DE3587422T2

DE3587422T2 - Für ein hirudinähnliches protein kodierende dns-sequenz und verfahren zur herstellung eines solchen proteins.

Info

Publication number: DE3587422T2
Application number: DE86900122T
Authority: DE
Inventors: Ernest Fink; Elke Fortkamp; Michael Rieger; Reinhold Sommer
Original assignee: Ciba Geigy AG; UCP Gen Pharma AG
Current assignee: Novartis Ag Basel Ch Ucp Gen-Pharma Ag Kirchber
Priority date: 1984-12-13
Filing date: 1985-12-12
Publication date: 1993-10-21
Anticipated expiration: 2005-12-13
Also published as: ZA859437B; DE3445517A1; DE3587422D1; WO1986003517A1; ATE90944T1; DE3445517C2; EP0236330B1; AU5233686A; JPH0811760B2; HUT46061A; JP2531652B2; JPS62501414A; EP0236330A1; AU597238B2; JPH0770188A; HU204564B

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die für ein hirudinähnliches Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin codiert. Weiters betrifft die Erfindung rekombinante DNA-Moleküle, d. h. Klonierungs- und Expressionsvektoren, für die Verwendung bei der Herstellung eines hirudinähnlichen Proteins mit der biologischen Aktivität von Hirudin und auf Wirtsorganismen, wie Bakterien, Hefen und Säugerzellen, die mit solchen Vektoren transformiert wurden. Schließlich betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein hirudinähnliches Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin enthalten.
Das Setzen von Blutegeln (Hirudo medicinalis) ist eine der ältesten bekannten Therapieformen. Man kann zeigen, daß schon in prähistorischer Zeit Blutentnahme als therapeutische Behandlung durchgeführt wurde.
Tausende Jahre lang stellte die Blutegeltherapie ein therapeutisches Verfahren dar, das bessere Ergebnisse brachte als die bloße Blutentnahme. Über die Wirkungsweise war jedoch nichts bekannt.
Die erste historische Therapie unter Verwendung von Blutegeln wurde von dem griechischen Arzt Nikander von Colophon vor fast 2200 Jahren angewandt; Themison von Laodicea, ein Schüler von Äsculap, wird jedoch als der tatsächliche Begründer dieser Therapieform betrachtet. Im Mittelalter wurden die Blutegel im allgemeinen zu Heilzwecken, nicht nur von den Badern, den Krankenpflegern jener Zeit, sondern insbesondere auch von den Ärzten angewandt.
Ein Blutegel kann bis zu 15 Kubikzentimeter Blut in wenigen Minuten aufnehmen. Er würde an dieser Nahrung ersticken, wenn er das Blut nicht am Koagulieren hindern könnte. Bereits in der Wunde mischt der Blutegel ein Antikoagulans unter das Blut. Die Absonderung eines Thrombin-Antagonisten ist für den Blutegel absolut lebensnotwendig. Der Blutegel produziert den Thrombin-Antagonisten in seinen Jugulardrüsen.
Die gerinnungshemmende Eigenschaft verbessert die Blutzirkulation, erhöht die Blut- und Lymphdurchflußmenge um ein Mehrfaches und hat einen vasospasmolytischen Effekt. Weiters hat dieses Sekret antibiotische Eigenschaften, die nur das Bakterium Pseudomonas überlebt. Dieses Bakterium verdaut das gespeicherte Blut und verwandelt es in Nahrung. Wenn dieses Bakterium zerstört wird, stirbt der Blutegel, da der Blutegel ohne das Bakterium nicht lebensfähig ist. Dadurch wird verständlich, wieso der Blutegel für die Menschen jahrtausendelang hilfreich war. Sein Sekret ist antithrombotisch, entzündungshemmend, ödemreduzierend, beschleunigt die Geschwindigkeit des Blut- und Lymphstroms, ist vasospasmolytisch und antibiotisch. Es ist also eine äußerst wirksame Substanz. Kleine Mengen in einem von einem Blutegel verursachten Biß (der Biß schmerzt übrigens nicht, sondern verursacht nur ein leichtes Jucken) verhindern die Blutgerinnung bis zu 10 Stunden lang.
Nachdem Asepsis und Antisepsis die direkte Therapie mit Blutegeln beendet hatten, suchten Fachleute auf der ganzen Welt nach einer Methode zur Isolierung der aktiven Substanz, um sie wieder bei der Therapie einzusetzen. 1884 wurde zum ersten Mal ein Antikoagulans-Extrakt aus Blutegeln erhalten. Später wurde die aktive Substanz aus dem Blutegel teilweise von Fremdprotein gereinigt. Das erhaltene Rohmaterial wurde als Hirudin bezeichnet.
Hirudin ist ein hochmolekulares Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 7000 und entzündungshemmenden und ödemreduzierenden Eigenschaften. Die Analyse der hemmenden Wirkung auf die individuellen Phasen des Gerinnungssystems zeigte, das es ein spezifischer Hemmstoff des Enzyms Thrombin war, der mit keinem anderen Gerinnungsfaktor reagiert und seine Wirkung ohne Mitwirkung anderer im Blut anwesender Komponenten hervorruft. Hirudin verhindert also die Blutgerinnung durch Abfangen des Reaktionsproduktes der ersten Gerinnungsphase, nämlich des Thrombins, und verhindert daher das Auslösen der zweiten Gerinnungsphase, nämlich der Bildung von Fibrin.
Hirudin ist daher ein spezifischer Thrombin-Antagonist (Jui-Yoa Chang, FEBS Lett. Vol. 164, S. 307 (1983)). Bisher wurde Hirudin aus Blutegeln isoliert. Aus 70 Blutegeln konnte nur etwa 1 mg Hirudin erhalten werden. Das so erhaltene Hirudin wurde hauptsächlich für Salben zur Verwendung bei der antithrombotischen und antiphlogistischen Venentherapie verarbeitet (P. Walsmann, F. Markwardt, Die Pharmazie, Vol. 36, S. 653 (1981)). In letzter Zeit wurde Hirudin auch bei der Behandlung von Gerinnungsstörungen oder zum Verhindern der Blutgerinnung z. B. während der Hämodialyse verwendet. Weil es aber nur in begrenzter Menge zur Verfügung stand und seine Reinheit nicht ausreichend war, konnte Hirudin bisher nicht in klinischen Versuchen eingesetzt werden.
Die nicht vorveröffentlichten EP-A-158564 und 168342 offenbaren für Hirudin codierende DNA-Sequenzen und ein Verfahren zur Herstellung dieses Proteins. Die vollständige Aminosäuresequenz von Hirudin wurde von J. Dodt u. a. in FEBS Letters, Vol. 165, Nr. 2, S. 180-184 beschrieben.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem ist die Bereitstellung einer für ein hirudinähnliches Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin codierenden DNA-Sequenz und eines Verfahrens, welches die gentechnische Herstellung dieses Proteins in großem Maßstab erlaubt.
Die Erfindung betrifft also den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Der Ausdruck "hirudinähnliches Protein" bezeichnet ein Protein, dessen Aminosäuresequenz der Aminosäuresequenz von natürlichem Hirudin ähnlich ist oder nur einen Teil davon umfaßt und/oder im Gegensatz zum natürlichen Hirudin am Tyrosinrest 63 nicht sulfatiert ist. Erfindungsgemäß werden entsprechende Fusionsproteine auch als hirudinähnliche Proteine bezeichnet. Die Bezeichnung "Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin" bezieht sich auf ein Protein, das mit natürlichem Hirudin nicht identisch sein muß daß aber dennoch die biologische Aktivität von natürlichem Hirudin aufweist. Es agiert also gegenüber Proteinen wie Thrombin wie natürliches Hirudin, und/oder es hat immunologische Eigenschaften von natürlichem Hirudin.
Es ist bekannt, daß die Desulfatierung von Hirudin nur eine geringe Reduktion der biologischen Aktivität von Hirudin verursacht (Jui-Yoa Chang, FEBS Lett., Vol. 164, S. 307 (1983)).
Für die Herstellung eines hirudinähnlichen Proteins mit der biologischen Aktivität von Hirudin durch Gentechnik werden die folgenden Schritte durchgeführt:
Zuerst werden die in der Tabelle I angeführten Oligodesoxyribonucleotide unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes synthetisiert. Diese Synthese basiert auf der von J. Dodt, H.P. Müller, U. Seemüller und Jui-Yoa Chang in FEBS Lett., Vol. 615, S. 180 (1984) beschriebenen Aminosäuresequenz. Es werden überwiegend die von E.coli am häufigsten verwendeten Codons verwendet.
Es wird darauf geachtet, daß sich am 5'-Ende des synthetischen Gens ein ATG-Codon befindet, weil in diesem Fall wahlweise das entsprechende Protein durch CNBr-Spaltung von einem Fusionsprotein abgespaltet werden kann. Die so erhaltenen Oligodesoxyribonucleoude werden gereinigt und mit Polynucleotid-Kinase und γ-³²P-rATP phosphoryliert wegen der in einer späteren Stufe auszuführenden Ligation.
Die Produkte dieser Reaktion werden durch präparative Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese gereinigt. Anschließend werden die jeweiligen (+) und (ω)-Stränge (komplementäre Stränge) hybridisiert, ligiert, um Genfragmente zu ergeben, die dann durch präparative Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese gereinigt werden und zu einem vollständigen synthetischen Gen verbunden (Fig. 1). Das so erhaltene Gen kann für die Isolierung des natürlichen Gens aus genomischen Banken oder cDNA-Banken verwendet werden.
Dieses synthetische Gen wird in den Vektor pEMBL 8+ (hinterlegt bei DSM, Göttingen, BRD, unter der Hinterlegungsnummer DSM 3139) inseriert, der den Promotor lac UV5 enthält. Natürlich können auch andere Expressionskontrollsequenzen verwendet werden, z. B. das E.coli-tac-System, das E.coli-trp-System, der E.coli-Lipoprotein-Promotor, Hefe-Expressionskontrollsequenzen oder andere eukaryotische Expressionskontrollsequenzen.
Was in diesem Zusammenhang wichtig ist, ist die operative Verknüpfung des Gens mit der Expressionskontrollsequenz sowie die Selektion einer geeigneten Expressionskontrollsequenz für einen speziellen Wirtsorganismus.
Nachdem der rekombinante Expressionsvektor konstruiert wurde, wird er in einen transformierbaren Wirtsorganismus inseriert, wie E.coli-Bakterium, z. B. E.coli OM 214 (Stammsammlung Prof. G. Schütz, Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg; DMS Göttingen, Hinterlegungsnummer DSM 3138). In Abhängigkeit von der Expressionskontrollsequenz können andere Bakterien, Hefen und tierische oder menschliche Zellen auch als Wirtsorganismus verwendet werden. Ein hirudinähnliches Protein synthetisierende Transformanten werden durch ihre Ampicillinresistenz und die Reaktion mit Anti-Hirudin-IgG-Antikörpern identifiziert.
Schließlich wird das erfindungsgemäß hergestellte hirudinähnliche Protein hinsichtlich seiner biologischen Aktivität gegenüber dem Enzym Thrombin, das eine Schlüsselrolle bei der Blutgerinnung spielt, untersucht.
In diesem Zusammenhang zeigt sich, daß erstens das von Bakterien produzierte hirudinähnliche Protein die Reaktion von Fibrinogen zu Fibrin durch Thrombin inhibiert und daß zweitens mit diesem Protein auch die Transformation einer chromogenen Substanz durch Thrombin inhibiert werden kann. Daraus kann man ersehen, daß das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Protein die biologische Aktivität von Hirudin hat.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für die Behandlung von Gerinnungsstörungen des Blutes oder zum Verhindern der Blutgerinnung können unter Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins bzw. seines Bromcyan-Spaltproduktes hergestellt werden. Wahlweise können pharmazeutisch verträgliche Additive und Verdünnungsmittel zugesetzt werden.
Fig. 1 zeigt die vollständige DNA-Sequenz des synthetischen Gens. Die schwarzen Pfeile bezeichnen die Grenzen der synthetisierten einzelsträngigen Oligodesoxynucleotide, die Subfragmente I, II und III sowie das Linkerfragment sind umrandet. Weiters wird die entsprechende Aminosäuresequenz über der DNA-Sequenz gezeigt. Fig. 2 zeigt das rekombinante Plasmid pRudi 1 mit einem inserierten synthetischen EcoRI-BamHI-Fragment. Das synthetische Fragment wurde in den Polylinker inseriert, der im Alpha-Fragment des β-Galactosidase-Gens von Plasmid pEMBL 8+ lokalisiert ist. Die ersten Aminosäuren des Alpha-Fragments bilden das beschriebene Fusionsprotein zusammen mit den Aminosäuren von Hirudin. Fig. 3 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des Fusionsproteins, für das Klon pRudi 1 codiert. Die Aminosäuren, die natürlichem Hirudin entsprechen, werden mit Großbuchstaben beginnend angegeben.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung. Sie werden nur zu Illustrationszwecken angeführt und sollen keinesfalls den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.

Beispiel 1:

Synthese einer für ein Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin codierenden DNA-Sequenz:

Die in der Tabelle 1 angeführten Oligodesoxyribonucleotide werden unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes (Applied Biosystems Model 380A) synthetisiert. Tabelle I: Synthetisierte Oligonucleotide
Das Syntheseprogramm ist ABI 003 5/17/84. Die verwendeten Chemikalien sind ebenfalls von Applied Biosystems, wie auch das LCAA/CPG (langkettiges Alkylamin-Controlled Pore Glass), das mit Nucleosid-3-O-Succinat (etwa 30 umol/g) funktionalisiert wurde. Jede Synthese wird mit 1 umol Nucleosid gestartet. Die Synthese wird in jedem Fall mit dem "trityl off, auto"-Spaltungsmodus beendet, mit dem die säureinstabile 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-Gruppe vor der Behandlung mit Thiophenol und Ammoniak entfernt wird. Die ammoniakalischen Lösungen der Produkte des Synthesegerätes werden in verjüngte Flaschen transferiert, und die ursprünglichen Glasbehälter werden jeder mit etwa 10 ml 25%iger Ammoniaklösung gespült.
Die Flaschen werden sorgfältig verschlossen und dann 14 Stunden auf 50ºC erhitzt. Anschließend wird die Lösung im Ölpumpenvakuum zur Trockne eingeengt, und jedes Produkt wird in 500 ul 20 mM Triethylammoniumbicarbonat-Puffer (TEAB), pH 7,4, gelöst.
Ein Zehntel jedes Roh-Oligomers wird dann durch Ionenaustausch-HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie) gereinigt. Das Latek HPLC-System umfaßt zwei P 400 Lösungsmittelpumpen, eine automatische Gradientenregelung, ein Rheodyne 7125 Injektionselement mit einer 100-ul- Probeaufnahmeschleife, einen Milton Roy Modell 1204 A UV-Detektor (Detektionswellenlänge 280 nm, Empfindlichkeit 1,0) und einen Shimadzu C-R3A Schreiber. Die Latek Partisil 10 SAX HPLC-Säule (4 mm Durchmesser) befindet sich in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 50ºC, und die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 2 ml/min. Für die Trennung wird ein linearer Gradient der Lösungsmittel A und B von 20 bis 60% B für 45 Minuten verwendet (Lösungsmittel A = 40% (v/v) 1 mM Triethylammoniumphosphat, pH 6,3, 60% (v/v) Formamid; Lösungsmittel B = 40% (v/v) 500 mM Triethylammoniumphosphat, pH 6,3, 60% (v/v) Formamid). Um diese Lösungen herzustellen, wird analysenreines (p.a.) Formamid verwendet, das 5 Stunden mit 40 g/l Bio Rad AG 501-XB Ionenaustauscher (p.a.-Mischbett-Harz) gerührt worden ist. Die Elution wird sorgfältig beobachtet, und die Fraktion mit der letzten eluierten UV-aktiven Substanz (üblicherweise die Hauptabsorption) wird manuell gesammelt. Zum Entsalzen wird dieser Fraktion destilliertes Wasser im Verhältnis 1 : 1 zugesetzt. Die Fraktion wird dann auf eine 3 ml-Octadecyl(C&sub1;&sub8;)-Einwegsäule (J.T. Baker 7020-3) aufgebracht, die mit 3 ml Methanol, 200 mM TEAB, pH 7,4/30% Acetonitril bzw. 200 mM TEAB, pH 7,4, vorgewaschen wurde. Danach wird die Säule zweimal mit jeweils 3 ml von dem gleichen Puffer gespült. Das Produkt wird anschließend der Elution mit 2·3 ml 200 mM TEAB, pH 7,4/80% Methanol (H. Blöcker, R. Frank und Assistenten, EMBO-Kurs, Braunschweig, September 1984, Manual) unterworfen. Nach Einengen zur Trockne im Ölpumpenvakuum wird das gereinigte Oligodesoxyribonucleotid in 1 ml 20 mM TEAB, pH 7,4, aufgenommen und die Absorption wird bei 260 nm bestimmt.
500 Picomol von jedem Oligomer werden für die quantitative Phosphorylierung eingesetzt. Die molaren Extinktionskoeffizienten werden berechnet, indem man die individuellen Extinktionskoeffizienten der Nucleotide addiert, ohne daß man die hypochromatischen Effekte berücksichtigt. 500 Picomol jedes Oligonucleotids wurden in 15 ul destilliertem Wasser und 2 ul 10 · PNK-Puffer (500 mM Tris-HCl, pH 7,6,100 mM MgCl&sub2;, 50 mM DTT, 10 mM Spermidin) suspendiert und dann 10 Minuten auf 70ºC gehalten. Die Mischung wurde anschließend abgekühlt und auf 1 uM rATP eingestellt, dann wurden 1 uCi Adenosin-5'-(γ-³²P)-triphosphat, Triethylammoniumsalz (6000 Ci/mMol, Amersham Buchler GmbH & Co. KG, Braunschweig) und 1 ul Polynucleotidkinase (4,5 U, Boehringer Mannheim) zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 37ºC inkubiert. Nach 15 Minuten wurde 1 ul 10 mM rATP zugesetzt und die Inkubation wurde weitere 15 Minuten fortgesetzt und durch Zugabe von 10 ul Harnstoffmischung (10 mM Harnstoff, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenol- Blau, 0,05% Xylolcyanblau) gestoppt. Vor der Gelbeladung wurde das Gemisch eine Minute auf 95ºC gehalten.
Ein denaturierendes Polyacrylamidgel (60 cm lang, 0,1 cm dick; 8% Acrylamid, 8,5 M Harnstoff, 1 · TBE (89 mM Tris-Base, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA)) wurde bei 30 Watt 2 Stunden vorlaufen gelassen. Die denaturierten Phosphorylierungsreaktionen wurden dann aufgegeben. Die Elektrophorese wurde bei 30 Watt durchgeführt, bis das Bromphenol-Blau 45 cm gewandert war. Eine der Glasplatten wurde abgehoben, das Gel mit Saran abgedeckt, und ein Röntgenfilm wird 1 Stunde exponiert. Die Banden, die den Oligonucleotiden mit Gesamtlänge entsprachen, wurden einschließlich der Gelmatrix herausgeschnitten. Die Matrix wurde zerkleinert und in 300 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,1 mM EDTA) suspendiert.
Die Oligonucleotide wurden 3 Stunden bei 65ºC eluiert. Dann wurde die Gelmatrix bei 12000 UpM 10 Minuten hinunterzentrifugiert, und der Überstand wurde in Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat, pH 10, und Glycogen als Carrier mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde zweimal mit 80%igem Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer zu einer Endkonzentration von 2 Picomol Nucleotid/ul aufgenommen.
In einem ersten Schritt wurden 50 Picomol einzelsträngiges Oligonucleotid zum entsprechenden entgegengesetzten Strang in einem Gesamtreaktionsvolumen von 100 ul (50 mM NaCl, 2 · TE, pH 8) hybridisiert. Die Gemische wurden auf 90ºC erhitzt, 2 Minuten auf dieser Temperatur in einem Wasserbad gehalten, welches man dann über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen ließ.
Subfragmente wurden ligiert unter Verwendung von 20 ul jeder Annealing-Mischung (Subfragment I: R1 + R2 plus R3 + R4, Subfragment II: R5 + R6 plus R7 + R8, Subfragment III: R9 + R10 plus R11 + R12, Subfragment IV: R13 + R14 wurden ligiert, um ein Dimer zu bilden) in einem Gesamtvolumen von 100 ul (50 mM Tris-HCl, pH 7,5,10 mM MgCl&sub2;, 5 ug BSA, 1 mM Spermidin, 1 mM ATP, 10 U T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim)).
Die Inkubation erfolgte 4 Stunden bei 17ºC und wurde durch 10minütiges Erhitzen auf 70ºC gestoppt. Das Gemisch wurde einer Ethanol-Fällung in Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat, pH 10, und Glycogen als Carrier unterworfen, zweimal mit 80%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 30 ul TE-Puffer, pH 8, aufgenommen. 20 ul jedes Ligationsgemischs wurden mit 5,5 ul Beladungspuffer (20% Ficoll 400 (Pharmacia, Uppsala, Schweden), 2% SDS, 0,05% Bromphenolblau, 0,05% Xylolcyanolblau) vermischt und 5 Minuten auf 70ºC erhitzt.
Ein nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel (40 cm lang, 0,01 cm dick, 10 % Acrylamid, 1 · TBE) wurde 2 Stunden bei 200 Volt vorlaufen gelassen, dann wurden die Ligationsproben aufgebracht. Die Elektrophorese wurde bei 300 Volt in 1/2 · TBE 7 Stunden durchgeführt, bis Bromphenolblau 25 cm wanderte. Das Gel wurde 12 Stunden autoradiographiert.
Die der erwarteten Länge entsprechenden Fragmente wurden herausgeschnitten und wie beim ersten Gel beschrieben eluiert. Das getrocknete DNA-Pellet wurde in 20 ul TE-Puffer aufgenommen.
Ungefähr 1 Picomol (10 ul Subfragment-Zubereitung) jedes Subfragments wurde in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 ul unter den gleichen Bedingungen wie zuvor beschrieben ligiert. Die Inaktivierung des Enzyms und die Konzentration der DNA erfolgten wie bereits beschrieben. Das DNA-Pellet wurde in 8 ul TE aufgenommen.
Die Gesamtsequenz des synthetischen Gens wird auch in Fig. 1 gezeigt.

Beispiel 2:

Konstruktion eines Vektors für Klonierung, Expression der synthetisierten DNA-Sequenz und Transformation von E.coli OM 214:

Da das synthetisierte Gen über seine EcoRI- und BamHI-Klonierungsstellen Multimere bilden kann, wurde die Zubereitung vor der Ligation mit dem Vektor mit EcoRI und BamHI verdaut. 5 ul der Ligationsreaktion wurden mit 40 Einheiten EcoRI und 30 Einheiten BamHI in einem Gesamtvolumen von 40 ul (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT) bei 37ºC eine Stunde verdaut. Danach wurde die DNA mit Ethanol in Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat, pH 10, gefällt, zweimal mit 80%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 24 ul TE aufgenommen.
10 ug Plasmid-DNA von PEMBL8+ (Dente L, Cesareni G. und Cortese R. (1983), Nucleic Acids Res. 11, 1645-1655) wurden mit 40 Einheiten EcoRI, 30 Einheiten BamHI verdaut und mit 2,5 Einheiten Kälberdarm-Phosphatase (Boehringer Mannheim) dephosphoryliert, in einem Gesamtreaktionsvolumen von 100 ul, 1 Stunde bei 37ºC. Der Reaktionspuffer war 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von EGTA zu einer Endkonzentration von 25 mM und 10minütiges Erhitzen auf 70ºC gestoppt, dann mit 150 ul 80%igern gepuffertem Phenol, pH 7,5, extrahiert. Die obere Phase wurde auf eine Gelfiltrationssäule aufgebracht, gefüllt mit Sephadex G 100 (Pharmacia, Uppsala, Schweden; Gesamtbettvolumen: 2 ml) und äquilibriert mit 10 mM Ammoniumbicarbonat. Jede Fraktion des Eluats enthielt ungefähr 100 ul. Aliquote dieser Fraktionen wurden auf Agaroseplatten gebracht, die Ethidiumbromid enthielten. Die DNA wurde durch UV-Beleuchtung sichtbar gemacht. Die ersten Fraktionen, die etwa 75% der gesamten DNA enthielten, wurden zusammengefaßt und unter vermindertem Druck getrocknet. Die DNA wurde zu einer Endkonzentration von 0,1 ug DNA/ul TE-Puffer resuspendiert.
Die Menge von 0,05 Picomol der restringierten Insert-DNA wurde mit 0,1 Picomol der hergestellten Vektor-DNA in einem Gesamtvolumen von 20 ul (50 mM Tris, pH 7,5; 10 mM MgCl&sub2;; 1 ug BSA; 1 mM Spermidin; 1 mM ATP; 5 Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim)) vermischt. Die Inkubation erfolgte drei Stunden bei 14ºC. Nach Zugabe von 2 ug tRNA aus Kälberthymus (Boehringer Mannheim) und 80 ul TE-Puffer wurde das Gemisch mit 100 ul 80%igem Phenol, pH 7,5-Chloroform-Isoamylalkohol (24 : 24 : 1; Vol.:Vol.:Vol.) extrahiert. 10 ul 3 M Natriumacetat, pH 10, und 1 ul Glycogen (Renner GmbH, Darmstadt, BRD) wurden zugesetzt, und die Lösung wurde mit Ethanol gefällt, zweimal mit 80%igem Ethanol gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet und in 10 ul TE-Puffer wiederaufgelöst. Die Struktur des so erhaltenen Plasmids pRudi 1 wird in Fig. 2 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des Expressionsproduktes wird in Fig. 3 gezeigt. Das Expressionsprodukt ist ein Fusionsprotein mit Aminosäuren des Alpha-Peptids von β-Galactosidase (Positionen 1-8) und mit den Aminosäuren, die dem natürlichen Hirudin entsprechen (Positionen 9 bis Ende).
Die Herstellung von kompetenten Zellen des E.coli-Stamms OM 214 erfolgte nach Standardmethoden. 40 ml Nährlösung (Serva, Katalog-Nr. 48498) wurde mit einer einzelnen Kolonie des E.coli-Stammes OM 214 beimpft. Die Kultur wurde bei 200 UpM und 37ºC etwa 15 Stunden geschüttelt. 4 ml dieser Kultur wurden zu 200 ml frischer Nährlösung zugesetzt. Die Inkubation erfolgte wie zuvor, bis eine Zelldichte von 2·10&sup8; Zellen pro ml erreicht war. Die Kultur wurde schnell auf Eis abgekühlt und 5 Minuten bei 8000 UpM zentrifugiert. Das Sediment der Zellen wurde in 100 ml 30 mM Calciumchlorid-Lösung resuspendiert und 20 Minuten auf 0ºC gehalten, wieder zentrifugiert und erneut in 10 ml Calciumchlorid-Lösung suspendiert. Die Zellen wurden 24 Stunden auf 0ºC gehalten. Dann wurde 1 ml steriles Glycerin zugesetzt, und die Zellen wurden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70ºC gelagert.
Die so erhaltenen eingefrorenen kompetenten E.coli-Zellen wurde auf Eis aufgetaut. Zu 100 ul Zellen wurden 5 ul der gereinigten ligierten DNA zugesetzt. Das Gemisch wurde 20 Minuten auf 0ºC gehalten. Die Zellen wurden genau 4 Minuten bei 37ºC wärmegepulst, um die Aufnahme von Plasmid-DNA zu ermöglichen. Die Zellsuspension wurde auf Eis abgekühlt und 10 Mal in Nährlösung verdünnt und etwa 40 Minuten bei 37ºC inkubiert. Aliquote (1%, 10% und 90%) der Suspension wurden auf Agarplatten plattiert, die 1,5% Agar, Nährlösung und 100 ug Ampicillin pro ml enthalten, was herangezogen wurde, um transformierte Zellen nach ihrer Resistenz gegenüber diesem Antibiotikum zu selektieren. Die Agarplatten wurden 14 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die wachsenden Kolonien wurden ausgewählt und hinsichtlich der Expression eines Fusionsproteins mit Hirudin-Sequenzen mittels ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) geprüft.

Beispiel 3:

Expression der synthetischen DNA-Sequenz und Detektion der Expressionsprodukte:

2,5 ml 2 · YT-Medium, das 60 ug/ml Ampicillin enthält, wird mit individuellen E.coli-Kolonien inkubiert, und die Kulturen werden 6 Stunden bei 37ºC geschüttelt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet, in 1 ml 10 mM NaCl gewaschen und in 250 ul Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8, 30 mM NaCl, 1 mg/ml Lysozym) suspendiert. Nach 30 Minuten bei 0ºC werden die Zellen dreimal bei -70ºC gefroren und bei 37ºC aufgetaut. Die abgekühlten Lysate werden bei 15000 UpM zentrifugiert. Die Überstände werden für den Nachweis von hirudinähnlichen Proteinen behalten.
Der Nachweis von Hirudin in E.coli-Lysaten erfolgt mit einem ELISA-Test. 50 ul einer Anti-Hirudin-IgG-Lösung (Plantorgan, Bad Zwischenahn) und 10 ul/ml IgG in Verknüpfungspuffer (1,59 g Na&sub2;CO&sub3;, 2,93 g NaHCO&sub3;, 0,2 g NaN&sub3;, ad 1 l H&sub2;O) werden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gefüllt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Vertiefungen werden dreimal mit PBS-Puffer (8,0 g NaCl, 0,2 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,9 g Na&sub2;PO&sub4;·12 H&sub2;O, 0,2 g KCl, 0,5 ml Tween 20, 0,2 g NaN&sub3;, ad 1 l H&sub2;O) gespült. Dieser Puffer wird für alle Spülvorgänge verwendet. 50 ul der zu prüfenden Lysate werden verwendet. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur werden die Vertiefungen der Platten dreimal gewaschen, und 50 ul Anti-Hirudin-IgG, die mit alkalischer Phosphatase konjugiert wurden, wurden zugesetzt. Das Konjugat wird mit alkalischer Phosphatase Typ VII T (Sigma) nach der Vorschrift im Katalog "Biochemical and Organic Compounds for Research", Sigma Chemie GmbH Seite 713, hergestellt.
Nach 2stündiger Inkubation bei Raumtemperatur werden die Vertiefungen wieder dreimal gewaschen. Anschließend werden 50 ul des Substrats für alkalische Phosphatase (Sigma 104: p-Nitrophenylphosphat, 1 mg/ml in 10%igem Diethanolamin, 0,1 mg/ml MgCl&sub2;·6 H&sub2;O, pH 9,8) zugesetzt. Die Enzymreaktion wird visuell bestimmt. Ein positives Ergebnis, d. h. die Gegenwart von hirudinähnlichem Protein, kann man anhand der Gelbfärbung der Lösung aufgrund der Aktivität der an Anti-Hirudin-IgG gebundenen alkalischen Phosphatase sehen. Eine quantitative Abschätzung des hirudinähnlichen Proteins in E.coli-Extrakten erfolgt durch Vergleich mit einer Verdünnungsreihe einer Hirudin-Standardlösung bekannter Konzentration, die parallel zu den Testproben verwendet wird.
35 E.coli-Klone werden insgesamt getestet. Vier von ihnen zeigen ein positives Ergebnis (Nr. 9, 13, 19, 35). Der Vergleich der Farbreaktion mit der der Hirudin-Standardlösungen zeigte, daß die Klone zwischen 10 und 20 ug/l hirudinähnliches Protein bildeten.

Beispiel 4:

Nachweis der biologischen Aktivität des hirudinähnlichen Proteins:

1 l 2 · YT-Medium, das 60 ug/ml Ampicillin enthält, wird mit 10 ml einer Übernachtkultur des E.coli-Klons Nr. 9 inkubiert und bei 37ºC geschüttelt. 5 ml 100 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thio-galacto-pyranosid; Boehringer Mannheim) werden nach 1 Stunde zugesetzt, um die Expression des synthetischen Gens zu induzieren. Nach weiteren 5 Stunden werden die Zellen geerntet, in 100 ml Lyse-Puffer suspendiert und wie oben beschrieben lysiert. Das Lysat wird auf eine Endkonzentration von 10 mM mit 1 mM MgCl&sub2; gebracht, und 10 mg DNase I werden zugesetzt. Nach 15 Minuten bei 37ºC wird das Lysat 15 Minuten bei 70ºC inkubiert. Ausgefälltes Protein wird zentrifugiert, der Überstand wird auf einen pH von 4,5 mit Trichloressigsäure (6%ig) titriert. Kaltes Aceton wird zu einer Endkonzentration von 50% zugesetzt. Nach 2 Stunden bei 0ºC wird der Niederschlag abzentrifugiert. Dem Überstand wird kaltes Aceton zu einer Endkonzentration von 80% zugesetzt. Dann wird 2 Stunden auf 0ºC gehalten. Der Niederschlag wird dann wieder zentrifugiert, das Aceton bei 37ºC abgedampft, und der Niederschlag wird in 2 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7, gelöst.
Anschließend wird ein Gerinnungstest mit dem E.coli-Extrakt durchgeführt. Der Gerinnungstest basiert auf der spezifischen Inhibition von Thrombin durch Hirudin oder ein Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin. Eine gegebene Menge Thrombin wird einer Fibrinogen-Lösung bekannter Konzentration zugesetzt. Durch dieses wird die Umwandlung in Fibrin katalysiert und innerhalb einer bestimmten Zeit registriert. Wenn Hirudin oder ein Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin der Fibrinogen-Lösung in steigender Menge zugesetzt wird, wird die Gerinnung verhindert, solange kein Überschuß an Thrombin vorliegt. Der Wendepunkt kann anhand der Gerinnung der Probe erkannt werden.
Der Test wird wie folgt durchgeführt: 100 ul einer Fibrinogen-Lösung (60 mg/ml in 0,85%iger NaCl) und 100 ul der zu untersuchenden Probe in 50 mM Tris-HCl, pH 7 (Puffer oder Hirudin- Standardlösung oder E.coli-Extrakte) werden zu 100 ul 50 mM Tris-HCl, pH 7, zugesetzt. Dann werden 5 ul Thrombin (30 IU/ml in 0,85%iger NaCl; Behring-Werke) zugesetzt. Das Ganze wird sorgfältig vermischt. Nach einminütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden die Teströhrchen um 180º gedreht. Ein positives Ergebnis, d. h. Inhibierung des Thrombins, kann man sehen, wenn die Lösung aus dem Röhrchen fließt, wohingegen im Falle eines negativen Ergebnisses die Gerinnung nicht verhindert wird und das Fibrin-Gel am Boden des Röhrchens bleibt.
Angereicherter Extrakt von dem E.coli-Klon Nr. 9 inhibiert die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin, wohingegen ein gleich behandelter E.coli-Extrakt, der das Hirudin-Gen nicht enthält, keine Inhibierung zeigt. Ein Vergleich mit Hirudin-Standardlösungen zeigt, daß die biologische Aktivität des hirudinähnlichen Proteins aus E.coli einer Hirudin-Konzentration von 120 ng/ml entspricht.
Die Hirudin-Aktivität der E.coli-Extrakte wird weiters durch ihre Fähigkeit, die Thrombin-Aktivität gegenüber einem chromogenen Substrat zu inhibieren, gemessen. In dieser Reaktion spaltet Thrombin die gelbe Verbindung p-Niroanilin vom chromogenen Substrat Tos-Gly-Pro-ArgpNA (Chromozyme TH, Boehringer, Mannheim). In dem Test werden 890 ul Diethanolamin-Puffer (150 ul/l, pH 8,4) mit 20 ul einer Thrombin-Lösung (5 IU/ml in 0,25 M Phosphatpuffer, pH 6,7) gemischt. Dazu werden 50 ul einer hirudinhaltigen Lösung (· ng Hirudin in Diethanolamin-Puffer für Eichung oder E.coli-Extrakt) zugegeben und 5 Minuten bei 25ºC inkubiert.
Anschließend werden 125 ul einer Chromozym-Lösung (1,5 mM in Diethanolamin-Puffer) zugesetzt, und die Extinktion der Mischung wird bei 405 nm im Photometer (Shimadzu) alle 60 Sekunden 6 Minuten lang gemessen. Die Zunahme der Extinktion sind ein Maß für die Thrombin-Aktivität und reziprok zur Hirudin-Aktivität.

Claims

1. DNA-Sequenz,

die für ein hirudinähnliches Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin codiert.

2. Rekombinantes DNA-Molekül für die Klonierung, eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 enthaltend.

3. Rekombinantes DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 umfaßt, die operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskontrollsequenz ein E.coli- Promotorsystem, das E.coli-lac-System, das E.coli-β-Lactamase-System, das E.coli-trp-System, der E.coli-Lipoprotein-Promotor, eine Hefe-Expressionskontrollsequenz oder eine andere eukaryotische Expressionskontrollsequenz ist.

5. Wirtsmikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mit zumindest einem der rekombinanten DNA-Moleküle nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 4 transformiert ist.

6. Wirtsmikroorganismus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß er E.coli ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines hirudinähnlichen Proteins mit der Aminosäuresequenz

und der biologischen Aktivität von Hirudin, dadurch gekennzeichnet, daß ein Wirtsorganismus mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 3 oder 4 transformiert wird und daß das durch Expression und Kultivierung des Transformanten erhaltene hirudinähnliche Protein isoliert wird.