WO2006134917A1 - 抗体の作製方法 - Google Patents

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virus
minus
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Yasuji Ueda
Hiroto Hara
Tsugumine Shu
Mamoru Hasegawa
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    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to an antibody and a method for producing an antibody-producing cell.
  • antibodies can be used to detect a variety of proteins, including Western blotting, immunohistochemistry, flow cytometry, immunoprecipitation, immunoaffinity column method, and cancer cell missile therapy, vector targeting, It is also widely used in practical applications such as cell function inhibition.
  • the present invention provides methods for producing antibodies and antibody-producing cells.
  • the present invention also provides a method for producing an antigen composition for producing an antibody.
  • a minus-strand RNA virus is a virus having minus-strand RNA in the genome, and when the cell is infected, the genomic RNA is amplified in the cell and the loaded gene is expressed at a high level (Yonemitsu Y. et al., Nat Biotechnol, 2000, 18 (9): 970-3).
  • the present inventor considered the use of a minus-strand RNA virus for antibody production taking advantage of this advantage of a minus-strand RNA virus.
  • negative-strand RNA viruses have been reported to enhance host immune activity by secreting multiple cytoplasmic ins after infection (Strahle et al. J. Virol. 77 (14): 7903-7913.
  • the present inventors produced a recombinant minus-strand RNA virus that expresses a polypeptide desired as an antigen, and immunized the animal to produce an antibody.
  • RNA virus or cell lysate (lysate) infected with the virus via multiple routes of administration, including nasal drop, intramuscular injection, direct spleen injection, subcutaneous lumbar region, and footpad injection
  • routes of administration including nasal drop, intramuscular injection, direct spleen injection, subcutaneous lumbar region, and footpad injection
  • antibodies were detected in blood by any route of administration.
  • the increase in antibody titer was particularly noticeable with nasal administration.
  • hyperpridoma from immunized mouse spleen cells and successfully produced monoclonal antibodies. It is considered that antibody production was efficiently induced by the immunostimulatory effect of the minus-strand RNA virus vector and high expression of the antigen polypeptide.
  • an antibody against the polypeptide can be efficiently produced by inoculating a minus-strand RNA virus vector expressing the antigen polypeptide.
  • the place of vector inoculation was not limited, and the boost was effective.
  • Immunization can be performed by directly inoculating a negative-strand RNA virus vector, or by using cultured cells infected with the vector, and the prepared cells can be used for immunization in addition to immunization.
  • the antibody obtained by the method of the present invention is expected to be applied to a wide range of fields such as detection and separation of biomolecules and antibody therapy.
  • the present invention relates to an antibody and a method for producing antibody-producing cells using a minus-strand RNA virus, and more specifically to the invention described in each item of the claims.
  • inventions composed of one or more combinations of the inventions recited in the claims that cite the same claim are already intended for the inventions recited in those claims.
  • the present invention provides:
  • step (b) recovering an antibody or antibody-producing cell from the animal, (2)
  • the inoculation in step (a) is performed by an administration route selected from the group consisting of intramuscular injection, subcutaneous administration, nasal administration, palm or footpad administration, spleen administration, and intraperitoneal administration.
  • Th2 site force Inca is selected from the group force consisting of SIL_4, IL_10, and IL-13.
  • the method of the present invention can efficiently produce an antibody using a minus-strand RNA virus that expresses a desired antigen polypeptide, and it is not essential to purify the antigen peptide.
  • Antibodies produced according to the present invention can be used for missile therapy of cancer cells by simply detecting and identifying various proteins such as Western blotting, immunohistochemistry, flow cytometry, immunoprecipitation, and immunoaffinity column method. It can also be used in clinical applications such as vector targeting and cell function inhibition.
  • FIG. 1 is a view showing the production of an anti-LacZ antibody by administration of a negative strand RNA virus vector carrying a LacZ gene. Detection was performed with commercially available purified LacZ using mouse plasma 5 weeks after priming by intramuscular injection.
  • FIG. 2 is a diagram showing anti-GFP antibody production by administration of a minus-strand RNA virus vector carrying a GFP gene.
  • A Primed with nasal injection, intramuscular injection, direct injection of spleen or footpad injection with viral vector, boosted by intraperitoneal administration of the viral vector 2 weeks later, bra Anti-GFP antibody in mouse plasma 4 weeks after imming was detected by Western plot.
  • FIG. 3 is a graph showing antibody production by intraperitoneal administration of a minus-strand RNA virus vector-infected cell lysate.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of boost by intraperitoneal administration of a minus-strand RNA viral vector on antibody production.
  • the boost operation after 2 weeks was performed with DPBS (-).
  • FIG. 6 shows the results of Western blot analysis using a hybridoma supernatant (# 6-76) producing an anti-gpl60 monoclonal antibody.
  • Hypridoma was produced from the spleen cells of mice inoculated with the minus strand RNA virus vector carrying HIV-1 gpl60 gene, and the hyperidoma producing anti-gpl60 monoclonal antibody was selected. Using this hyperidoma supernatant, the gpl60 protein in the SeV18 + GP160 / AF vector-infected LLC-MK cell lysate
  • FIG. 7 shows the determination of subclasses of anti-gpl60 antibodies produced by Hypridoma # 6-76. ⁇ ⁇
  • the subclass of anti-gpl60 antibody produced by Hypridoma # 6-76 was determined using the ⁇ zoisotai pink kit (Mouse Immunoglobulin Screemng / Isotyping Kit (Genzyme)).
  • the subclass-specific antibody used is shown in the upper part.
  • Gl IgG
  • G2a IgG
  • Ig, ⁇ IgG
  • A IgA
  • M IgM
  • B buffer blank
  • N non-immune serum ⁇ negative c
  • FIG. 8 is a diagram showing that a hyperidoma producing a monoclonal antibody recognizing HIV-1 gpl60 can be prepared by boosting with a synthetic peptide after priming with a Sendai virus vector.
  • the gpl60 protein in the BHK-21 cell membrane fraction infected with SeV18 + GP160 / AF vector was detected by Western plot.
  • the membrane fraction was prepared using a commercially available kit (Calb iochem catalog number 539790) according to the instructions.
  • the migration positions of gpl60 and gp41 are indicated by arrows on the right side. [Description of each lane] 1. Molecular weight marker 2. Non-infected BHK-21 cell membrane fraction 3. SeV18 + GFP / AF infected BHK-21 cell membrane fraction 4. SeV18 + GP16 0 / ⁇ F infected BHK-21 cell membrane fraction Min
  • FIG. 10 Purification by cell cloning of anti-gpl60 antibody-producing hybridoma # 6-76 obtained in Example 6 and anti-gpl60 antibody-producing hybridoma C1-182 obtained by boosting with a synthetic peptide in Example 7
  • FIG. 6 is a view showing purification by cell cloning of Hypridoma # 6-76 and the hybridoma C1-182 obtained in Example 7.
  • Figure 12 High Pridoma # 6 obtained in Example 6
  • IgG H chain and L chain are indicated by arrows on the right side.
  • FIG. 13 shows the same Western blot as in Example 7 using the antibody protein purified from the culture supernatant of hybridoma # 6-76-14-29 after cloning twice.
  • the purified antibody was compared with the unpurified culture supernatant of # 6-76 and # 6-76-14-29 before cloning. It has been shown that purified antibody recognizes g PL60, gp41 with the same specificity as the previous purification.
  • [Description of each lane] 1. Molecular weight marker 2. Non-infected BHK-21 cell membrane fraction 3. SeV18 + GFP / AF infected BHK-21 cell membrane fraction 4. SeV18 + GP160 / ⁇ F infected BHK-21 cell membrane Fraction
  • FIG. 14 A diagram showing the results of Western blotting using the culture supernatants of a plurality of anti-gpl60 antibody-producing hyperpridoma obtained in Example 10.
  • FIG. c that recognizes the gp41 moiety in gpl60
  • the migration positions of gpl60, gpl20, and gp41 are indicated by arrows on the right side.
  • [Description of each lane] 1. Molecular weight marker 2. Uninfected BHK-21 cell membrane fraction 3. SeV18 + GFP / AF infected BHK-21 cell membrane fraction 4. SeV18 + GP160 / ⁇ F infected BHK-21 cell membrane fraction.
  • FIG. 15 shows that anti-gpl60 antibody is induced in mouse plasma by immunization with Sendai virus vector carrying both mouse IL10 gene and gpl60 gene. Seven mice were used. Blood was collected from the orbit on day 56 after priming. Hypridoma # 6-76 culture supernatant was used as a positive control, and pre-immune mouse plasma (# 1 pre) was used as a negative control. The migration position of gpl60 was indicated by the right arrow and black dots. [Description of each lane] 1. Molecular weight marker 2. Non-infected BHK-21 cell membrane fraction 3. SeV18 + GFP / AF infected BHK-21 cell membrane fraction 4. SeV18 + GP160 / ⁇ F infected BHK-21 cell membrane fraction Min.
  • the present invention relates to a method for producing an antibody or antibody-producing cell, which comprises a minus-strand RNA virus vector carrying a nucleic acid encoding a foreign polypeptide to be used as an antigen, a nucleic acid that produces the virus vector, the vector or
  • the present invention relates to a method comprising inoculating an animal with a cell into which a nucleic acid for producing the vector has been introduced, or a lysate of the cell, and recovering an antibody or antibody-producing cell from the animal.
  • the minus-strand RNA virus is a virus that contains the minus-strand RNA (an antisense strand complementary to the strand that senses the viral protein) as a genome.
  • Negative strand RNA viruses are also called negative strand RNA viruses.
  • the minus-strand RNA virus used in the present invention is particularly preferably a single-strand minus-strand RNA virus (also referred to as a non-segmented minus-strand RNA virus).
  • a “single-stranded negative strand RNA virus” refers to a virus having a single-stranded negative strand [ie, minus strand] RNA in the genome.
  • the minus-strand RNA viral vector used in the present invention is a defective vector that does not have the ability to propagate but may or may not have the ability to propagate. May be used.
  • “Having a transmission ability” means that when a viral vector infects a host cell, the virus replicates in the cell and infectious virus particles are produced.
  • the defective vector include a vector that lacks at least one gene encoding a protein constituting the envelope.
  • Specific examples include vectors that lack at least one of the genes that code for envelope-constituting proteins such as F, H, HN, G, M, and Ml, which vary depending on the type of virus (WO00 / 70055). And WO00 / 70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000)).
  • minus-strand RNA viruses that are particularly preferably used in the present invention include, for example, Paramyxoviridae virus Sendai virus, Newcastle disease virus, mumps force, Zeunores (mu mps virus) RSasoleus (respiratory syncytial virus) ⁇ bovine plague quinoles (rinde ⁇ est virus), distemper virus (distemper virus), sanorepaline fluenza virus (SV5), human parainfluenza virus Type 1,2,3, Orthomyxoviridae Influenza virus, Rabodoviridae vesicular stomatitis virus, rabies Winores (rab) ies virus) and the like.
  • Paramyxoviridae virus Sendai virus Newcastle disease virus
  • mumps force Zeunores (mu mps virus)
  • RSasoleus respiratory syncytial virus
  • bovine plague quinoles rinde ⁇ est virus
  • distemper virus distemper virus
  • the paramyxovirus is preferably a virus belonging to the Paramyxovirinae family (including the genera Respirovirus, Rubravirus, and Mobile virus), more preferably the Respirovirus genera.
  • Derivatives include viruses in which the viral gene is altered and chemically modified viruses so as not to impair the ability of the gene to be introduced by the virus.
  • respirovirus viruses to which the present invention can be applied include human parainfluenza virus type 1 (HPIV-1), human parainfluenza virus type 3 (HPIV-3), and ushipaline fluenza virus type 3 (BPIV).
  • the paramyxovirus is most preferably Sendai virus.
  • Sendai virus also called mouse parainfluenza virus type 1
  • monkey parainfluenza virus type 10 SPIV-10
  • the paramyxovirus is most preferably Sendai virus.
  • These viruses may be derived from natural strains, wild strains, mutant strains, laboratory passage strains, and artificially constructed strains.
  • each gene in each virus belonging to the Paramyxovirus subfamily is generally expressed as follows.
  • the NP gene is also denoted as “N”.
  • HN is expressed as H (hemagglutinin) when it does not have neuraminidase activity.
  • the minus-strand RNA viral vector can encode a desired foreign polypeptide to be used as an antigen in genomic RNA.
  • the foreign polypeptide is not limited as long as it is a polypeptide that does not have a natural negative-strand RNA virus, and is a full-length natural protein or a partial fragment thereof (7 amino acids or more, preferably 8, 10 or 15 amino acids or more). Or a fusion polypeptide of these and other polypeptides.
  • a recombinant viral vector encoding a foreign polypeptide can be obtained by inserting a gene encoding the polypeptide antisense into the genome of a minus-strand RNA viral vector.
  • a desired site in the protein non-coding region of the viral genome can be selected as the gene insertion position.
  • each viral protein is located between the 3 ′ leader region of genomic RNA and the viral protein ORF closest to the 3 ′ end. It can be inserted between the ORF and / or between the viral protein ORF closest to the 5 'end and the 5' trailer region.
  • an envelope protein gene such as the M, F, or HN gene, it may be inserted into the deleted region.
  • E-I-S sequence should be constructed between the inserted foreign gene and the viral ORF. Two or more foreign genes can be inserted in tandem via the E-I-S sequence.
  • the expression level of a foreign gene can be regulated by the type of transcription initiation sequence added upstream of the gene (3 ′ side of the negative strand (negative strand)) (WO01 / 18223). It can also be controlled by the position of the foreign gene inserted on the genome, and the higher the expression level is, the lower the expression level is. Become.
  • a gene encoding a foreign polypeptide can be linked to a highly efficient transcription initiation sequence and inserted near the 3 ′ end of the minus-strand genome. preferable. Specifically, it is inserted between the 3 'leader region and 3' and the viral protein ORF.
  • the viral protein gene closest to 3 ′ and the ORF of the second viral protein gene may be inserted between the viral protein gene closest to 3 ′ and the ORF of the second viral protein gene, or between the second and third viral protein genes from 3 ′.
  • the closest to the 3 'genome the viral protein gene is the N gene
  • the second gene is the P gene
  • the third gene is the M gene.
  • the insertion position of the foreign gene should be set as 5 'as possible in the minus-strand genome, or the transcription initiation sequence should be made less efficient. Thus, it is possible to obtain an appropriate effect by keeping the expression level from the virus vector low.
  • Particularly preferred are 3'-UCCCAGUUUC-5 '(SEQ ID NO: 2), 3'-UCCCACUUAC-5, (SEQ ID NO: 3), and 3'-UCCCACUUUC_5' (SEQ ID NO: 4).
  • the E sequence of Sendai virus vector is preferably, for example, 3′-AUUCUUUU-5 ′ (SEQ ID NO: 8) (5′-TAAGAAAAA-3 ′ (SEQ ID NO: 9) for DNA encoding a plus strand).
  • 3′-GAA-5 (specifically, 5 and CTT-3 ′ for plus-strand DNA) may be used as the I sequence.
  • Recombination of the recombinant RNA virus vector may be performed using a known method. Specifically, (a) minus-strand RNA virus genome that expresses a desired foreign antigen polypeptide in the presence of a viral protein that constitutes an RNP containing the minus-strand RNA virus genome RNA in mammalian cells. A step of transcribing DNA encoding RNA or its complementary strand (antigenomic RNA, plus strand), (b) produced minus strand RNA virus or The ability to produce RNP containing the genomic RNA can be achieved.
  • the above-mentioned viral proteins constituting RNP are proteins that form RNP together with viral genomic RNA and constitute a nucleoside psid.
  • N nucleocapsid (or nucleoprotein (NP))
  • P phospho
  • L large proteins.
  • N nucleocapsid
  • P phospho
  • L large proteins.
  • N nucleocapsid
  • P phospho
  • L large proteins.
  • Corresponding proteins are known to those skilled in the art (Anjeanette Robert et al., Virology 247: 1-6 (1998)).
  • N may be written as NP
  • RNA genome that is, the same antisense strand as the virus genome
  • a plus-strand RNA antigenome; complementary strand of genomic RNA
  • a positive strand is preferably generated.
  • the viral genomic RNA encodes a viral protein necessary for reconstitution of RNP
  • the gene encoding the envelope protein may be deleted. Specifically, for example, if N, P, and L proteins are encoded, viral proteins such as F, H N, and M may not be encoded.
  • Such defective viruses are useful as highly safe gene transfer vectors because they do not release infectious virus particles capable of amplifying genomic RNA in cells (WO00 / 70055, WO00 / 70070, and WO03 / 025570). Li, H.—O. et al., J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000)).
  • these envelope-constituting proteins are separately expressed in virus-producing cells to complement particle formation.
  • a vector in which DNA encoding the protein or genome is linked downstream of an appropriate promoter is introduced into a host cell.
  • the promoter for example, CM V promoter, CAG promoter and the like are used (Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199, Japanese Patent Laid-Open No. 3-168087).
  • the RNA ends accurately reflect the ends of the 3 'leader sequence and the 5' trailer sequence as in the case of the natural viral genome.
  • a self-cleaving ribozyme is added to the 5 ′ end of the transcript, and the end of the minus-strand RNA winores genome is accurately excised by the ribozyme (Inoue, K. et al. J. Virol. Methods 107, 2003, 229-236).
  • a RNA polymerase recognition sequence of bacteriophage is used at the transcription start site, and the RNA polymerase is expressed in the cell to induce transcription.
  • Escherichia coli T3 and T7 phages and Salmonella SP6 phages are used as RNA polymerases for butteriophage (Krieg, PA and Melton, DA 1987, Methods Enzymol. 155: 397—15; Milligan, JF et al. al, 1987, Nucleic Acids Res. 15: 8783-798; Pokrovskaya, ID and Gurevich, VV, 1994, Anal. Biochem. 220: 420-23).
  • Batteriophage RNA polymerase can be supplied using, for example, vaccinia virus expressing it (Fuerst, TR et al., Pro Natl. Acad. Sci.
  • the 3' end of the transcript is encoded with a self-cleaving ribozyme and this ribozyme is used to accurately 3 ' The edges are cut out (Hasan, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ et al "J. Gen. Virol. 1997: 78; 2 813-2820, Kato, A. et al., EMBO J. 1997,: 16; 578- 587 and Yu, D. et al "Genes Cells. 1997: 2; 457-466).
  • a ribozyme a self-cleaving ribozyme derived from the antigenomic strand of hepatitis delta virus can be used.
  • the infectivity of the virus may be complemented with the missing envelope constituent protein.
  • an envelope protein different from the deleted protein may be used. You can also make it a pseudo type.
  • V protein (VSV-G) of Vesicular stomatitis virus (VSV) (J. Virology 39: 519-528 (1981)) can be used (Hirata , T. et al., 2002, J. Virol. Methods, 104: 125-133; Inoue, M. et al., 2003, J. Virol. 77: 6419-6429; Inoue M. et al., J Gene Med.
  • genes to be deleted from the genome include spike protein genes such as F, HN, H, and G, envelope lining protein genes such as M, and any combination thereof. Deletion of spike protein gene is effective to make negative-strand RNA virus vector non-transmissible, and deletion of protein gene behind envelope such as M protein makes particle formation from infected cells impossible. It is effective to For example, F gene-deleted negative-strand RNA virus vectors (Li, H.-O. et al., J. Virol. 74, 6 564-6569 (2000)), M gene-deleted negative-strand RNA viral vector (Inoue, M. et al., J. Virol.
  • 77, 6419-6429 (2003)) and the like are preferably used.
  • a vector lacking the F gene pathogenicity in the host mouse was suppressed, and it was possible to realize good antibody production (see Examples).
  • Vectors lacking any combination of at least two genes of F, HN, and H) and M are more secure.
  • both M and F gene deletion-type vectors are non-transmissible and lack particle formation while maintaining a high level of infectivity and gene expression ability.
  • F gene-deficient recombinant virus examples include, for example, a minus-strand RNA virus genome deficient in the F gene or a plasmid expressing its complementary strand, and an expression vector that expresses the F protein.
  • an expression vector that expresses the F protein As well as N, P, and L protein expression vectors.
  • viruses can be produced more efficiently by using host cells in which the F gene is integrated into the chromosome (WO00 / 70070).
  • an envelope protein gene is included in a vector having a recombinant enzyme target sequence such as Cre / loxP-inducible expression plasmid pCALNdlw (Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, pi 115-1121).
  • the minus-strand RNA virus used in the present invention may have an accessory gene deficient.
  • knocking out the V gene which is one of the accessory genes of Sendai virus (SeV) significantly reduces the pathogenicity of SeV against hosts such as mice that do not impair gene expression and replication in cultured cells ( Kato, A. et al., 1997, J. Virol. 71: 7266-7272; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Curran, J. et al., WO01 / 04272 , EP1067179).
  • a minus-strand RNA virus having a mutation in the P gene or L gene may be used in order to increase the persistence of infection.
  • mutations include Se Examples include mutation of the 86th Glu (E86) of the VP protein, substitution of the SeV P protein with the other amino acid of the 511st Leu (L511), or substitution of homologous sites of other minus-strand RNA virus P proteins. Specific examples include substitution of the 86th amino acid with Lys and substitution of the 511st amino acid with Phe.
  • Specific examples include substitution of the 1197th amino acid with Ser, and the substitution of the 1795th amino acid with Glu. Mutations in the P and L genes can significantly enhance the effects of persistent infectivity, suppression of secondary particle release, or suppression of cytotoxicity.
  • Th2 site force-in refers to a site force-in produced predominantly in type 2 helper T cells (Th2 cells) over type 1 helper T cells (Thl cells).
  • Th2 cells type 2 helper T cells
  • Thl cells type 1 helper T cells
  • Anti-inflammatory site force-in is a generic term for polypeptides that act in the direction of suppressing inflammation, and is a signaling molecule that promotes signal transduction that suppresses inflammation and / or Signaling molecules that inhibit signal transduction that promote inflammation (eg, inflammatory site force in inhibitors) are included.
  • the anti-inflammatory site force-in specifically includes interleukin (IL) _4, IL-10, IL_11, IL_13, TGF- ⁇ , soluble TNF-receptor, and IL-l receptor antagoni st (IL- lra).
  • the vector-encoded Th2 site force-in and / or anti-inflammatory site force-in may be a partial peptide (such as an active fragment) as long as the activity of the natural polypeptide is maintained. For example, deletion of N-terminal and / or C-terminal amino acid residues (eg 1-30 amino acids, more particularly 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, or 25 amino acids) There is a high possibility that it will not affect the activity of Site Force Inn.
  • soluble fragments of inflammatory site force-in receptor including ligand binding domain
  • antibodies or antibody fragments that bind to the ligand binding domain of inflammatory site force-in receptor including inflammatory site force Polypeptides that inhibit in signal transduction may be used.
  • Th2 site force-in and / or anti-inflammatory site force-in also includes mature polypeptides with the signal sequence removed.
  • the desired fragment can be used, and the signal sequence of the desired protein can be appropriately used as the N-terminal signal sequence for secretion outside the cell.
  • a signal sequence of a desired secretory protein such as interleukin (IL) _2 or tissue plasminogen activator (tPA) can be used, but it is not limited thereto. Alternatively, it may be expressed as a fusion protein with another peptide.
  • the Th2 site force-in is more preferably a site force in selected from the group consisting of IL_4, IL_10, IL_13, and TGF-beta force, and most preferably IL-10.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of each site force in gene are known (IL_4: NM_000589, NP_000580, AAH66277, AAH67515, NP_758858, NP.067258, NP.958427; IL-10: NM_000572, NP_000563, CAG46825, NP .034678, NP.036986; IL-13: NM_002188, NP .002179, AAB01681, NP_032381, NP.446280; TGF-beta (transforming growth factor -beta): M_60316) o
  • each Th2 site force-in or anti-inflammatory site force-in can be detected by a known method.
  • a method for detecting activity by proliferation assay using mouse mast cell MC / 9 (ATCC CRL-8306), human erythroleukemia cell line TF-1 (ATCC CRL-2003), etc. is known.
  • Thompson-Snipes Shi et al., 1991, J. Exp. Med. 17 3: 507—510; Kruse N et al., EMBO J.
  • Th2 site-in or anti-inflammatory site-in deletion mutants prepared using genetic recombination techniques can be assembled by this method to identify active fragments.
  • ED effective dose
  • activity for example, the reciprocal of ED
  • the activity is 50% or more, preferably 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more Or a partial peptide of 95% or more is recommended.
  • mice which are not particularly limited by the origin of vector-encoded Th2 site-in and / or anti-inflammatory site-in It is appropriate to use those derived from the same species as the force administration target that can use any of mammals such as nu, chimpanzee, monkey, and human.
  • the nucleotide sequence can be obtained from the database as described above. For example, in the case of mouse IL-10, Genbank Accession No. AY410237, NM_010548, hi HL-10, Genbank Accession No. AY029171 NM.000572.
  • the minus-strand RNA virus of the present invention does not encode a polypeptide containing a protein involved in a desired disease or a partial peptide thereof (for example, a partial peptide of 9, 8, 7, 6, or 5 amino acids or more). be able to.
  • diseases include neurodegenerative diseases, and examples of proteins involved in neurodegenerative diseases include amyloid ⁇ .
  • mammalian cells can be used for virus production, specifically, for example, LLC-MK cells derived from monkey kidney (ATCC CCL-7) and CV-1 cells (such as ATCC CCL-7) and CV-1 cells (such as ATCC CCL-7) and ATCC CCL-7) and ATCC CCL-7) and ATCC CCL-7) and CV-1 cells (such as ATCC CCL-7) and ATCC CCL-7) and ATCC CCL-7) and ATCC CCL-7 cells (ATCC CCL-7) and CV-1 cells (such as ATCC CCL-7).
  • ATCC CCL-7 monkey kidney
  • CV-1 cells such as ATCC CCL-7
  • CC CCL-70 BHK cells derived from hamster kidney (eg, ATCC CCL-10), human-derived cells, and the like.
  • a viral vector production method using chicken eggs has already been developed (Nakanishi et al. (1993), “Advanced Protocols for Neuroscience Research, Molecular Neuronal Physiology”, Koseisha, Osaka, pp.153-172). Specifically, for example, fertilized eggs are placed in an incubator and cultured at 37-38 ° C for 9-12 days to grow embryos.
  • Viral vector is inoculated into the allantoic cavity and eggs are cultured for several days (eg 3 days) to propagate the viral vector. Conditions such as the culture period may vary depending on the recombinant Sendai virus used. Then collect the urine containing the virus. Separation and purification of Sendai virus vector from urine can be carried out according to conventional methods (Yasuto Tashiro, “Virus Experiment Protocol”, supervised by Nagai and Ishihama, Medical View, pp.68-73, (1995))
  • the recovered viral vector can be purified to be substantially pure.
  • the purification method can be performed by a known purification / separation method including filtration (filtration), centrifugation, adsorption, column purification, or any combination thereof.
  • “Substantially pure” means that the virus component occupies a major proportion in the solution containing the virus vector.
  • a substantially pure viral vector composition has 10% of the total protein contained in the solution (excluding proteins prepared as carriers and stabilizers) as a component of the viral vector ( Weight / weight) or more, preferably 20% or more, more preferably 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and further preferably 90% or more.
  • a paramyxovirus vector as a specific purification method, a method using a cellulose sulfate ester or a crosslinked polysaccharide sulfate ester (Japanese Examined Patent Publication No. 62-30752, Japanese Examined Patent Publication No. 62-33879, and Japanese Examined Publications). No. 62-30753), and a method of adsorbing to a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or a degradation product thereof (WO97 / 32010) and the like.
  • a minus-strand RNA viral vector, a nucleic acid that produces the viral vector, the vector or a cell into which the nucleic acid that produces the vector has been introduced, or a lysate thereof, and a desired pharmacologically acceptable carrier or medium A composition for antibody production is combined.
  • the composition for producing an antibody is a composition used exclusively for the purpose of producing an antibody.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier or vehicle” includes any desired solution capable of suspending viral vectors or cells, such as phosphate buffered saline (PBS), sodium chloride solution. , Ringer's solution, culture solution, and the like.
  • the present invention includes a minus-strand RNA viral vector carrying a nucleic acid encoding a foreign polypeptide to be used as an antigen, a nucleic acid that generates the viral vector, a cell into which the vector or a nucleic acid that generates the vector has been introduced, or the cell
  • the present invention relates to a method for producing an antigen vector composition for producing an antibody, comprising a step of producing a composition comprising a lysate of the above and a pharmaceutically acceptable carrier or medium.
  • the present invention also relates to the use of a minus-strand RNA virus vector, a nucleic acid that produces the virus vector, a cell into which the vector or a nucleic acid that produces the vector has been introduced, or a lysate thereof in the production of a composition for producing an antibody. Also related.
  • a recombinant minus-strand RNA viral vector carrying a nucleic acid that encodes a foreign polypeptide desired to be used as an antigen the above description of the present specification may be referred to.
  • the composition for producing an antibody can be supplemented with an immunoactivator such as cytokinin, cholera toxin, and salmonella toxin.
  • Miyuban complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, MF59 (oil emulsion), MTP-PE (mura myl tripeptide derived from mycobacterial cell wall) ⁇ or QS—21 soapbark tree Quilaia saponana), Alum (hydroxylic acid)
  • Adjuvants such as aluminum compound particles such as aluminum phosphide, aluminum sulfate, and aluminum phosphate can also be combined.
  • the composition preferably further contains Th2 site force-in or a nucleic acid encoding Th2 site force-in.
  • Th2 site force-in a nucleic acid encoding other anti-inflammatory site force-in or anti-inflammatory site force-in alone or in combination with a nucleic acid encoding Th2 site force-in or Th2 site force-in described above may be included.
  • the Th2 cytokine or anti-inflammatory cytokine those described in the present specification and combinations thereof can be used.
  • the Th2 site force-in is also selected as a group force that also includes IL-4, IL-10, and IL-13 forces.
  • the composition can also include a Th2 adjuvant.
  • Th2 adjuvant is an adjuvant that activates type 2 helper T cells (Th2 cells) over type 1 helper T cells (Thl cells), specifically alum mum hydroxide alum), cholera toxin (B sub image t), Schistosoma mansom egg extract protein (eg Lacto-N-fticopentaose ⁇ ), etc. can be used (Grun, J. and P H.
  • an organic substance such as a biopolymer, an inorganic substance such as hydroxyapatite, specifically a collagen matrix, a polylactic acid polymer or copolymer, a polyethylene glycol polymer or copolymer, and a chemical derivative thereof can be combined as a carrier.
  • the antigen polypeptide is expressed and antibody production is induced.
  • the vector can be administered in vivo or ex vivo via cells.
  • the minus-strand RNA Winoresector that is inoculated has the ability to express the antigenic polypeptide gene on its genome, it can be a non-infectious virus particle or virus core ( RNP complex including genome and genome-binding virus protein).
  • the minus-strand RNA viral vector includes an infected cell containing a ribonucleoprotein (RNP) complex having genomic RNA derived from a minus-strand RNA virus and a viral protein necessary for the replication of the RNA and the expression of the loaded gene.
  • RNP ribonucleoprotein
  • the RNP is a complex containing, for example, genomic RNA of a negative strand RNA virus or a complementary strand thereof (antigenomic RNA) and N, L, and P proteins.
  • the minus-strand RNA viral vector includes genomic RNA and genomic RNA, such as viral infectious particles, non-infectious particles (also called virus-like particles; also referred to as VLPs), and minus-strand RNA viral nucleosides.
  • genomic RNA such as viral infectious particles, non-infectious particles (also called virus-like particles; also referred to as VLPs), and minus-strand RNA viral nucleosides.
  • RNPs that contain viral proteins that bind. Even if it is RNP (virus core) from which the envelope has been removed from the virus particle, it can replicate the viral genomic RNA in the cell if it is introduced into the cell (W097 / 16538; W00 / 70055).
  • RNP or VLP can be inoculated into animals together with, for example, a transfection reagent (WO00 / 70055; WO00 / 70070).
  • RNA viral vector When inoculated via cells, collected from appropriate cultured cells or inoculated animals Introduce minus-strand RNA viral vector into cells. When infecting cells with a minus-strand RNA virus outside the body (for example, in a test tube or petri dish), it is performed in vitro (or ex vivo) in a desired physiological aqueous solution such as a culture solution or physiological saline. At this time, M0I (multiplicity of infection; number of infectious viruses per cell) is preferably between 1 and 1000, more preferably 2 to 500, more preferably 3 to 300, and even more preferably. 5 to 100.
  • the contact between the minus-strand RNA virus and the cells is sufficient even for a short time, for example, 1 minute or more, preferably 3 minutes or more, 5 minutes or more, 10 minutes or more, or 20 minutes or more. It may be about 5 minutes to 30 minutes. Of course, it may be contacted for a longer time, for example, for several days or longer.
  • RNP containing virus genomic RNA or non-infectious virus particles virus-like particles (VLP)
  • VLP virus-like particles
  • a known transfection method can be used. Specifically, calcium phosphate (Chen, C. & Okayama, H. (1988) BioTechniques 6: 632-63 8; Chen, C. and Okayama, ⁇ , 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745), DEAE-dextran (Rosenthal, N. (1987) Methods Enzymol. 152: 704-709), various ribosome-based transcription reagents (Sambrook, J. et al.
  • transfection reagents include DO TMA. (Roche), Superfect Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No.
  • Envelope viruses are known to take up host cell proteins during virus particle formation, and these proteins are antigens when introduced into cells. (J. Biol. Chem. (1997) 272, 16578-16584). Therefore, it is beneficial to use RNP with the envelope removed.
  • an expression vector that expresses viral genomic RNA and an expression vector that encodes viral proteins (N, P, and L proteins) necessary for replication of the genomic RNA are introduced into the cell, and the virus is introduced into the cell.
  • RNPs can also be formed directly. Cells into which a viral vector has been introduced may be produced in this way.
  • the obtained cells are inoculated to the animals as lysates (lysates) as they are or after lysis.
  • the lysate of vector-infected cells can be prepared by lysing cell membranes with detergents or by repeatedly freezing and thawing.
  • the surfactant nonionic Triton X-100, Nonidet P-40 or the like is used at a concentration of 0.1 to 1%.
  • the cell mass recovered by centrifugation after washing with PBS is resuspended in TNE buffer [25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, ImM EDTA, 1% Nonidet P_40] and left on ice for 10 to 30 minutes. Obtained at. If the protein used as an antigen is soluble in the cytoplasm, the resulting lysate should be centrifuged (10,000 X g, 10 min) to remove unnecessary insoluble fraction as a precipitate, and the supernatant should be used for immunization. it can.
  • Lysates used at the site of administration where it is not desirable to use a detergent can be obtained by repeatedly freezing and thawing the cells re-suspended in PBS 5-6 times after washing.
  • the method for producing an antibody or antibody-producing cell of the present invention comprises a negative-strand RNA virus vector carrying a nucleic acid encoding a foreign polypeptide as an antigen before inoculation to an animal, and a nucleic acid for producing the viral vector.
  • the method may further comprise the step of preparing a cell into which the vector or the nucleic acid that generates the vector has been introduced, or preparing a lysate of the cell, and any combination thereof.
  • a minus strand that expresses a target antigen polypeptide in an animal by administering to the animal a nucleic acid that generates a minus-strand RNA viral vector carrying a nucleic acid encoding a foreign polypeptide that is to be used as an antigen.
  • the nucleic acid that produces the minus-strand RNA viral vector is a set of nucleic acids that express the RNA and protein groups necessary for the production of a recombinant of the minus-strand RNA viral vector.
  • the negative strand R encoding the desired foreign polypeptide A set of nucleic acids containing nucleic acids encoding NA virus genomic RNA or its complementary strand (antigenomic RNA, plus strand), and the viral proteins that comprise the RNP containing genomic RNA of minus strand RNA viruses.
  • These nucleic acids contain an appropriate promoter so that the encoded RNA and protein can be expressed.
  • CMV promoter Ferturing, MK, and Hofstetter H. Gene 1986; 45: 101-10 5
  • retrovirus LTR Shinnik, TM, Lerner, RA & Sutcliffe (1981) Nature, 293 , 543-548
  • EF1 promoter CAG promoter (Niwa, H.
  • a plasmid vector can be suitably used as the nucleic acid.
  • the genome of the minus-strand RNA virus contains genes encoding viral proteins (typically N, L, and P) that constitute the RNA containing genomic RNA, and is possessed by the parental wild-type virus. Those with all envelope protein genes are preferred.
  • an envelope protein that complements the formation of infectious virus particles for example, an envelope protein or VSV-G that is deleted in the genome).
  • Nucleic acids encoding other envelope proteins may be included in the above set of nucleic acids. By administering these nucleic acids to animals, recombinant minus-strand RNA viruses are generated in the animals.
  • the virus protein group that constitutes the RNP containing the genomic RNA of the minus-strand RNA virus is a protein that forms an RNP with the viral genomic RNA and constitutes the nucleoside psid. These are a group of proteins required for genome replication and gene expression, typically N, P, and L proteins.
  • the present invention comprises (a) (i) a nucleic acid encoding a minus-strand RNA viral genomic RNA encoding a foreign polypeptide or a complementary strand thereof, and (ii) a nucleic acid encoding N, P, and L protein, respectively. And (b) recovering an antibody or antibody-producing cell from the animal.
  • inoculated norate there is no particular limitation on the inoculated norate, but for example, intramuscular injection (for example, gastrocnemius), subcutaneous administration, nasal administration, intrapalpal or footpad administration, spleen direct administration, intraperitoneal administration and the like are suitable.
  • Nasal administration includes the case where the infection site stays in the nasal cavity (intranasal administration) to the respiratory tract to the lungs (intranasal lung administration).
  • transanal (rectal) administration may be used, and target organs include the oral cavity, intestinal tract, urogenital or upper respiratory tract mucosa, and the like.
  • target organs include the oral cavity, intestinal tract, urogenital or upper respiratory tract mucosa, and the like.
  • oral administration in order to maintain transportability even when exposed to gastric juice with strong acidity, it is possible to infect target organs by processing into sustained release microcapsule vectors.
  • the inoculation site may be one site or a plurality of sites (for example, 2 to 15 sites).
  • the inoculation amount may be appropriately adjusted according to the inoculated animal, the inoculation site, the number of inoculations, and the like.
  • the inoculation amount per site is 1 ⁇ 10 4 CIU to 5 ⁇ 10 11 CIU (cell infectious unit), preferably 1 ⁇ 10 6 CIU to 1 ⁇ 10 1 in terms of virus titer. Let's say CIU.
  • the same type of cultured cell line for example, sarcoma cell line
  • a minus-strand RNA virus vector for example, 10 4 to 10 9 cells, preferably 10 5 ⁇ 10 8 cells, or lysates thereof, can be inoculated into animals.
  • a significant antibody titer can be induced by the first immunization alone, but boosting by more than one inoculation will increase the antibody titer. Can be raised.
  • RNA viral vector encoding the antigen those further encoding Th2 site force-in and / or anti-inflammatory site force-in can be preferably used.
  • Th2 site force-in and / or anti-inflammatory site force-in may be administered.
  • the administration site is not particularly limited, but it is administered at the same location as or around the minus-strand RNA virus vector encoding the antigen (1 mm force, within 3 cm, preferably 3 mm force, within 10 mm). Good.
  • nucleic acid encoding the minus-strand RNA viral genomic RNA encoding the foreign polypeptide or its complementary strand, and N, P, and L The nucleic acid encoding the protein may be administered to the animal at a weight ratio of 5: 0.5: 0.5: 2, respectively, but the amount ratio of each nucleic acid may be appropriately adjusted.
  • an expression plasmid 5 ⁇ g to 1000 ⁇ g of a plasmid encoding viral genomic RNA (plus or minus strand), N, P, and L expression plasmids of 0.5 ⁇ ig / ig 200 ig, 0.5 ⁇ ⁇ 200 / 1 ⁇ , 2/1 ⁇ ⁇ 500 ⁇ when administered Yo Le.
  • the nucleic acid is administered by, for example, naked DNA injection or mixing with a transfection reagent.
  • transfection reagent examples include ribofactamine or polycationic ribosome.
  • Specific examples include DOTMA (Roche), Superfect (QIAGEN # 3 01305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Roche # 1811169), TransIT—LTl (Minis, Product No. MIR 2300) can be used.
  • Boost is inoculated in the same manner as described above 1 to several weeks after the first immunization (eg:! To 3 weeks, more specifically about 2 weeks later).
  • intraperitoneal administration and / or boosting by intradermal injection to the back, toes, etc. are suitable. If you want to increase the antibody titer, repeat the boost.
  • the animal is inoculated with an antigen purified from the cell lysate or an antigen purified from the cell lysate.
  • Cell lysates for boost immunization can be prepared as described above.
  • the degree of purification of the purified antigen is not particularly limited, and it may be purified to various degrees.
  • an antigen purified from a lysate by centrifugation, filtration, dialysis, various types of chromatography, or the like can be used. It is also suitable to inoculate a foreign polypeptide or a partial peptide that is to be used as an antigen.
  • a partial peptide can be synthesized and immunized with a carrier protein such as KLH (keyhole limpet hemocyanin), ushi serum albumin (BSA), thyroglobulin (THY), or ovoalbumin (OVA) as appropriate.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • BSA ushi serum albumin
  • THY thyroglobulin
  • OVA ovoalbumin
  • the length of the partial peptide should be, for example, 8 to 25 residues (9-20, 10-18, or 12-16 residues).
  • the antibody is collected by blood collection (in the case of a polyclonal antibody).
  • blood collection in the case of a polyclonal antibody.
  • cells are collected from the spleen or lymph node of the immunized animal, immortalized by operations such as cell fusion with myeloma to produce a hyperidoma, and then the desired antibody is produced.
  • animals to be inoculated include fish, amphibians, reptiles, birds, mammals and other desired non-human vertebrates having antibodies, but preferred and non-human mammals, more preferably non-human mammals. Is an animal. Specific examples include rodents such as chickens, rabbits, goats, sheep, pigs, rabbits, mice and rats, non-human primates such as monkeys, and other mammals.
  • the antibody titer is determined by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) or Octaroni method ( ⁇ uc hterlony method).
  • ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • Octaroni method ⁇ uc hterlony method
  • the ELISA method for example, after the antigen is adsorbed to the microplate, the prepared antiserum is diluted 1000-fold to 2-fold and added to the plate to cause the antigen-antibody reaction. Further, as a secondary antibody, a peroxidase enzyme-labeled heterologous animal antibody against the antibody of the immunized animal is reacted and then developed.
  • the antibody titer can be calculated by using the dilution ratio at which the color developing absorbance is 1 ⁇ 2 of the maximum color developing absorbance as the antibody titer of the antibody.
  • the Octaloni method Ouchteriony method
  • the antigen and antibody diffuse in the agar gel, resulting in an immunoprecipit
  • the antibody may be prepared in the form of serum or a diluted solution thereof, or may be purified.
  • a desired class such as IgG or IgM antibody can be purified.
  • a column or bead in which Protein A or Protein G is immobilized on a carrier can be used.
  • An IgM antibody can be purified by a column using 2-mercaptopyridine as a ligand. The 2-mercaptopyridine column is also used for purification of IgY (chicken egg yolk antibody) (HiTrap Ig Y Purification HP, Amersham Biosciences ⁇ ⁇ ⁇ .).
  • the antibody can be purified by DEAE anion exchange chromatography. For example, when purifying a large amount from goats, hidges, etc., first salt out with sulfate to obtain a crude IgG fraction, and then pass through a DEAE-cellulose column. Collected in minutes.
  • an affinity purification method can be used as a method for specifically purifying an antibody from antiserum. The ability to specifically recover antibodies that bind to antigens by immobilizing the antigen on a carrier gel, preparing an affinity gel, passing antiserum through this gel, and recovering the IgG bound to the antigen S it can.
  • the collected antibody can be analyzed for purity by HPLC (for example, Tosoh TSK G3000 SWXL column) (Howard, CC and Bathell, DR eds., Basic Methods in Antibody Production and Characterization, 2001, CRC Press BocaRaton, London, New Yorkj 0
  • an antibody that does not bind to the target antigen polypeptide can be removed by negative selection.
  • minus-strand RNA virus Antibodies that bind to the viral proteins of can be removed. This can be accomplished, for example, by encoding the antigenic polypeptide of interest, a minus-strand RNA viral vector, a cell into which the viral vector has been introduced, a lysate of the cell, or one or more of the viruses.
  • a viral protein may be prepared and the antibody binding thereto may be removed.
  • a solution containing an antibody is added to the minus-strand RNA vinores betater that does not encode the target antigen polypeptide, a cell into which the viral vector has been introduced, a lysate of the cell, or a viral protein of the virus.
  • a solution containing an antibody is added to the minus-strand RNA vinores betater that does not encode the target antigen polypeptide, a cell into which the viral vector has been introduced, a lysate of the cell, or a viral protein of the virus.
  • the immobilized carrier gel to remove the antibody binding to them.
  • a solution containing an antibody produced by a hyperidoma is mixed with a protein that does not encode the antigen polypeptide of interest, a minus-strand RNA virus vector, a cell into which the virus vector is introduced, a lysate of the cell, or the virus It is mixed with the virus protein and the binding is detected.
  • hybridomas that produce antibodies that do not bind to these it is possible to exclude hybridomas that produce antibodies that bind to the viral vector itself.
  • the obtained antibody can be stored in the form of a solution or a lyophilized product.
  • sodium azide may be added as a preservative. It may also contain ushi serum albumin (BSA) as a stabilizer.
  • BSA ushi serum albumin
  • the antibody can be diluted in phosphate buffered saline containing 2 mg / mL ushi serum albumin and 0.1% sodium azide.
  • Applications of antibodies include, for example, analysis of surface antigens by flow cytometry, analysis of intracellular antigens by flow cytometry, immunohistochemical staining, immunoblotting (u stampblot), immunoprecipitation, ELISA, ELISP T, in vivo, bioaccess, blocking, neutralization, antibody therapy, etc.
  • Bioassays For in vivo applications, antibodies that do not contain preservatives such as sodium azide are preferred. When used for protein detection, the antibody can be labeled appropriately.
  • various labeling methods such as enzyme labeling, fluorescent labeling, radioactive labeling, piotin labeling, and gold colloid labeling are known (P. Cuatrecasas, et al, Biochemistry). , 11, 2291 (1972); S. Yoshitake, et al., Eur. J. Biochem., 101, 395 (1979); MJ O'S ullivan, et al., Anal. Biochem., 100, 100 (1979); S. Yoshitake, et al "Anal.
  • the photochromic dyes are: FITC, PE, ECD (PE-TxRED), PC5 (PE_Cy5), PC 5.5 (PE-Cy5.5), PC7 (PE-Cy7) APC, APC5.5 (APC_Cy5.5), APC7 (APC_Cy7), Cy5, Alexa Fluor TM, etc. are used.
  • the antibody is fragmented and F (ab '), Fab', Fab, F
  • Antibody fragments can be obtained by degrading antibodies using peptidases such as papain or pepsin.
  • a 6-week-old male BALB A mouse LacZ-expressing F gene-deficient Sendai virus vector SeV18 + LacZ / AF (W ⁇ 00 /) was prepared in 6 gastrocnemius muscles with saline to 2xl0 8 CIU / ml. 70070) was administered. 100 ⁇ was inoculated at two sites on one side by intramuscular injection. Five weeks after vector inoculation, blood was collected from the orbital venous plexus and plasma was separated.
  • SDS electrophoresis was performed using a commercially available Escherichia coli-derived j3 galactosidase (Sigma G5635) to 4 ⁇ g per lane.
  • the electrophoresed protein was transferred to a PVDF membrane with a semi-drive mouther and blocked with 5% skim milk.
  • Plasma of immunized mice was diluted 200-fold with PBS containing 4% ushi serum albumin and used for the primary antibody reaction.
  • an anti-LacZ antibody Promega Z378A
  • diluted 5000 times with PBS containing 4% ushi serum albumin was used.
  • HRP-labeled anti-mouse Igs Bioso urce AMI4704
  • 5% skim milk and 0.1% Tween20 added TBS was used as secondary antibody.
  • Signals were detected by chemiluminescence using ECL plus (Amersham) using a LAS1000 instrument (FUJI FILM).
  • mice Sixteen-week-old female BALB A mice (4 mice for each route of administration) were diluted with physiological saline by nasal injection, intramuscular injection, direct spleen injection, and footpad injection.
  • GFP expression F The gene-deficient Sendai virus vector SeV18 + GFP / ⁇ F (WO00 / 70070) was injected in an amount of 5 ⁇ 10 6 CIU.
  • mice under slight anesthesia with sevoflurane were aspirated by a small amount of vector suspension of 100 ⁇ 1 by nasal breathing.
  • 50 ⁇ 1 of vector suspension was injected into one leg of the gastrocnemius muscle, and 50 ⁇ 1 of vector suspension was directly injected for spleen direct injection.
  • footpad injection each foot was injected with a total of 50 ⁇ l of each foot 25 ⁇ l.
  • mice Two 6-week-old female BALB A mice were each administered with the viral vector SeV18 + GFP / AF prepared in saline at 1 xlO 8 ClU / ml subcutaneously in the abdominal cavity or lumbar region. In the abdominal cavity, 100 ⁇ l of the vector suspension was used as it was, and subcutaneous administration was performed by injection of 50 ⁇ l each into two lumbar regions.
  • mice After priming 2 weeks, the 5xl0 7 CIU / ml base virus were prepared Kuta one SeV18 + GFP / AF intraperitoneally administered ⁇ ⁇ ⁇ all mice. Control non-boost mice received 100 ⁇ l of saline in the same manner.
  • Anti-GFP antibody titer in plasma was detected by Western blotting on commercially available purified GFP protein that was electrophoresed on SDS-PAGE and then transferred and fixed on a PVDF membrane.
  • a commercially available anti-GFP antibody and non-immune mouse plasma were used as controls.
  • Anti-GFP antibody titer in plasma was electrophoresed on SDS-PAGE, then transferred to PVDF membrane and immobilized on Sendai virus vector-infected LLC-MK cell lysate protein loaded with FP gene
  • LLC-MK cells were infected with SeV18 + GFP / AF to a moi of 10, and after 2 days, the cells were washed twice with 4 ° C PBS. After adding 5 ml of cell lysis buffer (PBS supplemented with 10 mM CHAPS, 2 mM EDTA, 2 mM PMSF) and allowing to stand at 4 ° C. for 20 minutes, soluble matter was recovered with a cell scraper. The collected material was centrifuged at 9000 mm, and the supernatant was collected and placed in a permeation tube, Slide-A-Lyzer 2000MW (Piarce). Dialyzed against PBS at 4 ° C to remove CHAPS. . Soluble protein was quantified by the Bradford method (Bio-Rad DC Protein Assembly kit), applied at 5 ⁇ g per lane, and subjected to SDS-PAGE.
  • the protein was transferred to a PVDF membrane with a semi-drive lotter and blocked with 5% skim milk or 4% sushi serum albumin.
  • Plasma was diluted 200-fold with PBS containing 4% ushi serum albumin and used for the primary antibody reaction.
  • an anti-GFP antibody (Invitrogen) diluted 5000 times with PBS containing 4% ushi serum albumin was used.
  • Secondary antibody HRP-labeled anti-mouse Igs (Biosource AMI4704) diluted with 5% skim milk, 4% ushi serum albumin, 0.1% Tween 20 supplemented BS was used. Detection was performed by chemiluminescence using ECL plus (Amersham) using a LAS1000 device (FUJI FILM).
  • mice 2 weeks after priming, and the viral vectors one SeV18 + GFP / ⁇ F prepared in 5xl0 7 CIU / ml intraperitoneally all mice were administered 100 mu 1. Control non-boost mice received 100 ⁇ l of saline in the same manner.
  • the anti-GFP antibody titer in the plasma was detected by Western blotting on commercially available purified GFP protein (Wako chemicals), which was electrophoresed by SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane and fixed as in Example 2.
  • a commercially available anti-GFP antibody (Invitrogen) and non-immune mouse plasma were used as controls.
  • Example 2 Dilute in saline with saline, intramuscular injection, direct spleen injection, and footpad injection in the same manner as in Example 2 on a total of 8 BALB A mice (2 mice for each administration route) in 6-week-old females.
  • the prepared Sendai virus vector SeV18 + GFP / AF was administered at 5 ⁇ 10 6 CIU per head.
  • lysate of Sendai virus vector SeV18 + GFP / AF-infected mouse sarcoma cell Meth-A was administered intraperitoneally to all mice in an amount equivalent to 5 X 10 6 cells per head did.
  • the lysate was prepared in the same manner as in Example 3.
  • the anti-GFP antibody titer in plasma was detected by Western blotting on a commercially purified GFP protein that was electrophoresed on SDS-PAGE and then transferred and fixed on a PVDF membrane.
  • a commercially available anti-GFP antibody (Invitrogen) and non-immune mouse plasma were used as controls (FIG. 4).
  • virus vector SeV18 + GFP / ⁇ F prepared to 1 xlO 8 CIU / ml with physiological saline was administered intraperitoneally.
  • Myeloma (P3_X63-Ag8.653) (RIKEN RCB0146) was cultured in RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), and prepared for the logarithmic growth phase on the day of fusion. On the third day after boosting, the mice were sacrificed by cervical dislocation and the spleen was removed. Using a stainless steel net sterilized in serum-free RPMI1640 medium, spleen cells were isolated by filtration. Spleen cells were washed 3 times and myeloma was washed 2 times with serum-free RPMI1640 medium, and both were mixed at a ratio of 1: 1 and centrifuged.
  • FBS fetal bovine serum
  • spleen cells and myeloma were fused with 50% polyethylene glycol PEG (Sigma Hybri-Max mw3000_3700). Fused cells are washed with serum-free medium and centrifuged twice, then suspended in 40 ml of RPMI 1640 medium supplemented with 20% FBS / 10 mM HEPES / lmM sodium pyruvate, and added to a 96-well plate at approximately 10 5 cells per well. Sowing.
  • HAT selection medium 100 ⁇ l of HAT selection medium to each well, remove half of the medium supernatant from the next day, and add 100 ⁇ l of HAT medium (20% FBS / lxHAT supplement Hybri-Max (Sigma H0262)) RP MI1640 ) was added.
  • Half of the medium is exchanged daily in the HAT selection medium until one week after cell fusion, and thereafter in HT medium (Carlo RPMI1640 with 20% FBS / lxHT supplement Hybri-Max (Sigma H0137)). The test was performed every day or according to the density of living cells.
  • the fused cells selected by the HAT selection medium When the fused cells selected by the HAT selection medium are large enough to cover more than half of the bottom of the well, collect the culture supernatant and perform Western blotting to obtain anti-GFP antibody from the fused cells. Selected.
  • the proliferated fused cells were cloned by limiting dilution using a 96-well plate with BALB A mouse thymocytes as feeders.
  • the obtained clones were amplified and became large enough to cover about half of the well, the culture supernatant was recovered, and the clones producing the anti-GFP antibody were recovered by Western blot.
  • we succeeded in producing a monoclonal antibody that recognizes GFP using spleen cells of mice immunized with Sendai virus vector loaded with GFP (Fig. 5).
  • HIV-1 Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) envelope protein, gpl60 gene, prepared in 8 x 7-week-old female BALB A mice under sevoflurane anesthesia with 5 xlO 8 CIU / ml in physiological saline F gene-deficient Sendai virus vector SeV18 + GP160 / ⁇ F loaded with 100 ⁇ per nose was administered.
  • HAV-1 Human immunodeficiency virus type 1 envelope protein
  • gpl60 gene prepared in 8 x 7-week-old female BALB A mice under sevoflurane anesthesia with 5 xlO 8 CIU / ml in physiological saline F gene-deficient Sendai virus vector SeV18 + GP160 / ⁇ F loaded with 100 ⁇ per nose was administered.
  • Myeloma (P3-X63-Ag8.653) was prepared by the method described in Example 5.
  • 4 animals with high anti-gpl60 antibody titers collected during the final boost were sacrificed by cervical dislocation and the spleen was removed.
  • Spleen cells were isolated and collected by grinding the spleen on a nylon mesh in serum-free RPMI 1640 medium.
  • Cell fusion of spleen cells and myeloma and culture of the fused cells were performed by the method described in Example 5.
  • Antibody-producing cells were identified by detecting culture supernatants that were positive only in the cell.
  • g P 160 specific antibody is a Western blot using a PVDF membrane that was transcribed after SDS-PAGE of SeV18 + GP160 / AF vector-infected LLC-MK cell lysate prepared by freezing and thawing.
  • Antibodies against viral proteins of HIV and other viruses are useful for detecting and diagnosing viral infections, for example.
  • the amino acid sequence of the synthesized peptide is as follows. The number in parenthesis is the amino acid number of the corresponding part on the amino acid sequence of gpl60 registered in Genbank (accession number NPJ357856). However, the # 493 and # 495 amino-terminal cysteines and the # 494 carboxy-terminal cysteine were added for conjugation with KLH and are not included in the gpl60 sequence.
  • hybridoma C1-182 producing anti-gpl60 antibody was detected in fusion cells prepared from mice boosted with peptide (FIG. 8). It was determined to be IgG by the C1-182 subclass (6) (Mouse Immunoglobulin Screening / Isotyping Kit (Genzyme, catalog number 97-6550)).
  • Cell cloning of 6-76 and C1-182 was performed to enable stable passage of the prepared hyperpridoma. Dilute and inoculate a 96-well tissue culture plate with 0.3, 1, 3 cells / well, and after about 2 weeks, check for a well in which only one cell colony appears per well under a microscope. The supernatant was collected and the presence of anti-gpl60 antibody was detected by ELISA. For cloning, 10% FBS-containing RPMI1640 medium and 10% BM Condimed HI (Roche Diagnostics catalog number 1 088 947) were added for preparation. Cloning was performed twice.
  • Example 6 Furthermore, the same positive results as in Example 6 were obtained using the culture supernatants of the second positive cells 6-76-14-21, 6-76-14-29, Cl-182-48-5, CH82-48-35.
  • gpl60 and gp41 could be detected in exactly the same way as the original hybridoma and the first cloning positive cells (Fig. 11).
  • the antibody protein in the culture supernatant of Hypridoma 6-76-14-29 was purified using a column (Pierce ImmunoPure Immobilized Protein L, catalog number 20510) on which immunoglobulin-binding protein L was immobilized. The protocol followed the attached instructions.
  • the purified antibodies were Syp ro Orange fluorescent staining (BioRad catalog number 170-3120), anti-mouse IgG (L + H) antibody (M As with the commercially available anti-Ovalbumin antibody (antibodyshop catalog number HYB 094-07) used as a control in both Western blots according to P Biomedicals catalog number 67428), one band each for H chain and L chain is shown.
  • Example 11 Induction of anti-gpl60 antibody in plasma by administration of IL10 co-loaded F gene-deficient Sendai virus vector
  • the F gene-deficient Sendai virus vector SeV18 + LacZ / AF contains a nucleic acid encoding cytoforce-in interleukin (IL) -10, which is known to have an effect of stimulating antibody production simultaneously with CT L suppression. Then, a vector loaded with a nucleic acid encoding gpl60 was prepared, and a mouse was immunized using this vector, and the antibody produced in plasma after 56 days was examined. Immunization and Western blot were performed as in Example 7. It was shown that anti-gpl60 antibody is effectively induced by Sendai virus vector loaded with IL-10. ( Figure 15) Industrial applicability
  • a method for producing an antibody using a minus-strand RNA viral vector is provided.
  • the antibody produced by the method of the present invention is used for protein detection and purification, neutralization, clinical examination, pathological diagnosis, antibody therapy, and the like.

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Abstract

［課題］　本発明は抗体および抗体産生細胞の製造方法を提供する。 ［解決手段］　本発明は、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、または該細胞の溶解物を、非ヒト動物に接種する工程、および、該動物から、抗体または抗体産生細胞を回収する工程、を含む、抗体または抗体産生細胞の製造方法を提供する。マイナス鎖RNAウイルスベクターによる免疫活性化作用と抗原ポリペプチドの高発現により、効率的に抗体産生を誘導することができる。本発明の方法により製造された抗体は、研究開発および臨床分野において用いることができる。

Description

明 細 書
抗体の作製方法
技術分野
[0001] 本発明は抗体および抗体産生細胞の作製方法に関する。
背景技術
[0002] 蛋白質発現の多寡と細胞の機能あるいは細胞の状態との関連性を解明することは ポストゲノムにおける最大の課題の 1つである力 遺伝子レベルの発現解析だけでそ の機能を関連づけることは非常に困難である。そこで蛋白質、あるいはペプチド鎖の 検出、同定が必須となる。蛋白質の分析は、アミノ酸配列および組成解析、 2次、 3次 構造の解析、分子量同定など様々な手法が開発されてきている。しかし、蛋白質の 同定には抗体を用いる方法が現在も標準的な手法となっている（Michael Steward, C hapter 27. Immunological Techniques, pp. 417-434, m Immunology, 6th edition (Iva n M. Roitt, Jonathan Brostoff, David K. Male, Editors), 2001, C.V. Mosby)。もちろ ん抗体は、ウェスタンブロッテイング、免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫沈降 法、免疫ァフィ二ティーカラム法など多岐に渡る蛋白質の検出、同定だけでなぐ癌 細胞のミサイル療法、ベクターのターゲッティング、細胞の機能阻害など実用的にも 広く用いられている。
[0003] 抗体はその結合の特異性、結合性能の高さが鍵になり、モノクローナル抗体の作 製法の発明によりその利用価値が一段と増したと思われる。しかしながら蛋白質によ つてはその形状、性質力、ら標的としたェピトープに対する充分なァフィ二ティーを持 つ抗体を作製することは非常に困難な場合が多くある。抗体作製のためには精製蛋 白質、合成ペプチド、分離した蛋白質発現細胞、単離組織などを用い動物を免疫す る場合が多いが、特定の遺伝子情報に基づく蛋白質 ·ペプチド鎖に対する抗体を作 製する場合、当該遺伝子を載せた発現プラスミドを直接動物組織に接種する方法や 、培養細胞で発現させた後、粗精製分画によって免疫する方法がある。しかし、発現 量が充分でなく目的の抗体が得にくい場合も多い。
非特 3午文献 1： Michael Steward, Chapter 27. Immunological fechmques, pp. 417-43 4, in Immunology, 6th edition (Ivan M. Roitt, Jonathan Brostoff, David K. Male, Edit ors), 2001, C.V. Mosby
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は抗体および抗体産生細胞の作製方法を提供する。また本発明は、抗体 製造用抗原組成物の製造方法を提供する。
課題を解決するための手段
[0005] マイナス鎖 RNAウィルスは、マイナス鎖 RNAをゲノムに持つウィルスであり、細胞に 感染したときにゲノム RNAが細胞内で増幅し搭載遺伝子を高いレベルで発現させる（ Yonemitsu Y. et al. , Nat Biotechnol, 2000, 18(9):970- 3)。本発明者は、マイナス鎖 R NAウィルスのこの利点を生力 て、抗体製造にマイナス鎖 RNAウィルスを利用するこ とを考えた。また、マイナス鎖 RNAウィルスは感染後、複数のサイト力インを分泌させ ることにより宿主の免疫活動を高めることが報告されており（Strahle et al. J. Virol. 77( 14): 7903-7913 (2003)， Tsutsumi et al. Pediatr. Infect. Dis. J. 20(10): 997-1001 (20 01))、この点でも抗体作製に有利に働くと予想した。そこで本発明者らは、抗原とした いポリペプチドを発現する組み換えマイナス鎖 RNAウィルスを作製し、これを動物に 免疫して抗体の作製を行った。
[0006] マイナス鎖 RNAウィルスを直接、または該ウィルスを感染させた細胞ライセート（溶 解物）を、点鼻、筋注、脾臓直接注、腰部皮下、足躕注などの複数の投与経路により 接種し、抗体産生を確認したところ、いずれの投与経路においても血中に抗体が検 出された。抗体価の上昇は、特に点鼻投与で顕著であった。また、腹腔内投与による ブーストを行うことにより、抗体産生レベルをさらに上昇させることに成功した。さらに、 免疫を行ったマウス脾臓細胞からハイプリドーマを作製し、モノクローナル抗体の作 製にも成功した。マイナス鎖 RNAウィルスベクターによる免疫活性化作用と抗原ポリ ペプチドの高発現により、効率的に抗体産生が誘導されたと考えられる。
[0007] 従来抗原ポリペプチドを用いて動物を免疫する際には、皮下、皮内、腹腔内、足躕 などの投与部位が用レ、られ、また抗原ポリペプチド発現プラスミドを用いる際には筋 注が用いられてきた。マイナス鎖 RNAウィルスベクター、中でもセンダイウィルスべク ターは、免疫のための投与法として、上記の部位にカ卩えて点鼻投与を新たに提供す る。また、従来の抗原ポリペプチド発現プラスミドを筋注する方法では確実に免疫を 誘導することが困難であり、誘導される免疫も多くの場合充分な強さに達しないことが 知られている。センダイウィルスベクターは多くの細胞に効率良く感染し外来遺伝子 を高発現するので確実にかつ簡便に抗体産生を誘導することが可能であると考えら れる。さらに、感染細胞から感染性粒子を産生しないなど Biosafetyの面で安全性を 高めた改良型ベクターが使用可能であることもセンダイウィルスベクターを用いた抗 体産生法の利点である（WO00/70055および WO00/70070; Li, H.-O. et al" J. Vir ol. 74(14) 6564-6569 (2000))。
このように、抗原ポリペプチドを発現するマイナス鎖 RNAウィルスベクターを接種す ることにより、該ポリペプチドに対する抗体を効率的に産生させることができることが証 明された。ベクターの接種箇所は限定されず、ブーストも有効であった。免疫は、マイ ナス鎖 RNAウィルスベクターを直接接種する他、該ベクターを感染させた培養細胞な どを用いても可能であり、作製した細胞は、免疫に用いる以外にも、 目的の抗原ポリ ペプチドを精製し、 ELISAやウェスタンブロットによる抗体の検出、モノクローナル抗 体産生ハイプリドーマのスクリーニングなどに用いることも可能である。本発明の方法 により得られた抗体は、生体分子の検出や分離、抗体治療など幅広い分野への適用 が期待される。すなわち本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスを用いた抗体および抗体 産生細胞の作製方法等に関し、より具体的には、請求項の各項に記載の発明に関 する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の 1つまたは複数の組み 合わせからなる発明は、それらの請求項に記載の発明に既に意図されている。具体 的には、本発明は、
〔1〕抗体または抗体産生細胞の製造方法であって、
(a)抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖 RNAウイ ルスベクター、該ウィルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生 成する核酸が導入された細胞、または該細胞の溶解物を、非ヒト動物に接種するェ 程、
(b)該動物から、抗体または抗体産生細胞を回収する工程、を含む方法、 〔2〕工程 (a)の接種が、筋注、皮下投与、点鼻投与、手掌または足躕皮内投与、脾 臓投与、および腹腔内投与からなる群より選択される投与経路により行われる、〔1〕 に記載の方法、
〔3〕該マイナス鎖 RNAウィルスベクター、該ウィルスベクターを生成する核酸、該べ クタ一または該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、該細胞の溶解物、また は該細胞の溶解物から精製された抗原の接種によりブーストを行う工程をさらに含む 、〔1〕または〔2〕に記載の方法、
〔4〕該ポリペプチドまたはその断片を含むポリペプチドによりブーストを行う工程をさら に含む、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の方法、
〔5〕回収した抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を選択する工程を さらに含む、〔1〕から〔4〕のレ、ずれかに記載の方法、
〔6〕回収した抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合させ、ハイプリドーマを調製する 工程をさらに含む、〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の方法、
〔7〕ハイプリドーマが産生する抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を 産生するハイプリドーマを選択する工程をさらに含む、〔6〕に記載の方法、 〔8〕ハイプリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収する工程をさらに含む、 〔6〕 または〔7〕に記載の方法、
〔9〕マイナス鎖 RNAウィルスが複製欠損型である、〔1〕から〔8〕のレ、ずれかに記載の 方法、
〔10〕マイナス鎖 RNAウィルス力 S、パラミクソウィルスである、 〔1〕から〔9〕のいずれか に記載の方法、
〔11〕パラミクソウィルスが少なくとも F遺伝子を欠損する、〔10〕に記載の方法、 〔12〕パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、〔10〕または〔11〕に記載の方法、 〔13〕回収した抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしない該マイナス鎖 R NAウィルスベクター、該ウィルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、また は該ウィルスのウィルス蛋白質とを共存させる工程、および、それらと結合しない抗体 を選択する工程、をさらに含む、〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の方法、 〔14〕ハイプリドーマが産生する抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしな ぃ該マイナス鎖 RNAウィルスベクター、該ウィルスベクターが導入された細胞、該細 胞の溶解物、または該ウィルスのウィルス蛋白質とを共存させる工程、および、それら と結合しない抗体を産生するハイプリドーマを選択する工程、をさらに含む、 〔1〕から 〔12〕のいずれかに記載の方法、
〔15〕Th2サイト力インまたはその活性部分ペプチド、あるレ、はそれらをコードするべ クタ一を投与する工程をさらに含む、〔1〕から〔14〕のいずれかに記載の方法、 〔16〕該サイト力インまたはその活性部分ペプチドが、抗原としたい外来ポリペプチド をコードする該マイナス鎖 RNAウィルスベクターにコードされている、 [15]に記載の 方法、
〔17〕Th2サイト力インカ SIL_4、 IL_10、および IL-13からなる群力、ら選択される、 〔15〕 または〔16〕に記載の方法、を含むものである。
発明の効果
[0009] 本発明の方法は、所望の抗原ポリペプチドを発現するマイナス鎖 RNAウィルスを用 いて効率的に抗体を作製することが可能であり、抗原ペプチドを精製することは必須 ではない。本発明により製造された抗体は、ウェスタンブロッテイング、免疫組織化学 、フローサイトメトリー、免疫沈降法、免疫ァフィ二ティーカラム法など多岐に渡る蛋白 質の検出、同定だけでなぐ癌細胞のミサイル療法、ベクターのターゲッティング、細 胞の機能阻害など臨床においても用いることができる。
図面の簡単な説明
[0010] [図 l]LacZ遺伝子搭載マイナス鎖 RNAウィルスベクターの投与による抗 LacZ抗体産 生を示す図である。筋注によるプライミング後 5週目のマウス血漿を用いて、市販精製 LacZで検出した。 [各レーンの説明] 1分子量マーカー； 2 SeV-LacZ接種マウス #1 ； 3 SeV-LacZ接種マウス #2； 4 SeV-LacZ接種マウス #3； 5 SeV-LacZ接種マウス #4； 6 SeV-LacZ接種マウス #5； 7 36 -1^ 2接種マゥス#6 ; 8非免疫マウス； 9巿販抗 LacZ 抗体（1/5000希釈）
[図 2]GFP遺伝子搭載マイナス鎖 RNAウィルスベクターの投与による抗 GFP抗体産生 を示す図である。 A:ウィルスベクターで点鼻、筋注、脾臓直接注入、あるいは足 躕注にてプライム、 2週間後、同ウィルスベクターの腹腔内投与によりブーストし、ブラ イミングから 4週間後のマウス血漿中の抗 GFP抗体をウェスタンプロットで検出した。
[各レーンの説明] 分子量マーカー；2巿販抗 GFP抗体； 3非免疫マウス; 4点鼻プ ライム/センダイウィルスベクターブースト； 5点鼻プライム/ PBSブースト（対照）；6筋 注プライム/センダイウィルスベクターブースト； 7筋注プライム /PBSブースト（対照）；8 脾臓注プライム/センダイウィルスベクターブースト； 9脾臓注プライム/ PBSブースト（ 対照）； 10足躕注プライム/センダイウィルスベクターブースト； 11足躕注プライム/ PB Sブースト（対照） B:センダイウィルスベクターで皮内、あるいは腹腔内投与にてプ ライム、 16日後センダイウィルスベクター（lxlO7 CIU/head)の腹腔内投与によりブー ストし、プライミングから 19日後のマウス血漿中の抗 GFP抗体をウェスタンブロットで検 出した。メンブレンには GFP遺伝子搭載センダイウィルスベクター感染 LLC-MK細胞
2 ライセートを固定した。 [各レーンの説明] 1分子量マーカー； 2皮下プライム； 3腹 腔内プライム
園 3]マイナス鎖 RNAウィルスベクター感染細胞ライセートの腹腔内投与による抗体 産生を示す図である。 GFP遺伝子搭載マイナス鎖 RNAウィルスベクター感染細胞ライ セートの腹腔内投与によるプライミングの 2週間後、同ベクターの腹腔内投与によりブ 一ストし、プライミンダカも 4週間後のマウス血漿中の抗 GFP抗体をウェスタンブロット で検出した。 [各レーンの説明] 1.分子量マーカー; 2.巿販抗 GFP抗体; 3.非免疫 マウス; 4·ライセート腹腔内投与プライム /センダイウィルスベクターブースト； 5.ライセ ート腹腔内投与プライム /PBSブースト（対照）
[図 4]抗体産生におけるマイナス鎖 RNAウィルスベクターの腹腔内投与によるブース トの効果を示す図である。 GFP遺伝子搭載センダイウィルスベクターで点鼻、筋注、 脾臓直接注入、あるいは足躕注にてプライム、あるいはセンダイウィルスベクター感 染細胞ライセートの腹腔内投与にてプライムし、 2週間後センダイウィルスベクター感 染細胞ライセートの腹腔内投与によりブーストし、プライミングから 4週間後のマウス血 漿中の抗 GFP抗体をウェスタンプロットで検出した。対照動物では 2週間後のブース ト操作を DPBS (-)で行なった。 [各レーンの説明] 1分子量マーカー； 2巿販抗 GFP 抗体； 3非免疫マウス； 4ベクター点鼻プライム/ライセートブースト 1 ; 5ベクター点鼻 プライム/ライセートブースト 2 ; 6ベクター筋注プライム /ライセートブースト 1 ; 7ベクタ 一筋注プライム/ライセートブースト 2 ; 8ベクター脾臓注プライム/ライセートブースト 1 ; 9ベクター脾臓注プライム/ライセートブースト 2 ; 10ベクター足躕注プライム/ライセ ートブースト 1 ; 11ベクター足躕注プライム/ライセートブースト 2 ; 12ライセート腹腔内 投与プライム /ライセートブースト 1； 13ライセート腹腔内投与プライム /ライセートブー スト 2 ; 14ベクター点鼻プライム/ PBSブースト（対照）； 15ベクター筋注プライム /PBS ブースト（対照）； 16ベクター脾臓注プライム/ PBSブースト（対照）； 17ベクター足躕注 プライム/ PBSブースト（対照）； 18ライセート腹腔内投与プライム /PBSブースト（対照） [図 5]マイナス鎖 RNAウィルスベクター投与によるモノクローナル抗体の産生を示す図 である。得られたハイプリドーマ上清を用いて GFP遺伝子搭載センダイウィルスベクタ 一感染 LLC- MK細胞可溶蛋白質を固定したウェスタンブロットメンブレン上で GFPを
2
検出した。 [各レーンの説明] 1分子量マーカー； 2 GFP遺伝子搭載センダイウィル スベクター感染 LLC-MK細胞の可溶蛋白質固定 ハイプリドーマ上清でプローブ
2
[図 6]抗 gpl60モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ上清（#6-76)を用いたゥ エスタンブロット解析の結果を示す図である。 HIV-1 gpl60遺伝子搭載マイナス鎖 RN Aウィルスベクターを接種したマウスの脾細胞からハイプリドーマを作製し、抗 gpl60 モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを選択した。このハイプリドーマ上清を 用いて、 SeV18+GP160/ A Fベクター感染 LLC-MK細胞ライセート中の gpl60蛋白質
2
をウェスタンプロットにより検出した (パネル A)。陽性対照として市販の抗 gpl60抗体（ ICN)を用いて同様にウェスタンブロットを行った（パネル B)。 [各レーンの説明] 1 分子量マーカー； 2.非感染 LLC-MK細胞ライセート；3. SeV18+GP160/ A F感染 LL
2
C-MK細胞ライセート；4.非感染 BHK-21細胞ライセート；5. SeV18+GP160/ Δ F感染
2
BHK-21細胞ライセート
[図 7]ハイプリドーマ #6-76が産生する抗 gpl60抗体のサブクラスの決定を示す図で あ 。巿 Ικのゾイソタイピンクキット (Mouse Immunoglobulin Screemng/Isotyping Kit ( Genzyme社)）を用いて、ハイプリドーマ #6-76が産生する抗 gpl60抗体のサブクラス を決定した。使用した subclass特異的抗体を上段に示す。 Gl: IgG , G2a: IgG
1 2a， G2b:
Ig ， ^: IgG， A: IgA. M: IgM， B: buffer blank, N: non-immune serum ^negative c
2b 3
ontrol) [図 8]センダイウィルスベクターによるプライミング後、合成ペプチドを用いてブースト することにより HIV-1 gpl60を認識するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ が作製できることを示す図である。 ELISAによる 1次スクリーニング陽性のハイプリドー マ C1-182の培養上清を用いて、 SeV18+GP160/ A Fベクター感染 BHK-21細胞膜画 分中の gpl60蛋白質をウェスタンプロットにより検出した。膜画分は市販のキット（Calb iochem社カタログ番号 539790)を説明書に従って使用して作製した。 gpl60と gp41 の泳動位置を右側の矢印で示した。 [各レーンの説明] 1.分子量マーカー 2.非感 染 BHK-21細胞膜画分 3. SeV18+GFP/ A F感染 BHK-21細胞膜画分 4. SeV18+GP16 0/ Δ F感染 BHK-21細胞膜画分
園 9]合成ペプチドを用いてブーストすることにより作製した抗 gpl60抗体産生ハイプリ ドーマ C1-182が認識する gpl60タンパク上のェピトープを、ブーストに使用したぺプ チドを培養上清と混合してウェスタンプロットを行なうことにより検出した図である。 C1 -182上清を使用した場合ペプチド #495を混合した場合のみペプチドの濃度依存的 に抗体反応が阻害され、 C1-182抗体が認識するェピトープがペプチド #495の配列 であることが証明された。パネル上の数字 0, 0.1， 1, 10は混合したペプチドの濃度を 示す。単位は β g/ml。 gpl60と gp41の泳動位置を右側の矢印で示した。 [各パネル の説明] A.〜C.ハイプリドーマ C1-182上清使用 D.〜F.ハイブリドーマ #6-76上清使 用 A.および D.ペプチド #493を混合 B.および E.ペプチド #494を混合 C.および F.ぺプ チド #495を混合 [各レーンの説明] 1.分子量マーカー 2.非感染 BHK-21細胞膜画 分 3. SeV18+GFP/ A F感染 BHK-21細胞膜画分 4. SeV18+GP160/ Δ F感染 BHK-21 細胞膜画分。
[図 10]実施例 6で取得した抗 gpl60抗体産生ハイブリドーマ #6-76および実施例 7で 合成ペプチドを用いてブーストすることにより取得した抗 gpl60抗体産生ハイブリドー マ C1-182の細胞クローニングによる純化を示す図である。ハイプリドーマ #6-76を 1回 クローニングした #6-76-14と #6-76-17および C1-182を 1回クローニングした C1-182- 40と C1-182-48を再度希釈播種によりクローニングして得たコロニーの上清の ELISA の結果である。 C1-182-40以外はクローユングに成功した。陽性対照としてクロー二 ング前の #6-76の上清と抗センダイウィルス HNタンパクモノクローナル抗体 IL4.1を用 いた。 [各パネルの説明] A.ハイプリドーマ #6-76由来の 2回目クローニングコロニー の上清使用 B.ハイプリドーマ C1-182由来の 2回目クローニングコロニーの上清使用 園 11]実施例 6で取得したハイプリドーマ #6-76および実施例 7で取得したハイブリド 一マ C1-182の細胞クローニングによる純化を示す図である。ハイプリドーマ #6-76を 1 回クローニングした #6-76-14を再度クローニングした #6-76-14-21と #6-76-14-29、お よびハイプリドーマ C1-182を 1回クローユングした C1-182-48を再度クローユングした C1-182-48-5と Cl-182-48-35を用いて、実施例 7と同様のウェスタンブロットを行な つた。 2回クローニング後のハイブリドーマ力、らもクローニング前同様の抗 gpl60抗体 が産生されていることが示された。 [各パネルの説明] A.ハイプリドーマ #6-76、 1回 目クローニングコロニー #6- 76- 14、 2回目クローニングコロニー #6- 76- 14- 21および #6 -76-14-29の上清使用 B.ハイプリドーマ Cl_182、 1回目クローニングコロニー C1-18 2-48、 2回目クローニングコロニー Cl_182_48_5および Cl-182-48-35の上清使用 [図 12]実施例 6で取得したハイプリドーマ #6-76を 2回クローニングした #6-76-14-29 の培養上清中の抗体タンパクをィムノグロブリン結合タンパク L固定化カラム（Pierce 社 ImmunoPure Immobilized Protein L;カタログ番号 20510)を用いて精製した結果 を示す図である。 2回クローニング後のハイプリドーマからもクローニング前同様の抗 g pl60抗体が産生されていることが示された。 IgG H鎖と L鎖の泳動位置を右側の矢印 で示した。 [各パネルの説明] A. SyproOrange染色 B.抗マウス IgG(H+L)抗体（HRP- conjugate)染色 [各レーンの説明] 1.抗 Ovalbuminマウスモノクローナル抗体 2.精製 #6-76-14-29上清 3.分子量マーカー 4.未精製 #6-76_14_29上清
[図 13]2回クローニング後のハイブリドーマ #6-76-14-29の培養上清から精製した抗 体タンパクを用いて実施例 7と同様のウェスタンブロットを行なった図である。クロー二 ング前の #6-76および #6-76-14-29の未精製培養上清と精製抗体を比較した。精製 抗体が精製前と同じ特異性をもって gpl60, gp41を認識することが示された。 [各レ ーンの説明] 1.分子量マーカー 2.非感染 BHK-21細胞膜画分 3. SeV18+GFP/ A F感 染 BHK-21細胞膜画分 4. SeV18+GP160/ Δ F感染 BHK-21細胞膜画分
園 14]実施例 10で取得した複数の抗 gpl60抗体産生ハイプリドーマの培養上清を用 いたウェスタンブロットの結果を示す図である。 gpl60中の gp41 moietyを認識するハ イブリドーマと、 gpl20 moietyを認識するハイブリドーマの両種のハイプリドーマが得 られた。 gpl60、 gpl20、 gp41の泳動位置を右側の矢印で示した。 [各レーンの説明] 1.分子量マーカー 2.非感染 BHK-21細胞膜画分 3. SeV18+GFP/ A F感染 BHK-21 細胞膜画分 4. SeV18+GP160/ Δ F感染 BHK-21細胞膜画分。
[図 15]マウス IL10遺伝子と gpl60遺伝子を同時搭載したセンダイウィルスベクターによ る免疫で、マウスの血漿中に抗 gpl60抗体が誘導されることを示す図である。マウスは 7頭使用した。血液は Priming後 56日目に眼窩から採取した。陽性対照としてハイプリ ドーマ #6-76培養上清、陰性対照として免疫前のマウス血漿 (#1 pre)を用いた。 gpl6 0の泳動位置を右側の矢印と黒のドットで示した。 [各レーンの説明] 1.分子量マー カー 2.非感染 BHK-21細胞膜画分 3. SeV18+GFP/ A F感染 BHK-21細胞膜画分 4. S eV18+GP160/ Δ F感染 BHK-21細胞膜画分。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、抗体または抗体産生細胞の製造方法であって、抗原としたい外来ポリ ペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖 RNAウィルスベクター、該ウィルス ベクターを生成する核酸（nucleic acids)、該ベクターまたは該ベクターを生成する核 酸が導入された細胞、または該細胞の溶解物を動物に接種する工程、および該動物 から抗体または抗体産生細胞を回収する工程、を含む方法に関する。マイナス鎖 RN Aウィルスとは、マイナス鎖（ウィルス蛋白質をセンスにコードする鎖と相補的なアンチ センス鎖）の RNAをゲノムとして含むウィルスのことである。マイナス鎖 RNAウィルスは ネガティブ鎖 RNAウィルスとも呼ばれる。本発明において用いられるマイナス鎖 RNA ウィルスとしては、特に一本鎖マイナス鎖 RNAウィルス（非分節型（non- segmented) マイナス鎖 RNAウィルスとも言う）が好ましレ、。 「一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルス」とは 、一本鎖ネガティブ鎖 [すなわちマイナス鎖] RNAをゲノムに有するウィルスを言う。こ のようなゥイノレスとしては、ハ0ラミクソゥイノレス (Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbil livirus, Rubulavirus,および Pneumovirus禹等を- sむ 、フブ ウイノレス (Rhabdovindae ； Vesiculovirus, Lyssavirus,および Ephemerovirus属等を含む)、フィロウイノレス (Pilo viridae)などの科に属するウィルスが含まれる。本発明において用いられるマイナス 鎖 RNAウィルスベクターは、伝播能を有していてもよぐ伝播能を有さない欠損型べク ターであってもよい。 「伝播能を有する」とは、ウィルスベクターが宿主細胞に感染し た場合、該細胞においてウィルスが複製され、感染性ウィルス粒子が産生されること を指す。欠損型ベクターとしては、例えばエンベロープを構成する蛋白質をコードす る遺伝子の少なくとも 1つを欠損するベクターが挙げられる。具体的には、ウィルスの 種類によっても異なる力 F、 H、 HN、 G、 M、 Mlなどのエンベロープ構成蛋白質をコ ードする遺伝子の少なくとも 1つを欠損するベクターが例示できる（WO00/70055およ び WO00/70070; Li, H.-O. et al.， J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000))。
本発明において特に好適に用いられるマイナス鎖 RNAウィルスを具体的に挙げれ ば、例えばパラミクソウィルス科 (Paramyxoviridae)ウィルスのセンダイウィルス (Sendai virus),ニューカツスノレ病ウイノレス (Newcastle disease virus),おたふく力、ぜゥイノレス (mu mps virus入麻珍ヮ ノレス uneasles virus) ^ RSソイノレス (respiratory syncytial virus) Λ牛 疫ゥイノレス (rinde卬 est virus),ジステンパーウイノレス (distemper virus),サノレパラインフ ルェンザウィルス（SV5)、ヒトパラインフルエンザウイルス 1，2，3型、オルトミクソウィルス 科 (Orthomyxoviridae)のインフノレエンザゥイノレス (influenza virus),ラブドウイノレス科 (Rh abdoviridae)の水抱十生口内炎ウイノレス (vesicular stomatitis virus),狂犬病ウイノレス (rab ies virus)等が例示できる。本発明においてパラミクソウィルスは、好ましくはパラミクソ ウィルス亜科（Paramyxovirinae) (レスピロウィルス属、ルブラウィルス属、およびモー ビリウィルス属を含む）に属するウィルス、より好ましくはレスピロウィルス属（Respirovir us) (パラミクソウィルス属（Paramyxovirus)とも言う）に属するウィルスまたはその誘導 体である。誘導体には、ウィルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウィルス遺 伝子が改変されたウィルス、および化学修飾されたウィルス等が含まれる。本発明を 適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウィル ス 1型（HPIV-1)、ヒトパラインフルエンザウイルス 3型（HPIV- 3)、ゥシパラインフルェ ンザウィルス 3型（BPIV- 3)、センダイウィルス (Sendai virus;マウスパラインフルエンザ ウィルス 1型とも呼ばれる)、およびサルパラインフルエンザウイルス 10型（SPIV-10)な どが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダイウィルス である。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に 構築された株などに由来してもよい。 [0013] 例えばパラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、一般に次 のように表記される。一般に、 NP遺伝子は" N"とも表記される。また、 HNはノイラミニダ ーゼ活性を有さない場合には H (へマグルチニン）と表記される。
レスピロウイノレス属 NP P/C/V M F HN - L
ルブラウィルス属 NP P/V M F HN (SH) L
モーピリウィルス属 NP P/C/V M F H - L
[0014] マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、ゲノム RNA中に抗原としたい所望の外来ポリぺ プチドをコードすることができる。外来ポリペプチドとしては、天然のマイナス鎖 RNAゥ ィルスが持たないポリペプチドであれば特に制限はなぐ天然の蛋白質全長、その部 分断片（7アミノ酸以上、好ましくは 8、 10、または 15アミノ酸以上）、またはそれらと他 のポリペプチドとの融合ポリペプチド等であってよい。外来ポリペプチドをコードする 組換えウィルスベクターは、マイナス鎖 RNAウィルスベクターのゲノムに該ポリべプチ ドをアンチセンスにコードする遺伝子を挿入することによって得られる。遺伝子の挿入 位置は、例えばウィルスゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することが でき、例えばゲノム RNAの 3'リーダー領域と 3'端に最も近いウィルス蛋白質 ORFとの 間、各ウィルス蛋白質 ORFの間、および/または 5'端に最も近いウィルス蛋白質 ORF と 5'トレイラ一領域の間に挿入することができる。また、 M、 Fまたは HN遺伝子などのェ ンべロープ構成蛋白質遺伝子を欠失するゲノムでは、その欠失領域に挿入してもよ レ、。パラミクソウィルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌ クレオチドの鎖長力 の倍数となるように挿入することが望ましい（Kolakofski, D. et al. ， J. Virol. 1998: 72; 891-899; Calain, P. and Roux,し J. Virol. 1993: 67; 4822—4830 )。揷入した外来遺伝子とウィルス ORFとの間には、 E-I-S配列が構成されるようにす る。 E-I-S配列を介して 2またはそれ以上の外来遺伝子をタンデムに並べて揷入する ことちできる。
[0015] 外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（マイナス鎖 (ネガティブ鎖）の 3' 側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる (WO01/18223)。ま た、ゲノム上の外来遺伝子の揷入位置によって制御することができ、マイナス鎖の 3' の近くに揷入するほど発現レベルが高ぐ 5'の近くに揷入するほど発現レベルが低く なる。一般に、抗原ポリペプチドを高発現させることが有利と考えられるため、外来ポ リペプチドをコードする遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、マイナス鎖ゲ ノムの 3'端近くに挿入することが好ましい。具体的には、 3'リーダー領域と 3'に最も近 レ、ウィルス蛋白質 ORFとの間に挿入される。あるいは、 3'に一番近いウィルス蛋白質 遺伝子と 2番目のウィルス蛋白質遺伝子の ORFの間、または 3'から 2番目と 3番目のゥ ィルス蛋白質遺伝子の間に挿入してもよい。野生型パラミクソウィルスにおいては、ゲ ノムの 3'に最も近レ、ウィルス蛋白質遺伝子は N遺伝子であり、 2番目の遺伝子は P遺 伝子、 3番目の遺伝子は M遺伝子である。逆に、抗原ポリペプチドの高発現が望まし くない場合は、例えば外来遺伝子の揷入位置をマイナス鎖ゲノムのなるべく 5'側に設 定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウィルスベクターからの発 現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
[0016] 外来遺伝子をコードする核酸をゲノムに揷入するときに付加する S配列としては、例 えばマイナス鎖 RNAウィルスの所望の S配列を用いることができる力 センダイウイノレ スであれば、 3'-UCCCWVUUWC-5，（W= Aまたは C; V= A, C,または G) (配列番号 : 1)のコンセンサス配列を好適に用いることができる。特に 3'-UCCCAGUUUC-5' ( 配列番号： 2)、 3'-UCCCACUUAC-5，（配列番号： 3)、および 3'-UCCCACUUUC_5 ' (配列番号: 4)が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードする DNA配列で表す とそれぞれ 5'-AGGGTCAAAG-3，（配列番号： 5)、 5 -AGGGTGAATG-3' (配列番 号： 6)、および 5'-AGGGTGAAAG-3，（配列番号： 7)である。センダイウィルスベクタ 一の E配列としては、例えば 3'-AUUCUUUUU-5' (配列番号： 8) (プラス鎖をコード する DNAでは 5'-TAAGAAAAA-3' (配列番号： 9))が好ましい。 I配列は、例えば任 意の 3塩基であってよぐ具体的には 3'-GAA-5，（プラス鎖 DNAでは 5し CTT-3')を 用いればよい。
[0017] 組み換え RNAウィルスベクターの再構成は公知の方法を利用して行えばよレ、。具 体的には、 （a)哺乳動物細胞において、マイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAを含む RNPを構成するウィルス蛋白質の存在下、所望の外来性抗原ポリペプチドを発現す るマイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAまたはその相補鎖（アンチゲノム RNA。プラス 鎖）をコードする DNAを転写させる工程、 (b)生成したマイナス鎖 RNAウィルスまたは 該ゲノム RNAを含む RNPを回収する工程、により製造すること力 Sできる。上記の RNPを 構成するウィルス蛋白質 (viral proteins)とは、ウィルスゲノム RNAと共に RNPを形成し 、ヌクレオ力プシドを構成する蛋白質を言う。これらはゲノムの複製および遺伝子発現 に必要な蛋白質群であり、典型的には、 N (ヌクレオキヤプシド（またはヌクレオプロテ イン（NP)とも言う)）、 P (ホスホ）、および L (ラージ）蛋白質である。ウィルス種によって は、表記は異なることもある力 対応する蛋白質群は当業者には知られている（Anjea nette Robert et al.， Virology 247:1-6 (1998))。例えば、 Nは NPと表記されることもある
[0018] ウィルス再構成に際しては、上記にように、マイナス鎖 RNAゲノム（すなわちウィルス ゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させても、プラス鎖 RNA (アンチゲノム。ゲノム RN Aの相補鎖）を生成させてもよいが、ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくは プラス鎖を生成させる。ウィルスゲノム RNAとしては、 RNPの再構成に必要なウィルス 蛋白質をコードしていれば、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子は欠失し ていてもよレ、。具体的には、例えば、 N、 P、および L蛋白質をコードしていれば、 F、 H N、 Mなどのウィルス蛋白質はコードしていなくてもよレ、。このような欠損型ウィルスは、 細胞内でゲノム RNAを増幅できる力 感染性ウィルス粒子を放出しないため、安全性 の高い遺伝子導入ベクターとして有用である（WO00/70055、 WO00/70070、および WO03/025570; Li, H.—O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000))。ウィルスベクタ 一を製造する場合は、これらのエンベロープ構成蛋白質を、ウィルス産生細胞内で 別途発現させ、粒子形成を相補する。ウィルス蛋白質や RNAゲノムを細胞内で発現 させるためには、適当なプロモーターの下流に該蛋白質またはゲノムをコードする DN Aが連結されたベクターを、宿主細胞に導入する。プロモーターとしては、例えば CM Vプロモーターや CAGプロモーターなどが用いられる（Niwa, H. et al. (1991) Gene. 1 08: 193-199、特開平 3-168087)。
[0019] RNA末端は、天然のウィルスゲノムと同様に 3'リーダー配列と 5'トレイラ一配列の末 端をなるベく正確に反映させることが好ましい。このためには、例えば転写産物の 5' 端に自己切断型のリボザィムを付加しておき、リボザィムによりマイナス鎖 RNAウイノレ スゲノムの末端を正確に切り出させる（Inoue, K. et al. J. Virol. Methods 107， 2003, 229-236)。あるいは、転写産物の 5'端を正確に制御するために、転写開始部位にバ クテリオファージの RNAポリメラーゼ認識配列を利用し、該 RNAポリメラーゼを細胞内 で発現させて転写を誘導する。バタテリオファージの RNAポリメラーゼとしては、例え ば大腸菌 T3ファージおよび T7ファージ、およびサルモネラ SP6ファージ等が用いられ る（Krieg, P.A. and Melton, D.A. 1987， Methods Enzymol. 155: 397—15; Milligan, J. F. et al , 1987, Nucleic Acids Res. 15: 8783-798; Pokrovskaya, I.D. and Gurevich, V.V., 1994, Anal. Biochem. 220: 420-23)。バタテリオファージの RNAポリメラーゼは、 例えばこれを発現するワクシニアウィルス（Fuerst, T.R. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA 83， 8122-8126 (1986》を用いて供給することができるし、あるいはプラスミドな どの発現ベクターから供給することもできる。転写産物の 3'端を制御するには、例え ば転写産物の 3'端に自己切断型リボザィムをコードさせておき、このリボザィムにより 正確に 3'端が切り出されるようにする（Hasan, Μ· Κ· et al" J. Gen. Virol. 1997: 78; 2 813-2820、 Kato, A. et al., EMBO J. 1997, : 16; 578-587及び Yu， D. et al" Genes Cells. 1997: 2; 457-466)。リボザィムとしては、デルタ肝炎ウィルスのアンチゲノム鎖 (antigenomic strand)由来の自己開裂リボザィムが使用できる。
エンベロープ構成蛋白質の遺伝子を欠失させたウィルスの再構成においては、欠 失させたエンベロープ構成蛋白質でウィルスの感染性を相補してもよいが、例えば、 欠失させた蛋白質とは別のエンベロープ蛋白質でシユードタイプ化することもできる。 このようなエンベロープ蛋白質としては、例えば水疱性口内炎ウィルス（Vesicular sto matitis virus; VSV)の G蛋白質（VSV-G) (J. Virology 39: 519-528 (1981))を用いるこ とができる（Hirata, T. et al., 2002， J. Virol. Methods, 104: 125—133; Inoue, M. et al., 2003, J. Virol. 77:6419-6429; Inoue M. et al., J Gene Med. 2004;6: 1069-1081)。ゲ ノムから欠損させる遺伝子としては、例えば F、 HN、 H、 Gなどのスパイク蛋白質遺伝 子、 Mなどのエンベロープ裏打ち蛋白質遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせ が挙げられる。スパイク蛋白質遺伝子の欠失は、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを 非伝播性にするために有効であり、また、 M蛋白質などのエンベロープの裏打ち蛋白 質遺伝子の欠失は、感染細胞からの粒子形成を不能にするために有効である。例え ば、 F遺伝子欠失型マイナス鎖 RNAウィルスベクター（Li， H.-O. et al., J.Virol. 74, 6 564-6569 (2000))、 M遺伝子欠失型マイナス鎖 RNAウィルスベクター（Inoue, M. et al .， J.Virol. 77， 6419-6429 (2003))などは好適に用いられる。例えば F遺伝子を欠損す るベクターを用いることにより、宿主マウスでの病原性が抑えられ、良好な抗体産生を 実現させることが可能であった（実施例参照）。また、 F、 HNほたは H)、および Mの少 なくとも 2つの遺伝子の任意の組み合わせを欠損するベクターは、より安全性が保障 される。例えば、 Mおよび F遺伝子両欠失型ベクターは、高レベルの感染性および遺 伝子発現能を保ったまま、非伝播性でかつ粒子形成を欠くベクターとなる。
[0021] F遺伝子欠失型の組み換えウィルスの製造を具体的に例示すれば、例えば F遺伝 子が欠損したマイナス鎖 RNAウィルスゲノムまたはその相補鎖を発現するプラスミドを 、 F蛋白質を発現する発現ベクター、ならびに N、 P、および L蛋白質の発現ベクターと 共に宿主細胞にトランスフヱクシヨンする。または、 F遺伝子が染色体に組み込まれた 宿主細胞を用いれば、より効率的にウィルスを製造することができる (WO00/70070) 。この場合は、 F遺伝子を誘導発現できるように、 Cre/loxPや FLP/FRTなどの配列特 異的組み換え酵素とその標的配列を用いて、発現を誘導できるようにしておくことが 好ましい（WO00/70055および WO00/70070 ; Hasan, M. K. et al., 1997， J. General Virology 78: 2813-2820参照）。具体的には、例えば Cre/loxP誘導型発現プラスミド p CALNdlw (Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998， pi 115-1121)等の組み換え酵素標 的配列を持つベクターにエンベロープ蛋白質遺伝子を組み込む。発現の誘導は、 例えばアデノウイルス AxCANCreを moi=3〜5で感染させて行う（Saito et al., Nucl. A cids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T.et al" J. Virol 72, 1115—1121 (1998))。
[0022] 本発明において用いるマイナス鎖 RNAウィルスは、アクセサリー遺伝子が欠損した ものであってよレ、。例えばセンダイウィルス（SeV)のアクセサリー遺伝子の 1つである V遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現および複製は障 害されることなぐマウス等の宿主に対する SeVの病原性が顕著に減弱する（Kato， A. et al., 1997， J. Virol. 71:7266-7272; Kato, A. et al., 1997， EMBO J. 16:578-587; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179)。
[0023] またマイナス鎖 RNAウィルスは、感染の持続性を高めるために、 P遺伝子または L遺 伝子に変異を有するものを使用してもよい。このような変異としては、具体的には、 Se V P蛋白質の 86番目の Glu (E86)の変異、 SeV P蛋白質の 511番目の Leu (L511)の他 のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖 RNAウィルス P蛋白質の相同部位の置換 が挙げられる。具体的には、 86番目のアミノ酸の Lysへの置換、 511番目のアミノ酸の Pheへの置換などが例示できる。また L蛋白質においては、 SeV L蛋白質の 1197番目 の Asn (Nl 197)および/または 1795番目の Lys (K1795)の他のアミノ酸への置換、また は他のマイナス鎖 RNAウィルス L蛋白質の相同部位の置換が挙げられ、具体的には 、 1197番目のアミノ酸の Serへの置換、 1795番目のアミノ酸の Gluへの置換などが例示 できる。 P遺伝子および L遺伝子の変異は、持続感染性、 2次粒子放出の抑制、また は細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。
マイナス鎖 RNAウィルスは、抗原に加え、 Th2サイト力インおよび/または抗炎症サイ トカインをさらにコードすることができる（実施例 1 1)。本発明において Th2サイト力イン とは、 1型のヘルパー T細胞（Thl cells)よりも 2型のヘルパー T細胞（Th2 cells)にお いて優位に産生されるサイト力インを言レ、、具体的には IL_4、 IL_5、 IL_6、 IL_9、 IL_1 0、 IL-13および TGF- が含まれる。また、抗炎症サイト力イン (抗炎症性サイト力イン とも言う）とは、炎症を抑制する方向に作用するポリペプチドを総称し、炎症を抑制す るシグナル伝達を促進するシグナル伝達分子および/または炎症を促進するシグナ ル伝達を阻害するシグナル伝達分子 (例えば炎症性サイト力インインヒビター）が含ま れる。本発明において抗炎症サイト力インには、具体的には、 interleukin (IL)_4、 IL-1 0、 IL_11、 IL_13、 TGF- β、 soluble TNF- receptor,および IL-l receptor antagoni st (IL-lra)が含まれる。ベクターにコードされる Th2サイト力インおよび/または抗炎症 サイト力インは、天然のポリペプチドの全長でもよぐ活性が維持される限りその部分 ペプチド (活性断片など)でもよい。例えば、 N末端および/または C末端のアミノ酸残 基の欠失（例えば 1〜30アミノ酸、より特定すれば、 1、 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、または 2 5アミノ酸）はサイト力インの活性に影響を与えない可能性が高い。また、炎症性サイト 力イン受容体の可溶型断片（リガンド結合ドメインを含む）や、炎症性サイト力イン受容 体のリガンド結合ドメインに結合する抗体または抗体断片などであって、炎症性サイト 力インのシグナル伝達を阻害するポリペプチドでもよい。また Th2サイト力インおよび/ または抗炎症サイト力インは、シグナル配列が除去された成熟ポリペプチドを含む所 望の断片を利用することができ、細胞外に分泌させるための N末端のシグナル配列 は、適宜所望の蛋白質のシグナル配列を利用することができる。分泌シグナル配列と しては、例えば interleukin (IL)_2や tissue plasminogen activator (tPA)などの所望の 分泌蛋白質のシグナル配列を用いることができるが、これらに限定されない。また、他 のペプチドとの融合蛋白質として発現させてもよい。
[0025] 本発明において Th2サイト力インは、より好ましくは IL_4、 IL_10、 IL_13、および TGF -beta力、らなる群より選択されるサイト力インであり、最も好ましくは IL-10である。各サ イト力イン遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は知られている（IL_4 : NM_000589， NP_000580, AAH66277, AAH67515, NP_758858， NP.067258, NP.958427； IL-10 : N M_000572, NP_000563， CAG46825, NP.034678, NP.036986； IL-13 : NM_002188, NP .002179, AAB01681, NP_032381, NP.446280； TGF-beta (transforming growth factor -beta) : M_60316) o
[0026] 各 Th2サイト力インまたは抗炎症サイト力インの活性は、公知の方法により検出する こと力 Sできる。例えば、マウス mast cell MC/9 (ATCC CRL-8306)、ヒト赤白血病（eryt hroleukemia)細胞株 TF-1 (ATCC CRL-2003)などを用いた増殖アツセィにより活性 を検出する方法が知られている（Thompson-Snipes,し et al.， 1991， J. Exp. Med. 17 3:507— 510 ; Kruse N et al., EMBO J. 1993;12:5121-5129; Oshima Y et al., J Biol Ch em 2001;276:15185-91; Oshima, Y., et al., J. Biol. Chem. 275， 14375-14380， 2000; Leland, P. et al., Oncol. Res. 7， 227-235， 1995)。例えば、遺伝子組み換え技術を 用いて作製した各種 Th2サイト力インまたは抗炎症サイト力インの欠失変異体をこの 方法によりアツセィして、活性断片を同定することができる。 50% effective dose (ED ) を算出し、これを基に算出した活性 (例えば ED の逆数）が野生型と比べ 50%以上、 好ましくは 60%以上、 70%以上、 80%以上、 90%以上、または 95%以上の部分ぺプ チドを用いるとよい。
[0027] ベクターにコードされる Th2サイト力インおよび/または抗炎症サイト力インの由来に 特に制限はなぐマウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ロノく、ャギ、ィヌ 、チンパンジー、サル、ヒト等の哺乳類のいずれをも用いることができる力 投与対象 と同種由来のものを用いるのが適当である。これらのサイト力インをコードする核酸の 塩基配列は、上記のようにデータベースから入手可能である力 さらに例を挙げれば 、マウス IL-10であれば、 Genbank Accession No. AY410237、 NM_010548、ヒ HL-10 であれば、 Genbank Accession No.AY029171、 NM.000572が挙げられる。
[0028] また本発明のマイナス鎖 RNAウィルスは、所望の疾患に関与する蛋白質またはそ の部分ペプチド（例えば 9、 8、 7、 6、または 5アミノ酸以上の部分ペプチド）を含むポリ ペプチドをコードしないことができる。そのような疾患には、例えば神経変性疾患が挙 げられ、神経変性疾患に関与する蛋白質としては、例えば amyloid βが挙げられる。
[0029] より具体的な組み換えウィルスの再構成は、例えば以下の文献を参照することがで きる（W097/16539; W097/16538; WOOO/70055; WOOO/70070; WOOl/18223; WO 03/025570 ; WO2005/071092; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388 - 8392; Schnell. M. J • et al" 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995， EMBO J. 14: 577 3-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D . et al" 1995， EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-5 79; Baron, M. D. and Barrett, Τ·， 1997， J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and El liott, R. M.， 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Hasan, M. K. et al .， J. Gen. Virol. 78: 2813—2820， 1997; Kato, A. et al., 1997， EMBO J. 16: 578-587; Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、 Li, H.-O. et al" J. Virol. 2000: 74; 6564-6569)。これらの方法により、パ ラインフルエンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダ一 成させることができる。
[0030] ウィルス産生には所望の哺乳動物細胞などを用いることができるが、具体的には、 例えば、サル腎由来の LLC-MK細胞（ATCC CCL-7)および CV-1細胞（例えば AT
CC CCL-70)、ハムスター腎由来の BHK細胞（例えば ATCC CCL-10)などの培養細 胞、ヒト由来細胞等が挙げられる。また、大量にウィルスベクターを得るために、上記 の宿主から得られたウィルスベクターを発育鶏卵に感染させ、ベクターを増幅するこ とができる。鶏卵を使ったウィルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら 編， (1993),「神経科学研究の先端技術プロトコール m，分子神経細胞生理学」，厚生 社，大阪， pp.153-172)。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ 9〜12日間 37 〜38°Cで培養し、胚を成長させる。ウィルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例 えば 3日間）卵を培養してウィルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使 用する組み換えセンダイウィルスにより変わり得る。その後、ウィルスを含んだ尿液を 回収する。尿液からのセンダイウィルスベクターの分離 ·精製は常法に従って行うこと ができる（田代眞人,「ウィルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビユー社 ， pp.68-73, (1995))
[0031] 回収したウィルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方 法はフィルトレーシヨン (濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の 精製 ·分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「実質的に純 粋」とは、ウィルスベクターを含む溶液中で該ウィルスの成分が主要な割合を占める ことを言う。例えば実質的に純粋なウィルスベクター組成物は、溶液中に含まれる全 蛋白質 (但しキャリアーや安定剤としてカ卩えた蛋白質は除く）のうち、ウィルスベクター の成分として含まれる蛋白質の割合が 10% (重量/重量）以上、好ましくは 20%以上、よ り好ましくは 50%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましく は 90%以上を占めることにより確認することができる。例えばパラミクソウィルスベクタ 一であれば、具体的な精製方法としては、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサ ッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭 62-30752号公報、特公昭 62-33879号 公報、および特公昭 62-30753号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および/または その分解物に吸着させる方法 (WO97/32010)等を例示することができる力 これらに 制限されない。
[0032] マイナス鎖 RNAウィルスベクター、該ウィルスベクターを生成する核酸、該ベクター または該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、またはそのライセートは、薬理 学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わされて抗体製造用組成物となる 。抗体製造用組成物とは、もっぱら抗体の製造の用途のみに用いる組成物である。「 薬学的に許容される担体または媒体」とは、ウィルスベクターまたは細胞を懸濁でき る所望の溶液が挙げられ、例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS)、塩化ナトリウム溶液 、リンゲル溶液、培養液等が例示できる。本発明は、抗原としたい外来ポリペプチドを コードする核酸を搭載するマイナス鎖 RNAウィルスベクター、該ウィルスベクターを生 成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、または 該細胞のライセートと、薬学的に許容される担体または媒体とを含む組成物を製造 する工程を含む、抗体製造用抗原ベクター組成物の製造方法に関する。また本発明 は、抗体製造用組成物の製造における、マイナス鎖 RNAウィルスベクター、該ウィル スベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入され た細胞、またはそのライセートの使用にも関する。抗原としたい外来ポリペプチドをコ ードする核酸を搭載する組み換えマイナス鎖 RNAウィルスベクターの製造について は、本明細書の上記の記載を参照すればよい。抗体製造用組成物には、免疫原性 を高めるために、サイト力イン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫活性化剤を添 カロすること力 Sできる。またミヨゥバン、完全 Freund'sアジュバント、不完全 Freund'sアジ ュバント、 MF59 (オイルェマルジヨン)、 MTP-PE (マイコバクテリア細胞壁由来の mura myl tripeptide)^または QS— 21 soapbark tree Quilaia saponana由来)、 Alum (水酸 化アルミニウム、硫酸アルミニウム、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物粒子 )などのアジュバントを組み合わせることもできる。
また、上記組成物は、 Th2サイト力インまたは Th2サイト力インをコードする核酸をさら に含むことも好ましい。あるいは、それ以外の抗炎症サイト力インまたは抗炎症サイト 力インをコードする核酸を単独で、または上記 Th2サイト力インまたは Th2サイト力イン をコードする核酸と組み合わせて含んでもょレ、。 Th2サイトカインゃ抗炎症サイトカイ ンは、本明細書に記載したもの、およびそれらの組み合わせを用いることができる。 好ましくは、 Th2サイト力インは、 IL-4、 IL-10、および IL-13力もなる群力も選択される 。また、上記組成物は、 Th2アジュバントを含むことができる。例えば、 Th2アジュバン トを含む組成物を用いることにより、 Thl/Th2バランスの Th2へのシフトをより促進する ことができる。 Th2アジュバントとは、 1型のヘルパー T細胞（Thl cells)よりも 2型のへ ルパー T細胞（Th2 cells)を優位に活性化するアジュバントを言い、具体的には、 alum mum hydroxide alum)、 cholera toxin (B sub画 t)、 Schistosoma mansom egg抽出蛋 白質（例えば Lacto- N-fticopentaose ΠΙ)などを用いることができる（Grun， J.し and P . H. Maurer, 1989， Cellular Immunology 121 : 134-145; Holmgren J et al" 1993， Vac cine 11 : 1179-1184; Wilson AD et al" 1993， Vaccine 11 : 113-118; Lindsay DS et al, 1994, Int Arch Allergy Immunol 105:281-288; Xu-Amano J et al. , 1993， J Exp Med 178: 1309-1320; Okano M et al" 2001 , J Immunol. 167(1):442_50)。
[0034] また、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的に はコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコール ポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などを担体として組み合わせるこ とあできる。
[0035] 製造されたマイナス鎖 RNAウィルスまたはそれを含む組成物を動物に投与すること により、抗原ポリペプチドを発現させ、抗体産生を誘導する。ベクターの投与は、 in vi vo投与でも、細胞を介した ex vivo投与でもよレ、。また、接種するマイナス鎖 RNAウイ ノレスべクタ一は、搭載する抗原ポリペプチド遺伝子をゲノム RNA力 発現する能力を 有する限り、感染性ウィルス粒子でなくても、非感染性ウィルス粒子やウィルスのコア (ゲノムおよびゲノム結合ウィルス蛋白質を含む RNP複合体）などであってもよい。本 発明においてマイナス鎖 RNAウィルスベクターとは、マイナス鎖 RNAウィルス由来の ゲノム RNAおよび該 RNAの複製および搭載遺伝子の発現に必要なウィルス蛋白質を 有するリボヌクレオプロテイン (RNP)複合体を含み、感染した細胞において該ゲノム R NAを複製し、搭載遺伝子を発現する複合体を言う。該 RNPは、例えばマイナス鎖 RN Aウィルスのゲノム RNAまたはその相補鎖 (アンチゲノム RNA)と、 N、 L、 P蛋白質とを含 む複合体である。すなわち、本発明においてマイナス鎖 RNAウィルスベクターには、 ウィルスの感染粒子、非感染性粒子（ウィルス様粒子; VLPとも言う）、およびマイナス 鎖 RNAウィルスのヌクレオ力プシドなどの、ゲノム RNAおよびゲノム RNAに結合するゥ ィルス蛋白質を含む RNPなどが含まれる。ウィルス粒子からエンベロープを除去した RNP (ウィルスコア）であっても、細胞に導入されれば、細胞内においてウィルスゲノム RNAを複製することができる（W097/16538; W〇00/70055)。 RNPまたは VLPは、例え ばトランスフエクシヨン試薬などと共に動物に接種するとよレ、（WO00/70055; WO00/7 0070)。
[0036] 細胞を介して接種する場合は、適当な培養細胞または接種対象動物から採取した 細胞などにマイナス鎖 RNAウィルスベクターを導入する。マイナス鎖 RNAウィルスを 体外 (例えば試験管またはシャーレ内）で細胞に感染させる場合は、例えば培養液ま たは生理食塩水など所望の生理的水溶液中で in vitro (または ex vivo)で行う。この 時、 M〇I (多重感染度；細胞 1つあたりの感染ウィルス数）は 1〜1000の間にすることが 好ましぐより好ましくは 2〜500、さらに好ましくは 3〜300、さらに好ましくは 5〜100で ある。マイナス鎖 RNAウィルスと細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば 1分 以上、好ましくは 3分以上、 5分以上、 10分以上、または 20分以上接触させればよぐ 例えば 1〜60分程度、より特定すれば 5分〜 30分程度であってよい。もちろん、それ 以上の時間接触させてもよぐ例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。
ウィルスゲノム RNAを含む RNPや非感染性ウィルス粒子（ウィルス様粒子（VLP))を 細胞に導入するには、周知のトランスフヱクシヨン方法を利用することができる。具体 的には、リン酸カルシウム (Chen, C. & Okayama, H. (1988) BioTechniques 6:632-63 8; Chen, C. and Okayama, Η·， 1987， Mol. Cell. Biol. 7: 2745)、 DEAE-デキストラン ( Rosenthal, N. (1987) Methods Enzymol. 152:704-709)、種々のリボソームベースのト ランスフエクシヨン試薬 (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY》、エレクト口ポレー シヨン (Ausubel, F. et al. (1994) In Current Protocols in Molecular Biology (John Wil ey and Sons, NY), Vol. 1, Ch. 5および 9)など、当業者に知られる様々な技術で糸田 胞にトランスフエタトすることが可能である。エンドソームでの分解を抑制するため、ト ランスフエクシヨンにおいてクロ口キンを加えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。トランスフエクシヨン試薬を幾つか例示すれば、 DO TMA (Roche)、 Superfect Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305)、 DOTAP 、 DOPE, DOSPER (Roche #1811169)、 TransIT—LTl (Mirus, Product No. MIR 2300) 、 CalPhos Mammalian Transfection Kit (Clontech #K2051_1)、 CLONfectin (Clon tech #8020-1)などが挙げられる。エンベロープウィルスはウィルス粒子形成の際に 宿主細胞由来の蛋白質を取り込むことが知られており、このような蛋白質は、細胞に 導入した際に抗原性や細胞傷害性の原因となることが考えられる (J. Biol. Chem. (19 97) 272, 16578-16584)。従って、エンベロープが除去された RNPを用いることには利 [0038] また、ウィルスゲノム RNAを発現する発現ベクター、および該ゲノム RNAの複製に必 要なウィルス蛋白質 (N、 Pおよび L蛋白質）をコードする発現ベクターを細胞に導入し て、細胞内でウィルス RNPを直接形成させることもできる。ウィルスベクターが導入さ れた細胞をこのようにして作製してもよい。
[0039] マイナス鎖 RNAウィルスベクターが導入された細胞を調製したら、これを 12時間〜 5
日間（好ましくは 1〜3日間）程度培養し、抗原ポリペプチドを発現させる。得られた細 胞は、そのまま、あるいは溶解してライセート (溶解物）として動物に接種する。ベクタ 一感染細胞のライセートは界面活性剤で細胞膜を溶解する方法、凍結 ·融解をくり返 す方法などで作製することができる。界面活性剤としては非イオン性の Triton X-100 、 Nonidet P-40など力 .1〜1%の濃度で用いられる。例えば PBSで洗浄したあと遠心 によって回収した細胞塊を TNE buffer [25mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM NaCl, ImM EDTA, 1% Nonidet P_40]に再懸濁し氷上で 10から 30分間放置することで得られる 。抗原として使用するタンパクが細胞質に可溶性である場合は得られたライセートを 遠心（10,000 X g, 10分）して不要な不溶性画分を沈澱として除去した後の上清を免 疫に用いることができる。界面活性剤を用いることが望ましくない投与部位に使用す るライセートは洗浄後 PBSに再懸濁した細胞を 5-6回にわたってくり返し凍結 '融解し て破壊することで得られる。本発明の抗体または抗体産生細胞の製造方法は、動物 への接種の前に、抗原としたレ、外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナ ス鎖 RNAウィルスベクター、該ウィルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは 該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、または該細胞の溶解物を調製するェ 程、およびその任意の組み合わせをさらに含んでもよい。
[0040] また、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖 RNAゥ ィルスベクターを生成する核酸を、動物に投与することにより、動物内で目的の抗原 ポリペプチドを発現するマイナス鎖 RNAウィルスベクターを生成させ、抗体産生を誘 導してもよレ、。該マイナス鎖 RNAウィルスベクターを生成する核酸とは、該マイナス鎖 RNAウィルスベクターの組み換え体の生成に必要な RNAおよび蛋白質群を発現する 核酸のセットである。具体的には、所望の外来ポリペプチドをコードするマイナス鎖 R NAウィルスのゲノム RNAまたはその相補鎖（アンチゲノム RNA。プラス鎖）をコードす る核酸、およびマイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAを含む RNPを構成するウィルス 蛋白質群をコードする核酸を含む核酸のセットを言う。これらの核酸は、コードする R NAや蛋白質を発現できるように適当なプロモーターを含む。具体例を挙げれば、例 えば、 CMVプロモーター（Foecking, M.K, and Hofstetter H. Gene 1986; 45: 101-10 5)、レトロウイルス LTR (Shinnik, T. M.， Lerner, R. A. & Sutcliffe (1981) Nature, 293, 543-548)、 EF1プロモーター、 CAGプロモーター（Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199、特開平 3-168087)などが用いられる。核酸としては、プラスミドベクターを好 適に用いることができる。該マイナス鎖 RNAウィルスのゲノムは、ゲノム RNAを含む RN Pを構成するウィルス蛋白質群 (典型的には N、 L、および P)をコードする遺伝子を搭 載し、かつ親株の野生型ウィルスが持つ全てのエンベロープ構成蛋白質遺伝子を搭 載するものが好ましレ、。該マイナス鎖 RNAウィルスのゲノム力 S、エンベロープ構成蛋 白質の遺伝子を欠損する場合においては、感染性ウィルス粒子の形成を相補するェ ンべロープ蛋白質（例えば該ゲノムで欠損するエンベロープ蛋白質あるいは VSV-G などの他のエンベロープ蛋白質）をコードする核酸を、上記の核酸のセットに含めて もよレ、。これらの核酸を動物に投与することにより、動物内で組み換えマイナス鎖 RN Aウィルスが生成する。マイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAを含む RNPを構成するゥ ィルス蛋白質群とは、ウィルスゲノム RNAと共に RNPを形成し、ヌクレオ力プシドを構 成する蛋白質を言う。これらはゲノムの複製および遺伝子発現に必要な蛋白質群で あり、典型的には、 N、 P、および L蛋白質である。すなわち本発明は、 （a) (i)外来ポリ ペプチドをコードするマイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAまたはその相補鎖をコード する核酸、および（ii)それぞれ N、 P、および L蛋白質をコードする核酸、を動物に接 種する工程、および (b)該動物から、抗体または抗体産生細胞を回収する工程を含 む方法にも関する。
( a )に関しては、動物に直接接種せず、あらかじめ該ウィルスベクターを生成する 核酸が導入された細胞を調製後、その細胞、該細胞の溶解物、または該細胞の溶解 物から生成された抗原を接種してもよレ、。マイナス鎖 RNAウィルスベクターを生成す る核酸の詳細については、以下の文献を参照することができる（W097/16539; W09 7/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570; Durbin, A. P . et al" 1997， Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Rade cke, F. et al, 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Aca d. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al. , 1995， EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1 : 569—579; Baron, M. D. and Barrett, Τ· , 1997, J. Vir ol. 71 : 1265-1271 ; Bridgen, A. and Elliott, R. M.， 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al., 1997， EMBO J. 16: 578-587; Yu, D. et al. , 1997, Genes Cells 2: 457-466; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33—38、 Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74 ； 6564-6569)。
接種ノレートに特に制限はないが、例えば筋注 (例えば腓腹筋）、皮下投与、点鼻投 与、手掌または足躕皮内投与、脾臓直接投与、腹腔内投与などが好適である。点鼻 投与とは、感染部位が鼻腔内に留まる場合 (鼻腔内投与)から、気道'肺まで至る場 合 (経鼻肺投与)などを含む。
また、経口投与、経肛門（直腸)投与、経子宮 (泌尿器または生殖器官)投与であつ てもよく、標的器官としては、口腔、腸管、泌尿生殖器または上気道粘膜等を含む。 経口投与の場合は、酸性度の強い胃液に晒されても運搬能力を保持するために、徐 放性マイクロカプセルィ匕ベクター等に加工することによって、標的器官への感染が可 能となる。
接種部位は、一箇所または複数箇所 (例えば 2〜15箇所）であってよぐまた、接種 量は、接種対象動物、接種部位、接種回数などに応じて適宜調整してよい。例えば 、一箇所当たりの接種量は、ウィルス力価に換算して、 1 X 104 CIU〜 5 X 1011 CIU (c ell infectious unit),好ましくは 1 X 106 CIU〜 1 X 101。 CIUとするとよレ、。細胞を介し て接種 (ex vivo投与）する場合は、例えば同種の培養細胞株 (例えばサルコ一マ細 胞株）にマイナス鎖 RNAウィルスベクターを感染させ、 104〜109細胞、好ましくは 105〜 108細胞、またはそのライセートを動物に接種することができる。初回免疫だけでも有 意な抗体価を誘導できるが、 2回以上の接種によりブーストを行えば、抗体価をより上 昇させることができる。
[0042] 抗原をコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターとして、 Th2サイト力インおよび/ま たは抗炎症サイト力インをさらにコードするものを好適に用いることができる。あるいは 、抗原をコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターで免疫する際、および/またはそ の前後（例えば抗原をコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターの投与の前後 1-72 時間以内、好ましくは 1-48時間以内、好ましくは 1-24時間以内）に、 Th2サイト力イン および/または抗炎症サイト力インあるいはそれらをコードするベクターを投与してもよ レ、。投与部位は特に制限はなレ、が、抗原をコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクタ 一と同じ箇所またはその周辺（1 mm力、ら 3 cm以内、好ましくは 3 mm力、ら 10 mm以内） に投与するとよい。
[0043] マイナス鎖 RNAウィルスベクターを生成する核酸を動物に接種する場合は、外来ポ リペプチドをコードするマイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAまたはその相補鎖をコー ドする核酸、ならびに N、 P、および L蛋白質をコードする核酸を、それぞれ 5 : 0.5 : 0.5 : 2の重量比で動物に投与するとよいが、各核酸の量比は適宜調整してよい。例えば 発現プラスミドを用いる場合は、ウィルスゲノム RNA (プラス鎖またはマイナス鎖）をコ ードするプラスミドを 5 μ g〜1000 μ g、 N、 P、および L発現プラスミドを、それぞれ 0·5 /i g〜200 i g、 0.5 ^〜200 /1 §、 2 /1 §〜500 ^投与するとょレ、。核酸の投与は、例え ば naked DNAの注入またはトランスフエクシヨン試薬と混合して注入することなどにより 行う。トランスフエクシヨン試薬としては、例えばリボフヱクトァミンまたはポリカチォニッ クリボソームなどが挙げられ、具体的には、 DOTMA (Roche) , Superfect (QIAGEN #3 01305)、 DOTAP、 DOPE, DOSPER (Roche #1811169)、 TransIT—LTl (Minis, Produ ct No. MIR 2300)などが利用できる。
[0044] ブーストは、初回免疫から 1〜数週間（例えば:!〜 3週間、より具体的には約 2週間 後）に上記と同様に接種を行う。例えば、腹腔内投与および/または背部、足躕など への皮内注射によるブーストが好適である。抗体価をさらに上げたい場合は、さらに ブーストを繰り返してよレ、。ブーストでは、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする 核酸を搭載する上記のマイナス鎖 RNAウィルスベクター、該ウィルスベクターを生成 する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、該細胞 の溶解物、または該細胞の溶解物から精製された抗原を動物に接種するのが好まし レ、。ブースト免疫用の細胞溶解物は、上記の記載に従って調製することができる。精 製抗原の精製度は特に限定されず、様々な程度に精製されたものであってよい。例 えば、遠心、濾過、透析、各種のクロマトグラフィーなどで溶解物から精製された抗原 を用いることができる。また、抗原としたい外来ポリペプチドまたはその部分ペプチド を接種するのも好適である。例えば部分ペプチドを合成し、適宜 KLH (keyhole limpe t hemocyanin),ゥシ血清アルブミン（BSA)、チログロブリン（THY)、またはオボアルブ ミン（OVA)などのキャリア蛋白質にコンジュゲートして免疫することができる。部分べ プチドの長さは、例えば 8から 25残基（9〜20、 10〜18、または 12〜16残基）とするとよ レ、。ブーストに際しても、 Th2サイト力インおよび/または抗炎症サイト力イン、あるいは それらをコードするベクターを投与してょレ、。
[0045] 十分な抗体価が得られたら、採血により抗体を回収する（ポリクローナル抗体の場 合)。モノクローナル抗体を調製する場合は、免疫した動物の脾臓またはリンパ節な どから細胞を回収し、ミエローマと細胞融合させてハイプリドーマを作製するなどの操 作で不死化した後、 目的の抗体を産生する細胞を選択、クローニングする（Harlow, E.， 1988, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold bprmg Harbor, New York; John E. Coligan et al. (Eds), Current Protocols in Immunology (Chapter 2); Peter J. Delves (Ed), Antibody Production: Essential Techniques, 1997, John Wiley & Sons; R. Kont ermann & S. Dub el (Ed), Antibody Engineering, 2001 , Springer Verlag, Heidelberg; Caponi, L. & Migliorini, P. (Eds), Antibody Usage In The Lab, Springer Lab Manual, 1999， Springer- Verlag Berlin and Heidelberg GmbH & Co. ; William C. Davis (Ed.), Monoclonal Antibody Protocols. , Methods in Molecular Biology, Vol 45, 1995， Hum ana Press Inc. , Totowa, N.J.)。接種対象となる動物としては、魚類、両生類、爬虫類 、鳥類、哺乳類などの抗体を持つ所望の非ヒト脊椎動物が含まれるが、好ましぐ 類 および非ヒト哺乳類であり、より好ましくは非ヒト哺乳動物である。具体的には、ニヮトリ 、ゥサギ、ャギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、マウスおよびラットなどのげつ歯類、サル等の非ヒ ト霊長類およびその他の哺乳動物が挙げられる。
[0046] 抗体価は、 ELISA法 (Enzyme-linked immunosorbent assay)やオクタローニ法 (〇uc hterlony法）により測定することができる。 ELISA法を例示すれば、マイクロプレートに 抗原を吸着させた後、作製した抗血清を、 1000倍から 2倍段階希釈をおこなって、プ レートに加え抗原抗体反応を行なわせる。更に二次抗体として、免疫動物の抗体に 対するパーォキシダーゼ酵素標識した異種動物の抗体を反応させた後、発色させる 。最大発色吸光度の 1/2の発色吸光度を示すときの希釈倍率を抗体の抗体価として 抗体価が算出できる。また、オクタローニ法（Ouchteriony法）においては、寒天ゲル 内に抗原および抗体が拡散して、免疫沈降反応を呈し白い沈降線が生じるのを利用 し、免疫沈降反応を呈した時の抗体の希釈倍率を抗体価として測定できる。
[0047] 抗体は、血清やその希釈溶液の状態で調製してもよレ、し、精製してもよレ、。例えば 、 IgGや IgM抗体などの所望のクラスを精製することができる。例えば、一般にァフィ二 ティーが高いことから最もよく利用される IgG抗体を精製する場合は、 Protein Aまたは Protein Gを担体に固定化したカラムやビーズなどを利用することができる。 IgM抗体 であれば、 2-メルカプトピリジンをリガンドとしたカラムにより精製することができる。 2- メルカプトピリジンカラムは、 IgY (ニヮトリ卵黄抗体）の精製にも用いられる（HiTrap Ig Y Purification HP, Amersham Biosciences Κ·Κ.)。あるいは抗体を、 DEAE陰イオン交 換クロマトグラフィー法により精製することもできる。例えば、ャギ、ヒッジなどから大量 に精製する場合に、まず、硫酸塩で塩析し粗 IgG画分とし、 DEAE-セルロースカラム に通すと、 IgG画分はカラムに吸着されることなぐ素通り画分に回収される。また、抗 血清から抗体を特異的精製する方法として、ァフィ二ティー精製法を用いることもでき る。抗原を担体ゲルに固相化し、ァフィ二ティーゲルを作製し、このゲルに抗血清を 通し、抗原に結合した IgGを回収することで、抗原に結合する抗体を特異的に回収す ること力 Sできる。回収された抗体は、 HPLC (例えば東ソー製 TSK G3000 SWXLカラム )等により純度を分析することができる（Howard, C.C. and Bathell, D.R. eds. , Basic Methods in Antibody Production and Characterization, 2001, CRC Press BocaRaton ， London, New Yorkj 0
[0048] 本発明の方法により作製した抗体または抗体を産生するハイプリドーマを選択また は精製する時に、 目的の抗原ポリペプチドに結合しない抗体をネガティブ選択により 除去することができる。例えば、作製した抗体の中から、マイナス鎖 RNAウィルス由来 のウィルス蛋白質に結合する抗体を除去することができる。このためには、例えば目 的とする抗原ポリペプチドをコードしなレ、マイナス鎖 RNAウィルスベクター、該ウィル スベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウィルスの 1つまたは複数 のウィルス蛋白質を調製し、これに結合する抗体を除去すればよい。具体的には、抗 体を含む溶液を、 目的とする抗原ポリペプチドをコードしない該マイナス鎖 RNAウイ ノレスベタター、該ウィルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ゥ ィルスのウィルス蛋白質が固定化された担体ゲルと混合し、これらと結合する抗体を 除去する。この操作により、マイナス鎖 RNAウィルスベクターに結合する抗体が除去 されることから、残った溶液を回収することにより、 目的の抗原ポリペプチドに結合す る抗体の純度を上げることができる。同様の操作はハイプリドーマなどに対しても適用 することが可能である。例えば、ハイプリドーマが産生する抗体を含む溶液を、 目的 の抗原ポリペプチドをコードしなレ、マイナス鎖 RNAウィルスベクター、該ウィルスべク ターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウィルスのウィルス蛋白質と混合 し、結合を検出する。これらと結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択するこ とにより、ウィルスベクター自体に結合する抗体を産生するハイブリドーマを除外する こと力 Sできる。
得られた抗体は、溶液または凍結乾燥品などの形態で保存することができる。溶液 とする場合は、防腐剤としてアジ化ナトリウムを添加してもよい。また、安定化剤として ゥシ血清アルブミン（BSA)を含んでもよレ、。一例を挙げれば、 2 mg/mLのゥシ血清ァ ルブミンと 0.1%のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水に抗体を希釈することが できる。抗体の用途としては、例えばフローサイトメトリーによる表面抗原の解析、フロ 一サイトメトリーによる細胞内抗原の解析、免疫組織染色、ィムノブロッテイング（ゥヱ スタンプロット）、免疫沈降、 ELISA、 ELISP〇T、マウスや他の哺乳動物における in viv oアツセィ、バイオアツセィ、ブロッキング、中和アツセィ、抗体治療等が挙げられるが 、これらに制限されなレ、。バイオアツセィゃ in vivo用途には、アジ化ナトリウムなどの 防腐剤を含まない抗体が好ましい。蛋白質の検出に用いる場合、抗体は、適宜標識 すること力 Sできる。例えば、酵素標識、蛍光標識、放射性標識、ピオチン標識、金コロ イド標識などの様々な標識方法が知られている（P. Cuatrecasas, et al, Biochemistry ， 11, 2291 (1972); S. Yoshitake, et al., Eur. J. Biochem., 101, 395(1979); M. J. O'S ullivan, et al., Anal. Biochem., 100, 100(1979); S. Yoshitake, et al" Anal. Lett., 15， 147(1982); J. V. Staros, Biochemistry, 21, 3950(1982); E. Ishikawa, et al., J. Immun oassay, 4, 209(1983); S. Yoshitake, et al" Scand. J. Immunol.，10, 81(1979); K. Fuji wara, et al., J. Immunol. Methods, 112， 77(1988))。蛍光色素により抗体を標識する 場合、 光色素としては、 ί列えば、 FITC、 PE、 ECD (PE-TxRED)、 PC5 (PE_Cy5)、 PC 5.5 (PE-Cy5.5)、 PC7 (PE-Cy7)、 APC、 APC5.5 (APC_Cy5.5)、 APC7(APC_Cy7)、 C y5、 Alexa Fluor™などが用いられる。また抗体は、断片化して、 F(ab')、 Fab'、 Fab, F
2
Vなどの形態にすることができる。抗体断片は、パパインまたはペプシン等のぺプチダ ーゼを用いて抗体を分解することによって得ることができる。
実施例
[0050] 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制 限されるものではなレ、。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の 一部として組み込まれる。
[0051] [実施例 l]LacZ遺伝子搭載マイナス鎖 RNAウィルスベクター投与による抗 LacZ抗体 産生
1.免疫
6週齢ォスの BALBん Aマウス 6頭の腓腹筋に生理食塩水で 2xl08CIU/mlに調製し た、 LacZを発現する F遺伝子欠損型センダイウィルスベクター SeV18+LacZ/ A F (W ◦00/70070)を投与した。筋肉内注射により片側の 2ケ所に 1ケ所当たり 100 μ ΐずつ 接種した。ベクター接種 5週後に眼窩静脈叢より採血し、血漿を分離した。
2.抗体の検出
抗体アツセィのため、市販の大腸菌由来 j3ガラクトシダーゼ（シグマ G5635)を用い レーン当たり 4 μ gになるよう SDS電気泳動を行った。泳動した蛋白質はセミドライブ口 ッターにて PVDF膜に転写し、 5%スキムミルクによりブロッキングを行った。免疫したマ ウスの血漿は 4%ゥシ血清アルブミン入り PBSにて 200倍に希釈し一次抗体反応に用い た。陽性対照には抗 LacZ抗体（プロメガ社 Z378A)を 4%ゥシ血清アルブミン入り PBS にて 5000倍に希釈したものを用いた。二次抗体として、 HRP-標識抗マウス Igs (Bioso urce AMI4704)を 5%スキムミルク、 0.1%Tween20添加 TBSにて希釈したものを用いた。 ECL plus (アマシャム）を用いた化学発光により LAS1000装置（FUJI FILM)を用いて シグナルを検出した。
[結果]
SeV18+LacZ/ A Fを用いたプライミング 1回のみで、 5週後に抗 LacZ抗体の産生を マウス血中に確認することができた（図 1)。
[実施例 2] GFP遺伝子搭載マイナス鎖 RNAウィルスベクター投与による抗 GFP抗体 産生
1.免疫
(1)プライミング
A: 6週齢メスの BALBん Aマウス 16頭（各投与経路につき 4頭ずつ）に、点鼻、筋注、 脾臓直接注、足躕注により、生理食塩水で希釈調製した、 GFP発現 F遺伝子欠損型 センダイウィルスベクター SeV18+GFP/ Δ F (WO00/70070)をl頭ぁたり5 x 106 CIU投 与した。点鼻投与ではセボフレンによる軽微な麻酔下においたマウスに 100 μ 1のべク ター懸濁液を少量ずつ経鼻的に自然呼吸により吸引させた。筋注は片脚腓腹筋内 に 50 μ 1ずつ 2箇所に、脾臓直接注射では 50 μ 1のベクター懸濁液をそのまま注射し た。足躕注では片足 25 μ 1ずつ両足計 50 μ 1を注射した。
Β: 6週齢メスの BALB Aマウス 2頭ずつに、腹腔、あるいは腰部皮下に生理食塩水 で 1 xlO8 ClU/mlに調製したウィルスベクター SeV18+GFP/ A Fを投与した。腹腔に は 100 μ 1のベクター懸濁液をそのまま、皮下投与は腰部 2箇所にそれぞれ 50 μ 1ずつ 注射を行った。
(2)ブースト
Α:プライミング 2週後、全てのマウスに腹腔内に 5xl07 CIU/mlに調製したウィルスべ クタ一 SeV18+GFP/ A Fを ΙΟΟ μ Ι投与した。対照の非ブーストマウスには 100 μ 1の生 理食塩水を同様の方法で投与した。
Β:プライミング 16日後、全てのマウスの腹腔内に生理食塩水で 1 xlO8 CIU/mlに調 製したウィルスベクター SeV18 + GFP/ Δ Fを 100 μ 1投与した。
(3)採血 A:プライミング前 (非免疫対照）、プライミング後 28日目に眼窩静脈よりへパリン塗布 キヤピラリーを用いて約 100 / 1採血し、血漿を分離した。
B:プライミング後 19日目（ブースト 3日後）に眼窩静脈より同様に約 100 / 1採血し、血 清を分離した。
(4)抗体の検出
A:血漿中の抗 GFP抗体価を SDS-PAGEにて電気泳動後 PVDF膜に転写 ·固定した 市販精製 GFPタンパクに対するウェスタンブロッテイングにて検出した。対照として巿 販抗 GFP抗体および非免疫マウス血漿を用いた。
B:血漿中の抗 GFP抗体価を SDS-PAGEにて電気泳動後 PVDF膜に転写'固定した G FP遺伝子搭載センダイウィルスベクター感染 LLC-MK細胞ライセートタンパクに対
[0053] 2.ウェスタンブロット用細胞ライセートの調整
10cmシャーレにて LLC- MK細胞に moi 10になるように SeV18+ GFP/ A Fを感染さ せ、 2日後に細胞を 4°Cの PBSにて 2回洗浄した。細胞溶解バッファー（10mM CHAPS 、 2mM EDTA、 2mM PMSFを添加した PBS)を 5 ml加え 4°Cで 20分静置した後、セルス クレーパにて可溶物を回収した。回収物は 9000卬 mで遠心した後、上清を回収し、透 析チューブ、 Slide-A-Lyzer 2000MW (Piarce社）に入れ、 4°Cの PBSに対し透析を行 レヽ、 CHAPSを除去した。可溶蛋白質はブラッドフォード法（Bio-Rad社 DC Protein Ass ay kit)にて定量、 1レーン当たり 5 μ gになるようにアプライし、 SDS-PAGEを行った。
3.ウェスタンブロット
蛋白質はセミドライブロッターにて PVDF膜に転写し、 5%スキムミルクあるいは 4%ゥシ 血清アルブミンによりブロッキングを行つた。血漿は 4%ゥシ血清アルブミン入り PBSに て 200倍に希釈し一次抗体反応に用いた。陽性対照には抗 GFP抗体 (Invitrogen社） を 4%ゥシ血清アルブミン入り PBSにて 5000倍に希釈したものを用いた。二次抗体 HRP -標識抗マウス Igs (Biosource AMI4704)を 5%スキムミルクあるいは 4%ゥシ血清アルブミ ン、 0.1%Tween20添カ叮 BSにて希釈したものを用いた。検出は ECL plus (アマシャム） を用いた化学発光により LAS1000装置（FUJI FILM)を用いて検出した。
[0054] [結果] SeV18+GFP/ A Fによるプライミングで、ブーストのあるなしにかかわらず 4週後に抗 GFP抗体の産生をマウス血中に確認することができた（図 2)。抗体価の上昇は特に 点鼻投与のマウスで顕著であった。
[0055] [実施例 3]マイナス鎖 RNAウィルスベクター感染細胞ライセートの腹腔内投与による 抗体産生
1.免疫
(1)プライミング
6週齢メスの BALBん Aマウス 2頭の腹腔に、センダイウィルスベクター SeV18+GFP/ A F感染マウスサルコ一マ細胞 Meth- A (RIKEN RCB0464; Old, L. et al. (1962) An n. N.Y. Acad. Sci. 101 , 80-106)のライセートを 1頭あたり 5 x 106細胞相当量投与し た。 Meth_A細胞に moi=l ,000でセンダイウィルスベクター SeV18+GFP/ Δ Fを感染さ せ、 3日後に遠心で集めた細胞を DPBS (-)で洗浄後、凍結融解を 5回くり返した後に 細胞破片を遠心で除去した後の上清分画をライセートとして用いた。
(2)ブースト
プライミング 2週後、全てのマウスの腹腔内に 5xl07CIU/mlに調製したウィルスベクタ 一 SeV18 + GFP/ Δ Fを 100 μ 1投与した。対照の非ブーストマウスには 100 μ 1の生理 食塩水を同様の方法で投与した。
[0056] 2.抗体の検出
(1)採血
プライミング前（非免疫対照）、プライミング後 14日目（ブースト前）、 28日目に眼窩 静脈よりへパリン塗布キヤピラリーを用いて約 100 μ 1採血し、血漿を分離した。
(2)ウェスタンブロット
血漿中の抗 GFP抗体価を実施例 2同様 SDS-PAGEにて電気泳動後 PVDF膜に転写 '固定した巿販精製 GFPタンパク（Wako chemicals)に対するウェスタンブロッテイング にて検出した。対照として巿販抗 GFP抗体（Invitrogen社）および非免疫マウス血漿を 用いた。
[0057] [結果]
SeV18+GFP/ Δ F感染細胞ライセートによるプライミングで、ブーストのあるなしにか かわらず 4週後に抗 GFP抗体の産生をマウス血中に確認することができた（図 3)。
[0058] [実施例 4]ウィルスベクターによるプライム、および同ベクター感染細胞ライセートに よるブーストの組み合わせによる抗体の産生
1.免疫
(1)プライミング
6週齢メスの BALBん Aマウス計 8頭 (各投与経路につき 2頭）に、実施例 2と同様の方 法で点鼻、筋注、脾臓直接注、足躕注により生理食塩水で希釈調製したセンダイゥ ィルスベクター SeV18+GFP/ A Fを 1頭あたり 5 x 106 CIU投与した。
(2)ブースト
プライミング 2週後、全てのマウスの腹腔内にセンダイウィルスベクター SeV18+GFP / A F感染マウスサルコ一マ細胞 Meth-A (RIKEN RCB0464)のライセートを、 1頭あた り 5 X 106細胞相当量投与した。ライセートは実施例 3と同様の方法で作製した。
2.抗体の検出
(1)採血
プライミング前（非免疫対照）、プライミング後 14日目（ブースト前）、 28日目に眼窩 静脈よりへパリン塗布キヤピラリーを用いて約 100 μ 1採血し、血漿を分離した。
(2)ウェスタンブロット
血漿中の抗 GFP抗体価を SDS-PAGEにて電気泳動後 PVDF膜に転写 ·固定した巿 販精製 GFPタンパクに対するウェスタンブロッテイングにて検出した。対照として市販 抗 GFP抗体（Invitrogen社）および非免疫マウス血漿を用いた（図 4)。
[結果]
SeV18+GFP/ Δ Fベクターでプライム後、同ベクターの感染細胞によるブーストで、 抗 GFP抗体の産生増強をマウスの血中に確認することができた（図 4)。
[0059] [実施例 5]抗 GFPモノクローナル抗体の作製
1.免疫
(1)プライミング
6週齢メスの BALBん Aマウス 1頭の腹腔内に、生理食塩水で 1 xlO8 CIU/mlに調製 したウィルスベクター SeV18+GFP/ Δ Fを 100 μ 1投与した。 (2)ブースト
プライミング 16日後、腹腔内に生理食塩水で 1 xlO8 CIU/mlに調製したウィルスべ クタ一 SeV18+GFP/ Δ Fを 100 μ 1投与した。
[0060] 2.ハイプリドーマの作製
ミエローマ（P3_X63-Ag8.653) (RIKEN RCB0146)は 10%牛胎児血清（FBS)を含む R PMI1640培地で培養を行なレ、、融合当日に対数増殖期になるように用意した。ブー スト後 3日目にマウスを頸椎脱臼により屠殺し、脾臓を摘出した。無血清の RPMI1640 培地中で滅菌したステンレス網を用レ、、脾臓細胞を濾し単離した。脾細胞を 3回、ミ エローマを 2回無血清 RPMI1640培地で洗浄後、両者を数比 1： 1で混合し、遠心した 。上清除去後、 50%ポリエチレングリコール PEG (Sigma Hybri-Max mw3000_3700)に て脾細胞とミエローマの細胞融合を行った。融合細胞は無血清培地で洗浄、遠心を 2回繰り返したのち、 20%FBS/10mM HEPES/lmM sodium pyruvate添加 RPMI 1640培 地 40mlに懸濁し、 wellあたり約 105細胞になるように 96wellプレートに播種した。融合の 翌日、 HAT選択培地を 100 μ 1ずつ wellに添加し、翌日より培地上清を半量除去後 10 0 μ 1ずつ HAT培地（20%FBS/lxHAT supplement Hybri-Max (Sigma H0262)添加 RP MI1640)を添加した。半量ずつの培地交換は、細胞融合後 1週間後までは毎日 HAT 選択培地にて行い、それ以降は HT培地（20%FBS/lxHT supplement Hybri-Max (Sig ma H0137)添カロ RPMI1640)にて 2日ごとあるいは生細胞の密度に合わせて行った。
HAT選択培地によって選択された融合細胞が wellの底をだいたい半分以上覆うくら いの大きさになったら、培養上清を回収し、ウェスタンブロットを行い融合細胞のうち 抗 GFP抗体を産生するものを選択した。増殖してきた融合細胞は、 BALB Aマウス の胸腺細胞をフィーダ一とした 96 wellプレートを用いて限界希釈法にてクローニング を行った。得られたクローンが増幅し、 wellの約半分を覆う位の大きさになったら、培 養上清を回収し、ウェスタンブロットにより、抗 GFP抗体の産生するクローンを回収し た。その結果、 GFP搭載センダイウィルスベクターにより免疫したマウスの脾細胞を用 レ、、 GFPを認識するモノクローナル抗体の作製に成功した（図 5)。
[0061] [実施例 6]ヒト免疫不全ウィルス 1型（HIV-1)のエンベロープタンパク gpl60を認識す るモノクローナル抗体の作製 1.免疫
(1)プライミング
セボフレン麻酔下に 7週齢メスの BALBん Aマウス計 8頭に、生理食塩水で 5 xlO8 CIU /mlに調製した、ヒト免疫不全ウィルス 1型（HIV-1)のエンベロープタンパク gpl60遺 伝子を搭載する F遺伝子欠損型センダイウィルスベクター SeV18+GP160/ Δ Fを 1頭 あたり 100 μ ΐ点鼻投与した。
(2)ブースト
プライミング後 14、 28、 42、 56日目に凍結'融解法で作製した SeV18+GP160/ Δ F感染 7T1細胞ライセート（5xl06個細胞相当/ 100 μ ΐ)を 1頭当たり 100 μ ΐ腹腔内投与した。
2.ハイプリドーマの作製
ミエローマ（P3-X63-Ag8.653)は実施例 5に記載された方法で用意した。最終ブー スト後 4日目に、最終ブースト時に採取した血漿中の抗 gpl60抗体価が高かった 4頭 を頸椎脱臼により屠殺し、脾臓を摘出した。無血清の RPMI1640培地中のナイロンメッ シュ上で脾臓をすり潰すことにより脾臓細胞を分離、回収した。脾細胞とミエローマの 細胞融合と融合細胞の培養は実施例 5に記載された方法で行った。
HAT選択培地によって選択された融合細胞が wellの底を半分以上覆うほど増殖し たら、培養上清を回収し、 SeV18+GP160/ A Fベクター感染 LLC-MK細胞ライセート
2
を固定した 96 wellプレートおよび搭載遺伝子を搭載しない空の SeV18+/ A Fベクタ 一感染 LLC-MK細胞ライセートを固定した 96 wellプレートを用いた ELISA法を行な
2
レヽ、 SeV18+GP160/ A Fベクター感染 LLC-MK細胞ライセートを固定した 96 wellプレ
2
ートでのみ陽性となる培養上清を検出することにより抗体産生細胞を同定した。 gP16 0特異的抗体であることは、凍結、融解法で作製した SeV18+GP160/ A Fベクター感 染 LLC-MK細胞ライセートを SDS-PAGE後に転写した PVDF膜を用いたウェスタンブ
2
ロットを実施例 2同様に行って確認した（図 6)。このようにして得られたハイプリドーマ 力産生する抗 gpl60:f几体の subclassは t†i|Rのキット (Mouse Immunoglobulin Screening /Isotyping Kit (Genzyme社、カタログ番号 97-6550))により IgGと決定された（図 7)。
1
HIVやその他のウィルスのウィルス蛋白質に対する抗体は、例えばウィルス感染の検 查 '診断に有用である。 [0063] [実施例 7]ヒト免疫不全ウィルス 1型（HIV-1)のエンベロープタンパク gpl60を認識す るモノクローナル抗体のペプチドを用いたブーストによる作製
1.免疫
(1)プライミング
実施例 6と同様に行なった。
(2)ブースト
gpl60蛋白質のアミノ酸配列の一部をなすペプチド 3種類を人工合成し、キャリア蛋 白質 KLH (keyhole limpet hemocyanin)に常法を用いて結合した。合成したペプチド のアミノ酸配列は以下のとおりである。括弧内の番号は Genbank (accession number NPJ357856)に登録されている gpl60のアミノ酸配列上の相当する部分のアミノ酸番号 である。ただし、 #493と #495のァミノ末端のシスティンおよび #494のカルボキシ末端の システィンは、 KLHとの結合のために付加されたもので、 gpl60の配列には含まれな レ、。
# 493 CTRKRIRIQRGPGRAFV (303-318) (配列番号： 10)
# 494 SELYKYKVVKIEPLGVC (481-496) (配列番号： 11)
# 495 CPRGPDRPEGIEEEGGER (724-740) (配列番号： 12)
上記 3種のペプチドを等重量（1頭あたり各 50 μ g)混合した溶液と Freund's incomplet e adjuvantとのェマルジヨンをブースト直前に作製し、プライミング後 14、 28、 42、 56日 目に 1頭当たり 200 μ 1を背部皮内注射した。
[0064] 2.ハイプリドーマの作製、選択およびウェスタンブロット
実施例 6と同様に行なレ、、ペプチドでブーストしたマウスから作製した融合細胞中に 抗 gpl60抗体を産生するハイブリドーマ C1-182を検出した（図 8)。 C1-182の subclass 夹施列 6同 (こ巿販の ット (Mouse Immunoglobulin Screening/Isotyping Kit (Ge nzyme社、カタログ番号 97-6550))により IgGと決定された。よって、細胞ライセートだ
1
けでなく合成ペプチドによってもモノクローナル抗体作製に有効なブーストを行ない 得ることが示された。
[0065] 3.抗体結合阻害によるェピトープの確認
ハイプリドーマ C1-182が産生する抗体がブーストに使用したペプチドのいずれをェ ピトープとして認識するかを結合阻害アツセィにて確認した。ウェスタンプロットは上 記同様におこなった力 上清ハイブリドーマ C1-182の上清と反応させる際、あらかじ め反応液に 0.1， 1.0あるいは lO g/mlになるように #493， #494, #495のうちのいずれ かのペプチドを混合したものを用いた。上清中の抗体とメンブレン上の gpl60の反応 はペプチド #495が混合されている時のみ阻害され、 C1-182が産生する抗体がぺプ チド #495のアミノ酸配列をェピトープとして認識することがわ力、つた。これによりぺプチ ドによるブーストが有効であったことが裏付けられた（図 9)。
[0066] [実施例 8] gpl60を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクロー二 ング
作製したハイプリドーマを安定して継代維持できるようにするため、 6-76と C1-182の 細胞クローニングを行なった。 96ゥヱル組織培養プレートに 1ゥヱルあたり 0.3， 1, 3個 の細胞が入るように希釈して播種し、約 2週間後に細胞コロニーが 1ゥエルあたり 1個 のみ出現したゥエルを顕微鏡下に確認後、その上清を採取して抗 gpl60抗体の存在 を ELISA法で検出した。クローニングにあたっては 10%FBS含有 RPMI1640培地にさら に BM Condimed HI (Roche Diagnostics社カタログ番号 1 088 947)を 10%加えて用レヽ た。クローニングは 2回行なった。 2回目には 1回目で陽性を示したハイプリドーマ株 6 -76-14, 6-76-17, Cl-182-40, C1-182-48を用いた。 2回目クローニングの陽性率は 、それぞれ 35/36 (97%), 26/26 (100%), 20/29 (69%), 29/29 (100%)で、 #6-76、 C1-18 2はレ、ずれもクローンィ匕に成功したと結論した（図 10)。
さらに、 2回目陽性の細胞 6-76-14-21， 6-76-14-29, Cl-182-48-5, CH82- 48- 3 5の培養上清を用いて実施例 6同様のウェスタンブロットを行なったところ、もとになつ たハイブリドーマおよび 1回目クローニング陽性細胞とまったく同様に gpl60と gp41を 検出することができた（図 11)。
[0067] [実施例 9]ハイプリドーマ 6-76-14-29が産生する抗体の精製
ハイプリドーマ 6-76-14-29の培養上清中の抗体タンパクをィムノグロブリン結合タン パク Lを固定化したカラム（Pierce社 ImmunoPure Immobilized Protein L,カタログ番 号 20510)を用いて精製した。プロトコルは添付説明書に従った。精製した抗体は Syp ro Orange蛍光染色（BioRad社 カタログ番号 170- 3120)、抗マウス IgG(L+H)抗体（M P Biomedicals社 カタログ番号 67428)によるウェスタンブロットのいずれにおいても コントロールとして用いた巿販抗 Ovalbumin抗体（AntibodyShop社カタログ番号 HYB 094-07)同様 H鎖、 L鎖それぞれ 1本のバンドを示し、ハイブリドーマ 6-76-14-29がク ローンであること、産生される抗体タンパクが単一種であることを示した（図 12)。さら に、この精製抗体を用いてウェスタンプロットを行なったところ、精製前の上清と同様 に gpl60， gp41を検出することができた（図 13)。
[0068] [実施例 10]gpl20を認識するハイブリドーマの取得
免疫、ノ、イブリドーマの作製、選択およびウェスタンプロットは実施例 6にならつて行 なった。ただし、免疫部位として足躕注を用い、 Priming時のベクターは 2xl09 CIU/mo useを用いた。 gp41を認識するもの（D1-518, A2-12, B2-39, B2-103)だけではなく g pl20を認識するもの (Dl-106, Dl-137, Dl-526, D2-26)も含む複数の抗 gpl60抗体 産生ハイブリドーマの取得に成功した（図 14)。
[0069] [実施例 11]IL10同時搭載 F遺伝子欠損型センダイウィルスベクター投与による血漿 中抗 gpl60抗体の誘導
F遺伝子欠損型センダイウィルスベクター SeV18+LacZ/ A F (WO00/70070)に、 CT L抑制と同時に抗体産生刺激効果があることが知られているサイト力イン interleukin (I L)-10をコードする核酸と、 gpl60をコードする核酸とを同時搭載したベクターを作製し 、これを用いてマウスを免疫し、 56日後の血漿中に産生される抗体を調べた。免疫お よびウェスタンブロットは実施例 7にならつて行なった。 IL-10が同時搭載されたセン ダイウィルスベクターで抗 gpl60抗体が有効に誘導されることが示された。 （図 15) 産業上の利用可能性
[0070] 本発明により、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いた抗体の製造方法が提供さ れた。本発明の方法により製造された抗体は、蛋白質の検出や精製、中和、臨床検 查、病理診断、抗体治療などに用いられる。

Claims

請求の範囲
[I] 抗体または抗体産生細胞の製造方法であって、
(a)抗原としたレ、外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖 RNAウイ ルスベクター、該ウィルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生 成する核酸が導入された細胞、または該細胞の溶解物を、非ヒト動物に接種するェ 程、
(b)該動物から、抗体または抗体産生細胞を回収する工程、
を含む方法。
[2] 工程 (a)の接種が、筋注、皮下投与、点鼻投与、手掌または足躕皮内投与、脾臓 投与、および腹腔内投与からなる群より選択される投与経路により行われる、請求項 1に記載の方法。
[3] 該マイナス鎖 RNAウィルスベクター、該ウィルスベクターを生成する核酸、該ベクタ 一または該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、該細胞の溶解物、または該 細胞の溶解物から精製された抗原の接種によりブーストを行う工程をさらに含む、請 求項 1に記載の方法。
[4] 該ポリペプチドまたはその断片を含むポリペプチドによりブーストを行う工程をさらに 含む、請求項 1に記載の方法。
[5] 回収した抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を選択する工程をさら に含む、請求項 1に記載の方法。
[6] 回収した抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合させ、ノ、イブリドーマを調製するェ 程をさらに含む、請求項 1に記載の方法。
[7] ハイプリドーマが産生する抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を産 生するハイプリドーマを選択する工程をさらに含む、請求項 6に記載の方法。
[8] ハイプリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収する工程をさらに含む、請求 項 6に記載の方法。
[9] マイナス鎖 RNAウィルスが複製欠損型である、請求項 1に記載の方法。
[10] マイナス鎖 RNAウィルス力 パラミクソウィルスである、請求項 1に記載の方法。
[II] パラミクソウィルスが少なくとも F遺伝子を欠損する、請求項 10に記載の方法。
[12] パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、請求項 10に記載の方法。
[13] 回収した抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしない該マイナス鎖 RNA ウィルスベクター、該ウィルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または 該ウィルスのウィルス蛋白質とを共存させる工程、および、それらと結合しない抗体を 選択する工程、をさらに含む、請求項 1に記載の方法。
[14] ハイプリドーマが産生する抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしない該 マイナス鎖 RN Aウィルスベクター、該ウィルスベクターが導入された細胞、該細胞の 溶解物、または該ウィルスのウィルス蛋白質とを共存させる工程、および、それらと結 合しない抗体を産生するハイプリドーマを選択する工程、をさらに含む、請求項 6に 記載の方法。
[15] Th2サイト力インまたはその活性部分ペプチド、あるいはそれらをコードするべクタ 一を投与する工程をさらに含む、請求項 1に記載の方法。
[16] 該サイト力インまたはその活性部分ペプチドが、抗原としたい外来ポリペプチドをコ ードする該マイナス鎖 RNAウィルスベクターにコードされている、請求項 15に記載の 方法。
[17] Th2サイト力インが IL_4、 IL_10、および IL-13からなる群から選択される、請求項 15 に記載の方法。
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