JPH02113893A - 凝固因子２、７、９およびｘの１または２以上を濃縮する方法 - Google Patents
凝固因子２、７、９およびｘの１または２以上を濃縮する方法Info
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- JPH02113893A JPH02113893A JP1201463A JP20146389A JPH02113893A JP H02113893 A JPH02113893 A JP H02113893A JP 1201463 A JP1201463 A JP 1201463A JP 20146389 A JP20146389 A JP 20146389A JP H02113893 A JPH02113893 A JP H02113893A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、凝固因子■、■、■およびＸをα−ヒドロキ
シルアミン基を担持するマトリックス上に吸着させ、そ
して前記因子を溶離して、より高い比活性を有する調製
物を得る、血漿または他の分画から得られる調製物中の
凝固因子■、■、■およびＸを濃縮する方法に関する。
シルアミン基を担持するマトリックス上に吸着させ、そ
して前記因子を溶離して、より高い比活性を有する調製
物を得る、血漿または他の分画から得られる調製物中の
凝固因子■、■、■およびＸを濃縮する方法に関する。
（従来の技術並び発明が解決しようとする課題）血友病
Ａの次に、血友病Ｂは最も普通の遺伝性血液凝固障害で
ある。血友病Ｂの患者は凝固のために必須である因子■
を欠く。しかしながら、この状態は因子■を含有する調
製物で置換することによって処置することができる。凝
固因子■、■、■およびＸついての応用の他の分野は、
遺伝の血液凝固障害、例えばポリツラウマチゼイション
（ｐｏｌｙｔｒａｕＩＩａｔｌｚａｔｉｏｎ）または肝
臓病を伴うビタミンに依存因子の欠乏に引き続く、散在
性脈管向凝固である。
Ａの次に、血友病Ｂは最も普通の遺伝性血液凝固障害で
ある。血友病Ｂの患者は凝固のために必須である因子■
を欠く。しかしながら、この状態は因子■を含有する調
製物で置換することによって処置することができる。凝
固因子■、■、■およびＸついての応用の他の分野は、
遺伝の血液凝固障害、例えばポリツラウマチゼイション
（ｐｏｌｙｔｒａｕＩＩａｔｌｚａｔｉｏｎ）または肝
臓病を伴うビタミンに依存因子の欠乏に引き続く、散在
性脈管向凝固である。
１９５４年まで、因子■の欠乏を処置する唯一の利用可
能な手段は新鮮な凍結した血漿であった。
能な手段は新鮮な凍結した血漿であった。
後になされた試みは、硫酸バリウム上に（Ａｇｇｅｌｅ
ｒ 、 Ｐ、Ｍ、ｅｔ ａｌ、 、 Ｔｒａｎｓ、 ８
ｔｈ ＣｏｎｇｒｅｓｓＩｎｔｅｒｎａｔ、 Ｓｏｃ、
Ｈｅｍａｔｏｌ、 、 ＮＹ、 Ｇｒｕｎｅ ＆ ５
ｔｒａｔｔｏｎ、 １９Ｈ，４９０−４９７）またはリ
ン酸三カルシウム（Ｊａｎｌａｋおよび５ｏｕｌｉｅｒ
、 Ｔｈｒｏｍｂ、 ｅｔ Ｄｉａｔｈ、 ｌ１ａｅ
Ｉａｏｒｒｈ、８［１９６２］、 ４０Ｂ−４２４）を
吸着させることにより因子■を濃縮することであった。
ｒ 、 Ｐ、Ｍ、ｅｔ ａｌ、 、 Ｔｒａｎｓ、 ８
ｔｈ ＣｏｎｇｒｅｓｓＩｎｔｅｒｎａｔ、 Ｓｏｃ、
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ｔｒａｔｔｏｎ、 １９Ｈ，４９０−４９７）またはリ
ン酸三カルシウム（Ｊａｎｌａｋおよび５ｏｕｌｉｅｒ
、 Ｔｈｒｏｍｂ、 ｅｔ Ｄｉａｔｈ、 ｌ１ａｅ
Ｉａｏｒｒｈ、８［１９６２］、 ４０Ｂ−４２４）を
吸着させることにより因子■を濃縮することであった。
鉱物、例えば、リン酸カルシウム、硫酸バリウム、水酸
化アルミニウム、およびヒドロキシアパタイト上への因
子■の吸ごは、年が経つにつれてさらに最適化され、そ
して、例えば、欧州特許筒５６６２９号に記載されてい
る。因子■について引用されている比活性は、タンパク
質の１ ｍｇにつき２，５ｖである。同一調製物は、タ
ンパク質の１ ｍｇにつき２．ＯＵの因子■、１．ＯＵ
の因子■、および２．５Ｕの因子Ｘを含有した。凝固因
子■、■、■およびＸは、また、ＰＰ５Ｂ複合体である
。
化アルミニウム、およびヒドロキシアパタイト上への因
子■の吸ごは、年が経つにつれてさらに最適化され、そ
して、例えば、欧州特許筒５６６２９号に記載されてい
る。因子■について引用されている比活性は、タンパク
質の１ ｍｇにつき２，５ｖである。同一調製物は、タ
ンパク質の１ ｍｇにつき２．ＯＵの因子■、１．ＯＵ
の因子■、および２．５Ｕの因子Ｘを含有した。凝固因
子■、■、■およびＸは、また、ＰＰ５Ｂ複合体である
。
ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーは、また、１
９６５年以来（Ｔｕｌｌｌｓ ｅｔ ａｔ、 Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、２７３［１９６５］、 ６６７
−６７４ ）因子■またはＰＰ５Ｂ複合体を分離するた
めに使用されてきている。ＤＥＡＥセファデックス（５
ｅｐｈａｄｅｘ）上への吸着によりＰＰ５Ｂ複合体を分
離する最適化された方法は欧州特許筒４１１７４号に記
載されており、ここで因子■の比活性はタンパク質の１
ｍｇにつき２，２Ｕであり、因子■の高度の不足を伴
う。
９６５年以来（Ｔｕｌｌｌｓ ｅｔ ａｔ、 Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、２７３［１９６５］、 ６６７
−６７４ ）因子■またはＰＰ５Ｂ複合体を分離するた
めに使用されてきている。ＤＥＡＥセファデックス（５
ｅｐｈａｄｅｘ）上への吸着によりＰＰ５Ｂ複合体を分
離する最適化された方法は欧州特許筒４１１７４号に記
載されており、ここで因子■の比活性はタンパク質の１
ｍｇにつき２，２Ｕであり、因子■の高度の不足を伴
う。
因子■の調製物は、現在、変化する比率の凝固因子■、
■、■およびＸとのＰＰ５Ｂ複合体の形態で、あるいは
高度に濃縮された因子■濃縮物の形態で血液凝固障害の
処置に使用されている。
■、■およびＸとのＰＰ５Ｂ複合体の形態で、あるいは
高度に濃縮された因子■濃縮物の形態で血液凝固障害の
処置に使用されている。
すべての４つのＰＰ５Ｂ因子は、因子ＩＸｍ製物中にほ
ぼ同一の比率で存在しなくてはならず、現在の技術水準
において血漿からそれらを吸着することは、すべての因
子についてタンパク質の１ ｔｎｇにつき約１Ｕの比活
性を有する生成物が得られ、費用のかかる多工程の精製
方法用いたときでさえ、それに応じた比率は低い。
ぼ同一の比率で存在しなくてはならず、現在の技術水準
において血漿からそれらを吸着することは、すべての因
子についてタンパク質の１ ｔｎｇにつき約１Ｕの比活
性を有する生成物が得られ、費用のかかる多工程の精製
方法用いたときでさえ、それに応じた比率は低い。
プロトロムブレックス（Ｐｒｏｔｈｏｍｐｌｅｘ） Ｓ
−ＴＩＭ ４ （Ｉｎｕａｕｎｏ）は、最も高度に濃縮
された商業的に入手可能なＰＰ５Ｂ製品であり、因子■
を別に精製し、次いでそれをＰＰ５Ｂ複合体中に混合す
ることによってのみ、すべての４つの因子についてタン
パク質の１ ａ＋ｇにつき１ｕより大きい比活性を提供
することができる。因子■について夕ンバク質の１ ｍ
ｇにつきＩＯＵより大きい比活性を有する高度に濃縮さ
れた因子■濃縮物は、現在の技術水準において、それら
を血漿からいくつかの段階で分画することによって得る
ことができる。例は国際特許出願ｖ０８３１０３７６０
号またはト′イツ国特許第３１０１７５２号に記載され
ている。
−ＴＩＭ ４ （Ｉｎｕａｕｎｏ）は、最も高度に濃縮
された商業的に入手可能なＰＰ５Ｂ製品であり、因子■
を別に精製し、次いでそれをＰＰ５Ｂ複合体中に混合す
ることによってのみ、すべての４つの因子についてタン
パク質の１ ａ＋ｇにつき１ｕより大きい比活性を提供
することができる。因子■について夕ンバク質の１ ｍ
ｇにつきＩＯＵより大きい比活性を有する高度に濃縮さ
れた因子■濃縮物は、現在の技術水準において、それら
を血漿からいくつかの段階で分画することによって得る
ことができる。例は国際特許出願ｖ０８３１０３７６０
号またはト′イツ国特許第３１０１７５２号に記載され
ている。
本発明の目的は、因子■についてタンパク質の１ ｍｇ
につき１Ｕの比活性を有し、そして必要に応じて、はぼ
同一の比率で他のＰＰ５Ｂ因子汀、■およびＸを含有す
る因子■調製物を得る方法を提供することである。
につき１Ｕの比活性を有し、そして必要に応じて、はぼ
同一の比率で他のＰＰ５Ｂ因子汀、■およびＸを含有す
る因子■調製物を得る方法を提供することである。
（課題を解決するための手段並びに作用、効果〕この目
的は、本発明によれば、凝固因子を含量する血漿または
他の分画をα−ヒドロキシルアミン基を担持するマトリ
ックスで処理し、因子■を、必要に応じて因子■、■お
よびＸと一緒に吸着し、適当な緩衝液で洗浄し、そして
因子を溶離することによって達成される。α−ヒドロキ
シルアミン基を担持するマトリックスは、１．７ツモト
ら、Ｊ、ＢＩｏｃｈｅｍ、８７ （１９８０） 、５３
５−５４０から知られている方法により調製することが
できる。
的は、本発明によれば、凝固因子を含量する血漿または
他の分画をα−ヒドロキシルアミン基を担持するマトリ
ックスで処理し、因子■を、必要に応じて因子■、■お
よびＸと一緒に吸着し、適当な緩衝液で洗浄し、そして
因子を溶離することによって達成される。α−ヒドロキ
シルアミン基を担持するマトリックスは、１．７ツモト
ら、Ｊ、ＢＩｏｃｈｅｍ、８７ （１９８０） 、５３
５−５４０から知られている方法により調製することが
できる。
驚くべきことには、溶液のイオン強度に依存して、因子
■または全体のＰＰ５Ｂ複合体は高い収率で急速に結合
し、そして再び高い純度で溶離できることが発見された
。
■または全体のＰＰ５Ｂ複合体は高い収率で急速に結合
し、そして再び高い純度で溶離できることが発見された
。
アルキルアミン基をもつが、α−ヒドロキシルアミン基
をもたないゲルを使用して因子■を精製することは、文
献から知られている（Ｔｈｒ。
をもたないゲルを使用して因子■を精製することは、文
献から知られている（Ｔｈｒ。
ｉｂ、 Ｈａｅｉａｓｔａｓ、［Ｓｔｒｙｔｔｇａｒ
ｔ］４７． ２ ［１９８２コ、１２４−１２７
；欧州特許０１４４９５７号； Ｂｒ１ｔｉｓｈ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｒ ｔｌａｅＩＩｌａｔｏｌｏｔｙ
４３［１９７９］ 、６６９Ｊ７４ ）。
ｔ］４７． ２ ［１９８２コ、１２４−１２７
；欧州特許０１４４９５７号； Ｂｒ１ｔｉｓｈ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｒ ｔｌａｅＩＩｌａｔｏｌｏｔｙ
４３［１９７９］ 、６６９Ｊ７４ ）。
これらのゲルは、また、ＰＰ５Ｂ因子を結合する。
吸着は因子■の場合とほぼ同一の法則に従って起こる。
このような既知のゲル［セファローズ（５ｃｐｈｅｒｏ
ｓｅ ） ］の吸着の挙動は、マトリックスと末端アミ
ン基との間の種々の長さの炭素鎖を有し、α−ヒドロキ
シルアミノプロピル基をもつゲル（α−ヒドロキシルア
ミノプロピルセフ７０−ス）のそれと比較して試験した
。クエン酸処理した血漿の各々の５０ ｍｌを水で１：
３に稀釈し、そして種々のゲルを充填したｌＸ５ｔｙｎ
のカラムのクロマイトグラフィーにかけた。残留する血
漿中の結合しない内容物を、吸着後、決定し、そして表
１に出発血漿の活性のパーセントで記載する。
ｓｅ ） ］の吸着の挙動は、マトリックスと末端アミ
ン基との間の種々の長さの炭素鎖を有し、α−ヒドロキ
シルアミノプロピル基をもつゲル（α−ヒドロキシルア
ミノプロピルセフ７０−ス）のそれと比較して試験した
。クエン酸処理した血漿の各々の５０ ｍｌを水で１：
３に稀釈し、そして種々のゲルを充填したｌＸ５ｔｙｎ
のカラムのクロマイトグラフィーにかけた。残留する血
漿中の結合しない内容物を、吸着後、決定し、そして表
１に出発血漿の活性のパーセントで記載する。
表１
アミノセファ０−スへの吸着後の血漿中のＰＰ５Ｂ因子
の最終含量因子： ■ ■ ■ ＩＸＸ アミノエチルセファロース
９９ ９７ ９３ ９７ ９ｇアミノプロピルセファ
ロース ９４ ９９ ９２
９５ ９６アミノベンチルセフアロース
エ１２２ ７ １０ １６アミノへキシル
セファロース １３４２１
アミノオクチルセフアロース
４２４４３α−ヒドロキシアミノプロピルセファロ
ース（本発明）８２８６３３表１から明らかなように、
α−ヒドロキシルアミン基を欠く純粋なアミノ−アルキ
ル担体上へのこのような吸着のための最適条件は、スペ
ーサーと呼ぶものが６〜８個の炭素原子の長さであると
き起こる。アミノへキシルセファロースを使用するクロ
マトグラフィー後のＰＰ５Ｂ因子の純度は、ＤＥＡＥマ
トリックスのクロマトグラフィー後の比活性に多少匹敵
する。
の最終含量因子： ■ ■ ■ ＩＸＸ アミノエチルセファロース
９９ ９７ ９３ ９７ ９ｇアミノプロピルセファ
ロース ９４ ９９ ９２
９５ ９６アミノベンチルセフアロース
エ１２２ ７ １０ １６アミノへキシル
セファロース １３４２１
アミノオクチルセフアロース
４２４４３α−ヒドロキシアミノプロピルセファロ
ース（本発明）８２８６３３表１から明らかなように、
α−ヒドロキシルアミン基を欠く純粋なアミノ−アルキ
ル担体上へのこのような吸着のための最適条件は、スペ
ーサーと呼ぶものが６〜８個の炭素原子の長さであると
き起こる。アミノへキシルセファロースを使用するクロ
マトグラフィー後のＰＰ５Ｂ因子の純度は、ＤＥＡＥマ
トリックスのクロマトグラフィー後の比活性に多少匹敵
する。
アンモニアを使用する予備的エボキン段階からのアミン
基をもつ担体の調製は、アミン基に加えて、α−抵抗性
ヒドロキシル基を生成する。
基をもつ担体の調製は、アミン基に加えて、α−抵抗性
ヒドロキシル基を生成する。
純粋なアルキルアミンについての前述の結果のｔ二め１
こ、驚くべきこと１こは、α−ヒト′ロキシルアミンの
担体はＰＰ５Ｂ因子に関して完全に異なる挙動を示すこ
とが発見された。
こ、驚くべきこと１こは、α−ヒト′ロキシルアミンの
担体はＰＰ５Ｂ因子に関して完全に異なる挙動を示すこ
とが発見された。
アルキルアミンの担体を使用して起こるものと対照的に
、６〜８個の炭素原子を有するスペーサーはもはや不必
要である。３個の炭素原子を有するスペーサー上のα−
ヒドロキシルアミン基は、ＰＰ５Ｂ因子の強力な吸着に
導くことさえする。
、６〜８個の炭素原子を有するスペーサーはもはや不必
要である。３個の炭素原子を有するスペーサー上のα−
ヒドロキシルアミン基は、ＰＰ５Ｂ因子の強力な吸着に
導くことさえする。
ＰＰ５Ｂ因子は、アルキルアミン担体およびＤＥＡＥア
ニオン交換体を使用して従来可能であったより、本質的
に特異的に吸着され、引き続いて大きい純度で溶離され
る。
ニオン交換体を使用して従来可能であったより、本質的
に特異的に吸着され、引き続いて大きい純度で溶離され
る。
α−ヒドロキシルアミン担体上への吸着は、現在まで最
も頻繁な媒質を構成した、ＤＥＡＥアニオン交換体上へ
よりも、本質的に急速である。
も頻繁な媒質を構成した、ＤＥＡＥアニオン交換体上へ
よりも、本質的に急速である。
因子■、■、■およびＸをＤＥＡＥセファロース上へ吸
着させるためには約１〜４時間を要するが、本発明に従
いα−ヒドロキシルアミノプロピルのゲルを比較できる
試験装置において使用するとき、この方法は５分程度に
短い時間で完結す４る 。
着させるためには約１〜４時間を要するが、本発明に従
いα−ヒドロキシルアミノプロピルのゲルを比較できる
試験装置において使用するとき、この方法は５分程度に
短い時間で完結す４る 。
既知のＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーからの
他の差は、低いイオン強度におけるα−ヒドロキシルア
ミンマトリックスへの因子■の高度に満足すべき結合、
および高い、タンパク質の１ｍｇにつき１Ｕより大きい
比活性にほぼ等しい比活性ですべてのＰＰ５Ｂ因子の同
時の溶離である。ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフ
ィーにおいて、このような高い比活性の達成は、因子■
のかなりな量の損失を常に必然的に伴ってきた。実際に
、これが意味するように、因子■はこのようなＰＰ５Ｂ
４縮物において非常に低いレベルで存在するか、あるい
はそれは別に調製し、そして添加しなくてはならなかっ
た。
他の差は、低いイオン強度におけるα−ヒドロキシルア
ミンマトリックスへの因子■の高度に満足すべき結合、
および高い、タンパク質の１ｍｇにつき１Ｕより大きい
比活性にほぼ等しい比活性ですべてのＰＰ５Ｂ因子の同
時の溶離である。ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフ
ィーにおいて、このような高い比活性の達成は、因子■
のかなりな量の損失を常に必然的に伴ってきた。実際に
、これが意味するように、因子■はこのようなＰＰ５Ｂ
４縮物において非常に低いレベルで存在するか、あるい
はそれは別に調製し、そして添加しなくてはならなかっ
た。
ＰＰ５Ｂ囚子は、好ましくは、本発明に従いα−ヒドロ
キシルアミンの担体上にｐＩ＋７．０〜７．５お１び７
．５１Ｓ／ｃ１１１より低い電動度で吸着させる。
キシルアミンの担体上にｐＩ＋７．０〜７．５お１び７
．５１Ｓ／ｃ１１１より低い電動度で吸着させる。
ＰＰ５Ｂ因子は０．２５〜１モルの塩化ナトリウムを使
用してそれらの出発被覆剤の８０％までの収率で溶離す
ることができる。
用してそれらの出発被覆剤の８０％までの収率で溶離す
ることができる。
出発材料は血漿、血漿分画、または凝固因子を含有する
他の溶液であることができる。
他の溶液であることができる。
本発明による方法は、また、出発溶液が単一の因子のみ
を含有する場合、個々のＰＰ５Ｂ因子■、■およびＸを
得るか、あるいは濃縮するために使用することができる
。
を含有する場合、個々のＰＰ５Ｂ因子■、■およびＸを
得るか、あるいは濃縮するために使用することができる
。
このような濃縮されたＰＰ５Ｂまたは前記間々の因子を
含有する調製物に加えて、本発明に従うα−ヒドロキシ
ルアミン担体は、また、適当なりロマトグラフィーの条
件に８′ｎした血漿または血漿分画から高い因子■の濃
縮物を調製するために使用することができる。血漿また
は血漿分画はわずかに高い電動度、好ましくは１２〜１
５ｒｘｓ／ｃｍ、および好ましくは４．５〜７．７のｐ
Ｈにおいて吸着させ、゛とくに因子■はマトリックスに
よりいっそう特異的に結合し、そしてタンパクＨのｌｌ
ｌ１ｇにつき１０〜２０ Ｕの純度で溶離することかで
きる。従来、このような高い比活性は多段階の方法での
み、かつ本発明に従って得ることができる３０〜４０９
６よりかなり低い収量で得ることが可能であった。した
がって、因子■、■、■およびＸをα−ヒドロキシルア
ミン担体上へ吸着させることは、凝固因子■およびＰＰ
５Ｂ複合体の両者を数便する技術におけるかなりの進歩
を表す。＋１点は簡単かつ急速な方法による高い収率お
よび高い純度である。
含有する調製物に加えて、本発明に従うα−ヒドロキシ
ルアミン担体は、また、適当なりロマトグラフィーの条
件に８′ｎした血漿または血漿分画から高い因子■の濃
縮物を調製するために使用することができる。血漿また
は血漿分画はわずかに高い電動度、好ましくは１２〜１
５ｒｘｓ／ｃｍ、および好ましくは４．５〜７．７のｐ
Ｈにおいて吸着させ、゛とくに因子■はマトリックスに
よりいっそう特異的に結合し、そしてタンパクＨのｌｌ
ｌ１ｇにつき１０〜２０ Ｕの純度で溶離することかで
きる。従来、このような高い比活性は多段階の方法での
み、かつ本発明に従って得ることができる３０〜４０９
６よりかなり低い収量で得ることが可能であった。した
がって、因子■、■、■およびＸをα−ヒドロキシルア
ミン担体上へ吸着させることは、凝固因子■およびＰＰ
５Ｂ複合体の両者を数便する技術におけるかなりの進歩
を表す。＋１点は簡単かつ急速な方法による高い収率お
よび高い純度である。
凝固因子の吸着は、カラムクロマトグラフィーに限定さ
れず、また、バッチ式で実施することができる。マトリ
ックスへの因子の例外的に急速な結合のために、本発明
による方法は、また、α−ヒドロキシルアミン基で変性
した膜を使用して因子を吸着させるとき、膜を通す親和
分離に適する。
れず、また、バッチ式で実施することができる。マトリ
ックスへの因子の例外的に急速な結合のために、本発明
による方法は、また、α−ヒドロキシルアミン基で変性
した膜を使用して因子を吸着させるとき、膜を通す親和
分離に適する。
因子■、■およびＸは、また、適当に予（１指的に精製
したまたは濃縮した溶液から対応して高い濃・度で精製
することができる。因子をα−ヒドロキシルアミンマト
リックス上に吸着させる前または後に、因子をβ−プロ
ビオラクトンおよび／または紫外線で、溶媒および洗浄
剤で、あるいは低温殺菌で減菌して、ヒト病原性ウィル
スを不活性化することができる。
したまたは濃縮した溶液から対応して高い濃・度で精製
することができる。因子をα−ヒドロキシルアミンマト
リックス上に吸着させる前または後に、因子をβ−プロ
ビオラクトンおよび／または紫外線で、溶媒および洗浄
剤で、あるいは低温殺菌で減菌して、ヒト病原性ウィル
スを不活性化することができる。
（実施例）
次の実施例によって、本発明をさらに説明する。
実施例１
α−ヒドロキシルアミノプロピル基を担持し、そしてグ
リシジルメタクリレート、ペンタ−エリストールジメタ
クリレート、およびポリビニルアルコールのコポリマー
から成るマトリックスの２５第１のカラム（Ｐｒａｋｔ
ｏｇｅｌ−ＴＳＫ−Ａｍｌｎａ 、メルク、ダーマシュ
タット）を、１．００ ｍｌの緩衝液Ｂ（１，０ミリモ
ルのクエン酸塩、ｐＨ７，０）と平衝化した。
リシジルメタクリレート、ペンタ−エリストールジメタ
クリレート、およびポリビニルアルコールのコポリマー
から成るマトリックスの２５第１のカラム（Ｐｒａｋｔ
ｏｇｅｌ−ＴＳＫ−Ａｍｌｎａ 、メルク、ダーマシュ
タット）を、１．００ ｍｌの緩衝液Ｂ（１，０ミリモ
ルのクエン酸塩、ｐＨ７，０）と平衝化した。
３５０ ｍｌのクエン酸塩添加血漿７ ｍｓ／ ｃｍの
電動塵に希釈し、そしてカラムに３００第１／時間の流
速で移した。次いで、このカラムを１００第１の緩衝液
Ｂで洗浄した。ＰＰ５Ｂ因子を緩衝液Ｂ中の０．５モル
の塩化ナトリウムで溶離した。ＰＰ５Ｂ因子の収率は初
期の活性の６０〜８０％であった。ＰＰ５Ｂ因子の比活
性は、タンパク質の１ ｍｇにつき２、ＩＵの因子■、
１．９Ｕの因子■、２，３Ｕの因子■、および２．０υ
の因子Ｘであった。
電動塵に希釈し、そしてカラムに３００第１／時間の流
速で移した。次いで、このカラムを１００第１の緩衝液
Ｂで洗浄した。ＰＰ５Ｂ因子を緩衝液Ｂ中の０．５モル
の塩化ナトリウムで溶離した。ＰＰ５Ｂ因子の収率は初
期の活性の６０〜８０％であった。ＰＰ５Ｂ因子の比活
性は、タンパク質の１ ｍｇにつき２、ＩＵの因子■、
１．９Ｕの因子■、２，３Ｕの因子■、および２．０υ
の因子Ｘであった。
実施例２
実施例１に記載する吸着剤の２０第１のカラムを、５０
第１の緩衝液Ａ（ＩＯＥリモルのクエン酸塩、１０ミリ
モルのＮ８２１１ＰＯ４、および１００ミリモルのＮａ
Ｃｌ、ｐＨ７，５）と平衝化した。ｉ３ｎ＋ｓ／ｃｍの
電動塵の血漿の１０００ ｍｌを３００第１／時間の流
速で添加し、そして１５０第１の緩衝液Ａで洗浄した。
第１の緩衝液Ａ（ＩＯＥリモルのクエン酸塩、１０ミリ
モルのＮ８２１１ＰＯ４、および１００ミリモルのＮａ
Ｃｌ、ｐＨ７，５）と平衝化した。ｉ３ｎ＋ｓ／ｃｍの
電動塵の血漿の１０００ ｍｌを３００第１／時間の流
速で添加し、そして１５０第１の緩衝液Ａで洗浄した。
因子■を緩衝液Ａ中のＯ〜０．５モルの塩化ナトリウム
の直線の勾配（これは、また、０．５Ｕ／ｍｌのＡｒ１
および５Ｕ／ｍｌのヘパリンを含有した）で溶離した。
の直線の勾配（これは、また、０．５Ｕ／ｍｌのＡｒ１
および５Ｕ／ｍｌのヘパリンを含有した）で溶離した。
因子■およびタンパク質の含量を分画で決定した。
タンパク質の１ ｍｇにつき５Ｕより大きい因子■の比
活性をもつ分画をプールした。結果はタンパク質の１１
１１ｇにつき１５０の因子■の比活性を示す因子■濃縮
物であった。収率は血漿中の初期活性の４０％であった
。
活性をもつ分画をプールした。結果はタンパク質の１１
１１ｇにつき１５０の因子■の比活性を示す因子■濃縮
物であった。収率は血漿中の初期活性の４０％であった
。
実施例３
２００第１の血漿の各々を、実施例１に記載するように
、α−ヒドロキシルアミン基をもつ種々の担体のクロマ
トグラフィーにかけた。担体は次の通りであった。
、α−ヒドロキシルアミン基をもつ種々の担体のクロマ
トグラフィーにかけた。担体は次の通りであった。
１、酢酸ビニルおよびジビニルエチレン尿素のコポリマ
ー［例えば、パイオンンス（Ｂｆｏｓｙｎｔｈ） ］、 ２、メタクリルアミド、Ｎ−メチレン−ビス−メタクリ
ルアミド、およびアリルグリシジルエーテルのコポリマ
ー［例えばエラベルジット（Ｅｕｐｅｒｇｌｔ） ］
、および３、炭水化物のポリマー［例えば、セファロー
ズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ］。
ー［例えば、パイオンンス（Ｂｆｏｓｙｎｔｈ） ］、 ２、メタクリルアミド、Ｎ−メチレン−ビス−メタクリ
ルアミド、およびアリルグリシジルエーテルのコポリマ
ー［例えばエラベルジット（Ｅｕｐｅｒｇｌｔ） ］
、および３、炭水化物のポリマー［例えば、セファロー
ズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ］。
結果は原理的には実施例１において得られたものと同一
であり、そして表２に記載する。
であり、そして表２に記載する。
表２
収率０６ 比活性 ＩＪ／ｆｆｇ担体 因
子：■■ＩＸＸ ＩＩ ■ ｌＸＸ１
５０ ８２ ５５ ６１ １．．５ ２゜１ １
．５ １．７２ ５７ ７０ ５４ ４
＆ １．６ ２．０ １．１１１ １．５３
５２ ４３ ５７ ４８ １．２ １．０
１．３ １．１実施例４ １０００ｍｌの血漿を一夜０１２５％のβ−ブロビオク
ラクトンでｐＨ８゜０において処理し、次いで紫外線で
照射した。冷たい減菌した血漿を実施例１に記載するよ
うにして調製した。６０〜８０％の収率において、ＰＰ
５Ｂ因子の純度は実施例１に記載する比活性に匹敵した
。
子：■■ＩＸＸ ＩＩ ■ ｌＸＸ１
５０ ８２ ５５ ６１ １．．５ ２゜１ １
．５ １．７２ ５７ ７０ ５４ ４
＆ １．６ ２．０ １．１１１ １．５３
５２ ４３ ５７ ４８ １．２ １．０
１．３ １．１実施例４ １０００ｍｌの血漿を一夜０１２５％のβ−ブロビオク
ラクトンでｐＨ８゜０において処理し、次いで紫外線で
照射した。冷たい減菌した血漿を実施例１に記載するよ
うにして調製した。６０〜８０％の収率において、ＰＰ
５Ｂ因子の純度は実施例１に記載する比活性に匹敵した
。
実施例５
タンパク質の１ ａｇにつき０．８υの比活性をもつ市
販用ＰＰ５Ｂ製品の１００第１を、３０第１の実施例１
に記載する吸着剤で実施例２に記載するようにクロマト
グラフィーにかけた。９５％の収率でタンパク質の１＆
１ｇにつき１０．４ Ｕの比活性をもつ高い因子■の濃
縮物を分離することができた。
販用ＰＰ５Ｂ製品の１００第１を、３０第１の実施例１
に記載する吸着剤で実施例２に記載するようにクロマト
グラフィーにかけた。９５％の収率でタンパク質の１＆
１ｇにつき１０．４ Ｕの比活性をもつ高い因子■の濃
縮物を分離することができた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、凝固因子、II、VII、IXおよびＸを含有する溶液を
α−ヒドロキシルアミン基を担持する吸着剤上に吸着さ
せ、必要に応じて前記吸着剤を洗浄し、そして前記因子
を溶離することを特徴とする、凝固因子II、VII、IXお
よびＸの１または２以上を濃縮する方法。 ２、出発溶液は血漿、血漿分画、または前記因子を含有
する発酵溶液またはその分画であることを特徴とする、
上記第１項記載の方法。 ３、α−ヒドロキシルアミン基の担体は有機ポリマーで
あることを特徴とする、上記第１または２項記載の方法
。 ４、該ポリマー担体はグリシジルメタクリレート、ペン
タ−エリスリトールジメタクリレート、およびポリビニ
ルアルコールのコポリマーであることを特徴とする、上
記第１〜３項のいずれかに記載の方法。 ５、該ポリマー担体はメタクリルアミド、Ｎ−メチレン
−ビス−メタクリルアミド、およびアリルグリシジルエ
ーテルのコポリマーであることを特徴とする、上記第１
〜３項のいずれかに記載の方法。 ６、該ポリマー担体は酢酸ビニルおよびジビニルベンゼ
ン尿素のコポリマーであることを特徴とする、上記第１
〜３項のいずれかに記載の方法。 ７、該ポリマー担体は炭水化物のポリマーであることを
特徴とする、上記第１〜３項のいずれかに記載の方法。 ８、α−ヒドロキシルアミン基の担体は無機ポリマーで
あることを特徴とする、上記第１および２項記載の方法
。 ９、α−ヒドロキシルアミン基の担体はケイ酸塩のマト
リックスであることを特徴とする、上記第８項記載の方
法。 １０、前記因子はカラムクロマイトグラフィーにより、
バッチ式に、あるいは膜上に吸着させることを特徴とす
る、上記第１〜９項のいずれかに記載の方法。 １１、前記因子をα−ヒドロキシルアミン基の担体上に
吸着させる前または後に、前記溶液中に存在するウィル
スを適当な手段により不活性化することを特徴とする、
上記第１〜１０項のいずれかに記載の方法。 １２、前記因子をα−ヒドロキシルアミン基の担体上に
吸着させる前または後に、前記溶液中に存在するウィル
スをβ−プロビオラクトンおよび／または紫外線により
、溶媒および／または洗浄剤により、あるいは低温殺菌
により不活性化することを特徴とする、上記第１１項記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3826792.6 | 1988-08-06 | ||
| DE3826792A DE3826792C1 (ja) | 1988-08-06 | 1988-08-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02113893A true JPH02113893A (ja) | 1990-04-26 |
| JP2579217B2 JP2579217B2 (ja) | 1997-02-05 |
Family
ID=6360383
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1201463A Expired - Lifetime JP2579217B2 (ja) | 1988-08-06 | 1989-08-04 | 凝固因子▲ｉｉ▼、▲ｖｉｉ▼、▲ｉｘ▼およびｘの１または２以上を濃縮する方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5071961A (ja) |
| EP (1) | EP0354354B1 (ja) |
| JP (1) | JP2579217B2 (ja) |
| AT (1) | ATE104987T1 (ja) |
| DE (2) | DE3826792C1 (ja) |
| ES (1) | ES2055761T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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