JP2634545B2 - Ｒｔｘトキシンファミリーに属する細菌毒素ワクチンの製造法 - Google Patents
Ｒｔｘトキシンファミリーに属する細菌毒素ワクチンの製造法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- A61P31/04—Antibacterial agents
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＲＴＸトキシンを産生
する細菌によって引き起こされる感染症の予防に有効
で、かつ安全性の高いワクチンの製造法に関する。
する細菌によって引き起こされる感染症の予防に有効
で、かつ安全性の高いワクチンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アクチノバシラス プルロニューモニエ
（Actinobacillus pleuropneumoniae）、アクチノバシ
ラス スイス（Actinobacillus suis）、パスツレラ
ヘモリチカ（Pasteurella haemolytica）、エシェリキ
ア コリ（Escherichia coli）等の細菌は、互いに血清
学的交差性を示す特有の菌体外毒素を産生する。これら
の毒素は１０３から１１０KDaの分子量を有するタンパ
ク質で、その構造遺伝子内に一定のアミノ酸のくり返し
配列が存在することからＲＴＸ（repeats in thestruct
ural toxin）トキシンファミリーの毒素と呼ばれてい
る。これらの毒素は、赤血球、好中球マクロファージ等
の細胞に障害を与え、細胞を溶解させて最終的に宿主に
疾病を引き起こす。
（Actinobacillus pleuropneumoniae）、アクチノバシ
ラス スイス（Actinobacillus suis）、パスツレラ
ヘモリチカ（Pasteurella haemolytica）、エシェリキ
ア コリ（Escherichia coli）等の細菌は、互いに血清
学的交差性を示す特有の菌体外毒素を産生する。これら
の毒素は１０３から１１０KDaの分子量を有するタンパ
ク質で、その構造遺伝子内に一定のアミノ酸のくり返し
配列が存在することからＲＴＸ（repeats in thestruct
ural toxin）トキシンファミリーの毒素と呼ばれてい
る。これらの毒素は、赤血球、好中球マクロファージ等
の細胞に障害を与え、細胞を溶解させて最終的に宿主に
疾病を引き起こす。
【０００３】例えばアクチノバシラス プルロニューモ
ニエ（A. pleuropneumoniae）は、ＲＴＸトキシンファ
ミリーに属するヘモリジンと呼ばれる毒素を産生し、こ
の菌体外毒素が重要な病原因子となって豚に胸膜肺炎を
起こす。一方、精製したヘモリジンタンパクで免疫した
豚は、その後のアクチノバシラス プルロニューモニエ
（A. pleuropneumoniae）の感染に抵抗することが明ら
かとなっており（Devenish,J.,S.Rosendal,and J.T.Bos
se., Infect.Immun., 58,3829-3832,1990）、ヘモリジ
ンが豚胸膜肺炎予防の有効なワクチン抗原になりうるこ
とが示されている。しかし、最近になってヘモリジンタ
ンパクに菌体由来のリポ多糖が比較的強固に結合してい
ることが見いだされた。リポ多糖はエンドトキシン（内
毒素）とも呼ばれ、非常に毒性の強い物質であり、生体
に種々の作用を及ぼすサイトカインの産生に深く関係し
ている。したがって、リポ多糖を含むヘモリジンをワク
チン抗原とした場合、豚にエンドトキシンショック等の
副反応を起こす可能性がある。
ニエ（A. pleuropneumoniae）は、ＲＴＸトキシンファ
ミリーに属するヘモリジンと呼ばれる毒素を産生し、こ
の菌体外毒素が重要な病原因子となって豚に胸膜肺炎を
起こす。一方、精製したヘモリジンタンパクで免疫した
豚は、その後のアクチノバシラス プルロニューモニエ
（A. pleuropneumoniae）の感染に抵抗することが明ら
かとなっており（Devenish,J.,S.Rosendal,and J.T.Bos
se., Infect.Immun., 58,3829-3832,1990）、ヘモリジ
ンが豚胸膜肺炎予防の有効なワクチン抗原になりうるこ
とが示されている。しかし、最近になってヘモリジンタ
ンパクに菌体由来のリポ多糖が比較的強固に結合してい
ることが見いだされた。リポ多糖はエンドトキシン（内
毒素）とも呼ばれ、非常に毒性の強い物質であり、生体
に種々の作用を及ぼすサイトカインの産生に深く関係し
ている。したがって、リポ多糖を含むヘモリジンをワク
チン抗原とした場合、豚にエンドトキシンショック等の
副反応を起こす可能性がある。
【０００４】この特性は、エシェリキア コリ（E. col
i）のα−ヘモリジン（Bohach,G.A.,and I.S.Snyder.,
Infect.Immun., 53,435-437,1986）のような他のＲＴＸ
トキシンについても観察されており、安全性の面で、こ
れらの毒素が関与する感染症の予防ワクチンの開発を困
難にしている。
i）のα−ヘモリジン（Bohach,G.A.,and I.S.Snyder.,
Infect.Immun., 53,435-437,1986）のような他のＲＴＸ
トキシンについても観察されており、安全性の面で、こ
れらの毒素が関与する感染症の予防ワクチンの開発を困
難にしている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】したがって、安全なＲ
ＴＸトキシンファミリーのワクチンを調製するために
は、本毒素タンパクから種々の副反応の原因となるリポ
多糖をできるだけ除去する必要がある。本発明の目的
は、ＲＴＸトキシンからリポ多糖を効率よく除去する方
法を検討し、これによって安全性の高いＲＴＸトキシン
のワクチンを提供することにある。
ＴＸトキシンファミリーのワクチンを調製するために
は、本毒素タンパクから種々の副反応の原因となるリポ
多糖をできるだけ除去する必要がある。本発明の目的
は、ＲＴＸトキシンからリポ多糖を効率よく除去する方
法を検討し、これによって安全性の高いＲＴＸトキシン
のワクチンを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＲＴＸトキシ
ンファミリーに属する毒素を産生する細菌を、栄養培地
で増殖させ、この培養上清濃縮液に陽イオン性界面活性
剤を加えてリポ多糖を含まないＲＴＸトキシン単一物の
沈殿物を生じさせ、これをワクチン抗原とすることを特
徴とするＲＴＸトキシンファミリーに属する細菌毒素ワ
クチンの製造法、及び陽イオン性界面活性剤の濃度が、
１〜１０mMの範囲内であるＲＴＸトキシンファミリーに
属する細菌毒素ワクチンの製造法、に係るものである。
ンファミリーに属する毒素を産生する細菌を、栄養培地
で増殖させ、この培養上清濃縮液に陽イオン性界面活性
剤を加えてリポ多糖を含まないＲＴＸトキシン単一物の
沈殿物を生じさせ、これをワクチン抗原とすることを特
徴とするＲＴＸトキシンファミリーに属する細菌毒素ワ
クチンの製造法、及び陽イオン性界面活性剤の濃度が、
１〜１０mMの範囲内であるＲＴＸトキシンファミリーに
属する細菌毒素ワクチンの製造法、に係るものである。
【０００７】
【作用】本発明者は、前述の問題点を解決すべくＲＴＸ
トキシンからリポ多糖を除去する方法を種々検討した結
果、陽イオン性界面活性剤にリポ多糖除去作用のあるこ
とを見いだし、本発明に到達した。
トキシンからリポ多糖を除去する方法を種々検討した結
果、陽イオン性界面活性剤にリポ多糖除去作用のあるこ
とを見いだし、本発明に到達した。
【０００８】具体的には、ＲＴＸトキシンファミリーに
属する毒素を産生する細菌を栄養培地で増殖させ、遠心
分離等の操作により培養液から菌体を除いて濃縮し、こ
れに特定濃度の陽イオン性界面活性剤を加える。陽イオ
ン性界面活性剤は、ラウリルトリメチルアンモニウムブ
ロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミ
ド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ラウリル
ピリジニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド等
を用いることができ、その濃度は１〜１０mMが適当であ
る。この操作によりＲＴＸトキシンが不溶性となり、沈
殿を生ずる。この時、リポ多糖はＲＴＸトキシンから離
れ、上清中に残る。遠心分離により上清を除き、沈殿に
約１．０Mの塩溶液を加えて溶解させ、さらに過剰量の
蒸留水を加えて再度ＲＴＸトキシンの沈殿を生じさせ
る。必要ならばこの操作を繰り返して行う。これらの操
作により、ＲＴＸトキシンに結合していたリポ多糖が大
部分除去されるとともに、ＲＴＸトキシンも高度に精製
される。
属する毒素を産生する細菌を栄養培地で増殖させ、遠心
分離等の操作により培養液から菌体を除いて濃縮し、こ
れに特定濃度の陽イオン性界面活性剤を加える。陽イオ
ン性界面活性剤は、ラウリルトリメチルアンモニウムブ
ロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミ
ド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ラウリル
ピリジニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド等
を用いることができ、その濃度は１〜１０mMが適当であ
る。この操作によりＲＴＸトキシンが不溶性となり、沈
殿を生ずる。この時、リポ多糖はＲＴＸトキシンから離
れ、上清中に残る。遠心分離により上清を除き、沈殿に
約１．０Mの塩溶液を加えて溶解させ、さらに過剰量の
蒸留水を加えて再度ＲＴＸトキシンの沈殿を生じさせ
る。必要ならばこの操作を繰り返して行う。これらの操
作により、ＲＴＸトキシンに結合していたリポ多糖が大
部分除去されるとともに、ＲＴＸトキシンも高度に精製
される。
【０００９】このようにして調製したＲＴＸトキシンの
沈殿を適当な溶媒に溶解させ、必要に応じてトキソイド
化し、適当なアジュバントと保存剤を加えてワクチンと
する。
沈殿を適当な溶媒に溶解させ、必要に応じてトキソイド
化し、適当なアジュバントと保存剤を加えてワクチンと
する。
【００１０】
【実施例】以下に実施例及び試験例を示して本発明をさ
らに詳細に説明する。
らに詳細に説明する。
【００１１】実施例１ ＲＴＸトキシンからリポ多糖を除去するために必要な陽
イオン性界面活性剤の濃度について検討した。供試菌株
は、ＲＴＸトキシンファミリーに属するヘモリジンを産
生するアクチノバシラス プルロニューモニエ（A. ple
uropneumoniae）の野外分離株であるＨＡ−３３７株
（血清型１型）を用いた。本菌株を前培養後、０．００
２％β−ＮＡＤ及び１０mM塩化カルシウムを添加したコ
ロンビアブロス（ＢＢＬ製）５ｌに接種し、３７℃で４
時間通気攪拌培養した。培養液を遠心分離し、上清を限
外濾過（分画分子量３００K）により約５００mlにまで
濃縮した。この濃縮液０．５mlに、それぞれ０、２、
４、１０、２０、４０、８０mMのセチルトリメチルアン
モニウムブロミドを０．５ml添加し、室温で約３０分間
感作した。この間に沈殿が生ずるので遠心分離して上清
と沈殿に分け、沈殿には１．０M塩化ナトリウム１．０m
lを加えて沈殿を溶解させた。沈殿溶解液と遠心上清中
のエンドトキシン量をリムルステスト（ＱＣＬ−１００
０、WhittakerBioproducts製）により測定し、また、ヘ
モリジンタンパクの存在を確認するために、これらをＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）で分析した。
イオン性界面活性剤の濃度について検討した。供試菌株
は、ＲＴＸトキシンファミリーに属するヘモリジンを産
生するアクチノバシラス プルロニューモニエ（A. ple
uropneumoniae）の野外分離株であるＨＡ−３３７株
（血清型１型）を用いた。本菌株を前培養後、０．００
２％β−ＮＡＤ及び１０mM塩化カルシウムを添加したコ
ロンビアブロス（ＢＢＬ製）５ｌに接種し、３７℃で４
時間通気攪拌培養した。培養液を遠心分離し、上清を限
外濾過（分画分子量３００K）により約５００mlにまで
濃縮した。この濃縮液０．５mlに、それぞれ０、２、
４、１０、２０、４０、８０mMのセチルトリメチルアン
モニウムブロミドを０．５ml添加し、室温で約３０分間
感作した。この間に沈殿が生ずるので遠心分離して上清
と沈殿に分け、沈殿には１．０M塩化ナトリウム１．０m
lを加えて沈殿を溶解させた。沈殿溶解液と遠心上清中
のエンドトキシン量をリムルステスト（ＱＣＬ−１００
０、WhittakerBioproducts製）により測定し、また、ヘ
モリジンタンパクの存在を確認するために、これらをＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）で分析した。
【００１２】培養上清濃縮液に種々の濃度のセチルトリ
メチルアンモニウムブロミドを作用させた時の、沈殿溶
解液と遠心上清中のエンドトキシン量を表１に示した。
セチルトリメチルアンモニウムブロミドの濃度の増加に
したがい、沈殿溶解液中のエンドトキシン量は減少し
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、セチルトリメチルアンモ
ニウムブロミドが最終濃度で１〜５mMの範囲にある時、
ヘモリジンタンパクは沈殿溶解液にのみ存在していた
が、１０mMを越えると沈殿溶解液ばかりでなく遠心上清
中にも認められるようになった。したがって、ヘモリジ
ンタンパクからリポ多糖を効果的に除き、かつヘモリジ
ンタンパクの収量を減少させないためには、セチルトリ
メチルアンモニウムブロミドの濃度を最終濃度で１〜１
０mMの範囲内にするのが最適であった。
メチルアンモニウムブロミドを作用させた時の、沈殿溶
解液と遠心上清中のエンドトキシン量を表１に示した。
セチルトリメチルアンモニウムブロミドの濃度の増加に
したがい、沈殿溶解液中のエンドトキシン量は減少し
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、セチルトリメチルアンモ
ニウムブロミドが最終濃度で１〜５mMの範囲にある時、
ヘモリジンタンパクは沈殿溶解液にのみ存在していた
が、１０mMを越えると沈殿溶解液ばかりでなく遠心上清
中にも認められるようになった。したがって、ヘモリジ
ンタンパクからリポ多糖を効果的に除き、かつヘモリジ
ンタンパクの収量を減少させないためには、セチルトリ
メチルアンモニウムブロミドの濃度を最終濃度で１〜１
０mMの範囲内にするのが最適であった。
【００１３】
【表１】
【００１４】実施例２ 陽イオン性界面活性剤に属する種々の薬剤のリポ多糖除
去効果について試験した。界面活性剤は、ラウリルトリ
メチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチル
アンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウム
ブロミド、ラウリルピリジニウムクロリド、セチルピリ
ジニウムクロリドを供試した。実施例１で用いたアクチ
ノバシラス プルロニューモニエ（A. pleuropneumonia
e）ＨＡ−３３７株の培養上清濃縮液５mlに、種々の界
面活性剤をそれぞれ２、１０、２０mMに調製してその５
mlを添加し、室温で３０分間感作した。遠心分離により
上清と沈殿に分け、沈殿には１０mlの１．０M塩化ナト
リウムを加えて沈殿を溶解させた。沈殿溶解液と遠心上
清中のエンドトキシン量をリムルステストにより測定
し、また、ヘモリジンタンパクの存在をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより確認した。
去効果について試験した。界面活性剤は、ラウリルトリ
メチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチル
アンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウム
ブロミド、ラウリルピリジニウムクロリド、セチルピリ
ジニウムクロリドを供試した。実施例１で用いたアクチ
ノバシラス プルロニューモニエ（A. pleuropneumonia
e）ＨＡ−３３７株の培養上清濃縮液５mlに、種々の界
面活性剤をそれぞれ２、１０、２０mMに調製してその５
mlを添加し、室温で３０分間感作した。遠心分離により
上清と沈殿に分け、沈殿には１０mlの１．０M塩化ナト
リウムを加えて沈殿を溶解させた。沈殿溶解液と遠心上
清中のエンドトキシン量をリムルステストにより測定
し、また、ヘモリジンタンパクの存在をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより確認した。
【００１５】その結果、供試した陽イオン性界面活性剤
の全てに、最終濃度で１〜１０mMの範囲でリポ多糖除去
効果が認められ、ヘモリジンタンパクは沈殿中に存在す
ることが確認された（表２）。
の全てに、最終濃度で１〜１０mMの範囲でリポ多糖除去
効果が認められ、ヘモリジンタンパクは沈殿中に存在す
ることが確認された（表２）。
【００１６】
【表２】
【００１７】実施例３ このような陽イオン性界面活性剤のリポ多糖除去効果
が、他のＲＴＸトキシンにも認められるかどうかを確認
するため、パスツレラ ヘモリチカ（P. haemolytica）
のロイコトキシンとエシェリキア コリ（E. coli）の
α−ヘモリジンについて試験した。供試菌株は、パスツ
レラ ヘモリチカ（P. haemolytica）の野外分離株であ
るＳＩ−２株と、α−ヘモリジン産生性のエシェリキア
コリ（E.coli）Ｓ−５株を用いた。これらの菌株を前
培養後、０．００２％β−ＮＡＤ及び１０mM塩化カルシ
ウムを添加したコロンビア ブロス２００mlにそれぞれ
接種し、３７℃で４時間振盪培養した。その後培養液を
遠心分離し、上清を限外濾過（分画分子量３００K）に
より約２０mlにまで濃縮した。これらの培養上清濃縮液
５mlに、セチルトリメチルアンモニウムブロミドをそれ
ぞれ０、２、１０、２０mMに調製してその５mlを添加
し、室温で３０分間感作した。遠心分離により上清と沈
殿に分け、沈殿には１０mlの１．０M塩化ナトリウムを
加えて沈殿を溶解させた。沈殿溶解液と遠心上清中のエ
ンドトキシン量をリムルステストにより測定し、また、
それぞれのＲＴＸトキシンの存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より確認した。
が、他のＲＴＸトキシンにも認められるかどうかを確認
するため、パスツレラ ヘモリチカ（P. haemolytica）
のロイコトキシンとエシェリキア コリ（E. coli）の
α−ヘモリジンについて試験した。供試菌株は、パスツ
レラ ヘモリチカ（P. haemolytica）の野外分離株であ
るＳＩ−２株と、α−ヘモリジン産生性のエシェリキア
コリ（E.coli）Ｓ−５株を用いた。これらの菌株を前
培養後、０．００２％β−ＮＡＤ及び１０mM塩化カルシ
ウムを添加したコロンビア ブロス２００mlにそれぞれ
接種し、３７℃で４時間振盪培養した。その後培養液を
遠心分離し、上清を限外濾過（分画分子量３００K）に
より約２０mlにまで濃縮した。これらの培養上清濃縮液
５mlに、セチルトリメチルアンモニウムブロミドをそれ
ぞれ０、２、１０、２０mMに調製してその５mlを添加
し、室温で３０分間感作した。遠心分離により上清と沈
殿に分け、沈殿には１０mlの１．０M塩化ナトリウムを
加えて沈殿を溶解させた。沈殿溶解液と遠心上清中のエ
ンドトキシン量をリムルステストにより測定し、また、
それぞれのＲＴＸトキシンの存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より確認した。
【００１８】その結果、パスツレラ ヘモリチカ（P. h
aemolytica）のロイコトキシンとエシェリキア コリ
（E. coli）のα−ヘモリジンに結合しているリポ多糖
は、両方とも最終濃度で１〜１０mMのセチルトリメチル
アンモニウムブロミドにより効果的に除去され（表
３）、陽イオン性界面活性剤のリポ多糖除去効果がアク
チノバシラス プルロニューモニエ（A. pleuropneumon
iae）のみならず他のＲＴＸトキシンファミリーにも及
ぶことが示された。
aemolytica）のロイコトキシンとエシェリキア コリ
（E. coli）のα−ヘモリジンに結合しているリポ多糖
は、両方とも最終濃度で１〜１０mMのセチルトリメチル
アンモニウムブロミドにより効果的に除去され（表
３）、陽イオン性界面活性剤のリポ多糖除去効果がアク
チノバシラス プルロニューモニエ（A. pleuropneumon
iae）のみならず他のＲＴＸトキシンファミリーにも及
ぶことが示された。
【００１９】
【表３】
【００２０】試験例１ 陽イオン性界面活性剤でリポ多糖を除去したＲＴＸトキ
シンの安全性を、動物で試験した。実施例１で用いたア
クチノバシラス プルロニューモニエ（A. pleuropneum
oniae）ＨＡ−３３７株の培養上清濃縮液４００mlに、
１．０２gのセチルトリメチルアンモニウムブロミドを
添加し、室温で約３０分間感作した。その後遠心分離し
て沈殿を採取し、これに１００mlの１．０M塩化ナトリ
ウムを加えて沈殿を溶解させた。これに注射用蒸留水３
００mlを加えて再度ヘモリジンの沈殿を生じさせ、遠心
分離後１．０M塩化ナトリウムに再溶解させた。この操
作を繰り返すことにより、沈殿中のリポ多糖はほとんど
除去することができた。
シンの安全性を、動物で試験した。実施例１で用いたア
クチノバシラス プルロニューモニエ（A. pleuropneum
oniae）ＨＡ−３３７株の培養上清濃縮液４００mlに、
１．０２gのセチルトリメチルアンモニウムブロミドを
添加し、室温で約３０分間感作した。その後遠心分離し
て沈殿を採取し、これに１００mlの１．０M塩化ナトリ
ウムを加えて沈殿を溶解させた。これに注射用蒸留水３
００mlを加えて再度ヘモリジンの沈殿を生じさせ、遠心
分離後１．０M塩化ナトリウムに再溶解させた。この操
作を繰り返すことにより、沈殿中のリポ多糖はほとんど
除去することができた。
【００２１】このようにして調製したヘモリジンをタン
パク量で約１mg／mlに調製し、この１．０mlをワクチン
接種の当該動物である豚の耳根部筋肉内に注射した。１
回の試験につき、４〜７週齢の豚を３頭〜８頭使用し、
調製ロットの異なるリポ多糖除去ヘモリジンを試験日を
変えて計４回試験した。陽性対照として、セチルトリメ
チルアンモニウムブロミド処理前の培養上清濃縮液１．
０mlを２頭の豚に同様に注射した。供試豚の注射後の反
応を、約２時間観察した。
パク量で約１mg／mlに調製し、この１．０mlをワクチン
接種の当該動物である豚の耳根部筋肉内に注射した。１
回の試験につき、４〜７週齢の豚を３頭〜８頭使用し、
調製ロットの異なるリポ多糖除去ヘモリジンを試験日を
変えて計４回試験した。陽性対照として、セチルトリメ
チルアンモニウムブロミド処理前の培養上清濃縮液１．
０mlを２頭の豚に同様に注射した。供試豚の注射後の反
応を、約２時間観察した。
【００２２】注射後対照豚の１頭に、元気消失、呼吸促
迫、戦慄の症状が観察された。一方、リポ多糖除去ヘモ
リジンを注射した豚には、これらの症状を示した個体は
なく（表４）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド
処理ヘモリジンの安全性が立証された。
迫、戦慄の症状が観察された。一方、リポ多糖除去ヘモ
リジンを注射した豚には、これらの症状を示した個体は
なく（表４）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド
処理ヘモリジンの安全性が立証された。
【００２３】
【表４】
【００２４】試験例２ 陽イオン性界面活性剤によりリポ多糖を除去したＲＴＸ
トキシンの有効性を、実験動物で評価した。３週齢のｄ
ｄＹマウス（日本エスエルシー）１２０匹を１群３０匹
ずつ４群に区分けした。試験例１で用いたアクチノバシ
ラス プルロニューモニエ（A. pleuropneumoniae）Ｈ
Ａ−３３７株のリポ多糖除去ヘモリジンをタンパク濃度
で１２０、１２、１．２μg／mlに調製し、この０．５m
lをそれぞれ３０匹のマウスに２週間間隔で２回腹腔内
に免疫した。対照としてヘモリジンの溶解液である１．
０M塩化ナトリウムを同様に注射した。
トキシンの有効性を、実験動物で評価した。３週齢のｄ
ｄＹマウス（日本エスエルシー）１２０匹を１群３０匹
ずつ４群に区分けした。試験例１で用いたアクチノバシ
ラス プルロニューモニエ（A. pleuropneumoniae）Ｈ
Ａ−３３７株のリポ多糖除去ヘモリジンをタンパク濃度
で１２０、１２、１．２μg／mlに調製し、この０．５m
lをそれぞれ３０匹のマウスに２週間間隔で２回腹腔内
に免疫した。対照としてヘモリジンの溶解液である１．
０M塩化ナトリウムを同様に注射した。
【００２５】各群２０匹のマウスを、第１回免疫後１週
間目から１週間毎に５匹ずつ放血殺し、血清をプールし
てＥＬＩＳＡ抗体価を測定した。残りの１０匹のマウス
には、第２回免疫後２週間目に４．２×１０6CFU／mlの
アクチノバシラス プルロニューモニエ（A. pleuropne
umoniae）ＨＡ−３３７株の生菌を０．５mlずつ腹腔内
に攻撃した。攻撃後１週間観察し、マウスの生死数から
防御効果を判定した。
間目から１週間毎に５匹ずつ放血殺し、血清をプールし
てＥＬＩＳＡ抗体価を測定した。残りの１０匹のマウス
には、第２回免疫後２週間目に４．２×１０6CFU／mlの
アクチノバシラス プルロニューモニエ（A. pleuropne
umoniae）ＨＡ−３３７株の生菌を０．５mlずつ腹腔内
に攻撃した。攻撃後１週間観察し、マウスの生死数から
防御効果を判定した。
【００２６】表５にマウスの血中抗体価の推移を示し
た。抗体価は、免疫した抗原濃度に応じて第２回免疫後
１週間目に急激に上昇した。
た。抗体価は、免疫した抗原濃度に応じて第２回免疫後
１週間目に急激に上昇した。
【００２７】攻撃後、対照群のマウスは全て死亡した
が、６０あるいは６μg免疫群では９０％のマウスが耐
過生存し、有効な防御効果が得られた（表６）。
が、６０あるいは６μg免疫群では９０％のマウスが耐
過生存し、有効な防御効果が得られた（表６）。
【００２８】以上の成績から、リポ多糖除去ヘモリジン
は、実験動物レベルで抗体価の上昇を認め、さらに有効
な防御能も有することから、ワクチンとして有効である
と考えられた。
は、実験動物レベルで抗体価の上昇を認め、さらに有効
な防御能も有することから、ワクチンとして有効である
と考えられた。
【００２９】
【表５】
【００３０】
【表６】
【００３１】
【発明の効果】本発明によってＲＴＸトキシンからリポ
多糖を効率よく除去することができ、これにより安全性
の高いＲＴＸトキシンファミリーのワクチンを調製する
ことが可能となった。
多糖を効率よく除去することができ、これにより安全性
の高いＲＴＸトキシンファミリーのワクチンを調製する
ことが可能となった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:185
Claims (2)
- 【請求項１】 ＲＴＸトキシンファミリーに属する毒素
を産生する細菌を、栄養培地で増殖させ、この培養上清
濃縮液に陽イオン性界面活性剤を加えてリポ多糖を含ま
ないＲＴＸトキシン単一物の沈殿物を生じさせ、これを
ワクチン抗原とすることを特徴とするＲＴＸトキシンフ
ァミリーに属する細菌毒素ワクチンの製造法。 - 【請求項２】 陽イオン性界面活性剤の濃度が、１〜１
０mMの範囲内である請求項１記載のＲＴＸトキシンファ
ミリーに属する細菌毒素ワクチンの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4311182A JP2634545B2 (ja) | 1992-10-27 | 1992-10-27 | Ｒｔｘトキシンファミリーに属する細菌毒素ワクチンの製造法 |
| EP93117015A EP0595188B1 (en) | 1992-10-27 | 1993-10-21 | Process for producing vaccine for a bacterial toxin belonging to the RTX toxin family |
| DE69321319T DE69321319T2 (de) | 1992-10-27 | 1993-10-21 | Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes für ein zur RTX-Toxinfamilie gehörendes bakterielles Toxin |
| CA002109233A CA2109233C (en) | 1992-10-27 | 1993-10-26 | Process for producing vaccine for bacterial toxin belonging to rtx toxin family |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4311182A JP2634545B2 (ja) | 1992-10-27 | 1992-10-27 | Ｒｔｘトキシンファミリーに属する細菌毒素ワクチンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06135853A JPH06135853A (ja) | 1994-05-17 |
| JP2634545B2 true JP2634545B2 (ja) | 1997-07-30 |
Family
ID=18014080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4311182A Expired - Fee Related JP2634545B2 (ja) | 1992-10-27 | 1992-10-27 | Ｒｔｘトキシンファミリーに属する細菌毒素ワクチンの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0595188B1 (ja) |
| JP (1) | JP2634545B2 (ja) |
| CA (1) | CA2109233C (ja) |
| DE (1) | DE69321319T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5908630A (en) * | 1994-05-13 | 1999-06-01 | Kansas State University Research Foundation | Swine immunization using live, RTX toxin-secreting organisms |
| US5925354A (en) | 1995-11-30 | 1999-07-20 | Michigan State University | Riboflavin mutants as vaccines against Actinobacillus pleuropneumoniae |
| ES2251268B1 (es) * | 2002-07-15 | 2007-07-01 | Universidad Del Pais Vasco Euskal Herriko Unibertsitatea | Peptidos derivados de toxinas rtx para la proteccion de celulas del ataque por toxinas bacterianas. |
| US8563005B2 (en) * | 2009-11-10 | 2013-10-22 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Actinobacillus suis antigens |
| WO2019121861A1 (en) * | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Intervet International B.V. | A vaccine to protect a pig against actinobacillus pleuropneumoniae |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5750925A (en) * | 1980-09-12 | 1982-03-25 | Takeda Chem Ind Ltd | Preparation of pertussis toxoid |
| SU1313172A1 (ru) * | 1985-09-30 | 1988-03-15 | Univ Moskovsk | Cпocoб oпpeдeлehия ahtигeha или ahtиteл |
| US4681761A (en) * | 1985-10-24 | 1987-07-21 | State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University | Major iron-regulated protein of Neisseria gonorrhoeae and its use as vaccine |
-
1992
- 1992-10-27 JP JP4311182A patent/JP2634545B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-10-21 DE DE69321319T patent/DE69321319T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-10-21 EP EP93117015A patent/EP0595188B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-26 CA CA002109233A patent/CA2109233C/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2109233C (en) | 2000-05-02 |
| EP0595188B1 (en) | 1998-09-30 |
| DE69321319D1 (de) | 1998-11-05 |
| EP0595188A3 (en) | 1995-05-24 |
| CA2109233A1 (en) | 1994-04-28 |
| JPH06135853A (ja) | 1994-05-17 |
| EP0595188A2 (en) | 1994-05-04 |
| DE69321319T2 (de) | 1999-04-01 |
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