KR840001512B1

KR840001512B1 - 백일해 톡소이드의 제조방법

Info

Publication number: KR840001512B1
Application number: KR1019810000199A
Authority: KR
Inventors: 유끼오 슈우구다; 히데오 와다나베; 시게오 마쯔야마
Original assignee: 다께다 야꾸힝 고오교오 가부시기가이샤; 고니시 신베이
Priority date: 1980-09-12
Filing date: 1981-01-23
Publication date: 1984-09-29
Also published as: ES499112A0; HU185404B; EP0047802B1; EP0047802A2; JPS5750925A; NO159667B; CA1152001A; NO810014L; NO159667C; DK9281A; JPS64928B2; DE3069433D1; US4455297A; GB2083358A; DK155915B; EP0047802A3; ES8202058A1; SU1297712A3; KR830004851A; DK155915C

Abstract

내용 없음.

Description

백일해 톡소이드의 제조방법

본 발명은 백일해 톡소이드의 제조방법에 관한 것이다.

백일해는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)에 의한 전염병으로서 유아에게 특히 심한 영향을 준다.

현재 이 질병을 예방하기 위하여 백신을 사용하여 왔다. 그러나, 백신은 원인 박테리아 전체세포로부터 제조되기 때문에, 이것은 열과 다른 부작용을 일으킨다. 따라서 이들 부작용을 제거하는 것이 절실히 요구된다. 보르데텔라 페르투시스로부터 유효한 성분을 분리하기 위한 실험을 많이 해 왔지만 어떠한 공정도 만족스럽지 못하였다. 보르데텔라 페르투시스에 의한 오염이 상기의 박테리아로부터 방출된 외독소에 의한다는 것(M. 피트만 : ″전염병의 관찰″, 1, p.401-412, 1979)은 페르투시스 톡소이드에 의한 보호의 가능성을 보였지만 페르투시스 톡소이드를 얻는 것을 보고한 것은 없었다.

상기의 기술적 배경에 대응하여, 본 발명은 최초로 무독화법에 의한 페르투시스 톡소이드의 제조에 성공하였다.

따라서, 본 발명은 독성이 낮고 매우 높은 면역성을 지니는 페르투시스 톡소이드의 제조방법을 제공한다.

위의 목적은 배양상층액 또는 이것의 농축물에서 내독소를 제거하며 이 결과의 액에서 페르투시스 외독소를 포름알데히드가 염기성 아미노산이 없는 곳에서 액에 반응하도록 하여 응집시키므로서 실현시킬 수 있다.

본 발명에 따라서, 보르데델라 페르투시스 상 I 균주 혹은 이것의 농축물을 사용한다. 보르데텔라 페르투시스상 I 균주의 배양은 알려진 것이다. 즉, 약 35℃로 약 5에서 7일간 액체 배지(코헨-휠터 배지, 스타이너와 솔트배지 등)에서 배양한다. 배양 상층액은 필터 혹은 원심분리로 수집한다. 이 상층액 혹은 농축물은 이것의 내독소를 제거하는 연속단계에서 사용될 수 있다. 농축물은 통상의 염출법으로 얻을 수 있다. 즉, 2에서 5㎏의 암모늄 설페이트를 10ℓ의 각 상층액에 가하고, 혼합 후 형성된 침전물은 필터나 원심분리로 수집한다. 이 침전물은 1M 염화나트륨을 가한 알맞는 양의 0.05M 인산염 완충액에 용해시키고, 상층액은 원심침전 또는 농축액에 주어진 공정으로 산출한다.

상기의 상층액이나 농축물은 내독소를 제거하기 위하여 처리한다. 내독소의 제거는 자당농축원심분리, 포타슘 타트레이트 농축원심분리, 염화세슘 농축원심분리, 겔필터 등으로 행할 수 있다. 특히, 양호한 것은 상기의 상층액이나 농축물을 10에서 24시간 동안 62,000에서 122,000G의 속도로 약 0에서 60W/W% 자당 농축상에서 원심 분리시켜 행하는 것이다.

본 발명에서 특히 양호한 것은 위에서 얻은 페르투시스 외독소액의 외독소를 포름알데히드와 염기성 아미노산이 없는 상태에서 반응시켜 페르투시스외독소가 응고되도록 하는 단계에 있다. 따라서, 무독성 톡소이드를 지닌 침전 세정된 백신과 무독성 톡소이드를 지닌 침전 세정된 페르투시스-디프테리아-테타누스 3가 백신은 독성이 낮으며 매우 높은 면역성을 지녔다. 이같은 효능은 L-리진과 같은 염기성 아미노산의 존재하에 포름알데히드가 작용하도록 하여서 제조된 페르투시스 톡소이드에서는 이루어질 수 없다.

일반적으로, 디프테리아와 같은 박테리아성 외독소는 포름알데히드와 독분자 사이의 결합을 완화시키므로 L-리진과 같은 염기성 아미노산의 부가적인 첨가가 없이는 안정한 중합체의 획득이 어렵다. 페르투시스 외독소의 경우에, 기대치 않게도 아미노산이 없는 상태에서 포르말린 탈독성화는 반대로 외독소의 중합을 촉진하여서 응집 항원 덩어리를 형성한다. 이것은 면역성 분자크기를 증가시키고 고단위 페르투시스 톡소이드의 생산을 가능하게 한다.

상기의 응집화 처리는 포르말린(즉, 37W/V% 포름알데히드 수용액, 혹은 물로 희석된 것을 L-리진과 같은 염기성 아미노산이 없는 상태(10mM 이하)에서 페르투시스 외독소에 가하고 페르투시스 외독소를 탈독소화때까지 배양하여서 행한다. 항상 포르말린 혹은 외독소액의 희석액을 염기성 아미노산이 전혀 없는 것과 혼합하여서 포르말린이 약 0.1에서 0.6V/V% 농도가 되도록 하여서 포르말린이나 그 희석물이 상기 범위에서 약 32℃에서 42℃로 약 3에서 14일간 배양하는 것이 바람직하다.

상기의 처리에 의하여, 페르투시스 외독소를 응집시킨 후, 탈독소화 처리하여서 응집 페르투시스 톡소이드 함유 현탁액을 산출한다. 이 결과의 응집 톡소이드 덩어리는 약 10에서 50kc의 초음파로 톡소이드액이 되도록 분산시킨다.

본 발명의 방법에서, 투석 처리되는 반응성 단계사이에서 수행한다. 이같은 투석은 그 자체의 방법으로 수행할 수 있다.

정확히 전세포 백일해 백신액에서, 페르투시스 톡소이드액은 침전 세정된 페르투시스 백신 혹은 침전세정된 페르투시스-테타누스 3가 백신에서 처리할 수 있으며 인간에게 투여할 수 있다.

하기의 실시예는 본 발명을 더욱 잘 설명하지만 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

하기의 실시예에서 토하마 상 I 균주(보르데텔라 페르투시스)의 특징은 [″감염과 면역″, 6, p.899-904(1972)]에 서술되어 있다. 이 균주는 일본 동경의 NIHJ에 보고되어 있으며 IFO-14073의 일련번호로 일본오사카에 저장되어 있다.

본 명세서와 청구범위에서, ″㎍″, ″㎎″, ″g″, ″㎏″, ″㎖″, ″ℓ″, ″℃″, ″mM″, ″M″, ″r.p.m.″, ″kc″ ″R_max″, ″G″, ″IU″ 및 ″Lf″는 ″각각″ 마이크로그람(스), ″밀리그람(스)″ ″그람(스)″, ″킬로그람(스)″, 밀리리터(스)″, ″리터(스)″, ″디그리(스)센티그리드″, ″밀리몰농도″, ″몰농도″, ″분당회전″, ″킬로사이클″, 반경최대″, ″중력″, ″국제단위″ 및 ″응결한도″를 의미한다.

[실시예 1]

보르데텔라 페르투시스의 토하마상 I 균주를 감자, 펩톤, 염화나트륨, 우무 및 소혈청의 보르데트-겐고우배지에 접종시키고 35℃에서 2일간 배양하였다. 그후, 반투명의 환형 콜로리를 체취하여서 응집항체에 반응하는 콜로니는 다시 종배지용으로 보르데트-겐고우 배지에서 성장시켰다. 이 배지는 코헨-휠터 액체배지(표 1)를 121℃에서 60분간 고압살균 후 즉시 약 40℃로 식혀서 제조하였다. 이 배지는 37℃에서 보존하였다.

위의 종배양물을 이 배지에 가하여 200에서 300백만셀/㎖가 되도록 하고 잘 저은 후, 병당 0.2ℓ로 록스병에 접종시키고 즉시 배양기에서 배양하였다. 배양기간은 세포성장조건에 따른다. 최대생산은 닭적혈구에 대한 배지액의 혈구응집가(″감염과 면역″, 7, p.922-999(1978)에 서술된 방법)가 최고인 5일째이었다. 따라서, 이 액을 함께 섞고 원심 분리하여서 20.2W/V%의 암모늄설페이트를 상층액에 가하였다. 잘 교반 후 이것을 4℃에 방치하였다. 7일 후, 상층액을 깔대기로 거르고 침전물은 수집하고 8,000rpm으로 10분간 원심분리시킨다. 상층액은 제거하며 본 침전물에 1M 염화나트륨-0.05M 인산염 완충액(pH8.0)의 1/10부피를 가하였다. 잘 교반하고 다시 4℃에서 7일간 방치하고 이후 다시 원심 분리시키고 상층액을 수집하였다(수출 I). 이 상층액은 펌브리에, 백혈구증다촉진자(LPF), 히스타민 감응자(HSF) 및 내독속가 풍부하다. 추출 I은 제농축하고, 동부피의 포화암모늄 설페이트(암모니아로 pH 8.0으로 맞춤)를 이곳에 가하고 이것을 4℃에서 7일간 방치하였다. 이 암모늄 설페이트 부분은 20분간 1000rpm에서 원심 분리하여서 침전물을 수집하고 1M 염화나트륨-0.05M 인산염 완충액(pH 8.0) 1/300부피를 가하였다. 완전히 혼합 후, 반투성막의 투석관에 놓아서 외부용액으로 1M용액의 염화나트륨(pH 8.0)을 써서 암모늄 설페이트를 제거하였다. 투석된 농축물은 하기의 자당 농축원심분리기에 가하였다.

미리 살균된 원심분리 회전자(1700㎖ 용량)과 실기구를 저속해서 작동시키고 1300㎖의 5W/V%에서 30W/V% 자당용액을 그레디언트 펌프로 공급하였다. 100㎖의 상기의 투석된 농축물을 가하고 300㎖의 피막액(0.5M 염화나트륨용액 pH 8.0)을 가하였다. 회전자는 R_max89,400G로 18.5시간 작동시켰다.

원심분리 후, 34W/V% 자당 용액을 저속에서 가하고 회전자내의 액은 50에서 100㎖ 부분으로 수집하였다. 이 수집은 저농도 자당으로부터 행하고 높은 혈구응집성 20역가/㎖ 이상, 특히 500역가/㎖ 이상)과 내독성이 적은 부분이 수집되었다. 내독성이 거의 없는 것은 토끼 발열도검사로 결정하였다. 즉, 각 부분샘플을 100℃로 3분간 가열하고 생리식염수로 20HA역가/㎖로 희석하였다. 이것을 몸무게 ㎏당 1㎖로 혈관내 주입하였다. 3시간 내에 발열이 없는 것을 선택하고 의독소액으로 혼합하였다.

외독소액은 M/250인산염 완충염수(pH7.0)으로 약 50㎍/㎖의 프로토테인아세우스 N농도로 희석하였다. 이 단계에서, 젤라틴, 트윈 80(폴리옥시에티렌 소르비탄 모노래이트 ; 카오-아트라스, 일본)과 티머로살을 가하여서 0.02W/V%의 젤라틴, 0.05V/V%의 트윈 80 및 0.01W/V%의 티머로살의 농도로 만들었다.

이 용액에 염기성 아미노산을 전혀 가하지 않고, 0.2V/V%농도가 되게 39℃ 배양기에 가하고, 완전혼합 후, 동일한 배양기에 방치하였다. 하루후 포르말린을 0.2V/V% 농도로 39℃ 배양기에서 가하고, 완전히 혼합한 후 동일한 배양기에서 더 배양하였다. 2일 후, 포르말린을 0.4V/V%로 가하고 잘 혼합한 후 총 5일간 배양기에서 배양하였다. 이 결과의 응집된 톡소이드 함유 서스펜젼을 외부용액으로 0.01V/V% 포르말린-생리식염수로 투석하였다. 이 투석은 항상 교반되는 외부용액을 4℃에서 2일간 투석판관에 상기 현탁액을 위의 외부용액의 내부적 호름부피에 대하여 12.5회 투석하여 행하였다. 이 외부용액은 2일후 신선한 것으로 대치하고 투석을 반복하였다. 투석된 응집톡소이드 현탁액은 페르투시스백신에 알맞는 여러 가지 검사를 하여서 톡소이드액으로 사용하였다. 최종 제조 이전에, 응집 톡소이드 현탁액은 초음파처리(10kc, 5분)를 하고 400메쉬필터로 걸려서 최종의 페르투시스 톡소이드액을 제조하였다. 조절용으로서, 외독소액을 0.05ML-리진과 함께 포르말린 처리를 하고 계속해서 위와 같이 처리하여서 표준액을 제조하였다.

위에서 얻은 페르투시스 톡소이드액과 표준액은 레빈방법에 따라 처리하였다(레오, 레빈, 조세프엘, 스톤과 루이스 와이만 : 디프테리아와 테타누스 톡소이드에서 알루미늄 좌약효능에 영향을 미치는 인자, 면역학지 75, p301-307, 1955). 즉, 각각은 M/250인산염 염주완충액(pH 7.0)으로 20㎍/㎖ 혹은 그 이하의 프로테나시우스 N농도로 희석하고, 염화알루미늄을 0.18W/V%농도로 가하였다. 잘 교반하고 염화수소산 혹은 수산화나트륨으로 pH7.0으로 조절하여서 알루미늄/㎖ 측면에서 약 0.2㎎의 알루미늄-침전물백신을 산출하였다. 이것의 특징은 표2에 서술되어 있다. 통계적인 처리 후, LPF는 0.5LPU/㎖ 당량 이상이 아닐 경우에 알맞으며(″약과 생물학″, 83, p117-123에 서술된 방법으로 결정된 백혈구증다촉진단위) 그렇지 않을 경우 알맞지 아니하다. 동일하게, HSF는 0.8HSU(″생물학적 표준화지″, 7(1979), p21-29)/㎖ 당량 이상이 아닌 경우 알맞으며 그렇지 않을 경우 부적당하다. 쥐의 보호역가는 동일하게 통계적 처리후 최소한 8IU(면역후 3주에 감염됨)/㎖ 혹은 그 이상의 경우에 알맞으며 반대의 경우에 부적당하였다.

표 2에 명백하듯이, 본 발명의 탈독소법에 의거하여 전체 14개 생산뱃취에서 LPF, HSF 및 및 쥐의 보호역가에 대하여 평균역가가 13.5IU/㎖로서 거부반응은 전혀 발견되지 아니하였다. 반대로, L-리진이 가해질 경우, 23-뱃취염의 생산은 4LPF 거부, 8HSF 거부 및 10역가 거부가 있어서 총계는 6/23=26%가 받아들일 수 있는 것이었다.

[표 1]

위의 성분을 증류수로 희석하여 150ℓ로 만들고, pH 7.0에서 7.2로 조절 후 살균하였다. 이후, 하기물질을 가하였다.

[표 2]

[실시예 2]

실시예 1에서 제조된 페르투시스 톡소이드액, 일본 생물학적 생산물 표준에 맞는 디프테리아 톡소이드 및 테타누스 톡소이드를 실시예 1에서와 같이 침전처리를 하여서 침전세정된 페르투시스-디프테리아-테타누스 3가 백신을 제조하였다. 이 백신의 조성분은 하기와 같음 :

이 3가 백신의 주요특성은 다음과 같다 : 수소이온농도(역반응가) 7.0 : 토끼발열도(염수로 50배 희석후 몸무게에 대하여 1㎎/㎏으로 혈관내 주업), 음성 : 쥐 몸무게 감소, 10BWDU(의과학생물지, 21, 115-135에 서술된 방법으로 결정된 몸무게 감소단위)/㎖ ; 생쥐 백혈구다중 촉진활성, 0.5LPU/㎖당량 이하 ; 생쥐 히스타민 감응활성, 0.8HSU/ ㎖당량이하 ; 페르투시스 톡소이드역가, 8IU/㎖ 당량 ; 디프테리아 톡소이드역가 45IU/㎖ 당량 ; 테라누스 톡소이드역가, 30IU/㎖ 당량. 3가 백신은 다음 계획에 따라서 인간에게 주입할 수 있다.

3에서 48개월 된 유아의 경우 0.5㎖ 백신은 3회 2에서 8주의 간격으로 피하 주사한다. 주사후 12에서 18개월 후 0.5㎖ 백신을 추가로 피하 주사한다.

Claims

보르데텔라 페르투시스상 I 균주의 배양상층액 혹은 이것의 농축물로부터 내독소를 제거하고 이 결과의 액에서 페르투시스 외독소를 포름알데히드가 염기성 아미노산이 전혀 없는 액에 대하여 작용하도록 하므로서 응집을 일으키도록 하는 백일해 톡소이드를 제조하는 방법.