JP2593951B2 - 血液凝固因子▲ｉｘ▼の単離方法 - Google Patents
血液凝固因子▲ｉｘ▼の単離方法Info
- Publication number
- JP2593951B2 JP2593951B2 JP2115330A JP11533090A JP2593951B2 JP 2593951 B2 JP2593951 B2 JP 2593951B2 JP 2115330 A JP2115330 A JP 2115330A JP 11533090 A JP11533090 A JP 11533090A JP 2593951 B2 JP2593951 B2 JP 2593951B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- factor
- amino
- hydroxyl
- carrier
- matrix
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 15
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 9
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 41
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 40
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 13
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 6
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 5
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 4
- -1 hydroxyl-amino group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 4
- XFNJVJPLKCPIBV-UHFFFAOYSA-N trimethylenediamine Chemical compound NCCCN XFNJVJPLKCPIBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 3
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 claims description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 2
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 claims description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims 2
- UYBWIEGTWASWSR-UHFFFAOYSA-N 1,3-diaminopropan-2-ol Chemical compound NCC(O)CN UYBWIEGTWASWSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 claims 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 claims 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 claims 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims 1
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 abstract description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 description 5
- HXKKHQJGJAFBHI-UHFFFAOYSA-N 1-aminopropan-2-ol Chemical compound CC(O)CN HXKKHQJGJAFBHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 102000013831 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 3
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- CIAMOALLBVRDDK-UHFFFAOYSA-N 1,1-diaminopropan-2-ol Chemical compound CC(O)C(N)N CIAMOALLBVRDDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 238000007696 Kjeldahl method Methods 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は，α−ヒドロキシル−アミノ−基を有するマ
トリックスで血液凝固因子IXを吸着し，その因子を溶出
し，硫酸化された炭水化物を有するマトリックスで引き
続き吸着して，血しょう又は他の分画から血液凝固因子
IXをほぼ純粋な形で，高収量で単離する，簡単な方法に
関する。
トリックスで血液凝固因子IXを吸着し，その因子を溶出
し，硫酸化された炭水化物を有するマトリックスで引き
続き吸着して，血しょう又は他の分画から血液凝固因子
IXをほぼ純粋な形で，高収量で単離する，簡単な方法に
関する。
血友病Ａによれば血友病Ｂは二番目に頻度の多い遺伝
性血液凝固阻害である。その患者には，凝固に不可欠な
因子IXがない。因子IX−含有調製物で置き換えることに
よって，この遺伝しうる凝固阻害を処理することができ
る。
性血液凝固阻害である。その患者には，凝固に不可欠な
因子IXがない。因子IX−含有調製物で置き換えることに
よって，この遺伝しうる凝固阻害を処理することができ
る。
血友病Ｂの処置は，今日ほとんどいわゆるPPSB−濃縮
物−これは因子IXの他に更に他のビタミンＫ−依存性血
液凝固因子II,VII及びＸの種々の量を含有する−を用い
て行われる。この様な調製物の比活性−たとえばこれは
ヨーロッパ特許第56629号及び第41174号明細書中に記載
されている−は，たん白質mgあたり約2.5E因子IXであ
る。
物−これは因子IXの他に更に他のビタミンＫ−依存性血
液凝固因子II,VII及びＸの種々の量を含有する−を用い
て行われる。この様な調製物の比活性−たとえばこれは
ヨーロッパ特許第56629号及び第41174号明細書中に記載
されている−は，たん白質mgあたり約2.5E因子IXであ
る。
PPSB−濃縮物に対する代替物は，凝固阻害の治療に対
する，高富化された因子IX−濃縮物である。たん白質mg
あたり10Eより多くの，因子IXに関する比活性を有す
る，高富化された因子IX−濃縮物を現在の技術によれば
血しょうから数段階の分画によってしか得ることができ
ない。このことに関する例は，国際特許出願WO83/03760
号明細書又はドイツ特許出願公開第2429191号明細書中
に記載されている。
する，高富化された因子IX−濃縮物である。たん白質mg
あたり10Eより多くの，因子IXに関する比活性を有す
る，高富化された因子IX−濃縮物を現在の技術によれば
血しょうから数段階の分画によってしか得ることができ
ない。このことに関する例は，国際特許出願WO83/03760
号明細書又はドイツ特許出願公開第2429191号明細書中
に記載されている。
ドイツ特許第3826792号明細書中，α−ヒドロキシル
−アミノ−基を有する吸着剤を用いてたん白質mgあたり
20E因子IXまでの比活性を有する因子IX−濃縮物を単離
することが記載されている。
−アミノ−基を有する吸着剤を用いてたん白質mgあたり
20E因子IXまでの比活性を有する因子IX−濃縮物を単離
することが記載されている。
ミカルスキー（Michalski,C.等（Vox Sang.55（４）,
202−10,1989）の研究に於て,DEAE−アニオン交換体と
ヘパリン−セフアロースの組合せ使用によってたん白質
mgあたり約10Eの比活性を有する因子IX−濃縮物を単離
することができる方法が示されている。
202−10,1989）の研究に於て,DEAE−アニオン交換体と
ヘパリン−セフアロースの組合せ使用によってたん白質
mgあたり約10Eの比活性を有する因子IX−濃縮物を単離
することができる方法が示されている。
たん白質あたり120〜150E因子IXのより一層高い純度
は、ブルノフ（Burnouf）,T.等（Int.Symp.on Biotechn
ogy of Plasma Proteins,Nancy17,05,1988,Abstr.4.0
9）によれば２回アニオン交換−クロマトグラフィー及
びアフィニティークロマトグラフィーの使用によって得
られる。米国特許第3920625号，第4,721,572号及び第47
25673号明細書中，有機及び無機担体に固定化された，
硫酸化された炭水化物を用いる因子IX−濃縮物の高度の
精製が記載されている。このアフィニティークロマトグ
ラフィーは、専ら出発血しょうに対して低い全収量を有
する数段階精製法の最後の段階であるか，あるいは最終
生成物は不純物以外のたん白質をまた含有する。僅かに
より高い収量が，しばしばプロテアーゼ阻害剤，たとえ
ばベンズアミジン又はPMSFの添加によって達成される。
しかしヒトの治療に使用するために，血しょう又は最終
生成物に異種物質の添加をできる限り止めねばならな
い。
は、ブルノフ（Burnouf）,T.等（Int.Symp.on Biotechn
ogy of Plasma Proteins,Nancy17,05,1988,Abstr.4.0
9）によれば２回アニオン交換−クロマトグラフィー及
びアフィニティークロマトグラフィーの使用によって得
られる。米国特許第3920625号，第4,721,572号及び第47
25673号明細書中，有機及び無機担体に固定化された，
硫酸化された炭水化物を用いる因子IX−濃縮物の高度の
精製が記載されている。このアフィニティークロマトグ
ラフィーは、専ら出発血しょうに対して低い全収量を有
する数段階精製法の最後の段階であるか，あるいは最終
生成物は不純物以外のたん白質をまた含有する。僅かに
より高い収量が，しばしばプロテアーゼ阻害剤，たとえ
ばベンズアミジン又はPMSFの添加によって達成される。
しかしヒトの治療に使用するために，血しょう又は最終
生成物に異種物質の添加をできる限り止めねばならな
い。
本発明は，たん白質mgあたり150Eより大きい因子IXの
比活性を有する，異種たん白質を全く含有しない，でき
る限り純粋な因子IX−調製物を簡単に得る方法を調製す
ることを課題とする。
比活性を有する，異種たん白質を全く含有しない，でき
る限り純粋な因子IX−調製物を簡単に得る方法を調製す
ることを課題とする。
この課題は本発明によれば次の様にして解決される。
すなわち血しょう又は他の，凝固因子IXを含有する分画
に，α−ヒドロキシル−アミノ−基を有するマトリック
スを加え，因子IXを吸着し，適当な緩衝液で後洗滌し，
次いで特異的に溶出する。次いでこの溶出液中の因子IX
を，ほとんどすべての他のたん白質を吸着しない条件下
で固定化された硫酸化された炭水化物を有する担体と結
合させる。塩−勾配で最後に因子IXを溶出する。
すなわち血しょう又は他の，凝固因子IXを含有する分画
に，α−ヒドロキシル−アミノ−基を有するマトリック
スを加え，因子IXを吸着し，適当な緩衝液で後洗滌し，
次いで特異的に溶出する。次いでこの溶出液中の因子IX
を，ほとんどすべての他のたん白質を吸着しない条件下
で固定化された硫酸化された炭水化物を有する担体と結
合させる。塩−勾配で最後に因子IXを溶出する。
驚くべきことに本発明者は，因子IXをこの簡単な二段
階方法を用いて高収量かつほぼ純粋な形で得ることがで
きることを見い出した。因子IXの凝固活性の維持のため
に非生理的たん白質阻害剤の添加は，必ずしも必要では
ない。
階方法を用いて高収量かつほぼ純粋な形で得ることがで
きることを見い出した。因子IXの凝固活性の維持のため
に非生理的たん白質阻害剤の添加は，必ずしも必要では
ない。
出発材料として血しょう及び血しょう分画又は他の，
凝固因子IXを含有する溶液を使用することができる。
凝固因子IXを含有する溶液を使用することができる。
本発明による方法の場合，たとえば血しょうを少し高
められた伝導度，好ましくは12〜15mS/cm及び好ましく
は7.0〜7.7のpHでα−ヒドロキシル−アミノ−担体，た
とえばフラクトゲル（Ftaktogel）TSK−アミノ（メクル
社製，ダルムシュタット）で吸着する。担体を，因子IX
をほんの僅かしか溶離しない条件下に洗滌する。この洗
滌を，低分子の有機アミン−これはα−ヒドロキシル−
アミノ−プロピル−基と一定の類似性を有しなければな
らない−，たとえば１−アミノ２−プロパノ−ル,1,3−
ジアミノ−２−プロパノ−ル又は1,3−ジアミノプロパ
ンを用いてたとえば10mMクエン酸塩,10mMリン酸塩及び1
00mM Naclを有する緩衝液中でpH7.5で実施するのが好ま
しい。洗滌工程をアミン不含の緩衝液でも行うことがで
きる。勿論これからほんの僅かな純度及び収量が得られ
る。次いでアミン−又は場合により塩濃度の増加によっ
て，因子IXを担体から溶出する。低分子アミンの添加
は，洗滌工程でも，因子IXの溶出でも特異性を増加させ
る。
められた伝導度，好ましくは12〜15mS/cm及び好ましく
は7.0〜7.7のpHでα−ヒドロキシル−アミノ−担体，た
とえばフラクトゲル（Ftaktogel）TSK−アミノ（メクル
社製，ダルムシュタット）で吸着する。担体を，因子IX
をほんの僅かしか溶離しない条件下に洗滌する。この洗
滌を，低分子の有機アミン−これはα−ヒドロキシル−
アミノ−プロピル−基と一定の類似性を有しなければな
らない−，たとえば１−アミノ２−プロパノ−ル,1,3−
ジアミノ−２−プロパノ−ル又は1,3−ジアミノプロパ
ンを用いてたとえば10mMクエン酸塩,10mMリン酸塩及び1
00mM Naclを有する緩衝液中でpH7.5で実施するのが好ま
しい。洗滌工程をアミン不含の緩衝液でも行うことがで
きる。勿論これからほんの僅かな純度及び収量が得られ
る。次いでアミン−又は場合により塩濃度の増加によっ
て，因子IXを担体から溶出する。低分子アミンの添加
は，洗滌工程でも，因子IXの溶出でも特異性を増加させ
る。
次いで因子IX−活性を有する溶出液を，硫酸化された
炭水化物を有する担体，たとえばヘパリン−セフアロー
ス（フアルマシア社製，フライブルグ）ヘパリン−フラ
クトゲル−TSK,ヘパリン−オンペルギト（Eupergit）
（レーム社製，ダルムシュタット）又はデキストランス
ルフアート−セフアロース上に施す。その際伝導度を13
〜17,好ましくは15mS/cmに調整する。この方法で因子IX
しか担体に著しく吸着されない。次いでこれをたとえば
０〜1M NaClを用いる塩−勾配によってほぼ純粋な形で
マトリックスから溶出することができる。得られた因子
IX−溶出液をダイア（Dia）−及び限外濾過によって濃
縮し，次いで凍結乾燥する。
炭水化物を有する担体，たとえばヘパリン−セフアロー
ス（フアルマシア社製，フライブルグ）ヘパリン−フラ
クトゲル−TSK,ヘパリン−オンペルギト（Eupergit）
（レーム社製，ダルムシュタット）又はデキストランス
ルフアート−セフアロース上に施す。その際伝導度を13
〜17,好ましくは15mS/cmに調整する。この方法で因子IX
しか担体に著しく吸着されない。次いでこれをたとえば
０〜1M NaClを用いる塩−勾配によってほぼ純粋な形で
マトリックスから溶出することができる。得られた因子
IX−溶出液をダイア（Dia）−及び限外濾過によって濃
縮し，次いで凍結乾燥する。
この簡単な方法での収率は，たん白質mgあたり200〜3
00Eの比活性を有する因子IXに関して，血しょう中で出
発活性の40％までである。その際因子IXの凝固活性を，
ベーリング社の市場で入手できるテキスト試剤を用いて
製造者の指示に従って測定する。分画のたん白質含有量
は，ブラドフォード（Bradford）,MM.,Anal.Biochem.7
2,248−254（1976）のマイクロ法によって又は窒素−検
知器を備えたマイクロケルダール法によって製造者（ア
ンテクインストルメンツ社，ヒューストン，テキサス
州）の指示に従って測定される。
00Eの比活性を有する因子IXに関して，血しょう中で出
発活性の40％までである。その際因子IXの凝固活性を，
ベーリング社の市場で入手できるテキスト試剤を用いて
製造者の指示に従って測定する。分画のたん白質含有量
は，ブラドフォード（Bradford）,MM.,Anal.Biochem.7
2,248−254（1976）のマイクロ法によって又は窒素−検
知器を備えたマイクロケルダール法によって製造者（ア
ンテクインストルメンツ社，ヒューストン，テキサス
州）の指示に従って測定される。
最終生成物中，ゲル−電気泳動を用いてライスフエル
ド（Reisfeld）,RA等,Nature195,281（1962）及びラエ
ンリー（Laenmli）,UK.等,Nature227,680（1970）に従
って減少する及び自然条件下に因子IX−移動性を有する
たん白質しか著しく検出することができない。
ド（Reisfeld）,RA等,Nature195,281（1962）及びラエ
ンリー（Laenmli）,UK.等,Nature227,680（1970）に従
って減少する及び自然条件下に因子IX−移動性を有する
たん白質しか著しく検出することができない。
この様な比活性は，従来数段階処理によってしか達成
され得なかった。当然その収率は，明らかに本発明によ
る方法を用いれば得ることができる30−40％以下であ
る。
され得なかった。当然その収率は，明らかに本発明によ
る方法を用いれば得ることができる30−40％以下であ
る。
したがって本発明による因子IXの精製方法は，凝固因
子IXの工業的収得に於て著しい進歩である。この長所
は，簡単かつ迅速な方法で高収率及び高純度にある。
子IXの工業的収得に於て著しい進歩である。この長所
は，簡単かつ迅速な方法で高収率及び高純度にある。
α−ヒドロキシル−アミノ−マトリックスに又は硫酸
化された炭水化物−マトリックスに因子IXを吸着前又は
吸着後，β−プロピオラクトン及び（又は）UV−照射
で，溶剤／洗剤で，安定剤を用いるパスツゥール法を行
うことによって無菌化を行い，場合により存在するヒト
病原体ウイルスを不活性化する。
化された炭水化物−マトリックスに因子IXを吸着前又は
吸着後，β−プロピオラクトン及び（又は）UV−照射
で，溶剤／洗剤で，安定剤を用いるパスツゥール法を行
うことによって無菌化を行い，場合により存在するヒト
病原体ウイルスを不活性化する。
次の例によって本発明を説明する。
例１ グリシジルメタアクリラート，ペンタエリスロールジ
メチルアクリラート及びポリビニルアルコールのコポリ
マーから成る，α−ヒドロキシル−アミノ−プロピルを
有するマトリックス，たとえばフラクトゲルTSK−アミ
ノ（メルク社製，ダルムシュタット）を有するカラム25
0mlを，緩衝液A1500ml（10mMクエン酸塩,10mM NaHPO4,1
00mM NaCl,pH7.5）で平衡化する。
メチルアクリラート及びポリビニルアルコールのコポリ
マーから成る，α−ヒドロキシル−アミノ−プロピルを
有するマトリックス，たとえばフラクトゲルTSK−アミ
ノ（メルク社製，ダルムシュタット）を有するカラム25
0mlを，緩衝液A1500ml（10mMクエン酸塩,10mM NaHPO4,1
00mM NaCl,pH7.5）で平衡化する。
伝導度13mS/cmを有する血しょう5000mlを流動度300ml
/hで施し，次いで緩衝液A1000mlで洗滌する。因子IXを
０〜0.5M NaClの直線勾配で緩衝液Ａ中に溶出する。3E
因子IX/mgたん白質以上の比活性を有する分画を貯留す
る。
/hで施し，次いで緩衝液A1000mlで洗滌する。因子IXを
０〜0.5M NaClの直線勾配で緩衝液Ａ中に溶出する。3E
因子IX/mgたん白質以上の比活性を有する分画を貯留す
る。
ヘパリン−セフアロースを有するカラム500ml（フア
ルマシア社，フライブルグ）を，緩衝液A1000mlで平衡
化する。因子IX−溶出液を緩衝液Ｂ（10mMクエン酸塩,p
H7.5）で伝導度15mS/cmに希釈し，カラムに装てんす
る。次いで緩衝液B500mlで洗滌し,0.1M NaClの勾配で緩
衝液Ｂ中に溶出する。
ルマシア社，フライブルグ）を，緩衝液A1000mlで平衡
化する。因子IX−溶出液を緩衝液Ｂ（10mMクエン酸塩,p
H7.5）で伝導度15mS/cmに希釈し，カラムに装てんす
る。次いで緩衝液B500mlで洗滌し,0.1M NaClの勾配で緩
衝液Ｂ中に溶出する。
因子IX−溶出液を，ダイア濾過及び限外濾過によって
濃縮し，凍結乾燥する。因子IXに関する全収率は，プラ
ズマ中で出発活性の30％である。因子IXの比活性は,270
E因子IX/mgたん白質である。
濃縮し，凍結乾燥する。因子IXに関する全収率は，プラ
ズマ中で出発活性の30％である。因子IXの比活性は,270
E因子IX/mgたん白質である。
例２ クエン酸塩−血しょう1000ml中に例１と同様にクロマ
トグラフィー分離する。因子IXを，今回α−ヒドロキシ
ル−アミノ−プロピル−マトリックスフラクトゲルTSK
−アミノ（メルク社，ダルムシュタット）から遊離配位
子，すなわち１−アミノ−２−プロパノ−ルと共に溶出
する。カラムを緩衝液Ａで，次いで緩衝液Ａ中の0.2M 1
−アミノ−２−プロパノ−ルで洗滌した後，緩衝液Ａ中
の0.25M1−アミノ−２−プロパノ−ルで溶出する。
トグラフィー分離する。因子IXを，今回α−ヒドロキシ
ル−アミノ−プロピル−マトリックスフラクトゲルTSK
−アミノ（メルク社，ダルムシュタット）から遊離配位
子，すなわち１−アミノ−２−プロパノ−ルと共に溶出
する。カラムを緩衝液Ａで，次いで緩衝液Ａ中の0.2M 1
−アミノ−２−プロパノ−ルで洗滌した後，緩衝液Ａ中
の0.25M1−アミノ−２−プロパノ−ルで溶出する。
例１と同様にヘパリン−セフアロースを介して因子IX
−溶出液をクロマトグラフィー分離した後，因子IXの比
活性は265E因子IX/mgたん白質である。収率は，血しょ
う中で出発活性の39％である。
−溶出液をクロマトグラフィー分離した後，因子IXの比
活性は265E因子IX/mgたん白質である。収率は，血しょ
う中で出発活性の39％である。
例３ 血しょう1000mlを，例１と同様にクロマトグラフィー
分離する。ヘパリン−担体として，クリジルメタアクリ
ラート，ペンタエリスロール−ジメチトアクリラート及
びポリビニルアルコールのコポリマータイプのポリマー
（メルク社のフラクトゲル−TKS,ダルムシュタット）を
使用する。
分離する。ヘパリン−担体として，クリジルメタアクリ
ラート，ペンタエリスロール−ジメチトアクリラート及
びポリビニルアルコールのコポリマータイプのポリマー
（メルク社のフラクトゲル−TKS,ダルムシュタット）を
使用する。
ヘパリン−フラクトゲルを，フラクトゲル−TSK−ア
ミノ50gと0.2Mリン酸塩緩衝液50ml中にヘパリン1.5g及
びNaCNBH3150mgとをpH7.0、２日間室温で反応させ，次
いで蒸溜水で洗滌して製造する。
ミノ50gと0.2Mリン酸塩緩衝液50ml中にヘパリン1.5g及
びNaCNBH3150mgとをpH7.0、２日間室温で反応させ，次
いで蒸溜水で洗滌して製造する。
因子IXの比活性は，出発血しょうに対して収率27％
で,200Emgたん白質である。
で,200Emgたん白質である。
例４ 血しょう1000ml中に，例１と同様にクロマトグラフィ
ー分離する。ヘパリン−セフアロースの代わりに，デキ
ストランスルフアート−セフアロースを使用する。
ー分離する。ヘパリン−セフアロースの代わりに，デキ
ストランスルフアート−セフアロースを使用する。
デキストランスルフアート−セフアロースを，セフア
ロース4B100ml（フアルマシア社，フライブルグ）とデ
キストランスルフアート5gとを水100ml及びブロムシア
ン4g中でpH11で10分間反応させることによって製造す
る。pH8で更に24時間後，ゲルを水及び緩衝液で洗滌す
る。
ロース4B100ml（フアルマシア社，フライブルグ）とデ
キストランスルフアート5gとを水100ml及びブロムシア
ン4g中でpH11で10分間反応させることによって製造す
る。pH8で更に24時間後，ゲルを水及び緩衝液で洗滌す
る。
因子IXの比活性は，出発血しょうに対して収率31％
で,210E/mgたん白質である。
で,210E/mgたん白質である。
例５ 血しょう1000mlを,0.25％β−プロピオラクトンを用
いてpH8.0で一晩処理し，次いでUV−光線を照射する。
低温滅菌された血しょうを例２に準じて後処理する。20
％の収率で純度は,210E/mgたん白質である。
いてpH8.0で一晩処理し，次いでUV−光線を照射する。
低温滅菌された血しょうを例２に準じて後処理する。20
％の収率で純度は,210E/mgたん白質である。
例６ クエン酸塩−血しょう1000mlを，例２に準じてクロマ
トグラフィー分離する。２つのクロマトグラフィー分離
−工程の間で，フラクトゲルTSK−アミノの溶出液を８
時間,25℃で0.3％トリ−Ｎ−ブチルホスフアート及び１
％トゥ−ン80を用いて処理し，次いで２個の20ワットUV
−ランプを有する回転流動−装置中で600UpM及び流量20
l/hrで1cm間隔で照射する。
トグラフィー分離する。２つのクロマトグラフィー分離
−工程の間で，フラクトゲルTSK−アミノの溶出液を８
時間,25℃で0.3％トリ−Ｎ−ブチルホスフアート及び１
％トゥ−ン80を用いて処理し，次いで２個の20ワットUV
−ランプを有する回転流動−装置中で600UpM及び流量20
l/hrで1cm間隔で照射する。
因子IXの比活性は,245E因子IX/mgたん白質である。収
率は，血しょう中で出発活性の35％である。
率は，血しょう中で出発活性の35％である。
例７ 0.6E因子IX/mgたん白質の比活性を有するPPSB−市販
生成物100mlを，例２と同様に例１で使用された吸着剤
夫々30mlを介してクロマトグラフィー分出する。この方
法で210E/mgたん白質の因子IXを，収率76％で単離する
ことができる。
生成物100mlを，例２と同様に例１で使用された吸着剤
夫々30mlを介してクロマトグラフィー分出する。この方
法で210E/mgたん白質の因子IXを，収率76％で単離する
ことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ベルトラーム・アイヒエントップフ ドイツ連邦共和国、バート・ゾーデン、 ロッセルト ストラーセ、13 (56)参考文献 特開 平１−207239（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−26227（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−80323（ＪＰ，Ａ)
Claims (14)
- 【請求項１】ａ）血液凝固因子IXを含有する溶液を，α
−ヒドロキシル−アミノ−基を有する吸着剤で吸着し，
血液凝固因子を溶出し， ｂ）因子IX−溶出液から因子IXを硫酸化された炭水化物
を有するマトリックスと結合させ，その際伝導度を13〜
17mS/cmに調整し，次いで塩−勾配で溶出し， ｃ）純粋な因子IXを濃縮し，凍結乾燥することを特徴と
する，血液凝固因子IXの単離方法。 - 【請求項２】α−ヒドロキシル−アミノ−担体として，
グリシジルメタアクリラート，ペンタエリスロールジメ
タアクリラート及びポリビニルアルコールのコポリマー
のポリマーを使用する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】α−ヒドロキシル−アミノ−担体の因子IX
用溶出剤として低分子の第一有機アミンを使用する請求
項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】溶出剤として１−アミノ−２−プロパノ−
ルを使用する請求項３記載の方法。 - 【請求項５】溶出剤として1,3−ジアミノ−２−プロパ
ノール又は1,3−ジアミノ−プロパンを使用する請求項
３記載の方法。 - 【請求項６】吸着を，カラムクロマトグラフィーとして
α−ヒドロキシル−アミノ−担体でバッチ法で又は膜で
実施する請求項１ないし５のいずれかに記載した方法。 - 【請求項７】硫酸化された炭水化物を有するマトリック
スとして，グリシジルメタアクリラート，ペンタエリス
ロール−ジメタアクリラート及びポリビニルアルコール
のコポリマータイプのポリマーに固定されたヘパリンを
使用する請求項１ないし６のいずれかに記載した方法。 - 【請求項８】硫酸化された炭水化物を有するマトリック
スとして，メタアクリルアミド,N−メチレン−ビス−メ
タアクリルアミド及びアリルクリシジルエーテルのコポ
リマータイプのポリマーに固定されたヘパリンを使用す
る請求項１ないし６のいずれかに記載した方法。 - 【請求項９】硫酸化された炭水化物を有するマトリック
スとして，炭水化物のポリマーに固定化されたヘパリン
を使用する請求項１ないし６のいずれかに記載した方
法。 - 【請求項１０】硫酸化された炭水化物を有するマトリッ
クスとして，炭水化物のポリマーに固定化されたデキス
トランスルフアートを使用する請求項１ないし６のいず
れかに記載した方法。 - 【請求項１１】吸着を，カラムクロマトグラフィーとし
て硫酸化された炭水化物を有するマトリックスでバッチ
法で又は膜で実施する請求項１ないし10のいずれかに記
載した方法。 - 【請求項１２】出発溶液として血液凝固因子IXを含有す
る血しょう，血しょう分画又は発酵溶液又はその分画を
使用する請求項１ないし11のいずれかに記載した方法。 - 【請求項１３】α−ヒドロキシル−アミノ−担体又は硫
酸化された炭水化物−担体で吸着前又は吸着後，溶液中
に存在するウイルスを適当な操作で不活性化する請求項
１ないし12のいずれかに記載した方法。 - 【請求項１４】α−ヒドロキシル−アミノ−担体又は硫
酸化された炭水化物−担体で吸着前又は吸着後，溶液中
に存在するウイルスを，β−プロピオラクトン及び（又
は）UV−照射で処理して，溶剤及び（又は）洗剤で処理
して又は溶液の形で安定剤を用いてパストゥール法を行
うことによって又はこれらの方法の組合せによって不活
性化する請求項13記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3914869.6 | 1989-05-05 | ||
| DE3914869A DE3914869C1 (ja) | 1989-05-05 | 1989-05-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02306994A JPH02306994A (ja) | 1990-12-20 |
| JP2593951B2 true JP2593951B2 (ja) | 1997-03-26 |
Family
ID=6380171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2115330A Expired - Lifetime JP2593951B2 (ja) | 1989-05-05 | 1990-05-02 | 血液凝固因子▲ｉｘ▼の単離方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5061789A (ja) |
| EP (1) | EP0396022B1 (ja) |
| JP (1) | JP2593951B2 (ja) |
| AT (1) | ATE76751T1 (ja) |
| DE (2) | DE3914869C1 (ja) |
| DK (1) | DK0396022T3 (ja) |
| ES (1) | ES2037499T3 (ja) |
| GR (1) | GR3005036T3 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT402261B (de) * | 1991-01-25 | 1997-03-25 | Immuno Ag | Komplex enthaltend den gerinnungsfaktor ix |
| AT395597B (de) * | 1991-01-25 | 1993-01-25 | Immuno Ag | Reagens zur bestimmung von faktor viii-aktivitaet |
| ES2150914T3 (es) | 1991-03-01 | 2000-12-16 | Rhone Poulenc Rorer Int | Preparacion de factor ix. |
| IT1262899B (it) * | 1992-03-27 | 1996-07-22 | Sclavo Spa | Processo per l'isolamento di fattore ix, fattore x e fattore ii altamente purificati dal complesso protrombinico o dal plasma umano |
| DE4342132C1 (de) * | 1993-12-10 | 1994-11-03 | Octapharma Ag | Verfahren zur Herstellung virusinaktivierte Vitamin K abhängige Plasmakomponenten sowie Protein C und Protein S enthaltender Mittel durch Membran-Chromatographie |
| DE19504852C2 (de) * | 1995-02-15 | 2003-01-23 | Octapharma Ag Lachen | Verfahren zur Reinigung Vitamin K-abhängiger Gerinnungsfaktoren durch Affinitäts-Chromatographie |
| US5714583A (en) * | 1995-06-07 | 1998-02-03 | Genetics Institute, Inc. | Factor IX purification methods |
| DE10045434B4 (de) * | 2000-09-14 | 2005-07-14 | Fresenius Hemocare Gmbh | Adsorbens mit unterschiedlich modifizierten Oberflächenbereichen, Verfahren zu dessen Herstellung und Verwendung davon |
| CA2821711C (en) | 2010-12-15 | 2017-10-10 | Baxter International Inc. | Eluate collection using conductivity gradient |
| US9663553B2 (en) | 2014-01-29 | 2017-05-30 | Hemarus Therapeutics Limited | Integrated process for the production of therapeutics (human albumin, immunoglobulins, clotting factor VIII and clotting factor IX) from human plasma |
| US10793327B2 (en) | 2017-10-09 | 2020-10-06 | Terumo Bct Biotechnologies, Llc | Lyophilization container and method of using same |
| CA3130700A1 (en) | 2019-03-14 | 2020-09-17 | Terumo Bct Biotechnologies, Llc | Lyophilization container fill fixture, system and method of use |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3920625A (en) * | 1973-06-19 | 1975-11-18 | Kabi Ab | Isolation of coagulation factors from biological material using cross linked sulfated, sulfonated carbohydrates |
| DE3172210D1 (en) * | 1980-05-27 | 1985-10-17 | Miles Lab | Blood coagulation promoting product and process of preparing same |
| DE3033932C2 (de) * | 1980-09-10 | 1984-05-24 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Kaltsterilisation von Blutgerinnungsfaktor VIII enthaltenden Präparaten |
| DE3101752A1 (de) * | 1981-01-21 | 1982-08-26 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | "verfahren zur reinigung der blutgerinnungsfaktoren ii, vii, ix und/oder x und danach hergestellte praeparationen" |
| US4447416A (en) * | 1982-04-28 | 1984-05-08 | American National Red Cross | Plasma protein concentrates of reduced thrombogenicity and their use in clinical replacement therapy |
| US4721572A (en) * | 1985-07-12 | 1988-01-26 | Miles Laboratories, Inc. | Purfication of blood clotting factors and other blood proteins on non-carbohydrate sulfated matrices |
| US4725673A (en) * | 1986-08-29 | 1988-02-16 | Alpha Therapeutic Corporation | Plasma fraction purification using silica resin bound to a ligand |
| EP0317376B2 (fr) * | 1987-10-23 | 1996-04-03 | Centre Regional De Transfusion Sanguine De Lille | Préparation de concentré de facteur IX humain de haute pureté et d'autres protéines plasmatiques |
| DE3826792C1 (ja) * | 1988-08-06 | 1989-07-06 | Biotest Pharma Gmbh, 6072 Dreieich, De |
-
1989
- 1989-05-05 DE DE3914869A patent/DE3914869C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-04-26 AT AT90107974T patent/ATE76751T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-04-26 DK DK90107974.9T patent/DK0396022T3/da active
- 1990-04-26 EP EP90107974A patent/EP0396022B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-26 DE DE9090107974T patent/DE59000141D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-26 ES ES199090107974T patent/ES2037499T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-01 US US07/517,081 patent/US5061789A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-05-02 JP JP2115330A patent/JP2593951B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-06-26 GR GR920400491T patent/GR3005036T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0396022A1 (de) | 1990-11-07 |
| DE59000141D1 (de) | 1992-07-09 |
| DE3914869C1 (ja) | 1990-08-09 |
| JPH02306994A (ja) | 1990-12-20 |
| EP0396022B1 (de) | 1992-06-03 |
| ES2037499T3 (es) | 1993-06-16 |
| ATE76751T1 (de) | 1992-06-15 |
| DK0396022T3 (da) | 1992-07-20 |
| US5061789A (en) | 1991-10-29 |
| GR3005036T3 (ja) | 1993-05-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2768957B2 (ja) | 高純度のヒト因子ｉｘ濃縮物および他の血漿蛋白質およびそれらの治療学的使用 | |
| JP2805364B2 (ja) | 血漿蛋白質のクロマトグラフィーによる分離 | |
| JP2593951B2 (ja) | 血液凝固因子▲ｉｘ▼の単離方法 | |
| AU691993B2 (en) | Process for purification of factor VIII | |
| EP0208215B1 (en) | Purification of blood clotting factors and other blood proteins on non-carbohydrate sulfated matrices | |
| US5409990A (en) | Complex containing coagulation factor IX | |
| JP2579217B2 (ja) | 凝固因子▲ｉｉ▼、▲ｖｉｉ▼、▲ｉｘ▼およびｘの１または２以上を濃縮する方法 | |
| JPS6323896A (ja) | ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 | |
| JP3471379B2 (ja) | ヒトアンチトロンビン−ｉｉｉの調製方法 | |
| JP3043558B2 (ja) | ヒト活性化プロテインｃ調製物及びその製法 | |
| EP0391974B1 (en) | Process for the purification of vitamin k-dependent blood clotting factors | |
| US5445958A (en) | Process for purifying blood clotting factors | |
| US20090093038A1 (en) | Method for the production of pure virally inactivated butyrylcholinesterase | |
| US4780529A (en) | Isolation of an endotoxin inactivator from human plasma, and methods of use | |
| JP2594256B2 (ja) | ウロキナーゼの殺菌方法 | |
| US4677194A (en) | Isolation of an endotoxin inactivator from human plasma | |
| JPH09286797A (ja) | ヘパリンコファクターｉｉ及びその精製方法 | |
| WO1991013976A1 (en) | Process for producing purified tissue plasminogen activator or its derivative | |
| AU627446C (en) | Chemical process | |
| Okabe et al. | Studies on the purification of prothrombin from bovine plasma | |
| JPH09157184A (ja) | アンチトロンビンｉｉｉ含有組成物およびその製造方法 |