WO2006001120A1 - マイナス鎖rnaウイルスを含む抗癌剤 - Google Patents

マイナス鎖rnaウイルスを含む抗癌剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2006001120A1
WO2006001120A1 PCT/JP2005/008124 JP2005008124W WO2006001120A1 WO 2006001120 A1 WO2006001120 A1 WO 2006001120A1 JP 2005008124 W JP2005008124 W JP 2005008124W WO 2006001120 A1 WO2006001120 A1 WO 2006001120A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
virus
gene
minus
protein
strand rna
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/008124
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shinji Okano
Yoshikazu Yonemitsu
Katsuo Sueishi
Satoko Shibata
Mamoru Hasegawa
Haruhiko Kondo
Original Assignee
Dnavec Research Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/JP2004/016089 external-priority patent/WO2005042737A1/ja
Application filed by Dnavec Research Inc. filed Critical Dnavec Research Inc.
Priority to AU2005257105A priority Critical patent/AU2005257105A1/en
Priority to CA002571844A priority patent/CA2571844A1/en
Priority to JP2006528383A priority patent/JPWO2006001120A1/ja
Priority to US11/630,522 priority patent/US20080031855A1/en
Priority to EP05736740A priority patent/EP1775342A4/en
Publication of WO2006001120A1 publication Critical patent/WO2006001120A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464408—Platelet-derived growth factor receptors [PDGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464454—Enzymes
    • A61K39/464456—Tyrosinase or tyrosinase related proteinases [TRP-1 or TRP-2]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A61K39/464492—Glycoprotein 100 [Gp100]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464499—Undefined tumor antigens, e.g. tumor lysate or antigens targeted by cells isolated from tumor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18832—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18871—Demonstrated in vivo effect

Definitions

  • Anticancer agents including negative-strand RNA viruses
  • the present invention relates to the field of cancer therapy.
  • Viral therapy is a treatment that cures tumors by infecting tumor cells with proliferating viruses such as HSV-1 and adenovirus, and killing the virus by the virus-killing effect associated with virus growth.
  • proliferating viruses such as HSV-1 and adenovirus
  • the proliferating virus for tumor treatment is a mutant virus in which the virus genome has been genetically engineered, and has minimal pathogenicity in normal human tissues while maintaining replication in the tumor. It is held to the limit.
  • the therapeutic propagating virus that infects tumor cells replicates within the cell, and in the process, the infected cell dies. The propagated virus re-infects surrounding tumor cells, spreading the antitumor effect (Alemany R. et al., Replicative adenoviruses for cancer therapy. Nat BiotechnoL, 2000,
  • Viral therapy for cancer can be used in combination with conventional therapies such as surgery 'radiotherapy' chemotherapy, can be applied to solid cancer in general, it can be administered repeatedly, cytokines, etc.
  • the therapeutic range can be directly integrated into the viral genome to enhance the anti-tumor effect. If more effective virus therapy can be developed, it is expected to make a significant contribution to cancer treatment.
  • Patent Document 1 Alemany R. et ai., Replicative adenoviruses for cancer therapy. Nat BiotechnoL, 2000, 18: 723-727
  • Non-Special Terms 2 Curiel, DT, The development of conditionally replicative adenoviruses for cancer therapy., Clin Cancer Res., 2000, 6: 3395-9
  • Patent Literature 3 Kirn, D., Virotherapy for cancer: Current status, hurdles, and future directions., Cancer Gene Therapy, 2002, 9: 959-960
  • Non-Patent Document 4 Mineta T. et al., Attenuated multi-mutated herpes simplex virus-1 for the treatment of malignant gliomas. Nat Med, 1995, 1: 938-943
  • An object of the present invention is to provide a more effective viral therapy for cancer and an anticancer agent. More specifically, the present invention provides a method for producing an anticancer agent containing a minus-strand RNA virus and a method for treating cancer using the minus-strand RNA virus.
  • RNA virus In order to verify the therapeutic effect on tumors caused by in vivo administration of RNA virus, the present inventors conducted experiments using mice inoculated subcutaneously with a melanoma cell line. As a result, it was found that a tumor size was significantly reduced by injecting a minus-strand RNA virus having no therapeutic gene into the tumor of the animal. That is, it was found that in vivo administration of a minus-strand RNA virus exerts an antitumor effect even when the virus has no therapeutic gene.
  • Negative strand RNA viruses are considered to be effective anticancer agents themselves.
  • an effective antitumor effect can be expected by directly injecting the virus into a tumor site (cancer tissue), and the virus is useful for cancer treatment.
  • the present invention relates to an anticancer agent containing a minus-strand RNA virus, a method for producing the anticancer agent, and a method for suppressing cancer using the RNA virus, and more specifically relates to the invention described in each claim. .
  • inventions composed of one or more combinations of the inventions recited in the claims that refer to the same claim are already intended for the inventions recited in those claims. That is, the present invention
  • anti-cancer agent including minus-strand RNA virus
  • the minus-strand RNA virus does not encode a foreign protein, the anticancer agent according to [1], [3] the minus-strand RNA virus is an infectious or non-infectious virus particle, [1] or Is an anticancer agent according to [2],
  • RNA virus is a genomic RNA-protein complex
  • the paramyxovirus is Sendai virus, the anticancer agent according to [5],
  • a method for producing an anticancer agent comprising the step of mixing a minus-strand RNA virus with a pharmaceutically acceptable carrier or medium,
  • a method for suppressing cancer comprising a step of administering a minus-strand RNA virus to a cancer tissue.
  • FIG. 1 is a graph showing the therapeutic effect on melanoma by in vivo administration of GFP-expressing SeV, soluble FGF receptor-expressing SeV, or soluble PDGFRa-expressing SeV.
  • FIG. 2 is a graph showing a growth curve of B 16 melanoma cells inoculated subcutaneously.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of 51 Cr release assembly of YAC_1 target cells.
  • FIG. 4 shows the results of 51 Cr release assembly of TRP2 peptide + EL-4.
  • RNA virus refers to a virus having an RNA genome.
  • the RNA virus used as the active ingredient of the anticancer agent of the present invention is preferably a minus-strand RNA virus.
  • a minus-strand RNA virus is a virus that contains minus-strand RNA (an antisense strand against a sense strand encoding a viral protein) as a genome. Negative strand RNA is also called negative strand RNA. Examples of minus-strand RNA viruses used in the present invention include single-strand minus-strand RNA viruses (also referred to as non-segmented minus-strand RNA viruses).
  • a “single-stranded negative strand RNA virus” refers to a virus having a single-stranded negative strand [ie, minus strand] RNA in the genome.
  • unoinoles include noramixouinoles (including Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, and Pneumovirus genera), Ravine Inoles ( Rhabdoviridae; including the genus Vesiculovirus, Lyssavirus, and Ephemerovirus), Filoviridae, Fierynovirone (including Orthomyxoviridae; Infuluenza virus A, B, C, and Thogoto-like viruses), Bunyaviridae;
  • viruses belonging to the family such as Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, and Phlebovirus) and Arenaviridae.
  • minus-strand RNA viruses preferably used in the present invention include Sendai virus of the Paramyxoviridae virus.
  • Other examples include Newcastle disease virus, Mumps virus, Measles virus, RS virus
  • canine distemper virus (CDV) dolphin molbillivirus (DMV), peste-des-petits-ruminants virus (PDPR), measles virus (MV), rinderpest virus (RPV), Hendra virus (Hendra), Nipah virus (Nipah), human parainfluenza virus-2 (HPIV-2), simian parainfluenza virus 5 (SV5), human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a), human parainfluenza virus_4b (HPIV_4b), mumps virus (Mumps), and Newcastle disease virus (NDV) Etc.
  • SeV Sendai virus
  • HPIV-1 human parainfluenza virus-1
  • HPIV_3 human parainfluenza virus-3
  • PDV
  • Sendai virus SeV
  • human parainfluenza virus-1 HPIV-1
  • human parainfluenza virus-3 HPIV-3
  • phocine distemper virus PDV
  • canine distemper virus CDV
  • dolphin molbillivirus DMV
  • Peste des—petites-ruminants virus (PDPR), measles virus (MV), rinderpest virus (RPV), Hendra virus (Hendra), and Nipah virus (Nipah).
  • the Paramyxovirus subfamily (Respirovirus, Rubravirus, and Or a derivative thereof, more preferably a virus belonging to the genus Respirovirus (also referred to as Paramyxovirus) or a derivative thereof.
  • Derivatives include viruses in which viral genes have been altered, chemically modified viruses, etc. so as not to impair the gene transfer ability of the viruses.
  • respirovirus viruses to which the present invention can be applied include human parainfluenza virus type 1 (HPIV_1), human parainfluenza virus type 3 (HPIV-3), and ushiparainfluenza virus type 3 (BPIV-3).
  • Sendai virus also called mouse parainfluenza virus type 1
  • SPIV-10 sarpaline fluenza virus type 10
  • the minus-strand RNA virus of the present invention is most preferably Sendai virus.
  • the minus-strand RNA virus in the present invention may be derived from a natural strain, a wild strain, a mutant strain, a laboratory passage strain, an artificially constructed strain, and the like. That is, the minus-strand RNA virus may be a minus-strand RNA virus isolated from nature or a minus-strand RNA virus artificially created by genetic recombination. Moreover, as long as it retains the ability to replicate genomic RNA in infected cells, any gene of the wild-type minus-strand RNA virus may be mutated or deleted. For example, a minus-strand RNA virus having a mutation or deletion in at least one gene encoding an envelope protein or outer shell protein of a minus-strand RNA virus can be preferably used.
  • minus-strand RNA viruses can replicate the RNA genome in infected cells, but cannot form infectious virus particles. Therefore, safety is high because there is no concern about spreading infection around.
  • a minus-strand RNA virus that does not contain at least one gene encoding an envelope protein such as F, H, HN, or G, or a spike protein, or a combination thereof can be used (WO00 / 70055 and And WO00 / 70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000)).
  • Genomic RNA can be amplified in infected cells if it encodes proteins necessary for genome replication (eg, N, P, and L proteins) in genomic RNA.
  • a defective gene product or a protein capable of complementing it is supplied exogenously in the virus-producing cell (WO00 / 70055 and WO00 / 70070; Li, H.-O. et al, J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000)).
  • a non-infectious virus particle VLP can be obtained even if it does not have a gene encoding a spike protein such as F protein or HN protein if the virus has an M protein gene.
  • VLP since released, it is possible to produce the VLP without complementing the viral proteins (WO00 / 70070) o in addition, even without anything-enveloped protein gene, N, L, P protein, and genomic Since RNP consisting of RNA can be amplified in the cell, RNP can be recovered from the Itoda lysate by centrifugation or the like.
  • the anticancer agent of the present invention can also be produced using a mutant RNA virus.
  • RNA viruses having these temperature-sensitive mutant protein genes can be suitably used in the present invention.
  • a temperature-sensitive mutation is a mutation whose activity is significantly reduced at a normal temperature (eg, 37 ° C. to 38 ° C.) of a virus host compared to a low temperature (eg, 30 ° C. to 32 ° C.).
  • a normal temperature eg, 37 ° C. to 38 ° C.
  • a low temperature eg, 30 ° C. to 32 ° C.
  • the temperature-sensitive mutation of the M gene of the minus-strand RNA virus includes amino acid substitution at a site arbitrarily selected from the group consisting of G69, T116, and A183 in the Sendai virus M protein (Inoue, M. et al., J. Virol. 2003, 77: 3238-3246). Amino acids in other minus-strand RNA virus M protein homologous sites can be easily identified.
  • the human parainfluenza virus-1 is the homologous site of the M protein corresponding to G69 of the SeV M protein.
  • HPIV-l in parentheses abbreviations
  • G69 human parainfluenza virus-3 (HPIV-3) G73
  • PDV pnocine distemper virus
  • CDV canine distemper virus
  • DMV dolphin molbillivirus
  • PDPR dolphin molbillivirus
  • MV measles virus
  • the homologous site of each M protein corresponding to T116 of SeV M protein As for human parainfluenza virus-1 (HPIV-l) fc T116, human parainfluenza virus-3 (HPIV-3) T120, phocine distemper virus (PDV) and canine distemper virus (CDV) T104 for T104, dolphin molbillivirus (DMV), T104 for peste-des-petits-ruminants virus (PDPR), measles virus (MV) and rinderpest virus (RPV), Hendra virus (Hendra) and Nipah virus (Nipah ) T120, human parainfluenza virus-2 (HPIV-2) and simian parainfluenza virus 5 (SV5) T117, human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a) and human parainfluenza virus_4b (HPIV_4b) T121 T119 for mumps virus (Mumps) and S120 for Newcastle disease virus (NDV).
  • HPIV-l human parain
  • the homologous site of each M protein corresponding to A183 of SeV M protein is A183 for human parainfluenza virus-1 (HPIV-1), F187 for human parainfluenza virus-3 (HPIV-3), phocine distemper virus FlPD for PDV and canine distemper virus (CDV), Y172 for dolphin molbillivirus (DMV), peste-des-petits-ruminants virus (PDPR), measles virus (MV) and rinderpest virus (RPV) Y187 for Hendra virus (Hendra) and Nipah virus (Nipah), Y184 for human parainfluenza virus-2 (HPIV-2), F184 for simian parainfluenza virus 5 (SV5), human parainfluenza virus- F188 for 4a (HPIV-4a) and human parainfluenza virus-4b (HPIV-4b), F186 for mumps virus (Mumps), and Y187 for Newcastle disease virus (NDV).
  • HPIV-1 human parainfluenza virus-1
  • each M protein is a mutant M protein in which any one of the above three sites, preferably a combination of any two sites, and more preferably all of the three sites are substituted with other amino acids.
  • a virus having a genome encoding is preferably used in the present invention.
  • Amino acid mutations are preferably substituted with other amino acids with different side chain chemistry, such as the BLOSUM62 matrix (Henikoff, S. and Henikoff, JG (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 -10919) is substituted with an amino acid having a value of 3 or less, preferably 2 or less, more preferably 1 or less, more preferably 0 or less.
  • the homologous sites of Sendai virus M protein G69, T116, and A183 or other viral sputum proteins can be replaced with Glu (E), Ala (A), and Ser (S), respectively.
  • Mutation can be introduced according to a known mutation introduction method using, for example, oligonucleotide.
  • the temperature-sensitive mutation of the HN gene includes, for example, amino acid substitution at a site arbitrarily selected from the group consisting of A262, G264, and K461 of Sendai virus HN protein (Inoue, ⁇ et al. "J. Virol. 2003, 77: 3238-3246).
  • a preferred example is Sendai virus HN protein A262, G264, and K461 or other viral HN protein homologous sites, Thr (T), Arg, respectively) , And Gly (G)
  • Urabe AM9 of mumps virus amino acids 464 and 468 of the HN protein can be mutated (Wright, KE et al. al., Virus Res. 2000: 67; 49-57).
  • the minus-strand RNA virus may have a mutation in the P gene or L gene.
  • mutations include SeV P protein 86th Glu (E86) mutation, SeV P protein 511st Leu (L511) substitution to other amino acids, or other negative strands.
  • RNA virus P protein homologous site replacement Specific examples include substitution of the 86th amino acid with Lys and substitution of the 511st amino acid with Phe.
  • Mutations in the P and L genes can significantly enhance the effects of persistent infectivity, suppression of secondary particle release, or suppression of cytotoxicity. Furthermore, by combining mutations and / or deletions in the envelope protein gene, these effects can be dramatically increased.
  • a virus containing a protein that is different from the envelope protein inherent in the virus may be used.
  • a virus containing this can be produced by expressing a desired foreign envelope protein in a virus-producing cell during the production of virus.
  • a desired protein that imparts the ability to infect mammalian cells is not particularly limited. Specifically examples thereof include vesicular stomatitis virus (V;> V protein, VSV-G).
  • V vesicular stomatitis virus
  • VSV-G protein may be derived from any VSV strain.
  • VSV-G protein derived from Indiana serotype strain J. Virology 39: 519-528 (1981)
  • the minus-strand RNA virus used in the present invention can contain any combination of envelope proteins derived from other viruses.
  • the minus-strand RNA virus of the present invention is characterized by having an anticancer activity by itself. That is, the minus-strand RNA virus does not need to have a foreign protein or a nucleic acid encoding the protein. Therefore, the present invention relates to an anticancer agent containing a minus-strand RNA virus that does not encode a foreign protein.
  • the minus-strand RNA virus of the present invention may or may not encode a foreign protein or foreign gene in the genomic RNA.
  • a negative-strand RNA virus that does not encode a foreign protein exerts its anticancer (anticancer) action, so a foreign gene is not always necessary.
  • the present invention has an advantage that desired negative-strand RNA viruses such as wild-type negative-strand RNA viruses and negative-strand RNA viruses (including mutants) isolated from nature can be used.
  • desired negative-strand RNA viruses such as wild-type negative-strand RNA viruses and negative-strand RNA viruses (including mutants) isolated from nature
  • an RNA virus used in the present invention an RNA virus that does not encode a protein having a cancer therapeutic effect can be used.
  • viruses include RNA viruses that encode desired foreign proteins that do not have cancer therapeutic effects.
  • GFP green fluorescent protein
  • luciferase various peptides RNA viruses that code for marker proteins such as tags
  • the anticancer (anticancer) action can be further enhanced by further incorporating a foreign protein or foreign gene that helps the anticancer (anticancer) action into the minus-strand RNA virus.
  • Recombination of a recombinant negative-strand RNA virus having a foreign gene may be performed using a known method.
  • the specific procedure is typically as follows: (a) the step of transcribing the cDNA encoding the minus-strand RNA virus genomic RNA in a cell expressing the viral protein necessary for virus particle formation; (b) the virus produced The step of recovering the culture supernatant containing The viral protein may be expressed as a transcribed viral genomic RNA force or may be supplied to trans from other than genomic RNA. In genomic RNA If the virus gene required for particle formation is deficient, the virus gene is separately expressed in virus-producing cells to complement particle formation.
  • a vector in which DNA encoding the protein or genomic RNA is linked downstream of an appropriate promoter that functions in the host cell is introduced into the host cell.
  • the transcribed genomic RNA is replicated in the presence of viral proteins to form infectious viral particles.
  • the defective protein or another viral protein capable of complementing its function is expressed in virus-producing cells.
  • the production of the minus-strand RNA virus of the present invention can be carried out using the following known methods (W097 / 16539; W097 / 16538; WO00 / 70055; WO00 / 70070; WO01 / 18223).
  • minus-strand RNA viruses including Paline fluenza, vesicular stomatitis virus, rabies virus, measles virus, Linda pestowinoles and Sendai virus can be reconstituted from DNA.
  • a minus-strand RNA virus particularly a single-strand minus-strand RNA virus, more preferably a Paramyxoviridae virus, and more preferably a Respirovirus virus can be suitably used.
  • the foreign gene to be loaded on the minus-strand RNA virus is not particularly limited, but natural proteins include, for example, hormones, cytosines, growth factors, receptors, intracellular signal molecules, enzymes , Antibodies (including full-length antibodies, antibody fragments such as Fab, single chain antibodies, etc.), peptides and the like. Proteins are secreted proteins, membrane proteins, cytoplasmic proteins, nuclear proteins It can be white matter. Artificial proteins include, for example, fusion proteins such as chimeric toxins, dominant negative proteins (including soluble receptors or membrane-bound dominant negative receptors), deletion-type cell adhesion molecules and cell surface molecules. And so on.
  • It may also be a protein with added secretion signal, membrane localization signal, nuclear translocation signal or the like. It is also possible to suppress the function of a specific gene by expressing an antisense RNA molecule or RNA-cleaving ribozyme as a transgene. If a virus is prepared using a therapeutic gene exhibiting anticancer activity as a foreign gene, it becomes possible to further enhance the anticancer activity.
  • FGF2 fibroblast growth factor 2
  • ECGF endothelial cells Endothelial cell growth factor
  • VPF vascular endothelial growth factor
  • Circulation 90 (5 Pt 2): II228-34, 1994; Takeshita, S. et al., J. Clin. Invest. 93 (2): 662- 70, 1994), hepatocyte growth factor / scatter factor (hepatocyte growth
  • HGF / scatter factor HGF / scatter factor
  • a gene encoding a secreted protein that inhibits the action of these signal molecules can be used as a foreign gene.
  • a minus-strand RNA virus encoding a soluble polypeptide of the FGF receptor FGF-R
  • a negative-strand RNA virus encoding soluble FGF-R is preferably used in the present invention.
  • soluble FGF-R natural soluble FGF-R can be used, or a fragment composed of the extracellular domain of membrane-bound FGF_R (such as FGF-R1) can be used.
  • Hanneken and A. Baird Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol 36, 1192—1196, 1995; Takaishi, S. et al., Biochem Biophys Res Commun "267 (2): 658-62, 2000; Seno M, et al., Cytokine, 10 (4): 290-4, 1998; Hanneken, Tsuji, FEBS Lett. 489: 176, 2001).
  • RNA viruses into which a gene encoding site force-in has been introduced are also useful because the expression of site force-in enhances the immune system and enhances the immune response against cancer. is there.
  • a minus-strand RNA virus carrying a gene encoding an immunostimulatory site force-in becomes an anticancer agent having an effective tumor immunity-inducing action.
  • immunostimulatory cytokines include interleukins (e.g.
  • interferons eg, IFN_alpha, IFN_beta, IFN-gamma
  • TGF tumor necrosis factor
  • TGF tumor necrosis factor
  • TGF transforming growth factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • Flt_3 Includes ligands, Fas ligands, and c-kit ligands, as well as other immunoregulatory proteins such as chemokines and costaemia molecules.
  • IL-4 for example, Arai et al. (1989), J. Immunol. 142 (1) 274-282
  • IL-6 For example, Yasukawa et al. (1987), EMBO J., 6 (10): 2939-2945, IL-12, for example, Wol (1991), J. Immunol. 146 (9): 3074-3081
  • IFN-alpha is, for example, Gren et al. (1984) J. Interferon Res. 4 (4): 609-617, and Weismann et al. (1982) Princess Takamatsu Symp.
  • IFN-beta is, for example, Accession number Examples include a sequence containing the 139th-636th sequence of NM_002176 (amino acid sequence is 22nd-187th of NP_002167) (Derynck, R. et al, Nature 285, 542-547 (1980); Higashi, Y. et al. , J. Biol. Chem. 258, 9522-9529 (1983); Kuga, T. et al, Nucleic Acids Res. 17, 3291 (1989)).
  • TNF is, for example, Pennica et al. (1984) Nature 312: 724-729
  • G-CSF is, for example, Hirano et al.
  • GM-CSF is, for example, Cantrell et al. (1985). Pro Natl. Acad. Sci. (USA) 82 (18): 6250-6254. More specifically, examples of the nucleic acid sequence encoding GM-CSF include a sequence containing the 84th to 461st positions of Accession number NM_000758 (amino acid sequence is 18th to 144th positions of NP_000749). The nuclear acid sequence that encodes IL-4 includes the 443-829th position of Accession number NM_000589! Examples of the sequence include a sequence including NP_000580, positions 25 to 153).
  • the signal peptide sequence may be appropriately replaced with the signal peptide sequence of another protein. It is possible to construct and use a mutant gene encoding a functional site force-in using the natural gene encoding these site force-in or the degeneracy of the gene code.
  • genetic modification may be performed so as to express a modified version of these cyto force-ins.
  • a site force-in that has two forms a precursor and a mature form (for example, one that generates an active fragment by cleavage of a signal peptide or one that generates an active fragment by limited degradation of a protein)
  • Genetic modifications may be made to express either precursors or matures.
  • Other variants eg, fusion proteins between an active fragment of cytoforce-in and a heterologous sequence (eg, a heterologous signal peptide) may be used.
  • the recombinant virus refers to a virus generated via a recombinant polynucleotide, or an amplification product of the virus.
  • a recombinant polynucleotide refers to a polynucleotide that is joined at both ends or one end in the same manner as in the natural state.
  • a recombinant polynucleotide is a polynucleotide in which the binding of polynucleotide strands has been altered (cut and / or joined) by human hands.
  • the recombinant polynucleotide can be produced by a known genetic recombination method by combining polynucleotide synthesis, nuclease treatment, ligase treatment and the like.
  • a recombinant virus can be produced by expressing a polynucleotide encoding a viral genome constructed by genetic engineering and reconstructing the virus. For example, a method of reconstructing a virus from cDNA encoding a viral genome is known (Y. Nagai, A. Kato, Microbiol. Immunol., 43, 613-624 (1999)).
  • a gene refers to genetic material and refers to a nucleic acid containing a transcribed sequence in sense or antisense.
  • the gene can be RNA or DNA.
  • a nucleic acid encoding a protein is called a gene of the protein.
  • the gene may not encode a protein.
  • the gene may encode a functional RNA such as a ribozyme or an antisense RNA.
  • Genes can be naturally occurring or artificially designed sequences.
  • “DNA” refers to single-stranded DNA and double-stranded DNA. Contains strand DNA.
  • encoding a protein means that an ORF encoding the amino acid sequence of the protein is included in sense or antisense so that the polynucleotide can express the protein under appropriate conditions.
  • the minus-strand RNA virus may encode an antisense corresponding to a foreign gene in the genomic RNA, if necessary.
  • Genomic RNA is a function that forms a ribonucleoprotein (RNP) together with the minus-strand RNA virus virus protein, and that the gene in the genome is expressed by the protein, and this RNA is replicated to form a daughter RNP.
  • RNP ribonucleoprotein
  • RNA with In general, the genome of a minus-strand RNA virus has a structure in which a viral gene is arranged as an antisense sequence between a 3 'leader region and a 5' trailer region.
  • each gene's ORF there is a transcription termination sequence (E sequence)-an intervening sequence (I sequence)-a transcription initiation sequence (S sequence), whereby the RNA encoding each gene's ORF is in a separate cistron. Is transcribed as
  • the gene encoding the viral protein of the minus-strand RNA virus includes NP, P, M, F, HN, and L genes.
  • NP, P, M, F, HN, and L genes refer to genes encoding nucleocapsid, phospho, matrix, fusion, hemagglutinin-neuraminidase, and large protein, respectively.
  • Paramyxovirus Each gene in each virus belonging to the subfamily is generally expressed as follows. Generally, the NP gene is sometimes referred to as “N gene”.
  • accession numbers in the nucleotide sequence database of each gene of Sendai virus are M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218 for the NP gene, and M30202, M30203, for the P gene.
  • viral genes encoded by other viruses include the CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128. ; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091;
  • PDPR X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; and Tupaia, AF079780, P genes, CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV— 4a, M55975; HPIV— 4b, M55976; Mumps,
  • multiple strains are known for each virus, and there are genes having sequences other than those exemplified above depending on the strain.
  • the ORFs encoding these viral proteins and the ORFs of foreign genes are placed antisense in the genomic RNA via the EIS sequence described above.
  • the closest 3 'ORF in genomic RNA requires only the S sequence between the 3' leader region and the ORF, and does not require the E and I self sequences.
  • the closest 5 'ORF in genomic RNA is the 5' trailer region. Only the E sequence is required between the region and the ORF, and the I and S sequences are required.
  • Two ORFs can also be transcribed as the same cistron using, for example, a sequence such as IRES. In such cases, an EIS sequence is required between these two ORFs.
  • RNA genome follows the 3 'leader region, followed by six ORFs that encode N, P, M, F, HN, and L proteins in antisense order.
  • ORFs that encode N, P, M, F, HN, and L proteins in antisense order.
  • a 5 'trailer region at the other end.
  • the arrangement of the viral gene is not limited to this, but preferably, as in the wild type virus, N, P, M, F, followed by the 3 ′ leader region. It is preferable that ORFs encoding H, HN, and L proteins are arranged in order, followed by a 5 ′ trailer region.
  • each virus gene in the same manner as the wild type as described above even in such a case.
  • a virus carrying the N, P, and L genes autonomously expresses the gene from the RNA genome in the cell, and the genomic RNA is replicated.
  • infectious virus particles are formed and released extracellularly by the action of genes encoding envelope proteins such as the F and HN genes and the M gene. Therefore, such a virus becomes a virus having a transmission ability. “Having a transmission ability” means that when a virus infects a host cell, the virus replicates in the cell and infectious virus particles are produced.
  • a foreign gene may be inserted into a non-protein coding region in this genome as necessary.
  • the minus-strand RNA virus of the present invention may be one lacking any of the genes possessed by the wild-type virus.
  • a virus that does not contain the M, F, or HN gene, or a combination thereof can be suitably used in the present invention.
  • Such virus reconstitution can be performed, for example, by supplying a defective gene product exogenously.
  • the virus produced in this way has the ability to adhere to the host cell and cause cell fusion in the same way as the wild-type virus. Since the virus genome introduced into the cell has a defect in the virus gene, the infectivity is the same as the original virus. Daughter virus particles with no formation. Therefore, it is useful as a safe virus having the ability to introduce a gene only once (for example, a foreign gene).
  • genes to be deleted from the genome include Examples include the F gene and the Z or HN gene.
  • F gene and the Z or HN gene For example, by transfecting a plasmid expressing a recombinant negative-strand RNA virus genome deficient in the F gene into a host cell together with an F protein expression vector and an NP, P, and L protein expression vector, Reconfiguration can be performed (WO00 / 70055 and
  • a virus can be produced using a host cell in which the F gene is integrated into the chromosome.
  • F gene is integrated into the chromosome.
  • These protein groups have mutations or homologous genes of other viruses as long as the activity in introducing the nucleic acid is equal to or higher than that of the natural type, even if the amino acid sequence is not the virus-derived sequence as it is. You may substitute.
  • a virus containing a protein different from the envelope protein of the virus from which the virus genome is derived can also be produced.
  • a virus having a desired envelope protein can be produced by expressing an envelope protein other than the envelope protein encoded by the genome of the virus at the time of virus reconstitution.
  • Any desired protein that confers the ability to infect cells is used.
  • the envelope protein of other viruses for example, the G protein (VSV-G) of vesicular stomatitis virus (VSV) can be mentioned.
  • VSV-G protein may be derived from any VSV strain.
  • the ability to use VSV-G protein derived from Indiana serotype strain J.
  • the virus of the present invention can contain any combination of envelope proteins derived from other viruses.
  • an envelope protein derived from a virus that infects human cells is suitable as such a protein.
  • Such a protein is not particularly limited, and examples thereof include a retroviral unphotopick envelope protein.
  • a retrovirus unphotopick envelope protein for example, an envelope protein derived from mouse leukemia virus (MuLV) 4070A strain can be used.
  • An envelope protein derived from MuMLV 10A1 can also be used (for example, pCL_10Al (Imgenex) (Naviaux, RK et al, J. Virol. 70: 5701-5705 (1996)).
  • the herpes simplex virus gB, gD, gH, gp85 protein, EB Winore Gp350 and gp220 proteins examples include hepadnaviridae proteins.
  • hepadnaviridae proteins include hepatitis B virus S protein. These proteins may be used as fusion proteins in which the extracellular domain is bound to the intracellular domain of F protein or HN protein.
  • the viruses used in the present invention include pseudotyped viruses including envelope proteins derived from viruses other than the virus from which the genome is derived, such as the VSV-G protein. If the viral genomic RNA is designed so that these envelope proteins are not encoded in the genome, the virus will not be expressed after the virus particles have infected the cells.
  • the virus used in the present invention is, for example, a protein such as an adhesion factor, a ligand, or a receptor that can adhere to a specific cell on the envelope surface, an antibody or a fragment thereof, or a protein such as these proteins. It may include a chimeric protein having in the outer region and having a polypeptide derived from the virus envelope in the intracellular region. These may be encoded in the viral genome or supplied by the expression of a gene other than the viral genome (for example, another expression vector or a gene on the host chromosome) when the virus is reconstructed.
  • a protein such as an adhesion factor, a ligand, or a receptor that can adhere to a specific cell on the envelope surface, an antibody or a fragment thereof, or a protein such as these proteins. It may include a chimeric protein having in the outer region and having a polypeptide derived from the virus envelope in the intracellular region. These may be encoded in the viral genome or supplied by the expression of a gene other than the viral
  • a virus in order to reduce immunogenicity due to viral proteins, for example, or to increase RNA transcription efficiency or replication efficiency, a virus has any viral gene contained in the virus modified from a wild-type gene. Good. Specifically, for example, at least one of N, P, and L genes, which are replication factors, may be modified to enhance the function of transcription or replication.
  • N, P, and L genes which are replication factors, may be modified to enhance the function of transcription or replication.
  • HN protein which is one of the envelope proteins, has both the activity of hemagglutinin, which is a hemagglutinin, and the activity of neuraminidase, but if the activity of the former can be weakened, for example.
  • the membrane fusion ability can be regulated by modifying the F protein.
  • F protein and / or HN protein antigen-presenting epitopes that can become cell surface antigen molecules can be analyzed and used to produce viruses with reduced antigen-presenting ability for these proteins. .
  • the minus-strand RNA virus may be deficient in an accessory gene.
  • knocking out the V gene one of the SeV accessory genes, markedly reduces the pathogenicity of SeV to hosts such as mice without disrupting gene expression and replication in cultured cells (Kato, A et al., 1997, J. Virol.
  • a minus-strand RNA virus can also serve as a vector for introducing a foreign gene that is expected to have a synergistic effect with its own anticancer activity.
  • the vector only transcribes and replicates in the cytoplasm of the host cell, and does not have a DNA phase, so there is no integration into the chromosome (Lamb, RA and Kolakofsky, D., Paramyxovindae: The viruses and their replication. In: Fields BN, Kmpe DM, Howley PM, (eds) .Fields of virology. Vol. 2. Lippincott-Raven Publishers:
  • the minus-strand RNA virus can additionally have a function as a high-efficiency vector for human gene therapy.
  • Sendai virus with transmissibility can introduce foreign genes up to at least 4 kb, and it can also express two or more genes simultaneously by adding a transcription unit.
  • Sendai virus is pathogenic to rodents and is known to cause pneumonia. This is also supported by previous reports that nasal administration of wild-type Sendai virus does not show serious adverse effects in non-human primates (Hurwitz, JL et al, Vaccine 15: 533-540, 1997). These characteristics of Sendai virus suggest that Sendai virus power can be applied to human therapy. It concludes that it will be one of the promising options for cancer gene therapy.
  • the minus-strand RNA virus of the present invention is not essential, but may encode a foreign gene in genomic RNA.
  • a recombinant virus containing a foreign gene can be obtained by inserting the foreign gene into the genome of the virus.
  • the foreign gene a desired gene that can be expected to have a synergistic effect with the anticancer activity of the RNA virus of the present invention can be used.
  • the foreign gene may be a gene encoding a natural protein or a gene encoding a protein obtained by modifying the natural protein by deletion, substitution or insertion.
  • the insertion position of the foreign gene can be selected, for example, from a desired site in the protein non-coding region of the viral genome, for example, between the 3 'leader region of the genomic RNA and the 3' end closest to the virus protein ORF. It can be inserted between each viral protein ORF and / or closest to the 5 'end, between the viral protein ORF and the 5' trailer region.
  • a nucleic acid encoding a foreign gene can be inserted into the deleted region.
  • the expression level of a foreign gene carried in a minus-strand RNA virus can be regulated by the type of transcription initiation sequence added to the upstream (3 'side of the negative strand) of the gene (WO01 / 18223) o It can also be controlled by the position of the foreign gene inserted on the genome, and the higher the expression level is, the lower the expression level is. Become. Thus, the insertion position of a foreign gene can be adjusted as appropriate in order to obtain a desired expression level of the gene and so that the combination with genes encoding the preceding and subsequent viral proteins is optimal.
  • the foreign gene since it is considered advantageous to obtain high expression of a foreign gene, it is preferable to link the foreign gene to a transcription initiation sequence with high efficiency and insert it near the 3 ′ end of the negative strand genome. Specifically, it is inserted between the 3 ′ leader region and the viral protein ORF closest to 3 ′. Alternatively, it may be inserted between the ORF of the viral gene closest to 3 'and the ORF of the second gene. Wild type For paramyxoviruses, the closest to the 3 'genome, the viral protein gene is the N gene and the second gene is the P gene.
  • the insertion position of the foreign gene in the virus should be set to the 5 ′ side of the negative strand, or the transcription initiation sequence should be made less efficient.
  • the expression level from the virus it is possible to obtain an appropriate effect by keeping the expression level from the virus low.
  • the viral genomic RNA required for reconstitution of RNP which is a component of the virus, ie, the N, P, and L proteins is used in the presence of the viral genomic RNA. Transcribe the encoding cDNA.
  • the transcription of a negative strand genome (ie, the same antisense strand as the viral genome) by transcription or the generation of a positive strand (sense strand encoding a viral protein) can reconstitute the viral RNP. Can do.
  • a positive strand is preferably generated.
  • RNA ends accurately reflect the ends of the 3 ′ leader sequence and the 5 ′ trailer sequence as in the case of the natural viral genome.
  • a T7 RNA polymerase recognition sequence is used as a transcription initiation site, and the RNA polymerase may be expressed in cells.
  • a 3 ′ end of the transcript may be encoded with a self-cleaving ribozyme so that the 3 ′ end can be accurately cut out by this ribozyme (Hasan, MK et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997, Kato, A. et al "1997, EMBO J. 16: 578-587 and Yu, D. et al” 1997, Genes Cells 2: 457-466).
  • a DNA sample containing a cDNA base sequence of a target foreign gene is prepared.
  • the DNA sample is preferably electrophoretically confirmed as a single plasmid at a concentration of 25 ng / micro-L or higher.
  • the following describes an example in which a foreign gene is inserted into DNA encoding viral genomic RNA using the Notl site. If the target cDNA base sequence contains a Notl recognition site, encode the amino acid using site-directed mutagenesis. It is preferable to modify the base sequence so as not to change the acid sequence and remove the Notl site in advance. From this sample, the gene fragment of interest is amplified by PCR and collected.
  • both ends of the amplified fragment become Notl sites. It is designed to include the EIS sequence in the primer so that the EIS sequence is placed between the ORF of the foreign gene after insertion into the viral genome and the ORF of the viral gene on both sides.
  • the forward-side synthetic DNA sequence does not contain any two or more nucleotides on the 5 'side to ensure cleavage by Notl (preferably a sequence derived from a Notl recognition site such as GCG and GCC). 4 bases, more preferably ACTT), a Notl recognition site gcggccgc is added on the 3 'side, and any 9 bases as a spacer sequence on the 3' side or a multiple of 6 added to 9
  • a sequence corresponding to about 25 bases of the ORF is added to the 3 ′ side of the gene, including the start codon ATG force of the desired cDNA. It is preferable to select about 25 bases from the desired cDNA so that the last base is G or C and use it as the 3 ′ end of the forward synthetic oligo DNA.
  • the reverse-side synthetic DNA sequence is any two or more nucleotides from the 5 'side (preferably 4 bases not including sequences derived from Notl recognition sites such as GCG and GCC, more preferably
  • PCR can be performed by a conventional method using Taq polymerase or other DNA polymerase.
  • the amplified fragment of interest is digested with Notl and inserted into the Notl site of a plasmid vector such as pBluescript. Confirm the base sequence of the obtained PCR product with a sequencer and select a plasmid with the correct sequence.
  • the inserted fragment is excised from this plasmid with Notl and cloned into the Notl site of the plasmid containing the genomic cDNA. It is also possible to obtain recombinant Sendai virus cDNA by inserting directly into the Notl site of genomic cDNA without using a plasmid vector.
  • recombinant Sendai virus genomic cDNA can be constructed according to literature methods (Yu, D. et al "Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, MK et al" J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997).
  • an 18 bp spacer sequence (5 '-(G) -CGGCCGCAGATCTTCACG-3,) (SEQ ID NO: 3) with a Notl restriction site is cloned into Sendai virus genomic cDNA (pSeV (+)) leader.
  • the plasmid pSeV18 + b (+) containing the self-cleaving ribozyme site derived from the antigenic strand of Delta lupus dermatitis virus is obtained (Hasan, MK et al , 1997, J. General Virology 78: 2813-2820).
  • a foreign gene fragment into the Notl site of pSeV18 + b (+)
  • a recombinant Sendai virus cDNA incorporating the desired foreign gene can be obtained.
  • the virus can be reconstituted by transcribing the DNA encoding the genomic RNA of the recombinant virus thus produced in the presence of the above-described viral proteins (Les P and N) in the cell. it can.
  • Recombination of the recombinant virus can also be performed using known methods (W097 / 16539; W097 / 16538; Durbin, AP et al "1997, Virology 235: 323-332; Whelan, SP et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. MJ et al, 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al "1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, ND et al "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481;
  • RNA viruses including parainfluenza, vesicular stomatitis virus, rabies virus, measles virus, Linda-pest virus, Sendai virus, etc. can be reconstituted from DNA. According to these methods, the virus of the present invention can be reconstituted.
  • infectious virus particles can be formed by separately introducing a gene encoding an envelope protein of another virus into a cell and expressing it.
  • cDNA encoding negative-strand RNA viral genomic RNA (negative strand RNA) or its complementary strand (positive strand) is expressed in cells expressing N, P, and L proteins. It can be produced by a transcription step, and (b) a step of recovering the culture supernatant containing the produced minus-strand RNA virus.
  • the DNA encoding genomic RNA is ligated downstream of a suitable promoter. Transcribed genomic RNA is replicated in the presence of N, L, and P proteins to form an RNP complex. In the presence of M, HN, and F proteins, enveloped virus particles are formed.
  • DNA encoding genomic RNA is ligated downstream of the T7 promoter and transcribed into RNA by T7 RNA polymerase.
  • a desired promoter can be used in addition to a promoter containing a T7 polymerase recognition sequence.
  • RNA transcribed in vitro may be transferred to cells.
  • Enzymes such as T7 RNA polymerase that are required for the initial transcription of genomic RNA from DNA can be supplied by introducing a plasmid or viral vector that expresses it or, for example, RNA into the chromosome of the cell
  • the polymerase gene can also be supplied by inducing expression and inducing expression at the time of virus reconstitution.
  • Genomic RNA and viral proteins necessary for virus reconstitution are supplied, for example, by introducing plasmids that express them. These viral proteins can be supplied using helper viruses such as wild-type or certain mutant minus-strand RNA viruses.
  • Examples of methods for introducing DNA expressing genomic RNA into cells include the following methods: (i) a method of making a DNA precipitate that can be taken up by the target cell, (ii) a method of making a complex containing DNA suitable for uptake by the target cell and having a positive charge characteristic with low cytotoxicity, ( iii) There is a method that instantaneously opens a hole enough to allow DNA molecules to pass through the target cell membrane with an electric pulse.
  • transfection reagents can be used.
  • DOTMA Roche
  • Superfect QIAGEN # 301305
  • DOTAP DOPE
  • DOSPER Roche # 1811169
  • (I) includes, for example, the transfection method using calcium phosphate.
  • the DNA that has entered the cell by this method can be taken into the phagocytic vesicle S, and a sufficient amount of DNA can also enter the nucleus.
  • the method (iii) is a method called electroporation and is more versatile than the method G) or (ii) in that it has no cell selectivity. Efficiency is said to be good under the optimum conditions of pulse current duration, pulse shape, electric field (gap between electrodes, voltage) strength, buffer conductivity, DNA concentration, and cell density.
  • the method (ii) is easy to operate and can examine a large number of specimens using a large amount of cells, so that DNA for cell reconstitution can be introduced into cells.
  • a transfection reagent is suitable. Forces preferably using Superfect Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305) or DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Roche, Cat No. 1811169).
  • reconstitution of virus from cDNA can be performed, for example, as follows.
  • Minimal essential medium containing 10% urinary fetal serum (FCS) and antibiotics (100 units / ml penicillin G and 100 micro-g / ml streptomycin) on a plastic plate of 24 to 6 holes or 100mm Petri dish (MEM) is used to culture the monkey kidney-derived cell line LLC_MK2 (ATCC CCL-7) until almost 100% confluent.
  • FCS urinary fetal serum
  • antibiotics 100 units / ml penicillin G and 100 micro-g / ml streptomycin
  • the amount of the expression vector that encodes N, P, and L is preferably 2: 1: 2, for example, 1 to 4 micro-g of pGEM-N, 0.5 to 2 micron. -Adjust appropriately with g of pGEM-P and 1 to 4 micro-g of pGEM-L.
  • Transfectioned cells may contain only 100 micro_g / ml rifampicin (Sigma) and cytosine arabinoside (AraC), more preferably 40 micro-g / ml cytosine arapinoside (AraC) (Sigma) if desired.
  • the cells are collected, disrupted by repeating freeze-thaw three times, and then the RNP-containing lysate is transferred again to LLC-MK2 cells.
  • Incubate in culture or collect the culture supernatant and add to the culture medium of LLC-MK2 cells to infect and incubate, for example, lipofectamine or polycationic. Ribosome etc. Both can be introduced into cells by forming a complex.
  • various tiger A fusion reagent can be used. Examples include DOTMA (Roche), Superfect (QIAGEN # 301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Roche # 1811169). Black mouth quin can be added to prevent degradation in the endosome (Calos, MP, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015).
  • the viral gene expression from RNP and the RNP replication process proceed and the virus is amplified.
  • the resulting virus solution, and then repeating the amplification dilution (e.g. 10 6 times) and vaccinia Angeles vTF7_3 can be completely removed. Re-amplification is repeated 3 times or more, for example.
  • the resulting virus can be stored at -80 ° C.
  • the ability to use LLC-MK2 cells expressing the envelope protein for transfection or an envelope expression plasmid You can tranform them together. It is also possible to amplify defective viruses by overlaying LLC-MK2 cells that express envelope proteins on cells that have been transfected (see International Publication Nos. WO00 / 70055 and WO00 / 70070). .
  • the titer of the recovered virus can be determined by, for example, CIU (CelHnfected Unit) measurement or hemagglutination activity (HA) measurement (WO00 / 70070; Kato, A. et al., 199). Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. By Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine : Humana Press: pp. 295-306, 1999).
  • CIU CelHnfected Unit
  • HA hemagglutination activity
  • the titer can be quantified by counting the number of infected cells directly using the marker as an indicator (eg, GFP-CIU). The titer measured in this way can be handled in the same way as CIU (WO00 / 70070).
  • GFP green fluorescent protein
  • the host cells used for reconstitution are not particularly limited.
  • the host cells used for reconstitution are not particularly limited.
  • CV-1 cells cultured cells such as hamster kidney-derived BHK cells, human-derived cells, and the like can be used. By expressing an appropriate envelope protein in these cells, infectious virus particles having the protein in the envelope can also be obtained.
  • a large amount of In order to obtain Nidai virus it is possible to amplify the virus by infecting a chicken egg with a virus obtained from the above host.
  • a virus production method using chicken eggs has already been developed (Nakanishi et al., (1993), “Advanced Neuroscience Protocol Protocol III, Molecular Neuronal Physiology”, Koseisha, Osaka, ⁇ .153-172.
  • fertilized eggs are placed in an incubator and cultured at 37-38 ° C for 9-12 days to grow embryos.
  • the virus is inoculated into the allantoic cavity and the eggs are cultured for several days (eg 3 days) to propagate the virus. Conditions such as the culture period may vary depending on the recombinant Sendai virus used.
  • collect the urine containing the virus Separation and purification of Sendai virus from urine can be performed according to conventional methods (Tatsuro Tashiro, “Virus Experiment Protocol”, supervised by Nagai and Ishihama, Medical View, pp.68-73, (1995)) 0
  • Sendai virus lacking the F gene can be constructed and prepared as follows (see WO00 / 70055 and WO00 / 70070).
  • F gene can be detected by a combination of PCR-ligation method.
  • a deletion-type SeV genomic cDNA (pSeV18 + / AF) is constructed.
  • PCR is upstream of F [forward: 5— gttgagtactgcaagagc ⁇ ⁇ I [Number: 5, reverse:
  • F is is the child's torrent [forward: 5 -atgcatgccggcagatga / ⁇ ⁇ ⁇ ' J Issue: (, reverse:
  • the PCR product using the primer pair of 5′_tgggtgaatgagagaatcagcZ SEQ ID NO: 8] is ligated with EcoT22I.
  • the plasmid thus obtained was digested with Sacl and Sail, and the fragment (4931 bp) of the region containing the F gene deletion site was recovered and cloned into pUC18.
  • This pUC18 / dFSS is digested with Drain, the fragment is recovered and replaced with the Drain fragment of the region containing the pSeV18 + F gene, and ligated to plasmid pSeV18. / ⁇ F is obtained.
  • the foreign gene is inserted into the restriction enzyme Nsil and NgoMIV sites at the F gene deletion site of pUC18 / dFSS, for example.
  • a foreign gene fragment may be amplified with an Nsil-tailed primer and an NgoMIV-tailed primer.
  • the Cre / loxP-inducible expression plasmid that expresses the Sendai virus F gene (SeV_F) was constructed by PCR amplification of the SeV_F gene, and the plasmid pCALNdlw (Arai, Arai, designed to induce the gene product by Cre DNA recombinase). Insert into the unique site Swal site of T. et al., J. Virology 72, 1998, pi 115-1121) to construct plasmid pCALNdLw / F.
  • a helper cell line expressing SeV-F protein is established.
  • the cells for example, the monkey kidney-derived cell line LLC-MK2 cells often used for SeV growth can be used. LLC-MK2 cells are cultured in MEM supplemented with 10% heat-treated immobilized rabbit fetal serum (FBS), penicillin G sodium 50 units / ml, and streptomycin 50 micro-g / ml at 37 ° C, 5% Incubate with CO.
  • FBS immobilized rabbit fetal serum
  • penicillin G sodium 50 units / ml penicillin G sodium 50 units / ml
  • streptomycin 50 micro-g / ml at 37 ° C, 5% Incubate with CO.
  • the above plasmid pCALNdLw / F designed to induce and express the F gene product by Cre DNA recombinase is expressed using the calcium phosphate method (.mammalian transfection kit (Stratagene)) (from this , Zhou Yaguchi's Flotoko 1 ⁇ Nore
  • the plasmid in which the pSeV18 + / AF foreign gene is inserted is transfected into LLC-MK2 cells as follows. Seed LLC-MK2 cells at 5 x 10 6 cells / dish in a 100 mm dish. When T7 RNA polymerase is used to transcribe genomic RNA, a recombinant vaccinia virus that expresses T7 RNA polymerase (psoralen) and long-wave ultraviolet light (365 nm) treated for 20 minutes after 24 hours of cell culture (psoralen) and long-wave ultraviolet light (365 nm) treated for 20 minutes after 24 hours of cell culture (psoralen) and long-wave ultraviolet light (365 nm) treated for 20 minutes after 24 hours of cell culture (psoralen) and long-wave ultraviolet light (365 nm) treated for 20 minutes after 24 hours of cell culture (psoralen) and long-wave ultraviolet light (365 nm) treated for 20 minutes after 24 hours of cell culture (psoralen) and long-wave
  • PLWUV-VacT7 Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) is infected with MOI 2 at room temperature for 1 hour.
  • MOI 2 MOI 2
  • UV Stratalinker 2400 Catalog No. 400676 (100V), Stratagene, La Jolla, CA, USA
  • five 15-watt bulbs can be used for UV irradiation of vaccinia virus. it can.
  • the plasmid expressing the genomic RNA and the expression plasmid expressing the N, P, L, F, and HN proteins of the minus-strand RNA virus, respectively can be obtained using an appropriate lipofussion reagent. Transfect this cell.
  • the amount ratio of the plasmid is not limited to this, but can be preferably 6: 2: 1: 2: 2: 2 in order.
  • plasmids that express genomic RNA, and expression plasmids that express N, P, L, and F plus HN proteins pGEM / NP, pGEM / P, pGEM / L, and pGEM / F—HN;
  • WO00 / 70070 Kato, A. et al, Genes Cells 1, 569-579 (1996)), respectively, 12 micro-g, 4 micro-g, 2 micro-g, 4 micro-g and 4 micro-g / Remove the volume ratio of the dish. After culturing for several hours, the cells were washed twice with serum-free MEM, 40 micro-g / mL Cytosine ⁇ -D-arabinofuranoside (Ara: Sigma, St. Louis, MO) and 7.0
  • the minus-strand RNA virus of the present invention can be used even if it is a natural virus that is not a recombinant virus, and each RNA virus is purified, propagated, or obtained from an isolated strain.
  • RNA virus is purified, propagated, or obtained from an isolated strain.
  • MK2 sal kidney
  • P334 trypsin-added Vero cells
  • Purification can be performed by sucrose density gradient centrifugation, equilibrium centrifugation, or the like (p336). Measles virus can proliferate well in various monkey-derived cells (Matsumoto M, Bact. Rev. 30, 152 (1966)) Vero cells are the most widely used, but CV1, FL, KB, HeLa HEp2 etc. are used. (P351). Rhabdoviridae, such as rabies virus, uses BHK, CE, and Vero cells using tissue culture methods. As a purification method, adjust the culture solution on the 3rd to 4th day of infection to pH 7.4 or higher, remove cell debris by low speed centrifugation, and concentrate (P376).
  • Arenaviridae such as Lassa virus, grows well in most cultured cells that have been passaged in vitro. After infecting HK-21 / 13S cells, cultivate suspended in agar. Ru der allows growth by (Sedwik WDJVirol. l, 1224 ( 1967)) (p240) ortho Mikusowirusu family, such as o influenza virus (Orthomyxoviridae) can be grown in embryonated chicken eggs and MDCK cells (p295). Purification can be carried out by centrifugal fractionation, purification by adsorption on erythrocytes (Laver WG, Fundamental Techniques in Virology, 82 (1969)), etc. (p317).
  • the foreign gene introduced by the minus-strand RNA virus is not particularly limited, but examples of natural proteins include hormones, cytokines, growth factors, and receptors. , Intracellular signal molecules, enzymes, peptides and the like.
  • the protein can be a secreted protein, a membrane protein, a cytoplasmic protein, a nucleoprotein, and the like. artificial Examples of the protein include fusion proteins such as chimeric toxins, dominant negative proteins (including soluble receptors or membrane-bound dominant negative receptors), deletion-type cell adhesion molecules, and cell surface molecules. Further, it may be a protein to which a secretion signal, a membrane localization signal, a nuclear translocation signal or the like is added.
  • virus of the present invention is prepared using a gene for treating a disease as a foreign gene, this virus can be administered to perform gene therapy.
  • the virus of the present invention is, for example, 1 X 10 5 CIU / mL or more, preferably 1 X 10 6 CIU / mL or more, more preferably 5 X 10 6.
  • CIU / mL or more more preferably 1 X 10 7 CIU / mL or more, more preferably 5 X 10 7 CIU / mL or more, more preferably 1 X 10 8 CIU / mL or more, more preferably 5 X 10 8 CIU /
  • Viral titers can be measured by methods described herein and elsewhere (Kiyotani, K. et al., Virology 177 (1), 65-74 (1990); WO00 / 70070).
  • the recovered virus can be purified to be substantially pure.
  • the purification method can be performed by a known purification method including filtration (filtration), centrifugation, adsorption, column purification, or any combination thereof.
  • “Substantially pure” means that the virus component occupies a major proportion in the virus-containing solution.
  • a substantially pure virus composition contains 10% (weight / weight) of the protein contained in the virus as a component of the total protein contained in the solution (excluding proteins prepared as carriers and stabilizers). Weight) or more, preferably 20% or more, more preferably 50 ° / o or more, preferably 70 ° / o or more, more preferably 80% or more, and further preferably 90% or more.
  • RNA virus in the present invention may be, for example, an infectious virus particle or a non-infectious virus particle. Further, the RNA virus of the present invention comprises a genome.
  • RNA-protein complex RNP
  • ribofactamine or polycationic ribosome can be mixed with particles or complexes, and the mixture can be administered in vivo (WO00 / 70055).
  • various transfection reagents can be used. Examples thereof include DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN # 301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Boehringer # 1811169). Black mouth quinine can also be added to prevent degradation in endosomes (Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015).
  • the minus-strand RNA virus can be mixed (combined) with a desired pharmacologically acceptable carrier or medium as necessary.
  • the present invention provides a method for producing an anticancer agent, which comprises the step of mixing a minus-strand RNA virus and a pharmaceutically acceptable carrier or medium.
  • a "pharmaceutically acceptable carrier or vehicle” is a material that can be administered with a minus-strand RNA virus and does not significantly inhibit infection with a minus-strand RNA virus.
  • a carrier or medium include deionized water, sterile water, sodium chloride solution, dextrose solution, dextrose and sodium chloride, lactic acid-containing Ringer solution, culture solution, serum, and phosphate buffered saline (PBS). It is conceivable to formulate a combination of these and minus-strand RNA viruses as appropriate. Also, if necessary, concentrate by centrifugation, etc., and resuspend in a physiological solution such as a culture solution or physiological saline.
  • ribosome membrane stabilizers eg sterols such as cholesterol
  • antioxidants such as tocopherol or vitamin E
  • vegetable oils, suspending agents, surfactants, stabilizers, biocides and the like may be contained. Preservatives and other additives can also be added
  • the composition of the present invention may be in the form of an aqueous solution, capsule, suspension, syrup and the like.
  • Ma The virus composition of the present invention may be a solution, a lyophilized product, or a composition in the form of an aerosol. In the case of a freeze-dried product, it may contain sorbitol, sucrose, amino acid and various proteins as stabilizers.
  • the minus-strand RNA virus of the present invention has anticancer activity, and can exert an anticancer (anticancer) action when administered to a tumor (cancer tissue). That is, the present invention relates to a method for suppressing cancer (a method for suppressing cancer cell growth or a method for treating cancer), comprising a step of administering (in vivo administration) a minus-strand RNA virus to a cancer tissue.
  • cancer treatment can be performed on a cancer patient.
  • This method includes a step of administering a minus-strand RNA virus (the anticancer agent of the present invention). Specifically, the method includes a step of administering to a patient a therapeutically effective amount of a minus-strand RNA virus.
  • This method can be expected to suppress the growth of cancer cells compared to the case where the minus-strand RNA virus of the present invention is not administered.
  • the minus-strand RNA virus may be one having no foreign gene, or a gene encoding one or more of a cancer antigen, immunostimulatory site force-in, a protein that inhibits angiogenesis, etc. (foreign gene) May have
  • the present invention can be applied to a desired solid cancer such as tongue cancer, gingival cancer, malignant lymphoma, malignant melanoma, maxillary cancer, nasal cancer, nasal cancer, laryngeal cancer, pharyngeal cancer.
  • a desired solid cancer such as tongue cancer, gingival cancer, malignant lymphoma, malignant melanoma, maxillary cancer, nasal cancer, nasal cancer, laryngeal cancer, pharyngeal cancer.
  • Glioma meningioma, glioma, lung cancer, breast cancer, knee cancer, gastrointestinal cancer (esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, colon cancer), squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, alveolar epithelial cancer, testicular tumor Prostate cancer, thyroid cancer, liver cancer, ovarian cancer, rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, chondrosarcoma and the like.
  • the target cancer is preferably epithelial cancer, more preferably skin cancer including cutaneous squamous cell carcinoma, cutaneous basal cell carcinoma, cutaneous Paget's disease, cutaneous Paget's disease, cutaneous malignant melanoma and the like.
  • the in vivo dosage of the minus-strand RNA virus of the present invention depends on the disease, the patient's weight, age, sex, symptom, administration purpose, form of administration composition, administration method, although it depends on the transferred gene and the like, those skilled in the art can appropriately determine it.
  • the administration route can be appropriately selected, and can be performed, for example, transcutaneously, intranasally, transbronchially, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously, intraarticularly, or subcutaneously. Administration can be local or systemic.
  • the administered virus is preferably from about 10 5 ClU / ml to about 10 11 ClU / m
  • the preferred dose per dose is 2 x 10 5 CIU to 2 x 10 11 CIU is one or multiple doses within the range of clinically acceptable side effects. The same applies to the number of doses.
  • an amount converted from the above-mentioned dose can be administered based on the body weight ratio between the target animal and human or the volume ratio (eg, average value) of the administration target site. If it is necessary to suppress the growth of the virus, such as when the treatment is completed after administration of the transmissible minus-strand RNA virus to an individual or cell, administration of an RNA-dependent RNA polymerase inhibitor will allow It is also possible to specifically inhibit only the growth of the virus without causing any damage.
  • the minus-strand RNA virus of the present invention is administered, it is preferably administered to the cancer lesion of the patient.
  • a cancer lesion refers to a cancer tissue or a region around it (for example, within 5 mm, preferably within 3 mm from cancer).
  • the dose may be adjusted as appropriate depending on the type and stage of cancer and the presence or absence of the transgene.
  • the minus-strand RNA virus is expected to have an anti-tumor effect even if it does not carry a foreign gene.
  • the minus-strand RNA virus can be administered once or multiple times within the range of clinically acceptable side effects, and the same applies to the number of daily administrations.
  • the administration target is not particularly limited, but for example, birds, mammals, including chickens, quails, mice, rats, dogs, pigs, cats, rabbits, rabbits, hidges, goats, monkeys, and humans Animals (human and non-human mammals) are included. In the case of administration to animals other than humans, for example, an amount obtained by converting the above-mentioned dose by the body weight ratio between the target animal and human can be administered.
  • the present invention also relates to the use of a minus-strand RNA virus in cancer treatment.
  • the present invention also relates to the use of minus-strand RNA viruses in the production of anticancer agents, anticancer agents, cancer growth inhibitors and the like.
  • the present invention also relates to a package comprising a minus-strand RNA virus, the package comprising a statement that the minus-strand RNA virus is used for cancer suppression (as an anticancer agent).
  • the minus-strand RNA virus may be suspended in a solution such as a culture solution or physiological saline.
  • a minus-strand RNA virus or a composition containing the same is used for tumor suppression, such as tumor growth suppression, cancer degeneration, cancer therapy, treatment of cancer patients' therapy, survival of cancer patients, or anticancer agents. It is to be used as The description may be directly written on the package, or the paper or seal containing the description may be included in the package.
  • the package may be a container containing a minus-strand RNA virus, in which case the container may be, for example, a bottle, tube, plastic bag, vial, syringe, and the like.
  • the package of the present invention may include a bag or an outer box for storing the container.
  • the package may include instructions describing how to administer the minus-strand RNA virus, and may further include a syringe, catheter, and / or injection needle for administering the minus-strand RNA virus.
  • the present invention relates to a kit for treating cancer or producing an anticancer agent, comprising at least a minus-strand RNA virus as a constituent component.
  • the kit of the present invention may appropriately include, for example, a carrier, physiological saline, buffer solution, bottle, tube, plastic bag, vial, syringe, and the like. You can also package it up by using it.
  • the tumor size was significantly reduced in all SeV administration groups compared to the SeV non-administration group (Fig. 1).
  • SeV expressing soluble FGF receptor was administered, a stronger tumor growth inhibitory effect was confirmed than when SeV-GFP was administered, and the antitumor effect when administering SeV expressing soluble PDGFR was Most notably, tumor size did not increase much.
  • Example 2 Antitumor effect by Sendai virus having therapeutic gene (IFN) This example shows an example of a method for treating tumors by in vivo and etha vivo administration of RNA virus.
  • IFN Sendai virus having therapeutic gene
  • a transplantation model of B16 melanoma that expresses MHC Class I only at a very low level and has poor immunogenicity was adopted.
  • C57BL / 6 mice (6-8 weeks old, female) (Charles Japan's Liver) were used, and for rod cells, C57BL / 6 mice (8 weeks old, female) (Charles Japan) Collected from 'River 1).
  • the rod-shaped cells were collected from large 573 ⁇ 4 'of C57BL / 6 mice, and SpinSep, murine hematopoetic progenitor
  • Dendritic cells (SeV GFP DC or SeV IFN ⁇ DC, respectively) activated by introducing SeV_IFN ⁇ expressing SeV_GFP or mouse interferon ⁇ were administered around the tumor.
  • a tumor antigen tumor lysate by freeze and thaw of B16
  • an experiment was conducted to examine the anti-tumor effect by direct intratumoral injection of SeV-IFN ⁇ on day 10 after tumor inoculation (day 10).
  • SeV-IFN ⁇ For introduction of SeV into dendritic cells, seV-IFN ⁇ Were infected with MOI 40 and cultured for 8 hours.
  • NK cell activity In order to assess (NK) cell activity, spleens were extracted from mice 7 days after the completion of 3 DC treatments for each treatment group, and effector cells were prepared. Yac-1 was used as a target and a 51 Cr release assembly was performed. In addition, in order to assess the cytotoxicity of T lymphocytes, the remaining spleen cells used in the above NK cell activity assay were used together with TRP-2 peptide, which is a tumor antigen of B16, and the cells cultured for 5 days as effectors The cells were used as cells and co-cultured with EL-4 target cells pulsed with mTRP-2 peptide and subjected to 51 Cr release assay. The percentage of specific 51 Cr release was calculated as follows:
  • NK natural killer
  • the tumor suppressive effect when SeV was administered was based on the activation of NK cells.
  • administration of SeV having a gene that is expected to have a therapeutic effect also showed that a more effective therapeutic effect can be exerted against cancer.
  • an anticancer agent comprising a minus-strand RNA virus as an active ingredient. Since the RNA virus of the present invention exerts an effective cancer therapeutic effect in the absence of a foreign gene having a therapeutic effect, the cost for introducing the foreign gene can be reduced, and the virus can be prepared. This is considered to contribute greatly to the reduction of operation time.
  • the present invention enables new viral therapies with minus-strand RNA viruses.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　マイナス鎖RNAウイルスが治療効果を有する遺伝子を持たない場合であっても、効果的な腫瘍抑制効果を有することが見出された。本発明は、マイナス鎖RNAウイルスを含む抗癌剤を提供する。また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスと薬学的に許容される担体とを混合する工程を含む、抗癌剤の製造方法を提供する。また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスを癌組織へ投与する工程を含む癌の抑制方法を提供する。

Description

明 細 書
マイナス鎖 RNAウィルスを含む抗癌剤
技術分野
[0001] 本発明は癌治療の分野に関する。
背景技術
[0002] 近年、進行癌を対象とした増殖型ウィルスによるウィルス療法（virotherapy)の臨床 研究が進められている。ウィルス療法とは、 HSV-1やアデノウイルスなどの増殖型ウイ ルスを腫瘍細胞に感染させ、ウィルス増殖に伴うウィルスの殺細胞効果により腫瘍の 治癒を図る治療法である。 HSV-1やアデノウイルスの場合、腫瘍治療用の増殖型ウイ ルスは、ウィルスゲノムに遺伝子操作を加えた変異ウィルスで、腫瘍内での複製能を 保ちつつ、ヒト正常組織での病原性が最小限に押さえられている。腫瘍細胞に感染 した治療用の増殖型ウィルスは、細胞内で複製し、その過程で感染細胞は死滅する 。増殖したウィルスは周囲の腫瘍細胞に再感染し、抗腫瘍作用を広げる (Alemany R. et al., Replicative adenoviruses for cancer therapy. Nat BiotechnoL, 2000,
18:723-727; Curiel, D.T., The development of conditionally replicative adenoviruses for cancer therapy., Clin Cancer Res. , 2000, 6:3395-9; Kirn, D.， Virotherapy for cancer: Current status, hurdles, and future directions., Cancer Gene Therapy, 9:959—960, 2002; Mineta T. et al , Attenuated multi-mutated herpes simplex virus- 1 for the treatment of malignant gliomas. Nat Med 1 :938-943, 1995)。癌に対 するウィルス療法は、手術'放射線療法 '化学療法といった従来の治療法との併用が 可能で、固形癌一般に適用が可能であること、反復投与が可能であること、サイトカイ ンなどの治療遺伝子をウィルスゲノムに直接組み込んで抗腫瘍効果を増強できること など、その応用範囲が広ぐ実用面で優れている。より効果的なウィルス療法を開発 することができれば、癌治療に大きく貢献できるものと期待される。
[0003] 特許文献 1： Alemany R. et ai., Replicative adenoviruses for cancer therapy. Nat BiotechnoL, 2000, 18:723-727
非特言午文献 2 : Curiel, D.T., The development of conditionally replicative adenoviruses for cancer therapy.， Clin Cancer Res., 2000， 6:3395-9
^^特許文献 3 : Kirn， D.， Virotherapy for cancer: Current status, hurdles, and future directions., Cancer Gene Therapy, 2002, 9:959 - 960
非特許文献 4 : Mineta T. et al.， Attenuated multi-mutated herpes simplex virus- 1 for the treatment of malignant gliomas. Nat Med， 1995， 1 :938 - 943
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、癌に対するより効果的なウィルス療法、並びに、抗癌剤の提供を課題と する。より詳しくは本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスを含む抗癌剤の製造方法、およ び、マイナス鎖 RNAウィルスを用いた癌の治療方法を提供する。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、 RNAウィルスのインビボ投与による腫瘍に対する治療効果を検証す るために、メラノーマ細胞株を腹側皮下へ接種したマウスを用いて実験を行った。そ の結果、治療遺伝子を持たないマイナス鎖 RNAウィルスを、該動物の腫瘍内へ注射 することにより、腫瘍サイズが有意に縮小することを見出した。即ち、マイナス鎖 RNA ウィルスのインビボ投与は、該ウィルスが治療遺伝子を持たない場合であっても、抗 腫瘍効果を発揮することが分かった。
マイナス鎖 RNAウィルスは、それ自体が有効な抗癌剤となるものと考えられる。また 、該ウィルスを直接、腫瘍部位 (癌組織)へ注入することにより、有効な抗腫瘍効果が 期待でき、該ウィルスは、癌の治療に有用である。
[0006] すなわち本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスを含む抗癌剤、該抗癌剤の製造方法 、および該 RNAウィルスを用いた癌の抑制方法に関し、より具体的には請求項の各 項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の 1 つまたは複数の組み合わせからなる発明は、それらの請求項に記載の発明に既に 意図されている。すなわち本発明は、
〔1〕マイナス鎖 RN Aウィルスを含む抗癌剤、
〔2〕マイナス鎖 RNAウィルスが外来蛋白質をコードしない、〔1〕に記載の抗癌剤、 〔3〕マイナス鎖 RNAウィルスが感染性または非感染性ウィルス粒子である、〔1〕また は〔2〕に記載の抗癌剤、
〔4〕RNAウィルスがゲノム RNA—蛋白複合体である、 〔1〕力 〔3〕のいずれかに記 載の抗癌剤、
〔5〕マイナス鎖 RNAウィルスがパラミクソウィルスである、〔1〕から〔4〕のいずれかに 記載の抗癌剤、
〔6〕パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、 〔5〕に記載の抗癌剤、
[7]マイナス鎖 RNAウィルスと、薬学的に許容される担体または媒体とを混合するェ 程を含む、抗癌剤の製造方法、
〔8〕マイナス鎖 RNAウィルスを癌組織へ投与する工程を含む癌の抑制方法、 に関する。
図面の簡単な説明
[0007] [図 1]GFP発現 SeV、可溶型 FGF受容体発現 SeV、または可溶型 PDGFR a発現 SeV の in vivo投与によるメラノーマに対する治療効果を示す図である。
[図 2]皮下接種された B 16メラノーマ細胞の増殖曲線を示す図である。
[図 3]YAC_1ターゲット細胞の51 Cr放出アツセィの結果を示す図である。
[図 4]TRP2ペプチド +EL-4の51 Cr放出アツセィの結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明は、有効成分としてマイナス鎖 RNAウィルスを含む抗癌剤 (制癌剤)を提供 する。本発明において RNAウィルスとは、 RNAゲノムを持つウィルスを言う。
本発明の抗癌剤の有効成分とする RNAウィルスは、好ましくは、マイナス鎖 RNAウイ ルスである。マイナス鎖 RNAウィルスとは、マイナス鎖（ウィルス蛋白質をコードするセ ンス鎖に対するアンチセンス鎖）の RNAをゲノムとして含むウィルスである。マイナス 鎖 RNAはネガティブ鎖 RNAとも呼ばれる。本発明において用いられるマイナス鎖 RNA ウィルスとしては、特に一本鎖マイナス鎖 RNAウィルス（非分節型（non- segmented)マ イナス鎖 RNAウィルスとも言う）が挙げられる。「一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルス」とは 、一本鎖ネガティブ鎖 [すなわちマイナス鎖] RNAをゲノムに有するウィルスを言う。こ のよつなゥイノレスとしては、ノ ラミクソゥイノレス (Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus,および Pneumovirus属等を含む)、ラブドウイノレス ( Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus,および Ephemerovirus属等を含む)、フィ ロウィノレス (Filoviridae)、ォノレトミクソウイノレス ( Orthomyxoviridae； Infuluenza virus A, B, C，および Thogoto-like viruses等を含む）、ブニヤウィルス（Bunyaviridae;
Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus,および Phlebovirus属等 含む)、ァレナウイノレ ス（Arenaviridae)などの科に属するウィルスが含まれる。
[0009] 本発明において好適に用いられるマイナス鎖 RNAウィルスとしては、例えばパラミク ソウィルス科 (Paramyxoviridae)ウィルスのセンダイウィルス (Sendai virus)を挙げること ができる。他の例としては、ニューカッスル病ウィルス (Newcastle disease virus),おた ふくかぜウィルス (Mumps virus),麻疹ウイノレス (Measles virus), RSウィルス
(Respiratory syncytial virus) 牛 ゥ ノレス (rinderpest virus) ンスアンノヽ一1ノイノレス (distemper virus),サルパラインフルエンザウイルス（SV5)、ヒトパラインフルエンザゥ ィルス 1,2, 3型、オルトミクソウィルス科 (Orthomyxoviridae)のインフルエンザウイルス (Influenza virus),ラブドウィルス科 (Rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウィルス (Vesicular stomatitis virus),狂犬病ウイノレス (Rabies virus)等が挙げられる。
[0010] 本発明において用いることができるウィルスをさらに例示すれば、例えば Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV- 1)、 human parainfluenza virus-3 (HPIV_3)、 phocine distemper virus (PDV)ゝ canine distemper virus (CDV)、 dolphin molbillivirus (DMV)、 peste-des- petits-ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra)、 Nipah virus (Nipah)、 human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)、 simian parainfluenza virus 5 (SV5)、 human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)、 human parainfluenza virus_4b (HPIV_4b)、 mumps virus (Mumps),および Newcastle disease virus (NDV)などが含まれる。より好ましく は、 Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV-1)、 human parainfluenza virus-3 (HPIV- 3)、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CDV)、 dolphin molbillivirus (DMV)、 peste—des— petits-ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra)、および Nipah virus (Nipah)力 なる群より選択されるウィルスが挙げられる。
[0011] より好ましくは、パラミクソウィルス亜科（レスピロウィルス属、ルブラウィルス属、およ びモルビリウィルス属を含む）に属するウィルスまたはその誘導体であり、より好ましく はレスピロウイノレス属 (genus Respirovirus) (パラミクソウイノレス属 (Paramyxovirus)とも 言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウィルスによる遺伝子 導入能を損なわないように、ウィルス遺伝子が改変されたウィルス、および化学修飾 されたウィルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとして は、例えばヒトパラインフルエンザウイルス 1型（HPIV_1)、ヒトパラインフルエンザウイ ルス 3型（HPIV- 3)、ゥシパラインフルエンザウイルス 3型（BPIV- 3)、センダイウィルス (Sendai virus;マウスパラインフルエンザウイルス 1型とも呼ばれる)、およびサルパライ ンフルェンザウィルス 10型（SPIV-10)などが含まれる。
[0012] 本発明のマイナス鎖 RNAウィルスとしては、最も好ましくはセンダイウィルスである。
[0013] 本発明におけるマイナス鎖 RNAウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株 、および人為的に構築された株などに由来してもよい。つまり、マイナス鎖 RNAウィル スは、天然から単離されたマイナス鎖 RNAウィルスであっても、遺伝子組み換えにより 人為的に作出したマイナス鎖 RNAウィルスであってもよい。また、感染細胞において ゲノム RNAを複製する能力を保持する限り、野生型マイナス鎖 RNAウィルスが持つい ずれかの遺伝子に変異や欠損があるものであってよい。例えば、マイナス鎖 RNAウイ ルスのエンベロープ蛋白質または外殻蛋白質をコードする少なくとも 1つの遺伝子に 変異または欠損を有するマイナス鎖 RNAウィルスを好適に用いることができる。このよ うなマイナス鎖 RNAウィルスは、感染細胞においては RNAゲノムを複製することはでき るが、感染性ウィルス粒子を形成できない。従って、周囲に感染を拡大する懸念がな いので安全性が高レ、。例えば、 F、 H、 HN、または Gなどのエンベロープ蛋白質また はスパイク蛋白質をコードする少なくとも 1つの遺伝子、あるいはそれらの組み合わせ が含まれていないマイナス鎖 RNAウィルスを用いることができる（WO00/70055およ び WO00/70070; Li, H.-O. et al.， J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000))。ゲノム複製 に必要な蛋白質（例えば N、 P、および L蛋白質）をゲノム RNAにコードしていれば、 感染細胞においてゲノムを増幅することができる。欠損型ウィルスを製造するには、 例えば、欠損している遺伝子産物またはそれを相補できる蛋白質をウィルス産生細 胞において外来的に供給する（WO00/70055および WO00/70070; Li, H.-O. et al , J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000))。但し、例えばマイナス鎖 RNAウィルスにおい ては、 M蛋白質遺伝子を持つウィルスであれば、 F蛋白質や HN蛋白質などのスパイ ク蛋白質をコードする遺伝子を持たなくても非感染性のウィルス粒子 (VLP)が放出さ れるので、ウィルス蛋白質を相補することなく VLPを製造することが可能である（ WO00/70070) oまた、エンベロープ蛋白質遺伝子を何も持たなくても、 N、 L、 P蛋白 質、およびゲノム RNAからなる RNPは細胞内において増幅することができるので、糸田 胞ライセートから遠心分離等により RNPを回収することができる。
[0014] また、変異型の RNAウィルスを用いて本発明の抗癌剤を製造することもできる。例え ば、エンベロープ蛋白質や外殻蛋白質において多数の温度感受性変異が知られて レ、る。これらの温度感受性変異蛋白質遺伝子を有する RNAウィルスを本発明におレ、 て好適に用いることができる。温度感受性変異とは、低温（例えば 30°Cないし 32°C) に比べ、ウィルス宿主の通常の温度（例えば 37°Cないし 38°C)において有意に活性 が低下する変異のことである。このような、温度感受性変異を持つ蛋白質は、許容温 度（低温）下でウィルスを作製することができるので有用である。
[0015] 例えば、マイナス鎖 RNAウィルスの M遺伝子の温度感受性変異としては、センダイ ウィルスの M蛋白質における G69、 T116、および A183からなる群より任意に選択され る部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003， 77: 3238-3246) 。他のマイナス鎖 RNAウィルス M蛋白質の相同な部位のアミノ酸は容易に同定できる 力 具体的に示せば、例えば SeV M蛋白質の G69に相当する M蛋白質の相同部位と しては、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV-l) (括弧は略称）であれば G69、 human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)であれは G73、 pnocine distemper virus (PDV)および canine distemper virus (CDV)であれば G70、 dolphin molbillivirus (DMV)であれば G71、 peste—des-petits— ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)、および
rinderpest virus (RPV)で fcれば G70、 Hendra virus (Hendra)および Nipah virus (Nipah)であれば G81、 human parainfluenza vims— 2 (HPIV— 2)であれば G70、 human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)および human parainfluenza virus- 4b (HPIV- 4b)で あれば E47、 mumps virus (Mumps)であれば E72が挙げられる（文字と番号はアミノ酸 とその位置を表す）。また、 SeV M蛋白質の T116に相当する各 M蛋白質の相同部位 としては、 human parainfluenza virus— 1 (HPIV—l)で fcれば T116、 human parainfluenza virus- 3 (HPIV-3)であれば T120、 phocine distemper virus (PDV)および canine distemper virus (CDV)であれば T104、 dolphin molbillivirus (DMV)であれば T105、 peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)および rinderpest virus (RPV)であれば T104、 Hendra virus (Hendra)および Nipah virus (Nipah)であれば T120、 human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)および simian parainfluenza virus 5 (SV5)であれば T117、 human parainfluenza virus- 4a (HPIV- 4a)および human parainfluenza virus_4b (HPIV_4b)であれば T121、 mumps virus (Mumps)であれば T119、 Newcastle disease virus (NDV)であれば S120が挙げられる。 SeV M蛋白質の A183に相当する各 M蛋白質の相同部位としては、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV-1)であれば A183、 human parainfluenza virus- 3 (HPIV-3)であれば F187、 phocine distemper virus (PDV)および canine distemper virus (CDV)であれは fl71、 dolphin molbillivirus (DMV)であれば Y172、 peste-des-petits-ruminants virus (PDPR) 、 measles virus (MV)および rinderpest virus (RPV)であれば Y171、 Hendra virus (Hendra)および Nipah virus (Nipah)であれば Y187、 human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)であれば Y184、 simian parainfluenza virus 5 (SV5)であれば F184、 human parainfluenza virus- 4a (HPIV- 4a)および human parainfluenza virus- 4b (HPIV- 4b)で あれば F188、 mumps virus (Mumps)であれば F186、 Newcastle disease virus (NDV)で あれば Y187が挙げられる。ここに挙げたウィルスにおいて、それぞれの M蛋白質に上 記の 3つの部位のいずれカ 好ましくは任意の 2部位の組み合わせ、さらに好ましくは 3つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異 M蛋白質をコードするゲノ ムを有するウィルスは、本発明において好適に用いられる。
アミノ酸変異は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましぐ例え ば BLOSUM62マトリックス（Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)の値が 3以下、好ましくは 2以下、より好ましくは 1以下、よ り好ましくは 0以下のアミノ酸に置換する。具体的には、センダイウィルス M蛋白質の G69、 T116、および A183あるいは他のウィルス Μ蛋白質の相同部位を、それぞれ Glu (E)、 Ala (A)、および Ser (S)へ置換することができる。また、麻疹ウィルス温度感受性 株 P253-505 (Morikawa, Y. et al , Kitasato Arch. Exp. Med. 1991 : 64; 15-30)の M 蛋白質の変異と相同な変異を利用することも可能である。変異の導入は、例えばオリ ゴヌクレオチド等を用いて、公知の変異導入方法に従って実施すればよい。
[0017] また、 HN遺伝子の温度感受性変異としては、例えばセンダイウィルスの HN蛋白質 の A262、 G264、および K461からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が 挙げられる（Inoue, Μ· et al" J.Virol. 2003, 77: 3238-3246)。好ましい一例を挙げれ ば、センダイウィルス HN蛋白質の A262、 G264、および K461あるいは他のウィルス HN蛋白質の相同部位を、それぞれ Thr (T)、 Arg )、および Gly (G)へ置換する。ま た、例えば、ムンプスウィルスの温度感受性ワクチン株 Urabe AM9を参考に、 HN蛋 白質の 464及び 468番目のアミノ酸に変異導入することもできる（Wright, K. E. et al. , Virus Res. 2000: 67; 49—57)。
[0018] またマイナス鎖 RNAウィルスは、 P遺伝子または L遺伝子に変異を有していてもよい 。このような変異としては、具体的には、 SeV P蛋白質の 86番目の Glu (E86)の変異、 SeV P蛋白質の 511番目の Leu (L511)の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス 鎖 RNAウィルス P蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。具体的には、 86番目のアミ ノ酸の Lysへの置換、 511番目のアミノ酸の Pheへの置換などが例示できる。また L蛋 白質においては、 SeV L蛋白質の 1197番目の Asn (N1197)および/または 1795番目 の Lys (K1795)の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖 RNAウィルス L蛋白質 の相同部位の置換が挙げられ、具体的には、 1197番目のアミノ酸の Serへの置換、 1795番目のアミノ酸の Gluへの置換などが例示できる。 P遺伝子および L遺伝子の変 異は、持続感染性、 2次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に 高めることができる。さらに、エンベロープ蛋白質遺伝子の変異および/または欠損を 組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。
[0019] またエンベロープウィルスを用いる場合は、ウィルスが本来持つエンベロープ蛋白 質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むウィルスを使用してもよレ、。例えば、ウィル ス製造の際に、所望の外来性エンベロープ蛋白質をウィルス産生細胞で発現させる ことにより、これを含むウィルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限 はなぐ哺乳動物細胞への感染能を付与する所望の蛋白質が用いられる。具体的に は、例えば水疱性口内炎ウィルス（Vesicular stomatitis virus; V;> V の 蛋白質、 VSV-G)を挙げることができる。 VSV-G蛋白質は、任意の VSV株に由来するものであ つてよく、例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981))由来の VSV-G蛋 白を用いることができる力 これに限定されない。本発明において用いられるマイナス 鎖 RNAウィルスは、他のウィルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて 含むことができる。
[0020] また本発明のマイナス鎖 RNAウィルスは、それ自体で抗癌作用を有することを特徴 とする。即ち、該マイナス鎖 RNAウィルスは、外来蛋白質もしくは該蛋白質をコードす る核酸を有する必要はない。従って本発明は、外来蛋白質をコードしないマイナス鎖 RNAウィルスを含む抗癌剤に関する。本発明のマイナス鎖 RNAウィルスは、ゲノム RNA中に外来蛋白質あるいは外来遺伝子をコードしてもよいし、しなくてもよい。外来 蛋白質をコードしないマイナス鎖 RNAウィルスでも抗癌（制癌）作用を発揮するため、 外来遺伝子は必ずしも必要ではなレ、。従って本発明には、野生型マイナス鎖 RNAゥ ィルスや天然から単離されたマイナス鎖 RNAウィルス（変異株を含む）などの所望の マイナス鎖 RNAウィルスを利用できる利点がある。例えば本発明において用いる RNA ウィルスとしては、癌治療効果を有する蛋白質をコードしなレ、 RNAウィルスを用いるこ とができる。このようなウィルスとしては、癌治療効果を有さない所望の外来蛋白質を コードする RNAウィルスが含まれ、例えば RNAウィルスの導入を検出するために、緑 色蛍光蛋白質（GFP)、ルシフェラーゼ、各種ペプチドタグなどのマーカー蛋白質をコ ードする RNAウィルスなどを用いることができる。あるいは、マイナス鎖 RNAウィルスへ 抗癌（制癌）作用を助ける外来蛋白質あるいは外来遺伝子をさらに組み込むことで、 制癌 (抗癌）作用をより高めることもできる。
[0021] 外来遺伝子を持つ組み換えマイナス鎖 RNAウィルスの再構成は公知の方法を利用 して行えばよレ、。具体的な手順は、典型的には、（a)マイナス鎖 RNAウィルスゲノム RNAをコードする cDNAを、ウィルス粒子形成に必要なウィルス蛋白質を発現する細 胞で転写させる工程、 （b)生成したウィルスを含む培養上清を回収する工程、により 製造することができる。ウィルス蛋白質は、転写させたウィルスゲノム RNA力も発現さ れてもよいし、ゲノム RNA以外からトランスに供給されてもよい。ゲノム RNAにおいて 粒子形成に必要なウィルス遺伝子が欠損している場合は、そのウィルス遺伝子をウイ ルス産生細胞で別途発現させ、粒子形成を相補する。ウィルス蛋白質や RNAゲノム を細胞内で発現させるためには、該蛋白質やゲノム RNAをコードする DNAを宿主細 胞で機能する適当なプロモーターの下流に連結したベクターを宿主細胞に導入する 。転写されたゲノム RNAは、ウィルス蛋白質の存在下で複製され、感染性ウィルス粒 子が形成される。エンベロープ蛋白質などの遺伝子を欠損する欠損型ウィルスを製 造する場合は、欠損する蛋白質またはその機能を相補できる他のウィルス蛋白質な どをウィルス産生細胞において発現させる。
[0022] 例えば、本発明のマイナス鎖 RNAウィルスの製造は、以下の公知の方法を利用し て実施することができる（W097/16539; W097/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820， 1997、 Kato, A. et al" 1997， EMBO J. 16: 578-587及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2:
457-466; Durbin, A. P. et al" 1997， Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al.,
1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995， EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995， EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T.， 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M.,
1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404)。これらの方法により、パライン フルェンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダ一ペスト ゥイノレス、センダイウィルスなどを含むマイナス鎖 RNAウィルスを DNAから再構成させ ることができる。本発明においては、マイナス鎖 RNAウィルス、特に一本鎖マイナス鎖 RNAウィルス、より好ましくはパラミクソウィルス科ウィルス、より好ましくはレスピロウイ ルス属ウィルスを好適に用いることができる。
[0023] マイナス鎖 RNAウィルスに搭載させる外来遺伝子としては、特に制限はなレ、が、天 然の蛋白質としては、例えばホルモン、サイト力イン、増殖因子、受容体、細胞内シグ ナル分子、酵素、抗体 (全長抗体、 Fabなどの抗体断片、一本鎖抗体などを含む）、 ペプチドなどが挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋 白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白 質、ドミナントネガティブ蛋白質 (受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガ ティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子などが挙げられ る。また、分泌シグナル、膜局在化シグナル、または核移行シグナル等を付加した蛋 白質であってもよレヽ。導入遺伝子としてアンチセンス RNA分子または RNA切断型リボ ザィムなどを発現させて、特定の遺伝子の機能を抑制することもできる。外来遺伝子 として制癌作用を示す治療用遺伝子を用いてウィルスを調製すれば、制癌作用をよ り高めることが可能となる。
例えば、血管形成または血管新生を阻害する遺伝子を用いれば、抗癌効果をより 高めることができる。血管形成または血管新生を促進する遺伝子としては、例えば線 維芽細胞増殖因子 2 (FGF2) (Baifour, R. et al., J. Vase. Surg. 16(2): 181_91, 1992) 、内皮細胞増殖因子（endothelial cell growth factor; ECGF) (Pu, L. Q. et al" J. Surg. Res. 54(6):575_83， 1993)、血管内皮増殖因子/血管透過性因子（vascular endothelial growth factor; VEGF I vascular permeability factor; VPF) (Takeshita, S. et al., Circulation 90(5 Pt 2):II228- 34， 1994; Takeshita, S. et al., J. Clin. Invest. 93(2):662-70, 1994)、肝細胞増殖因子/ scatter因子（hepatocyte growth
factor/scatter factor) (HGF/SF)などが知られている。これらのシグナル分子の作用 を阻害する分泌蛋白質をコードする遺伝子を外来遺伝子として利用することが可能 である。具体的には、これらのシグナル分子またはその受容体に結合する抗体また はその抗原結合断片を含むポリペプチド、該受容体の可溶型蛋白質 (リガンド結合 部を持ち、膜貫通領域を持たない分泌型受容体)などが挙げられる。特に、 FGF受容 体（FGF-R)の可溶型ポリペプチドをコードするマイナス鎖 RNAウィルスは、癌の増殖 抑制効果を有意に上昇させることができる。従って、可溶性 FGF-Rをコードするマイ ナス鎖 RNAウィルスは、本発明において好適に用いられる。可溶性 FGF-Rとしては、 天然の可溶型 FGF-Rを用いることもできるし、膜結合型の FGF_R (FGF-R1など）の細 胞外ドメインからなる断片を用いてもょレ、（A. Hanneken and A. Baird, Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol 36, 1192—1196, 1995; Takaishi, S. et al., Biochem Biophys Res Commun" 267(2):658- 62, 2000; Seno M, et al., Cytokine, 10(4):290-4, 1998; Hanneken, Α·， FEBS Lett. 489:176, 2001)。
[0025] また、サイト力イン類を発現させれば、免疫系を刺激して癌に対する免疫応答を高 めることから、サイト力インをコードする遺伝子を導入したマイナス鎖 RNAウィルスも有 用である。免疫刺激性サイト力インをコードする遺伝子を搭載するマイナス鎖 RNAウイ ルスは効果的な腫瘍免疫誘導作用を有する抗癌剤となる。例えば、免疫刺激性サイ トカインとして、インターロイキン（例えば、 IL- lalpha、 IL_lbeta、 IL- 2、 IL- 3、 IL- 4、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL_9、 IL- 10、 IL- 12、 IL- 15、 IL- 18、 IL- 19、 IL_20、 IL_21、 IL_23、 IL_27)、インターフェロン（例えば、 IFN_alpha、 IFN_beta、 IFN-gamma)、腫瘍壊死因 子（TNF)、トランスフォーミング增殖因子 (TGF)_beta、顆粒球コロニー刺激因子（ G-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー 刺激因子（GM-CSF)、インスリン様増殖因子（IGF)_I、 IGF_2、 Flt_3リガンド、 Fasリガ ンド、および c-kitリガンド、ならびに他の免疫調節蛋白質（ケモカインおよびコステイミ ユラトリー分子など）が含まれる。
[0026] これらのサイト力インのアミノ酸配列は当業者には周知であり、 IL-4については、例 えば、 Araiら (1989)、 J. Immunol. 142(1) 274-282、 IL-6については、例えば、 Yasukawaら（1987)、 EMBO J.、 6(10): 2939-2945、 IL- 12は、例えば、 Wolも (1991)、 J. Immunol. 146(9): 3074-3081、 IFN- alphaは、例えば、 Grenら (1984) J. Interferon Res. 4(4): 609-617、および Weismannら (1982) Princess Takamatsu Symp. 12: 1—22、 IFN-betaは、例えば Accession number NM_002176の 139〜636番目の配列（アミノ酸 配列は NP_002167の 22〜187番目）を含む配列が挙げられる（Derynck, R. et al, Nature 285, 542-547 (1980); Higashi, Y. et al., J. Biol. Chem. 258, 9522-9529 (1983); Kuga, T. et al, Nucleic Acids Res. 17, 3291 (1989))。また、 TNFは、例えば 、 Pennicaら (1984) Nature 312: 724-729、 G-CSFは、例えば、 Hiranoら (1986) Nature 324:73 - 76、 GM—CSFは、例えば、 Cantrellら (1985) Pro Natl. Acad. Sci. (USA) 82(18): 6250-6254を参照することができる。より具体的には、 GM-CSFをコー ドする核酸配列としては Accession number NM_000758の 84〜461番目の配歹 (ァミノ 酸配列は NP_000749の 18〜144番目）を含む配列が挙げられる。 IL-4をコードする核 酸配列としては、 Accession number NM_000589の 443〜829番目の配歹 !J (アミノ酸配 列は NP_000580の 25〜153番目）を含む配列が挙げられる。シグナルペプチド配列は 、適宜他の蛋白質のシグナルペプチドの配列に置換してもよレ、。これらのサイト力イン をコードする天然の遺伝子または遺伝子暗号の縮重を利用して、機能的サイト力イン をコードする変異遺伝子を構築し利用することができる。
[0027] また、これらのサイト力インの改変体を発現するように遺伝子改変してもよい。例え ば、前駆体および成熟体の 2つの形態を持つサイト力イン (例えば、シグナルぺプチ ドの切断により活性フラグメントを生成するもの、または蛋白質の限定分解により活性 フラグメントを生成するものなど）について、前駆体または成熟体のいずれかを発現 するように遺伝子改変してもよい。その他の改変体 (例えば、サイト力インの活性フラ グメントと異種配列（例えば、異種シグナルペプチド）との間の融合タンパク質）を用い てもよい。
[0028] なお、本発明において組み換えウィルスとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生 成したウィルス、またはそのウィルスの増幅産物を言う。組み換えポリヌクレオチドとは 、両端または片端が自然の状態と同じようには結合してレ、なレ、ポリヌクレオチドを言う 。具体的には、組み換えポリヌクレオチドは、人の手によってポリヌクレオチド鎖の結 合が改変（切断および/または結合）されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌク レオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせ て、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換えウィルスは、 遺伝子操作により構築されたウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、 ウィルスを再構築することによって生成することができる。例えば、ウィルスゲノムをコ ードする cDNAから、ウィルスを再構成する方法が知られている（Y. Nagai, A. Kato, Microbiol. Immunol., 43, 613—624 (1999))。
[0029] 本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、転写される配列をセンスまたはアンチ センスに含む核酸を言う。遺伝子は RNAであっても DNAであってもよレ、。本発明にお レ、て蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。また遺伝子は蛋白質を コードしていなくてもよぐ例えば遺伝子はリボザィムまたはアンチセンス RNAなどの 機能的 RNAをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設 計された配列であり得る。また、本発明において「DNA」とは、一本鎖 DNAおよび二本 鎖 DNAを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な 条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードする ORFをセンスまたは アンチセンスに含むことを言う。
[0030] マイナス鎖 RNAウィルスは、ゲノム RNAに、必要に応じて外来遺伝子に対応するァ ンチセンスをコードしていてもよレ、。ゲノム RNAとは、マイナス鎖 RNAウィルスのウィル ス蛋白質と共にリボヌクレオプロテイン（RNP)を形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺 伝子が発現し、この RNAが複製されて娘 RNPが形成される機能を持つ RNAである。 一般にマイナス鎖 RNAウィルスのゲノムは、 3'リーダー領域と 5'トレイラ一領域の間に 、ウィルス遺伝子がアンチセンス配列として並んだ構成をしている。各遺伝子の ORF の間には、転写終結配列 (E配列） -介在配列 (I配列） -転写開始配列 (S配列）が存 在し、これにより各遺伝子の ORFをコードする RNAが別々のシストロンとして転写され る。
[0031] マイナス鎖 RNAウィルスのウィルスタンパク質をコードする遺伝子としては、 NP、 P、 M、 F、 HN、および L遺伝子が含まれる。 「NP、 P、 M、 F、 HN、および L遺伝子」とは、そ れぞれヌクレオキヤプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、へマグルチニン-ノイラ ミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。パラミクソウィルス 亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に 、 NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもある。
レスピロウイノレス属 NP P/C/V M F HN - L
ルブラウィルス属 NP P/V M F HN (SH) L
モービリウィルス属 NP P/C/V M F H - L
[0032] 例えばセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのァクセッション番 号は、 NP遺伝子については M29343、 M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218、 P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、 M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、 F遺伝子 については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、 HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131、 L遺伝子については
D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。またそ の他のウィルスがコードするウィルス遺伝子を例示すれば、 N遺伝子については、 CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV- 2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091;
PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5， M81442;および Tupaia, AF079780, P遺伝子については、 CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV— 4a, M55975; HPIV— 4b, M55976; Mumps,
D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755;および Tupaia, AF079780、 C遺伝子については CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1. M74081; HPIV-3, D00047; MV, AB016162; RPV, X68311;
SeV, AB005796;および Tupaia, AF079780、 M遺伝子については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV- 2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV- 4a， D10241; HPIV- 4b， D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956;および SV5, M32248、 F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-l. M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3. X05303, HPIV- 4a, D49821; HPIV_4b， D49822; Mumps, D86169;
MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514;
SeV, D17334;および SV5, AB021962、 HN (Hまたは G)遺伝子については CDV， AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV- 4B， AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433;および SV-5， S76876が例示できる。但し、各ウィルスは複数の株が知られ ており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。
これらのウィルス蛋白質をコードする ORFおよび外来遺伝子の ORFは、ゲノム RNA において上記の E-I-S配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノム RNAにおいて 最も 3'に近い ORFは、 3'リーダー領域と該 ORFとの間に S配列のみが必要であり、 Eお よび I酉己列は必要ない。またゲノム RNAにおいて最も 5'に近い ORFは、 5'トレイラー領 域と該 ORFとの間に E配列のみが必要であり、 Iおよび S配列は必要なレ、。また 2つの ORFは、例えば IRES等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能で ある。このような場合は、これら 2つの ORFの間には E-I-S配列は必要なレ、。例えば、 野生型のパラミクソウィルスの場合、典型的な RNAゲノムは、 3'リーダー領域に続き、 N、 P、 M、 F、 HN、および L蛋白質をアンチセンスにコードする 6つの ORFが順に並ん でおり、それに続いて 5'トレイラ一領域を他端に有する。本発明のゲノム RNAにおい ては、ウィルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではなレ、が、好ましくは、野生 型ウィルスと同様に、 3'リーダー領域に続き、 N、 P、 M、 F、 HN、および L蛋白質をコー ドする ORFが順に並び、それに続いて 5'トレイラ一領域が配置されることが好ましい。 ある種のウィルスにおいては、ウィルス遺伝子が異なっている力 そのような場合でも 上記と同様に各ウィルス遺伝子を野生型と同様の配置とすることが好ましい。一般に N、 P、および L遺伝子を保持しているウィルスは、細胞内で自律的に RNAゲノムから 遺伝子が発現し、ゲノム RNAが複製される。さらに Fおよび HN遺伝子等のェンベロー プ蛋白質をコードする遺伝子、および M遺伝子の働きにより、感染性のウィルス粒子 が形成され、細胞外に放出される。従って、このようなウィルスは伝播能を有するウイ ルスとなる。 「伝播能を有する」とは、ウィルスが宿主細胞に感染した場合、該細胞に おいてウィルスが複製され、感染性ウィルス粒子が産生されることを指す。本発明に おいて外来遺伝子は、必要に応じて、このゲノム中の蛋白質非コード領域に揷入す ればよい。
また、本発明のマイナス鎖 RNAウィルスは、野生型ウィルスが持つ遺伝子のいずれ かを欠損したものであってよレ、。例えば、 M、 F、または HN遺伝子、あるいはそれらの 組み合わせが含まれていないウィルスも、本発明において好適に用いることができる 。このようなウィルスの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給 することにより行うこと力 Sできる。このようにして製造されたウィルスは、野生型ウィルス と同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こす力 細胞に導入されたウィルスゲノ ムはウィルス遺伝子に欠損を有するため、最初と同じような感染力を持つ娘ウィルス 粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子（例えば、外来遺伝子）導入力を 持つ安全なウィルスとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えば F遺伝子および Zまたは HN遺伝子が挙げられる。例えば、 F遺伝子が欠損した組み 換えマイナス鎖 RNAウィルスゲノムを発現するプラスミドを、 F蛋白質の発現ベクター ならびに NP、 P、および L蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフエクショ ンすることにより、ウィルスの再構成を行うことができる（WO00/70055および
WO00/70070; Li, H.-O. et al.， J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000))。また、例えば、 F遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いてウィルスを製造することもできる 。これらの蛋白質群は、そのアミノ酸配列はウィルス由来の配列そのままでなくとも、 核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入した り、あるいは他のウィルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、本発明において用いられるウィルスとして、ウィルスゲノムが由来するウィルス のエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むウィルスを作製する こともできる。例えば、ウィルス再構成の際に、ベースとなるウィルスのゲノムがコード するエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、 所望のエンベロープ蛋白質を有するウィルスを製造することができる。このような蛋白 質に特に制限はない。細胞への感染能を与える所望の蛋白質が用いられる。例えば 、他のウィルスのエンベロープ蛋白質、例えば水疱性口内炎ウィルス（Vesicular stomatitis virus; VSV)の G蛋白質（VSV-G)を挙げることができる。 VSV-G蛋白質は、 任意の VSV株に由来するものであってよレ、。例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981))由来の VSV-G蛋白を用いることができる力 これに限定されない。 また本発明のウィルスは、他のウィルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合 わせて含むことができる。例えば、このような蛋白質として、ヒト細胞に感染するウィル スに由来するエンベロープ蛋白質が好適である。このような蛋白質としては、特に制 限はないが、レトロウイルスのアンフォト口ピックエンベロープ蛋白質などが挙げられる 。レトロウイルスのアンフォト口ピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血 病ウィルス（MuLV) 4070A株由来のエンベロープ蛋白質を用い得る。また、 MuMLV 10A1由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えば pCL_10Al(Imgenex) ( Naviaux, R. K. et al, J. Virol. 70: 5701-5705 (1996))。また、ヘルぺスウィルス科の 蛋白質としては、例えば単純へルぺスウィルスの gB、 gD、 gH、 gp85蛋白質、 EBウイノレ スの gp350、 gp220蛋白質などが挙げられる。へパドナウィルス科の蛋白質としては、 B 型肝炎ウィルスの S蛋白質などが挙げられる。これらの蛋白質は、細胞外ドメインを F 蛋白質または HN蛋白質の細胞内ドメインと結合させた融合蛋白質として用いてもよ レ、。このように本発明において用いられるウィルスには、 VSV-G蛋白質などのように、 ゲノムが由来するウィルス以外のウィルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシュ ードタイプウィルスが含まれる。ウィルスのゲノム RNAにはこれらのエンベロープ蛋白 質をゲノムにコードされないように設計すれば、ウィルス粒子が細胞に感染した後は 、ウィルスからこの蛋白質が発現されることはない。
[0036] また、本発明において用いられるウィルスは、例えば、エンベロープ表面に特定の 細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断 片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウィルスエンベロープ由来のポリ ペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これら はウィルスゲノムにコードされていてもよいし、ウィルスの再構成時に、ウィルスゲノム 以外の遺伝子 (例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体上などにある遺伝子）の 発現により供給されてもよい。
[0037] またウィルスは、例えばウィルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、または RNAの転写効率または複製効率を高めるために、ウィルスに含まれる任意のウィルス 遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えば複製因子であ る N、 P、および L遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高 めることが考えられる。また、エンベロープ蛋白質の 1つである HN蛋白質は、赤血球 凝集素であるへマグノレチニン (hemagglutinin)活十生とノィラミニダーゼ (neuraminidase) 活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液 中でのウィルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改 変することにより、感染能を調節することも可能である。また、 F蛋白質を改変すること により膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりう る F蛋白質および/または HN蛋白質の抗原提示ェピトープ等を解析し、これを利用し てこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウィルスを作製することもできる。
[0038] またマイナス鎖 RNAウィルスは、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。 例えば SeVのアクセサリー遺伝子の 1つである V遺伝子をノックアウトすることにより、 培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなぐマウス等の宿主に 対する SeVの病原性が顕著に減少する（Kato, A. et al.， 1997， J. Virol.
71 :7266-7272; Kato, A. et al., 1997， EMBO J. 16:578-587; Curran, J. et al.， WO01/04272, EP1067179) o
[0039] マイナス鎖 RNAウィルスは、例えば、それ自体の抗癌作用との相乗効果が期待され る外来遺伝子を導入するためのベクターとしての役割を担わせることも可能である。 該ベクターは、宿主細胞の細胞質でのみ転写.複製を行い、 DNAフェーズを持たな いため染色体への組み込み（integration)は起こらない（Lamb, R.A. and Kolakofsky, D.， Paramyxovindae: The viruses and their replication. In: Fields BN, Kmpe DM, Howley PM, (eds). Fields of virology. Vol. 2. Lippincott - Raven Publishers:
Philadelphia, 1996, pp. 1177-1204)。このため染色体異常による癌化および不死化 などの安全面における問題が生じなレ、。マイナス鎖 RNAウィルスのこの特徴は、ベタ ターとして利用した際の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、 例えばセンダイウィルス (SeV)を連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、 ゲノムの安定性が高ぐ挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示さ れている（Yu， D. et al., Genes Cells 2, 457-466 (1997))。また、力プシド構造蛋白質 を持たなレ、ことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性 (flexibility) など性質上のメリットがある。このように、マイナス鎖 RNAウィルスには、ヒトの遺伝子治 療のための高効率ベクターとしての機能を付加的に担わせることも可能である。例え ば、伝播能を有するセンダイウィルスは、外来遺伝子を少なくとも 4kbまで導入可能で あり、転写ユニットを付加することによって 2種類以上の遺伝子を同時に発現する事も 可能である。
[0040] またセンダイウィルスは、齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られてい る力 人に対しては病原性がなレ、。これはまた、野生型センダイウィルスの経鼻的投 与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告に よっても支持されている（Hurwitz, J.L. et al, Vaccine 15: 533-540, 1997)。センダイ ウィルスのこれらの特徴は、センダイウィルス力 ヒトの治療へ応用できることを示唆し 、癌の遺伝子治療の有望な選択肢の一つとなることを結論づけるものである。
[0041] 本発明のマイナス鎖 RNAウィルスは、必須ではないが、ゲノム RNA中に外来遺伝子 をコードしてもよレ、。外来遺伝子を含む組換えウィルスは、上記のウィルスのゲノムに 外来遺伝子を揷入することによって得られる。外来遺伝子としては、本発明の RNAゥ ィルスの抗癌作用との相乗効果などを期待できる所望の遺伝子を用いることができる 。外来遺伝子は天然型蛋白質をコードする遺伝子であってもよぐあるいは欠失、置 換または揷入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよ レ、。外来遺伝子の挿入位置は、例えばウィルスゲノムの蛋白質非コード領域の所望 の部位を選択することができ、例えばゲノム RNAの 3'リーダー領域と 3'端に最も近レ、ゥ ィルス蛋白質 ORFとの間、各ウィルス蛋白質 ORFの間、および/または 5'端に最も近 レ、ウィルス蛋白質 ORFと 5'トレイラ一領域の間に挿入することができる。また、 Fまたは HN遺伝子などを欠失するゲノムでは、その欠失領域に外来遺伝子をコードする核酸 を挿入することができる。ノ ミクソウィルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノム への挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長力 S6の倍数となるように挿入することが望まし い（Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, 4822-4830， 1993)。挿入した外来遺伝子とゥ ィルス ORFとの間には、 E-I-S配列が構成されるようにする。 E-I-S配列を介して 2また はそれ以上の遺伝子をタンデムに並べて挿入することができる。
[0042] マイナス鎖 RNAウィルスに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上 流 (ネガティブ鎖の 3'側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる (WO01/18223) oまた、ゲノム上の外来遺伝子の揷入位置によって制御することがで き、ネガティブ鎖の 3'の近くに揷入するほど発現レベルが高ぐ 5'の近くに揷入するほ ど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の揷入位置は、該遺伝子の所望の 発現量を得るために、また前後のウィルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせ が最適となる様に適宜調節することができる。一般に、外来遺伝子の高い発現が得ら れることが有利と考えられるため、外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結 し、ネガティブ鎖ゲノムの 3'端近くに揷入することが好ましい。具体的には、 3'リーダ 一領域と 3'に最も近いウィルス蛋白質 ORFとの間に挿入される。あるいは、 3'に一番 近いウィルス遺伝子の ORFと 2番目の遺伝子の ORFの間に挿入してもよい。野生型 パラミクソウィルスにおレ、ては、ゲノムの 3'に最も近レ、ウィルス蛋白質遺伝子は N遺伝 子であり、 2番目の遺伝子は P遺伝子である。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましく なレ、場合は、例えばウィルスにおける外来遺伝子の揷入位置をネガティブ鎖のなる ベく 5'側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウィルスから の発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
[0043] マイナス鎖 RNAウィルスを製造するには、哺乳動物細胞において、ウィルスの成分 である RNPの再構成に必要なウィルス蛋白質、すなわち N、 P、および L蛋白質の存在 下、ウィルスのゲノム RNAをコードする cDNAを転写させる。転写によりネガティブ鎖ゲ ノム（すなわちウィルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよぐあるいはポジ ティブ鎖（ウィルス蛋白質をコードするセンス鎖）を生成させても、ウィルス RNPを再構 成することができる。マイナス鎖 RNAウィルスの再構成効率を高めるには、好ましくは ポジティブ鎖を生成させる。 RNA末端は、天然のウィルスゲノムと同様に 3'リーダー配 列と 5'トレイラ一配列の末端をなるベく正確に反映させることが好ましい。転写産物の 5'端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位として T7 RNAポリメラーゼ認 識配列を利用し、該 RNAポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。転写産物の 3'端 を制御するには、例えば転写産物の 3'端に自己切断型リボザィムをコードさせておき 、このリボザィムにより正確に 3'端が切り出されるようにすることができる（Hasan, M. K. et al. , J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、 Kato, A. et al" 1997， EMBO J. 16: 578-587及び Yu， D. et al" 1997， Genes Cells 2: 457-466)。
[0044] 例えば、外来遺伝子を有する組み換えセンダイウィルスは、 Hasan, Μ· K. et al. , J.
Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、 Kato, A. et al. , 1997, EMBO J. 16: 578-587及 び Yu， D. et al" 1997， Genes Cells 2: 457-466の記載等に準じて、次のようにして構 築すること力 Sできる。
[0045] まず、 目的の外来遺伝子の cDNA塩基配列を含む DNA試料を用意する。 DNA試料 は、 25ng/micro-L以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが 好ましレ、。以下、 Notl部位を利用してウィルスゲノム RNAをコードする DNAに外来遺 伝子を揷入する場合を例にとって説明する。 目的とする cDNA塩基配列の中に Notl 認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異導入法などを用いて、コードするァミノ 酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、 Notl部位を予め除去しておくことが 好ましい。この試料から目的の遺伝子断片を PCRにより増幅し回収する。 2つのプライ マーの 5'部分に Notl部位を付加しておくことにより、増幅された断片の両端を Notl部 位とする。ウィルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子の ORFとその両側のウィル ス遺伝子の ORFとの間に E-I-S配列が配置されるように、プライマー中に E-I-S配列を 含めるように設計する。
[0046] 例えば、フォワード側合成 DNA配列は、 Notlによる切断を保証するために 5'側に任 意の 2以上のヌクレオチド（好ましくは GCGおよび GCCなどの Notl認識部位由来の配 列が含まれない 4塩基、更に好ましくは ACTT)を選択し、その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを付加し、さらにその 3'側にスぺーサー配列として任意の 9塩基または 9に 6 の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその 3'側に所望の cDNAの開始コドン ATG 力 これを含めて ORFの約 25塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基は Gまたは Cとなるように該所望の cDNAから約 25塩基を選択してフォワード側合成オリ ゴ DNAの 3'の末端とすることが好ましレ、。
[0047] リバース側合成 DNA配列は 5'側から任意の 2以上のヌクレオチド（好ましくは GCGお よび GCCなどの Notl認識部位由来の配列が含まれない 4塩基、更に好ましくは
ACTT)を選択し、その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを付加し、さらにその 3'側に長さ を調節するための揷入断片のオリゴ DNAを付加する。このオリゴ DNAの長さは、最終 的な PCR増幅産物の Notl断片の鎖長が 6の倍数になるように塩基数を設計する（レ、 わゆる「6のルール（rule of six) J； Kolakofski, D. et al.， J. Virol. 72:891-899, 1998; Calain, P. and Roux,し， J. Virol. 67:4822-4830, 1993; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993)。このプライマーに E-I-S配列を付加する場合には、揷 入断片のオリゴ DNAの 3'側にセンダイウィルスの S配列、 I配列、および E配列の相補 鎖配列、好ましくはそれぞれ 5'-CTTTCACCCT-3，（配列番号： 1)、 5，_AAG_3，、お よび 5'-TTTTTCTTACTACGG_3，（配列番号： 2)を付加し、さらにその 3'側に所望 の cDNA配列の終始コドンから逆に数えて約 25塩基相当の相補鎖の最後の塩基が G または Cになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成 DNAの 3'の末端と する。 [0048] PCRは、 Taqポリメラーゼまたはその他の DNAポリメラーゼを用いる通常の方法を用 レ、ることができる。増幅した目的断片は Notlで消化した後、 pBluescript等のプラスミド ベクターの Notl部位に揷入する。得られた PCR産物の塩基配列をシークェンサ一で 確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから揷入断片を Notlで切り 出し、ゲノム cDNAを含むプラスミドの Notl部位にクローニングする。またプラスミドべク ターを介さずにゲノム cDNAの Notl部位に直接挿入し、組み換えセンダイウィルス cDNAを得ることも可能である。
[0049] 例えば、組み換えセンダイウィルスゲノム cDNAであれば、文献記載の方法に準じ て構築することができる（Yu， D. et al" Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, M. K. et al" J. Gen. Virol. 78: 2813-2820， 1997)。例えば、 Notl制限部位を有する 18bpの スぺーサー配列（5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3，）（配列番号： 3)を、クロー ニングされたセンダイウィルスゲノム cDNA (pSeV(+))のリーダー配列と N蛋白質の ORFとの間に挿入し、デルタ月干炎ウィルスのアンチゲノム鎖（antigenomic strand)由 来の自己開裂リボザィム部位を含むプラスミド pSeV18+ b(+)を得る（Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820)。 pSeV18+ b(+)の Notl部位に外来遺伝 子断片を挿入し、所望の外来遺伝子が組み込まれた組み換えセンダイウィルス cDNAを得ることができる。
[0050] このようにして作製した組み換えウィルスのゲノム RNAをコードする DNAを、上記の ウィルス蛋白質 (レ P、および N)存在下において細胞内で転写させることにより、ウイ ルスを再構成することができる。
[0051] また、組み換えウィルスの再構成は公知の方法を利用しても行うことができる（ W097/16539; W097/16538; Durbin, A. P. et al" 1997， Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al, 1994, EMBO J. 13: 4195—4203; Radecke, F. et al" 1995， EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481;
Garcin, D. et al., 1995， EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al, 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T.， 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M.， 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400—15404)。これらの 方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウイ ノレス、リンダ一ペストウィルス、センダイウィルスなどを含むマイナス鎖 RNAウィルスを DNAから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のウィルスを再構 成させることができる。ウィルス DNAにおいて、 F遺伝子、 HN遺伝子、および/または M遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウィルス粒子を形成しなレ、 、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および/または他のウィルスのェンベロー プ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、細胞に導入し発現させることにより、感染 性のウィルス粒子を形成させることが可能である。
[0052] 具体的な手順は、（a)マイナス鎖 RNAウィルスゲノム RNA (ネガティブ鎖 RNA)または その相補鎖（ポジティブ鎖）をコードする cDNAを、 N、 P、および L蛋白質を発現する細 胞で転写させる工程、 （b)生成したマイナス鎖 RNAウィルスを含む培養上清を回収す る工程、により製造すること力できる。転写のために、ゲノム RNAをコードする DNAは 適当なプロモーターの下流に連結される。転写されたゲノム RNAは N、 L、および P蛋 白質の存在下で複製され RNP複合体を形成する。そして M、 HN、および F蛋白質の 存在下でエンベロープに包まれたウィルス粒子が形成される。ゲノム RNAをコードす る DNAは、例えば T7プロモーターの下流に連結させ、 T7 RNAポリメラーゼにより RNAに転写させる。プロモーターとしては、 T7ポリメラーゼの認識配列を含むもの以 外にも所望のプロモーターを利用することができる。あるいは、インビトロで転写させ た RNAを細胞にトランスフエタトしてもよい。
[0053] DNAからのゲノム RNAの最初の転写に必要な T7 RNAポリメラーゼ等の酵素は、こ れを発現するプラスミドまたはウィルスベクターの導入によって供給することができる し、または、例えば細胞の染色体に RNAポリメラーゼ遺伝子を、発現を誘導できるよう に組み込んでおき、ウィルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもでき る。またゲノム RNA、およびウィルス再構成に必要なウィルス蛋白質は、例えばこれら を発現するプラスミドの導入によって供給する。これらのウィルス蛋白質の供給にお レ、て、野生型またはある種の変異マイナス鎖 RNAウィルスなどのヘルパーウィルスを 用レ、ることちできる。
[0054] ゲノム RNAを発現する DNAを細胞内に導入する方法には、例えば次のような方法、 (i) 目的の細胞が取り込めるような DNA沈殿物を作る方法、（ii) 目的の細胞による取り こみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つ DNAを含む複合体を作る方 法、（iii) 目的の細胞膜に、 DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルス によって瞬間的に開ける方法などがある。
[0055] (ii)としては、種々のトランスフエクシヨン試薬が利用できる。例えば、 DOTMA (Roche )、 Superfect (QIAGEN #301305)、 DOTAP、 DOPE, DOSPER (Roche #1811169)など 力 S挙げられる。（i)としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフエクシヨン法が挙 げられ、この方法によって細胞内に入った DNAは貪食小胞に取り込まれる力 S、核内 にも十分な量の DNAが入ることが知られている（Graham, F. L. and Van Der Eb, J. , 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S. , 1977， Cell 11 : 223)。 Chenお よび Okayamaはトランスファー技術の最適化を検討し、 1)細胞と共沈殿物のインキュ ベーシヨン条件を 2〜4% CO、 35°C、 15〜24時間、 2) DNAは直鎖状より環状のもの が活性が高ぐ 3)沈殿混液中の DNA濃度が 20〜30 micro-g/mlのとき最適な沈殿が 得られると報告している（Chen, C. and Okayama, H.， 1987， Mol. Cell. Biol. 7: 2745) 。（ii)の方法は、一過的なトランスフエクシヨンに適している。古くは DEAE-デキストラン (Sigma #D-9885 M.W. 5 X 105)混液を所望の DNA濃度比で調製し、トランスフエクシ ヨンを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまう ため、効果を高めるためにクロ口キンを加えることもできる（Calos, Μ· P. , 1983， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。（iii)の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞 選択性がないという点で G)または (ii)の方法に比べて汎用性が高レ、。効率はパルス電 流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導 電率、 DNA濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
[0056] 以上、 3つのカテゴリーの中で (ii)の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数 の検体を検討することができるので、ウィルス再構成のための DNAの細胞への導入 には、トランスフエクシヨン試薬が適している。好適には Superfect Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305)、または DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Roche, Cat No. 1811169)が用いられる力 これらに制限されなレ、。
[0057] cDNAからのウィルスの再構成は具体的には例えば以下のようにして行うことができ る。
24穴から 6穴程度のプラスチックプレートまたは 100mmペトリ皿等で、 10%ゥシ胎児 血清 (FCS)および抗生物質（100 units/mlペニシリン Gおよび 100 micro-g/mlストレ プトマイシン）を含む最少必須培地（MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株 LLC_MK2 ( ATCC CCL-7)をほぼ 100%コンフルェントになるまで培養し、例えば 1 micro-g/ml psoralen (ソラレン)存在下、紫外線（UV)照射処理を 20分処理で不活化した、 T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルス vTF7- 3 (Fuerst, T. R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126,1986、 Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)を 2 PFU/細胞で感染させる。ソラレンの添加量および UV照射時間 は適宜調整することができる。感染 1時間後、 2〜60 micro-g,より好ましくは 3〜20 micro-gの組換えセンダイウィルスのゲノム RNAをコードする DNAを、ウィルス RNPの 生成に必須なトランスに作用するウィルス蛋白質を発現するプラスミド（0.5〜24 micro- gの pGEM_N、 0.25〜12 micro- gの pGEM_P、および 0.5〜24 micro- gの pGEM-L) (Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579， 1996)と共に Superfect (QIAGEN 社）を用いたリポフエクシヨン法等によりトランスフエクシヨンする。 N、 P、および Lをコー ドする発現ベクターの量比は例えば 2 : 1 : 2とすることが好ましぐプラスミド量は、例 えば 1〜4 micro-gの pGEM- N、 0.5〜2 micro- gの pGEM- P、および 1〜4 micro- gの pGEM-L程度で適宜調整する。
トランスフエクシヨンを行った細胞は、所望により 100 micro_g/mlのリファンピシン（ Sigma)及びシトシンァラビノシド（AraC)、より好ましくは 40 micro-g/mlのシトシンァラ ピノシド（AraC) (Sigma)のみを含む血清不含の MEMで培養し、ワクシニアウィルスに よる細胞毒性を最少にとどめ、ウィルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度 を設定する（Kato, A. et al" 1996， Genes Cells 1: 569-579)。トランスフエクシヨンから 48〜72時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を 3回繰り返して細胞を破砕した 後、 RNPを含む破砕物を LLC-MK2細胞に再度トランスフエクシヨンして培養する。ま たは、培養上清を回収し、 LLC-MK2細胞の培養液に添加して感染させ培養する。ト ランスフエクシヨンは、例えばリポフエクトァミンまたはポリカチォニックリボソームなどと 共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトラ ンスフヱクシヨン試薬が利用できる。例えば、 DOTMA (Roche) , Superfect (QIAGEN #301305)、 DOTAP、 DOPE, DOSPER (Roche #1811169)などが挙げられる。エンドソ ーム中での分解を防ぐため、クロ口キンを加えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。 RNPが導入された細胞では、 RNPからのウイ ルス遺伝子の発現および RNPの複製の過程が進行しウィルスが増幅する。得られた ウィルス溶液を希釈 (例えば 106倍）して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウイ ルス vTF7_3は完全に除去することができる。再増幅は、例えば 3回以上繰り返す。得 られたウィルスは- 80°Cで保存することができる。エンベロープ蛋白質をコードする遺 伝子を欠損した伝播能を持たなレ、ウィルスを再構成させるには、エンベロープ蛋白 質を発現する LLC-MK2細胞をトランスフエクシヨンに使用する力、またはェンベロー プ発現プラスミドを共にトランスフエクシヨンすればよレ、。また、トランスフエクシヨンを行 つた細胞にエンベロープ蛋白質を発現する LLC-MK2細胞を重層して培養することに よって欠損型ウィルスを増幅することもできる（国際公開番号 WO00/70055および WO00/70070参照）。
[0059] 回収されたウィルスの力価は、例えば CIU (CelHnfected Unit)測定または赤血球 凝集活性 (HA)の測定することにより決定することができる（WO00/70070; Kato, A. et al., 199り， Genes Cells 1 : 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999)。また、 GFP (緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を 搭載したウィルスについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントするこ とにより力価を定量することができる（例えば GFP-CIUとして）。このようにして測定し た力価は、 CIUと同等に扱うことができる（WO00/70070)。
[0060] ウィルスが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されなレ、。例えば
、センダイウィルス等の再構成においては、サル腎由来の LLC-MK2細胞および
CV-1細胞、ハムスター腎由来の BHK細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うこ とができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、その蛋 白質をエンベロープに有する感染性ウィルス粒子を得ることもできる。また、大量にセ ンダイウィルスを得るために、上記の宿主から得られたウィルスを発育鶏卵に感染さ せ、該ウィルスを増幅することができる。鶏卵を使ったウィルスの製造方法は既に開 発されている（中西ら編， (1993),「神経科学研究の先端技術プロトコール III，分子神経 細胞生理学」，厚生社，大阪， ρρ.153-172) 0具体的には、例えば、受精卵を培養器 に入れ 9〜12日間 37〜38°Cで培養し、胚を成長させる。ウィルスを尿膜腔へ接種し、 数日間（例えば 3日間）卵を培養してウィルスを増殖させる。培養期間等の条件は、 使用する組み換えセンダイウィルスにより変わり得る。その後、ウィルスを含んだ尿液 を回収する。尿液からのセンダイウィルスの分離 ·精製は常法に従って行うことができ る（田代眞人，「ウィルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビユー社， pp.68-73, (1995)) 0
[0061] 例えば、 F遺伝子を欠失したセンダイウィルスの構築と調製は、以下のように行うこと ができる（WO00/70055および WO00/70070参照）。
[0062] < 1 > F遺伝子欠失型センダイウィルスゲノム cDNAおよび F発現プラスミドの構築 センダイウィルス（SeV)全長ゲノム cDNA、 pSeV18+b (+) (Hasan, M. K. et al.， 1997, J. General Virology 78: 2813-2820) (「pSeV18+ b(+)」は 36 18+」ともいう）の cDNAを Sphl/Kpnlで消化してフラグメント (14673bp)を回収し、 pUC18にクローニングしてブラ スミド PUC18/KSとする。 F遺伝子欠損部位の構築はこの pUC18/KS上で行う。 F遺伝 子の欠損は、 PCR-ライゲーシヨン方法の組み合わせで行レ、、結果として F遺伝子の ORF (ATG-TGA=1698bp)を除レ、て例えば atgcatgccggcagatga (配列番号： 4)で連結 し、 F遺伝子欠失型 SeVゲノム cDNA (pSeV18+/ A F)を構築する。 PCRは、 Fの上流に は [forward: 5— gttgagtactgcaagagc 酉己歹 I [番号： 5， reverse:
0— tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc 酉己歹'」^ 亏： 6]、 F退 is子の卜流に は [forward: 5 -atgcatgccggcagatga/酉 ΰ歹' J 号： ( , reverse:
5'_tgggtgaatgagagaatcagcZ配列番号： 8]のプライマー対を用いた PCRの産物を EcoT22Iで連結する。このように得られたプラスミドを Saclと Sailで消化して、 F遺伝子 欠損部位を含む領域の断片（4931bp)を回収して pUC18にクローユングし、
pUC18/dFSSとする。この pUC18/dFSSを Drainで消化して、断片を回収して pSeV18+ の F遺伝子を含む領域の Drain断片と置き換え、ライゲーシヨンしてプラスミド pSeV18 /△Fを得る。
外来遺伝子は、例えば pUC18/dFSSの F遺伝子欠失部位にある制限酵素 Nsilおよ び NgoMIV部位に揷入する。このためには、例えば外来遺伝子断片を、 Nsil-tailed プライマーおよび NgoMIV-tailedプライマーで増幅すればよレ、。
< 2 > SeV_F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウィルスの F遺伝子（SeV_F)を発現する Cre/loxP誘導型発現プラスミドの 構築は SeV_F遺伝子を PCRで増幅し、 Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物が 誘導発現されるように設計されたプラスミド pCALNdlw (Arai， T. et al.， J. Virology 72, 1998, pi 115-1121)のユニークサイト Swal部位に挿入し、プラスミド pCALNdLw/Fを 構築する。
F遺伝子欠損ゲノムから感染ウィルス粒子を回収するため、 SeV-F蛋白を発現する ヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えば SeVの増殖によく用いられているサル 腎臓由来細胞株 LLC-MK2細胞を用いることができる。 LLC-MK2細胞は、 10%の熱 処理した不動化ゥシ胎児血清 (FBS)、ペニシリン Gナトリウム 50単位/ ml、およびストレ プトマイシン 50 micro-g/mlを添加した MEMで 37°C、 5% COで培養する。 SeV_F遺 伝子産物は細胞傷害性を有するため、 Cre DNAリコンビナーゼにより F遺伝子産物を 誘導発現されるように設計された上記プラスミド pCALNdLw/Fを、リン酸カルシウム法 (.mammalian transfection kit (Stratagene)) (こより、周矢口のフロトコ1 ~ノレ (こ¾：って
LLC-MK2細胞に導入する。
10cmプレートを用レ、、 40%コンフルェントまで生育した LLC-MK2細胞に 10 micro-g のプラスミド pCALNdLw/Fを導入後、 10mlの 10% FBSを含む MEM培地にて、 37。Cの 5 %CO インキュベータ一中で 24時間培養する。 24時間後に細胞をはがし、 10nd培地 に懸濁後、 10cmシャーレ 5枚を用レ、、 5ml 夂、 2ml 2枚、 0.2ml 2枚に蒔き、 G418 (GIBCO-BRL)を 1200 micro-g/mlを含む 10mlの 10%FBSを含む MEM培地にて培養を 行レ、、 2日毎に培地交換しながら、 14日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行 う。該培地により生育してきた G418に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて 回収する。回収した各クローンは 10cmプレートでコンフルェントになるまで拡大培養 を続ける。 F蛋白質の発現誘導は、細胞を 6cmシャーレにてコンフルェントまで生育させた後、 アデノウイルス AxCANCreを斉藤らの方法（Saito et al.， Nucl. Acids Res. 23:
3816-3821 (1995); Arai, T.et al.， J. Virol 72, 1115-1121 (1998))により例えば moi=3 で感染させて行うことができる。
< 3 > F遺伝子欠失 SeVウィルスの再構築及び増幅
上記 pSeV18+/ A Fの外来遺伝子が揷入されたプラスミドを以下のようにして LLC-MK2細胞にトランスフエクシヨンする。 LLC- MK2細胞を 5 X 106 cells/dishで 100mmのシャーレに播く。 T7 RNAポリメラーゼによりゲノム RNAの転写を行わせる場 合には、細胞培養 24時間後、ソラレン (psoralen)と長波長紫外線 (365nm)で 20分間 処理した T7 RNAポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウィルス（
PLWUV-VacT7 : Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986))を MOI 2程度で室温で 1時間感染させる。ワクシニアウィルスへの紫外線照射 には、例えば 15ワットバルブを 5本が装備された UV Stratalinker 2400 (カタログ番号 400676 (100V),ストラタジーン社， La Jolla, CA， USA)を用レ、ること力 Sできる。細胞を 無血清の MEMで洗浄した後、ゲノム RNAを発現するプラスミド、およびマイナス鎖 RNAウィルスのそれぞれ N、 P、 L、 F、および HN蛋白質を発現する発現プラスミドを、 適当なリポフエクシヨン試薬を用いてこの細胞にトランスフエタトする。プラスミドの量比 は、これに限定されないが、好適には順に 6 : 2 : 1 : 2 : 2 : 2とすることができる。例えば 、ゲノム RNAを発現するプラスミド、並びに N、 P、 L、および Fプラス HN蛋白質を発現 する発現プラスミド（pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L及び pGEM/F— HN;
WO00/70070, Kato, A. et al , Genes Cells 1， 569-579 (1996))を、それぞれ 12 micro-g, 4 micro-g, 2 micro-g, 4 micro - g及び 4 micro-g/ dishの量比卜フンスフェ外 する。数時間培養後、血清を含まない MEMで細胞を 2回洗浄し、 40 micro-g/mLの Cytosine β -D-arabinofuranoside (Araし： Sigma, St. Louis, MO)及び 7.0
micro-g/mLの Trypsin (Gibco- BRL， Rockville, MD)を含む MEMで培養する。これら の細胞を回収し、ペレットを OptiMEMに懸濁する（107 cells/ml) 0凍結融解を 3回繰 り返して lipofection reagent DOSPER (Boehringer mannheim)と混合し (10 cells/25 micro-L DOSPER)室温で 15分放置した後、上記でクローニングした F発現ヘルパー 細胞にトランスフエクシヨン（106cells /well 12-wel卜 plate)し、血清を含まない MEM (40 micro-g/ml AraC, 7.5 micro-g/mlトリプシンを含む)で培養し、上清を回収する。 F 以外の遺伝子、例えば HNまたは M遺伝子を欠損したウィルスも、これと同様の方法 で調製すること力 Sできる。
[0065] なお、本発明のマイナス鎖 RNAウィルスは、組み換えウィルスでなぐ天然のウィル スであっても使用することが可能であり、各 RNAウィルスの精製方法、増殖方法、単 離株の取得方法については、ウィルス学実験学各論、改訂二版（国立予防衛生研 究所学友会編、丸善、 1982)を参照することができる。例えば、パラミクソウィルス科（ Paramyxoviridae)のセンダイウィルスなどパラインフルエンザウイルスは、各型ともサ ル腎臓 (MK2)、ヒト胎児肺、腎臓、羊膜の初代培養細胞、およびトリプシン添加 Vero 細胞で良く増殖し（同上， p334 ; Itoh H et al., Jap.J.Med.Sci.Biol. 23， 227 (1970))回 収することができる。精製は、ショ糖密度勾配遠心法、平衡遠心法などで精製できる（ p336)。麻疹ウィルスは、サル由来の各種細胞で良く増殖でき（Matsumoto M, Bact. Rev. 30， 152 (1966)) Vero細胞が最も汎用されているが、 CV1, FL, KB, HeLa HEp2 などを使用して増殖可能である（p351)。狂犬病ウィルスなどのラブドウィルス科（ Rhabdoviridae)では組織培養法を用いて、 BHK、 CEおよび Vero細胞などが使用され ている。精製法としては、感染 3〜4日の培養液を pH7.4以上に補正し、低速遠心で 細胞片を除き濃縮する（P376)。ラッサウィルスなどのァレナウィルス科（Arenaviridae) は、 in vitroで継代されているほとんどの培養細胞でよく増殖する力 HK-21/13S細 胞に感染させた後、寒天中に suspendした形で培養することによって増殖が可能であ る（Sedwik W.D.J.Virol. l, 1224 (1967) ) (p240) oインフルエンザウイルスなどのオルソ ミクソウィルス科（Orthomyxoviridae)は、発育鶏卵や MDCK細胞において増殖できる (p295)。精製は遠心分画法、赤血球への吸着'游出による精製 (Laver W.G., Fundamental Techniques in Virology, 82 (1969) )などで精製できる（p317)。
[0066] 本発明の一つの態様において、マイナス鎖 RNAウィルスにより導入する外来遺伝 子としては、特に制限はなレ、が、天然の蛋白質としては、例えばホルモン、サイトカイ ン、増殖因子、受容体、細胞内シグナル分子、酵素、ペプチドなどが挙げられる。蛋 白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な 蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（ 受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の 細胞接着分子および細胞表面分子などが挙げられる。また、分泌シグナル、膜局在 化シグナル、または核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝 子としてアンチセンス RNA分子または RNA切断型リボザィムなどを発現させて、特定 の遺伝子の機能を抑制することもできる。外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を 用いて本発明のウィルスを調製すれば、このウィルスを投与して遺伝子治療を行うこ とが可能となる。
[0067] 本明細書に記載したウィルス製造方法に従えば、本発明のウィルスは、例えば 1 X 105 CIU/mL以上、好ましくは 1 X 106 CIU/mL以上、より好ましくは 5 X 106 CIU/mL 以上、より好ましくは 1 X 107 CIU/mL以上、より好ましくは 5 X 107 CIU/mL以上、より 好ましくは 1 X 108 CIU/mL以上、より好ましくは 5 X 108 CIU/mL以上の力価でウィル ス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウィルスの力価は、本明細 書および他に記載の方法により測定することができる（Kiyotani, K. et al.， Virology 177(1), 65-74 (1990); WO00/70070)。
[0068] 回収したウィルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィ ルトレーシヨン (濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の精製'分 離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。 「実質的に純粋」とはゥ ィルスを含む溶液中でウィルスの成分が主要な割合を占めることを言う。例えば実質 的に純粋なウィルス組成物は、溶液中に含まれる全蛋白質 (但しキャリアーや安定剤 としてカ卩えた蛋白質は除く）のうち、ウィルスの成分として含まれる蛋白質の割合が 10% (重量/重量）以上、好ましくは 20%以上、より好ましくは 50°/o以上、好ましくは 70°/o 以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上を占めることにより確認する ことができる。例えばパラミクソウィルスであれば、具体的な精製方法としては、セル口 ース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭 62-30752号公報、特公昭 62-33879号公報、および特公昭 62-30753号公報）、およ びフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法 (WO97/32010 )等を例示することができるが、これらに制限されない。 [0069] 本発明におけるマイナス鎖 RNAウィルスは、例えば、感染性ウィルス粒子であって も非感染性ウィルス粒子であってもよレ、。また、本発明の RNAウィルスは、ゲノム
RNA-蛋白複合体 (ribonucleoprotein complex; RNP)であってもよレヽ。これらの粒子も しくは複合体を利用する場合には、これら粒子もしくは複合体を、リポフエクシヨン試 薬と混合させてインビボ投与することが好ましい。例えばリボフヱクトァミンやポリカチ ォニックリボソームなどと粒子もしくは複合体とを混合させて、その混合物をインビボ 投与することができる（WO00/70055)。この方法においては、種々のトランスフエクシ ヨン試薬が利用できる。例えば、 DOTMA (Boehringer) , Superfect (QIAGEN #301305 )、 DOTAP、 DOPE, DOSPER (Boehringer #1811169)などが挙げられる。エンドソーム 中での分解を防ぐため、クロ口キンを加えることもできる（Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。
[0070] 本発明におけるマイナス鎖 RNAウィルスを含む抗癌剤の製造においては、マイナス 鎖 RNAウィルスは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と混合 する（組み合わせる）こと力 Sできる。
即ち本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスと、薬学的に許容される担体または媒体と を混合する工程を含む、抗癌剤の製造方法を提供する。
[0071] 「薬学的に許容される担体または媒体」とは、マイナス鎖 RNAウィルスと共に投与す ることが可能であり、マイナス鎖 RNAウィルスの感染を有意に阻害しない材料である。 このような担体または媒体としては、例えば脱イオン水、滅菌水、塩化ナトリウム溶液 、デキストロース溶液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸含有リンゲル溶液、 培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)などが挙げられ、これらとマイナス鎖 RNAウィルスを適宜組み合わせて製剤化することが考えられる。また、必要に応じて 遠心などにより濃縮され、培養液または生理食塩水などの生理的溶液中に再懸濁さ れてよレ、。また、リボソームの膜安定化剤（例えばコレステロール等のステロール類） を含んでいてもよレ、。また、抗酸化剤（例えばトコフエロールまたはビタミン Eなど）を含 んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物 剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる
。本発明の組成物は、水溶液、カプセル、懸濁液、シロップなどの形態であり得る。ま た本発明のウィルス組成物は溶液、凍結乾燥物、またはエアロゾノレの形態の組成物 であってよい。凍結乾燥物の場合は安定化剤としてソルビトール、シユークロース、了 ミノ酸及び各種蛋白質等を含んでレ、てもよレ、。
[0072] 本発明のマイナス鎖 RNAウィルスは抗癌活性を有しており、腫瘍 (癌組織）に投与 することにより抗癌（制癌）作用を発揮できる。つまり本発明は、マイナス鎖 RNAウィル スを癌組織へ投与 (インビボ投与）する工程を含む、癌の抑制方法 (癌細胞増殖の抑 制方法、または癌の治療方法）に関する。
[0073] 例えば、癌患者に対して癌治療を行うことができる。この方法は、マイナス鎖 RNAゥ ィルス (本発明の抗癌剤）を投与する工程を含む方法である。具体的には、マイナス 鎖 RNAウィルスの治療上有効量を、患者に投与する工程を含む方法である。本方法 により、本発明のマイナス鎖 RNAウィルスを投与しない場合に比べ、癌細胞の増殖を 抑制することが期待できる。マイナス鎖 RNAウィルスは、外来遺伝子を持たないもの であってもよく、あるいは癌抗原、免疫刺激性サイト力イン、血管新生を阻害する蛋白 質などの 1つまたは複数をコードする遺伝子（外来遺伝子）を持つものであってもよい
[0074] 本発明は、所望の固形癌に適用することができ、例えば舌癌、歯肉癌、悪性リンパ 腫、悪性黒色腫 (メラノーマ)、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭癌、咽頭癌、神経膠腫、 髄膜腫、神経膠腫、肺癌、乳癌、膝癌、消化器癌 (食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸 癌）、扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、甲状腺癌、肝癌、卵巣 癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫などが挙げられる。対象となる癌は、 好ましくは上皮癌であり、より好ましくは、皮膚扁平上皮癌、皮膚基底細胞癌、皮膚ボ ーェン病、皮膚ページエツト病、皮膚悪性黒色腫などを含む皮膚癌である。
[0075] 本発明のマイナス鎖 RNAウィルス（本発明の抗癌剤）のインビボでの投与量は、疾 患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導 入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与 経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内 的、腹腔内、静脈内、関節内、または皮下等に行われうる。投与は局所あるいは全身 であってよい。投与されるウィルスは好ましくは約 105 ClU/mlから約 1011 ClU/m より 好ましくは約 107 ClU/mlから約 109 CIU/m 最も好ましくは約 1 X 108 CIU/mlから約 5 X 108 CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。 ヒトにおいては 1回当たりの投与量は 2 X 105 CIU〜 2 X 1011 CIUが好ましぐ投与回 数は、 1回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、 1日の投与 回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの 体重比または投与標的部位の容積比 (例えば平均値)で上記の投与量を換算した 量を投与することができる。なお、伝播性のマイナス鎖 RNAウィルスを個体または細 胞に投与後、治療が完了するなどウィルスの増殖を抑止する必要が生じた際には、 RNA依存性 RNAポリメラーゼ阻害剤を投与すれば、宿主に障害を与えずにウィルス の増殖だけを特異的に抑止することもできる。
[0076] 本発明のマイナス鎖 RNAウィルスを投与する場合は、好ましくは、患者の癌病巣に 投与する。癌病巣とは、癌組織またはその周囲（例えば癌から 5 mm以内、好ましくは 3 mm以内）の領域を言う。なお投与量は、癌のタイプやステージ、導入遺伝子の有 無等により適宜調節されてよい。マイナス鎖 RNAウィルスは外来遺伝子を搭載してい なくても抗腫瘍効果が期待されるが、より相乗的な効果を期待して、例えば、
IFN-beta遺伝子または可溶性 FGF受容体遺伝子などを RNAウィルスに搭載させるこ とも可能である。
[0077] マイナス鎖 RNAウィルスの投与回数は、 1回または臨床上容認可能な副作用の範 囲で複数回可能であり、 1日の投与回数についても同様である。投与対象としては特 に制限はないが、例えば、ニヮトリ、ゥズラ、マウス、ラット、ィヌ、ブタ、ネコ、ゥシ、ゥサ ギ、ヒッジ、ャギ、サル、およびヒトなどを含む鳥類、哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳動 物）が挙げられる。ヒト以外の動物に投与する場合は、例えば目的の動物とヒトとの体 重比で上記の投与量を換算した量を投与することができる。
[0078] また本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスの、癌治療における使用に関する。また、本 発明は、マイナス鎖 RNAウィルスの、抗癌剤ほたは制癌剤、癌増殖抑制剤など）の 製造における使用に関する。
[0079] また本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスを含むパッケージであって、該マイナス鎖 RNAウィルスを癌抑制に (抗癌剤として)使用することの記載を含むパッケージに関 する。マイナス鎖 RNAウィルスは、培養液または生理食塩水などの溶液中に懸濁さ れていてよい。癌抑制に使用することとは、例えばマイナス鎖 RNAウィルス、またはそ れを含む組成物が、腫瘍増殖抑制、癌の縮退、癌治療、癌患者の処置'治療、癌患 者の延命、または抗癌剤として用いられることである。該記載は、パッケージに直接 記載されてレ、てもよレ、し、該記載を含む紙やシールをパッケージに含んでレ、てもよレヽ 。パッケージは、マイナス鎖 RNAウィルスを含む容器であってよぐその場合、容器は 、例えばボトル、チューブ、ビニールバッグ、バイアル、シリンジ等であってよい。また 本発明のパッケージは、該容器を収納するバッグまたは外箱等を含んでもよい。パッ ケージには、マイナス鎖 RNAウィルスの投与方法が記載された説明書を含んでもよく 、マイナス鎖 RNAウィルス投与のためのシリンジ、カテーテル、および/または注射針 等をさらに含んでもよい。
[0080] さらに本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスを少なくとも構成成分として含有する、癌 治療用もしくは抗癌剤製造用キットに関する。本発明のキットは、マイナス鎖 RNAウイ ルス以外に、例えば、担体、生理食塩水、緩衝液、ボトル、チューブ、ビニールバッグ 、バイアル、シリンジ等を、適宜含んでいてもよい。また、使用書をパッケージングする ことちでさる。
なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれ る。
実施例
[0081] 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
[0082] 〔実施例 1〕 治療遺伝子を持たないセンダイウィルスによる抗腫瘍効果
メラノーマ細胞株 B16F1 (ATCC CRL-6323) 1 X 105個を、 C57BL/6マウス（6〜8週 齢、雌）の腹側皮下へ接種した（n = 4)。接種後 5日（day 5)および 12日（day 12)に、 特別な治療遺伝子を有さなレ、センダイウィルス（GFP発現 SeV； SeV-GFP)、ヒト可溶 型 FGF受容体を発現するセンダイウィルス（SeV-sFGFR)、またはヒト PDGFR a可溶 型を発現するセンダイウィルス（SeV-hsPDGFR α )、各 1 X 108PFUを腫瘍内注射し、 以降、腫瘍サイズを経時的に測定した。 その結果、いずれの SeV投与群においても、 SeV非投与群に比べて腫瘍サイズが 有意に縮小した（図 1)。このように、 SeVのインビボ投与は、治療遺伝子を持たないも のであっても抗腫瘍効果を発揮することができた。可溶型 FGF受容体を発現する SeV を投与した場合は、 SeV-GFP投与群よりも強い腫瘍増殖抑制効果が確認され、可溶 型 PDGFRひを発現する SeVを投与した場合の抗腫瘍効果は最も顕著で、腫瘍サイズ はほどんど増加しなかった。
以上から、治療遺伝子等の外来遺伝子を持たなレ、 SeVであっても、十分な抗腫瘍 効果を発揮することが明らかとなった。
〔実施例 2〕 治療遺伝子 (IFN ）を有するセンダイウィルスによる抗腫瘍効果 本実施例は、 RNAウィルスのインビボおよびエタスビボ投与による腫瘍の治療方法 の一例を示す。
腫瘍モデルとして、 MHC Class Iを非常に低いレベルでしか発現せず免疫原性に 乏しい B16メラノーマの移植モデルを採用した。腫瘍モデルマウスには、 C57BL/6マ ウス（6〜8週齢、メス）（日本チャールズ 'リバ一）を用レ、、榭状細胞は C57BL/6マウス（ 8週齢、メス）（日本チャールズ 'リバ一）より採取した。榭状細胞は、 C57BL/6マウス の大 ϋ¾' より を採取し、 SpinSep , murine hematopoetic progenitor
enrichmentcocktail 几 CD5饥体， inJCD45R¾ #:,饥 CDl lbf几体，饥 Gr_l 体,饥 TER119抗体，抗 7/4抗体、 StemCell technology)を使用し、 T cellを除去した後、 IL-4 および GM-CSFを添加し 1週間培養して得た。 1 X lOVlOO micro-Lの B16メラノーマ 細胞を day 0にマウスの腹部皮下（s. ）接種した。 Day 10、 17、および 24に、活性化 刺激を加えない樹状細胞、 LPSで活性化させた樹状細胞（LPS DC)、あるいは
SeV_GFPまたはマウスインターフェロン βを発現する SeV_IFN βを導入して活性化さ せた樹状細胞（それぞれ SeV GFP DCまたは SeV IFN β DC)を腫瘍周囲に投与した 。このとき、樹状細胞に腫瘍抗原（B16の freeze and thawによる腫瘍ライセート）をパル スしてから投与する実験も行った。これらとは別に、腫瘍接種後 10日目 （day 10)に SeV-IFN βを直接、腫瘍内注入（intratumoral injection)して抗腫瘍効果を調べる実 験も行った。
樹状細胞への SeVの導入では、上記のように 1週間培養した榭状細胞に SeV-IFN β を MOI 40で感染させ、 8時間培養した。腫瘍抗原をパルスする場合は、上記のように 1週間培養した樹状細胞を回収し、腫瘍抗原となる tumor lysateをパルス (DC： tumor lysate= 1： 3)し、 18時間培養した後、 SeV_IFN /3を MOI 40で感染させ、 8時間 培養した。その後、これらの樹状細胞を回収し、 5xl05から ΙΟχΙΟ5細胞数をマウスの 腫瘍周囲に投与した。
[0084] 図 2に示すように、 SeV-IFN βの直接腫瘍内注入および樹状細胞を介したエタスビ ボ投与は、どちらも腫瘍増殖を抑制した。特に DC/SeV-IFN /3で処理したマウスでは 、非常に強い腫瘍抑制効果が観察された。
[0085] 上記の各治療群における抗腫瘍効果をより詳細に検討した。ナチュラルキラー
(NK)細胞活性をアツセィするために、上記の各治療群について、 3回の DC療法終了 7日後のマウスより脾臓を摘出し、エフェクター細胞を作成した。ターゲットとして Yac-1を使用し、 51Cr放出アツセィを行った。また、 Tリンパ球の細胞傷害性をアツセィ するため、上記の NK細胞活性アツセィに使用した脾臓細胞の残りを用いて、 B16の 腫瘍抗原である TRP-2ペプチドとともに、 5日間培養した細胞をエフェクター細胞とし て用い、 mTRP-2ペプチドをパルスした EL-4ターゲット細胞と共培養し、 51Cr放出アツ セィを行った。特異的51 Cr放出の割合は以下のように計算した。
[(試料の cpm - 自発放出の cpm) / (最大放出の cpm -自発放出の cpm)] x 100 ここで、最大放出は 1% triton Xと共にインキュベートしたターゲット細胞、 自発放出 は培養液のみでインキュベートしたターゲット細胞を用いた。
[0086] ナチュラルキラー（NK)細胞の活性化は、直接 SeVを注入したマウスにのみ見られ、 樹状細胞投与群では検出されなかった（図 3)。これに対して、細胞傷害性 Tリンパ球 (cytotoxic T-lymphocytes, CTL)の活性化は、 DC/LPS処理群および DC/SeV- IFN βで処理したマウスで最も強ぐ DC/SeV-GFP処理群ではそれよりも若干弱ぐ SeV-IFN /3の直接注入群では検出されなかった（図 4)。腫瘍ライセートのパルスは、 腫瘍増殖にも CTL応答にも有意に影響しなかった。このように、 SeV-IFN j3の直接投 与は NK細胞を強く活性化することが判明した。
従って、 SeVを投与した場合の腫瘍抑制効果は、 NK細胞の活性化を機序とするも のであることが示唆された。さらに、治療遺伝子を持たない SeVを投与することに加え て、治療効果が期待される遺伝子を有する SeVを投与することによつても、癌に対し て、より有効な治療効果が発揮されることが示された。
産業上の利用可能性
本発明により、マイナス鎖 RNAウィルスを有効成分とする抗癌剤が提供された。本 発明の RNAウィルスは、治療効果を有する外来遺伝子を持たない状態で、効果的な 癌治療効果が発揮されることから、外来遺伝子の導入のためのコストの削減、および ウィルスの調製のための操作時間の削減に大きく寄与するものと考えられる。本発明 は、マイナス鎖 RNAウィルスによる新たなウィルス療法を可能にする。

Claims

請求の範囲
[1] マイナス鎖 RNAウィルスを含む抗癌剤。
[2] マイナス鎖 RNAウィルスが外来蛋白質をコードしない、請求項 1に記載の抗癌剤。
[3] マイナス鎖 RNAウィルスが感染性または非感染性ウィルス粒子である、請求項 1ま たは 2に記載の抗癌剤。
[4] RNAウィルスがゲノム RNA—蛋白複合体である、請求項 1から 3のいずれかに記 載の抗癌剤。
[5] マイナス鎖 RNAウィルスがパラミクソウィルスである、請求項 1から 4のいずれかに 記載の抗癌剤。
[6] ノ ミクソウィルスがセンダイウィルスである、請求項 5に記載の抗癌剤。
[7] マイナス鎖 RNAウィルスと、薬学的に許容される担体または媒体とを混合する工程 を含む、抗癌剤の製造方法。
[8] マイナス鎖 RNAウィルスを癌組織へ投与する工程を含む癌の抑制方法。
PCT/JP2005/008124 2004-06-24 2005-04-28 マイナス鎖rnaウイルスを含む抗癌剤 WO2006001120A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2005257105A AU2005257105A1 (en) 2004-06-24 2005-04-28 Anticancer agent containing minus-strand RNA virus
CA002571844A CA2571844A1 (en) 2004-06-24 2005-04-28 Anticancer agent containing minus-strand rna virus
JP2006528383A JPWO2006001120A1 (ja) 2004-06-24 2005-04-28 マイナス鎖ｒｎａウイルスを含む抗癌剤
US11/630,522 US20080031855A1 (en) 2004-06-24 2005-04-28 Anticancer Agent Containing Minus-Strand Rna Virus
EP05736740A EP1775342A4 (en) 2004-06-24 2005-04-28 ANTITUM-AGENT WITH MINUS STRAND RNA VIRUS

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-187028 2004-06-24
JP2004187028 2004-06-24
JPPCT/JP2004/016089 2004-10-29
PCT/JP2004/016089 WO2005042737A1 (ja) 2003-11-04 2004-10-29 遺伝子導入された樹状細胞の製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006001120A1 true WO2006001120A1 (ja) 2006-01-05

Family

ID=37866022

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/008175 WO2006001122A1 (ja) 2004-06-24 2005-04-28 Rnaウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
PCT/JP2005/008124 WO2006001120A1 (ja) 2004-06-24 2005-04-28 マイナス鎖rnaウイルスを含む抗癌剤

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/008175 WO2006001122A1 (ja) 2004-06-24 2005-04-28 Rnaウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20080031855A1 (ja)
EP (2) EP1775343A4 (ja)
JP (3) JPWO2006001120A1 (ja)
KR (2) KR101270839B1 (ja)
CN (2) CN101006172B (ja)
AU (2) AU2005257105A1 (ja)
CA (2) CA2571849A1 (ja)
HK (1) HK1106794A1 (ja)
WO (2) WO2006001122A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008136438A1 (ja) * 2007-04-27 2008-11-13 Kyushu University, National University Corporation 遺伝子治療用ウイルスベクター
US20090053790A1 (en) * 2006-01-31 2009-02-26 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. Polypeptide Having Affinity for Envelope Virus Constituent and Use Thereof in Transferring Substance Into Cell
WO2010032764A1 (ja) * 2008-09-16 2010-03-25 ジェノミディア株式会社 前立腺癌の治療・予防剤

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE470704T1 (de) * 1995-11-01 2010-06-15 Dnavec Research Inc Rekombinantes sendai-virus
US20030166252A1 (en) * 1999-05-18 2003-09-04 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
KR100854917B1 (ko) * 2000-03-30 2008-08-27 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 센다이바이러스 벡터를 사용한 ａｉｄｓ 바이러스 백신
US20060104950A1 (en) * 2002-10-24 2006-05-18 Shinji Okano Methods of Tranducing genes into T cells
US20070269414A1 (en) * 2003-11-04 2007-11-22 Shinji Okano Method for Producing Gene Transferred Denritic Cells
EP1712243A4 (en) * 2004-01-13 2007-04-11 Dnavec Research Inc GENE THERAPY FOR TUMOR USING A NEGATIVE CHAIN RNA VIRAL VECTOR ENCODING AN IMMUNOSTIMULATORY CYTOKINE
CN1934260B (zh) * 2004-01-22 2013-03-13 株式会社载体研究所 利用含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的杂合启动子制造负链RNA病毒载体的方法
US20080038234A1 (en) * 2004-03-23 2008-02-14 Shuji Hayashi Bone Marrow-Related Cells Associated With Tissue Maintenance And/Or Repair
WO2006001122A1 (ja) 2004-06-24 2006-01-05 Dnavec Research Inc. Rnaウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
WO2006134917A1 (ja) * 2005-06-14 2006-12-21 Dnavec Corporation 抗体の作製方法
JPWO2007083644A1 (ja) * 2006-01-17 2009-06-11 ディナベック株式会社 新規タンパク質発現系
EP2013331A2 (en) 2006-04-14 2009-01-14 Advanced Cell Technology, Inc. Hemangio-colony forming cells
WO2008065752A1 (fr) * 2006-11-30 2008-06-05 National University Corporation Hokkaido University Agent immunothérapeutique contenant un arndi en tant que principe actif
EP2952583A1 (en) * 2007-03-12 2015-12-09 Oncolytics Biotech Inc. Reoviruses having modified sequences
EP2154243B1 (en) 2007-05-17 2016-01-13 ID Pharma Co., Ltd. Method for production of dendritic cell
US8719420B2 (en) * 2008-05-13 2014-05-06 At&T Mobility Ii Llc Administration of access lists for femtocell service
JP6055165B2 (ja) 2008-11-14 2016-12-27 株式会社Ｉｄファーマ 樹状細胞の製造方法
US20100266642A1 (en) * 2009-02-20 2010-10-21 Bind Biosciences, Inc. Modified cells for targeted cell trafficking and uses thereof
EP2236520A1 (en) * 2009-03-31 2010-10-06 Leukocare Ag Stabilizing composition for immobilized biomolecules
KR101947588B1 (ko) * 2009-12-04 2019-02-14 스템 셀 앤드 리제너러티브 메디신 인터내셔날, 인크. 인간 배아줄기세포 유래된 혈액모세포로부터 자연 살해 세포 및 수지상 세포를 생성하는 방법
DE102010018961B4 (de) * 2010-04-23 2012-09-20 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Genetisch modifiziertes Paramyxovirus zur Behandlung von Tumorerkrankungen
KR101365208B1 (ko) * 2011-12-06 2014-02-20 가톨릭대학교 산학협력단 바이러스를 이용하여 제조된 심근염 치료용 면역관용 수지상 세포 및 이의 제조 방법
ES2896354T3 (es) 2012-12-21 2022-02-24 Astellas Inst For Regenerative Medicine Métodos para la producción de plaquetas a partir de células madre pluripotentes
EP3316897A4 (en) 2015-07-02 2019-03-13 Primevax Immuno-Oncology, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR COMBINATION THERAPY WITH DENGUE VIRUS AND DENDRITIC CELLS
JP2018535191A (ja) * 2015-09-26 2018-11-29 プライムヴァックス イミュノ−オンコロジー，インク． 樹状細胞を産生するための組成物及び方法
JP2019522481A (ja) * 2016-06-22 2019-08-15 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ 自己切断リボザイムを利用したｒｎａのウイルス送達およびそのｃｒｉｓｐｒベースの適用
EP3541417A4 (en) 2016-11-16 2020-05-27 Primevax Immuno-Oncology, Inc. COMBINATION IMMUNOTHERAPIES FOR TREATING CANCER
CN117417886B (zh) * 2023-10-20 2024-05-14 广东壹加再生医学研究院有限公司 一种负载肿瘤抗原的树突状细胞激活的t淋巴细胞的培养方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000070070A1 (fr) * 1999-05-18 2000-11-23 Dnavec Research Inc. Vecteur de virus paramyxoviridae defectueux dans un gene enveloppe
JP2002272465A (ja) * 2000-05-18 2002-09-24 Dnavec Research Inc 外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクター

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5124148A (en) * 1988-04-27 1992-06-23 United Cancer Research Institute Method for treating viral diseases with attenuated virus
US6077519A (en) 1993-01-29 2000-06-20 University Of Pittsburgh Methods for isolation and use of T cell epitopes eluted from viable cells in vaccines for treating cancer patients
DE69432409T2 (de) * 1993-04-30 2003-12-24 Wellstat Biologics Corp Verwendung der NDV zur Herstellung eines Medikaments zur Krebsbehandlung
US6300090B1 (en) * 1994-07-29 2001-10-09 The Rockefeller University Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells
DE69634904T2 (de) * 1995-10-31 2006-05-18 Dnavec Research Inc., Tsukuba Negativstrand rna virus mit selbständiger replikationsaktivität
ATE470704T1 (de) * 1995-11-01 2010-06-15 Dnavec Research Inc Rekombinantes sendai-virus
US6734014B1 (en) * 1996-02-08 2004-05-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods and compositions for transforming dendritic cells and activating T cells
US6251433B1 (en) 1996-08-13 2001-06-26 Chiron Corporation Polycationic polymers
AU7499498A (en) * 1997-05-21 1998-12-11 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Methods and compositions for making dendritic cells from expanded populations ofmonocytes and for activating t cells
JP2000253876A (ja) 1999-03-08 2000-09-19 Dnavec Research Inc センダイウイルスベクターを用いたワクチンおよびワクチンタンパク質
US20030166252A1 (en) * 1999-05-18 2003-09-04 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
US20020169306A1 (en) * 1999-05-18 2002-11-14 Kaio Kitazato Envelope gene-deficient paramyxovirus vector
US20030022376A1 (en) * 1999-05-18 2003-01-30 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
US7226786B2 (en) * 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
ATE399206T1 (de) 1999-05-18 2008-07-15 Dnavec Research Inc Ribonukleoproteinkomplex aus paramyxovirus
US20020123479A1 (en) * 1999-12-08 2002-09-05 Song Elizabeth S. Immunostimulation mediated by gene-modified dendritic cells
US6472208B1 (en) * 1999-12-13 2002-10-29 Héma-Québec Method of producing human IFN-α using sendai virus-infected hematopoietic stem cells
KR100854917B1 (ko) * 2000-03-30 2008-08-27 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 센다이바이러스 벡터를 사용한 ａｉｄｓ 바이러스 백신
CA2322057A1 (en) * 2000-05-18 2001-11-18 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vectors used for transfer of foreign genes
WO2002090510A2 (en) * 2001-05-08 2002-11-14 Emory University Regulating immine responses using dendritic cells
JP2005505261A (ja) 2001-07-05 2005-02-24 ファイロジックス・インコーポレーテッド 樹状細胞単離法
ES2598109T3 (es) 2001-09-06 2017-01-25 Northwest Biotherapeutics, Inc. Composiciones y métodos para la activación linfocitaria de células dendríticas monocíticas y células T para generar una respuesta Th-1
EP1437593A1 (en) 2001-09-18 2004-07-14 Dnavec Research Inc. Method of examining (-)-strand rna virus vector having lowered ability to form grains and method of constructing the same
CA2462259A1 (en) 2001-09-28 2003-04-10 Dnavec Research Inc. Mammalian cell-infecting virus vector encoding epitope-bound .beta.2m and utilization thereof
EP1438399A4 (en) * 2001-09-28 2005-09-14 Univ North Carolina PARAMYXOVIRUSES AS GENE TRANSFER VECTORS TO PULMONARY CELLS
FR2838123B1 (fr) * 2002-04-04 2005-06-10 Sanofi Synthelabo Nouveaux derives d'indolozine-1,2,3 substituee, inhibiteurs selectifs du b-fgf
CN1675357A (zh) * 2002-06-03 2005-09-28 株式会社载体研究所 编码抗体的副粘病毒载体及其应用
AU2002951082A0 (en) 2002-08-30 2002-09-12 The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland Therapeutic cellular agents
US20060104950A1 (en) * 2002-10-24 2006-05-18 Shinji Okano Methods of Tranducing genes into T cells
WO2004053095A2 (en) * 2002-12-10 2004-06-24 Merix Bioscience, Inc. In situ maturation of dendritic cells
US20070269414A1 (en) * 2003-11-04 2007-11-22 Shinji Okano Method for Producing Gene Transferred Denritic Cells
EP1712243A4 (en) * 2004-01-13 2007-04-11 Dnavec Research Inc GENE THERAPY FOR TUMOR USING A NEGATIVE CHAIN RNA VIRAL VECTOR ENCODING AN IMMUNOSTIMULATORY CYTOKINE
CN1934260B (zh) * 2004-01-22 2013-03-13 株式会社载体研究所 利用含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的杂合启动子制造负链RNA病毒载体的方法
US20070141705A1 (en) * 2004-01-22 2007-06-21 Makoto Inoue Method for producing viral vectors
CA2560046A1 (en) * 2004-03-16 2005-09-22 Dnavec Research Inc. Methods for suppressing tumor proliferation
US20080038234A1 (en) * 2004-03-23 2008-02-14 Shuji Hayashi Bone Marrow-Related Cells Associated With Tissue Maintenance And/Or Repair
WO2006001122A1 (ja) 2004-06-24 2006-01-05 Dnavec Research Inc. Rnaウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
AU2006237903A1 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 Dna Vec Corporation Highly safe intranasally administrable gene vaccines for treating Alzheimer's disease
US20090246170A1 (en) * 2006-05-31 2009-10-01 Dnavec Corporation Therapeutic Agent For Alzheimer's Disease
EP2154243B1 (en) * 2007-05-17 2016-01-13 ID Pharma Co., Ltd. Method for production of dendritic cell

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000070070A1 (fr) * 1999-05-18 2000-11-23 Dnavec Research Inc. Vecteur de virus paramyxoviridae defectueux dans un gene enveloppe
JP2002272465A (ja) * 2000-05-18 2002-09-24 Dnavec Research Inc 外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクター

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIRAOKA K ET AL: "Enhanced tumor-specific long-term immunity of hemagglutinating [correction of hemaggluttinating] virus of Japan-mediated dendritic cell-tumor fused cell vaccination by coadministration with CpG oligodeoxynucleotides.", J IMMUNOL., vol. 173, no. 7, October 2004 (2004-10-01), pages 4297 - 4307, XP002987083 *
KANEDA Y.: "Development of HVJ envelope vector for cancer therapy.", SEIKAGAKU., vol. 75, no. 8, 2003, pages 737, XP002987056 *
KANYAMA H ET AL: "Usefulness of repeated direct intratumoral gene transfer using hemagglutinating virus of Japan-liposome method for cytosine deaminase suicide gene therapy.", CANCER RES., vol. 61, no. 1, 2001, pages 14 - 18, XP002987094 *
KUNISAWA J. ET AL: "DDS Gijutsu o Mochiita Gan Chiryo-Maku Yugo Liposome no Gan Chiryo eno Oyo-.", JNP J CANCER CHEMOTHER., vol. 28, no. 5, 2001, pages 577 - 583, XP002987093 *
See also references of EP1775342A4 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090053790A1 (en) * 2006-01-31 2009-02-26 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. Polypeptide Having Affinity for Envelope Virus Constituent and Use Thereof in Transferring Substance Into Cell
WO2008136438A1 (ja) * 2007-04-27 2008-11-13 Kyushu University, National University Corporation 遺伝子治療用ウイルスベクター
JPWO2008136438A1 (ja) * 2007-04-27 2010-07-29 国立大学法人九州大学 遺伝子治療用ウイルスベクター
WO2010032764A1 (ja) * 2008-09-16 2010-03-25 ジェノミディア株式会社 前立腺癌の治療・予防剤
JP5547640B2 (ja) * 2008-09-16 2014-07-16 ジェノミディア株式会社 前立腺癌の治療・予防剤

Also Published As

Publication number Publication date
AU2005257105A1 (en) 2006-01-05
HK1106794A1 (en) 2008-03-20
EP1775343A4 (en) 2007-11-14
JP5296983B2 (ja) 2013-09-25
US20080031855A1 (en) 2008-02-07
EP1775342A1 (en) 2007-04-18
AU2005257107A1 (en) 2006-01-05
KR20070028573A (ko) 2007-03-12
WO2006001122A1 (ja) 2006-01-05
CA2571844A1 (en) 2006-01-05
JPWO2006001122A1 (ja) 2008-04-17
JPWO2006001120A1 (ja) 2008-04-17
JP2013151523A (ja) 2013-08-08
EP1775343A1 (en) 2007-04-18
KR20070032022A (ko) 2007-03-20
US8889118B2 (en) 2014-11-18
EP1775342A8 (en) 2007-06-20
CN101006171A (zh) 2007-07-25
CN101006172B (zh) 2012-09-05
CA2571849A1 (en) 2006-01-05
EP1775342A4 (en) 2007-11-07
EP1775343A8 (en) 2007-09-26
CN101006172A (zh) 2007-07-25
KR101270839B1 (ko) 2013-06-05
US20080014183A1 (en) 2008-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006001120A1 (ja) マイナス鎖rnaウイルスを含む抗癌剤
KR100852078B1 (ko) 심혈관계로의 유전자 전달을 위한 파라믹소바이러스 벡터
US7521043B2 (en) Gene therapy for tumors using minus-strand RNA viral vectors encoding immunostimulatory cytokines
JP2012065652A (ja) 遺伝子導入された樹状細胞の製造方法
EP2048232A1 (en) Non-replicating paramyxoviridae virus vector
KR20050062634A (ko) Ｔ 세포에 유전자를 도입하는 방법
WO2002031138A1 (fr) Vecteur de paramyxovirus permettant de transferer un gene etranger dans le muscle squelettique
WO2006137517A1 (ja) 幼少個体への遺伝子導入用ベクター
US20100203027A1 (en) Viral vector for gene therapy
JP2008536476A (ja) アルツハイマー病の治療のための安全性に優れた鼻腔内投与可能遺伝子ワクチン
EP1642966B1 (en) Minus strand rna viral vectors carrying a gene with altered hypermutable regions
EP1598424A1 (en) Paramyxovirus vector encoding ribozyme and utilization thereof

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006528383

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2571844

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005257105

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005736740

Country of ref document: EP

Ref document number: 1020077001605

Country of ref document: KR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2005257105

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20050428

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005257105

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200580028403.6

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020077001605

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005736740

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11630522

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 11630522

Country of ref document: US