JPH06128296A - ヒトアンチトロンビン−ｉｉｉの調製方法 - Google Patents
ヒトアンチトロンビン−ｉｉｉの調製方法Info
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- JPH06128296A JPH06128296A JP4346918A JP34691892A JPH06128296A JP H06128296 A JPH06128296 A JP H06128296A JP 4346918 A JP4346918 A JP 4346918A JP 34691892 A JP34691892 A JP 34691892A JP H06128296 A JPH06128296 A JP H06128296A
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- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8128—Antithrombin III
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 アルコール含有溶液中に存在するヒトアンチ
トロンビン−III （ＡＴ−III ）の簡便で効果的な精製
方法を提供すること。 【構成】 ３℃〜−１０℃の低温でヒトＡＴ−III を含
むアルコール含有溶液を固相結合ヘパリンに接触させ、
ＡＴ−III をヘパリンに結合させることを特徴とするア
フィニティクロマトグラフィー法によりヒトＡＴ−III
を精製する。 【効果】 ヒトアンチトロンビン−III を容易に効率良
く精製することが可能になる。
トロンビン−III （ＡＴ−III ）の簡便で効果的な精製
方法を提供すること。 【構成】 ３℃〜−１０℃の低温でヒトＡＴ−III を含
むアルコール含有溶液を固相結合ヘパリンに接触させ、
ＡＴ−III をヘパリンに結合させることを特徴とするア
フィニティクロマトグラフィー法によりヒトＡＴ−III
を精製する。 【効果】 ヒトアンチトロンビン−III を容易に効率良
く精製することが可能になる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトアンチトロンビン
−III の調製方法に関する。
−III の調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アンチトロンビン−III （以下、ＡＴ−
III と称する）は、血液凝固を抑制することが知られて
いるα2 −グロブリンである。ＡＴ−III は、本質的に
不可逆性抑制因子として作用する。ＡＴ−III は、凝固
系または線維素溶解系のいずれかの活性化中に血漿中の
セリンプロテアーゼを抑制すると考えられている。ＡＴ
−III は、Xa因子およびトロンビンを抑制する重要な作
用を有している。先天的にＡＴ−III が不全な家系は、
血栓症の発症率が高い。血栓障害を有する患者に対する
ＡＴ−III の投与が試みられている。
III と称する）は、血液凝固を抑制することが知られて
いるα2 −グロブリンである。ＡＴ−III は、本質的に
不可逆性抑制因子として作用する。ＡＴ−III は、凝固
系または線維素溶解系のいずれかの活性化中に血漿中の
セリンプロテアーゼを抑制すると考えられている。ＡＴ
−III は、Xa因子およびトロンビンを抑制する重要な作
用を有している。先天的にＡＴ−III が不全な家系は、
血栓症の発症率が高い。血栓障害を有する患者に対する
ＡＴ−III の投与が試みられている。
【０００３】従来からの技術を用いて、ヒトの血漿およ
び血漿ペーストからＡＴ−III を精製する試みが幾つか
報告されている。しかしながら、これらの方法は多くの
時間を要したり、収率が低かったりした。固相結合リガ
ンド（配位子）として、精製したヘパリンを使用するア
フィニティークロマトグラフィー工程を組み入れること
によって、精製方法が実質的に改良された。
び血漿ペーストからＡＴ−III を精製する試みが幾つか
報告されている。しかしながら、これらの方法は多くの
時間を要したり、収率が低かったりした。固相結合リガ
ンド（配位子）として、精製したヘパリンを使用するア
フィニティークロマトグラフィー工程を組み入れること
によって、精製方法が実質的に改良された。
【０００４】ダムスとワラス（Biochem. Biophys. Res.
Comm.，61 (4); 1147, 1974）は、ヘパリン−セファロ
ースクロマトグラフィーを組み入れた方法により、イヌ
ＡＴ−III を精製した。この方法においては、熱処理に
より線維素を除去した血漿を、８℃で、ヘパリン−セフ
ァロースを含む小カラムを通過させている。しかしなが
ら、溶出プロフィール全体にわたって特異的活性の分布
を測定すると、最終生成物はまだ異質物を含有してい
た。ミラー−アンダーソン等（Thromb. Res.，5:439, 1
974 ）は、ヘパリン−セファロースを使用してヒトＡＴ
−III を精製することを開示している。この方法におい
ては、遠心法により血液細胞を除去した直後に冷凍した
クエン酸塩添加ヒト血漿を、５℃でバッチ式にてヘパリ
ン−セファロースに添加している。その後カラムにこの
ゲル状懸濁液を注入して沈降させ、吸着物質を塩勾配に
より溶出させている。この全工程（イオン交換およびゲ
ルろ過クロマトグラフィーを含む）の収率は３４％であ
った。しかしながらこの方法によっては、クロマトグラ
フィーによる分離が多くなるので、ＡＴ−III の大規模
な産生は困難である。ターラーとシュメール（Br. J. H
aemat.，31:233 ,1975）は、ヘパリン−アガロースクロ
マトグラフィーおよびポリエチレングリコール沈殿を含
む、ヒトおよびウシのＡＴ−III の単離方法を示してい
る。この方法は全て４℃で行われている。クロマトグラ
フィーあるいは沈殿のどちらかを精製工程の第１工程と
することができる。ヴィッケルハウザー等（Vox Sanq.,
36:281, 1979 ）は、血漿またはコーン分画IV−１より
ＡＴ−III を調製する大規模な方法を示している。この
方法は、まずポリエチレングリコール沈殿を行い、次に
ヘパリン−セファロースにバッチ吸着させ、限外濾過に
より除塩した後、最終生成物を低温殺菌するものであ
る。活性による回収率は、血漿からは３２％、コーン分
画IVからは１６％であった。精製工程は全て５℃で行っ
ている。
Comm.，61 (4); 1147, 1974）は、ヘパリン−セファロ
ースクロマトグラフィーを組み入れた方法により、イヌ
ＡＴ−III を精製した。この方法においては、熱処理に
より線維素を除去した血漿を、８℃で、ヘパリン−セフ
ァロースを含む小カラムを通過させている。しかしなが
ら、溶出プロフィール全体にわたって特異的活性の分布
を測定すると、最終生成物はまだ異質物を含有してい
た。ミラー−アンダーソン等（Thromb. Res.，5:439, 1
974 ）は、ヘパリン−セファロースを使用してヒトＡＴ
−III を精製することを開示している。この方法におい
ては、遠心法により血液細胞を除去した直後に冷凍した
クエン酸塩添加ヒト血漿を、５℃でバッチ式にてヘパリ
ン−セファロースに添加している。その後カラムにこの
ゲル状懸濁液を注入して沈降させ、吸着物質を塩勾配に
より溶出させている。この全工程（イオン交換およびゲ
ルろ過クロマトグラフィーを含む）の収率は３４％であ
った。しかしながらこの方法によっては、クロマトグラ
フィーによる分離が多くなるので、ＡＴ−III の大規模
な産生は困難である。ターラーとシュメール（Br. J. H
aemat.，31:233 ,1975）は、ヘパリン−アガロースクロ
マトグラフィーおよびポリエチレングリコール沈殿を含
む、ヒトおよびウシのＡＴ−III の単離方法を示してい
る。この方法は全て４℃で行われている。クロマトグラ
フィーあるいは沈殿のどちらかを精製工程の第１工程と
することができる。ヴィッケルハウザー等（Vox Sanq.,
36:281, 1979 ）は、血漿またはコーン分画IV−１より
ＡＴ−III を調製する大規模な方法を示している。この
方法は、まずポリエチレングリコール沈殿を行い、次に
ヘパリン−セファロースにバッチ吸着させ、限外濾過に
より除塩した後、最終生成物を低温殺菌するものであ
る。活性による回収率は、血漿からは３２％、コーン分
画IVからは１６％であった。精製工程は全て５℃で行っ
ている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エタ
ノール含有溶液中に存在するヒトＡＴ−III の簡便で効
果的な精製方法を提供することにある。また本発明の目
的は、固定化ヘパリンをリガンドとして用いるＡＴ−II
I 精製方法を、ＡＴ−III を含有するエタノール溶液に
応用することにある。さらにまた本発明の目的は、精製
したＡＴ−III をコーン分画法による上清II＋III から
得ることにある。
ノール含有溶液中に存在するヒトＡＴ−III の簡便で効
果的な精製方法を提供することにある。また本発明の目
的は、固定化ヘパリンをリガンドとして用いるＡＴ−II
I 精製方法を、ＡＴ−III を含有するエタノール溶液に
応用することにある。さらにまた本発明の目的は、精製
したＡＴ−III をコーン分画法による上清II＋III から
得ることにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記およびその他の目的
は、エタノール含有ヒト血漿上清のようなＡＴ−IIIを
含むアルコール含有溶液をヘパリンアフィニティーゲル
マトリックスに４℃以下の温度で接触させる方法を提供
することにより達成されたものであり、好ましくは上記
温度を０℃以下とするものである。即ち、本発明は、下
記（１）および（２）に関する。 （１）以下の工程よりなるヒトアンチトロンビン−III
の調製方法。 (a) ヒトアンチトロンビン−III を含むヒト血漿のアル
コール含有溶液を得、(b) ３℃〜−１０℃で上記アルコ
ール含有溶液を固相結合ヘパリンに接触させて混合物を
形成し、アンチトロンビン−III を上記ヘパリンに結合
させ、(c) 上記固相結合ヘパリンを上記溶液から分離
し、(d) 上記固相結合ヘパリンから前記ヒトアンチトロ
ンビン−III を溶出して、アンチトロンビン−III 溶液
を得る。 （２）以下の工程よりなる、ヒトアンチトロンビン−II
I およびそれ以外の蛋白質を含むアルコール含有溶液の
精製方法。 (a) ３℃〜−１０℃で上記アルコール含有溶液を固相結
合ヘパリンに接触させて混合物を形成し、アンチトロン
ビン−III を上記ヘパリンに結合させ、(b) 上記固相結
合ヘパリンを上記溶液から分離し、(c) 上記ヒトアンチ
トロンビン−III を上記固相結合ヘパリンから溶出し
て、精製アンチトロンビン−III 溶液を得る。
は、エタノール含有ヒト血漿上清のようなＡＴ−IIIを
含むアルコール含有溶液をヘパリンアフィニティーゲル
マトリックスに４℃以下の温度で接触させる方法を提供
することにより達成されたものであり、好ましくは上記
温度を０℃以下とするものである。即ち、本発明は、下
記（１）および（２）に関する。 （１）以下の工程よりなるヒトアンチトロンビン−III
の調製方法。 (a) ヒトアンチトロンビン−III を含むヒト血漿のアル
コール含有溶液を得、(b) ３℃〜−１０℃で上記アルコ
ール含有溶液を固相結合ヘパリンに接触させて混合物を
形成し、アンチトロンビン−III を上記ヘパリンに結合
させ、(c) 上記固相結合ヘパリンを上記溶液から分離
し、(d) 上記固相結合ヘパリンから前記ヒトアンチトロ
ンビン−III を溶出して、アンチトロンビン−III 溶液
を得る。 （２）以下の工程よりなる、ヒトアンチトロンビン−II
I およびそれ以外の蛋白質を含むアルコール含有溶液の
精製方法。 (a) ３℃〜−１０℃で上記アルコール含有溶液を固相結
合ヘパリンに接触させて混合物を形成し、アンチトロン
ビン−III を上記ヘパリンに結合させ、(b) 上記固相結
合ヘパリンを上記溶液から分離し、(c) 上記ヒトアンチ
トロンビン−III を上記固相結合ヘパリンから溶出し
て、精製アンチトロンビン−III 溶液を得る。
【０００７】アルコールを含有するヒト血漿分画が、本
発明で使用する出発原料として好適なものである。例え
ば、コーン分画法による上清II＋III 、あるいは上清
Ｉ、クエン酸含有血漿から血液凝固第VIII因子を回収し
た後の残渣画分等が例示される。なかでも、コーン分画
法による上清II＋III が好ましい。コーン分画法による
上清II＋III は、約２０％のエタノールを含有してい
る。
発明で使用する出発原料として好適なものである。例え
ば、コーン分画法による上清II＋III 、あるいは上清
Ｉ、クエン酸含有血漿から血液凝固第VIII因子を回収し
た後の残渣画分等が例示される。なかでも、コーン分画
法による上清II＋III が好ましい。コーン分画法による
上清II＋III は、約２０％のエタノールを含有してい
る。
【０００８】上記ヘパリンは、例えば多糖類、シリカゲ
ルまたは線維よりなる不溶性の固体支持体に結合した単
量体ヘパリンである。このような固体支持体の例として
は、寒天、アガロース、架橋アガロース、セルロース、
シリカ、ナイロンおよびその他当該分野で公知のものが
挙げられる。
ルまたは線維よりなる不溶性の固体支持体に結合した単
量体ヘパリンである。このような固体支持体の例として
は、寒天、アガロース、架橋アガロース、セルロース、
シリカ、ナイロンおよびその他当該分野で公知のものが
挙げられる。
【０００９】本発明のヒトＡＴ−III の精製方法におい
ては、アルコール含有血漿分画をヘパリンゲルマトリッ
クスに、約３℃〜約−１０℃、好ましくは０℃以下、よ
り好ましくは０〜−６℃、さらに好ましくは約−６℃で
接触させる。上記精製をバッチ方式で行うと、遠心法の
ような従来の方法によりリガンド結合ＡＴ−III を上清
II＋III とゲルマトリックスとの混合物から分離するこ
とができる。
ては、アルコール含有血漿分画をヘパリンゲルマトリッ
クスに、約３℃〜約−１０℃、好ましくは０℃以下、よ
り好ましくは０〜−６℃、さらに好ましくは約−６℃で
接触させる。上記精製をバッチ方式で行うと、遠心法の
ような従来の方法によりリガンド結合ＡＴ−III を上清
II＋III とゲルマトリックスとの混合物から分離するこ
とができる。
【００１０】ＡＴ−III は、０．１〜１Ｍ ＮａＣｌ等
で洗浄した後に、特に好ましくは段階的に塩濃度を上げ
て洗浄操作を繰り返した後に、例えば２ＭのＮａＣｌ等
の高塩濃度緩衝液に接触させる等の、従来の方法によ
り、ヘパリン−ゲルマトリックスから溶出される。
で洗浄した後に、特に好ましくは段階的に塩濃度を上げ
て洗浄操作を繰り返した後に、例えば２ＭのＮａＣｌ等
の高塩濃度緩衝液に接触させる等の、従来の方法によ
り、ヘパリン−ゲルマトリックスから溶出される。
【００１１】精製したＡＴ−III 溶液には、例えばｐＨ
約７〜８の約０．２Ｍ〜約０．６Ｍクエン酸緩衝液中で
約１０時間、約６０℃の熱処理、または、デタージェン
トに約２０℃〜約４０℃で約３０分〜約１０時間接触さ
せ、その後クロマトグラフィーのような従来の方法によ
り上記デタージェントを除去するデタージェント処理を
施して、存在するウィルスを不活性化することができ
る。例えば、ホロウィッツ等（Transfusion, 25 (6):51
6, 1985 ）は、トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮ
ＢＰ）またはトウィーン８０等のデタージェントを用い
てウィルスを不活性化することを開示している。
約７〜８の約０．２Ｍ〜約０．６Ｍクエン酸緩衝液中で
約１０時間、約６０℃の熱処理、または、デタージェン
トに約２０℃〜約４０℃で約３０分〜約１０時間接触さ
せ、その後クロマトグラフィーのような従来の方法によ
り上記デタージェントを除去するデタージェント処理を
施して、存在するウィルスを不活性化することができ
る。例えば、ホロウィッツ等（Transfusion, 25 (6):51
6, 1985 ）は、トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮ
ＢＰ）またはトウィーン８０等のデタージェントを用い
てウィルスを不活性化することを開示している。
【００１２】一実施態様においては、コーン分画法によ
る上清II＋III をヘパリン−セファロース（Pharmacia
社製 )や heparin- Actigel Superflow (Sterogene社
製) 等の固相結合ヘパリンとバッチ吸着法で混合し、こ
の懸濁液を３℃以下、好ましくは０〜−６℃の低温で保
温する。固相ヘパリンを血漿分画に接触させる前に、例
えば本発明で使用するのに好適なアルコールおよび濃度
である２０％エタノール溶液等のアルコール含有溶液で
ヘパリン−セファロースを洗浄する。他に洗浄溶液とし
ては、２５％エタノール溶液が好適である。その後上記
ヘパリン−セファロースを液相から分離する。別の実施
態様では、ヘパリン−固相マトリックスをカラムに充填
し、血漿アルコール分画を上記カラムに通す。ここで
も、固相ヘパリンを、カラム充填前後に例えば２０〜２
５％のエタノール溶液等のアルコール含有溶液で洗浄す
る。コーン分画法による上清II＋III を４℃以下の低温
で処理すると、４℃以上のアルコール存在下では変性し
てしまうアルブミン、ハプトグロビン、α−１プロテア
ーゼ抑制剤、ＩｇＡ等の、他の重要な蛋白質が影響を受
けない。また、上記アルコールは、分離工程で適用され
る低温下で固相が凍結するのを防止するのに有用であ
る。さらに疎水性クロマトグラフィー処理、陰イオン交
換体処理等を施すことにより、他の血漿蛋白、パイロジ
ェン、熱変性蛋白等の夾雑物質を除き、高純度のＡＴ−
III を精製、回収することができる（特開平１−２７５
６００号公報、特開平２−４７１７号公報）。
る上清II＋III をヘパリン−セファロース（Pharmacia
社製 )や heparin- Actigel Superflow (Sterogene社
製) 等の固相結合ヘパリンとバッチ吸着法で混合し、こ
の懸濁液を３℃以下、好ましくは０〜−６℃の低温で保
温する。固相ヘパリンを血漿分画に接触させる前に、例
えば本発明で使用するのに好適なアルコールおよび濃度
である２０％エタノール溶液等のアルコール含有溶液で
ヘパリン−セファロースを洗浄する。他に洗浄溶液とし
ては、２５％エタノール溶液が好適である。その後上記
ヘパリン−セファロースを液相から分離する。別の実施
態様では、ヘパリン−固相マトリックスをカラムに充填
し、血漿アルコール分画を上記カラムに通す。ここで
も、固相ヘパリンを、カラム充填前後に例えば２０〜２
５％のエタノール溶液等のアルコール含有溶液で洗浄す
る。コーン分画法による上清II＋III を４℃以下の低温
で処理すると、４℃以上のアルコール存在下では変性し
てしまうアルブミン、ハプトグロビン、α−１プロテア
ーゼ抑制剤、ＩｇＡ等の、他の重要な蛋白質が影響を受
けない。また、上記アルコールは、分離工程で適用され
る低温下で固相が凍結するのを防止するのに有用であ
る。さらに疎水性クロマトグラフィー処理、陰イオン交
換体処理等を施すことにより、他の血漿蛋白、パイロジ
ェン、熱変性蛋白等の夾雑物質を除き、高純度のＡＴ−
III を精製、回収することができる（特開平１−２７５
６００号公報、特開平２−４７１７号公報）。
【００１３】
【実施例】本発明を以下の実施例により詳述するが、本
発明はこれら実施例によって限定されるものではない。 実施例１ コーン等の開示（J. Am. Chem. Soc., 72, 465(1950)）
に従って、−４℃〜−６℃でヒト血漿よりコーン分画法
による上清II＋III を得た。Heparin-ActigelSuperflow
(Sterogene社製) を、−４℃〜−６℃で２０％エタノ
ール溶液で洗浄し、−６℃で１００mlのカラムに充填し
た。その後、コーン分画法による上清II＋III １５００
mlを上記カラムに通した。上記操作の後、２０％エタノ
ール５０mlでカラムを洗浄した。この洗浄分画を、コー
ンのアルブミンを得る方法により処理した。上記カラム
を、０．３ＭのＮａＣｌ溶液で洗浄して、非特異的結合
蛋白質を除去した。２ＭのＮａＣｌ溶液でＡＴ−III を
溶出させた。上記ＡＴ−III を、限外濾過（Filtron, O
mega,10K)により濃縮した。ウィルス不活性化処理とし
ては、１v/v%のトウィーン８０および０．３v/v%のＴＮ
ＢＰを上記濃縮ＡＴ−III 溶液に添加し、３０℃で６時
間保温した。上記デタージェントは、イオン交換クロマ
トグラフィー（DEAE-Sephadex またはヘパリンアフィニ
ティークロマトグラフィー）により除去した。上記ＡＴ
−III 溶液(50 u/ml) を、無菌条件下で凍結乾燥した。
発明はこれら実施例によって限定されるものではない。 実施例１ コーン等の開示（J. Am. Chem. Soc., 72, 465(1950)）
に従って、−４℃〜−６℃でヒト血漿よりコーン分画法
による上清II＋III を得た。Heparin-ActigelSuperflow
(Sterogene社製) を、−４℃〜−６℃で２０％エタノ
ール溶液で洗浄し、−６℃で１００mlのカラムに充填し
た。その後、コーン分画法による上清II＋III １５００
mlを上記カラムに通した。上記操作の後、２０％エタノ
ール５０mlでカラムを洗浄した。この洗浄分画を、コー
ンのアルブミンを得る方法により処理した。上記カラム
を、０．３ＭのＮａＣｌ溶液で洗浄して、非特異的結合
蛋白質を除去した。２ＭのＮａＣｌ溶液でＡＴ−III を
溶出させた。上記ＡＴ−III を、限外濾過（Filtron, O
mega,10K)により濃縮した。ウィルス不活性化処理とし
ては、１v/v%のトウィーン８０および０．３v/v%のＴＮ
ＢＰを上記濃縮ＡＴ−III 溶液に添加し、３０℃で６時
間保温した。上記デタージェントは、イオン交換クロマ
トグラフィー（DEAE-Sephadex またはヘパリンアフィニ
ティークロマトグラフィー）により除去した。上記ＡＴ
−III 溶液(50 u/ml) を、無菌条件下で凍結乾燥した。
【００１４】コーン分画法による上清II＋III からのＡ
Ｔ−III 収率は６０％であり、アルブミン、グロブリ
ン、トランスフェリンおよびその他の夾雑蛋白質は、セ
ルロース・アセテート膜（Jowkin, M.等，PNAS, USA 7
6, 4350(1978)）およびポリアクリルアミド（Laemmli,
U.K. 等，Nature, 227, 680 (1970) ）での電気泳動に
よって検知されなかった。
Ｔ−III 収率は６０％であり、アルブミン、グロブリ
ン、トランスフェリンおよびその他の夾雑蛋白質は、セ
ルロース・アセテート膜（Jowkin, M.等，PNAS, USA 7
6, 4350(1978)）およびポリアクリルアミド（Laemmli,
U.K. 等，Nature, 227, 680 (1970) ）での電気泳動に
よって検知されなかった。
【００１５】実施例２ −６℃で２０％エタノールで洗浄しておいたヘパリン−
セファロース(Pharma-cia 社製 )２００mlに、コーン分
画法による上清II＋III ２リットルを−４℃で混合し、
この混合液を−４℃で６０分間攪拌した。上記ヘパリン
−セファロースを濾過して収集し、−４℃の２０％エタ
ノール１００mlに続いて−４℃の０．３ＭのＮａＣｌ
５００mlで洗浄した。ＡＴ−III を実施例１と同様にし
て溶出した。ウイルス不活性化処理として、０．５Ｍク
エン酸ナトリウムを、限外濾過により濃縮したＡＴ−II
I 溶液に添加した。上記溶液をｐＨ７．５に調整した
後、１０時間６０℃に加熱した。上記熱処理の後、限外
濾過によりクエン酸ナトリウムを除去した。上記ＡＴ−
III 溶液(50 u/ml) を、無菌条件下で凍結乾燥した。
セファロース(Pharma-cia 社製 )２００mlに、コーン分
画法による上清II＋III ２リットルを−４℃で混合し、
この混合液を−４℃で６０分間攪拌した。上記ヘパリン
−セファロースを濾過して収集し、−４℃の２０％エタ
ノール１００mlに続いて−４℃の０．３ＭのＮａＣｌ
５００mlで洗浄した。ＡＴ−III を実施例１と同様にし
て溶出した。ウイルス不活性化処理として、０．５Ｍク
エン酸ナトリウムを、限外濾過により濃縮したＡＴ−II
I 溶液に添加した。上記溶液をｐＨ７．５に調整した
後、１０時間６０℃に加熱した。上記熱処理の後、限外
濾過によりクエン酸ナトリウムを除去した。上記ＡＴ−
III 溶液(50 u/ml) を、無菌条件下で凍結乾燥した。
【００１６】コーン分画法による上清II＋III からのＡ
Ｔ−III 収率は、ヘパリン処理後では７０％で、熱処理
後では５５％であった。アルブミン、グロブリン、トラ
ンスフェリンおよびその他の夾雑蛋白質は、電気泳動に
よって検知されなかった。
Ｔ−III 収率は、ヘパリン処理後では７０％で、熱処理
後では５５％であった。アルブミン、グロブリン、トラ
ンスフェリンおよびその他の夾雑蛋白質は、電気泳動に
よって検知されなかった。
【００１７】実施例３ ヘパリン−セファロース処理における洗浄を０．７Ｍ
ＮａＣｌで行う以外は実施例２に準じた。６０℃、１０
時間の加熱処理後に、塩化ナトリウム（最終濃度３Ｍ）
及びクエン酸ナトリウム（最終濃度２０ｍＭ）を添加
し、ｐＨ７．５に調整した。一方、３Ｍ塩化ナトリウム
含有２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
で平衡化したブチル型ポリビニル系担体（ブチル−トヨ
パール６５０、東洋曹達（株）製）にアンチトロンビン
−III 含有水溶液を接触させたのちに上記緩衝液で展開
し、未吸着画分を回収した。続いて、０．９％塩化ナト
リウム溶液に対して一夜透析を行いつつ濃縮してアンチ
トロンビン−III の１（ｗ／ｖ）％水溶液を得、必要に
応じて、濾過又は遠心分離を行って澄明な液とした。こ
のアンチトロンビン−III の１（ｗ／ｖ）％水溶液にマ
ンニトール２（ｗ／ｖ）％とクエン酸ナトリウム０．２
（ｗ／ｖ）％を加え、塩化ナトリウムが０．５％になる
ように少量の冷蒸留水希釈し、１Ｎの水酸化ナトリウム
でｐＨ７．６に調整した後、滅菌したミリポアフィルタ
ーで除菌濾過し、５００単位ずつ分注し、凍結乾燥を行
って乾燥製剤とした。
ＮａＣｌで行う以外は実施例２に準じた。６０℃、１０
時間の加熱処理後に、塩化ナトリウム（最終濃度３Ｍ）
及びクエン酸ナトリウム（最終濃度２０ｍＭ）を添加
し、ｐＨ７．５に調整した。一方、３Ｍ塩化ナトリウム
含有２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
で平衡化したブチル型ポリビニル系担体（ブチル−トヨ
パール６５０、東洋曹達（株）製）にアンチトロンビン
−III 含有水溶液を接触させたのちに上記緩衝液で展開
し、未吸着画分を回収した。続いて、０．９％塩化ナト
リウム溶液に対して一夜透析を行いつつ濃縮してアンチ
トロンビン−III の１（ｗ／ｖ）％水溶液を得、必要に
応じて、濾過又は遠心分離を行って澄明な液とした。こ
のアンチトロンビン−III の１（ｗ／ｖ）％水溶液にマ
ンニトール２（ｗ／ｖ）％とクエン酸ナトリウム０．２
（ｗ／ｖ）％を加え、塩化ナトリウムが０．５％になる
ように少量の冷蒸留水希釈し、１Ｎの水酸化ナトリウム
でｐＨ７．６に調整した後、滅菌したミリポアフィルタ
ーで除菌濾過し、５００単位ずつ分注し、凍結乾燥を行
って乾燥製剤とした。
【００１８】本発明を、その精神から逸脱することなく
変更できることは、当業者にとって明白であろう。前記
特許請求の範囲の精神および範囲を逸脱しない変更態様
は、それらと同等であると考えられる。
変更できることは、当業者にとって明白であろう。前記
特許請求の範囲の精神および範囲を逸脱しない変更態様
は、それらと同等であると考えられる。
フロントページの続き (72)発明者 スワライ カウール アメリカ合衆国、91763 カリフォルニア 州、モンクレール、ヴァーモン アヴェニ ュー 10395 (72)発明者 プラビール バッチャーイーア アメリカ合衆国、91789 カリフォルニア 州、ウォールナット、ミュルフィールド レーン 300 (72)発明者 大水 章正 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 板垣 好雄 大阪市都島区都島中通３丁目５番44号 株 式会社ミドリ十字都島工場内
Claims (23)
- 【請求項１】 以下の工程よりなるヒトアンチトロンビ
ン−III の調製方法。(a) ヒトアンチトロンビン−III
を含むヒト血漿のアルコール含有溶液を得、(b) ３℃〜
−１０℃で上記アルコール含有溶液を固相結合ヘパリン
に接触させて混合物を形成し、アンチトロンビン−III
を上記ヘパリンに結合させ、(c) 上記固相結合ヘパリン
を上記溶液から分離し、(d) 上記固相結合ヘパリンから
前記ヒトアンチトロンビン−III を溶出して、アンチト
ロンビン−III 溶液を得る。 - 【請求項２】 上記アンチトロンビン−III 溶液にウイ
ルス不活性化処理を施す請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 上記ウイルス不活性化処理が熱処理であ
る請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 上記ウイルス不活性化処理がデタージェ
ント処理である請求項２記載の方法。 - 【請求項５】 上記ヒト血漿のアルコール含有溶液がコ
ーン分画法による上清II＋III である請求項１記載の方
法。 - 【請求項６】 上記接触工程(b) を０℃以下で行う請求
項１記載の方法。 - 【請求項７】 上記接触工程(b) を０〜−６℃で行う請
求項１記載の方法。 - 【請求項８】 上記接触工程(b) を約−６℃で行う請求
項１記載の方法。 - 【請求項９】 上記ヒト血漿のアルコール含有溶液がエ
タノールを含有する請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 以下の工程よりなる、ヒトアンチトロ
ンビン−III およびそれ以外の蛋白質を含むアルコール
含有溶液の精製方法。(a) ３℃〜−１０℃で上記アルコ
ール含有溶液を固相結合ヘパリンに接触させて混合物を
形成し、アンチトロンビン−III を上記ヘパリンに結合
させ、(b) 上記固相結合ヘパリンを上記溶液から分離
し、(c) 上記ヒトアンチトロンビン−III を上記固相結
合ヘパリンから溶出して、精製アンチトロンビン−III
溶液を得る。 - 【請求項１１】 上記アルコールがエタノールである請
求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 上記アルコール含有溶液がコーン分画
法による上清II＋III である請求項１０記載の方法。 - 【請求項１３】 上記接触工程(a) を０℃以下で行う請
求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 上記接触工程(a) を０〜−６℃で行う
請求項１２記載の方法。 - 【請求項１５】 上記接触工程(a) を約−６℃で行う請
求項１２記載の方法。 - 【請求項１６】 上記接触工程(a) 以前に上記固相結合
ヘパリンをアルコール含有溶液で洗浄する請求項１２記
載の方法。 - 【請求項１７】 上記洗浄を２０〜２５％のエタノール
水溶液を用いて行う請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 上記アンチトロンビン−III 溶液にウ
イルス不活性化処理を施す請求項１２記載の方法。 - 【請求項１９】 上記ウイルス不活性化処理が熱処理ま
たはデタージェント処理よりなる請求項１８記載の方
法。 - 【請求項２０】 請求項１２記載の方法により得られる
精製ヒトアンチトロンビン−III 溶液。 - 【請求項２１】 請求項５記載の方法により得られるヒ
トアンチトロンビン−III の溶液。 - 【請求項２２】 工程(d) において、固相結合ヘパリン
を０．１〜１Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後に、
固相結合ヘパリンからヒトアンチトロンビン−III を溶
出する請求項１記載の方法。 - 【請求項２３】 工程(c) において、固相結合ヘパリン
を０．１〜１Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後に、
固相結合ヘパリンからヒトアンチトロンビン−III を溶
出する請求項１０記載の方法。
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| US07/818831 | 1992-01-10 | ||
| US07/818,831 US5319072A (en) | 1992-01-10 | 1992-01-10 | Human antithrombin-III preparation |
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|---|---|
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|---|---|
| US (1) | US5319072A (ja) |
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| JP (1) | JP3471379B2 (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994022471A1 (en) * | 1993-04-05 | 1994-10-13 | The Green Cross Corporation | Liquid antithrombin iii preparation and method of stabilizing the same |
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|---|---|---|---|---|
| JP3494667B2 (ja) * | 1992-10-02 | 2004-02-09 | アベンティス ファーマ株式会社 | アンチトロンビンｉｉｉ製剤 |
| US5610285A (en) * | 1994-08-24 | 1997-03-11 | Bayer Corporation | Purification of α-1 proteinase inhibitor using novel chromatographic separation conditions |
| US5767108A (en) * | 1995-08-22 | 1998-06-16 | Medtronic, Inc. | Method for making improved heparinized biomaterials |
| US7045585B2 (en) * | 1995-11-30 | 2006-05-16 | Hamilton Civic Hospital Research Development Inc. | Methods of coating a device using anti-thrombin heparin |
| US6562781B1 (en) * | 1995-11-30 | 2003-05-13 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates |
| US6491965B1 (en) * | 1995-11-30 | 2002-12-10 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Medical device comprising glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates |
| AT405739B (de) * | 1997-09-19 | 1999-11-25 | Immuno Ag | Verfahren zur reinigung von antithrombin iii |
| US6245741B1 (en) | 1998-05-19 | 2001-06-12 | Washington University | Protein Z-dependent protease inhibitor |
| EP1117428B1 (en) | 1998-10-08 | 2003-09-24 | Children's Hospital | Compositions and their use for inhibiting angiogenesis |
| US6462180B1 (en) | 1999-11-24 | 2002-10-08 | Bayer Corporation | Method of preparing α-1 proteinase inhibitor |
| EP2522354B1 (en) * | 2011-05-12 | 2017-08-23 | CSL Behring GmbH | Methods to reduce adverse events caused by pharmaceutical preparations comprising plasma derived proteins |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4632981A (en) * | 1982-07-30 | 1986-12-30 | Genentech, Inc. | Human antithrombin III |
| JPS6048930A (ja) * | 1983-08-24 | 1985-03-16 | Nippon Sekijiyuujishiya | アンチトロンビン３の精製法 |
| US5066788A (en) * | 1984-09-21 | 1991-11-19 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Blood coagulation inhibiting proteins, processes for preparing them and their uses |
| US4656254A (en) * | 1985-12-02 | 1987-04-07 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor and antithrombin III |
| CA1341379C (en) * | 1988-04-28 | 2002-07-23 | Welfide Corporation | Purified antithrombin-iii and methods of producing the same |
| US5138034A (en) * | 1989-07-12 | 1992-08-11 | The Green Cross Corporation | Method of fractionating plasma proteins |
-
1992
- 1992-01-10 US US07/818,831 patent/US5319072A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-21 CA CA002085953A patent/CA2085953C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-25 JP JP34691892A patent/JP3471379B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-01-05 EP EP9393100056A patent/EP0551084A3/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994022471A1 (en) * | 1993-04-05 | 1994-10-13 | The Green Cross Corporation | Liquid antithrombin iii preparation and method of stabilizing the same |
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|---|---|
| EP0551084A3 (en) | 1994-09-28 |
| CA2085953A1 (en) | 1993-07-11 |
| US5319072A (en) | 1994-06-07 |
| EP0551084A2 (en) | 1993-07-14 |
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| CA2085953C (en) | 2002-02-19 |
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