PT94326B - Processo para a preparacao de polipeptidios e seus analogos e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

ZENECA LIMITED, britânica, industrial e comercial, com sede em 15 Stanhope Gate, London W1Y 6LN, Inglaterra

Inventores (72):

Enno Christophers, Oliver Wiedow, Jens-Michael Schroder, residentes na Alemanha Ocidental e Michael Derek Edge e David Pioli, residentes na Inglaterra nAo preencher as zonas sombreadas

Reivindicação de prioridade(s) (5o)	Figura (para interpretação do resumo)
Data do pedido	País de Origem	N.° de pedido
09.06.1989	GB	8913346.6
09.06.1989	GB	8913349.0
25.09.1989	GB	8921613.9
02.11.1989	GB	8924717.5
Epígrafe: (54)
PROCESSO PARA A	PREPARAÇÃO
DE POLIPEPTIDOS E SEUS ANÁLOGOS E DE
COMPOSIÇOES	FARMACÊUTICAS QUE OS	!
CONTÊM

Resumo: (máx. 150 palavras) @

A invenção refere-se a um processo para a prepa ração de um polipéptido que possui actividade inibidora contra a elas tase de leucócitos humana, o qual se pode obter a partir de escamas psoriáticas de pele humana e tem uma ou mais das seguintes caracterís ticas

a) um peso molecular igual a cerca de 9 kD (determinada por SDS-PAGE)

b) um ponto iso-electrónico igual a cerca de pH 9,7 (determinado por focagem isoelectrónica) ;

c) actividade inibitória relativamente a elastase pancreática porcina

CAMPO DAS CEBOLAS, 1100 LISBOA TEL.: 888 51 51 / 2 / 3 TELEX: 18350 INPt TELEFAX :87 53 08

Modalidade e n.° (£j)

a INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

DIRECÇÃO DE SERVIÇOS DE PATENTES ^,NR FOLHA DO RESUMO (Continuação)

PT 94 326

Resumo (continuação)

Data do pedido

08.06.1990

ΝΑΟ preencher as zonas sombreadas além de relativamente a elastase de leucócitos humana; e

d) não tem actividade significativa contra tripsina, catepsina G humana, alfa-quimotripsina e plasmina; ou de um seu fragmento que possui actividade inibitória contra elastase de leucócitos humana, que compreende a cultura de uma célula hospedeira transformada com um veículo de expressão plasmídica replicável que é capaz de dirigir a síntese do referido polipéptido.

DSM-5 _MOORERKBRX&-^%*rar.

tâncias normais, estes grânulos fundem-se com fagossomas que contem material estranho, tais como bactérias, e as partículas são metabolisadas por uma combinação de HLE e outras enzimas lisómicas.

No entanto, em certas condições patológicas, os leucócitos polimorfonucleares ficam ligados à proteína hospedeira, tal como elastina e colagénio e o conteúdo dos grânulos incluindo HLE, pode ser libetado directamente para dentro do tecido. A actividade degradativa resultante da HLE no tecido hospedeiro acredita-se originar a danificação do tecido que po de representar um papel importante em doenças tais como enfis£ ma (2), sindroma das perturbações respiratórias dos adultos (1), psoríase (3) e dermatoses eruptivas (4).

A potente actividade proteolítica da HLE sabe-se que é equilibrada em certa medida pela actividade antiproteolí^ tica de inibidores, tais como alfa^-antitripsina e alfa₂-macro globulina. Estes inibidores foram detectados no soro, assim co mo em vários tecidos incluindo a epiderme (5, 10). Além disso, verificou-se estar presente um inibidor de baixo peso molecular de proteases de leucócitos humanos no fluido seminal (11), no muco cervical (12), na secreção dos brônquios (13) e na secreção das parótidas (14), assim como no soro humano (6). 0 inibidor de todas estas fontes verificou-se ser idêntico a anti leucoprotease e os seus metabólitos por análise de imuno-reactividade (6, 15) ou por análise da sequência de aminoácidos (16, 17) e ser também um potente inibidor da tripsina. Inibido res de baixo peso molecular foram detectados no muco dos brônquios por Hochstrasser e col. (21) e na pele psoriática (22).

A literatura também tem indicações sobre outros inibidores da elastase (18, 19), que também inibem a tripsina. Além disso, detectaram-se inibidores da elastase nas glândulas submandibulares de cães, leões e gatos (20).

De acordo com uma primeira característica da pre- 2 -

sente invenção, proporciona-se um polipéptido que tem toda ou , parte da estrutura primária da formula I e seus fragmentos ! ί i Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser- ί -Cys-Pro-Ile-Ile-leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Iieu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-Ile-Lys-Lys-Cys-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Met-Ala-Cys-Phe-Val-Pro-Gln(PÓrmula I) polipéptido ou fragmentos esses que possuem actividade inibitó ria contra a elastase de leucócitos humanos e compostos capazes de serem modificados In vivo ou ln vitro para obtenção dos men cionados polipéptidos ou fragmentos.

Le acordo com a presente invenção, proporciona-se também um polipéptido que compreende toda ou parte da seguinte estrutura primária e seus fragmentos

Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn polipéptido ou fragmentos esses que possuem actividade inibitó ria contra a elastase de leucócitos humanos e compostos capazes de serem modificados in vivo ou in vitro com obtenção do citado polipéptido ou seus fragmentos.

Convenientemente, o polipéptido ou os seus fragmen tos tem a seguinte estrutura lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-I«ys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-X, em que o símbolo X representa um ou mais resíduos de aminoácidos e é, preferivelmente, Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-Ile-Lys-lys-Cys-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Met-Ala-Cys-Phe-Val-Pro-Gnl.

í polipéptido pode ser precedido por um ou mais re síduos de aminoácidos, por exemplo, Ala-Gln-Glu-Pro-Val; ou Y-Ala-Gln-Glu-Pro-Val, em que o símbolo Y compreende um ou mais aminoácidos que podem ser, por exemplo,

- 5 I

Asn-Gly- Gln-Asp-Pro-Val-Lys-Gly-Gin-Val-Ser-Val-Lys-Gly-Gln- As p-Lys-Val-Lys;

Gly/Ala-Gln/Val-Asp-Lys-Val-Lys;

Asp-Lys-Val-Lys ; ou Gly/Val-Lysmas, mais preferivelmente, o polipéptido tem a estrutura da fórmula I.

Convenientemente, o polipéptido ou os fragmentos de acordo com a presente invenção possuem actividade inibitória que é específica para as proteases da serina, na medida em que possuem actividade inibitória contra proteases tais como elastase de leucócitos humanos e elastase pancreática porcina, mas não possuem qualquer actividade inibitória significativa contra a tripsina. Os polipéptidos ou fragmentos preferidos de acordo com a presente invenção não possuem qualquer actividade inibitória significativa contra catepsina G humana, alfa-quimotripsina e plasmina.

Os polipéptidos ou os seus fragmentos de acordo com a presente invenção podem ter um ponto isoelectrónico igual a cerca de pH 9,7 (determinado por focagem isoelectrónica).

Muito embora possam ser preparados por técnicas de engenharia genética, os polipéptidos preferidos de acordo com i a presente invenção podem também ser obtidos a partir de escamas psoriáticas de pele humana.

De acordo com a presente invenção, proporciona-se também um polipéptido que possui actividade inibitória contra a elastase de leucócitos humanos, podendo o referido polipépti do ser obtido a partir de escamas psoriáticas de pele humana e possuindo uma ou mais das seguintes propriedades características

a) um peso molecular igual a cerca de 9 KD (determina do por SDS-PAGE) ;

b) um ponto isoelectrónico igual a cerca de pH 9,7 (determinado por focagem isoelectrónica);

c) actividade inibitória contra elastase pancreática porcina, além de contra a elastase de leucócitos humano s;

d) nenhuma actividade significativa contra tripsina, catepsina G humana, alfa-quimotripsina e plasmina;

ou um seu fragmento que possui actividade inibitória contra a elastase de leucócitos humanos.

Os polipéptidos que se podem obter a partir de pele humana incluem os que se podem directamente por meio de pro cedimentos de isolamento e de purificação e também de fragmentos desses polipéptidos.

Os polipéptidos preferidos de acordo com a presente invenção contém uma ou mais das seguintes sequências de ami. noácidos:

(a) - Ala- Gin- Glu-Pro - Vai- Lys - Gly-Pr o e, mais preferivelmente, uma sequência N-terminal que compreen de a sequência acima referida precedida por X, em que X representa uma sequência de aminoácidos que pode conter 19 aminoácidos e que é convenientemente a seguinte

Asn-Gly-Gln-Asp-Pro-Vai-Lys-Gly-Gin-Val-Ser-Vai-Lys-Gly-Gln-Asp-Lys-Vai-Lysb) -Ala-Gin-Glu-Pro-Vai-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leue, mais preferivelmente, uma sequência N-terminal que compreende a sequência acima referida precedida de X,

em que X representa uma sequência de aminoácidos que pode conter 6 aminoácidos, que á convenientemente a seguinte Gly/Ala-Gin/Vai-Asp-Lys-Val-lysc) -Ala-Gln-Glu-Pro-Val-lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Oyse, mais preferivelmente, uma sequência N-terminal que compreen de a sequência acima mencionada precedida de X, em que X representa uma sequência de aminoácidos que pode conter 4 aminoácidos e que convenientemente é a seguinte Asp-lys-Val-Lysd) Ala-Gln-Glu-Pro-Val-lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Iieu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thre, mais preferivelmente, uma sequência N-terminal que compreen de a sequência acima citada precedida de X, em que X representa uma sequência de aminoácidos que pode conter 2 resíduos de aminoácidos que são convenientemente os seguintes

Gly/Val-lys

e) Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asne, mais preferivelmente, um polipéptido que tem uma sequência N-terminal que compreende a sequência acima referida.

Os polipáptidos particularmente preferidos são como se definiu no primeiro aspecto da presente invenção, especialmente o polipéptido de formula I.

polipéptido de formula I possui também actividade inibitória contra protinase 3·

Os polipéptidos e os seus fragmentos de acordo com

- 6 ΐ a presente invenção podem obter-se sob uma forma biologicamente pura e homogénea. A presente invenção também proporciona um polipéptido como se define na presente memória descritiva não acompanhado por glicosilação natural associada.

Além dos polipéptidos como se definiu anteriormente na presente memória descritiva, a presente invenção também abrange outros produtos que possuem actividade inibitória contra a elastase de leucócitos humanos, tais como análogos de po lipéptidos. Potanto, de acordo com a presente invenção, também se proporcionam análogos polipeptídicos dos polipéptidos como se definiu antes na presente memória descritiva, análogos esses que possuem actividade inibitória contra elastase de leucó eitos humanos.

Estes análogos polipeptídicos incluem polipéptidos que diferem dos definidos anteriormente na presente memória descritiva em termos de identidade ou de posição de um ou mais resíduos de aminoácidos. Por exemplo, esses análogos podem con ter substituições ou adições terminais ou intermédias ou supressões desses resíduos. Esses análogos compartilham da actividade inibitória contra a elastase de leucócitos humanos e po dem, caso assim se pretenda, compartilhar uma ou mais activida des adicionais do polipéptido de fórmula I, tal como actividade inibitória contra a elastase pancreática porcina.

Como exemplos, os produtos preparados de acordo com a presente invenção incluem aqueles que são mais estáveis à hidrólise (e, portanto, podem ter efeitos mais pronunciados ou de maior duração do que os que ocorrem naturalmente); ou que têm um ou mais resíduos de cisteína omitidos ou substituídos por, por exemplos, resíduos de alanina ou de serina e são potencialmente mais facilmente isolados sob a forma activa a par tir dos sistemas microbianos.

Os polipéptidos, fragmentos ou análogos polipépti- 7 -

dicos de acordo com a presente invenção podem ser obtidos sob uma forma biologicamente pura e homogénea.

Os polipéptidos de acordo com a presente invenção podem convenientemente preparar-se por técnicas de engenharia j genética. Os análogos da presente invenção podem preparar-se por expressão de genes que codificam esses análogos. Esses genes podem ser prontamente obtidos por modificações de cADN e genes genomicos, por técnicas de mutagénese dirigidas para o sítio bem conhecidas.

Assim, de acordo com uma outra característica es^e cífica da presente invenção, proporciona-se um polipéptido (co mo se define na presente memória descritiva) ou um seu análogo produzido por tecnologia de ADN recombinante.

De acordo ainda com uma outra característica específica da presente invenção, proporciona-se um processo para a preparação de um polipéptido como se definiu acima na presente memória descritiva, compreendendo o mencionado processo a cultura de uma célula hospedeira transformada com um veículo de expressão plasmídica replicável compreendendo material genético que codifica o citado polipéptido, de tal maneira que o reft rido polipéptido é expressado, e a recuperação do polipéptido assim expressado.

A expressão veículo de expressão plasmídica repli cável”, tal como é utilizada na presente memória descritiva, é usada no sentido mais lato e inclui, por exemplo, plasmídios que são capazes de se replicarem numa célula como elemento extra-cromossómico e aqueles que são capazes de se replicarem por integração no material genético da célula hospedeira.

processo acima mencionado pode realizar-se pelo uso apropriado de qualquer célula hospedeira, tal como E. coli, levedura ou células de mamíferos. Dependendo do hospedeiro em

[ pregado, os polipéptidos de acordo com a presente invenção poj dem ser glicosilados com hidratos de carbono de mamíferos ou J de outros eucarioticos ou podem ser nao glicosilados.

Aprecia-se que quando o metabólito pretendido não passou para fora da célula hospedeira com uma velocidade comer cialmente útil, o hospedeiro pode ser cultivado e colhido como célula intacta e o polipéptido pretendido recuperado extraindo -o subsequentemente das células, por exemplo, depois da separa ção do meio que contém os nutrientes necessários para o desenvolvimento da célula hospedeira. Quando o metabólito passa para fora da célula hospedeira para a solução de cultura que a rodeia, então o polipéptido pode ser recuperado por extracção procedendo de acordo com a maneira de proceder normal.

De acordo com outra característica específica da presente invenção, proporciona-se um hospedeiro transformante capaz de expressar um polipéptido tal como se definiu antes na presente memória descritiva, compreendendo o hospedeiro um veí culo de expressão plasmídica replicável, compreendendo o mencionado veículo material genético que codifica o citado polipéptido .

De acordo ainda com uma outra propriedade característica da presente invenção, proporciona-se um processo para a preparação de um hospedeiro transformante como se definiu na presente memória descritiva, compreendendo o referido processo transformar-se o hospedeiro pela inserção nele de um veículo de expressão plasmídica replicável, veículo esse que compreende material genético que codifica o polipéptido como se definiu anteriormente na presente memória descritiva.

Os métodos apropriados para a introdução do material genético estranho no hospedeiro são geralmente conhecidos da literatura. Esses métodos incluem a formação do veículo de expressão replicável que compreende um vector e o material ge- 9 -

nético estranho e a introdução do veículo no hospedeiro. A introdução do veículo no hospedeiro pode ser facilitada suhmeten do o hospedeiro a um tratamento apropriado, por exemplo, no ca so de E. coll, a um tratamento com solução de cloreto de cálcio .

De acordo com uma outra propriedade característica da presente invenção, proporciona-se um veículo de expressão plasmídica replicável capaz de, num hospedeiro transformante, expressar um polipéptido como se definiu anteriormente na presente memória descritiva.

Assim, proporciona-se também um processo para a preparação desse veículo de expressão plasmídica replicável, compreendendo o mencionado processo a inserção de um gene que codifica um polipéptido como se definiu anteriormente na presente memória descritiva num vector num sítio de inserção apropriado, de modo que se obtém um veículo de expressão plasmí dica replicável que é capaz de dirigir a síntese do polipéptido como se definiu anteriormente na presente memória descritiva.

De acordo com uma outra característica específica da presente invenção, proporciona-se uma sequência de ADN que codifica um polipéptido como se definiu antes na presente memó ria descritiva.

As sequências de ADN de acordo com a invenção incluem sequências úteis em assegurar a expressão em células de hospedeiros quer procarióticas quer eucarióticas de um polipép tido como se definiu anteriormente na presente memória descritiva. As sequências de ADN de acordo com a presente invenção verifica-se que especificamente compreendem

a) uma sequência de ADN representada na Figura 13 e os seus fragmentos, em particular, o fragmento que codifica o polipéptido de fórmula I ou a sua ca10 -

deia complementar;

b) uma sequência de ADN que se hibridiza com uma sequência de ADN representada na Figura 15 ou com um seu fragmento;

c) uma sequência de ADN que, a não ser pela degeneres cência do código genético, se hibridiza com uma se quência de ADN representada na Figura 15 ou com um seu fragmento e, de maneira particular, com o fragmento que codifica o polipéptido de fórmula I.

Estão especificamente compreendidas na alínea b) as sequências de ADN genómico que codificam formas variantes alélicas ou o polipéptido de fórmula I. Freparam-se sequências de ADN especificamente compreendidas na alínea c). As sequências fabricadas podem ser facilmente preparadas de acordo com os métodos de Alton e col., de acordo com o Pedido de patente PCT publicado WO85/O4O53; e de acordo com Edge e col., Nature, Vol. 292, páginas 756-762, 1981.

Os fragmentos das sequências representadas na Figu ra 15 acima mencionadas incluem os fragmentos gerados por digestão sequencial com enzimas de restrição, tais como EcoRI e Sall; e com BspMI e BamHI; assim como o fragmento que codifica o polipéptido de fórmula I. As sequências representadas nas Fi guras 14 e 15 acima citadas são sequências parciais de cADN, enquanto a representada na Figura 16 é a sequência completa de cADN. Assim, proporciona-se também uma sequência de ADN que compreende substancialmente a sequência de ÀDN representada na Figura 14 ou na Figura 16 ou a sua cadeia complementar.

A degenerescência do código genético permite uma liberdade substancial na escolha de codões que podem ser usados para construir um gene para o polipéptido apropriado de acordo com a presente invenção. São normalmente escolhidos os codões que são preferidos pelo hospedeiro.

Podem construir-se amostras de polinucleótidos capazes de hibridização com qualquer porção da sequência de ADN acima referida ou de uma correspondente sequência de ARN ou de cADN. Convém que a amostra do nucleótido compreenda uma sequên cia de nucleótidos capaz de hibridização com o comprimento suficiente da sequência a ser determinada para garantir que a amostra detecte de forma não ambígua a sequência de interesse. Em geral, a amostra é capaz de se hibridizar com pelo menos o_i to nucleótidos consecutivos da sequência a ser determinada.

Assim, de acordo com uma outra característica espe cífica da presente invenção, proporciona-se uma amostra de polinucleótidos que compreende uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridizar com uma sequência de ADN como se definiu anteriormente na presente memória descritiva ou um seu fragmen to ou uma correspondente sequência de ARN, tendo a mencionada amostra, opcionalmente, um componente marcado ou marcador.

As amostras de polinucleótidos de acordo com a pre sente invenção podem ser etiquetadas ou marcadas de acordo com as técnicas conhecidas neste campo, por exemplo, marcadas com 32 p radioactivo de qualquer maneira convencional ou, como variante, radiomarcadas por outros meios bem conhecidos na técni ca de hibridização, por exemplo, para originar amostras rádio35

-marcadas com S. As amostras podem possuir, por exemplo, mar cadores fluorescentes. Como variante, podem ser marcadas com biotina ou com uma espécie semelhante pelo método de D. C.

Ward e col., como se descreve em Proceedings of the 1981 ICN-UCLA Symposium on Development Biology using Purified Genes, realizado em Keystone, Colorado, Estados Unidos da América, de 15 a 20 de Março de 1981, Vol. XXIII 1981, páginas 647 - 658, Academic Press, editor Donald D. Brown e col., ou mesmo marcadas com enzimas pelo método de A. D. B- Malcomn e col., Abstracts of the 604th Biochemical Society Meeting, Cambridge, In glaterra (reunião de 1 de Julho de 1983).

Le acordo com uma outra propriedade característica da presente invenção, proporciona-se um anticorpo capaz de se ligar pelo menos a um fragmento do polipéptido como se definiu anteriormente na presente memória descritiva.

termo anticorpo”, tal como é utilizado na presente memória descritiva, a não ser que o contexto indique outra significação, pode ser considerado como incluindo anticorpos intactos, tais como, por exemplo, anticorpos monoclonais e policlonais, e fragmentos de anticorpos, assim como anticorpos quiméricos como os descritos no Pedido de Patente de Invenção Britânica Numero 2 188 638.

termo fragmentos, tal come é utilizado na presente memória descritiva, a não seja qualificado de modo a pos suir outra significação, deve ser considerado como referindo-se a fragmentos que contém a região de ligação do anticorpo. Tais fragmentos podem ser fragmentos do tipo Fab, que são defi nidos como fragmentos isentos da porção Fc, por exemplo, fragmentos Fab, Fab^ e F(ab^)2» ou podem ser os assim chamados fragmentos de meia molécula, obtidos por clivagem redutora das ligações de dissulfureto que ligam os componentes pesados da cadeia ao anticorpo intacto.

anticorpo de acordo com a presente invenção pode, caso assim se pretenda, possuir um componente marcado ou marcador, por exemplo, como se descreveu anteriormente na presen te memória descritiva, em relação com as amostras de polinucleótidos de acordo com a presente invenção. Assim, os anticor pos podem possuir, por exemplo, um marcador fluorescente. Não é necessário, no entanto, que o anticorpo de acordo com a presente invenção tenha um componente marcado ou marcador. Assim, por exemplo, o anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser detectado por um segundo anticorpo que é um anticorpo em relação aos anticorpos da espécie dos anticorpos de acordo com a presente invenção. 0 segundo anticorpo tem um componente

marcado ou marcador.

Estes anticorpos ou amostras podem ser utilizados para detectar a presença ou indicar a ausência de um polipépti do tal como se definiu anteriormente na presente memória descritiva ou o correspondente ADN ou ARN, como for apropriado, e, portanto, a presença ou a ausência de material que possui actividade inibitória contra a elastase. Assim, as amostras ou os anticorpos podem ser utilizados para indicar se pode estar presente ou ausente uma condição mediada por elastase pelo menos parcialmente provocada por uma ausência de material inibitó rio da elastase.

A potência dos polipéptidos de acordo com a presente invenção para actuarem como inibidores da elastase foi determinada pela capacidade de um composto de acordo com a pre sente invenção inibir a acção de elastase de leucócitos humanos (HLE) num substrato de péptido de baixo peso molecular. Avaliou-se a potência do inibidor obtendo uma determinação cinética da constante de dissociação, K^, do complexo formado pela inte racção do inibidor com HLE.

substrato utilizado foi a anilida metoxi-succinil-alanil-alanil-propil-valina-p-nitroanilida como é descrito por K. Nakajima e col. em J. Biol. Chem. 254, 4027 - 4032 (1979) e por T. Teshima e col. em J. Biol. Chem. 257, N2 9, 5085 - 5091 (1982). A emzima HLE utilizada nestes estudos pode ser obtida a partir da firma Elastin Products de St. Louis, Missouri, Estados Unidos da América ou pode ser purificada de acordo com B. R. Viscarello e col., em Preparative Biochemistry, Vol. 13, páginas 57 - 67 (1983).

Os polipéptidos como se definiu anteriormente na presente memória descritiva podem ser utilizados como são obti dos ou depois de purificados de acordo com uma maneira conheci da e apropriada e formulados em composições farmacêuticas, por

exemplo, por mistura com um diluente ou com uma substância vei cular farmaceuticamente aceitável.

A administração pode fazer-se por meio de várias vias conhecidas na técnica. Em particular, a administração pode efectuar-se por via parentérica, por exemplo, intranasalmente, rectalmente, pulmonarmente ou por meio de injecção como, por exemplo, por via intramuscular ou por meio de injecção subcutâ nea.

As composições farmacêuticas são formuladas de acordo com o modo de administração á ser empregado. Por exemplo, quando a composição ae destina a ser administrada intranasalmente, a composição pode ser formulada sob a forma de aerossol em pó; e quando a composição se destina a ser administrada por meio de injecção, pode ser formulada como suspensão ou solução esterilizada. Os diluentes apropriados incluem soluções aquosas e podem juntar-se aditivos tais como tampões e agentes ten sio-activos.

As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção também incluem formulações de libertação contro lada. Por exemplo, os polipéptidos de acordo com a presente in venção podem ser encapsulados em polímeros biodegradáveis ou dispersos numa matriz desses polímeros de tal maneira que o po lipéptido seja libertado à medida que a degradação da matriz do polímero se realiza.

Os polímeros biodegradáveis apropriados para utilização nas formulações de libertação retardada incluem poliéis teres que se degradam gradualmente por hidrólise quando coloca dos num ambiente aquoso fisiológico. Uma composição farmacêuti ca particular que proporciona a libertação prolongada de um po lipéptido é descrita na Patente de Invenção Europeia Numero 58481. Nesta composição, emprega-se uma polilactida e, quando colocado num ambiente aquoso de tipo fisiológico, o polipépti- 15 -

>! do liberta-se da composição de maneira contínua até que essencialmente todo o polipéptido tenha sido libertado.

Os polipéptidos de acordo com a presente invenção são potencialmente úteis no tratamento de estados em que a pro teólise do tecido mediada por elastase desempenha um papel importante .

Os polipéptidos de acordo com a presente invenção (tal como se definem na presente memória descritiva) podem ser administrados a animais de sangue quente que necessitem de um tal tratamento, particularmente seres humanos, para o tratamen to de condições inflamatórias, condições pulmonares, condições da pele e condições que envolvam secreção mucosa. Os exemplos de condições em que os polipéptidos de acordo com a presente

I invenção são de utilização potencial incluem aterosclerose, ar trite, enfisema, síndroma respiratório de adultos, fibrose cís tica, bronquite, leucémia aguda não linfoblástica e psoríase.

¹ ~ Z ' ~ | A presente invenção também se refere a utilização de um polipéptido (como se define na presente memória descriti va) ou de um seu análogo na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças tais como as acima mencionadas.

Assim, a presente invenção também proporciona um método de tratamento de animais de sangue quente, por exemplo, de seres humanos, que compreende administrar-se uma quantidade eficaz de um polipéptido de acordo com a presente invenção (co mo se definiu anteriormente na presente memória descritiva) ou í de um seu análogo ao citado animal de sangue quente, a fim de tratar doenças como as referidas acima.

A invenção é seguidamente melhor esclarecida, a título de exemplo apenas, por meio dos seguintes Exemplos com referência aos desenhos anexos, em que:

A Figura 1 representa uma maneira de proceder de cromatografia com permuta de catiões utilizada na extracção e purificação do polipéptido de fórmula I a partir de placas pso riáticas.

A Figura 2 representa uma maneira de proceder por cromatografia em fase inversa C8, utilizada na extracção e purificação do polipéptido de fórmula I a partir de placas psoriá ticas.

A Figura 3 representa a maneira de proceder croma tográfica com poli-sulfoetil-aspartamida utilizada na extracção do polipéptido de fórmula I a partir de placas psoriáticas.

A Figura 4 representa uma maneira de proceder por cromatografia em fase inversa em Ο^θ utilizada na extracção e purificação do polipéptido de fórmula I a partir de placas pso riáticas.

A Figura 5 representa uma maneira de proceder por cromatografia em gel analítico usada para determinar o peso mo lecular do polipéptido de fórmula I.

A Figura 6 representa uma maneira de proceder por focagem isoeléctrica usuda para determinar o ponto isoeléctrico do polipéptido de fórmula I.

A Figura 7 represente a titulação de elastase de leucócitos humanos com o polipéptido de fórmula I.

A Figura 8 representa a sequência do polipéptido de fórmula I (o inibidor mais importante”)·

As Figuras 9 a 12 representam a maneira de proceder utilizada para sequenciar o inibidor mais importante (o po

lipéptido de fórmula I).

A Figura 13 representa a sequencia de ADN utiliza da na obtenção da expressão do polipéptido de fórmula I.

As Figuras 14 e 15 representam sequências parciais de cALN para o polipéptido de fórmula I.

A Figura 16 representa a sequência de cADN para o polipéptido de fórmula I.

A Figura 17 representa o plasmídio pUEX2.

A Figura 18 representa o plasmídio pDP258 usado e a maneira de proceder para se obter a expressão do polipéptido maduro de fórmula I em levedura.

A Figura 19 representa a acumulação de polipéptido de fórmula I em levedura.

ISOLAMENTO DO INIBIDOR PE ELASTASE DE LEUCÕCITOS HUMANOS

Colectaram-se escamas de pele de pacientes com psoríase ou dermatite atópica, reuniram-se e extraíram-se em cargas descontínuas com entre 1 e 100 gramas. 0 material das escamas, que incluía calo humano normal, foi suspenso em água destilada (10 a 200 ml), o pH da suspensão foi ajustado a 2,8 usando citrato a 1% e ácido fórmico, diluíu-se com etanol a 10% em volume e congelou-se (-80°).

Efectuou-se então a disrupção mecânica com ultraturrax (uma hora em gelo), ultra-sons (quinze minutos, 400 watts), ultraturrax (uma hora) e centrifugação (10 minutos a 5.000 x g). Extraíram-se novamente os sedimentos assim obtidos com etanol a 50% e 50% de citrato/formiato (pH 3,0) e combinaram-se os sobrenadantes de ambas as extracções. Concentraram18 -

-se os extractos, depois de combinados, por ultrafiltração (Amicon YM5) e dialisaram-se contra formiato de amónio 0,01 M (pH 4,0) para se obter um extracto bruto.

PURIFICAÇÃO

Purificou-se cromatograficamente o extracto bruto obtido pelo processo de isolamento acima descrito (de acordo com as maneiras de proceder descritas abaixo), de maneira a ob ter-se uma amostra homogénea de material que possui actividade inibitória contra elastase de leucócitos humanos.

extracto bruto foi purificado inicialmente por meio de HPCL com permuta de catiões para separar o material que possui actividade inibitória contra elastase de leucócitos i humanos do material como a própria elastase de leucócitos huma nos. Como se mostra na Figura 1, eluíu-se o material que possui actividade inibitória contra HLE como um pico largo entre cerca de vinte e seis e cinquenta e oito minutos. As fracções que contém a parte mais importante do inibidor foram depois pu rificadas numa coluna em fase inversa Οθ e submetidas de novo a cromatografia até se observar aproximadamente a homogeneidade (Figura 2).

Combinaram-se as fracções que contêm material que possui actividade inibitória contra HLE e cromatografaram-se numa coluna Poly LC. A separação proporcionou material que incluía um componente que se verificou ser o inibidor mais impor tante. Este componente foi ainda mais purificado por cromatografia em fase inversa Ο^θ (Figura 4).

Em algumas preparações, realizaram-se operações adicionais de cromatografia de HPLC de exclusão de tamanhos e HPLC em fase inversa de Poly F que foram necessárias com o fim de se obter mais de 95% de pureza (como se prova por ensaios analíticos por cromatografia em fase inversa em Ο^θ, Poly LC e i

- 19 1

pela completa ausência de contaminantes em SLS-PAGE e focagem isoeléctrica).

PERMUTA CATIÓNICA - HPLG

Coluna: TSK CM 3-SW (7,5 x 150 mm, LKB Bromma, Suécia)

Ensaio: 20 minutos de tampão A com um caudal de 0,5 a 1,0 ml por minuto; 30 minutos de gradiente linear ate 100% de tampão B, com um caudal de 1,0 ml por minuto; 20 minutos de tampão B; e 50 minutos de tampão C.

Tampão A: formiato de amónio 0,01 M de pH 4,0.

Tampão B: formiato de amónio 0,5 M de pH 4,0.

Tampão C: formiato de amónio 0,5 M de pH 3,0.

Cromatografou-se o extracto bruto nas condições a cima mencionadas com colheita automática de sessenta gotas por fracção e com detecção com UV a 280 nm. Combinaram-se as fracções que contém material que possui actividade inibitória eluídas pelo gradiente, concentraram-se e dialisaram-se contra TFA a 0,1%.

HPLC EM PASE INVERSA - C_Q

Coluna: Nucleosil 300-7 Coluna de HPLC Οθ (250 x 14,7 mm, Macherey-Nagel, Duren, Alemanha).

Ensaio: Caudal - 3 ml por minuto;

ml de tampão B a 20%; 75 ml de gradiente linear até 60% de tampão B; 15 ml de gradiente linear até 100% de tampão B; 30 ml de tampão B a 100%.

Tampão A: 0,1% de TFA.

Tampão B: 0,1% de TFA em acetonitrilo.

As amostras foram submetidas a cromatografia nas condições acima mencionadas com detecção de UV a 215 nm e com

recolha do pico. Combinaram-se as fracções que contêm material que possui actividade inibitória, eluídas com gradiente até 60% de tampão B, liofilizaram-se e recromatografaram-se na mes ί ma coluna e em condições idênticas.

HPLC EM POLI-(2-SULFO-ETIL-ASPARTAMILA)

Coluna: Poly LC (200 x 4,6 mm, Columbia, ML, Estados Unidos da América).

Ensaio: caudal 1 ml por minuto ml de tampão A; 30 ml de gradiente linear até 50% íj de tampão B; 10 ml de gradiente linear até 100% de tam pão B; 10 ml de tampão B.

Tampão A: KHgPO^ 5 mM, pH 3,1 + 25% de acetonitrilo.

Tampão B: KH₂P0^ 5 mM, KC1 0,5 M, pH 3,1 + 25% de acetonitrilo.

Solubilizaram-se amostras liofilizadas em tampão A e em seguida cromatografaram-se nas condições acima indicadas com detecção de UV a 220 nm e com recolha no pico.

KPLC 04 FASE INVERSA - C_1Q

Coluna: Nucleosil 100-5 C^g (250 x 4,6 mm, Bischoff, Loenberg, Alemanha)

Ensaio: caudal 1 ml por minuto;

ml de gradiente linear desde 10 até 40% de tampão B; 10 ml de gradiente linear até 100% de tampão B; 10 ml de tampão B.

Tampão A: 0,1% de TFA

Tampão B: 0,1% de TFA em acetonitrilo.

As amostras foram submetidas a cromatografia nas condições acima mencionadas com detecção por UV a 215 nm e com recolha no pico. Caso seja necessária, tornam a cromatografar21 -

-se as fracções que contêm material que possui actividade inibitória no mesmo sistema, ate se conseguir a homogeneidade.

HPLC DB EXCLUSÃO DE TAMANHO

Coluna: coluna TSK 2000 (600 x 7,5 mm, LKB, Bromma, Suécia)

Ensaio: caudal 1 ml por minuto;

0,1% de TFA.

As amostras foram submetidas a cromatografia nas condições acima referidas com detecção por UV a 215 nm e com vinte gotas colectadas por fracção. Calibrou-se Mr usando os péptidos Val-Grly-Ser-Glu, insulina, fragmentos da cadeia B 22- 36, aprotinina, albumina de ovo de galinha e albumina de soro bovino.

HPLC IM FASE INVERSA - POLY F

Coluna: coluna Poly F (80 x 6,2 mm, Lu Pont, Breieich, Alemanha)

Ensaio: caudal 1 ml por minuto;

ml de gradiente linear de 10% de tampão B até 40% de tampão B; 2 ml de gradiente linear até 100% de tampão B; 10 ml de tampão B.

Tampão A: 1% de NH^

Tampão B: 1% de NH^ em acetonitrilo.

Solubilizaram-se amostras liofilizadas em tampão

A e submeteram-se a cromatografia nas condições acima menciona das com detecção por ultravioletas a 215 nm e com recolha de acordo com o pico.

DETERMINAÇÃO DAS PROTEÍNAS

As concentrações de proteína foram determinadas

por integração da curva de absorvãncia a 215 nm em cromatografia em fase inversa C^g. Como agentes de calibração, utilizaram-se os seguintes péptidos: ubiquitina (Sigma) e eglina C re combinante (Ciba-Geigy).

SDS - PAGE

Realizou-se a electroforese em gel de poliacrilaί mida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) usando um sistema Pharmacia Phast (Pharmacia, Freiburg, Alemanha) e geles de SDS a 20% homogéneos, de acordo com as instruções do fabricante. Liofilizaram-se as amostras e reduziram-se por fervura (cinco minutoa) em H^PO^ 0,01 M, ureia 8 M, SDS a 2,5%, azul de brom£ fenol a 0,02%, pH 6,8. Como padrões, utilizaram-se fragmentos de mioglobulina (Pharmacia) ou mioglobina de cavalo (Serva) e ubiquitina (Sigma). Realizaram-se as manchas com prata de acor do com as instruções do fabricante (Sigma).

EOCAGIM ISOELÉCTRICA ensaio de focagem isoeléctrica realizou-se utilizando Servalyt Precoates de pH 3 - 10 e Test-Mix 9 (Serva).

A pré-focagem realizou-se durante trinta minutos a 5 watts e utilizou-se a mancha de prata (Sigma) ou a mancha de azul de Comassie R, de acordo com as instruções de Serva.

Em paralelo, os pré-revestimentos foram cortados em peças e eluídos para localizar os péptidos inibitórios acti vos. Eluíram-se troços com aproximadamente 1 mm com 100 microlitros de acetonitrilo. Deixaram-se secar os eluídos e resolve ram-se em 100 microlitros de tampão (HEPES 0,1 M, NaCl 0,5 M, BSA a 1%, pH 7,5) contendo 20 nanogramas de HLE. Depois de trinta minutos de incubação, determinou-se a actividade remanescente de HLE.

- 23 PROPRIEDADES BIOLÓGICAS

P® ι Determinou-se j lo inibidor proeminente de ! mais abaixo. Os resultados a inibição de diversas proteases acordo com os métodos descritos estão reunidos na Tabela I.

TABELA 1

PROTEASE	CONSTANTE DE DISSOCIAÇÃO (K±)	SUBSTRATO
elastase de leucócitos humanos	3 x 10_1°M	AAPVpNA 2 mM
elastase pancreática porcina	1 x 109 M	AAPV-AFC 0,1 mM
catepsina G humana	n.i.	AAPPpNA 0,5 mM
Alfa-quimotripsina	n.i.	AAPPpNA 0,5 mM
tripsina	n.i.	TGPLpNA 0,1 mM
plasmina	n.i.	TGPLpNA 0,1 mM

(n.i.: ausência de inibição)

INIBIÇÃO DA ELASTASE DE LEUCÓCITOS HUMANOS

Determinou-se a actividade de elastase de leucóci tos humanos (EC 3.4.21.37) de acordo com o método de Nakajima e col. (7). Determinou-se a inibição de HLE utilizando o pépti do sintético metoxi-succinil-alanil-alanil-propil-valil-p-nitro-anilida (AAPVpNA, Sigma).

Incubou-se a amostra (100 microlitros) e 100 microlitros de HLE (200 ng/ml; Elastin Products Corporation, Paci fic, MO, Estados Unidos da América) em tampão de ensaio (HEPES 0,1 M, NaCl 0,5 M, DMSO a 10%, pH 7,5) durante trinta minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se substrato (800 microlitros 0,5 mM) em tampão de ensaio.

Seguiram-se as alterações da absorvãncia a 405 nm até uma hora e calculou-se a inibição percentual a partir da actividade residual e dos controlos. Determinou-se a constante de dissociação (Ki) de acordo com o método de Green e Work (8) no mesmo sistema, usando substrato 2 mM e HLE (1 micrograma/mi lilitro) (concentrações finais).

INIBIÇÃO DE ELASTASE PANCREÁTICA PORCINA

Determinou-se a actividade da elastase pancreática porcina (E. C. 3.4.21.36) utilizando substrato fluorogénico de metoxi-succinil-alanil-alanil-propil-valil-trifluormetil-cumarina (AAPV-APC, Bachem, Bubendorf, Suíça).

Pré-incubou-se elastase (100 microlitros) e inibi dor (100 microlitros) durante trinta minutos. Adicionou-se en tão uma solução de substrato (1,8 ml de uma solução 0,1 mM). Seguiu-se a fluorescência, Ex 400 Em 505, e calculou-se a inibição percentual a partir da actividade inicial das amostras e dos controlos. Determinou-se o valor da constante de dissociação (Ki) de acordo com o método de Green e Work (8).

INIBIÇÃO DE CATEPSINA G E DE ALFA-QUIMOTRIPSINA

Determinaram-se as actividades da catepsina G e de alfa-quimotripsina de acordo com o método de Nakajima e col.

(9), usando um análogo de HLE - succinil-alanil-alanil-propil-fenilalanil-p-nitro-anilida (AAPFpNA, Sigma). Para as experiências de inibição, a concentração mais elevada do inibidor

foi de 1 micrograma/mililitro representando uma concentração molar tripla em comparação com catepsina G e alfa-quimotripsina.

INIBIÇÃO DE TRIPSINA E DE PLASMINA

Incubaram-se 100 microlitros de inibidor (1 micro grama/mililitro) e 100 microlitros de tripsina (1 micrograma/ /mililitro) ou de plasmina (1 micrograma/mililitro), conforme for apropriado, durante trinta minutos antes de se adicionar o substrato, tosil-glicil-propil-lisina-pNA 0,1 mM (Boehringer, Mannheim, República Federal da Alemanha) em HEPES 0,05 M, NaCl 0,12 M, pH 7,5.

INIBIÇÃO DE PROTEINASE 5

Purificou-se proteinase 3 a partir de leucócitos polimorfonucleares humanos, usando o método de Ludemann descri to em J. Exp. Med. 171, 357 - 362, 1990. A ausência de elastase de leucócitos humanos e de catepsina G foi confirmada pela falta de actividade da preparação de proteinase 3 com os substratos metoxi-succinil-ala-ala-pro-val-p-nitro-anilida (AAPVpNA) e succinil-ala-ala-phe-p-nitroanilida respectivamente de acordo com o método de Nakajima (7).

Determinou-se a actividade elastinolítica por hidrólise de elastina de núcleos de ligamento bovino PITO (Elastin Products Corporation, Estados Unidos da América).

Pré-incubou-se a preparação de proteinase 3 (1 mi crolitro) a 37° C durante trinta minutos com o inibidor de elastase de fórmula I (0 - 1 micrograma) em tampão de carbonato (50 microlitros, 0,1 M), NaN^ (0,02%), Brij 35 (0,01%), pH 8,5 e elastina-PITC (1 mg) em tampão de carbonato (100 microlitros,

0,1 M), NaN, (0,02%), Brij 35 (0,01%), pH 8,5. Incubou-se a ** mistura a 37 C com ligeira agitaçao durante quatro horas e,

em seguida, centrifugou-se a 6 000 x g. Diluíram-se os sobrena dantes a 1 ; 20 e determinou-se a fluorescência da elastina-FITC solubilizada usando um leitor de placa de microtitulação Perkin Elmer IS 50 a Ex 489 nm, Em 513 nm. Corrigiu-se a fluorescência pelos controlos livres de enzima e exprimiu-se a ini bição em percentagem de inibição em relação aos controlos livres .

Verificou-se que o polipéptido de fórmula I é um inibidor potente de proteinase 3, com uma actividade correspon dente a um valor da ΟΙ,-θ Igual a 9,5 x 10 M.

CARACTERIZAÇÃO

A cromatografia de exclusão de tamanhos analítica (Tsk 2000) do inibidor proeminente deu como resultado uma massa molecular aparente compreendida entre 5 e 10 kD (Figura 4). A massa molecular do inibidor proeminente de acordo com o ensaio de SDS-PAGE era igual a cerca de 9 kD, com a migração na proximidade da ubiquitina (massa molecular 8500), como se mostra na Figura 5.

ponto isoeléctrico do inibidor proeminente veri ficou-se ser pH 9,7, como se mostra pela mancha de prata e por detecção enzimática paralela do inibidor em troços de gel (Figura 6).

inibidor proeminente verificou-se inibir HLE elastase da serina e elastase pancreática porcina. No entanto, nem a alfa-quimotripsina nem a tripsina nem a plasmina foram significativamente inibidas por um excesso pelo menos triplo do inibidor. A constante de dissociação de equilíbrio (Ki) para a inibição de HLE determinou-se de acordo com o método de Green e Work (8), como se mostra na Figura 7·

Verificou-se também que o inibidor é estável em

presença de ácidos.

! DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA DO INIBIDOR DE HLE

I

Sequenclamento Dlrecto

I Submeteram-se aproximadamente 5 microgramas do ma ί , ~ \ terial purificado do inibidor proeminente a analise de sequenciamento, usando um sequenciador de fase gasosa de modelo 470A

Applied Biosystems com um modelo 120A em análise em série das fenil-tio-hidantoínas. Este ensaio forneceu uma sequência de trinta resíduos, como se representa na Figura 8, mas com as cisteínas deduzidas devido à ausência de qualquer resíduo iden tificado. 0 rendimento inicial dos resíduos de aminoácidos foi compatível com uma única cadeia de polipéptido de tamanho mole cular de 6 - 8 kD.

Carboxamldometilação (CAM)

Dissolveu-se o inibidor proeminente purificado (10 microgramas) em água (50 microlitros) e misturou-se com cloridrato de guanidina 6 M, tampão de pH 8,5 de cloridrato de tris 0,1 M (30 microlitros).

Lavou-se o tubo com azoto e adicionou-se uma solu ção de ditiotreitol (5 microlitros de uma solução a 50 mg/ml em tampão de guanidina). Lavou-se de novo o tubo com azoto, fe chou-se e conservou-se a 37° C durante quatro horas. Adicionou j -se iodo-acetamida (5 mg) em tampão de guanidina (50 microlitros) e, depois de se lavar novamente com azoto, manteve-se o tubo às escuras à temperatura ambiente durante uma hora. Diluíuee a amostra até perfazer 1 ml com solução aquosa a 0,1% de ácido triflúor-acético e aplicou-se directamente a uma colu na de Vydac C18 (25 x 0,46 cm). Desenvolveu-se a coluna com o caudal de 1 ml/minuto com um gradiente linear de 0,1% de ácido triflúor-acético em água até ácido triflúor-acético a 0,1% em acetonitrilo durante setenta minutos.

- 28 I sajaãsgmg

Obtiveram-se assim dois picos (Figura 9), um componente menor correspondente às fracções 33 - 34 e um componen te mais importante (cerca de 67%) a 35 - 36. Cada componente foi exposto separadamente de novo às condições de carboxamidometilação mas a cromatografia mostrou que estava inalterado mostrando assim que a reacção original se tinha completado. Análise de Aminoácidos

Hidrolisou-se metade da quantidade do componente menor resultante da carboxamidometilação com ácido clorídrico 6 N contendo 1% de fenol, em vácuo a 110° C durante dezasseis horas. Analisou-se o produto da hidrólise utilizando uma anali sador de aminoácidos LKB Alpha e obtiveram-se as proporções in dicadas no Quadro 2. Muito embora a amostra analisada fosse

muito pequena,	não se aplicou a	correcção	do fundo.
	TABELA 2
Aminoácido	Proporção com	base em	Aminoácidos encon-
	péptido de 57	amino-	trados no péptido
	ácidos		sequenciado
Asp/Asn/Cys	8,8		4+8 cys
Thr	2,1		2
Ser	4,5		3
Glu/C-ln	5,5		4
Pro	7,0		8
ciy	7,4		5
Ala	3,0		3
Vai	3,0		3
Met	1,6		2
Ile	2,8		4
Leu	3,4		3
Phe	1,1		1
Lys	4,5		5
Arg	2,3		2

- 29 Digestão com Quimotripsina

Tomou-se a outra metade do derivado carboxamidome tilado (CAM) existente nas fracções 55 - 54 em solução de bicarbonato de amónio 0,1 M (50 microlitros) e cloreto de cálcio 0,2 Μ (1 microlitro) e tratou-se com quimotripsina (Worthington, 10 microlitros de uma solução contendo 20 microgramas/mililitro). Conservou-se a solução a 57° C durante uma hora e, em seguida, diluíu-se com ácido trifluor-acético a 0,1% em água (200 microlitros) para carregar directamente na coluna Vydac C-^θ. Fez-se passar um gradiente linear até 0,1% de ácido trifluor-acético em acetonitrilo durante sessenta minutos com um caudal de 1 ml/minuto. Isto originou três picos principais, como se mostra na Figura 10. Sequenciou-se cada um destes o mais possível e os resultados estão indicados mais adiante.

Cg Digeriu-se metade do produto carboxamidometilado (CAM) existente nas fracções 55 - 56 com quimotripsina, nas mesmas condições. 0 perfil do ensaio de HPLC (Figura 11) mostrou que tinha ocorrido uma degradação mais extensa, muito emhora os picos 1 e 5 (Figura 10) parecessem estar presentes na mesma proporção que os picos 1 e 8 do segundo digerido. 0 outro pico (2 na Figura 10) era relativamente muito mais pequeno no segundo digerido e não claramente na mesma posição em que estavam os outros dois. Os picos adicionais de Cg, isto é, 5, 4, 6, 7 e 9 foram sequenciados. Estes são representados (Figura 8) à parte do pico 7 que prova que têm a mesma sequência que 6 na medida em que foi traçado.

Digestão com Tripsina

T. A parte restante do derivado principal carhoxamidometilado (CAM), fracções 55 - 56, foi tomada com solução 0,1 M de bicarbonato de amónio (50 microlitros) e de cloreto de cálcio 0,2 Μ (1 microlitro) e tratada com tripsina (200 ng em 10 microlitros de bicarbonato de amónio 0,1 M). Manteve-se a

J solução a 37° C durante trinta minutos, diluíu-se com solução aquosa 0,1% de ácido triflúor-acético e carregou-se imediatamente para uma coluna C-^θ que se desenvolveu como no caso dos outros produtos de digestão com enzimas (Figura 5). Este trata mento mostrou a existência de dois picos de produtos definíveis e que não permanecia qualquer material de partida. Os dados da sequência relevantes estão representados na Figura 1.

Realizou-se uma análise de aminoácidos individuais que originou uma indicação aproximada em vez de rigorosa do teor de aminoácidos que ajudou a selecção de enzimas para a de gradação em fragmentos mais pequenos.

sequenciamento directo forneceu os primeiros trinta resíduos e esta conclusão foi confirmada pelo fragmento de tripsina de grandes dimensões TIO. As condições de reacção com tripsina permitiram que os fragmentos de grandes dimensões dos produtos principais, isto é, não todas as ligações de lisi na, fossem clivadas e esses fragmentos abrangessem a estrutura completa, como se indica na Figura 8. Os pontos de clivagem li mitaram-se a resíduos básicos.

Em contraste, a quimotripsina não clivou depois do resíduo aromático mas clivou depois de dois grupos de meti£ nina e também depois de leucina na posição 33. Além disso, a clivagem ocorreu depois da leucina na posição 20.

A glutamina C-terminal foi considerada na base de um resíduo muito pequeno mas detectável encontrado tanto nos péptidos T9 e C2 - 3 a seguir a picos intensos de prolina. No entanto, isto pode ser antecipado a partir desse resíduo C-ter minai. Diversos outros péptidos de quimotripsina, não incluídos na Figura 8, proporcionaram outra confirmação da estrutura.

Sequenciaram-se os produtos de digestão com quimo tripsina do derivado mais pequeno carboxamidometilado CAM o

mais longe possível, obtendo-se os seguintes dados: i (cf C? _ Ile-Arg-Cys-Ala-Met (cf C£ _ g) Ala-Gin-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val- Gly/Ser-Xaa-Lys-Pro-Gly_ 2 Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-Ile-Lys-Lys-Cys-Cys-Gly/Glu-Gly-Ser-CysA partir dos dados disponíveis, não foi possível detectar diferenças entre os derivados mais concentrados e menos concentrados carboxamidometilados (CAM). Isso não é devido a qualquer extensão ou supressão na extremidade N.

A estrutura estabelecida (Figura 8) é a de um polipéptido de comprimento pequeno predominantemente básico. Tem um teor invulgarmente elevado de prolina para essa molécula e também a glicina e a cisteína indicam uma molécula apertamente encaixada.

Além do inibidor proeminente, que compreende um polipéptido de cinquenta e sete resíduos, isolou-se outro mate rial que possui actividade inibitória da elastase de leucócitos humanos e polipéptidos neles parcialmente sequenciados. Ob

tiveram-se os seguintes	5 resultados:
Pico	II -	componente componente	principal E secundário D.
Pico	III -	componente componente	principal L secundário E.
Pico	IV -	componente componente	principal B secundário C.
Pico	V -	componente principal A 0 componente secundário começa na mesma posição

Componente A : Asn-Gly-Gin-Asp-Pro-Val-Lys-Gly-Gin-Val-Ser- Val-Lys- G-ly- Gln-Asp-Lys-Val-Lys-Ala-Gin-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro.

Componente B: Gly/Ala-Gln/Val-Asp-Lys-Val-Lys-Ala-Gln-Glu-Pro-Vai-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu.

Componente C : Asp-Lys-Val-Lys-Ala-Gin-Glu-Pro-Vai-Lys-Gly-Pro-Vai-S er-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys.

Componente D : Gly/Val-Lys-Ala-Gin-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr.

Componente E : Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn.

Nas sequências N-terminais acima referidas, as se quências 1-19, 1- 6 e 1- 4 dos Componentes A, B e C foram respectivamente determinadas com menor certeza do que a parte seguinte da sequência.

Os componentes adicionais isolados verificou-se te rem propriedades semelhantes ao inihidor principal, por exemplo, propriedades biológicas semelhantes.

material que possui actividade inibitória contra elastase de leucócitos humanos verificou-se, assim, que compreende um inihidor principal compreendendo um polipéptido estável a ácidos que se supõe ligar a elastase de leucócitos humanos na proporção molar de 1 : 1. Este inihidor supõe-se que é ligado numa estrutura semelhante a gaiola com um certo

número de ligações de dissulfureto que mantêm o péptido nesta forma.

Uma elevada afinidade e especificidade para elastase e, em particular, para HLE, torna o inibidor útil no tratamento de condições em que a proteólise de tecido mediada por elastase desempenha papel importante, por exemplo, na psoríase e no enfisema.

Também se isolaram outros polipéptidos que indicam uma família de polipéptidos com propriedades semelhantes ao inibidor principal e, na realidade, o sequenciamento parcial de polipéptidos relacionados indicou a presença de, pelo menos, uma parte da sequência de aminoácidos do inibidor proeminente .

A proteinase 3 é a terceira protease de serina que degrada a elastina, além da elastase de leucócitos humanos e da elastase pancreática porcina, que é efectivamente inibida pelo inibidor proeminente (o polipéptido de fórmula I). Como es te inibidor parece ser um regulador fisiológico da proteólise de tecido mediado por elastase de leucócitos humanos na pele e, provavelmente, em outros órgãos, parece ser interessante que este inibidor também iniba a proteinase 5.

Ambas as enzimas da elastase de leucócitos humanos são constituintes dos grânulos azurofílicos dos neutrófilos e ambas são capazes de provocar a destruição de tecidos de maneira semelhante a enfisema em cricetos depois da instilação da enzima nas vias respiratórias (R. C. Kao, N. G. Wehner, K.

M. Skubitz, B. H. Gray e J. R. Huidal, proteinase 3 a Distinct Human Polymorphonuclear Leukocyte Proteinase that produces Emphysema in Hamsters, J. Clin. Invest. 82, 1963 - 1973, 1988). Como este inibidor é capaz de inibir qualquer enzima depois da pré-absorção pela enzima, este inibidor é de valor terapêutico potencial nas doenças dos pulmões com destruição do tecido me- 34 -

diada por elastase e proteinase 3·

Síntese do Inibidor de Elastase de Leucócitos Humanos polipéptido de fórmula I (o inibidor proeminen te) foi sintetizado procedendo de acordo com a seguinte manei ra de proceder.

Concebeu-se uma sequencia de ADN que codifica a sequência de aminoácidos do polipéptido de fórmula I de acordo com as seguintes considerações:

1) Extremidades coesivas de cadeia única para permitir a ligação a sítios apropriados de um plasmídio.

2) Uma série de sequências de endonuclease de restrição na extremidade 5’ para facilitar a subsequente manipulação genética.

3) Codões de terminação da translação.

4) Codões na extremidade 5' da região de codificação foram normalmente escolhidos de maneira a serem ricos em A/T. Outros codões foram normalmente escolhidos como preferi dos para a expressão em levedura e/ou em E. coli.

gene foi reunido a partir dos seis oligonucleótidos indicados na Tabela 3.

TABELA 3

CÓDIGO SEQUÊNCIA (5' a 3') TAMANHO (Bases)

ELI1	AAT	TCG	AGC	TCG	GTA	CCA	TAC	CTG
	CAT	ATG	CTC	AAG	AAC	CAG	TTA	AAG
	GTC	CTG	TGT	CTA	CTA	A			64

ELI2	CCT TTA GGT	GGC ACT ATG	TTA GGT GTA	GTA GAC ACA GGA TCT TGA GCA TAT	CCT GCA
CCG AGC	TCG
ELI3	GCC	AGG	TTC	TTG	TCC	TAT	TAT	CTT
	GAT	TCG	TTG	CGC	TAT	GTT	AAA	CCC
	ACC	TAA	CCG	TTG	TTT	GAA	GG
ELI 4	TCA	GTG	TCC	TTC	AAA	CAA	CGG	TTA
	GGT	GGG	TTT	AAC	ATA	GCG	CAA	CGA
	ATC	AAG	ATA	ATA	GGA	CAA	GAA
ELI 5	ACA	CTG	ATT	GTC	CAG	GTA	TCA	AAA
	AGT	GCT	GTG	AAG	GTT	CCT	GCG	GTA
	TGG	CTT	GTT	TCG	TTC	CAC	AAT	AAT
	AG
ELI 6	GAT	CCT	ATT	ATT	GTG	GAA	CGA	AAC
	AAG	CCA	TAC	CGC	AGG	AAC	CTT	CAC
	AGC	ACT	TTT	TGA	TAC	CTG	GAC	AA

Preparação dos Oligonucleótidos

Prepararam-se as sequências de oligonucleótidos indicadas na Tabela 3 num sintetizador de ADN Applied Biosystems 380A a partir de 5’-dimetoxi-tritil-base-nucleósido prote gido-2-ciano-etil-N,N-di-isopropil-fosforamidites e nucleósidos protegidos ligados a suportes de vidro de poros controlados numa escala de 0,2 micromoles de acordo cora protocolos for necidos por Applied Biosystems Inc.

Cada oligonucleótido, depois da clivagem a partir do suporte sólido e da eliminação de todos os grupos de prote£ ção, foi dissolvido em água (1 ml). Adicionou-se uma solução de acetato de sódio 3 M (pH 5,6; 40 microlitros) e adicionou-se etanol ( 1 ml) às soluções de oligonucleótidos (400 micro litros) e guardaram^se as misturas a -70° C durante vinte horas. Colectaram-se os precipitados resultantes por centrifuga- 36 -

;j ção (13.000 rotações por minuto durante dez minutos) e lavaram-se os peletes com etanol : água (7:3) (200 microlitros) e, em seguida, secaram-se rapidamente in vacuo e dissolveram-se em água (15 microlitros) e 10 microlitros de uma mistura de for mamida/corante (NaOH 10 mM, EDTA 0,5 mM, azul de bromofenol 0,01%, xileno-cianol 0,01%, formamida 80%).

Purificaram-se os oligonucleátidos num gel de poliacrilamida a 10% em solução 50 mM de borato de tris (pH 8,3) contendo ureia 8,3 M.

Identificaram-se os oligonucleátidos de comprimen to correcto por manchas de ultravioleta (Narang e col., 1979, em Methods in Enzymology, Vol. 68, 90 - 98) - normalmente a banda mais proeminente - cortada do gel e electro-eluída em so lução 5 mM de borato de tris (pH 8,3) a 300 mV durante três a quatro horas. Concentrou-se a solução aquosa até cerca de 200 microlitros por tratamento com n-butanol (mistura, centrifugação e separação da fase orgânica superior). Precipitou-se o oligonucleátido purificado a -70° C durante vinte horas a partir de uma solução de acetato de sódio 0,3 M por adição de eta nol (2,5 volumes).

Formação do Gene

Fosforilaram-se oligonucleótidos ELI2 a ELI5 (200 pM de cada um) com polinucleótido-quinase T4 (3,6 unidades) du rante duas horas a 37° C em 25 microlitros de uma solução contendo ATP (800 pM contendo 25 pM de gama-^p ATP), espermidina 100 micromolar, DTT 20 mM, MgClg 10 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 9,0) e EDTA 0,1 mM.

Aqueceram-se as soluçoes a 100 C durante cinco mi nutos para terminar as reacções e depois misturaram-se aos pares como se mostra na Tabela 2, para originar duplexes I a III. (Utilizaram-se oligonucleótidos ELI1 a ELI6 (200 mM em 25 mi- 37 -

crolitros) não fosforilados). Adicionou-se acetato de sódio M (pH 5,6, 200 microlitros) e etanol (850 microlitros) e precipitaram-se os monómeros duplos a -20° G durante vinte horas. Golectaram-se os precipitados resultantes por centrifugação e lavaram-se com etanol : água (7 : 3) e depois dissolveram-se em água (50 microlitros). Analisaram-se os pares de oli í gonucleótidos conjuntamente aquecendo primeiramente as soluções a 100° C durante dois minutos em banho de água à ebulição. Depois deixou-se arrefecer lentamente o banho até 40° C (cerca de quatro horas). Combinaram-se as soluções que contêm os duplexes I e II, liofilizaram-se e dissolveu-se em 30 microlitros de uma solução que contém T4- ADN ligase (1 unidade; BRL), Tris 50 mM (pH 7,6), cloreto de magnésio 10 mM, 5% (em peso por volume) de PEG 8000, 1 mM de ATP, 1 mM de DTT (BRL, Pocus, Vol. 8, N^s 1, Inverno de 1986) e ligou-se o ADN a 30° C durante cinco minutos, seguidos por vinte horas a 16° C.

Adicionou-se acetato de sódio 3M (20 microlitros) e água (150 microlitros) e precipitou-se o produto por adição de etanol (750 microlitros) e arrefeceu-se a -20° C durante vinte horas. Colectou-se o precipitado por centrifugação e lavou-se com etanol (1 ml) e, em seguida, dissolveu-se em água (15 microlitros) e mistura de formamida/corante (10 microlitros ) e purificou-se em gel contendo 10% de poliacrilamida em tris-borato 50 mM (pH 8,3), EDTA 1 mM e ureia 8,3 M.

Identificaram-se bandas para cadeias com o compri mento de cento e trinta e duas bases e cento e trinta e cinco bases por auto-radiografia e isolaram-se conjuntamente por electro-eluição de um troço de gel simples, como se descreveu acima para ® sequênciaB individuais de oligonucleótidos. Anelisaram-se as cadeias de ADN aquecendo em primeiro lugar uma solução aquosa (50 microlitros) a 100° C durante dois minutos e depois deixando arrefecer até 4-0° C durante quatro horas.

Ao produto da ligação acima mencionada (I e II), adicionou-se o duplex III, essencialmente como se descreveu pa ra a preparação daquele produto, com a diferença de se ter aquecido a mistura a 40° C antes de se anelisarem as extremidades coesivas. Purificou-se o produto, constituído pela sequência de genes representada na Figura 13, num gel a 8% de poliacrilamida e isolou-se como se descreveu acima por electro-elui ção de um troço do gel. Depois da precipitação, fosforilou-se o gene com T4 polinucleótido-quinase como se descreveu anterior mente para os oligonucleótidos individuais e depois dissolveu-se em água (20 microlitros).

TABELA 4

NÚMERO DE BASES ΈΜ

DÚPLEX	OLIGONUCLEÓTIDOS	CADEIA SUPERIOR	CADEIA INFERIOR
I	ELI1 + ELI 2	64	66
II	ELI3 + ELI4	68	69
III	ELI5 + ELI6	74	71

Clonação do Gene Sintético do Inibidor de Elastase Humana

Clonou-se o gene sintético acima descrito no vector de plasmídio pUC18 (exBRL 52O-5363SA), que contém uma sequência de multi-clonação.

Para a preparação do vector, dissolveram-se 10 mi crogramas de pUC18 em água (42 microlitros) e 10 x tampão de restrição B (BCL). Adicionou-se a endonuclease de restrição BamHI (3 microlitros) (BCL, 8 unidades/microlitro) e incubou-se a mistura a 37°C durante uma hora, até que o plasmídio linearizado fosse predominante em relação às formas super-helicoidais e circulares com entalhes. Precipitou-se o ADN com eta nol a 4° 0 durante trinta minutos, lavou-se com etanol (7 : 3)» em seguida dissolveu-se em água (44 microlitros), 10 vezes tam

pão salino elevado (BCL). Adicionou-se a endonuclease de restrição EcoRI (1 microlitro) (BCL, 90 unidades/microlitro) e in cubou-se a mistura a 37° C durante uma hora até que fosse predominante o fragmento de grandes dimensões EcoRI-BamHI. Preciί pitou-se o ADN a -20° C durante vinte horas, lavou-se com etanol : água (7 : 3) e, em seguida, dissolveu-se em água (20 microlitros).

Purificou-se o fragmento de grandes dimensões EcoRI - BamHI num gel de agarose preparativo a 1%, electro-eluíu-se e precipitou-se como se descreveu anteriormente e, em í seguida, dissolveu-se em água (20 microlitros). Para ligação do gene sintético, incubou-se a 16° C durante quatro horas uma mistura do vector de ADN (2 microlitros da solução do fragmento EcoRI - BamHI), gene sintético (5 microlitros da solução aquoda anteriormente descrita), 5 x tampão de ligase (6 microlitros - tris 250 mM de pH 7,6, MgCl₂ 50 mM, 25% em peso volume de PEG 8000, 5 mM de ATP, 5 mM de DTT exBRL), água (15 microlitros) e T4 ADN ligase (2 microlitros, 1 unidade/microlitrq

Usou-se directamente a mistura de ADN (ou 1 micro litro de mistura de ligação pura ou 2 microlitros de mistura de ligação diluída 5 x com água) para transformar a estirpe HB101 de E. coli. Adicionou-se a mistura de ADN (1 ou 2 microlitros) às competentes células de E. coli HB101 (20 microlitros, BRL) em gelo e incubou-se a mistura em gelo durante quarenta e cinco minutos e depois submeteu-se a choque térmico a 42° G durante quarenta e cinco segundos. Depois de dois minutos em gelo, adicionaram-se 100 microlitros de tampão SOC (bac totriptona 2%; extracto de levedura 0,5%; NaCl 10 mM; KC1 2,5 mM; MgCl₂, MgSO^ 20 mM (10 mM de cada); glucose 20 mM) e incubou-se a mistura a 37°C durante uma hora.

Placaram-se partes alíquotas das suspensões em placas L com 50 microlitros/mililitro de ampicilina. Escolheram-se os transformantes relativamente à presença do gene sin- 40 -

tético clonado por análise de hibridização de colónias usando os métodos correntes descritos em Molecular Cloning; a Labora tory Manual”, por Maniatis e col. (Cold Spring Harbor) e no Pe dido de Patente de Invenção Britânica Numero 8502605.

Colocou-se um total de cento e sessenta colónias em filtros (Schleicher & Schuell), desenvolveu-se a 37°C duran te vinte horas, submeteu-se a lise e aqueceu-se até cozer. Hibridizou-se o filtro a 65° C durante vinte horas com uma amostra radioactiva preparada a partir da sequência de oligonucleó tidos ELI3 (Tabela 1) utilizando um estojo de marcação aleatório (Pharmacia). Desenvolveram-se seis colónias (34, 40, 42, 106, 109 e 156) que originam um sinal de hibridização positivo no caldo L a 37° C durante vinte horas em uma escala pequena (100 ml) e preparou-se o plasmídio de ADN por centrifugação com um gradiente de cloreto de césio, essencialmente como se descreve em Molecular Cloning; a Laboratory Manual” por Mania tis e col. (Cold Spring Harbor).

Sequenciou-se o ADN pelo método de terminação da cadeia padrão, como é descrito por Sanger e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463 - 5467 (1977), usando um estojo de Sequenase (marca comercial registada) (United States Biochemical Corporation). Os oligonucleótidos ELI1 e ELI2 (Tabela 5) foram utilizados como primários de sequenciamento.

TABELA 5

Código (Sequência 5' - 5' ) Sítio de primagem (Figura 1)

ELS 1 AGCTCGGTACCATACCTGCATATGC 7-32 (cadeia superior)

ELS 2 CTTCACAGCACTTTTTGATACCTGG 144-168 (cadeia inferior)

plasmídio de ADN do clone 156 continha a sequên cia representada na Figura 13 e o plasmídio foi designado com ι o número de código pAG76. 0 plasmídio pAG76 foi utilizado para ; transformar células competentes das seguintes estirpes de E. ι coli por maneiras de proceder correntes

HB1O1

MSD462 (W3110 Delta lac)

MSD522 (CGSC 6300)

DH5 Alfa.

I

Expressão de uma Proteína de Fusão Inlbldora de Elastase de

Beta-Galactosidase Humana

Glonou-se a sequência do gene sintético do inibidor de elastase humana num vector comercialmente disponível pUEX2 (Amersham International Plc - também depositado de acordo com o Tratado de Budapeste). 0 vector contém um gene para

J beta-galactosidase sob o controlo transcripcional de promotor de P_R do bateriófago lambda. 0 plasmídio contém também um gene i de beta-lactamase, que torna os transformantes que contêm · plasmídio resistentes a ampicilina e o gene para o repressor ί sensível à temperatura (CI857) do promotor P_R.

Isolou-se o gene a partir de pAG76 (preparado a partir de MSD522) a seguir à digestão sequencial com EcoRI e Sall e purificação do fragmento de 222 pb resultante por electroforese num gel com 1% de agarose.

Isolou-se o fragmento de ADN do gel primeiramente electro-eluindo o ADN para papel DEAE NA45 e, em seguida, eluindo o ADN do papel NA45 com solução de NaCl 1 Μ. A maneira de proceder utilizada é resumidamente a seguinte.

Uma pequena peça de papel NA45» cortada com a lar gura da banda de ADN e com a profundidade do gel, foi molhada com tampao 1 x TE (tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM; pH 8,0). 0 papel

ΝΑ45 molhado é colocado numa ranhura no gel, cortada precisamente em frente da banda a ser eluída. Continua-se a electrofo rese durante cinco minutos, até que a banda de ADN seja absorvida pelo papel NA45. 0 papel contendo o ADN é primeiramente lavado com tampão 1 x TE e, em seguida, tratado duas vezes com NaCl 1 M (200 microlitros) a 70° C durante dez minutos, com agitação ocasional. Combinaram-se as soluções de NaCl e precipi tou-se o ADN com etanol (1 ml) a 4° C durante dez minutos. Colectou-se o ADN por centrifugação, lavou-se com etanol : água (7 : 3), secou-se e dissolveu-se em água (20 microlitros).

Para a preparação do vector, digeriram-se 5 micro gramas de pUEX2 com EcoRI e Sall em tampão com um elevado teor salino (BC1; 50 microlitros) durante uma hora a 37° C· Precipi tou-se o ADN com etanol e purificou-se num gel contendo 1% de agarose. Isolou-se o fragmento do vector com 6,7 kb por electro-eluição para papel NA45, como se descreveu acima, precipitou-se e dissolveu-se em água (20 microlitros).

Para ligação, adicionaram-se 5 microlitros do veç tor ADN (1 micrograma) ao fragmento do gene do inibidor de elastase (10 microlitros, 1 micrograma), 5 x tampão de ligase (BR1; 6 microlitros), água (8 microlitros) e T4 ADN ligase (1 microlitro, 1 micrograma/microlitro). A ligação fez-se durante vinte horas a 16°C. Utilizou-se a mistura de ADN ou directamen te ou depois de diluição 5 x com água para transformar células de E. coli MSD462 e MSD522 como se descreveu anteriormente para clonar o gene sintético. Obteve-se um total de oito colónias em MSD462 e de setenta e cinco em MSD522. Examinaram-se seis das colónias em MSD462 e trés das colónias em MSD522 por análise da hibridização, como se descreveu anteriormente. Todas provaram ser positivas e foram depois analisadas desenvolvendo-as em escala reduzida para examinar as proteínas expressadas a 37° C e 42°C. Estes desenvolvimentos em pequena escala foram realizados da seguinte forma.

Desenvolveram-se culturas em 75 ml de meio M9 con tendo 0,02% de hidrolisado de caseína; glucose (2,0 gramas/litro); MgSO^.7HgO (1 mM); CaClg^HgO (0,1 mM); ampicilina (50 microgramas/mililitro) e tiamina (4 microgramas/mililitro) durante vinte horas a 37 C num incubador com agitaçao por batimento (250 rotações por minuto).

Transferiram-se as células para meio fresco (75 ml) de maneira a obter-se uma densidade óptica a 550 nm igual a 0,1 e incubou-se a 37° C até a ter atingido 0,4 - 0,5 e, em seguida, a 42° C durante três horas. Colectaram-se as cé lulas por centrifugação e submeteu-se a lise uma parte alíquota por aquecimento à ebulição (100° G, quinze minutos) em tampão de laemmli (0,125 mM de tris-HGl, pH 6,8), SDS (2% em peso/ /volume), glicerol (20% em peso/volume), azul de bromofenol (vestígios) contendo beta-mercapto-etanol (2% em peso/volume) recentemente adicionado.

Examinaram-se as proteínas por electroforese num gel de poliacrilamida a 20% e por manchamento com Azul Brilhan te de Coomassie. Todos os três clones de MSL522 e cinco clones de MSD462 produziram uma nova proteína de maior peso molecular ·, do que o marcador de beta-galactosidase e a proteína de beta-galactosidase produzida pelo vector parente pUEX2. Um clone > de MSD522 foi designado pAG77·

Preparação de Proteína de Fusão de Beta-GalactQ3idase/lnibidor de Elastase Humana

Recuperou-se uma estirpe recombinante de E. coli MSD522 que expressa a proteína de fusão de beta-galactosidase/ /inibidor de elastase (pAG77) de armazenagem, colocou-se numa placa de agar 1 suplementada com ampicilina (50 microgramas/mi lilitro) e incubou-se a 37° C durante vinte horas. Transferiu-se um conjunto de células desta placa para cada um de quatro • balões de Erlenmeyer de 250 ml contendo 75 ml de meio M9 suplje

mentado como se descreveu acima. Incubaram-se estes balões agi tando-os a 300 rotações por minuto num incubador orbital a 37°

C durante vinte horas e depois a 42° C durante quatro horas.

Purificação da Proteína de Fusão de Beta-Galactosidase/Elastase Humana

Colheram-se as células de E. coli e suspenderam-se em tampão de lise (15% de sacarose, 50 mM de EDTA, 50 mM de cloridrato de tris, pH 8,0) e submeteu-se a lise por tratamento com lisózima/LDS (0,5 mg/ml e 0,05%, respectivamente), seguida de tratamento com ultra-sons (4 x 45 segundos usando um MSE Sonicator) a 4° 0.

Centrifugou-se a suspensão resultante e ressuspen deu-se a fracção de pelete com água, seguida de centrifugação.

Solubilizou-se a pelete lavada em cloridrato de guanidina 6 M em solução salina tamponizada com fosfato conten do 50 mM de beta-mercapto-etanol.

Bialisou-se esta solução extensivamente contra so, lução salina tamponizada com fosfato e colectou-se o precipita do resultante por centrifugação.

Dissolveu-se o precipitado em tampão de carga de gel de poliacrilamida SDS e submeteu-se a electroforese em gel de poliacrilamida usando um sistema de gel redutor a 10%.

Manchou-se o gel com Azul de Coomassie e cortou-se a banda que corresponde à proteína de fusão. Usou-se em se guida esta como imunogénio para obter anti-soros em coelhos.

Preparação de Inibidor de Elastase em levedura-Vector de Secreção de Levedura pDP258

vector de secreção em levedura está representado na Figura 8 e foi depositado de acordo com o Tratado de Budapeste. Este vector permite a fusão da sequência de codificação do sinal de processamento STE13 na pré-pro-região MF alfa

1. Ha um certo número de trabalhos que descrevem como a fusão das sequências de codificação de proteínas com o sinal STE13 pode conduzir à secreção da proteína codificada, embora a secreção ou a acumulação intracelular de proteínas de fusão parcialmente processadas ou não processadas também tenham sido descritas. Este problema pode ser evitado utilizando outros sí tios de processamento na pré-pro-região MF alfa 1. Veja-se, por exemplo, G. A. Bitter e col. P. N. A. S. 81, 5330 - 5334 (1984); A. J. Brake e col., P. N. A. S. 81, 4642 - 4646 (1984);

K. M. Zsebo e col., J. Biol. Chem. 261, 5858 - 5865 (1986); G. Loison e col., Bio/Technology 6, 72 - 77 (1988); J. F. Ernst, DNA 7, 355 - 360 (1988).

A construção de pDP258, representado na Figura 18, é esboçada em seguida. A posição dos sítios de enzima de restrição é aproximada.

promotor MF alfa 1 e a sequência de pré-pro-codificação do fragmento EcoRI - HindIII do sítio EcoRI em 959, em M. C. Flessel e col. (Genetics 121, 223 - 236, 1989) até ao sítio HindIII a 263, em J. J. Kurjan e Herskowitz (Cell 30,

933 - 943, 1982). Este fragmento pode ser derivado do plasmídio p69A, descrito por Kurjan & Herskowitz (Cell 30, 933 - 943, 1982).

A região Sall(l6O6)-Espl/AatII derivou do fragmen to com 2550 pb, Sall-Aatll, de pBR328 (L. Covarrubias e col., Gene 13, 25 - 35, 1981).

A região Esp-EcoRI (1) que contém o gene LEU2 foi derivada de YEpl3S(YEp213) (J. R. Broach, Methods in Enzymol.

• 101, 307 - 325, 1983 e F. Sherman e col., Methods in Yeast Ge46 -

netics, Cold Spring Harbor, 1986, página 95). 0 sítio de HindIII presente na sequência 2u foi destruído por corte com HindIII, preenchimento com polimerase de Klenov e religação.

Tratou-se um fragmento de HindIII-Sphl contendo o terminador ADC1 derivado do plasmídio pAAH5 (G. Ammerer, Methods in Enzymol. 101, 192 - 201) com T4 polimerase, para criar ADN com extremidades lisas. 0 sítio Sall (representado em 1606 na Figura 18) foi cortado e preenchido usando T4 polimerase. 0 fragmento ADC1 foi ligado com o fragmento do plasmídio para se obter um recombinante que contém o terminador ADC1 com a orientação correcta para terminar os transcriptos que são originados pelo promotor MF alfa 1. Esta clonação também regenerou o sítio Sall (representado) e o sítio HindIII (dentro de parêntesis).

poli-ligador que contém os sítios representados no mapa foi clonado no sítio HindIII regenerado pela clonação com o terminador ADC1. Este poli-ligador foi concebido de modo que apenas um sítio HindIII foi preservado pela clonação. pDP258 contém o poli-ligador na orientação representada na Figura 18. 0 sítio de HindIII representado dentro de parêntesis é destruído por clonação com o poliligador.

Modificação do Vector de Secreção de Levedura plasmídio representado na Figura 18 foi modificado para introduzir sítios de restrição, Sphl na peptidase de sinal e StuI nos sítios de processamento com KEX2 na região pré-pró MF alfa 1 para permitir a fusão das sequências de proteína que codificam ADN para estes sinais de processamento, a fim de facilitar a secreção da proteína codificada para o meio extracelular.

Realizou-se a mutagénese in vitro como é pormenorizado por Amersham International plc na sua Oligonucleotide47 -

-directed in vitro mutagenesis system version 2” (código RPN-1523). Outras maneiras de proceder utilizadas neste trabalho são conhecidas pelos peritos no assunto e são descritas, por exemplo, em Molecular Cloning; a Laboratory Manual, 2§ Edição, J. Sambrook, E. E. Eritsch e T. Maniatis, G. S. H., 1989.

Introdução do Sítio Sphl no sítio de Processamento da Peptidase de Sinal

A fim de permitir a fusão da sequência de codificação do inibidor de elastase com o lider MF alfa 1 prá-secretório, concebeu-se um sítio de enzima de restrição de Sphl, de modo que, a seguir à restrição e ao tratamento com T4 polimerase, se obtivesse uni extremidade abrupta que termina na ter í ceira base do último codão (aminoácido 19) da sequência de sinal ME alfa 1 (veja-se, por exemplo, J. P. Ernst, DNA 7, 355 - 360, 1988). Concebeu-se um primário de oligonucleótido mutagénico e sintetizou-se para introduzir as alterações da sequên cia necessárias na sequência de sinal ME alfa 1.

EIGURA IA

Primário complementar para esta região

------G CAT GCNova sequencia

ala	-----T GCT C------	Original
leu	ala
17	18	19	Resíduo de aminoácido (Kurjan e Herskowitz.1982)
Sítio	de	Sphl sublinhado

3C = ver o texto ^«-^«SSSBiECgyma.^ identifica bases alteradas usando mutagénese fragmento de pequeno comprimento SstI para Hind III de pLP258 (ver Figura 18) foi clonado em SstI + HindIII - corte RF M13mpl8 ADN (BRL 52O-8227SA). As placas potencialmente recombinantes (brancas em X-gal + IPTG) foram caracterizadas por uma preparação em pequena escala de RF ADN para a análise de tamanhos e com enzima de restrição por eleetroforese em gel de agarose. Gerou-se um ALN modelo de cadeia única em larga escala a partir de um clone que contém este fragmento pa ra utilizar em experiências de mutagénese in vitro usando um primário de oligonucleótido como se representa na Figura IA. A seguir à 1ransformação da população mutagenizada, picaram-se quinze placas e preparou-se ADN modelo de cadeia única. A seguir à análise de tamanhos por eleetroforese em gel de agaroL se, examinaram-se onze modelos por sequenciamento normal da ter minação da cadeia relativamente ao aparecimento de um resíduo T extra (complementar de A” com asterisco, na Figura IA).

Escolheu-se então o clone número 6 a partir de e£ tudos posteriores de sequenciamento, o que demonstrou que não havia alterações adicionais detectadas no promotor conhecido de MF alfa 1 ou na sequência de codificação. Transformou-se en tão 1 microlitro de uma diluição 1/100 da preparação de ALN mo delo do clone número 6 em TG1 competente. Picaram-se as placas e inocularam-se em culturas de 1 ml de 2 x TY, previamente semado com células TG1 (como se descreve no estojo Amersham). De senvolveram-se estas culturas com sacudidelas a 37° C durante cinco horas e utilizaram-se para inocular 100 ml de meio 2 x x TY. Depois de uma posterior incubação com sacudimentos duran te cinco horas, preparou-se ADN RF de cadeia dupla por métodos de preparação de plasmídio usuais. 0 fragmento de pequenas dimensões SstI - HindIII do clone número 6 (preparação A) foi en tão gerado por corte com enzima de restrição e purificou-se o

- 49 fragmento a seguir à separação por electroforese em gel de aga rose. Clonou-se o fragmento purificado com formação do fragmen to de grandes dimensões HindIII - SstI pLP258 (veja-se Figura 18) para originar pDP294, isto é, pLP258 que contém um sítio de Sphl no sítio de clivagem de peptidase com sinal putativo (o vector SIGPEP”).

Introdução do Sítio StuI no sítio de Processamento KEX2

Com o fim de permitir a fusão da sequência de codificação do inibidor de elastase com o sinal de processamento KEX2, introduziu-se um sítio de StuI por mutagénese de PCR.

FIGURA 2A

Primário de PCR complementar para esta região

StuI AGG CCT

HindIII -AA GCT T—

-A GAG

Nova sequência

Sequência ori ginal ser leu asp lys arg 81 82 83 84 85

Resíduo de aminoácidos (Kurjan e

Herskowitz 1982)

I identifica bases modificadas utilizando mutagénese de PCR para introduzir o sítio de StuI (sublinhado).

Originaram-se dois primários de PCR. 0 primeiro (um mero com trinta e três resíduos) era homologo de sequência MF alfa 1 (J. Kurjan e I Herskowitz, Cell 30, 933 - 943, 1982) à parte das bases representadas na Figura 2A acima. Este prima

rio foi concebido de maneira a incluir o novo sítio StuI e o sítio de HindIII existente no produto de PCR.

segundo primário de trinta oligonucleotidos era homólogo com a região MF alfa 1 211 a 241 (Flessel e col., Genetics 121, 223 - 236, 1989) incluindo o sítio de restrição Nsil em 227.

Utilizando estes dois oligómeros como primários, pode gerar-se um modelo de plasmídio (por exemplo, pDP258) nu) ma reacção de amplificação de PCR constituído por um fragmento com aproximadamente 490 pb. A seguir à extracção com 1 volume de fenol : clorofórmio : álcool isoamílico (25 : 24 : l) e pr£ cipltação com etanol, o produto de ADN de PCR foi retomado em 1 volume de água. 0 ADN foi cortado com as enzimas de restrição Nsil e HindIII. Submeteu-se o produto desta reacção a uma separação com gel de agarose e purificou-se a banda que corres ponde a 490 bp (aproximadamente) por técnicas usuais.

Gerou-se um pUC18 (BRL52O - 5363SA) recombinante contendo a região Xbal a HindIII de pDP258. 0 sítio de Nsil (-227 de Flessel e col.) era único neste plasmídio. Substituiu -se o fragmento Nsil-HindIII neste plasmídio pelo fragmento ge rado por PCR que contém o novo sítio de StuI, usando as técnicas de clonação usuais. Identificaram-se seis clones que continham o sítio de StuI. Caracterizou-se o clone número 6 por sequenciamento com didesóxi como contendo o novo sítio de StuI na posição correcta e sem mutações adicionais em comparação com as sequências publicadas. Este plasmídio foi designado por pDP273.

fragmento de grandes dimensões Xbal - HindIII de pLP258 e o fragmento StuI ’’ Xbal - HindIII de pDP273 foram então preparados por corte com enzimas de restrição e separação em geles de agarose. A seguir à purificação por gel de aga rose, ligaram-se estes fragmentos é transformaram-se em E. co- 51 li (HB101) competente. Efectuaram-se preparações de ADN em pequena escala a partir de trinta e seis colónias. Digeriu-se o ADN com as enzimas de restrição StuI e SstI. Identificou-se o clone número 9 contendo o modelo de enzima de restrição correc to tal como visualizado por electroforese em gel de agarose (pDP274). 0 ADN de pDP274 foi então cortado com Xbal e ligado com uma preparação purificada do fragmento de pequenas dimensões Xbal de pDP258. Pizeram-se preparações de ADN em pequena escala a partir de trinta e seis colónias de E. coli transformadas com esta mistura de ligação. A seguir à digestão com EcoRI + StuI, identificaram-se dois clones qúe continham o frag mento de Xbal de pequenas dimensões na orientação natural original correcta. Preparou-se um clone (pDP289) para trabalho posterior, isto é, pDP258 com o sítio de StuI no sítio de processamento KEX2.

Cionação do Gene Inibidor de Elastase a Jusante dos Sinais de

Secreção de levedura

Cortou-se pAG76 com a enzima de restrição BpsMI (veja-se a Figura 13) e, em seguida, tratou-se com T4 polimera se para preencher na suspensão 5’ para gerar ADN com extremida de abrupta.

A seguir à extracção com fenol : clorofórmio : ál cool isoamílico e precipitação com etanol, dissolveu-se o ADN em água e digeriu-se com a enzima de restrição BamHI. Isolou-se o fragmento de pequenas dimensões que codifica o inibidor de elastase por purificação com gel de agarose. Digeriu-se então cada um dos tres vectores como se descreve abaixo e isolaram-se os fragmentos de grandes dimensões por meio de geles de agarose.

pDP258 - cortado com HindIII, tratado com T4 polimerase para preencher a suspensão 5', cortado com BamHI.

pDP289 - cortado com StuI e BamHI.

pDP294 - cortado com Sphl, tratado com T4 polimerase para eliminar a suspensão 3’, cortado com BamHI.

Ligou-se cada um dos tres fragmentos do vector pu rificados com fragmento de inibidor de elastase. Transformaram -se as amostras de cada uma das misturas de ligação no competente E. coli HB101. Prepararam-se amostras de ADN de pequenas dimensões 20 - 40 a partir de colónias obtidas com cada uma das três misturas de ligação. Identificaram-se os recombinantes por digestão com as enzimas de restrição BamHI + PstI e separação de fragmentos em geles de agarose. Confirmaram-se os clones que têm a sequência correcta na fusão entre o sinal ME alfa 1 e a sequência de codificação do inibidor de elastase por sequenciamento de ADN. Escolheram-se os clones para análise posterior da seguinte forma:

Fusão de pDP280 STE13/inibidor de elastase, isto é, derivado de pDP258.

Fusão de pDP298 SIGPEP/inibidor de elastase, de pDP294· isto á, derivado

Fusão de pDP299 KEX2/inibidor de elastase, isto é, derivado de pDP289.

Trans formaram-se estes constructos (Sherman e col.) em JRY188 (Brake e col., P. N. A. S. 81, 4642 - 4646, 1984). Inocularam-se os clones e desenvolveram-se a 30° C em fase estacionária em YPAD líquido (Sherman e col., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, 1986, páginas 164 o 165) ou meios de desaparecimento de LEU (meio completo sintético menos leuci na em Shermann e col., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, páginas 164 e 165, 1986).

inibidor de elastase activo pode ser detectado nos sobrenadantes das culturas dos clones de’pDP280 (ver Figura 19). Os rendimentos de material a partir dos clones pDP298 e pDP299 foram menores.

Os constructos foram também transformados na estirpe de levedura XS95-6C (Yeast Genetic Stock Genter, Universidade da Califórnia, Berkely, OA 94720, Estados Unidos da América).

Depois de incubação com sacudimento durante setenta e duas horas (250 rotaçoes por minuto) a 30 C, quando a cultura atingiu a fase estacionária (tipicamente, = 4

- 6), colheram-se os sobrenadantes das culturas peletizando as células completas. Utilizando o ensaio enzimático descrito mais adiante, detectou-se a actividade dos sobrenadantes da cultura. Com base nas curvas padrão usando inibidor de elasta se natural (ver abaixo), foram segregados clones pDP298 até

3,5 microgramas/mililitro de inibidor de elastase activo nos sobrenadantes da cultura.

Purificação de Proteína Inlbidora de Elastase Humana Recombinante

Purificou-se o material obtido usando o sítio de processamento STE13 (pDP280) e um hospedeiro de JRY188 desenvolvido em meio líquido -LEU de eliminação”.

Filtraram-se os sobrenadantes da cultura (até 2 litros desenvolvidos em balões sacudidos) usando um filtro de 0,22 micrómetro. Concentrou-se o filtrado até aproximadamente dez vezes usando um filtro de corte de 3000 Mr num concentrador em espiral Amicon. Dialisou-se então o concentrado contra 3 x 20 volumes de formiato de amónio 10 mM (pH 4). 0 material dialisado foi introduzido numa coluna de sulfo-propil-Sepharose previamente equilibrada e eluíu-se com um gradiente de formiato de amónio. Reuniram-se as fracções activas concentraram-se e introduziram-se numa coluna de exclusão de tamanhos (pharmacia HR100) e eluíu-se com uma solução salina tamponizada com fosfato.

Obteve-se um produto micro-heterogéneo que, por sequenciamento do N-terminal, originou polipéptido maduro de fórmula I (60%) e polipéptido maduro de fórmula I mais ou uma ou duas extensões terminais de aminoácido glu-ala. Estas exten sões pensou-se serem devidas a processamento incompleto pela estirpe de levedura e separaram-se os polipéptidos com estas extensões terminais do polipéptido maduro de fórmula I por MonoS HPLC em acetato de sódio 50 mM de pH 4,5 usando um eluen te que compreende um gradiente de 0 a 0,5 M de cloreto de sódio. Verificou-se que o produto micro-heterogéneo tinha a mesma actividade específica que a exibida pelo péptido isolado a partir de placas psoriáticas.

Empregou-se uma maneira de proceder semelhante pa ra purificar proteína produzida por cultura de constructos obtidos pelo uso dos sítios de processamento SIGPEP e KEX2. Com estes constructos, obteve-se uma espécie homogénea que tem a sequência N-terminal correcta para o polipéptido maduro de fór mula I.

A maneira de proceder de purificação utilizada com os constructos desenvolvidos em outros hospedeiros foi essencialmente como se descreveu acima. Por exemplo, o construo to obtido usando o sítio de clivagem de peptidase de sinal foi desenvolvido na estirpe de levedura XS 956C e purificado de acordo com o protocola acima mencionado, para se obterem 4 mg de polipéptido maduro de fórmula I como única espécie que exibe a mesma actividade específica que o polipéptido isolado a partir de placas psoriáticas.

Ensaio para Determinar a Presença de Inlbidores de Elastase

A presença e a quantidade do polipéptido de fórmu la I durante, por exemplo, a sua produção por meio da tecnologia do ADN recombinante, foi controlada usando o seguinte ensaio. Neste ensaio, determinou-se a actividade do material pe55 -

la inibição de elastase pancreática porcina (Sigma), usando N- ;

-metóxi-succinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida (AAPV, Sigma) ΐ i

como substrato.

A amostra, por exemplo, o sobrenadante da fermentação da levedura (100 microlitros) foi misturada com elastase porcina (10 mlcrogramas/mililitro) em tampão de ensaio (0,1 M de HEPBS/0,5 M de NaCl/pH 7,5 contendo 1% de albumina de soro bovino de grau RIA).

Incubou-se a mistura durante trinta minutos à tem peratura ambiente, adicionou-se substrato (800 microlitros,

2,5 mM) em tampão de ensaio e incubou-se a mistura durante dois minutos à temperatura ambiente. Calculou-se a velocidade de alteração da absorvãncia a 405 nm durante dois minutos e a actividade a partir de uma curva padrão construída usando o po lipéptido de fórmula I isolado de placas psoriáticas (o padrão foi utilizado no intervalo de 0 até 2,5 microgramas/mililitro).

Actividade Inibitória do Inibldor de Elastase Recombinante contra HLE

Ensaiou-se o inibidor de elastase recombinante produzido pelos métodos acima descritos relativamente à activi dade inibitória contra a elastase de leucócitos humanos usando o método descrito acima. Verificou-se que o polipéptido recombinante tem uma actividade inibitória comparável à do material obtido a partir de pele psoriática.

HPLC com Poly L0 de Inibidor de Elastase Recombinante Bruto

Submeteram-se a cromatografia 100 microgramas de inibidor de elastase recombinante bruto numa coluna com Poly LC e revelou-se para os picos de inibição de elastase de leucó eitos humanos. Observaram-se dois picos maiores (i e II). 0 pi co I continha 23 microgramas de proteína com base na absorván- 56 -

cia integrada a 215 nm e 19,4 microgramas de inibidor activo (massa molecular 7017, titulado com HLE). 0 pico II continha í 8,4 microgramas de proteína e 6,9 microgramas de ibibidor acti vo.

Portanto, estes dois picos parecem ser inibidores essencialmente puros. Uma co-eluição experimental de 1 micrograma do pico I e de 1 micrograma do polipéptido de fórmula I obtido a partir de pele psoriática humana mostrou que o material do pico leo material obtido a partir da pele são idênti cos neste sistema. Este facto foi posteriormente substanciado por uma experiência de co-eluição por HPLC-RP^q que também apresenta um único pico.

Titulou-se o pico I de HPLC-Poly LC com HLE para a determinação de Ki de acordo com o método de Green e Work.

material do pico I apresentou um valor de K. igual a 8,0 x

-10 ~ ¹ x 10 M em comparaçao com o inibidor de pele humana que apresentou um valor de IL igual a 3,3 x 10“^θΜ. Relativamente ao rigor do método de Green e Work, o material do pico I mostra ser de uma actividade comparável à do polipéptido obtido a par tir de pele psoriática humana.

Este inibidor de elastase recombinante bruto pare ce ser constituído por cerca de 75% de proteína inactiva, 5% de inibidor de HLE que difere do polipéptido de fórmula I obti do a partir de pele humana no tempo de retenção em HPLC-Poly LC (provavelmente devido ao prolongamento ou à eliminação no terminal N) e 20% de um inibidor de HLE (pico I em HPLC-Poly LC) idêntico ao polipéptido obtido a partir de pele psoriática humana relativamente aos tempos de retenção em HPLC de exclusão de tamanhos TSK 2000, HPLC-RP^g, HPLC-Poly LO e actividade inibitória.

Sequencia de cADN do Inibidor de Elastase de Leucócitos Huma57 -

i ^nos i

I ' A derivação de sequências de ADN que codificam um polipéptido particular pode realizar-se usando técnicas corren tes. Estas técnicas incluem técnicas de selecção, isto é, seleç ção por hibridização de bibliotecas de cADN recombinante com oligonucleótidos misturados que representam possíveis combinações de sequências de ADN e técnicas de amplificação, tais como as conhecidas por FCR (reacção da cadeia de polimerase).

Descrevem-se os protocolos experimentais para a selecção de bibliotecas de cADN por ambos os métodos acima referidos em Molecular Cloning - J. Sambrook, E. E. Eritsch e T. Maniatis - segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

I

Utilizando as técnicas bem conhecidas acima mencionadas, determinou-se a sequência de cADN para o inibidor proeminente (isto é, o polipéptido de fórmula I). Utilizou-se uma biblioteca de cADN lambda gtll de pulmão e obteve-se a sequência representada na Figura 14. Supõe-se que a sequência continua como se ilustra na Figura 15. 0 codão de terminação da translação está presente depois da sequência de codificação e supõe-se que está presente um sinal de poli-adenilação a 153 bp além de 3’. Fensa-se também que se encontra presente um interão de 250 bp na extremidade 3’ do gene.

Num trabalho posterior, isolaram-se clones de cADN que codificam a sequência completa de aminoácidos do componente activo principal (e dos componentes secundários) de preparações de inibidor de elastase da biblioteca de cADN de pulmão humano. A Figura 16 mostra a sequência de ADN completa de um desses clones (EI4). Esta sequência foi também verificada em outros clones de cADN independentes e de fragmentos de ADN isolados da mesma biblioteca de cADN por PCR. Esta sequência demonstra a presença de sequência de codificação da proteí

Ί na a montante da estrutura em adição da região de codificação í do inibidor de elastase. Esta sequência de montante tem as seguintes propriedades características:

a) Os 19 aminoácidos codões imediatamente a montante da sequência da proteína do inibidor de elastase são consistentes com os dados da sequência de proteínas derivados de uma fracção de proteína secundária (pico V, componente A), identificados por análise de sequência de proteínas.

b) Seis cópias do motivo de péptido de repetição (nominal i mente, Val-Lys-Gly-Gln-X-Y, em que X é ou Asp, Vai,

Glu, Pro, Ser ou Lys) dos resíduos -26 a +10 a partir do início da sequência que codifica o inibidor de ela£ tase. As extremidades N dos vários componentes secunda rios das preparações de inibidor de elastase não são consistentes com este motivo, sendo o sítio de clivagem proteolítica específico.

!

c) A extremidade N codificada por este clone ê muito hidrofóbica (13 de 18 resíduos) que pode apresentar parte de uma sequência de sinal ou de um domínio de trans -membrana.

Este clone não contêm um codão de iniciação de translação reconhecível de acordo com as hipóteses convencionais, isto é, AUG. Os resultados dos estudos da extensão do primário revelaram 0 inicio de um transcripto maior aproximada mente a oitenta bases antes do início da sequência de cADN identificado em mARN em queratinócitos humanos cultivados (HEX 78). A presença de uma mensagem semelhante numa gama de outras espécies de mARN (incluindo ARN total de pulmão humano) não foi demonstrada por esta técnica.

A análise de manchamento Northern de ARN total de adenocarcinoma pancreático demonstrou a presença de um trans59 -

inconsistente com o tamanho previsto a partir da sequência ac_i ma mencionada de cADN dos dados de extensão do primário (supon do um comprimento de poli-adenilação de aproximadamente cento e noventa bases).

ANTICORPOS PARA 0 INIBIDOR DE ELASTASE

Criaram-se anticorpos contra o polipéptido de fór mula I usando coelhos de raça New Zealand Vhite. Usaram-se as seguintes vacinas:

1. Substrato (A), que compreendia os dezasseis resíduos de aminoácidos N-terminais do polipéptido de fórmula I, acoplados a albumina de soro bovino por intermédio do éster de maleimidobenzoíl-n-hidróxi-succinimi da pelo método de Lerner e col. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 3403 - 3407).

2. Substrato (A) acoplado a tiroglobulina bovina como em 1 acima descrito.

3. Substrato (A) misturado com metil-albumina de soro bovino.

4. Proteína de fusão de beta-galactosidase e o polipéptido de fórmula I.

programa de imunização utilizado para os péptidos que figuram nas alíneas 1, 2 e 3 acima foi o seguinte:

Eia 1 - 250 microgramas do péptido em adjuvante completo de

Preund foram administrados subcutaneamente.

Dia 39 - 250 microgramas do péptido em adjuvante incompleto de Freund foram administrados subcutaneamente.

Dia 66 - Administraram-se subcutaneamente 250 microgramas do péptido em adjuvante incompleto de Preund.

Dia 107 - Administrou-se intravenosamente sem adjuvante 1 mg do péptido.

Dia 120 - Sangria.

programa de imunização utilizado para a proteína de fusão indicada na alínea 4 acima descrita foi o seguinte :

Dia 1 - Administraram-se subcutaneamente 200 microgramas da vacina de proteína em adjuvante completo de Freund.

Dia 22 - Administraram-se subcutaneamente 100 microgramas de vacina de proteína em adjuvante incompleto de Freund.

Dia 61 - Administraram-se subcutaneamente 200 microgramas da vacina de proteína em adjuvante incompleto de Freund.

Dia 94 - Administraram-se intravenosamente 130 microgramas da vacina de proteína sem adjuvante.

Dia 107 - Sangria.

Ensaiou-se a reactividade cruzada dos anti-soros assim obtidos usando SDS PAGE e manchamento de Western. Verifi cou-se que o anti-soro gerado usando a proteína de fusão (alínea 4 acima) reage cruzadamente com o polipéptido de formula I e de placas psoriáticas e também com o polipéptido recombinante de fórmula I (1 micrograma detectado a uma diluição de 1 pa ra 2000) e alfa^-antitripsina.

Eliminou-se a reactividade cruzada de alfa^-antitripsina (90%) fazendo passar (x 3) os anti-soros através de uma coluna compreendendo alfa^ imobilizado (25 mg de alfa^-antitripsina ligada a uma coluna 4B de Sepharose activada com

brometo de cianogénio - Pharmacia). Os anti-soros gerados a partir dos péptidos indicados na lista 1, 2 e 3 verificou-se também que reagem também cruzadamente com o polipéptido de for mula I.

Trataram-se vários tecidos do organismo com os an ti-soros usando um título de 1 ; 50 e uma técnica de imunopero xidase corrente. Verificou-se intensa reactividade com hepatócitos no sistema hepato-biliar, detectou-se ligeira reactivida ! de com mucosas musculares do estômago, ligeira reactividade com lâmina espinosa e células de musculatura lisa venosa das amígdalas e forte reactividade com estrato corneo, estrato gra nuloso, estrato espinoso e estrato basal da epiderme da pele.

ABREVIATURAS

AAPFpNA

AAPV-APC

AAPVpNA

TGPLpNA

HLE

TEA

DMSO

PCR succinil-alani1-propil-fenilalanil-p-nitro-anilida.

metoxi-succinil-alanil-alanil-propil-valil-trifluo rm e t i1-cumarina.

metoxi-succinil-alanil-propil-valil-p-nitro-anilida.

tosil-glicil-propil-lisina-p-nitro-anilidaT elastase de leucócitos humanos, ácido triflúor-acético. sulfóxido de dimetilo.

reacção da cadeia de polimerase - método para amplificar uma sequência de ADN pretendida; veja-se, por exemplo, K. Kleppe e col., J. Mol. Biol. (1971), 56, 341 - 361; e Pedido de Patente de Invenção Europeia Publicado Numero 0201 184; e Molecular Cloning - a Laboratory Manual, Segunda Edição, J. Sambrook, E. P. Eritsch e T® Maniatis, GSH, 1989.

G	ou	Giy		Glicina
A	ou	Ala		Alanina
S	ou	Ser		Serina
T	ou	Thr		treonima
c	ou	Cys		cisteína
N	ou	Asn		asparagina
Q	ou	Gin		glutamina
L	ou	Leu		leucina
I	ou	Ile		isoleucina
V	ou	Vai		valina
M	ou	Met		metionina
F	ou	Phe		fenil-alanina
Y	ou	Tyr		tirosina
W	ou	Trp		triptofano
P	ou	Pro		prolina
D	ou	Asp		ácido aspártico
E	ou	Glu		ácido glutãmico
H	ou	His		histidina

K ou Lys: lisina

R ou Arg : arginina.

Utilizou-se a notação corrente para denotar sequências de ADN.

DESCRIÇÃO DAS. FIGURAS 1 A 8

A FIGURA 1 representa a cromatografia com permuta catiónica (TSK CM 3 SE-HPLC) de um extracto acidulado de 50 gramas de escamas psoriáticas. As fracções saídas da coluna fo ram colectadas automaticamente (60 gotas/fracção) e controladas relativamente ao teor de proteína a 280 nm. Ensaiaram-se as fracções relativamente à actividade inibidora de HLE (HLE-I). Ensaiaram-se 5 microlitros de cada fracção relativamente à actividade inibitória em relação à proteólise mediada por

HLE do substrato tetrapeptídico sintético de metoxi-succinil-alanil-alanil-propil-valil-p-nitro-anilida. As fracções com actividade inibitória (área tracejada) foram combinadas para posterior purificação.

A FIGURA 2 ilustra a cromatografia em fase inversa Cg (Nucleosil 300 Cg-HPLC) de fracções contendo inibidor de elastase derivadas de cromatografia com permuta catiónica, submetidas a uma segunda recromatografia. 0 teor de proteína foi continamente registado a 215 nm. Combinaram-se as fracções que contêm inibidor de elastase (área tracejada) e submeteram-se a cromatografia com Poly LC.

A FIGURA 3 ilustra a cromatografia com poli-sulf£ -etil-aspartamida (Poly LC-HPLC) de fracções contendo inibidor da elastase derivadas da cromatografia em fase inversa Cg. Registou-se o teor de proteína a 215 nm. Colectou-se o pico mais proeminente V com base no teor de proteína e de capacidade ini bitória (aproximadamente 20% do total) e purificou-se mais por cromatografia em fase inversa C^g.

A FIGURA 4 ilustra a cromatografia em fase inversa Cig (Nucleosil 5 C^g-HPLC) do componente principal inibitório da elastase derivado de Poly LC-HPLC, submetido a uma segunda recromatografia. A área tracejada representa o inibidor de elastase proeminente purificado. Usou-se esta preparação para posterior caracterização.

A FIGURA 5 representa a massa molecular aparente do polipéptido de fórmula I determinada por cromatografia em gel analítica por TSK 2000 HPLC com 0,1% de TFA como eluente. Controlou-se o teor de proteína a 215 nm. Como marcadores M , utilizaram-se Vai-Gly-Ser-Glu de massa molecular 390, fragmento de insulina beta-cadeia 22 - 30 de peso molecular 6512, ini bidor de tripsina, de soja de peso molecular 22000, inibidor de tripsina ovomucóide de massa molecular 27000, albumina de

soro bovino de massa molecular igual a 67000.

A FIGURA 6 representa a focagem isoeléctrica do * _z , p polipeptido de formula I em pre-revestimentos de Servalyt de pH 3 - 10. Como padrões, utilizou-se Serva Test Mix 9 constituído por citocromo C (Cy-c), ribonuclease A (Rib A), mioglobu lina de baleia (Myo I) e mioglobulina de cavalo (Myo II). Os geles foram ou manchados com prata (representado em cima) ou cortados, eluídos com acetonitrilo e ensaiados relativamente à actividade inibitória da elastase (HLE-I) (representado na parte inferior).

A FIGURA 7 representa a titulação de elastase de leucócitos humanos com o inibidor proeminente de elastase (o polipeptido de fórmula I). Titulou-se HLE purificada (titulada a 1 micrograma/mililitro com eglina C recombinante) contra o inibidor principal 0,05 - 0,8 micrograma (teor de proteína com base na absorvãncia integrada a 215 nm em HPLC em fase inversa Ο^θ). Pré-incubaram-se a enzima e o inibidor principal durante trinta minutos a 21° C e determinou-se a actividade residual do E durante um minuto usando 2 mM de AAPV-pNA como substrato. 0 valor de Ki foi igual a 3 x ΙΟ'^θΜ, calculado pelo método de Green e Work (8).

A FIGURA 8 representa a sequência do inibidor de elastase proeminente, isto é, o polipeptido de fórmula I.

PORMENORES SOBRE OS DEPÓSITOS SOB 0 TRATADO PE BUDAPESTE

Os seguintes plasmídios foram depositados em The National Collection of Industrial and Marine Bactéria Limited, 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Escócia, Reino Unido, de acordo com as indicações do Tratado de Budapeste:

pUC18 na estirpe hospedeira de E. coli CGSC 6300 (MSD1208): número de acesso 40290.

pUEX2 na estirpe hospedeira de E. coli CGSC 6300 (MSD1209) : número de acesso 40289.

pDP258 (HB101) em E. coli estirpe HB101 (pDP258(HB101)) : número de acesso 40288.

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13. Ohlsson K, Tegner H, Akesson U. Isolation and Par tial Characterixation of a Low Molecular Weight Acid Stable Protease Inhibitor from Human Bronchial Secretion. (1977) Hoppe-Seyler Z. Physiol. Chem. 358: 583-589.

14. Ohlsson M, Rosengren M, Tegner H, Ohlsson K. Quantification of Granulocyte Elastase Inhihitors in Human Mixed Saliva and in Pure Parotid Secretion. (1983) Hoppe-SeylerZ. Physiol. Chem. 364: 1323-1328.

15. Ohlsson K, Tegner H, Pritz H, Schiessler M. Immunological Similarity between Low Molecular Weight Trypsin-Chymotrypsin Inhihitors from Human Bronchial Secretion and Seminal Plasma. (1976) Hoppe Seyler Z. Physiol. Chem. 357: 124167 -

-1244.

16. Thompson RC, Ohlsson K. Isolation, properties and complete amino acid sequence of human secretory leukocyte protease inhibitor, a potent inhibitor or leukocyte elastase. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 6692-6696.

17. Seemuller U, Arnhold M, Pritz H, Wiedenmann K, Machleidt V, Heinzel R, Appelhans H, Gassen H-G, Lottspeich P. The acid-stable proteinase inhibitor of human mucous secretions (HUSI-I, antileukoprotease). (1986).

18. Albrecht GJ, Hochstrasser K, Salier J-P. Elastase Inhibition by the Inter-Alpha-Trypsin Inhibitor and Derived Inhibitors of Man and Cattle. (1983) Hoppe-Seyler Z. Physiol. Chem. 364: 1703-1708.

19. Pioretti E, Angeletti M, Citro G, Barra D, Ascoli

P. Kunitztype Inhibitors in Human Serum. Identification and Characterisation. (1987) J. Biol. Chem. 262: 3586-3589.

20. Reisinger PWM, Hochstrasser K, Gottlicher I, Eulitz M, Wachter E. The Amino-Acid Sequences of the Double-Headed Proteinase Inhibitors from Cat, Lion and Dog Submandibular Glands. (1987) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368: 717-726.

21. Schalwijk J, Lammers AM, Chang A, van de Kerkhof PCM, Mier PD. An Epidermal Elastase Inhibitor Induced by Spontaneous or Experimental Inflammation. (Abstract) (1988) J. Invest. Dermatol. 91: 376.

22'.' Hochstrasser K, Albrecht GJ, Schonberger OL, Rasche B, Lempart K. An Elastase-Specific Inhibitor from Human Bronchial Mucus. (1981) Hoppe-Seyler Z. Physiol. Chem. 362: 1369-1375.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - lâ Processo para a preparação de um polipéptido que possui actividade inibidora contra a elastase de leucócitos hu mana, o qual se pode obter a partir de escamas psoriáticas de pele humana e tem uma ou mais das seguintes características

   a) um peso molecular igual a cerca de 9 KD (determinada por SDS-PAGE);

   b) um ponto iso-electrónico igual a cerca de pH 9,7 (determina do por focagem isoelectrónica);

   c) actividade inibitória relativamente a elastase pancreática porcina além de relativamente a elastase de leucócitos huma na; e

   d) não tem actividade significativa contra tripsina, catepsina G humana, alfa-quimotripsina e plasmina;

   ou de um seu fragmento que possui actividade inibitória contra elastase de leucócitos humana, caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospede^ ra transformada com um veículo de expressão plasmídica replica vel que é capaz de dirigir a síntese do referido polipéptido.

   - 2« Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o polipéptido compreender uma sequência de aminoácidos escolhida de

   a) -Ala-Gln-Glu-Pro-Vai-lys-Gly-Prob) -Ala-Gln-Glu-Pro-Val-lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-leuc) -Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys- 69 -

   d) -Ala-Gin-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Vai-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr; e

   e) Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn_ 3a _

   Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido ter uma sequência de aminoácidos escolhida de

   Asn-Gly-Gin-Asp-Pro-Val-Lys-Gly-Gin-Val-Ser-Val-Lys- Gly- Gin-Asp-Lys-Val-Lys-Ala-.G-ln-Glu-Pro-Val-Lys- Gly-Pro-;

   Gly/Ala-Gin/Vai-Asp-Lys-Val-Lys-Ala-Gin-Glu-Pro-Vai-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-;

   Asp-Lys-Vai-Lys-Ala-Gin-Glu-Pro-Vai-Lys-Gly-Pro-Vai-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys;

   Gly/Val-Lys-Ala-Gin-Glu-Pro-Vai-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-AlaMet-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr; e a sequência de aminoácidos de fórmula I.

   - 4a _

   Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por se obter um polipéptido que tem toda ou parte da estrutura primária de fórmula I

   Ala- Gin-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-SerCys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-Ile-Lys-Lys-Cys-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Met-Ala-Cys-Phe-Val-Pro-Gln (Formula I) ou os seus fragmentos que possuem actividade inibitória contra

   - 70 ί 14 »* ^ν_· elastase de leucócitos humana e compostos capazes de serem modificados in vivo ou in vitro para obtenção do mencionado poli péptido ou fragmentos.

   - 5^a Processo de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado por se obter um polipéptido que compsende toda ou parte da sequinte estrutura primária e seus fragmentos

   Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asnpolipéptido e fragmentos esses que possuem actividade inibitória contra elastase de leucócitos humana e compostos capazes de serem modificados in vivo ou in vitro com obtenção do citado polipéptido ou fragmentos.

   _ 6ã _

   Processo de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizado por se obter um polipéptido que é precedido por um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos de

   Asn- Gly- Gln-Asp-Pro-Val-lys-Gly- Gln-Val-Ser-Val-Lys-Gly-Gln-Asp-Lys-Val-Lys-;

   Gly/Ala- Gln/Val-Asp-Lys-Vai-Lys-;

   Asp-Lys-Val-Lys-; e Gly/Val-Lys-.

   - ?a _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se obter um fragmento de polipéjo tido ou um seu análogo produzido por tecnologia de ADN recombi. nante.

   - 8δ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por se empregar uma sequência de ADN que codifica para um polipéptido definido em qualquer das reivindicações 1 a 7.

   - 9® Processo de acordo com a reivindicação 8, caract£ rizado por se empregar uma sequência de ADN que compreende

   a) uma sequência de ADN como a seguinte

   Pigura 15

   AlaGlnGluProValLysGlyProValSerThr

   -> ELI1

   ATTCGAGCTCGGTACCATACCTGCATATGCTCAAGAACCAGTTAAAGGTGCTGTGTCTAGT

   GCTCGAGCCATGGTATGGACGTATACGAGTTCTTGGTCAATTTCCAGGACACAGATGA

   LysPro GlySerCysProIlelleLeuIleArgCysAlaMetLeuAsnProProAsnArg 63 I-> ELI3 aagccaggttcttgtcctattatcttgattcgttgcgctatgttaaacccacctaaccgt TTCGGTCCAAGAACAGGATAATAGAACTAAGCAACGCGATACAATTTGGGTGGATTGGCA ELI2 <—I

   CysLeuLysAspThrAspCysProGlylleLysLysCysCysGluGlySerCysGlyMet

   123 r* ιΙλπαπγ

   ELI5

   TGTTTGAAGG'ACACTGATTGTCCAGGTATCAAAAAGTGCTGTGAAGGTTCCTGCGGTATG

   ACAAACTTCCTGTGACLAACAGGTCCATAGTTTTTCACGACACTTCCAAGGACGCCATAC

   ELI 4

   TGACíjAJ

   AlaCysPheValPro GlnEndEnd 183 GCTTGTTTCGTTCCAOAATAATAG

   OGAACAAAGCAAGGTGTTATTATCCTAG 210

   ELI6 fou um seu fragmento ou o seu complemento;

   b) uma sequência de ADN que se hibridiza com a sequência de ADN representada em a) ou com um seu fragmento; ou

   c) uma sequência de ADN que, não obstante a degenerescência do código genético, se hibridizaria com uma sequência de ADN como a representada em a) ou um seu fragmento.

   - 105 Processo de acordo com a reivindicação 9, caracte rizado por o fragmento da ADN da sequência representada na rei vindicação 9, alínea a) compreender a parte que codifica o polipéptido de fórmula I.

   - 11® _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a sequência de ADN ser constituída pelos seguintes resíduos

   Figura 14Ala Gin Glu Pro Vai Lys Gly Pro Vai Ser Thr Lys Pr o Gly Ser Gys GCG CAA GAG CCA GTC AAA GGT COA GTC TCC ACT AAG CCT GGG TCC TQC 5’ DNA

   Sequência

   Pro Ile Ile Leu Ile Arg Gys Ala Met Leu Asn Pro Pro Asn Arg Cys CCC ATT ATC TTG ATC CGG TGG GCO ATG TTG AAT CCC CCT AAC CGO TGC

   Leu Lys Asp Thr Asp Cys Pro Gly Ile Lys Lys Cys Cys Glu Gly Ser TTG AAA GAT ACT GAC TGC CCA GGA ATZ AAG AAP TGC TGT GAA GGC ΤΟΤ Cys Gly Met Ala Cys Phe Vai Pro Gin TGC GGG ATG GCC TGT TTC GTT ccc CAG

   Ζ = Τ, σ ou Α

   Ρ = A ou G ou a sequência de resíduos

   Pigura 16

   10 30 50 ······

   GGAATTCQGGTTC C TC AT C GC T GGGAC GG TGGTTCTAGAGGCAGCT GT CAC GGGAGT TC C EcoRI Xbal

   FLIAGTLVLEAAVTGVP |-------IN-FRAME UPSTREAM PROTEIN SEQUENCE-----70 90 110

   TGTTAAAGGTCAAGACACTGTCAAAGGCCGTGTTCCATTCAATGGACAAGATCCCGTTAA VKGQDTVKGRVPFNGQDPVK 130 150 170

   AGGACAAGTTTCAGTTAAAGGTCAAGATAAAGTCAAAGCGCAAGAGCCAGTCAAAGGTCC

   GQVSVKGQDKVK

   AlaGlnGluProValLysGlyPr

   I —ELASTASE INHIBITOR—

   190 210 230 ····.·

   AGTCTCCACTAAGCCTGGCTGCTGCCCGATTATCTTGATCCGGTGCGCCATGTTGAATCC o ValS er ThrLysPro GlySerCysPrοIleIleLeuIleArgCysAlaMetLeuAsnPr

   - 74 I !

   250 270 290 • · · · · 9

   CCCTAACCGGTGCTTGAAAGATACTGACTGCCCAGGAATCAAGAAGTGCTGTGAAGGGTG oProAsnArgCysLeuLysAspThrAspCysPro GlylleLysLysCysCysGluGlySe

   310 330 350 ······

   TTGGGGGATGGCCTGTTTCGTTCCCCAGTGAGAGGGAGCGGGTCCTTGCTGCACCTGTGG rCys GlyMetAlaCysPheValPro GlnEnd

   370 390 410 ······

   CGTCGCCAGAGGTACAGGCGCCATCTGGTCCTAAGTCCCTGCTGCGCTTCCCCTTCCOAC

   430 450 470 ······

   ACTGTCCATTCTTCCTCCCATTCAGGATGGCCACGGCTGGAGCTGCGTCTGTGATCCACT

   490 • ·

   TTOGAATAAAGAGTTCCGGAATTC

   Poly A EcoRI signal ou a sua hélice complementar.

   - 125 _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se empregar um veículo de expressão plasmídica replicável capaz de, num hospe deiro transformante, expressar um polipéptido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7.

   - 13» Processo de acordo com qualquer das reivindica75 çoes anteriores, caracterizado pelo facto de se empregar um ho_s pedeiro transformante capaz de expressar um polipéptido como se define em qualquer das reivindicações 1 a 7, compreendendo o citado hospedeiro um veículo de expressão replicável como se define na reivindicação 12.

   - 14^a Processo para a preparação de anticorpos, caracte rizado pelo facto de se obter um anticorpo capaz de se ligar a pelo menos um fragmento de um polipéptido como se define em qualquer das reivindicações 1 a 7·

   - 15^a Processo para a preparação de um polinucleótido de ensaio, caracterizado por se obter um polinucleótido que compreende uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridizar com uma sequência de ADN como se definiu nas reivindicações 8, 9, 10 ou 11. '

   - 169 Processo para a preparação de um veículo de expres são replicável de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender a inserção de um gene que codifica um polipéptido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 num vector num sítio de inserção apropriado de maneira que se obtenha um veículo de expressão plasmídico que é capaz de dirigir a síntese de um polipéptido como se definiu em qualquer das reivindicações 1 a 7.

   - 17^a Processo para a preparação de um hospedeiro trans formante como ae definiu na reivindicação 13, caracterizado por compreender a transformação de um hospedeiro por inserção de um veículo de expressão replicável como se definiu na reivindicação 12.

   - 18« Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se incorporar um polipéjs tido quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7 num diluente ou uma substância veicular farmaceuticamente aceitável.

   A requerente reivindica as prioridades dos pedidos britânicos apresentados em 9 de Junho de 1989, sob os n«s

   8913346.6 e 8913349.0, 25 de Setembro de 1989, sob o nS 8921613.9 e 2 de Novembro de 1989, sob o n« 8924717.5.

   Lisboa, 8 de Junho de 1990.

   0 AGENTE OEICIAE DA PBOEIilEUAhE Lsi> vSTKIAL