WO2004038029A1 - T細胞に遺伝子を導入する方法 - Google Patents

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WO2004038029A1
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gene
vector
virus
sev
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Shinji Okano
Yoshikazu Yonemitsu
Katsuo Sueishi
Mamoru Hasegawa
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Dnavec Research Inc.
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    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
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    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing a gene into ⁇ cells.
  • ⁇ lymphocytes are one of the targets for gene delivery from the early stages of gene therapy for severe combined immunodeficiency (ADA-SCID) due to adenosine-deaminase (ADA) deficiency.
  • ADA severe combined immunodeficiency
  • the current barrier is that T cells are relatively resistant to gene delivery by currently available vectors such as retroviruses. '
  • T lymphocytes Given the clinical context in treating autoimmune diseases, organ transplant rejection after transplantation, or tumors, a subset of activated T lymphocytes must be an ideal target for genetic modification (Altenschmidt, U.S.A.). et al., J. Mol. Med., 1997, 75: 259-266; Hege, KM and Roberts, MR, Curr. Opin. Biotechnol., 1996, 7: 629-634; Tuohy, VK et al., J. Neuroimraunol., 2000, 107: 226-232). Early clinical reports on gene marking demonstrated that tumor infiltrating lymphocytes (TILs) were activated by tumor antigens.TILs were demonstrated to migrate to tumors in individuals with tumors.
  • TILs tumor infiltrating lymphocytes
  • the vector was introduced into T cells under various conditions, and the gene transfer efficiency was measured.
  • the present inventors have found that paramyxovirus vectors exhibit high gene transfer efficiency to antigen-activated T cells.
  • the gene transfer was specific for activated T cells, that is, the gene transfer efficiency of the vector was significantly higher for activated T cells than for naive T cells.
  • Paramyxovirus vectors are suitably used as vectors for gene transfer into antigen-activated T cells.
  • T-lymphocyte-directed gene therapy has therapeutic potential for various immunological diseases
  • gene transduction gene transduction
  • the present invention it has been demonstrated that a paramyxovirus vector can express a foreign gene specifically in activated T cells by a very simple procedure, and can overcome the above problems in gene therapy of ⁇ cells. It became.
  • gene delivery specific to activated T cells can be efficiently performed, and application to a modification strategy by gene delivery directed to T cells in an immune disease is expected. That is, the present invention relates to a method for introducing a gene into a ⁇ cell, more specifically,
  • the present invention provides a method for introducing a gene into T cells using a paramyxovirus vector. This method includes a step of contacting a paramyxovirus vector carrying a gene to be introduced with activated T cells.
  • the present inventors have found that It has been found that a xovirus vector can introduce a gene into activated T cells with extremely high efficiency. The transfection efficiency of the paramyxovirus vector into naive ⁇ ⁇ cells was low, and it was found that gene transfer using this vector was specific to antigen-activated ⁇ cells. Therefore, the method of the present invention can be suitably used for selective gene transfer into activated ⁇ cells.
  • T cells are important as targets for controlling the immune system in the treatment of cancer and other diseases, and the method of the present invention can be suitably used for gene therapy of these diseases.
  • Gene transfer can be performed in a desired physiological aqueous solution such as a culture solution, physiological saline, blood, or body fluid.
  • the present invention also provides a method for introducing a desired gene into a cell, comprising: (a) a step of activating the T cell; and (b) a step of activating the paramyxovirus vector carrying the gene. Contacting the germinated T cells.
  • This method is also included in the method of the present invention for introducing a gene into a T cell.
  • T cells can be activated by antigen stimulation.
  • the step of activating the T cells enables efficient gene transfer using a paramyxovirus vector.
  • the activation of T cells may be performed before the paramyxovirus vector is brought into contact with the T cells, or may be performed in the presence of a paramyxovirus vector.
  • the paramyxovirus vector solution was able to achieve better gene delivery simply by adding it, without the aid of special agents.
  • Optimal gene delivery via Sendai virus vector is described in Nasal mucosa iasal mucosa) (Yonemitsu, Y. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18: 970-973), vascular (vasculature) (Masaki, I. et al., FASEB J., 2001, 15: 1294-1296), retinal tissue (Ikeda, Y. et al., Exp. Eye Res., 2002, 75: 39-48), etc.
  • the present inventors have found that the lower the cell concentration of human lymphocytes in vitro, the lower the percentage of transfected cells, but this result was also observed in mouse cells. Therefore, in gene transfer, the cell concentration is preferably relatively high. Fine ⁇ degree Example Eba 1 10 6/1 1 11-4 10 6/1111, preferably 4 X 10 6 / ml ⁇ 8 X 10 6 / ml, preferred properly is 8 X 10 6 / ml to: l It should be about X 10 7 / ml.
  • M0I is administered between 1 and 500, more preferably between 2 and 300, even more preferably between 3 and 200.
  • Short contact time between the vector and T cells is sufficient, for example, 1 minute or more, preferably 3 minutes or more, 5 minutes or more, 10 minutes or more, or 20 minutes or more, for example, 1 to 60 minutes. Degree, more specifically about 5 to 30 minutes.
  • the contact may be for longer periods of time, for example for several days or longer.
  • the Universal Artificial Antigen Presenting Cell (APC) system (Maus, MV) that can stimulate T cells with immunological synaps using anti-CD3, anti-CD28, and 4-4-1BB ligands et al., Nat. Biotechnol., 2002, 20: 143-148), which makes it easier to prepare sufficient quantities of ⁇ cell lines.
  • APC Universal Artificial Antigen Presenting Cell
  • the SeV-derived vector system can be used as a T cell-directed gene for various immunological diseases. It has important therapeutic potential for clinical application of treatment.
  • the present invention also relates to a method for selectively introducing a gene into activated T cells, which comprises introducing a paramyxovirus vector carrying the gene into a cell population containing activated T cells and naive T cells.
  • a method that includes a step of making them coexist.
  • Selective for activated ⁇ cells means that a gene is significantly introduced into activated T cells as compared to naive ⁇ cells.
  • the present invention provides a method comprising the step of adding a paramyxovirus vector carrying the gene to a cell population containing activated T cells and na ⁇ ve ⁇ cells.
  • the paramyxovirus vector preferentially introduces a gene into activated T cells as compared to naive T cells, and thus can selectively introduce genes into activated T cells by this method.
  • T cells also called T lymphocytes
  • T cell receptors which are receptors that recognize peptide complexes of antigens on the major histocompatibility complex (MHC).
  • MHC major histocompatibility complex
  • ⁇ Cells are the main lymphocytes that recognize peptides derived from protein antigens, tumor antigens, ara antigens, pathogens, etc., and generate antigen-specific individual immune responses (adaptive immunity). Aids antibody production (humoral immunity) or arm itself ⁇ Activates cell-mediated immunity as cells.
  • Activated ⁇ cells are ⁇ lymphocytes that have been brought into a state of being proliferated and differentiated by stimulation with an antigen or mitogen. That is, ⁇ activation of intracellular tyrosine kinase by binding of cell receptor or direct enzyme activation, followed by After increasing inositol phospholipid metabolism and increasing intracellular calcium concentration, DNA synthesis and cell division are initiated by interleukin (IL) -2 production, IL-2 receptor expression, and associated cell signals.
  • IL interleukin
  • T cells that are proliferating and differentiating. Differentiates into various T cells that produce various cytokines depending on the biological environment at the time of activation.
  • the activated T cells are preferably T cells activated by an antigen.
  • Transduction with Sendai virus vector is selective for antigen-activated T cells, and non-antigen-specific T cells are ex vivo in cases where specific T cells that responded to the antigen are activated to bystanders.
  • Gene transfer efficiency is low. Therefore, by activating T cells with an antigen, or performing an equivalent activation, the efficiency of gene transfer by a vector can be dramatically improved.
  • An antigen-activated T cell is a T cell that has a complex between the aforementioned MHC of an antigen presenting cell and a peptide derived from a specific antigen and a T cell receptor having an appropriate affinity.
  • Antigen-activated T cells are preferably expanded, blasted, produce various cytokines such as IL-2, IL-4 and IFN-, express cytotoxic molecules such as Fas Ligand and perforin, and present antigens such as CD40 Ligand It has the ability to activate cells and / or B cells.
  • Antigen-specific T cells are activated by antigen-presenting cells and / or B-cell activation and antibody production under the antigen-presenting cells presenting MHC and peptide in lymph nodes, etc. It has a major effect on the elimination of non-self proteins, non-self cells, and pathogens from living organisms by their effects on the production site, cytotoxicity by cytotoxic molecules, and promotion of inflammation.
  • Activated T cells can be prepared by fractionation.
  • human T cells have a characteristic of changing the expression pattern of the CD antigen upon activation.
  • activated T cells and naive T cells can be selected.
  • T cells are collected by negative selection, and CD45R0 is expressed on activated T cells.
  • CD45RA and CD62L double positive T cells be used as Nip T cells, and the others be used as activated or memory T cells. It is considered that activated T cells or na ⁇ ⁇ ve T cells can be fractionated by performing magnetic bead separation or sorting by flow cytometry using antibodies against both.
  • Antibodies used for fractionation can be obtained by any method combining known activation-related markers. Also included are methods of fractionating populations with certain special functions in activated T cells, such as chemokine receptors and cytotoxic receptors. For the fractionation method, other existing methods such as a method using specific gravity are included.
  • Activated T cells can also be prepared by activating naive T cells by antigen stimulation.
  • naive T cells can be cultured on a plate on which anti-CD3 antibody (10 g / ml) and anti-CD28 antibody (I0 ⁇ g / ml) are immobilized at the following concentrations, preferably for peripheral blood monocytes.
  • Activation can be achieved by simultaneously adding more denatured mature dendritic cells.
  • activation can also be achieved by culture in which dendritic cells and peptides, or protein antigens are added.
  • Preparation of antigen-activated T cells for example in the case of using a Hitaro antigen, donor, taken Residencial Piento peripheral blood, respectively isolating lymphocytes in peripheral blood lymphocyte separating medium, the l X 10 7 / ml, respectively adjusted to a concentration, the cell suspension derived from donor perform morphism radiation irradiation of 30 Gy, respectively 500 mu 1 to Dzu' injected into each well in the plate of 24-well, about the human IL-2 (5 ⁇ 100 U / ral) Obtained by culturing for 7 days. Passaging is possible by restimulating with donor-irradiated lymphocytes approximately every 7 days.
  • the antigen-specific T cell line has been subjected to at least three antigen stimuli (including the first).
  • the antigen-activated T cells include those stimulated and expanded using beads or cells to which the anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody are fixed after the second antigen stimulation.
  • the tumor is repeatedly frozen and thawed four or more times.
  • the solution in which tumor cells were lysed was added to dendritic cells differentiated from peripheral blood, and then irradiated with 20 Gy to 30 Gy of radiation to obtain antigen-presenting cells, and T cells separated from peripheral blood were used. It can be obtained by co-culturing for 7 days in the presence of IL-2 (5 to 100 U / ml) alone or in the presence of other optimal sites such as IL-7, and performing restimulation every 7 days three times ( Fields, RC et al., Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 1998, 95: 9482-9487).
  • the dendritic cells used here are derived from peripheral blood monocytes or hematopoietic stem cells such as bone marrow, umbilical cord blood, and mobilized peripheral blood by a known method of proliferating and differentiating using cytokines such as GM-CSF and IL-4. Includes all obtained.
  • Separation of peripheral blood T cells may be performed using a T cell separation solution; if an effective peptide in the antigen is known, antigen specificity using a class I or class II tetramer and peptide complex It may be obtained by a method for separating specific T cells. Preparation of activated T cells In addition to the above, if a known specific antigen is known, prepare it by a method that activates T cells using the antigen or a protein or peptide derived from the antigen. You can also. In addition, known T cell activation methods, such as a non-specific activation method using lectin or the like, can be used for preparing activated T cells. In the present invention, the antigen-activated T cells also include the cells thus obtained.
  • These activated ⁇ cells can be co-cultured with appropriate growth factors, cytodynamics and antigen and antigen presenting cells (including feeder cells, differentiated dendritic cells, artificial APCs, etc.), Alternatively, subculture can be performed by co-culture with antigen-presenting cells having no antigen.
  • a passage method suitable for various diseases to be treated may be used. For example, in the case of transfer immunotherapy against infectious immunity, etc., since T cells activated with antigens produce various cytokins, when transferred into the body, side effects such as fever may occur. May be used.
  • T cells as transfer immunity should express their functions only during infection of living organisms.
  • a paramyxovirus vector is a paramyxovirus-based virus particle having infectivity and a carrier for introducing a gene into a cell.
  • the term “infectivity” refers to the ability of a paramyxovirus vector to maintain the ability to adhere to cells and to introduce the gene contained in the vector into the adhered cells.
  • the paramyxovirus vector of the present invention is incorporated into the genomic RNA of the vector so that the foreign gene can be expressed.
  • the paramyxowi / sbetater of the present invention may have a replication ability or may be a defective vector having no replication ability. “Replicating” means that when a viral vector infects a host cell, the virus is replicated in the cell and infectious virus particles are produced.
  • Recombinant virus refers to a virus produced via a recombinant polynucleotide.
  • Recombinant polynucleotides are polynucleotides that are not linked at one or both ends in the same manner as in their natural state.
  • a recombinant polynucleotide is a polynucleotide in which the binding of a polynucleotide chain has been modified (cleaved and / or bound) by hand.
  • the recombinant polynucleotide can be produced by a known gene recombination method by combining polynucleotide synthesis, nuclease treatment, ligase treatment and the like.
  • Recombinant viruses can be produced by expressing a polynucleotide encoding the viral genome constructed by genetic engineering and reconstructing the virus.
  • a recombinant paramyxovirus can be produced by reconstitution from cDNA (Y. Nagai, A. Kato, Microbiol. Immunol., 43, 613-624 (1999)).
  • a gene refers to genetic material, and refers to a nucleic acid encoding a transcription unit.
  • the gene may be RNA or DNA.
  • a nucleic acid encoding a protein is called a gene of the protein.
  • genes do not code for proteins
  • the gene may encode a functional RNA such as lipozyme or antisense RNA.
  • the gene can be a naturally occurring or artificially designed sequence.
  • “DNA” includes single-stranded DNA and double-stranded DNA.
  • encoding a protein means that the polynucleotide contains, in sense or antisense, 0RF encoding an amino acid sequence of the protein so that the polynucleotide can express the protein under appropriate conditions.
  • paramyxovirus refers to a virus belonging to the family Paramyxoviridae or a derivative thereof.
  • Paramyxovirinae is a group of viruses that have non-segmented negative-strand RNA in their genome, including the subfamily Paramyxovirinae (the genus Respirovirus (also known as the genus Paramyxovirils), the genus Rubravirus, And Pneumovirinae (including the genus Pneumovirinae) (including the genus Pneumovirinae) and viruses.
  • the paramyxoviruses to which the present invention can be applied include, specifically, Sendai virus (Sendai virus :), Newcastle disease virus (Newcastle disease virus), diapers, Mumps virus / Mumps virus, hemp 3 ⁇ 4: Innoles (Measles virus), RS virus / Res (Respiratory syncytial virus), Ushito Winores (rinderpest virus), Distenno virus (distemper virus), Sanoleno reinfluenza virus (SV5), Human parainfluenza virus 1, 2, 3 More specifically, for example, Sendai virus (SeV), human parainfluenza virus-1 (HPIV-] J, human parainfluenza virus-3 (HPIV-3), phocine distemper virus (PDV), canine distemper virus (CDV), dolphin molbillivirus (DMV), peste-des-petits-ruminants virus (PDPR), measles virus (MV), rinderpest virus (RPV), Hendra virus (Hendra), Nip
  • Sendai virus SeV
  • human parainfluenza virus-1 HPIV-1
  • human parainfluenza virus-3 HPIV-3
  • phocine distemper virus PDV
  • canine distemper virus CDV
  • dolphin molbillivirus DMV
  • PDPR peste-des-petits-ruminants virus
  • MV measles virus
  • RPV rinderpest virus
  • Hendra virus Hendra
  • Nipah virus Nipah virus
  • the virus of the present invention is preferably a virus belonging to the subfamily Paramyxoviridae (including the genus Respirovirus, Rubravirus, and Mopyrivirus) or a derivative thereof, and more preferably the genus Respirovirus (genus).
  • Respirovirus is a virus belonging to the genus Paramyxovirus or its derivative.
  • examples of the respirovirus belonging to the genus of the respirovirus to which the present invention can be applied include, for example, human type (HPIV-3), cisparainfluenza virus type 3 (BPIV-3), Sendai virus / Sendai virus; Virus 1), and monkey parainfluenza virus 10 (SPIV-10).
  • the paramyxovirus is most preferably a Sendai virus. These viruses may be derived from natural strains, wild strains, mutant strains, laboratory passages, and artificially constructed strains.
  • Genomic RNA is RNA that has the function of forming ribonucleoprotein (RNP) together with the viral protein of paramyxovirus, expressing a gene in the genome by the protein, and replicating this RNA to form a daughter RNP. It is.
  • RNP ribonucleoprotein
  • the genome of Paramyxovirus has a configuration in which viral genes are arranged as antisense between the 3, leader region and the 5 'trailer region.
  • NP transcription termination sequence
  • I sequence intervening sequence
  • S sequence transcription initiation sequence
  • Genes encoding the viral proteins of Paramyxovirus include the NP, P, M, F, HN, and L genes.
  • the “NP, ⁇ , ⁇ , F, ⁇ , and 1 gene” refers to genes encoding nucleocapsid, phospho, matrix, fusion, hemadaltune-neuraminidase, and large protein, respectively.
  • Each gene in each virus belonging to the subfamily Paramyxovirinae is generally described as follows. In general, the ⁇ gene is sometimes referred to as the “ ⁇ gene.”
  • accession numbers in the database of the base sequence of each gene of Sendai virus are as follows: ⁇ 29343, ⁇ 30202, ⁇ 30203, ⁇ 30204, M51331, 55565, ⁇ 69046, X17218 for ⁇ gene, ⁇ 30202, ⁇ 30203, ⁇ 30204, ⁇ 55565, 69046 for ⁇ gene , ⁇ 00583, X17007, X17008, ⁇
  • genes D11446, ⁇ 02742, ⁇ 30202, ⁇ 30203, ⁇ 30204, ⁇ 69046, U31956, ⁇ 00584, X53056 For F gene D00152, D11446, D17334, D17335, ⁇ 30202, ⁇ 30203, ⁇ 30204, ⁇ 30204, ⁇ 300015 , ⁇ 02131, and the H gene, see D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131
  • virus genes encoded by other viruses for the N gene, CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; and Tupaia, AF079780, CDV, X51869; DMV, Z47758 ; HPIV-1, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV
  • the 0RF encoding these viral proteins and the 0RF of the foreign gene are placed in genomic RNA in antisense via the above E-IS sequence.
  • the 0RF closest to the 3 'in the genomic RNA requires only the S sequence between the 3' leader region and the 0RF, and does not require the E and I sequences.
  • the 0RF closest to 5 ′ in the genomic RNA requires only the E sequence between the 5 ′ trailer region and the 0RF, and does not require the I and S sequences.
  • two 0RFs can be transcribed as the same cistron using a sequence such as IRES. In such a case, there is no need for an E-1-S sequence between these two 0RFs.
  • a typical RA genome consists of a leader region followed by six ORFs encoding N, P, M, F, H, and L proteins in antisense order.
  • ORFs encoding N, P, M, F, H, and L proteins are arranged in order following the 3 'leader region, followed by a 5' trailer region.
  • ORFs encoding N, P, M, F, HN, and L proteins are arranged in order following the 3 'leader region, followed by a 5' trailer region.
  • ORFs encoding N, P, M, F, HN, and L proteins are arranged in order following the 3 'leader region, followed by a 5' trailer region.
  • the viral genes are different, but even in such a case, it is preferable to arrange the respective viral genes in the same manner as in the wild type.
  • vectors carrying the N, P, and L genes autonomously express genes from the RNA genome in cells, and genomic RNA is replicated.
  • the genes encoding the envelope proteins such as the F and HN genes and the M gene cause infectious virus particles to be formed and released outside the cells. Therefore, such a vector is a virus vector having replication ability.
  • a foreign gene to be introduced into a T cell may be inserted into a non-protein coding region in this genome, as described later.
  • the paramyxovirus vector of the present invention may be one in which any of the genes of the wild-type paramyxovirus is deleted.
  • a paramyxovirus vector that does not contain the M, F, or HN gene, or a combination thereof can also be suitably used as the paramyxovirus vector of the present invention. Reconstitution of such a viral vector can be performed, for example, by exogenously supplying a defective gene product. The virus vector thus produced adheres to the host cell and causes cell fusion similarly to the wild-type virus.
  • Genes to be deleted from the genome include, for example, the F gene and the Z or HN gene.
  • a plasmid expressing a recombinant paramyxovirus vector genome deficient in the F gene is transfected into a host cell together with an expression vector for the F protein and an expression vector for the NP, P, and L proteins.
  • Virus vectors can be reconstructed (W000 / 70055 and WO00 / 70O70; Li, ⁇ ⁇ -0. et al., J. Virol.
  • a virus can be produced using a host cell in which the F gene has been integrated into the chromosome. Even if the amino acid sequence of the protein group is not the same as the sequence derived from a virus, if the activity in introducing the nucleic acid is equal to or higher than that of the naturally-occurring type, a mutation or other virus may be introduced. The homologous gene may be substituted.
  • a vector containing a protein different from the envelope protein of the virus from which the vector genome is derived can be prepared.
  • a viral vector having a desired envelope protein can be produced by expressing in a cell an envelope protein other than the envelope protein encoded by the viral genome serving as the vector base.
  • envelope proteins of other viruses for example, G protein (VSV-G) of vesicular stomatitis virus (VSV) can be mentioned.
  • the viral vector of the present invention includes pseudotyped viral vectors containing envelope proteins derived from viruses other than the virus from which the genome is derived, such as the VSV-G protein. If these envelope proteins are designed so that they are not encoded in the genome of the viral genomic RNA, these proteins will not be expressed from the viral vector after the viral particles infect the cells.
  • the viral vector of the present invention includes, for example, proteins such as an adhesion factor, a ligand, and a receptor capable of adhering to a specific cell on the envelope surface, an antibody or a fragment thereof, or these proteins in the extracellular region.
  • proteins such as an adhesion factor, a ligand, and a receptor capable of adhering to a specific cell on the envelope surface, an antibody or a fragment thereof, or these proteins in the extracellular region.
  • it may contain a chimeric protein having a virus envelope-derived polypeptide in the cell region. This can control the specificity of the vector for T cells.
  • proteins such as an adhesion factor, a ligand, and a receptor capable of adhering to a specific cell on the envelope surface, an antibody or a fragment thereof, or these proteins in the extracellular region.
  • it may contain a chimeric protein having a virus envelope-derived polypeptide in the cell region. This can control the specificity of the vector for T cells.
  • These may be encoded
  • any viral gene contained in the vector is modified from a wild-type gene, for example, in order to reduce the immunogenicity of a viral protein or to enhance the transcription efficiency or replication efficiency of RA. May be.
  • a paramyxovirus vector it is conceivable that at least one of the replication factors N, P, and one gene is modified to enhance the transcription or replication function.
  • the H protein, one of the envelope proteins has both hemagglutinin (hemagglutinin) activity and neuraminida 1 e (neuraminidase) activity, but weakens the former, for example.
  • an antigen presenting epitope of an F protein or an HN protein which can be an antigen molecule on a cell surface, and to use this to produce a viral vector having a weakened antigen presenting ability for these proteins.
  • the accessory gene may be deleted.
  • the gene expression and replication in cultured cells is not impaired, and the virulence of SeV to hosts such as mice is significantly reduced (Kato, A. et al., 1997, J. Virol. 71: 7266-7272; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Curran, J. et al., 001/04272, EP1067179. ).
  • Such attenuated vectors are particularly useful as non-toxic viral vectors for gene transfer in vivo or ex vivo.
  • Paramyxoviruses are excellent gene transfer vectors, transcribe and replicate only in the cytoplasm of the host cell, and do not have a DNA phase, so they do not integrate into chromosomes (Lamb, RA and Kolakofsky, D. , Paramyxoviridae: The viruses and their replication. In'-Fields BN, Knipe DM, Holey PM, (eds). Fields of virology. Vol. 2. Lippincott-Raven Publishers: Philadelphia, 1996, pp. 1177-1204). For this reason, there are no safety problems such as canceration and immortalization due to chromosomal abnormalities. This feature of paramyxoviruses greatly contributes to the safety of vectorization.
  • heterologous gene expression for example, even when the Sendai virus (SeV) is serially passaged, almost no base mutation is observed, the genome is highly stable, and the inserted heterologous gene is stably expressed over a long period of time. (Yu, D. et al., Genes Cells 2, 457-466 (1997)).
  • paramyxovirus vectors represent a new class of highly efficient vectors for human gene therapy.
  • a SeV vector capable of replication can introduce a foreign gene of at least 4 kb, and can simultaneously express two or more types of genes by adding a transcription unit.
  • Sendai virus is known to be pathogenic for rodents and causes pneumonia, but is not pathogenic to humans. This has also been supported by previous reports that nasal administration of wild-type Sendai virus has no serious adverse effects in non-human primates (Hurwitz, JL et al., Vaccine 15: 533-540, 1997). These characteristics of Sendai virus suggest that Sendai virus vector can be applied to human therapy, and conclude that Sendai virus vector is one of the promising options for gene therapy targeting human T cells. It is a thing.
  • the viral vector of the present invention can encode a foreign gene in genomic RNA.
  • a recombinant paramyxovirus vector containing a foreign gene can be obtained by inserting a foreign gene into the paramyxovirus vector genome described above.
  • a desired gene to be expressed in a target T cell can be used.
  • the foreign gene may be a gene encoding a native protein, or may be deleted. Alternatively, it may be a gene encoding a protein obtained by modifying a natural protein by substitution or insertion.
  • the insertion position of the foreign gene can be selected, for example, at a desired site in the protein non-coding region of the viral genome.
  • each position between the 3 ′ leader region of the genomic RNA and the viral protein 0RF closest to the 3 ′ end can be selected. It can be inserted between the viral protein 0RF and / or between the viral protein 0RF closest to the end and the 5, trailer region.
  • a nucleic acid encoding a foreign gene can be inserted into the deleted region.
  • An E-1-S sequence is constructed between the inserted foreign gene and virus 0RF. Two or more genes can be inserted in tandem via the EIS sequence.
  • the expression level of a foreign gene carried on a vector can be regulated by the type of transcription initiation sequence added upstream of the gene (3 'side of the negative strand) (W001 / 18223).
  • the expression level can be controlled by the insertion position of the foreign gene on the genome. The expression level is higher near the 3 ′ end of the negative strand, and the expression level is lower near the 5 ′ end.
  • the insertion position of the foreign gene can be appropriately adjusted in order to obtain a desired expression level of the gene and to optimize the combination with the genes encoding the preceding and succeeding viral proteins. it can.
  • the foreign gene be linked to a highly efficient transcription initiation sequence and inserted near the 3 'end of the negative strand genome. . Specifically, it is inserted between the 3 'leader region and the viral protein 0RF closest to 3. Alternatively, it may be inserted between the viral gene closest to 3 ′ and the 0RF of the second gene.
  • the viral protein gene closest to 3 in the genome is the N gene
  • the second gene is the P gene.
  • genomic RNA of paramyxovirus in the presence of viral proteins required for reconstitution of RNP which is a component of paramyxovirus in mammalian cells, that is, N, P, and L proteins Transcribe cDNA encoding
  • the transcription can produce a negative strand genome (ie, the same antisense strand as the viral genome), or a positive strand (the sense strand encoding the viral protein), but does not reconstitute the viral RNP. it can.
  • a positive strand is preferably generated. It is preferable that the RNA end reflects the 3 ′ leader sequence and the 5 ′ trailer sequence end exactly as well as the natural virus genome.
  • a T7 RNA polymerase recognition sequence may be used as a transcription initiation site, and the RNA polymerase may be expressed in cells.
  • a self-cleaving ribozyme can be encoded at the 3' end of the transcript so that the 3 'end can be accurately cut out by this ribozyme ( Hasan, MK et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 and Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466).
  • a recombinant Sendai virus vector having a foreign gene is described in Hasan, MK et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587. According to Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466, it can be constructed as follows.
  • a DNA sample containing the cDNA sequence of the foreign gene of interest can be identified as a single plasmid by electrophoresis at a concentration of 2513 ⁇ 4 / 1 or more.
  • a foreign gene is inserted into DNA encoding viral genomic RNA using a Not I site will be described as an example.
  • ⁇ I found in cDNA sequence of interest When a recognition site is included, it is preferable to modify the base sequence using a site-directed mutagenesis method or the like so as not to change the amino acid sequence to be encoded, and to remove the NotI site in advance. From this sample, the target gene fragment is amplified by PCR and collected.
  • both ends of the amplified fragment are used as fciI sites.
  • the primer is designed to include the EI-S sequence in the primer so that the EIS sequence is located between the 0RF of the foreign gene inserted into the viral genome and the 0RF of the viral gene on both sides thereof.
  • the forward synthetic DNA sequence may have any two or more nucleotides on the 5 ′ side (preferably not including sequences derived from NotI recognition sites such as GCG and GCC) to ensure cleavage by I4.
  • Base more preferably ACTT
  • a Vfeil recognition site gcggccgc was added to its 3 'side
  • any 9 bases or a multiple of 6 to 9 as a spacer sequence was added to its 3' side.
  • a number of bases are added, and a sequence corresponding to about 25 bases of 0RF from the initiation codon ATG of the desired cDNA is added to the 3 ′ side. It is preferable that about 25 bases are selected from the desired cDNA so that the last base is G or C, and the base is 3 'end of the synthetic oligo DNA on the feed side.
  • any two or more nucleotides are selected from the 5 '
  • the ifc I recognition site gcggccgc is added to the 3 'side, and an oligo DNA of an insertion fragment for adjusting the length is added to the 3' side.
  • the length of this oligo DNA is designed so that the number of bases of the TfcI fragment of the final PCR amplification product will be 6 in the chain length (the so-called “rule of six”; Kolakofski , D. et al., J. Virol. 72: 891-899, 1998; Calain, P.
  • the complementary strand sequence of the Sendai virus S sequence, I sequence and E sequence preferably 5'-CTTTCACCCT -3 '(SEQ ID NO: 1), 5'-MG-3 ', and 5'-TTTTTCTTACTACGG-3 '( SEQ ID NO: 2) is added, and the length is selected so that the last base of the complementary strand corresponding to about 25 bases, counting backward from the termination codon of the desired cDNA sequence, is G or C on the 3 'side. And add the sequence to make the 3 'end of the reverse synthetic DNA.
  • PCR For the PCR, an ordinary method using Taq polymerase or another DNA polymerase can be used.
  • the amplified target fragment is digested with ⁇ I and inserted into the NotI site of a plasmid vector such as pBluescript.
  • the insert is excised from this plasmid with I and cloned into the NotI site of the plasmid containing the genomic cDNA. It is also possible to obtain a recombinant Sendai virus cDNA by directly inserting into the ⁇ I site of the genomic cDNA without using a plasmid vector.
  • a recombinant Sendai virus genomic cDNA can be constructed according to the method described in the literature (Yu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, MK et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997).
  • an 18 bp spacer sequence (5 ′-(G) -CGGCCGCAGATCTTCACG-3 ′) having a Not I restriction site (SEQ ID NO: 3) was cloned into a Sendai virus genomic cDNA (pSeV (+) ) From the leader sequence of the N protein and the plasmid pSeV18 + b (+) containing a self-cleaving ribozyme site derived from the antigenomic strand of the delta hepatitis virus (Hasan , MK et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820).
  • pSeV (+) Sendai virus genomic cDNA
  • pSeV (+) From the leader sequence of the N protein and the plasmid pSeV18 + b (+) containing a self-cleaving ribozyme site derived from the antigenomic strand of the delta hepatitis virus (Hasan ,
  • the DNA encoding the genomic RNA of the recombinant paramyxovirus thus prepared is transcribed in a cell in the presence of the above-mentioned viral proteins (Le and P), whereby the vector of the present invention is reconstituted. be able to.
  • the present invention provides a DNA encoding the viral genome band of the vector of the present invention for producing the vector of the present invention.
  • the present invention also relates to the use of a DNA encoding the genomic RNA of the vector for application to the production of the vector of the present invention. Reconstitution of recombinant virus Natl.
  • DNA can be reconstituted from minus-strand RA virus including parainfluenza, vesicular stomatitis virus, rabies virus, measles virus, Linda pestovirus, Sendai virus.
  • the vector of the present invention can be reconstituted according to these methods.
  • the virus When the F gene, HN gene, and / or M gene are deleted in the virus vector DNA, the virus does not form infectious virus particles as it is, but these are deleted in the host cell. Infectious virus particles can be formed by separately introducing and expressing genes and / or genes encoding envelope proteins of other viruses into cells.
  • RNA transcribed in vitro may be transfused into cells.
  • Enzymes, such as T7 RNA polymerase, required for the initial transcription of genomic RNA from DNA can be supplied by the introduction of a plasmid or viral vector that expresses it, or, for example, by incorporating the RNA polymerase gene into the chromosome of a cell. Alternatively, it may be incorporated so that expression can be induced, and supplied by inducing expression at the time of virus reconstitution.
  • Genomic RNA and viral proteins required for vector reconstitution are supplied, for example, by introducing a plasmid that expresses them. In providing these viral proteins, helper viruses such as wild-type or certain mutant paramyxoviruses are used.
  • Methods for introducing DNA that expresses genomic RNA into cells include, for example, the following methods: (1) a method of preparing a DNA precipitate that can be taken up by a target cell; (2) suitable for uptake by a target cell; and There are methods to create a complex containing DNA with low cytotoxicity and positive charge characteristics, and 3 a method of instantaneously opening a hole in the target cell membrane with an electric pulse to allow DNA molecules to pass through.
  • transfusion reagents can be used.
  • D0TMA (Roche), Superfect (QIAGEN # 301305), D0TAP, DOPE, DOSPER (Roche # 1811169) and the like can be mentioned.
  • D0TMA (Roche), Superfect (QIAGEN # 301305), D0TAP, DOPE, DOSPER (Roche # 1811169) and the like can be mentioned.
  • Known Graham, FL and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S., 1977, Cell 11: 223).
  • Method (3) is a method called electroporation and is more versatile than methods (1) and (2) in that there is no cell selectivity. Efficiency is said to be good under optimal conditions of pulse current duration, pulse shape, strength of electric field (gap between electrodes, voltage), buffer conductivity, DNA concentration, and cell density.
  • method (1) among the three categories is easy to operate and can examine a large number of samples using a large number of cells.
  • introduction of DNA into cells for vector reconstitution requires Transfection reagents are suitable.
  • Transfection reagents are suitable.
  • Superfect Transfection Ragent QIAGEN, Cat No. 301305
  • D0SPER Liposomal Transfection Reagent Roche, Cat No. 1811169
  • Reconstitution of the virus from the cDNA can be specifically performed, for example, as follows.
  • FCS fetal serum
  • antibiotics 100 units / ml penicillin G and 100; zg / ml streptomycin
  • the ratio of the amounts of the expression vectors encoding N, P, and L is preferably, for example, 2: 1: 2, and the amount of the plasmid is, for example;! -4 ⁇ g of pGEM- ⁇ , 0.5-2 ⁇ g. Adjust appropriately with pGEM- ⁇ of 1 g and pGEM-L of 1 ⁇ 4 g.
  • the transfected cells may contain only 100 ⁇ g / ml rifampicin (Sigma) and cytosine arabinoside (AraC), more preferably only 40 ⁇ g / ml cytosine arabinoside (AraC) (Sigma), if desired. Cultivation in serum-free MEM containing serum, and setting the optimal concentration of drug to minimize cytotoxicity by the vaccinia virus and maximize virus recovery (Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579).
  • Transfection can be introduced into cells by forming a complex with, for example, ribophthalamine or polycationic liposome.
  • various transfusion reagents can be used. For example, DOTMA (Roche), Superfect (QIAGEN # 301305), D0TAP, DOPE, D0SPER (Roche # 1811169) and the like can be mentioned.
  • a black kin can be added (Calos, MP, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015).
  • the expression of the viral gene from RNP and the process of RNP replication progress, and the vector is amplified.
  • Vaccinia virus vTF7-3 can be completely removed by diluting the obtained virus solution (for example, 10 6 times) and repeating reamplification. The reamplification is repeated, for example, three times or more.
  • the resulting vector can be stored at -80 ° C.
  • LLC-MK2 cells that express the envelope protein may be used for transfection, or transfection may be performed together with the envelope expression plasmid.
  • defective viral vectors can be amplified by overlaying and culturing LLC-MK2 cells that express an envelope protein on cells that have undergone transfection (see International Publication Nos. TO00 / 70055 and W000 / 70070). .
  • the titer of the recovered virus can be determined, for example, by measuring CIU (Cell-Infected Unit) or measuring hemagglutination activity (HA) (W000 / 70070; Kato, A. et al., 1996). , Genes Cells 1: 569-579; Yoneraitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome— mediated gene delivery to vascular cells. Ed. By Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999).
  • CIU Cell-Infected Unit
  • HA hemagglutination activity
  • the titer can be quantified by directly infecting infected cells using the matrix as an index (eg, GFP-CIU As).
  • the titer measured in this way can be treated as equivalent to CIU (W000 / 70070).
  • the host cell used for the reconstitution is not particularly limited as long as the viral vector is reconstituted.
  • cultured cells such as monkey kidney-derived LLCMK2 cells and CV-1 cells, hamster kidney-derived BH cells, and human-derived cells can be used.
  • infectious virus particles having the envelope can also be obtained.
  • one of the virus vectors obtained from the above-mentioned host can be infected into embryonated chicken eggs to amplify the vector.
  • a method for producing virus vectors using chicken eggs has already been developed (Nakani et al., Eds., (1993), "Advanced Technology Protocol for Neuroscience III, Molecular Neuronal Physiology"), Kouseisha, Osaka, pp. 153- 172). Specifically, for example, put a fertilized egg in an incubator 9 ⁇ : 12 days Incubate at 37-38 ° C for an embryo to grow. The viral vector is inoculated into the allantoic cavity and the eggs are cultured for several days (eg, 3 days) to propagate the viral vector. Conditions such as the culture period may vary depending on the recombinant Sendai virus used. Then collect the urine fluid containing the virus.
  • Separation and purification of Sendai virus vector from urine fluid can be performed according to a conventional method (Masato Tashiro, “Virus Experiment Protocol”, Nagai, Ishihama, Medical View, pp. 68-73, (1995)).
  • construction and preparation of the Sendai virus vector from which the F gene has been deleted can be performed as follows (see WO0O / 7O055 and W000 / 70070).
  • PCR upstream of F [forward: 5 '-gttgagtactgcaagagc / sequence number: 5, reverse: 5- : 6],!
  • the PCR product using the primer pair [forward: 5 -atgcatgccggcagatga / rooster 5 system (J-number ⁇ ": 7, reverse: 5-tgggtgaatgagagaatcagcZ SEQ ID NO: 8] is ligated with EcoT22I.
  • the plasmid thus obtained is digested with Sacl and Sail, and a fragment (493 lbp) of the region containing the F gene deletion site is recovered and cloned into pUC18 to obtain pUC18 / dFSS.
  • the fragment After digestion with Dralll, the fragment is recovered, replaced with the Dralll fragment in the region containing the F gene of pSeV18 +, and ligated to obtain plasmid pSeV18 + / AF.
  • the foreign gene is inserted into, for example, the restriction enzyme NsiI and NgoJN sites at the F gene deletion site of pUC18 / dFSS.
  • a foreign gene fragment should be amplified with Nsi I-tailed primer and XMgo MIV-tailed primer.
  • the Cre / loxP-inducible expression plasmid that expresses the Sendai virus F gene (SeV-F) was designed so that the SeV-F gene was amplified by PCR and the gene product was induced and expressed by Cre DNA recombinase.
  • Plasmid pCALNdlw / F is inserted into unique site 5aI site of plasmid pCALNdlw (Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, plll5-1121) to construct plasmid pCALNdLw / F.
  • helper cell line expressing the SeV-F protein is established.
  • a sal kidney-derived cell line LLC-MK2 cell which is often used for the growth of SeV, can be used.
  • LLC-MK2 cells with 10% heat-treated immobilized ⁇ Shi fetal serum (FBS), penicillin G sodium 50 units / ml, and streptomycin 50 ig / ml was added to MEM 37 ° C, 5% C0 2 Incubate with Since the SeV-F gene product has cytotoxicity, the above plasmid pCALNdLw / F designed to induce and express the F gene product by Cre DNA recombinase was used in the calcium phosphate method (mammalian transfect ion kit (Stratagene )), The gene is introduced into LLC-MK2 cells according to a well-known protocol.
  • FBS immobilized ⁇ Shi fetal serum
  • penicillin G sodium 50 units / ml penicillin G sodium 50 units / ml
  • streptomycin 50 ig / ml was added to MEM 37 ° C, 5% C0 2 Incubate with Since the SeV-F gene product has cytotoxicity,
  • the plasmid into which the foreign gene of pSeV18 + / AF has been inserted is transfected into LLC-MK2 cells as follows. Seed LLC-MK2 cells at 5X10 6 cells / dish in a 100 mm Petri dish. If the T7 RNA polymerase direct transcription of the genome RA is 24 hours after cell culturing, psoralen (psoralens) and recombinant vaccinia Virus expressing 20 minutes treated with T7 thigh polymerase long-wave ultraviolet (3 6 5 nm) (PLWUV—VacT7: Fuerst, TR et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • T7 thigh polymerase long-wave ultraviolet 3 6 5 nm
  • UV Stratal inker 2400 (catalog number 400676 (100 V), Stratagene, La Jolla, CA, USA) equipped with five 15-pet valves can be used. After washing the cells with serum-free MEM, the plasmid expressing genomic RA and the expression plasmid expressing N, P, L, F, and HN proteins of paramyxovirus, respectively, were combined with an appropriate lipofection reagent. Transfection of these cells using The amount ratio of the plasmid is not limited to this, but may be preferably 6: 2: 1: 2: 2: 2 in order.
  • 12 [mu genomic RNA of that be expressed plasmid of [delta], and N, P, L, and F-expressing expressing plus HN proteins plasmid (pGEM / NP, pGEM / P , pGEM / L , and pGEM / F- HN W000 / 70070, Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579 (1996)) at 12 / ig, ⁇ g, 4 / g and
  • Viruses deficient in genes other than F for example, the HN or M genes, can also be prepared in a similar manner.
  • a viral gene deficient vector for example, when two or more vectors having different viral genes on the viral genome contained in the vector are introduced into the same cell, the defective viral protein will be lost in each case. Since the virus vector is supplied by expression from another vector, infectious virus particles complementary to each other are formed, the replication cycle goes around, and the viral vector is amplified. That is, if two or more vectors of the present invention are inoculated in a combination that captures viral proteins, a mixture of the respective viral gene-deficient virus vectors can be produced in large quantities at low cost. . Since these viruses lack the viral gene, their genome size is smaller than that of a virus that does not lack the viral gene, and their size can be increased and foreign genes can be retained. In addition, these viruses, which are not proliferative due to viral gene deficiency, are diluted outside the cell and are difficult to maintain co-infection.
  • the foreign gene introduced by the paramyxovirus of the present invention is not particularly limited, and examples of natural proteins include hormones, cytokines, growth factors, receptors, intracellular signal molecules, enzymes, peptides and the like.
  • the protein can be a secreted protein, a membrane protein, a cytoplasmic protein, a nucleoprotein, and the like.
  • artificial proteins include fusion proteins such as chimeric toxins, dominant negative proteins (recipients). (Including a soluble molecule or a membrane-bound dominant negative receptor), a deletion type cell adhesion molecule and a cell surface molecule.
  • the protein may be a protein to which a secretion signal, a membrane localization signal, a nuclear transport signal, and the like are added.
  • RNA-cleavable ribozyme By expressing an antisense RNA molecule or an RNA-cleavable ribozyme as a transgene, the function of a specific gene expressed in T cells can also be suppressed. If a virus vector is prepared using a gene for treating a disease as a foreign gene, gene therapy can be performed by administering this vector.
  • the application of the viral vector of the present invention to gene therapy includes gene expression by direct administration and gene expression by indirect (ex vivo) administration. Thus, it is possible to express endogenous genes and the like that are in short supply.
  • the method of the present invention can also be used as a gene therapy vector in regenerative medicine.
  • a replicative paramyxovirus vector to an individual or a cell, it is necessary to suppress the growth of the virus vector such as completion of treatment.
  • an RA-dependent RNA polymerase inhibitor it is also possible to specifically inhibit only the growth of the viral vector without damaging the host.
  • viral vectors of the invention for example, 1 X 10 5 CIU / raL or more, preferably 1 X 10 6 CIU / mL or more, more preferably 5 X 10 6 CIU / mL or more, more preferably 1 ⁇ 10 7 CIU / mL or more, more preferably 5 ⁇ 10 7 CIU / mL or more, more preferably IX 10 8 CIU / mL or more, more preferably 5 ⁇ 10 8 CIU / mL or more It can be released by titer into the extracellular fluid of the virus producing cells.
  • the titer of virus can be measured by the method described elsewhere in this specification (Kiyotani, K. et al., Virology 177 (1), 65-74 (1990); W000 / 70070). .
  • the recovered paramyxovirus vector can be purified to be substantially pure.
  • the purification method can be performed by a known purification / separation method including filtration, centrifugation, column purification and the like, or a combination thereof.
  • substantially pure means that the viral vector makes up the major proportion of the components in the sample in which it is present.
  • a substantially pure viral vector is one that contains at least 10% of the protein derived from the viral vector out of the total proteins (excluding proteins added as carriers or stabilizers) in the sample. Preferably, it accounts for 20% or more, more preferably 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more.
  • a specific method for purifying paramyxovirus for example, a method using cellulose sulfate ester or a crosslinked polysaccharide sulfate (Japanese Patent Publication No. Sho 62-30752, Japanese Patent Publication No. Sho 62-33879, and Japanese Patent Publication No. Sho 62-33879) -30753), and a method of adsorbing to a fucose / sulfuric acid-containing polysaccharide and / or a decomposition product thereof (W097 / 32010).
  • the vector can be combined with a desired pharmacologically acceptable carrier or vehicle, if necessary.
  • a “pharmaceutically acceptable carrier or vehicle” is a material that can be administered with a vector and does not significantly inhibit gene transfer by beta.
  • the composition can be prepared by appropriately diluting the vector with physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), or a culture solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • urine fluid may be contained.
  • the composition containing the vector may contain a carrier or a medium such as deionized water and a 5% dextrose aqueous solution.
  • composition containing the vector of the present invention is useful as a reagent and as a medicament.
  • Gene transfer into T cells using the betatta of the present invention is expected to be applied to gene therapy for various diseases.
  • Such gene therapy includes, for example, to detect abnormal expression in a cell due to a gene deficiency, to add a new function by introducing a foreign gene into a cell, or to use a certain gene. Against To suppress undesired effects in the cell by introducing a suppressive gene.
  • the method of the present invention is useful for suppressing rejection in, for example, an autoimmune disease.
  • an activated T-cell established strain that recognizes the aro antigen or a major antigen that causes an autoimmune disease an inhibitory site force-in such as IL-10
  • an inhibitory site force-in such as IL-10
  • rejection can be controlled by suppressing the T cell aro-reaction in vivo or by inducing suppressive dendritic cells.
  • cancer treatment through gene transfer into T cells by the method of the present invention is also expected. For example, by introducing a vector encoding a vascular growth suppression gene into T cells that recognize tumor-specific antigens, a local tumor growth suppression effect is expected.
  • a gene such as PDGF platelet derived growth factor-A
  • PDGF platelet derived growth factor-A
  • T cells activated with the target antigen a gene that can differentiate oligodendrocytes from stem cells using T cells activated with the target antigen. It is expected that it will be introduced, promote local oligodendrocyte regeneration, and control disease (Vincent, KT et al., Journal of Neuroiramunology, 2000, 107: 226-232).
  • the method of the present invention can be applied.
  • IFNs interferons
  • IFN- ⁇ interferons
  • the dose of the vector varies depending on the disease, the patient's body weight, age, sex, symptoms, purpose of administration, form of administration composition, administration method, transgene, etc., but can be appropriately determined by those skilled in the art. is there.
  • the administration route can be appropriately selected. It can be administered locally or systemically.
  • Vector administered is preferably about 10 5 CIU / ml to about 10 11 CIU / ml, more preferably about 10 7 CIU / ml to about 10 9 CIU / ml, and most preferably from about 1 X 10 8 CIU / ml
  • an amount in the range of about 5 ⁇ 10 8 CIU / ml is administered in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the dose per dose is preferably 2 ⁇ 10 5 CIU to 2 ⁇ 10 11 CIU, and the number of doses can be once or multiple times within the range of clinically acceptable side effects.
  • the above doses can be administered in terms of the weight ratio of the target animal to the human or the volume ratio (for example, the average value) of the administration target site, and can be administered.
  • the vector is contacted with the T cells ex vivo (eg, in a test tube or petri dish).
  • M0I is administered between 1 and 500, more preferably between 2 and 300, even more preferably between 3 and 200.
  • Subjects to which the composition containing the vector of the present invention is administered include all mammals such as humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, sheep, dogs and the like. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a diagram showing the gene transfer efficiency of mouse T cells by SeV. The gene transfer efficiency in activated or naive T cells is shown.
  • Mouse lymphocytes were cultured for 2 days in the presence or absence of 2.5 ⁇ 10 7 PFU (MOI 62.5) of SeV_EGFP, and the cells were collected and APC-bound anti-CD3 and PE-bound anti-CD4 (upper panel). ) Or anti-CD8 (lower panel) antibody.
  • Dot plot shows live CD3 + CD4 + or CD3 + CD8 +
  • Fig. 4 shows expression of CD4 or CD8 and GFP in lymphocytes, respectively. In the upper right corner of each of the four sections, the gene transfer efficiency is shown as the percentage of EGFP positive cells.
  • FIG. 2 is a diagram showing the efficiency of gene transfer by SeV into a T cell line.
  • T cell lines were cultured for 2 days in the presence or absence of 2.5 x 10 7 PFU (M0I 62.5) SeV_EGFP, and cells were harvested and APC-bound anti-CD3 and PE-bound anti-CD4 (top panel). ) Or anti-CD8 (lower panel) antibody.
  • the dot plot in the leftmost panel shows the expression of CD3 and CD4 or CD8 in gated living lymphocytes. The ratio of each quarter is shown.
  • the dot plots in the other panels show the expression of EGFP on CD4 or CD8 T cells in living CD3-positive, living lymphocytes.
  • FIG. 3 is a diagram showing the gene transfer efficiency in the activation of nao T cells and T cell lines in the specific antigen-specific manner.
  • FIG. 4 is a diagram showing the effect of the pie stander's activity on gene transfer by SeV. 50 / zl of 2C naive lymphocytes (l X 10 7 / ml) and 50 mu 1 of B6 na ⁇ ve lymphocytes and (l X 10 7 / ml) , 2. the presence of 5X 10 7 PFU of SeV- EGFP ( Balb (black par), B6 (gray par), or C3H (check par) with 100 tl irradiated Balb (black par), or in the absence (positive X axis) Stimulation was performed for 2 days with lymphocytes (1 ⁇ 10 7 / ml) or without lymphocytes (white par).
  • the percentage of EGFP positive cells was obtained from gated surviving CD8 + 1B2 + T cells.
  • the Y-axis shows the percentage of EGFP-positive clonotype cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing the maintenance of GFP expression in T cells transfected with SeV-EGFP.
  • T cells from 2C-tg mice were stimulated with B6 (left column) or Balb / c (right column) irradiated lymphocytes for 6 days in the presence of SeV-EGFP, and the transfected T cells After rinsing, the cells were restimulated for 6 or 7 days with irradiated B6 or Balb stimulator without SeV.
  • the dot plot shows the expression of EGFP in surviving clonotype T cells.
  • the numbers in the upper right corner of each quadrant indicate the percentage of EGFP positive or negative clonotype T cells on day 13 (upper panel) and day 20 (middle panel). Data from uninfected 2C T cell line stimulated for 20 days as negative control (Lower panel). Data are representative of two independent experiments.
  • FIG. 6 is a diagram showing the efficiency of gene transfer by SeV into human T cells. It shows gene transfer efficiency in activated or na ⁇ ⁇ ve T cells. 200 / zl human lymphocytes (4 ⁇ 10 6 / ml) are cultured for 2 days in the presence or absence of 2.5 ⁇ 10 7 PFU (M0I 31) of SeV-EGFP, and cells are collected. And stained with APC-conjugated anti-CD3 and PE-conjugated anti-CD4 (upper panel) or anti-CD8 (lower panel) antibodies. The dot plots show the expression of GFP and CD4 or CD8, respectively, in living CD3 + CD4 + or CD3 + CD8 + T lymphocytes.
  • Gene transfer efficiency was expressed as the percentage of EGFP positive cells in the indicated T cells.
  • Left panel Cells were cultured in uncoated antibody wells.
  • Middle panel Cells were cultured in wells coated with activating antibodies (anti-CD3 and anti-CD28 antibodies).
  • Right panel Cells were cultured without SeV-EGFP in wells coated with activating antibodies (anti-CD3 and anti-CD28 antibodies).
  • As a negative control data was similarly obtained from cells cultured with SeV-luci. The numbers in each right corner of the quadrant indicate the proportion of the population. Reproducible data was obtained from more than four independent experiments.
  • FIG. 7 is a diagram showing the efficiency of gene transfer into human naive or memory / activated T cells.
  • Freshly isolated T cells are incubated with SeV-EGFP for 2 days in an antibody-uncoated well, and the cells are harvested and APC-conjugated anti-CD62L, PE-conjugated anti-CD3, and biotinylated anti-CD45M The cells were stained with an antibody and subsequently stained with streptavidin PerCP.
  • the dot plot shows CD62L and CD45RA expression in gated (segmented) viable CD3-positive T cells.
  • the dot plot shows CD3 and EGFP expression in naive T cells, CD62L high and CD45M high T cells (upper panel), or in other cells that are memory / activated T cells (lower panel). Is shown. Reproducible data were obtained in three experiments from healthy donors.
  • FIG. 8 is a graph showing the efficiency of gene transfer into a human T cell line.
  • the human T cell line was cultured for 2 days in the presence or absence of SeV-EGFP as shown in FIG. 6, and analyzed as shown in FIG. EGFP expression ratio in CD4 (upper panel) or CD8 (lower panel) T cells is shown.
  • left Panel cells were cultured in uncoated antibody wells.
  • Middle panel cells were cultured in gels coated with antibodies (human anti-CD3 and human anti-CD28 antibodies).
  • Right panel Cells were cultured in the absence of SeV-EGFP in a gel coated with antibodies (human anti-CD3 and human anti-CD28 antibodies).
  • FIG. 9 is a view showing evaluation of SeV entry into naive or activated T cells.
  • the prepared cells were cultured with 2.5 ⁇ 10 7 PFU of SeV-EGFP for 2 days in an activity gel (white bar). Recovered cells were stained with APC-conjugated anti-CD3 and PE-conjugated anti-CD8 antibodies.
  • the percentage of EGFP positive cells was obtained from gated (segmented) surviving CD3 + CD4 + or CD3 + CD8 + T cells.
  • the Y-axis shows the percentage of EGFP-positive CD4 (3 bars on the left) or CD8 (3 pars on the right) T cells.
  • 2C trans diethyl nick mice is Tsu Kumausu (2c- tg, H-2 b ) the literature Sha, WC et al, Nature, 1988, 335: 271-274. All mice were treated humanely, kept free of specific pathogens, and received standard rodent chow and tap water. 7-9 week old mice were used. The animal experiments were examined by the Kyushu University Ethics Committee on Animal Experiments and the Committee on Recombinant DNA Experiments at Kyushu University.
  • SeV SeV-EGFP or SeV-luci, respectively
  • EGFP jellyfish enhanced green fluorescent protein
  • firefly luciferase gene firefly luciferase gene
  • This vector which contains the cloned SeV genomic cDNA, also contains a self-cleaving liposome site on the antigenomic strand of hepatitis delta virus.
  • Whole cDNA encoding EGFP (for SeV-EGFP) or luciferase (for SeV-luci) using primers containing a foil site and a set of new SeV E and S signal sequence tags for foreign gene expression was amplified by PCR and inserted into the ⁇ I site of the cloned genome.
  • the total length of the SeV genome which is ⁇ type, is set to be a multiple of 6 bases including the foreign gene (so-called “rule of six”) (Kolakofsky, D. et al., J. Virol., 1998, 72: 891-899) Type I SeV genome with foreign genes, and N, phospho (P), and large
  • Plasmids encoding the proteins are complexed with commercially available catonic lipids to form vaccinia virus vT7-3. Together with CV-1 or LLCMK cells
  • Virus titer was determined by hemagglutination assay using chicken erythrocytes (Y onemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus oi Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. By Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999), and the virus was stored at -80 ° C until use.
  • Piotinylated human CD45 RA (HI 100) mAb, anti-mouse CD3 (145-2C11) conjugated to allophycocyanin (APC), mouse CD8 (53-6.7), and human CD62L (DREG- 56) mAb, phycoerythrin (PE) -conjugated anti-human CD3 (UCHT1), human CD4 (RPA-T4), mouse CD4 (GK1.5), and mouse CD8 (53.67) mAb, PE-conjugated streptavidin , And peridinin chlorophyll ⁇ -protein (perCP) -conjugated streptavidin were purchased from PharMingen (San Diego, CA, USA).
  • APC-conjugated anti-human CD3 (UCHT1) mAb was purchased from DAK0 (Kyoto, Japan).
  • PE-conjugated anti-human CD8 (NU-Ts / c) mAb was purchased from Nichirei (Tokyo, Japan).
  • the anti-2C clonotypic TCR determinant mAb was prepared by the inventors of Hypridoma (1B2) (Sha, WC et al., Nature, 1988, 335: 271-274); The supernatant was purified using a HiTrap protein G column (Amersham Pharmacia Bioscience Inc., Buckinghamshire UK) and biotinylated using EZ_Link TM NHS-LC Biotin (PIERCE Biotechnology Inc., Rockfold, IL, USA).
  • CD28.2 For activation of T cells, purified anti-mouse CD3 (145-2C11), mouse CD28 (37.51), human CD3 (HIT3a), anti-human CD28 purchased from PharMingen (San Diego, CA, USA) (CD28.2) was used.
  • mice lymphocytes For the preparation of mouse lymphocytes, collect the spleen and lymph nodes and keep them on ice in complete medium I carried it. The spleen and lymph nodes were dissected in the medium by applying pressure to the tissue fragments between two glass slides. The cell suspension was filtered through a stainless mesh and washed twice with medium. Erythrocytes were lysed using ammonium chloride potassium carbonate lysing buffer.
  • PBL peripheral blood lymphocyte
  • blood was collected from healthy volunteers and separated from the blood by Ficoll Paque TM Plus (Pharmacia Biotech Inc., Wikstroms, Sweden; 4). Surviving nucleated cells were counted using a simple trypable monochromic exclusion system.
  • B6 or 2C-tg mouse lymphocytes (5 ⁇ 10 7 ) are irradiated with 30 Gy ( 137 Cs; Gammacell 40, Atomic Energy of Canada Limited, Ottawa, Canada) to prepare an aro-reactive T cell line.
  • 30 Gy 137 Cs; Gammacell 40, Atomic Energy of Canada Limited, Ottawa, Canada
  • an aro-reactive T cell line In a 50 ml flask (35-3014; FALCON, Beckton Dickinson Bioscience, Inc., Franklin Lake, NJ, USA) with a total of 10 ml of RPMI 1640 complete medium with Balb / c lymphocytes (5 ⁇ 10 7 ) Co-cultured for 6 days.
  • Activated aro-reactive T Itoda Tsuzuki is added to irradiated Balb / c lymphocytes by adding 10 ng / ml of human IL-12 (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd, Fujioka, Japan). Stimulated every time.
  • human IL-12 Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd, Fujioka, Japan. Stimulated every time.
  • B6 CD8-depleted lymphocytes are irradiated to obtain a CD4 T cell line. Stimulated with lymphocytes.
  • lymphocytes For the preparation of CD8-depleted lymphocytes, freshly isolated lymphocytes were incubated with anti-mouse CD8 (Lyt-2.2: Meiji, Tokyo, Japan) raAb for 30 minutes at 4 ° C, followed by Incubated with Low-Tox TM -M Rabbit completent (Cedarlane, Ontario, Canada) for 50 minutes at 37 ° C. B6 or 2C-tg ara antigen-activated T cells stimulated three or more times were used as mouse T cell lines.
  • CD8 Lyt-2.2: Meiji, Tokyo, Japan
  • raAb Low-Tox TM -M Rabbit completent
  • peripheral blood lymphocytes 5 x 10 6
  • peripheral blood lymphocytes 5 x 10 6
  • 10 ng 10 ng
  • the collected mouse cells were centrifuged, and the supernatant of a cultured hybridoma (2.4 G2; American type culture collection, Manassas, VA, USA) producing anti-mouse CD16 / 32 mAb was 50 ⁇ l for 30 minutes4. Incubated with C. This step was eliminated for human lymphocytes. The cells were washed with complete medium, incubated with various combinations of mAbs for 30 minutes at 4 ° C, and then washed twice with complete medium. Piotinylated mAbs were detected with PE or PerCP streptavidin.
  • Labeled cells were analyzed by FACS Caliber using the CellQuest program (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) and the FL0WJ0 program (TREE STAR, Inc., San Carlos, CA, USA).
  • PI propidium iodide
  • CD3 + CD4 + PI-cells were designated as viable CD4 T cells and the population of CD3 + CD8 + Pr cells was designated as viable CD8 T cells.
  • Transgenic clonotype T cells, CD8 + 1B2 + ⁇ cells were designated as viable 2c T cells.
  • Na ⁇ ⁇ ve human or activated / memory human T cells were either gated (segmented) as CD62 / CD45RA + CD3 + cells or gated (segmented) as others in CD3 + cells, respectively (Picker, LJ et al., J. Immunol., 1993, 150: 1105-1121; Ostrowski, MA et al., J. Virol., 1999, 73: 6430-6435).
  • lymphocytes newly isolated from 2C-tg mouse were used.
  • 2.5 ml of a T cell line (2 ⁇ 10 6 / ml) from a 2C-tg mouse was injected with 30 Gy irradiated lymphocytes (1 ⁇ 10 6 ) from a B6 or Balb / c mouse.
  • a mixture of 50 ⁇ l of 2C na ⁇ ve lymphocytes (1 ⁇ 10 7 / ml) and 50 ⁇ of B6 na ⁇ ve lymphocytes (1 ⁇ 10 7 / ml) was added to 2.5 ⁇ 10 7 PFU of In the presence of SeV-EGFP, the cells were stimulated with 100 ⁇ l of irradiated Balb / c, B6, or C3H lymphocytes (1 ⁇ 10 7 / ml) 100 ⁇ l for 2 days.
  • B6 lymphocytes (4 ⁇ 10 6 / ml) were inactivated with 2000 raj of UV (UV crosslinker; Pharmacia Biotech Inc., San Francisco, Calif., USA) to SeV-luci (5 ⁇ 10 8 PFU / ml). of 1: 1 in the presence or absence of a ratio, after incubation for 30 minutes 37 ° C, cells were washed well with complete medium, SeV- EGFP and (2. 5 X 10 8 PFU / ml) 1 : Incubated at 37 ° C for 30 minutes at a ratio of 1.
  • EGFP-positive unstimulated mouse CD3 + CD4 + or CD3 + CD8 + T cells also referred to as CD4 T cells or CD8 T cells, respectively
  • had a low percentage 0.5-: 1.5% or 0.8-2.0, respectively.
  • the percentage of EGFP-positive cells increased in a dose-dependent manner with SeV, with At that time almost reached the level of the plateau.
  • T cell stimulation that allows naive T lymphocytes to respond and proliferate in primary culture without immunization in vivo Aro antigen was used as the antigen.
  • Most of the T cell lines generated by co-culture of unmodified lymphocytes from C57BL / 6 and irradiated lymphocytes from Balb / c consist of CD8 T cells, so lymphocytes depleted of CD8 T cells
  • the CD4 T cell line was obtained by co-culture with the stimulated lymphocytes irradiated with.
  • T cells from 2c-tg mice were used.
  • Na ⁇ ⁇ ve 2c T cells expressed EGFP very strongly only in the presence of Balb / c stimulated cells, and little expression was seen in syndigenous B6 stimulated cells, but 3% in Balb / c stimulated cells.
  • SeV efficiently transduced EGFP into 2c T cells stimulated more than once and activated, either in the presence of B6 or Balb-stimulated cells (Fig. 3).
  • CD3 + CD4 + or CD3 + CD8 + T cells stimulated with immobilized anti-CD3 and anti-CD28 antibodies expressed EGFP at a high intensity, with a high percentage of EGFP-positive cells (range 30-69%, respectively). Or 50-70%) (Figure 6).
  • both CD4 and CD8 T cells showed extremely efficient transduction of 97% or 98%, respectively, in the presence of the immobilized antibody (FIG. 8).
  • FOG. 8 For this T cell line, simply incubating for 30 minutes at 37 ° C was sufficient to maximize EGFP expression.
  • SeV-mediated activation of T cell-specific gene delivery was investigated.
  • Factors that can affect the efficiency of gene transfer include the following: (I) SeV-specific receptor (Markwell, MA and Paulson, JC, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77: 5693-5697), (ii) a possible coreceptor for fusion (Kumar, M. et al., J. Virol., 1997, 71: 6398-6406; Eguchi, A. et al., J. Biol.
  • the present invention it has become possible to efficiently introduce a gene into T cells. Since gene transfer into T cells is important for the treatment of various diseases involving the immune system, application of the present invention to an alteration strategy by gene delivery directed to T cells in these diseases is expected. .

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Abstract

　本発明は、パラミクソウイルスベクターと活性化したT細胞とを接触させる工程を含む、T細胞に遺伝子を導入する方法を提供する。また本発明は、外来遺伝子が導入されたT細胞の製造方法であって、パラミクソウイルスベクターと活性化したT細胞とを接触させる工程を含む方法を提供する。また本発明は、この方法により製造された、外来遺伝子が導入されたT細胞を提供する。本発明により、効率的な活性化T細胞特異的な遺伝子送達が可能となり、T細胞を指向した遺伝子送達による免疫学的な改変戦略への適用が期待される。

Description

T細胞に遺伝子を導入する方法 技術分野
本発明は、 τ細胞に遺伝子を導入する方法に関する。
造血細胞の遺伝的改変は、 自己免疫疾患、 免疫不全、 さらには抗重瘍免疫の活 性ィ匕を介した腫瘍に対する治療の魅力的な戦略である。 様々な血液細胞の中でも τ リンパ球は、 アデノシンデアミナーゼ （adenosine- deaminase； ADA) 欠損症によ る重症複合型免疫不全 （ADA-SCID) に対する遺伝子治療の初期段階から遺伝子送 達の標的の 1つとされてきた （Blaese, R. M. et al. , Science, 1995， 270： 475— 480； Altenschmidt, U. et al. , J. Mol. Med. , 1997, 75： 259—266; Misaki, Y. et al. , Mol. Ther. , 2001, 3： 24-27) 。 し力 しながら、 レトロウイルスなどの 現在使用可能なベクターによる遺伝子送達に対して、 T細胞は比較的抵抗性を示す ことが、 現在の障壁となっている。 '
自己免疫疾患、 移植後のァロ器官拒絶、 または腫瘍などの治療における臨床場 面を考えると、 活性化 Tリンパ球のサブセットは遺伝的改変の標的として理想的で あるに違いない (Altenschmidt, U. et al. , J. Mol. Med. , 1997, 75： 259-266; Hege, K. M. and Roberts, M. R. , Curr. Opin. Biotechnol. , 1996， 7： 629-634； Tuohy, V. K. et al.， J. Neuroimraunol. , 2000, 107 : 226—232) 。 遺伝子マーキ ングに関する初期の臨床報告により、 腫瘍抗原により活性化される腫瘍浸潤リン パ球 （tumor infiltrating lymphocytes ; TILs) 力 腫瘍を持つ個体内において 腫瘍に移動することが実証されたことから、 TILsは治療遺伝子を腫瘍へと移動さ せる理想的な担体ビークルであることが示唆される （Rosenberg, S. A. et al. , N. Engl. J. Med. , 1990， 323： 570-578) 。 活性化 Tリンパ球の類似した特徴は、 自己免疫および器官移植においても期待されるものの、 その研究はここ 10年ほと んどなされておらず、 それは現在のベクターの活性化 T細胞への遺伝子送達の効率 が低いことが原因と予想される。
最近では、 新しく登場した Tリンパ球への遺伝子送達ビークル、 すなわちヒト免 疫不全ウィルス （HIV) をベースとするレンチウィルスベクターに多くの注目が集 まっているが、 これは HIVが CD4リンパ球に指向したトロピズムを持つからである 。 近年の努力の結果、 ベクターゲノムの核へのインポートおよび染色体へのイン テグレーションを促進するセントラル DNAフラップを構築することを介して、 HIV の活性化 T細胞への遺伝子送達効率は飛躍的に向上した （従来の HIVベクターでは 平均 15%に対して、 このベクターでは平均 51%) (Dardalhon, V. et al. , Gene Ther. , 2001， 8 : 190-198) 。 しかしながら、 特に HIVを含む病原性ウィルスをべ ースとしたレンチウィルスの場合には、 潜在的な安全性に関する関心が臨床適用 を遅らせている （Buchschacher, G. L. Jr. and ong-Staal, F. , Blood 2000, 95 : 2499-2504) 。 より効率的に遺伝子送達が可能で、 より安全な他の選択肢を開 発する努力を続けることが必要であることは明らかである。 発明の開示
T細胞へ効率的に遺伝子導入が可能なベクターを探し出すため、 T細胞に対して 種々の条件でベクターの導入を行い、 遺伝子導入効率を測定した。 その結果、 本 発明者らは、 パラミクソウィルスベクターが、 抗原活性化 T細胞に対して高い遺伝 子導入効率を示すことを見いだした。 遺伝子導入は活性化 T細胞に特異的、 すなわ ちべクターの遺伝子導入効率はナイープ T細胞と比べ活性化 T細胞に対して顕著に 高かった。 パラミクソウィルスベクターは、 抗原活性化 T細胞への遺伝子導入のた めのベクターとして好適に用いられる。
Tリンパ球を指向した遺伝子治療は、 様々な免疫学的疾患に対する治療の可能性 を持っているが、 これまでの T細胞の遺伝子治療においては、 複雑な操作を行うに も関わらず遺伝子導入 （ジーントランスダクシヨン） の効率が低いことが大きな 制約となっていた。 本発明により、 パラミクソウィルスベクターは、 非常に単純 な手順で、 活性化 T細胞に特異的に外来遺伝子を発現できることが実証され、 τ細 胞の遺伝子治療における上記の問題を克服することが可能となった。 本発明によ り、 活性化 T細胞特異的な遺伝子送達を効率的に実施することが可能となり、 免疫 疾患における T細胞を指向した遺伝子送達による改変戦略への適用が期待される。 すなわち本発明は、 τ細胞に遺伝子を導入する方法に関し、 より具体的には、
(1) T細胞に遺伝子を導入する方法であって、 該遺伝子を保持するパラミクソゥ ィルスべクタ一と活性ィ匕した T細胞とを接触させる工程を含む方法、
(2) パラミクソウィルスベクターがセンダイウィルスベクターである、 (1) · に記載の方法、
(3) 外来遺伝子が導入された T細胞の製造方法であって、 該遺伝子を保持するパ ラミクソウィルスベクターと活性化した T細胞とを接触させる工程を含む方法、
(4) パラミクソウィルスベクターがセンダイウィルスベクターである、 （3) に記載の方法、
(5) (3) または （4) に記載の方法により製造された、 外来遺伝子が導入さ れた T細胞、
(6) 活性化 T細胞への遺伝子送達のために用いる、 パラミクソウィルスベクター
(7) パラミクソウィルスベクターがセンダイウィルスベクターである、 (6) に記載のベクター、 に関する。 本発明は、 パラミクソウィルスベクターを用いる T細胞への遺伝子導入方法を提 供する。 この方法は、 導入したい遺伝子を保持するパラミクソウィルスベクター を、 活性ィヒした T細胞に接触させる工程を含む方法である。 本発明者等は、 パラミ クソウィルスベクターが極めて高い効率で活性化 T細胞へ遺伝子を導入できること を見出した。 ナイーブ Τ細胞に対しては、 パラミクソウィルスベクターによる遺伝 子導入効率は低く、 このベクターによる遺伝子導入は、 抗原活性化 Τ細胞に特異的 であることが判明した。 従って、 本発明の方法は、 活性化 Τ細胞への選択的な遺伝 子導入に好適に利用することができる。 τ細胞は、 癌おょぴその他の疾患の治療に おいて免疫系を制御するための標的として重要であり、 本発明の方法はこれら疾 患の遺伝子治療に好適に用いられ得る。 遺伝子導入は培養液、 生理食塩水、 血液 、 体液など所望の生理的水溶液中で行うことができる。
また本発明は、 Τ細胞に所望の遺伝子を導入する方法であって、 （a ) 該 T細胞 を活性化させる工程、 および （b ) 該遺伝子を保持するパラミクソウィルスべク ターを、 活性ィヒさせた T細胞に接触させる工程、 を含む方法を提供する。 この方法 も、 本発明における T細胞に遺伝子を導入する方法に含まれる。 T細胞は、 抗原刺 激により活性ィ匕することができる。 T細胞を活性ィ匕させる工程は、 パラミクソウイ ルスベクターによる効率的な遺伝子導入を可能にする。 T細胞の活性ィ匕は、 パラミ クソウィルスベクターをこの T細胞に接触させる前に行ってもよいし、 パラミクソ ウィルスべクターの存在下で行ってもよい。
単純な技術により高い効率で遺伝子送達が起こることは、 パラミクソウィルス ベクターを介した τ細胞標的化遺伝子送達の重要な優位性の 1つである。 以前に報 告されているように、 レトロウイルスおよびレンチウィルスを介した T細胞への遺 伝子送達は、 最適な遺伝子送達のためには遠心で濃縮しなくてはならず、 毒性の ある薬剤であるポリプレンなどを必要とする （Bunnell, B. A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1995, 92 : 7739—7743 ; Chuck, A. S. , Hum. Gene Ther. , 1996, 7： 743 - 750 ; Chinnasamy, D. et al. , Blood 2000, 96： 1309 - 1316 ; Fehse, B. et al. , Br. J. Haematol. , 1998, 102： 566-574) 。 一方でパ ラミクソウィルスベクター溶液は特別な薬剤に助けられることなく、 単に添加す るだけでより優れた遺伝子送達を達成することができた。 さらに、 活性化 T細胞へ のセンダイウィルスベクター （SeV) を介する最適な遺伝子送達は、 鼻腔粘膜 iasal mucosa) (Yonemitsu, Y. et al. , Nat. Biotechnol. , 2000, 18 : 970 - 973)、 血管 （vasculature) (Masaki, I. et al. , FASEB J. , 2001, 15： 1294- 1296)、 網膜組織 （retinal tissue) (Ikeda, Y. et al. , Exp. Eye Res. , 2002, 75： 39-48) 等で見られた代表的な結果と同様、 比較的短い暴露で行うことができ た （30分未満、 データ省略） 。 臨床場面を考えると、 パラミクソウィルスベクタ 一を介した遺伝子送達のこれらの特徴は、 本発明においても、 Tリンパ球の ex vivoでの遺伝的改変を単純化し、 操作に依存した細胞生存性の喪失を最小化し得 るものである。
本発明者らは、 in vitroでヒ トリンパ球の細胞濃度を低くするほど、 遺伝子導 入細胞の比率が低くなることを見いだしたが、 この結果はマウス細胞でも見られ た。 従って、 遺伝子導入においては、 細胞濃度は比較的高いことが好ましい。 細 胞濃度は、 例ぇば1 106/1111〜4 106/1111、 好ましくは 4 X 106/ml〜8 X 106/ml、 好ま しくは 8 X 106/ml〜： l X 107/ml程度にするとよレ、。
M0Iは 1〜500の間で投与することが好ましく、 より好ましくは 2〜300、 さらに好 ましくは 3〜200である。 ベクターと T細胞との接触は短い時間でも十分であり、 例 えば 1分以上、 好ましくは 3分以上、 5分以上、 10分以上、 または 20分以上接触させ ればよく、 例えば 1〜60分程度、 より特定すれば 5分〜 30分程度であってよい。 も ちろん、 それ以上の時間接触させてもよく、 例えば数日間またはそれ以上接触さ せてもよい。
最近、 免疫学的シナプス （immunological synaps) を用いて抗 CD3、 抗 CD28、 お よぴ 4- 1BBリガンドにより T細胞を刺激できるユニバーサルァーティフイシャル抗 原提示細胞 （APC) システム （Maus， M. V. et al.， Nat. Biotechnol. , 2002， 20 : 143-148) を含む、 幾つかの洗練された効率的な技術により、 十分な量の Τ細胞株 をより容易に調製することが可能となった。 そのような技術を組み合わせれば、 SeVに由来するベクター系は、 様々な免疫学的疾患に対する T細胞指向性の遺伝子 治療の臨床適用のための重要な治療的可能性を持つ。
また本発明は、 活性化 T細胞に選択的に遺伝子を導入する方法であって、 該遺伝 子を保持するパラミクソウィルスベクターを、 活性化 T細胞おょぴナイーブ T細胞 を含む細胞集団中に共存させる工程を含む方法を提供する。 活性化 τ細胞に選択的 とは、 ナイーブ τ細胞に比べ活性化 T細胞へ有意に遺伝子が導入されることを言う 。 例えば本発明は、 該遺伝子を保持するパラミクソウィルスベクターを、 活性化 T 細胞およぴナイーブ τ細胞を含む細胞集団中に添加する工程を含む方法を提供する 。 パラミクソウィルスベクターは、 ナイーブ T細胞に比べ活性化 T細胞へ優先的に 遺伝子を導入するので、 この方法により活性化 T細胞に選択的に遺伝子を導入する ことができる。 あるいは、 予め T細胞とベクターを共存させておき、 その後この T 細胞を活性化させる処理を行うことにより、 活性化された T細胞の選択的にベタタ 一を導入することができる。 これらの方法も、 本発明における T細胞に遺伝子を導 入する方法に含まれる。
T細胞は Tリンパ球ともいい、 組織主要適合抗原 （Major Histocompatibility Complex; MHC) 上にのった抗原のペプチド複合体を認識するレセプターである T細 胞レセプターを発現したリンパ球である。 主として、 骨髄の幹細胞より分化し、 胸腺にてポジティブセレクション （自己の MHCを認識できるレパーターの選択） 、 ネガティブセレクション （自己抗原を認識するレパーター排除） を受け、 成熟ナ ィーブ Τ細胞として末梢血液、 及びリンパ組織に出現する。 Τ細胞は蛋白抗原、 腫 瘍抗原、 ァロ抗原、 病原体などから由来するペプチドを認識し、 抗原特異的な個 体の免疫応答 （適応免疫） を発生させる主たるリンパ球であり、 ペプチドに対す る抗体産生を援助 （液性免疫） 、 あるいはそれ自身が武装化 Τ細胞となって細胞性 免疫を発動する。
活性化 Τ細胞とは、 抗原またはマイトジェンなどの刺激により、 増殖分化へと導 かれる状態となった Τリンパ球を言う。 つまり、 Τ細胞レセプターの結合、 あるい は直接的な酵素活性化により細胞内チロシンリン酸化酵素の活性化、 これに続く イノシトールリン脂質代謝の亢進、 細胞内カルシウム濃度の上昇を経て、 インタ 一ロイキン（IL)- 2産生、 IL- 2レセプターの発現、 及ぴそれに伴う細胞シグナルに より、 DNA合成、 細胞分裂を開始し、 増殖分化している T細胞を言う。 活性化時の 生体環境により種々のサイトカインを産生する種々の T細胞へと分化する。
また、 本発明において活性化 T細胞は、 好ましくは抗原により活性化された T細 胞である。 センダイウィルスベクターによる導入は抗原活性化 T細胞に選択的であ り、 抗原非特異的 T細胞には、 ex vivoにおいて抗原に応答した特異的 T細胞からバ イスタンダーに活性化される場合においては遺伝子導入効率は低い。 従って、 T細 胞を抗原により活十生化することにより、 あるいはこれと同等の活十生ィ匕を行うこと により、 ベクターによる遺伝子導入効率を劇的に向上させることができる。
抗原活性化 T細胞とは、 先に述べた抗原提示細胞の MHCと、 ある特定の抗原由来 のぺプチドなどとの複合体と適切なァフィ二ティーのある T細胞レセプターを持つ た T細胞が、 両者の結合を介して、 活性化シグナルを伝達した T細胞を言い、 好ま しくは、 CD28、 4- 1BB等の適切なコレセプターよりのシグナルを伝達する事によつ て活性化した T細胞である。 抗原活性化 T細胞は、 好ましくは、 増殖、 芽球化、 IL- 2、 IL- 4、 IFN- などの各種サイトカイン産生、 Fas Ligand, perforinなどの細胞 傷害分子発現、 及び CD40 Ligand等の抗原提示細胞および/または B細胞を活性化す るなどの能力を有する。 抗原特異的 T細胞はリンパ節等では MHCとペプチドを提示 した抗原提示細胞のもとで、 抗原提示細胞の活性ィ匕および/または B細胞の活性化 、 抗体産生刺激を行い、 末梢組織の局所ではその産生サイト力インおよび細胞傷 害分子による細胞傷害、 炎症の促進などの作用により、 生体から非自己蛋白、 非 自己細胞、 病原体の排除に主要な作用を及ぼす。
活性化 T細胞は、 分画により調製することができる。 例えばヒト T細胞は、 活性 化に伴 、CD抗原の表現パターンを変化させるという特徴があるため、 これにより 活性化 T細胞とナイーブ T細胞とを選別することが可能である。 具体的方法として 、 T細胞をネガテイブセレクションで採取し、 活性化 T細胞に表出する CD45R0に対 する抗体を用い、 マグネットビーズ分離法あるいは flow cytometryによるソーテ ィングを行うことで、 好ましくは、 CD45RA及ぴ、 CD62Lダブルポジティプ T細胞は ナイ一プ T細胞、 それ以外は活性化あるいはメモリ一 T細胞と考えられていること から、 両者に対する抗体を用いて、 マグネットビーズ分離法あるいは flow cytometryによるソーティングを行うことで、 活性化 T細胞あるいはナイーブ T細胞 を分画できる。 分画に用いる抗体は、 既知の活性化関連マーカーを組み合わせた すべての方法で可能である。 また、 ケモカインレセプター、 サイト力インレセプ ターなどの活性化 T細胞の中のある特殊な機能をもったポピュレーションを分画す る方法も含まれる。 分画法に関しては、 その他、 比重を用いた方法など、 既存の 方法を含む。
また活性化 T細胞は、 ナイーブ T細胞を抗原刺激により活性化して調製すること もできる。 例えばナイーブ T細胞は、 抗 CD3抗体 （10 g/ml) と抗 CD28抗体 (I0^ g/ml) を固着させたプレートに以下に述べる濃度で培養することで、 好まし くは末梢血単球より分ィヒさせた成熟樹状細胞を同時に添加することで活性化させ ることができる。 また、 腫瘍抗原による活性化の項で述べるように、 樹状細胞と ぺプチド、 あるいは蛋白抗原を添加された培養でも活性ィ匕させることができる。 抗原活性化 T細胞の調製は、 例えばヒトァロ抗原を用いる場合は、 ドナー、 レシ ピエント末梢血を採取し、 それぞれを末梢血リンパ球分離液でリンパ球を分離し 、 それぞれ l X 107/mlの濃度に調整、 ドナー由来の細胞浮遊液を 30 Gyの放射線照 射を行い、 24穴のプレートに各穴にそれぞれ 500 μ 1づっ注入し、 ヒト IL-2 (5〜 100 U/ral) で約 7日間培養することで得られる。 継代は約 7日間ごとのドナー放射 線照射リンパ球で再刺激することで可能である。 抗原特異的 T細胞株としては、 少 なくとも 3回の抗原刺激 （初回を含め、 ） を受けたものが望ましい。 あるいは、 2 回の抗原刺激以降は抗 CD3抗体と抗 CD28抗体が固着化されたビーズあるいは細胞な どを用いて刺激、 増殖させたものも、 抗原活性化 T細胞に含まれる。
腫瘍抗原などによる活性化の場合は、 4回以上の迅速な凍結融解をくり返して腫 瘍細胞を溶解した溶液を末梢血より分化させた樹状細胞に添カ卩した後、 放射線照 射 20 Gy〜30 Gyを照射したものを抗原提示細胞とし、 それに末梢血より分離した T 細胞を IL- 2 (5〜： 100 U/ml) 単独あるいは、 その他 IL- 7等の至適サイト力インの存 在下で 7日間共培養、 7日ごとの再刺激を 3回行うことによって得られる （Fields, R. C. et al.， Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 1998, 95 : 9482-9487) 。 ここで用 いられる榭状細胞は、 末梢血単球あるいは骨髄、 臍帯血、 動化末梢血などの造血 幹細胞より GM- CSF、 IL- 4等のサイトカインを用いて増殖分化させる既知の方法に より得られたものすベてを含む。
末梢血の T細胞の分離は、 T細胞分離液での分離でも良いし； 抗原内の有効なぺ プチドが分かっているならば、 Class I あるいは Class II のテトラマーとぺプチ ド複合体による抗原特異的 T細胞の分離方法により得られたものであってもよい。 活性化 T細胞の調製に関して、 以上の他に、 既知の特異的抗原が明らかなものに 関して、 その抗原あるいは抗原由来の蛋白、 ペプチドを使用して、 T細胞を活性化 する方法により調製することもできる。 その他、 活性化 T細胞の作成には、 レクチ ン等を用いた非特異的な活性ィ匕方法など、 既知の T細胞活性ィヒ方法が使用可能であ る。 本発明において抗原活性化 T細胞には、 このようにして得られた細胞も含まれ る。
これら活性化された τ細胞は、 適切な増殖因子、 サイト力インと抗原及ぴ抗原提 示細胞 （フィーダ一細胞、 分化させた樹状細胞、 アーティフィシャル APCなどを含 む） での共培養、 または、 抗原のない抗原提示細胞などとの共培養で継代が可能 である。 その他、 種々の治療対象疾患にあった継代法を用いてもよい。 例えば、 感染免疫等に対する移入免疫治療の場合は、 抗原で活性化されている最中の T細胞 は様々なサイト力インを産生しているため、 生体内へ移入した際、 発熱等の副作 用があらわれる可能性が有る。 また、 移入免疫としての T細胞は生体の感染時にの みその機能を発現すべきである。 そのため、 抗原で活性化した T細胞にパラミクソ ウィルスベクターを用いて遺伝子導入した後、 一旦、 抗原のない状態で APCと共培 養で継代し、 静止状態の活性化 T細胞 （いわゆるメモリー T細胞） を継代によって 作成する方法等がある。
本発明においてパラミクソウィルスベクターとは、 パラミクソウィルスをべ一 スとする感染力を持つウィルス粒子であって、 遺伝子を細胞に導入するための担 体である。 ここで 「感染力」 とは、 パラミクソウィルスベクターが細胞への接着 能を保持しており、 接着した細胞の内部にベクターに含まれる遺伝子を導入する ことのできる能力のことを言う。 好ましい態様では、 本発明のパラミクソウィル スベクターは、 ベクターのゲノム RNA中に外来遺伝子が発現できるように組み込ま れている。 本発明のパラミクソウイ^/スベタターは、 複製能を有していてもよく 、 複製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。 「複製能を有する」 とは、 ウィルスベクタ一が宿主細胞に感染した場合、 該細胞においてウィルスが複製さ れ、 感染性ウィルス粒子が産生されることを指す。
組み換えウィルスとは、 組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウィルス を言う。 組み換えポリヌクレオチドとは、 両端または片端が自然の状態と同じよ うには結合していないポリヌクレオチドを言う。 具体的には、 組み換えポリヌク レオチドは、 人の手によってポリヌクレオチド鎖の結合が改変 （切断および/また は結合） されたポリヌクレオチドである。 組み換えポリヌクレオチドは、 ポリヌ クレオチド合成、 ヌクレアーゼ処理、 リガーゼ処理等を組み合わせて、 公知の遺 伝子組み換え方法により生成させることができる。 組み換えウィルスは、 遺伝子 操作により構築されたウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ 、 ウィルスを再構築することによって生成することができる。 例えば、 組換えパ ラミクソウィルスは、 cDNAから再構成して生成することができる （Y. Nagai, A. Kato, Microbiol. Immunol. , 43, 613-624 (1999) ) 。
本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、 転写単位をコードする核酸を言う 。 遺伝子は RNAであっても DNAであってもよい。 本発明において蛋白質をコードす る核酸は、 該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。 また遺伝子は蛋白質をコードしていなくて もよく、 例えば遺伝子はリポザィムまたはァンチセンス RNAなどの機能的 RNAをコ ードするものであってもよい。 遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列 であり得る。 また、 本発明において 「DNA」 とは、 一本鎖 DNAおよぴニ本鎖 DNAを含 む。 また蛋白質をコードするとは、 ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下 で発現できるように、 該蛋白質のァミノ酸配列をコードする 0RFをセンスまたはァ ンチセンスに含むことを言う。
本発明においてパラミ ク ソウィルス とはパラ ミ ク ソウィルス科 （ Paramyxoviridae) に属するウィルスまたはその誘導体を指す。 パラミクソウィル スは、 非分節型ネガティブ鎖 RNAをゲノムに持つウィルスのグループの 1つで、 ノ ラミクソウィルス亜科 （Paramyxovirinae) (レスピロウィルス属 （パラミクソゥ ィルス属とも言う） 、 ルブラウィルス属、 およびモーピリウィルス属を含む） お よびニューモウィルス亜科 (Pneumovirinae) (ニューモウィルス属ぉょぴメタ二 ユーモウィルス属を含む） ウィルスを含む。 本発明を適用可能なパラミクソウイ ルスとしては、 具体的にはセンダイウィルス（Sendai virus：)、 ニューカッスル病 ウイノレス (Newcastle disease virus)、 おたふ、 力ぜワイ/レス (Mumps virus)、 麻 ¾：ゥイノレス (Measles virus)、 RSウイ/レス (Respiratory syncytial virusノ、 牛投 ウイノレス (rinderpest virus)、 ジステンノ ーウイノレス (distemper virus)、 サノレノ ラインフルェンザウィルス (SV5) 、 ヒ トパラインフルエンザウイルス 1， 2， 3型 等が挙げられる。 よ り具体的には、 例えば Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV -] J、 human parainfluenza virus - 3 (HPIV-3)、 、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CDV)、 dolphin molbillivirus (DMV)、 peste—des - petits - ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra)、 Nipah virus (Nipah)、 human parainfluenza virus- 2 (HPIV- 2)、 simian parainfluenza virus 5 (SV5)、 human parainfluenza virus - 4a (HPIV- 4a)、 human parainfluenza virus- 4b (HPIV - 4b)、 mumps virus (Mumps)、 およぴ Newcastle disease virus (NDV) などが含まれる。 よ り好ま しく は、 Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus - 1 (HPIV-1)、 human parainfluenza virus - 3 (HPIV-3)ヽ phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CDV)、 dolphin molbillivirus (DMV) 、 peste - des-petits - ruminants virus (PDPR) 、 measles virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra)、 およぴ Nipah virus (Nipah) からなる群より選択されるウィルスが例示できる。 本発明のウイ ルスは、 好ましくはパラミクソウィルス亜科 （レスピロウィルス属、 ルブラウイ ルス属、 およびモーピリウィルス属を含む） に属するウィルスまたはその誘導体 であり、 より好ましくはレスピロウィルス属 （genus Respirovirus) (パラミク ソウィルス属 （Paramyxovirus) とも言う） に属するウィルスまたはその誘導体で ある。 本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとしては、 例えばヒ トパ 型 (HPIV-3) 、 ゥシパラインフルェンザウイルス 3型 (BPIV-3) 、 センダイウイ/レ ス（Sendai virus ; マウスパラインフルエンザウイルス 1型とも呼ばれる）、 およ びサルパラインフルエンザウイルス 10型 （SPIV- 10) などが含まれる。 本発明にお いてパラミクソウィルスは、 最も好ましくはセンダイウィルスである。 これらの ウィルスは、 天然株、 野生株、 変異株、 ラボ継代株、 および人為的に構築された 株などに由来してもよい。
パラミクソウィルスベクターはゲノム RNAに搭載遺伝子をアンチセンスにコード している。 ゲノム RNAとは、 パラミクソウィルスのウィルス蛋白質と共にリボヌク レオプロテイン （RNP) を形成し、 該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、 こ の RNAが複製されて娘 RNPが形成される機能を持つ RNAである。 一般にパラミクソゥ ィルスのゲノムは、 3，リーダー領域と 5' トレイラ一領域の間に、 ウィルス遺伝子 がアンチセンスとして並んだ構成をしている。 各遺伝子の 0RFの間には、 転写終結 配列 (E配列） -介在配列（I配列） -転写開始配列 (S配列） が存在し、 これにより 各遺伝子の 0RFをコードする R Aが別々のシストロンとして転写される。 パラミクソウィルスのウィルスタンパク質をコードする遺伝子としては、 NP、 P 、 M、 F、 HN、 および L遺伝子が含まれる。 「NP、 Ρ、 Μ、 F、 ΗΝ、 およひ 1遺伝子」 と は、 それぞれヌクレオキヤプシド、 ホスホ、 マトリックス、 フュージョン、 へマ ダルチュン -ノイラミニダーゼ、 およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを 指す。 パラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、 一般に 次のように表記される。 一般に、 ΝΡ遺伝子は 「Ν遺伝子」 と表記されることもある レスピロウィルス属 NP P/C/V M F Η - L
ルブラウィルス属 NP P/V M F HN (SH) L
モーピリウィルス属 NP P/C/V M F Η - L
例えばセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのァクセッショ ン番号は、 ΝΡ遺伝子については Μ29343、 Μ30202, Μ30203, Μ30204, M51331, 55565, Μ69046, X17218, Ρ遺伝子については Μ30202, Μ30203, Μ30204, Μ55565, 69046, Χ00583, X17007, X17008, Μ遺伝子については D11446, Κ02742, Μ30202, Μ30203, Μ30204, Μ69046, U31956, Χ00584, X53056、 F遺伝子については D00152, D11446, D17334, D17335, Μ30202, Μ30203, Μ30204, Μ69046, X00152, Χ02131、 H 遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131, L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。 またその他のウィルスがコードするウイ ルス遺伝子を例示すれば、 N遺伝子については、 CDV， AF014953 ; DMV, X75961； HPIV-1, D01070 ; HPIV - 2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128 ; Mumps, D86172 ; MV, K01711 ; NDV, AF064091 ; PDPR, X74443 ; PDV, X75717 ; RPV, X68311 ; SeV, X00087 ; SV5, M81442 ; および Tupaia， AF079780, P遺伝子につい ては、 CDV， X51869; DMV, Z47758 ; HPIV-1, M74081 ; HPIV-3, X04721 ; HPIV - 4a, M55975 ; HPIV- 4b， M55976 ; Mumps, D86173 ; MV, M89920 ; NDV, M20302 ; PDV, X75960 ; RPV, X68311 ; SeV, M30202 ; SV5, AF052755 ; および Tupaia, AF079780 、 C遺伝子については CDV， AF014953 ; DMV, Z47758; HPIV- 1. M74081 ; HPIV-3, D00047; MV, AB016162; RPV, X68311 ; SeV, AB005796; および Tupaia, AF079780 、 M遺伝子については CDV， M12669; DMV Z30087 ; HPIV- 1， S38067; HPIV - 2， M62734; HPIV-3, D00130 ; HPIV- 4a， D10241 ; HPIV- 4b, D10242 ; Mumps, D86171 ; MV, AB012948 ; NDV, AF089819 ; PDPR, Z47977 ; PDV, X75717 ; RPV, M34018 ; SeV, U31956; および SV5， M32248、 F遺伝子については CDV， M21849 ; DMV, AJ224704; HPN-1. M22347 ; HPIV-2, M60182 ; HPIV-3. X05303, HPIV-4a, D49821 ; HPIV- 4b， D49822 ; Mumps, D86169 ; MV, AB003178 ; NDV, AF048763; PDPR, Z37017 ; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; およぴ SV5， AB021962, HN (Hまたは G) 遺伝子については CDV， AF112189; DMV, AJ224705 ; HPIV- 1， U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV- 4A， M34033 ; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711 ; NDV, AF204872; PDPR, Z81358 ; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433 ; および SV-5, S76876 が例示できる。 伹し、 各ウィルス は複数の株が知られており、 株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる 遺伝子も存在する。
これらのウィルス蛋白質をコードする 0RFおよび外来遺伝子の 0RFは、 ゲノム RNA において上記の E - I-S配列を介してアンチセンスに配置される。 ゲノム RNAにおい て最も 3'に近い 0RFは、 3'リーダー領域と該 0RFとの間に S配列のみが必要であり、 Eおよび I配列は必要ない。 またゲノム RNAにおいて最も 5'に近い 0RFは、 5' トレイ ラー領域と該 0RFとの間に E配列のみが必要であり、 Iおよび S配列は必要ない。 ま た 2つの 0RFは、 例えば IRES等の配列を用いて同一シストロンとして転写させるこ とも可能である。 このような場合は、 これら 2つの 0RFの間には E- 1 - S配列は必要な い。 野生型のパラミクソウィルスの場合、 典型的な R Aゲノムは、 3，リーダー領域 に続き、 N、 P、 M、 F、 H 、 および L蛋白質をアンチセンスにコードする 6つの ORF が順に並んでおり、 それに続いて 5， トレイラ一領域を他端に有する。 本発明のゲ ノム R Aにおいては、 ウィルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、 好ましくは、 野生型ウィルスと同様に、 3'リーダー領域に続き、 N、 P、 M、 F、 HN 、 および L蛋白質をコードする ORFが順に並ぴ、 それに続いて 5' トレイラ一領域が 配置されることが好ましい。 ある種のパラミクソウィルスにおいては、 ウィルス 遺伝子が異なっているが、 そのような場合でも上記と同様に各ウィルス遺伝子を 野生型と同様の配置とすることが好ましい。 一般に N、 P、 および L遺伝子を保持 しているベクターは、 細胞内で自律的に RNAゲノムから遺伝子が発現し、 ゲノム RNAが複製される。 さらに Fおよび HN遺伝子等のエンベロープ蛋白質をコードする 遺伝子、 および M遺伝子の働きにより、 感染性のゥィルス粒子が形成され、 細胞外 に放出される。 従って、 このようなベクターは複製能を有するウィルスベクター となる。 T細胞に導入したい外来遺伝子は、 後述するように、 このゲノム中の蛋白 質非コード領域に揷入すればよい。
また、 本発明のパラミクソウィルスベクターは、 野生型パラミクソウィルスが 持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってよい。 例えば、 M、 F、 または HN遺 伝子、 あるいはそれらの組み合わせが含まれていないパラミクソウィルスべクタ 一も、 本発明のパラミクソウィルスベクターとして好適に用いることができる。 このようなウィルスベクターの再構成は、 例えば、 欠損している遺伝子産物を外 来的に供給することにより行うことができる。 このようにして製造されたウィル スベクターは、 野生型ウィルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが
、 細胞に導入されたベクターゲノムはウィルス遺伝子に欠損を有するため、 最初 と同じような感染力を持つ娘ウィルス粒子は形成されない。 このため、 一回限り の遺伝子導入力を持つ安全なウィルスベクターとして有用である。 ゲノムから欠 損させる遺伝子としては、 例えば F遺伝子および Zまたは HN遺伝子が挙げられる。 例えば、 F遺伝子が欠損した組み換えパラミクソウィルスべクターゲノムを発現す るプラスミ ドを、 F蛋白質の発現ベクターならびに NP、 P、 および L蛋白質の発現べ クタ一と共に宿主細胞にトランスフエクシヨンすることにより、 ウィルスベクタ 一の再構成を行うことができる （W000/70055 および WO00/70O70 ; Li, Η· - 0. et al.， J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000) ) 。 また、 例えば、 F遺伝子が染色体に 組み込まれた宿主細胞を用いてウィルスを製造することもできる。 これらの蛋白 質群は、 そのアミノ酸配列はウィルス由来の配列そのままでなくとも、 核酸の導 入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、 変異を導入したり、 あ るいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよレ、。
また、 本発明のウィルスベクターとして、 ベクターゲノムが由来するウィルス のエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むベクターを作製す ることもできる。 例えば、 ウィルス再構成の際に、 ベクターのベースとなるウイ ルスのゲノムがコードするエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞 で発現させることにより、 所望のエンベロープ蛋白質を有するウィルスベクター を製造することができる。 このような蛋白質に特に制限はない。 例えば、 他のゥ ィルスのエンベロープ蛋白質、 例えば水疱性口内炎ウィルス （VSV) の G蛋白質 （ VSV-G) を挙げることができる。 本発明のウィルスベクターには、 VSV- G蛋白質な どのように、 ゲノムが由来するウィルス以外のウィルスに由来するエンベロープ 蛋白質を含むシユードタイプウィルスベクターが含まれる。 ウィルスのゲノム RNA にはこれらのエンベロープ蛋白質をゲノムにコードされないように設計すれば、 ウィルス粒子が細胞に感染した後は、 ウィルスベクターからこの蛋白質が発現さ れることはなレ、。
また、 本発明のウィルスベクターは、 例えば、 エンベロープ表面に特定の細胞 に接着しうるような接着因子、 リガンド、 受容体等の蛋白質、 抗体またはその断 片、 あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、 ウィルスエンベロープ由来の ポリべプチドを細胞內領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい 。 これにより、 ベクターの T細胞への特異性を制御し得る。 これらはウィルスゲノ ムにコードされていてもよいし、 ウィルスベクターの再構成時に、 ウィルスゲノ ム以外の遺伝子 （例えば別の発現べクターまたは宿主染色体上などにある遺伝子 ) の発現により供給されてもよい。 また本発明のベクターは、 例えばウィルス蛋白質による免疫原性を低下させる ために、 または R Aの転写効率または複製効率を高めるために、 ベクターに含まれ る任意のウィルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。 具体的には、 例えばパラミクソウィルスベクターにおいては、 複製因子である N、 P、 およひ 1遺 伝子の中の少なくとも一つを改変し、 転写または複製の機能を高めることが考え られる。 また、 エンベロープ蛋白質の 1つである H蛋白質は、 赤血球凝集素であ るへマグノレチニン (hemagglutinin) 活十生とノィラミニダ1 e (neuraminidase) 活性との両者の活性を有するが、 例えば前者の活性を弱めることができれば、 血 液中でのウィルスの安定性を向上させることが可能であろうし、 例えば後者の活 性を改変することにより、 感染能を調節することも可能である。 また、 F蛋白質を 改変することにより膜融合能を調節することもできる。 また、 例えば、 細胞表面 の抗原分子となりうる F蛋白質または HN蛋白質の抗原提示ェピトープ等を解析し、 これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウィルスベクターを 作製することもできる。
また本発明のベクターにおいては、 アクセサリー遺伝子が欠損したものであつ てよい。 例えば SeVのアクセサリー遺伝子の 1つである V遺伝子をノックァゥトす ることにより、 培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなく、 マウス等の宿主に対する SeVの病原性が顕著に減少する （Kato， A. et al. , 1997, J. Virol. 71 : 7266 - 7272 ; Kato, A. et al. , 1997, EMBO J. 16: 578-587 ; Curran, J. et al. , 001/04272, EP1067179) 。 このような弱毒化ベクターは、 in vivoまたは ex vivoにおける毒性のない遺伝子導入用ウィルスベクターとして 特に有用である。
パラミクソウィルスは遺伝子導入ベクターとして優れており、 宿主細胞の細胞 質でのみ転写 ·複製を行い、 DNAフェーズを持たないため染色体への組み込み （ integration) は起こらない (Lamb, R. A. and Kolakofsky, D. , Paramyxoviridae ： The viruses and their replication. In'- Fields BN, Knipe DM, Ho ley PM, (eds) . Fields of virology. Vol. 2. Lippincott - Raven Publishers : Philadelphia, 1996, pp. 1177-1204) 。 このため染色体異常による癌化おょぴ不 死化などの安全面における問題が生じない。 パラミクソウィルスのこの特徴は、 ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。 異種遺伝子発現の結果では、 例えばセンダイウィルス （SeV) を連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められ ず、 ゲノムの安定性が高く、 挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事 が示されている （Yu， D. et al. , Genes Cells 2, 457-466 (1997) ) 。 また、 力 プシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージン グの柔軟性 (flexibility) など性質上のメリットがある。 このように、 パラミク ソウィルスベクターは、 ヒトの遺伝子治療のための高効率ベクターの新しいクラ スとなることが示唆される。 複製能を有する SeVベクターは、 外来遺伝子を少なく とも 4kbまで導入可能であり、 転写ュニットを付加することによって 2種類以上の 遺伝子を同時に発現する事も可能である。
またセンダイウィルスは、 齧歯類にとつては病原性で肺炎を生じることが知ら れているが、 人に対しては病原性がない。 これはまた、 野生型センダイウィルス の経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこ れまでの報告によっても支持されている （Hurwitz, J. L. et al. , Vaccine 15: 533-540, 1997) 。 センダイウィルスのこれらの特徴は、 センダイウィルスベクタ 一が、 ヒトの治療へ応用できることを示唆し、 センダイウィルスベクターが、 ヒ ト T細胞を標的とした遺伝子治療の有望な選択肢の一つとなることを結論づけるも のである。
本発明のウィルスベクターは、 ゲノム RNA中に外来遺伝子をコードし得る。 外来 遺伝子を含む組換えパラミクソウィルスベクターは、 上記のパラミクソウィルス ベクターゲノムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。 外来遺伝子とし ては、 標的とする T細胞において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる 。 外来遺伝子は天然型蛋白質をコードする遺伝子であってもよく、 あるいは欠失 、 置換または揷入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であ つてもよい。 外来遺伝子の揷入位置は、 例えばウィルスゲノムの蛋白質非コード 領域の所望の部位を選択することができ、 例えばゲノム RNAの 3'リーダー領域と 3' 端に最も近いウィルス蛋白質 0RFとの間、 各ウィルス蛋白質 0RFの間、 および/また は 5，端に最も近いウィルス蛋白質 0RFと 5， トレイラ一領域の間に挿入することがで きる。 また、 Fまたは HN遺伝子などを欠失するゲノムでは、 その欠失領域に外来遺 伝子をコードする核酸を挿入することができる。 パラミクソウィルスに外来遺伝 子を導入する場合は、 ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が6の倍数と なるように揷入することが望ましい （Journal of Virology, Vol. 67, No. 8， 4822-4830, 1993) 。 挿入した外来遺伝子とウィルス 0RFとの間には、 E - 1 - S配列が 構成されるようにする。 E-I-S配列を介して 2またはそれ以上の遺伝子をタンデム に並べて揷入することができる。
ベクターに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、 その遺伝子の上流 （ネガティ プ鎖の 3'側） に付加する転写開始配列の種類により調節することができる （ W001/18223) 。 また、 ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することが でき、 ネガティブ鎖の 3'の近くに揷入するほど発現レベルが高く、 5，の近くに揷 入するほど発現レベルが低くなる。 このように、 外来遺伝子の揷入位置は、 該遺 伝子の所望の発現量を得るために、 また前後のウィルス蛋白質をコードする遺伝 子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。 一般に、 外来遺 伝子の高い発現が得られることが有利と考えられるため、 外来遺伝子は、 効率の 高い転写開始配列に連結し、 ネガティブ鎖ゲノムの 3'端近くに挿入することが好 ましい。 具体的には、 3'リーダー領域と 3，に最も近いウィルス蛋白質 0RFとの間に 挿入される。 あるいは、 3'に一番近いウィルス遺伝子と 2番目の遺伝子の 0RFの間 に揷入してもよい。 野生型パラミクソウィルスにおいては、 ゲノムの 3，に最も近 いウィルス蛋白質遺伝子は N遺伝子であり、 2番目の遺伝子は P遺伝子である。 逆に 、 導入遺伝子の高発現が望ましくない場合は、 例えばベクターにおける外来遺伝 子の揷入位置をネガティブ鎖のなるべく 5'側に設定したり、 転写開始配列を効率 の低いものにするなどして、 ウィルスべクターからの発現レベルを低く抑えるこ とで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
本発明のベクターを製造するには、 哺乳動物細胞においてパラミクソウィルス の成分である RNPの再構成に必要なウィルス蛋白質、 すなわち N、 P、 および L蛋白 質の存在下、 パラミクソウィルスのゲノム RNAをコードする cDNAを転写させる。 転 写によりネガティブ鎖ゲノム (すなわちウィルスゲノムと同じアンチセンス鎖) を生成させてもよく、 あるいはポジティブ鎖 （ウィルス蛋白質をコードするセン ス鎖） を生成させても、 ウィルス RNPを再構成することができる。 ベクターの再構 成効率を高めるには、 好ましくはポジティブ鎖を生成させる。 RNA末端は、 天然の ウィルスゲノムと同様に 3'リーダー配列と 5' トレイラ一配列の末端をなるベく正 確に反映させることが好ましい。 転写産物の 5'端を正確に制御するためには、 例 えば転写開始部位として T7 RNAポリメラーゼ認識配列を利用し、 該 RNAポリメラー ゼを細胞内で発現させればよい。 転写産物の 3'端を制御するには、 例えば転写産 物の 3'端に自己切断型リボザィムをコードさせておき、 このリボザィムにより正 確に 3'端が切り出されるようにすることができる （Hasan, M. K. et al. , J. Gen. Virol. 78： 2813—2820, 1997、 Kato, A. et al. , 1997, EMBO J. 16 : 578- 587及び Yu， D. et al. , 1997, Genes Cells 2 : 457—466) 。
例えば外来遺伝子を有する組み換えセンダイウィルスベクターは、 Hasan, M. K. et al. , J. Gen. Virol. 78： 2813-2820, 1997、 Kato, A. et al. , 1997， EMBO J. 16： 578-587及ぴ Yu, D. et al.， 1997, Genes Cells 2： 457 - 466の記 载等に準じて、 次のようにして構築することができる。
まず、 目的の外来遺伝子の cDNA塩基配列を含む DNA試料を用意する。 DNA試料は 、 251¾/ 1以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ま しい。 以下、 Not I部位を利用してウィルスゲノム RNAをコードする DNAに外来遺伝 子を挿入する場合を例にとって説明する。 目的とする cDNA塩基配列の中に^ I認 識部位が含まれる場合は、 部位特異的変異導入法などを用いて、 コードするアミ ノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、 Not I部位を予め除去しておく ことが好ましい。 この試料から目的の遺伝子断片を PCRにより増幅し回収する。 2 つのプライマーの 5'部分に ί I部位を付加しておくことにより、 増幅された断片 の両端を fci I部位とする。 ウィルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子の 0RF とその両側のウィルス遺伝子の 0RFとの間に E-I-S配列が配置されるように、 プラ イマ一中に E-I - S配列を含めるように設計する。
例えば、 フォワード側合成 DNA配列は、 Iによる切断を保証するために 5'側 に任意の 2以上のヌクレオチド （好ましくは GCGおよぴ GCCな の Not I認識部位由 来の配列が含まれない 4塩基、 更に好ましくは ACTT) を選択し、 その 3'側に Vfei l 認識部位 gcggccgcを付加し、 さらにその 3'側にスぺーサー配列として任意の 9塩 基または 9に 6の倍数を加えた数の塩基を付加し、 さらにその 3'側に所望の cDNA の開始コドン ATGからこれを含めて 0RFの約 25塩基相当の配列を付加した形態とす る。 最後の塩基は Gまたは Cとなるように該所望の cDNAから約 25塩基を選択してフ ォヮード側合成オリゴ DNAの 3'の末端とすることが好ましい。
リバース側合成 DNA配列は 5'側から任意の 2以上のヌクレオチド （好ましくは GCGおよび GCCなどの 7\¾ I認識部位由来の配列が含まれない 4塩基、 更に好ましく は ACTT) を選択し、 その 3'側に ifc I認識部位 gcggccgcを付加し、 さらにその 3'側 に長さを調節するための揷入断片のオリゴ DNAを付加する。 このオリゴ DNAの長さ は、 最終的な PCR増幅産物の Tfc I断片の鎖長が 6の倩数になるように塩基数を設 計する （いわゆる 「6のノレール (rule of six) 」 ； Kolakofski, D. et al. , J. Virol. 72 : 891-899， 1998； Calain, P. and Roux, L. , J. Virol. 67 :4822-4830， 1993 ; Calain, P. and Roux, L. , J. Virol. 67： 4822-4830， 1993) 。 このプラ イマ一に E-I- S配列を付加する場合には、 挿入断片のオリゴ DNAの 3'側にセンダイ ウィルスの S配列、 I配列、 および E配列の相補鎖配列、 好ましくはそれぞれ 5' - CTTTCACCCT- 3' (配列番号： 1 ) 、 5' - MG - 3'、 および 5' - TTTTTCTTACTACGG- 3' ( 配列番号： 2 ) を付加し、 さらにその 3'側に所望の cDNA配列の終始コドンから逆 に数えて約 25塩基相当の相補鎖の最後の塩基が Gまたは Cになるように長さを選択 して配列を付加し、 リバース側合成 DNAの 3，の末端とする。
PCRは、 Taqポリメラーゼまたはその他の DNAポリメラーゼを用いる通常の方法を 用いることができる。 増幅した目的断片は ^ Iで消化した後、 pBluescript等の プラスミ ドベクターの Not I部位に揷入する。 得られた PCR産物の塩基配列をシー クェンサ一で確認し、 正しい配列のプラスミ ドを選択する。 このプラスミ ドから 挿入断片を Iで切り出し、 ゲノム cDNAを含むプラスミ の Not I部位にクロー ニングする。 またプラスミ ドベクターを介さずにゲノム cDNAの^ I部位に直接揷 入し、 組み換えセンダイウィルス cDNAを得ることも可能である。
例えば、 組み換えセンダイウィルスゲノム cDNAであれば、 文献記載の方法に準 じて構築することができる （Yu， D. et al.， Genes Cells 2： 457-466, 1997； Hasan, M. K. et al.， J. Gen. Virol. 78 : 2813-2820, 1997) 。 例えば、 Not I 制限部位を有する 18bpのスぺーサー配列 （5' - (G) - CGGCCGCAGATCTTCACG- 3' ) (配 列番号： 3 ) を、 クロー-ングされたセンダイウィルスゲノム cDNA (pSeV (+) ) の リ一ダー配列と N蛋白質の 0RFとの間に揷入し、 デルタ肝炎ウィルスのアンチゲノ ム鎖 （antigenomic strand) 由来の自己開裂リボザィム部位を含むプラスミ ド pSeV18+b (+)を得る （Hasan, M. K. et al. , 1997, J. General Virology 78： 2813-2820) 。 pSeVlS (+)の I部位に外来遺伝子断片を挿入し、 所望の外来遺 伝子が組み込まれた組み換えセンダイウィルス cDNAを得ることができる。
このようにして作製した組み換えパラミクソウィルスのゲノム RNAをコードする DNAを、 上記のウィルス蛋白質 （レ P、 および N) 存在下で細胞内で転写させるこ とにより、 本発明のベクターを再構成することができる。 本発明は、 本発明のベ クタ一の製造のための、 本発明のベクターのウィルスゲノム匪をコードする DNA を提供する。 また本発明は、 本発明のベクターの製造に適用するための、 該べク ターのゲノム RNAをコードする DNAの使用に関する。 組み換えウィルスの再構成は 公知の方法を利用して行うことができる (W097/16539; W097/16538; Durbin, A. P. et al.， 1997, Virology 235： 323-332； Whelan, S. P. et al. , 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 8388-8392; Schnell. M. J. et al.， 1994, EMBO J. 13 : 4195-4203； Radecke, F. et al. , 1995， EMBO J. 14： 5773-5784； Lawson, N. D. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92： 4477-4481； Garcin, D. et al. , 1995， EMBO J. 14： 6087—6094; Kato, A. et al.， 1996, Genes Cells 1： 569-579； Baron, M. D. and Barrett, T,， 1997， J. Virol. 71： 1265-1271； Bridgen, A. and Elliott, R. M. , 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93： 15400-15404) 。 これらの方法により、 パラインフルエンザ、 水疱性口内炎ウィル ス、 狂犬病ウィルス、 麻疹ウィルス、 リンダ一ペス トウィルス、 センダイウイノレ スなどを含むマイナス鎖 R Aウィルスを DNAから再構成させることができる。 これ らの方法に準じて、 本発明のベクターを再構成させることができる。 ウィルスべ クタ一 DNAにおいて、 F遺伝子、 HN遺伝子、 および/または M遺伝子を欠失させた場 合には、 そのままでは感染性のウィルス粒子を形成しないが、 宿主細胞に、 これ ら欠失させた遺伝子および/または他のウィルスのエンベロープ蛋白質をコードす る遺伝子などを別途、 細胞に導入し発現させることにより、 感染性のウィルス粒 子を形成させることが可能である。
具体的な手順は、 （a ) パラミクソウィルスゲノム RNA (ネガティブ鎖 RNA) ま たはその相捕鎖 （ポジティブ鎖） をコードする cDNAを、 N、 P、 および L蛋白質を発 現する細胞で転写させる工程、 （b ) 生成したパラミクソウィルスを含む培養上 清を回収する工程、 により製造することができる。 転写のために、 ゲノム RNAをコ 一ドする DNAは適当なプロモーターの下流に連結される。 転写されたゲノム R Aは N、 L、 および P蛋白質の存在下で複製され RNP複合体を形成する。 そして M、 HN、 および F蛋白質の存在下でェンべ口ープに包まれたウィルス粒子が形成される。 ゲ ノム R Aをコードする DNAは、 例えば T7プロモーターの下流に連結させ、 T7 RNA ポ リメラーゼにより R Aに転写させる。 プロモーターとしては、 T7ポリメラーゼの認 識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用することができる。 あるい は、 インビトロで転写させた RNAを細胞にトランスフエタトしてもよい。
DNAからのゲノム RNAの最初の転写に必要な T7 RNAポリメラーゼ等の酵素は、 こ れを発現するプラスミドまたはウィルスベクターの導入によって供給することが できるし、 または、 例えば細胞の染色体に RNAポリメラーゼ遺伝子を、 発現を誘導 できるように組み込んでおき、 ウィルス再構成時に発現を誘導することにより供 給することもできる。 またゲノム RNA、 およびべクタ一再構成に必要なウィルス蛋 白質は、 例えばこれらを発現するプラスミドの導入によって供給する。 これらの ウィルス蛋白質の供給において、 野生型またはある種の変異パラミクソウィルス などのヘルパーウィルスを用いる。
ゲノム RNAを発現する DNAを細胞内に導入する方法には、 例えば次のような方法 、 ①目的の細胞が取り込めるような DNA沈殿物を作る方法、 ②目的の細胞による取 りこみに適し、 かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つ DNAを含む複合体を作る方 法、 ③目的の細胞膜に、 DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスに よって瞬間的に開ける方法などがある。
②としては、 種々のトランスフエクシヨン試薬が利用できる。 例えば、 D0TMA ( Roche) 、 Superfect (QIAGEN #301305) 、 D0TAP、 DOPE, DOSPER (Roche #1811169 ) などが挙げられる。 ①としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフエ クション法が挙げられ、 この方法によって細胞内に入った DNAは貧食小胞に取り込 まれるが、 核内にも十分な量の DNAが入ることが知られている （Graham, F. L. and Van Der Eb, J. , 1973, Virology 52： 456； Wigler, M. and Silverstein, S.， 1977, Cell 11： 223) 。 Chenおよび Okayamaはトランスファー技術の最適化を 検討し、 1) 細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4% C02、 35°C、 15 〜24時間、 2) DNAは直鎖状より環状のものが活性が高く、 3) 沈殿混液中の DNA濃 度が 20〜30 /z g/mlのとき最適な沈殿が得られると報告している （Chen, C. and Okayama, H. , 1987, Mol. Cell. Biol. 7： 2745) 。 ②の方法は、 一過的なトラン スフエクシヨンに適している。 古くは DEAE-デキストラン （Sigma抑- 9885 M. W. 5 X 105 ) 混液を所望の DNA濃度比で調製し、 トランスフエクシヨンを行う方法が 知られている。 複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、 効果 を高めるためにクロ口キンを加えることもできる （Calos, M. P. , 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80： 3015) 。 ③の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、 細 胞選択性がないという点で①または②の方法に比べて汎用性が高い。 効率はパル ス電流の持続時間、 パルスの形、 電界 （電極間のギャップ、 電圧） の強さ、 バッ ファーの導電率、 DNA濃度、 細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、 3つのカテゴリーの中で②の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多 数の検体を検討することができるので、 ベクター再構成のための DNAの細胞への導 入には、 トランスフエクシヨ ン試薬が適している。 好適には Superfect Transfection Ragent ( QIAGEN, Cat No. 301305 ) 、 または D0SPER Liposomal Transfection Reagent (Roche, Cat No. 1811169) が用いられるが、 これらに制 限されない。
cDNAからのウィルスの再構成は具体的には例えば以下のようにして行うことカ できる。
24穴から 6穴程度のプラスチックプレートまたは 100醒ペトリ皿等で、 10%ゥシ 胎児血清 (FCS)および抗生物質 （100 units/ml ペニシリン Gおよび 100 ;z g/ml スト レプトマイシン） を含む最少必須培地 （MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株 LLC-MK2 をほぼ 100%コンフルェントになるまで培養し、 例えば 1 /z g/ml psoralen (ソラ レン） 存在下、 紫外線 （UV) 照射処理を 20分処理で不活化した、 T7 RNAポリメラ ーゼを発現する組換えワクシニアウィルス vTF7- 3 (Fuerst, T. R. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83： 8122—8126, 1986、 Kato, A. et al. , Genes Cells 1 : 569-579, 1996) を 2 PFU/細胞で感染させる。 ソラレンの添加量おょぴ UV照射時間 は適宜調整することができる。 感染 1時間後、 2〜60 g、 より好ましくは 3〜20 μ δ の組換えセンダイウィルスのゲノム RNAをコードする DNAを、 ウィルス匿の生成に 必須なトランスに作用するウィルス蛋白質を発現するプラスミ ド （0. 5〜24 μ §の pGEM-N, 0. 25〜12 §の 6£¾1—?、 および 0. 5〜24 // gの pGEM— L) (Kato, A. et al.， Genes Cells 1： 569-579, 1996) と共に Superfect (QIAGEN社） を用いたリポフエ クシヨン法等により トランスフエクシヨンする。 N、 P、 および Lをコードする発現 ベクターの量比は例えば 2 : 1 : 2 とすることが好ましく、 プラスミド量は、 例え ば；!〜 4 μ gの pGEM - Ν、 0. 5〜2 μ gの pGEM- Ρ、 および 1〜4〃 gの pGEM- L程度で適宜調整 する。
トランスフエクションを行つた細胞は、 所望により 100 μ g/mlのリファンピシン (Sigma) 及ぴシトシンァラビノシド （AraC) 、 より好ましくは 40 μ g/mlのシトシ ンァラビノシド （AraC) (Sigma) のみを含む血清不含の MEMで培養し、 ヮクシ- ァウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、 ウィルスの回収率を最大にするよう に薬剤の最適濃度を設定する (Kato, A. et al. , 1996, Genes Cells 1： 569-579 ) 。 トランスフエクシヨンから 48〜72時間程度培養後、 細胞を回収し、 凍結融解 を 3回繰り返して細胞を破碎した後、 RNPを含む破砕物を LLC- MK2細胞に再度トラ ンスフエクシヨンして培養する。 または、 培養上清を回収し、 LLC- MK2細胞の培養 液に添加して感染させ培養する。 トランスフエクシヨンは、 例えばリボフヱタト ァミンまたはポリカチォニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に 導入することが可能である。 具体的には、 種々のトランスフエクシヨン試薬が利 用できる。 例えば、 DOTMA (Roche) 、 Superfect (QIAGEN #301305) 、 D0TAP、 DOPE, D0SPER (Roche #1811169) などが挙げられる。 エンドソーム中での分解を 防ぐため、 クロ口キンを加えることもできる （Calos, M. P. , 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80： 3015) 。 RNPが導入された細胞では、 RNPからのウィルス遺伝 子の発現およぴ RNPの複製の過程が進行しべクタ一が増幅する。 得られたウイルス 溶液を希釈 （例えば 106倍） して再増幅を繰り返すことにより、 ワクシニアウイ ルス vTF7- 3は完全に除去することができる。 再増幅は、 例えば 3回以上繰り返す 。 得られたベクターは- 80°Cで保存することができる。 エンベロープ蛋白質をコー ドする遺伝子を欠損した複製能を持たないウィルスベクターを再構成させるには 、 エンベロープ蛋白質を発現する LLC- MK2細胞をトランスフエクションに使用する 、 またはエンベロープ発現プラスミ ドを共にトランスフエクシヨンすればよい 。 また、 トランスフエクシヨンを行った細胞にエンベロープ蛋白質を発現する LLC - MK2細胞を重層して培養することによって欠損型ウィルスベクターを増幅する こともできる （国際公開番号 TO00/70055および W000/70070参照） 。
回収されたウィルスの力価は、 例えば CIU (Cell-Infected Unit) 測定または赤 血球凝集活性 (HA)の測定することにより決定することができる （W000/70070； Kato, A. et al. , 1996, Genes Cells 1： 569-579; Yoneraitsu, Y. & Kaneda, Y.， Hemaggulutinating virus of Japan - liposome— mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine : Humana Press : pp. 295-306, 1999) 。 また、 GFP (緑色蛍光蛋白質） などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、 マ 一力一を指標に直接的に感染細胞を力ゥントすることにより力価を定量すること ができる （例えば GFP - CIUとして） 。 このようにして測定した力価は、 CIUと同等 に扱うことができる (W000/70070) 。
ウィルスベクターが再構成する限り、 再構成に用いる宿主細胞は特に制限され ない。 例えば、 センダイウィルスベクター等の再構成においては、 サル腎由来の LLCMK2細胞およぴ CV-1細胞、 ハムスター腎由来の BH細胞などの培養細胞、 ヒト由 来細胞等を使うことができる。 これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現 させることで、 そのエンベロープを有する感染性ウィルス粒子を得ることもでき る。 また、 大量にセンダイウィルスベクターを得るために、 上記の宿主から得ら れたウィルスベクタ一を発育鶏卵に感染させ、 該ベクターを増幅することができ る。 鶏卵を使ったウィルスベクターの製造方法は既に開発されている （中西ら編 , (1993) , 「神経科学研究の先端技術プロトコール III， 分子神経細胞生理学」 ， 厚 生社， 大阪， pp. 153-172) 。 具体的には、 例えば、 受精卵を培養器に入れ 9〜： 12日 間 37〜38°Cで培養し、 胚を成長させる。 ウィルスベクターを尿膜腔へ接種し、 数 日間 （例えば 3日間） 卵を培養してウィルスベクターを増殖させる。 培養期間等 の条件は、 使用する組み換えセンダイウィルスにより変わり得る。 その後、 ウイ ルスを含んだ尿液を回収する。 尿液からのセンダイウィルスベクターの分離 ·精 製は常法に従って行うことができる （田代眞人， 「ウィルス実験プロトコール」 ， 永井、 石浜監修， メジカルビユー社， pp. 68-73, (1995) ) 。
例えば、 F遺伝子を欠失したセンダイウィルスベクターの構築と調製は、 以下の ように行うことができる （WO0O/7O055および W000/70070参照） 。
<1> F遺伝子欠失型センダイウィルスゲノム cDNAおよび F発現プラスミドの構築 センダイウィルス （SeV) 全長ゲノム cDNA、 pSeV18+ b (+) (Hasan, M. K. et al.， 1997, J. General Virology 78： 2813-2820 ) ( 「pSeV18+ b (十） 」 は Γ pSeV18+」 ともいう） の cDNAを Sphl/Kpnlで消化してフラグメント（14673bp)を回収 し、 pUC18にクローユングしてプラスミ ド pUC18/KSとする。 F遺伝子欠損部位の構 築はこの PUC18/KS上で行う。 F遺伝子の欠損は、 PCR-ライゲーシヨン方法の組み合 わせで行い、 結果として F遺伝子の ORF (ATG-TGA=1698bp ) を除いて例えば atgcatgccggcagatga (配列番号： 4 ) で連結し、 F遺伝子欠失型 SeVゲノム cDNA ( pSeV18+/ A F ) を構築す る 。 PCRは、 Fの上流には [ forward : 5' - gttgagtactgcaagagc / 配 列 番 号 ： 5 , reverse : 5 -
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： 6 ] 、 ！^ 子の " 流 には [ forward: 5 -atgcatgccggcagatga / 酉 5歹 (J番^" : 7 ， reverse : 5 ― tgggtgaatgagagaatcagcZ配列番号： 8 ] のプライマー対を用いた PCRの産物を EcoT22Iで連結する。 このように得られたプラスミ ドを Saclと Sailで消化して、 F 遺伝子欠損部位を含む領域の断片 (493 lbp) を回収して pUC18にクローユングし、 pUC18/dFSSとする。 この pUC18/dFSSを Dralllで消化して、 断片を回収して pSeV18+ の F遺伝子を含む領域の Dralll断片と置き換え、 ライゲーシヨンしてプラスミド pSeV18+/ A Fを得る。 外来遺伝子は、 例えば pUC18/dFSSの F遺伝子欠失部位にある制限酵素 Nsi I お ょぴ Ngo JN部位に揷入する。 このためには、 例えば外来遺伝子断片を、 Nsi I- tailedプライマーおよ XMgo MIV- tailedプライマ^ "で増幅すればょレヽ。
<2> SeV- F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウィルスの F遺伝子 （SeV- F) を発現する Cre/loxP誘導型発現プラスミ ドの構築は SeV- F遺伝子を PCRで増幅し、 Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物 が誘導発現されるように設計されたプラスミ ド pCALNdlw (Arai, T. et al. , J. Virology 72, 1998， plll5-1121) のユニークサイト 5 a I部位に挿入し、 プラス ミド pCALNdLw/Fを構築する。
F遺伝子欠損ゲノムから感染ウィルス粒子を回収するため、 SeV - F蛋白を発現す るヘルパー細胞株を樹立する。 細胞は、 例えば SeVの増殖によく用いられているサ ル腎臓由来細胞株 LLC-MK2細胞を用いることができる。 LLC- MK2細胞は、 10%の熱 処理した不動化ゥシ胎児血清 (FBS)、 ぺニシリン Gナトリウム 50単位/ ml、 および ストレプトマイシン 50 i g/mlを添加した MEMで 37°C、 5% C02で培養する。 SeV- F 遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、 Cre DNAリコンビナーゼにより F遺伝子産 物を誘導発現されるように設計された上記プラスミド pCALNdLw/Fを、 リン酸カル シゥム法 （mammalian transfect ion kit (Stratagene) ) により、 周知のプロトコ ールに従って LLC- MK2細胞に遺伝子導入を行う。
10cmプレートを用い、 40%コンフルェントまで生育した LLC- MK2細胞に 10 gの プラスミ ド pCALNdLw/Fを導入後、 10mlの 10% FBSを含む MEM培地にて、 37°Cの 5 % C02 インキュベータ一中で 24時間培養する。 24時間後に細胞をはがし、 10ml培地 に懸濁後、 10cmシャーレ 5枚を用い、 5ml 1枚、 2ml 2枚、 0. 2ml 2枚に蒔き、 G418 (GIBC0-BRL)を 1200 g/mlを含む 10mlの 10%FBSを含む MEM培地にて培養を行レ、、 2 日毎に培地交換しながら、 14日間培養し、 遺伝子の安定導入株の選択を行う。 該 培地により生育してきた G418に耐性を示す細胞はクローニンダリングを用いて回 収する。 回収した各クローンは 10cmプレートでコンフルェントになるまで拡大培 養を続ける。
F蛋白質の発現誘導は、 細胞を 6cmシャーレにてコンフルェントまで生育させた 後、 アデノウイルス AxCANCreを斉藤らの方法 （Saito et al. , ucl. Acids Res. 23： 3816—3821 (1995); Arai, T. et al. , J. Virol 72， 1115 - 1121 (1998) ) によ り例えば moi=3 で感染させて行う。
く 3〉 F遺伝子欠失 SeVウィルスの再構築及び増幅
上記 pSeV18+/AF の外来遺伝子が挿入されたプラスミ ドを以下のようにして LLC- MK2細胞にトランスフエクションする。 LLC - MK2 細胞を 5X 106 cells/dish で 100mmのシャーレに播く。 T7 RNAポリメラーゼによりゲノム R Aの転写を行わせる 場合には、 細胞培養 24時間後、 ソラレン （psoralen) と長波長紫外線 （365nm) で 20分間処理した T7腿ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウィル ス （PLWUV— VacT7 ： Fuerst, T.R. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) を M0I 2程度で室温で 1時間感染させる。 ワクシニアウィルス への紫外線照射には、 例えば 15ヮットバルブを 5本が装備された UV Stratal inker 2400 (カタログ番号 400676 (100V) , ストラタジーン社， La Jolla, CA, USA) を 用いることができる。 細胞を無血清の MEMで洗浄した後、 ゲノム R Aを発現するプ ラスミ ド、 およびパラミクソウィルスのそれぞれ N、 P、 L、 F、 および HN蛋白質を 発現する発現プラスミ ドを、 適当なリポフエクシヨン試薬を用いてこの細胞にト ランスフヱタトする。 プラスミドの量比は、 これに限定されないが、 好適には順 に 6 : 2 : 1 : 2 : 2 : 2 とすることができる。 例えば、 12μδのゲノム RNAを発現す るプラスミ ド、 並びに N、 P、 L、 および Fプラス HN蛋白質を発現する発現プラスミ ド （pGEM/NP， pGEM/P, pGEM/L及び pGEM/F- HN; W000/70070, Kato, A. et al.， Genes Cells 1, 569 - 579 (1996) ) を、 それぞれ 12 /ig, μg, 4/ g及び
4〃gZdishの量比トランスフエタトする。 数時間培養後、 血清を含まない MEMで細 胞を 2回洗浄し、 40 ig/raLの Cytosine j3 -D-arabinofuranoside (AraC： Sigma, St. Louis, M0) 及ぴ 7.5 wg/mLの Trypsin (Gibco-BRL, Rockville, MD) を含む MEM で培養する。 これらの細胞を回収し、 ペレットを OptiMEM に懸濁する （107 cells/ml ) 。 凍結融解を 3 回繰り 返して lipofection reagent DOSPER (Boehringer mannheim)と混合し （106cells/25 w 1 DOSPER) 室温で 15分放置した 後、 上記でクローユングした F発現ヘルパー細胞にトランスフエクシヨン （ 106cells /well 12-well-plate ) し、 血清を含まない MEM ( 40/i g/ral AraC, 7. 5 z g/ml トリプシンを含む）で培養し、 上清を回収する。 F以外の遺伝子、 例え ば HNまたは M遺伝子を欠損したウィルスも、 これと同様の方法で調製することがで きる。
ウィルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、 例えば、 ベクターに含まれる ウィルスゲノム上で欠損しているウィルス遺伝子が異なる 2種またはそれ以上の ベクターを同じ細胞に導入すれば、 それぞれで欠損するウィルス蛋白質が、 他の ベクターからの発現により供給されるため、 互いに相補しあって感染力のあるゥ ィルス粒子が形成され、 複製サイクルがまわりウィルスベクターが増幅される。 すなわち、 2種またはそれ以上の本発明のベクターを、 ウィルス蛋白質を相捕す る組み合わせで接種すれば、 それぞれのウィルス遺伝子欠損型ウィルスべクタ一 の混合物を大量かつ低コストで生産することができる。 これらのウィルスは、 ゥ ィルス遺伝子が欠損しているため、 ウィルス遺伝子を欠損していないウィルスに 比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大きレ、外来遺伝子を保持することができ る。 また、 ウィルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウィルスは細胞外 で希釈され共感染の維持が困難であることから、 不稳ィ匕するため、 環境放出管理 上の利点がある。
本発明のパラミクソウィルスにより導入する外来遺伝子としては、 特に制限は ないが、 天然の蛋白質としては、 例えばホルモン、 サイトカイン、 増殖因子、 受 容体、 細胞内シグナル分子、 酵素、 ペプチドなどが挙げられる。 蛋白質は分泌蛋 白質、 膜蛋白質、 細胞質蛋白質、 核蛋白質などであり得る。 人工的な蛋白質とし ては、 例えば、 キメラ毒素などの融合蛋白質、 ドミナントネガティブ蛋白質 （受 容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む） 、 欠失型 の細胞接着分子および細胞表面分子などが挙げられる。 また、 分泌シグナル、 膜 局在化シグナル、 核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。 導入遺伝 子としてアンチセンス RNA分子または RNA切断型リボザィムなどを発現させて、 T細 胞で発現する特定の遺伝子の機能を抑制することもできる。 外来遺伝子として疾 患の治療用遺伝子を用いてウィルスベクターを調製すれば、 このベクターを投与 して遺伝子治療を行うことが可能となる。 本発明のウィルスベクターの遺伝子治 療への応用としては、 直接投与による遺伝子発現、 間接 （ex vivo) 投与による遺 伝子発現のいずれの方法によっても、 治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは 患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。 また本発明の方法は、 再生医療における遺伝子治療ベクターとしても利用できる なお、 複製性のパラミクソウィルスベクターを個体または細胞に投与後、 治療 が完了するなどウィルスベクターの増殖を抑止する必要が生じた際には、 R A依存 性 RNAポリメラーゼ阻害剤を投与すれば、 宿主に障害を与えずにウィルスベクター の増殖だけを特異的に抑止することもできる。
本明細書に記載したウイルス製造方法に従えば、 本発明のウィルスベクターは 、 例えば 1 X 105 CIU/raL以上、 好ましくは 1 X 106 CIU/mL以上、 より好ましくは 5 X 106 CIU/mL以上、 より好ましくは 1 X 107 CIU/mL以上、 より好ましくは 5 X 107 CIU/mL以上、 より好ましくは I X 108 CIU/mL以上、 より好ましくは 5 X 108 CIU/mL 以上の力価でウィルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。 ゥ ィルスの力価は、 本明細書おょぴ他に記載の方法により測定することができる （ Kiyotani, K. et al. , Virology 177 (1) , 65—74 (1990) ; W000/70070) 。
回収したパラミクソウィルスベクターは実質的に純粋になるよう精製すること ができる。 精製方法はフィルトレーシヨン （濾過） 、 遠心分離、 およびカラム精 製等を含む公知の精製 ·分離方法またはその組み合わせにより行うことができる 。 「実質的に純粋」 とは、 ウィルスベクターが、 それが存在する試料中の成分と して主要な割合を占めることを言う。 典型的には、 実質的に純粋なウィルスべク ターは、 試料中に含まれる全蛋白質 （但しキャリアーまたは安定剤として加えた 蛋白質は除く） のうち、 ウィルスベクター由来の蛋白質の割合力 10%以上、 好まし くは 20%以上、 より好ましくは 50%以上、 好ましくは 70%以上、 より好ましくは 80 %以上、 さらに好ましくは 90%以上を占めることにより確認することができる。 パラミクソウィルスの具体的な精製方法としては、 例えばセルロース硫酸エステ ルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法 （特公昭 62- 30752号公 報、 特公昭 62- 33879号公報、 およぴ特公昭 62- 30753号公報） 、 およびフコース硫 酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法 （W097/32010) 等を例示す ることができる。
ベクターを含む組成物の製造においては、 ベクターは必要に応じて薬理学的に 許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。 「薬学的に許容 される担体または媒体」 とは、 ベクターと共に投与することが可能であり、 ベタ ターによる遺伝子導入を有意に阻害しなレ、材料である。 例えばベクターを生理食 塩水、 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 、 または培養液などで適宜希釈して組成物と することができる。 ベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んで よい。 またベクターを含む組成物は、 脱イオン水、 5%デキストロース水溶液等の 担体または媒体を含んでいてもよい。 さらに、 その他にも、 植物油、 懸濁剤、 界 面活性剤、 安定剤、 殺生物剤等が含有されていてもよい。 また保存剤またはその 他の添加剤を添加することができる。 本発明のベクターを含む組成物は試薬とし て、 および医薬として有用である。
本発明のベタターを用いた T細胞への遺伝子導入は、 様々な疾患に対する遺伝子 治療に適用することが期待される。 このような遺伝子治療には、 例えば、 遺伝子 欠損による細胞での発現の異常を捕正するために、 また、 外来遺伝子を細胞に導 入することにより新しい機能を付加させるために、 あるいは、 ある遺伝子に対し て抑制的に働く遺伝子を導入することにより細胞における望ましくない作用を抑 制するために行い得る。
本発明の方法は、 例えば自己免疫疾患等において拒絶反応を抑制するために有 用である。 例えばァロ抗原、 あるいは自己免疫疾患の原因となる主要な抗原を認 識する活性化 T細胞樹立株を用いて、 その T細胞に本発明の方法に従って抑制性サ イト力イン、 例えば IL - 10等を強発現させることによって、 生体内の T細胞のァロ 反応を抑制、 あるいは抑制性榭状細胞の誘導により、 拒絶反応をコントロールで きると予想される。 また、 本発明の方法による T細胞への遺伝子導入を介した癌治 療も期待される。 例えば、 腫瘍特異的抗原を認識する T細胞に血管増殖抑制遺伝子 をコードするベクターを導入することにより、 局所の腫瘍増殖抑制効果が期待さ れる。 あるいは脱髄疾患である多発性硬化症などの場合にはそのターゲットとな る抗原で活性化した T細胞を用い、 oligodendrocyteを幹細胞より分化させ得る PDGF (platelet derived growth factor-A) などの遺伝子を導入し、 局所での oligodendrocyte再生を促し、 病勢のコントロールが可能と予想される （Vincent, K. T. et al. , Journal of Neuroiramunology, 2000, 107： 226-232) 。 その他にも 、 抗原活性化 T細胞あるいは抗原非特異的活性化 T細胞 （抗体またはマイトゲンを 使用する活性化 Τ細胞〉 を用い、 遺伝子導入することにより治療効果が期待される すべての疾患 ·傷害に対して、 本発明の方法を適用することが可能である。
パラミクソウィルスにより導入された遺伝子の転写は、 インターフェロン （ IFNs) などの宿主由来の因子により影響を受ける （Kato, A. et al. , J. Virol. , 2001, 75： 3802-3810) 。 ァロ抗原で刺激した T細胞株からは大量の IFNが産生され ることから、 IFN - γなどの IFNがパラミクソウィルスベクターからの遺伝子の転写 に影響を与える可能性がある （Biron, C. A. and Sen, G. C. , Interferons and other cytokine. In-' Fields BN, Knipe DM, Rowley PM, (eds) . Fields of virology. Vol. 2. し ippincott - Raven Publishers : Philadelphia, 1996. 321 - 351) 。 実際、 本発明者らは、 IFN -マ受容体欠損マウスからのァロ活性化 T細胞株 は、 3週間以上にわたって EGFPの比較的高い発現が持続することを見いだした。 従 つて、 T細胞を指向した遺伝子治療において、 標的遺伝子の高いレベルの発現が必 要な場合には、 IFN- γのシグナル伝達を抑制することが有効と考えられる。
ベクターの投与量は、 疾患、 患者の体重、 年齢、 性別、 症状、 投与目的、 投与 組成物の形態、 投与方法、 導入遺伝子等により異なるが、 当業者であれば適宜決 定することが可能である。 投与経路は適宜選択することができる。 また局所ある いは全身に投与し得る。 投与されるベクターは好ましくは約 105 CIU/mlから約 1011 CIU/ml、 より好ましくは約 107 CIU/mlから約 109 CIU/ml、 最も好ましくは約 1 X 108 CIU/mlから約 5 X 108 CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与するこ とが好ましい。 ヒトにおいては 1回当たりの投与量は 2 X 105 CIU〜 2 X 1011 CIU が好ましく、 投与回数は、 1回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可 能であり、 1 日の投与回数についても同様である。 ヒト以外の動物についても、 例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比 （例えば平均値 ) で上記の投与量を換算した量を投与することができる。 ェクスビポ投与の場合 は、 体外 （例えば試験管またはシャーレ内） で T細胞にベクターを接触させる。 M0Iは 1〜500の間で投与することが好ましく、 より好ましくは 2〜300、 さらに好ま しくは 3〜200である。 本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、 ヒト 、 サル、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ゥシ、 ィヌなど全ての哺乳動物が含 まれる。 図面の簡単な説明
' 図 1は、 マウス T細胞における SeVによる遺伝子導入効率を示す図である。 活性 化またはナイーブ T細胞における遺伝子導入効率を示す。 マウスリンパ球を 2. 5 X 107 PFU (MOI 62. 5) の SeV_EGFPの存在下または非存在下で 2日間培養し、 細 胞を回収して APC結合抗 CD3および PE結合抗 CD4 (上パネル）または抗 CD8 (下パネル ) 抗体で染色した。 ドットプロットは、 生存している CD3+ CD4+または CD3+ CD8+ リンパ球中のそれぞれ CD4または CD8と、 GFPの発現を示す。 四分割したそれぞれ の右上の隅に、 EGFP陽性細胞の割合として遺伝子導入効率を示した。 左のパネル ：抗体をコートしていないゥヱルで細胞を培養した。 中央のパネル：活性化抗体 (抗 CD3およぴ抗 CD28抗体） をコートしたゥエルで細胞を培養した。 右のパネル： 活性化抗体 （抗 CD3および抗 CD28抗体） をコートしたゥェルで、 SeV- EGFPなしで細 胞を培養した。 陰性対照として、 ルシフェラーゼを発現する SeV- luciと共に培養 した細胞からも類似したデータを取得した。 4回より多い独立した実験から、 再現 性のあるデータが得られた。
図 2は、 T細胞株への SeVによる遺伝子導入効率を示す図である。 T細胞株を 2. 5 X 107 PFU (M0I 62. 5) の SeV_EGFPの存在下または非存在下で 2日間培養し、 細 胞を回収して APC結合抗 CD3および PE結合抗 CD4 (上パネル）または抗 CD8 (下パネル ) 抗体で染色した。 最も左のパネルのドットプロットは、 ゲート（区分）された生 存しているリンパ球中の CD3および CD4または CD8の発現を示す。 それぞれの四分割 の割合が示されている。 他のパネルのドットプロットはゲ一トされた CD3陽性の生 存リンパ球中の CD4または CD8 T細胞の EGFPの発現を示す。 左から 2番目のパネルで は、 細胞を照射 B6スティミュレ一ター （刺激細胞） と共に培養した。 3番目のパネ ルでは、 細胞を照射 Balbんスティミュレ一ター （刺激細胞） と共に培養した。 最 後のパネルでは、 細胞を照射 Balbんスティミュレ一ター （刺激細胞） と共に SeV - EGFPなしで培養した。 4回より多い独立した実験から、 再現性のあるデータが得ら れた。
図 3は、 ナイーブ T細胞および T細胞株のァロ抗原特異的活性化における遺伝子 導入効率を示す図である。 ナイーブ 2Cリンパ球 （上パネル lx"の文字） または 2C T細胞株 （下パネル；" 3x"の文字） を 2. 5 X 107 PFU の SeV- EGFPの存在下または非存 在下で 2日間培養し、 細胞を回収して、 APC結合抗 CD8およびビォチン結合抗ク口ノ タイプ T細胞レセプター mAb (1B2) で染色し、 さらに PEストレプトアビジンで染 色した。 一番左のパネルは、 グートされた生存リンパ球中の CD8+ 1B2+ T細胞の割合 を示す。 他のパネルのドットプロットは、 生存しているクロノタイプ T細胞の EGFP の発現を示す。 左から 2番目のパネルでは、 細胞を照射 B6ステイミユレ一ター （刺 激細胞） と共に培養した。 3番目のパネルでは、 細胞を照射 Balbんスティミュレ一 ター （刺激細胞） と共に培養した。 最後のパネルでは、 細胞を照射 Balbんスティ ミュレ一ター （刺激細胞） と共に SeV-EGFPなしで培養した。 2回の独立した実験か ら、 再現性のあるデータが得られた。
図 4は、 SeVによる遺伝子導入におけるパイスタンダー活个生ィ匕の効果を示す図で ある。 50 /z lの 2Cナイーブリンパ球 （l X 107/ml) および 50 μ 1の B6ナイーブリン パ球 （l X 107/ml) を、 2. 5X 107 PFU の SeV- EGFPの存在下 （X軸の表示が +のもの） または非存在下 （X軸の表示が一のもの）、 100 t lの照射した Balbん （黒いパー）、 B6 (灰色のパー）、 または C3H (チェックのパー） リンパ球 （l X 107/ml) または リンパ球なし （白のパー） で 2日間刺激した。 ゲートされた生存している CD8+ 1B2+ T細胞から EGFP陽性細胞の割合を得た。 Y軸は EGFP陽性のクロノタイプ細胞の割合 を示す。 個々のデータは 3連にしたゥエル （n=3) の平均土標準誤差 (SEM) として 示し、 2回の独立した実験で類似した結果を得た。 C3Hで刺激した 2C T細胞と Balb/cで刺激した 2C T細胞との間には統計学的有意差 （p〈0. 01) があったが、 C3H で刺激した 2C T細胞と B6で刺激した 2C T細胞との間にはそれがなかった。 統計学 的有意性は一元配置分散分析法及ぴ Fisher' s PLSD testを用いて決定した。
図 5は、 SeV- EGFPにより遺伝子導入された T細胞の GFP発現の維持を示す図であ る。 2C- tgマウスからの T細胞株を、 SeV-EGFPの存在下、 B6 (左カラム） または Balb/c (右カラム） の照射したリンパ球で 6日間刺激し、 遺伝子導入した T細胞を 新しい培地で洗浄後、 SeVなしで、 照射した B6または Balbんスティミュレ一ターで 6または 7日間再刺激した。 ドットプロットは生存しているクロノタイプ T細胞中の EGFPの発現を示す。 四分割の各右上の隅の数字は、 day 13 (上パネル） および day 20 (中央パネル） における EGFP陽性または陰性のクロノタイプ T細胞の割合を 示す。 陰性対照として、 20日間刺激した非感染 2C T細胞株からのデータを示した (下パネル)。 データは 2回の独立した実験の代表例である。
図 6は、 ヒ ト T細胞への SeVによる遺伝子導入効率を示す図である。 活性化また はナイーブ T細胞における遺伝子導入効率を示す。 200 /z lのヒ ト リ ンパ球 (4 X 106/ml) を 2. 5 X 107 PFU (M0I 31) の SeV- EGFPの存在下または非存在下、 2日 間培養し、 細胞を回収して APC結合抗 CD3および PE結合抗 CD4 (上パネル）または抗 CD8 (下パネル） 抗体で染色した。 ドットプロットは、 生存している CD3+ CD4+また は CD3+ CD8+ Tリンパ球中のそれぞれ CD4または CD8と、 GFPの発現を示す。 遺伝子 導入効率は、 示されている T細胞中の EGFP陽性細胞の割合として示した。 左のパネ ル：抗体をコートしていないゥエルで細胞を培養した。 中央のパネル：活性化抗 体 （抗 CD3およぴ抗 CD28抗体） をコートしたゥエルで細胞を培養した。 右のパネル ：活性化抗体 （抗 CD3および抗 CD28抗体） をコートしたゥエルで、 SeV - EGFPなしで 細胞を培養した。 陰性対照として、 SeV - luciと共に培養した細胞からも同様にデ ータを取得した。 四分割の各右隅の数字はその集団の割合を示す。 4回より多い独 立した実験から、 再現性のあるデータが得られた。
図 7は、 ヒトナイーブまたはメモリー/活性化 T細胞への遺伝子導入の効率を示 す図である。 新しく単離した T細胞を抗体をコ一トしていないゥエルで SeV- EGFPと 共に 2日間培養し、 細胞を回収して APC結合抗 CD62L、 PE結合抗 CD3、 およぴビォチ ン化抗 CD45M抗体で染色し、 続いてストレプトァビジン PerCPで染色した。 左のパ ネルで、 ドットプロットはゲート（区分）された生存 CD3陽性 T細胞中の CD62Lおよび CD45RAの発現を示す。 右のパネルで、 ドットプロットは、 ナイーブ T細胞である CD62Lhighおよび CD45Mhigh T細胞中 （上パネル）、 またはメモリー/活性化 T細胞で あるその他の細胞中 （下パネル） の CD3および EGFPの発現を示す。 健常者ドナーか らの 3回の実験において再現性のあるデータが得られた。
図 8は、 ヒ ト T細胞株への遺伝子導入効率を示す図である。 ヒ ト T細胞株を図 6 のように SeV- EGFPの存在下または非存在下、 2日間培養し、 図 6のように解析した 。 CD4 (上パネル） あるいは CD8 (下パネル） T細胞中の EGFP発現割合を示した。 左 のパネル； 抗体をコートしてないゥエルで細胞を培養した。 中央パネル； 抗体 （ ヒト抗 CD3およびヒト抗 CD28抗体） をコートしたゥェルで細胞を培養した。 右パネ ル； 抗体 （ヒト抗 CD3およぴヒト抗 CD28抗体） をコートしたゥェルで SeV - EGFP非存 在下に細胞を培養した。
図 9は、 ナイーブまたは活性化 T細胞への SeVの侵入 （entry) の評価を示す図で ある。 B6リンパ球 （4X 106/ml) を UVで不活化した SeV- luciの存在下 （白おょぴ灰 色のパー） または非存在下 （黒のパー） で 30分 37°Cでインキュベートした後、 細 胞をよく洗浄し、 SeV- EGFP (M0I=62. 5) を共に 30分 37°Cでィンキュベートした。 細胞を 3回洗浄した後、 200 / lの細胞懸濁液 (2 X 106/ml) をマウス抗 CD3およぴマ ウス抗 CD28抗体をコートした活个生ィ匕ゥエル中でウィルスなしで 2日間培養した。 陽 対照として、 調製した細胞を 2. 5 X 107 PFUの SeV - EGFPと共に活性ィ匕ゥエル中で 2日間培養した （白いバー）。 回収した細胞は、 APC結合抗 CD3および PE結合抗 CD8抗 体で染色した。 ゲート (区分)した生存 CD3+ CD4+または CD3+ CD8+ T細胞から EGFP陽 性細胞の割合を得た。 Y軸は、 EGFP陽性の CD4 (左の 3つのバー） または CD8 (右 の 3つのパー） T細胞の割合を示す。 個々のデータは 3連にしたゥヱル （n=3) の平 均の割合土 SEMとして示した。 各群間で統計学的有意差があった （p〈0. 01)。 統計 学的有意性は一元配置分散分析法及ぴ Fisher' s PLSD testを用いて決定した。 図 1 0は、 ナイーブまたは活性化 T細胞への SeVの侵入 （entry) の評価を示す図 である。 B6リンパ球を SeV- EGFP (M0I=100) の非存在下 （X軸の一番左のスケール） または存在下 （X軸のその他のスケール）、 30分 4°Cでインキュベートし、 細胞をよ く洗浄し、 SeVなしで 0、 15、 30、 45、 および 90分 37°Cでインキュベートした。 3回洗浄後、 それぞれ図示した期間インキュベートした細胞を、 マウス抗 CD3およ ぴマウス抗 CD28抗体をコートした活' I"生ィ匕ゥエル中で 2日間培養した。 細胞を回収し 、 図 9に記載した通りに染色した （CD4 T細胞は黒い円、 CD8 T細胞は黒い四角） 。 陽性対照として、 調製した細胞を 2. 5 X 107 PFU (Μ0Ι=62· 5) の SeV - EGFPと共に培 養した （CD4 T細胞は白い円、 CD8 T細胞は白い四角） 。 値は 3連にしたゥヱル (n=3) の平均の割合土 SEMとして示した。 CD4 T細胞おょぴ CD8 T細胞の両方におい て、 37°C0分のインキュベーションにおける値と 15分のインキュベーションにおけ る値との間に統計学的有意差があった （p〈0. 01)。 さらに、 37°C0分のインキュべ ーシヨンにおける値と 90分のインキュベーションにおける値との間にも統計学的 有意差があった （Pく 0. 01)。 統計学的有意性は一元配置分散分析法及び Fisher' s PLSD testを用いて決定した。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。 なお、 本明細書中に引用された文献は、 本明細書の 一部として組み込まれる。 統計的有意性は一元配置分散分析法及び Fisher' s PLSD testを用いて決定した。 Pく 0. 05を統計的有意とした。 近交系雌 C57BL/6 (H-2b) (B6と略記する） 、 C3H (H- 2k)、 および雌 Balbん （H- 2d) マウス （Charles Riverグレードマウス） は KBTオリエンタル （Tosu, Japan) より得た。 クラス I MHC抗原 Ld反応性 T細胞レセプター （TCR) のトランスジェ -ッ クマウスである 2Cトランスジエニックマウス （2c- tg， H-2b) は文献 Sha， W. C. et al. , Nature, 1988, 335： 271-274 に記載されている。 マウスは全て人道的に 扱い、 特定病原菌フリーで維持し、 標準的なげつ歯類用の餌および水道水を与え た。 7から 9週齢のマウスを使用した。 動物実験は、 九州大学における動物実験倫 理委員会 （Co腿 itee of Ethics on Animal Experiments) および組み換え DNA実験 委員会 （Coramitee of Recombinant DNA Experiments) の検查を受け、 九州大学の
「動物実験ガイドライン」 に従って実施した。 また、 アメリカ国立衛生研究所 (National Institute of Health) の 「研究室動物のケアの原則」 （Principles of Laboratory Animal Care) およぴ 「研究室動物のケアおょぴ使用のための指針」 (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) にも従った。 組み換え SeVの構築
EGFP (クラゲ増強緑色蛍光蛋白質） 遺伝子またはホタルルシフェラーゼ遺伝子 を持つ SeV (それぞれ SeV-EGFPまたは SeV- luci) は、 文献の記載の通りに構築した
(Kato, A. et al. , Genes Cells, 1996, 1： 569 - 579 ; Sakai, Y. et al. , FEBS Lett. , 1999, 456： 221-226) 。 具体的には、 Not I 制限酵素部位を含む 18 bpの スぺーサー配列 5' - (G) - CGGCCGCAGATCTTCACG - 3' (配列番号： 3 ) を、 SeVのゲノ ムをコードする cDNAを含むベクターの 5'非翻訳領域とヌクレオ力プシド （N) 遺伝 子の開始コドンとの間に挿入した。 クローン化された SeVゲノム cDNAを含むこのべ クタ一には、 デルタ肝炎ウィルスのアンチゲノム鎖の自己切断型リポソーム部位 も含まれている。 foi l部位と、 外来遺伝子の発現のための新しい SeVの Eおよび S シグナル配列タグのセットを含むプライマーを用いて、 EGFP (SeV- EGFPについて ) またはルシフェラーゼ （SeV- luciについて） をコードする全 cDNAを PCRにより增 幅し、 上記のクローン化したゲノムの ^ I部位に挿入した。 錶型となる SeVゲノ ムの全長は、 外来遺伝子を含めて 6の倍数の塩基となるようにした （いわゆる" 6の ルール〃（rule of six) ) (Kolakofsky, D. et al. , J. Virol. , 1998, 72： 891- 899) 。 外来遺伝子を持つ铸型 SeVゲノム、 および N、 ホスホ （P) 、 およびラージ
(L) 蛋白質をコードするプラスミ ド (それぞれプラスミ ド pGEM- N， pGEM-P, お よび pGEM - L) を商業的に入手可能なカチォニックリピッドと複合体を形成させ、 ワクシニアウィルス vT7- 3と共に CV- 1または LLCMK細胞にコトランスフエク トした
(Fuerst, T. R. , Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1986, 83： 8122-8126) 。 40時 間後、 凍結融解を 3回繰り返して細胞を破枠し、 10日齢 （10- day- old) の発育鶏卵 の尿嚢 （chorioallantoic cavity) に注入した。 その後ウィルスを回収し、 鶏卵 中で 2回継代してワクシニアウィルスを除去した。 ニヮトリ赤血球を用いたへマグ ルチネーシヨンアツセィによりウィルスのタイターを決定し （Yonemitsu， Y. & Kaneda, Y. , Hemaggulutinating virus oi Japan - liposome - mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press : pp. 295 - 306, 1999) 、 ウィルスは使用するまで- 80°Cで保存した。
モノクローナル抗体 (mAb)
ピオチン化ヒト CD45 RA (HI 100) mAb、 ァロフィコシァニン （allophycocyanin; APC) 結合抗マウス CD3 (145- 2C11)、 マウス CD8 (53-6. 7) , およぴヒ ト CD62L (DREG - 56) mAb、 フィコエリスリン （PE) 結合抗ヒ ト CD3 (UCHT1)、 ヒト CD4 (RPA- T4)、 マウス CD4 (GK1. 5)、 およびマウス CD8 (53. 67) mAb、 PE結合ストレプトアビ ジン、 並びにペリジニンクロロフィル αプロテイン （perCP) 結合ストレプトアビ ジンは PharMingen (San Diego, CA, USA) より購入した。
APC結合抗ヒ ト CD3 (UCHT1) mAbは DAK0 (Kyoto, Japan) より購入した。 PE結合 抗ヒ ト CD8 (NU-Ts/c) mAb はニチレイ （Tokyo, Japan) より購入した。 抗 2Cクロ ノタイプ TCR決定因子 （anti 2C clonotypic TCR determinant) mAb は、 本発明者 らがハイプリ ドーマ (1B2) (Sha, W. C. et al. , Nature, 1988, 335 : 271-274) の；! ¾·養上清力 ら HiTrap protein G カラム (Amersham Pharmacia Bioscience Inc. , Buckinghamshire UK) を用いて精製し、 EZ_Link™ NHS-LC Biotin (PIERCE Biotechnology Inc. , Rockfold, IL， U. S. A. ) を用いてビォチン化した。
T細胞の活性化のために、 PharMingen (San Diego, CA, USA) より購入した精製 抗マウス CD3 (145-2C11)、 マウス CD28 (37. 51)、 ヒ ト CD3 (HIT3a)、 抗ヒ ト CD28 (CD28. 2) を用いた。
細胞の調製
20 raM Ν-2-hydroxyethylpiperazine-N' -2-ethanesulfonic acid (HEPES) , 0. 2% sodium bicarbonate, 50 2-mercaptoethanol (2- ME) , 10 μ g/ml gentamicine sodium, および 10% 熱不動化ゥシ胎児血清 （FBS) (ICN Biomedicals, Inc. , Arora, OH, U. S. A. ) を加えた RPMI 1640 (SIGMA, St. Louis, MO, U. S. A. ) 培地 を完全培地として用いた。
マウスリンパ球の調製のため、 脾臓、 リンパ節を回収し完全培地中、 氷上に保 持した。 脾臓およびリンパ節は、 培地中、 2枚のガラススライ ドの間で組織断片に 圧力をかけて破碑した。 細胞懸濁液をステンレスメッシュで濾過し、 培地で 2回洗 浄した。 赤血球は塩化アンモニゥム炭酸カリウムリシスパッファー （ammonium chloride potassium carbonate lysing buffer) 用いてリシスさせた。 ヒト末 梢血リ ンパ球 （PBL) については、 健常者ド^ -ーより血液を採取し、 Ficoll Paque™ Plus (Pharmacia Biotech Inc. , Wikstroms, Sweden; 4こより リ ンノヽ球 分離した。 標準的なトリパンブル一色素排除アツセィ系を用いて、 生存している 有核細胞をカウントした。
マウス及びヒ ト T細胞株の樹立
ァロ反応性 T細胞株を調製するため、 B6または 2C- tgマウスのリンパ球 （5 X 107) を、 30 Gy (137Cs； Gammacell 40, Atomic Energy of Canada Limited, Ottawa, Canada) を照射した Balb/cリンパ球 （5 X 107) と共に、 50 mlフラスコ （35-3014; FALCON, Beckton Dickinson Bioscience, Inc. , Franklin Lake, NJ, U. S. A. ) 中 、 総量 10 ml の RPMI 1640完全培地中で 6日間共培養した。 活性化したァロ反応性 T糸田月包は、 10 ng/ml のヒ ト IL一 2 (Immuno— Biological Laboratories Co. , Ltd, Fujioka, Japan) を添加して、 照射 Balb/cリンパ球により週ごとに刺激した。 こ の方法では、 B6から得られる T細胞株は、 ほとんどが CD8 T細胞からなることから 、 CD4 T細胞株を得るために、 B6の CD8を枯渴させた （CD8-depleted) リンパ球を 照射リンパ球で刺激した。 CD8を枯渴させたリンパ球の調製のため、 新しく単離し たリンパ球を抗マウス CD8 (Lyt-2. 2： Meiji, Tokyo, Japan) raAbと共に 30分 4°Cで イ ンキュベー ト し、 続レヽて Low- Tox™ - M Rabbit completent (Cedarlane, Ontario, Canada) と共に 50分 37°Cでインキュベートした。 3回以上刺激した、 B6 または 2C- tgのァロ抗原活性化 T細胞を、 マウス T細胞株として用いた。
ヒ ト T細胞株を調製するため、 ある健康人の末梢血リンパ球 （5 X 106) を別の健 康人の放射線照射 （30 Gy) 末梢血リンパ球（5 X 106) と 10 ng/ml の human IL- 2 存在下に 1 mlの RPMI- 1640感染培地中で 7日間共培養した。 その後、 7日間ごとに 少なくとも 2回のリンパ球による再刺激を行つたものを T細胞株として使用した。 フローサイトメ トリー解析
回収したマウス細胞を遠心分離し、 抗マウス CD16/32 mAbを産生する培養ハイブ リ ドーマ (2. 4G2； American type culture collection, Manassas, VA, U. S. A) の上清 50 μ 1と 30分 4。Cでインキュベートした。 ヒトリンパ球ではこのステップは 排除した。 細胞を完全培地で洗浄し、 mAbを様々に組み合わせて 30分 4°Cでインキ ュベートし、 その後完全培地で 2回洗浄した。 ピオチン化 mAbは PEストレプトアビ ジンまたは PerCPストレプトアビジンで検出した。 標識した細胞は FACS Caliberに より CellQuestプログラム （Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) および FL0WJ0プログラム （TREE STAR, Inc. , San Carlos, CA, USA) を用いて角军析した 。 サイトメ一ターにアプライする直前に、 死細胞を検出して排除するため 250 1 の細胞懸濁液に 125 ng の propidium iodide (PI) を加えた。 このステップは、 ヒ ト活性化/メモリー T細胞からのナイーブ T細胞の認識においては除外した。 EGFP は蛍光 1 (fluorescence 1) で検出した。 マウスまたはヒ トの実験において、 CD3+ CD4+ PI—細胞の集団を生存 CD4 T細胞と表し、 CD3+ CD8+ Pr細胞の集団を生存 CD8 T 細胞と表した。 トランスジエニッククロノタイプ T細胞である CD8+ 1B2+ ΡΓ細胞 を生存 2c T細胞と表した。 ナイーブヒト T細胞または活性化/メモリーヒト T細胞は 、 それぞれ CD62じ CD45RA+ CD3+細胞としてゲート（区分）されたものまたは CD3+細 胞の中のその他としてゲート（区分）されたものとした （Picker, L. J. et al. , J. Immunol. , 1993, 150 : 1105 - 1121 ; Ostrowski, M. A. et al. , J. Virol. , 1999， 73： 6430-6435) 。
マウスまたはヒ ト T細胞への SeVによる遺伝子送達
活性化またはナイーブ T細胞における遺伝子導入効率を評価するため、 抗マウス CD3 mAb (15 μ g/ml) および抗マウス CD28 mAb (20 μ g/ml) でコートした、 あるい はコートしていない 96ゥエル平底プレート （3860-096 ; IWAKI, Tokyo, Japan) 中 で、 200 z lのマウスリンパ球 （2 X 106/ml) の懸濁液を、 2. 5 X 107 plaque forming unit (PFU) の SeV- EGFPと共に 2日間培養した。 ヒトリンパ球では、 抗ヒト CD3 mAb (10 μ g/ml) およぴ抗ヒト CD28 mAb (10 μ g/ml) でコートした、 あるいはコートし ていない 96ゥヱル平底プレート中で、 200 ilのヒ ト末梢血リンパ球 （PBL) ( X106/ml) またはヒ ト T細胞株 (4X106/ml) の懸濁液を、 2.5X107 PFU の SeV- EGFPと共に 2日間培養した。 ァ口活性化 T細胞株の導入効率の評価では、 2.5 X 107 PFUの SeV- EGFPと共に 100 ilの B6または 2C- tgマウスの T細胞株 （2Xl06/ml) を B6 または Balbんマゥスの 30 Gyを照射したリンパ球 （1 X lOVml) 100 μ 1と 2日間共培 養するか、 あるいは 200//1の Β6または 2C- tgマウスの Τ細胞株 （2X106/ml) を抗体 (抗 CD3抗体および抗 CD28抗体） をコートした 96ゥエル平底プレートで 2日間、 2.5 X 107 PFUの SeV- EGFPと共培養して行つた。 ナイーブ T細胞のァ口抗原特異的活 性化における遺伝子導入効率の評価では、 2C- tgマウスカら新しく単離したリンパ 球を用いた。 別の実験では、 6X108 PFUの SeV-EGFPの存在下、 2C-tgマウスから の T細胞株 （2X106/ml) 2.5ml を B6または Balb/cマウスからの 30 Gy 照射リン パ球 （lX107/ml) 2.5ml で 6日間刺激し （3または 4日毎に、 半分の培地を新しい 培地に交換した） 、 遺伝子導入を行った T細胞を新しい培地で洗浄し、 SeVなしで 6 または 7日間、 照射 B6または Balb/cリンパ球で再刺激した （再刺激は 6または 7日毎 に行った） 。 パイスタンダー活性化の効果を評価するためには、 50μ1の 2Cナイ一 ブリンパ球 （lX107/ml) および 50 μΐの B6ナイーブリンパ球 （lX107/ml) の混合 液を、 2.5X107 PFU の SeV- EGFPの存在下、 100 μ 1 の照射 Balb/c、 B6、 または C3H リンパ球 （lX107/ml) 100 μΐ で 2日間刺激した。
各サンプルを 3つのゥヱルに重複させ、 5% C02 を含む湿大気中で 37°Cで培養し た。 SeVの感染後 48時間で EGFPの発現は最大となった。 適当な濃度の活性化 mABま たは最適ィ匕した用量の SeVを、 タイトレーシヨン実験により決定した。 最大の割合 で T細胞に EGFPを導入する SeVの最低の用量は、 多重感染度 （Multiplicity of infection; MOI) 12.5 であり、 500より高い M0Iの SeVは T細胞に対して細胞変性効 果 (cytopathic effect) を有していた。 ナイーブまたは活性化 T細胞への SeVの侵入 （entry) の評価
B6リ ンパ球 （4X 106/ml) を、 2000 raj の UV (UV crossl inker; Pharmacia Biotech Inc. , San Francisco, CA， USA) で不活化した SeV- luci (5 X 108 PFU/ml) の 1 : 1の比での存在下または非存在下、 30分 37°Cでインキュベートした後、 細胞を 完全培地でよく洗浄し、 SeV- EGFP (2. 5 X 108 PFU/ml) と 1： 1の比で 30分 37°Cでイン キュペートした。 3回洗浄した後、 200/ lの細胞懸濁液 (2 X 10Vml) を、 抗マウ ス CD3 mAb (15 μ g/ral) およぴ抗マウス CD28 mAb (20 μ g/ml) でコートした 96ゥェ ル平底プレート中で 2日間培養した。 最後の洗浄を行った培地中に混入している SeVは、 活性化ゥェル中の前処理していない T細胞に対してほとんど EGFPを導入す る能力がなかったことから、 この洗浄過程は十分であったことが確認された。 陽 性対照として、 調製した細胞を活性化ゥヱルにて、 2. 5 X 107 PFU の SeV- EGFPと共 に 2日間培養した。 ナイーブ T細胞からの接着した SeVの解離を調べるため、 10 ml の B6リンパ球 （2 X 106/ml) を 2 X 109 PFU の SeV- EGFPの存在下または非存在下、 30 分 4°Cでインキュベートし、 細胞を完全培地でよく洗浄した後、 SeVなしで 0、 15 、 30、 45、 および 90分 37°Cでインキュベートした。 3回洗浄した後、 細胞を活性 化ゥヱル中で 37°Cで 2日間培養した。 陽性対照として、 調製した細胞を 2. 5 X 107 PFU の SeV- EGFPと共に培養した。
[実施例 1 ] 組み換え SeVは高 、効率で EGFPを活性化 T細胞に導入する
センダイウィルスベクターが T細胞に EGFP遺伝子を導入できるかを調べた。 まず 、 マウスリンパ球を SeV- EGFP (M0I=62. 5) と共に 48時間培養した。 EGFP陽性の非 刺激マウス CD3+ CD4+または CD3+ CD8+ T細胞 （それぞれ CD4 T細胞または CD8 T細胞 とも称す） の割合は低かった一方 （それぞれ 0. 5〜： 1. 5%または 0· 8〜2. 0%) 、 固 着化した抗 CD3抗体おょぴ抗 CD28抗体を用いて非特異的に活性ィヒした CD3+ CD4+ま たは CD3+ CD8+ Τ細胞は高い強度で EGFPを発現し、 EGFP陽性細胞の割合は劇的に上 昇した （それぞれ 65〜85%または 70~92%) (図 1 ) 。 CD4 T細胞おょぴ CD8 T細 胞の両方の場合で、 EGFP陽性細胞の割合は SeVの用量依存的に上昇し、 ¾101が12. 5 の時にほぼプラトーのレベルに達した。
次に、 抗原で活性化した T細胞株への遺伝子送達が可能か否かを調べるため、 in vivoで免疫することなしに初代培養においてナイーブ Tリンパ球が応答し増殖する ことができる T細胞刺激抗原としてァロ抗原を用いた。 C57BL/6からの非改変リン パ球と Balb/cからの照射リンパ球との共培養により生成した T細胞株は、 ほとんど は CD8 T細胞からなるため、 CD8 T細胞を枯渴させたリンパ球を照射した刺激リン パ球と共培養して CD4 T細胞株を得た。 また、 これとは別に、 2c - tgマウスからの T 細胞 （2c T細胞） を用いたが、 これは Ld特異的 TCRを発現するナイーブ T細胞クロ ーンを大量に持っており、 抗原特異的な初代 T細胞の応答における遺伝子導入を観 察することが可能であった。 期待したように、 ァロ抗原で刺激した T細胞株は、 照 射を行つたァロジェニックなリンパ球の存在下、 SeVにより効率的に EGFPが導入さ れた (図 2 ) 。 さらに、 刺激するァロジェニックなリンパ球の非存在下でさえも 、 活性化 T細胞は効率的に遺伝子導入された （図 2 ) 。 この効果は、 CD4 T細胞お ょぴ CD8 T細胞の両者で共通していたが、 EGFP発現レベルおよび陽性細胞の割合は 、 CD8 T細胞株よりも CD4 T細胞株の方がわずかに低い傾向があった。 これらの知 見は、 SeVは T細胞に対し、 T細胞が活性化状態にあれば標的遺伝子を送達すること ができることを示している。
これらの知見を T細胞の抗原特異的応答において確認するため、 Ldに特異的に応 答し、 ナイーブな状態でも CD8+ 1B2+集団としてパルクのリンパ球の中から区別す ることが可能な、 2c-tgマウスからの T細胞を用いた。 ナイーブ 2c T細胞はァ口で ある Balb/c刺激細胞の存在下でのみ EGFPを非常に強く発現し、 シンジヱニックで ある B6刺激細胞ではほとんど発現が見られなかったが、 Balb/c刺激細胞で 3回以上 刺激し、 活性ィ匕した 2c T細胞に対しては、 B6あるいは Balbんの刺激細胞どちらの 存在下でも SeVは効率的に EGFPを導入した （図 3 ) 。 それに加え、 単純に T細胞株 を SeVと共にたつた 30分 37°Cでインキュベートしても、 EGFPを最大に発現させるの に十分であった （データ省略） 。 さらに、 SeVによるこの非常に強い導入が抗原特異的に活性ィヒした T細胞に限ら れるのかを明らかにするため、 以下のような実験を行った。 非抗原特異的 Τ細胞は 、 in vitro での強力なァロ応答のパイスタンダー効果により活性化され得る。 C3Hスティミュレ一ターではなく Balb/cスティミュレ一ターに応答することができ る抗原特異的 T細胞としてナイーブ 2c T細胞を用いた。 C57BL/6および 2Cナイーブ T 細胞の混合物からなるレスポンダー （応答細胞） を、 Balbん、 C57BL/6, C3H刺激 細胞、 または何もなしに共培養し、 2. 5 X 107 PFUの SeV- EGFPを培養ゥヱルに添加 した。 この培養系において、 混合リンパ球培養中で C57BL/6マウスからの T細胞が C3Hスティミュレーターに強く応答している時に、 SeV- EGFPにより 2c T細胞に EGFP 遺伝子が導入されるかを調べることができた。 C3H刺激細胞を用いると、 C57BL/6 T細胞の C3Hスティミュレーターに対する応答は起こっても、 2c T細胞に EGFPは導 入されず、 C57BL/6刺激細胞を用いた場合または刺激細胞を何も用いなかつた場合 と同様であった （図 4 ) 。 それに対して、 Balbんスティミュレ一ターを用いた場 合、 2c T細胞は EGFPを非常に強く発現した （図 4 ) 。 従って、 SeVによるこの遺伝 子導入は特異的な抗原で活性ィヒされた T細胞に限定されていた。
[実施例 2 ] 活性化 T細胞における SeVによる導入遺伝子の発現期間
次に、 導入遺伝子の in virtoでの維持について調べた。 活性化 2c T細胞をセン ダイウィルスと共培養し、 遺伝子導入された T細胞を Balbんスティミュレーターま たは C57BL/6スティミュレ一ターと in vitroで維持した。 EGFPの発現は、 48時間目 に発現がピークとなった後は、 発現レベルは急速に低下するものの、 少なくとも 20日間維持された （図 5および省略したデータ） 。 EGFPの発現レベルは、 Balb/c スティミュレ一ターにより抗原再刺激を行っても上昇しなかった。 これらの知見 は、 ァロ特異的活性化 T細胞株においても観察された （データ省略） 。
[実施例 3 ] 活性化ヒト T細胞およぴ T細胞株への遺伝子送達
健常者から新しく単離したヒ ト PBLを 2. 5 X 107 PFU の EGFP発現 SeVベクター (M0I=30) と共に 48時間培養した。 マウス T細胞の場合とは対照的に EGFPの発現強 度は比較的低レ、ものの、 刺激していないヒト CD3+ CD4+および CD3+ CD8+ T細胞にお いて比較的高い EGFP陽性率が得られた （それぞれ平均 =23. 1%、 範囲 15〜45%、 およぴ平均 =34. 0%、 範囲 18〜50%) (図 6 ) 。
本発明者らは、 活性化/メモリー T細胞の集団は、 特定病原菌フリー （Specific - Pathogen-Free) の条件下で維持されたマウスリンパ系組織におけるよりも、 ヒト PBLにおける方が高いという仮説を立てた。 活性化/メモリ一 T細胞からナイーブ T 細胞 （CD45RA+ CD62L+) を識別し、 これらの各 T細胞集団の EGFPの発現を解析した 。 期待したように、 EGFP陽性の活性化/メモリー T細胞中の EGFP陽性細胞の割合は 、 ナイーブ T細胞中の EGFP陽性細胞よりもはるかに高く、 ナイーブ T細胞中の EGFP 陽性細胞の割合は 4%よりも低かった （図 7 ) 。 マウス実験で示したように、 既に 抗原で活性化した T細胞は、 抗原刺激がなくても効率良く EGFPが導入されたことか ら、 活性化/メモリ一の表現型を有する T細胞中の活性化 T細胞が EGFPを発現したと 考えられた。 それに対して、 固着化した抗 CD3抗体おょぴ抗 CD28抗体で刺激した CD3+ CD4+または CD3+ CD8+ T細胞は強い強度で EGFPを発現し、 EGFP陽性細胞の割合 は高かった （それぞれ範囲 30〜69%または 50〜70%) (図 6 ) 。
ヒトァロ抗原刺激 T細胞株においては、 CD4または CD8 T細胞ともに固着化抗体存 在のもとでは、 それぞれ 97%または 98%と非常に効率のよい導入を示した （図 8 ) 。 この T細胞株についても、 単純に 30分 37°Cのインキュベートで EGFPを最大に発現 させるのに十分であった。
[実施例 4 ] ベクターの接着後の SeVの侵入 （entry) は活性化 T細胞では起こる 力 ナイーブ T細胞では起こらない .
SeVを介した活性化 T細胞特異的な遺伝子送達の考えられる機構を調べた。 遺伝 子導入の効率に影響し得る要因としては、 以下のようなものがありうる。 （i) SeV 特異的なレセプター （Markwell, M. A. and Paulson, J. C. , Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1980, 77： 5693 - 5697) 、 (ii) 融合のための考えられるコレセプタ 一 (Kumar, M. et al. , J. Virol. , 1997, 71 : 6398 - 6406; Eguchi, A. et al. , J. Biol. Chem. , 2000, 275： 17549-17555) 、 (iii) T細胞の活性化によるシグナ ル伝達の誘導、 これは SeVが侵入 （entry) した後の SeVの転写に影響し得る （ し ollins, P. L. et al. , Parainfluenza viruses. In-' Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds) . Fields of virology. Vol. 2. Lippincott - Raven Publishers : Philadelphia, 1996： 1205-1241) 。 これらを調べるため、 マウス T 細胞を用いた。 活性化したマウス Τリンパ球は SeVにより効率的に遺伝子導入され るが、 新しく単離したマウス Tリンパ球は SeVによりほとんど遺伝子導入されない ため、 マウス T細胞を用いたこれらの実験では、 活性化/メモリー T細胞からナイ一 ブ T細胞を細胞分離するプロセスは行わなかつた。
まず、 新しく単離したリンパ球を紫外線 （UV) で不活化した SeV-luci存在下 （ 前処理したナイーブ T細胞） または非存在下 （前処理しないナイーブ T細胞） で 60 分 37°Cでインキュベートし、 T細胞の特異的レセプターを干渉させ、 SeVの HNのノ ィラミニダーゼ活性によりシアル酸残基を遊離させた。 その後、 それら T細胞を SeV-EGFP (M0I=62. 5) と共に 30分 37°Cでインキュベートした。 続いて、 それら T細 胞を、 固着化した抗 CD3およぴ抗 CD28抗体で刺激し、 2日後に EGFPの発現レベルを 調べた。 SeV-EGFPで前処理したナイーブ T細胞においては、 続く活性化における CD4または CD8 T細胞の EGFP陽性細胞の割合は、 それぞれ 35%または 50%となった （ 図 9 ) 。 しかしながら、 UVで不活化した SeV_luciと共にインキュベートすると、 活性化 T細胞への EGFPの遺伝子導入は妨げられた。 不活化 SeV- luciとプレインキュ ベーションしても、 活性化の培養期間の間 SeV- EGFPと共に T細胞をィンキュベート するとほとんどのリンパ球は EGFPを発現したことから、 前処理した T細胞で EGFPが 発現しなかったのは、 T細胞の生存が低下したためではない （図 9 ) 。 この結果は 、 続くインキュベーション期間において SeVのための特異的レセプターが回復した ためであると考えられる。 さらに、 最後の洗浄培養液は、 改変していない活性化 T 細胞にほとんど EGFPを導入しなかった （データ省略） こと力 ら、 洗浄の過程が不 十分であった可能性は排除することができた。 これらの知見は、 SeVは遺伝子導入 のために T細胞上の特異的なレセプターを使用していることを示唆している。
Τ細胞と SeV - EGFPとのィンキュベーシヨンの時間を決定する予備的な実験におい て、 ィンキュベーション時間を延ばすと、 EGFP陽性 T細胞の割合が低下することが 観察された。 この観察から、 本発明者らは SeVはナイーブ T細胞に接着することは できるが、 恐らくコレセプターの欠損により融合できずに、 37°Cというノイラミ ニダーゼがよく働く温度でのインキュベーションにおいて、 自身がもつ HNのノィ ラミエダーゼ活性によりナイーブ T細胞から SeVが離れてしまうという仮説をたて た。 そこで、 新しく単離したリンパ球を、 ノィラミニダーゼがほとんど働かない I SeVがシアル酸残基に接着することはできる 4°Cで SeV - EGFP (MOI=100) とイン キュベートした後、 それらのリンパ球を新しい培地で図示した期間 37°Cでィンキ ュペートした （図 1 0 ) 。 その後、 細胞を 3回洗浄し、 それら T細胞を固着化した 抗 CD3およぴ抗 CD28抗体で刺激し、 2日後、 GFPの発現レベルを調べた。 この実験で は、 全ての T細胞が均一に活性ィ匕されたことから、 データは、 細胞のキナーゼ活性 などのような SeVの遺伝子発現に関連する要因には影響されず、 侵入 （entry) に 関連する要因によってのみ影響を受けた。 期待したように、 T細胞を 4°Cで一度ィ ンキュベートした後に活性化すると、 EGFP陽性の CD4または CD8 T細胞の割合は、 それぞれ 50%または 70%であった。 これに対して、 4°Cのインキュベーションに続い て 37°Cでィンキュベートすると、 EGFP陽性 T細胞の割合は時間依存的に減少した （ 図 1 0 ) 。 37°Cで 90分のインキュベーションにより EGFP陽性 T細胞の割合は最低に なり、 これは最後の洗浄後の培養液に混入している SeVと活性ィ匕ゥヱル中で共培養 した前処理なしの T細胞の割合と同等であった。 活性化のための培養期間の間 SeV - EGFPと共にィンキュベートした陽 ¾t対照の T細胞はすべて効率的に遺伝子導入され た。 さらに、 活十生化 T細胞を用いた場合、 30分 37°Cでインキュベートするだけで、 EGFP陽性 T細胞の割合は陽性対照と同じくらい高かった （データ省略） 。 侵入 (enter) した SeVがナイーブ T細胞から放出されることはありそうにないことから 、 これらの現象は、 SeVは活性化 T細胞に侵入 （enter) することができる一方、 ナ ィープ T細胞に接着することはできるが融合できないと説明することができる。 ベ クタ一粒子は、 ナイーブ Τリンパ球ではなく活性化 Τリンパ球に特異的にィンター ナリゼーシヨン （internalization; 内部化） が起こる可能性が高い。 産業上の利用の可能性
本発明により、 T細胞に効率的に遺伝子を導入することが可能となった。 T細胞 への遺伝子導入は、 免疫系が関与する様々な疾患の治療にとって重要であること から、 これらの疾患における、 T細胞を指向した遺伝子送達による改変戦略への本 発明の適用が期待される。

Claims

請求の範囲
1 . T細胞に遺伝子を導入する方法であって、 該遺伝子を保持するパラミクソウイ ルスべクターと活性化した Τ細胞とを接触させる工程を含む方法。
2 . パラミクソウィルスベクターがセンダイウィルスベクターである、 請求項 1 に記載の方法。
3 . 外来遺伝子が導入された Τ細胞の製造方法であって、 該遺伝子を保持するパラ ミクソウィルスベクターと活性ィ匕した Τ細胞とを接触させる工程を含む方法。
4 . パラミクソウィルスベクターがセンダイウィルスベクターである、 請求項 3 に記載の方法。
5 . 請求項 3または 4に記載の方法により製造された、 外来遺伝子が導入された Τ 細胞。
6 . 活性化 Τ細胞への遺伝子送達のために用いる、 パラミクソウィルスベクター。
7 . パラミクソウィルスベクターがセンダイウィルスベクターである、 請求項 6 に記載のベクター。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006085451A1 (ja) * 2005-02-08 2006-08-17 Dnavec Corporation 遺伝子導入造血細胞から血液細胞を再構築させる方法
US7101685B2 (en) 1995-11-01 2006-09-05 Dnavec Research Inc. Recombinant Sendai virus
US7226786B2 (en) 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
US7521043B2 (en) 2004-01-13 2009-04-21 Dnavec Research Inc. Gene therapy for tumors using minus-strand RNA viral vectors encoding immunostimulatory cytokines
US8889118B2 (en) 2004-06-24 2014-11-18 Dna Vec Research Inc. Anticancer agent containing dendritic cell having RNA virus transferred thereinto
US10017784B2 (en) 2005-10-28 2018-07-10 Id Pharma Co., Ltd. Gene transfer into airway epithelial stem cell by using lentiviral vector pseudotyped with RNA virus or DNA virus spike protein
JP2022507453A (ja) * 2018-11-14 2022-01-18 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｔ細胞送達のためのフソソーム組成物
JP2022513040A (ja) * 2018-11-14 2022-02-07 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド コンパートメント特異的カーゴ送達のための組成物および方法

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030166252A1 (en) * 1999-05-18 2003-09-04 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
US7314614B1 (en) 1999-11-02 2008-01-01 Dnavec Research, Inc. Recombinant sendai virus vector for introducing exogenous genes to airway epithelia
JP2002142770A (ja) * 2000-11-08 2002-05-21 Dnavec Research Inc 循環系への遺伝子送達用パラミクソウイルスベクター
ATE353954T1 (de) * 2002-10-11 2007-03-15 Sentoclone Therapeutics Ab Immuntherapie für krebs
JPWO2005001082A1 (ja) * 2003-06-30 2006-08-10 株式会社ディナベック研究所 高変異領域が改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ｒｎａウイルスベクター
KR101279748B1 (ko) * 2003-11-04 2013-07-04 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 유전자 도입된 수상세포의 제조방법
EP1715048A4 (en) * 2004-01-22 2007-02-07 Dnavec Research Inc PROCESS FOR PRODUCING A VIRAL VECTOR
AU2006258655A1 (en) * 2005-06-14 2006-12-21 Dnavec Corporation Method for production of antibody
JP5205275B2 (ja) * 2005-12-21 2013-06-05 セントクローネ インターナショナル エービー 散在性ガンの治療法
AU2006328945B2 (en) * 2005-12-21 2011-06-30 Sentoclone International Ab Method for treating malignant melanoma
US8206702B2 (en) * 2005-12-21 2012-06-26 Sentoclone International Ab Method for expansion of tumour-reactive T-lymphocytes for immunotherapy of patients with cancer
WO2007071410A1 (en) * 2005-12-21 2007-06-28 Sentoclone Ab Method for treating urinary bladder cancer
EP1983048A4 (en) * 2006-01-17 2009-04-22 Dnavec Corp NEW PROTEIN EXPRESSION SYSTEM
US7951365B2 (en) * 2007-06-27 2011-05-31 Deifiera Falun Ab Method for expansion of tumour-reactive T-lymphocytes for immunotherapy of patients with specific cancer types
WO2009021163A2 (en) * 2007-08-08 2009-02-12 University Of Rochester Enhancing gene transfer
CA2730050A1 (en) * 2008-07-18 2010-01-21 Sentoclone Ab Composition comprising in vitro expanded t-lymphocytes and vessel formation inhibitors suitable in the treatment of cancer
WO2010080032A2 (en) 2009-01-09 2010-07-15 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Bead-assisted viral transduction

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
AU7335196A (en) * 1995-10-31 1997-05-22 Dnavec Research Inc. (-)-strand rna virus vector having autonomously replicating activity
DK0863202T3 (da) * 1995-11-01 2010-09-27 Dnavec Research Inc Rekombinant Sendai-virus
US5962274A (en) * 1998-03-13 1999-10-05 Wake Forest University Viral vector directed to predetermined target cells
US6828138B1 (en) * 1998-08-11 2004-12-07 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus vector including a gene encoding a chemokine
US7226786B2 (en) * 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
US20030166252A1 (en) * 1999-05-18 2003-09-04 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
US20020169306A1 (en) * 1999-05-18 2002-11-14 Kaio Kitazato Envelope gene-deficient paramyxovirus vector
KR100776086B1 (ko) * 1999-09-06 2007-11-15 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 개변된 전사개시서열을 갖는 파라믹소바이러스
US7314614B1 (en) * 1999-11-02 2008-01-01 Dnavec Research, Inc. Recombinant sendai virus vector for introducing exogenous genes to airway epithelia
CN1418252A (zh) * 2000-01-19 2003-05-14 株式会社载体研究所 副粘病毒属载体在血管内基因转移中的用途
WO2001072340A1 (fr) * 2000-03-30 2001-10-04 Dnavec Research Inc. Vaccin contre le virus du sida, contenant un vecteur du virus de sendai
CA2322057A1 (en) * 2000-05-18 2001-11-18 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vectors used for transfer of foreign genes
JP4700888B2 (ja) * 2000-06-01 2011-06-15 株式会社ディナベック研究所 ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質を含むシュードタイプレトロウイルスベクター
AU2001266337A1 (en) * 2000-06-27 2002-01-08 Dnavec Research Inc. Virus vector for transferring gene into renal cells
AU2001290273A1 (en) * 2000-10-06 2002-04-22 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vector for transferring foreign gene into skeletal muscle
JP2002142770A (ja) * 2000-11-08 2002-05-21 Dnavec Research Inc 循環系への遺伝子送達用パラミクソウイルスベクター
CN100357443C (zh) * 2000-11-27 2007-12-26 株式会社载体研究所 编码血管生成基因的副粘病毒载体及其应用
CN1233154C (zh) * 2001-01-22 2005-12-21 马斯普罗电工株式会社 外来杂音混入防止装置和信号放大器、保护器、天线插头
US20060269529A1 (en) * 2002-05-07 2006-11-30 Niederman Thomas M Modified t lymphocytes and uses therefor
KR101279748B1 (ko) * 2003-11-04 2013-07-04 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 유전자 도입된 수상세포의 제조방법
CN1929867A (zh) * 2004-01-13 2007-03-14 株式会社载体研究所 肿瘤的基因治疗，即利用编码免疫刺激性细胞因子的单链负链rna病毒载体进行的治疗
AU2005257107A1 (en) * 2004-06-24 2006-01-05 Dnavec Research Inc. Anticancer agent containing dendritic cell having RNA virus transferred thereinto

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IKEDA A. ET AL: "Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue:Efficient gene transfer by brief exposure.", EXPERIMENTAL EYE RESEARCH, vol. 75, no. 1, July 2002 (2002-07-01), XP002973826 *
OKANO S. ET AL: "Recombinant Sendai virus vectors for activated T Lymphocytes", GENE THERAPY, vol. 10, no. 16, 2003, pages 1381 - 1391, XP002973825 *
SAKAI Y: "Accomodation of foreign genes into the sendai virus genome: sizes of inserted genes and viral replication.", FEBS LETTERS, vol. 456, 1999, pages 221 - 226, XP000887286 *
See also references of EP1561819A4 *
SHIOTANI A. ET AL: "Skeletal muscle regeneration after insulin-like growth factor I gene transferby recombinant Sendai virus vector.", GENE THERAPY, vol. 8, no. 14, 2001, pages 1043 - 1050, XP008007613 *
YONEMITSU Y. ET AL: "Efficient gene transfer to airway epithelium using recombinant Sendai virus", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 18, no. 9, 2000, pages 970 - 973, XP002165781 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7101685B2 (en) 1995-11-01 2006-09-05 Dnavec Research Inc. Recombinant Sendai virus
US7442544B2 (en) 1995-11-01 2008-10-28 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus
US7226786B2 (en) 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
US7521043B2 (en) 2004-01-13 2009-04-21 Dnavec Research Inc. Gene therapy for tumors using minus-strand RNA viral vectors encoding immunostimulatory cytokines
US8889118B2 (en) 2004-06-24 2014-11-18 Dna Vec Research Inc. Anticancer agent containing dendritic cell having RNA virus transferred thereinto
WO2006085451A1 (ja) * 2005-02-08 2006-08-17 Dnavec Corporation 遺伝子導入造血細胞から血液細胞を再構築させる方法
US10017784B2 (en) 2005-10-28 2018-07-10 Id Pharma Co., Ltd. Gene transfer into airway epithelial stem cell by using lentiviral vector pseudotyped with RNA virus or DNA virus spike protein
JP2022507453A (ja) * 2018-11-14 2022-01-18 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｔ細胞送達のためのフソソーム組成物
JP2022513040A (ja) * 2018-11-14 2022-02-07 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド コンパートメント特異的カーゴ送達のための組成物および方法

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