JPH0770188A - ヒルジン様蛋白質及びその製造方法 - Google Patents
ヒルジン様蛋白質及びその製造方法Info
- Publication number
- JPH0770188A JPH0770188A JP6131498A JP13149894A JPH0770188A JP H0770188 A JPH0770188 A JP H0770188A JP 6131498 A JP6131498 A JP 6131498A JP 13149894 A JP13149894 A JP 13149894A JP H0770188 A JPH0770188 A JP H0770188A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hirudin
- protein
- coli
- dna
- biological activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規なヒルジン様蛋白質及びその製造方法の
提供。 【構成】 次の式： 【化１】 で表わされるＤＮＡ配列によりコードされるヒルジンの
生物活性を有するヒルジン様蛋白質、並びにその製造方
法。
提供。 【構成】 次の式： 【化１】 で表わされるＤＮＡ配列によりコードされるヒルジンの
生物活性を有するヒルジン様蛋白質、並びにその製造方
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒルジンの生物活性を
有するヒルジン様蛋白質に関する。更に本発明は、ヒル
ジンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質の製造方法に
関する。
有するヒルジン様蛋白質に関する。更に本発明は、ヒル
ジンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質の製造方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒル（医療用ヒル−Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅ
ｄｉｃｉｎａｌｉｓ）の適用は、最も古くから知られた
治療形態の一つである。それは、有史以前に、既に、血
液の抜取りが治療法として行なわれていたことからも知
ることができる。
ｄｉｃｉｎａｌｉｓ）の適用は、最も古くから知られた
治療形態の一つである。それは、有史以前に、既に、血
液の抜取りが治療法として行なわれていたことからも知
ることができる。
【０００３】ヒルによる治療は、数千年の間単なる血液
の抜取りよりも良い結果をもたらす治療法として提供さ
れていた。しかしながら、その作用形態に関しては、全
く知られていなかった。歴史上に現れるヒルを用いた最
初の治療は、約２２００年前にギリシア人医師であるコ
ロフォン（Ｃｏｌｏｐｈｏｎ）のニカンデル（Ｎｉｋａ
ｎｄｅｒ）により行なわれたが、かかる治療形態の実質
的な創始者は、イースキュラプ（Ａｅｓｃｕｌａｐ）の
弟子であるラオディカのテミソン（Ｔｈｅｍｉｓｏｎ）
と考えられている。中世において、ヒルは当時の看護人
であった理髪師のみならず、特に医師によっても、一般
に治療目的として使用されていた。
の抜取りよりも良い結果をもたらす治療法として提供さ
れていた。しかしながら、その作用形態に関しては、全
く知られていなかった。歴史上に現れるヒルを用いた最
初の治療は、約２２００年前にギリシア人医師であるコ
ロフォン（Ｃｏｌｏｐｈｏｎ）のニカンデル（Ｎｉｋａ
ｎｄｅｒ）により行なわれたが、かかる治療形態の実質
的な創始者は、イースキュラプ（Ａｅｓｃｕｌａｐ）の
弟子であるラオディカのテミソン（Ｔｈｅｍｉｓｏｎ）
と考えられている。中世において、ヒルは当時の看護人
であった理髪師のみならず、特に医師によっても、一般
に治療目的として使用されていた。
【０００４】ヒルは、数分間のうちに約１５立方センチ
の血液を吸い取ることができる。もしヒルが血液の凝固
を防ぐことができなければ、その摂取によって窒息して
しまうのであろう。ヒルは、傷口においてすでに凝固防
止剤を血液に混合する。トロンビン拮抗剤の分泌は、ヒ
ルにとっては絶対的生命力となる。ヒルは、トロンビン
拮抗剤をその頸部の腺で作る。この抗凝血性質は、付随
的に血行を改善し、血液及び体液の流速を数倍に高め、
また血管鎮痙効果を有する。更には、この分泌物は、殺
菌シュードモナスのみが生存する抗菌性質を有する。
の血液を吸い取ることができる。もしヒルが血液の凝固
を防ぐことができなければ、その摂取によって窒息して
しまうのであろう。ヒルは、傷口においてすでに凝固防
止剤を血液に混合する。トロンビン拮抗剤の分泌は、ヒ
ルにとっては絶対的生命力となる。ヒルは、トロンビン
拮抗剤をその頸部の腺で作る。この抗凝血性質は、付随
的に血行を改善し、血液及び体液の流速を数倍に高め、
また血管鎮痙効果を有する。更には、この分泌物は、殺
菌シュードモナスのみが生存する抗菌性質を有する。
【０００５】この細菌は、蓄積された血液を消化し、栄
養物に転換する。この殺菌が破壊されると、ヒルは、こ
の菌なしには生存できないため、死滅する。従って、な
ぜヒルが数千年にわたって人類の助けになったものであ
ったかが、理解できる。その分泌物は、抗トロンビン
性、抗炎症性、浮腫減少性であり、体液及び血液流の速
度を増大し、血管鎮痙性でかつ抗菌性である。従って、
その分泌物は非常に有効な物質である。ヒルによって生
ずる少量のかみ傷（ところで、そのかみ傷は、痛みはな
いが、たゞわずかにかゆみを生ずる）は、１０時間もの
間血液の凝固を防ぐ。
養物に転換する。この殺菌が破壊されると、ヒルは、こ
の菌なしには生存できないため、死滅する。従って、な
ぜヒルが数千年にわたって人類の助けになったものであ
ったかが、理解できる。その分泌物は、抗トロンビン
性、抗炎症性、浮腫減少性であり、体液及び血液流の速
度を増大し、血管鎮痙性でかつ抗菌性である。従って、
その分泌物は非常に有効な物質である。ヒルによって生
ずる少量のかみ傷（ところで、そのかみ傷は、痛みはな
いが、たゞわずかにかゆみを生ずる）は、１０時間もの
間血液の凝固を防ぐ。
【０００６】無菌的処置及び防腐処置が、ヒルによる直
接治療を終結させた後、世界中の研究者がその活性物質
を再び治療に用いるため、その単離方法を追求した。１
８８４年に、凝集拮抗性の抽出物が初めてヒルから得ら
れた。後に、ヒルの活性物質は、異質の蛋白質から部分
的に精製された。かくして得られた精製の物質はヒルジ
ンと命名された。
接治療を終結させた後、世界中の研究者がその活性物質
を再び治療に用いるため、その単離方法を追求した。１
８８４年に、凝集拮抗性の抽出物が初めてヒルから得ら
れた。後に、ヒルの活性物質は、異質の蛋白質から部分
的に精製された。かくして得られた精製の物質はヒルジ
ンと命名された。
【０００７】ヒルジンは、高分子ポリペプチドであっ
て、分子量７０００を有し、抗炎症性及び浮腫減少性を
有する。凝集系の各相におけるその抑制効果の分析は、
他の凝集要因と反応せず、また血液中に存在する他の成
分と相互作用を起こさないで効果を生ずる酵素トロンビ
ンの特異的抑制物質であることを示した。ヒルジンは、
このように血液凝固を、第１の凝集相の反応生成物すな
わちトロンビンを遮断することにより防ぎ、そして第２
の凝集相、すなわちフィブリン形成の誘因を防ぐ。
て、分子量７０００を有し、抗炎症性及び浮腫減少性を
有する。凝集系の各相におけるその抑制効果の分析は、
他の凝集要因と反応せず、また血液中に存在する他の成
分と相互作用を起こさないで効果を生ずる酵素トロンビ
ンの特異的抑制物質であることを示した。ヒルジンは、
このように血液凝固を、第１の凝集相の反応生成物すな
わちトロンビンを遮断することにより防ぎ、そして第２
の凝集相、すなわちフィブリン形成の誘因を防ぐ。
【０００８】それ故、ヒルジンは、特異的なトロンビン
拮抗剤である（Ｊｕｉ−Ｙｏａ Ｃｈａｎｇ，ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．Vol.１６４、３０７頁（１９８３））。こ
れまでヒルジンは、ヒルから単離されていた。約１mgの
ヒルジンが７０匹のヒルから得られるにすぎなかった。
かくして得られたヒルジンは、抗血栓および抗炎症静脈
治療に使用される軟膏に主として加工される（Ｐ．Ｗａ
ｌｓｍａｎｎ，Ｆ．Ｍａｒｋａｒｄｔ．Ｄｉｅ Ｐｈａ
ｒｍａｚｉｅ，Vol.３６、６５３頁（１９８１））。最
近、ヒルジンは、例えば血液透析中、凝血障害の処置ま
たは血液凝集の防止のためにも使用されている。しかし
ながら、それは限られた量しか入手できず、また純度も
十分でなかったため、従来ヒルジンは、臨床試験に用い
られることはなかった。
拮抗剤である（Ｊｕｉ−Ｙｏａ Ｃｈａｎｇ，ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．Vol.１６４、３０７頁（１９８３））。こ
れまでヒルジンは、ヒルから単離されていた。約１mgの
ヒルジンが７０匹のヒルから得られるにすぎなかった。
かくして得られたヒルジンは、抗血栓および抗炎症静脈
治療に使用される軟膏に主として加工される（Ｐ．Ｗａ
ｌｓｍａｎｎ，Ｆ．Ｍａｒｋａｒｄｔ．Ｄｉｅ Ｐｈａ
ｒｍａｚｉｅ，Vol.３６、６５３頁（１９８１））。最
近、ヒルジンは、例えば血液透析中、凝血障害の処置ま
たは血液凝集の防止のためにも使用されている。しかし
ながら、それは限られた量しか入手できず、また純度も
十分でなかったため、従来ヒルジンは、臨床試験に用い
られることはなかった。
【０００９】従って、本発明の根底にある課題は、ヒル
ジンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質、および遺伝
子工学によってこの蛋白質の大規模生産を可能とする方
法を提供することにある。更に本発明は、このヒルジン
様蛋白質からなる医薬組成物を提供することを目的とす
る。それ故、本発明は、特許請求の範囲に特徴づけられ
る課題に関するものである。“ヒルジン様蛋白質”の用
語は、そのアミノ酸配列が天然のヒルジンのアミノ酸配
列に近似しているか、またはその一部だけからなり、お
よび／または天然のヒルジンに対して、６３位のチロシ
ン残基において硫酸化され（ｓｕｌｆａｔｉｚｅｄ）て
ない蛋白質を指す。
ジンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質、および遺伝
子工学によってこの蛋白質の大規模生産を可能とする方
法を提供することにある。更に本発明は、このヒルジン
様蛋白質からなる医薬組成物を提供することを目的とす
る。それ故、本発明は、特許請求の範囲に特徴づけられ
る課題に関するものである。“ヒルジン様蛋白質”の用
語は、そのアミノ酸配列が天然のヒルジンのアミノ酸配
列に近似しているか、またはその一部だけからなり、お
よび／または天然のヒルジンに対して、６３位のチロシ
ン残基において硫酸化され（ｓｕｌｆａｔｉｚｅｄ）て
ない蛋白質を指す。
【００１０】本発明によると相当する融合蛋白質もまた
ヒルジン様蛋白質と称される。“ヒルジンの生物活性を
有する蛋白質”とは、天然のヒルジンと同一である必要
はないが、天然のヒルジンの生物活性を持つ蛋白質に関
するものである。従ってそれは、天然ヒルジンのような
トロンビンなどの蛋白質類に対して作用し、および／ま
たは該天然ヒルジンの免疫学的性質を有する。ヒルジン
の脱硫酸化は、ヒルジンの生物活性に、わずかな減少を
生ずるにすぎないということが知られている。（Ｊｕｉ
−Ｙｏａ Ｃｈａｎｇ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，Vol.１６
４、３０７頁（１９８３））。
ヒルジン様蛋白質と称される。“ヒルジンの生物活性を
有する蛋白質”とは、天然のヒルジンと同一である必要
はないが、天然のヒルジンの生物活性を持つ蛋白質に関
するものである。従ってそれは、天然ヒルジンのような
トロンビンなどの蛋白質類に対して作用し、および／ま
たは該天然ヒルジンの免疫学的性質を有する。ヒルジン
の脱硫酸化は、ヒルジンの生物活性に、わずかな減少を
生ずるにすぎないということが知られている。（Ｊｕｉ
−Ｙｏａ Ｃｈａｎｇ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，Vol.１６
４、３０７頁（１９８３））。
【００１１】ヒルジンの生物活性を有するヒルジン様蛋
白質を遺伝子工学的に製造するに当り、次の工程が実施
される。まず、表Ｉに示されたオリゴデオキシリボヌク
レオチド類を、ＤＮＡ合成装置を用いて合成する。この
合成は、Ｊ．Ｄｏｄｔ，Ｈ．Ｐ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｕ．
Ｓｅｅｍｕｅｌｌｅｒ及びＪｕｉ−Ｙｏａ Ｃｈａｎｇ
によるＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ誌Vol.６１５、１８０頁（１
９８４）に記載されたアミノ酸配列に基くものである。
白質を遺伝子工学的に製造するに当り、次の工程が実施
される。まず、表Ｉに示されたオリゴデオキシリボヌク
レオチド類を、ＤＮＡ合成装置を用いて合成する。この
合成は、Ｊ．Ｄｏｄｔ，Ｈ．Ｐ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｕ．
Ｓｅｅｍｕｅｌｌｅｒ及びＪｕｉ−Ｙｏａ Ｃｈａｎｇ
によるＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ誌Vol.６１５、１８０頁（１
９８４）に記載されたアミノ酸配列に基くものである。
【００１２】主として、Ｅ．ｃｏｌｉにより最も高頻度
で使われているコドン類が使用されている。この場合、
融合蛋白質から相当する蛋白質をＣＮＢｒ解裂により任
意に解裂するため、合成遺伝子の５′末端にＡＴＧコド
ンを置くように配慮されている。かくして得られたオリ
ゴデオキシリボヌクレオチド類は、精製され、更に後の
工程において行なわれる結紮（ｌｉｇａｔｉｏｎ）のた
めに、ポリヌクレオチドキナーゼ及びγ−32Ｐ−ｒＡＴ
Ｐによりリン酸化される。
で使われているコドン類が使用されている。この場合、
融合蛋白質から相当する蛋白質をＣＮＢｒ解裂により任
意に解裂するため、合成遺伝子の５′末端にＡＴＧコド
ンを置くように配慮されている。かくして得られたオリ
ゴデオキシリボヌクレオチド類は、精製され、更に後の
工程において行なわれる結紮（ｌｉｇａｔｉｏｎ）のた
めに、ポリヌクレオチドキナーゼ及びγ−32Ｐ−ｒＡＴ
Ｐによりリン酸化される。
【００１３】この反応における生成物は、予備的なポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製される。次いで
＋鎖及び−鎖（相補鎖）をアニールし、結合して遺伝子
断片を生成させ、それは次いで予備的なポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により精製し、互いに結合して完全な
合成遺伝子が得られる（図１）。かくして得られた遺伝
子は、遺伝子ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー
から天然の遺伝子を単離するために用いることができ
る。
アクリルアミドゲル電気泳動により精製される。次いで
＋鎖及び−鎖（相補鎖）をアニールし、結合して遺伝子
断片を生成させ、それは次いで予備的なポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により精製し、互いに結合して完全な
合成遺伝子が得られる（図１）。かくして得られた遺伝
子は、遺伝子ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー
から天然の遺伝子を単離するために用いることができ
る。
【００１４】この合成遺伝子は、ｌａｃ ＵＶ５プロモ
ータを含むベクターｐＥＭＢＬ８＋（ドイツ連邦共和
国、ゲッチンゲンのＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ３１３９と
して寄託されている）に組込まれた。もちろん、他の発
現制御配列、例えばＥ．ｃｏｌｉのｔａｃ系、Ｅ．ｃｏ
ｌｉのｔｒｐ系、Ｅ．ｃｏｌｉのリポ蛋白質プロモータ
ー、酵母の発現制御配列または他の真核生物の発現制御
配列も使用することができる。この点において重要なこ
とは、遺伝子と発現制御配列との間の有効な結合及び特
定の宿主生物に対して適切な発現制御配列の選択であ
る。
ータを含むベクターｐＥＭＢＬ８＋（ドイツ連邦共和
国、ゲッチンゲンのＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ３１３９と
して寄託されている）に組込まれた。もちろん、他の発
現制御配列、例えばＥ．ｃｏｌｉのｔａｃ系、Ｅ．ｃｏ
ｌｉのｔｒｐ系、Ｅ．ｃｏｌｉのリポ蛋白質プロモータ
ー、酵母の発現制御配列または他の真核生物の発現制御
配列も使用することができる。この点において重要なこ
とは、遺伝子と発現制御配列との間の有効な結合及び特
定の宿主生物に対して適切な発現制御配列の選択であ
る。
【００１５】組換え発現ベクターを構築した後に、それ
を形質転換可能な宿主生物、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＯＭ
２１４（Ｓｔａｍｍｓａｍｍｌｕｎｇ Ｐｒｏｆ．
Ｇ．Ｓｃｈｕｅｔｚ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｋｒｅｂｓ
−ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｎｍ Ｈｅｉｄｅｌ
ｂｅｒｇ ＤＳＭ Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ寄託番号ＤＳ
Ｍ３１３８）に挿入する。発現制御配列によっては、他
の細菌、酵母、および動物またはヒトの細胞も宿主生物
として使用することができる。ヒルジン様蛋白質を合成
する形質転換体類は、それらのアンピシリン抵抗性及び
抗ヒルジンＩｇＧ抗体との反応により同定される。
を形質転換可能な宿主生物、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＯＭ
２１４（Ｓｔａｍｍｓａｍｍｌｕｎｇ Ｐｒｏｆ．
Ｇ．Ｓｃｈｕｅｔｚ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｋｒｅｂｓ
−ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｎｍ Ｈｅｉｄｅｌ
ｂｅｒｇ ＤＳＭ Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ寄託番号ＤＳ
Ｍ３１３８）に挿入する。発現制御配列によっては、他
の細菌、酵母、および動物またはヒトの細胞も宿主生物
として使用することができる。ヒルジン様蛋白質を合成
する形質転換体類は、それらのアンピシリン抵抗性及び
抗ヒルジンＩｇＧ抗体との反応により同定される。
【００１６】最後に、本発明により製造されたヒルジン
様蛋白質を、血液凝固において重要な役割をはたす酵素
トロンビンに対する生物活性について試験する。これに
関連して、第１に殺菌から合成されたヒルジン様蛋白質
は、トロンビンによるフィブリノーゲンからフィブリン
への反応を抑制し、また第２にトロンビンによる色原物
質の転換もまたこの蛋白質によって抑制されるというこ
とが分かった。このことから、本発明の方法により製造
された蛋白質は、ヒルジンの生物活性を有することが分
かる。
様蛋白質を、血液凝固において重要な役割をはたす酵素
トロンビンに対する生物活性について試験する。これに
関連して、第１に殺菌から合成されたヒルジン様蛋白質
は、トロンビンによるフィブリノーゲンからフィブリン
への反応を抑制し、また第２にトロンビンによる色原物
質の転換もまたこの蛋白質によって抑制されるというこ
とが分かった。このことから、本発明の方法により製造
された蛋白質は、ヒルジンの生物活性を有することが分
かる。
【００１７】かくして血液の凝血障害の処置または血液
凝集の防止のための医薬組成物は、発明に係る蛋白質ま
たはそのシアン化臭素分解物を各々用いて製造すること
ができる。任意的に医薬的に許容される添加剤および希
釈剤を添加することもできる。
凝集の防止のための医薬組成物は、発明に係る蛋白質ま
たはそのシアン化臭素分解物を各々用いて製造すること
ができる。任意的に医薬的に許容される添加剤および希
釈剤を添加することもできる。
【００１８】
【実施例】以下の実施例は、本発明を説明するものであ
る。これらは説明の目的のみに示されたものであって本
発明の範囲を限定するものではない。実施例１．ヒルジンの生物活性を有する蛋白質をコード
するＤＮＡ配列の合成 表Ｉに示されたオリゴデオキシリボヌクレオチド類は、
ＤＮＡ合成装置（アプライド バイオシステムズ社（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のモデル３８０
Ａ）により合成した。
る。これらは説明の目的のみに示されたものであって本
発明の範囲を限定するものではない。実施例１．ヒルジンの生物活性を有する蛋白質をコード
するＤＮＡ配列の合成 表Ｉに示されたオリゴデオキシリボヌクレオチド類は、
ＤＮＡ合成装置（アプライド バイオシステムズ社（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のモデル３８０
Ａ）により合成した。
【００１９】表Ｉ：合成オリゴヌクレオチド類 ５′末端 ３′末端 R1 AATTCTATGGTTGTTTACACTGACTGCACCGAA R2 CCAGATTCGGTGCAGTCAGTGTAAACAACCATAG R3 TCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGTTCTAA R4 AAACGTTAGAACCTTCGCACAGGCACAGGTTCTGA R5 CGTTTGCGGTCAGGGAAACAAATGCATCCTGG R6 AGAACCCAGGATGCATTTGTTTCCCTGACCGC R7 GTTCTGACGGTGAAAAGAACCAGTGCGTTACCGGTG R8 ACCTTCACCGGTAACGCACTGGTTCTTTTCACCGTC R9 AAGGTACTCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGA R10 CGAAGTCACCGTCGTTGTGAGACTGCGGTTTCGGAGT R11 CTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGC R12 CTATTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTT R13 AATAGTAAGTGAGCGTCG R14 GATCCGACGCTCACTTA
【００２０】合成プログラムは、ＡＢＩ００３ ５／１
７／８４である。用いた化学品は同様にＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から入手した。ＬＣＡＡ／Ｃ
ＰＧ（長鎖アルキルアミン調製多孔性ガラス）がヌクレ
オシド−３−０−コハク酸エステル（約３０μmol ／
ｇ）により活性化された。各々の合成は、１μmol のヌ
クレオシドから開始した。また、各々の合成の停止は、
“トリチル オフ、オート（ｔｒｉｔｙｌ ｏｆｆ，ａ
ｕｔｏ）”分裂モードにより行なった。
７／８４である。用いた化学品は同様にＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から入手した。ＬＣＡＡ／Ｃ
ＰＧ（長鎖アルキルアミン調製多孔性ガラス）がヌクレ
オシド−３−０−コハク酸エステル（約３０μmol ／
ｇ）により活性化された。各々の合成は、１μmol のヌ
クレオシドから開始した。また、各々の合成の停止は、
“トリチル オフ、オート（ｔｒｉｔｙｌ ｏｆｆ，ａ
ｕｔｏ）”分裂モードにより行なった。
【００２１】それによれば酸に不安定な５′−Ｏ−
（４，４′−ジメトキシトリチル）基は、チオフェノー
ル及びアンモニアによる処理の前に離脱した。合成装置
の生成物のアンモニア性溶液は、テーパー付フラスコに
移し、元のガラス容器はそれぞれ約１０mlの２５％アン
モニア溶液ですすいだ。フラスコを注意深く密封し、次
いで５０℃で１４時間加温した。次いでその溶液をオイ
ル式真空ポンプにより濃縮、乾燥し、各生成物を、pH
７．４の２０mMトリエチルアンモニウム二カルボン酸塩
緩衝溶液（ＴＥＡＢ）５００μｌ中に溶解した。
（４，４′−ジメトキシトリチル）基は、チオフェノー
ル及びアンモニアによる処理の前に離脱した。合成装置
の生成物のアンモニア性溶液は、テーパー付フラスコに
移し、元のガラス容器はそれぞれ約１０mlの２５％アン
モニア溶液ですすいだ。フラスコを注意深く密封し、次
いで５０℃で１４時間加温した。次いでその溶液をオイ
ル式真空ポンプにより濃縮、乾燥し、各生成物を、pH
７．４の２０mMトリエチルアンモニウム二カルボン酸塩
緩衝溶液（ＴＥＡＢ）５００μｌ中に溶解した。
【００２２】１０分の１の各々の粗製オリゴマーを、次
いでイオン交換型のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ
ィー）により精製した。ラテック（Ｌａｔｅｋ）ＨＰＬ
Ｃ装置は、２台のＰ４００溶媒ポンプ、自動勾配制御装
置、１００μｌの試料受容ループを備えたレオダイン
（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）７１２５注入部、ミルトン ロイ
（Ｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｙ）モデル１２０４Ａ ＵＶ検出
器（検出波長２８０nm、感度１．０）及び島津Ｃ−Ｒ３
Ａ記録計からなる。
いでイオン交換型のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ
ィー）により精製した。ラテック（Ｌａｔｅｋ）ＨＰＬ
Ｃ装置は、２台のＰ４００溶媒ポンプ、自動勾配制御装
置、１００μｌの試料受容ループを備えたレオダイン
（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）７１２５注入部、ミルトン ロイ
（Ｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｙ）モデル１２０４Ａ ＵＶ検出
器（検出波長２８０nm、感度１．０）及び島津Ｃ−Ｒ３
Ａ記録計からなる。
【００２３】ラテック パーテイシル（Ｌａｔｅｋ Ｐ
ａｒｔｉｓｉｌ）１０ＳＡＸ ＨＰＬＣカラム（直径４
mm）は、５０℃の湯浴中に配置されており、その流速は
２ml／分であった。分離のために、溶媒Ｂが２０から６
０％までの、溶媒ＡおよびＢの線形勾配を、４５分間使
用した（溶媒Ａ＝４０％（Ｖ／Ｖ）。１mMリン酸トリエ
チルアンモニウム、pH６．３、６０％（Ｖ／Ｖ）、ホル
ムアミド；溶媒Ｂ＝４０％（Ｖ／Ｖ）５００mMリン酸ト
リエチルアンモニウムpH６．３、６０％（Ｖ／Ｖ）ホル
ムアミド）。
ａｒｔｉｓｉｌ）１０ＳＡＸ ＨＰＬＣカラム（直径４
mm）は、５０℃の湯浴中に配置されており、その流速は
２ml／分であった。分離のために、溶媒Ｂが２０から６
０％までの、溶媒ＡおよびＢの線形勾配を、４５分間使
用した（溶媒Ａ＝４０％（Ｖ／Ｖ）。１mMリン酸トリエ
チルアンモニウム、pH６．３、６０％（Ｖ／Ｖ）、ホル
ムアミド；溶媒Ｂ＝４０％（Ｖ／Ｖ）５００mMリン酸ト
リエチルアンモニウムpH６．３、６０％（Ｖ／Ｖ）ホル
ムアミド）。
【００２４】これらの溶液の調製には、分析品質のホル
ムアミドを、４０ｇ／ｌのＢｉｏＲａｄ ＡＧ５０１−
Ｘ８イオン交換樹脂（分析品質の混合床樹脂）と共に５
時間攪拌して用いた。流出を注意深く監視し、最後に流
出するＵＶ活性物質を含む分画（通常、主吸収）を手動
により集めた。脱塩のためにこの分画に、蒸留水を１：
１の割合で加えた。その分画を、次いで３mlのメタノー
ル、pH７．４の２００mM ＴＥＡＢ／３０％アセトニト
リル及びpH７．４の２００mM ＴＥＡＢ各々により、前
洗浄した３mlオクタデシル（Ｃ18）一方カラム（Ｊ．
Ｔ．Ｂａｋｅｒ７０２０−３）にかけた。
ムアミドを、４０ｇ／ｌのＢｉｏＲａｄ ＡＧ５０１−
Ｘ８イオン交換樹脂（分析品質の混合床樹脂）と共に５
時間攪拌して用いた。流出を注意深く監視し、最後に流
出するＵＶ活性物質を含む分画（通常、主吸収）を手動
により集めた。脱塩のためにこの分画に、蒸留水を１：
１の割合で加えた。その分画を、次いで３mlのメタノー
ル、pH７．４の２００mM ＴＥＡＢ／３０％アセトニト
リル及びpH７．４の２００mM ＴＥＡＢ各々により、前
洗浄した３mlオクタデシル（Ｃ18）一方カラム（Ｊ．
Ｔ．Ｂａｋｅｒ７０２０−３）にかけた。
【００２５】後にカラムは３mlの各々前記と同じ緩衝液
により２回すすいだ。次いで、該生成物を２×３mlの２
００mM ＴＥＡＢ、pH７．４／８０％メタノールにより
溶出させた（Ｈ．Ｂｌｏｃｋｅｒ，Ｒ．Ｆｒａｎｋ及び
助手らのＥＭＢＯ Ｃｏｕｒｓｅ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｕ
ｒｅｉｇ、１９８４年９月、マニュアル）。オイル式ポ
ンプ減圧により、濃縮、乾燥した後、精製されたオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを１mlの２０mM ＴＥＡＢ
（pH７．４）にとり、吸収を２６０nmで測定した。
により２回すすいだ。次いで、該生成物を２×３mlの２
００mM ＴＥＡＢ、pH７．４／８０％メタノールにより
溶出させた（Ｈ．Ｂｌｏｃｋｅｒ，Ｒ．Ｆｒａｎｋ及び
助手らのＥＭＢＯ Ｃｏｕｒｓｅ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｕ
ｒｅｉｇ、１９８４年９月、マニュアル）。オイル式ポ
ンプ減圧により、濃縮、乾燥した後、精製されたオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを１mlの２０mM ＴＥＡＢ
（pH７．４）にとり、吸収を２６０nmで測定した。
【００２６】５００ピコモルの各オリゴマーを定量的リ
ン酸化に使用した。モル吸光係数は、それぞれのヌクレ
オチドの吸光係数を退色効果を考慮せずに加算して計算
した。各オリゴヌクレオチド５００ピコモルを、１５μ
ｌの蒸留水と２μｌの１０×ＰＮＫ緩衝液（pH７．６の
５００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００mM ＭｇＣｌ2、
５０mM ＤＴＴ、１０mMスペルミジン）に懸濁し、次い
で７０℃で１０分間保持した。
ン酸化に使用した。モル吸光係数は、それぞれのヌクレ
オチドの吸光係数を退色効果を考慮せずに加算して計算
した。各オリゴヌクレオチド５００ピコモルを、１５μ
ｌの蒸留水と２μｌの１０×ＰＮＫ緩衝液（pH７．６の
５００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００mM ＭｇＣｌ2、
５０mM ＤＴＴ、１０mMスペルミジン）に懸濁し、次い
で７０℃で１０分間保持した。
【００２７】次いで混合物を冷却し、ｒＡＴＰが１μＭ
となるように調整し、次に１μCiのアデノシン５′−
（γ−32Ｐ）三リン酸塩、トリエチルアンモニウム塩
（６０００Ci／mMol、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｕｃｈｌｅ
ｒ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅ
ｉｇ）及び１μｌのポリヌクレオチドキナーゼ（４．５
単位、ベーリンガー マンハイム）を加えた。反応は、
３７℃で熟成した。１５分後に１μｌの１０mM ｒＡＴ
Ｐを加え、熟成を更に１５分間続け、１０μｌのウレア
−ミクス（Ｕｒｅａ−Ｍｉｘ；１０Ｍ尿素、２０mM Ｅ
ＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５
％キシレンシアノブルー）を添加して反応を停止した。
となるように調整し、次に１μCiのアデノシン５′−
（γ−32Ｐ）三リン酸塩、トリエチルアンモニウム塩
（６０００Ci／mMol、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｕｃｈｌｅ
ｒ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅ
ｉｇ）及び１μｌのポリヌクレオチドキナーゼ（４．５
単位、ベーリンガー マンハイム）を加えた。反応は、
３７℃で熟成した。１５分後に１μｌの１０mM ｒＡＴ
Ｐを加え、熟成を更に１５分間続け、１０μｌのウレア
−ミクス（Ｕｒｅａ−Ｍｉｘ；１０Ｍ尿素、２０mM Ｅ
ＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５
％キシレンシアノブルー）を添加して反応を停止した。
【００２８】ゲル装入前に、その混合物を９５℃に１分
間保った。変性ポリアクリルアミドゲル（長さ６０cm、
厚さ０．１cm；８％アクリルアミド、８．５Ｍ尿素、１
×ＴＢＥ（８９mMトリス塩基、８９mMホウ酸、２mM Ｅ
ＤＴＡ））を３０ワットで２時間前操作した。次いで、
変性されたリン酸化反応物を負荷した。電気泳動を３０
ワットでブロモフェノールブルーが４５cmに移行するま
で行なった。ガラス板の一方を取り外し、ゲルをサラン
ラップで覆い、Ｘ線フイルムに、１時間さらした。オリ
ゴヌクレオチドに相当するバンドの全長をゲルマトリッ
クスを含めて切り出した。そのマトリックスを３００μ
ｌのＴＥ緩衝後（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８）、
１mM ＥＤＴＡ）中にくだき、懸濁した。
間保った。変性ポリアクリルアミドゲル（長さ６０cm、
厚さ０．１cm；８％アクリルアミド、８．５Ｍ尿素、１
×ＴＢＥ（８９mMトリス塩基、８９mMホウ酸、２mM Ｅ
ＤＴＡ））を３０ワットで２時間前操作した。次いで、
変性されたリン酸化反応物を負荷した。電気泳動を３０
ワットでブロモフェノールブルーが４５cmに移行するま
で行なった。ガラス板の一方を取り外し、ゲルをサラン
ラップで覆い、Ｘ線フイルムに、１時間さらした。オリ
ゴヌクレオチドに相当するバンドの全長をゲルマトリッ
クスを含めて切り出した。そのマトリックスを３００μ
ｌのＴＥ緩衝後（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８）、
１mM ＥＤＴＡ）中にくだき、懸濁した。
【００２９】オリゴヌクレオチドを６５℃で３時間溶出
した。ゲルマトリックスは、１２，０００rpm で１０分
間遠心して落とし、上澄を０．３Ｍ酢酸ナトリウム（pH
１０）及び担体としてのグリコーゲンの存在下でエタノ
ール沈殿にかけた。ペレットを８０％エタノールで２回
洗浄し、次いで真空下で乾燥し、ＴＥ緩衝液中に最終濃
度がヌクレオチド２ピコモル／μｌとなるように入れ
た。
した。ゲルマトリックスは、１２，０００rpm で１０分
間遠心して落とし、上澄を０．３Ｍ酢酸ナトリウム（pH
１０）及び担体としてのグリコーゲンの存在下でエタノ
ール沈殿にかけた。ペレットを８０％エタノールで２回
洗浄し、次いで真空下で乾燥し、ＴＥ緩衝液中に最終濃
度がヌクレオチド２ピコモル／μｌとなるように入れ
た。
【００３０】最初の工程において、５０ピコモルの単鎖
オリゴヌクレオチドをそれに対応する他方の単鎖と全反
応液量１００μｌ（５０mM ＮａＣｌ、２×ＴＥ、pH
８）中でアニールさせた。その混合物を９０℃まで加温
し、湯浴中で同温度に２分間保ち、次いで湯浴を一夜室
温まで冷却させた。小断片をそれぞれ２０μｌのアニー
リング混合物（小断片Ｉ：Ｒ１＋Ｒ２とＲ３＋Ｒ４、小
断片II：Ｒ５＋Ｒ６とＲ７＋Ｒ８、小断片III ：Ｒ９＋
Ｒ１０とＲ１１＋Ｒ１２、小断片IV：Ｒ１３＋Ｒ１４を
二量体が形成されるように結合させた）を用いて全量を
１００μｌ（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、
１０mM ＭｇＣｌ2 、５μｇ ＢＳＡ、１mMスペルミジ
ン、１mM ＡＴＰ、１０単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼ
（ベーリンガー マンハイム））として結合させた。
オリゴヌクレオチドをそれに対応する他方の単鎖と全反
応液量１００μｌ（５０mM ＮａＣｌ、２×ＴＥ、pH
８）中でアニールさせた。その混合物を９０℃まで加温
し、湯浴中で同温度に２分間保ち、次いで湯浴を一夜室
温まで冷却させた。小断片をそれぞれ２０μｌのアニー
リング混合物（小断片Ｉ：Ｒ１＋Ｒ２とＲ３＋Ｒ４、小
断片II：Ｒ５＋Ｒ６とＲ７＋Ｒ８、小断片III ：Ｒ９＋
Ｒ１０とＲ１１＋Ｒ１２、小断片IV：Ｒ１３＋Ｒ１４を
二量体が形成されるように結合させた）を用いて全量を
１００μｌ（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、
１０mM ＭｇＣｌ2 、５μｇ ＢＳＡ、１mMスペルミジ
ン、１mM ＡＴＰ、１０単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼ
（ベーリンガー マンハイム））として結合させた。
【００３１】熟成を１７℃で４時間行ない、７０℃で１
０分間加熱することにより反応を停止した。混合物は、
０．３Ｍ酢酸ナトリウム（pH１０）及び担体としてのグ
リコーゲンの存在下でエタノール沈殿させ、８０％エタ
ノールで２回洗浄し、乾燥させた後に３０μｌのＴＥ−
緩衝液（pH８）中に採取した。２０μｌの各結合混合物
を５．５μｌの負荷用緩衝液（２０％フィコール（Ｆｉ
ｃｏｌｌ）４００（ファルマシア製、ウプサラ，スウェ
ーデン）、２％ ＳＤＳ、０．０５％ブロモフェノール
ブルー、０．０５％キシレンキサノールブルー）と混合
し、次いで７０℃で５分間加熱した。
０分間加熱することにより反応を停止した。混合物は、
０．３Ｍ酢酸ナトリウム（pH１０）及び担体としてのグ
リコーゲンの存在下でエタノール沈殿させ、８０％エタ
ノールで２回洗浄し、乾燥させた後に３０μｌのＴＥ−
緩衝液（pH８）中に採取した。２０μｌの各結合混合物
を５．５μｌの負荷用緩衝液（２０％フィコール（Ｆｉ
ｃｏｌｌ）４００（ファルマシア製、ウプサラ，スウェ
ーデン）、２％ ＳＤＳ、０．０５％ブロモフェノール
ブルー、０．０５％キシレンキサノールブルー）と混合
し、次いで７０℃で５分間加熱した。
【００３２】非変性ポリアクリルアミドゲル（長さ４０
cm、厚さ０．０１cm、１０％アクリルアミド、１×ＴＢ
Ｅ）を２００ボルトで２時間前操作し、次いで結合試料
を負荷した。電気泳動を３００ボルト、１／２×ＴＢＥ
中で７時間、ブロモフェノールブルーが２５cmに移行す
るまで行なった。そのゲルは、オートラジオグラフに１
２時間かけた。
cm、厚さ０．０１cm、１０％アクリルアミド、１×ＴＢ
Ｅ）を２００ボルトで２時間前操作し、次いで結合試料
を負荷した。電気泳動を３００ボルト、１／２×ＴＢＥ
中で７時間、ブロモフェノールブルーが２５cmに移行す
るまで行なった。そのゲルは、オートラジオグラフに１
２時間かけた。
【００３３】目的の長さに相当する断片を切り出し、第
１のゲルについて述べたと同様にして溶出した。乾燥し
たＤＮＡペレットは、２０μｌのＴＥ緩衝液に採取し
た。約１ピコモル（１０μｌの小断片調製物）の各小断
片を全反応液量５０μｌ中で前述したのと同様な条件で
結合した。酵素の不活性化及びＤＮＡの濃縮は、すでに
述べた方法によって行なった。そのＤＮＡペレットは８
μｌのＴＥ中に採取した。合成遺伝子の全配列もまた、
図１に示されている。
１のゲルについて述べたと同様にして溶出した。乾燥し
たＤＮＡペレットは、２０μｌのＴＥ緩衝液に採取し
た。約１ピコモル（１０μｌの小断片調製物）の各小断
片を全反応液量５０μｌ中で前述したのと同様な条件で
結合した。酵素の不活性化及びＤＮＡの濃縮は、すでに
述べた方法によって行なった。そのＤＮＡペレットは８
μｌのＴＥ中に採取した。合成遺伝子の全配列もまた、
図１に示されている。
【００３４】実施例２．クローニング用ベクターの構
築、合成ＤＮＡ配列の発現及びＥ．ｃｏｌｉ ＯＭ ２
１４の形質転換 合成遺伝子は、そのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩのクロー
ニング部位を経て多量体を形成することができるので、
その調製物をベクターとの結合に先立ってＥｃｏＲＩと
ＢａｍＨＩとにより消化した。５μｌの結合反応物を４
０単位のＥｃｏＲＩ及び３０単位のＢａｍＨＩにより全
体積４０μｌ（５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）、１００
mM ＮａＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ2 、１mM ＤＴＴ）中
で３７℃、１時間消化した。引き続きそのＤＮＡを０．
３Ｍ酢酸ナトリウム（pH１０）の存在下でエタノール沈
殿させ、８０％エタノールで２回洗浄し、乾燥させ、２
４μｌのＴＥ中に採取した。
築、合成ＤＮＡ配列の発現及びＥ．ｃｏｌｉ ＯＭ ２
１４の形質転換 合成遺伝子は、そのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩのクロー
ニング部位を経て多量体を形成することができるので、
その調製物をベクターとの結合に先立ってＥｃｏＲＩと
ＢａｍＨＩとにより消化した。５μｌの結合反応物を４
０単位のＥｃｏＲＩ及び３０単位のＢａｍＨＩにより全
体積４０μｌ（５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）、１００
mM ＮａＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ2 、１mM ＤＴＴ）中
で３７℃、１時間消化した。引き続きそのＤＮＡを０．
３Ｍ酢酸ナトリウム（pH１０）の存在下でエタノール沈
殿させ、８０％エタノールで２回洗浄し、乾燥させ、２
４μｌのＴＥ中に採取した。
【００３５】１０μｇのｐＥＭＢＬ８＋（Ｌ．Ｄｅｎｔ
ｅ，Ｇ．Ｃｅｓａｒｅｎｉ及びＲ．Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，１６４５−
１６５５（１９８３））のプラスミドＤＮＡを４０単位
のＥｃｏＲＩと３０単位のＢａｍＨＩにより消化し、
２．５単位の小牛の腸からのホスファターゼ（ベーリン
ガー マンハイム製）で脱リン酸化を全反応体積１００
μｌ、３７℃で１時間行なった。反応緩衝液は、５０mM
Ｔｒｉｓ（pH７．５）、１００mM ＮａＣｌ、１０mM
ＭｇＣｌ2 及び１mM ＤＴＴからなる。
ｅ，Ｇ．Ｃｅｓａｒｅｎｉ及びＲ．Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，１６４５−
１６５５（１９８３））のプラスミドＤＮＡを４０単位
のＥｃｏＲＩと３０単位のＢａｍＨＩにより消化し、
２．５単位の小牛の腸からのホスファターゼ（ベーリン
ガー マンハイム製）で脱リン酸化を全反応体積１００
μｌ、３７℃で１時間行なった。反応緩衝液は、５０mM
Ｔｒｉｓ（pH７．５）、１００mM ＮａＣｌ、１０mM
ＭｇＣｌ2 及び１mM ＤＴＴからなる。
【００３６】反応は、ＥＧＴＡを最終濃度２５mMとなる
ように加え、７０℃で１０分間加熱することにより停止
させた。次いで、８０％の緩衝されたフェノール（pH
７．５）を１５０μｌ用いて抽出を行なった。上層をセ
ファデックスＧ１００（ファルマシア、ウプサラ，スウ
ェーデン；全床体積２ml）が充填されたゲルロ過カラム
に付し、１０mM重炭酸アンモニウムで平衡化した。
ように加え、７０℃で１０分間加熱することにより停止
させた。次いで、８０％の緩衝されたフェノール（pH
７．５）を１５０μｌ用いて抽出を行なった。上層をセ
ファデックスＧ１００（ファルマシア、ウプサラ，スウ
ェーデン；全床体積２ml）が充填されたゲルロ過カラム
に付し、１０mM重炭酸アンモニウムで平衡化した。
【００３７】溶出液の各々の分画は約１００μｌであっ
た。これらの分画の一部を、臭化エチジウムを含むアガ
ロース板にスポットした。ＤＮＡは、ＵＶ照射によって
可視化できる。全ＤＮＡのうちの約７５％を含んでいる
最初の分画を集め、それを減圧下に乾燥させた。そのＤ
ＮＡを最終濃度が０．１μｇ ＤＮＡ／μｌ ＴＥ緩衝
液となるように再度懸濁した。
た。これらの分画の一部を、臭化エチジウムを含むアガ
ロース板にスポットした。ＤＮＡは、ＵＶ照射によって
可視化できる。全ＤＮＡのうちの約７５％を含んでいる
最初の分画を集め、それを減圧下に乾燥させた。そのＤ
ＮＡを最終濃度が０．１μｇ ＤＮＡ／μｌ ＴＥ緩衝
液となるように再度懸濁した。
【００３８】０．０５ピコモルの挿入用ＤＮＡ制限断片
を０．１ピコモルの合成されたベクターＤＮＡと全量２
０μｌ（５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）、１０mM Ｍｇ
Ｃｌ 2 、１μｇ ＢＳＡ、１mMスペルミジン、１mM Ａ
ＴＰ、５単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー
マンハイム製））中で混合した。１４℃で３時間熟成さ
せた。２μｇの小牛胸腺のｔＲＮＡ（ベーリンガー マ
ンハイム製）及び８０μｌのＴＥ緩衝液を加えた後、８
０％フェノール（pH７．５）−クロロホルム−イソアミ
ルアルコール（体積比２４：２４：１）を含む溶媒１０
０μｌを用いて抽出を行なった。
を０．１ピコモルの合成されたベクターＤＮＡと全量２
０μｌ（５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）、１０mM Ｍｇ
Ｃｌ 2 、１μｇ ＢＳＡ、１mMスペルミジン、１mM Ａ
ＴＰ、５単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー
マンハイム製））中で混合した。１４℃で３時間熟成さ
せた。２μｇの小牛胸腺のｔＲＮＡ（ベーリンガー マ
ンハイム製）及び８０μｌのＴＥ緩衝液を加えた後、８
０％フェノール（pH７．５）−クロロホルム−イソアミ
ルアルコール（体積比２４：２４：１）を含む溶媒１０
０μｌを用いて抽出を行なった。
【００３９】１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（pH１０）
及び１μｌのグリコーゲン（レンナー（Ｒｅｎｎｅｒ）
ＧｍｂＨ製、ダルムシュタット，西ドイツ）を加え、次
いでその溶液をエタノール沈殿させ、８０％エタノール
で２回洗浄し、減圧下に乾燥させ、１０μｌのＴＥ緩衝
液に再溶解させた。かくして得られたプラスミドｐＲｕ
ｄｉ１の構造を図２に示した。発現生成物のアミノ酸配
列は図３に示されている。発現される生成物は融合蛋白
質であって、β−ガラクトシダーゼのアルファペプチド
のアミノ酸（１−８番目）及び天然のヒルジンに対応す
るアミノ酸（９番目以降）を有している。
及び１μｌのグリコーゲン（レンナー（Ｒｅｎｎｅｒ）
ＧｍｂＨ製、ダルムシュタット，西ドイツ）を加え、次
いでその溶液をエタノール沈殿させ、８０％エタノール
で２回洗浄し、減圧下に乾燥させ、１０μｌのＴＥ緩衝
液に再溶解させた。かくして得られたプラスミドｐＲｕ
ｄｉ１の構造を図２に示した。発現生成物のアミノ酸配
列は図３に示されている。発現される生成物は融合蛋白
質であって、β−ガラクトシダーゼのアルファペプチド
のアミノ酸（１−８番目）及び天然のヒルジンに対応す
るアミノ酸（９番目以降）を有している。
【００４０】目的に適したＥ．ｃｏｌｉ ＯＭ ２１
４、細胞の調製は、標準法に従って行なった。４０mlの
栄養培養液（セルバ（Ｓｅｒｖｅ）、カタログ番号４８
４９８）にＥ．ｃｏｌｉ ＯＭ ２１４株の単一コロニ
ーを接種した。培養は、２００rpm で振とうを行ないな
がら３２℃で約１５時間行なった。この培養液４mlを２
００mlの新鮮な栄養培地に加えた。熟成を前述と同様に
して細胞密度が１mlあたり２×１０8 細胞となるまで行
なった。
４、細胞の調製は、標準法に従って行なった。４０mlの
栄養培養液（セルバ（Ｓｅｒｖｅ）、カタログ番号４８
４９８）にＥ．ｃｏｌｉ ＯＭ ２１４株の単一コロニ
ーを接種した。培養は、２００rpm で振とうを行ないな
がら３２℃で約１５時間行なった。この培養液４mlを２
００mlの新鮮な栄養培地に加えた。熟成を前述と同様に
して細胞密度が１mlあたり２×１０8 細胞となるまで行
なった。
【００４１】その培養液を氷上で急速に冷却し、次いで
８０００rpm で５分間遠心分離を行なった。沈殿した細
胞を１００mlの３０mM塩化カルシウム溶液中に再び懸濁
し、０℃に２０分間保った。次いでそれを再び遠心分離
し、１０mlの塩化カルシウム溶液に懸濁させた。その細
胞を０℃で２４時間保持した。次いで１mlの滅菌したグ
リセロールを加え、液体窒素中で急速に凍結させた後、
−７０℃で保存した。かくして得られた凍結された十分
なＥ．ｃｏｌｉ細胞を氷上で融解させた。１００μｌの
細胞に、５μｌの精製された結合ＤＮＡを添加した。該
混合物を０℃に２０分間保った。該細胞を正確に４分間
３７℃に律動的に加温して、プラスミドＤＮＡの取込み
を可能にした。
８０００rpm で５分間遠心分離を行なった。沈殿した細
胞を１００mlの３０mM塩化カルシウム溶液中に再び懸濁
し、０℃に２０分間保った。次いでそれを再び遠心分離
し、１０mlの塩化カルシウム溶液に懸濁させた。その細
胞を０℃で２４時間保持した。次いで１mlの滅菌したグ
リセロールを加え、液体窒素中で急速に凍結させた後、
−７０℃で保存した。かくして得られた凍結された十分
なＥ．ｃｏｌｉ細胞を氷上で融解させた。１００μｌの
細胞に、５μｌの精製された結合ＤＮＡを添加した。該
混合物を０℃に２０分間保った。該細胞を正確に４分間
３７℃に律動的に加温して、プラスミドＤＮＡの取込み
を可能にした。
【００４２】該細胞懸濁液を氷上で冷却し、次いで培養
液中に、１０倍に希釈し、３７℃で約４０分間熟成し
た。懸濁液の一部（１％、１０％及び９０％）を１．５
％の寒天、栄養培地及び１ml中１００μｇのアンピシリ
ンを含む寒天平板上に延ばし、これを抗菌剤に対する抵
抗性によって形質転換体を選択するために用いた。該寒
天平板を３７℃で１４時間熟成した。育成したコロニー
を採取し、ヒルジン配列を含む融合蛋白質の発現を酵素
結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）により検査した。
液中に、１０倍に希釈し、３７℃で約４０分間熟成し
た。懸濁液の一部（１％、１０％及び９０％）を１．５
％の寒天、栄養培地及び１ml中１００μｇのアンピシリ
ンを含む寒天平板上に延ばし、これを抗菌剤に対する抵
抗性によって形質転換体を選択するために用いた。該寒
天平板を３７℃で１４時間熟成した。育成したコロニー
を採取し、ヒルジン配列を含む融合蛋白質の発現を酵素
結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）により検査した。
【００４３】実施例３．合成ＤＮＡ配列の発現及び発現
生成物の検出 ６０μｇ／mlのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地２．５
mlで各Ｅ．ｃｏｌｉコロニーを培養し、各培養液を、３
７℃で６時間振とうした。細胞を遠心分離により収集
し、１mlの１０mM ＮａＣｌ溶液で洗浄し、２５０μｌ
の溶菌用緩衝液（５０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８）、
３０mMのＮａＣｌ、１mg／mlのリゾチーム）中に懸濁し
た。０℃に３０分間保った後、細胞を３度にわたって−
７０℃で凍結し、３７℃で融解させた。冷却した溶菌液
を１５，０００rpm で遠心分離した。上澄は、ヒルジン
様蛋白質の検出のために保存した。
生成物の検出 ６０μｇ／mlのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地２．５
mlで各Ｅ．ｃｏｌｉコロニーを培養し、各培養液を、３
７℃で６時間振とうした。細胞を遠心分離により収集
し、１mlの１０mM ＮａＣｌ溶液で洗浄し、２５０μｌ
の溶菌用緩衝液（５０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８）、
３０mMのＮａＣｌ、１mg／mlのリゾチーム）中に懸濁し
た。０℃に３０分間保った後、細胞を３度にわたって−
７０℃で凍結し、３７℃で融解させた。冷却した溶菌液
を１５，０００rpm で遠心分離した。上澄は、ヒルジン
様蛋白質の検出のために保存した。
【００４４】Ｅ．ｃｏｌｉの溶菌液中のヒルジンの検出
をＥＬＩＳＡ試験により行なった。５０μｌの抗ヒルジ
ンＩｇＧ溶液（プラントルガン（Ｐｌａｎｔｏｒｇａ
ｎ）、バドチュイッシェナン（Ｂａｄ Ｚｗｉｓｃｈｅ
ｎａｈｎ））及び１０μｌ／mlのＩｇＧを含有する結合
形成用緩衝液（１ｌのＨ2 Ｏに１．５９ｇのＮａ2 ＣＯ
3 、２．９３ｇのＮａＨＣＯ3 及び０．２ｇのＮａＮ3
を加える）をマイクロタイタープレートのくぼみに満た
し、４℃で一夜熟成した。
をＥＬＩＳＡ試験により行なった。５０μｌの抗ヒルジ
ンＩｇＧ溶液（プラントルガン（Ｐｌａｎｔｏｒｇａ
ｎ）、バドチュイッシェナン（Ｂａｄ Ｚｗｉｓｃｈｅ
ｎａｈｎ））及び１０μｌ／mlのＩｇＧを含有する結合
形成用緩衝液（１ｌのＨ2 Ｏに１．５９ｇのＮａ2 ＣＯ
3 、２．９３ｇのＮａＨＣＯ3 及び０．２ｇのＮａＮ3
を加える）をマイクロタイタープレートのくぼみに満た
し、４℃で一夜熟成した。
【００４５】次いでプレートのくぼみを、ＰＢＳ緩衝液
（１ｌのＨ2 Ｏに８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＨ
2 ＰＯ4 、２．９ｇのＮａ2 ＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．
２ｇのＫＣｌ、０．５mlのＴｗｅｅｎ ２０、０．２ｇ
のＮａＮ3 を加える）によって３回すすいだ。この緩衝
液は、すべてのすすぎ処理に用いた。試験用溶菌液は５
０μｌを使用した。室温で２時間置いた後、プレートの
くぼみを３回洗浄し、そしてアルカリホスファターゼと
接合された抗ヒルジンＩｇＧ ５０μｌを加えた。
（１ｌのＨ2 Ｏに８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＨ
2 ＰＯ4 、２．９ｇのＮａ2 ＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．
２ｇのＫＣｌ、０．５mlのＴｗｅｅｎ ２０、０．２ｇ
のＮａＮ3 を加える）によって３回すすいだ。この緩衝
液は、すべてのすすぎ処理に用いた。試験用溶菌液は５
０μｌを使用した。室温で２時間置いた後、プレートの
くぼみを３回洗浄し、そしてアルカリホスファターゼと
接合された抗ヒルジンＩｇＧ ５０μｌを加えた。
【００４６】接合体は、アルカリホスファターゼタイプ
VII Ｔ（シグマ製）を用いて調製したもので、その調製
は、カタログ“研究用生化学及び有機化合物（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏ
ｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）”７１３頁（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）の説明書に従って
行なった。
VII Ｔ（シグマ製）を用いて調製したもので、その調製
は、カタログ“研究用生化学及び有機化合物（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏ
ｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）”７１３頁（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）の説明書に従って
行なった。
【００４７】室温で２時間の熟成の後、くぼみを再び３
度洗浄した。引き続いて、アルカリホスファターゼの基
質（シグマ１０４：ｐ−ニトロフェニルホスフェート、
１mg／mlの１０％ジエタノールアミン、０．１mg／mlの
ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏを含む、pH９．８）を５０μｌ加
えた。酵素反応は視覚的に判定した。陽性の結果、すな
わちヒルジン様蛋白質の存在は、抗ヒルジンＩｇＧに結
合したアルカリホスファターゼの活性による溶液の黄変
として認められた。Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物中のヒルジン様
蛋白質の定量的評価は、試料と並行して使用した既知濃
度をヒルジン標準溶液の希釈系との比較により行なっ
た。
度洗浄した。引き続いて、アルカリホスファターゼの基
質（シグマ１０４：ｐ−ニトロフェニルホスフェート、
１mg／mlの１０％ジエタノールアミン、０．１mg／mlの
ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏを含む、pH９．８）を５０μｌ加
えた。酵素反応は視覚的に判定した。陽性の結果、すな
わちヒルジン様蛋白質の存在は、抗ヒルジンＩｇＧに結
合したアルカリホスファターゼの活性による溶液の黄変
として認められた。Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物中のヒルジン様
蛋白質の定量的評価は、試料と並行して使用した既知濃
度をヒルジン標準溶液の希釈系との比較により行なっ
た。
【００４８】３５個のＥ．ｃｏｌｉクローンを同時に検
定した。そのうちの４個（No. ９，１３，１９，３５）
が陽性の結果を示した。ヒルジン標準溶液との発色反応
の比較から、該クローン類は、１０ないし２０μｇ／ｌ
のヒルジン様蛋白質を生成したことが示された。
定した。そのうちの４個（No. ９，１３，１９，３５）
が陽性の結果を示した。ヒルジン標準溶液との発色反応
の比較から、該クローン類は、１０ないし２０μｇ／ｌ
のヒルジン様蛋白質を生成したことが示された。
【００４９】実施例４．ヒルジン様蛋白質の生物活性の
検出 ６０μｇ／mlアンピシリンを含有する１ｌの２×ＹＴ培
地で、Ｅ．ｃｏｌｉクローンNo. ９の一夜培養液１０ml
を３７℃において振とう培養した。合成遺伝子の発現を
誘導するために、１時間後に５mlの１００mM ＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−Ｏ−チオガラクトピラノシド；ベ
ーリンガー マンハイム製）を添加した。５時間後に、
細胞を収集し、１００mlの溶菌緩衝液中に懸濁し、前述
と同様にして溶菌した。溶菌液は１Ｍ ＭｇＣｌ2 によ
り、その最終濃度が１０mMとなるように調製し、次いで
１０mgのデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ
Ｉ）を加えた。
検出 ６０μｇ／mlアンピシリンを含有する１ｌの２×ＹＴ培
地で、Ｅ．ｃｏｌｉクローンNo. ９の一夜培養液１０ml
を３７℃において振とう培養した。合成遺伝子の発現を
誘導するために、１時間後に５mlの１００mM ＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−Ｏ−チオガラクトピラノシド；ベ
ーリンガー マンハイム製）を添加した。５時間後に、
細胞を収集し、１００mlの溶菌緩衝液中に懸濁し、前述
と同様にして溶菌した。溶菌液は１Ｍ ＭｇＣｌ2 によ
り、その最終濃度が１０mMとなるように調製し、次いで
１０mgのデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ
Ｉ）を加えた。
【００５０】３７℃で１５分間置いた後、溶菌液を７０
℃で１５分間熟成した。沈殿した蛋白質を遠心分離し、
その上澄液をトリクロロ酢酸（６％）によりpH４．５に
調整した。冷アセトンを最終濃度５０％となるように添
加した。０℃で２時間置いた後に沈殿物を遠心分離し
た。冷アセトンを上澄に最終濃度８０％となるように加
えた。次いで、それを０℃に２時間保った。沈殿物を再
び遠心分離し、アセトンを３７℃で蒸発せしめ、その沈
殿物をpH７の５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２ml中に溶解
させた。
℃で１５分間熟成した。沈殿した蛋白質を遠心分離し、
その上澄液をトリクロロ酢酸（６％）によりpH４．５に
調整した。冷アセトンを最終濃度５０％となるように添
加した。０℃で２時間置いた後に沈殿物を遠心分離し
た。冷アセトンを上澄に最終濃度８０％となるように加
えた。次いで、それを０℃に２時間保った。沈殿物を再
び遠心分離し、アセトンを３７℃で蒸発せしめ、その沈
殿物をpH７の５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２ml中に溶解
させた。
【００５１】引続き、Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物により凝固試
験を行なった。凝固試験は、ヒルジンまたはヒルジンの
生物活性を有する蛋白質によるトロビンの特異的な抑制
作用に基づいている。既知濃度のフィブリノーゲン溶液
に所定量のトロンビンを加えた。これによりフィブリン
への変換が触媒作用によって行なわれ、ある時間内に記
録された。ヒルジンまたはヒルジンの生物活性を有する
蛋白質をフィブリノーゲン溶液に増加する量において加
えると、トロンビンが過剰でない限り凝固は阻止され
る。転換点は、試料の凝固によって知ることができる。
験を行なった。凝固試験は、ヒルジンまたはヒルジンの
生物活性を有する蛋白質によるトロビンの特異的な抑制
作用に基づいている。既知濃度のフィブリノーゲン溶液
に所定量のトロンビンを加えた。これによりフィブリン
への変換が触媒作用によって行なわれ、ある時間内に記
録された。ヒルジンまたはヒルジンの生物活性を有する
蛋白質をフィブリノーゲン溶液に増加する量において加
えると、トロンビンが過剰でない限り凝固は阻止され
る。転換点は、試料の凝固によって知ることができる。
【００５２】試験は以下のように行なった。１００mlの
フィブリノーゲン溶液（０．８５％ＮａＣｌ中に６０mg
／ml）及び５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７）中におい
て分析されるべき１００μｌの試料（緩衝液またはヒル
ジン標準溶液またはＥ．ｃｏｌｉ抽出物）を１００μｌ
の５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７）に加えた。次いで
５μｌのトロンビン（０．８５％ ＮａＣｌ中において
３０IU／ml、ベーリング−ヴェルケ）を加えた。全量を
次いで注意深く混合した。室温で１分間熟成した後に試
験管を１８０°回転させた。陽性の結果、すなわちトロ
ンビンの阻止は試験管から溶液が流出することから分か
る。それに対して陰性の場合は、凝固が阻止されず、フ
ィブリンのゲルが試験管の底に残る。
フィブリノーゲン溶液（０．８５％ＮａＣｌ中に６０mg
／ml）及び５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７）中におい
て分析されるべき１００μｌの試料（緩衝液またはヒル
ジン標準溶液またはＥ．ｃｏｌｉ抽出物）を１００μｌ
の５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７）に加えた。次いで
５μｌのトロンビン（０．８５％ ＮａＣｌ中において
３０IU／ml、ベーリング−ヴェルケ）を加えた。全量を
次いで注意深く混合した。室温で１分間熟成した後に試
験管を１８０°回転させた。陽性の結果、すなわちトロ
ンビンの阻止は試験管から溶液が流出することから分か
る。それに対して陰性の場合は、凝固が阻止されず、フ
ィブリンのゲルが試験管の底に残る。
【００５３】Ｅ．ｃｏｌｉクローンNo. ９からの強化さ
れた抽出物は、フィブリノーゲンからフィブリンへの変
換を阻止したが、一方、ヒルジン遺伝子を含まないＥ．
ｃｏｌｉから同様に処理して得られた抽出物は、阻害作
用を示さなかった。ヒルジン標準溶液との比較により、
Ｅ．ｃｏｌｉからのヒルジン様蛋白質の生物活性は、ヒ
ルジン濃度で１２０ng／mlに相当することが示された。
れた抽出物は、フィブリノーゲンからフィブリンへの変
換を阻止したが、一方、ヒルジン遺伝子を含まないＥ．
ｃｏｌｉから同様に処理して得られた抽出物は、阻害作
用を示さなかった。ヒルジン標準溶液との比較により、
Ｅ．ｃｏｌｉからのヒルジン様蛋白質の生物活性は、ヒ
ルジン濃度で１２０ng／mlに相当することが示された。
【００５４】Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物のヒルジン活性を更に
発色性基質に対するトロンビン活性の阻害能として測定
した。この反応において、トロンビンは発色性基質Tos-
Gly-Pro-Arg-pNA （クロモチーム ＴＨ、ベーリンガー
マンハイム）から黄色の化合物、ｐ−ニトロアニリン
（ｐＮＡ）を解離させる。この試験では、８９０μｌの
ジエタノールアミン緩衝液（１５０μｌ／ｌ、pH８．
４）を２０μｌのトロンビン溶液（０．２５Ｍリン酸緩
衝液中に５IU／ml、pH６．７）と混合した。この溶液に
対して、５０μｌのヒルジン含有溶液（×ngのヒルジン
を含む標準用ジエタノールアミン緩衝液またはＥ．ｃｏ
ｌｉ抽出物）を加え、２５℃で５分間熟成した。
発色性基質に対するトロンビン活性の阻害能として測定
した。この反応において、トロンビンは発色性基質Tos-
Gly-Pro-Arg-pNA （クロモチーム ＴＨ、ベーリンガー
マンハイム）から黄色の化合物、ｐ−ニトロアニリン
（ｐＮＡ）を解離させる。この試験では、８９０μｌの
ジエタノールアミン緩衝液（１５０μｌ／ｌ、pH８．
４）を２０μｌのトロンビン溶液（０．２５Ｍリン酸緩
衝液中に５IU／ml、pH６．７）と混合した。この溶液に
対して、５０μｌのヒルジン含有溶液（×ngのヒルジン
を含む標準用ジエタノールアミン緩衝液またはＥ．ｃｏ
ｌｉ抽出物）を加え、２５℃で５分間熟成した。
【００５５】次いで、１２５μｌのクロモチーム溶液
（ジエタノールアミン緩衝液中に１．５mM）を加え、そ
の混合物の吸光度を光度計（島津製）により４０５nmで
６０秒毎に６分間測定した。吸光度の増加はトロンビン
活性の尺度となり、また、それはヒルジン活性の逆数と
なる。
（ジエタノールアミン緩衝液中に１．５mM）を加え、そ
の混合物の吸光度を光度計（島津製）により４０５nmで
６０秒毎に６分間測定した。吸光度の増加はトロンビン
活性の尺度となり、また、それはヒルジン活性の逆数と
なる。
【図１】図１は、合成遺伝子の完全なＤＮＡ配列を示
す。黒色矢印は合成単鎖オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドの境界を示し、小断片Ｉ，II，III 及びリンカーが仕
切られている。更に対応するアミノ酸配列がＤＮＡ配列
の上に示してある。
す。黒色矢印は合成単鎖オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドの境界を示し、小断片Ｉ，II，III 及びリンカーが仕
切られている。更に対応するアミノ酸配列がＤＮＡ配列
の上に示してある。
【図２】図２は、組換えプラスミドｐＲｕｄｉ１及びそ
れに挿入された合成ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を示
す。合成断片はプラスミドｐＥＭＢＬ８＋のβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子のα断片中に位置するポリリンカーに
挿入されている。α断片の最初のアミノ酸は、ヒルジン
のアミノ酸と共に、示された融合蛋白質を形成する。
れに挿入された合成ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を示
す。合成断片はプラスミドｐＥＭＢＬ８＋のβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子のα断片中に位置するポリリンカーに
挿入されている。α断片の最初のアミノ酸は、ヒルジン
のアミノ酸と共に、示された融合蛋白質を形成する。
【図３】図３は、クローンｐＲｕｄｉ１によりコードさ
れた融合蛋白質の完全なアミノ酸配列を示す。天然のヒ
ルジンに対応するアミノ酸は、第１文字を大文字として
示した。
れた融合蛋白質の完全なアミノ酸配列を示す。天然のヒ
ルジンに対応するアミノ酸は、第１文字を大文字として
示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 フォルトカンプ エルク ドイツ連邦共和国，デー6900 ハイデルベ ルク オベレル ラインヴェーク 29 (72)発明者 リーゲル ミハエル ドイツ連邦共和国，デー6901 シェナウ アルテンドルフ パノラムストラーセ 98 (72)発明者 ソメル ラインホルト ドイツ連邦共和国，デー6900 ハイデルベ ルク フルトヴェンクレルストラーセ 39 (72)発明者 フィンク エルンスト ドイツ連邦共和国，デー2910 ヴェステル ステッド ジーセルホルスト ステルホル ネル ストラーセ １
Claims (4)
- 【請求項１】 次の式： 【化１】 で表わされるＤＮＡ配列によりコードされているヒルジ
ンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質。 - 【請求項２】 次のアミノ酸配列： 【化２】 を有する、請求項１に記載のヒルジン様蛋白質。
- 【請求項３】 次の式： 【化３】 で表わされるＤＮＡ配列を有しヒルジンの生物活性を有
するヒルジン様蛋白質をコードするＤＮＡ配列が発現制
御配列と作用可能に結合されている組換えＤＮＡ分子に
より形質転換された大腸菌を培養し、そして培養によっ
て得られるヒルジン様蛋白質を単離することを特徴とす
るヒルジンの生物活性を有するヒルジン様蛋白質の製造
方法。 - 【請求項４】 前記発現制御配列が、Ｅ．ｃｏｌｉプロ
モーター系、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ系、Ｅ．ｃｏｌｉβ
−ラクタマーゼ系、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐ系、Ｅ．ｃｏ
ｌｉリポ蛋白質プロモーター、酵母の発現制御配列また
は他の真核生物の発現制御配列である請求項３に記載の
製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3445517A DE3445517C2 (de) | 1984-12-13 | 1984-12-13 | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| DE3445517:5 | 1984-12-13 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61500141A Division JP2531652B2 (ja) | 1984-12-13 | 1985-12-12 | ヒルジン様蛋白質をコ―ドするｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0770188A true JPH0770188A (ja) | 1995-03-14 |
| JPH0811760B2 JPH0811760B2 (ja) | 1996-02-07 |
Family
ID=6252703
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61500141A Expired - Lifetime JP2531652B2 (ja) | 1984-12-13 | 1985-12-12 | ヒルジン様蛋白質をコ―ドするｄｎａ |
| JP6131498A Expired - Fee Related JPH0811760B2 (ja) | 1984-12-13 | 1994-06-14 | ヒルジン様蛋白質及びその製造方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61500141A Expired - Lifetime JP2531652B2 (ja) | 1984-12-13 | 1985-12-12 | ヒルジン様蛋白質をコ―ドするｄｎａ |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0236330B1 (ja) |
| JP (2) | JP2531652B2 (ja) |
| AT (1) | ATE90944T1 (ja) |
| AU (1) | AU597238B2 (ja) |
| DE (2) | DE3445517C2 (ja) |
| HU (1) | HU204564B (ja) |
| WO (1) | WO1986003517A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA859437B (ja) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| US5821079A (en) * | 1985-05-02 | 1998-10-13 | Transgene S.A. | Vectors for the expression and secretion of hirudin by transformed yeasts |
| MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
| FR2607516B2 (fr) * | 1986-12-01 | 1989-12-22 | Transgene Sa | Vecteurs perfectionnes d'expression d'un variant de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
| FR2607517B2 (fr) * | 1986-12-01 | 1989-12-22 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
| US6005071A (en) * | 1987-01-23 | 1999-12-21 | Merrell Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
| US5789540A (en) * | 1987-01-23 | 1998-08-04 | Merrell Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
| CA1341032C (en) * | 1987-01-23 | 2000-06-20 | John L. Krstenansky | Anticoagulant peptides |
| FR2611723B1 (fr) * | 1987-02-27 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteur d'expression d'adn recombinant codant pour l'hirudine, cultures de cellules de mammiferes infectees ou transformees, procede de preparation de l'hirudine et proteine obtenue |
| AU604925B2 (en) * | 1988-02-23 | 1991-01-03 | Schering Aktiengesellschaft | A hirudin derivative |
| US5256559A (en) * | 1988-03-04 | 1993-10-26 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
| US5112615A (en) * | 1988-08-03 | 1992-05-12 | New England Deaconess Hospital Corporation | Soluble hirudin conjugates |
| US5167960A (en) * | 1988-08-03 | 1992-12-01 | New England Deaconess Hospital Corporation | Hirudin-coated biocompatible substance |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
| GB9010552D0 (en) * | 1990-05-10 | 1990-07-04 | Erba Carlo Spa | Method for the recombinant production of hirudins and novel hirudins |
| US6514730B1 (en) | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
| HU214698B (hu) * | 1992-04-09 | 1998-06-29 | Gyógyszerkutató Intézet Kft. | Eljárás rekombináns deszulfátó-hirudin HV-1 peptidek előállítására |
| DE4323754C1 (de) * | 1993-07-15 | 1994-12-01 | Gruenenthal Gmbh | Bifunktionelle Urokinasevarianten mit verbesserten fibrinolytischen Eigenschaften und thrombinhemmender Wirkung |
| US5972648A (en) * | 1993-09-28 | 1999-10-26 | Japan Energy Corporation | Hirudin analogs, methods of manufacture thereof and anticoagulant compositions having these as active ingredients |
| DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
| US5795776A (en) * | 1994-03-22 | 1998-08-18 | Bio-Technology General Corp. | Expression plasmids regulated by an OSMB promoter |
| DE4440892A1 (de) * | 1994-11-17 | 1996-05-23 | Gruenenthal Gmbh | Proteine mit fibrinolytischen und gerinnungshemmenden Eigenschaften |
| DE19529997C1 (de) | 1995-08-16 | 1997-04-10 | Hoechst Ag | Verfahren zur Inaktivierung von Carboxypeptidase Y in hirudinhaltigen Kulturbrühen |
| DE19543737A1 (de) * | 1995-11-24 | 1997-05-28 | Hoechst Ag | Verfahren zur Ultrafiltration von Peptide oder Proteine enthaltender biologischer Matrices |
| DE19544233A1 (de) | 1995-11-28 | 1997-06-05 | Hoechst Ag | Verfahren zur Nutzung des Hefe-ADH II-Promotorsystems zur biotechnologischen Produktion heterologer Proteine in hohen Ausbeuten |
| DE69625623T2 (de) | 1996-01-31 | 2003-11-06 | Sumitomo Bakelite Co. Ltd., Tokio/Tokyo | Verfahren zur Herstellung von in Epoxyharz eingekapselter Halbleitervorrichtung |
| CN108866043B (zh) * | 2018-07-17 | 2022-02-08 | 成都医学院 | 一种细菌质粒抽提的前处理试剂盒以及方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341417C (fr) * | 1984-03-27 | 2003-01-21 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| ATE64956T1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren. |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
-
1984
- 1984-12-13 DE DE3445517A patent/DE3445517C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1985
- 1985-12-10 ZA ZA859437A patent/ZA859437B/xx unknown
- 1985-12-12 AU AU52336/86A patent/AU597238B2/en not_active Ceased
- 1985-12-12 JP JP61500141A patent/JP2531652B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-12 EP EP86900122A patent/EP0236330B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-12 DE DE86900122T patent/DE3587422T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-12 HU HU86962D patent/HU204564B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-12-12 AT AT86900122T patent/ATE90944T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-12 WO PCT/EP1985/000698 patent/WO1986003517A1/en active IP Right Grant
-
1994
- 1994-06-14 JP JP6131498A patent/JPH0811760B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU5233686A (en) | 1986-07-01 |
| EP0236330A1 (en) | 1987-09-16 |
| ATE90944T1 (de) | 1993-07-15 |
| WO1986003517A1 (en) | 1986-06-19 |
| DE3445517C2 (de) | 1993-11-18 |
| AU597238B2 (en) | 1990-05-31 |
| JPH0811760B2 (ja) | 1996-02-07 |
| ZA859437B (en) | 1987-08-26 |
| HUT46061A (en) | 1988-09-28 |
| DE3587422T2 (de) | 1993-10-21 |
| HU204564B (en) | 1992-01-28 |
| JP2531652B2 (ja) | 1996-09-04 |
| DE3445517A1 (de) | 1986-06-19 |
| JPS62501414A (ja) | 1987-06-11 |
| EP0236330B1 (en) | 1993-06-23 |
| DE3587422D1 (de) | 1993-07-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0770188A (ja) | ヒルジン様蛋白質及びその製造方法 | |
| FI90787C (fi) | Menetelmä desulfatohirudiinin valmistamiseksi | |
| EP0154434B1 (en) | Human transforming growth factor and precursor or fragment thereof, cells, dna, vectors and methods for their production, compositions and products containing them, and related antibodies and diagnostic methods | |
| DK169708B1 (da) | Komplex sonde, DNA-sekvens, som hybridiserer med sonden, og som koder for en fysiologisk aktiv del af faktor VIII:C, og ekstrachromosomalt element indeholdende en sådan DNA-sekvens | |
| JP2553829B2 (ja) | 組換えコロニー刺激因子−１ | |
| AU9046791A (en) | A beta-type transforming growth factor | |
| EP0445971B1 (en) | DNA encoding a major mite allergen and the use thereof | |
| Denèfle et al. | Chemical synthesis of a gene coding for human angiogenin, its expression in Escherichia coli and conversion of the product into its active form | |
| JP2533869B2 (ja) | Ｈｕｓｉ―ｉ型インヒビタ―の生物学的活性を有するタンパク質をコ―ドするｄｎａ配列、前記ｄｎａ配列を含む組換え体クロ―ニングベクタ―及び前記ベクタ―により形質転換された細菌 | |
| JPH025869A (ja) | Ｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子及びリポコルチン類３、４、５並びに６の製造方法 | |
| Takeuchi et al. | Purification and characterization of, and preparation of an antibody to, transketolase from human red blood cells | |
| US5026639A (en) | Method to improve mRNA translation and use thereof for production of platelet factor-4 | |
| US5583111A (en) | Thrombin inhibitors | |
| US5317011A (en) | Cloning and expression of a variant gene of platelet factor 4 and compositions thereof to modulate immune responses | |
| JPS62278986A (ja) | ハイブリツドポリペプチド | |
| JPH0730119B2 (ja) | エグリン及びその製造方法並びにそれを含有する医薬 | |
| US5801037A (en) | Expression of signal-peptide-free staphylokinases | |
| KR100311883B1 (ko) | 원구류의타액으로부터제조된트롬빈억제제 | |
| EP0404055B1 (en) | Ghilanten: antimetastatic principle from the south american leech, haementeria ghilianii | |
| EP0352089B1 (en) | A modified human PSTI | |
| KR970005913B1 (ko) | 항혈액응고 작용을 갖는 폴리펩티드 | |
| Lee et al. | Kinetic characterization of two active mutants of placental ribonuclease inhibitor that lack internal repeats | |
| DK172400B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af renset minactivin, minactivinkodende DNA-molekyle, rekombinant DNA-molekyle, sammensmeltet gen, vært, reagent til lokalisering og definering af grænserne for tumorer i histologiske prøver, samt anvendelse af det rekombinante DNA-molekyle, minactivinet og peptider deraf | |
| MATSUDA et al. | Limited proteolysis of a chemically modified third component of human complement, C3, by cathepsin G of human leukocytes | |
| JPH10501422A (ja) | 血栓溶解酵素及びその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050307 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20070509 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20071003 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20071108 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Effective date: 20080430 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080513 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110606 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 3 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110606 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130606 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130606 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140606 Year of fee payment: 6 |