、膜に完全には及ばない疎水性ループを含む)、または
f)膜貫通ドメインを含まないタンパク質を含むか、もしくはコードし、タンパク質が、例えば、静電相互作用もしくはイオン相互作用を介して、膜表面と相互作用する、実施形態115~123のいずれかに記載の方法。
125.第1のフソゲンが、リポペプチドではない、実施形態115~124のいずれかに記載の方法。
126.
癌の進行、腫瘍の後退、腫瘍の体積、新生物細胞数の減少、融合細胞の量、膜タンパク質ペイロード剤を含む融合細胞の量、核酸タンパク質ペイロードを発現する融合細胞の量、および融合細胞の膜に配置された膜タンパク質の量をモニターする工程を更に含む、実施形態109~125のいずれかに記載の方法。
127.膜タンパク質ペイロード剤が、
A)米国特許公開第2016/0289674号の配列番号8144~16131の配列、
b)米国特許公開第2016/0289674号の配列番号8144~16131の配列のフラグメント、バリアント、もしくはホモログ、
c)米国特許公開第2016/0289674号の配列番号8144~16131の配列を含むタンパク質をコードする核酸、または
d)米国特許公開第2016/0289674号の配列番号8144~16131の配列のフラグメント、変異体、もしくはホモログを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
128上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法であって、膜タンパク質ペイロード剤が、
a)表7~17から選択されるタンパク質、
b)表7~17から選択されるタンパク質のフラグメント、バリアント、もしくはホモログ、
c)表7~17から選択されるタンパク質であるか、もしくはそれを含むタンパク質をコードする核酸、または
d)表7~17から選択されるタンパク質のフラグメント、バリアント、もしくはホモログを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
129.膜タンパク質ペイロード剤が、 抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
130.本明細書に記載の膜タンパク質ペイロード剤によって、または膜タンパク質ペイロード剤として提供される膜タンパク質が、免疫グロブリン部分または実体(例えば、抗体、Fab、scFV、scFab、sdAb、デュオボディ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、ザイボディ、ラクダ抗体、BiTE、クアドローマ、もしくはbsDb)であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
131.本明細書に記載の膜タンパク質ペイロード剤によって、または膜タンパク質ペイロード剤として提供される膜タンパク質が、1つ以上の細胞表面リガンド(例えば、1、2、3、4、5、10、20、50、もしくはそれ以上の細胞表面リガンド)であるか、またはそれを含む、および/あるいは本明細書に記載の膜タンパク質ペイロード剤によって、または膜タンパク質ペイロード剤として提供される膜タンパク質が、1つ以上の細胞表面リガンドを、例えば、標的細胞に提示する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
132.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、複数の作用物質(例えば、少なくとも2、3、4、5、10、20、もしくは50の作用物質)を含み(標的細胞に送達することができる)、少なくとも1つの作用物質が、膜タンパク質ペイロードであるか、またはそれを含み、任意に、作用物質のうちの1つ以上が、阻害性核酸(例えば、siRNAもしくはmiRNA)および/またはmRNAであるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
133.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞を再プログラミングまたは分化転換することができる膜タンパク質ペイロード剤を含み(例えば、標的細胞に送達することができる)、例えば、フソソーム(および/またはその組成物)が、標的細胞の再プログラミングまたは分化転換を誘導する1つ以上の作用物質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
134.上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法であって、
a)フソソームが、フソソームによって構成される膜タンパク質ペイロード剤(例えば、治療薬、例えば、ソース細胞に対して内因性もしくは外因性である治療薬)の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を標的細胞に送達する、
b)標的細胞(複数可)と融合するフソソームが、標的細胞(複数可)と融合するフソソームによって構成される膜タンパク質ペイロード剤(例えば、治療用膜タンパク質ペイロード剤、例えば、内因性の治療用膜タンパク質ペイロード剤もしくはソース細胞に対して外因性である治療用膜タンパク質ペイロード剤)の平均で少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を標的細胞に送達する、および/あるいは
c)フソソーム組成物が、フソソーム組成物によって構成される膜タンパク質ペイロード剤(例えば、膜タンパク質ペイロード剤剤、例えば、ソース細胞に対して外因性である治療用膜タンパク質ペイロード剤)の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を標的組織に送達する、フソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
135.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、膜タンパク質ペイロード剤(例えば、フソソームの半減期よりも、例えば、少なくとも10%、20%、50%、2倍、5倍、または10倍長い、被験体における半減期を特徴とする膜タンパク質ペイロード剤(例えば、治療薬)を送達するか、または送達することができる(例えば送達する)、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
136.フソソームが治療薬を標的細胞に送達し、任意に、フソソームがもはや存在しないか、または検出可能でなくなった後に作用物質が存在する、実施形態306に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
137.フソソームが、治療用膜タンパク質ペイロード剤、例えば、治療用膜タンパク質ペイロード剤、例えば、ソース細胞に対して外因性もしくは内因性である治療用膜タンパク質ペイロード剤、任意に、治療用膜タンパク質ペイロード剤が、タンパク質、例えば、膜貫通タンパク質、細胞表面タンパク質、分泌タンパク質、受容体、抗体、核酸、例えば、DNA、染色体(例えば、ヒト人工染色体)、RNA、またはmRNAのうちの1つ以上から選択される、フソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
核への送達
138.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)核ペイロード剤、例えば、核タンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する)と、を含み、
i)標的細胞が複数のフソソームと接触すると、核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、例えば、実施例117~122のいずれかのアッセイにより、標的細胞の核において標的細胞の細胞質中の核タンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも10%、20%、50%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、または100倍高いレベルで存在するようになる、
ii)標的細胞の集団が複数のフソソームと接触すると、例えば、実施例117~122のいずれかのアッセイにおいて測定した場合、核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、標的細胞の集団における少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の細胞の核において豊富化される(例えば、標的細胞の細胞質中の核タンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも50%高いレベルで標的細胞の核に存在するようになる)、
iii)標的細胞の集団が複数のフソソームと接触すると、核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、標的細胞の集団の亜集団(「融合集団」)に存在するようになり、核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、例えば、実施例117~122のいずれかのアッセイにおいて測定した場合、融合集団における少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の細胞中の核において豊富化される(例えば、標的細胞の細胞質ゾル中の核タンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも50%高いレベルで標的細胞の核に存在するようになる)、
iv)標的細胞の集団が複数のフソソームと接触すると、核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、標的細胞の集団の亜集団(「レシピエント細胞集団」)に存在するようになり、核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、例えば、実施例117~122のいずれかのアッセイにおいて測定した場合、レシピエント細胞集団中の少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の細胞中の核において豊富化される(例えば、標的細胞の細胞質中の核タンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも50%高いレベルで標的細胞の核内に存在するようになる)、
v)少なくとも1、2、5、10、20、50、100、200、500、もしくは1,000コピーの核タンパク質ペイロード剤、または核酸核タンパク質ペイロード剤によってコードされるタンパク質が、例えば、実施例117または118のアッセイで測定される場合、標的細胞中の核に存在する、
vi)核タンパク質ペイロード剤が、転写活性化因子、転写抑制因子、エピジェネティック修飾因子、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、DNAメチルトランスフェラーゼ、DNAニッカーゼ、部位特異的DNA編集酵素、例えば、デアミナーゼ、DNAトランスポサーゼ、DNAインテグラーゼ、RNAエディター、RNAスプライシング因子、PIWIタンパク質のうちの1つ以上を含むか、またはコードする、
vii)核タンパク質ペイロード剤が、基本的なヘリックスループヘリックスモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックスターンヘリックスモチーフ、ホメオドメインモチーフ、翼状ヘリックスモチーフ、翼状ヘリックスターンモチーフ、HMG-ボックスドメイン、Wor3ドメイン、OBフォールドドメイン、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター、またはB3ドメインのうちの1つ以上を含むか、またはコードする、
viii)核タンパク質ペイロード剤が、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、またはヘテロ四量体を含む複合体を含む、
ix)核タンパク質ペイロード剤が、異種核局在化シグナルを含むか、またはコードし、核タンパク質ペイロード剤が、Creなどの部位特異的ヌクレアーゼを含まない、
x)核タンパク質ペイロード剤が、表6-1に列挙されている核局在化シグナルを含むか、またはコードし、任意に、NLSが、配列番号128~507および605~626のうちのいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む、あるいは
xi)核タンパク質ペイロード剤が、核質、核小体、核小体周辺領域、カハール体、クラストソーム、ジェム核内構造体、ヒストン遺伝子座体(HLB)、核スペックル、核ストレス体、パラスペックル、PML体、ポリコーム体を含むか、またはコードする、あるいは
xii)核タンパク質ペイロード剤が、標的細胞の細胞質に(少なくとも部分的に)存在する内因性タンパク質に結合する第1のドメイン、および核移入を促進する第2のドメイン、例えば、NLSを含むタンパク質を含むか、またはコードする、フソソーム。
139.エンドサイトーシス小胞にあるペイロードが、標的細胞の細胞質にある、実施形態138に記載のフソソーム。
140.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)核ペイロード剤、例えば、核タンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する)と、を含み、
i)フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれに含まれる、
ii)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数で存在する、
iii)フソソームが、例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数の治療薬を含む、
iv)フソソームが、CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGのうちの1つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの75%以内である脂質を含む、
v)フソソームが、例えば、実施例42のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
vi)フソソームが、例えば、実施例63のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも10%多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したAKTリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)の取込みが可能である、
vii)フソソームが、被験体、例えば、マウスに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば、実施例87または100のアッセイにより、例えば、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも0.1%または10%が、24時間後に標的組織内に存在する、あるいは
viii)ソース細胞が、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、フソソーム。
141.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)(i)核酸、および(ii)核酸の核移入を促進するタンパク質を含む核ペイロード剤と、を含む、フソソーム。
142.核タンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する)が、
i)転写活性化因子、例えば、表17-1の転写活性化因子、
ii)転写抑制因子、例えば、表17-1の転写抑制因子、
iii)エピジェネティック修飾因子、例えば、表17-1のエピジェネティック修飾因子、
iv)ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、例えば、表17-1のヒストンアセチルトランスフェラーゼ、
v)ヒストンデアセチラーゼ、例えば、表17-1のヒストンデアセチラーゼ、
vi)ヒストンメチルトランスフェラーゼ、例えば、表17-1のヒストンメチルトランスフェラーゼ、
vii)DNAメチルトランスフェラーゼ、例えば、表17-1のDNAメチルトランスフェラーゼ、
viii)DNAニッカーゼ、例えば、本明細書に記載のDNAニッカーゼ、
ix)部位特異的DNA編集酵素、例えば、表17-1のデアミナーゼ、
x)DNAトランスポザーゼ、例えば、本明細書に記載のDNAトランスポザーゼ、
xi)DNAインテグラーゼ、例えば、本明細書に記載のDNAインテグラーゼ、
xii)RNAエディター、例えば、表17-1のRNAエディター、
xiii)RNAスプライシング因子、例えば、表17-1のRNAスプライシング因子、または
xiv)PIWIタンパク質、例えば、本明細書に記載のPIWIタンパク質、のうちの1つ以上を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
143.核タンパク質ペイロード剤が、NLSを有するタンパク質を含むか、またはコードし、NLSが、タンパク質の天然に存在する対応物中のNLSと同じである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
144.核タンパク質ペイロード剤が、タンパク質の天然に存在する対応物によって含まれないNLSを有するタンパク質を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
145.核タンパク質ペイロード剤が、転写因子、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、エピジェネティック因子、転写後RNA修飾因子(例えば、mRNAスプライシング因子)、非コードRNA(例えば、snRNAもしくはsnoRNA)、またはリボ核酸タンパク質(例えば、snRNPもしくはsnoRNP)、構造タンパク質(例えば、ラミンもしくはカリソケレタル(karysokeletal)タンパク質)を含むか、またはそれをコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
146.核タンパク質ペイロード剤が、抗体分子、例えば、Fab、scFv、scFab、sdAb、デュオボディ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、ザイボディ、ラクダ抗体、BiTE、クアドローマ、またはbsDbを含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
147.核タンパク質ペイロード剤が、エフェクタードメインおよび局在化ドメインを含む融合タンパク質を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
148.局在化ドメインが、TALドメイン、ジンクフィンガードメイン、Cas9ドメイン、またはメガヌクレアーゼドメインを含む、実施形態147に記載のフソソーム。
149.エフェクタードメインが、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、塩基エディター(デアミナーゼ)、転写因子、またはエピジェネティック修飾因子を含む、実施形態147または148に記載のフソソーム。
150.核タンパク質ペイロード剤が、遺伝子編集タンパク質または核酸、例えば、Cas9またはガイドRNAを含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
151.核ペイロード剤が、機能性RNAを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
152.核ペイロード剤が、核タンパク質ペイロード剤、例えば、タンパク質またはタンパク質をコードするmRNAを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
153.核ペイロード剤が、(i)核酸、および(ii)核酸の核移入を促進するタンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
154.核酸が、結合部位を含み、核移入を促進するタンパク質が、結合部位に結合する、実施形態153に記載のフソソーム。
155.結合部位が、TetR結合部位を含み、タンパク質が、TetRを含む、実施形態154に記載のフソソーム。
156.核ペイロード剤が、合成転写因子、例えば、(i)DNA結合ドメイン、例えば、特定のDNA結合ドメイン、例えば、TALドメイン、ZFドメイン、またはCas9ドメイン、および(ii)転写活性化因子ドメインまたは転写抑制ドメインを含む融合タンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
157.核ペイロード剤が、合成エピジェネティック修飾因子、例えば、(i)DNA結合ドメインおよび(ii)エピジェネティック修飾因子ドメインを含む融合タンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
158.核タンパク質ペイロード剤が、表17-1から選択されるタンパク質であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
159.核タンパク質ペイロード剤が、表17-1から選択されるタンパク質のフラグメント、バリアント、もしくはホモログであるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
160.核タンパク質ペイロード剤が、表17-1から選択されるタンパク質であるか、またはそれを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
161.核タンパク質ペイロード剤が、表17-1から選択されるタンパク質のフラグメント、バリアント、またはホモログを含むタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
オルガネラ送達
162.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)オルガネラペイロード剤、例えば、オルガネラタンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現する)と、を含み、標的細胞が複数のフソソームと接触すると、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドが、標的細胞のミトコンドリアにおいて、細胞質または標的細胞原形質膜中のオルガネラタンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも10%、20%、50%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、または100倍高いレベルで豊富化される、フソソーム。
163.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)標的細胞の細胞質オルガネラにおいて、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドを豊富化するのに十分なオルガネラタンパク質ペイロード剤に対する異種シグナル配列(例えば、表6もしくは6-1のシグナル配列)を含むか、またはコードするオルガネラタンパク質ペイロード剤と、を含み、任意に、異種シグナル配列が、配列番号39~127および605~626のうちのいずれか1つに記載されている、フソソーム。
164.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔であって、内腔がオルガネラを含まない、内腔と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)オルガネラタンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現する)と、を含み、標的細胞が複数のフソソームと接触すると、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドが、標的細胞のシオゾル(cyosol)または原形質膜に対して、標的細胞のゴルジ装置、小胞体、液胞、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロメノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、またはストレス顆粒のうちの1つ以上において豊富化される、フソソーム。
165.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔であって、内腔がオルガネラを含まない、内腔と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)ポリペプチドをコードする核酸を含む、オルガネラタンパク質ペイロード剤と、を含み、標的細胞が、複数のフソソームと接触すると、コードされたポリペプチドが、標的細胞の細胞質ゾルまたは原形質膜に対して、リソソームおよび/またはエンドソームにおいて豊富化される、フソソーム。
166.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)外因性であるか、または過剰発現するオルガネラタンパク質ペイロード剤と、を含み、オルガネラタンパク質ペイロード剤が、ミトコンドリア膜タンパク質、ミトコンドリア外膜タンパク質、ミトコンドリア内膜タンパク質、ミトコンドリア内境界膜タンパク質、ミトコンドリア結晶膜タンパク質、ミトコンドリアDNAタンパク質、ミトコンドリア膜間腔タンパク質、ミトコンドリアマトリックスタンパク質、ミトコンドリアマトリックス顆粒タンパク質、ミトコンドリアクリステタンパク質、ミトコンドリアリボソームタンパク質、ミトコンドリアクリステル内タンパク質、ミトコンドリア末梢空間タンパク質、膜タンパク質、ペルオキシソーム晶質コアタンパク質、ペルオキシソームマトリックスタンパク質、ペルオキシンから選択されるポリペプチドを含むか、またはコードする、フソソーム。
167.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)外因性であるか、または過剰発現するオルガネラタンパク質ペイロード剤と、を含み、オルガネラタンパク質ペイロード剤が、
i)代謝タンパク質(例えば、電子伝達系タンパク質もしくはATP合成酵素)、
ii)プロテアーゼ、
iii)シャペロン、
iv)タンパク質輸送タンパク質、
v)ミトコンドリアリボソームタンパク質、
vi)ミトコンドリア転写タンパク質、または
vii)ミトコンドリア複製タンパク質から選択されるポリペプチドを含むか、またはコードする、フソソーム。
168.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)標的細胞の細胞質ゾルまたは核に(少なくとも部分的に)存在する内因性タンパク質に結合する第1のドメイン、および標的細胞の細胞質オルガネラへの移入を促進する第2のドメインを含むか、またはコードするオルガネラタンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現する)と、を含む、フソソーム。
169.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)(i)核酸、および(ii)細胞質オルガネラへの核酸の移入を促進するタンパク質を含む、オルガネラタンパク質ペイロード剤と、を含む、フソソーム。
170.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)オルガネラタンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現する)と、を含み、オルガネラタンパク質ペイロード剤が、核酸(例えば、DNAもしくはRNA)、例えば、機能性RNAまたはタンパク質をコードする核酸を含む、フソソーム。
171.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)オルガネラペイロード剤、例えば、オルガネラタンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する)と、を含み、
ix)フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれに含まれる、
ii)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数で存在する、
xi)フソソームが、例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数の治療薬を含む、
xii)フソソームが、CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGのうちの1つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの75%以内である脂質を含む、
xiii)フソソームが、例えば、実施例42のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
xiv)フソソームが、例えば、実施例63のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも10%多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したAKTリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)の取込みが可能である、
xv)フソソームが、被験体、例えば、マウスに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば、実施例87または100のアッセイにより、例えば、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも0.1%または10%が、24時間後に標的組織内に存在する、あるいは
xvi)ソース細胞が、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、フソソーム。
172.フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)オルガネラペイロード剤、例えば、オルガネラタンパク質ペイロード剤(例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する)と、を含み、
i)フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれに含まれる、
ii)フソソームが、除核細胞を含む、
iii)フソソームが、不活化核を含む、
iv)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、または100倍高い割合で融合する、
v)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、または100倍高い割合で融合する、
vi)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、24、48、または72時間後に、標的細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
vii)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、
viii)フソソームが、例えば、実施例43または156のアッセイによって測定した場合、少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下のコピー数で治療薬を含む、
ix)フソゲンのコピー数と治療薬のコピー数との比が、1,000,000:1~100,000:1、100,000:1~10,000:1、10,000:1~1,000:1、1,000:1~100:1、100:1~50:1、50:1~20:1、20:1~10:1、10:1~5:1、5:1~2:1、2:1~1:1、1:1~1:2、1:2~1:5、1:5~1:10、1:10~1:20、1:20~1:50、1:50~1:100、1:100~1:1,000、1:1,000~1:10,000、1:10,000~1:100,000、または1:100,000~1:1,000,000の間である、
x)フソソームが、ソース細胞のそれと実質的に同様の脂質組成物を含むか、またはCL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGのうちの1つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、または75%以内である、
xi)フソソームが、例えば、実施例42または155のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
xii)フソソームが、例えば、実施例49のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質とタンパク質との比率を含む、
xiii)フソソームが、例えば、実施例50のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内であるタンパク質と核酸(例えば、DNA)との比率を含む、
xiv)フソソームが、例えば、実施例51または159のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質と核酸(例えば、DNA)との比率を含む、
xv)フソソームが、被験体、例えば、マウスにおいて、例えば、実施例75のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%以内の半減期を有する、
xvi)フソソームが、例えば、実施例64のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%多く(例えば、約11.6%多く)グルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)を、膜を横切って輸送する、
xvii)フソソームが、例えば、実施例66のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
xviii)フソソームが、例えば、実施例68に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞におけるクエン酸合成酵素活性の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内の代謝活性レベルを含む、
xix)フソソームが、例えば、実施例69に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内の呼吸レベル(例えば、酸素消費率)を含む、
xx)フソソームが、例えば、実施例70のアッセイを使用して、最大で18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、もしくは10,000MFIのアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含む、
xxi)フソソームが、例えば、実施例39のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上のmiRNA含有量レベルを有する、
xxii)フソソームが、例えば、実施例47のアッセイにより、ソース細胞のそれの1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以内、もしくはそれ以上大きい、または例えば、ソース細胞のそれの1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、もしくは80%~90%以内の可溶性:不溶性タンパク質の比率を有する、
xxiii)フソソームが、例えば、実施例48のアッセイにおいて、ソース細胞のLPS含有量の5%、1%、0.5%、0.01%、0.005%、0.0001%、0.00001%未満、またはそれ以下のLPSレベルを有する、
xxiv)フソソームが、例えば、実施例63のアッセイを使用して、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したAKTリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)の取込みが可能である、
xxv)フソソームが、被験体、例えば、マウスに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば、実施例87または100のアッセイにより、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%が、24、48、または72時間後に標的組織内に存在する、
xxvi)フソソームが、例えば、実施例71のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞(BMSC)によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
xxvii)フソソームが、例えば、実施例72のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
xxviii)フソソームが、例えば、実施例73のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはC2C12細胞における重合アクチンのレベルと比較して、1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内のレベルでアクチンを重合する、
xxix)フソソームが、例えば、実施例74のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはC2C12細胞の膜電位の約1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約-20~-150mV、-20~-50mV、-50~-100mV、もしくは-100~-150mVの膜電位を有する、
xxx)フソソームが、例えば、実施例57のアッセイを使用して、例えば、ソース細胞またはソース細胞と同じタイプの細胞の血管外漏出の速度の少なくとも1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の速度で、血管からの血管外漏出が可能であり、ソース細胞が、好中球、リンパ球、B細胞、マクロファージ、またはNK細胞である、
xxxi)フソソームが、細胞膜、例えば、内皮細胞膜または血液脳関門を通過することができる、
xxxii)フソソームが、例えば、実施例62のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%大きい割合でタンパク質を分泌することができる、
xxxiii)フソソームが、医薬品または適正製造基準(GMP)基準を満たしている、
xxxiv)フソソームが、適正製造基準(GMP)に従って作製された、
xxxv)フソソームが、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、
xxxvi)フソソームが、所定の参照値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない、
xxvii)フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
xxxviii)ソース細胞が、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、あるいは
xxxix)ソース細胞が、293細胞、HEK細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または幹細胞以外のものである、フソソーム。
173.細胞質オルガネラが、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、またはストレス顆粒から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
174.細胞質オルガネラが、膜結合オルガネラである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
10a.オルガネラペイロード剤が、ミトコンドリアマトリックス、ミトコンドリア膜間腔、ミトコンドリア外膜、ミトコンドリア内膜、またはミトコンドリアクリステのうちの1つ以上において豊富化される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
175.オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドが、表17-2のタンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
176.標的細胞の集団が複数のフソソームと接触すると、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドが、例えば、実施例123または124のアッセイにおいて測定されるように、標的細胞の集団中の少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の細胞の細胞質オルガネラにおいて豊富化される(例えば、標的細胞の細胞質中のオルガネラタンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも50%高いレベルで標的細胞の細胞質オルガネラに存在するようになる)、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
177.標的細胞の集団が複数のフソソームと接触すると、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、標的細胞の集団の亜集団(「融合集団」)に存在するようになり、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、例えば、実施例123~124のアッセイにおいて測定した場合、融合集団における少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の細胞の細胞質オルガネラにおいて豊富化される(例えば、標的細胞の細胞質ゾル中のオルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドのレベルよりも少なくとも50%高いレベルで標的細胞の細胞質に存在するようになる)、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
178.少なくとも1、2、5、10、20、50、100、200、500、もしくは1,000コピーのオルガネラタンパク質ペイロード剤、またはそこにコードされるポリペプチドが、複数のフソソームと接触した標的細胞中の細胞質オルガネラに存在する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
179.オルガネラタンパク質ペイロード剤が、基本的なヘリックス・ループヘリックスモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフ、ホメオドメインモチーフ、翼状ヘリックスモチーフ、翼状ヘリックス・ターンモチーフ、HMG-ボックスドメイン、Wor3ドメイン、OBフォールドドメイン、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター、またはB3ドメインのうちの1つ以上を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
180.オルガネラタンパク質ペイロード剤が、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、またはヘテロ四量体を含むタンパク質複合体を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
181.オルガネラタンパク質ペイロード剤が、タンパク質の天然に存在する対応物中のシグナル配列と同じシグナル配列を有するタンパク質を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
182.オルガネラタンパク質ペイロード剤が、タンパク質の天然に存在する対応物によって含まれないシグナル配列を有するタンパク質を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
183.オルガネラタンパク質ペイロード剤が、抗体分子、例えば、Fab、scFv、scFab、sdAb、デュオボディ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、ザイボディ、ラクダ抗体、BiTE、クアドローマ、またはbsDbを含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
184.オルガネラペイロード剤が、機能性RNAを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
185.オルガネラペイロード剤が、オルガネラタンパク質ペイロード剤、例えば、タンパク質またはタンパク質をコードするmRNAを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
186.オルガネラペイロード剤が、レポータータンパク質または蛍光タンパク質、例えば、GFPを含まないか、またはコードしない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
187.内腔が、オルガネラを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
188.オルガネラタンパク質ペイロード剤、またはそこにコードされるタンパク質が、細胞膜タンパク質または分泌タンパク質ではない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
189.フソソーム組成物中のウイルスカプシドタンパク質の量が、総タンパク質の1%未満である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
190.コンドリソームおよびフソゲンを含む、フソソーム。
191.部分的または完全な核不活化(例えば、核除去)を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
192.ソース細胞が、付着または懸濁条件下で増殖した細胞である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
193.ソース細胞が、初代細胞、培養細胞、不死化細胞、または細胞株(例えば、ミエロバスト(myelobast)細胞株、例えば、C2C12)である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
194.ソース細胞が、内皮細胞、線維芽球、血液細胞(例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球)、幹細胞(例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞)、胚性幹細胞(例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯からの幹細胞、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織)、筋芽細胞、実質細胞(例えば、肝細胞)、肺胞細胞、ニューロン(例えば、網膜神経細胞)、前駆細胞(例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球)、前駆細胞(例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞)、または不死化細胞(例えば、HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR90、IMR91、PER.C6、HT-1080、もしくはBJ細胞)である、上記実施のいずれかに記載のフソソーム。
195.ソース細胞が、同種異系である、例えば、標的細胞と同じ種の異なる生物から得られる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
196.ソース細胞が、自己由来である、例えば、標的細胞と同じ生物から得られる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
197.ソース細胞が、異種である、例えば、標的細胞とは異なる種の生物から得られる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
198.ソース細胞が、白血球または幹細胞から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
199.ソース細胞が、好中球、リンパ球(例えば、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞)、マクロファージ、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または骨髄芽球から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
200.ソース細胞が、293細胞、HEK細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または幹細胞以外のものである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
201.上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
i)ソース細胞が、形質転換もしくは不死化されていない、または
ii)ソース細胞が、アデノウイルスを介した不死化以外の方法を使用して形質転換または不死化され、例えば、自然突然変異もしくはテロメラーゼ発現によって不死化される、フソソーム。
202.フソソームが、修飾されたゲノムを有する、例えば、(例えば、MHC複合体を除去するためのゲノム編集によって)免疫原性が低下したソース細胞に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
203.ソース細胞が、抗炎症シグナルで処理された細胞培養物に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
204.ソース細胞が、例えば、本明細書に記載のアッセイを使用して、実質的に非免疫原性である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
205.ソース細胞が、組換え細胞である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
206.ソース細胞が、ソース細胞に対して外因性である第2の作用物質、例えば、治療薬、例えば、タンパク質または核酸(例えば、RNA、例えば、mRNAもしくはmiRNA)を更に含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
207.第2の作用物質が、フソソームによって含まれる少なくとも10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、もしくは1,000,000コピー、またはそれ以下で存在するか、あるいはフソソームあたり少なくとも10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、もしくは1,000,000コピー、またはそれ以下の平均レベルで存在する、実施形態206に記載のフソソーム。
208.フソソームが、ソース細胞、例えば、哺乳動物ソース細胞をsiRNAまたは遺伝子編集酵素で処理することにより、ソース細胞、例えば、タンパク質または核酸と比較して、改変した、例えば増加または減少したレベルの1つ以上の内因性分子を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
209.フソソームが、少なくとも10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、もしくは1,000,000コピー、またはそれ以下の内因性分子を含むか、あるいはフソソームあたり少なくとも10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、もしくは1,000,000コピー、またはそれ以下の平均レベルで存在する、実施形態208に記載のフソソーム。
210.内因性分子(例えば、RNAもしくはタンパク質)が、ソース細胞におけるその濃度よりも少なくとも1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106、1.0×107、5.0×107、または1.0×108高い濃度で存在する、実施形態208または実施形態209に記載のフソソーム。
211.内因性分子(例えば、RNAもしくはタンパク質)が、ソース細胞におけるその濃度よりも少なくとも1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106、1.0×107、5.0×107、または1.0×108低い濃度で存在する、実施形態208または実施形態209に記載のフソソーム。
212.例えば、実施例39のアッセイにより、フソソームが、ソース細胞のそれよりも少なくとも1%のmiRNA含有量レベルを有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
213.第2の作用物質、例えば、治療薬が、タンパク質、タンパク質複合体(例えば、少なくとも2、3、4、5、10、20、もしくは50個のタンパク質、例えば、少なくとも少なくとも2、3、4、5、10、20、もしくは50個の異なるタンパク質)ポリペプチド、核酸(例えば、DNA、染色体、もしくはRNA、例えば、mRNA、siRNA、もしくはmiRNA)、または小分子から選択される、実施形態206または207に記載のフソソーム。
214.フソソームが、例えば、実施例42のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
215.フソソームが、例えば、実施例47のアッセイにより、フソソームが、ソース細胞のそれの90%以内の可溶性:不溶性タンパク質比を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
216.例えば、実施例30のアッセイによって測定した場合、ソース細胞のサイズの約0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%未満である直径を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
217.フソソームが、例えば、実施例30のアッセイによって測定した場合、ソース細胞のそれの約0.01%または1%未満である直径を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
218.ソース細胞の体積の約0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%%未満である体積を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
219.フソゲンが、タンパク質フソゲンである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
220.フソゲンが、哺乳動物フソゲンまたはウイルスフソゲンである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
221.フソゲンが、ソース細胞からの小胞形成を促進しない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
222.フソゲンが、除核細胞を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
223.フソゲンが、
i)ウイルスタンパク質以外のものである、
ii)フソゲンが、フソゲン糖タンパク質以外のものである、
iii)フソゲンが、フェルチリン-β以外の哺乳動物のタンパク質である、
iv)フソゲンが、VSVG、SNAREタンパク質、もしくは分泌顆粒タンパク質以外のものである、または
v)フソゲンが、TAT、TAT-HA2、HA-2、gp41、アルツハイマー病のβアミロイドペプチド、センダイウイルスタンパク質、または両親媒性の正味の負電荷(net-negative)ペプチド(WAE 11)以外のものである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
224.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数で存在する、あるいは
ii)フソゲンのコピー数とペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)のコピー数との比が、1,000,000:1~100,000:1、100,000:1~10,000:1、10,000:1~1,000:1、1,000:1~100:1、100:1~50:1、50:1~20:1、20:1~10:1、10:1~5:1、5:1~2:1、2:1~1:1、1:1~1:2、1:2~1:5、1:5~1:10、1:10~1:20、1:20~1:50、1:50~1:100、1:100~1:1,000、1:1,000~1:10,000、1:10,000~1:100,000、または1:100,000~1:1,000,000の間である、フソソーム。
225.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
フソソームが、フソソームに治療用または診断用物質をロードすることによって作製されたものではなかった、
ii)ソース細胞には、治療用または診断用物質はロードされていなかった、
iii)フソソームが、ドキソルビシン、デキサメタゾン、シクロデキストリン;ポリエチレングリコール、マイクロRNA、例えば、miR125、VEGF受容体、ICAM-1、E-セレクチン、酸化鉄、蛍光タンパク質、例えば、GFPもしくはRFP、ナノ粒子、もしくはRNaseを含まないか、またはソース細胞に対して外因性である上記のうちのいずれの形態も含まない、あるいは
iv)フソソームが、ソース細胞に対して外因性であり、1つ以上の翻訳後修飾、例えば、グリコシル化を含む治療薬を更に含む、フソソーム。
226.フソゲンが、ウイルス性フソゲン、例えば、HA、HIV-1 ENV、gp120、もしくはVSV-Gであるか、またはフソゲンが、哺乳動物フソゲン、例えば、SNARE、シンシチン、ミオメーカー(myomaker)、ミオミキサー(myomixer)、ミオマージャー(myomerger)、もしくはFGFRL1である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
227.フソゲンが、4~5、5~6、6~7、7~8、8~9、または9~10のpHで活性である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソームまたはフソソーム。
228.フソゲンが、4~5、5~6、6~7、7~8、8~9、または9~10のpHでは活性でない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
229.フソゲンが、脂質フソゲン、例えば、オレイン酸、モノオレイン酸グリセロール、グリセリド、ジアシルグリセロール、または修飾された不飽和脂肪酸である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
230.フソゲンが、化学フソゲン、例えば、PEGである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
231.フソゲンが、小分子フソゲン、例えば、ハロタン、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、およびクロルプロマジンなどのNSAIDである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
232.フソゲンが、組換えである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
233.フソゲンが、生化学的に組み込まれる、例えば、フソゲンが、精製タンパク質として提供され、フソゲンと脂質二重層との会合を可能にする条件下でフソソーム脂質二重層と接触する、または生合成的に組み込まれる、例えば、フソゲンがフソソーム脂質二重層と会合することを可能にする条件下でソース細胞で発現される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
234.フソソームが、以下の特性のうちの1つ以上を有する、
i)フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、もしくはそれに含まれる、
ii)フソソームが、除核細胞を含むか、もしくはそれに含まれる、または
iii)フソソームが、不活化核を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
234A.フソソームが、例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数でペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
235.フソソームが、以下の特性のうちの1つ以上を有する、
i)フソソームが、CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGのうちの1つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの75%以内である脂質を含む、
ii)フソソームが、例えば、実施例49のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質とタンパク質との比率を含む、
iii)フソソームが、例えば、実施例50のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内であるタンパク質と核酸(例えば、DNA)との比率を含む、
iv)フソソームが、例えば、実施例51のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質と核酸(例えば、DNA)との比率を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
236.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%(例えば、10%)高い割合で融合する、
ii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%(例えば、50%)高い割合で融合する、
iii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、24、48、または72時間後に、標的細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%(例えば、10%)に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
vi)フソソームが、例えば、実施例64のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも10%多く、グルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)を膜を横切って輸送する、
v)フソソームが、例えば、実施例66のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の90%以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
vi)フソソームが、例えば、実施例68に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性(例えば、クエン酸合成酵素活性)の90%以内の代謝活性レベルを含む、
vii)フソソームが、例えば、実施例69に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの90%以内の呼吸レベル(例えば、酸素消費率)を含む、
viii)フソソームが、例えば、実施例70のアッセイを使用して、最大で18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、もしくは10,000MFIのアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含む、
ix)フソソームが、例えば、実施例48のアッセイによって測定した場合、フソソームの脂質含有量の5%未満のLPSレベルを有する、
x)フソソームが、例えば、実施例71のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞(BMSC)によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも5%大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
xi)フソソームが、例えば、実施例72のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも5%大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
xii)フソソームが、例えば、実施例73のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはC2C12細胞における重合アクチンのレベルと比較して、5%以内のレベルでアクチンを重合する、
xiii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例62のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも少なくとも5%大きい割合でタンパク質を分泌することができる、のうちの1つ以上である、フソソーム。
237.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)フソソームが、例えば、実施例74のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはC2C12細胞の膜電位の約5%以内の膜電位を有するか、またはフソソームが、約-20~-150mV、-20~-50mV、-50~-100mV、もしくは-100~-150mVの膜電位を有する、
ii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例57のアッセイを使用して、例えば、ソース細胞と同じタイプの細胞の血管外漏出の速度の少なくとも1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の速度で、血管からの血管外漏出が可能であり、ソース細胞が、好中球、リンパ球、B細胞、マクロファージ、またはNK細胞である、
iii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、細胞膜、例えば、内皮細胞膜または血液脳関門を、例えば、ソース細胞と同じタイプの細胞のそれの少なくとも1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の速度で通過することができる、
iv)フソソームが、医薬品または適正製造基準(GMP)基準を満たしている、
v)フソソームが、適正製造基準(GMP)に従って作製された、
vi)フソソームが、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、
vii)フソソームが、所定の参照値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない、あるいは
viii)フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、のうちの1つ以上である、フソソーム。
238.フソソームが、コンドリソームであるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
239.フソソームが、例えば、実施例75のアッセイにより、被験体、例えば、マウスにおいて、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の90%以内の半減期を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
240.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、1.08g/mL~1.12g/mLの間以外の密度を有する、
ii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例33のアッセイによって測定した場合、1.12g/mL超、例えば、1.25g/mL+/-0.1、1.25g/mL+/-0.05の密度を有する、
iii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例33のアッセイにより、1未満、1~1.1、1.05~1.15、1.1~1.2、1.15~1.25、1.2~1.3、1.25~1.35、または1.35g/mL超の密度を有する、フソソーム。
241.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)フソソームが、循環中のスカベンジャー系または肝臓の洞内のクッパー細胞によって捕捉されない、
ii)フソソームが、例えば、実施例76のアッセイにより、被験体の細網内皮系(RES)によって捕捉されない、
iii)複数のフソソームが被験体に投与される場合、複数の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%未満が、例えば、実施例76のアッセイにより、24時間後にRESによって捕捉されない、のうちの1つ以上である、フソソーム。
242.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)フソソームが、医薬品もしくは適正製造基準(GMP)基準を満たしている、
ii)フソソームが、適正製造基準(GMP)に従って作製された、
iii)フソソームが、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、または
iv)フソソームが、所定の参照値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない、フソソーム。
243.上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
i)フソソームが、5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm、または200μmを超える直径を有する、
ii)フソソームが、40~150nmの間以外、例えば、150nm、200nm、300nm、400nm、または500nmを超える直径を有する、
iii)フソソームが、少なくとも80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm、または1500nmの直径を有する、
iv)フソソームが、80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm、または1500nm未満の直径を有する、あるいは
v)フソソームが、例えば、実施例32のアッセイによって測定した場合、少なくとも約10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、または200nmの直径を有する、フソソーム。
244.フソソームが、その内腔に、酵素、抗体、または抗ウイルスポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
245.フソソームが、CD63またはGLUT4を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
246.フソソームが、
i)ウイルスを含まない、感染性ではない、もしくは宿主細胞内で増殖しない、
ii)VLP(ウイルス様粒子)ではない、
iii)ウイルス構造タンパク質、例えば、ウイルスカプシドタンパク質、例えば、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質を含まないか、またはウイルスカプシドタンパク質の量が、例えば、実施例53のアッセイにより、総タンパク質の10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%、もしくは0.1%未満である、
iv)ウイルスマトリックスタンパク質を含まない、
v)ウイルスの非構造タンパク質を含まない、
vi)10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピー未満のウイルス構造タンパク質を含む、あるいは
vii)ビロゾームではない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
247.フソソームが、ウイルス構造タンパク質および/またはウイルスマトリックスタンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
248.上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
i)フソゲンのコピー数とフソソーム上のウイルス構造タンパク質のコピー数との比が、少なくとも1,000,000:1、100.000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、または1:1である。
ii)フソゲンのコピー数とフソソーム上のウイルスマトリックスタンパク質のコピー数との比が、少なくとも1,000,000:1、100.000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、または1:1である、フソソーム。
249.フソソームが、単層または多層である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
250.上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
i)フソソームが、水不混和性の液滴を含まない、
ii)フソソームが、水性内腔および親水性外部を含む、フソソーム。
251.フソソームが、以下のオルガネラ:ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒のうちの1つ以上を実質的に含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
252.フソソームが、ソース細胞と比較して少数のオルガネラを有し、オルガネラが、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
253.上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
i)フソソームが、エクソソームではない、
ii)フソソームが、微小胞である、
iii)フソソームが、非哺乳動物のフソゲンを含む、
iv)フソソームが、フソゲンを組み込むように操作されている、
v)フソソームが、ソース細胞に対して外因性であるフソゲンを含む、
vi)フソソームが、1つ以上のオルガネラ、例えば、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、ストレス顆粒、またはそれらの組み合わせを含む、
vii)フソソームが、細胞骨格またはその成分、例えば、アクチン、Arp2/3、フォルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、またはチューブリンを含む、
viii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、Thery et al.,″Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.″Curr Protoc Cell Biol.2006 Apr;Chapter 3:Unit 3.22に記載される、例えばショ糖勾配遠心分離アッセイにおいて、1.08~1.22g/mlの浮遊密度を有しないか、または少なくとも1.18~1.25g/ml、もしくは1.05~1.12g/mLの密度を有する、
ix)フソソーム脂質二重層が、ソース細胞と比較して、セラミドもしくはスフィンゴミエリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されているか、あるいはフソソーム脂質二重層が、ソース細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、もしくはホスファチジルセリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されていない(例えば、枯渇している)、
x)フソソームが、実施例52のアッセイにおいて測定した場合、ホスファチジルセリン(PS)もしくはCD40リガンド、またはPSおよびCD40リガンドの両方を含む、
xi)フソソームが、ソース細胞と比較して、PSについて豊富化されており、例えば、複数のフソソームにおいて、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%が、PSに対して陽性である、
xii)フソソームが、アセチルコリンエステラーゼ(AChE)を実質的に含まないか、または例えば、実施例67のアッセイにより、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、または1000 AChE活性単位/タンパク質ug未満を含む、
xiii)フソソームが、テトラスパニンファミリータンパク質(例えば、CD63、CD9、もしくはCD81)、ESCRT関連タンパク質(例えば、TSG101、CHMP4A-B、もしくはVPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、アクチニン-4、ミトフィリン、シンテニン-1、TSG101、ADAM10、EHD4、シンテニン-1、TSG101、EHD1、フロチリン-1、熱ショック70-kDaタンパク質(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)、またはそれらの任意の組み合わせを実質的に含まないか、あるいは例えば、実施例44のアッセイにより、任意の個々のエクソソームマーカータンパク質の0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、5%、もしくは10%未満、および/または前述のタンパク質のうちのいずれかの総エクソソームマーカータンパク質の0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、5%、10%、15%、20%、もしくは25%未満を含むか、あるいはこれらのタンパク質のうちのいずれか1つ以上について豊富化されていない、
xiv)フソソームが、例えば、実施例45のアッセイを使用して、500、250、100、50、20、10、5、もしくは1ng GAPDH/総タンパク質μgを下回る、またはソース細胞中のGAPDHのレベルを下回る、例えば、ソース細胞中の総タンパク質あたりのGAPDHのレベル(ng/μg)よりも1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%未満低いレベルのグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を含む、
xv)フソソームが、1つ以上の小胞体タンパク質(例えば、カルネキシン)、1つ以上のプロテアソームタンパク質、もしくは1つ以上のミトコンドリアタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせについて豊富化され、例えば、カルネキシンの量が、500、250、100、50、20、10、5、もしくは1ngカルネキシン/総タンパク質μgを超えるか、あるいはフソソームが、例えば、実施例46のアッセイを使用して、ソース細胞と比較して、1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%多い総タンパク質あたりのカルネキシン(ng/μg)を含む、
xvi)フソソームが、例えば、実施例39または40のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞に対して外因性である作用物質(例えば、タンパク質、mRNA、もしくはsiRNA)を含む、あるいは
xvii)フソソームが、原子間力顕微鏡により、雲母表面に少なくとも30分間固定化され得る、フソソーム。
254.上記実施形態のいずれかのフソソームであって、
i)フソソームが、エクソソームである、
ii)フソソームが、微小胞ではない、
iii)フソソームが、オルガネラを含まない、
iv)フソソームが、細胞骨格またはその成分、例えば、アクチン、Arp2/3、フォルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、またはチューブリンを含まない、
v)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、ショ糖勾配遠心分離アッセイにおいて、1.08~1.22g/mLの浮遊密度を有する、
vi)フソソーム脂質二重層が、ソース細胞と比較して、セラミドもしくはスフィンゴミエリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されていない(例えば、枯渇している)か、あるいはフソソーム脂質二重層が、ソース細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、もしくはホスファチジルセリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されている、
vii)フソソームが、実施例52のアッセイにおいて測定した場合、ホスファチジルセリン(PS)もしくはCD40リガンド、またはPSおよびCD40リガンドの両方を含まないか、ソース細胞に対して枯渇している、
viii)フソソームが、ソース細胞と比較して、PSについて豊富化されていない(例えば、枯渇している)、例えば、複数のフソソームにおいて、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%未満が、PSに対して陽性である、
ix)フソソームが、例えば、実施例67のアッセイにより、例えば、少なくとも0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、または1000 AChE活性単位/タンパク質ugのアセチルコリンエステラーゼ(AChE)を含む、
x)フソソームが、テトラスパニンファミリータンパク質(例えば、CD63、CD9、もしくはCD81)、ESCRT関連タンパク質(例えば、TSG101、CHMP4A-B、もしくはVPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、アクチニン-4、ミトフィリン、シンテニン-1、TSG101、ADAM10、EHD4、シンテニン-1、TSG101、EHD1、フロチリン-1、熱ショック70-kDaタンパク質(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)、またはそれらの任意の組み合わせを含む、例えば、実施例44のアッセイにより、ソース細胞と比較して、任意の個々のエクソソームマーカータンパク質の0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、5%、もしくは10%超、および/または前述のタンパク質のうちのいずれかの総エクソソームマーカータンパク質の0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、もしくは25%未満を含むか、あるいはこれらのタンパク質のうちのいずれか1つ以上について豊富化されている、
xi)フソソームが、例えば、実施例45のアッセイを使用して、500、250、100、50、20、10、5、もしくは1ng GAPDH/総タンパク質μgを上回る、またはソース細胞中のGAPDHのレベルを下回る、例えば、ソース細胞中の総タンパク質あたりのGAPDHのレベルよりも少なくとも1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%多いレベルのグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を含む、
xii)フソソームが、1つ以上の小胞体タンパク質(例えば、カルネキシン)、1つ以上のプロテアソームタンパク質、もしくは1つ以上のミトコンドリアタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせについて豊富化されず(例えば、枯渇している)、例えば、カルネキシンの量が、500、250、100、50、20、10、5、もしくは1ngカルネキシン/総タンパク質μg未満であるか、あるいはフソソームが、例えば、実施例46のアッセイを使用して、ソース細胞と比較して、1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%少ない総タンパク質あたりのカルネキシン(ng/μg)を含む、あるいは
xiii)フソソームを、原子間力顕微鏡により、雲母表面に少なくとも30分間固定化することができない、フソソーム。
255.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)フソソームが、VLPを含まない、
ii)フソソームが、ウイルスを含まない、
iii)フソソームが、複製能ウイルスを含まない、
iv)フソソームが、ウイルスタンパク質、例えば、ウイルス構造タンパク質、例えば、カプシドタンパク質もしくはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、
v)フソソームが、エンベロープウイルス由来のカプシドタンパク質を含まない、
vi)フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質を含まない、または
vii)フソゲンが、ウイルスフソゲンではない、フソソーム。
256.フソソームが、細胞質ゾルを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
257.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)フソソームが、例えば、実施例102のアッセイにより、被験体に移植されたときに奇形腫を形成しない、
ii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例58のアッセイを使用して、参照細胞、例えばマクロファージと比較して、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%の速度で走化性が可能である、
iii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、傷害の部位にホーミングすることができ、フソソームが、例えば、実施例59のアッセイを使用して、ヒト細胞に由来し、例えば、ソース細胞が、好中球である、あるいは
iv)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、食作用が可能であり、例えば、フソソームによる食作用が、実施例60のアッセイを使用して、0.5、1、2、3、4、5、または6時間以内に検出可能であり、例えば、ソース細胞が、マクロファージである、フソソーム。
258.フソソームが、以下の特徴のうちの1つ以上を有する、
a)ソース細胞からの1つ以上の内因性タンパク質、例えば、膜タンパク質もしくは細胞質ゾルタンパク質を含む、
b)少なくとも10、20、50、100、200、500、1000、2000、もしくは5000個の異なるタンパク質を含む、
c)少なくとも1、2、5、10、20、50、もしくは100個の異なる糖タンパク質を含む、
d)フソソーム中のタンパク質の少なくとも10質量%、20質量%、30質量%、40質量%、50質量%、60質量%、70質量%、80質量%、もしくは90質量%が、天然に存在するタンパク質である、
e)少なくとも10、20、50、100、200、500、1000、2000、もしくは5000個の異なるRNAを含む、または
f)少なくとも2、3、4、5、10、もしくは20個の異なる脂質を含み、例えば、CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGから選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
259.フソソームが、以下の特性のうちの1、2、3、4、5つ、もしくはそれ以上を有するように操作されているか、またはフソソームが、天然に存在する細胞ではなく、以下の特性のうちの1、2、3、4、5つ、もしくはそれ以上を有するか、または核が、天然に、以下の特性のうちの1、2、3、4、5つ、もしくはそれ以上ではない、
i)部分的な核の不活化が、核機能、例えば、転写もしくはDNA複製、または両方の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、もしくはそれ以上の低下をもたらし、例えば、転写が、実施例19のアッセイにより測定され、DNA複製が、実施例20のアッセイにより測定される、
ii)フソソームが、転写ができないか、または例えば、実施例19のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞の転写活性のそれの1%、2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%未満の転写活性を有する、
iii)フソソームが、核DNA複製ができないか、または例えば、実施例20のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞の核DNA複製の1%、2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%未満の核DNA複製を有する、
iv)フソソームが、クロマチンを欠いているか、または例えば、実施例37のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞のクロマチン含有量の1%、2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%未満のクロマチン含有量を有する、
v)フソソームが、核膜を欠いているか、または例えば、実施例36のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはJurkat細胞の50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、もしくは1%未満の核膜の量を有する、
vi)フソソームが、機能的な核膜孔複合体を欠いているか、または例えば、実施例36のアッセイにより、移入もしくは移出活性が少なくとも50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%%、3%、2%、もしくは1%低減したか、あるいはフソソームが、核孔タンパク質、例えば、NUP98またはインポーチン7のうちの1つ以上を欠いている、
vii)フソソームが、ヒストンを含まないか、または例えば、実施例37のアッセイにより、ソース細胞(例えば、H1、H2a、H2b、H3、もしくはH4)の1%未満のヒストンレベルを有する、
viii)フソソームが、20、10、5、4、3、2、または1未満の染色体を含む、
ix)核機能が、排除されている、
x)フソソームが、除核された哺乳動物細胞である、
xi)核が、除去または不活化される、例えば、機械的力によって、放射線によって、もしくは化学的アブレーションによって押し出される、あるいは
xii)フソソームが、例えば、間期または有糸分裂中に完全にまたは部分的に除去されるDNAを有する哺乳動物細胞に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
260.フソソームが、mtDNAまたはベクターDNAを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
261.DNAを含まないか、または実質的にDNAを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
262.フソソームが、機能的核を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
263.フソソームが、核を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
264.フソソームが、核DNAを実質的に含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
265.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
ii)フソソームが、CreもしくはGFP、例えばEGFPを含まない、または
iii)フソソームが、ソース細胞に対して外因性であり、CreもしくはGFP、例えば、EGFP以外であるタンパク質を更に含む、フソソーム。
266.フソソームが、核酸(例えば、DNA、gDNA、cDNA、RNA、pre-mRNA、mRNA、miRNA、もしくはsiRNA)またはタンパク質(例えば、抗体)を更に含み、核酸またはタンパク質が、例えば、内腔において、ソース細胞に対して外因性である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
267.フソソームが、ミトコンドリアを含まないか、またはミトコンドリアを実質的に含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
268.被験体、例えばヒト被験体への投与後、5日以内、例えば、4日以内、3日以内、2日以内、1日以内、例えば、約12~72時間にわたって、いずれかの特徴のうちの1、2、3、4、5、6つ、またはそれ以上を保持する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
269.標的細胞または標的細胞の表面特徴部と会合および/または結合する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
270.標的細胞の表面で標的細胞に融合する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
271.リソソームに依存しない方法で標的細胞への融合を促進する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
272.フソソームおよび/またはフソソーム内容物が、エンドサイトーシスによって、または非エンドサイトーシス経路を介して標的細胞に入る、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
273.フソソーム脂質二重層の少なくとも一部が、標的細胞膜に組み込まれるようになる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
274.フソソームが、エンドサイトーシスによって標的細胞に入り、例えば、所与のフソソームのエンドサイトーシス経路を介して送達されるペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)のレベルが、例えば、実施例91のアッセイを使用して、0.01~0.6、0.01~0.1、0.1~0.3、もしくは0.3~0.6であるか、またはクロロキン処理された参照細胞よりも少なくとも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくはそれ以上大きい、実施形態273に記載のフソソーム。
275.フソソームが、非エンドサイトーシス経路によって標的細胞に入り、例えば、所与のフソソームの非エンドサイトーシス経路を介して送達されるペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)のレベルが、例えば、実施例90のアッセイを使用して、0.1~0.95、0.1~0.2、0.2~0.3、0.3~0.4、0.4~0.5、0.5~0.6、0.6~0.7、0.7~0.8、0.8~0.9、0.9~0.95であるか、またはクロロキン処理された参照細胞よりも少なくとも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくはそれ以上大きい、実施形態273に記載のフソソーム。
276.標的細胞が、生物内にある、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
277.標的細胞が、生物から単離された初代細胞である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
278.標的細胞が、内皮細胞、線維芽球、血液細胞(例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球)、幹細胞(例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞)、胚性幹細胞(例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯からの幹細胞、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織)、筋芽細胞、実質細胞(例えば、肝細胞)、肺胞細胞、ニューロン(例えば、網膜神経細胞)、前駆細胞(例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球)、前駆細胞(例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞)、または不死化細胞(例えば、HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR90、IMR91、PER.C6、HT-1080、もしくはBJ細胞)から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
279.標的細胞が、HeLa細胞以外であるか、または標的細胞が、形質転換もしくは不死化されていない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
280.標的細胞が、形質転換または不死化されている、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
281.標的細胞が、白血球または幹細胞から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
282.標的細胞が、好中球、リンパ球(例えば、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞)、マクロファージ、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または骨髄芽球から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
283.フソソームが、フソソームを標的細胞に局在化させる標的化ドメインを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
284.標的化ドメインが、標的細胞上の標的細胞部分と相互作用する、実施形態283に記載のフソソーム。
285.標的細胞部分が、細胞表面の特徴である、実施形態284に記載のフソソーム。
286.フソソームが、前述の標的細胞部分を含まない、実施形態284または実施形態285に記載のフソソーム。
287.フソソームが、標的細胞上のフソゲン結合パートナーと相互作用し、それによりフソソームが標的細胞に結合または融合することを可能にするフソゲンを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
288.フソソームが、前述のフソゲン結合パートナーを含まない、実施形態287に記載のフソソーム。
289.標的化ドメインが、フソゲンの一部ではない、実施形態283~288のいずれかに記載のフソソーム。
290.フソゲンが、標的化ドメインを含む、実施形態283~288のいずれかに記載のフソソーム。
291.フソゲン結合パートナーが、標的細胞部分とは異なる実体であるか、またはその一部である、実施形態283~289のいずれかに記載のフソソーム。
292.フソゲン結合パートナーが、標的細胞部分であるか、またはその一部である、実施形態283~289のいずれかに記載のフソソーム。
293.内腔内に配置されたオルガネラ、例えば、治療上有効な数のオルガネラを更に含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
294.上記実施形態のいずれかに記載のフソソームであって、
i)ソース細胞が、樹状細胞または腫瘍細胞以外のものあり、例えば、ソース細胞が、内皮細胞、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球、幹細胞(例えば、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞)、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、
ii)フソゲンが、フソゲン糖タンパク質以外のものである、
iii)フソゲンが、フェルチリン-β以外の哺乳動物のタンパク質である、
iv)フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
v)フソソームが、医薬品または適正製造基準(GMP)基準を満たしている、
vi)複数のフソソームを含む医薬製剤が、適正製造基準(GMP)に従って作製された、
vii)複数のフソソームを含む医薬製剤が、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、または
viii)複数のフソソームを含む医薬製剤が、所定の参照値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
295.上記実施形態のいずれかによる複数のフソソームを含む、フソソーム組成物またはフソソーム調製物。
296.複数のフソソームを含む、フソソーム組成物であって、少なくとも1つのフソソームが、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)と、
(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)、例えば、本明細書に記載される、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、またはオルガネラタンパク質ペイロード剤と、を含む、フソソーム組成物。
297.複数のフソソームのうちの少なくとも1つのフソソームが、ソース細胞に由来する、実施形態295または実施形態296に記載のフソソーム組成物。
298.フソソームが、4、0、-4、-10、-12、-16、-20、-80、または-160℃未満の温度にある、実施形態295~297のいずれかに記載のフソソーム組成物。
299.複数のフソソームが、少なくとも約103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、または1015フソソームを含む、実施形態295~298のいずれかに記載のフソソーム組成物。
300.複数のフソソームが同じである、実施形態295~299のいずれかに記載のフソソーム組成物。
301.フソソーム組成物中のフソソームの少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、もしくは80%~90%が、
同じフソゲンを含む、
同じタイプのソース細胞を使用して産生される、または
同じペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)を含む、から選択される少なくとも1つの特性を共有する場合、複数のフソソームが同じである、実施形態300に記載のフソソーム組成物。
302.複数のフソソームが異なる、実施形態295~299のいずれかに記載のフソソーム組成物。
303.複数のフソソームが、2つ以上のタイプのソース細胞に由来する、実施形態295~302のいずれかに記載のフソソーム組成物。
304.少なくとも1μL、2μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1mL、2mL、5mL、または10mLの体積を有する、実施形態295~303のいずれかに記載のフソソーム組成物。
305.複数のフソソームが、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、これらは機能的核を含まない、実施形態295~304のいずれかに記載のフソソーム組成物。
306.複数のフソソームが、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、これらは核を含まない、実施形態295~305のいずれかに記載のフソソーム組成物。
307.複数のフソソームが、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、これらは実質的に核DNAを含まない、実施形態295~306のいずれかに記載のフソソーム組成物。
308.複数のフソソームが、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、これらは機能的ミトコンドリアを含まない、実施形態295~307のいずれかに記載のフソソーム組成物。
309.複数のフソソームが、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、これらはミトコンドリアを含まない、実施形態295~308のいずれかに記載のフソソーム組成物。
310.タンパク質質量で0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、もしくは10%未満のソース細胞、または0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、もしくは10%未満の機能的核を有するソース細胞を含む、実施形態295~309のいずれかに記載のフソソーム組成物。
311.フソソーム組成物が、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、
i)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも1,000コピーのコピー数で存在する、または
ii)フソゲンのコピー数とフソゲンあたりのペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)のコピー数との比が、1,000,000:1~100,000:1、100,000:1~10,000:1、10,000:1~1,000:1、1,000:1~100:1、100:1~50:1、50:1~20:1、20:1~10:1、10:1~5:1、5:1~2:1、2:1~1:1、1:1~1:2、1:2~1:5、1:5~1:10、1:10~1:20、1:20~1:50、1:50~1:100、1:100~1:1,000、1:1,000~1:10,000、1:10,000~1:100,000、または1:100,000~1:1,000,000の間である、実施形態295~310のいずれかに記載のフソソーム組成物。
312.フソソーム組成物が、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)が、例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも1,000コピーのコピー数で存在する、実施形態295~311のいずれかに記載のフソソーム組成物。
313.複数のフソソームが、少なくとも約50nm、約80nm、約100nm、約200nm、約500nm、約1000nm、約1200nm、約1400nm、または約1500nmの平均径を有する、実施形態295~312のいずれかに記載のフソソーム組成物。
314.複数のフソソームが、約10nm~約100μmの範囲内の直径を有するフソソームを含む、実施形態295~313のいずれかに記載のフソソーム組成物。
315.複数が、約20nm~約200nm、約50nm~約200nm、約50nm~約100nm、約50nm~約150nm、または約100nm~約150nmの範囲内のサイズを有するフソソームを含む、実施形態295~314のいずれかに記載のフソソーム組成物。
316.複数のフソソームの少なくとも50%が、フソソーム組成物中のフソソームの平均径の10%、20%、30%、40%、または50%以内の直径を有する、実施形態295~315のいずれかに記載のフソソーム組成物。
317.複数が、約500nm3~約0.0006mm3、または約4,000nm3~約0.005μm3、約65,000nm3~約0.005μm3、約65,000nm3~約0.0006μm3、約65,000nm3~約0.002μm3、または約0.0006μm3~約0.002μm3の範囲内の体積を有するフソソームを含む、実施形態295~316のいずれかに記載のフソソーム組成物。
318.複数のフソソームの少なくとも50%が、フソソーム組成物中のフソソームの平均体積の10%、20%、30%、40%、または50%以内の体積を有する、実施形態295~317のいずれかに記載のフソソーム組成物。
319.複数のフソソームの少なくとも50%が、フソソーム組成物中のフソソームの平均フソゲンコピー数の10%、20%、30%、40%、または50%以内のフソゲンのコピー数を有する、実施形態295~318のいずれかに記載のフソソーム組成物。
320.複数のフソソームの少なくとも50%が、フソソーム組成物中のフソソームの平均ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)コピー数の10%、20%、30%、40%、または50%以内のペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)のコピー数を有する、実施形態295~319のいずれかに記載のフソソーム組成物。
321.組成物中のフソソームの10%、5%、4%、3%、2%、または1%未満が、内腔にオルガネラを含み、例えば、内腔が、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、ミトコンドリア、空胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、セントリオール、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、または顆粒のうちの1つ以上を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物。
322.上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物または調製物、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
323.所定の温度で少なくとも1、2、3、6、もしくは12時間;1、2、3、4、5、もしくは6日間;1、2、3、もしくは4週間;1、2、3、もしくは6ヶ月間;または1、2、3、4、もしくは5年間維持されている、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
324.所定の温度が、約4、0、-4、-10、-12、-16、-20、-80、または-160℃から選択される、実施形態323に記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
325.例えば、以下のうちの1つ以上により、前述の温度で維持される前に、複数の活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%の活性を有する、
i)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも10%高い割合で融合する、
ii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも50%高い割合で融合する、
iii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、24時間後に、標的細胞の少なくとも10%に送達されるような割合で標的細胞と融合する、または
iv)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、前述の温度で維持する前に、複数のフソゲンコピー数の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは99%のコピー数で存在する、実施形態323または実施形態324に記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
326.4℃未満の温度で少なくとも1、2、3、6、もしくは12時間;1、2、3、4、5、もしくは6日間;1、2、3、もしくは4週間;1、2、3、もしくは6ヶ月間;または1、2、3、4、もしくは5年間貯蔵安定である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
327.-20℃未満の温度で少なくとも1、2、3、6、もしくは12時間;1、2、3、4、5、もしくは6日間;1、2、3、もしくは4週間;1、2、3、もしくは6ヶ月間;または1、2、3、4、もしくは5年間貯蔵安定である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
328.-80℃未満の温度で少なくとも1、2、3、6、もしくは12時間;1、2、3、4、5、もしくは6日間;1、2、3、もしくは4週間;1、2、3、もしくは6ヶ月間;または1、2、3、4、もしくは5年間貯蔵安定である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
329.例えば、以下のうちの1つ以上により、組成物が、前述の温度で前述の期間にわたって貯蔵する前に、複数の活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%の活性を有する場合、組成物が安定であると見なされる、
i)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも10%高い割合で融合する、
ii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも50%高い割合で融合する、
iii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、24時間後に、標的細胞の少なくとも10%に送達されるような割合で標的細胞と融合する、または
iv)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、前述の温度で維持する前に、複数のフソゲンコピー数の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは99%のコピー数で存在する、実施形態326~328のいずれかに記載のフソソーム組成物または薬学的組成物。
330.以下の特徴のうちの1つ以上を有する、
a)薬学的組成物が、医薬品または適正製造基準(GMP)基準を満たしている、
b)薬学的組成物が、適正製造基準(GMP)に従って作製された、
c)薬学的組成物が、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、
d)薬学的組成物が、所定の参照値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない、または
e)薬学的組成物が、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、実施形態322~329のいずれかに記載の薬学的組成物。
331.フソソーム組成物を製造する方法であって、
a)例えば、フソゲンを発現することを含む、ソース細胞を提供することと、
b)ソース細胞からフソソームを産生することであって、フソソームが、脂質二重層、内腔、フソゲン、およびペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、またはオルガネラタンパク質ペイロード剤を含み、それによりフソソームを作製する、産生することと、
c)フソソームを、例えば、被験体への投与に適した薬学的組成物として製剤化することと、を含み、
xii)ソース細胞が、293細胞、HEK細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞以外のものである、
xiii)フソゲンが、ウイルスタンパク質以外のものである、
xiv)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、1.08g/mL~1.12g/mLの間以外の密度を有する、
xv)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例33のアッセイによって測定した場合、1.25g/mL+/-0.05の密度を有する、
xvi)フソソームが、循環中のスカベンジャー系または肝臓の洞内のクッパー細胞によって捕捉されない、
xvii)フソソームが、例えば、実施例76のアッセイにより、被験体の細網内皮系(RES)によって捕捉されない、
xviii)複数のフソソームが被験体に投与される場合、複数の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%未満が、例えば、実施例76のアッセイにより、24時間後にRESによって捕捉されない、
xix)フソソームが、5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm、または200μmを超える直径を有する、
xx)フソソームが、細胞生物学的物質を含む、
xxi)フソソームが、除核細胞を含む、あるいは
xxii)フソソームが、不活化核を含む、のうちの1つ以上である、方法。
332.フソゲンを発現するソース細胞を提供することが、ソース細胞において外因性フソゲンを発現させること、またはソース細胞において内因性フソゲンの発現を上方調節することを含む、実施形態331に記載の方法。
333.ソース細胞の核を不活化することを含む、実施形態331または実施形態332に記載の方法。
334.フソソーム組成物を製造する方法であって、
i)実施形態1~70のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態71~97のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態97に記載の薬学的組成物を提供することと、
ii)複数のフソソーム、フソソーム組成物、または薬学的組成物を、例えば、被験体への投与に適したフソソーム製剤として製剤化することと、を含む、方法。
335.フソソーム組成物が、少なくとも約103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、または1015フソソームを含む、実施形態331~334のいずれかに記載の方法。
336.フソソーム組成物が、少なくとも10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1L、2L、5L、10L、20L、または50Lの量を含む、実施形態331~335のいずれかに記載の方法。
337.ソース細胞、例えば哺乳動物細胞を、例えば、化学的除核、機械的力の使用、例えば、フィルターまたは遠心分離機の使用、細胞骨格の最小部分破壊によって除核することを含む、実施形態331~336のいずれかに記載の方法。
338.ソース細胞においてフソゲンまたは他の膜タンパク質を発現することを含む、実施形態331~337のいずれかに記載の方法。
339.小胞形成、低張処理、押出し、または遠心分離のうちの1つ以上を含む、実施形態331~338のいずれかに記載の方法。
340.細胞内で外因性作用物質を遺伝的に発現させること、または外因性作用物質をソース細胞もしくはフソソームにロードすることを含む、実施形態331~339のいずれかに記載の方法。
341.例えば、核を不活化する、例えば、ソース細胞を除核する前に、ソース細胞を、ポリペプチド剤をコードするDNAと接触させることを含む、実施形態331~340のいずれかに記載の方法。
342.例えば、核を不活化する、例えば、ソース細胞を除核する前または後に、ソース細胞を、ポリペプチド剤をコードするRNAと接触させることを含む、実施形態331~341のいずれかに記載の方法。
343.ペイロード、例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤(例えば、核酸またはタンパク質)を、例えば、エレクトロポレーションによって、フソソームに導入することを含む、実施形態331~342のいずれかに記載の方法。
344.ソース細胞が、内皮細胞、線維芽球、血液細胞(例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球)、幹細胞(例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞)、胚性幹細胞(例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯からの幹細胞、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織)、筋芽細胞、実質細胞(例えば、肝細胞)、肺胞細胞、ニューロン(例えば、網膜神経細胞)、前駆細胞(例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球)、前駆細胞(例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞)、または不死化細胞(例えば、HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR90、IMR91、PER.C6、HT-1080、もしくはBJ細胞)である、実施形態331~343のいずれかに記載の方法。
345.フソソームが、修飾されたゲノムを有する、例えば、(例えば、MHC複合体を除去するためのゲノム編集によって)免疫原性が低下した哺乳動物細胞に由来する、実施形態331~344のいずれかに記載の方法。
346.ソース細胞が、抗炎症シグナルで処理された細胞培養物に由来する、実施形態331~345のいずれかに記載の方法。
347.例えば、核を不活化する、例えば、細胞を除核する前または後に、工程a)のソース細胞を、抗炎症シグナルと接触させることを更に含む、実施形態331~346のいずれかに記載の方法。
348.フソソーム医薬品組成物を製造する方法であって、
a)例えば、実施形態1~70のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態71~97のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態97に記載の薬学的組成物を提供することと、
b)以下の基準のうちの1つ以上(例えば、2、3、または全て)が満たされているかどうかを決定するために、複数からの1つ以上のフソソームをアッセイすることと、
i)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも10%高い割合で融合する、
ii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、他のフソソームよりも標的細胞と、例えば、少なくとも50%高い割合で融合する、
iii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、24時間後に、標的細胞の少なくとも10%に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
iv)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数で存在する、
v)フソソームが、例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数でペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)を含む、
vi)フソゲンのコピー数とペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)のコピー数との比が、1,000,000:1~100,000:1、100,000:1~10,000:1、10,000:1~1,000:1、1,000:1~100:1、100:1~50:1、50:1~20:1、20:1~10:1、10:1~5:1、5:1~2:1、2:1~1:1、1:1~1:2、1:2~1:5、1:5~1:10、1:10~1:20、1:20~1:50、1:50~1:100、1:100~1:1,000、1:1,000~1:10,000、1:10,000~1:100,000、または1:100,000~1:1,000,000の間である、
vii)フソソームが、CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGのうちの1つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの75%以内である脂質組成物を含む、
viii)フソソームが、例えば、実施例42のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
ix)フソソームが、例えば、実施例49のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質とタンパク質との比率を含む、
x)フソソームが、例えば、実施例50のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内であるタンパク質と核酸(例えば、DNA)との比率を含む、
xi)フソソームが、例えば、実施例51のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、または50%以内である脂質と核酸(例えば、DNA)との比率を含む、
xii)フソソームが、被験体、例えば、マウスにおいて、例えば、実施例75のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の90%以内の半減期を有する、
xiii)フソソームが、例えば、実施例64のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも10%多く、グルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)を膜を横切って輸送する、
xiv)フソソームが、例えば、実施例66のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の90%以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む、
xv)フソソームが、例えば、実施例68に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性(例えば、クエン酸合成酵素活性)の90%以内の代謝活性レベルを含む、
xvi)フソソームが、例えば、実施例69に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの90%以内の呼吸レベル(例えば、酸素消費率)を含む、
xvii)フソソームが、例えば、実施例70のアッセイを使用して、最大で18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、もしくは10,000MFIのアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含むか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、もしくは50%低いアネキシンV染色レベルを含む、
xviii)フソソームが、例えば、実施例39のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも1%のmiRNA含有量レベルを有する、
xix)フソソームが、例えば、実施例47のアッセイにより、ソース細胞のそれの90%以内である可溶性:不溶性タンパク質比を有する、
xx)フソソームが、例えば、実施例48のアッセイによって測定した場合、フソソームの脂質含有量の5%未満のLPSレベルを有する、
xxi)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例63のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも10%多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したAKTリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)の取込みが可能である、
xxii)フソソームが、例えば、実施例71のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞または骨髄間質細胞(BMSC)によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも5%大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
xxiii)フソソームが、例えば、実施例72のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも5%大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する、
フソソームは、例えば、実施例73のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞またはC2C12細胞における重合アクチンのレベルと比較して、5%以内のレベルでアクチンを重合する、
フソソームは、例えば、実施例74のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはC2C12細胞の膜電位の約5%以内の膜電位を有するか、またはフソソームは、約-20~-150mV、-20~-50mV、-50~-100mV、もしくは-100~-150mVの膜電位を有する、
xxvi)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例62のアッセイを使用して、例えば、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも少なくとも5%大きい割合でタンパク質を分泌することができる、あるいは
xxvii)フソソームが、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する;
c)(任意に)基準のうちの1つ以上が満たされた場合に、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含み、
それにより、フソソーム医薬品組成物を製造する、方法。
349.フソソーム医薬品組成物を製造する方法であって、
a)例えば、実施形態1~70のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態71~97のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態97に記載の薬学的組成物を提供する、例えば、産生する、提供することと、
b)以下の因子のうちの1つ以上の存在またはレベルを決定するために、複数からの1つ以上のフソソームをアッセイすることと、
i)免疫原性分子、例えば、免疫原性タンパク質、例えば、本明細書に記載されるようなもの、
ii)病原体、例えば、細菌もしくはウイルス、または
iii)汚染物質、
c)(任意に)因子のうちの1つ以上が参照値を下回る場合に、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含み、
それにより、フソソーム医薬品組成物を製造する、方法。
350.検出可能なレベル、例えば、参照値を超える値が決定される場合、複数のフソソームまたはフソソーム組成物を含有する試料が廃棄される、実施形態349に記載の方法。
351.フソソーム組成物を製造する方法であって、
a)本明細書に記載の複数のフソソームまたは本明細書に記載のフソソーム組成物を提供することと、
b)フソソームを、例えば、被験体への投与に適した薬学的組成物として製剤化することと、を含む、方法。
352.フソソーム組成物を製造する方法であって、
a)例えば、本明細書に記載の複数のフソソームまたはフソソーム調製物を提供する、例えば、産生することと、
b)1つ以上(例えば、2、3、またはそれ以上)の基準が満たされているかどうかを決定するために、複数の(例えば、調製物の)試料を分析することと、を含む、方法。
353.フソソーム組成物を製造する方法であって、
a)本明細書に記載の複数のフソソーム、または本明細書に記載のフソソーム組成物もしくは調製物を提供する、例えば、産生することと、
b)複数または調製物の試料をアッセイして、以下の因子のうちの1つ以上の存在またはレベルを決定することと、
i)免疫原性分子、例えば、免疫原性タンパク質、例えば、本明細書に記載されるようなもの、
ii)病原体、例えば、細菌もしくはウイルス、または
iii)汚染物質(例えば、核構造もしくは核DNAなどの成分)、
c)(任意に)因子のうちの1つ以上が参照値から大幅に(例えば、指定された量を超えて)逸脱している場合に、複数のフソソームもしくはフソソーム調製物を放出することを承認するか、または(任意に)1つ以上の因子が参照値から大幅に逸脱していない(例えば、指定された約を超えて逸脱していない)場合に、複数のフソソームもしくはフソソーム調製物を医薬品として製剤化することと、を含む、方法。
354.フソソーム組成物を製造する方法であって、
i)本明細書に記載の複数のフソソーム、フソソーム組成物、または薬学的組成物を提供することと、
ii)複数のフソソーム、フソソーム組成物、または薬学的組成物を、例えば、被験体への投与に適したフソソーム製剤として製剤化することと、を含む、方法。
355.フソソーム組成物を製造する方法であって、
a)本明細書に記載の複数のフソソーム、フソソーム組成物、または薬学的組成物を提供することと、
b)以下の因子のうちの1つ以上の存在またはレベルを決定するために、複数からの1つ以上のフソソームをアッセイすることと、
i)免疫原性分子、例えば、免疫原性タンパク質、例えば、本明細書に記載されるようなもの、
ii)病原体、例えば、細菌もしくはウイルス、または
iii)汚染物質、
c)(任意に)因子のうちの1つ以上が参照値を下回る場合に、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含み、
それにより、フソソーム医薬品組成物を製造する、方法。
356.以下のうちの1つ以上が存在する、
i)ソース細胞が、293細胞、HEK細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞以外のものである、
ii)フソゲンが、ウイルスタンパク質以外のものである、
iii)複数のフソソームを含む調製物が、1.08g/mL~1.12g/mL以外の密度を有する、
iv)複数のフソソームを含む調製物が、例えば、実施例33のアッセイによって測定した場合、1.25g/mL+/-0.05の密度を有する、
v)フソソームが、循環中のスカベンジャー系または肝臓の洞内のクッパー細胞によって実質的に捕捉されない、
vi)フソソームが、例えば、実施例76のアッセイにより、被験体の細網内皮系(RES)によって実質的に捕捉されない、
vii)複数のフソソームが被験体に投与される場合、該複数の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%未満が、例えば、実施例76のアッセイにより、24、48、または72時間後にRESによって捕捉される、
viii)フソソームが、5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm、または200μmを超える直径を有する、
ix)フソソームが、細胞生物学的物質を含む、
x)フソソームが、除核細胞を含む、あるいは
xi)フソソームが、不活化核を含む、のうちの1つ以上である、実施形態102~356のいずれかに記載の方法。
357.フソソーム組成物を被験体、例えば、ヒト被験体に送達する方法であって、実施形態1~70のいずれかによる複数のフソソームを含むフソソーム組成物、実施形態71~97のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態97に記載の薬学的組成物を被験体に投与することを含み、それによりフソソーム組成物を被験体に投与する、方法。
358.ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)を被験体に送達する方法であって、実施形態1~70のいずれかによる複数のフソソームを含むフソソーム組成物、実施形態71~97のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態97に記載の薬学的組成物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物が、ペイロードが送達されるような量および/または時間で投与される、方法。
359.被験体における生物学的機能を調節する、例えば、増強する方法であって、被験体に投与すること、または標的組織もしくは細胞を、実施形態1~70のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態71~97のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態97に記載の薬学的組成物と接触させることを含み、それにより被験体における生物学的機能を調節する、方法。
360.生物学的機能が、
a)2つの細胞間の相互作用を調節する、例えば、増加または減少させる、
b)免疫応答を調節する、例えば、増加または減少させる、
c)標的組織への細胞の動員を調節する、例えば、増加または減少させる、
d)癌の成長率を低下させる、または
e)被験体における癌細胞の数を低減する、から選択される、実施形態359に記載の方法。
361.機能を被験体に送達する方法であって、実施形態1~70のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態71~97のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態97に記載の薬学的組成物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物が、被験体における機能が送達されるような量および/または時間で投与される、方法。
362.機能を被験体に標的化する方法であって、実施形態1~70のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態71~97のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態97に記載の薬学的組成物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物が、被験体における機能が標的化されるような量および/または時間で投与される、方法。
363.機能を被験体に送達または標的化する方法であって、本明細書に記載される複数のフソソームを含むフソソーム組成物、フソソーム組成物、または薬学的組成物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物が、被験体における機能が送達または標的化されるような量および/または時間で投与される、方法。
364.患者における疾患または障害を治療する方法であって、実施形態1~70のいずれかによる複数のフソソーム、実施形態71~97のいずれかに記載のフソソーム組成物、または実施形態97に記載の薬学的組成物を被験体に投与することを含み、フソソーム組成物が、疾患または障害が治療されるような量および/または時間で投与される、方法。
365.疾患または障害が、癌、自己免疫障害、または感染症から選択される、実施形態364に記載の方法。
366.複数のフソソームが、局所効果を有する、実施形態357~365のいずれかに記載の方法。
367.複数のフソソームが、遠位効果を有する、実施形態357~365のいずれかに記載の方法。
368.複数のフソソームが、全身効果を有する、実施形態357~365のいずれかに記載の方法。
369.被験体が、癌を有する、実施形態357~368のいずれかに記載の方法。
370.被験体が、癌を有し、フソソームが、新生抗原を含む、実施形態369に記載の方法。
371.フソソーム組成物が、被験体に少なくとも1、2、3、4、または5回投与される、実施形態357~370のいずれかに記載の方法。
372.フソソーム組成物が、全身的に(例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内に)または局所的に被験体に投与される、実施形態357~370のいずれかに記載の方法。
373.フソソーム組成物が、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼から選択される標的組織に到達するように、フソソーム組成物が被験体に投与される、実施形態357~372のいずれかに記載の方法。
374.フソソーム組成物が、免疫抑制物質、例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、またはイムノフィリンモジュレーターと同時投与される、実施形態357~373のいずれかに記載の方法。
375.フソソーム組成物が、免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと同時投与される、実施形態357~374のいずれかに記載の方法。
376.方法が、標的細胞の細胞質ゾルに作用物質を送達することを含み、任意に、細胞質ゾルが送達される作用物質が、タンパク質(またはタンパク質をコードするか、もしくはタンパク質をコードするものに相補的である核酸、例えば、例えば、タンパク質をコードするDNA、gDNA、cDNA、RNA、pre-mRNA、mRNA等)である、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
377.フソソーム組成物をヒト被験体に投与する方法であって、
a)被験体の1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第1のフソゲンを被験体に投与することであって、
i)第1のフソゲンを投与することが、1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第1のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ii)第1のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの1つ以上である、投与することと、
b)第2のフソゲンを含む複数のフソソームを含む、フソソーム組成物をヒト被験体に投与することと、を含み、第2のフソゲンが、第1のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)を更に含み、
それにより、フソソーム組成物を被験体に投与する、方法。
378.ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)を被験体に送達する方法であって、
a)被験体の1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第1のフソゲンを被験体に投与することであって、
i)第1のフソゲンを投与することが、1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第1のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ii)第1のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの1つ以上である、投与することと、
b)第2のフソゲンおよび治療薬を含む複数のフソソームを含む、フソソーム組成物をヒト被験体に投与することと、を含み、第2のフソゲンが、第1のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)を更に含み、
それにより、ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)を被験体に送達する、方法。
379.被験体における生物学的機能を調節する、例えば増強する方法であって、
a)被験体の1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの配置を可能にする条件下で、第1のフソゲンを被験体に投与することであって、
i)第1のフソゲンを投与することが、1つ以上の標的細胞における第1のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第1のフソゲンをコードする核酸を投与することを含む、または
ii)第1のフソゲンが、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの1つ以上である、投与することと、
b)第2のフソゲンを含む複数のフソソームを含む、フソソーム組成物をヒト被験体に投与することと、を含み、第2のフソゲンが、第1のフソゲンと適合性であり、複数のフソソームが、ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)を更に含み、
それにより、被験体における生物学的機能を調節する、方法。
380.ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)が、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する、実施形態377~379のいずれかに記載の方法。
381.ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)が、
i)転写活性化因子、例えば、表17-1の転写活性化因子、
ii)転写抑制因子、例えば、表171の転写抑制因子、
iii)エピジェネティック修飾因子、例えば、表17-1のエピジェネティック修飾因子、
iv)ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、例えば、表17-1のヒストンアセチルトランスフェラーゼ、
v)ヒストンデアセチラーゼ、例えば、表17-1のヒストンデアセチラーゼ、
vi)ヒストンメチルトランスフェラーゼ、例えば、表17-1のヒストンメチルトランスフェラーゼ、
vii)DNAメチルトランスフェラーゼ、例えば、表17-1のDNAメチルトランスフェラーゼ、
viii)DNAニッカーゼ、例えば、本明細書に記載のDNAニッカーゼ、
ix)部位特異的DNA編集酵素、例えば、表17-1のデアミナーゼ、
x)DNAトランスポザーゼ、例えば、本明細書に記載のDNAトランスポザーゼ、
xi)DNAインテグラーゼ、例えば、本明細書に記載のDNAインテグラーゼ、
xii)RNAエディター、例えば、表17-1のRNAエディター、
xiii)RNAスプライシング因子、例えば、表17-1のRNAスプライシング因子、または
xiv)PIWIタンパク質、例えば、本明細書に記載のPIWIタンパク質、のうちの1つ以上を含むか、もしくはコードする、実施形態377~379のいずれかに記載の方法。
382.複数のフソソームが、局所効果を有するか、または遠位効果を有する、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
383.フソゲンを発現するソース細胞を提供すること(ソース細胞における外因性フソゲンを発現することを含む)、またはソース細胞における内因性フソゲンの発現を上方調節することを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
384.ソース細胞の核を不活化することを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
385.例えば、化学的除核、機械的力の使用、例えば、フィルターもしくは遠心分離機の使用、細胞骨格の少なくとも部分的破壊、またはそれらの組み合わせによって、哺乳動物細胞を除核することを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
386.ソース細胞においてフソゲンまたは他の膜タンパク質を発現することを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
387.小胞形成、低張処理、押出し、または遠心分離のうちの1つ以上を含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
388.ソース細胞内で外因性作用物質を遺伝的に発現させること、または外因性作用物質をソース細胞もしくはフソソームにロードすることを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
389.例えば、核を不活化する、例えば、細胞を除核する前に、細胞を、ポリペプチド剤をコードするDNAと接触させることを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
390.例えば、核を不活化する、例えば、細胞を除核する前または後に、細胞を、ポリペプチド剤をコードするRNAと接触させることを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
391.例えば、エレクトロポレーションによって、治療薬(例えば、核酸またはタンパク質)をフソソームに導入することを含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
392.フソソームが、例えば、免疫原性を低下させるために(例えば、ゲノム編集によって、例えば、MHCタンパク質を除去するために)修飾されたゲノムを有する哺乳動物細胞に由来し、任意に、方法が、例えば、核を不活化する、例えば、細胞を除核する前または後に、工程a)のソース細胞を免疫抑制物質と接触させることを更に含む、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
393.検出可能なレベル、例えば、参照値を超える値が決定される場合、複数のフソソームまたはフソソーム組成物もしくは調製物を含有する試料が廃棄される、上記実施形態のいずれかに記載の方法。
394.上記実施形態のいずれかに記載の方法であって、
a)癌の進行、腫瘍の後退、腫瘍の体積、新生物細胞数の減少、融合細胞の量、ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)を含む融合細胞の量、核酸タンパク質ペイロードを発現する融合細胞の量、および融合細胞の膜に配置された膜タンパク質の量をモニターする工程、ならびに/または
b)生物の有害事象をモニターする工程を更に含み、任意に、有害事象には、サイトカイン放出症候群、発熱、頻脈、寒気、食欲不振、悪心、嘔吐、筋痛、頭痛、毛細血管漏出症候群、低血圧、肺水腫、凝固障害、腎機能障害、腎障害、マクロファージ活性化症候群、血球貪食性リンパ組織球症、臓器不全、脳浮腫、T細胞活性化によるバイスタンダー炎症、神経症状、脳症、混乱、幻覚、せん妄、昏睡、失語症、発作、B細胞形成不全、腫瘍溶解症候群、および移植片対宿主疾患のうちの1つ以上が含まれる、方法。
395.第1のフソゲンが、リポペプチドではない、実施形態377~379のいずれかに記載の方法。
396.
融合細胞の量、ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)を含む融合細胞の量、ペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)を発現する融合細胞の量、および融合細胞の核内に配置された膜タンパク質の量のうちの1つ以上をモニターする工程を更に含む、実施形態357~395のいずれかに記載の方法。
397.生物における有害事象をモニターする工程を更に含む、実施形態357~396のいずれかに記載の方法。
398.有害事象には、サイトカイン放出症候群、発熱、頻脈、寒気、食欲不振、悪心、嘔吐、筋痛、頭痛、毛細血管漏出症候群、低血圧、肺水腫、凝固障害、腎機能障害、腎障害、マクロファージ活性化症候群、血球貪食性リンパ組織球症、臓器不全、脳浮腫、T細胞活性化によるバイスタンダー炎症、神経症状、脳症、混乱、幻覚、せん妄、昏睡、失語症、発作、B細胞形成不全、腫瘍溶解症候群、および移植片対宿主疾患のうちの1つ以上が含まれる、実施形態397に記載の方法。
399.生物が、ヒトである、実施形態357~398のいずれかに記載の方法。
400.ヒトが、疾患、障害、または状態を有する、実施形態399に記載の方法。
401.標的細胞の細胞膜脂質二重層中のペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、またはオルガネラタンパク質ペイロード剤)の存在が、疾患、障害、または状態の1つ以上の症状を改善する、実施形態400に記載の方法。
402.CARが、
a)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメイン(例えば、1つ、2つ、または3つのシグナル伝達ドメイン)を含む第一世代のCAR、
b)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも3つのシグナル伝達ドメインを含む第三世代のCAR、
c)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、3つまたは4つのシグナル伝達ドメイン、およびCARのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む第四世代のCARであるか、またはそれらを含み、
任意に、抗原結合ドメインが、scFvまたはFabである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
403.CAR抗原結合ドメインが、B細胞、形質細胞、形質芽細胞、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、インターフェロン受容体、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5、またはCD2上で発現されるリガンドに結合する、実施形態401または402に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
404.CAR膜貫通ドメインが、少なくともT細胞受容体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、またはそれらの機能的バリアントのα、β、もしくはζ鎖の膜貫通領域を含む、実施形態401~403のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
405.膜貫通ドメインが、少なくともCD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS、およびFGFR2B、またはそれらの機能的バリアントの膜貫通領域(複数可)を含む、実施形態401~404のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
406.CARが、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6)、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BBリガンド/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFFR/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27リガンド/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30リガンド/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40リガンド/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITRリガンド/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、リンホトキシン-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40リガンド/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α、TNFRII/TNFRSF1B)、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150)、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLAクラスI、HLA-DR、イカロス、インテグリンα4/CD49d、インテグリンα4β1、インテグリンα4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、CAP12、デクチン-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLPR、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、NKG2C、CD3ζドメイン、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、またはそれらの機能的フラグメントのうちの1つ以上から選択される少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む、実施形態401~405のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
407.CARが、CD3ζドメイン、または免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)、またはその機能的バリアントを含む、実施形態401~406のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。幾つかの実施形態では、CARは、(i)CD3ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)、またはその機能的バリアント;(ii)CD28ドメイン、もしくは4-1BBドメイン、またはその機能的バリアント;および(iii)4-1BBドメイン、もしくはCD134ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。
408.CARが、1つ以上のスペーサーを更に含み、例えば、スペーサーが、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間の第1のスペーサーであり、任意に、第1のスペーサーが、免疫グロブリン定常領域またはそのバリアントもしくは修飾バージョンの少なくとも一部を含み、任意に、スペーサーが、膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間の第2のスペーサーであり、任意に、第2のスペーサーが、オリゴペプチドであり、例えば、オリゴペプチドが、グリシン-セリンダブレットを含む、実施形態401~407のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
409.抗原結合ドメインが、新生物細胞に特徴的な抗原を標的とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
410.新生物細胞に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Gタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン/スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、表皮成長因子受容体(EGFR)(ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3、およびErbB4/HER4を含む)、線維芽細胞成長因子受容体(FGFR)(FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18、およびFGF21を含む)血管内皮成長因子受容体(VEGFR)(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、およびPIGFを含む)、RET受容体およびEph受容体ファミリー(EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、およびEphB6を含む)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、ベストロフィン、TMEM16A、GABA受容体、グリシン受容体、ABCトランスポーター、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、スフィンゴシン-1-リン酸受容体(S1P1R)、NMDAチャネル、膜貫通タンパク質、マルチスパン膜貫通タンパク質、T細胞受容体モチーフ。T細胞アルファ鎖、T細胞β鎖、T細胞γ鎖、T細胞δ鎖、CCR7、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD34、CD35、CD40、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD62L、CD68、CD80、CD95、CD117、CD127、CD133、CD137(4-1BB)、CD163、F4/80、IL-4Ra、Sca-1、CTLA-4、GITR、GARP、LAP、グランザイムB、LFA-1、トランスフェリン受容体、NKp46、パーフォリン、CD4+、Th1、Th2、Th17、Th40、Th22、Th9、Tfh、古典的Treg、FoxP3+、Tr1、Th3、Treg17、TREG、CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG-72、炭酸アンヒドラーゼIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド(例えば、CD2、CD3、GM2など)、ルイス-γ2、VEGF、VEGFR1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、テネイシン、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、Smoothened、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR、またはANTXR1、葉酸受容体アルファ(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、上皮成長因子受容体(EGFR)、メソテリン、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、TnAg、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、インターロイキン-11受容体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、ルイスY、CD24、血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFRベータ)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、プロスターゼ、PAP、ELF2M、エフリンB2、IGF-1受容体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、テロメラーゼ、フコシルGM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-アセチル-GD2、葉酸受容体ベータ、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、ポリシアル酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、レグマイン、HPVE6、E7、ETV6-AML、精子タンパク質17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos関連抗原1、p53、p53変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、PCTA-1/ガレクチン8、MelanA/MART1、Ras変異体、hTERT、肉腫転座ブレークポイント、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2、腸内カルボキシルエステラーゼ、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新生抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C)CD49f、CD151、CD340、CD200、tkrA、trkB、trkC、あるいはそれらの抗原性フラグメントまたは抗原性部分から選択される、実施形態409に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
411.抗原結合ドメインが、T細胞に特徴的な抗原を標的とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
412.T細胞に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、膜輸送タンパク質(例えば、イオンチャネルタンパク質、孔形成タンパク質等の能動もしくは受動輸送タンパク質)、膜貫通受容体、膜酵素、および/またはT細胞に特徴的な細胞接着タンパク質から選択される、実施形態411に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
413.T細胞に特徴的な抗原が、Gタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン/スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、AKT1;AKT2;AKT3;ATF2;BCL10;CALM1;CD3D(CD3δ);CD3E(CD3ε);CD3G(CD3γ);CD4;CD8;CD28;CD45;CD80(B7-1);CD86(B7-2);CD247(CD3ζ);CTLA4(CD152);ELK1;ERK1(MAPK3);ERK2;FOS;FYN;GRAP2(GADS);GRB2;HLA-DRA;HLA-DRB1;HLA-DRB3;HLA-DRB4;HLA-DRB5;HRAS;IKBKA(CHUK);IKBKB;IKBKE;IKBKG(NEMO);IL2;ITPR1;ITK;JUN;KRAS2;LAT;LCK;MAP2K1(MEK1);MAP2K2(MEK2);MAP2K3(MKK3);MAP2K4(MKK4);MAP2K6(MKK6);MAP2K7(MKK7);MAP3K1(MEKK1);MAP3K3;MAP3K4;MAP3K5;MAP3K8;MAP3K14(NIK);MAPK8(JNK1);MAPK9(JNK2);MAPK10(JNK3);MAPK11(p38β);MAPK12(p38γ);MAPK13(p38δ);MAPK14(p38α);NCK;NFAT1;NFAT2;NFKB1;NFKB2;NFKBIA;NRAS;PAK1;PAK2;PAK3;PAK4;PIK3C2B;PIK3C3(VPS34);PIK3CA;PIK3CB;PIK3CD;PIK3R1;PKCA;PKCB;PKCM;PKCQ;PLCY1;PRF1(パーフォリン);PTEN;RAC1;RAF1;RELA;SDF1;SHP2;SLP76;SOS;SRC;TBK1;TCRA;TEC;TRAF6;VAV1;VAV2;またはZAP70であり得る、実施形態411または412に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
414.抗原結合ドメインが、自己免疫または炎症障害に特徴的な抗原を標的とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
415.自己免疫性または炎症性障害が、慢性移植片対宿主病(GVHD)、ループス、関節炎、免疫複合体糸球体腎炎、グッドパスチャー、ブドウ膜炎、肝炎、全身性硬化症または強皮症、I型糖尿病、多発性硬化症、寒冷凝集素疾患、尋常性ペンフィガス、グレイブス病、自己免疫性溶血性貧血、血小板減少症A、原発性シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、神経骨髄性視神経症、エバン症候群、IgM媒介性神経障害、サイログロブリン血症、皮膚筋炎、特発性血小板減少症、強直性脊椎炎、水疱性類天疱瘡、後天性血管浮腫、慢性蕁麻疹、抗リン脂質脱髄性多発神経障害、および自己免疫性血小板減少症または好中球減少症または純粋な赤血球形成不全から選択され、一方、同種免疫疾患の例示的な非限定的な例には、同種感作(例えば、Blazar et al.,2015,Am.J.Transplant,15(4):931-41を参照)または造血器もしくは実質臓器移植からの異種感作、輸血、胎児同種感作を伴う妊娠、新生児同種免疫性血小板減少症、新生児溶血性疾患、酵素またはタンパク質補充療法、血液製品、および遺伝子治療で治療される先天性もしくは後天性欠損障害の置換により起こり得るような外来抗原に対する感作が挙げられ、任意に、自己免疫または炎症障害に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Gタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型じゅようたい、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン/スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ会合型受容体から選択される、実施形態414に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
416.抗原結合ドメインが、感染症に特徴的な抗原を標的とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
417.感染症が、HIV、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス8(HHV-8、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV))、ヒトTリンパ球向性ウイルス-1(HTLV-1)、メルケル細胞ポリオーマウイルス(MCV)、シミアンウイルス40(SV40)、エプトスタイン・バーウイルス、CMV、ヒトパピローマウイルスから選択され、任意に、感染症に特徴的な抗原が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Gタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン/スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、HIV、Env、gpl20、またはHIV-1 Env上のCD4誘導性エピトープから選択される、実施形態416に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
418.標的細胞が、凝集またはミスフォールド膜タンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
419.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞における凝集もしくはミスフォールドタンパク質のレベルを低下させることができる(例えば、レベルを低下させる)か、または本明細書の方法が、標的細胞における凝集もしくはミスフォールドタンパク質のレベルを低下させることを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
420.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞の細胞膜に膜タンパク質を送達することができる(例えば、送達する)、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
421.タンパク質を送達することが、タンパク質をコードする核酸(例えば、DNA、gDNA、cDNA、RNA、pre-mRNA、mRNA等)を標的細胞に送達することを含み、それにより標的細胞が、タンパク質を産生し、それを膜に局在化する、実施形態420に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
422.フソソームが、タンパク質を含むか、または方法が、タンパク質を送達することを含み、フソソームと標的細胞との融合が、標的細胞の細胞膜にタンパク質を運ぶ、実施形態420または421に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
423.タンパク質が、細胞表面リガンドまたは細胞表面受容体に結合する抗体を含む、実施形態420~422のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
424.フソソームが、細胞表面受容体に結合する第2の細胞表面リガンドまたは抗体を含むか、またはコードし、任意に、細胞表面受容体に結合する1つ以上の追加の細胞表面リガンドまたは抗体(例えば、1、2、3、4、5、10、20、50、もしくはそれ以上)を更に含むか、またはコードする、第2の作用物質を更に含むか、あるいは方法が、それを送達することを更に含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
425.第1の作用物質および第2の作用物質が、複合体を形成し、任意に、複合体が、1つ以上の追加の細胞表面リガンドを更に含む、実施形態424に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
426.作用物質が、細胞表面受容体、例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する細胞表面を含むか、またはコードする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
427.フソソームが、第2の細胞表面受容体を含むか、またはコードし、任意に、1つ以上の追加の細胞表面受容体(例えば、1、2、3、4、5、10、20、50、もしくはそれ以上の追加の細胞表面受容体)を更に含むか、またはコードする、第2の作用物質を更に含むか、あるいは方法が、それを送達することを更に含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
428.第2の作用物質、例えば、治療薬が、タンパク質、タンパク質複合体(例えば、少なくとも2、3、4、5、10、20、もしくは50個のタンパク質、例えば、少なくとも少なくとも2、3、4、5、10、20、もしくは50個の異なるタンパク質)ポリペプチド、核酸(例えば、DNA、染色体、もしくはRNA、例えば、mRNA、siRNA、もしくはmiRNA)、または小分子から選択される、実施形態427に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
429.第1の作用物質および第2の作用物質が、複合体を形成し、任意に、複合体が、1つ以上の追加の細胞表面受容体を更に含み、任意に、作用物質が、抗原または抗原提示タンパク質を含むか、またはコードする、実施形態427または428に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
430.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、標的細胞がタンパク質を産生および分泌することを可能にする条件下で、タンパク質を標的細胞にコードする核酸(例えば、DNA、gDNA、cDNA、RNA、pre-mRNA、mRNA等)を標的細胞に送達することによって、分泌された作用物質、例えば、分泌されたタンパク質を標的部位(例えば、細胞外領域)に送達するか、または送達することができる(例えば、送達する)、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
431.分泌されたタンパク質が、ソース細胞に対して、または標的細胞に対して内因性または外因性である、実施形態430に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
432.分泌されたタンパク質が、治療用タンパク質、例えば、抗体分子、サイトカイン、酵素、オートクリンシグナル伝達分子、パラクリンシグナル伝達分子、または分泌顆粒を含む、実施形態430または431に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
433.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、膜タンパク質、または抗原であるか、もしくはそれを含む分泌された細胞を送達するか、または送達することができる(例えば、送達する)、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
434.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、膜タンパク質、または任意に、抗原と一緒に(例えば、複合体として)、抗原抗原提示タンパク質であるか、もしくはそれを含む膜タンパク質もしくは分泌タンパク質を送達するか、または送達することができる(例えば、送達する)、実施形態433に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
435.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、1つ以上の細胞表面受容体を標的細胞(例えば、免疫細胞)に供与するか、または供与することができる(例えば、供与する)、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
436.標的細胞が、腫瘍細胞であるか、またはそれを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
437.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、免疫刺激リガンド、抗原提示タンパク質、腫瘍抑制タンパク質、アポトーシス促進タンパク質、または前述のうちのいずれかの受容体もしくは結合パートナーであるか、またはそれを含む膜もしくは分泌タンパク質を送達するか、もしくは送達することができる(例えば、送達する)、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
438.フソソームが、免疫調節性、例えば、免疫刺激性である作用物質(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤、および任意に、少なくとも1つの第2の作用物質)を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
439.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞に抗原を提示させるか、または提示させることができる(例えば、提示させる)、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
440.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、標的細胞における遺伝子発現を一時的に修飾するために、または例えば、標的細胞のゲノムへの組込みによって修飾する、例えば、本明細書に記載の膜タンパク質(または分泌タンパク質)の発現を引き起こすために、核酸を標的細胞に送達するか、または送達することができる(例えば、送達する)、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
441.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、タンパク質(例えば、トランスポータータンパク質などの膜タンパク質、もしくは免疫抑制タンパク質などの分泌タンパク質)を標的細胞に送達するか、または送達することができ(例えば、送達する)、それにより標的細胞のタンパク質欠損が、少なくとも一時的に救済されるようにする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
442.膜タンパク質が、例えば、1つ以上の炭水化物部分、脂質部分、ポリエチレングリコール部分、小分子等の1つ以上の共有結合した非ペプチド部分、およびそれらの組み合わせを含み得る、実施形態441に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
443.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞にタンパク質、例えば、治療用タンパク質を分泌させるか、または分泌させることができる(例えば、分泌させる)、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
444.細胞表面リガンドを有するフソソームが、好中球(例えば、および標的細胞が腫瘍浸潤リンパ球である)、樹状細胞(例えば、および標的細胞がナイーブT細胞である)、または好中球(例えば、および標的が腫瘍細胞またはウイルス感染細胞である)から選択されるソース細胞に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
445.フソソームが、膜複合体、例えば、少なくとも2、3、4、または5つのタンパク質を含む複合体、例えば、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、またはヘテロ四量体を含む、実施形態444に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
446.フソソームが、抗体、例えば、毒性抗体を含み、例えば、フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、標的部位にホーミングすることによって、抗体を標的部位に送達することができる(例えば、送達する)、実施形態444または445に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
447.ソース細胞が、NK細胞または好中球である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
448.膜タンパク質が、細胞表面受容体、イオンチャネル結合受容体、酵素結合受容体、Gタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ会合型受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン/スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ会合型受容体、表皮成長因子受容体(EGFR)(ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3、およびErbB4/HER4を含む)、線維芽細胞成長因子受容体(FGFR)(FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18、およびFGF21を含む)血管内皮成長因子受容体(VEGFR)(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、およびPIGFを含む)、RET受容体およびEph受容体ファミリー(EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、およびEphB6を含む)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、ベストロフィン、TMEM16A、GABA受容体、グリシン受容体、ABCトランスポーター、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、スフィンゴシン-1-リン酸受容体(S1P1R)、NMDAチャネル、膜貫通タンパク質、マルチスパン膜貫通タンパク質、T細胞受容体モチーフ。T細胞アルファ鎖、T細胞β鎖、T細胞γ鎖、T細胞δ鎖、CCR7、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD34、CD35、CD40、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD62L、CD68、CD80、CD95、CD117、CD127、CD133、CD137(4-1BB)、CD163、F4/80、IL-4Ra、Sca-1、CTLA-4、GITR、GARP、LAP、グランザイムB、LFA-1、トランスフェリン受容体、NKp46、パーフォリン、CD4+、Th1、Th2、Th17、Th40、Th22、Th9、Tfh、古典的Treg、FoxP3+、Tr1、Th3、Treg17、TREG、CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG-72、炭酸アンヒドラーゼIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド(例えば、CD2、CD3、GM2など)、ルイス-γ2、VEGF、VEGFR1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、テネイシン、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、Smoothened、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR、またはANTXR1、葉酸受容体アルファ(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、上皮成長因子受容体(EGFR)、メソテリン、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、TnAg、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、インターロイキン-11受容体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、ルイスY、CD24、血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFRベータ)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、プロスターゼ、PAP、ELF2M、エフリンB2、IGF-1受容体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、テロメラーゼ、フコシルGM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-アセチル-GD2、葉酸受容体ベータ、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、ポリシアル酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、レグマイン、HPVE6、E7、ETV6-AML、精子タンパク質17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos関連抗原1、p53、p53変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、PCTA-1/ガレクチン8、MelanA/MART1、Ras変異体、hTERT、肉腫転座ブレークポイント、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2、腸内カルボキシルエステラーゼ、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新生抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C)CD49f、CD151、CD340、CD200、tkrA、trkB、またはtrkCから選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
449.フソソームが、標的細胞または標的細胞の表面特徴部と会合および/または結合する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
450.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞からのタンパク質の分泌または標的細胞の表面上のリガンド提示を引き起こすか、または引き起こすことができる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
451.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、標的細胞の細胞死を引き起こすか、または引き起こすことができる、実施形態450に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
452.フソソームが、NKソース細胞に由来する、実施形態450または451に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
453.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、1つ以上の局所環境の特徴、例えば、代謝物、インターロイキン、抗原等、もしくはそれらの組み合わせを、感知および/または応答するか、あるいは送信および/または応答することができる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
454.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、走化性、血管外遊出、および/または1つ以上の代謝活性(例えば、キニューリニン、糖新生、プロスタグランジン脂肪酸酸化、アデノシン代謝、尿素回路、および熱発生呼吸)が可能である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
455.ソース細胞が、以下である、
a)好中球、ならびにフソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、損傷部位にホーミングすることができる、
b)マクロファージ、ならびにフソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、食作用が可能であるか、あるいは
c)褐色脂肪組織細胞、ならびにフソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、脂肪分解が可能である、実施形態454に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
456.フソソームが、以下である、
a)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%高い割合で融合する、
b)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%高い割合で融合する、
c)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、24、48、または72時間後に、標的細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%に送達されるような割合で標的細胞と融合する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
457.フソソームが、以下である、
a)例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、または
b)例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、少なくとも1,000コピーのコピー数で存在する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
458.フソソームによって含まれるフソゲンの少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%が、細胞膜内に配置されている、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
459.フソソームがまた、内部、例えば、細胞質またはオルガネラ内にフソゲンを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
460.フソソームが、
a)例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、フソソームあたり少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下のコピー数での治療薬(例えば、治療用膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤)、
b)例えば、実施例43のアッセイによって測定した場合、少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下のコピー数でのタンパク質治療薬、
c)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピーのコピー数での核酸治療薬、
d)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピーのコピー数でのDNA治療薬、
e)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピーのコピー数でのRNA治療薬、
f)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピーのコピー数でのソース細胞に対して外因性である治療薬、
g)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピーのコピー数でのソース細胞に対して外因性であるタンパク質治療薬、および/あるいは
h)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピーのコピー数でのソース細胞に対して外因性である核酸(例えば、DNAもしくはRNA)治療薬を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
461.フソゲンのコピー数と治療薬のコピー数との比が、1,000,000:1~100,000:1、100,000:1~10,000:1、10,000:1~1,000:1、1,000:1~100:1、100:1~50:1、50:1~20:1、20:1~10:1、10:1~5:1、5:1~2:1、2:1~1:1、1:1~1:2、1:2~1:5、1:5~1:10、1:10~1:20、1:20~1:50、1:50~1:100、1:100~1:1,000、1:1,000~1:10,000、1:10,000~1:100,000、または1:100,000~1:1,000,000である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
462.フソソームが、
a)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピーの治療薬(例えば、治療用膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)、
b)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピーのタンパク質治療薬、
c)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピーの核酸治療薬、
d)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピーのRNA治療薬、および/あるいは
e)少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピーのDNA治療薬を標的細胞に送達する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
463.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、
a)フソソーム中の総タンパク質1mgあたり0.00000001mgのフソゲン~1mgのフソゲン、例えば、フソソーム中の総タンパク質1mgあたり0.00000001~0.0000001、0.0000001~0.000001、0.000001~0.00001、0.00001~0.0001、0.0001~0.001、0.001~0.01、0.01~0.1、もしくは0.1~1mgのフソゲン、または
b)フソソーム中の脂質1mgあたり0.00000001mgのフソゲン~5mgのフソゲン、例えば、フソソーム中の脂質1mgあたり0.00000001~0.0000001、0.0000001~0.000001、0.000001~0.00001、0.00001~0.0001、0.0001~0.001、0.001~0.01、0.01~0.1、0.1~1、もしくは1~5mgのフソゲンを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
464.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、ソース細胞のそれと実質的に同様の脂質組成物を特徴とするか、あるいはCL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGのうちの1つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%、例えば、75%以内である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
465.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、ソース細胞内のカルジオリピン:セラミドの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:セラミドの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:ジアシルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:ジアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:ヘキソシルセラミドの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:ヘキソシルセラミドの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:リゾホスファチジン酸塩の比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:リゾホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のカルジオリピン:リゾホスファチジルコリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:リゾホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:リゾホスファチジルエタノールアミンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:リゾホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:リゾホスファチジルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:リゾホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:リゾホスファチジルイノシトールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:リゾホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:リゾホスファチジルセリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:リゾホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:ホスファチジン酸塩の比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:ホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のカルジオリピン:ホスファチジルコリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:ホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:ホスファチジルエタノールアミンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:ホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:ホスファチジルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:ホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:ホスファチジルイノシトールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:ホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:ホスファチジルセリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:ホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:コレステロールエステルの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:コレステロールエステルの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:スフィンゴミエリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:スフィンゴミエリンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:トリアシルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:トリアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:セラミドの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:セラミドの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:ジアシルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:ジアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:ヘキソシルセラミドの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:ヘキソシルセラミドの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:リゾホスファチジン酸塩の比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:リゾホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:リゾホスファチジルコリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:リゾホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:リゾホスファチジルエタノールアミンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:リゾホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:リゾホスファチジルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:リゾホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:リゾホスファチジルイノシトールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:リゾホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:リゾホスファチジルセリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:リゾホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のカルジオリピン:ホスファチジル酸塩の比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:ホスファチジル酸塩の比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:ホスファチジルエタノールアミンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:ホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:ホスファチジルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のカルジオリピン:ホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:ホスファチジルイノシトールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:ホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:ホスファチジルセリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:ホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:コレステロールエステルの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:コレステロールエステルの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:スフィンゴミエリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:スフィンゴミエリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルコリン:トリアシルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルコリン:トリアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:セラミドの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:セラミドの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:ジアシルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:ジアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:ヘキソシルセラミドの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:ヘキソシルセラミドの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:リゾホスファチジン酸塩の比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:リゾホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:リゾホスファチジルコリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:リゾホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:リゾホスファチジルエタノールアミンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:リゾホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:リゾホスファチジルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:リゾホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:リゾホスファチジルイノシトールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:リゾホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:リゾホスファチジルセリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:リゾホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:ホスファチジン酸塩の比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:ホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:ホスファチジルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:ホスファチジルグリセロールの比、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:ホスファチジルイノシトールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:ホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:ホスファチジルセリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:ホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:コレステロールエステルの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:コレステロールエステルの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:スフィンゴミエリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内の、ホスファチジルエタノールアミン:スフィンゴミエリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン:トリアシルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルエタノールアミン:トリアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:セラミドの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:セラミドの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:ジアシルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:ジアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:ヘキソシルセラミドの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:ヘキソシルセラミドの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:リゾホスファチジン酸塩の比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:リゾホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:リゾホスファチジルコリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:リゾホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:リゾホスファチジルエタノールアミンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:リゾホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:リゾホスファチジルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:リゾホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:リゾホスファチジルイノシトールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内の、ホスファチジルセリ
ン:リゾホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:リゾホスファチジルセリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:リゾホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:ホスファチジン酸塩の比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:ホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:ホスファチジルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:ホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:ホスファチジルイノシトールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:ホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:コレステロールエステルの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:コレステロールエステルの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:スフィンゴミエリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:スフィンゴミエリンの比、またはソース細胞内のホスファチジルセリン:トリアシルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のホスファチジルセリン:トリアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:セラミドの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:セラミドの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:ジアシルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:ジアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:ヘキソシルセラミドの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:ヘキソシルセラミドの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:リゾホスファチジン酸塩の比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:リゾホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:リゾホスファチジルコリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:リゾホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:リゾホスファチジルエタノールアミンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:リゾホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:リゾホスファチジルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:リゾホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:リゾホスファチジルイノシトールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:リゾホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:リゾホスファチジルセリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:リゾホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:ホスファチジン酸塩の比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:ホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:ホスファチジルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:ホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:ホスファチジルイノシトールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:ホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:コレステロールエステルの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:コレステロールエステルの比、またはソース細胞内のスフィンゴミエリン:トリアシルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のスフィンゴミエリン:トリアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:セラミドの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:セラミドの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:ジアシルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:ジアシルグリセロールの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:ヘキソシルセラミドの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:ヘキソシルセラミドの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:リゾホスファチジン酸塩の比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:リゾホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:リゾホスファチジルコリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:リゾホスファチジルコリンの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:リゾホスファチジルエタノールアミンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:リゾホスファチジルエタノールアミンの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:リゾホスファチジルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:リゾホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:リゾホスファチジルイノシトールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:リゾホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:リゾホスファチジルセリンの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:リゾホスファチジルセリンの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:ホスファチジン酸塩の比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:ホスファチジン酸塩の比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:ホスファチジルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:ホスファチジルグリセロールの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:ホスファチジルイノシトールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:ホスファチジルイノシトールの比、またはソース細胞内のコレステロールエステル:トリアシルグリセロールの比の10%、20%、30%、40%もしくは50%以内のコレステロールエステル:トリアシルグリセロールの比を特徴とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
466.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、
a)例えば、実施例42のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物、
b)例えば、実施例49のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、もしくは50%以内である脂質とタンパク質との比率、
c)例えば、実施例50のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、もしくは50%以内であるタンパク質と核酸(例えば、DNAもしくはRNA)との比率、
d)例えば、実施例50のアッセイを使用して測定した場合、例えば、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%超のソース細胞における対応する比率よりも大きいタンパク質とDNAとの比率、
e)例えば、実施例51のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の10%、20%、30%、40%、もしくは50%以内であるタンパク質と核酸(例えば、DNA)との比率、および/または
f)例えば、実施例51のアッセイを使用して測定した場合、例えば、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%超のソース細胞における対応する比率よりも大きいタンパク質とDNAとの比率を特徴とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
467.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、
a)被験体、例えば、マウスにおける、例えば、実施例75のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞の半減期の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%以内の半減期、または
b)例えば、実施例75のアッセイにより、例えば、ヒト被験体またはマウスにおいて、少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、12時間、もしくは24時間の被験体、例えば、マウスにおける半減期を特徴とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
468.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例64のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%多く、グルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)を膜を横切って輸送するか、または輸送することができる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
469.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、
a)例えば、実施例66のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内の内腔におけるエステラーゼ活性、
b)例えば、実施例68に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性レベルの1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内の代謝活性レベル(例えば、クエン酸合成酵素活性)、
c)例えば、実施例68に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における代謝活性レベルの少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%の代謝活性レベル(例えば、クエン酸合成酸素活性)、
d)例えば、実施例69に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%以内の呼吸レベル(例えば、酸素消費率)、
e)例えば、実施例69に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞における呼吸レベルの少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%の呼吸レベル(例えば、酸素消費率)、ならびに/あるいは
f)例えば、実施例70のアッセイを使用して、最大で18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、もしくは10,000 MFIのアネキシンV染色レベルを特徴とするか、またはフソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソーム、またはその組成物もしくは調製物のアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%低いアネキシンV染色レベルを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
470.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物、フソソームが、実施例70のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンV染色レベルよりも少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%低いアネキシンV染色レベルを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
471.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、
a)例えば、実施例39のアッセイにより、ソース細胞のそれよりも少なくとも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくはそれ以上のmiRNA含有量、
b)例えば、実施例39のアッセイにより、ソース細胞のmiRNA含有量レベルの少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくはそれ以上(例えば、ソース細胞のmiRNA含有量レベルの最大100%)のmiRNA含有量レベル、
c)例えば、実施例108のアッセイによって測定した場合、ソース細胞の総RNA含有量レベルの少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくはそれ以上(例えば、ソース細胞の総RNA含有量レベルの最大100%)の総RNA含有量レベル、
d)例えば、実施例47のアッセイにより、ソース細胞のそれの1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以内、もしくはそれ以上、例えば、ソース細胞のそれの1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、もしくは80%~90%以内である可溶性:不溶性タンパク質の比率、および/または
e)例えば、実施例48のアッセイによって測定した場合、フソソームの脂質含有量の5%、1%、0.5%、0.01%、0.005%、0.0001%、0.00001%未満、またはそれ以下のLPSレベルを特徴とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
472.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例63のアッセイを使用して、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したAKTリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース(例えば、標識グルコース、例えば、2-NBDG)の取込みが可能である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
473.フソソームが、被験体、例えばマウスに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば、実施例87または100のアッセイにより、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%が、24、48、または72時間後に標的組織内に存在する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
474.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、
a)例えば、実施例71のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくは骨髄間質細胞(BMSC)によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくは100%大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベル、
b)例えば、実施例71のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくは骨髄間質細胞(BMSC)によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルの少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%(例えば、最大100%)のジャクスタクリンシグナル伝達レベル、
c)例えば、実施例72のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%大きいパラクリンシグナル伝達レベル、
d)例えば、実施例72のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルの少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%(例えば、最大100%)のパラクリンシグナル伝達レベル、
e)例えば、実施例73のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはC2C12細胞における重合アクチンのレベルと比較して、1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくは100%以内のレベルの重合アクチン、および/または
f)例えば、実施例74のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはC2C12細胞の膜電位の約1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%以内の膜電位を特徴とするか、あるいは提供されるフソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、約-20~-150mV、-20~-50mV、-50~-100mV、または-100~-150mVの膜電位を特徴とし、フソソームが、-1mV、-5mV、-10mV、-20mV、-30mV、-40mV、-50mV、-60mV、-70mV、-80mV、-90mV、-100mV未満の膜電位を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
475.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例57のアッセイを使用して、ソース細胞の血管外遊出率の少なくとも1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の速度で血管から血管外遊出することができ、例えば、ソース細胞が、好中球、リンパ球、B細胞、マクロファージ、またはNK細胞であり、任意に、提供されるフソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例58のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マクロファージと比較して、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%(例えば、最大100%)の走化性が可能である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
476.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例60のアッセイを使用して、参照細胞、例えばマクロファージと比較して、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%(例えば、最大100%)での食作用が可能である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
477.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、細胞膜、例えば、内皮細胞膜または血液脳関門を通過することができる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
478.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、
a)例えば、実施例62のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくは100%大きい割合でタンパク質を分泌することができる、または
b)例えば、実施例62のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞と比較して、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%(例えば、最大100%)大きい割合でタンパク質を分泌することができる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
479.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、
a)転写ができないか、または例えば、実施例19のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞の転写活性の1%、2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%未満の転写活性を有する、あるいは
b)核DNA複製ができないか、または例えば、実施例20のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞の核DNA複製の1%、2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%未満の核DNA複製を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
480.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、クロマチンを欠いているか、または例えば、実施例37のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞のクロマチン含有量の1%、2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%未満のクロマチン含有量を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
481.フソソーム、および/またはその組成物または調製物が、医薬品もしくは適正製造基準(GMP)基準を満たすか、またはGMPに従って作製された、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
482.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、
a)所定の参照値を下回る病原体レベルを特徴とし、例えば、病原体を実質的に含まない、
b)所定の基準値を下回る汚染物質(例えば、核DNAなどの核成分)レベルを含み、例えば、1つ以上の特定の汚染物質を実質的に含まない、および/または
c)例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を特徴とする、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
483.ソース細胞または標的細胞が、内皮細胞、線維芽球、血液細胞(例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球)、幹細胞(例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞)、胚性幹細胞(例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯からの幹細胞、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織)、筋芽細胞、実質細胞(例えば、肝細胞)、肺胞細胞、ニューロン(例えば、網膜神経細胞)、前駆細胞(例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球)、前駆細胞(例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞)、または不死化細胞(例えば、HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR90、IMR91、PER.C6、HT-1080、もしくはBJ細胞)であり、任意に、ソース細胞が、293細胞、HEK細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または幹細胞以外のものであり、任意に、ソース細胞または標的細胞が、好中球、リンパ球(例えば、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞)、マクロファージ、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または骨髄芽球から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
484.ソース細胞が、
a)付着もしくは懸濁条件下で増殖した細胞、
b)初代細胞、培養細胞、不死化細胞、もしくは細胞株(例えば、骨髄バスト細胞株、例えば、C2C12)、
c)例えば、標的細胞と同じ種の異なる生物から得られた同種異系細胞、
d)例えば、標的細胞と同じ生物から得られた自家細胞、または
e)例えば、標的細胞とは異なる種の生物から得られた異種細胞である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
485.ソース細胞が、ソース細胞に対して外因性である第2の作用物質、例えば、治療薬、例えば、タンパク質または核酸(例えば、RNA、例えば、mRNAもしくはmiRNA)を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
486.第2の作用物質が、フソソームによって含まれる少なくとも10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下で存在するか、あるいはフソソームあたり少なくとも10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、もしくは1,000,000コピー、またはそれ以下の平均レベルで存在する、実施形態485に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
487.標的細胞が、生物、例えば、生物から単離された初代細胞内にある、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
488.標的化ドメインが、標的細胞上の標的細胞部分、例えば、細胞表面特徴部と相互作用する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
489.フソソームが、前述の標的細胞部分を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
490.フソソームが、標的細胞上のフソゲン結合パートナーと相互作用し、それによりフソソームが標的細胞に結合または融合することを可能にするフソゲンを含み、任意にフソソームが、前述のフソゲン結合パートナーを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
491.標的化ドメインが、フソゲンの一部でないか、またはフソゲンが、標的化ドメインを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
492.フソゲン結合パートナーが、標的細胞部分とは異なる実体であるか、もしくはその一部であるか、またはフソゲン結合パートナーが、標的細胞部分であるか、もしくはその一部である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
493.フソソームが、エンドサイトーシスによって標的細胞に入り、例えば、エンドサイトーシス経路を介して送達される作用物質(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤、および任意に第2の作用物質)のレベルが、例えば、実施例91のアッセイを使用して、0.01~0.6、0.01~0.1、0.1~0.3、または0.3~0.6であるか、あるいは同様のフソソームと接触したクロロキン処理された参照細胞よりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれより大きい、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
494.標的細胞に入るフソソーム組成物または調製物中のフソソームの少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%が、非エンドサイトーシス経路に入り、例えば、フソソームが、細胞表面との融合を介して標的細胞に入り、任意に、標的細胞に入るフソソーム組成物または調製物中のフソソームの少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%が、細胞質に入る(例えば、エンドソームもしくはリソソームには入らない)、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
495.標的細胞に入るフソソーム組成物または調製物中のフソソームの90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、または1%未満が、エンドソームまたはリソソームに入る、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
496.フソソームが、非エンドサイトーシス経路によって標的細胞に入り、例えば、送達される作用物質(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤、および任意に第2の作用物質)のレベルが、例えば、実施例91のアッセイを使用して、クロロキン処理された参照細胞のレベルの少なくとも90%、95%、98%、または99%である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
497.フソソームが、作用物質(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤、および任意に第2の作用物質)を、ダイナミン媒介経路を介して標的細胞に送達し、例えば、ダイナミン媒介経路を介して送達される作用物質(例えば、膜タンパク質ペイロード剤および/もしくは第2の作用物質)のレベルが、例えば、実施例92のアッセイにおいて測定した場合、0.01~0.6の範囲内であるか、または同様のフソソームと接触したDynasore処理細胞よりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくはそれ以上大きい、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
498.フソソームが、作用物質(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤、および任意に第2の作用物質)を、マクロピノサイトーシスを介して標的細胞に送達し、例えば、マクロピノサイトーシスを介して送達される作用物質(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤、および任意に第2の作用物質)のレベルが、例えば、実施例92のアッセイにおいて測定した場合、0.01~0.6の範囲内であるか、または同様のフソソームと接触したEIPA処理標的細胞よりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上大きい、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
499.フソソームが、作用物質(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤、および任意に第2の作用物質)を、アクチン媒介経路を介して標的細胞に送達し、例えば、アクチン媒介経路を介して送達される作用物質(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤、および任意に第2の作用物質)のレベルが、例えば、実施例92のアッセイにおいて測定した場合、0.01~0.6の範囲内であるか、または同様のフソソームと接触したラトランクリンB処理参照細胞よりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上大きいであろう、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
500.フソソームおよび/またはその組成物または調製物が、例えば、実施例33のアッセイにより、<1、1~1.1、1.05~1.15、1.1~1.2、1.15~1.25、1.2~1.3、1.25~1.35、または>1.35g/mLの密度を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
501.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、タンパク質質量で0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、もしくは10%未満のソース細胞を含むか、または0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、もしくは10%未満の細胞が、機能的核を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
502.フソソーム組成物または調製物中のフソソームの少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%が、オルガネラ、例えば、ミトコンドリアを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
503.フソソームおよび/またはその組成物または調製物が、ソース細胞に対して外因性である治療薬を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
504.
a)治療薬が、標的細胞に対して外因性である、および/または
b)外因性治療薬が、タンパク質、例えば、膜貫通タンパク質、分泌タンパク質、受容体、抗体、核酸、例えば、DNA、染色体(例えば、ヒト人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA、もしくは小分子のうちの1つ以上から選択される、実施形態503に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
505.フソソームが、エンドサイトーシスまたは非エンドサイトーシス経路によって細胞に入る、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
506.フソソームおよび/またはその組成物または調製物が、核を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
507.フソソームが、核DNAを実質的に含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
508.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、
a)冷蔵または冷凍されている、
b)機能的核を含まない、および/または提供されるフソソーム組成物もしくは調製物が、機能的核のない1つ以上のフソソームを含む、
c)タンパク質質量で0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、もしくは10%未満のソース細胞を含むか、または0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、もしくは10%未満の細胞が、機能的核を有する、
d)前述の温度で少なくとも1、2、3、6、もしくは12時間;1、2、3、4、5、もしくは6日間;1、2、3、もしくは4週間;1、2、3、もしくは6ヶ月間;または1、2、3、4、もしくは5年間維持されている、あるいは
e)例えば、
i)例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%高い割合で融合する、
ii)例えば、実施例54のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%高い割合で融合する、
iii)例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、24、48、または72時間後に、標的細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%に送達されるような割合で標的細胞と融合する、または
iv)例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、少なくとも10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、もしくは1,000,000コピー、またはそれ以下のコピー数でのフソゲンのレベルのうちの1つ以上によって、前述の温度で維持される前に、集団の活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%の活性を特徴とする、実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
509.フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、以下の温度で安定である、
a)4℃未満で少なくとも1、2、3、6、もしくは12時間;1、2、3、4、5、もしくは6日間;1、2、3、もしくは4週間;1、2、3、もしくは6ヶ月間;または1、2、3、4、もしくは5年間、
b)-20℃未満で少なくとも1、2、3、6、もしくは12時間;1、2、3、4、5、もしくは6日間;1、2、3、もしくは4週間;1、2、3、もしくは6ヶ月間;または1、2、3、4、もしくは5年間、あるいは
c)-80℃未満で少なくとも1、2、3、6、もしくは12時間;1、2、3、4、5、もしくは6日間;1、2、3、もしくは4週間;1、2、3、もしくは6ヶ月間;または1、2、3、4、もしくは5年間、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
510.以下のうちの1つ以上が、真である、
i)ソース細胞が、293細胞以外である、
ii)ソース細胞が、形質転換もしくは不死化されていない、
iii)ソース細胞が、アデノウイルスを介した不死化以外の方法を使用して形質転換または不死化され、例えば、自然突然変異もしくはテロメラーゼ発現によって不死化される、
iv)フソゲンが、VSVG、SNAREタンパク質、もしくは分泌顆粒タンパク質以外のものである、
v)治療薬が、CreまたはGFP、例えば、EGFP以外である、
vi)治療薬が、例えば、内腔内の核酸(例えば、RNA、例えば、mRNA、miRNA、もしくはsiRNA)またはソース細胞(例えば、抗体、例えば、抗体)に対して外因性のタンパク質である、あるいは
vii)フソソームが、ミトコンドリアを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
511.以下のうちの1つ以上が、真である、
i)ソース細胞が、293もしくはHEK細胞以外である、
ii)ソース細胞が、形質転換もしくは不死化されていない、
iii)ソース細胞が、アデノウイルスを介した不死化以外の方法を使用して形質転換もしくは不死化され、例えば、自然突然変異もしくはテロメラーゼ発現によって不死化される、
iv)フソゲンが、ウイルス性フソゲンではない、または
v)フソソームが、40~150nmの間以外、例えば、150nm、200nm、300nm、400nm、もしくは500nmを超える直径を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
512.以下のうちの1つ以上が、真である、
i)膜タンパク質が、ソース細胞によって発現される、
ii)フソゲンが、TAT、TAT-HA2、HA-2、gp41、アルツハイマー病のβアミロイドペプチド、センダイウイルスタンパク質、もしくは両親媒性ネットネガティブ(net-negative)ペプチド(WAE 11)以外のものである、
iii)フソゲンが、哺乳動物フソゲンである、
iv)フソソームが、その内腔に、酵素、抗体、もしくは抗ウイルスポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む、
v)フソソームは、治療用膜貫通タンパク質、例えば、ソース細胞に対して外因性である治療用膜貫通タンパク質を含まない、または
vi)フソソームが、CD63またはGLUT4を含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
513.以下のうちの1つ以上が、真である、
i)ウイルスを含まない、感染性ではない、もしくは宿主細胞内で増殖しない、
ii)VLP(ウイルス様粒子)ではない、
iii)ウイルス構造タンパク質、例えば、ウイルスカプシドタンパク質、例えば、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質を含まないか、またはウイルスカプシドタンパク質の量が、例えば、実施例53のアッセイにより、総タンパク質の10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%、もしくは0.1%未満である、
iv)ウイルスマトリックスタンパク質を含まない、
v)ウイルスの非構造タンパク質を含まない、
vi)ウイルス構造タンパク質の小胞あたり10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、または1,000,000,000コピー未満のウイルス構造タンパク質を含む、あるいは
vii)フソソームが、微小胞ではない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
514.フソゲンのコピー数とフソソーム上のウイルス構造タンパク質のコピー数との比が、少なくとも1,000,000:1、100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:11、20:1、10:1、5:1、もしくは1:1であるか、または、フソゲンのコピー数とフソソーム上のウイルスマトリックスタンパク質のコピー数との比が、少なくとも1,000,000:1、100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、もしくは1:1である、である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
515.以下のうちの1つ以上が、真である、
i)フソソームが、水不混和性の液滴を含まない、
ii)フソソームが、水性内腔および親水性外部を含む、
iii)フソゲンが、タンパク質フソゲンである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
516.以下のうちの1つ以上が、真である、
i)フソゲンが、哺乳動物のフソゲンもしくはウイルスのフソゲンである、
ii)フソソームが、フソソームに治療用または診断用物質をロードすることによって作製されたものではなかった、
iii)ソース細胞には、治療用または診断用物質がロードされていなかった、
iv)フソソームが、ドキソルビシン、デキサメタゾン、シクロデキストリン;ポリエチレングリコール、マイクロRNA、例えば、miR125、VEGF受容体、ICAM-1、E-セレクチン、酸化鉄、蛍光タンパク質、例えば、GFPもしくはRFP、ナノ粒子、もしくはRNaseを含まないか、またはソース細胞に対して外因性である上記のうちのいずれの外因性形態も含まない、あるいは
v)フソソームが、ソース細胞に対して外因性であり、1つ以上の翻訳後修飾、例えば、グリコシル化を有する治療薬を更に含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
517.フソソームが、単層または多層である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
518.フソソーム、フソソーム組成物、またはフソソーム調製物が、以下を特徴とする、
a)例えば、実施例30のアッセイによって測定した場合、ソース細胞のそれの約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以内の直径、
b)例えば、実施例30のアッセイによって測定した場合、ソース細胞のそれの約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%未満である直径、
c)例えば、実施例30のアッセイによって測定した場合、ソース細胞の直径の約0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、もしくは80%~90%以内である直径、
d)例えば、実施例30のアッセイによって測定した場合、ソース細胞の直径の約0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%未満である直径、
e)例えば、実施例32のアッセイによって測定した場合、少なくとも約10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、もしくは250nmである直径、
f)例えば、実施例32のアッセイによって測定した場合、約10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、もしくは250nm(例えば、±20%)である直径、
g)例えば、実施例32のアッセイによって測定した場合、少なくとも約500nm、750nm、1,000nm、1,500nm、2,000nm、2,500nm、3,000nm、5,000nm、10,000nm、もしくは20,000nmである直径、
h)例えば、実施例32のアッセイによって測定した場合、約500nm、750nm、1,000nm、1,500nm、2,000nm、2,500nm、3,000nm、5,000nm、10,000nm、もしくは20,000nm(例えば、±20%)である直径、および/または
i)5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm、もしくは200μmを超える直径を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
519.フソソーム、フソソーム組成物、またはフソソーム調製物が、ソース細胞の体積の約0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%未満である体積を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
520.フソソーム、フソソーム組成物、またはフソソーム調製物が、1.08g/mL~1.12g/mL以外の密度を有し、任意に、フソソーム、フソソーム組成物、またはフソソーム調製物が、1.08g/mL~1.12g/mL以外の密度を有し、任意に、例えば、実施例33のアッセイにより、密度が、<1、1~1.1、1.05~1.15、1.1~1.2、1.15~1.25、1.2~1.3、1.25~1.35、または>1.35g/mLである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
521.以下のうちの1つ以上が、真である、
i)フソソームが、エクソソームではない、
ii)フソソームが、微小胞である、
iii)フソソームが、非哺乳動物のフソゲンを含む、
iv)フソソームが、フソゲンを含むように操作されている、
v)フソソームが、ソース細胞または過剰発現したフソゲンに対して外因性であるフソゲンを含む、
vi)フソソームが、少なくとも80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm、もしくは1500nmの直径を有するか、またはフソソームの集団もしくは複数のフソソームが、少なくとも80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm、もしくは1500nmの平均直径を有する、
vii)フソソームが、1つ以上のオルガネラ、例えば、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒を含む、
viii)フソソームが、細胞骨格またはその成分、例えば、アクチン、Arp2/3、フォルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、またはチューブリンを含む、
ix)複数のフソソームを含む調製物が、例えば、Thery et al.,″Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.″Curr Protoc Cell Biol.2006 Apr;Chapter 3:Unit 3.22に記載される、例えば、ショ糖勾配遠心分離アッセイにおいて、1.08~1.22g/mLの浮遊密度を有しないか、または少なくとも1.18~1.25g/ml、もしくは1.05~1.12g/mLの密度を有する、
x)脂質二重層が、ソース細胞と比較して、セラミドもしくはスフィンゴミエリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されているか、あるいは脂質二重層が、ソース細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、もしくはホスファチジルセリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されていない(例えば、枯渇している)、
xi)フソソームが、実施例52のアッセイにおいて測定した場合、ホスファチジルセリン(PS)もしくはCD40リガンド、またはPSおよびCD40リガンドの両方を含む、
xii)フソソームが、ソース細胞と比較して、PSについて豊富化されており、例えば、フソソームの集団において、Kanada M,et al.(2015)Differential fates of biomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles.Proc Natl Acad Sci USA 112:E1433-E1442のアッセイにより、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%が、PSに対して陽性である、
xiii)フソソームが、アセチルコリンエステラーゼ(AChE)を実質的に含まないか、または例えば、実施例67のアッセイにより、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、または1000 AChE活性単位/タンパク質ug未満を含む、
xiv)フソソームが、テトラスパニンファミリータンパク質(例えば、CD63、CD9、もしくはCD81)、ESCRT関連タンパク質(例えば、TSG101、CHMP4A-B、もしくはVPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、アクチニン-4、ミトフィリン、シンテニン-1、TSG101、ADAM10、EHD4、シンテニン-1、TSG101、EHD1、フロチリン-1、熱ショック70-kDaタンパク質(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)、またはそれらの任意の組み合わせを実質的に含まないか、あるいは例えば、実施例44のアッセイにより、任意の個々のエクソソームマーカータンパク質の0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、5%、もしくは10%未満、および/または前述のタンパク質のうちのいずれかの総エクソソームマーカータンパク質の0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、5%、10%、15%、20%、もしくは25%未満を含むか、あるいはこれらのタンパク質のうちのいずれか1つ以上について豊富化されていない、
xv)フソソームが、例えば、実施例45のアッセイを使用して、500、250、100、50、20、10、5、もしくは1ng GAPDH/総タンパク質μgを下回るか、またはソース細胞中のGAPDHのレベルを下回る、例えば、ソース細胞中の総タンパク質あたりのGAPDHのレベル(ng/μg)よりも1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%未満低いレベルのグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を含む、
xvi)フソソームが、1つ以上の小胞体タンパク質(例えば、カルネキシン)、1つ以上のプロテアソームタンパク質、もしくは1つ以上のミトコンドリアタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせについて豊富化され、例えば、カルネキシンの量が、500、250、100、50、20、10、5、もしくは1ngカルネキシン/総タンパク質μg未満であるか、あるいはフソソームが、例えば、実施例46のアッセイを使用して、ソース細胞と比較して、1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%多い総タンパク質あたりのカルネキシン(ng/μg)を含む、
xvii)フソソームが、例えば、実施例39または40のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞に対して外因性である作用物質(例えば、タンパク質、mRNA、もしくはsiRNA)を含む、あるいは
xviii)フソソームが、例えば、Kanada M, et al.(2015)Differential fates of biomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles.Proc Natl Acad Sci USA 112:E1433-E1442のアッセイにより、原子間力顕微鏡法によって少なくとも30分間、雲母の表面に固定化され得る、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
522.以下のうちの1つ以上が、真である、
i)フソソームが、エクソソームである、
ii)フソソームが、微小胞ではない、
iii)フソソームが、80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm、もしくは1500nm未満の直径を有するか、またはフソソームの集団が、少なくとも80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm、もしくは1500nmの平均直径を有する、
iv)フソソームが、オルガネラを含まない、
v)フソソームが、細胞骨格またはその成分、例えば、アクチン、Arp2/3、フォルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、またはチューブリンを含まない、
vi)複数のフソソームを含む調製物が、例えば、Thery et al.,″Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.″Curr Protoc Cell Biol.2006 Apr;Chapter 3:Unit 3.22に記載される、例えば、ショ糖勾配遠心分離アッセイにおいて、1.08~1.22g/mLの浮遊密度を有する、
vii)脂質二重層が、ソース細胞と比較して、セラミドもしくはスフィンゴミエリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されていない(例えば、枯渇している)か、あるいは脂質二重層が、ソース細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、もしくはホスファチジルセリン、またはそれらの組み合わせについて豊富化されている、
viii)フソソームが、実施例52のアッセイにおいて測定した場合、ホスファチジルセリン(PS)もしくはCD40リガンド、またはPSおよびCD40リガンドの両方を含まないか、ソース細胞に対して枯渇している、
ix)フソソームが、ソース細胞と比較して、PSについて豊富化されておらず(例えば、枯渇しており)、例えば、フソソームの集団において、Kanada M,et al.(2015)Differential fates of biomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles.Proc Natl Acad Sci USA 112:E1433-E1442のアッセイにより、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%未満が、PSに対して陽性である、
x)フソソームが、例えば、実施例67のアッセイにより、例えば、少なくとも0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、または1000 AChE活性単位/タンパク質ugのアセチルコリンエステラーゼ(AChE)を含む、
xi)フソソームが、テトラスパニンファミリータンパク質(例えば、CD63、CD9、もしくはCD81)、ESCRT関連タンパク質(例えば、TSG101、CHMP4A-B、もしくはVPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、アクチニン-4、ミトフィリン、シンテニン-1、TSG101、ADAM10、EHD4、シンテニン-1、TSG101、EHD1、フロチリン-1、熱ショック70-kDaタンパク質(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)、またはそれらの任意の組み合わせを含む、例えば、実施例44のアッセイにより、ソース細胞と比較して、任意の個々のエクソソームマーカータンパク質の0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、5%、もしくは10%超、および/または前述のタンパク質のうちのいずれかの総エクソソームマーカータンパク質の0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、5%、10%、15%、20%、もしくは25%未満を含むか、あるいはこれらのタンパク質のうちのいずれか1つ以上について豊富化されている、
xii)フソソームが、例えば、実施例45のアッセイを使用して、500、250、100、50、20、10、5、もしくは1ng GAPDH/総タンパク質μgを上回る、またはソース細胞中のGAPDHのレベルを下回る、例えば、ソース細胞中の総タンパク質あたりのGAPDHのレベル(ng/μg)よりも少なくとも1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%多いレベルのグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を含む、
xiii)フソソームが、1つ以上の小胞体タンパク質(例えば、カルネキシン)、1つ以上のプロテアソームタンパク質、もしくは1つ以上のミトコンドリアタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせについて豊富化されず(例えば、枯渇している)、例えば、カルネキシンの量が、500、250、100、50、20、10、5、もしくは1ngカルネキシン/総タンパク質μg未満であるか、あるいはフソソームが、例えば、実施例46のアッセイを使用して、ソース細胞と比較して、1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%少ない総タンパク質あたりのカルネキシン(ng/μg)を含む、
xiv)フソソームが、例えば、Kanada M,et al.(2015)Differential fates of biomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles.Proc Natl Acad Sci USA 112:E1433-E1442のアッセイにより、原子間力顕微鏡法によって少なくとも30分間、雲母の表面に固定化され得ない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
523.以下のうちの1つ以上が、真である、
i)フソソームが、VLPを含まない、
ii)フソソームが、ウイルスを含まない、
iii)フソソームが、複製能ウイルスを含まない、
iv)フソソームが、ウイルスタンパク質、例えば、ウイルス構造タンパク質、例えば、カプシドタンパク質もしくはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、
v)フソソームが、エンベロープウイルス由来のカプシドタンパク質を含まない、
vi)フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質を含まない、または
vii)フソゲンが、ウイルスフソゲンではない、フソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
524.フソソームが、細胞質ゾルを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
525.フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれによって構成される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
526.フソソームが、除核細胞を含むか、またはそれによって構成される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
527.フソソームが、コンドリソームを含むか、またはそれによって構成される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
528.以下のうちの1つ以上が、真である、
i)フソソームまたはソース細胞が、例えば、実施例102のアッセイにより、被験体に移植されたときに奇形腫を形成しない、
ii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、実施例58のアッセイを使用して、参照細胞、例えばマクロファージよりも、例えば、1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%以内、またはそれより優れた走化性が可能である、
iii)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、例えば、傷害の部位にホーミングすることができ、細胞生物学的物質が、例えば、実施例59のアッセイを使用して、ヒト細胞に由来し、例えば、ソース細胞が、好中球である、あるいは
iv)フソソームおよび/またはその組成物もしくは調製物が、食作用が可能であり、例えば、フソソームによる食作用が、実施例60のアッセイを使用して、0.5、1、2、3、4、5、または6時間以内に検出可能であり、例えば、ソース細胞が、マクロファージである、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
529.フソソーム、フソソーム組成物、またはフソソーム調製物が、被験体、例えば、ヒト被験体への投与後、5日以内、例えば、4日以内、3日以内、2日以内、1日以内、例えば、約12~72時間にわたって、いずれかの特徴のうちの1、2、3、4、5、6つ、またはそれ以上を保持する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
530.フソソームが、以下の特徴のうちの1つ以上を有する、
a)ソース細胞からの1つ以上の内因性タンパク質、例えば、膜タンパク質もしくは細胞質ゾルタンパク質を含む、
b)少なくとも10、20、50、100、200、500、1000、2000、もしくは5000個の異なるタンパク質を含む、
c)少なくとも1、2、5、10、20、50、もしくは100個の異なる糖タンパク質を含む、
d)フソソーム中のタンパク質の少なくとも10質量%、20質量%、30質量%、40質量%、50質量%、60質量%、70質量%、80質量%、もしくは90質量%が、天然に存在するタンパク質である、
e)少なくとも10、20、50、100、200、500、1000、2000、もしくは5000個の異なるRNAを含む、または
f)少なくとも2、3、4、5、10、もしくは20個の異なる脂質を含み、例えば、CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM、およびTAGから選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
531.フソソームが、以下の特性のうちの1、2、3、4、5つ、もしくはそれ以上を有するように操作されているか、またはフソソームが、天然に存在する細胞ではなく、以下の特性のうちの1、2、3、4、5つ、もしくはそれ以上を有するか、または核が、天然に、以下の特性のうちの1、2、3、4、5つ、もしくはそれ以上を有しない、
a)部分的な核の不活化が、核機能、例えば、転写もしくはDNA複製、またはその両方の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、もしくはそれ以上の低下をもたらし、例えば、転写が、実施例19のアッセイにより測定され、DNA複製が、実施例20のアッセイにより測定される、
b)フソソームが、転写ができないか、または例えば、実施例19のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞の転写活性の1%、2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%未満の転写活性を有する、
c)フソソームが、核DNA複製ができないか、または例えば、実施例20のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞の核DNA複製の1%、2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%未満の核DNA複製を有する、
d)フソソームが、クロマチンを欠いているか、または例えば、実施例37のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞のクロマチン含有量の1%、2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%未満のクロマチン含有量を有する、
e)フソソームが、核膜を欠いているか、または例えば、実施例36のアッセイにより、参照細胞、例えば、ソース細胞もしくはJurkat細胞の50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、もしくは1%未満の核膜の量を有する、
f)フソソームが、機能的な核膜孔複合体を欠いているか、または例えば、実施例36のアッセイにより、少なくとも50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、もしくは1%低減した移入もしくは移出活性を有するか、あるいはフソソームが、核孔タンパク質、例えば、NUP98またはインポーチン7のうちの1つ以上を欠いている、
g)フソソームが、ヒストンを含まないか、または例えば、実施例37のアッセイにより、ソース細胞の(例えば、H1、H2a、H2b、H3、もしくはH4の)ヒストンレベルの1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%未満のヒストンレベルを有する、
h)フソソームが、20、10、5、4、3、2、または1未満の染色体を含む、
i)核機能が、排除されている、
j)フソソームが、除核された哺乳動物細胞である、
k)核が、除去または不活化される、例えば、機械的力によって、放射線によって、もしくは化学的アブレーションによって押し出される、あるいは
l)フソソームが、例えば、間期または有糸分裂中に完全にまたは部分的に除去されるDNAを有する哺乳動物細胞に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
532.フソソームが、mtDNAまたはベクターDNAを含む、例えば、フソソームが、DNAを含まないか、または実質的にDNAを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
533.ソース細胞が、初代細胞、不死化細胞、または細胞株(例えば、ミエロバスト(myelobast)細胞株、例えば、C2C12)である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
534.フソソームが、修飾されたゲノムを有する、例えば、(例えば、MHCタンパク質、例えば、MHC複合体を除去するためのゲノム編集によって)免疫原性が低下したソース細胞に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
535.ソース細胞が、免疫抑制物質で処理された細胞培養物に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
536.ソース細胞が、例えば、本明細書に記載のアッセイを使用して、実質的に非免疫原性である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
537.ソース細胞が、外因性作用物質、例えば、治療薬である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
538.ソース細胞が組換え細胞である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
539.ソース細胞が、抗炎症シグナルで処理された細胞培養物に由来する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
540.フソソームが、ソース細胞に対して外因性である作用物質、例えば、治療用膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤、例えば、タンパク質または核酸(例えば、DNA、染色体(例えば、ヒト人工染色体)、RNA、例えば、mRNAもしくはmiRNA)を更に含み、例えば、外因性作用物質が、少なくとも10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下で存在する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
541.フソソームが、例えば、ソース細胞、例えば、哺乳動物ソース細胞をsiRNAまたは遺伝子編集酵素で処理することにより、改変した、例えば増加または減少したレベルの1つ以上の内因性分子、例えば、タンパク質または核酸(例えば、幾つかの実施形態では、ソース細胞に対して内因性、および幾つかの実施形態では、標的細胞に対して内因性)を有する、実施形態381に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
542.内因性分子が、
a)少なくとも10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、もしくは1,000,000,000コピー、またはそれ以下で存在する、
b)ソース細胞におけるその濃度よりも少なくとも1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106、1.0×107、5.0×107、または1.0×108高い濃度で存在する、
c)ソース細胞におけるその濃度よりも少なくとも1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106、1.0×107、5.0×107、または1.0×108低い濃度で存在する、実施形態540または541に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
543.フソゲンが、
a)ウイルス性フソゲン、例えば、HA、HIV-1 ENV、gp120、またはVSV-Gである、
b)哺乳動物のフソゲン、例えば、SNARE、Syncytin、myomaker、myomixer、myomerger、またはFGFRL1である、
c)4~5、5~6、6~7、7~8、8~9、または9~10のpHで活性である、
d)4~5、5~6、6~7、7~8、8~9、または9~10のpHでは活性でない、
e)標的細胞の表面で標的細胞に融合する、
f)リソソームに依存しない方法で融合を促進する、
g)タンパク質フソゲンである、
h)脂質フソゲン、例えば、オレイン酸、モノオレイン酸グリセロール、グリセリド、ジアシルグリセロール、または修飾された不飽和脂肪酸である、
i)化学フソゲン、例えば、PEGであり、任意に、フソゲンが、小分子フソゲン、例えば、ハロタン、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、およびクロルプロマジンなどのNSAIDである、
j)組換え体である、
k)生化学的に組み込まれ、例えば、フソゲンが、精製されたタンパク質として提供され、フソゲンと脂質二重層との会合を可能にする条件下で脂質二重層と接触する、ならびに/あるいは
l)生合成的に組み込まれ、例えば、フソゲンが脂質二重層と会合するのを可能にする条件下で、ソース細胞において発現される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
544.フソゲンが、標的細胞、例えば、HeLa細胞以外の標的細胞、例えば、形質転換または不死化されていない標的細胞に結合する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
545.形質転換されていない細胞が、接触阻害を示し、かつ/またはその増殖が、同じタイプの正常細胞と同じ生存因子もしくは成長因子に依存する、実施形態544に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
546.複数のフソソームが、同じであるか、または異なる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
547.複数のフソソームが、
a)1つ、2つ、もしくはそれ以上のタイプのソース細胞に由来する、および/または
b)フソソーム組成物中のフソソームの少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%が、同じフソゲンを含む、同じタイプのソース細胞を使用して産生される、または同じペイロード(例えば、膜ペイロード剤、核ペイロード剤、もしくはオルガネラペイロード剤)を含む、から選択される少なくとも1つの特性を共有する、実施形態546に記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
548.
a)複数のフソソームの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは99%が、フソソーム組成物もしくは調製物中のフソソームの平均径の10%、20%、30%、40%、もしくは50%以内の直径を有する、または
b)複数のフソソームの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは99%が、フソソーム組成物もしくは調製物中のフソソームの平均体積の10%、20%、30%、40%、もしくは50%以内の体積を有する、実施形態546または547に記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
549.フソソーム組成物または調製物が、例えば、実施例31に基づいて、直径分布におけるソース細胞集団の変動の10%、50%、または90%以内で、約90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%未満の直径分布における変動を有する、実施形態546~548のいずれかに記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
550.複数のフソソームの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%が、フソソーム組成物または調製物におけるフソソーム中の平均フソゲンコピー数の10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%以内のコピー数のフソゲンを有する、実施形態546~549のいずれかに記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
551.複数のフソソームの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%が、フソソーム組成物または調製物におけるフソソーム中の平均治療薬コピー数の10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%以内のコピー数の治療薬を有する、実施形態546~550のいずれかに記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
552.フソソーム組成物または調製物が、少なくとも105、106、107、108、109、もしくは1010、またはフソソームを含む、実施形態546~551のいずれかに記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物または調製物は、少なくとも1μL、2μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1mL、2mL、5mL、または10mLの量である。
553.複数のフソソームが、少なくとも0.01%~0.05%、0.05%~0.1%、0.1%~0.5%、0.5%~1%、1%~2%、2%~3%、3%~4%、4%~5%、5%~10%、10%~20%、20%~30%、30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~80%、または80%~90%のフソソームを含み、これらは以下の特徴のうちの1つ以上を有する、
(i)核もしくは機能的核を含まない、
(ii)核DNAを実質的に含まない、または
(iii)ミトコンドリアもしくは機能的ミトコンドリアを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム組成物またはフソソーム調製物。
554.以下のうちの1つ以上が、真である、
a)薬学的組成物が、医薬品もしくは適正製造基準(GMP)基準を満たしている、
b)薬学的組成物が、適正製造基準(GMP)に従って作製された、
c)薬学的組成物が、所定の参照値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない、
d)薬学的組成物が、所定の参照値を下回る汚染物質レベル(例えば、核DNA)を有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない、または
e)薬学的組成物が、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、上記実施形態のいずれかに記載の薬学的組成物。
555.生物学的機能が、
a)酵素を調節する、例えば、阻害または刺激する、
b)例えば、合成を阻害または刺激することによって、または因子の分解を阻害もしくは刺激することによって、被験体における分子(例えば、タンパク質、核酸、もしくは代謝物、薬物、もしくは毒素)のレベルを調節する、例えば、増加または減少させる、
c)標的細胞または組織の生存率を調節する、例えば、増加または減少させる、あるいは
d)タンパク質の状態を調節する、例えば、タンパク質のリン酸化を増加もしくは減少させる、またはタンパク質立体配座を調節する、
e)傷害の治癒を促進する、
f)2つの細胞間の相互作用を調節する、例えば、増加または減少させる、
g)細胞分化を調節する、例えば、促進または阻害する、
h)被験体における因子(例えば、タンパク質、核酸、代謝産物、薬物、または毒素)の分布を変化させる、
i)免疫応答を調節する、例えば、増加または減少させる、あるいは
j)標的組織への細胞の動員を調節する、例えば、増加または減少させる、から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
556.被験体が、癌、炎症性障害、自己免疫疾患、慢性疾患、炎症、臓器機能の損傷、感染症、代謝性疾患、変性障害、遺伝性疾患(例えば、遺伝性欠損症もしくは優勢な遺伝性障害)、または傷害を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
557.被験体が、感染症を有し、フソソームが、感染症の抗原を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
558.被験体が、遺伝的欠損を有し、フソソームが、被験体が欠損しているタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸(例えば、DNA、gDNA、cDNA、RNA、pre-mRNA、mRNA等)、またはタンパク質をコードするDNA、またはタンパク質をコードする染色体、またはタンパク質をコードする核酸を含む核を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
559.被験体が、優性遺伝性障害を有し、フソソームが、優性変異体対立遺伝子の核酸阻害剤(例えば、siRNAまたはmiRNA)を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
560.被験体が、優性遺伝性障害を有し、フソソームが、優性変異体対立遺伝子の核酸阻害剤(例えば、siRNAまたはmiRNA)を含み、フソソームがまた、核酸阻害剤によって標的とされない変異遺伝子の非変異対立遺伝子をコードするmRNAを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
561.被験体が、ワクチン接種を必要としている、および/または、例えば、損傷部位の再生を必要としている、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
562.フソソームが、1つ以上のシグナル配列をコードする1つ以上の配列を更に含む核酸を含み、例えば、標的細胞が、シグナル配列を含むタンパク質を標的細胞の細胞膜に転位させる、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
563.フソソーム組成物または調製物が、
a)被験体に少なくとも1、2、3、4、もしくは5回投与される、
b)被験体に全身的に(例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内に)もしくは局所的に投与される、
c)フソソーム組成物もしくは調製物が、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、もしくは眼から選択される標的組織に到達するように、被験体に投与される、
d)免疫抑制物質、例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、もしくはイムノフィリンモジュレーターと同時投与される、および/または
e)免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、もしくはケモカインと同時投与される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
564.フソソーム組成物または調製物の投与が、被験体の標的細胞における遺伝子の上方調節または下方調節をもたらし、例えば、フソソームが、転写活性化因子もしくは抑制因子、翻訳活性化因子もしくは抑制因子、またはエピジェネティック活性化因子もしくは抑制因子を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
565.フソソーム調製物が、
a)少なくとも105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、もしくは1015フソソーム、および/または
b)少なくとも10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1L、2L、5L、10L、20L、もしくは50Lを含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
566.第1のフソゲンが、リポペプチドではない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
567.フソソーム、フソソーム組成物、またはフソソーム調製物が、部分的または完全な核不活化(例えば、核除去)を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
568.ソース細胞が、
a)付着または懸濁条件下で増殖した細胞、
b)初代細胞、培養細胞、不死化細胞、または細胞株(例えば、ミエロバスト(myelobast)細胞株、例えば、C2C12)、
c)例えば、標的細胞と同じ種の異なる生物から得られた同種異系細胞、
d)例えば、標的細胞とは異なる種の生物から得られた異種細胞である、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
569.フソソームが、
a)循環中のスカベンジャー系もしくは肝臓の洞内のクッパー細胞、または
b)例えば、実施例76のアッセイによる、被験体における細網内皮系(RES)によって捕捉されない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
570.複数のフソソームが被験体に投与される場合、複数の1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%未満が、例えば、実施例76のアッセイにより、24時間後にRESによって捕捉されない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
571.フソソームが、ウイルス構造タンパク質および/またはウイルスマトリックスタンパク質を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
572.フソソームが、例えば、ソース細胞と比較して、以下のオルガネラ:ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒のうちの1つ以上を実質的に含まないか、または少数を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
573.フソソームが、CreまたはGFP、例えば、EGFPを含まない、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
574.フソソーム組成物または薬学的組成物が、所定の温度で少なくとも1、2、3、6、もしくは12時間;1、2、3、4、5、もしくは6日間;1、2、3、もしくは4週間;1、2、3、もしくは6ヶ月間;または1、2、3、4、もしくは5年間維持されている、かつ/あるいは所定の温度が、約4、0、-4、-10、-12、-16、-20、-80、または-160℃から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
575.フソソーム組成物または薬学的組成物が、例えば、以下のうちの1つ以上によって、前述の温度で維持する前に、複数の活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%の活性を有する、
i)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも10%高い割合で融合する、
ii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも50%高い割合で融合する、
iii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、24時間後に、標的細胞の少なくとも10%に送達されるような割合で標的細胞と融合する、または
iv)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、前述の温度で維持する前に、複数のフソゲンコピー数の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは99%のコピー数で存在する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
576.フソソーム組成物または薬学的組成物が、例えば、以下のうちの1つ以上によって、前述の期間にわたって前述の温度で保存する前に、複数の活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%の活性を有する場合、安定であると見なされる、
i)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、非標的細胞とよりも標的細胞と、例えば、少なくとも少なくとも10%高い割合で融合する、
ii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、他のフソソームとよりも標的細胞と、例えば、少なくとも50%高い割合で融合する、
iii)フソソームが、例えば、実施例54のアッセイにおいて、フソソーム中の作用物質が、24時間後に、標的細胞の少なくとも10%に送達されるような割合で標的細胞と融合する、または
iv)フソゲンが、例えば、実施例29のアッセイによって測定した場合、前述の温度で維持する前に、複数のフソゲンコピー数の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは99%のコピー数で存在する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
577.疾患または障害が、癌、自己免疫障害、または感染症から選択される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
578.フソソームが、新生抗原を含む、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
579.フソソーム組成物が、
a)被験体に少なくとも1、2、3、4、もしくは5回、
b)被験体に全身的(例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内)もしくは局所的に、および/または
c)フソソーム組成物が、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、もしくは眼から選択される標的組織に到達するように、被験体に投与される、上記実施形態のいずれかのフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
580.フソソーム組成物が、
a)免疫抑制物質、例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、もしくはイムノフィリンモジュレーター、および/または
b)免疫刺激剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、もしくはケモカインと同時投与される、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
581.複数のフソソームが、局所的、遠位的、または全身的効果を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
582.生物が、ヒトであり、例えば、ヒトが、疾患、障害、または状態を有する、上記実施形態のいずれかに記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
583.標的細胞の細胞膜脂質二重層における膜ペイロード剤、核ペイロード剤、またはオルガネラペイロード剤の存在が、疾患、障害、または状態のうちの1つ以上の症状を改善する、実施形態582に記載のフソソーム、フソソーム組成物、フソソーム調製物、または方法。
作用物質:一般に、本明細書で使用される「作用物質」という用語は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸(例えば、DNA、染色体(例えば、ヒト人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA)、糖類もしくは多糖類、脂質、低分子、またはそれらの組み合わせもしくは複合体を含む、化合物または実体を指すために使用され得る。この用語は、オルガネラ、またはその画分、抽出物、もしくは成分であるか、またはそれを含む実体を指す場合がある。
本明細書に記載のフソソーム組成物および方法は、(a)脂質二重層、(b)脂質二重層に囲まれた内腔(例えば、細胞質ゾルを含む)、(c)ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲン(例えば、フソゲンが脂質二重層内に配置されている場合)、および(d)膜タンパク質ペイロード剤を含む。実施形態では、フソソームは、非植物細胞、例えば、哺乳動物細胞、またはその誘導体(例えば、ミトコンドリア、コンドリソーム、オルガネラ、小胞、もしくは除核細胞)に由来し、フソゲン、例えば、タンパク質、脂質、または化学融合物質を含む。
本明細書に記載の組成物および方法の幾つかの実施形態では、フソソーム、例えば、両親媒性脂質とフソゲンとの天然由来の二重層が含まれる。フソソームは、幾つかの異なるタイプの脂質、例えば、リン脂質などの両親媒性脂質を含み得る。フソソームは、最外面として脂質二重層を含み得る。そのような組成物は、驚くべきことに、本発明の方法で使用することができる。場合によっては、膜は、Ahmad et al.2014 Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport&enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy.EMBO Journal.33(9):994-1010に記載されているように、自家、同種、異種、または操作された細胞の形態をとり得る。幾つかの実施形態では、組成物は、例えば、Orive.et al.2015.Cell encapsulation:technical and clinical advances.Trends in Pharmacology Sciences;36(8):537-46;and in Mishra.2016.Handbook of Encapsulation and Controlled Release.CRC Pressに記載されているように、操作された膜を含む。幾つかの実施形態では、組成物は、天然に存在する膜を含む(McBride et al.2012.A Vesicular Transport Pathway Shuttles Cargo from mitochondria to lysosomes.Current Biology 22:135-141)。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム(例えば、小胞または細胞の一部を含む)は、フソソームと膜、例えば、細胞膜との融合を促進するために、1つ以上のフソゲンを含む。また、これらの組成物は、1つ以上のフソゲンを含むように合成中または合成後に行われる表面修飾を含み得る。表面修飾は、膜への修飾、例えば、脂質またはタンパク質の膜への挿入を含み得る。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、タンパク質フソゲン、例えば、哺乳動物タンパク質または哺乳動物タンパク質のホモログ(例えば、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上の同一性を有する)、ウイルスタンパク質またはウイルスタンパク質のホモログ等の非哺乳動物タンパク質(例えば、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上の同一性を有する)、天然タンパク質または天然タンパク質の誘導体、合成タンパク質、そのフラグメント、そのバリアント、フソゲンまたはフラグメントのうちの1つ以上を含むタンパク質融合、およびそれらの任意の組み合わせである。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、哺乳動物タンパク質を含み得、表1を参照する。哺乳動物のフソゲンの例には、限定されないが、vSNAREおよびtSNAREなどのSNAREファミリータンパク質、シンシチン-1(DOI:10.1128/JVI.76.13.6442-6452.2002)およびシンシチン-2などのシンシチンタンパク質、ミオメーカー(myomaker)(biorxiv.org/content/early/2017/04/02/123158、doi.org/10.1101/123158、doi:10.1096/fj.201600945R、doi:10.1038/nature12343)、ミオミキサー(myomixer)(www.nature.com/nature/journal/v499/n7458/full/nature12343.html、doi:10.1038/nature12343)、ミオマージャー(myomerger)(science.sciencemag.org/content/early/2017/04/05/science.aam9361、DOI:10.1126/science.aam9361)、FGFRL1(線維芽細胞成長因子受容体様1)、ミニオン(doi.org/10.1101/122697)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のアイソフォーム(例えば、米国特許第6,099,857A号に開示されている)、コネキシン43、コネキシン40、コネキシン45、コネキシン32、またはコネキシン37などのギャップ結合タンパク質(例えば、米国特許第2007/0224176号に開示されている、Hap2、異種細胞間でシンシチン形成を誘導することができる任意のタンパク質(表2を参照)、フソゲン特性を有する任意のタンパク質(表3を参照)、それらのホモログ、それらのフラグメント、それらのバリアント、およびそれらの1つ以上のタンパク質またはフラグメントを含むタンパク質融合物が含まれ得る。幾つかの実施形態では、フソゲンは、ヒトゲノムに見出されるヒト内在性レトロウイルスエレメント(hERV)によってコードされる。追加の例示的なフソゲンは、US6,099,857A号およびUS2007/0224176号に開示されており、その全容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ウイルスタンパク質
幾つかの実施形態では、フソゲンは、非哺乳動物タンパク質、例えば、ウイルスタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、ウイルスフソゲンは、クラスIウイルス膜融合タンパク質、クラスIIIウイルス膜融合タンパク質、ウイルス膜糖タンパク質、または他のウイルス融合タンパク質、あるいはそれらのホモログ、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらの1つ以上のタンパク質もしくはフラグメントを含むタンパク質融合物である。
表4.パラミクソウイルスF配列クラスター。列1、Genbank IDには、クラスターの重心配列であるウイルスの全ゲノム配列のGenbank IDが含まれる。列2、CDSのヌクレオチドは、全ゲノムの遺伝子のCDSに対応するヌクレオチドを提供する。列3、完全な遺伝子名は、Genbank ID、ウイルス種、株、およびタンパク質名を含む遺伝子の完全な名前を提供する。列4、配列は、遺伝子のアミノ酸配列を提供する。列5、配列数/クラスターは、この重心配列でクラスター化する配列の数を提供する。
表5.パラミクソウイルスプロテインG、H、およびHN配列クラスター。列1、Genbank IDには、クラスターの重心配列であるウイルスの全ゲノム配列のGenbank IDが含まれる。列2、CDSのヌクレオチドは、全ゲノムの遺伝子のCDSに対応するヌクレオチドを提供する。列3、完全な遺伝子名は、Genbank ID、ウイルス種、株、およびタンパク質名を含む遺伝子の完全な名前を提供する。列4、配列は、遺伝子のアミノ酸配列を提供する。列5、配列数/クラスターは、この重心配列でクラスター化する配列の数を提供する。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、pH依存性(例えば、虚血性傷害の場合と同様)タンパク質、そのホモログ、そのフラグメント、および1つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含むタンパク質融合物を含み得る。フソゲンは、細胞表面、またはエンドソーム内、または別の細胞膜結合空間内で膜融合を媒介する可能性がある。
幾つかの実施形態では、タンパク質フソゲンは、免疫応答性を低減するように改変することができる。例えば、タンパク質フソゲンは、PEGなどの免疫相互作用を低減する分子で装飾され得る(DOI:10.1128/JVI.78.2.912-921.2004)。したがって、幾つかの実施形態では、フソゲンは、PEGを含み、例えば、PEG化ポリペプチドである。免疫系の標的となるフソゲンのアミノ酸残基は、免疫系によって認識されないように改変することができる(doi:10.1016/j.virol.2014.01.027、doi:10.1371/journal.pone.0046667)。幾つかの実施形態では、フソゲンのタンパク質配列は、ヒト(ヒト化)に見られるアミノ酸配列に類似するように改変される。幾つかの実施形態では、フソゲンのタンパク質配列は、MHC複合体とわずかな強さで結合するタンパク質配列に変更される。幾つかの実施形態では、タンパク質フソゲンは、ヒトに感染しない(そしてヒトがワクチン接種されていない)ウイルスまたは生物に由来し、患者の免疫系がタンパク質フソゲンに対してナイーブである可能性を高める(例えば、フソゲンに対する無視できるほどの体液性または細胞媒介性の適応免疫応答がある)(doi:10.1006/mthe.2002.0550、doi:10.1371/journal.ppat.1005641、doi:10.1038/gt.2011.209、DOI10.1182/blood-2014-02-558163)。理論に拘束されることを望まないが、幾つかの実施形態では、ヒトに感染しないウイルスまたは生物に由来するタンパク質フソゲンは、患者において天然の融合標的を持たず、したがって高い特異性を有する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、飽和脂肪酸などの融合性化学物質で処理され得る。幾つかの実施形態では、飽和脂肪酸は、10~14個の炭素を有する。幾つかの実施形態では、飽和脂肪酸は、より長鎖のカルボン酸を有する。幾つかの実施形態では、飽和脂肪酸はモノエステルである。
幾つかの実施形態では、フソソームは、融合性化学物質で処理され得る。幾つかの実施形態では、融合性化学物質は、ポリエチレングリコール(PEG)またはその誘導体である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、融合性小分子で処理され得る。幾つかの非限定的な例としては、ハロタン、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、およびクロルプロマジンなどの非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)が挙げられる。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、切断可能なタンパク質に連結されている。場合によっては、切断可能なタンパク質は、プロテアーゼへの曝露によって切断され得る。操作された融合タンパク質は、膜貫通タンパク質の任意のドメインに結合し得る。操作された融合タンパク質は、切断ペプチドによって、膜間腔内に位置するタンパク質ドメインに連結され得る。切断ペプチドは、膜間プロテアーゼのうちの1つまたは組み合わせによって切断され得る(例えば、位置P1で非極性脂肪族アミノ酸を必要とするHTRA2/OMI(バリン、イソロイシン、またはメチオニンが好ましい)、ならびにP2およびP3位置での親水性残基(アルギニンが好ましい))。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームまたはフソソーム組成物は、非エンドサイトーシス経路を介してカーゴを標的細胞に送達する。理論に拘束されることを望まないが、非エンドサイトーシス送達経路は、細胞、例えば、細胞の所望のコンパートメントに送達されるカーゴの量またはパーセンテージを改善することができる。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物は、非標的細胞と比較して、標的細胞に優先的にカーゴを送達する。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、以下の特性の一方または両方を有する:(i)複数のフソソームが、標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触する場合、カーゴは、非標的細胞よりも標的細胞に少なくとも2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、もしくは100倍多く存在する、または(ii)複数のフソソームが、非標的細胞とよりも標的細胞と、少なくとも少なくとも50%高い割合で融合する。
細胞から生成されたフソソーム
フソソームの組成物は、培養中の細胞、例えば、培養された哺乳動物細胞、例えば、培養されたヒト細胞から生成され得る。細胞は、始原細胞または非始原(例えば、分化した)細胞であり得る。細胞は、初代細胞または細胞株(例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、本明細書に記載の細胞株)であり得る。実施形態では、培養細胞は、始原細胞、例えば、骨髄間質細胞、骨髄由来成体前駆細胞(MAPC)、内皮前駆細胞(EPC)、芽細胞、脳室下帯に形成された中間前駆細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞、衛星細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、骨髄間質細胞、表皮幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、前駆細胞、筋肉前駆細胞、筋芽細胞、心筋芽球、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経前駆細胞、肝芽球である。
i)マイト粒子、エクソソーム、または他の膜封入された小胞の出芽を誘導する、
ii)以下の方法のうちのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、核の不活化、例えば、除核を誘導する:
a)遺伝的方法、
b)例えば、アクチノマイシンDを使用する化学的方法、または
c)機械的方法、例えば、圧搾もしくは吸引、または
iii)例えば、以下の方法のうちのいずれかまたはそれらの組み合わせによって、細胞断片化を誘導する:
a)化学的方法、
b)機械的方法、例えば、遠心分離(例えば、超遠心分離もしくは密度遠心分離)、凍結融解、または超音波処理。
幾つかの態様では、修飾は、フソソーム生成の前に、被験体、組織、または細胞の修飾などの細胞に対して行われる。そのような修飾は、例えば、融合、フソゲンの発現もしくは活性、カーゴの構造もしくは機能、または標的細胞の構造もしくは機能を改善するのに効果的であり得る。
幾つかの実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に物理的に修飾される。例えば、本明細書の他の場所に記載されているように、フソゲンは、細胞の表面に連結され得る。
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞内の内因性フソゲン(例えば、幾つかの実施形態では、ソース細胞に対して内因性であり、幾つかの実施形態では、標的細胞に対して内因性である)の発現を増加させるために、フソソームを生成する前に遺伝子修飾される。幾つかの実施形態では、遺伝子修飾は、内因性フソゲンの転写活性化因子の発現または活性を増加させ得る。幾つかの実施形態では、遺伝子修飾は、内因性フソゲンの転写抑制因子の発現または活性を低下させ得る。幾つかの実施形態では、活性化因子または抑制因子は、ガイドRNAによって内因性フソゲンを標的とする転写活性化因子または抑制因子に連結されたヌクレアーゼ不活性cas9(dCas9)である。幾つかの実施形態では、遺伝子修飾は、内因性フソゲン遺伝子エピジェネティックに修飾して、その発現を増加させる。幾つかの実施形態では、エピジェネティック活性化因子は、ガイドRNAによって内因性フソゲンを標的とするエピジェネティック修飾因子に連結されたヌクレアーゼ不活性cas9(dCas9)である。
幾つかの態様では、修飾は、フソソームに対して行われる。そのような修飾は、例えば、標的化、機能、または構造を改善するのに効果的であり得る。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、膜タンパク質ペイロード剤であるか、またはそれを含むカーゴを含む。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、治療用タンパク質であり得るか、またはそれをコードし得る。フソソームは、他のカーゴを更に含み得、例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、治療薬であるか、またはそれを含むカーゴを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、複数の膜ペイロード剤を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、複数の治療薬であるか、またはそれを含むカーゴを含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、1つ以上の膜タンパク質ペイロード剤および1つ以上の治療剤を含むカーゴを含む。幾つかの実施形態では、カーゴは、ソース細胞に対して外因性または内因性である治療薬であり得る。
本明細書に記載の方法および組成物を使用して、ペイロード(例えば、ペイロード剤)を標的とすることができる。例えば、ペイロード剤は、例えば、同時翻訳小胞体(ER)シグナルの使用を通じて、細胞膜を標的にすることができる。細胞膜は、例えば、ER膜、原形質膜、分泌および/もしくは分泌小胞の膜、またはリソソーム膜であり得る。幾つかの実施形態では、ペイロード剤は、分泌の標的とされる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、ERでの翻訳後、ペイロードをオルガネラ(例えば、ゴルジ装置、分泌小胞、またはリソソーム)の内腔に標的とすることができる。幾つかの実施形態では、ペイロード剤は、例えば、核局在化シグナルを使用することにより、核を標的とすることができる。別の例では、ペイロード剤は、例えば、ミトコンドリアまたはペルオキシソーム局在化シグナルをそれぞれ使用することにより、ミトコンドリアまたはペルオキシソームを標的とすることができる。
幾つかの実施形態では、タンパク質ペイロード剤(例えば、本明細書に記載される、例えば、膜タンパク質ペイロード剤、核タンパク質ペイロード剤、オルガネラタンパク質ペイロード剤、ミトコンドリアタンパク質ペイロード剤、もしくはペルオキシソームタンパク質ペイロード剤、または分泌タンパク質ペイロード剤)は、タンパク質を特定の部位または位置(例えば、細胞表面、核、オルガネラ、ミトコンドリア、もしくはペルオキシソーム)に向けるシグナル配列を含むか、または含まれるタンパク質(もしくはそれをコードする核酸)である。当業者は、ある特定の例において、細胞が、タンパク質を特定の細胞内位置に(例えば、標的細胞の特定のオルガネラまたは表面膜に)標的化するために、少なくとも一時的にタンパク質の一部である(例えば、最初に産生されたとき)アミノ酸モチーフである「選別シグナル」を使用することを理解するであろう。幾つかの実施形態では、選別シグナルは、シグナル配列、シグナルペプチド、またはリーダー配列であり、タンパク質を小胞体(ER)、ミトコンドリア、またはペルオキシソームと呼ばれるオルガネラに向け、幾つかのそのような実施形態では、タンパク質は、次いで原形質膜に送達される。US2016/0289674A1を参照されたい。幾つかのそのような実施形態では、次いで、タンパク質が分泌される。幾つかのそのような実施形態では、次いで、タンパク質がリソソームに輸送される。幾つかのそのような実施形態では、次いで、タンパク質がゴルジ装置に輸送される。幾つかのそのような実施形態では、次いで、タンパク質が分泌小胞に輸送され、次いで細胞から分泌され得る。幾つかのそのような実施形態では、次いで、タンパク質がエンドソームに輸送される。幾つかの実施形態では、選別シグナルは、タンパク質を核に向けるシグナル配列、シグナルペプチド、またはリーダー配列(例えば、核局在化配列)であり、幾つかのそのような実施形態では、次いで、タンパク質が核に送達される。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、細胞の膜表面上(例えば、原形質膜の表面上)に自然に見出されるタンパク質(またはそれをコードする核酸)である。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、インテグリンまたはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表7から選択されるインテグリン、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表7のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、もしくは99%同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表7の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または99%同一の配列を有する核酸を含む。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、イオンチャネルタンパク質またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表8から選択されるイオンチャネルタンパク質、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表8のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、もしくは99%同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表8の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または99%同一の配列を有する核酸を含む。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、孔形成タンパク質またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、孔形成タンパク質は、溶血素またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であり得る。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表9から選択される溶血素、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、孔形成タンパク質は、コリシンまたはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であり得る。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表10から選択されるコリシン、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、トール様受容体(TLR)またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表11から選択されるトール様受容体、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表11のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、もしくは99%同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表11の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または99%同一の配列を有する核酸を含む。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、細胞接着タンパク質またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表13から選択される細胞接着タンパク質、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、細胞接着タンパク質は、カドヘリンまたはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であり得る。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表14から選択されるカドヘリン、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、細胞接着タンパク質は、セレクチンまたはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であり得る。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表15から選択されるセレクチン、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、細胞接着タンパク質は、ムチンまたはその機能的フラグメント、バリアント、またはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であり得る。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表16から選択されるムチン、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、輸送タンパク質またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表17から選択される輸送タンパク質、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表17のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、もしくは99%同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、表17の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または99%同一の配列を有する核酸を含む。
幾つかの実施形態では、膜タンパク質ペイロード剤は、CAR、例えば、第一世代のCARもしくは第一世代のCARをコードする核酸であるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、第一世代のCARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。幾つかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、T細胞活性化中に下流のシグナル伝達を媒介する。
幾つかの実施形態では、CAR抗原結合ドメインは、抗体もしくはその抗原結合部分であるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、CAR抗原結合ドメインは、scFvもしくはFabであるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、CAR抗原結合ドメインは、T細胞α鎖抗体、T細胞β鎖抗体、T細胞γ鎖抗体、T細胞δ鎖抗体、CCR7抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD5抗体、CD7抗体、CD8抗体、CD11b抗体、CD11c抗体、CD16抗体、CD19抗体、CD20抗体、CD21抗体、CD22抗体、CD25抗体、CD28抗体、CD34抗体、CD35抗体、CD40抗体、CD45RA抗体、CD45RO抗体、CD52抗体、CD56抗体、CD62L抗体、CD68抗体、CD80抗体、CD95抗体、CD117抗体、CD127抗体、CD133抗体、CD137(4-1BB)抗体、CD163抗体、F4/80抗体、IL-4Ra抗体、Sca-1抗体、CTLA-4抗体、GITR抗体、GARP抗体、LAP抗体、グランザイムB抗体、LFA-1抗体、またはトランスフェリン受容体抗体のscFvまたはFabフラグメントを含む。
幾つかの実施形態では、CARは、膜貫通ドメインを含む。幾つかの実施形態では、CAR膜貫通ドメインは、少なくともT細胞受容体のα、β、またはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、またはその機能的バリアントの膜貫通領域を含む。幾つかの実施形態では、CARは、少なくともCD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS、およびFGFR2B、またはその機能的バリアントの膜貫通領域を含む。
幾つかの実施形態では、CARは、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6)、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BBリガンド/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFFR/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27リガンド/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30リガンド/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40リガンド/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITRリガンド/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、リンホトキシン-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40リガンド/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α、TNFRII/TNFRSF1B)、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150)、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLAクラスI、HLA-DR、イカロス、インテグリンα4/CD49d、インテグリンα4β1、インテグリンα4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、CAP12、デクチン-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLPR、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、NKG2C、CD3ζドメイン、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)、またはそれらの機能的バリアントのうちの1つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、CARは、1つ以上のスペーサーを含む。幾つかの実施形態では、CARは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサーを含む。幾つかの実施形態では、CARは、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間にスペーサーを含む。
本明細書に記載のCARに加えて、様々なキメラ抗原受容体およびそれをコードするヌクレオチド配列が、当該技術分野で知られており、本明細書に記載のインビボおよびインビトロでの標的細胞のフソソーム送達および再プログラミングに適している。例えば、WO2013/040557、WO2012/079000、WO2016/030414、Smith T,et al.,Nature Nanotechnology.2017.DOI:10.1038/NNANO.2017.57(その開示は、参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
幾つかの実施形態では、ペイロード剤は、核タンパク質ペイロード剤またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、核タンパク質ペイロード剤は、表17-1から選択されるタンパク質、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、核タンパク質ペイロード剤は、表17-1のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、もしくは99%同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、核タンパク質ペイロード剤は、表17-1の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または99%同一の配列を有する核酸を含む。幾つかの実施形態では、ペイロード剤は、核小体もしくは核体に局在するタンパク質、またはそれをコードする核酸であるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、ペイロード剤は、構造タンパク質、転写活性化因子、転写抑制因子、エピジェネティック修飾因子、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、DNA修飾酵素、RNAスプライシング因子、もしくはゲノムホメオスタシスタンパク質、またはそれをコードする核酸であるか、またはそれを含む。
幾つかの実施形態では、ペイロード剤は、オルガネラタンパク質ペイロード剤またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。幾つかの実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、表17-2から選択されるタンパク質、またはその機能的フラグメント、バリアント、もしくはホモログ、あるいはそれをコードする核酸であるか、またはそれを損なう。実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、表17-2のタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも最少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、もしくは99%同一の配列、またはそれをコードする核酸を有するタンパク質を含む。実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、表17-2の遺伝子の核酸配列と少なくとも最少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または99%同一の配列を有する核酸を含む。実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、例えば、本明細書に記載されるように(例えば、表17-2に列挙されるように)、細胞内コンパートメントに局在化する。実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、小胞体、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、ゴルジ装置、脂肪滴、原形質膜、ストレス顆粒、または細胞骨格に局在化する。実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、例えば、本明細書に記載されるように(例えば、表17-2に列挙されるように)、細胞内コンパートメントの局在化シグナルを含む。実施形態では、オルガネラタンパク質ペイロード剤は、小胞体、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、ゴルジ装置、脂肪滴、原形質膜、ストレス顆粒、または細胞骨格のうちの1つ以上(例えば、1、2、3、もしくは4つ)の局在化シグナルを含む。
ペイロード剤、例えば、タンパク質ペイロード剤もまた、分泌の標的にすることができる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、ERでの翻訳後、ペイロードをオルガネラ(例えば、ゴルジ装置、分泌小胞)の内腔に標的化することができる。幾つかの実施形態では、分泌タンパク質ペイロード剤は、分泌タンパク質またはそれをコードする核酸を含む。
幾つかの実施形態では、フソソームまたはフソソーム組成物は、コンドリソームまたはコンドリソーム調製物を更に含む。幾つかの実施形態では、フソソームまたはフソソーム組成物は、ミトコンドリアの細胞源に由来する修飾されたコンドリソーム調製物を含む。幾つかの実施形態では、フソソームまたはフソソーム組成物は、外因性タンパク質を発現するコンドリソーム調製物を含む。幾つかの実施形態では、外因性タンパク質は、前述のミトコンドリアに対して外因性である。幾つかの実施形態では、外因性タンパク質は、前述のミトコンドリアの細胞源に対して外因性である。コンドリソーム、コンドリソーム調製物、方法、および使用を含む追加の特徴および実施形態は、例えば、国際出願第PCT/US16/64251号に記載されているように、本発明によって企図されている。
本明細書に記載の態様のうちのいずれかの実施形態では、フソソーム組成物は、実質的に非免疫原性である。免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように定量化することができる。
a.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはHeLa細胞と比較して、MHCクラスIまたはMHCクラスIIの50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
b.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、または本明細書に記載の参照細胞と比較して、LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3、またはB7-H4を含むが、これらに限定されない1つ以上の共刺激タンパク質の50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
c.マクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質(例えば、CD47)の発現、例えば、本明細書に記載の方法によって検出可能な発現、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して、マクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質(例えば、CD47)の1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍超、またはそれ以上多い発現、
d.可溶性免疫抑制サイトカイン(例えば、IL-10)の発現、例えば、本明細書に記載の方法によって検出可能な発現、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して、可溶性免疫抑制サイトカイン(例えば、IL-10)の1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍超、またはそれ以上多い発現、
e.可溶性免疫抑制タンパク質(例えば、PD-L1)の発現、例えば、本明細書に記載の方法によって検出可能な発現、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して、可溶性免疫抑制タンパク質(例えば、PD-L1)の1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍超、またはそれ以上多い発現、
f.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはU-266細胞と比較して、可溶性免疫刺激サイトカイン(例えば、IFN-γもしくはTNF-a)の50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
g.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはA549細胞もしくはSK-BR-3細胞と比較して、内因性免疫刺激抗原(例えば、Zg16もしくはHormad1)の50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
h.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して、例えば、本明細書に記載の方法によって検出可能な発現、HLA-EまたはHLA-Gの発現、
i.例えば、NK細胞の活性化を抑制するように作用する、例えば、シアル酸を含む、表面グリコシル化プロファイル、
j.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して、TCRα/βの50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
k.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはHeLa細胞と比較して、ABO結合基の50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
l.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して、マイナー組織適合抗原(MHA)の50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、あるいは
m.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して、ミトコンドリアMHAの10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%未満、もしくはそれ以下の発現を有するか、または検出可能なミトコンドリアMHAを有しない。
a.MHCクラスI、MHCクラスII、またはMHA、
b.限定されないが、LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3、またはB7-H4を含む、1つ以上の共刺激タンパク質、
c.可溶性免疫刺激サイトカイン、例えば、IFN-γまたはTNF-a、
d.内因性免疫刺激抗原、例えば、Zg16またはHormad1、
e.T細胞受容体(TCR)、
f.ABO式血液型をコードする遺伝子、例えばABO遺伝子、
g.免疫活性化を促進する転写因子、例えば、NFkB、
h.MHC発現を制御する転写因子、例えば、クラスIIトランスアクチベーター(CIITA)、Xbox5の調節因子(RFX5)、RFX関連タンパク質(RFXAP)、またはRFXアンキリン反復(RFXANK、RFXBとしても知られている)、あるいは
TAPタンパク質、例えば、MHCクラスIの発現を低下させるTAP2、TAP1、TAPBP、のうちの1、2、3、4、5、6、7つ、またはそれ以上を枯渇した、例えば、ノックアウトを有する、哺乳動物細胞に由来する。
a.マクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質、例えばCD47、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して、増加したCD47の発現、
b.可溶性免疫抑制性サイトカイン、例えば、IL-10、例えば、他の点ではソース細胞と同様である未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して増加したIL-10の発現、
c.可溶性免疫抑制タンパク質、例えば、PD-1、PD-L1、CTLA4、またはBTLA、例えば、参照細胞、例えば、他の点では細胞ソースと同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して、増加した免疫抑制タンパク質の発現、あるいは
d.免疫寛容原性タンパク質、例えば、ILT-2もしくはILT-4アゴニスト、例えば、HLA-EもしくはHLA-G、または任意の他の内因性ILT-2もしくはILT-4アゴニスト、例えば、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して増加したHLA-E、HLA-G、ILT-2、またはILT-4の発現のうちの1、2、3つ、またはそれ以上の発現の増加をもたらす遺伝子修飾を伴うソース細胞に由来する(例えば、遺伝子修飾の前に、細胞は因子を発現しなかった)。
幾つかの実施形態では、増加した発現レベルは、参照細胞と比較して、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、または100倍高い。
幾つかの実施形態では、フソソームは、免疫活性化物質、例えば、
a.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはHeLa細胞と比較して、MHCクラスIまたはMHCクラスIIの50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
b.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、または本明細書に記載される参照細胞と比較して、LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3、またはB7-H4を含むが、これらに限定されない1つ以上の共刺激タンパク質の50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
c.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはU-266細胞と比較して、可溶性免疫刺激サイトカイン(例えば、IFN-γもしくはTNF-a)の50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
d.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはA549細胞もしくはSK-BR-3細胞と比較して、内因性免疫刺激抗原(例えば、Zg16もしくはHormad1)の50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
e.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して、T細胞受容体(TCR)の50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
f.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはHeLa細胞と比較して、ABO式血液型の50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
g.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して、免疫活性化を促進する転写因子、例えば、NFkBの50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、
h.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはJurkat細胞と比較して、MHC発現を制御する転写因子、例えば、クラスIIトランスアクチベーター(CIITA)、Xbox5(RFX5)の調節因子、RFX関連タンパク質(RFXAP)、またはRFXアンキリン反復(RFXANK;RFXBとしても知られる)の50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現、あるいは
i.参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未修飾細胞、またはHeLa細胞と比較して、MHCクラスIの発現を低減するTAPタンパク質、例えば、TAP2、TAP1、またはTAPBPの50%、40%、30%、20%、15%、10%、もしくは5%未満、またはそれ以下の発現のうちの1、2、3、4、5、6、7、8つ、またはそれ以上の発現を減少させるように修飾されたソース細胞に由来する。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、実質的に免疫原性でないか、または免疫原性が低下するように修飾された、例えば、本明細書に記載の方法を使用して修飾された、ソース細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来する。ソース細胞およびフソソーム組成物の免疫原性は、本明細書に記載のアッセイのうちのいずれかによって決定することができる。
a.ソース細胞が、自家細胞源、例えば、フソソーム組成物を受ける、例えば、投与されるレシピエントから得られる細胞から得られる、
b.ソース細胞が、フソソーム組成物を受ける、例えば、投与されるレシピエント、例えば、本明細書に記載のレシピエントと一致する、例えば、同一の性別のものである同種異系細胞源から得られる、
c.ソース細胞が、レシピエントのHLAと、例えば、1つ以上の対立遺伝子で、一致するHLAである同種異系細胞源から得られる、
d.ソース細胞が、HLAホモ接合体である同種異系細胞源から得られる、
e.ソース細胞が、MHCクラスIおよびIIを欠いている(または参照細胞と比較して低下したレベルを有する)同種異系細胞源から得られる、あるいは
f.ソース細胞が、限定されないが、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、または網膜色素上皮細胞を含む、実質的に非免疫原性であることが知られている細胞源から得られる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、追加の作用物質、例えば、治療薬と共に、被験体、例えば、レシピエント、例えば、本明細書に記載のレシピエントに同時投与される。幾つかの実施形態では、同時投与される治療薬は、免疫抑制物質、例えば、グルココルチコイド(例えば、デキサメタゾン)、細胞増殖抑制物質(例えば、メトトレキサート)、抗体(例えば、ムロモナブ-CD3)、またはイムノフィリンモジュレーター(例えば、シクロスポリンもしくはラパマイシン)である。実施形態では、免疫抑制物質は、フソソームの免疫介在性クリアランスを減少させる。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、免疫賦活物質、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと同時投与される。
幾つかの実施形態では、フソゲン(例えば、タンパク質、脂質、もしくは化学フソゲン)またはフソゲン結合パートナーは、フソソームの送達の前、同時、または後に、標的細胞または組織に送達される。
例えば、ランディングパッドの実施形態のためのフソゲン結合パートナー
本明細書に記載の薬学的組成物の投与は、経口、吸入、経皮または非経口(静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、腔内、および皮下を含む)投与によるものであり得る。フソソームは、単独で投与することも、薬学的組成物として製剤化することもできる。
実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物は、細胞または組織、例えば、ヒトの細胞または組織にエクスビボで送達される。実施形態では、組成物は、エクスビボで細胞または組織の機能を改善し、例えば、細胞生存率、シグナル伝達、呼吸、または他の機能(例えば、本明細書に記載の別の機能)を改善する。
本明細書に記載のフソソーム組成物を、被験体、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに投与することができる。そのような実施形態では、被験体は、特定の疾患または状態(例えば、本明細書に記載の疾患もしくは状態)のリスクがあり得るか、症状があり得るか、または診断され得るか、またはそうであると識別され得る。一実施形態では、被験体は、癌を有する。一実施形態では、被験体は、感染症を有する。
本明細書に記載の組成物はまた、限定されるものではないが、以下を含む様々な他の生物の細胞または組織の機能または生理学を同様に調節するために使用され得る:家畜または使役動物(ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリ等)、ペットまたは動物園の動物(ネコ、イヌ、トカゲ、トリ、ライオン、トラ、クマ等)、水産養殖動物(魚、カニ、エビ、カキ等)、植物種(樹木、作物、観賞用花等)、発酵種(サッカロミセス等)。本明細書に記載のフソソーム組成物は、かかる非ヒト供給源から作製され、非ヒト標的細胞もしくは組織、または被験体に投与され得る。
ドナーHeLa細胞を発現するMito-DsRed(ミトコンドリア特異的標的色素)を、0.25%トリプシンでトリプシン処理し、収集し、500xgで5分間回転させ、PBSで1回洗浄し、カウントした。続いて、10x106細胞を、10ug/mLサイトカラシンBで補足された完全MEM-α(+10%FBS、+1%ペニシリン/ストレプトマイシン、+グルタミン)中の3mLの12.5%フィコールに15分間再懸濁した。細胞を除核するために、それらを次のフィコール画分(上から下):2mLの12.5%フィコール、0.5mLの15%フィコール、0.5mLの16%フィコール、2mLの17%フィコール勾配、2mLの25%フィコールからなる不連続フィコール勾配に移した。全てのフィコール勾配画分を、10ug/mLサイトカラシンBで補足された完全DMEM中で作製した。勾配を、Beckman SW-40超遠心機、Ti-70ローター上で107971xg、37℃で1時間回転させた。遠心分離後、除核されたHeLa細胞を、17%フィコール画分の12.5%、15%、16%、および2分の1から収集し、完全DMEM(+10%FBS、+1%ペニシリン/ストレプトマイシン、+グルタミン)に再懸濁し、500xgで5分間回転させてペレット化した。除核されたMito-DsRedドナー細胞を、DMEMで2回洗浄した。同時に、レシピエントHeLa細胞を発現するMito-GFP(ミトコンドリア特異的標的色素)をトリプシン処理し、カウントし、融合のために調製した。
ドナーHeLa細胞を発現するMito-DsRed(ミトコンドリア特異的標的色素)を、0.25%トリプシンでトリプシン処理し、収集し、500xgで5分間回転させ、PBSで1回洗浄し、カウントした。続いて、2x106細胞を、完全DMEM(+10%FBS、+1%ペニシリン/ストレプトマイシン、+グルタミン)に再懸濁し、カウントし、融合のために調製した。
この実施例では、外因性のフソゲンを発現する組織培養細胞の作成について説明する。以下の実施例は、いかなるタンパク質ベースのフソゲンにも等しく適用可能であり、初代細胞(懸濁液または付着物)および組織での産生にも等しく適用可能である。場合によっては、フソゲンペアを使用して融合を誘導することができる(フソゲンおよびフソゲン結合パートナーとして描写される)。
実施例1に記載のように産生および融合された融合細胞(Mito-DsRedドナー除核細胞およびMito-GFPレシピエントHeLa細胞)を、イメージングディッシュに沈着してから24時間後に、Zeiss LSM 780倒立共焦点顕微鏡で63倍で画像化した。Mito-DsRedのみとMito-GFPのみを発現する細胞を別々にイメージングして、Mito-DsRedおよびMito-GFPの両方が存在し、同時に取得された条件で2つのチャネル間で信号が重複しないように取得設定を構成した。対象の10の領域を、各ROI内に最低10個の細胞が含まれるという唯一の基準で、完全に偏りのない方法で選択し、その結果、最低100個の細胞を、下流分析に使用できるようにした。これらの画像の所与のピクセルは、いずれかのチャネル(mito-DsRedおよびmito-GFP)の強度が、3つのROI全てでそれぞれのチャネルの最大強度値の10%を超えている場合、ミトコンドリアに対して陽性であると判断された。
実施例2に記載のように産生および複合された融合細胞(Mito-DsRedドナー細胞およびMito-GFPレシピエントHeLa細胞)を、イメージングディッシュに沈着してから24時間後に、Zeiss LSM 780倒立共焦点顕微鏡で63倍で画像化した。Mito-DsRedのみとMito-GFPのみを発現する細胞を別々にイメージングして、Mito-DsRedとMito-GFPの両方が存在し、同時に取得された条件で2つのチャネル間で信号が重複しないように取得設定を構成した。対象の10の領域を、各ROI内に最低10個の細胞が含まれるという唯一の条件で、完全に偏りのない方法で選択し、その結果、最低100個の細胞を、下流分析に使用できるようにした。これらの画像の所与のピクセルは、いずれかのチャネル(mito-DsRedおよびmito-GFP)の強度が、3つのROI全てでそれぞれのチャネルの最大強度値の20%を超えている場合、ミトコンドリアに対して陽性であると判断された。
実施例3に記載されるように産生および複合された融合細胞は、イメージングディッシュに沈着してから24時間後に、Zeiss LSM 780倒立共焦点顕微鏡で63倍の倍率で画像化される。Mito-DsRedのみとMito-GFPのみを発現する細胞を別々に画像化して、Mito-DsRedとMito-GFPの両方が存在し、同時に取得された条件で2つのチャネル間で信号が重複しないように取得設定を構成する。対象の10の領域を、各ROI内に最低10個の細胞が含まれるという唯一の条件で、完全に偏りのない方法で選択し、その結果、最少数の細胞を、下流分析に使用できるようにする。これらの画像の所与のピクセルは、いずれかのチャネル(mito-DsRedおよびmito-GFP)の強度が、3つのROI全てでそれぞれのチャネルの最大強度値の10%を超えている場合、ミトコンドリアに対して陽性であると判断される。
この実施例では、フソゲンをコードする核酸(例えば、mRNAもしくはDNA)を用いた細胞または小胞のエレクトロポレーションによるフソソームの生成について説明する。
この実施例では、フソソームを生成するためのフソゲンのエレクトロポレーションについて説明する。
この実施例では、小胞形成および遠心分離によるフソソームの生成および単離について説明する。これは、フソソームを単離することができる方法のうちの1つである。
この実施例では、小胞形成および遠心分離によるフソソームの生成および単離について説明する。これは、フソソームを単離することができる方法のうちの1つである。フソソームは、以下のように調製される。
この実施例では、低張処理および遠心分離によるフソソームの生成および単離について説明する。これは、フソソームを産生することができる方法のうちの1つである。
この実施例では、膜を介した押し出しによるフソソームの製造について説明する。
この実施例では、フソソームを生成するための化学物質を介したフソゲンの送達について説明する。およそ5×106個の細胞または小胞が、フソゲンの化学物質を介した送達のために使用される。細胞または小胞を、50μLのOpti-MEM培地に懸濁する。マスターミックスを設定するには、24μgの精製タンパク質フソゲンを、25μLのOpti-MEM培地と混合し、続いて2μLの脂質トランスフェクション試薬3000を含有する25μLのOpti-MEMを添加する。細胞または小胞およびフソゲン溶液を、プレートを穏やかに回転させ、37℃で6時間インキュベートすることによって混合し、その結果、フソゲンを細胞または小胞膜に組み込むであろう。次いで、フソソームをPBSで洗浄し、PBSに再懸濁し、氷上に保持する。
この実施例は、フソソームを生成するためのソース細胞へのフソゲンのリポソーム媒介送達を説明している。およそ5×106個の細胞または小胞が、フソゲンのリポソーム媒介送達のために使用される。細胞または小胞を、50μLのOpti-MEM培地に懸濁する。融合タンパク質を、n-オクチルb-D-グルコピラノシドの存在下で細胞から精製する。n-オクチルb-D-グルコピラノシドは、内在性膜タンパク質を溶解するために使用される中性界面活性剤である。次いで、フソゲンタンパク質を、Top et al.,EMBO 24:2980-2988,2005に記載されるように、n-オクチルb-D-グルコピラノシド懸濁タンパク質を、n-オクチルb-D-グルコピラノシドで事前飽和されたLUVと混合し、続いてn-オクチルb-D-グルコピラノシドを除去することによって、大きな(直径400nm)単層小胞(LUV)に再構築する。マスターミックスを設定するには、24μgの総フソゲンタンパク質を含むリポソームの塊を、50μLのOpti-MEM培地と混合する。次いで、リポソームおよびソース細胞または小胞の溶液を組み合わせ、プレートを穏やかに回転させ、フソゲン含有リポソームおよびソース細胞または小胞との融合を可能にする条件下、37℃で6時間インキュベートすることにより、溶液全体を混合し、その結果、フソゲンタンパク質が、ソース細胞または小胞膜に組み込まれるであろう。次いで、フソソームをPBSで洗浄し、PBSに再懸濁し、氷上に保持する。Liang et al.,Rapid and highly efficiency mammalian sell engineering via Cas9 protein transfection,Journal of Biotechnology 208:44-53,2015も参照されたい。
この実施例では、遠心分離によるフソソームの単離について説明する。これは、フソソームを単離することができる方法のうちの1つである。
この実施例では、細胞骨格の不活化および遠心分離によるフソソームの除核について説明する。これは、フソソームを修飾することができる方法のうちの1つである。
次の実施例では、γ線照射によるフソソームの修飾について説明する。理論に拘束されることなく、γ線照射は、DNAに二本鎖切断を引き起こし、細胞をアポトーシスに駆り立てる可能性がある。
次の実施例では、マイトマイシンC処理によるフソソームの修飾について説明する。いかなる特定の理論にも拘束されることなく、マイトマイシンC処理は、細胞周期を不活化することによってフソソームを修飾する。
この実施例は、フソソーム生成に使用される親細胞、例えば、ソース細胞と比較したフソソームにおける転写活性を定量化する。幾つかの実施形態では、転写活性は、親細胞、例えば、ソース細胞と比較して、フソソームでは低いか、または存在しないであろう。
この実施例では、フソソームでのDNA複製を定量化する。幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞と比較して低い割合でDNAを複製する。
この実施例では、核酸カーゴを用いたフソソームのエレクトロポレーションについて説明する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか1つによって調製される。およそ109個のフソソームおよび1μgの核酸、例えば、RNAを、エレクトロポレーションバッファー(水中1.15mMリン酸カリウム(pH7.2)、25mMの塩化カリウム、60%w/vのイオジキサノール)中で混合する。エレクトロポレーションシステム(BioRad,165-2081)を使用し、単一の4mmキュベットを使用してフソソームをエレクトロポレーションする。フソソームおよび核酸を、400V、125μF、および∞オームでエレクトロポレーションし、キュベットを速やかに氷に移す。エレクトロポレーション後、フソソームをPBSで洗浄し、PBSに再懸濁し、氷上に保持する。
この実施例では、タンパク質カーゴを用いたフソソームのエレクトロポレーションについて説明する。
この実施例では、化学処理による核酸カーゴのフソソームへのロードについて説明する。
Kaneda,Y.,et al.,New vector innovation for drug delivery:development of fusigenic non-viral particles.Curr.Drug Targets,2003も参照されたい。
この実施例では、化学処理によるタンパク質カーゴのフソソームへのロードについて説明する。
この実施例では、核酸カーゴのフソソームへのトランスフェクションについて説明する。フソソームは、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか1つによって調製される。
この実施例では、タンパク質カーゴのフソソームへのトランスフェクションについて説明する。
この実施例では、フソソームの組成について説明する。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、中心に内腔を有する脂質二重層構造を含むであろう。
この実施例では、フソソームにおけるフソゲンの発現を定量化する。
この実施例では、フソソームあたりのフソゲンの絶対数の定量化について説明する。
この実施例では、フソソームの平均径の測定について説明する。
この実施例では、フソソームの径分布の測定について説明する。
この実施例では、フソソームの平均量の測定について説明する。理論に拘束されることを望まないが、フソソームのサイズ(例えば、直径、量、表面積等)を変えることは、それらを別個のカーゴ積載、治療計画、または適用に関して用途の広いものにすることができる。
フソソーム密度を、Thery et al.,Curr Protoc Cell Biol.2006 Apr;Chapter 3:Unit 3.22に記載されているように連続ショ糖勾配遠心分離アッセイを介して測定する。フソソームは、前の実施例に記載されているように得られる。
この実施例では、フソソーム中のオルガネラの検出について説明する。
この実施例では、フソソーム中の核含有量の測定について説明する。フソソームに核が含まれていないことを検証するために、フソソームを1μgmL-1 Hoechst 33342および1μM CalceinAM(C3100MP、Thermo Fisher、Waltham,MA)で染色し、染色したフソソームを、Attune NXTフローサイトメーター(Thermo Fisher、Waltham,MA)で実行し、以下の表に従って、各色素の蛍光強度を決定する。幾つかの実施形態では、細胞質ゾルの存在(CalceinAM)および核の不在(Hoechst 33342)の検証は、染色されたフソソームの平均蛍光強度を、染色されていないフソソームおよび染色された細胞と比較することによって行われる。
この実施例では、除核されたフソソームの核エンベロープ含有量の測定について説明する。核エンベロープは、細胞の細胞質からDNAを分離する。
この実施例では、除核されたフソソームのクロマチンの測定について説明する。
この実施例では、有核の対応物と比較した、フソソーム中のDNA量の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、有核の対応物よりも少ないDNAを有するであろう。核酸レベルは、全DNAまたは特定のハウスキーピング遺伝子のレベルを測定することによって決定される。幾つかの実施形態では、DNA含有量が減少している、またはDNAを実質的に欠いているフソソームは、遺伝子を複製、分化、または転写することができず、被験体に投与されたときにそれらの用量および機能が変化しないことを保証する。
SYBRグリーンマスターミックス:10μL
0.45μM順方向プライマー:1μL
0.45μM逆方向プライマー:1μL
DNAテンプレート:10ng
PCR-グレード水:可変
変性、94℃ 2分
次のシーケンスの40サイクル:
変性、94℃ 15秒
アニーリング、拡張、60℃ 1分
この実施例では、フソソーム中のマイクロRNA(miRNA)の定量について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、miRNAを含む。
この実施例では、発現が変化した内因性RNA、またはフソソームで発現する合成RNAのレベルの定量化について説明する。
この実施例では、フソソームの脂質組成の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームの脂質組成は、それらが由来する細胞に類似している。脂質組成は、フソソームおよび細胞の重要な生物物理学的パラメーター、例えば、サイズ、静電相互作用、およびコロイド挙動に影響を与える。
この実施例では、フソソームのタンパク質組成の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームのタンパク質組成は、それらが由来する細胞に類似している。
この実施例では、フソソームの内因性または合成タンパク質カーゴの定量について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、内因性または合成タンパク質カーゴを含む。
実施例44:フソソーム中のエクソソームタンパク質のマーカーを測定する
このアッセイでは、フソソーム中のグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のレベル、および親細胞と比較したフソソーム中のGAPDHの相対レベルの定量化について説明する。
このアッセイでは、フソソーム中のカルネキシン(CNX)のレベル、および親細胞と比較したフソソーム中のCNXの相対レベルの定量化について説明する。
この実施例では、フソソーム中のタンパク質質量の可溶性:不溶性比の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソーム中のタンパク質質量の可溶性:不溶性の比は、有核細胞と同様となるであろう。
この実施例では、親細胞と比較したフソソーム中のリポ多糖(LPS)のレベルの定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞と比較してより低いレベルのLPSを有するであろう。
この実施例では、フソソーム中の脂質質量とタンパク質質量の比率の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、有核細胞と同様の脂質質量とタンパク質質量との比率を有するであろう。
この実施例では、フソソーム中のタンパク質質量とDNAの比率の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、タンパク質質量と細胞よりもはるかに大きいDNA質量との比率を有するであろう。
この実施例では、親細胞と比較したフソソームの脂質とDNAとの比率の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞と比較してより高い脂質とDNAとの比率を有するであろう。
このアッセイでは、フソソーム上の表面マーカーの同定について説明する。
このアッセイは、試料調製物の構成の分析を説明し、ウイルスカプシド源に由来するタンパク質の割合を評価する。
この実施例では、非標的細胞と比較した標的細胞とのフソソーム融合の定量化について説明する。
幾つかの実施形態では、標的細胞とのフソソームの平均融合速度は、標的細胞融合の場合、1時間あたり0.01~4.0 RFP/GFP細胞の範囲、またはフソソームを含む非標的レシピエント細胞よりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上多くなるであろう。幾つかの実施形態では、フソソームが適用されていない群は、1時間あたり0.01 RFP/GFP細胞未満のバックグラウンド率を示すであろう。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞への活性膜タンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、インビボでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、インビボでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞への活性膜タンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、インビトロマイクロ流体システム(J.S Joen et al.2013,journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0056910)で試験した内皮単層を通過するフソソーム血管外漏出の定量化について説明する。
この実施例では、フソソーム走化性の定量化について説明する。細胞は、走化性を介して化学勾配に向かって、または化学勾配から離れて移動することができる。幾つかの実施形態では、走化性は、フソソームが傷害部位にホーミングすること、または病原体を追跡することを可能にする。前の実施例に記載された方法のうちのいずれか1つによって産生された精製フソソーム組成物を、その走化性について以下のとおりアッセイする。
この実施例では、傷害の部位へのフソソームのホーミングについて説明する。細胞は、遠位部位から移動することができる、および/または特定の部位に蓄積し得る、例えば、ある部位にホーミングし得る。通常、その部位は傷害部位である。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、傷害部位に移動するか、またはそこに蓄積するようにホーミングするであろう。
この実施例は、フソソームの食作用を実証する。幾つかの実施形態では、フソソームは、食作用活性を有し、例えば、食作用が可能である。細胞は食作用に関与し、粒子を貪食し、バクテリアまたは死細胞等の外来侵入者の隔離および破壊を可能にする。
この実施例では、血液脳関門を通過するフソソームの定量について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、中枢神経系への送達のために、血液脳関門を通過する、例えば、出入りする。
この実施例では、フソソームによる分泌の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、分泌、例えば、タンパク質分泌が可能である。細胞は分泌物を介して物質を処分または排出することができる。幾つかの実施形態では、フソソームは、分泌を介してそれらの環境において化学的に相互作用し、通信する。
この実施例では、フソソームにおけるシグナル伝達の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、シグナル伝達が可能である。細胞は、シグナル伝達として知られるプロセスで、リン酸化等のシグナル伝達カスケードを介して細胞外環境から分子シグナルを送受信できる。部分的または完全な核不活化を有する哺乳動物細胞からのフソソームを含む、前の実施例に記載の方法のうちのいずれか1つによって産生される精製フソソーム組成物は、インスリンによって誘導されるシグナル伝達が可能である。インスリンによって誘導されるシグナル伝達は、AKTリン酸化レベル、インスリン受容体シグナル伝達カスケードの重要な経路、およびインスリンに応答したグルコース取込みを測定することによって評価される。
この実施例では、生細胞でのグルコース取込みをモニターし、したがって脂質二重層を通過する能動輸送を測定するために使用できる蛍光グルコース類似体である、2-NBDG(2-(N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ)-2-デオキシグルコース)のレベルの定量化について説明する。幾つかの実施形態では、このアッセイまたは同等物を使用して、グルコース取込みおよびフソソームの脂質二重層を横切る能動輸送のレベルを測定することができる。
この実施例では、水などの水溶液とのフソソーム内腔の混和性を評価する。
この実施例は、フソソームにおける代謝活性の代用としてのエステラーゼ活性の定量化を説明している。フソソームの細胞質ゾルエステラーゼ活性は、カルセイン-AM染色の定量的評価によって決定される(Bratosin et al.,Cytometry 66(1):78-84,2005)。
アセチルコリンエステラーゼ活性を、以前に記載された手順(Ellman,et al.,Biochem.Pharmacol.7,88,1961)および製造元の推奨事項に従うキット(MAK119、SIGMA)を使用して測定する。
この実施例では、フソソームにおけるクエン酸合成酵素活性の測定の定量化について説明する。
この実施例では、フソソームの呼吸レベルの測定の定量化について説明する。細胞内の呼吸レベルは、代謝を促進する酸素消費量の尺度になり得る。Seahorse細胞外フラックスアナライザー(Agilent)により、酸素消費率のフソソーム呼吸を測定する(Zhang 2012)。
この実施例は、フソソームの表面に結合するアネキシンVのレベルの定量化について説明する。
この実施例では、フソソームにおけるジャクスタクリンシグナル伝達の定量化について説明する。
この実施例では、フソソームにおけるパラクリンシグナル伝達の定量化について説明する。
この実施例では、フソソームにおけるアクチンなどの細胞骨格成分の定量について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、アクチンなどの細胞骨格成分を含み、アクチン重合が可能である。
この実施例では、フソソームのミトコンドリア膜電位の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、ミトコンドリア膜を含むフソソームは、ミトコンドリア膜電位を維持するであろう。
この実施例では、フソソーム半減期の測定について説明する。
この実施例では、循環へのフソソーム送達と臓器での保持の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは循環に送達され、臓器部位に捕捉および保持されない。
この実施例では、フソソーム組成物が免疫抑制薬と同時投与された場合の免疫原性の定量化について説明する。
この実施例では、フローサイトメトリーを使用して測定された既存の抗フソソーム抗体価の定量化について説明する。
この実施例では、修飾フソソームの複数回投与後の修飾フソソームの体液性応答の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、例えば、本明細書に記載される方法によって修飾された修飾フソソームは、修飾フソソームの複数回(例えば1回超、例えば2回以上)の投与後に、低下した(例えば、非修飾フソソームの投与と比較して低下した)体液性応答を有するであろう。
この実施例では、修飾された細胞源に由来するフソソームにおける免疫原性の定量化について記載する。幾つかの実施形態では、修飾された細胞源に由来するフソソームは、修飾されていない細胞源に由来するフソソームと比較して、免疫原性が低下している。
この実施例では、免疫原性である分子の発現を低下させるように修飾された細胞源に由来するフソソーム組成物の生成の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、免疫原性である分子の発現を低下させるように修飾されている細胞源に由来することができる。
この実施例では、修飾フソソームによる食作用の回避の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、修飾されたフソソームは、マクロファージによる食作用を回避するであろう。
この実施例では、PBMCによる細胞溶解のために細胞毒性が減少するように修飾された細胞に由来するフソソームの生成について説明した。
この実施例では、NK細胞による細胞毒性媒介細胞溶解を減少させるように修飾されている細胞源に由来するフソソーム組成物の生成について説明する。幾つかの実施形態では、NK細胞によるソース細胞またはフソソームの細胞毒性媒介性細胞溶解は、フソソームの免疫原性の尺度である。
この実施例では、CD8+T細胞による細胞毒性媒介細胞溶解を減少させるように修飾されている細胞源に由来するフソソーム組成物の生成について説明する。幾つかの実施形態では、CD8+T細胞によるソース細胞またはフソソームの細胞毒性媒介性細胞溶解は、フソソームの免疫原性の尺度である。
この実施例では、混合リンパ球反応(MLR)によって評価されるように、T細胞の活性化および増殖が低下する修飾フソソームの生成について説明する。
この実施例では、特定の身体部位を標的とするフソソームの能力を評価する。幾つかの実施形態では、フソソームは、特定の身体部位を標的にすることができる。標的化は、治療薬の活性を1つ以上の関連する治療部位に制限する方法である。
この実施例では、被験体における外因性作用物質を含むフソソームの送達の定量化について説明する。フソソームは、ガウシアルシフェラーゼを発現する細胞から、またはルシフェラーゼを発現しない細胞(陰性対照)から、前の実施例に記載された方法のうちのいずれか1つによって調製される。
この実施例では、生細胞でのグルコース取込みをモニターし、脂質二重層を通過する能動輸送を測定するために使用できる蛍光グルコース類似体である、2-NBDG(2-(N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ)-2-デオキシグルコース)のレベルの定量化について説明する。幾つかの実施形態では、このアッセイまたは同等物を使用して、グルコース取込みおよびフソソームの脂質二重層を横切る能動輸送のレベルを測定することができる。
この実施例では、非エンドサイトーシス経路を介したレシピエント細胞へのCreのフソソーム送達の定量化について説明する。
この実施例では、エンドサイトーシス経路を介したレシピエント細胞へのCreのフソソーム送達について説明する。
この実施例では、ダイナミン媒介経路を介したレシピエント細胞へのCreのフソソーム送達について説明する。微小胞を含むフソソームを、前の実施例で説明したように産生することができる。フソソームを受けるレシピエント細胞の群をダイナミンの阻害剤であるダイナソア(120μM)で処理することを除いて、フソソームを、前の実施例に従って、ダイナミン媒介経路を介したCreの送達についてアッセイする。ダイナミン媒介経路を介して送達されるフソソームCreの値を計算するために、ダイナソアの存在下でのフソソームCre送達のレベル(FusL+DS)と並んで、ダイナソアの不在下でのフソソームCre送達のレベル(FusL-DS)を決定する。送達されたフソソームCreの正規化された値を、前の実施例で説明したように計算することができる。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞へのフソソームミトコンドリアカーゴの送達をもたらし得る。
この実施例では、フソソームを使用したDNAの、インビトロでの細胞への送達について説明する。この実施例では、代理治療カーゴである外因性遺伝子GFPをコードするプラスミドを使用してDNAを送達するフソソームの能力を定量化する。
この実施例では、フソソームを介したインビボでの細胞へのDNAの送達について説明する。インビボでの細胞へのDNAの送達は、レシピエント細胞内のタンパク質の発現をもたらす。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、特定のmRNAのレシピエント細胞への送達をもたらす。
この実施例では、フソソームを介したインビトロでの細胞への短干渉RNA(siRNA)の送達について説明する。インビトロでの細胞へのsiRNAの送達は、レシピエント細胞内のタンパク質の発現の抑制をもたらす。これを使用して、発現が細胞に有害であるタンパク質の活性を阻害することができ、したがって細胞が正常に振る舞うことを可能にする。
この実施例では、フソソームを介したインビボでの細胞へのメッセンジャーRNA(mRNA)の送達について説明する。幾つかの実施形態では、インビボでの細胞へのmRNAの送達は、レシピエント細胞内のタンパク質の発現をもたらす。幾つかの実施形態では、この送達方法を使用して、遺伝子突然変異のために存在しないタンパク質を補充することができ、細胞が正常に振る舞うことを可能にし、または機能、例えば治療機能を行うために細胞の活性を再指向する。
この実施例は、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について実証する。この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞へのCreタンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、フソソームによる眼への治療薬の送達について説明する。
この実施例では、ゲノムCRISPR-Cas9編集機構をインビトロで細胞に送達するためのフソソームについて説明する。幾つかの実施形態では、フソソームを介したインビトロでの細胞へのゲノムCRISPR-Cas9編集機構の送達は、レシピエント細胞における特定のタンパク質の機能の喪失をもたらす。この実施例で言及されているゲノム編集機構は、GFPに特異的なガイドRNA(gRNA)と複合体を形成したS.pyogenes Cas9タンパク質である。
この実施例では、フソソームによる奇形腫形成がないことを説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、被験体に投与されたときに奇形腫の形成をもたらさないであろう。
この実施例は、フソソームがインビボで被験体にタンパク質を送達できることを示す。これは、核編集タンパク質Creの送達によって例示される。細胞内に入ると、Creは核に転位し、そこで2つのLoxP部位間でDNAを再結合して切除する。Creを介した組換えは、2つのLoxP部位間のDNAが終止コドンであり、赤色蛍光タンパク質tdTomatoなどの遠位蛍光タンパク質の上流にある場合に顕微鏡で測定することができる。
この実施例では、超音波処理による核酸ペイロードのフソソームへのロードについて説明する。超音波処理法は、例えば、Lamichhane,TN,et al.,Oncogene Knockdown via Active Loading of Small RNAs into Extracellular Vesicles by Sonication.Cell Mol Bioeng,(2016)に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
この実施例では、超音波処理によるタンパク質ペイロードのフソソームへのロードについて説明する。超音波処理法は、例えば、Lamichhane,TN,et al.,Oncogene Knockdown via Active Loading of Small RNAs into Extracellular Vesicles by Sonication.Cell Mol Bioeng,(2016)に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
この実施例では、疎水性担体を介した核酸ペイロードのフソソームへのロードについて説明する。疎水性ロードの例示的な方法は、例えば、Didiot et al., Exosome-mediated Delivery of Hydrophobically Modified siRNA for Huntingtin mRNA Silencing,Molecular Therapy 24(10):1836-1847,(2016)に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
この実施例では、フソソームの処理について説明した。前の実施例に記載された方法のうちのいずれかを介して産生されたフソソームは、更に処理され得る。
この実施例では、ソース細胞と比較したフソソーム中のRNAの量を定量化する方法を説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、ソース細胞と同様のRNAレベルを有するであろう。このアッセイでは、RNAレベルは全RNAを測定することによって決定される。
a.DNAペイロード
この実施例では、フソソームを使用したDNAの、インビトロでのCD3+T細胞への送達について説明する。この実施例では、治療用カーゴであるCD19に対して指向されたキメラ抗原受容体である外因性遺伝子をコードするプラスミドを使用して、フソソームがDNAを送達する能力を定量化する。
幾つかの実施形態では、インビトロでのフソソームを用いたDNAカーゴの送達は、陰性対照と比較して、CARプラスミドを有するフソソームにおいてより高い。
この実施例では、フソソームを使用したmRNAの、インビトロでのCD3+T細胞への送達について説明する。この実施例では、フソソームが、治療用カーゴであるCD19に対して指向されたキメラ抗原受容体である、外因性遺伝子をコードするmRNAを送達する能力を定量化する。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、インビトロでのCD3+T細胞とのフソソーム融合は、キメラ抗原受容体タンパク質の、CD3+T細胞の膜への送達をもたらす。
この実施例では、インビトロでCD3+T細胞に優先的なフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、そのペイロードを、代替の細胞型よりも高い効率でCD3+T細胞に送達する。
この実施例では、インビボでCD3+T細胞に優先的なフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、フソソームは、そのペイロードを、任意の代替の細胞型よりも高い効率でCD3+T細胞に送達する。
この実施例は、前の実施例における方法のうちのいずれか1つに記載されるように、フソソームと接触した後にCARを発現するCD3+T細胞が、インビトロで、標的抗原、例えば、CD19と会合した細胞を溶解できることを示す。
この実施例は、インビボでフソソームと接触した後にCARを発現するように操作されたCD3+T細胞が、インビトロで標的抗原と会合した細胞を溶解できることを示す。
この実施例は、インビボでフソソームと接触した後にCARを発現するように操作されたCD3+T細胞がインビボで腫瘍を治療できることを示す。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、フソソーム融合は、レシピエント細胞への膜貫通タンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。幾つかの実施形態では、レシピエント細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞の原形質膜への異種膜タンパク質ペイロードの送達をもたらす。
幾つかの実施形態では、原形質膜局在化GFPを含むフソソームで処理された選別細胞は、細胞質ゾルGFPを含むフソソームで処理された選別細胞よりも高いGFPの原形質膜局在化%を有する。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞核へのタンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞核へのタンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、核局在化配列を含むナノボディの送達をもたらし、これは、その後、内因性細胞質ゾルタンパク質をレシピエント細胞内の核に駆動する。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、細胞の核へのDNAの送達をもたらす。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞核への転写因子の送達をもたらす。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞核へのエピジェネティック調節因子の送達をもたらす。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞ミトコンドリアへのタンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞ミトコンドリアへのタンパク質の送達をもたらす。
多くの場合、標的細胞への複雑な生物学的カーゴの侵入は、エンドサイトーシスによって達成される。エンドサイトーシスでは、カーゴがエンドソームに入る必要があり、エンドソームは成熟して酸性化したリソソームになる。不利なことに、エンドサイトーシスを介して細胞に入るカーゴは、エンドソームまたはリソソームに捕捉され、細胞質または標的細胞の他の所望のコンパートメントに到達できなくなる場合がある。カーゴはまた、リソソームの酸性条件によって損傷を受ける可能性がある。一部のウイルスは、標的細胞への非エンドサイトーシス侵入が可能であるが、このプロセスは完全には理解されていない。この実施例は、ウイルスのフソゲンを残りのウイルスから単離し、他のウイルスタンパク質を欠くフソソームに非エンドサイトーシスの侵入を与えることができることを示している。
麻疹ウイルス(MvH)の操作されたヘマグルチニン糖タンパク質および融合タンパク質(F)を細胞表面に発現し、Creリコンビナーゼタンパク質を含むHEK-293T細胞に由来するフソソームを、本明細書に記載されるように生成した。MvHは、その天然の受容体結合が除去され、細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体(scFv)を介して標的細胞の特異性が提供されるように操作されており、この場合、scFvは、T細胞受容体に対する供受容体、CD8を標的とするように設計されている。表面にフソゲンVSV-Gを発現し、Creリコンビナーゼタンパク質を含むHEK-293T細胞に由来する対照フソソームを使用した。標的細胞は、CMVプロモーター下で「Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP」カセットを発現するように操作されると共に、共受容体CD8aおよびCD8bを過剰発現するように操作されたHEK-293T細胞であった。非標的細胞は、「Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP」カセットを発現しているがCD8a/bの過剰発現がない同じHEK-293T細胞であった。標的または非標的レシピエント細胞を、30,000細胞/ウェルで黒色の透明底96ウェルプレートにプレーティングし、10%ウシ胎仔血清を含むDMEM培地中、37℃および5%CO2で培養した。レシピエント細胞をプレーティングしてから4~6時間後、Creリコンビナーゼタンパク質を発現するフソソームおよびMvH+Fを、DMEM培地中の標的または非標的レシピエント細胞に適用した。レシピエント細胞を10μgのフソソームで処理し、37℃および5%CO2で24時間インキュベートした。
Claims (60)
- フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)前記脂質二重層に囲まれた内腔と、
(c)前記ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、前記フソゲンが、前記脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)標的細胞の核に送達するための核ペイロード剤と、を含む、フソソーム。 - 前記核ペイロード剤が、核局在化シグナル(NLS)を有するタンパク質を含むか、またはコードし、前記NLSが、前記タンパク質の天然に存在する対応物中のNLSと同じである、請求項1に記載のフソソーム。
- 前記核タンパク質ペイロード剤が、NLSを有するタンパク質を含むか、またはコードし、前記NLSが、前記タンパク質の天然に存在する対応物によって含まれない、請求項1に記載のフソソーム。
- 前記核タンパク質ペイロード剤が、配列番号128~507および605~626のうちのいずれか1つに記載の核局在化シグナルを含む、請求項1~3のいずれかに記載のフソソーム。
- i)標的細胞が複数の前記フソソームと接触すると、前記核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、前記標的細胞の核において、前記標的細胞の細胞質中の前記核タンパク質ペイロード剤のレベルよりも少なくとも10%、20%、50%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、または100倍高いレベルで存在するようになり、
ii)標的細胞の集団が複数の前記フソソームと接触すると、前記核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、前記標的細胞の集団中の少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の細胞の核において豊富化され、
iii)標的細胞の集団が複数の前記フソソームと接触すると、前記核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、前記標的細胞の集団のレシピエント細胞集団である亜集団に存在するようになり、前記核タンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるタンパク質が、前記レシピエント細胞集団中の少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の細胞の核において豊富化され、かつ/あるいは
iv)前記核タンパク質ペイロード剤、または核酸核タンパク質ペイロード剤によってコードされるタンパク質の少なくとも1、2、5、10、20、50、100、200、500、もしくは1,000コピーが、標的細胞中の核内に存在する、請求項1~4のいずれかに記載のフソソーム。 - 前記核ペイロード剤が、転写活性化因子、転写抑制因子、エピジェネティック修飾因子、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、DNAメチルトランスフェラーゼ、DNAニッカーゼ、部位特異的DNA編集酵素、任意にデアミナーゼ、DNAトランスポサーゼ、DNAインテグラーゼ、RNAエディター、RNAスプライシング因子、またはPIWIタンパク質のうちの1つ以上を含むか、またはコードする、請求項1~5のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記核ペイロード剤が、転写因子、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、エピジェネティック因子、転写後RNA修飾因子、非コードRNAもしくはリボ核酸タンパク質、または構造タンパク質を含むか、またはコードする、請求項1~6のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記核ペイロード剤が、抗体分子、例えば、Fab、scFv、scFab、sdAb、デュオボディ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、ザイボディ、ラクダ抗体、BiTE、クアドローマ、またはbsDbを含むか、またはコードする、請求項1~5のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記核タンパク質ペイロード剤が、エフェクタードメインおよび局在化ドメインを含む融合タンパク質を含むか、またはコードする、請求項1~6のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記局在化ドメインが、TALドメイン、ジンクフィンガードメイン、Cas9ドメイン、またはメガヌクレアーゼドメインを含む、請求項9に記載のフソソーム。
- 前記エフェクタードメインが、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、塩基エディター(デアミナーゼ)、転写因子、またはエピジェネティック修飾因子を含む、請求項9または請求項10に記載のフソソーム。
- 前記核ペイロード剤が、遺伝子編集タンパク質または核酸、任意にCas9またはガイドRNAを含むか、またはコードする、請求項1~6のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記核ペイロード剤が、機能性RNAを含む、請求項1~6のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記核ペイロード剤が、(i)核酸、および(ii)前記核酸の核移入を促進するタンパク質を含む、請求項1~6のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記核酸が、結合部位を含み、核移入を促進する前記タンパク質が、前記結合部位に結合する、請求項14に記載のフソソーム。
- 前記結合部位が、TetR結合部位を含み、前記タンパク質が、TetRを含む、請求項15に記載のフソソーム。
- 前記核ペイロード剤が、(i)DNA結合ドメインであって、任意に、TALドメイン、ZFドメイン、またはCas9ドメインである、DNA結合ドメイン、および(ii)転写活性化因子ドメインまたは転写抑制因子ドメインを含む融合タンパク質である合成転写因子を含む、請求項1~6のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記核ペイロード剤が、(i)DNA結合ドメインおよび(ii)エピジェネティック修飾因子ドメインを含む融合タンパク質である合成エピジェネティック修飾因子を含む、請求項1~6のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記核タンパク質ペイロード剤が、フィブリラリン;KRI1ホモログ;核小体タンパク質11;上流結合転写因子;EBNA1結合タンパク質2;コイリン;前骨髄球性白血病;PRMT1のクロマチン標的;TERF1相互作用核因子2;ABL癌原遺伝子1;非受容体チロシンキナーゼ;ラミンB1;セントロメアタンパク質B;H1ヒストンファミリーメンバー0;動原体足場1;RB結合タンパク質7;クロマチンリモデリング因子;シグナル伝達物質および転写の活性化因子3;フォークヘッドボックスP3;肝細胞核因子4α;runt関連転写因子1;リンパ系エンハンサー結合因子1;フォークヘッドボックスP1;cut様ホメオボックス2;POUクラス2ホメオボックス1;SIXホメオボックス3;RELA癌原遺伝子、NF-kBサブユニット;SWI/SNF関連、マトリックス関連、アクチン依存性のクロマチン調節因子、サブファミリーb、メンバー1;クロモドメインヘリカーゼDNA結合タンパク質7;クロマチンアクセシビリティ複合体サブユニット1;APOBEC1補完因子;ブロモドメイン含有4;Glu/Aspリッチカルボキシ末端ドメイン1を有するCbp/p300相互作用トランスアクチβー;リジンアセチルトランスフェラーゼ2A;ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1;TATA-ボックス結合タンパク質関連因子5様;リジンアセチルトランスフェラーゼ5;サーチュイン1;サーチュイン2;ヒストンデアセチラーゼ11;ヒストンデアセチラーゼ3;ヒストンデアセチラーゼ6;ASH1様ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ;DOT1様ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ;核内受容体結合SETドメインタンパク質1;SET核癌原遺伝子;リジンメチルトランスフェラーゼ2A;リジンデメチラーゼ2A;リジンデメチラーゼ1A;リジンデメチラーゼ3A;リジンデメチラーゼ4B;リジンデメチラーゼ5C;DNAメチルトランスフェラーゼ1;DNAメチルトランスフェラーゼ3α;アデノシンデアミナーゼ2;アデノシンデアミナーゼ、RNA特異的;アポリポタンパク質B mRNA編集酵素触媒サブユニット1;スプライセオソーム関連因子3、U4/U6リサイクリングタンパク質;サイクリン依存性キナーゼ19;サイクリンL1;pre-mRNAプロセッシング因子31;スプライシング因子3aサブユニット3;DNA損傷チェックポイント1のメディエーター;ATMセリン/スレオニンキナーゼ;ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1;DNAトポイソメラーゼI;またはDNAリガーゼ4から選択されるタンパク質であるか、またはそれを含む、請求項1~6のいずれかに記載のフソソーム。
- フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)前記脂質二重層に囲まれた内腔であって、前記内腔がオルガネラを含まない、内腔と、
(c)前記ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、前記フソゲンが、前記脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)標的細胞の細胞質オルガネラに送達するためのオルガネラペイロード剤と、を含み、標的細胞が複数の前記フソソームと接触すると、前記オルガネラタンパク質ペイロード剤またはそこにコードされるポリペプチドが、前記標的細胞のシオゾル(cyosol)または原形質膜に対して、前記標的細胞のゴルジ装置、小胞体、液胞、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロメノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、またはストレス顆粒のうちの1つ以上において豊富化される、フソソーム。 - 前記オルガネラペイロード剤が、前記タンパク質の天然に存在する対応物中のシグナル配列と同じシグナル配列を有するタンパク質を含むか、またはコードする、請求項20に記載のフソソーム。
- 前記オルガネラペイロード剤が、前記タンパク質の天然に存在する対応物によって含まれないシグナル配列を有するタンパク質を含むか、またはコードする、請求項20に記載のフソソーム。
- フソソームであって、
(a)ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
(b)前記脂質二重層に囲まれた内腔と、
(c)前記ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、前記フソゲンが、前記脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
(d)標的細胞の細胞質オルガネラにおいてオルガネラペイロード剤を豊富化するのに十分な前記オルガネラペイロード剤に対する異種シグナル配列を含むか、またはコード化する、オルガネラペイロード剤と、を含む、フソソーム。 - 前記細胞質オルガネラが、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、またはストレス顆粒から選択される、請求項23に記載のフソソーム。
- 前記異種シグナル配列が、配列番号39~127および605~626のいずれか1つに記載されている、請求項20~24のいずれかに記載のフソソーム。
- 標的細胞が複数の前記フソソームと接触すると、前記オルガネラペイロード剤が、前記標的細胞のシオゾル(cyosol)または原形質膜に対して、前記標的細胞のゴルジ装置、小胞体、液胞、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、またはストレス顆粒のうちの1つ以上において豊富化される、請求項20~25のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記細胞質オルガネラが、分泌経路オルガネラであり、前記異種シグナル配列が、配列番号108~120のうちのいずれか1つに記載されている、請求項20~26のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記細胞質オルガネラが、小胞体であり、前記異種シグナル配列が、配列番号72~93および121~127のうちのいずれか1つに記載されている、請求項20~26のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記細胞質オルガネラが、ゴルジ装置であり、前記異種シグナル配列が、配列番号94~107および609~610のうちのいずれか1つに記載されている、請求項20~26のいずれかに記載のフソソーム。
- 標的細胞が複数の前記フソソームと接触すると、前記コードされたポリペプチドが、前記標的細胞の細胞質ゾルまたは原形質膜に対して、前記リソソームおよび/またはエンドソームにおいて豊富化される、請求項23~25のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記細胞質オルガネラが、リソソームであり、前記異種シグナル配列が、配列番号39~71および605~608のうちのいずれか1つに記載されている、請求項23~25、および30のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記オルガネラペイロード剤が、前記標的細胞のミトコンドリアにおいて、前記細胞質または前記標的細胞原形質膜中の前記オルガネラペイロード剤のレベルよりも少なくとも10%、20%、50%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、または100倍高いレベルで豊富化される、請求項23~25のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記オルガネラペイロード剤が、ミトコンドリア膜タンパク質、ミトコンドリア外膜タンパク質、ミトコンドリア内膜タンパク質、ミトコンドリア内境界膜タンパク質、ミトコンドリア結晶膜タンパク質、ミトコンドリアDNAタンパク質、ミトコンドリア膜間腔タンパク質、ミトコンドリアマトリックスタンパク質、ミトコンドリアマトリックス顆粒タンパク質、ミトコンドリアクリステタンパク質、ミトコンドリアリボソームタンパク質、ミトコンドリア結晶内タンパク質、ミトコンドリア末梢空間タンパク質、ペルオキシソーム膜タンパク質、ペルオキシソーム晶質コアタンパク質、ペルオキシソームマトリックスタンパク質、ペルオキシンから選択されるポリペプチドを含むか、またはコードする、請求項20~32のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記オルガネラペイロード剤が、
viii)代謝タンパク質、
ix)プロテアーゼ、
x)シャペロン、
xi)タンパク質輸送タンパク質、
xii)ミトコンドリアリボソームタンパク質、
xiii)ミトコンドリア転写タンパク質、または
xiv)ミトコンドリア複製タンパク質から選択されるポリペプチドを含むか、またはコードする、請求項20~33のいずれかに記載のフソソーム。 - 前記オルガネラペイロード剤が、B細胞受容体関連タンパク質31;カルネキシン;KDEL小胞体タンパク質保持受容体3;レチクロン4;Sec61トランスロコンα1サブユニット;筋形質/小胞体カルシウムATPase 1;Derlin-2;ストレス関連小胞体タンパク質2;Reticulocalbin-2;アトラスチン-3;シトクロムc、体細胞;ミトコンドリア内膜のトランスロカーゼ44;ミトコンドリア外膜のトランスロカーゼ40;電位依存性アニオンチャネル2;補酵素Q8B;アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ、ミトコンドリア;クエン酸合成酵素、ミトコンドリア;シトクロムcオキシダーゼサブユニット7A関連タンパク質、ミトコンドリア;フマル酸ヒドラターゼ、ミトコンドリア;NADPH:アドレノドキシンオキシドレダクターゼ、ミトコンドリア;骨髄性白血病細胞分化誘導タンパク質Mcl-1;NADHデヒドロゲナーゼ[ユビキノン]1αサブコンプレックスサブユニット13;転写因子A、ミトコンドリア;脂肪アシル-CoAレダクターゼ1;アセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ1;ATP結合カセットサブファミリーDメンバー3;ヒドロキシステロイド17-βデヒドロゲナーゼ4;ペルオキシソーム生合成因子14;非特異的脂質転移タンパク質;ペルオキシソーム生合成因子19;エノイル-CoAδイソメラーゼ2;アシル-CoA結合ドメイン含有タンパク質5;golgin A1;ゴルジ膜内在性タンパク質4;ゴルジ関連PDZおよびコイルドコイルモチーフ含有;トランス-ゴルジネットワーク小胞タンパク質23ホモログC;7を含有するジンクフィンガーDHHC型;コートマーサブユニットδ;BSDドメイン含有タンパク質1;血小板糖タンパク質4;保存されたオリゴマーゴルジ複合体サブユニット7;コートマーサブユニットε;タンパク質FAM3C;α-(1,6)-フコシルトランスフェラーゼ;一般的な小胞輸送因子p115;膜貫通タンパク質165;液胞タンパク質選別関連タンパク質54;タンパク質YIPF3;Fas関連因子ファミリーメンバー2;リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ2;NAD(P)依存性ステロイドデヒドロゲナーゼ様;ペリリピン3;2を含有するパタチン様ホスホリパーゼドメイン;カドヘリン4;カテニンβ1;上皮成長因子受容体;エズリン;シンタキシン4;ATP結合カセットサブファミリーGメンバー2;Caskin-2;ジャンクションプラコグロビン;神経細胞接着分子1;パネキシン-1;溶質担体ファミリー2、促進されたグルコーストランスポーターメンバー1;ストマチン様タンパク質3;FUS RNA結合タンパク質;TAR DNA結合タンパク質;TATA-ボックス結合タンパク質関連因子15;EWS RNA結合タンパク質1;DEAD-ボックスヘリカーゼ4;TAR DNA結合タンパク質43;異種核リボヌクレオプロテインA1;異種核リボ核タンパク質A2/B1;Nucleolysin TIA-1アイソフォームp40;中心体タンパク質164;2を含有するダブルコルチンドメイン;ケラチン8;ミオシン重鎖10;アクチンベット;コイルドコイルドメイン含有タンパク質14;ケラチン、I型細胞骨格18;ペリセントリン;チューブリンα-1A鎖;またはアクチン、α骨格筋から選択されるタンパク質を含む、請求項20~34のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記オルガネラペイロード剤が、抗体分子、例えば、Fab、scFV、scFab、sdAb、デュオボディ、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、ザイボディ、ラクダ抗体、BiTE、クアドローマ、またはbsDbを含むか、またはコードする、請求項20~34のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記オルガネラペイロード剤が、機能性RNAを含む、請求項20~34のいずれかに記載のフソソーム。
- 標的細胞の集団が複数の前記フソソームと接触すると、前記オルガネラペイロード剤が、前記標的細胞の集団における少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の細胞の前記細胞質オルガネラにおいて豊富化される、請求項20~37のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記ソース細胞が、初代細胞、培養細胞、不死化細胞、または細胞株であり、任意に前記細胞株が、アミエロバスト(amyelobast)細胞株、任意にC2C12である、請求項1~38のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記ソース細胞が、内皮細胞、線維芽球、血液細胞(例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球)、幹細胞(例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞)、胚性幹細胞(例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児の皮膚、青年期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織からの幹細胞)、筋芽細胞、実質細胞(例えば、肝細胞)、肺胞細胞、ニューロン(例えば、網膜神経細胞)、前駆細胞(例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球)、前駆細胞(例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞)、または不死化細胞(例えば、HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR90、IMR91、PER.C6、HT-1080、もしくはBJ細胞)である、請求項1~39のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記ソース細胞が、同種異系である、例えば、前記標的細胞と同じ種の異なる生物から得られる、請求項1~40のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記ソース細胞が、自己由来である、例えば、前記標的細胞と同じ生物から得られる、請求項1~40のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記ソース細胞が、白血球または幹細胞から選択される、請求項1~42のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記ソース細胞が、好中球、リンパ球(例えば、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞)、マクロファージ、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または骨髄芽球から選択される、請求項1~43のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記フソソームが、任意に、MHC複合体を除去するためのゲノム編集によって、免疫原性の低下を示す修飾されたゲノムを有するソース細胞に由来する、請求項1~44のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記フソソームが、前記ソース細胞の直径の約0.01%または1%未満の直径を有する、請求項1~45のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記フソゲンが、哺乳動物フソゲンまたはウイルスフソゲンである、請求項1~46のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記フソゲンが、pH6~8で活性である、請求項1~47のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記フソソームが、前記フソソームを標的細胞に局在化させる標的化ドメインを含む、請求項のいずれかに記載のフソソーム。
- 前記標的化ドメインが、前記標的細胞上の標的細胞部分と相互作用する、請求項49に記載のフソソーム。
- 前記標的細胞が、生物内にある、請求項1~50のいずれか一項に記載のフソソーム。
- 前記標的細胞が、生物から単離された初代細胞である、請求項1~50のいずれか一項に記載のフソソーム。
- 前記標的細胞が、内皮細胞、線維芽球、血液細胞(例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球)、幹細胞(例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞)、胚性幹細胞(例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児の皮膚、青年期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織からの幹細胞)、筋芽細胞、実質細胞(例えば、肝細胞)、肺胞細胞、ニューロン(例えば、網膜神経細胞)、前駆細胞(例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、もしくは血管芽球)、前駆細胞(例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞)、または不死化細胞(例えば、HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR90、IMR91、PER.C6、HT-1080、もしくはBJ細胞)から選択される、請求項1~52のいずれか一項に記載のフソソーム。
- 請求項1~53のいずれかに記載のフソソームを含む、薬学的組成物。
- フソソーム組成物を製造する方法であって、
i)請求項1~53のいずれかに記載の複数のフソソームを提供することと、
ii)前記複数のフソソーム、フソソーム組成物、または薬学的組成物を、例えば、被験体への投与に適したフソソーム製剤として製剤化することと、を含む、方法。 - フソソーム組成物を被験体に投与する方法であって、請求項1~53のいずれかに記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物を前記被験体に投与することによって、前記フソソーム組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
- タンパク質膜ペイロードを被験体に送達する方法であって、請求項1~53のいずれかに記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物を前記被験体に投与することを含み、前記フソソーム組成物が、前記タンパク質ペイロード遺伝子が送達されるような量および/または時間で投与される、方法。
- 患者における疾患または障害を治療する方法であって、請求項1~53のいずれかに記載の複数のフソソームを前記被験体に投与することを含み、前記フソソーム組成物が、前記疾患または障害が治療されるような量および/または時間で投与される、方法。
- 前記疾患または障害が、癌、自己免疫障害、または感染症から選択される、請求項58に記載の方法。
- 前記被験体が、ヒト被験体である、請求項56~59のいずれかに記載の方法。
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