HU204564B

HU204564B - Process for producing dns-sequencyes coding hirudine-like proteines and hirudine-like proteins

Info

Publication number: HU204564B
Application number: HU86962D
Authority: HU
Inventors: Elke Frotkamp; Michael Rieger; Reinhold Sommer; Ernst Fink
Original assignee: Gen Bio Tec Ges; Christensen Plantorgan Werk
Priority date: 1984-12-13
Filing date: 1985-12-12
Publication date: 1992-01-28
Also published as: JP2531652B2; JPH0770188A; DE3587422T2; ATE90944T1; JPH0811760B2; AU5233686A; DE3587422D1; EP0236330A1; DE3445517A1; AU597238B2; HUT46061A; ZA859437B; WO1986003517A1; JPS62501414A; EP0236330B1; DE3445517C2

Description

A találmány a hirudin biológiai hatásával rendelkezői, hirudinszeru polipeptidet kódoló, DNS-szekvencia előállítására vonatkozik. A taláhnány további tárgya a hirudin biológiai hatásával rendelkező, hirudinszerű protein előállítására, alkalmas, rekombináns DNS-mo- 5 lekulák, azaz klónozó és expressziós vektorok, továbbá ilyen vektorokkal átalakított gazdaszervezetek, így baktériumok, élesztők és emlőssejtek előállítására. Végül a találmány a hirudin biológiai hatásával rendelkező hirudinszeru proteint tartalmazó gyógyszerkészít- 10 mények előállítására is vonatkozik.

A piócák (Hirudo medicinalis) alkalmazása az egyik legrégebben ismert gyógyászati módszer. Bizonyítható, hogy már a történelem előtti időkben az érvágás gyógyászati kezelési mód volt 15

Évezredeken keresztül a píőcás gyógymód az egyszerű érvágásnál jobb eredményeket szolgáltató módszernek bizonyult Azonban hatása jellegéről semmit sem tudtak.

Történelmileg a piócák használatával végzett első 20 gyógykezelés közel 2200 évvel ezelőtt kolofon! Nikander nevéhez fűződik; azonban ezen gyógymód valódi megalapítójának Aesculap tanítványát, IaodikaiThemison-t tekintik. A középkorban a piócákat gyógyászati célokra általánosan használták nemcsak a borbélyok, 25 mint felcserek, hanem elsősorban az orvosok.

Egy pióca néhány perc alatt körülbelül 15 ml vért tud kiszívni. Ettől a tápláléktól megfulladna, ha nem tudná a vér alvadását megakadályozni. A pióca már a sebben antikoagulánst kever a vérhez. A trombinanta- 30 gonista kiválasztása a pióca számára létfontosságú. A pióca a trombinantagonistát a nyaki mirigyeiben termeli.

Az antikoaguláns tulajdonságok mellett az anyag javítja a vérkeringést, többszörösére növeli a vér és a 35 nyiroknedvek áramlási arányát, és érgörcsoldő hatású. Továbbá a váladéknak antibiotikus hatása is van, amely csak a Pseudomonas baktériumra hatástalan. Ez a baktérium megemészti a tárolt vért és táplálékká dolgozza fel. Ha ez a baktérium tönkremegy, a pióca is elpusztul, 40 mivel nélküle a pióca nem életképes. Érthető, hogy a pióca évezredeken keresztül az emberiség hasznos segítőtársaként szolgált. Váladéka antitrombotikus, gyulladásgátló, ödémacsökkentő, fokozza a nyirok és a vér i áramlását, érgörcsoldő és antibiotikus hatású. Tehát az 45 i anyag nagyon hatásos. A pióca harapásától (megje- i gyezzük, hogy a harapás nem fájdalmas, csak enyhe csípő érzést kelt) bejutott kis mennyiség a vér koagulá- 1 lását 10 óra hosszat gátolja. <

Aszeptikus és antiszeptikus tünetek véget vetettek a 50 piócákkal végzett közvetlen gyógykezelésnek a világ- i szerte számos kutató foglalkozott a hatóanyag elkülő- í nítésével, hogy a gyógyászatban ismét felhasználják. Először 1884-ben kaptak piócákból antikoaguláns ki- r vonatot. Később a pióca hatóanyagát részben megtisz- 55 s tították az idegen fehérjéktől. A kapott nyersanyagot ( hirudinnak nevezték el. a

A hirudin nagy molekulájú polipeptid, amelynek g molekulatömege 7000, gyulladásgátló és ödémacsök- k kentő tulajdonsága van. A koagulációs folyamat egyes 60 1<

fázisaira gyakorolt gátlőhatás vizsgálata azt mutatta, hogy a trombinenzímnek egy specifikus gátló anyaga, amely nem reagál semmilyen más koaguláló faktorral, és hatását a vérben jelen lévő egyéb összetevőkkel való 5 kölcsönhatás nélkül fejti ki. Tehát a hirudin úgy gátolja meg a vér koagulálását, hogy az első koagulációs fázis reakciótermékét, nevezetesen a trombint megköti, és ezáltal megakadályozza a második koagulációs fázist, nevezetesen a fibrin képződését.

A hirudin tehát egy specifikus trombinantagonista [Jui-Yoa Csang: FEBS Lett. 164,307. (1983)]. Mindeddig a hirudint piócákból izolálták. 70 piócából csak körülbelül 1 mg hirudin nyerhető. Az így kapott hirudint főleg olyan kenőcsökké dolgozzák fel, amelyek a o vénák trombózisellenes és gyulladásgátló gyógykezelésére használhatók [P. Walsmann, F. Markwardt: Die Pharmazie, 36,653. (1981)]. Később a hirudint véralvadási rendellenességek kezelésére vagy a vér koaguIálásának megakadályozására, például hemodialízis) nél is használták. Azonban mivel a hirudin csak korlátozott mennyiségben hozzáférhető és tisztasága nem kielégítő, nem használható klinikai vizsgálatokban.

Találmányunk célja a hirudin biológiai hatásával ! rendelkezőhirudinszeru protein, valamint olyan eljárás szolgáltatása, amely lehetővé teszi ennek a proteinnek genetikai módszerekkel való nagyüzemi termelését. A találmány további célja a hirudmszerú proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása.

A taláhnány a szabadalmi igénypontokban meghatározott tárgykörökre vonatkozik.

A hirudinszerú proteinmeghatározás olyan proteint jelent, amelynek aminosavszekvenciája hasonló a természetes hirudin aminosavszekvencíájához, vagy annak csak egy részét foglalja magában, és/vagy a 63 tirozincsoporton nem szulfátéit a természetes hirudinnal ellentétben. A találmány szerint a megfelelő fúziós proteineket is hirudinszeru proteinekként jelöljük.

A hirudin biológiai hatásával rendelkező proteinmeghatározás olyan proteinre vonatkozik, amely nem szükségszerűen azonos a természetes hirudinnal, de ennek ellenére a természetes hirudin biológiai hatását mutatja. így proteinekkel, például a trombinnal szemben úgy hat, mint a természetes hirudin, és/vagy immunológiai tulajdonságai megegyeznek a természetes hirudinéval.

Ismert, hogy a hirudin deszulfatálása biológiai hatékonyságát csak kis mértékben csökkenti [Jui-Yoa Csang: FEBS Lett., 164,307. (1983)].

A hirudin biológiai hatásával rendelkező hirudinszeru proteinnek géntechnológiai módszerekkel való előállításához a következő lépéseket végezzük.

Először az I. táblázatban felsorolt oligodezoxiribonuldeotidokat szintetizáljuk DNS-szintetizátorral. A szintézis J. Dodt, Η. P. Müller, U. Seemüller és Jui-Yoa Csang: FEBS Lett., 615, (1984) közleményében leírt aminosavszekvencián alapul. Főleg az E.coliban legygyakrabban használt kodonokat alkalmazzuk. Ügyelni kell arra, hogy a szintetikus gén 5’-végén ATG-kodon legyen, mivel ebben az esetben adott esetben a megfe2

HU 204564 Β lelő protein lehasítható a fúziós proteinről cianobromidos hasítással. Az így kapott oligodezoxiribonukleotidokat tisztítjuk és polinukleotidkinázzal és gamma-³²PrATP-vel foszforilezzük a későbbi lépésben végrehajtandó ligáció miatt.

Ennek a reakciónak a termékeit preparatív poliakrilamid-gélelektroforézissel tisztítjuk. Ezt követően a megfelelő + és - szálakat (komplementer szálak) összekapcsoljuk, génfragmensek előállítására ligáljuk, majd preparatív poliakrilamid-gélelektrofoiézissel tisztítjuk és a 10 komplett szintetikus génné egyesítjük. (1. ábra)

Az így kapott gént felhasználhatjuk géngyűjteményekből vagy cDNS-gyűjteményekből a természetes gén elkülönítésére. A szintetikus gént a pEMBL 8+ vektorba (letétbe helyezve a DMS-nél, Göttingen, NSZK, letétbe helyezési száma: DMS 3139) inzertáljuk, amely a lac UV5 promotort tartalmazza. Természetesen más expressziós kontrollszekvenciák szintén használhatók, például E.coli lac-rendszer, E.coli trprendszer, E.coli lipoprotein-promotor, élesztő expresz- 20 sziós kontrollszekvenciák, vagy más eukarióta expressziós kontrollszekvenciák.

Ami ebben az összefüggésben fontos, az, hogy a gént az expressziós kontrollszekvenciával operatívan kapcsoljuk, valamint egy adott gazdaszervezethez az 25 alkalmas expressziós kontrollszekvenciát kiválasztjuk.

Miután a rekombináns expressziós vektort felépítettük, egy átalakítható gazdaszervezetbe, így E.coli baktériumba, például E.coli OM 214-be (G. Schütz professzor törzsgyűjteménye, Deutsches Krebsforschung- 30 szentrum Heidelberg; DSM Göttingen, letétbe helyezési szám: DSM 3138) inzertáljuk. Az expressziós kontrollszekvenciától függően más baktériumok, élesztők és állati vagy emberi sejtek is használhatók gazdaszervezetként. A hirudinszerű proteint szintetizáló átalakí- 35 tókat ampicillin-rezisztenciájú és anti-hirudin-IgG-antitestekkel való reakciójuk alapján azonosítjuk.

Végül a találmány szerint előállított hirudinszerű protein biológiai hatását a vér koagulációjában kulcsszerepet játszó trombinenzimmel szemben vizsgáljuk. 40

Ebben az összefüggésben azt találtuk, hogy először

1. táblázat Szintetizált oligonukleotidok 5’-vég

3’-vég

Rl AATTCTATGGTTGTTTACACTGACTGCACCGAA R2 CCAGATTCGGTGCAGTCAGTGTAAACAACCATAG R3 TCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGTTCTAA R4 AAACGTTAGAACCTTCGCACAGGCACAGGTTCTGA R5 CGTTTGCGGTCAGGGAAACAAATGCATCCTGG R6 AGAACCCAGGATGCATTTGTTTCCCTGACCGC R7 GTTCTGACGGTGAAAAGAACCAGTGCGTTACCGGTG R8 ACCTTCACCGGTAACGCACTGGTTCmTCACCGTC R9 AAGGTACTCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGA RIO CGAAGTCACCGTCGITGTGAGACTGCGGTTTCGGAGT Rll CTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGC R12 CTATTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTT R13 AATAGTAAGTGAGCGTCG

R14 GATCCGACGCTCACTTA a baktérium által termelt hirudinszerű protein meggátolja a fibrinogénnek a trombin hatására fibrinné való átalalkulását és másodszor ezzel a proteinnel egy kromogén anyagnak trombin hatására való átalakulásra is 5 megakadályozható. Ezekből látható, hogy a találmány szerinti eljárással előállított protein a hirudin biológiai hatásával bír.

Tehát a vér koagulálási rendellenességei kezelésére vagy a vér koagulálásának megakadályozására alkalmas gyógyszerkészítmények állíthatók elő a találmány szerinti proteinből, illetve cianogén bromid hasítási termékéből. Adott esetben gyógyászatilag elfogadható adalékok és hígítóanyagok is hozzáadhatók.

Az 1. ábra a szintetikus gén teljes DNS-szekvenciá15 ját mutatja. A fekete nyilak jelölik a szintetizált egyszálú oligodezoxinukleotidok határait, I, Π és ül alfragmensek, valamint a kapcsoló fragmens a keretezett részben vannak. Ezenfelül a megfelelő aminosavszekvenciát a DNS-szekvencia fölött tüntetjük fel.

A 2. ábra a rekombináns pRudi 1 plazmidot mutatja inzertált szintetikus EcoRI-BamHI fragmenssel. A szintetikus fragmenst a pEMBL 8+ plazmid β-galaktozidáz génje alfa-fragmensében elhelyezkedő polilinkerbe inzertáltuk.

Az alfa-fragmens első aminosavai képezik a leírt fúziós proteint a hirudin aminosavaival együtt.

A 3. ábra szemlélteti a pRudi 1 klónnal kódolt fúziós protein teljes aminosavszekvenciáját. A természetes hirudinnak megfelelő aminosavakat nagy kezdőbetűkkel jelöltük.

A következő példák mutatják be a’ találmányt. A példák csak szemléltetésül szolgálnak és nem céljuk a találmány terjedelmének korlátozása.

1. példa

A hirudin biológiai hatásával rendelkező proteint kódoló DNS-szekvencia szintézise Az 1. táblázatban oligodezoxiribonukleotidokatDNSszintetizálóval (Applied Biosystems 380A modell) szintetizáltuk.

HU 204564 Β

A szintézisprogram ABI 003 5/17/84. A felhasznált vegyszerek szintén az Applied Biosystems-től származnak, ugyanúgy, mint az LCAA/CPG (hosszúláncú alkilamin kontrollált pórusú üveg), amelyet nukleozid-3-Οszukdnáttal (körülbelül 30 pl/g) funkcionalizáltunk. Mindegyik szintézist 1 pmól nukleozidal indítottuk. A szintézist minden esetben a „trityí off, autó” hasítási módszerrel fejeztük be, amellyel a savra instabil 5’-O(4,4’-dimetoxi-tritil)-csoportot eltávolítottuk a tiofenollal és ammóniával való kezelés előtt Aszintetizálő termékeinek ammóniás oldatát lezárt lombikokba vittük át és az eredeti üvegtartályokat körülbelül 10-10 ml 25%-os ammóniaoldattal kiöblítettük.

A lombikot gondosan lezártuk, majd 14 óra hosszat 50 “C-on melegítettük. Ezután az oldatokat szárazra be- 1 pároltuk olajszivaííyús vákuumban és mindegyik terméketfeloldottuk500 pl 20mmől-os trietil-ammónium-hidrogén-karbonát-pufferban (TEAB), amely 7,4 pH-értékű.

Mindegyik nyers oligomer tizedrészét ioncserélős nagy teljesítményű folyadékkromatografálással (HPLC) 2 tisztítottuk. ALatek HPLC-rendszerkétP 400 folyadékszivattyúból, automatikus gradiens ellenőrzőből, 100 ples min tagyűjtő hurokkal felszerelt Rheodyne 7125 injektáló tankból, Milton Roy 1204 A ultraibolya detektorból (detektálási hullámhossz 280 nm, érzékenység 1,0) és 2 Shimadzu C-R3Arögzítőből állt ALatekParfisil 10 SAY HPLC-oszlop (4 mm átmérőjű) 50 ’C-os vízfürdőben állt és az áramlási sebesség 2 ml/perc volt Az elválasztáshoz 20-60% B oldószert tartalmazó A és B oldószerek lineáris gradiensét használtuk (A oldószer 40 tf% I mmól-os 3 trietil-ammónium-foszfát, pH 6,3, 60 tf% formamid; B oldószer 40 tf% 500 mmól-os trietil-ammónium-foszfát pH 6,3,60 tf% formamid). Az oldatok előállításához analitikai minőségű formamidot használtunk, amelyet 5 óra hosszat 40 g/1 Bio Rád AG 501-X8 ioncserélővel (analiti- 3Í kai minőségű kevert ágyugyanta) kevertünk, az elűciót gondosan figyeltük, és az utoljára eluált ultraibolya-aktív anyagot tartalmazó fiakciót (rendszerint a fő abszorpció) manuálisan felfogtuk. Kisőzáshoz desztillált vizet adtunk ehhez a frakcióhoz 1:1 arányban. Ezután a frakciót 3 ml 4( oktadecií (Cjg) egyutas oszlopra (I. T. Baker 7020-3) vittük, amelyet 3 ml metanollal, 200 mmől TEAB-bal, pH 7,4/30% acetonitril, illetve 200 mmól TEAB-bal, pH 7,4 mostunk. Ezután az oszlopotkétszermindegyik puffer 33 ml-nyi mennyiségével kiöblítettük. Ezt követőén a tér- 45 méketkétszer 3 ml 200 mmólos TEAB, pH 7,4/80% metanollal eluáltuk (H. Blöcker, R. Ránk és munkatársai, EMBO Course, Braunschweig, 1984. szeptember, Manual). Olajszivattyú- vákuumban szárazra bepárolva, a tisztított oligodezoxiribonukleotidot 1 ml 20 mmól-os 50 TEAB-ban, (pH 7,4) felvettük és az abszorpciót 260 nmnél határoztuk meg.

Mindegyik oligomerből 500 pikomólt használtunk kvantitatív foszforilezéshez. A moláris extinkciős koefficienseket a nukleotidok egyedi extinkciős koefficienseinek összeadásával számítottuk ki a hlpokromatikus hatások figyelembevétele nélkül. Mindegyik oligonukleotidből 500 pikomől mennyiséget 15 pl desztillált vízben és 2 pl 10-PNK pufferben (500 mmól Trisz-HCl, pH 7,6,

100 mmól MgCh, 50 mmól DTT, 10 mmól spermidin) szuszpendáltunk, majd 10 percig 70 °C-on tarottuk, Ezután az elegyet lehűtöttük és hozzáadtuk 1 pmól rATPhez, majd 1 pCi adenozin-5’-(gamma-³²P)-trifoszfátot trietil-ammónium-sőt (6000 Ci/mmól, Amersham Buch5 ler GmbH and Co. KG. Braunschweig), és 1 pl polinukleotidkinázt (4,5 U, Boehringer Mannheim) adtunk hozzá. Areakcióelegyet 37 ‘C-on inkubáltuk. 15 perc elteltével 1 pl 10 mmól-os rATP-t adtunk hozzá és az inkubálást további 15 percig folytattuk, majd 10 pl Urea-Míx (10 mól karbamid, 20 mmól EDTA, 0,05% brómfenolkék, 0,05% xilolcianolkék) hozzáadásával megszakítottuk. A gélfeltöltés előtt az elegyet 1 percig 95 ’C-on tartottuk.

Denaturált poliakrilamidgélt [60 cm hosszú, 0,1 cm vastag, 8% akrilamid, 8,5 mól karbamid, 1·ΤΒΕ (89 mmól triszbázis, 89 mmól bórsav, 2 mmól EDTA)] előkészítettünk 2 óra hosszat 30 Watt-tal. Ezután feltöltöttük a denaturált foszforilezési reakcióelegyekkel. Az elektroforézist 30 Watton végeztük, amíg a brómfenol0 kék 45 cm-t migrált. Az üveglemezek egyikét felemeltük, a gélt Saran-takaróval lefedtük és 1 óra hosszat röntgenfilmen exponáltuk. A teljes hosszúságú oligonukleotidoknak megfelelő sávokat, beleértve a gélmatrixot kivágtuk. A mátrixot összepréseltük és 300 pl

TE-pufferben (10 mmól Trisz-HCl, pH 8, 1 mmól EDTA) szuszpendáltuk.

Azoligonukleotidokat3 óra hosszat 65 ‘C-on eluáltuk. Ezután a gélmaírixokat 10 percig 12 000/perc fordulatszámon Iecentri&gáltuk, és a felülúszót 0,3 mól nátrium3 acetát (pH 10) és glikogén, mint hordozó jelenlétében etanollal lecsaptuk. A szemcséket kétszer 80%-os etanollal mostuk, majd vákuumban szárítottuk, és TE-pufferben felvéve 2 pikomól nukle-otíd/pl végsőkoncentrációra beállítottuk.

Egy első lépésben 50 pikomól egyszálú oligonukleotidot hozzákapcsoltunk a megfelelő ellenkező szálához 100 pl-es (50 mmól nátrium-klorid, kétszer TE, pH 8) összes reakciótérfogatban. Az elegyeket 90 ’C-ra melegítettük, vízfürdőn 2 percig ezen a hőmérsékleten

I tartottuk, amelyet éjszakán át hagytunk szobahőmérsékletre hűlni.

A szubfragmenseket 20-20 pl kapcsoló elegyben [I szubfragmens R1+R2 és R3+R4, II szubfragmens R5+R6 és R7+R8, ΠΙ szubfragmens R9+R10 és R11+R12, IV szubfragmens R13+R14 h'gálásával diniért képeztünk) 100 pl össztérfogatban (50 mmól Trisz-HCl, pH 7,5,10 mmólMgCb, 5 pgBSA, 1 mmól spermidin, 1 mmól ATP, 10 egység T4-DNA-ligáz (Boehringer Mannheim)] ligáitok.

Az inkubálást 4 óra hosszat 17 ’C-on végeztük, majd 10 percig 70 ’C-on való melegítéssel megállítottuk. Az elegyet 0,3 mól nátrium-acetát (pH 10) és glikogén hordozó jelenlétében etanollal leválasztottuk, kétszer 80%os etanollal mostuk, szárítottuk, és 30 pl TE-pufferben (pH 8) felvettük. 20-20 pl ligációs elegyet 5,5 pl töltőpufferral kevertünk [20% Ficoll 400 (Pharmacia, UppsaIa, Svédország) 2% SDS, 0,05% brómfenolkék, 0,05% xilolcianokék] és 5 percig 70 ‘C-on melegítettük.

Egy nemkötő denaturált poliakrilamidgélt (40 cm hosszú, 0,01 cm vastag, 10% akrilamid, egyszer TBE)

HU 204 564 Β óra hosszat 200 Volttal előkezeltünk, majd rátöltöttük a ligálási mintákat. Az elektroforézis 7 óra hosszat 300 Volton l/2»TBE-ben végeztük, amíg a brómfenolkék 25 cm-t migrált. A gélt 12 óra hosszat autoradiografáltuk. A feltételezett hosszúságnak megfelelő fragmenseket kivágtuk és az első gélnél leírt módon eluáltuk. A szárított DNS-szemcséket 20 μΐ TE-pufferban felvettük.

Mindegyik szubfragmensből körülbelül 1 pikomólt (10 μΐ szubfragmens készítmény) 50 μΐ teljes reakciótérfogatban ligáltunk az előzőekben leírt körülmények között Az enzim inaktiválását és a DNS koncentrálását a már leírt módon végeztük. A DNS-szemcsét 8 μΐ TE-ben felvettük.

A szintetikus gén teljes szekvenciáját szintén az 1. ábrán mutatjuk be.

2. példa

A klónozó vektor felépítése, a szintetizált

DNS-szekvencia kifejezése és az E.coli OM 214 (DSM3138) transzformálása

Mivel a szintetizált gén EcoRI és BamHI klónozó helyein keresztül multimereket képezhet, a készítményt EcoRI-gyel és BamHI-gyel emésztettük a vektorral való ligálás előtt. 5 μΐ ligálási reakcióelegyet 40 egység EcoRI-gyel és 30 egység BamHI-gyel 40 μΐ teljes térfogatban (50 mmól Trisz, pH 7,5, 100 mmól NaCl, 10 mmól MgCl₂, 1 mmól DTT) 1 óra hosszat 37 °C-on emésztettünk. Ezután a DNS-t 0,3 mólos nátrium-acetát (pH 10) jelenlétében etanollal leválasztottuk, kétszer 80%-os etanollal mostuk, szárítottuk és 24 μΐ TE-ben felvettük.

pg pEMBL8+ plazmid DNS-t [Dente, L., Cesareni, G. és Cortese, R. (1983), Nucleic Acids Rés. 11,16451655] 40 egység EcoRI-gyel, 30 egység BamHI-gyel emésztettünk és 25 egység borjúintesztinális foszfatázzal (Boehringer Mannheim) 100 pl teljes reakciótérfogatban 1 óra hosszat 37 ’C-on defoszforileztünk. A reakció pufferje 50 mmól Trisz, pH 75, 100 mmól NaCl, 10 mmól MgCl₂, 1 mmól DTT. A reakciót 25 mmól EGTA hozzáadásával és 10 percig 70 °C-on való melegítéssel megállítottunk, majd 150 pl 80%-os pufferolt fenol (pH Ί5) segítségével extraháltuk. A felső fázist Sephadex G 100-zal töltött (Pharmacia, Uppsala, Svédország, teljes ágy térfogat 2 ml) és 10 mmól-os ammónium-hidrogén-karbonáttal kiegyensúlyozott gélszűrő oszlopra juttattuk. Az eluátum mindegyik frakciója körülbelül 100 pl volt. Ezeknek a frakcióknak alikvot részét etidium-bromidot tartalmazó agarózlemezekre helyeztük. A DNS-t ultraibolya-megvilágítással tettük láthatóvá. A teljes DNS körülbelül 75%-át tartalmazó első frakciókat összegyűjtöttük és csökkentett nyomáson szárítottuk. A DNS-t 0,1 pg DNS/pl Te-puffer végső koncentrációban újból szuszpendáltuk.

0,05 pikomól restrikciós DNS-inzertet összekevertünk 0,1 pikomól előállított DNS-vektorral, 20 pl teljes térfogatban [50 mmól Trisz, pH 7,5,10 mmól MgCl₂, pg BSA, 1 mmól spermidin, 1 mmól ATP, 5 egység T4-DNS-ligáz (Boehringer Mannheim)]. Az inkubálást 3 óra hosszat 14 'C-on végeztük. Borjú csecsemőmirigyéből származó 2 pg tRNS (Boehringer Mannheim) és 80 pl TE-puffer hozzáadása után az elegyet 100 pl 80%-os fenol (pH 7,5), kloroform és izoamil-alkohol 24:24:1 tf arányú elegyével extraháltuk, 10 pl 3 mólos nátrium-acetátot (pH 10) és 1 pl glikogént (Renner GmbH, Darmstadt, NSZK) adtunk hozzá, az oldatot etanollal leválasztottuk, kétszer 80%-os etanollal mostuk, csökkentett nyomáson szárítottuk és 10 pl TE-pufr ferban ismét feloldottuk. Az így kapott pRudi 1 plazmid szerkezetét a 2. ábra mutatja. Az expressziós termék aminosavszekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be. Az expressziós termék β-galaktozidáz (1-8 helyzetek) alfa-peptidjének aminosavaival és a természetes hirudin (9-végig) aminosavaival rendelkező fúziós protein.

A megfelelő E.coli OM 214 törzs sejtjeit szokásos módszerekkel állítottuk elő.

ml táptalajt (Serva, katalógusszám 48 498) beoltottunk az E.coli OM 214 törzs egyetlen telepével. A tenyészetet körülbelül 15 óra hosszat 200/perc fordulattal 37 °C-on ráztuk. A tenyészet 4 ml-éhez 200 ml friss táptalajt adtunk. Az inkubálást a fentiek szerint végeztük, amíg kétszer 10⁸ sejt/ml sejtsűrűséget értünk el. A tenyészetet jéggel gyorsan lehűtjük és 8000/perc fordulaton 5 percig centrifugáltuk. A sejtek szedimentumát 100 ml 30 mmólos kalcium-klorid-oldatban ismét szuszpendáltuk és 20 percig 0 ’C-ig tartottuk, majd újból centrifugáltuk és 10 ml kalcium-klorid-oldatban ismét szuszpendáltuk. A sejteket 24 óra hosszat 0 °C-on tarottuk. Ezután hozzáadtunk 1 ml steril glicerint és a sejteket cseppfolyós nitrogénnel gyorsan megfagyasztottuk és -70 ’C-on tároltuk. Az így kapott fagyasztott megfelelő E.coli sejteket jégen felolvasztottuk. 100 pl sejthez 5 pl tisztított ligáit DNS-t adtunk. Az elegyet 20 percig 0 'C-on tartottuk. A sejteket pontosan 4 percig 37 °C-on hőpulzálásnak vetettük alá, hogy a plazmid DNS-t fel tudják venni. A sejtszuszpenziót jégen lehűtöttük, táptalajon tízszeresére hígítottuk és körülbelül 40 percig 37 ’C-on inkubáltuk. A szuszpenzió alikvot részeit (1%, 10% és 90%) 1,5% agart, tápközeget és ml-ként 100 pg ampicillint tartalmazó agarlemezekre rétegeltük. Az ampicillint az átalakított sejteknek az antibiotikumra mutatott rezisztenciájuk alapján való kiválasztásra használtuk. Az agarlemezeket 14 óra hosszat 37 ’C-on inkubáltuk. A kifejlődő telepeket kiemeltük és a hirudinszekvenciájú fúziós protein kifejeződésére vizsgáltuk enzimmel kapcsolt immunoszorbens vizsgálattal (ELISA).

3. példa

A szintetikus DNS-szekvencia kifejeződése és a kifejeződési termékek detektálása pg/ml ampicillint tartalmazó 2,5 ml 2·ΥΤ közeget egyedi E.coíi telepekkel inkubáltuk és a tenyészeteket 6 óra hosszat 37 ’C-on ráztuk. A sejteket centrifugálással begyűjtöttük, 1 ml 10 mmólos nátrium-klorid-oldattal mostuk és 250 pl lizis pufferben (50 mmól Trisz-HCl, pH 8,30 mmól nátrium-klorid, 1 mg/ml lizozin szuszpendáltuk. 30 perces 0 ’C-on való állás után a sejteket háromszor lehűtöttük -70 ’C-ra és 37 ’C-on felengedtük. A hűtött lizátumokat 15 000/perc fordulaton centrifugáltuk. A

HU 204564 Β felülúszókat a hirudinszerű proteinek detektálásához használtuk fel.

Az E.coli Iizátumokban a hirudin észlelését ELISAvizsgálattal végeztük. 50 pl anti-hirudin-IgG-oldatot (Plantoigan, Bad Zwischenahn) és 10 pl IgG-t kap- 5 csolő pufferban (1,59 g Na₂CO3,2,93 gNaHCOj, 0,2 g NaNj vízzel 11-re kiegészítve) mikrotitrálő lemez mélyedéseibe töltöttük és éjszakán át 4 °C-on inkubáltunk.

A mélyedéseket három ízben PBS-pufferral öblítettük (8,0gNaCI, 0,2 g KH2PO4,2,9 gNaíPO+^HjO, 0,2g 10 KCI, 0,5 ml Tween 20,0,2 g NaN3 vízzel 11-re kiegészítve). Ezt a puffért használtuk az összes öblítéshez.

pl vizsgálandó lizátumot használtunk. Szobahőmérsékleten 2 órás állás után a lemezek mélyedéseit háromszor mostuk, és alkálifém-foszfatázzal konjugált 15 50 pl antí-hirudin-rgG-t adtunk hozzá. A konjugáfumot VHT típusú alkálifém-foszfatázból (Sigma) a „Biochemical and Organic Compounds fór Research”, (Sigma Chemie GmbH) _ katalógus 713. oldalán ismertetett módon állítottunk elő¹. 20

Szobahőmérsékleten 2 őrás inkubálás után a mélyedéseket ismét háromszor mostuk. Ezt követően az alkálifém-foszfatáz 50 ml-nyi szubsztrátumát (Sigma 104: p-nitro-fenil-foszfát, 1 mg/ml 10%-os dietanol-aminban, 0,1 mg/ml MgCl₂*6H₂O, pH 9,8) adtunk hozzá. Az 25 enzimreakciót vizuálisan határoztuk meg. Pozitív eredményt, azaz a hirudinszerű protein jelenlétét az oldat sárga elszíneződéséből állapítottuk meg az alkálifémfoszfatáznak az anti-hirudin-IgG-hez való kapcsolódásának aktivitása következtében. Az E.coli extraktu- 30 mokban a hirudinszerű protein kvantitatív becslését ismert koncentrációjú hirudin-standard oldat hígítási sorozatával állapíthattuk meg, amelyet a vizsgált mintákkal párhuzamosan végeztünk.

Összesen 35 E.coli kiónt vizsgáltunk. 4 közülük 35 pozitív eredményt adott (9., 13., 19. és 35. számúak). A színreakciőnak a hirudin-standard oldatokkal való összehasonlítása azt mutatta, hogy a klőnok 10-20 pg/1 hirudinszerű proteint termeltek.

4. példa

A hirudinszerű protein biológiai hatékonyságának meghatározása pg/ml ampicillint tartalmazó 112·ΥΤ közeget a 9. számú E.coli klón 10 ml-nyi egy éjszakás tenyésztésével inkubáltunk, és 37 ’C-on ráztuk, 1 óra elteltével hozzáadtunk 5 ml 100 mmólos IPTG-t (ΐζορΓορίΙ-β-Οtio-galakío-piranozid, Boehringer Mannheim), hogy a szintetikus gén kifejeződését indukáljuk. 5 óra elteltével a sejteket begyűjtöttük, 100 ml lízispufferben szuszpendáltuk és az előzőkben. leírt módon lizáltuk. A lizátumot 1 mólos magnézium-kloriddal 10 mmól végső koncentrációra állítottuk be, majd hozzáadtunk 10 mg DNase I-t. 15 percen 37 ’C-on való állás után a lizátumot 15 percig 70 ’C-on inkubáltuk. A kivált proteint centrifugáltuk, a felülúszót 6%-os triklőr-ecetsavval 4,5 pH-éríékre titráltuk. Hideg acetont adtunk hozzá 50%-os végkoncentráciőig. 2 óra hosszat 0 ’C-on való állás után a csapadékot centrifugáltuk. A felülú45 szóhoz hideg acetont adtunk 80% végkoncentrációig. Ezután 2 óra hosszat 0 ’C-on tartottuk A csapadékot ismét centrifugáltuk, és az acetont 37 ’C-on elpárologtattuk, majd a csapadékot 2 ml 50 mmólos Trisz-HClben (pH 7) oldottuk.

Ezután az E.coli kivonattal véralvadási vizsgálatot végeztünk. A véralvadási vizsgálat a trombinnak hirudinnal vagy a hirudin biológiai hatásával rendelkező proteinnel való specifikus gátlásán alapul. Adott mennyiségű trombint adtunk ismert koncentrációjú fibrinogén oldathoz. Ezáltal a fibrinné való átalakítást katalizáltuk, és bekövetkeztét adott idő alatt megállapítottuk. Ha a fibrinogén oldathoz növekvő mennyiségű hirudint vagy a hirudin biológiai hatásával rendelkező proteint adunk, a véralvadás mindaddig gátolt, amíg nincs trombinfelesleg. A fordulópont felismerhető a minta megakadásáról.

A vizsgálatot a következő módon végeztük.

100 pl fibirinogén oldatot (60 mg/ml 0,85%-os nátrium-klorid-oldatban) és 100 pl vizsgálandó mintát 50 mmől-os Trisz-HCl-ben (pH 7, puffer vagy hirudin-standard oldat, vagy E.coli kivonat) adtunk 100 pl 50 mmólos Trisz-HCI-oldathoz (pH 7). Ezután hozzáadtunk 5 pl trombint (30 NE/ml 0,85%-os nátrium-klorid-oldatban, Behring-Werke). Az anyagokat gondosan összekevertük. 1 perces szobahőmérsékleten való inkubálás után a vizsgálati kémcsöveket 180°-kal megfordítottuk. Pozitív eredmény, azaz a trombin gátlása tapasztalható ha az oldat kifolyik a kémcsőből, míg negatív eredmény esetén a véralvadás nem gátolt és a fibringél a kémcső alján marad.

A 9. számú E.coli klónból kapott dúsított kivonat gátolta a fibrinogénnek fibrinné való átalakulását, míg egy hasonló módon kezelt, hirudin gént nem tartalmazó E.coli kivonat nem fejt ki gátlást. Hirudinstandard oldatokkal való összehasonlítás azt mutatta, hogy az E.coli-ből kapott hirudinszerű protein biológiai hatékonysága 120 ng/ml hirudinkoncentrációnak felel mg.

Ezenfelül az E.coli kivonatok hirudinaktivitását meghatároztuk a trombin aktivitást gátló képességük révén kromogén szubsztrátummal szemben. Ebben a reakcióban a trombin lehasítja a sárga p-nitro-anilint a kromogén Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (Chromozyme TH, Boehringer Mannheim) szubsztrátumról. A vizsgálatban 890 pl dietanol-amin-puffert (150 p/1, pH 8,4} összekevertünk 20 pl trombinoldattal (5 NE/ml 0,25 mólos foszfátpufferben, pH 6,7). Az elegyhez 50 pl hirudiníartalmú oldatot (x ng hirudin dietanolamin-pufferban hitelesítéshez, vagy E.coli kivonat) adtunk, és 5 percig 25 ’C-on inkubáltuk. Ezután hozzáadtunk 125 plkromozinoldatot (1,5 mmólos, dietanolamin-pufferben) és az elegy extrinkcióját mértük 405 nm-nél fotométerben (Shimadzu) 6 percen keresztül 60 másodpercenként. Az extinkció növekedése a trombinaktivitás mértéke és reciprok viszonyban van ahirudinaktivitással.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás hirudinszeru aktivitású, a

1 met thr met ile thr asn ser met Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn 21 Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 41 Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn 61 Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin *** *** képletű aminosavszekvenciának megfelelő DNSfragmens előállítására, azzal jellemezve, hogy az A, T, C 10 és G oligodezoxiribonukleotidokból egymás utáni kémiai lépésekkel, adott esetben védőcsoportok bevitelével és későbbi lehasításával a tárgyi kör szerinti DNSfragmenst felépítjük oly módon, hogy először részszekvenciákat szintetizálunk, majd egy második lépésben ezeket a részszekvenciákat a megfelelő sorrendben ligáljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a y

1 |_AArrCTATGGTTGITTACACTGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAA TTÁÁjGATACCAACAAATGTGACTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTCGACACGGACACGCTT

61 GGTTCTAAQGTTTGCGGTCAGGGAAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAGAAC CCAAGATTGCAAAlCGCCAGTCCCTTTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTCTTG

121 CAGTGCGTTACCGGTG AAGGTACTCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAA

GTCACGCAATGGCCACTTCCSrGAGGCTTTGGCGTCAGAGTGITGCTGCCACTGAAGCTT

181 GAAATCCCGGAAGAATACCTGC AATAGTAAGTGAGCGTCG GATC

CTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTTATCjATTCACTCGCAGCCTAG képletű DNS-fragmens előállítására, azzal jellemezve, hogy először a

5’-vég 3’-vég

Rl AATTCTATGGTTGTTTACACTGACTGCACCGAA R2 CCAGATTCGGTGCAGTCAGTGTAAACAACCATAG R3 TCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGTTCTAA R4 AAACGTTAGAACCTTCGCACAGGCACAGGITCTGA R5 CGTTTGCGGTCAGGGAAACAAATGCATCCTGG R6 AGAACCCAGGATGCATTTGTTTCCCTGACCGC R7 GTTCTGACGGTGAAAAGAACCAGTGCGTTACCGGTG R8 ACCTTCACCGGTAACGCACTGGTTCTTTTCACCGTC R9 AAGGTACTCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGA RIO CGAAGTCACCGTCGTTGTGAGACTGCGGTTTCGGAGT Ril CTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGC R12 CTATTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTT R13 AATAGTAAGTGAGCGTCG

R14 GATCCGACGCTCACTTA képletű oligonukleotidokat szintetizáljuk, majd ezeket a második lépésben a megfelelő sorrendben 45 ligáljuk.
3. Eljárás egy hirudinszeru protein genetikai információját hordozó rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárással előállított DNS-fragmenst vektorba 50 építjük, és az ebben lévő expressziós kontrollszekvenciát kapcsoljuk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti DNS-fragmenst expreszsziós kontrollszekvenciaként E.coli promotorrendszert, 55 E.coli lac-rendszert, E.coli β-laktamázrendszert, E.coli trp-rendszert vagy E.coli lipoprotein-promotort tartalmazó vektorba építjük.
5. A 3. igénypont szerinti eljárás a pRudi 1 rekombináns plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. 60 igénypont szerinti DNS-fragmenst EcoRI-gyel és BamHI-gyel emésztjük, a kapott terméket BamHI-gyel és borjúbél-foszfatázzal kezelt pEMBL8+ plazmiddal ligáljuk, és a ligálási tennéket T4-DNS-ligázzal cirkuláltatjuk.
6. Eljárás hirudinszeru fehérjét kifejezni képes transzformált prokarióta gazdaszervezetek előállítására, azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezetet a 3-5. igénypontok bármelyike szerint előállított rekombináns DNS-molekulával transzformáljuk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként valamely E.coli törzset alkalmazunk.
8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezetet az 5. igénypont szerinti eljárással előállított pRudi 1 rekombináns plazmiddal transzformáljuk.

1 HU 204564 Β 2
9. Eljárás a

1 met thr met ile thr asn ser met Val Val Tyr Thr Asp Gys Thr Glu Ser Gly Gin Asn 21 Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Be Leu Gly-Ser 4Γ Asp Gly Glu Lys Asn Gin Gys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn 61 Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr LeuGin****** aminosavszekvencíát tartalmazó hirudinszeru fehérje előállítására, azzaljellemezve, hogy a 6-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított transzformáit gazdaszervezetet megfelelő tápközegben tenyésztjük és a tárgyi körben meghatározott, kifejeződött aminosavszekvencxát tartalmazó fehérjét a tenyészetből kinyerjük.
10. Eljárás a vér koagulálásának megakadályozására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy á 9. igénypont szerint előállított, és ott meghatározott aminosavszekvencíát tartalmazó hirudinszerű fehérjét a szokásos gyógyszerészeti hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk.