KR810001317B1 - 혼합백신의 제조방법 - Google Patents

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Description

혼합백신의 제조방법

제1도 및 2도는 실시예 2 및 3의 혼합백신에 대한 어린 쥐에서의 항체반응 결과를 나타낸 것이다.

제3도는 실시예 5의 혼합백신에 대한 어린쥐에서의 항체 반응결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 뇌막염과 같은 헤모필루스 인플루엔자 타입 b(Haemophilus influenzae type b)감염에 대한 면역백신에 관한 것이다. 특히 본 발명은 (1) 헤모필루스 인플루엔자 타입 b 배양액으로부터 항원성 폴리리보실리비톨 포스페이트(PRP)를 분리시키는 방법과 (2) PRP와 B. 페르투시스(pertussis,백일해) 항원을 함유하는 혼합백신의 제조법에 관한 것이다. 본 발명의 PRP는 또한 E.콜리, B.서브틸리스, S.아우레우스, B.푸니루스 및 L.플란타룸과 같은 박테리아의 다른 비병원성 균주와 함께 사용될 경우 온혈동물에서의 항체반응을 저지하는데 유효하다. 헤모필루스 인플루엔자 타입 b로부터 얻은 순수한 폴리리비톨포스페이트(PRP)는 보호면역원으로서 관찰되고 있다. 그러나 어린 동물이나 유아에서의 활성항원반응은 이루어지지 않았다. 종래의 정제방법에서는 에탄올과 세타블론(헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드)을 사용했다. 이 다당류의 항원성에 손상을 가져올 수 있는 오염물, 내독소 및 발열성물질은 냉페놀 또는 클로로포름과 t-부탄올을 사용하여 제거한다. 헤모필루스 인플루엔자 타입 b로부터 면역활성을 가진 PRP를 분리 및 정제시키는 새로운 방법이 개발되었다.

본 방법은 모든 오염물(헥산, 단백질 및 내독소)을 수산화인석회로 처리하여 최소치로 제거한 점에서 종래의 방법보다 아주 유리하다.

본 발명에 의해 제조되는 PRP는 종래의 것보다 고분자량의 다당류를 제공한다. 특히 본 신규방법에 의해 제조된 PRP는 종래의 방법에 의해 제조된 PRP는 종래의 방법에 의해 제조된 PRP와는 달리 온혈동물에서 면역원성이 높다. 다당류 PRP내의 오염물(단백,헥산 및 내독소)제거법은 지시된 조건하에서 다당류는 흡수하지 않는 흡착제를 함유하는 인산염으로 부분 정제된 다당류를 처리함으로써 수행된다.

본 발명의 두 번째 목적은 어린 동물에서 면역원성이 높은 PRP와 페르투시스의 혼합백신을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

(Ⅰ) 헤모필루스 인플루엔자 입자 타입 b의 캡슐형 다당류인 폴리리보실리비톨 포스페이트의 분리 및 정제

[미생물, 생장배지 및 배양]

헤모필루스 인플루엔자 타입 b의 균주 2개를 사용했다. Rab 균주는 그레이스 레이디 소아병원(Grace Leidy, Babies Hospital, Columbia University, New York City, New York)으로부터 얻었다. CK균주는 워터버리 병원(Waterbury Hospital Waterbury, Conn)의 환자로부터 얻었다. 미생물을 그들의 병속력을 확보하기 위해 여러번 생쥐를 통과시켰다. 미생물은 3.7% BHI(Brain Heart Infusion)(Difco Lab., Detroit Mich) 배지나 또는 0.01% NAD(P-L Biochemicals, Milwaukee, Wis) 및 1%(V/V) 섬유소 제거말 혈액(Animal Blood Center, Syracuse, N.Y)을 보충한 5% BHI한천 배지상에서 2차 배양한 생쥐의 뇌 조직으로부터 해결법으로 분리시킨 다음 액플당 1ml씩 나누어 넣고 동결 건조시켜 -70℃에서 저장한다. 미생물 생장에 사용되는 기본 배지는 3.7% BHI이다. 기본배지를 1ℓ당 NAD 10mg과 헤민 20mg(Eastman kodak, Rochester, N.Y)으로 보충시킨다. 종배양액 50㎖당 1%(V/V)섬유소제거 말혈액을 가한다. 보충물을 새로 제조한 다음 0.45M Nalgene 여과기(Nalge Sybron Corp., Rochester, N.Y)를 통해 여과하여 사용한다. 14ℓ 발효기에서 세균을 배양하기 위해 배지에 0.5% 포도당을 더 보충시킨다.

한 플라스크의 종자세균을 제조하기 위해 동결된 배양원액 1ml를 융해시켜 섬유소제거 말혈액 및 NAD를 보충한 BHI 강화배지 50ml에 옮긴다. 150rpm의 진탕기상 37℃에서 8시간동안 배양한다. 2ℓ플라스크에 강화 BHI 육즙 500ml를 넣고 여기에 세균을 1% 접종물로서 가한 다음 진탕기상에서 중정도로 교반하면서 37℃에서 8시간(PRP분리) 또는 14시간(종자배양)동안 배양시킨다. 14ℓ발효기내에서의 각 뱃치의 발효는 종자배양액 700ml를 섬유소제거말 혈액 대신 헤민을 보충한 BHI 강화배지 7ℓ에 무균적으로 옮기는 것으로부터 시작된다.

배양액은 37±1℃로 계속 유지시킨다. 탱크를 150rpm의 속도로 교반하고 기류를 0.25ℓ/공기 ℓ/분로 유지시킨다. 배양중 0.001%의 실리콘 안티폼(FD-82, Hodag Chemical Corp)를 필요에 따라 첨가한다.

배양액을 약 8시간동안 8~10×10⁹세포/ml의 생장속도로 배양하고 0.4% 포름알데히드를 가하여 반응을 종결시킨 다음 4℃에서 하룻밤 방치한다.

[폴리 리보실 리비톨 포스페이트(PRP)의 분리]

상기와 같이 제조된 배양육즙을 4℃의 온도에서 30분간 27,000×g의 속도로 원심용리했다. 탈세포 상등액을 모아 하기와 같이 처리했다.

[단계 1 에탄올 침전]

배양 상등액에 초산나트륨을 가했다(최종농도 4%). 용액을 pH 6.0~6.2로 맞추고 3A에탄올 44ℓ를 4℃에서 교반하면서 천천히 가했다. 혼합물을 빙초산을 가해 pH 6.8로 맞추고 3℃에서 12시간 동안 방치했다. 생성된 침전을 경사하여 모은 다음 원심 분리하여 불순한 PRP를 얻었다.

[단계 2 세타블론(헥사데실트리메틸 암모늄브로마이드)처리]

단계 1로부터의 침전물을 발열성 물질이 없는 증류수에 용해하고 원심분리 하여 잔사를 제거한다. 맑은 갈색용액을 10% 세타블론 수용액 1000ml에 천천히 가하여 혼합했다(최종농도 0.5%). 혼합물을 1시간동안 교반한 다음 원심분리했다. 헥산과 PRP-세타블론 혼합물의 침전을 0.3M 염화나트륨 2ℓ와 혼합했다.

탁한 용액을 원심분리하여 헥산-세타블론염과 같은 불용성 물질을 제거한다. 상등액을 동용량의 물로 희석하여 PRP-세타블론염을 침전시킨다. 혼합물을 1시간 교반하고 원심 분리하여 침전을 모으고 이어 0.3M 염화나트륨 2ℓ에 용해시킨다.

[단계 3 에탄올 침전]

세타블론과 헥산 및 단백질 오염물을 에탄올 침전에 의해 한번 더 제거한다(2회이상). PRP를 세타블론을 알콜성 용액에 용해시키면서 단계 1에서와 같이 침전시킨다. PRP를 원심분리하여 회수하고 발열성 물질이 없는 증류수 2ℓ에 용해시킨 다음 상기와 같이 재침전시킨다. 최종 PRP침전을 pH 6.8의 인산나트륨 20mM에 용해시킨다.

[단계 4 수산화인석회 처리]

부분 정제된 PRP제제중의 오염물(예 : 헥산, 단백 및 내독소)를 수산화인석회[3Ca₃(PO₄)₂·Ca(OH)₂]와 같은 흡착제 함유 인산칼슘에 흡착시켜 선별 제거한다. 본 발명은 다당류 PRP가 pH 약 6.7~6.9의 인산염 완충액(20mM)이나, pH 5.8의 인산염 완충액 (50mM)을 함유하는 인산칼슘 흡착제에 흡착되지 않는데 반해 오염물(헥산, 단백 및 내독소)은 이 조건하에서 흡착되는 사실에 근거를 둔 것이다. 본 발명의 방법은 뱃치법 또는 컬럼조작으로 수행될 수 있다. 이 뱃치법에서는 수산화 인석회를 부분 정제된 PRP제제에 가한다(20mM 인산염 : pH 6.9).

혼합물을 잘 혼합하고 원심분리하여 바람직하지 못한 고체(흡착제와 흡착제에 흡착된 오염물)을 제거한다. 상등액에 대해 상기와 같은 조작을 2회 이상한다. 생성된 용액을 밀리공 여과기로 여과하고 발열성물질이 없는 증류수로 투석하고 동결 건조한다. 컬럼조작에서 20mM 인산염(pH 5.8이상)종의 부분정제된 PRP를 pH 5.8의 20mM 인산염 완충액과 평형상태인 흡착제, 수산화인석회를 함유하는 컬럼에 넣고 20mM부터 10mM의 인산나트륨완충액(pH 5.8)로 단계적으로 용출시킨다. 분획물을 모으고 오탄당(폴리리보실 리비톨 포페이트)을 분석한다. 오탄당에 양성인 분획물을 발열성 물질이 없는 증류수로 투석하고 동결건조시킨다.

(Ⅱ) H. 인플루엔자 타입 b로부터의 PRP와 B.페르투시스항원으로 구성된 혼합백신의 제조법

PRP 백신을 제조하기 위해 동결 건조된 PRP(상기와 같이 제조된 것)을 인산염완충식염수(PBS) 1ℓ당 0.113g의 인산칼륨, 0.83g의 인산나트륨 및 8.5g의 염화나트륨, pH 7.0, 0.01% 티메토살함유)에 20㎍/ml농도로 용해시킨다. 백신을 0.45μ밀리공의 여과장치를 통해 멸균 여과하고 유리바이알에 넣은 후 4℃에서 보관한다. 농축액은 일정량의 다당류를 평량하여 이것을 인산염완충식염수(ℓ당 0.113g의 인산칼륨, 0.83g의 인산나트륨 및 8.5g의 염화나트륨, pH 7.0 0.01% 티메로살함유)에 용해시켜 제조한다. 이 PRP농축액을 B.페르투시스 세포 현탁액 적당량과 혼합하여 원액을 제조한다. B.페르투시스 138의 특성은 1974년 미국 메리렌드주 더블류 엠 에스 앤드 윌킨스사의 부케난과 기본스 편저 기세균학편람 8권 283면에 기재되어 있으며 이 종은 미국 메리렌드대학 보관번호 10380의 배양액으로부터 얻을 수 있다. 이 원액중의 혼합백신용 ml당 PRP 200㎍ 및 약 70OP의 세포를 함유한다. 최종생성물(백신)이 제조되기전에 페르투시스 항원을 무독화시키기 위해 원액을 4℃에서 90일간 보관한다. 백신은 0.5ml당 PRP 10㎍ 및 페르투시스세포 3.5OP 단위를 함유한다.

[실시예 1]

수산화인석회(예 BiO. gel HTP, BiO-Rad Laboratories, Richmond, Calif) 2.5g을 부분정제된 PRP제제(세타블론과 에탄올 처리후)(약 1.0mg PRP/ml함유)를 pH 6.9의 인산나트륨 완충액 20mM에 녹인 용액 250ml에 가하고 1시간 동안 빙냉수욕(1~4℃)에서 혼합한다. 혼합물을 Sorvall RC 2-B중에서 16,000×g의 속도로 30분간 원심분리했다. 상등액을 0.65밀리공의 여과기를 통해 여과한 다음 상기 과정을 2번 더 반복했다(매번 수산화인석회 2.5g으로 처리). 생장된 용액을 0.65 및 0.45밀리공 여과기를 통해 여과하고 발열성 물질이 없는 증류수로 투석한 다음 동결 건조한다. 동결건조된 생성물은 강한 면역원성(하기의 혼합백신 및 동물시험 참조)를 나타내며 오염물(헥산, 단백질 및 내독소 같은 것)을 극히 소량 함유한다.

(표 1 참조). 동결건조된 PRP 약 170mg을 얻었다. 이 방법에 의한 PRP의 회수는 출발다당류의 약 70%이다. PRP는 예컨대 오산화인 및 실리카겔상 데시케이터중 4℃와 같은 적당한 조건하에서 저장해야 한다.

[실시예 2]

부분정제된 PRP(300mg PRP)를 pH 5.8의 20mM 인산나트륨 완충액 100ml에 녹인다.(예; 3mg PRP/ml)이 용액을 실온에서 수산화 인석회컬럼(pH 5.8의 20mM의 인산나트륨 완충액과 편형인 베드용량 약 250mg)에 넣고 20mM, 50mM, 100mM의 인산나트륨 완충액(pH 5.8)으로 단계적으로 용출시킨 다음 오탄당에 양성인것(오르시난법에 의해 오탄당 측정)을 모은 다음 발열성 물질이 없는 증류수로 투석하고 동결건조된 생성물 PRP 약 206mg을 얻는다. 다당류 PRP의 순도는 그들이 헥산, 단백 및 내독소 에 어느정도 오염됐나를 측정하여 검정한다. 단백질의 농도는 표준품으로 노혈청 알부민을 사용하여 Lawry법(J. Biol. Chem, 193 : 265(1951))으로 측정한다. 헥산은 260nm에서의 PRP용액의 흡광도로서 측정한다. 헥산 50㎍을 물 1ℓ에 녹인 용액의 1cm셀에서의 흡광도를 1.0으로 규정한다. 분자크기를 1.5×90cm 컬럼상 세파로스 4B 또는 2B 겔여과법을 사용하여 측정한다.

(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway. N.J)분배계수(kd)치를 오르시난반응에 의해 전개된 용출패턴으로부터 계산한다. (Microbiology, Herbert et al의 방법 Vol 5B, 285~291).

[표 1]

바람직한 PRP의 물리-화학적 특성

a) 세파로스 2B 및 4B를 사용, 분자량 2×10⁷

b) 세파로스 4B를 사용

c) ㎍ PRP/토기몸무게 kg에서 열을 산출하지 않음.

d) 생물학국 (局) EⅠ(내독소 표준품)와 비교시 PRP(100㎍ PRP/ml)의 역수 회석.

실시예 1은 미국 메리렌드대학 보관번호 31551호의 배양액으로부터 얻을 수 있는 헤모필루스 인플루엔자 Bck의 특성을 나타내며 실시예 2는 미국 뉴욕의 콜롬비아대학 소아병원으로부터 얻을 수 있는 헤모필루스 인플루엔자 B Rab의 특성을 나타낸다.

[실시예 3]

H.인플루엔자 타입 b로부터의 PRP와 B.페르투시스 항원을 함유하는 혼합백신을 하기와 같이 제조한다. PRP 140mg(실시예 2에서 제조된 것)을 멸균인산염완충 식염수(PBS)(ℓ당 인산칼륨 0.113g, 인산나트륨 0.83g, 염화나트륨 8.5g함유 pH 7.0, 0.01% 티메토살함유)350ml에 녹이고 0.45V 밀리공 여과기를 통해 여과한다. 농축된 PRP용액을 PRP 및 B 페르투시스 항원으로 구성된 혼합백신을 제조하는데 사용한다. 농축 PRP용액 150ml(400㎍/ml)에 B-페르투시스(균주 138)세포현탁액을 PBS에 녹인 pH 7.0의 용액 150ml(149op unit cells/ml)에 가하여 혼합백신의 원액을 제조한다. 이 원액(300ml)를 페르투시스 내독소치가 감소될 때까지 (90일 이상) 4℃에서 보관한다. 원액의 멸균성을 티오글리콜레이트 배지로 32~33℃에서 검사한다. 90일 배양후 원액의 pH를 첵크하고 pH 7.0±1로 맞춘다. 동물시험용 최종 생성물(백신)은 혼합원액을 PES로 희석하여 조재하며 이것은 PRP 10㎍ 및 페르투시스 세포 3.5op/0.5ml를 함유한다. 이 혼합백신의 어린쥐에 대한 항체반응결과를 하기 제1도 및 제2도에 표시했다.

[실시예 4]

PRP 30mg(실시예 1에서 제조한 것)을 멸균인산염 완충식염수(PBS) 75ml에 녹이고 0.45V 밀리공 여과기를 통해 여과하며 PRP원액(400㎍/ml)을 제조한다. 이 농축 PRP 25ml에 새로만든 B.페르투시스(균주 138)세포의 PBS중 현탁액(pH 7.0 149 OP 단위세포/ml)을 동용량(즉 25ml)가하여 혼합백신원액을 조제한다. 이 원액(50ml)을 90일 이상 4℃에 보관한다. 원액의 멸균성은 티오글리콜레이트 배지를 사용하여 앞서와 같이 감사한다. 원액의 pH는 7.0±1이다. 동물시험에 사용된 최종 생성물(백신)은 혼합원액을 PBS와 혼합하여 조제하여 조제하며 이것은 PRP 10㎍과 페르투시스 세포 3.7OP단위/0.5㎖(용량)을 함유한다.

[실시예 5]

PRP원액(200mg/ml in PBS(pH 7.0))을 실시예 4에서와 같이 제조한다. 페르투시스원액(75OP단위/ml)은 새로 만든 B 페르투시스 세포현탁액(149OP단위/ml)25ml를 동용량의 PBS로 희석하여 제조한다. 원액을 각기 4℃에서 90일간 또는 그 이상 배양한다. 혼합백신은 PRP원액 14ml와 (무독화된)페르투시스 항원원액(75OP단위/ml) 14ml를 취해 112ml의 PBS로 희석함으로써(최종용량 140ml)제조한다. 동물시험에 사용되는 최종백신은 0.5ml당 10㎍의 PRP와 3.7OP단위의 페르투시스를 함유한다. 이들 혼합백신의 어린쥐에서의 항체 반응결과를 하기 제3도 및 표 2에 표시했다.

[표 2]

어린 쥐a에서의 PRP-페르투시스 복합체의 면역원성

a) 용량(0.5ml)당 10㎍ PRP 또는 3.5OP단위 페르투시스.

b) 부스터-각기 2째 및 3째주(복합주사).

c) 평균 10마리의 쥐. d) 단일주사.

Claims (1)

1. 미생물 헤모필루스 인플루엔자 타입 b균주를 통상의 조건하에서 발효하고 에탄올 침전법으로 PRP를 분리시키고 이 PRP를 통상의 방법으로 헥사데실트리메틸암모늄브로마이드 복합체로서 재분리시키는데 있어 pH 6.7~6.9에서 0.02M 인산나트륨 완충액중의 수산화인석회[3·Ca₃(PO₄)₂Ca(OH)₂]를 첨가하여 PRP를 정제하고 약 4℃에서 혼합한 후, 원심분리하고 상등액을 제거하는 상기 과정을 2회 이상 반복한 다음, 상등액을 적당한 여과기로 여과하고 발열성물질이 제거된 증류수로 투석하고 동결건조시키는 것을 특징으로 하는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b의 캡슐형 다당류인 면역활성을 가진 폴리리보실리비톨포스페이트(PRP)를 분리정제하는 방법.

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