JPS6230753B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、狂犬病ウイルスの精製方法、さらに
詳しくは、狂犬病ウイルス含有液を、下活化処理
後または不活性することなく、セルロース硫酸エ
ステルゲルに接触せしめ、狂犬病ウイルスを吸着
させた後、狂犬病ウイルスを該ゲルから溶出する
ことにより狂犬病ウイルスを精製する方法に関す
る。 発明の技術的背景と産業上の利用分野 狂犬病は1957年以来日本には発生がない。しか
し、現在でも太平洋地域、北欧地域のごく少数の
国を除き、全世界のほとんどの国において発生し
ており、特にアジア、アフリカの諸国ではイヌの
発生例に比例してヒトの発生例も多く、我国とし
ても常に注意を払つておく必要がある。 狂犬病ウイルスの伝播動物としては、イヌのほ
かに、地域により種々であるが、コウモリ、キツ
ネ、イタチ、ネコ、スカンク、マングースなどの
野生動御が知られており、このことが防疫対策を
著しく困難にしている。 狂犬病ウイルスは強い神経親和性を持つラプド
ウイルス群に属する長さ180nｍ、径80nｍの弾丸
型をしたRNAウイルスであり、すべての哺乳類
が感受性を持ち、主として神径組織と唾液腺に増
殖し、唾液に排出される。 最近の研究によれば、適当な条件下ではウイル
スは粘膜や筋肉組織にも良く増殖し、気道感染、
経口感染もありうることが実験的に確かめられて
いる。動物では感染後発病することなくウイルス
を保有する場合もあり、とくにコウモリは長期間
感染源となりうることが知られている。 ところで、狂犬病は、感染犬その他の感染動物
に咬まれたり、なめられたりして唾液に含まれる
ウイルスが傷口から侵入し、末梢神径を経て、中
枢神径に至り脳炎や麻痺を起すことにより顕性所
見を呈するが、ヒトが発病した場合、ほとんど
100％死亡するという恐ろしい病気である。 このような狂犬病に対する予防、治療対策とし
ては、現在のところ狂犬病ワクチンの注射以外に
方法はない。 この狂犬病ワクチンのヒトへの適用は、感染前
に予防的にワクチンを投与することもあるが、一
般的には、狂犬病の疑いのある動物に咬傷を受け
た直後にワクチン注射を頻繁に行ない、ウイルス
の潜伏期間中に免疫を与えて発病を予防する感染
後の処置に用いられる。これは病獣による咬傷と
いう感染の機会が明瞭であること、潜伏期が普通
１ケ月以上と長いことなどもその理由である。動
物への適用は、主として犬であつて、日本ではと
くに狂犬病予防法にもとづき、飼犬はすべてワク
チンの予防注射が義務づけられている。 従来技術 人体用狂犬病ワクチンとして過去に用いられた
ものにヤギ脳由来ワクチンがあるが、これは投与
後全身麻痺から死に至る後麻痺の副作用のためそ
の使用が中止されている。その後、乳のみマウス
脳由来ワクチンなど種々のワクチンを経て、現在
ではさらに安全かつ有効な狂犬病ワクチンとし
て、初代ハムスター腎細胞、ヒト２倍体細胞や初
代ニワトリ胚細胞などによる組織培養ワクチンが
開発されている。これは、脳物質に由来する副作
用の恐れがないので、それによりはじめてワクチ
ンの予防的使用が可能になつた。 動物用狂犬病ワクチンは、ヤギまたはマウス脳
乳剤の遠心上清をカルボキシメチルセルロースナ
トリウムやマクロゴールなどで濃縮精製し、β−
プロピオラクトンやUV照射などで不活化して作
られている。最近、HmLu細胞を用い、人体用ワ
クチンと類似の方法で組織培養ワクチンが作られ
るようになつた。 つぎに、狂犬病ワクチンの製造工程の一例とし
て、人体用乾燥組織培養不活化狂犬病ワクチンに
ついて、そのフローチヤートを示す。

【表】 凍結乾燥封栓
↓
小分製品
上記は一例であるが、いずれの方法で作られる
ワクチンでも濃縮精製の工程を必須としており、
従来法では限外過濃縮、マクロゴール濃縮、超
高速遠心沈殿といつた高価な設備器材を要し、煩
雑かつ収率の低い技術を基にしたものであつた。 発明の目的 本発明者らは、カラムクロマトグラフイまたは
バツチ法にて、より簡単に且つより安価に狂犬病
ウイルスを精製する方法を見い出すべく種々研究
を重ねた結果、セルロースを硫酸エステル化して
得られるセルロース硫酸エステルゲルが狂犬病ウ
イルスと特異的に親和性を有することを知り、こ
の知見にもとづき、狂犬病ウイルスの遊離液また
は濃縮液などの狂犬病ウイルス含有液を、不活化
処理後、または不活化しないで、セルロース硫酸
エステルゲルに接触せしめ、狂犬病ウイルスを吸
着させた後、該セルロース硫酸エステルゲルから
溶出することにより、高純度の狂犬病ウイルスが
きわめて簡単にしかも非常に高い収率で得られる
ことを発見し、本発明を完成するに至つた。 すなわち本発明の目的は、狂犬病ウイルスを、
高収率でかつきわめて高純度にまで精製する安価
な方法を提供することにある。この新しい方法を
ワクチン製造工程に組み入れることによつてはじ
めて高品質のワクチンが経済的に製造される。 発明の構成および効果 本発明は、狂犬病ウイルス含有液を、セルロー
ス硫酸エステルゲルに接触せしめ、狂犬病ウイル
スを吸着させた後、該ゲルから狂犬病ウイルスを
溶出することを特徴とする狂犬病ウイルスの精製
方法である。 本発明において出発材料として用いられる狂犬
病ウイルス含有液としては、組織培養法によつて
得られる狂犬病ウイルス浮遊液、たとえばニワト
リ胚初代培養細胞に狂犬病ウイルスを接種培養し
て得られる狂犬病ウイルス浮遊液またはこれを例
えば限外過法などにより若干濃縮した溶液を含
む。この狂犬病ウイルス含有液をそのまま、また
β−プロピオラクトンなどの常法により不活化処
理したのちに本発明の精製方法に供される。ま
た、乳のみマウス脳由来ワクチンなど感染動物の
脳材料に由来するウイルス培養材料も同様に供さ
れる。さらに、狂犬病ウイルスが遺伝子組換え体
を利用して培養されたウイルスであつてもよい。 本発明で用いられるセルロース硫酸エステルゲ
ルとは、セルロースを硫酸エステル化して得られ
るのであるが、好ましくは結晶セルロースあるい
は、結晶領域および非結晶領域からなるセルロー
スを硫酸エステル化したものが良い。この場合、
得られたセルロース硫酸エステルは原料の形状を
保持し、水性媒質に不溶性であり、物理的安定性
にすぐれ、クロマトグラフイ用ゲルとして好適で
ある。これらの原料セルロース類はすでに市販さ
れており例えば、セルロフアインGC−15、同GH
−25、同GC−100、同GC−200（チツソ社製）、
アビセル（旭化成工業社製）などがある。これら
のゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒の存在下
クロルスルホン酸、無水硫酸などを作用させるこ
とにより所望のセルロース硫酸エステゲルが得ら
れる。 本発明において、セルロース硫酸エステルゲル
を用いて、狂犬病ウイルスを精製採取するにあた
つては、たとえば、次のような方法で行なわれ
る。 原材料液の狂犬病ウイルス含有液を、所望によ
り蒸留水または緩衝液で比電導度が0.5〜5.0ｍ
ｓ／cmとなるように希釈した後、セルロース硫酸
エステルゲルによる吸着操作に付す。 セルロース硫酸エステルゲルへの狂犬病ウイル
スの吸着、ゲルの洗浄、該ウイルスの溶出等一連
の精製操作は、バツチ法およびカラム法等の工業
的に通常よく用いられる操作方法で行なうことが
できるが、カラム法の方が操作が簡単であり好都
合である。カラム法の場合、セルロース硫酸エス
テルゲルをカラムに充填し、あらかじめ、温度０
〜30℃にて、例えば0.14M NaCl添加0.01Mリン
酸緩衝液（PH7.0〜8.0）等の比電導度5.0〜25.0ｍ
ｓ／cmでPHが7.0〜8.0程度である適当な緩衝液を
通液して平衡化を行つた後に、狂犬病ウイルスの
吸着操作に移る。 吸着に際しては、狂犬病ウイルス含有液をPHが
7.0〜8.0、比電導度が5.0〜25.0ｍｓ／cmになるよ
うに適宜調整して、セルロース硫酸エステルゲル
充填カラムに通液し、狂犬病ウイルスを吸着させ
る。この後、比電導度0.5〜5.0ｍｓ／cmの緩衝液
を通液し、ゲルを洗浄し、夾雑物質を洗い出す。 狂犬病ウイルスの溶出に際しては、PHが5.0〜
9.0、比電導度が5.0以上である適当な緩衝液、例
えば0.5〜1.5M NaCl添加0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.0〜8.0）、を通液し溶出を行なうが、好ましく
は段階溶出または塩濃度勾配溶出を行なう。 本発明の精製法によれば、狂犬病ウイルスの精
製度は数十倍に達し、しかも狂犬病ウイルスの回
収率は90％以上100％近くに達する。得られる精
製狂犬病ワクチンの蛋白窒素含量を従来法とくら
べ約1/2に減少させることができる。 セルロース硫酸エステルゲルの能力を調べるた
めに、後記調製例１と同様にして調製したセルロ
ース硫酸エステルゲル２mlを充填したカラム（16
mmφ×400mm）に、不活化狂犬病ウイルス浮遊液
を連続して通液し、通過液についてHA
（Hemagglutinin）価を測定し、ゲル容量の160倍
まで処理能力を有することを確認した。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の狂犬病ウイルス含有液から所望のウイルスを高
収率、高純度に採取することができ、その操作も
きわめて簡単で、またその精製用クロマトグラフ
イ吸着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使
用しても劣化が全く無く、きわめて経済的にすぐ
れている。 したがつて、本発明方法は高純度狂犬病ウイル
スの工業的精製法としてきわめてすぐれた方法で
ある。また本発明の方法は従来の技術である遮糖
密度勾配超遠心分離法、［F.Hilfenhaus et al、J.
of Biological Standardization、４、263−271
（1976）］等と組合わせることも可能であり、その
際は従来方法で得られる結果に比して非常にすぐ
れた結果を得ることができる。 本発明の方法で得られる狂犬病ウイルスは高純
度で不純物として他の蛋白質、脂質、糖類等を含
まず、精製狂犬病ワクチンの調製に有用である。 実施例 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 １ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し、混合する。滴下終了
後、混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中
にセルロフアインGC−15（チツソ社製）80ｇを
加え、撹拌下65〜70℃にて３時間反応させる。反
応終了後、冷却し、10％水酸化ナトリウム水溶液
を加えて中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリ
ン酸緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸
エステルゲルを得る。 調製例 ２ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し、混合する。滴下終了
後、混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中
に結晶セルロースであるクロマトグラフイー用ア
ビセル（旭化成工業社製）80ｇを加え、撹拌下65
〜70℃にて４時間保持する。反応終了後、冷却
し、10％水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和す
る。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液
で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを
得る。 実施例 １ 前記調製例１と同様にして調製したセルロフア
インGC−15の硫酸エステルゲル0.14をカラム
（2.5cmφ×40cm）に充填し、これに蒸留水1400ml
を通液する。つぎに、0.14M NaCl添加0.01Mリ
ン酸緩衝液1400mlにてゲルを平衡化したのち、こ
のカラムにニワトリ胚初代培養細胞に接種増殖し
て得られる不活化狂犬病ウイルス浮遊液2.9を
流速500ml／時間で通液する。0.14M NaCl添加
0.01Mリン酸緩衝液にて、ゲルを十分洗浄した
後、1M NaCl添加0.01Mリン酸緩衝液（比電導度
約87.6ｍｓ／cm、PH7.26）500mlを用いて流速１
ml／分で溶出を行ない、約10mlずつ分画して分取
した後、狂犬病ウイルスを含有する画分約30mlを
プールする。 原材料液および精製狂犬病ウイルス画分の分析
結果および実験成績を第１表に示す。

【表】 実施例 ２ 上記実施例１において、不活化狂犬病ウイルス
浮遊液4200mlを流速700ml／時間で通液し、また
溶出を1.5M NaCl添加0.01Mリン酸緩衝液（比電
導度120ｍｓ／cm、PH７、２）を用いて行なう以
外は同様にして、狂犬病ウイルス含有画分を得
る。その結果を第２表に示す。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 狂犬病ウイルスを精製取得するに際し、狂犬
   病ウイルス含有液を、セルロース硫酸エステルの
   ゲルに接触せしめ、狂犬病ウイルスを吸着させた
   後、該セルロース硫酸エステルゲルより狂犬病ウ
   イルスを溶出することを特徴とする狂犬病ウイル
   スの精製方法。 ２ 狂犬病ウイルスが狂犬病感染動物の脳材料も
   しくは感染組織培養細胞の培養物材料より得られ
   たウイルスである前記第１項記載の方法。 ３ 狂犬病ウイルスが遺伝子組換え体を利用して
   培養されたウイルスである前記第１項記載の方
   法。 ４ 該狂犬病ウイルス含有液を不活化処理したの
   ちセルロース硫酸エステルゲルに接触させる前記
   第１項記載の方法。 ５ セルロース硫酸エステルゲルが結晶セルロー
   スまたは結晶領域および非結晶領域からなるセル
   ロースの硫酸エステルゲルである前記第１項〜第
   ４項のいずれか１つに記載の方法。 ６ 該吸着処理を、温度０〜30℃、比電導度5.0
   〜25.0ｍｓ／cmの緩衝液であらかじめ処理して平
   衡化したのち吸着処理に付す前記第１項〜第５項
   いずれか１つに記載の方法。 ７ 狂犬病ウイルスを吸着したゲルからの溶出
   を、比電導度5.0〜25.0ｍｓ／cmの緩衝液を用い
   て行なう前記第１〜６項のいずれか１つに記載の
   方法。 ８ 該溶出処理に先だつて、吸着ゲルを、比電導
   度0.5〜5.0ｍｓ／cmの緩衝液で洗浄する前記第７
   項記載の方法。