JPS62501414A - ヒルジン様蛋白質をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヒルジン様蛋白質をコードするＤＮＡ配列及びその蛋白質の製造方法 本発明は、ヒルジ゛ンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質をコードするＤＮＡ 配列に関する。更に本発明は、ヒルジンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質の 製造に使用するだめの組換えＤＮＡ分子、即ちクローニング及び発現ヘクターな らびに該ヘクターにより形質転換される殺菌、酵母、哺乳類細胞等の宿主に関す る。

また、本発明は、ヒルジンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質を含有する医薬 組成物に関する。

ヒル（医療用ヒル−旧ｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａ！ｉｓ）の通用は、最も古く から知られた治療形態の一つである。それは、有史以前に、既に、血液の抜取り が治療法として行なわれていたことからも知ることができる。

ヒルによる治療は、数千年の間車なる血液の抜取りよりも良い結果をもたらす治 療法として提供されていた。し２かしながら、その作用形態に関しては、全く知 られていなかった。歴史上に現れるヒルを用いた最初の治療は、約２２００年前 にギリシア人医師であるコロフォン（Ｃｏｌｏｐｈｏｎ）のニカンデル（Ｎｉｋ ａｎｄｅｒ　）により行なわれたが、かかる治療形態の実質的な創始者は、イー スキュラブ（Ａｅｓｃｕｌａｐ）の弟子であるラオディカのテミソン（Ｔｈｃｍ ｉｓｏｎ）と考えられている。中世において、ヒルは当時の看護人であった理髪 師のみならｒ、特に医師によっても、−ＪＧに治療目的として使用されていた。

ヒルは、数分間のうちに約１５立方センチの血液を吸い取ることができる。もし ヒルが血液の凝固を防ぐことができなければ、その摂取によって窒息してしまう のであろう。ヒルは、傷口においてすでに凝固防止剤を血液に混合する。トロン ビン拮抗剤の分泌は、ヒルにとっては絶対的生命力となる。ヒルは、トロンビン 拮抗剤をその頚部の腺で作る。

この抗凝血性質は゛、付随的に血行を改善し、血液及び体液の流速を数倍に高め 、また血管鎮痙効果を有する。

更には、この分泌物は、殺菌シュードモナスのみが生存する抗菌性質を有する。

この細菌は、蓄積された血液を消化し、栄養物に転換する。この殺菌が破壊され ると、ヒルは、この菌なしには生存できないため、死滅する。従って、なぜヒル が数千年にわたって人類の助けになったものであったかが、理解できる。その分 泌物は、抗トロンビン性、抗炎症性、浮腫減少性であり、体液及び血液流の速度 を増大し、血管鎮痙性でかつ抗菌性である。従って、その分泌物は非常に有効な 物質である。ヒルによって生ずる少量のかみ傷（ところで、そのかみ傷は、痛み はないが、たソわずかにかゆみを生ずる）は、１０時間もの間血液の凝固を防ぐ 。

無菌的処置及び防腐処置が、ヒルによる直接治療を終結させた後、世界中の研究 者がその活性物質を再び治療に用いるため、その単離方法を追求した。１８８４ 年に、凝集拮抗性の抽出物が初めてヒルから得られた。後に、ヒルの活性物質は 、異質の蛋白質から部分的に精製された。かくして得られた精製の物質はヒルジ ンと命名された。

ヒルジンは、高分子ポリペプチドであって、分子１７０００を有し７、抗炎症性 及び浮腫減少性を有する。凝集系の各相におけるその抑制効果の分析は、他の凝 集要因と反応せず、また血液中に存在する他の成分と相互作用を起こさないで効 果を生ずる酵素トロンビンの特異的抑制物質であることを示した。ヒルジンは、 このように血液凝固を、第１の凝集相の反応生成物ずなわらトロンビンを遮断す ることにより防ぎ、そし７で第２の凝集相、すなわちフィブリン形成の誘因を防 ぐ。

それ故、ヒルジンは、特異的なｌ−ロンビン拮抗剤である（、Ｉｕｉ−Ｙｏａ　 Ｃｈａｎｇ、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　Ｖｏｌ、　１６４．３０７頁（１９８３ ））、これまでヒルジンは、ヒルから単離されていた。約１ｍｇのヒルジンが７ ０匹のヒルから得られるにすぎなかった。かくして得られたヒルジンは、抗血栓 および抗炎症静脈治療に使用される軟膏に主として加工される　ＣＰ、ｌ＋ｌａ ｌｓｍａｎｎ、　Ｆ、Ｍａｒｋａｒｄｔ、　Ｄｉｅ　Ｐｈａｒｍａｚｉｅ＋　ν ０１゜３６．６５３頁（１９８１））。最近、ヒルジンは、例えば血液透析中、 凝血障害の処置または血液ａ集の防１Ｆのためにも使用されている。しかしなが ら、それは限られた量しか入手できず、また純度も十分でなかったため、従来ヒ ルジンは、Ｃ＝床試験に用いられることはなかった。

従って、本発明の根底にある課題は、ヒルジンの生物活性を有するヒルジン様蛋 白質、および遺伝子工学によってこの蛋白質の大規模生産を可能とする方法を提 供することにある。更に本発明は、このヒルジン様蛋白質からなる医薬組成物を 提供することを目的とする。

それ故、本発明は、特許請求の範囲に特徴ずけられる課題に関するものである。

“ヒルジン様蛋白質”の用語は、そのアミノ酸配列が天然のヒルジンのアミノ酸 配列に近似しているか、またはその一部だけからなり、および／′または天然の ヒルジンに対しで、６３位の（ロジン残基におい″（ｇ酸化され（ｓｕｌｆａｔ ｉｚｅｄ）でない蛋白質を指す。

未発明によると相当する融合蛋白質もまたＵルジン様蛋白質占称される。“ヒル ジンの生物活性を有する蛋白質”とは−１天然のヒルジンと同一・である必要は ないが、天然のヒルジンの住物活性を持つ蛋白質に関するものである。従ってそ れは、天然ヒルジンのような！・＋７ソビンなどの蛋白質類に対して作用し、お よび／または該天然ヒルジンの免疫学的性質を有する。

ヒルジンの脱硫酸化は、ヒルジンの生物活性に、わずかな減少を生ずるにずぎな いということが知られている。（Ｊｕｉ−Ｙｏａ　Ｃｈａｎｇ。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、シｏ１．１６４．３０７頁（１９８３））６ヒルジンの生 物活性を有するヒルジン様蛋白質を遺伝子工学的に製造するに当り、次の工程が 実施される。

まず、第１表に示されたオリゴデオキシリボヌクレオチド類を、ＤＮＡ合成装置 を用いて合成する。この合成は、Ｊ、Ｄｏｄｔ。

Ｈ，Ｐ、門口１１ｅｒ、　Ｕ、５ｅｅｎ＋旧１ｅｒ及びＪｕｉ−Ｙｏａ　Ｃｈａ ｎｇ（、こよるＦＥＢＳ　Ｌ、ｅｔｔ誌Ｖｏ１．６１５．１８０頁（１９８４） に記載されたアミノ酸配列に基くものである。

主として、Ｅ、ｃｏｌｉにより最も高頻度で使われているコドン類が使用されて いる。この場合、融合蛋白質から相当する蛋白質をＣＮＢｒ解裂により任意に解 裂するため、合成遺伝子の５′末端にＡＴＧコドンを置くように配慮されている 。かくして得られたオリボデ側キう・リボヌクレオチド類は、精製され、更に後 の工程においで；ＪなＡ、〉、ハる結紮：１ｉＢａｔｉ＊ｎ）ためｊ、こ、ボッ スフ°“しｉＪドキナーゼ及びＴ−′２Ｐ　−ｒＡＴＰによりリン酸化される。

この反応における生成物は、”？−備的なポリアクリルアミドゲル電気泳動によ り精製される。次いで→−鎖及び−鎖（相補鎖）をアニールし、結合して遺伝子 断片を生成させ、それは次いで予備的なポリアクリルアミドゲル電気泳動により 精製し、互いに結合して完全な合成遺伝子が得られる（第１図）。かくして得ら れた遺伝子は、遺伝子ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから天然の遺伝 子を距離するために用いることができる。この合成遺伝子は、ｌａｃ　ＵＶ５プ ロモータを含むベクターｐ　ＥＭＢ　＋−８＋　（＃’４ツ連邦共和国、ゲソヂ ンゲンのＤ　Ｓ　Ｍに寄託番号ＤＳＭ３１３９とし７て寄託されている）に組込 まれた。もちろん、他の発現制御配列、例えばＥ、ｃｏｌ　ｉのｔａｃ系、Ｅ、 ｃｏｌｉのｔｒｐ系、Ｆ、ｃｏｌｉのリボ蛋白質プロモーター、酵母の発現制御 配列または他の真核生物の発現制御配列も使用することがごきる。

この点において重要なことは、遺伝子と発世制？’ｊ’Ｊ配列との間の有効な結 合及び特定の宿主生物に対１．□−てｉら切な発現制御配列のｉｘ択である。

組換ス発現ベクターを構築した後に、それを形質転換５■能な宿主生物、例えば Ｅ、ｃｏｌｉ　ＯＭ　２１４　（Ｓｔａａｕ＋ｓａｍｎ＋１ｕｎＢ　Ｐｒｏｆ、 　Ｇ、　５ｃｈｕｔｚ。

Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ　Ｋｒｅｂｓ４ｏｒｓｅｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｎＩｌｌ　Ｈ ｅｉｄｉｌｌｂｅｒｇ　ＤＳＭ　Ｇ５ｔｔｉｎｓｅｎ寄託番号ＤＳＭ３１３８） に挿入する。発現制御配列によっては、他の殺菌、酵母、および動物またはヒト の細胞も宿主生物として使用することができる。ヒルジン様蛋白質を合成する形 質転換体類は、それらのアンビシリ゛／抵抗性及び抗ヒルジンＩｇＧ抗体との反 応により同定される。

最後４？、本発明により製造されたヒルジン様蛋白質を、血液凝固において重要 な役割発は、′、二ず酵素）ロソ”じンに対するろ１物活性について試験する。

これに関連して、第１に殺菌から合成されたヒルジン様蛋白質は、ト１コンピン によるフィブリノーゲンからフィブリンへの反応を抑制し、また第２にトロンビ ンによる色原物質の転接もまたこの蛋白質によって抑制されるということが分か った。このことから、本発明の方法により製造された蛋白質は、ヒルジンの生物 活性を有することが分かる。

かくして血液の凝血障害の処置または血液凝集の防止のための医薬組成物は、発 明に係る蛋白質またはそのシアン化臭素分解物を各々用いて製造することができ る。任意的に医薬的に許容される添加剤および希釈剤を添加することもできる。

第１図は、合成遺伝子の完全なりＮＡ配列を示す。黒色矢印は合成単鎖オリゴデ オキシリボヌクレオヂドの境界を示し、小断片Ｉ、■、■及びリンカ−が仕切ら れている。更に対応するアミノ酸配列がＤＮＡ配列の上に示しである。

第２図は、組換えプラスミドｐＲｕｄｉ　１及びそれに挿入された合成ＥｃｏＲ Ｉ−Ｂａｍｌｌｌ断片を示す。合成断片はプラスミドｐＥ？！ＢＬＢ＋のβ−ガ ラクトシダーゼ遺伝子のα断片中に位置するポリリンカーに挿入されている。α 断片の最初のアミノ酸は、ヒルジンのアミノ酸と共に、示された融合蛋白質を形 成する。

第３図は、クローンｐＲｕｄｉ　１によりコードされた融合蛋白質の完全なアミ ノ酸配列を示す。天然のヒルジンに対応するアミノ酸は、第１文字を大文字とし て示した。

以下の実施例は、本発明を説明するものである。こられは説明の目的のみに示さ れたものであって本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１ 占ルジンｑ住〕濯はレヒ忙ｔゑ厘迫ヱー全一ジニｙず邊−リＮ入祠剋食金人 第１表に示されたオリゴデオキシリボヌクレオチド類は、ＤＮＡ合成装置（アプ ライド　バイオシステムズ社（ＡＰｐＩｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のモデル ３８０Ａ）により合成した。

第１表二合成オリゴヌク１／オチド類 ５′末端　３・末端 ＲＩ　ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧＴＴＧ’ｒＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＣＣＧＡ ＡＲ２ＣＣＡＧＡＴＴＣＧＧＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＡ ＣＲ３ＴＣＴＧＧＴＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＴＧＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴ ＡＡ１１４　ＡＡＡＣＧＴＴＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＣＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴ ＴＣＴＧＡＲ５ＣＧＴＴＴＧＣＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＣＡＴＣＣ ＴＧＧＲ６ＡＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧ ＣＲ７ＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＧＣＧＴＴＡＣＣＧ ＧＴＧＲ８ＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＴＡＡＣＧＣＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＴＴＣＡ ＣＣＧＴＣＲ９ＡＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡＡＡＣＣＧＣＡＧＴＣＴＣＡＣＡＡＣ ＧＡＣＧＧＴＧＡＲＩＯＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＣＴＧ ＣＧＧＴＴＴＣＧＧＡＧＴＲ１１ＣＴＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＧＡ ＡＴＡＣＣＴＧＣＲ１２ＣＴＡＴＴＧＣＡＧＧＴＡＴＴＣＴＴＣＣＧＧＧ八ＴＴ ＴＣＴＴＲ１３ＡＡＴＡＧＴＡＡＧへへＡＧＣＧＴＣＧＲ１４ＧＡＴＣＣＧＡＣ ＧＣＴＣＡＣＴＴＡ合成プログラムは、Ａ　Ｂ　Ｉ　００３５／１７／８４であ る。用いた化学品は同様にＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から入手し た。ＬＣＡＡ／ＣＰＧ　（長鎖アルキルアミン調製多孔性ガラス）がヌクレオシ ド−３−〇−コハク酸エステル（約３０μｍｏｌ／ｇ）により活性化された。各 々の合成は、ｌメｒｍｏｌのヌクレオシドから開始した。また、各々の合成の停 止は、“トリチル　オフ、自動（ｔｒｉｔｙ　ｏｆＬａｕｔｏ）”分裂モードに より行なった。それによれば酸に不安定な５’−０−（４，４′−ジメトキシト リチル）基は、チオフェノール及びアンモニアによる処理の前に離脱した０合成 装置の生成物のアンモニア性溶液は、テーパー付フラスコに移し、元のガラス容 器はそれぞれ約１０ｍＪの２５％アンモニア溶液ですすいだ。

フラスコを注意深く密封し、次いで５０℃で１４時間加温した。

次いでその溶液をオイル式真空ポンプにより濃縮、乾燥し２、各生成物を、ｐＨ ７，４の２０ｍＭ）リエチルアンモニウムニカルボン酸塩緩衝溶液（ＴＥＡＢ） ５００μβ中に溶解した。

１０分の１の各々の粗製オリゴマーを、次いでイオン交換型のＨＰＬＣ（高速液 体クロマトグラフィー）により精製した。ラテソク（Ｌａｔｅｋ）　ＨＰ　Ｌ　 Ｃ装置は、２台のＰ４００溶媒ポンプ、自動勾配制御装置、１００μｐの試料受 容ループを備えたレオダイン（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）　７１２５注入部、ミルトン 　ロイ（Ｍｉｌｔｏｎ　Ｒｏｙ）モデル１２０４Ａ　ＵＶ検出器（検出波長２８ Ｏｒ＋ｍ、５度１．０）及び品性Ｃ−Ｒ３Ａ記録計からなる。ラテソク　パーテ ィシル（ＬａｔｅｋＰａｒｔｉｓｉｌ）　１０３ＡＸ　ＨＰＬＣカラム（直径４ ｍｍ）は、５０°Ｃの湯浴中に配置されており、その流速は２　ｍ１４／分であ った。分離のために、？容媒Ｂが２０から６０％までの、２容媒ＡおよびＢの線 形勾配を、４５分間使用した（溶媒Ａ−４０％（Ｖ／Ｖ）　。

１ｍＭ’Ｊ７酸トリエチルアンモニウム、ＰＨ６、３，６０％（Ｖ／Ｖ）、ポル ムアミド；ン容媒Ｂ−４０％（Ｖ／Ｖ）　５００ｍＭリン酸トリエチルアンモニ ウムｐＨ６，３，６０％（Ｖハ）ホルムアミド）。

これらの溶液の調製には、分析品質のホルムアミドを、４０ｇ／ｒのＢｉｏ　Ｒ ａｄ　ＡＣ３０１−Ｘ８イオン交換樹脂（分析品質の混合床樹脂）と共に５時間 撹拌して用いた。流出を注意深く監視し、最後に流出するＵＶ活性物質を含む分 画（ｉＪｆｌ常、主吸収）を手動により集めた。脱塩のためにこの分画に、蒸留 水を１：１の割合で加えた。その分画を、次いで３１１Ｉ！！のメタノール、ｐ Ｈ７，４の２００ｍＭ　ＴＥＡＢ／３０％アセトニトリル及びｐＨ１，４の２０ ０ｍＭ　ＴＥＡＢ各々により、前洗浄した３　ｔａｎオクタデシル（Ｃ＋ｅ）一 方力ラム（Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ　７０２０−３　）にかけた。後にカラムは３　 ｍ１２の各々前記と同じ緩衝液により２凹ずずいた。次いで、該生成物を２Ｘ３ ｏ＋ｆｆの２００ｎＭＴＥ八Ｂ、　ｐＨ７、４／　８０％メタノールにより溶出 させた（Ｈ，Ｂｌｏｃｌｉｅｒ、　Ｒ，Ｆｒａｎｋ及び助手らのＥＭ　Ｂ　ＯＣ ｏｕｒｓｅ＋　ＢｒａｕｎｓｃｈｕｒｅｉＨ＋　１９８４年９月・マニュアル） ０才イル式ポンプ減圧により、濃縮、乾燥した移、精製されたオリゴデオキシリ ボヌクレオチドを１　ｍ７！の２０ｍＭ　ＴＥＡＢ　（ｐＨ７，４）にとり、吸 収を２６０ｎｍで測定した。

５００ピコモルの各オリゴマーを定量的リン酸化に使用し７た。

を考慮せずに加算して計算した。各オリゴヌクレオチド５００ピコモルを、１５ μＩの蒸留水と２μβの１０ＸＰＮＫ緩街液（ｐＨ７，６の５００ａ＋ＭＴｒｉ ｓ　−ＨＣｌ、　１００ｍＭＭｇ（ｊ！ｚ　、５０ｍＭＤＴＴ。

１０１スペルミジン）に！！！、濁し、次いで７０℃で１０分間保持した。次い で混合物を冷却し、ｒＡＴＰが１μＭとなるように調整し、次に１ｕｃｉのアデ ノシン５′−（γ−３２Ｐ）三リン酸塩、ｌ・リエチルアンモニウム塩（６００ ０Ｃｉ／ｍ　Ｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｕｃｈ−ｌｅｒ　ＧｍｂＨ＆　Ｃｏ 、　ＫＧ、　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）及び１ｐＲのポリヌクレオチドキナー ゼ（４，５単位、ヘーリンガー　マンハイム）を加えた。

反応は、３７℃で熟成した６　１５分移に１ｐｌの１０ｍＭ　ｒＡＴＰを加え、 熟成を更に１５分間続け、１０μｐのつし・アーミクス（ｌｌｒｅａ−Ｍｉｘ； 　１０　Ｍ尿素、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０ ．０５％キシレンシアノブルー）を添加して反応を停止した。

ゲル装入前に、その混合物を９５℃に１分間保った。

変性ポリアクリルアミドゲル（長さ６０ｅ＋ｎ、ＪＷさ０．１　ｃｌ　；　８％ アクリルアミド、８．５Ｍ尿素、Ｉ　ＸＴＢＥ　（８９ｍＭトリス塩基、８９ｍ Ｍホウ酸、２ＲＩＭ　ＥＤＴＡ））を３０ワツトで２時間前操作した。

次いで、変性されたリン酸化反応物を負荷した。電気泳動を３０ワツトでブロモ フェノールブルーが４５ｃｍに移行するまで行なった。ガラス板の一方を取り外 し、ゲルをサランラップで覆い、Ｘ線フィルムに、１時間さらした。オリゴヌク レオチドに相当するバンドの全長をゲルマトリックスを含めて切り出した。その マトリックスを３００μｌのＴＥＩＩ衝後（１０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｅ　（ ｐＨ８）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中にくだき、懸濁した。

オリゴヌクレオチドを６５℃で３時間溶出した。ゲルマトリ・ノクスは、１２． ００　Ｏｒｐｍで１０分間遠心して落とし、Ｆ澄を０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ Ｈ１０）及び担体としてのグリコーゲンの存在下でエタノール沈殿にかけた。ベ レットを８０％エタノールで２回洗浄し、次いで真空下で乾燥し、ＴＥ緩街液中 に最終温度がヌクレオヂド２ピコモル／μｒとなるように入れた。

最初の工程において、５０ピコモルの単鎖オリゴヌクレオチドをそれに対応する 他方のｉ（＋鎖と全反応腹足１００メ１ｆｆ（５０ｍＭＮａＣβ、２ＸＴＥ％ｐ ＋！８）中でアニールさせた。その混合物を９０℃まで加温ｊ７、湯浴中で同温 度に２分間保ち、次いで湯浴を一夜室温まで冷却さ一１＝た。小断片をそれぞれ ２０μｒのアニーリング混合物（小断片１：Ｒ１＋Ｒ２とＲ３＋Ｒ４、小断片■ ：Ｒ５＋Ｒ６とＲ７＋　Ｒ８、小断片１１１：Ｒ９＋Ｒ１０とＲ１１＋Ｒｌ　２ 、小断片ＩＶ：Ｒ１３＋Ｒ１４を二量体が形成されるように結合させた）を用い て全量を１００９１　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−１１ｃｉ２（ｐＨ７，５）　、 １０ｍＭ　ｈ、、ｃｃ２．５７１ｇ　ＢＳＡ、１ｍＭス・”（ルミノン、。

１ｍＭ　ＡＴＰ、１０単位の７４−ＤＮＡリガーゼ（べ・−リンガ〜マンハイム ））として結合サセ？、：。

熟成を１７°Ｃで４時間行ない、７０°Ｃで１０分間加熱することにより反応を 停止した。混合物は、０．３Ｍ酢酸すｌ・リウム（ｐＨ１０）及び担体としての グリコーゲンの存在下でエタノール沈殿させ、８０％エタノールで２回洗浄し、 乾燥させた後に３０μｐのＴＥ−緩衝液（ｐｔ＋８）中に採取し７た。２０　Ｉ ｔ　（ｌの各結合混合物を５．５　ｐ　ｊ！の負荷用緩衝液（２０％フィコール （Ｆｉｃｏｌｌ）　４００（ファルマシア製、ウプサラ、スウェーデン）、２％ ＳＤＳ。

０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンキサノールブルー）と 混合し、次いで７０℃で５分間加熱した。

非変性ポリアクリルアミドゲル（長さ４０ａｎ、ｆｆさ０．０１ｃｍ、１０％ア クリルアミド、１ｘＴＢＥ）を２００ボルトで２時間前操作し、次いで結合試料 を負荷し、た。電気泳動を３００ボルト、１／２ＸＴＢＥ中で７時間、ブロモフ ェノールブルーが２５Ｃ１１１に移行するまで行なった。そのゲルは、オートラ ジオグラフに１２時間かけた。

目的の長さに相当する断片を切り出し、第１のゲルについて述べたと同様にして 溶出した。乾燥したＤＮＡべＬ・ノ１は、２０μｐのＴＥ緩衝液に採取した。

約１ピコモル（１０μｅの小断片調製！！！７Ｉ）の各小断片を企及ＬｉＳ液量 ５０μｅ中で前述し７たのと同様な条件で結合した。酵素の不活性化及びＤＮＡ の濃縮は、すでに述べた方法によって行な−２た。

そのＤＮＡベレットは８μ（ＯＴＥ中に採取した。

合成遺伝子の全配列もまた、第１図ｊ、こ示されている。

実施例２ クローニング用ベクターの構築、合成り　Ｎ　、Ａ配列の発規及びＥ７ｅｏｌｉ 　ＯＭ　２１４の形質転換 合成遺伝子は、ぞの胱ｏｉ１１及びＢ、うｍｉｌ＋のクローニング部（◇を経て 多量体を形成する、′、とができ、ろので、その：ｌｊｌ製物をベクター吉の結 合に先立ってＥｃｏＲＩ　とＢａｍＨＩ　とにより消化した。５μｌの結合反応 物を４０単位のＥｃｏＲＩ及び３０ｉＡ位のＢａｍＨにより全体積４０μＩＩ！ 　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）　、１００１μ１Ｍ　ＮａＣｊ！、１ ０ｍＭＭｇ　ＣＩ！、ｚ　、１ｍＭ　ＤＴＴ）中で３７°Ｃ，１時間消化した。

引き続きそのＤＮＡを０．３　Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨｌＯ）の存在下でエタノ ール沈殿させ、８０％エタノールで２回洗浄し、乾燥させ、２４μＥＯＴＥ中に 採取した。

１０ｇｇのｐ　Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　８　＋　（Ｌ、Ｄｅｎｔｅ、　Ｇ、Ｃｅ５ａｒ ｅｎｉ及びＲ，Ｃｏｒ−ｔｅｓｅ、　Ｎｕｅｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　 ＩＬ　１６４５−１６５５　（１９８３）　）のプラスミドＤＮＡを４０．ｉｉ ｉ位のＥｃｏＲＩ　と３０東位のＢａｍＨにより消化し、２，５単位の小生の腸 からのホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム製）で脱リン酸化を全反応体積 １００μｌ、３７℃で１時間行なった。反応緩衝液は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ ｐＨ７，５）、１００１Ｍ　ＮａＣ４！、１０ｍＭ　ＦＩｇＣｌｔ及び１ｍＭ　 ＤＴＴからなる。反応は、ＥＧＴＡをＱ終濃度２５ｍＭとなるように加え、７０ ℃で１０分間加熱することにより停止させた。次いで、８０％の緩衝されたフェ ノール（ｐＨ７、５）を１５０μｌ用いて抽出を行なった。

上層をセファデックスＧ１００（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン；全床 体積２　ｉｎ）が充填されたゲル口過カラムに付し、１０ｍＭ重炭酸アンモニウ ムで平衡化した。溶出液の各々の分画は約１００μｐであった。これらの分画の 一部を、臭化エチジウムを含むアガロース板にスポットした。ＤＮＡは、ＵＶ照 射によって可視化できる。全ＤＮＡのうちの約７５％を含んでいる最初の分画を 集め、それを減圧下に乾燥させた。そのＤＮＡを最終濃度が０．１ｇｇ　ＤＮＡ ／μρ　ＴＥ緩衝液となるように再度懸濁した。

０．０５ピコモルの挿入用ＤＮＡ制限断片を０．１ピコモルの合成されたブクタ ーＤ　Ｎ　Ａと全１２０　、ｌＪ　Ｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）、 １０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、ｌ　７１ｇ　ＢＳＡ、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭＡ ＴＰ、５単位の７４−ＴＩＪＡリガーゼ（ヘーリンガー　マンハイＪ、製））中 で混合した。１４℃で３時間９１！成させた。２ノｊｇの小生胸腺のｔＲＮＡ（ ベーリンガー　マンハイム製）及び８０μＮｏ）ＴＥ緩衝液を加えた後、８０％ フェノール（ｐＨ７、５）−クロロホルム−イソアミルアルコール（体ｔｎ比２ ４　：　２４　：　１　）　ヲ含む溶媒１００　／Ｊ　（４を用いて抽出を行な った。１０μβの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ１０）及び】μｐのグリコーゲン（ レンナー（Ｒｅｎｎｅｒ）　ＧｍｈＨ製、ダルムシュタット、西ドイツ）を加え 、次いでその溶液をエタノール沈殿させ、８０％エタノールで２回洗浄し、減圧 下に乾燥させ、１０μｌのＴ　Ｅ緩衝液に再溶解させた。

かくして得れたプラスミドｐＲｕｄｉ　１の構造を第２図に示した。発現生成物 のアミノ酸配列は第３図に示されている。発現される生成物は融合蛋白質であっ て、β−ガラクトシダーゼのアルファペプチドのアミノ酸（１−８番目）及び天 然のヒルジンに対応するアミノ酸（９番目以１！ｉ）を有している。

目的に適したＥ、ｃｏｌｉ　ＯＭ　２１４　、細胞の調製は、標準法に従って行 った。４０ｍ！！の栄養培養液（セルバ（Ｓｅｔνａ）、カタログ番号４８４９ ８）にｌＥ、ｃｏｌｉ　ＯＭ　２１４株の単一コロニーを接種した。培養は、２ ０Ｑｒｐｍで振とうを行ないながら３２℃で約１５時間行った。この培養液４　 ｍｘを２００ｗ＋ｆｆの新ζＴな栄養培地に加えた。

熟成を前述と同様にして細胞密度が１　ｍｌあたり２Ｘ１０’細胞となるまで行 なった。その培養液を氷トで急速に冷却し、次いで８０００ｒｐｍで５分間遠心 分離を行なった。沈殿した細胞を１００ｍＡの３０ｍＭ塩化カルシウム溶液中に 再び懸濁し、０℃に２０分間保った。次いでそれを再び遠心分離し、１０ｍ１！ の塩化カルシウム溶液に懸濁させた。その細胞を０℃で２４時間保持した。次い で１　ｍＮの滅菌したグリセロールを加え、液体窒素中で急速に凍結さセだ後、 −７０℃で保存した。

かくして得られた凍結された十分なＥ、ｃｏｌｉ細胞を氷」−で融解させた。１ ００μｐの細胞に、５μｒの精製された結合Ｄ　Ｎ　Ａを添加した。該混合物を ０℃に２０分間保った。該細胞を正確に４分間３７℃に律動的に加温して、プラ スミドＤＮＡの取込みを可能にした。

該細胞懸濁液を氷Ｆで冷却し２、次いで培養液中に、１０倍に希釈し、３７℃で 約４０分間熟成した。懸濁液の一部（１％、１０％及び９０％）を１．５％の寒 天、栄養培地及びｌ　ｍｌ中１００μｇのアンピシリンを含む寒天平机上に延ば し、これを抗菌剤に対する抵抗性によって形質転換体を選択するために用いた。

該寒天平板を３７℃で１４時間熟成した。育成したコロニーを採取し、ヒルジン 配列を含む融合蛋白質の発現を酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ、）により検 査した。

実施例３ 査茎ＤＮＡ配ｌ［λ発−則−及ｐ澤眞四−生〜床’＋ｉ　ｏ　ｉｔ　１−６０ｇ ｇ／ｉｆｆのアンピシリンを含む２ＸＹＴ培地２．５ｍ／！で各Ｅ、ｃｏｌｉコ ロニーを培養し、各培養液を、３７℃で６時間振とうした。細胞を遠心分離によ り収集し、１１の１０＋＋＋Ｍ　ＮａＣＥ溶液で洗浄し、２５０μｌの溶菌用緩 衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、３０１１１１１のＮａＣ１、ｌ ａ＋ｇ／ｍ７！のりゾヂーム）中に懸尚しまた。

０℃に３０分間保った後、細胞を３度にわたって一７０℃で凍結し、３７℃で融 解させた。冷却しソ、：溶菌液を１５．　ＯＯＯｒｐｍで遠心分離した。−Ｙ・ 、；今は、ピルジン様蛋白質の検出のために保存した。

Ｅ、ｅｏｌｉの溶菌液中のヒルジンの検出をＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓへ試験により行なっ た６５０μβの抗ヒルジンＩｇＧ溶液（プランドルガン（ＰＩａｎ−ｔｏｒｇａ ｎ）　、バドチュイソシエナン（Ｂａｄ　Ｚｗｉｓｃｈｅｎａｈｎ））及び１０ μｐ／ｍρのＩｇＧを含有する結合形成用緩衝液（１７！の［１，０に１．５９ ｇのＮａ１ＣＯ３，２，９３ｇのＮａ１１ＣＯ：＋及び０．２ｇのＮａＮａを加 える）をマイクロタイタープレー１のくぼめに満たし、４°Ｃで一夜熟成した。

次いでプレートの（ぼみを、ＰＢＳ緩衝液（Ｉｆｆの８．０に８．０ｇのＮａＣ ｌ、０．２ｇのに８２Ｐ０４．２．９８のＮａ２ＰＯ，−１２８，０，０，２Ｃ のｉ［Ｃ７！、０．５ｍｆｆのＴｗｅｅｎ　２０．０．２ｇのＮａＮ：＋を加え る）によって３回すすいだ。この緩衝液は、すべてのすすぎ処理に用いた。

試験用溶菌液は５０μｅを使用し７た。室温で２時間面いた段、プレートのくぼ みを３回洗浄し、そしてアルカリホスファターゼと接合された抗ヒルジンＩｇＧ ５０μｐを加えた。接合体は、アルカリホスファターゼタイプ■Ｔ（シグマＷＡ ）を用いて調製したもので、その調製は、カタｌ】グ“研究用４１−化学及び有 機化合物（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｎ ｄｓ　ｆｏｒ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ）　”　７１３頁（Ｓｉｇ＋ｎａ　Ｃｈｅｍｉ ｅ　ＧｍｈＨ）の説明書に従って行なった。

室温で２時間の７り成の後、くぼみを再び３度洗浄した。引き続いて、アルカリ ホスフッ・タービの基γｆ（シグマ］０４：ｐ−ニトロノエニルボス′ノエート 、１ｍｇ、／＋ｍｆｆの１０％ジェタノールアミン、０．１．　ｍｇ／　ｔｎ　 １のＭｇＣ１２２，６ｕ２ｏを含む、１１１１１９．８　）を５０μｌ’！カロ えた。酵素反応は視覚的（こ判定（また。同性の結果、ずなわら１テ。

ルジン様蛋白質の存在は、抗ヒルジンＩＰ、Ｇ　！こ結合し７たアルカリホスフ ァターゼの活性による溶液の黄変、！：　Ｌ、てｌ′テにぬられ〕、−ｏ　Ｅ、 ｃｏｌｉ抽出物中のヒルジン様蛋白質の定量的評価は、試料と並行して使用（７ た既知濃度をヒルジン標準溶液の希釈系、１．：の比較！：　Ｊ：り行な、た。

３５個のＥ、ｃｏｌｉクローンを同時に検定した。そのうちの４個（階９．１３ ．１９．３５）が陽性の結果を示した。ヒルジン標準溶液との発色反応の比較か ら、該クローン類は、１０ないし２０μｇ／７！のヒルジン様蛋白質を生成した ことが示された。

実施例４ ヒルジン様　白　の生　活性の４出 ６０μｇ／ｍｔｌアンピシリンを含有する１１の２ＸＹＴ培地で、Ｅ、ｃｏ１ｉ クローン１１ｈ９の一夜培養液１０ｍ１１を３７℃において振とう培養した。

合成遺伝子の発現を誘導するために、１時間後に５　ｍｌの１００ｍＭ　ＩＰＴ Ｇ（イソプロピル−β−〇−チオガラクトピラノシド；ベーリンガーマンハイム 製）を添加した。５時間後に、細胞を収集し、１００＋ａ１の溶菌緩衝液中に懸 濁し、前述と同様にして溶菌した。溶菌液はＩＭＭｇｆＪ２により、その最終濃 度が１０ｍＭとなるよう調製し、次いで１０ｍｇのデオキシリボヌクレアーゼＩ 　（Ｄ　Ｎａ５ｅ　Ｉ）を加えた。３７℃で１５分分間−た後、溶菌液を７０℃ で１５分間熟成した。沈殿した蛋白質を遠心分離し、その上澄液をトリクロロ酢 酸（６％）によりｐＨ４，５に調整した。

冷アセトンを最終濃度５０％となるように添加した。０℃で２時装置いた後に沈 殿物を遠心分離した。冷アセトンを上澄に最終濃度８０％となるように加えた。

次いで、それを０℃に２時間保った。沈殿物を再び遠心分離し、アセトンを３７ ℃で蒸発せしめ、その沈殿物をｐＨ７の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｊ！　２　 ｍｊ！中に溶解させた。

引続き、Ｅ、ｃｏｌｉ抽出物により凝固試験を行なった。凝固試験は、ヒルジン またはヒルジンの生物活性を有する蛋白質によるトロピンの特異的な抑制作用に 基づいている。既知濃度のフィブリノーゲン溶液に所定量のトロンビンを加えた 。これによりフィブリンへの変換が触媒作用によって行なわれ、ある時間内に記 録された。

ヒルジンまたはヒルジンの生物活性を有する蛋白質をフィブリノーゲン）８液に 増加する量において加えると、トロンビンが過剰でない限り凝固は阻止される。

転換点は、試料の凝固によって知ることができる。

試験は以下のように行なった。１００ｍ１のフィブリノーゲン溶液（０，８５％ ＮａＣ１中に６０ｍｇ／ｍｊす及び５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＩＩＣｊ！（ｐＨ７ ）中において分析されるべき１００μｐの試料（緩衝液またはヒルジン標準溶液 またはＥ、ｃｏｌｉ抽出物）を１００μｐの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣ１！（ ｐＨ７）に加えた。次いで５μｎのトロンビン（０，８５％ＮａＣ１中において ３０１Ｕ／ｍｆ、ベーリングーヴエルケ）を加えた。全量を次いで注意深く混合 した。室温で１分間熟成した後に試験管を１８０°回転させた。陽性の結果、す なわちトロンビンの阻止は試験管から溶液が流出することから分かる。

それに対して陰性の場合は、凝固が阻止されず、フィブリンのゲルが試験管の底 に残る。

Ｅ、ｃｏｌｉクローン１１ｈ９からの強化された抽出物は、フィブリノーゲンか らフィブリンへの変換を阻止したが、一方、ヒルジン遺伝子を含まないｌ：、ｃ ｏｌｉから同様に処理して得られた抽出物は、能書作用を示さなかった。ヒルジ ン標準溶液との比較により、Ｅ、ｃｏｌｉからのヒルジン様蛋白質の生物活性は 、ヒルジン湯度で１２０ｎｇ／ＩＩＩＩＶ、に相当することが示された。

Ｅ、ｃｏｌｉ抽出物のヒルジン活性を更に発色性基質に対するトロンビン活性の 阻害能として測定した。この反応において、トロンビンは発色性基質Ｔｏｓ　− Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ　（クロモチームＴＨ，ベーリンガーマンハイ ム）から黄色の化合物、ｐ−ニトロアニリンＣｐ　ＮＡ）を解離させる。この試 験では、８９０μｌのジェタノールアミン緩衝液（１５０μｍ／１、ｐ）１８． ４）を２０μｌのトロンビン溶液（０，２５Ｍリン酸緩衝液中に５ＴＵ／ｍｊ！ 。

ｐＨ６，７）と混合した゛、この溶液に対して、５０μｌのヒルジン含有溶液（ Ｘ　ｎｇのヒルジンを含む標準用ジェタノールアミン緩衝液またはＥ、ｃｏｌ＋ 抽出物）を加え、２５℃で５分間熟成した。

次いで、１２５μｌのクロモチーム溶液（ジェタノールアミン緩衝液中にす１． ５ｍＭ）を加え、その混合物の吸光度を光度計（品性部）により４０５ｎｙｌで ６０秒毎に６分間測定した。吸光度の増加はトロンビン活性の尺度となり、また 、それはヒルジン活性の逆数となる。

ＦＩＧ、　１ １　ａｓｎｓｅｒｍｅｔＶａｌＶａｌＴｙｒＴｈｒＡｓｐ（ｙｓＴｈｒＧＩｕＳ ｅｒＧｌｙＧｌｎＡｓｎＬｅｕ［：ｙｓＬｅｕＣｙｓＧｌｕ２１　ＧｌｙＳｅｒ ＡｓｎＶａｌＣｙｓＧｌｙＧｌｎＧｌｙＡｓｎＬｙｓＣｙｓｌｌｅＬｅｕＧｌｙ ＳｅｒＡｓｐＧｌｙＧｌｕＬｙｓＡｓｎ４１　Ｇｌｎ［ｙｓＶａｌＴｈｒ（ｉ［ ｙＧｌｕＧｌｙＴｈｒＰｒｏＬｙｓＰｒｏＧｌｎＳｅｒＨｉｓＡｓｎＡｓｐＧＩ ｙＡｓｐＰｈｅＧＩ■ ６１　ＧｌｕｌｌｅＰｒｏＧＩｕＧ［ｕＴｙｒＬｅｕＧＩｎｆ））”）ソンか− ＦＩＧ−２ ｍｅｔｔｈｒｍｅｔｉｌｅｔｈｒａｓｎｓｅｒｍｅｔＶａｌ　ＧｌｕＴｙｒＬｅ ｕＧｌｎ＋…丑国際調交報告 一情瞳り１＾ｅｍｃａ−惰・■ゴ／ＨＰ　８５１００６９ＢＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　 Ｔ？：Ｅ　ＩｈＪＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲτＯＮ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．式 【配列があります】 で表わされ、ヒルジンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質をコードするＤＮＡ 配列。
2. ２．医療用ヒル（Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）の染色体から誘導さ れ、ヒルジンをコードすることを特徴とするＤＮＡ配列。
3. ３．請求の範囲第１項または第２項に記載のＤＮＡ配列とハイブリッド形成し、 天然半合成または合成由来であり、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド削除、ヌク レオチド挿入またはヌクレオチド領域の逆位のような突然変異による請求の範囲 第１項または第２項に記載のＤＮＡ配列に関するものであって；かつ、ヒルジン の生物活性を有するヒルジン様蛋白質をコードすることを特徴とするＤＮＡ配列 。
4. ４．請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載のＤＮＡ配列からなるクロ ーニングのための組換えＤＮＡ分子。
5. ５．請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載のＤＮＡ配列が、発現制御 配列と有効に結合されていることを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
6. ６．発現制御配列がＥ．ｃｏｌｉプロモーター系、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃ系、Ｅ． ｃｏｌｉβ−ラクタマ−ゼ系、Ｅ．ｃｏｌｉｔｒｐ系、Ｅ．ｃｏｌｉリポ蛋白質 プロモーター、酵母の発現制御配列または他の真核生物の発現制御配列であるこ とを特徴とする請求の範囲第５項に記載の組換えＤＮＡ分子。
7. ７．請求の範囲第４項ないし第６項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子の少な くとも一つにより形質転換されることを特徴とする宿主生物。
8. ８．Ｅ．ｃｏｌｉ、他の殺菌、酵母、他の菌類、または動物もしくはヒトの細胞 であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の宿主生物。
9. ９．アミノ酸配列 【配列があります】 を有し、ヒルジンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質。
10. １０．請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載のＤＮＡ配列によりコー ドされることを特徴とするヒルジンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質。
11. １１．宿主生物を請求の範囲第５項または第６項に記載の組換えＤＮＡ分子によ り形質転換し、かつ形質転換体の発現及び培養によって得られるヒルジン様蛋白 質を単離することを特徴とするヒルジンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質の 製造方法。
12. １２．炎症の処置および／または浮腫の処置用の血液凝固を抑制するトロンビン 拮抗剤としての請求の範囲第９項または第１０項に記載のヒルジン様蛋白質の使 用。