JPH0393729A - 百日咳保護抗原の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、医薬の分野で利用される吸着ＤＰＴワクチン
の製造で使用される百日咳保護小体（ｃｏｒｐｕｓｃｌ
ｅ）抗原の製造方法に関する。

［従来の技術］ 百日咳保護小体抗原の公知の製造方法は、カゼイン寒天
及び炭素を有する媒体若しくは液体栄養物媒体中で３６
℃で百日咳微生物を培養する工程と、塩化ナトリウムの
等張溶液により、カゼイン寒天と炭素を有する媒体から
微生物塊を洗浄する工程と、遠心分離若しくは塩酸で液
体栄養物媒体から微生物塊を沈降する工程と、ついで遠
心分離し、過沈降した液体をデカントして、沈降物を塩
化ナトリウムの緩衝等張の溶液で希釈し、５６℃で加熱
し（又は加熱せず）、１０〜１４日から４か月までメル
チオレイトで処理する方法である（１）。

百日咳保護小体抗原の別の公知の製造方法は、前記第一
の方法と同様にして微生物懸濁物を得るが、室温中で２
０〜２４時間ホルムアルデヒドデで処理する。ついで遠
心分離して、遊離ホルムアルデヒドの濃度を減少させ、
保存用メルチオレイトを含む塩化ナトリウムの等張溶液
で希釈する方法である（２）。

［発明が解決しようとする技術的課・題］百日咳保護小
体抗原の公知の製造方法の欠点は、使用される化学物質
が微生物の細胞の蛋白質に有害な作用をもたらし（ホル
ムアルデヒドは、アミノ基と反応して変成させ、凝固さ
せ、一方メルチオレイトの水銀イオンは、スルホヒドリ
ル基と反応する）、その結果、百日咳保護小体抗原の保
護特性が減少する。さらにこれらの方法では、微生物と
不活性化剤との保持、一接触に時間がかかり（１０日〜
４か月）、その濃度の減少をもたらす。

また使用する熱処理は、微生物の消滅をある程度促進す
るが、同時にワクチンの保護活性及び安定性を減少させ
てしまう。

液体栄養物媒体から百日咳保護小体抗原を得ることの実
質的な欠点は、微生物塊と栄養物媒体との分離のための
遠心分離が必須であると言うことである。微生物塊の沈
降物を塩酸で置換するする際に、遠心分離はその保護的
性質を減少させ、同時に子供の抗原の場合にその毒性と
活性を増加させてしまう。

本発明の目的は、これら抗原の保護特性を向上し、その
毒性を減少し、その作製時間を減少させる百日咳保護小
体抗原の製造方法を提供することにある。

［技術的課題を解決する手段、作用、及び効果］この方
法は、微生物を培養する工程と、等張酸によって不活性
化された微生物の懸濁物を得る工程と、ついで微生物塊
の沈降物を、過沈降した液体をデカントして、バクテリ
ア沈降物を塩化ナトリウムの等張溶液で希釈する百日咳
保護小体抗原の製造方法により達成される。この方法は
、微生物を溶液または液体栄養物媒体中で媒溶すること
によりおこなわれる。微生物塊を塩化ナトリウムの等張
溶液で洗浄する。この様にして得られた微生物の懸濁物
の不活性化は、最終濃度が３．７５〜１　３ｍｇ／ｍｌ
ＳｐＨ３．７〜４．２となるようにイタコン酸を加えて
おこなわれる。その接触は、１〜４時問おこなわれる。

この処理中微生物はそれ自身で沈降される。過沈降した
液体をデカントした後、沈降物を塩化ナトリウムの等張
溶液で希釈する。

本発明方法の利点は、次のとおりである。作製された百
日咳保護小体抗原は、保護活性が高く、毒性が低い。ま
た、最終製品を得るための製造時間が減少される。加熱
や遠心分離を必要とせず、従ってそのための特別な機器
が不要である。

［実施例］ 本発明は、以下の実施例で詳細に説明する。

実施例１ 第Ｉ相の百日咳微生物をカゼイン寒天と炭素とを有する
栄養物媒体中で培養し、微生物塊を塩化ナトリウムの等
張溶液で洗浄し、濃度５０〜８０１００７　ｍｌに希釈
し、ついで等張酸を加えて最終濃度が３　．　　７　５
　＋＊ｇ　／　ｍｌ　Ｓｐ　Ｈ　３　．　７　〜４　．
　２とした。

混合物を振動し、懸濁物を４時間室温に保持し、ついで
４〜１０℃で夜中保持した。

この保持中、微生物は細胞沈降物を形威し、これは容易
に解体できるものである。次の日、過沈降した液体をデ
カントして細胞沈降物を再懸濁し、塩化ナトリウムの等
張溶液で初期濃度（細胞）となるまで希釈した。これに
対し、ｐＨは、７，ｏ〜７．２とした。この様に作製さ
れた微生物懸濁物は、百日咳保護小体抗原の作製物を示
した。

実施例２ 百日咳保護小体抗原用の微生物懸濁物は実施例１で記載
されたものであるが、その感染性の不活性化は、イタコ
ン酸６　．　　５　■／　ｍｌ　，　ｐ　Ｈ　３　．　
　７　〜４，２、室温で２〜３時間保持し、ついで５〜
１０℃に保持し、同じ日に又は次の朝に過沈降した液体
をデカントし、その後沈降物をｐＨ７．０〜７．２にし
た塩化ナトリウムの等張溶液で希釈した。

実施例３ 微生物懸濁物は実施例１及び２で記載された方法と同様
の方法で作製された。ただし、不活性化は、イタコン酸
１　３ａ＋ｇ／ｍｌＳｐＨ３．７　〜４、２、で、１〜
２時間保持しておこなった。透明な過沈降した液体を同
じ日又は次の朝にデカントし、沈降物を、塩化ナトリウ
ムの等張溶液で希釈して、細胞濃度がｐＨ７．０　〜７
．２で５０　〜８０１００／ｍｌとなるようにした。

実施例４ 第Ｉ相の微生物をコエンとビラーの液体半合或媒体（最
終的にイオン交換樹脂を加える）中で４８時間培養した
。樹脂を濾過により分離し、懸濁物ψの微生物の濃度を
測定した（通常４０〜５　０　　１ＵＯ／　ｍｌ）。つ
いでイタコン酸溶液を加えて、最終濃度が５■／ｍｌ，
ｐＨ３．７となるようにした。懸濁物の感染性の不活性
化は、室温で３〜４時間、なされた。そしてその後、懸
濁物を５〜１０℃で夜中保持した。細胞は、沈降物を形
成し、これは容易に解体できるものである。透明な過沈
降した液体をデカントして分離し、細胞沈降物を、ｐＨ
７．２の塩化ナトリウムの緩衝等張溶液で所定の微生物
濃度に希釈した。

実施例５ 実施例４と同様にして百日咳保護小体抗原の製造に用い
られる微生物懸濁物を得た。但し、感染性の不活性化は
、イタコン酸でおこない、最終濃度が１　０ｍｇ／ｍｌ
ＳｐＨ４．２となるようにした。

そして室温で２〜３時間保持した。更に微生物懸濁物の
処理は実施例４に記載されているようにしておこなった
。

この様にして得られた百日咳保護小体抗原（不活性化微
生物懸濁物）の不活性度（特定の滅菌）の制御および純
度（付随する微細植物の不存在）については、それぞれ
栄養物媒体中で培養し、無害性については、マウスの皮
下注射によってなされた。同様に、毒性、保護特性につ
いては、マウスの実験により百日咳と吸着ＤＰＴワクチ
ンの方法によってなされた（１．２）。

五つの実験で得られた百日咳保護小体抗原の全ては、乳
白色の均一な微生物懸濁物で、保持中容易に分離する沈
降物を形成した。微生物細胞は、典型的な形態学的で着
色の（　ＬｉｎｅＬｕｒｅ）特性を持ち、特定の集合性
と、羊と人の赤血球を凝集させる能力を持つ。

イタコン酸の殺菌作用の有効性については、酸濃度や接
触時間の関数であるｐＨや、温度が５〜１０℃、２０〜
２２℃の幾つかの異なる株から用意された微生物懸濁物
に関して評価された。希釈微生物懸濁物の培養は、カゼ
イン寒天と炭素を有し５％人血液を含む栄養物媒体によ
り、ペトリ上で１．２，３，４．１６．１８時間後にな
された。

その結果は５日後にチェックされた。実験がおこわれて
いる間、細胞消滅の過程は所定の条件で１〜４時間で終
了した。細胞の沈降は、１０〜１３ｍｇ　／　ｍｌのイ
タコン酸の濃度で、ｐＨ３．７の場合、通常３〜４時間
で終了する。濃度が低い場合この期間は長くなる（懸濁
物は温度５〜１０℃で朝まで保持される）。沈降物を形
成するための時間限度については、微生物の株が異なる
場合、若干の相違が見られた。

提案した方法を行った後に百日咳小体抗原を得、その毒
性を以下の試験に従って調べ、１０〜３０日後に評価し
た。すなわち、マウスの体の質量の増加と、リンパ球増
加後、作製物の注射後における末梢血液中のリンパ球の
数を数えることによる刺激活性により評価した。

実験では、１４〜１６ｋｇのマウスが使用された。

容積０．５ｍｌ中の１０１００中の百日咳小体抗原を腹
腔内に注射した。すなわち子供の単独適用量を導入した
。対照マウスは、塩化ナトリウムの等張溶液が注射され
た。マウスの重量は、７日間毎日測定された。

ＷＨＯの要請に基づけば、子供ワクチン用の単独免疫量
の少なくとも半分を各マウスに注射した後、３日目では
マウスの群の総量が初期重量と同じであるべきであり、
これに対して、７日目では対照マウスの重量に対して６
０％以上であるべきである。ペリスメント（ｐｅｒｉｓ
ｍｅｎｔ）は、５％未満であるべきである。

百日咳保護小体抗原は、カゼイン寒天と炭素とを持つ媒
体もしくは液体栄養物媒体で媒溶された微生物をイタコ
ン酸で不活性化した後に得られるが、これを注射した場
合、多量注射しても最初の２口間はマウスの重量減少は
生じず、７口目の体の質量の増加は６８．９％〜９１．
８％であった（表１参照）。マウスにはいずれも死滅す
ることはなかった。これらのデータによれば、この様に
作製された百日咳保護小体抗原は、１１〜３０日目に関
してもＷＨＯの毒性に関する要求を満すが、それだけで
なく、それを凌ぐものである（２，３）。

この様に作或された百日咳保護小体抗原は、リンパ球刺
激活性が低く、そのうちのいつつかは塩酸での沈降を含
む方法の後に得られたワクチンのそれよりも低い（表１
）。百日咳保護小体抗原の保護特性は、実験マウス中で
５０％の保証生存（ｓｕｒｌｉｖ１ｎｇ）のＥＤ，。適
用量に従って評価した。

この目的のために、研究された作製物の３つの五倍希釈
物をもちいてマウスを腹腔的に免疫せしめた。そして、
１４日後に、それらマウスの脳内を、活性の有毒な百日
咳微生物（１００ＬＤｓａ以上）で感染させた。すべて
の実験では、同じ微生物懸濁物から先に記載した方法に
従って作製された百日咳小体抗原ワクチンを含む。

本発明方法で作製された百日咳保護小体抗原は、ホルム
アルデヒドやメルチオレイトで作製されたワクチンと比
較して保護活性が高い。作製物のＥＤ，，は、上記ワク
チンより通常２．３〜５．３倍優れている（表１）。

微生物の懸濁物を不活性化するのに使用されるイタコン
酸は有機酸を示すことに注意する必要がある。これは動
物や植物の細胞の新陳代謝の自然の中間坐成物で、三炭
素酸の細胞サイクル中に含まれる。この物質は百日咳微
生物にのみ毒性である。

引用した公知資料 １．’７ｙクハロバ　エム、シー．「百日咳一ジフテリ
アー破傷風ワクチン。ワクチンと血清に関するマニュア
ル」　モスコー　パブリッシングハウス　「メデジナ」
１６４頁。

２．生物学的製造の標準化に関するＷＨＯエクスハート
のコミッティー、技術報告　６３８、ペーバ３（Ｌ，１
９８２．６５頁、Ｗ　Ｈ　Ｏ．３，生物学的生成物の最
小限の要求、厚生省、日本政府、１９８２．１２３〜１
２５頁。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　微生物を培養する工程と、その後微生物塊の沈降によ
   って不活性化された微生物の懸濁物を作成する工程と、
   過沈降した液体をデカントして、沈降物を塩化ナトリウ
   ムの等張溶液で希釈する百日咳保護小体抗原の製造方法
   において、不活性化は、微生物の懸濁物中の最終濃度が
   ３．７５〜１３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ３．７〜４．２となる
   ようにイタコン酸に、１〜４時間接触することを特徴と
   する百日咳保護小体抗原の製造方法。