ES2251268B1 - Peptidos derivados de toxinas rtx para la proteccion de celulas del ataque por toxinas bacterianas. - Google Patents
Peptidos derivados de toxinas rtx para la proteccion de celulas del ataque por toxinas bacterianas. Download PDFInfo
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Abstract
Péptidos derivados de toxinas RTX para la protección de células del ataque por toxinas bacterianas. La presente invención proporciona péptidos que son capaces de bloquear la acción de las toxinas bacterianas de la familia RTX, así como un método para producir dichos péptidos que comprende la transformación de un organismo con una construcción específica de ácido nucleico, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos péptidos y el uso de ellos para el tratamiento de enfermedades mediadas por las toxinas bacterianas de la familia RTX, tales como septicemia, peritonitis, meningitis, pielonefritis, enfermedades del tracto urinario o diarrea.
Description
Péptidos derivados de toxinas RTX para la
protección de células del ataque por toxinas bacterianas.
La invención se relaciona, en general, con las
toxinas bacterianas de la familia RTX y con los receptores de estas
toxinas en células de animales. Más concretamente, la invención se
refiere a péptidos que son capaces de proporcionar protección frente
al ataque de dichas toxinas bacterianas de la familia RTX y al uso
de dichos péptidos en el tratamiento de enfermedades relacionadas
con la actuación de las toxinas bacterianas de la familia RTX.
La \alpha-hemolisina (HlyA) de
Escherichia coli es una toxina que ciertas cepas patógenas
de la bacteria son capaces de secretar al medio. Se ha determinado
como un factor de virulencia en enfermedades provocadas por
infecciones extraintestinales de E. coli en humanos como
septicemia (Fairbrother y Ngeleka, 1994), peritonitis (Linggood e
Ingram, 1982), meningitis, pielonefritis (Freíd y Wong, 1970),
enfermedades en el tracto urinario (Johnson, 1991) y diarrea
(Elliot y cols., 1998).
Pertenece a la familia de toxinas denominada
"Familia RTX", un grupo de proteínas que se caracterizan por
poseer un nonapéptido rico en Gly y Asp repetido en tándem en el
extremo C-terminal de las correspondientes cadenas
polipeptídicas (Coote, 1996; Goñi y Ostolaza, 1998; Stanley y
cols., 1998; Welch, 2001). Estas proteínas se sintetizan como
protoxinas, precursores inactivos que requieren de una acilación
covalente específica en residuos conservados de Lys para que puedan
ejercer sus actividades líticas. Presentan además una organización
estructural similar, donde destacan una región hidrofóbica, cerca
del extremo amino de la proteína, que se ha relacionado directamente
con la unión a membranas y formación de poros, un dominio de
repeticiones localizado hacia el extremo carboxilo que está
implicado en la unión a calcio, catión imprescindible para la
actividad lítica de estas toxinas, una secuencia de exportación,
ubicada al final del extremo C-terminal, que es
reconocida por la maquinaria específica de exportación de esta
familia y finalmente, uno o dos residuos conservados de Lys que son
modificados covalentemente por uno o dos ácidos grasos.
Las toxinas RTX se pueden dividir en dos grupos,
dependiendo de los tipos celulares a los que atacan: las
hemolisinas, entre las que se incluiría la
\alpha-hemolisina de E. coli, que son
capaces de atacar a un amplio rango de tipos celulares y las
leucotoxinas, que poseen una gran especificidad celular y atacan
sólo a leucocitos de algunas especies. No está claro cómo se han
alcanzado estas diferentes especificidades celulares a lo largo de
la evolución de esta familia que presenta gran homología en muchos
aspectos, así como tampoco se conocen las bases físicas de dicha
especificidad celular.
Para intentar determinar las regiones implicadas
en la mencionada especificidad celular se han utilizado diversas
estrategias. Como todas las toxinas de la familia poseen dominios
funcionales similares, se han construido híbridos entre diferentes
toxinas con distinta especificidad y se ha estudiado la capacidad de
estos híbridos para actuar sobre distintos tipos celulares.
Así, un estudio con la leucotoxina de
Pasteurella haemolytica (LktA) y con la leucotoxina de
Actinobacillus actinomycetemcomitans (AktA), que tienen como
células diana leucocitos de rumiante y de humanos, respectivamente,
apunta al dominio de las repeticiones como el que determina la
especificidad celular (Lally y cols., 1994). En otro trabajo, a
partir de la creación de híbridos entre LktA y la hemolisina de
Actinobacillus pleuropneumoniae (ApxIIA) (McWhinney y cols.,
1992) se apunta a la región donde se encuentran los sitios de
acilación, así como la zona de las repeticiones como necesarias
para la especificidad por leucocitos de LktA. Por el contrario, en
el caso de ApxIIA la información presente en la región hidrofóbica
o la contenida en la región de acilación parece suficiente para
conferirle capacidad hemolítica. Además, la acilación de la misma
toxina híbrida mediante diferentes proteínas C, da como resultado
toxinas con diferentes especificidades, por lo tanto la acilación
parece desempeñar un papel en la especificidad celular. Al crear
híbridos entre HlyA y LktA, se identifica una región entre 563 y 739
como clave para la actividad hemolítica, ya que esta región de HlyA
confiere a la leucotoxina dicha actividad (Forestier y Welch,
1991). En esta zona se encuentran los lugares de acilación y parece
que están implicados en cierta medida en el reconocimiento celular
(Pellett y Welch, 1996). Sin embargo, la especificidad de la
leucotoxina por leucocitos de rumiante parece encontrarse en los
169 primeros aminoácidos de su secuencia. Otros estudios de
deleción de la leucotoxina LktA señalan que es necesaria la región
de acilación para la unión a las células diana, pero además la
unión es dependiente de calcio, y se necesita la integridad del
dominio de las repeticiones para la unión (Cruz y cols., 1990).
Los estudios llevados a cabo con diversas
toxinas híbridas así como los realizados con toxinas truncadas
indican que no parece que la especificidad celular resida en una
característica o región puntual de las toxinas. La ambigüedad al
definir las células que actúan como diana, hace que sea más difícil
interpretar los resultados, ya que se entiende que una célula actúa
como diana de una determinada toxina cuando se observa un efecto
citotóxico. Este efecto es el resultado de un proceso con muchos
pasos, por lo cual hay varias razones por las que una célula puede
no ser sensible a una determinada toxina. Puede que la toxina no
esté interaccionando con la membrana, que se una pero no sea capaz
de insertarse, o que incluso cuando la toxina sea capaz de
permeabilizar la membrana, la célula posea un mecanismo de
reparación.
En los diferentes estudios aparecen
mayoritariamente dos regiones como candidatas a ser determinantes
de la especificidad celular. Una de ellas es el dominio de las
repeticiones. Los resultados de la necesidad del calcio, y por lo
tanto, del dominio de las repeticiones, para que se dé la unión a
células diana en el caso de LktA se opone sin embargo, a la
observación de Clinkenbeeard y cols. (1989), donde se detecta unión
en presencia de EGTA, un agente quelante de calcio. Para la
adenilato ciclasa (CyaA), otra toxina de la familia, también se ha
descrito unión a eritrocitos en ausencia de calcio. Por lo tanto,
no parece que el dominio de las repeticiones constituya únicamente
la región de unión a las células diana.
Otra región propuesta como clave es la zona
entre el dominio hidrofóbico y el de las repeticiones, donde se
localizan los lugares de acilación. Lim y cols. (2000) proponen que
las diferencias en el tipo de acilación son determinantes en la
especificidad. Stanley y cols. (1994) sin embargo, al examinar los
lugares de acilación de las diferentes toxinas concluyen que no
parece que la especificidad por leucocitos o eritrocitos se
encuentre sólo en la diferente acilación y que esto sea dependiente
de la proteína C que actúa en cada caso. Además, la proteína no
acilada, así como los mutantes de HlyA en cada una de las lisinas
que se acilan, son capaces de unirse a eritrocitos de forma similar
a la proteína salvaje, aunque no resultan ser líticos (Moayeri y
Welch, 1997). Por tanto, al igual que en el caso del dominio de las
repeticiones, tampoco parece que la acilación, individualmente, sea
determinante en la capacidad de unión de las toxinas a las células
diana.
Los diferentes resultados en su conjunto,
parecen sugerir que no existe un único elemento responsable de la
unión de HlyA a eritrocitos, sino que mas bien parece que la toxina
posee múltiples elementos distribuidos a lo largo de su secuencia
capaces de llevar a cabo la unión. Del mismo modo, para otras
bacterias de la familia RTX no existen datos que faciliten la
localización de elementos secuenciales responsables de las
uniones.
Existe por tanto en el estado de la técnica la
necesidad de desarrollar medicamentos que sean capaces de bloquear
la actuación de las toxinas bacterianas de la familia RTX en las
células de animales.
El objeto de la presente invención es
proporcionar compuestos para el desarrollo de medicamentos que sean
capaces de bloquear la actuación de las toxinas bacterianas de la
familia RTX en las células de animales. Así, tras laboriosa
investigación, el solicitante ha diseñado unos péptidos que son
capaces de unirse a los receptores de las toxinas bacterianas de la
familia RTX en las membranas de ciertas células de animales, si bien
su unión no presenta actividad lítica. El resultado es que el
péptido protege a ciertas células de animales de la lisis inducida
por las toxinas de las bacterias RTX.
Por lo tanto, un primer aspecto de la invención
consiste en péptidos, derivados de dichos péptidos, variantes de
dichos péptidos o fragmentos de los mismos, los cuales son capaces
de bloquear la acción de las toxinas bacterianas de la familia
RTX.
Un segundo aspecto de la invención consta de las
secuencias de ADN aisladas que codifican los péptidos de la
invención, una construcción de ácido nucleico que comprende una de
las secuencias anteriores de ADN, un vector de expresión que
comprende una de las secuencias anteriores de ADN y un sistema de
expresión de células eucariotas o procariotas que comprende una
construcción o un vector anterior.
Un tercer aspecto de la invención consiste en un
organismo tranformado que comprende una de las secuencias
anteriores.
Un cuarto aspecto de la invención consiste en un
método para producir uno de los péptidos mencionados
anteriormente.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a
una composición farmacéutica que comprende uno de los péptidos
anteriores y al uso de los péptidos anteriores para la preparación
de un medicamento.
La figura 1 representa un esquema de los oligos
necesarios para la eliminación de un fragmento de la secuencia de
la proteína por PCR. A y B son los oligos que flanquean la región,
en los que se encuentra una diana de corte único. C y D son los
oligos entre los que queda la secuencia a eliminar, en ellos se ha
introducido una diana de corte único en los fragmentos a
amplificar.
La figura 2A representa un curva
dosis-efecto de la hemólisis sobre eritrocitos de
caballo (A_{412}=0,6) de HlyA y HlyA
\Delta0914-936, en tampón NaCl 150 mM, CaCl_{2}
10 mM, Tris 20 mM pH=7,0. La figura 2 B. Cinéticas de liberación en
liposomas de PC:PE:Col (100 \muM) con HlyA (100 nM) y HlyA
\Delta914-936 (500 nM), realizadas a 37ºC en el
mismo tampón que los ensayos de hemólisis.
La figura 3 muestra inmmunotransferencia de
geles de poliacrilamida con SDS, de los ensayos de unión de HlyA y
de HlyA \Delta914-936 a eritrocitos. Revelados con
anticuerpo anti-HlyA. Para el caso de HlyA las
calles 2 a 8 muestran la señal de proteína unida, obtenida al
incubar la misma cantidad de eritrocitos con concentraciones
crecientes de HlyA 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10 y 20 nM, la calle 1
muestra el control en el que no se han incubado los eritrocitos con
HlyA. Para la proteína HlyA \Delta914-936, en la
calle 1 se muestra el control de la proteína pura, en la calle 2,
los eritrocitos sin incubar con HlyA y entre la calle 3 y 8 las
muestras incubadas con concentraciones de proteína crecientes entre
0,5 y 10 nM.
La figura 4 muestra geles de SDS con
poliacrilamida al 10%. Concretamente la figura 4A emplea muestras
del ensayo de unión de HlyA salvaje a columna con glicoforina,
mientras que el ensayo B emplea muestras del ensayo de unión de HlyA
\Delta914-936. En ambos casos, I corresponde a la
muestra de proteína inicial, L1 a la proteína que sale en la
primera fracción de lavado, es decir, la que no se ha unido a la
columna, L4 es la muestra de la cuarta fracción del lavado, El es
la muestra de la primera elución (bajando el pH) y E2 la de la
segunda elución (aumentando la sal). PM_{B} y PM_{A} son los
marcadores de peso molecular, el PM_{B}, es de bajo intervalo de
pesos y le faltan las dos proteínas de mayor tamaño, el resto son
iguales a las de PM_{A}.
La figura 5A representa un ensayo de hemólisis
en eritrocitos de caballo (A_{412}=0,6), con HlyA y péptido
W914-R936, en tampón NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM,
Tris 20 mM pH=7,0. La figura 5B representa un ensayo de liberación
de contenidos y de mezcla de lípidos en liposomas de PC (100
\muM) con péptido W914-R936 a una concentración de
18 \muM.
La figura 6 representa la interacción del
péptido W914-R936 con liposomas de fosfatidilcolina
(PC) (LUV) y con liposomas de PC con glicoforina reconstituida en
una relación proteína:lípido de 1:1.000 (LUV+G). Se puede observar
un cambio en la fluorescencia intrinseca del péptido en función de
la concentración del lípido. La concentración de péptido, en ambos
casos, fue de 0,5 \muM en tampón NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM,
Tris 20 mM pH=7,0.
La figura 7 representa espectros de
fluorescencia de la unión del péptido W914-R936,
figura 7 A, y de HlyA, figura 7B, a una columna con glicoforina,
tomados a una \lambda de excitación de 280 nm en ambos casos. Los
espectros 1 corresponden a la muestra que no se ha unido a la
columna, los números 2 al último lavado tras la introducción de la
muestra y los 3 a la primera fracción de la elución.
La figura 8 muestra el efecto de la
preincubación del péptido W914-R936 en la hemólisis
provocada por HlyA. La figura 8A representa cinéticas de hemólisis
de HlyA a una concentración de 0,023 nM, sobre eritrocitos de
caballo control (C) y preincubados con péptido 24 \muM (PWR),
realizadas a temperatura ambiente y con agitación continua, en un
tampón NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM, Tris 20 mM pH=7,0. Se
realizaron registrando la disminución de turbidez a 700 nm. La
figura 8 representa los tiempos a los que se consigue un 50% de la
hemólisis final para cada caso, en función de la concentración de
HlyA para eritrocitos control (C) y preincubados con péptido
(PWR).
La figura 9 consiste en un esquema de HlyA donde
se muestra en amarillo la región implicada en la interacción entre
la hemolisina y la glicoforina, que se extiende entre los
aminoácidos 914 y 936. Asimismo, se indican los distintos dominios
de HlyA: en rosa la región amino terminal, en azul (tercera región
desde el N-terminal) el dominio anfipático de
interacción con membrana, en granate (quinta región desde el
N-terminal) el dominio de las repeticiones y en
verde (región del C-terminal) la secuencia de
exportación. FAI y FAII indican los lugares de acilación de la
toxina.
Finalmente, la figura 10 muestra las secuencias
específicas de los péptidos de la invención.
La invención proporciona en su primer aspecto
una serie de péptidos que proporcionan protección frente al ataque
de las toxinas bacterianas de la familia RTX, sus derivados,
variantes o fragmentos. Estos péptidos son:
- -
- Péptido HlyA que presenta la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 1, un derivado, una variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable de éstos.
- -
- Un péptido EhxA que presenta la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 2, un derivado, una variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable de éstos.
- -
- Un péptido ApxIIIA que presenta la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 3, un derivado, una variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable de éstos.
- -
- Un péptido ApxIA que presenta la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 4, un derivado, una variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable de éstos.
- -
- Un péptido LktA que presenta la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 5, un derivado, una variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable de éstos.
- -
- Un péptido AshA que presenta la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 6, un derivado, una variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable de éstos.
- -
- Un péptido AktA que presenta la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 7, un derivado, una variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable de éstos.
- -
- Un péptido CyaA que presenta la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ. ID, Nº: 8, un derivado, una variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable de éstos.
En el contexto de la presente invención se
entiende por el término "derivado" un producto obtenido a
partir de los péptidos originales por reacciones químicas de
acetilación, acilación, amidación, esterificación, fosforilación u
otras de las que se dan en las células en los procesos de
modificación post-traducción de las proteinas. Por
ejemplo formilmetionilpéptido HlyA.
El término "variante" se refiere en el
contexto de la presente invención a un péptido obtenido por
sustitución de uno o varios (máximo cuatro) residuos aminoácidos en
el péptido original, por otros residuos de aminoácido, o eliminado
hasta cuatro aminoácidos, o añadiendo hasta cuatro aminoácidos.
Ejemplo, para el péptido HlyA, WFVVVVGDISNHEIEQIFDKSGR.
El término "fragmento" significa en el
contexto de la presente invención moléculas obtenidas de los
péptidos originales o de los derivados o variantes eliminando
secuencias de hasta diez aminoácidos consecutivos. Por ejemplo,
para el péptido HlyA, WFEKESFDKRSGR.
La invención proporciona en su segundo aspecto
las secuencias de ADN aisladas que codifican los péptidos de la
invención. Dichas secuencias son las siguientes:
- -
- Secuencia ID número 9
- -
- Secuencia ID número 10
- -
- Secuencia ID número 11
- -
- Secuencia ID número 12
- -
- Secuencia ID número 13
- -
- Secuencia ID número 14
- -
- Secuencia ID número 15
- -
- Secuencia ID número 16
La invención también proporciona una
construcción de ácido nucleico que comprende un promotor
operativamente unido a una de las secuencias de ADN de números 9 a
16, un vector de expresión que comprende una de las secuencias
anteriores de ADN, así como un sistema de expresión de células
eucariotas o procariotas que comprende la construcción o el vector
anterior.
El tercer aspecto de la invención consiste en un
organismo transformado que comprende una de las secuencias
anteriores. El organismo preferido para efectuar esta
transformación es Escherichia coli, en particular
Escherichia coli D1210. El método preferido para llevar a
cabo la transformación es por electroporación.
El cuarto aspecto de la invención consiste en un
método para producir uno de los péptidos objeto de la invención que
comprende:
- (i)
- transformar un organismo con una construcción de ácido nucleico, o con un vector,
- (ii)
- mantener a ese organismo transformado en unas condiciones que permitan la expresión del péptido y,
- (iii)
- aislar y purificar el péptido obtenido.
El quinto aspecto de la invención se refiere a
una composición farmacéutica que comprende uno de los péptidos
anteriores y al uso de los péptidos anteriores para la preparación
de un medicamento.
La composición farmacéutica puede comprender uno
o varios de los péptidos de la presente invención. Los péptidos de
la presente invención se puede administrar bien por separado como
una sustancia pura, o bien en forma de preparaciones farmacéuticas,
aunque el compuesto de la invención se administra preferiblemente
en una combinación. La combinación de fármaco está preferiblemente
en forma de una formulación que: (1) contiene uno o varios péptidos
de la de acuerdo con la invención solo; (2) contiene uno o más
aglutinantes, vehículos u otros materiales auxiliares adecuados, y
(3) puede contener además sustancias terapéuticamente activas
adicionales.
Los aglutinantes, vehículos u otros materiales
auxiliares deben ser farmacéutica y farmacológicamente aceptables,
de modo que se puedan combinar con los otros componentes de la
formulación o preparación y no produzcan efectos adversos en el
organismo tratado.
Las formulaciones incluyen aquellas que son
adecuadas para administración oral o parenteral (incluyendo la
administración subcutánea, intradérmica, intramuscular e
intravenosa), aunque la mejor vía de administración depende del
estado del paciente.
Las formulaciones pueden presentarse en forma de
dosis sencillas. Las formulaciones se preparan de acuerdo con
procedimientos conocidos en el campo de la farmacología. Las
cantidades apropiadas de sustancias activas adecuadas para su
administración pueden variar en función del campo terapéutico
particular. En general, la concentración de sustancia activa en una
formulación de dosis sencilla es del 5% al 95% de la formulación
total.
Los péptidos, sus derivados, variantes o
fragmentos de la invención son capaces de unirse a los receptores
de las toxinas bacterianas de la familia RTX en las membranas de
ciertas células de animales, si bien su unión no presenta actividad
lítica. El resultado es que el péptido protege a ciertas células de
animales de la lisis inducida por las toxinas de las bacterias RTX.
Estos péptidos, por tanto, encuentran aplicación en el tratamiento
y/o prevención de las enfermedades relacionadas con las toxinas
bacterianas de la familia RTX. Estas enfermedades son, entre otras:
septicemia, peritonitis, meningitis. pielonefritis, enfermedades en
el tracto urinario o diarrea.
La Taq polimerasa fue suministrada por Bioline
(Londres, Reino Unido). Los enzimas de restricción NcoI, PacI y la
T4 DNA ligasa eran de New England Biolabs (Hertfordshire, Reino
Unido). El enzima de restricción BseA1 fue suministrado por Roche
(Mannheim, Alemania). Los desoxirribonucleótidos eran de Boehringer
Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania). Los eritrocitos de caballo se
obtuvieron de Biomedics (Alcobendas). La fosfatidilcolina (PC) y la
fosfatidiletanolamina (PE) de huevo se obtuvieron de Lipid Products
(South Nutfield, Reino Unido). La
N-(lisamina-rodamina-B-sulfonil)
fosfatidiletanolamina (RhB-PE) y la
N-(7-nitrobenzeno-2-oxa-1,3-diazol-4-il)
fosfatidiletanolamina (NBD-PE) eran de Avanti Polar
Lipids (Alabaster, AL, Estados Unidos). La sonda fluorescente ácido
8-aminonaftalen-1,3,6-trisulfónico
(ANTS) y el atenuador bromuro de
p-xileno-bis-piridinio
(DPX) eran de Molecular Probes (Eugene, OR, Estados Unidos). La
resina Sephadex G75 y las columnas Hi-Trap
desalting, Superdex HR-200 y
Hi-trap activada con
N-hidroxisuccinimida (NHS) eran de Amersham
Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia). El EGTA (ácido
etilen-bis(oxietilennitrilo)tetraacético)
y el colesterol (Col) se obtuvieron de Sigma (St Louis, MO, Estados
Unidos). El ^{45}Ca y el líquido de centelleo PCS fueron
suministrados por Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia). Los
oligonucleótidos fueron sintetizados por Amersham Pharmacia Biotech
(Uppsala, Suecia). Los filtros de celulosa y éster, Millipore GS
0,22 \mum y los filtros Millex-HV de 0,45 \mum
eran de Millipore (Bedford, MA, Estados Unidos). El péptido
W914-R936 fue sintetizado, con una pureza del 80%,
en el Instituto de Inmunología de Colombia (Bogotá, Colombia).
Para introducir mutaciones puntuales en la
proteína se utilizó el método de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Se diseñaron los oligos necesarios. Para eliminar
una región en la secuencia de HlyA, se utilizó el mismo método
modificándolo ligeramente según la figura 1.
Los oligos A y B utilizados son los que se
muestran en el esquema. Se muestran las secuencias de los oligos,
en sentido 5'\rightarrow3', su tamaño y su Tm. En negrita se
muestra la diana de corte único introducida en los oligos.
Para eliminar la secuencia entre los residuos
914 y 936, ambos inclusive, se amplificaron dos fragmentos mediante
PCR, eliminando la región entre ambos, uno con los oligos A y C y
otro con los oligos B y D, en las siguientes condiciones:
[dNTPs](desoxirribonucleótidos)=80 \muM, [oligonucleótidos]=1
\muM de cada de uno los oligos, [MgCl_{2}]=1,5 mM y 50 ng de
DNA molde (plásmido salvaje pSU124), en el tampón de reacción de la
Taq polimerasa. La reacción se realizó a una temperatura de
hibridación de 49ºC. Estos fragmentos poseían una diana de corte
único introducida en los oligos, para facilitar el proceso de
ligación de los fragmentos al crear cortes cohesivos. Por lo tanto,
se digirieron con el enzima BseA1 en tampón NaCl 100 mM, MgCl_{2}
5 mM, 2-mercaptoetanol 1 mM,
Tris-HC1 10 mM pH=8,0, durante una hora a 55ºC a una
concentración de enzima de 300 U/ml. A continuación, se limpiaron
los fragmentos digeridos mediante una columna de afinidad de DNA.
Finalmente, se realizó una ligación de ambos fragmentos con una
relación equimolecular, durante toda la noche a 15ºC, con una
concentración de T4 DNA ligasa de 40 U/\mul, tras lo cual se
inactivó térmicamente durante 20 minutos a 65ºC.
El fragmento de 685 pb para el mutante HlyA
\Delta914-936, así obtenido, se digirió con dos
enzimas de restricción de corte único, NcoI y PacI, en el plásmido
pSU124, que cortan en los extremos de los fragmentos. Las
digestiones con ambos enzimas, tanto del fragmento como del
plásmido, se realizaron en el tampón NBE1 (MgCl_{2} 10 mM, DTT 1
mM, Bis Tris Propano-HCl 10 mM pH=7,0) suministrado
por la casa comercial, con BSA 0,1 mg/ml, con una concentración de
enzima PacI de 80 U/ml. Se incubó durante toda la noche a 37ºC y
posteriormente se inactivó el enzima térmicamente a 65ºC durante 20
minutos. A continuación, se añadió el segundo enzima, NcoI, a una
concentración de 100 U/ml y se incubó a 37ºC durante 2 horas, y al
igual que para la anterior, se inactivó durante 20 minutos a
65ºC.
El vector digerido se corrió en un gel de
agarosa para eliminar el fragmento extraído y se purificó el DNA a
partir de la banda. El fragmento digerido se limpió de los enzimas,
del BSA y del tampón en el que se encontraba mediante una columna de
afinidad para DNA, eluyéndolo con H_{2}O. Se realizaron
ligaciones, como se describe en el apartado 2.1.5, para insertar el
fragmento en el vector digerido. Las mezclas de ligación contenían
diferentes relaciones de vector e inserto: equimoleculares, el doble
de inserto que de vector y cuatro veces más. La reacción de
ligación se desarrolló durante toda la noche a 15ºC con una
concentración de T4 DNA ligasa de 40 U/\mul, tras lo cual se
inactivó térmicamente durante 20 minutos a 65ºC.
Con los resultados de las ligaciones se procedió
a transformar las bacterias Escherichia coli D1210 por
electroporación.
Se purificaron HlyA salvaje y HlyA
\Delta914-936 a partir de un cultivo de
Escherichia coli D1210 con el plásmido pSU124, según se
describe en Ostolaza y cols. (1991) y se conservaron congeladas a
-20ºC en tampón NaCl 150 mM, urea 6 M, Tris 20 mM pH=7,0 hasta su
utilización. De la purificación de HlyA
\Delta914-936 se obtuvieron 2,3 mg de proteína
por litro de medio de cultivo, una cantidad algo superior a los 1,89
mg de toxina por litro que se consiguen de HlyA salvaje.
Para medir la liberación de contenidos provocada
por las diferentes proteínas, se utilizó el método fluorimétrico de
Ellens y cols. (1985), con la sonda ANTS y el atenuador DPX
encapsulados en los liposomas. El ensayo de liberación se realizó en
todos los casos con una concentración de lípido de 100 \muM, en
un tampón NaCl 150 mM, Tris 20 mM pH=7,0 a la concentración de
CaCl_{2} indicada, con agitación continua y a una temperatura de
25ºC.
Se realizaron los ensayos de mezcla de lípidos
siguiendo el método basado en la transferencia de energía entre dos
sondas fluorescentes, el NBD y la Rh. Los liposomas con lípido
marcado (0,6% de cada sonda), así como los liposomas sin marcar,
ambas poblaciones de un tamaño de 100 nm, se prepararon en tampón
NaCl 150 mM, Tris 20 mM pH=7,0. Para realizar el ensayo se
mezclaron las dos poblaciones de liposomas marcados y sin marcar en
una proporción 1:4. para obtener una concentración de lípido total
de 100 \muM, en tampón NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM, Tris 20 mM
pH=7,0. Los ensayos se realizaron con agitación continua a una
temperatura de 25ºC. Se añadieron las diferentes cantidades de
péptido a ensayar y se monitorizó la señal de fluorescencia del NBD,
excitando la muestra a 460 nm y fijando la emisión en 530 nm, con
una apertura de rendija de 5 nm. tamo en excitación como en
emisión. Las medidas se realizaron en un fluorímetro Perkin Elmer
LS-50B (Perkin Elmer, Beaconsfield, Reino Unido).
Cuando se alcanzó la saturación del efecto se añadió el detergente
Triton X-100 a una concentración final del 0.1%
(p/v) para calcular en 100% de mezcla. Finalmente. se calcularon
los porcentajes de mezcla de lípidos según la ecuación (1):
(1)%Mezcla
=\frac{(F_{f} - F_{0})}{(F_{100} -
F_{0})}x100
donde F_{f} corresponde a la
fluorescencia obtenida tras la adición de la proteína o péptido,
F_{0} es la fluorescencia inicial y F_{100} es la señal de
fluorescencia tras la adición del
detergente.
Para los ensayos de actividad hemolítica en
eritrocitos de caballo se utilizaron eritrocitos estandarizados en
tampón NaCl 150 mM, Tris 20 mM pH=7,0 y la hemólisis se llevó a
cabo en el mismo tampón con CaCl_{2} 10 mM. Para la cuantificación
de los ensayos en placa se realizaron medidas colorimétricas a 412
nm. Las cinéticas de actividad hemolítica se realizaron siguiendo
la turbidez de los eritrocitos, a través de medidas de absorbancia
a 700 nm.
La unión de las toxinas a eritrocitos de
caballo, se determinó siguiendo el método descrito en la referencia
(Cortajarena y cols., 2001).
Se determinó la unión de las toxinas a liposomas
de PC mediante el método de flotación descrito en Pereira y cols.,
(1996). Los liposomas con un 0,6% de rodamina-PE se
incubaron en tampón en D_{2}O (NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM, Tris
20 mM pH=7,0) a una concentración de lípido de 250 \muM con
distintas cantidades de proteína, utilizando relaciones de
proteína:lípido de 1:3.000 y 1:5.000, según el caso.
La unión del péptido W914-R936 a
liposomas, con y sin glicoforina, se llevó a cabo monitorizando los
cambios en la fluorescencia intrínseca del péptido. Se registraron
los espectros excitando la muestra a 295 nm y recogiendo la emisión
entre 300 y 400 nm. Inicialmente, se tomó un espectro del péptido en
solución, y a continuación, se realizaron adiciones sucesivas de
liposomas, manteniendo la muestra con agitación continua. Tras 2e
incubarlos durante 10 minutos a 25ºC, se midió el espectro de
fluorescencia, de la muestra para cada concentración de lípido,
entre 0 y 300 \muM. En paralelo, se realizó el mismo ensayo
añadiendo liposomas sobre una muestra de un análogo del triptófano
(NATA) para realizar las correcciones de la dilución y del efecto
de la dispersión de luz provocado por los liposomas. El ensayo se
realizó de la misma forma para liposomas de PC y para liposomas con
glicoforina reconstituida. De los espectros se sacó la intensidad de
fluorescencia a la longitud de onda de emisión máxima y se
corrigieron utilizando la ecuación (2):
(2)F_{pc} =
(F_{p} - F_{l})\frac{(F_{N0} - F_{l0})}{(F_{N} -
F_{L})}
siendo F_{p} la intensidad de
fluorescencia del péptido, F_{N} la fluorescencia del NATA y
F_{l} la de la muestra de liposomas, para cada concentración de
liposomas. Y donde F_{N0} y F_{l0} son las intensidades
iniciales de la muestra de NATA y del tampón, respectivamente. A
partir de las intensidades de fluorescencia corregidas se calcularon
las relaciones de intensidad de fluorescencia para cada
concentración de lípido, entre la intensidad de fluorescencia
inicial
(F/F0).
Para realizar medidas directas de unión, tanto
de las proteínas como del péptido W914-R936 a la
glicoforina, se preparó una columna de afinidad, donde se ancló
glicoforina como se describe en Cortajarena y cols. (2001). Con
objeto de determinar la unión de HlyA y de HlyA
\Delta914-936, se introdujo 1 ml de cada proteína
a una concentración de 0,5 \muM en la columna en un tampón NaCl
150 mM, CaCl_{2}, 10 mM, Tris 20 mM pH=7,0. Tras incubar la
muestra en la columna durante una hora a temperatura ambiente, se
procedió a lavarla con el mismo tampón, utilizando cuatro volúmenes
de columna. Finalmente, se eluyó la columna bajando el pH,
utilizando un tampón NaCl 150 mM, glicina 0,1 M pH 3,0 y después de
pasar 4 ml, se pasaron otros 4 ml de tampón NaCl 1 M, Tris 20 mM
pH=7,0. Se neutralizó el pH de las fracciones eluídas, se
concentraron y se realizó una electroforesis en geles de
poliacriamida que se tiñó con plata. En el caso del péptido
W914-R936, se realizó el ensayo de la misma manera,
introduciendo la misma cantidad de péptido, a una concentración de
18,2 \muM. Tras las eluciones, y debido a la dificultad que
presenta detectar un péptido de 23 aminoácidos en una
electroforesis, se optó por medir la fluorescencia intrinseca del
péptido en las fracciones eluídas excitando a 280 nm y recogiendo la
emisión entre 300 y 400 nm con una apertura de rejilla de 5 nm en
excitación y 10 nm en emisión, para determinar en qué fracciones
aparecía el péptido.
Con el fin de determinar la unión del péptido a
eritrocitos, se realizó un ensayo indirecto en el cual se observó
el efecto que provocaba la preincubación de eritrocitos con el
péptido en la actividad hemolítica de HlyA. Los eritrocitos
estandarizados en tampón NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM, Tris 20 mM
pH=7,0 se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con
el péptido a una concentración de 24 \muM. A continuación, se
lavaron los eritrocitos tres veces por centrifugación, durante 10
minutos a 3.000xg con el mismo tampón en el que se encontraban. Con
estos eritrocitos se realizaron cinéticas de hemólisis,
diluyéndolos 65 veces en el mismo tampón y registrando los cambios
en la absorbancia a 700 nm al añadir diferentes cantidades de
proteína, como se describe en el apartado 2.2.5. Se realizaron de
forma paralela cinéticas con eritrocitos tratados de igual forma,
aunque no incubados con el péptido.
Se ensayó la actividad lítica de la HlyA
\Delta914-936 en eritrocitos de caballo y en
liposomas (LUV) de PC:PE:Col (2:1:1). Al comparar su actividad con
la de HlyA, se aprecia que HlyA \Delta914-936 es
capaz de mostrar cierta actividad sobre eritrocitos, aunque a
concentraciones 1.000 veces mayores que HlyA salvaje (figura 2.A).
Este resultado está de acuerdo con la idea de que la región
delecionada está implicada en la unión de HlyA a su receptor en
eritrocitos. La hemólisis observada a altas concentraciones de HlyA
\Delta914-936 podría ser debida a la interacción
a través de otros dominios de unión a receptor, de acuerdo con la
sugerencias de que varias regiones de la proteína estarían
implicadas en la unión a la célula (Bauer y Welch, 1996a), así como
por una unión no específica a la bicapa lipídica. Por el contrario,
sobre liposomas no se detecta actividad lítica significativa
utilizando las mayores concentraciones de toxina posibles (figura
2.B), además de la cinética mostrada se realizaron ensayos de
liberación variando las relaciones lípido:proteína, y en ninguno de
los casos se detectó actividad.
A la vista de los resultados observados al
ensayar la hemólisis, parece que la proteína ha perdido la gran
afinidad que poseía por los eritrocitos, debida a su interacción
especifica con el receptor. Para determinar si este desplazamiento
de la curva de actividad era debido a una interacción menos afín o
a una inactivación parcial de la toxina, se realizaron medidas de
unión de la proteína HlyA \Delta914-936 a
eritrocitos a bajas concentraciones de proteína, donde se supone
que ocurre la interacción específica.
Al realizar el ensayo de unión se observa que, a
estas concentraciones de proteína, en las que la proteína HlyA
\Delta914-936 es inactiva frente a eritrocitos, la
toxina con la deleción no es capaz de unirse a los eritrocitos
(figura 3). En ninguna de las concentraciones ensayadas, tras la
incubación y los lavados, aparece la banda correspondiente a la
toxina, aunque el anticuerpo anti-HlyA reconoce
perfectamente la proteína delecionada como se muestra en la calle 1
del ensayo con HlyAA914-936. A estas
concentraciones, HlyA es capaz de unirse y de saturar la unión en
las concentraciones más altas así como provocar un 100% de
hemólisis. A la vista de estos resultados, se puede deducir que la
inactividad de HlyA \Delta914-936 a bajas
concentraciones de toxina está provocada por una incapacidad de
unión a los eritrocitos, probablemente por la falta de
reconocimiento de la glicoforina.
Para poder asegurar que la falta de unión a
eritrocitos a bajas concentraciones era debida al no reconocimiento
de la glicoforina en los mismos, se determinó la unión de HlyA y
HlyA \Delta914-936 a glicoforina pura. Se utilizó
para ello una columna de afinidad donde se había anclado
previamente la glicoforina.
La proteína HlyA salvaje, como se muestra en la
figura 4.A, se une a la columna de glicoforina, apareciendo en la
muestra de la primera elución (E1) que se realiza bajando el pH.
Como se puede observar tras lavar con 4 volúmenes de columna antes
de realizar la elución, se consigue lavar por completo la proteína
no unida, ya que en las muestras L4 no aparece nada de HlyA. La
proteína HlyA \Delta914-936, por el contrario,
parece que no es capaz de unirse a la columna de glicoforina ya que
al realizar las eluciones no aparece nada de proteína visible en
ninguna de las fracciones (E1, E2, figura 4. B).
Se utilizó un péptido sintético de la región
omitida en la toxina HlyA \Delta914-936, para
determinar si esta región estaba realmente implicada en el
reconocimiento a la glicoforina. El péptido de 23 aminoácidos
poseía un peso molecular de 2.748,72 kDa y la siguiente
secuencia:
WFEKESGDISNHEIEQIFDKSGR
Se ensayó la actividad hemolítica de este
péptido, tanto en liposomas como en eritrocitos, así como la mezcla
de lípidos de liposomas.
En la figura 5.A se observa que el péptido no
provocaba hemólisis en eritrocitos de caballo, incluso a
concentraciones 100 veces mayores que las ensayadas para HlyA. De la
misma forma, no provocaba ni liberación de contenidos, ni mezcla de
lípidos en liposomas de fosfatidilcolina (PC) a muy altas
concentraciones (figura 5.B).
Con objeto de determinar si la región eliminada
en la proteína HlyA \Delta914-936, está implicada
en la unión al receptor, se ensayó la unión del péptido sintético de
esta región a liposomas control y a liposomas con glicoforina
reconstituida. Se determinó la unión siguiendo la fluorescencia
intrinseca del péptido en función de la concentración de lípido. La
fluorescencia del triptófano cambia cuando el péptido pasa de estar
en solución, a estar unido a la membrana, incrementando su
intensidad de fluorescencia por el cambio a un entorno más apolar
(Lakowicz, 1983). Los resultados de la figura 6 muestran que el
péptido se une a los liposomas que poseen glicoforina
reconstituida, mientras que es incapaz de hacerlo a los de lípido
puro. Esto parece indicar que esta secuencia se une de forma
específica a la glicoforina.
\newpage
Se intentó demostrar la interacción entre el
péptido W914-R936 y la glicoforina, para lo cual se
preparó una columna de afinidad con glicoforina. Se introdujo una
muestra del péptido en la columna, se lavó para eliminar el péptido
no unido y posteriormente se eluyó primero bajando el pH y a
continuación, aumentando la concentración de NaCl para eliminar las
posibles interacciones. Para detectar en qué fracciones se
encontraba el péptido se realizaron espectros de fluorescencia
intrinseca. En la figura 7.A se muestran los espectros de la
primera fracción de los lavados (1), donde aparece el péptido que no
se ha unido a la columna, la última fracción de los lavados (2),
donde ya no aparece péptido, y la primera fracción de la elución
donde aparece el péptido que se ha unido a la glicoforina (3). Por
lo tanto, el péptido W914-R936 es capaz de unirse a
la glicoforina pura y anclada a la columna.
Se realizó de la misma forma un ensayo de unión
de la proteína salvaje como control de unión (figura 7.B). En este
caso también se observa que HlyA es capaz de unirse a la columna
con glicoforina, como ya se vio en la figura 4.A.
A partir de los resultados anteriores se puede
deducir que el péptido W914-R936 se une a la
glicoforina purificada, así como a la reconstituida en liposomas.
Para tratar de averiguar si esta unión también se está dando en
eritrocitos, se preincubaron eritrocitos con el péptido
W914-R936 y a continuación, se ensayó la hemólisis
producida por HlyA.
En los resultados obtenidos se observa que la
preincubación de los eritrocitos con el péptido
W914-R936 inhibe la actividad hemolítica de HlyA
(figura 8). Esta inhibición se observa tanto en el porcentaje de
hemólisis final como en la t_{1/2}. La inhibición es mayor cuanto
menor es la cantidad de HlyA utilizada para realizar la hemólisis,
no detectándose inhibición a concentraciones mayores de HlyA, donde
la hemólisis es del 100% en tiempos muy cortos. Sin embargo, en la
menor concentración de HlyA ensayada, donde la cinética incluso del
control es muy lenta, no se detecta una diferencia significativa en
el valor de t_{1/2}, aunque sí en el valor de hemólisis total
siendo más bajo en el caso de los eritrocitos preincubados con el
péptido. Estos resultados parecen indicar que el péptido es capaz de
unirse a los eritrocitos y que su unión, bloquea la unión
específica de HlyA, por lo tanto, se puede deducir que el péptido
se está uniendo a la glicoforina de los eritrocitos, receptor de
HlyA en este tipo celular.
A partir de los resultados obtenidos con la
proteína HlyA \Delta914-936, se puede decir que
la región eliminada, entre los aminoácidos 914 y 936 (figura 9),
está implicada en el reconocimiento específico a la glicoforina. El
mutante posee actividad frente a eritrocitos sólo a una
concentración mil veces mayor que HlyA (figura 2.A). Además, a bajas
concentraciones no es capaz de unirse a eritrocitos (figura 3), ni
a la glicoforina purificada (figura 4.B.). Los ensayos con la
secuencia de la región delecionada, confirman esta hipótesis, ya
que el péptido interacciona en mayor medida con liposomas que poseen
glicoforina reconstituida que con los de lípido puro (figura 6), y
es capaz de interaccionar de forma específica con la glicoforina
pura (figura 7.A). Se demostró además de forma indirecta, la
interacción del péptido con los receptores del eritrocito, al
inhibir mediante la previa incubación de las células con el
péptido, la hemólisis provocada por HlyA (figura 8).
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<210> 1
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<211> 23
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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<400> 1
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\sa{Trp Phe Glu Lys Glu Ser Gly Asp Ile Ser Asn
His Glu Ile Glu Gln}
\sac{Ile Phe Asp Lys Ser Gly Arg}
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<210> 2
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<211> 23
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
enterohemorrágica
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<400> 2
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\sa{Trp Phe Ala Lys Asp Ala Ser Gly Glu Asp Asn
His Leu Val Glu}
\sac{Val Ile Thr Asp Lys Asp Gly Arg}
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<213> Actinobacillus
pleuropneumoniae
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\sa{Trp Phe Lys Gly Gly Asn Ser Tyr Asn His Lys
Ile Glu Gln Ile}
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pleuropneumoniae
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\sa{Trp Phe Lys Glu Gly Lys Glu Gly Gln Asn Asn
Lys Ile Glu Lys}
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Ser Gln Tyr Leu Thr}
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Pro Asn Tyr Lys}
\sac{Ala Thr Lys Asp Glu Lys Ile Glu Glu Ile
Ile Gly Gln Asn Gly}
\sac{Glu Arg}
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<213> Actinobacillus suis
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\sa{Trp Phe Leu Glu Asp Asp Leu Ala Ser Thr Val
Ala Asn Tyr Lys}
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Ile Gly Leu Gly Gly}
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Phe Ser Lys Pro Asn Ser Ser Ala Gly Leu
Asp Glu Tyr Gln}
\sac{Arg Lys Leu Leu Glu Tyr Ala Pro Glu Pro
Asp Val His Asp Leu}
\sac{Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bordetella pertussis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Phe Ala Arg Gin Gly Asn Asp Leu Glu Ile
Arg Ile Leu Gly}
\sac{Tyr Asp Asp Ala Leu Thr Val His Asp Trp
Tyr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtttgaaa aagagtcagg tgatatctct aatcacgaga tagagcagat ttttgataaa
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtggccgg
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
enterohemorrágica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtttgcga aagatgcctc aggtgaagat aatcatcttg ttgaggttat aacagataaa
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatggtcgt
\hfill69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Actinobacillus
pleuropneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtttaaag aagggaataa atataaccat aaaattgaac aaattgttga taaaaatggt
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaga
\hfill63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Actinobacillus
pleuropneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggttcaagg aaggtaaaga aggacaaaat aataaaattg aaaaaatcgt tgataaagat
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagcttatg ttttaagcca atatctgact gaactgacag ctcctggaag a
\hfill111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pasteurella haemolytica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggttccgtg aagcagagtt tgcaaaaaca attcaaaatt atgttgcaac aagagacgat
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaattgaag agattatcgg tcaaaatggt gaacgg
\hfill96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Actinobacillus suis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggttcttag aagatgattt ggctagcaca gttgctaact ataaagctac gaatgaccga
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaattgagg aaattattgg taaaggagga gaacgt
\hfill96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Actinobacillus
actinomycetemcomitans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtttagta aacctaattc atcggcagga ttagatgagt atcaaagaaa acttcttgaa
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacgcacctg aaaaggatcg tgcacgactt
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bordetella pertussis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggttcgcgc gccagggcaa cgacctggag atccgcattc tcggcaccga cgatgcactt
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccgtgcacg actggtatcg c
\hfill81
Claims (21)
1. Un péptido HlyA que presenta la secuencia de
aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 1, un derivado, una
variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente
aceptable de éstos.
2. Un péptido EhxA que presenta la secuencia de
aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 2, un derivado, una
variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente
aceptable de éstos.
3. Un péptido ApxIIIA que presenta la secuencia
de aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 3, un derivado, una
variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente
aceptable de éstos.
4. Un péptido ApxIA que presenta la secuencia de
aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 4, un derivado, una
variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente
aceptable de éstos.
5. Un péptido LktA que presenta la secuencia de
aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 5, un derivado, una
variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente
aceptable de éstos.
6. Un péptido AshA que presenta la secuencia de
aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 6, un derivado, una
variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente
aceptable de éstos.
7. Un péptido AktA que presenta la secuencia de
aminoácidos identificada en la SEQ. ID. Nº: 7, un derivado, una
variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente
aceptable de éstos.
8. Un péptido CyaA que presenta la secuencia de
aminoácidos identificada en la SEQ. ID, Nº: 8, un derivado, una
variante o un fragmento del mismo, o una sal farmacéuticamente
aceptable de éstos.
9. Una secuencia de ADN aislada que presenta una
secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las secuencias
identificadas en las SEQ. ID. números: 9, 10, 11, 12, 13, 14 ,15 y
16, variantes o fragmentos de las mismas, que codifican los
péptidos según las reivindicaciones 1-8
respectivamente.
10. Una construcción de ácido nucleico que
comprende un promotor operativamente unido a una secuencia de ADN
según la reivindicación 9.
11. Un vector de expresión que comprende una
secuencia de ADN según la reivindicación 9, o una construcción
según la reivindicación 10.
12. Un sistema de expresión de células
eucariotas o procariotas transformado con una construcción de ácido
nucleico según la reivindicación 10, o un vector de expresión según
la reivindicación 11.
13. Un organismo transformado, procariota o
eucariota, que comprende una secuencia según la
reivindica-
ción 9.
ción 9.
14. Un método para producir un péptido según las
reivindicaciones 1-8 que comprende:
- (iv)
- transformar un organismo con una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 10, o con un vector según la reivindicación 11,
- (v)
- mantener a ese organismo transformado en unas condiciones que permitan la expresión del péptido de las reivindicaciones 1 a 8 y,
- (vi)
- aislar y purificar el péptido obtenido.
15. Composición farmacéutica que comprende uno o
varios péptidos según las reivindicaciones 1 a 8.
16. Péptido según las reivindicaciones 1 a 8
para uso como medicamento.
17. Péptido según la reivindicación 16 para uso
en el tratamiento de enfermedades relacionadas con las toxinas
bacterianas de la familia RTX.
18. Péptido según la reivindicación 17, donde
las enfermedades relacionadas con las toxinas bacterianas de la
familia RTX son: septicemia, peritonitis, meningitis,
pielonefritis, enfermedades en el tracto urinario o diarrea.
19. Uso de uno o varios péptidos según las
reivindicaciones 1 a 8 en la preparación de un medicamento.
20. Uso según la reivindicación 19 en la
preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de
enfermedades relacionadas con las toxinas bacterianas de la familia
RTX.
21. Uso según la reivindicación 20 donde las
enfermedades relacionadas con las toxinas bacterianas de la familia
RTX son: septicemia, peritonitis, meningitis, pielonefritis,
enfermedades en el tracto urinario o diarrea.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200201648A ES2251268B1 (es) | 2002-07-15 | 2002-07-15 | Peptidos derivados de toxinas rtx para la proteccion de celulas del ataque por toxinas bacterianas. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200201648A ES2251268B1 (es) | 2002-07-15 | 2002-07-15 | Peptidos derivados de toxinas rtx para la proteccion de celulas del ataque por toxinas bacterianas. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2251268A1 ES2251268A1 (es) | 2006-04-16 |
| ES2251268B1 true ES2251268B1 (es) | 2007-07-01 |
Family
ID=36201205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200201648A Expired - Fee Related ES2251268B1 (es) | 2002-07-15 | 2002-07-15 | Peptidos derivados de toxinas rtx para la proteccion de celulas del ataque por toxinas bacterianas. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2251268B1 (es) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2634545B2 (ja) * | 1992-10-27 | 1997-07-30 | 日本全薬工業株式会社 | Ｒｔｘトキシンファミリーに属する細菌毒素ワクチンの製造法 |
| AUPN631495A0 (en) * | 1995-11-02 | 1995-11-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vaccine and biological vector(I) |
| EP0810283A3 (en) * | 1996-05-31 | 1997-12-10 | Akzo Nobel N.V. | Live attenuated RTX-procucing bacteria of the family Pasteurellaceae |
-
2002
- 2002-07-15 ES ES200201648A patent/ES2251268B1/es not_active Expired - Fee Related
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| ES2251268A1 (es) | 2006-04-16 |
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