KR920009734B1 - 광견병 바이러스의 정제방법 - Google Patents

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Description

광견병 바이러스의 정제방법

본 발명은 광견병 바이러스의 정제방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 광견병에 대한 효과적인 왁진을 얻는 방법에 관한 것이다.

광견병은 전세계에 걸쳐서 발생하여, 특히 아시아와 아프리카국가들에서 많이 발생하는 질병이다.

이 병은 광견병 바이러스에 의하여 발병되는데, 이 광견병 바이러스는 라브도바이러스군에 속하는 길이 약 180nm, 직경 약 80nm인 탄환형을 한 RNA바이러스이다.

이 바이러스는 포유동물에 감염성을 가지고 있다.

따라서 광견병은 개 뿐만 아니라, 박쥐, 여우, 족재비와 같은 야생동물을 통하여서도 걸리는 수가 있는 것이다.

광견병으로 인한 증세는 광견병 바이러스가 말초신경을 통하여 중추 신경계로 침입하면서 일어나고, 바이러스에 감염된 동물이 물거나 핥음으로서 전염된다.

사람에 대한 치사율은 거의 100%에 달하고 있다.

이러한 광견병을 예방하거나 치료할 수 있는 단 한가지 방법은 왁진주사하는 것 뿐이며, 고도로 정제된 왁진이 사용되는 것이 계속 요구되어 왔다.

광견병 왁진을 제조하는 종래의 대표적인 방법, 특히 동물에 대한 것은, 쥐나 다른 적합한 동물의 뇌에 주입된 광견병 바이러스를 증식시켜 광견병 바이러스 함유 물질을 준비하여 뇌로부터 증식된 광견병 바이러스 함유물질을 준비하여 뇌로부터 증시된 바이러스를 채취하는 단계와, 소듐카르복시메틸 셀룰로스와 같은 처리재로 원심분리와/또는 화학적 처리를 하고 불활성처리를 하는 방법에 의하여 채취된 물질을 정제, 정화하는 단계로 되어 있다.

좀더 최근에는, 특히 사람에 대한 광견병 왁진의 제조방법의 경우에, 배양된 병아리 배아세포와 같은 세포를 사용하는, 광견병 바이러스의 조직배양법이 개발되어 왔다.

이와 같은 형태의 왁진은, 뇌의 물질로부터 생기게 되는 오염물이 적게 포함되고 부작용의 염려가 없어 더욱 효과적이고 안전하다.

이러한 대표적인 건조조직배양 불활성 광견병 바이러스 왁진에 대한 제조법은 다음과 같다.

그러나, 상기 플로우 다이아그램과 같은 방법이나 기타 종래의 광견병 왁진 제조방법은 광견병 바이러스를 정제하기 위하여 한외여과와 초고속 원심분리와 같은 복잡하고 비용이 많이드는 기술을 필요로하고 있고, 저순도의 왁진만을 생산하고 있다.

따라서, 본 발명의 주요한 목적은, 간단하고 저렴한 방법으로 광견병 바이러스를 정제할 수 있는 방법을 제공함으로서 고순도의 광견병 왁진을 생산하고자 하는 것이다.

이하 본 발명의 다른 목적이나 구성, 작용 및 효과를 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 셀룰로스 또는 가교 다당류의 황산 에스테르가 광견병 바이러스와 특이한 친화성이 있고 따라서 바이러스를 함유한 물질로부터 바이러스를 분리, 정제 시키는데에 효과적이라는 것을 발견한 것에 기초하고 있다.

따라서, 본 발명에 의하면, 크로마토그래피용 겔로서, 가교다당류 또는 셀룰로스의황산 에스테르를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 광견병 바이러스를 함유한 용액을 거치는 광견병 바이러스의 정제방법을 제공하게 되는 것이다.

본 발명에 사용되는 셀룰로스의 황산에스테르는 결정성 셀룰로스 또는 결정영역을 갖는 셀룰로스를 포함한다.

이들 원료 셀룰로스는 상업적으로 쉽게 구할 수 있는데, 예를들면, Abicel(일본국 아사히 카세이 제조),Cellulofine GC-15, GH-25, GC-100 또는 GC-200(일본국 칫소사 제조)등이 있다.

본 발명에 사용되는 가교 다당류의 황산 에스테르는, 덱스트란, 셀룰로스, 아가로스 등과 같은 다당류를, 예를들면, 에피클로로 히드린, 디 클로로 히드린, 디브로모히드린, 에틸렌 글리콜 비스에폭시 프로필 에테르등의 가료제로 가교하여 얻어진 가교 다당류를 황산에스테르화 하여 얻어진 것이다.

가교 다당류는 상업적으로 구입하기 쉬운데, 예를들면, Sephadex G-10, G-25, G-50, G-100(스웨덴의 파르마시아 제조)와 같은 가교 덱스트란, Sepharose Cl-2B, Cl-4B, Cl-6B(스웨덴의 파르마시아 제조)와 같은 가교 아가로스, Cellulofine GCL-25, GCL-90(일본국 칫소사 제조)와 같은 가교 셀룰로스등이 있다.

이러한 가교 다당류 또는 셀룰로스의 황산화는 종래의 방법에 의하여 수행될 수 있다.

그러나 본 발명에 있어서 사용되는 크로마토그래피용 겔은, 예를들면 피리민등의 유기용매의 존재하에 클로로 설폰산, 무수황산등의 황산화제로 작용시킴으로써, 물에 불용성인 셀룰로스 또는 가교 다당류를 직접 화산화 함으로서 제조되는 것을 특징으로 하고 있다.

따라서, 최종겔은 물에 불용성이고 고도로 안정화되어 있다.

또한, 이러한 셀룰로스 또는 가교 다당류의 황산에스테르의 겔은 충분히 황산화되어 있기 때문에, 그 내부영역에서도 극히 높은 흡착력을 나타낸다.

이러한 겔은 저렴한 가격으로 쉬게 제조될 수 있기 때문에 경제적인 관점에 있어서도 사용에 유리하다. 가교다당류의 황산화동(설포닐기의 함유량)는 가교 다당류의 중량비로 보통 0.1∼40%의 범위내이며, 좋기로는 10∼40%이고, 셀룰로스의 황산화도는 셀룰로스의 중량비로 보통 0.1∼5.0%의 범위내이다.

가교 다당류 또는 셀룰로스의 황산에스테르를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 광견병 바이러스의 정제방법은 통상이 컬럼 크로마토그래피에서와 유사한 방법으로 수행된다.

예를들면 다음과 같은 방법으로 수행되어진다 ; 먼저 가교다당류 또는 셀룰로스의 황산 에스테르(좋기로는 구형 입자의 형태로)를 컬럼에 충전시키고, 이것을 좋기로는 이온강도가 0.001∼2.0 정도인 적당한 완충액, 예를들면, 0.14M NaCl(pH 7.0∼8.0)을 함유하는 0.01M 인산 완충염액으로 평형화 한다.

평형화 한후, 광견병 바이러스를 함유한 처리용액을, 겔에 이 바이러스를 흡착시키기 위하여 컬럼으로 통과시키고, 상기 평행화에서 사용된 동일한 완충용액으로 세정한다.

그후, 이온 강도가 평형화 또는 세정시에 사용한 완충액의 이온강도보다 큰 적당한 완충액, 예를들면, 1.0M 또는 1.5M식염을 함유한 인산완충액(pH 6∼9) 등으로 컬을 통과시켜서 컬럼으로부터 흡착된 광견병 바이러스를 용출하여 원하는 정도의 고순도 광견병 바이러스를 얻는다.

본 발명 방법은 광견병 바이러스를 함유하는 어떤 용액에도 적용될 수 있고, 광견병 바이러스를 정제하는 어느 단계에 있어서도 채용될 수 있다.

따라서 본 발명 방법은 불활성 광견병 바이러스 함유 용액 뿐 아니라, 불활성 처리를 가하기전 광견병 바이러스를 함유하는 용액에 적용될 수 있다.

예를들면, 상기한 바와 같은 배양된 병아리 배아 세포로부터 방금 채취된 용액은 그 용액내에 함유된 광견병 바이러스를 정제하거나 분리하기위하여 본 발명 방법을 거칠 수 있다.

언급한 바와 같이 β프로피오락톤 또는 자외선으로 불활성화 하여 얻어진 용액과 같은 불활성 광견병 바이러스 함유 용액 역시, 바이러스를 정제하기 위하여 본 발명방법을 거칠 수가 있다.

본 발명은, 어느 다른 공정에 의하여 제조된 광견병 바이러스 함유 용액 예를들면, 쥐 또는 다른 동물의 뇌에 접종된 광견병 바이러스를 증식하여 얻어진 용액에도 물론 적용될 수 있다.

또한 본 발명 방법은, 유전공학에 의하여 나타나는 광견병 바이러스를 함유하는 용액에도 적용될 수 있다.

본 발명의 정제방법에 의하면, 광견병 바이러스는 사용된 세로와/또는 배양매채로부터의 단백질, 지질 및 기타 물질로 거의 오염되지 않고, 고도로 정제될 수 있다.

이것은 설포닐기가 가교 다당류 또는 셀룰로스의 황산에스테르중의 가교 다당류 또는 셀룰로스와 직접 결합하고, 따라서 설포닐기이 함량이 높고 광견병 바이러스에 우수한 특이 흡착력을 나타내는 사실에 기인하는 것으로 추측된다.

본 발명의 정제방법은 공업적인 면에서도 고가의 장비가 필요없이 쉽게 수행될 수 있고, 저렴한 가격으로 공업적으로 원하는 순도의 정제된 광견병 바이러스를 얻을 수 있다. 원한다면, 본 발명의 방법은, 가능한 높은 순도의 광견병 바이러스를 얻기 위하여 종래의 다른 기술(즉, 초원심분리)과 결합되어 사용될 수도 있다.

이하 본 발명을 제조예(크로마토그래피용 겔의 제조)와 실시예에 따라 상세히 설명하면 다음과 같고, 이에 한정되는 것을 아니다.

[제조예 1]

0℃ 이하의 온도에서 피리딘(600ml)에 클로로 설폰산(117g)을 한방울씩 떨어뜨려 혼합한다.

혼합후에, 혼합액을 가열하여 65∼70℃로 승온한다. 이 혼합액에 결정 셀룰로스(Cellulofine GC-15, 칫소사 제조)(80g)을 가하고 65∼70℃에서 4시간 교반한다.

반응 종료후, 냉각하고, 10% 수산화 나트륨 수용액을 가하여 중화한다.

이렇게 하여 얻어진 겔을 여과분리하여, 0.01M 이산 완충식염액으로 충분히 세정하여 셀룰로스 황산염겔을 얻는다.

[제조예 2]

0℃ 이하의 온도에서 피리딘(600ml)에 클로로 설폰산(117g)을 한방울씩 떨어뜨려 혼합한다.

혼합후에, 혼합액을 가열하여 65∼70℃로 승온한다. 이 혼햅액에, 결정 셀룰로스 겔(크로마토그리피용 Abicel, 아사히 카세이 제조)(80g)을 가하고, 65∼70℃에서 4시간 교반한다.

반응 종료후, 냉각하고, 10% 수산화나트륨 수용액을 가하여 중화한다.

이렇게 하여 얻어진 겔을 여과분리하여, 0.01M 이산완충 식염액으로 충분히 세정하여 셀룰로스 황산염겔을 얻는다.

[제조예 3]

0℃ 이하의 온도에서 피리딘(200ml)에 클로로 설폰산(11ml)을 한방울씩 떨어뜨려 혼합한다.

혼합후에, 혼합액을 가열하여 65∼70℃로 승온한다. 이 혼합액에, 에피클로로 히드린-가교 덱스트란(Sephadex G-50, 파르마시아 제조)(7.5g)을 가하고, 65∼70℃에서 4시간 동안 교반한다.

반응 종료후, 냉각하고, 수산화나트륨 수용액으로 중화한다. 이렇게 하여 얻어진 겔을 여과분리하고 0.01M 인산완충식염액으로 충분히 세정하여 가교 황산 덱스트란을 얻는다.

[실시예 1]

제조예 1에서 얻어진 셀룰로스 황산염겔을 컬럼(25mmφ×400mm) 내에 충진하고, 컬럼을 통하여 증류수 1,400ml를 통과시킨다.

충전된 컬럼을 0.14M 염화 나트륨을 함유하는 0.01M인산 완충역 용액으로 평형화한다.

그리고, 상기한 바와 같이 병아리 배아 세포에서 채취하여 불활성 처리하여 얻은 불활성 광견병 바이러스 함유용액 2,900ml를 컬을 통하여, 500ml/분의 비율로 통과시킨다.

바이러스 함유 용액을 통과시킨 후에, 0.14M 염화나트륨을 함유하는 0.01M 인산완충 용액으로 충분히 컬럼을 세정한다.

그리고, 1.0M염화나트륨(비전도도 87.6mS/cm, pH 7.3)을 함유하는 0.01M 인산완충용액 500ml로 1ml/분의 비율로 흡착된 재료를 용출한다.

원료 용액과 용출용액은 총 EA(Hemagglutinin)가 로 각각의 바이러스 함량에 대하여 결정된다.

또한, 불활성 바이러스 함유 용액이 한외여과와 초고속 원심분리에 의하여 정제되는 종래의 방법에 비하여, 사용된 세포로부터 나오는 오염물의 양에 대하여서도 결정된다.

결과는 표 1에 나타내는데, 원료용액 중에 함유된 바이러스는 본 발명에 의하여 거의 회수되고, 본 발명 방법에 의한 정제도는 단백질 오염물의 양에 관한 점으로 보아 거의 종래의 방법에 비하여 2배에 가까운 것이 증명된다.

[실시예 2]

컬럼을 통하여 불활성 광견병 바이러스함유 용액 4,200ml를 통과시키고 1.5M NaCl(비전도도 120mS/cm, pH 7.2)을 함유하는 0.01M 인산 완충용액으로 흡착재료를 용출하는 것을 제외하고는, 제조예 2에서 얻어진 셀룰로스 겔을 사용하여, 실시예 1과 같은 방법으로 수행되었다.

그 결과를 표 2에 나타낸다.

[표 2]

배양된 병아리 배아 세포(불활성화 되기전의 용액)에서 방금 채취하 용액이 3,000ml의 양이 사용되는 것을 제외하고는, 가교 황산 덱스트란 겔을 사용하여, 실시예 1과 같은 유사한 방법으로 수행되었다.

바이러스함량과 단백질오염물의 양은 실시계 1에서와 같은 방법으로 결정되고, 그 결과는 표 3에 나타낸다.

[표 3]

Claims (6)

1. 크로마토그래피용 겔로서, 셀룰로스 또는 가교 다당류의 황산에스테르를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 광견병 바이러스 함유 용액을 거쳐서 되는 것을 특징으로 하는 광견병 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 광견병 바이러스 함유용액은 병아리 배아의 세포 배양을 이용하여 광견병 바이러스를 증식하고, 바이러스를 불활성화 하여서 얻은 용액인 것을 특징으로 하는 광견병 바이러스 정제방법.
3. 제1항에 있어서, 광견병 바이러스 함유 용액은 병아리 배아의 세포배양을 이용하여, 배양된 매체로부터 방금 채취된 용액인 것을 특징으로 하는 광견병 바이러스 정제방법.
4. 제1항에 있어서, 광견병 바이러스 함유 용액은, 쥐 또는 다른 적합한 동물의 뇌에 접종한 광견병 바이러스를 증식하여서 얻은 용액인 것을 특징으로 하는 광견병 바이러스 정제방법.
5. 제1항 내지 제3항중 어느 1항에 있어서, 가교 다당류의 황산 에스테르는 가교황산 셀룰로스, 가교황산 아가로스 및 가교황산 덱스트란으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 광견병 바이러스 정제방법.
6. 제1항 내지 제4항중 어느 1항에 있어서, 셀룰로스의 황산에스테르는 결정성 셀룰로스 또는 결정영역과 비결정 영역을 갖는 셀룰로스의 황산 에스테르인 것을 특징으로 하는 광견병 바이러스 정제방법.