KR970005913B1

KR970005913B1 - 항혈액응고 작용을 갖는 폴리펩티드

Info

Publication number: KR970005913B1
Application number: KR1019890010107A
Authority: KR
Inventors: 아끼오 이와사끼; 마꼬또 수다; 유시 사이노
Original assignee: 코와 가부시끼가이샤; 미와 다까야수
Priority date: 1988-07-21
Filing date: 1989-07-15
Publication date: 1997-04-22
Also published as: JPH0232099A; ES2064391T3; JP2701047B2; CA1338401C; EP0351826A3; EP0351826B1; DE68918519D1; KR900001847A; DE68918519T2; EP0351826A2

Abstract

내용 없음.

Description

항혈액응고 작용을 갖는 폴리펩티드

제1도는 X가 메티오난 잔기(Met), 아세틸 또는 수소원자인 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고,

제2도는 본 발명의 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타내고,

제3도는 본 발명의 cDNA 삽입 단편의 제한 엔도뉴클레아제 맵(map)을 제공하고,

제4도는 본 발명의 재조합 플라스미드의 제한 엔도뉴클레아제 맵, pKS I 64 및 pKS I 61를 제공한다.

제5도는 본 발명의 cDNA의 전체 뉴클레오티드 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열을 나타내고,

제6도는 본 발명의 재조합 플라스미드 pKS I 73을 조제하는 방법을 나타내는 스킴을 나타내며,

제7도는 본 발명의 펩티드를 발현시키기 위한 재조합 플라스미드 pKS I X205를 조제하는 방법을 예시한 스킴을 나타내며,

제8도는 SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동으로 부터 얻은 본 발명의 폴리펩티드의 웨스턴 블로팅의 프로필이다.

본 발명은 사람태반에서 유래되는 사람조직으로 부터 입수할 수 있는 항혈액응고물질(이하, CPBⅡ라 함)과 같은 항혈액응고 활성을 갖는 폴리펩티드, 폴리펩티드를 코드할 수 있는 DNA, 이 DNA를 함유하는 재조합 벡터, 이 재조합 벡터를 함유하는 형질전환체 세포, 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 항혈액응고제 및 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 종래, 항혈액응고 물질로서는 헤파린, 헤파린 조인자-Ⅱ, 안티트롬빈-Ⅲ, α₂-마크로글로블린, α₂-트립신억제인자, C₁-에스테라제 인히비터, 프로테인 C 등이 알려져 있으나 실용적으로 제공되는 것은 헤파린 뿐이다. 그러나 헤파린은 출혈 경향을 초래하는 부작용을 갖고 있기 때문에 그의 사용방법 및 사용량이 극히 한정되어 있으므로, 항혈액응고제로서는 안전성의 견지에서 만족하지 못하였다. 이와 같은 상황에서, 본 발명자는 이미 사람 태반으로 부터 CPB Ⅱ를 분리, 정제하는데 성공하고 이를 특허출원하였다(특원소 60-243778호). CPBⅡ는 하기 특성을 갖는 의약품으로 유용한 물질이다.

(1) 분자량(SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동, 환원상태) : 73,000±2,000

(2) 등전점(암포라이트를 사용하는 등전컬럼 전기영동) : 6.2∼6.6.

(3) 안정성 :

(a) 50℃, 30분 가열처리하여 불활화

(b) pH 5.5∼8.5에서, 안정(37℃)

(c) 혈장중 37℃, 15분에서 안정

(a) 칼슘 재첨가 시간을 연장

(b) 프로트롬빈 시간을 연장

(c) 활성화 트롬보플라스틴 시간을 연장

(5) 아미노산 분석

아미노산 분석에서, 아스파르트산, 트레오닌, 세틴, 글루타민산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 시스틴, 발린, 메티오닌, 이소로이신, 로이신, 티로신, 페닐알라닌, 히스티딘, 리진 및 알기닌의 존재가 확인됨. 또한 본 출원인은 CPBⅡ에 특이적인 모노클로날 항체를 작성하고 이를 특허출원하였다(특원소 63-86753호), 이들 모노클로날 항체를 사용하여 CPBⅡ의 고감도분석, 정제 등을 수행하는 것이 가능하다. 그러나, 현재 CPBⅡ를 얻기 위하여는 사람 태반을 비롯한 사람조직을 원료물질로 하는 것은 필수불가결한 것이기 때문에 여러 가지 문제가 발생한다. 즉, 사람조직으로 부터 입수할 수 있는 CPBⅡ의 양에 대한 제한이 있는 것, 원료물질인 사람조직의 수집에 관한 어려움이 수반하여 안정하게 공급하는 것이 곤란한 것, 사람조직에 존재할 수 있는 바이러스의 위험성은 무시할 수 없는 것 등이다. 따라서, 보다 저가, 보다 대량으로 그리고 보다 안전하고 안정하게 CPBⅡ 또는 이와 같은 작용을 갖는 물질을 공급하는 방법의 개발에 요망되어 왔다. 본 발명자는 이러한 문제를 해결하기 위하여 광범위하게 검토한 결과, 사람 태반 cDNA 라이브러리로 부터 CPBⅡ-특이항체를 프로우브로서 사용함으로써 CPBⅡ 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 DNA 단편을 얻을 수 있고, 또한 이 DNA 단편을 재조합 벡터를 이용하여 미생물 세포를 형질전환하고, CPBⅡ 유전자를 발현하도록 함으로써 CPBⅡ-유사 폴리펩티드를 제조할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 재조합 플라스미드 및 형질전환체 세포는 예컨대, 다음의 단계와 같이 제조될 수 있다. 즉, (1) 사람 태반 cDNA 라이브러리로 부터 CPBⅡ-특이 항체를 사용하여 항체 양성클론을 스크리닝하고, (2) 이렇게 분리된 항체-양성 클론으로 부터 재조합 DNA를 조제하고, 재조합 DNA로 부터 cDNA 단편을 제한효소처리에 의해 떼어내고, 플라스미드 벡터에 결합하고, (3) 얻어진 cDNA 재조합 벡터로 부터 숙주세포를 형질 전환함으로써 본 발명의 형질전환체 세포를 얻는다. 이렇게 얻어진 본 발명의 형질전환체 세포를 배양함으로써, 균체중에서 본 발명의 DNA 단편을 함유하는 본 발명의 재조합 벡터를 얻는다. 이렇게 얻어진 재조합 벡터를 적당한 제한효소로 절단함으로써 본 발명의 DNA 단편을 얻는다. 이하, 상기 각 공정에 대하여 상세히 설명한다.

(1) 사람 태반 cDNA 라이브러리로 부터 항체-양성 클론의 스크리닝 :

cDNA 라이브러리는 사람 태반으로 부터 mRNA를 조제하고, 역전사 효소(reverse trascriptase)와 적당한 벡터를 사용하여 작성할 수 있으나, 시판되는 cDNA 라이브러리, 예컨대, 클론테크래보러토리즈 인코포레이트(Clontech Laboratories, Inc.)제 사람 태반 cDNA 라이브러리(λgell)가 이용될 수도 있다. 벡터로서 λgell를 사용하여 제조되는 cDNA 라이브러리는 특이항체를 프로우브로서 영 및 데이비스에 의해 제안된 방법[Huynh, T.V. Young, R.A. and Davis, R.W.(1985) In : DNA Cloning : A practical Approach, Vol. 1, (D.M. Glover, ed.), pp 49-78, IRL Press, Oxford]을 응용하여 스크리닝하여 특이항체 양성클론을 분리할 수 있다. 프로우브로서 이용하는 1차 항체로는, CPBⅡI-특이항체, 예컨대, 항-CPBⅡ 토끼 폴리클로날 항체, 항-CPBⅡ 마우스 폴리클로날항체 및 항-CPBⅡ 모노클로날 항체를 들 수 있으나, 이들중 항-CPBⅡ 모노클로날 항체, 특히 항-CPBⅡ 마우스 모노클로날 항체가 바람직하다. 항체는 혈청, 복수, 세포배양액 및 정제된 면역글로블린중 어느 하나의 형태로 사용될 수 있다. 항원에 결합된 1차 항체의 검출에는 방사성 요요드(¹²⁵I)가 표지된 프로테인 A 또는 방사성 요오드(¹²⁵I)가 표지된 항-면역글로블린 항체를 사용하여 오토래디오그래피에 의해 행하는 방법, 퍼옥시다제로 표지된 항-면역글로블린 항체 또는 알칼리성 포스파타제로 표지된 항-면역글로블린 항체를 사용하는 효소 항체법에 의해 행하는 방법을 이용할 수 있다. 또한, 항-CPBⅡ 모노클로날 항체는 예컨대, 쾰러 및 밀스타인에 의해 보고된 방법(Nature, Vol 256, 495-497, 1975)에 의해 제조될 수 있다. 즉, 사람의 태반으로 부터 추출, 정제한 CPBⅡ로 마우스를 면역시키고, 마우스로부터 비장세포를 채취하고, 이것과 마우스 골수종 세포와 세포융합시킨다. 세포융합시킨 세포를 HAT 선택 배지를 사용하여 배양함으로써 하이브리도마만 단독으로 증식되도록 한다. 이렇게 얻어진 하이브리도마가 배양된 배양물 또는 하이브리도마를 접종한 마우스의 복수로 부터 모노클로날 항체가 얻어진다.

(2) CPBⅡ cDNA 재조합 벡터의 작성 :

분리된 항체 양성클론으로 부터 영 및 데이브스가 제안한 방법[Huynh, T.V. Young, R.A. and Davis, R.W.(1985) In : DNA Cloning : A practical Approach, Vol. 1, (D.M. Glover, ed.), pp 49-78, IRL Press, Oxford]에 따라서, 재조합 λgell 파아지 DNA를 추출, 정제한다. 정제된 재조합 λgell 파아지 DNA를 제한효소 EcoR I에서 소화시킴으로써 cDNA를 벡터 DNA로 부터 분리할 수 있다. 생성 cDNA를 동일 EcoR I로 소화한 각종 클로닝용 플라스미드 벡터와 재결합하여 재조합 플라스미드를 작성한다. 이용될 수 있는 플라스미드는 예컨대, pBR 322, pBR 325, pUC 18, pTZ18R 등을 들 수 있다.

(3) CPBⅡ cDNA 재조합 벡터에 의한 숙주세포의 형질전환, 본 발명의 재조합 벡터 및 본 발명의 DNA의 조제 : 생성 CPBⅡ cDNA 재조합 벡터를 그의 재조합 벡터가 갖는 유전자 마커(marker)를 최대 범위까지 사용할 수 있는 각종 숙주세포에 도입함으로써 숙주세포가 형질전환된다. 숙주세포로서는 E. coli : K 12주의 각종 변이주, 예컨대 HB 101이, C600K, JM 101, JM 105, X 1776, MV 1304 등이 이용될 수 있으며, 재조합 벡터의 도입에는 칼슘처리에 의한 컴피텐트 세포법 등이 이용된다. 형질전환세포를 유전자 마커에 적당한 선택배지중에 배양시키고, 균체중에서 본 발명의 재조합 벡터가 채취된다. pUC 118 또는 pTZ18R을 벡터로서 사용하는 경우, 얻어진 재조합 벡터를 유지하는 형질전환체 대장균에 헬퍼 파아지 M13K07을 감염시킴으로써 단일가닥 DNA를 조제할 수 있다. 생성 단일가닥 DNA는 디데옥시 시퀀스법[Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. : DNA Sequencing with Chain Terminaning Inhibitors, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 74,5463-54671977)]에 의해 DNA 염기배열을 결정할 수 있다. 상기 염기배열중, 본 발명의 목적으로 하는 폴리펩티드를 코딩하는 부분의 염기배열은 예컨대, 제2도와 같다. 본 발명의 DNA 단편은 전술한 아미노산 배열을 코딩할 수 있는 한, 상기 염기배열에 반드시 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터도 전술한 아미노산 배열을 코당할 수 있는 염기배열을 갖고, 또한 복제할 수 있으면 대장균유래, 고초균유래, 효모유래등 어느 벡터와의 재조합도 좋다. 본 발명의 폴리펩티드는 상기 본 발명의 재조합 벡터를 함유하는 형질전환세포를 배양하고, 그 배양물로부터 채취, 제조할 수 있다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드를 효율좋게 생산하기 위하여는 전사의 하류방향의 순서로 다음 (1)∼(6)의 염기배열,

(1) 프로모터로서 작용하는 염기배열,

(2) 리보솜 결합 부위인 염기배열,

(3) 개시 코돈인 염기배열,

(4) 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 배열을 코딩할 수 있는 염기배열,

(5) 종지 코돈의 염기배열,

(6) 전사 터미네이터로서 작용하는 염기배열을 갖는 발현용 재조합 벡터를 구축하고, 이를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 것이 바람직하다.

이와 같은 발현용 재조합 벡터를 얻기 위한 벡터의 숙주로서는 발테리아와 같은 단세포 미생물, 특히 E. Coli, 비. 섭틸러스, 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 바람직하다. 또한 이러한 목적을 위하여 포유동물의 배양세포가 사용될 수 있다. 대장균이 숙주로 선택되는 경우, E. Coli의 K12주의 각종 변이주, 예컨대 HB 101, C600K, JM 101, JM 105, JM 109, X 1776, MV 1304 등이 이용될 수 있다. 벡터로서 이용되는 DNA는 바람직하기로는 플라스미드이다. 예를 들면, 대장균을 숙주로서 사용할 때, 플라스미드 DNA가 대장균의 세포중에서 플라스미드의 증식에 요구되는 DNA 배열, 예컨대 ColEl 플라스미드의 복제 기점의 DNA 배열을 갖고, 또한 프로모터 및 전사 터미네이터로 작용할 수 있는 DNA 배열을 가지며, 바람직하기로는 형질전환 대장균의 선택 마커인 유전자를 함유한다. 프로모터로서는 예컨대, PL, lac, trp, tac, trc 및lpp와 같은 프로모터를 들 수 있으며, 전사 터미네이터로서는 rrnB 리보좀 RNA 전사 터미네이터 등을 들 수 있다. 선택 마커 유전자로서는 앰피실린 내성 유전자, 가나마이신 내성유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 클로람페니콜 내성유전자 등을 들 수 있다. 이들 유전자는 1종 또는 2종 이상이 사용될 수 있다. 상기 벡터에 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 배열을 코딩할 수 있는 염기배열을 갖는 DNA, 예컨대 본 발명의 DNA 단편을 재조합하는 것은 이를 함유하는 DNA를 적당한 제한효소로 절단하고, 필요하면 적당한 링커를 부가한 후, 적당한 제한효소로 절단한 벡터와 결합시킴으로써 수행될 수 있다. 이용될 수 있는 제한 엔도뉴클레아제로서는 EcoR I, Sph I, Pst I, HindⅢ, BamH I, Xba I, BanⅢ, Sma I 및 Nco I를 들 수 있다. 엑소뉴클레아제Ⅲ, Bal31, S1 뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 Ⅶ, 즉 빈(mung bean) 뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제 I 등의 핵산 수식효소도 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 링커로는 EcoR I 링커, Sma I 링커, Nco I 링커, BamH I 링커, Xho I 링커, HindⅢ링커, Pst I 링커, SpH I 링커 및 Xba I 링커 등이 이용될 수 있다. 얻어진 발현용 재조합 벡터를 컴피덴트세포법, 프로토플라스트법, 칼슘공침법, 전기펄스법 등을 이용하여 숙주세포에 도입하면 본 발명의 폴리펩티드를 효율적으로 생산할 수 있는 형질전환체 세포가 얻어진다. 본 발명의 폴리펩티드는 생성 형질전환체 세포를 배양한 후, 배양된 세포 및 /또는 생성 배양액으로 부터 추출 및 분리함으로서 제조된다. 형질전환체 세포의 배양에 각종 천연 및 합성배지가 사용될 수 있다. 이 배지는 당류, 알코올 또는 유기산염 등의 탄소원; 단백질 혼합물, 아미노산류 또는 암모늄염 등의 질소원; 무기염을 함유하는 것이 바람직하다. 또한 관련 선택 마커 유전자에 상응하는 항생물질 및 비타민을 첨가하는 것이 바람직하다. 만일, 발현의 제어가 가능한 벡터이면, 배양도중에 유전자 발현을 유도하는 조작을 가할 필요가 있다. 배양 후, 원심처리를 행한 배양액과 배양세포로 분별한다. 본 발명의 폴리펩티드가 배양세포중에 축적되면 예컨대 동결해빙, 초음파처리, 프렌치프레스, 효소처리, 호모지나이저 등을 사용하여 세포를 파괴한 후, EDTA, 계면활성제, 요소, 염산구아니딘 등을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 가용화할 필요가 있다. 얻어진 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 생성 배양액 또는 배양세포 추출액을 각종 컬럼 크로마토그래피하여 정제된 본 발명의 폴리펩티드를 얻는다. 컬럼 크로마토그래피로서는 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이와 같이 얻어진 본 발명의 폴리펩티드는 다음의 특성을 갖는다.

(1) 아미노산 배열 :

본 발명의 DNA 단편의 염기배열로부터 번역된 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 배열은 제1도와 같은 것으로 판단된다.

(2) 분자량 :

75,700(아미노산 배열로 부터 추정)

73,000±2,000(SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 환원상태)

본 발명의 폴리펩티드를 항혈액응고제용 유효성분으로 사용하는 경우의 제형으로서는 주사제를 들 수 있다. 주사제로서는 동결건조 분말을 사용시 주사용 증류수, 생리식염수 등에 용해하여 투여하는 형태가 바람직하다. 그의 투여 부위로서는 정맥내가 적당하다. 투여량은 질병의 심각성, 환자의 체중 등에 따라 다르다. 통상 10μg∼10mg/kg/일로 투여하는 것이 바람직하다. 또 본 발명의 폴리펩티드는 상기 투여범위 내에서 전혀 이상이 발견되지 않고 안전하다. 본 발명의 폴리펩티드는 강력한 항혈액응고작용을 나타내므로, 이를 유효성분으로 함유하는 항혈액응고제는 혈액응고활성의 악화로 인한 각종 질병, 예컨대, 뇌경색 및 심근경색 등의 뇌, 심장 및 말초 혈관에 있어서의 혈전증, DI(파종성 혈관내 응고) 등의 예방 및 치료에 유용하다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 사람 태반 유래의 항혈액응고물질(CPBⅡ)과 같은 성질을 갖는 바, 사람에 대해 항원성을 갖지않는 안전한 물질이다. CPBⅡ는 항혈액응고제로서 유용하다 할지라도 사람 태반의 입수곤란으로 인해 대량 생산할 수 없는 결점이 있으나, 본 발명의 폴리펩티드는 대량으로 값싸게 제조할 수 있다.

[실시예]

이하 참고예 및 실시예로서 본 발명을 상세히 설명한다.

참고예 1 :

항-CPBⅡ 모노클로날 항체의 조제 :

(1) 항원(CPBⅡ)의 정제 :

(ⅰ) 5개의 사람 태반(약 2,500g)으로 부터 양수막 등을 제거하고 생리 식염수로 철저히 세척한 후, 세절한다. 이것에 50mM 트리스-염산완충액(pH 7.4) 2리터를 가한 다음, 웨어링 블랜더를 사용하여 파쇄하고, 이어서 다시 폴리트론중에서 마쇄한다. 생성 호모지네이트를 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리하여 침사를 얻는다. 이렇게 수집한 침사에 다시 50mM 트리스-염산완충액(pH 7.4) 2리터를 가하고, 생성혼합물을 폴리트론으로 호모지나이즈한 다음, 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리하여 세정 침사를 얻는다. 상기 조작을 여러번 반복하여 혈액 성분을 제거하여 세정침사를 약 900g을 얻었다.

(ⅱ) 상기 조작(ⅰ)에서 얻어진 침사 900g에 50mM EDTA를 함유하는 50mM 트리스-염산완충액(pH 7.4) 약 2리터를 가한 다음 웨어링 블랜더로 호모지나이즈한다. 생성 호모지네이트를 4℃에서 하룻밤 동안 교반하고 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리하여 추출액 2리터를 얻었다.

(ⅲ) 상기 (ⅱ)에서 얻어진 추출액에 고체 황산암모늄을 가해 35%포화로 하고, 4℃에서 30분 내지 수시간 방치한 다음, 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리하고 상층액을 수집한다. 상층액에 황산암모늄을 85%포화로 하고, 4℃에서 2시간 동안 방치한 다음, 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리하여 침사를 수집한다. 이렇게 얻어진 침사를 20mM 트리스-염산완충액의 소량에 녹이고, 동일 완충액에 대해 4℃에서 하룻밤 동안 충분히 투석 했다. 투석중 형성된 침전물을 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리하여 제거하여 투석액 390ml를 얻었다.

(ⅳ) 얻어진 투석액을 20mM 트리스-염산완충액(pH 7.4)으로 평형화한 DEAE-토요펄 컬럼(ø5.5×19cm)에 흡착시킨 후 동일 완충액으로 충분히 세척한 후, 0 내지 0.3M의 염화나트륨을 함유하는 동일 완충액 4리터씩 사용하여 직선농도 구배법에 따라 획분당 20ml 되도록 용출시켰다. 활성획분은 약 0.2M의 염화나트륨 농도 부근에서 용출되었으며, 이에 의해 200ml의 활성획분이 얻어졌다.

(ⅴ) 생성된 활성획분을 다이어플로우 맴브레인 필터 YM-10(DLAFLOW Membrane Filter YM-10)을 사용하여 농축시켰다. 농축액을 세파덱스 G-100 컬럼을 사용하여 겔 여과(ø4.5×75cm)하고, 생리식염수로 획분당 8ml가 되도록 용출시켰다. 활성획분 70-82를 수집하고, 한외여과로 농축하여 CPBⅡ 14ml(단백함량 : 59.3mg, Lowry method)를 얻었다.

(2) 면역 비장세포의 조제 :

상기 정제된 CPBⅡ(100μg)을 프로인드의 컴플리이트 어쥬번트에 유탁화시켜 BALB/C 마우스에 복강내 투여하였다. 그런 다음, 2주 간격으로 50μg의 CPBⅡ와 어쥬번트 유탁액을 2회 투여하고, 최종적으로 CPBⅡ 50μg을 단독투여하여 면역을 완료했다. 3일 후, 마우스는 치사되었다. 비장을 꺼내 자른 후, 100-메쉬 나일론 망을 통해 여과하여 분리된 비장세포를 얻었다.

(3) 하이브리도마의 조제 :

상기에서 얻어진 면역 비장세포에 저장액(155mM 염화암모늄)을 가하여 적혈구 세포를 용혈시킨 후, 이스코브스변성 둘베코스 배지(IMDM)에서 세포를 세척했다. 마우스 골수종세포 PAI를 IMDM으로 2회 세척 했다. 양쪽 세포의 수를 세었다. 비장세포와 PAI 세포를 5 : 1의 비율로 혼합하고 원심분리했다. 상층액을 경사시키고, 생성된 세포 침사에 융합용 완충액(0.25M 만니틀, 0.1mM CaCl₂, 0.1mM MgCl₂, 0.2mM 트리스-염산, pH 7.2)을 첨가한 후 교반한 다음, 원심분리했다. 이 조작을 2회 반복했다. 세포침사에 융합용 완충액을 첨가하여 세포 밀도를 4×10⁷/ml로 조제하였다. 세포 융합장치(″SSH-1 모델″, 상품명; 시마쯔사 제조)의 전극사이에 100∼200μl로 적하하고, 1MHz, 40V에서 10초 동안 전압을 걸은 후 300V, 1/60초 동안 수회 전기 펄스를 가한다. 5분 동안 정치한 후, 1MDM에서 전극간의 세포를 세척하고, 원심분리 튜브로 옮긴 후 1,000r.p.m.에서 8분 동안 원심분리했다. 침사를 10%의 태아송아지 혈청(FCS)를 첨가한 IMDM에 부유하고, 다시 원심분리하여 생성상층액을 경사시켰다. 10^-4M의 하이포크산틴, 4×10^-7M의 아미노프테린 및 1.6×10^-5M의 티미딘(HAT-)을 미리 첨가시킨 10% FCS-첨가 IMDM을 사용하여 침사를 4×10⁶ml로 재부유하고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 100μl씩 붓는다. 각 웰에 3∼4일마다 50μl씩 추가하고, 세포의 증식을 관찰했다. HAT의 선택에 의해 하이브리도마만 증식하는 것을 확인하였다. (4) 항체-생산 하이브리도마의 검색 :

하이브리도마가 증식한 웰중의 배양액을 수집하고, 효소면역법에 의해 CPBⅡ에 대한 항체생산 하이브리도마를 조사했다. 우선 96 웰 마이크로타이터 플레이트(″Immunoplate I″, NUNC 사제품)에 CPBⅡ를 0.1μg/100μl/웰의 속도로 주입하고, 25℃에서 18시간 정치하여 흡착시킨다. 그런다음, 검체인 배양액을 100μl/웰의 속도로 주입하고, 25℃에서 2시간 반응시킨다. 0.05%의 ″트윈 20″을 함유하는 인산염 완충식염수(PBS-Tween)로 3회 세정한 다음, 호오스 래디쉬 퍼옥시다제 표지 고우트 항마우스 IgG(KPL 래버러토리사 제품)를 100μl/웰의 속도로 첨가하고, 2시간 후 PBS-Tween으로 3회 세정했다. 이것에 0.001%의 과산화수소 0.4mg/ml의 오르토페닐렌디아민(시그마사 제품)의 0.1M 시트르산-수산화나트륨 완충액(pH 4.0)을 가하고, 파장 492nm의 흡광도를 측정하였다. 검체중 CPBⅡ에 대한 항체가 존재한 웰에서만 발색이 관찰되므로 발색된 웰중에서 세포를 수집하였다.

(5) CPBⅡ에 대한 모노클로날 항체생산 세포의 클로닝 :

마우스의 복강내 IMDM을 주사하여 채취한 복강세포를 피더세포로 사용하였다. 10% FCS-첨가 IMDM에 부유한 복강세포(1×10⁵세포/ml)를 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 100μl씩 붓는다. 다음날, 항체생산 하이브리도마를 5개/ml로 조제하고, 각 웰에 100μl씩 붓는다. 매 3일 마다 배지를 신선한 동일 배지로 교환하고, 적당한 양까지 세포가 증식한 웰에서 연속적으로 배양 상등액을 체취한다. 상기와 동일한 방법으로 항체생산을 확인했다. 양성 웰은 다시 클로닝하여 항-CPBⅡ 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 얻었다. 이들 하이브리도마는 4종류가 얻어졌으며, 각각 생산하는 항-CPBⅡ는 모노클로날 항체의 종류에 따라 이들을 CPBⅡ-H29, CPBⅡ-H76, CPBⅡ-H311 및 CPBⅡ-H511로 명명하였다.

참고예 2 :

항-CPBⅡ 모노클로날 항체의 조제 :

7주령의 BALB/C 마우스의 복강내에 0.5ml의 프리스탄(알드리찌 화학사 제품)을 투여하고, 약 1주일 후, 상기에서 얻어진 하이브리도마를 1×10⁶세포/마우스의 복강내로 접종했다. 10일 후, 복수를 마우스의 복강으로부터 수집했다. 이 액을 3,000r.p.m.에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 황산암모늄의 최종 농도가 50% 포화가 될 때까지 황산암모늄을 상층액의 5ml에 가했다. 생성혼합물을 4℃에서 60분간 교반했다. 이 혼합물을 10,000r.p.m.에서 20분간 원심분리하고, 생성침사를 0.1M 트리스-염산완충액(pH 8)에 녹인 다음, 동일 완충액액에 대해서 투석했다. 동량의 1.5M 글리신-3M 염화나트륨완충액(pH 8.9)을 가한 동일 완충액으로 평형화시킨 ″프로테인 A 세파로즈 CL-48″(Protein A Sepharose CL-4B : 상품명; 파르마시아 4B 제품) 컬럼 크로마토그라피 하였다. 모노클로날 항체의 용출을 0.1M 시트르산완충액(pH 4)으로 수행하여 항-CPBⅡ 모노클로날 항체를 얻었다. CPBⅡ-H29를 사용한 경우, 22.2mg의 CPBⅡ-A29, CPBⅡ-H76를 사용한 경우 7.8mg의 CPBⅡ-A76이, CPBⅡ-H311를 사용한 경우, 16mg의 CPBⅡ-A311이, CPBⅡ-H511를 사용한 경우, 29mg의 CPBⅡ-A511을 얻었다.

참고예 3 :

면역 흡착 크로마토그라피에 의한 CPBⅡ의 정제 :

(1) 항-CPBⅡ 모노클로날 항체의 담체에의 결합 : 브롬화시아노겐-활성 세파로즈 4B(0.4g)를 1mM 염산 및 0.1mM 중탄산나트륨-0.5M 염화나트륨(pH 8.3)완충액의 순서로 세척하여 브롬화시아노겐-활성 세파로즈 4B 현탁액을 커플링완충액(1.5ml)중에서 조재했다. 이것에 정제된 모노클로날 항체 CPBⅡ-A76 2mg을 함유하는 대응하는 커플링완충액(1ml)을 가하고, 실온에서 2시간 진탕한 후, 글래스 필터를 통해 탈수했다. 다시 0.1M 트리스-염산완충액(pH 8.0) 10ml를 가하고, 실온에서 2시간 진탕하여 잔류활성부위를 차단시켰다. 이렇게 얻어진 항체결합 세파로즈 4B를 0.1M 트리스-염산-0.5M 염화나트륨완충액(pH 8.3) 및 0.1M 아세트산-0.5M 염화나트륨완충액(pH 4.0)으로 교대로 3회 세정한 다음, 0.1M 트리스-염산완충액(pH 7.4)으로 평형화하여 항체컬럼 ＃76을 얻었다.

(2) 항체컬럼 ＃76의 사용에 의한 CPBⅡ의 정제 :

상기 참고예 1-(1)-(b)에서 얻은 조(粗)CPBⅡ용액을 상기 조작에서 제조된 항체컬럼 ＃76상에 충전시켰다. 이 컬럼을 그의 평형화에 사용된 것과 동일한 완충액으로 충분히 세정했다. CPBⅡ의 용출은 (1) 0.1M 아세트산-0.5M 염화나트륨완충액(pH 3.5)를 사용하는 방법 또는 (2) 0.2M 글리신-염산완충액(pH 2.3)을 사용하는 방법에 의해 수행할 수 있다. CPBⅡ는 어떠한 획분에서도 발견되지 않았다. CPBⅡ는 용출획분으로 부터 80% 이상의 회수율로 정제할 수 있었다. CPBⅡ의 측정은 후술하는 참고예 4의 방법에 의해 수행하였다.

참고예 4 :

항-CPBⅡ 모노클로날 항체를 이용한 CPBⅡ측정 :

에스, 요시다께 등에 의해 보고된 방법[J.Biochem., 92, 1413-1424(1982)]에 준하여, 호오스 래디쉬 퍼옥시다제(이하 ＂HRP＂라 약칭함)를 항-CPBⅡ 모노클로날 항체에 결합시켰다. 이 HRP 표지 항 CPBⅡ 모노클로날 항체를 사용하여, 후술하는 바와 같이 ERISA법에 의해 CPBⅡ를 측정했다. 0.05M 탄산나트륨 용액(pH 9.6)에 용해한 모노클로날 항체의 용액을 96-웰 플랫-바톰 마이크로타이터 플레이트의 각웰에 100μl씩 가하고, 25℃에서 2시간 동안 코팅했다. PBS-트윈으로 세정한 후, 0.1M 트리스-염산, 25mM EDTA, 0.05% 트윈 20 완충액(pH 7.4)용액 100μl를 가했다. 25℃에서 하룻밤 반응시킨 후, PBS-트윈으로 세정하고 HRP 표지 모노클로날 항체의 PBS-트윈 희석용액 100μl를 가한 다음, 25℃에서 2시간 반응시켰다. PBS-트윈으로 세정한 후, 100μl의 기질용액(0.4mg/ml)의 오르토-페닐렌디아민 및 0.01% 과산화수소를 함유하는 0.1M 시트르산염-인산염완충액; pH 5.0)를 첨가한 다음, 25℃에서 30분 동안 반응시켰다. 4.5M 황산 50μl를 가해 반응을 정지시킨 후, 492nm에서 흡광도를 측정했다. 그 결과, 코팅용 코팅 모노클로날 항체로서 CPBⅡ-A29가 사용되고, 표지용 모노클로날 항체로서 CPBⅡ-A76, CPBⅡ-A311 또는 CPBⅡ-A511이 사용될 때, 및 코딩 모노클로날 항체로서 CPBⅡ-A511을 사용하고, 모노클로날 항체로서 CPBⅡ-A29, CPBⅡ-A76을 사용하는 경우에는 1∼100ng/ml 범위의 CPBⅡ를 검출할 수 있다. 또한 코팅 모노클로날 항체로 사용되고 CPBⅡ-A511이 콘쥬게이트되는 모노클로날 항체로서 CPBⅡ-A29를 사용할 때 극히 고감도이며 양호한 직선성을 나타낸다.

실시예 1 :

항 CPBⅡ 폴리클로날항체의 조제

(1) 토끼 항혈청의 조제 :

참고예 1에서 작성 0.8mg의 CPBⅡ를 프로인드 컴플리이트 어쥬번트에 유탁화시키고 토끼(백색재래종, 수컷)발에 투여했다. 2주 간격으로 CPBⅡ 0.8mg와 어쥬번트 유탁액을 2회투여한 다음, 동량의 CPBⅡ를 프로인드 완전 어쥬번트에 유탁화시키고 피하투여하여 면역을 완료했다. 이렇게 면역이 완료된 토끼로 부터 전량의 혈액을 취하여 80ml의 혈청을 얻었다. CPBⅡ를 항원으로서 오우취터로니 법으로 본 혈청의 항체가를 측정한 바, 8배의 역가가 얻어졌다.

(2) 항체의 정제

2.5ml의 사람 알부민 용액(4mg/ml)을 상기 (1)에서 얻은항혈청 80ml에 가하고, 실온에서 2시간 동안 방치시킨 다음 14,000rpm, 10분간 원심분리하고, 항 사람 알부민 항체를 흡수했다. 78ml의 생성 상충액에 78ml의 PBS(0.29% 인산나트륨, 0.02% 인산칼륨, 0.8% 염화나트륨, 0.02% 염화칼륨)와 156ml의 포화 황산암모늄 용액을 가하고, 다시 4℃에서 하룻밤 동안 방치한 후, 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 침사를 얻었다. 이렇게 얻은 침전을 PBS에 용해시키고, 충분한 양의 PBS에 대해서 투석하였다. 얻어진 투석액을 10,000rpm에서 10분간 원심분리하고, PBS 평형화시킨 단백질 A-셀룰로핀 컬럼에 흡착시켰다. PBS로 세정하고, 0.15M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 글리신-염산완충액(pH 2.7)으로 용출시켰다. 트리스 용액으로 pH를 중성으로 조제하고, 칼포빈딘(Maki et al, 임산부 혈액 12(1), 41-48, 1988)을 고정화한 세파로즈 컬럼을 통과시켰다. 통과된 액체에 사람 태반으로 부터 제조된 리포콜딘 획분(Huang et al., Cell, Vol 46, pl91, 1986)을 가하고, 4℃에서 하룻밤 동안 방치시킨 다음, 15,000rpm으로 10분간 원심분리하여 항-리포콜틴 항체를 흡수했다. 원심분리한 상층액을 CPBⅡ를 고정화한 세파로즈 컬럼에 흡착시키고, PBS로 세정한 다음, 0.15M의 염화나트륨을 함유하는 0.1M 글리신-염산완충액(pH 2.7)으로 용출, 트리스 용액으로 pH를 중성으로 조제하였다. 용출액을 증류수에 투석한 다음, 동결건조하여 정제된 항 CPBⅡ 폴리클로날 항체 10.3mg을 얻었다.

실시예 2 :

CPBⅡ cDNA의 클로닝

(1) 사람 태반의 cDNA 라이브러리의 스크리닝 :

(a) cDNA 라이브러리

사람 태반 cDNA 라이브러리는 콜론테크사제(clontech laboratories, Inc.)에서 λgell 파아지의 EcoR I 부위에 평균 1.8kb의 사람 태반 mRNA로부터 역전사 효소를 사용하여 만든 cDNA가 EcoR I 링커를 개재하여 결합되어 있다. 이 라이브러리는 1.0×10⁵개의 독립된 클론으로 구성된 재조합 λgell 파아지이다.

(b) 숙주 대장균 Y 1090(ATCC 37197)을 사용하여 암피실린(100μg/ml)과 말토오즈를 함유하는 LB 한천 플레이트(박토-트립톤 10g, 박토-효모 추출물 5g, 염화나트륨 5g, 말토오즈 2g, 한천 15g, 증류수 1리터; pH 7.5)에 스트리킹을 한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이렇게 생성된 단일 콜로니를 암피실린(100μg/ml)과 말토오즈를 함유하는 LB 배지(박토-트립톤 10g, 박토-효모 추출물 5g, 염화나트륨 5g, 말토오즈 2g, 증류수 1리터; pH 7.5)에 이식시킨 후, 37℃에서 하룻밤 동안 진탕 배양하였다.

(3) 파아지 라이브러리의 감염 :

0.2ml의 숙주 대장균 Y1090의 하룻밤 배양액과 희석액(10mM 트리스-염산 완충액, 10mM 염화마그네슘; pH 7.5)에서 5.5×10⁵pfu/ml 되도록 조제한 라이브러리 0.1ml와 혼합하고, 실온에서 20분간 방치시켜 파이지를 숙주세포에 흡착시켰다. 45℃로 보온하여 높은 말토오즈를 함유한 LB 상층 한천배지(박토-트립톤 10g, 박토-효모 추출물 5g, 염화나트륨 5g, 말토오즈 2g, 한천 7.2g, 증류수 1리터; pH 7.5) 2.5ml를 첨가 혼합한 후 말토오즈를 함유하는 직경 9cm의 LB 한천 플레이트에 분산시킨 다음, 42℃에서 3시간 반동안 배양하였다.

(d) 니트로셀룰로오즈 막으로 전사 :

10mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피란노시드(IPTG)에 포화 후 건조한 멸균 니트로셀룰로오즈필터를 42℃에서 3시간 반 배양한 λgell 파아지 반점이 생긴 LB 한천 플레이트에 건조된 필터를 입혔다. 다시 37℃에서 3시간 반동안 증식시킨 후, 필터를 벗겨내고, 파아지 반점이 생긴 플레이트는 4℃에서 보존하였다. 필터를 TBST(100mM 트리스-염산완충액, 150mM 염화나트륨, 0.05% ″트윈-20″; pH 8.0)으로 세정한 후, 1% 소혈청 알부민/TBST에서 실온, 30분간 블로킹시켰다.

(e) 1차 항체의 결합 :

필터를 1차 항체 용액에 옮기고, 온화하게 진탕하면서 실온에서 60분 동안 반응시켰다. 1차 항체로서 TBST에 용해시킨 항-CPBⅡ 토끼 폴리클로날 항체(실시예 1에서 얻음)의 용액을 실온에서 30분간 방치하여 불순항체의 흡수를 행하여 사용하였다. 항 CPBⅡ 토끼 폴리클로날 항체의 용액은 항-CPBⅡ 토끼 폴리클로날 항체 0.1μg/ml, 소혈청 알부민 1mg/ml와 대장균 추출물 0.25μg/ml(프로메가사 제품)을 함유하는 것을 사용하였다. 1차 항체와 반응시킨 후, TBST에서 필터를 10분간씩 3회 세정하였다.

(f) 2차 항체의 결합 :

필터를 2차 항체 용액에 옮기고, 온화하게 교반하면서 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 2차 항체로서 알칼리성 포스파타제 결합 항-토끼 IgG(H＋L)(프로메가사 제품)을 TBST에서 1/7,500으로 희석한 것을 사용하였다. TBST에서 필터를 10분간 3회 세정한 다음, AP 완충액(100mM 트리스-염산완충액, 100mM 염화나트륨, 5mM 염화마그네슘; pH 9.5)으로 1회 세정하였다.

(g) 발색 :

5ml의 AP 완충액에 3μl의 니트로블루 테트라졸리움 용액(50mg/ml)과 66μl의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(50mg/ml)를 혼합한 발색 기질 용액에 필터를 침지하였다. 실온에서 1시간 동안 발색시킨 후, 반응정지액(20mM 트리스-염산완충액, 5mM 나트륨 에틸렌디아민 테트라아세테이트; pH 8.0)에 옮겨 발색 반응을 정지시켰다.

(h) 양성 반점의 조제 및 순화 :

발색 반응이 관찰되는 양성점에 해당되는 반점을 한천배지와 함게 채취한 다음, 0.1ml의 TMG 완충액(100mM 트리스-염산완충액, 10mM 염화 마그네슘, 100μg/ml 젤라틴; pH 7.4)에 옮겼다. 클로로포름 두 방울을 가한 후 4℃에서 4,000rpm으로 15분간 원심분리했다. 클로로포름 한 방울을 생성 상층액에 가하여 조제된 혼합물을 4℃에 보존하였다. 약 1×10⁶파아지 반점에 대해 상기 스크리닝을 수행한 결과, 26주의 양성반점을 얻었다. 강한 발색반응을 보인 4개의 반점에 대해서는 이들의 파아지액을 적당히 희석한 다음, 다시 2회 스크리닝 조작을 반복하여 순화 파아지주 C-1, C-4, C-5 및 C-6을 얻었다.

(2) 재조합 파아지 DNA의 조제 :

이렇게 얻은 4주의 재조합 파아지를 숙주 대장균 Y1088(ATCC 337195)에 감염시키고, 42℃에서 파아지 발생을 유도하였다. λ파아지 조재법[Bernard Perbal, PREPARATION OF λPHAGE DNA in A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING, pp 175-184, A wiley-Interscience Publication(1984), New York, U.S.A.]에 준하여 플레이트법에 의한 소량 조제 및 대량 조제를 액채 배양법에 대한 조제를 수행하여 10⁹pfu/ml의 재조합 파아지를 얻었다. λDNA 제작방법[Bernard Perbal, PREPARATION OF λ DNA in A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING, pp 184-187, A wiley-Interscience Publication(1984), New York, U.S.A.]에 따라서 폴리에틸렌 글리콜 침전법에 의해 10¹¹pfu/ml로 농축된 파아지 용액을 글리세린의 스텝와이즈 원심[Written by Bernard Perbal, translated by Shigeyasu Kobayashi : Practical Handbook of Gene Manipulation Experiments, pp 175(1985), The Jatec Publishing co.]에 의해 정제하였다. 또한, 정제된 재조합 파아지 DNA를 사용하여 동일한 λDNA 조제법에 따라 재조합 파아지 DNA를 조제하였다. 300ml의 배양물로부터 약 50∼100μg의 DNA를 얻었다.

(3) cDNA의 서브클로닝 :

pUc 118(Takara Shuzo사 제품)을 벡터로 사용하였다. pUC 118을 EcoR I 으로 자르고, 동일EcoR I 으로 절단한 4주의 재조합 λgtll 파아지 DNA와 DNA 라이게이션키트(다가라슈죠사 제품)를 사용하여 연결했다. 숙주 대장균 세포MV 1304(다가라 수죠사 제품)에 얻어진 재조합 벡터를 도입한 바, 생성된 형질전환체 MV 1304로 부터 4주의 재조합 λgell 파아지에 대응하는 삽입방향과 분자량이 다른 재조합 벡터가 얻어졌다. C-1으로 부터 벡터 조환체 pKS I 11, pKS I 12, pKS I 13을, C-4로 부터는 pKS I 41을, C-5로 부터 pKS I 51과 pKS I 53을, C-6으로 부터 pKS I 61, pKS I 63, pKS I 64가 얻어졌다. 각종 제한효소를 사용하여 각종 재조합 벡터를 절단하여 제3도에 나타낸 바와 같은 제한효소 지도를 만들었다. CPBⅡ cDNA는 삽입된 단편에 EcoR I 부위를 갖고 있으며, 서브클로닝 조작으로 큰 단편을 갖는 서브클론과 작은 단편을 갖는 서브클론을 얻었다. 최장 cDNA 단편을 갖는 재조합 파아지 C-6로 부터 얻어진 pKS I 64, pKS I 61을 제4도에 나타내었다. pKS I 64와 pKS I 61의 분자량은 각각 5.1Kb와 3.7Kb이었다.

(4) CPBⅡ cDNA의 염기배열의 확인 :

생성된 CPBⅡ cDNA 재조합 벡터는 각종 제한효소와 엑소뉴클레아제 Ⅲ, 즉빈(Mung Bean) 뉴클레아제를 사용 처리하여 cDNA 가닥을 짧게 하고, pUC 118을 벡터로 사용하여 짧은 가닥 플라스미드를 재구축하였다. 얻어진 짧은 가닥의 플라스미드로 숙주 대장균 세포 MV 1304를 형질전환 시켰다. 생성된 형질전환 세포 배양액에 헬퍼파아지 M13K07(다가라슈죠사 제품)을 감염시켜 증식한 파아지 단편으로 부터 단일가닥 DNA를 조제하고, 디데옥시뉴클레오디크 시퀀스법(SANGER, F, NICKLEN, S. and COULSON, A.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-5467, 1977)에 의해 제3도에 나타낸 계획에 따라 DNA 염기배열을 결정하였다. 제5도에 CPBⅡ cDNA의 전 염기배열을 나타내었으나, CPBⅡ 폴리펩티드를 완전히 코딩한 2,425bp의 cDNA를 얻을수 있다. 오픈리딩 프레임으로 검색한 바, 4번째 염기 GCC로 시작되고 2019번째 염기 GAC로 끝나는 2016 염기는 CPBⅡ의 672개의 아미노산을 구성하는 폴리펩티드를 코당한 것임이 밝혀졌다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩한 cDNA는 EcoRI 절단부위를 1개 포함하므로, 2종의 플라스미드에 각각 클로닝되어 있다. 본 cDNA를 접속하여 단일가닥의 DNA로 하는 목적에서 제6도에 나타난 바와 같이, 여러 가지의 제한효소, DNA 수식효소, DNA 링커를 사용하여 pKS I 64와 pKS I 61로 부터 본 발명 폴리펩티드를 완전히 코딩하는 오픈리딩 프레임 함유 pKS I 73을 구축했다. 본 재조합 벡터 pKS I 73을 유지하는 E.coli MV 1304/pKS I 73은 일본 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업기술 연구소에 미공연조기 제 1962호로서 기탁되었다.

실시예 3 :

발현용 재조합 벡터의 구축 및 이 재조합 벡터에 의한 숙주세포의 형질전환 :

(1) 발현 벡터의 선택

실시예 2에서 구축한 pKS I 73은 본 발명의 폴리펩티드의 번역 개시 부위 ATG의 상류에 멀티 클로닝 부위를 갖고, 적당한 제한효소에서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 단편을 잘라낼 수 있다. 따라서, 절단된 cDNA 단편을 강력한 프로모터의 하류에 EcoR I, Sph I, Pst I, Sal I, Xba I, BamH I, Sma I, Kpn I과 Sac I 같은 제한효소 부위를 갖는 발현 벡터에 연결시킴으로써 쉽게 발현될 수 있다. 여기서 대장균의 강력한 프로모터인 tac 프로모터를 함유하고, 리보좀 결합 부위의 하류에 EcoR I, Sma I, BamH I, Pst I과 HindⅢ의 제한효소 부위를 갖는 발현 벡터 pKK 223-3(Pharmacia AB 제품)을 사용하였다.

(2) 발현용 재조합 벡터의 구축

실시예 2에서 구축한 벡터 pKS I 73을 Pst I 과 HindⅢ으로 절단하고, pKK 223-3의 Pst I과 HindⅢ 사이에 DNA 라이게이션키트(다카라슈죠사 제품)을 사용하여 접속하고, 발현용 재조합 벡터 pKSI X266을 구축하였다. 그러나, pKSI X266은 리보좀 결합부위와 번역 개시 부위 ATG 사이에 거리가 있어, 발현 효율이 불량한 것으로 예상되었다. 그래서 pKSI X226을 Sma I 으로 절단한 후 재결합하고, pKS I X226을 다시 pKS I X226을 EcoR I 으로 절단한 후, 재결합하여 pKS I X205를 구축하였다. 이 수순을 제7도에 나타내었다.

(3) 발현용 재조합 벡터에 의한 숙주세포의 형질전환

(2)에서 구축한 발현용 재조합 벡터 pKSI X266, pKS I X226과 pKS I X205를 위스타스와 심마니스에 의해 제안된 방법[Hanaban, D. : DNA Cloning : A Practical Approach, Vol. 1,(D.M. Glover, ed.), p121, (1985) IRL Press,Oxford]따라 조제한 숙주 대장균 JM105[C. Yanisch-Perron, j. Vieira and J. Messing : Improved M13 Phage cloning Vectors and Host Strains-Nucleotide Seguence of the M13mp18 and pUC 19 Vector, Gene, 33, 103-119(1985)] 컴피턴트 세포에 도입했다. 형질전환체 세포 E.coli 선택은 100μg/ml의 암피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트(1% 박토-트립톤, 0.5% 박토-효모 추출물, 1% 염화나트륨, 1.5% 한천)에서 수행하였다. 생성된 형질전환체 세포중에서, Ecoli JM 105/pKS I X205는 일본 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업 기술 연구소에 미공연조기 1953으로 기탁되었다.

실시예 4 :

웨스턴 블로팅법에 의한 본 발명의 폴리펩티드 발현의 확인 :

실시예 3에서 작성한 E.coli JM 105/pKS I X205를 100μg/ml의 암피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트에서 37℃로 하룻밤 동안 배양하고, 생성 콜로니를 500ml의 삼각플라스크에 분주한 50ml씩의 MM배지(1.05% 인산 수소 칼륨, 0.45% 인산 중수소 칼륨, 0.1% 황산암모늄, 0.05% 시트르산 나트륨, 0.02% 황산마그네슘, 0.2% 글루코오스, 5ng/ml 티아민 염산염)에 접종하고, 37℃에서 3시간 동안 진탕 배양했다. 이소프로필-β-D-티오갈락토피란노시드를 최종 농도가 1mM이 되도록 가한 후, 다시 12시간 동안 진탕 배양하였다. 세포를 취하고, 0.5ml의 TE 완충액(10mM 트리스-염산완충액, 25mM EDTA; pH 8.0)에 현탁시켰다. 드라이 아이스/에탄올중 동결시킨 후, 이어서 해동하였다. 이 동결 및 해동 과정을 다시 2회 반복한 후, 15,000rpm으로 10분간 원심분리하여 균체파쇄액의 상층액을 얻었다. 이 상층액을 ″밀리포어(Millipore)″필터에 통과시켜 E.coli JM 105/pKS I X205 추출액을 얻었다. 이렇게 얻은 추출액 15μl를 β-메르캅토에탄올로 환원시킨 후, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(10%겔)시키고, 항-CPBⅡ 모노클로날 항체 CPBⅡ-A29, CPBⅡ-A311, CPBⅡ-A511 각 1μg/ml의 혼합액과 웨스턴 블로팅 AP 시스템(Promega Biotec사 제품)을 사용하여 웨스턴 블로팅을 수행한 바, CPBⅡ에 상당하는 분자량을 갖는 본 발명의 폴리펩티드의 발현이 확인되었다.(제8도)

실시예 5 :

본 발명의 폴리펩티드의 생산

(1) 배양 :

실시예 3에서 조제한 대장균 JM 105/pKS I X205 형질전환체를 100μl/ml의 암피실린을 함유하는 LB 한천플레이트에서 37℃로 하룻밤 동안 배양하였다. 생성된 콜로니를 각각 100ml의 생산 배지(0.7% 인산수소칼륨, 1.2%륨, 1.2% 인산 중수소 칼륨, 0.1% 황산암모늄, 0.05% 시트르산 나트륨, 0.01% 황산마그네슘, 0.2% 글루코오스, 0.5% 글리세롤, 0.5% 카스아미노산, 5ng/ml 티아민 염산염, 50μg/ml 암피실린)에 접종하고, 각각을 500ml 엘렌마이어 플라스크에 넣었다. 37℃에서 7시간 동안 200rpm으로 진탕 증식시키고, 각 배양물을 6리터 생산 배지에 접종시킨후, 4리터/분 속도의 통풍하에서 10리터 배양기에서 500rpm으로 38℃에서 증식시켰다. 3시간 동안 배양한 후, 이소프로필-β-D-티오갈락토피란노시드를 최종 농도가 1mM이 되도록 가한 후, 다시 15시간 동안 증식시켰다.

(2) 추출 및 정제 :

(ⅰ) 세포를 취한 후, 150ml의 25mM EDTA를 함유하는 25mM 트리스-염산완충액(pH 7.5)에 현탁시켰다. 현탁액을 원심분리하여 세척된 세포를 얻고, 동일 완충액 150ml에 현탁시킨 다음 초음파로 파쇄하였다. 원심분리하여 채취한 파쇄 세포를 다시 2회 초음파 파쇄를 가하여 450ml의 대장균 추출물을 얻었다. (ⅱ) 대장균 추출물을 25mM 트리스-염산완충액(pH 7.5)으로 투석하고, 투석물을 동시에 완충액으로 평형화시킨 DEAE-토요펄 컬럼(ø2.5×30cm)에 흡착시켰다. 컬럼을 동일 완충액으로 철저히 세척한 후 0.1M 염화나트륨을 함유하는 동일 완충액으로 다시 세척하였다. 0.3M 염화나트륨을 함유하는 동일 완충액을 사용하여 용출시켜 본 발명의 펩티드를 함유하는 획분을 얻었다. DEAE 획분을 참고예 3에서 얻은 항체 컬럼 76번(5ml)에 흡착시켰다. 컬럼을 0.15M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 트리스-염산완충액(pH 8.0)으로 철저히 세척하고 0.5M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 아세트산 완충액(pH 3.5)으로 용출시켰다. 용출물에 트리스 용액을 가하여 pH를 중성으로 조절한 다음, 밀리포어이머시블 CX-10(Milliporeimmersible CX-10)을 사용하여 농축시키고 생리 식염수로 투석하여 본 발명의 폴리펩티드 1.2mg을 함유하는 정제 시료를 얻었다.

(3) 항응고 활성의 측정 :

본 발명의 폴리펩티드의 항응고 활성을 측정하고 태반 유래 CPBⅡ의 항응고 활성과 비교하였다.

(ⅰ) 프로트롬빈 시간 :

생리식염수로 희석한 시험 시료 50μl와 생리 식염수로 100배 희석한 트롬보플라스틴 C(American Dade 사 제품) 100μl를 혼합하고 37℃에서 2분간 방치한 후, 여기에 사람의 표준 혈장 50μl를 가하였다. 그런다음 응고측정계 KC4A(Coagulometer KC4A, Ameling사 제품)를 이용하여 응고 시간을 측정하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

(2) 칼슘재첨가 시간 :

생리식염수로 희석한 시험 시료 50μl와 사람의 표준 혈장 50μl를 혼합하고, 37℃에서 2분간 방치한 다음 25mM 염화칼슘 수용액 50μl를 가하였다. 그런다음 응고측정계 KC4A(Ameling사 제품)를 이용하여 응고 시간을 측정하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

실시예 6 :

투여 형태로 제제

본 발명의 폴리펩티드 1mg

알부민 5mg

만니톨 25mg

염화나트륨 1.95mg

인산나트륨 3.85mg

상기 성분을 주사용 증류수 2ml에 녹여 멸균된 바이알에 채운다음, 2시간 동안 -30℃∼-40℃에서 잠정적으로 동결시켰다. 그후 -30℃∼＋20℃, 0.05∼0.1 토르로 35시간 동안 1차 건조시킨 다음, 30℃, 0.01∼0.05 토르에서 5시간 동안 2차 건조함으로써 주사용 바이알을 제조하였다.

Claims

제1도에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
제1도에 나타낸 아미노산 서열을 코딩한 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편.
제2항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 제2도에 나타낸 것인 DNA 단편.
제2항 또는 제3항에 있어서, DNA 단편에 상보적인 뉴틀레오티드 서열을 갖는 DNA 단편.
하기 (1) 및 (2)로 구성되는 재조합 플라스미드 : (1) 제1도에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편 및/또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편; (2) 복제능이 있는 벡터 DNA.
전사되는 아래방향으로 다음 뉴클레오티드 (1)-(6)의 순서를 갖는 재조합 플라스미드 : (1) 프로모터로 작용하는 뉴클레오티드 서열, (2) 리보좀 결합 부위인 뉴클레오티드 서열, (3) 개시 코돈인 뉴클레오티드 서열, (4) 제1도에 나타낸 바의 아미노산의 서열을 코딩한 뉴클레오티드 서열, (5) 종지 코돈인 뉴클레오티드 서열, (6) 전사 터미네이터로 작용하는 뉴클레오티드 서열.
제5항 또는 제6항에 기재된 재조합 플라스미드를 함유하는 형질전환체 세포.
제1항에 기재된 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 항혈액응고제.
제7항에 기재된 형질전환체 세포를 배양한 후, 배양물로 부터 생산된 폴리펩티드를 수집함을 특징으로 하는 제1항 기재의 폴리펩티드의 생산방법.