JPH0780907B2 - 新規な心房性ナトリウム尿排泄亢進性及び血管拡張性ポリペプチド - Google Patents

新規な心房性ナトリウム尿排泄亢進性及び血管拡張性ポリペプチド

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JPH0780907B2
JPH0780907B2 JP60501821A JP50182185A JPH0780907B2 JP H0780907 B2 JPH0780907 B2 JP H0780907B2 JP 60501821 A JP60501821 A JP 60501821A JP 50182185 A JP50182185 A JP 50182185A JP H0780907 B2 JPH0780907 B2 JP H0780907B2
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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願データ この出願は、共に共有され且つ共に継続中の、1984年４
月19日付出願の米国出願第602,117号および1984年６月
１日付出願の米国出願第616,488号の一部継続出願であ
る。
技術分野 本発明は、利尿剤、ナトリウム尿排泄亢進剤および血管
拡張剤として有用なポリペプチドの製造および用途に関
する。
背景技術 ほとんどの多細胞有機体は、特殊化された役目を果たす
組織および器官に組織化されている。かくして、それら
の組織および器官の間で物質を輸送するための一連の系
統が生気する。哺乳類を含む更に高度の動物において
は、当該輸送の効率を改善するために、この循環系統は
閉じられている。この閉じられた心臓と血管の系を通る
血液流体の流れは、当該流体が常に加圧されていること
を必要とし、そして当該系の動脈血圧の調整は、例え
ば、流体容積や、血管の弾性や、血管の口径などを含む
無数の因子の複雑な相互作用を必要とする。
通常の細胞外の流体容積の維持は、主に、腎臓によるナ
トリウムの排泄（ナトリウム排泄増加）および水の排泄
（利尿）に依存する。これは、（１）：血漿が糸球体に
おいて濾過される場合（糸球体濾過率すなわちGFRと；
（２）：腎臓の細管に沿って積極的に再吸収される（受
動的に従う水を伴う）ナトリウムの再吸収の程度とによ
って決定される。後者のプロセスは、部分的に、副腎の
ステロイドホルモン、アルドステロンによって調整され
る。GFRおよびアルドステロンに加えて、同様にナトリ
ウムの再吸収を調整する「第三番目の因子」が存在せね
ばならないと、長い間、信じられてきた。今日では、
「第三番目の因子」の仮説を必要とした多くの現象が、
ナトリウムの再吸収に関連する物理力（例えば、血圧
や、赤血球細胞濃度や、血漿粘度など）の作用によって
説明できることが明らかになっている。それにもかかわ
らず、細管の再吸収を調整することができる「ナトリウ
ム排泄増加ホルモン」を求める研究が続いている。
このようなホルモンの候補物質が幾つか存在しており、
この中に、最近、心房の筋細胞から分離されたナトリウ
ム排泄増加因子が含まれる。
ナトリウム排泄増加効果は、ラットの心室組織ではな
く、ラットの心房組織の抽出原液によって証明されてい
る：ドゥ・ボルド（De Bold）,A.J.ほか，生命科学（Li
fe Sciences）.28:89−94（1981）；ガルシア（Garci
a）,R.,実験（Experientia）,38:1071−73（1982）；キ
ューリー（Currie）,M.G.ほか，科学（Science）221:71
−73（1983）．利尿およびナトリウム排泄増加の特性を
有する種々のペプチドが心房組織から分離され、そして
生成されている：フリン（Flynn）,T.G.ほか，生科学お
よび生物物理通信（Biochem.Biophys.Res.Commun.）.11
8:113−139（1984）．これらの心房のナトリウム排泄増
加因子の存在によって、心臓は、腎臓の潅流に及ぼす自
己の明白な影響のほかにも、腎臓のナトリウムおよび水
分の排出を調整する上で大きな役割を果しているのでは
ないかという長い間の疑念が強められた。心房の伸張
が、利尿およびナトリウム排泄増加を引き起こすことは
知られており、そして、これは多分、これらの因子の増
大した解放によって媒介され実現化されているのかも知
れない。
臨床的に重要な疾患症状の多くは、異常流体容積の維持
によって特徴付けられる。うつ血性心不全、肝硬変およ
びネフローぜ症候群の各々は、血行の静脈側における過
度の流体蓄積に続いており、推定される共通の機構とし
ては、腎臓の潅流における糸球体濾過率（GFR）の低下
がある。更に、腎臓の潅流が減少することによって、ア
ンギオテンシンを血行中に形成させる働きを有するタン
パク質分解酵素の一種であるレニン（renin）の過度の
分泌が促される。アルギオテンシン（Angiotensin）
は、細動脈の強力な狭窄物質であり（動脈の血圧を維持
する助けをする）、そして又、副腎によるナトリウム保
持ホルモン アルドステロン（aldosterone）の放出を
即す（それが流体保持を更に悪化させる）。しかしなが
ら、これらの機構は、いわゆる「浮腫状の症状」の流体
保持の全てを説明するわけではないので、多分、付加的
因子が更に存在するのだろう。１つの重要な可能性とし
て、心房の慢性的な過度の伸張（すなわち、心不全）に
よって、あるいは心房の不適当な刺激（すなわち、肝硬
変およびネフローゼ症候群）によって引き起こされる心
房のナトリウム排泄増加因子の相対的な欠乏または絶対
的な欠乏が、流体保持にかかわり合っていることが上げ
られる。
多くの病例において、細胞外の流体容積の増加も又、高
血圧の亢進にかかわっているものと考えられる。高血
圧、即ち慢性的に高い血圧は、世界的に疾病および死亡
の主要な原因の１つとなっている。2000万人以上のアメ
リカ人が、この病気に苦しんでおり、彼等の合併症に
は、心不全、心臓発作、心房麻痺および腎不全が含まれ
る。慢性的高血圧において主に観察される血行力学上の
異常は、細動脈を通る血液流の大きな抵抗である。しか
しながら、この大きな「末梢抵抗」につながる機構は、
完全には理解されていない。幾つかのケースにおいて
は、レニン−アンギオテンシン系または交感神経系の不
適当な活性によって、細動脈の過度の狭窄が引き起こさ
れ得る；「不適当」という意味は、当該活性につながる
未知の信号が、生命体の生理的必要に基づいておらず、
そして高血圧を引き起こすことを意味する（ところが一
方、先に引用された症例においては、浮腫症状における
増加したレニンの分泌は、低下した動脈血圧に応答して
おり、従って正常血圧を取り戻したり、又は維持する助
けとなっている。しかしながら、高血圧疾患者の大部分
において、腎臓による不適当なナトリウムおよび流体容
積の保持が高血圧の引き金となっていたり、又は高血圧
の亢進にかかわっているものと考えられる。大きな末梢
抵抗につながる流体保持を引き起こすところの、腎機能
における問題となる欠陥およびその機構は、双方共に知
られていない。ナトリウム排泄増加ホルモンの欠乏が、
特に同物質が通常においては細動脈についての弛緩作用
を仮りに発揮する場合には、上記所見の原因となること
も、確かに可能である。
利尿療法は、現在、高血圧や、腎不全および種々の浮腫
病状の治療における大黒柱となっている。しかしなが
ら、現在入手可能な薬理学的薬は、幾つかの重大な制限
事項や、望ましくない効果を有する。それらの使用は、
特定の異常（すなわち、流体容積の増大）に向けられて
いはいるが、それらの多数の作用は、疑いなく、生理学
的でなく、例えば、カリウムの喪失や、尿酸の大量保持
や、ブドウ糖および脂質の異常な代謝などを引き起こ
す。更に、既知の全ての利尿剤は、レニン−アンギオテ
ンシン−アルドステロン系を強く刺激して、それらの流
体容積減少作用や血圧低下作用に反作用するので、その
他の望ましくない効果を生ずる。完全な、しかしなが
ら、調整された範囲内で生理的に局所化された反応を与
えることによって血圧を調整することができる薬理学的
に効果的な化合物が提供されることが望ましい。
しかしながら、このような化合物を心房組織から分離す
ることは、典型的に煩雑なプロセスであって、ごく少量
の当該化合物を得る場合でも、相当量の基質組織が必要
とされる。これ等の化合物のあるものは、科学合成によ
って作ることができるけれども、臨床的に、および治療
的に当該化合物を適用するために、大量に当該化合物を
生産するための技術として、デオキシリボ核酸（DNA）
の組み換え技術およびその関連技術を用いることが望ま
しいと考えられた。
コーヘン（Cohen）とボイヤー（Boyer）：米国特許第4,
237,224号の将来性を有する業績から出発して、DNA組み
換え技術は、新規なDNAの配列を提供する上で、そして
転換された細胞の培養で多量の異種のタンパク質を作る
上で有用になってきた。一般に、種々の生体からのDNA
の接合は、制限酵素であるエンドヌクレアーゼを用いた
DNA鎖の切断に依存する。これらの酵素は、供与体のDNA
を、極めて特異的な個所で切断するために用いられ、そ
の結果、供与体のDNAは、所望のDNA鎖を含む遺伝子断片
となる。これらのDNA断片は、一般に、「接着性末端（S
ticky−ends）」と称される短い一本鎖の尾を各端に有
する。これらの接着末端を有する断片は、次いで例え
ば、同じ制限酵素であるエンドヌクレアーゼでもって消
化されることにより作られた発現媒体の相補的断片につ
なぎ合わされる。制御要素によって適当に配列された所
望の構造遺伝子を含む発現ベクター（expression vecto
t）を作ることにより、当該ベクターを用いて、宿主細
胞（host cells）を転換させ、そして所望の遺伝子産物
を入手可能な細胞機関（cellular machinery）を用いて
発現させることができる。一旦、発現させられると、一
般に、当該遺伝子産物が細胞内に発現している場合に
は、培養細胞を溶解させることによって当該産物が取り
出され、あるいは、当該遺伝子産物が宿主細胞中に隠れ
ている場合には、培養液から当該産物が取り出される。
DNA組み換え技術は、直接発現と称される方法で、全く
異種の遺伝子産物を発現させるために用いられてきてい
る、あるいは、所望の遺伝子産物を、同種タンパク質の
アミノ酸配列のある部分を含む融合タンパク質として発
現させることができる。一般に、この融合タンパク質
は、後翻訳的に（post−translationally）処理され、
それによって天然の遺伝子産物が取り出される。当該技
術において有用な手法の多くは、下記文献中に見出され
る：アニアテイス,T.,ほか，分子クローニング（Molecu
lar Cloning）：研究所手引き書（A Laboratory Manua
l）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory），ニューヨーク（1982）。
しかしながら、一般的な方法を要約することは容易だ
が、所望の構造遺伝子を含む発現媒介ベクターの構成は
困難なプロセスであり、そして、所望の遺伝子産物を、
その生物学的活性を保持させながら充分な量だけ成功裏
に発現させることは、容易に予想することが困難なこと
である。しばしば、遺伝子産物は、イースト（yeast:酵
母菌）や、バクテリアあるいは哺乳動物の細胞系の中で
当該産物が発現させられた場合に、生物学的に活性でな
い場合がある。これらの場合において、後翻訳的処理
が、生物的活性を生じさせるために、必要とされる。
発明の開示 ナトリウム尿亢進増加剤、利尿剤、血管拡張剤およびレ
ニン−アンギオテンシン−アルドステロン系（system）
の変調成分として有用な本発明の化合物は、実質的に、
無関係の心房組織あるいはその生成物を含有しない心房
のナトリウム尿排泄亢進性／血管拡張性ポリペプチド
（ANVPs）を含む。本発明は、式:Arg−Ser−Ser−Cys−
Phe−Gly−Gly−Arg−Ile/Met−Asp−Arg−Ile−Gly−A
la−Gln−Ser−Gly−Leu−Gly−Cys−Asn−Ser−Phe−A
rg−Tyr（式中、Ile/MetはIle又はMetを表わす）で表わ
され、その環状ジスルフィド形を包含し、Ｎ末端アセチ
ル化形及び／又はＣ端末アミド化形を包含する、哺乳動
物におけるナトリウム尿排泄亢進剤、利尿剤及び／又は
血管拡張剤として有用なポリペプチドに関する。
更に又、DNAを暗号化するANVPs,proANVPsあるいはpre−
proANVPsを発現するためのDNA組み換え技術を用いた、
本発明の化合物を生産するための方法も提供される：本
発明の当該方法は、下記工程を含む： ａ）宿主細胞中にDNA鎖を発現させる能力のある発現ベ
クターを作り； ｂ）当該発現ベクターでもって、宿主細胞（a host cel
l culture）を転換させ； ｃ）当該転換させられた宿主細胞を、DNA鎖の発現が許
される条件下で培養して、ANVPs,proANVPsまたはpre−p
roANVPを含むポリペプチドを生産し；そして ｄ）当該ポリペプチドを取り出す。
これらの化合物を、診断薬および治療薬として用いるた
めの方法も提供される。
図面の簡単な説明 第1A図は本発明の一実施例のデオキシリボ核酸（DN
A），即ちヒト（human）pre−proANVPを暗号化した遺伝
子を、当該DNAによって指示されるポリペプチド合成に
おけるアミノ酸配列と共に提供する； 第1B図は、本発明の一実施例の相補的デオキシリボ核酸
（cDNA），即ちヒトpre−proANVPを暗号化したcDNAを、
このDNAで指揮されたポリペプチド合成におけるアミノ
酸配列と共に提供する； 第２図は、本発明の一実施例のデオキシリボ核酸（DN
A）配列、即ちラット（rat）pre−proANVPを暗号化した
DNAを、このDNAによって指揮されたポリペプチド合成に
おけるアミノ酸配列と共に、提供する； 第3A−Ｄ図は、心房組織からの、本発明の心房のナトリ
ウム排泄増加性／血管拡張性（ANVP）化合物の精製にお
ける図示的提示であり：ここで、 第3A図は、抽出原液のＧ−50ゲル濾過の結果を示し； 第3B図は、精製された抽出液のHPLC（C18カラム:co−lu
m）精製の結果を示し； 第3C図は、第1B図の産物の再クロマトグラフィー（rech
romatography）を示し； 第3D図は、第1C図の精製された活性フラクション即ち活
性分画（active fractions）のHPLC（CNカラム）精製の
結果を示し； 第４図は、本発明の核酸構造を含む相補的DNA（cDNA）
クローン（clones）を同定するために用いられるオリゴ
ヌクレオチド探針（probes）の配列を示し； 第５図は、ジデオキシヌクレオチド（dideoxynucleotid
e）の配列を分析するためのDNA断片を提供するために、
ラットpre−proANVPをコードするデオキシリボ核酸を、
特異的な制限酵素であるエンドヌクレアーゼでもって切
断した部位、すなわちサイト（sites）を示し； 第６（ａ）図は、心房および心室のmRANのノーザン・ブ
ロット（Northern blot）分析の結果を示し、ここで、
レーン（lane）１は、ラット心房組織から分離されたRN
Aを示し、そしてレーン２は、ラット心室組織から分離
されたRNAを示し； 第６（ｂ），（ｃ），（ｄ）および（ｅ）図は、ポリ
（poly）A+RNAによって暗号化された無細胞翻訳産物（c
ellfree translation products）の２元的ゲル分割法
（two dimensionalgel fractionation）の結果を示し、
ここで（ｂ）は、心房のポリA+RNAによって暗号化され
た35Sタンパク質を示し、（ｃ）は、心室のポリA+RNAに
よって暗号化された35Sタンパク質を示す。試験管内に
おける、ラットpre−proANVPをコードするDNAと特異的
に雑種形成、すなわちハイブリット形成させられ、そし
て当該DNAから溶出するポリA+RNAの翻訳が示され、ここ
で（ｄ）は、心房組織から誘導されたポリA+RNAを示
し、そして（ｅ）は、心室組織から誘導されたポリA+RN
Aを示し； 第７図は、ジデオキシヌクレオチドの配列を分析するた
めのDNA断片を提供するために、ヒトpre−proANVPをコ
ードするヒトゲノム（genomic）デオキシリボ核酸を、
特異的な制限酵素であるエンドヌクレアーゼでもって切
断したサイド（sites）を示し； 第８図は、精製され、そして合成された本発明の化合物
の血管緊張低下活性の比較であり； 第9A図および第9B図は、培養されたウシの大動脈の平滑
筋細胞（パネルＡ）と大動脈内皮細胞（パネルＢ）とに
対する125I-rANVP（126−150）の結合を示す。実線は
（−）は、特異的結合を示し、そして破線（−−−）
は、非特異的結合を示す。スキャッチャード・プロット
（Scatchard plots）によるデータの分析が、差込み図
に示される； 第10Aおよび第10B図は、各々、rANVP（126−150）およ
びhANVP（127−151）の種々の投与量に応答する、培養
されたウシの血管平滑筋（パネルＡ）および血管内皮細
胞（パネルＢ）における環状GMPレベルを示し； 第11Aおよび11B図は、培養されたウシの大動脈平滑筋細
胞（パネルＡ）および培養されたウシの大動脈内皮細胞
（パネルＢ）においてcGMPを増大させるための種々のAN
VPsの能力を示す投与量一反応曲線である。データは、
投与量の関数として最大限の反応の百分率で示される； 第12図は、ラットおよびヒトのproANVPおよびその誘導
断片の発現において用いられたバクテリア性の発現プラ
スミド（plasmids）の図式的な提示であり、ここで、第
12A図は、プラスミド発現ベクターpKT−52を示し；第12
B図は、第12C図に示されるラットpre−proANVP cDNAか
ら誘導されたDNAの分節を示し、それはプラスミドpRNF
−6852においてクローン（cloned）されたアミノ酸87−
152を暗号化する；第12D図は、第12C図のラットpre−pr
oANVP cDNAから誘導されたDNAの体節を示し、それはプ
ラスミドpRNF−12852においてクローンされたアミノ酸2
5−152を暗号化する；第12E図は、トリプトファンオペ
ロンプロモーター／オペレーター（tryptophan operonp
romotor/operator）およびシネーデルガルノ配列（Shin
e−Delgarno Sequence）（SD）を含む合成DNA配列を示
し、これは第12F図に示されるpTRP−233を構成するため
に用いられる；そして第12G図は、プラスミドphNF−233
においてクローンされたアミノ酸23−151を暗号化する
ヒトpre−proANVP cDNAから誘導されたDNAの体節を示
す； 第13図は、Ｌ−［35S］−システインで標識されたタン
パク質を示す、SDS−ポリアクリルアミドゲルの写真的
提示であり、ここで、レーンＡにおける大腸菌はpKT52
発現ベクターを含み、レーンＣはpRNF−6852（pre−pro
ANVPのアミノ酸87−152をコードするDNAを含むように変
性させられたpKT52）を含み、レーンＥはpRNF−12852
（pre−proANVPのアミノ酸25−152をコードするDNAを含
むように変形させられたpKT52）を含み、レーンＢ、Ｄ
およびＦは、各々、レーンＡ、ＣおよびＥからの産物を
含み、当該産物は、特異的な抗ANVP（antiANVP）抗血清
でもって免疫沈殿させられ、レーンＧは、それらの対応
する分子サイズについてのタンパク質の分子量基準を含
み、矢印は、pRNF−6852およびpRNF−12852から誘導さ
れた独特のポリペプチドを示す； 第14図は、［35S］−システインで標識されたタンパク
質を示すSDSポリアクリルアミドゲルの写真的提示であ
り、ここで、レーンＡにおける大腸菌は、pTRP−233発
現ベクターを含み、レーンＢは、phNF−233〔ヒトpre−
proANVP（26−151）を暗号化したDNAを含むように変性
させられたpTRP−233〕発現産物を含み；レーンＣおよ
びＤは、各々、レーンＡおよびＢからの産物を含み、当
該産物は、特異的な抗ANVP抗血清でもって免疫沈殿させ
られる。レーンＡに隣接して、分子量基準によるサイズ
が示される； 第15図は、特異的ベクターとイーストα−因子分泌信号
とを用いてサツカロミセス・セレビシアエ（Saccharomy
ces cerevisiae）において、ラットpre−proANVPおよび
その関連ポリペプチド断片を発現させるための構成を示
し； 第16図は、S.セレビシアエから分泌され、そして35SＳ
−メチオニン（Ａ）あるいは35SＳ−システインおよび
35Sメチオニン（Ｂ）によって標識されたタンパク質を
示すSDSポリアクリルアミド・ゲルの写真的提示であ
る。Ａにおいて、レーン１および２におけるS.セレビシ
アエは、YEp−α−８シャトル（shuttle）ベクターを含
み、レーン３および４は、YEp−α−NF−９を含み、レ
ーン５および６は、YEp−α−NF−12を含んだ。Ｂにお
いて、当該分泌されたタンパク質は、アセトンとメタノ
ールで抽出され、ここでレーン１および２は、YEp−α
−NF−７とYEp−α−NF−５とを含むS.セレビシアエを
表示し、レーン３および４は、特異的な抗ANVP Ig Gで
もって免疫沈殿した後の、これらの試料からのタンパク
質を表示し、レーン５および６は、各々、YEp−α−NF
−12およびYEp−α−NF−９を含み、そして抗ANVP Ig G
によって特異的に免疫沈殿させられたタンパク質を示
す； 第17図は、酵母菌発現プラスミドと、ヒト心房のナトリ
ウム排泄増加性／血管拡張性断片128−151をコードする
合成遺伝子配列との図表的線図を示す。詳細は、プラス
ミドJJ−１およびJC1−５内の関連部位のセクションIV.
A）配列に位置する。表示 は、pBR322配列を示し、 は、２μのＢフォーム（form）を含むDNA断片を示し； は、α−因子前駆物質／ペプチドをコードするDNA断片
を示し； は、LEU2遺伝子を含むDNA断片を示す。Ｂ）はヒトの前
心房（proatrial）のナトリウム尿排泄亢進性、血管拡
張性断片128−151をコードする合成DNA遺伝子配列を示
す。要素オリゴデオキシヌクレオチドは、１〜８で番号
付けられる。α−因子に対し、上記の通りヌクレオチド
配列を番号付けしたアミノ酸は、上記のクルジアンＪ
（Kurjan J）およびヘルスコヴィッツ（Herskowitz）に
よって記述された遺伝子配列に対応する； 第18A図は、中国産ハムスター（Chinese hamster）の卵
巣細胞内で、ラットおよびヒトのpre−proANVPを発現さ
せるための、発現ベクターの構成を示し；そして 第18B図は、中国産ハムスターの卵巣細胞培地からのタ
ンパク質であって、35S−メチオニンでもって標識され
たタンパク質のSDS−ポリアクリルアミドゲルの写真的
提示であり、ここで、レーン１は、prohANVP（26−15
1）の合成を指揮する配列を含むCHO細胞プールからのタ
ンパク質であって、35S−メチオニンで標識されたタン
パク質を示し、レーン２は、調整CHO細胞からのタンパ
ク質であって、35S−メチオニンでラベルされたタンパ
ク質を示し、レーン３−６は、prohANVP（26−151）の
合成を指示する配列を含むCHO細胞からのタンパク質で
あって、35S−メチオニンで標識されたタンパク質を示
す：ここでレーン３−６は、各々、CHO−8/2−93,CHO−
8/2−81,CHO−8/2−55及びCHO−8/2−６を表示する。
発明を実施するための最適実施態様 本発明に従って、宿主（host）生体において流体容積お
よび血圧を調整するために、新規な、心房のナトリウム
尿排泄亢進性／血管拡張性ポリペプチド化合物が提供さ
れる。ここで、本発明は一面において、無関係の心房組
織あるいはその生成物を実質的に含まないANVPsを提供
する。
ANVPs、proANVPs（成熟したANVP発現産物化合物の前駆
物質形態）およびpre−proANVPs（健全な信号ペプチド
を有するproANVPs）、およびそれ等から誘導される断片
の合成を指揮することができる核酸配列は、第１図およ
び第２図のDNA配列を有し、その中に含まれてオリゴヌ
クレオチド配列を有し、コドン（codons）を、同配列の
合成または機能的に等価なアミノ酸配列の合成を指揮す
ることができる他のコドンで置き換えることを可能に
し、当該等価なアミノ酸配列は、提供された実施例で開
示された代替的残基を含む。
本発明のANVP化合物を説明するために用いる用語は、ア
ミノ酸の種名の最初の３文字を用いる従来の慣習に従
い、そしてここで、光学異性体を有するＬ型の全てのア
ミノ酸が、もし別に明白に表示されていない限り、意図
されている。
本発明の範囲内の化学物は、また、かくして得られるAN
VP化合物の活性を維持しながら、種々の方法で、上に列
挙した式を変形させることによっても得ることができ
る。例えば、これらの化合物のアミノ酸は、通常、天然
のＬ型であるが、１つ又はそれ以上、通常は、２つの又
はそれ以下、そして望ましくは、１つのアミノ酸を、こ
の出願に含まれる例示的な実施例のあるものにおいて示
されている通り、光学異性体Ｄ型、またはDL−ラセミ混
合物で置換することができる。当該化合物に含まれるア
ミノ酸残基は、また、アミド化したり、アセチル化した
り、または他の化学基でもって置換したりすることによ
っても変形させることができる。但し、上記他の化学基
は、例えば、当該化合物の活性に影響を及ぼすことな
く、当該化合物の溶解性を変化させることができるよう
な化学基である。
更にその上、本発明の化合物は、生物学的活性の点で同
じか、又は相補的範囲を有する化合物と混合させたり、
結合させたり、又は複合化させたりして、本発明の利益
を得ることができる。
現在望ましい幾つかの本発明のANVP化合物は、無関係の
心房組織またはその生成物を実質に含まない心房組織か
ら分離される。一般に、心房組織の酢酸抽出液は、ゲル
濾過処理および逆転相高性能液体クロマトグラフィー
（C18およびCNカラムを用いた）処理を受け、当該分画
の、ナトリウム排泄増加性および血管緊張低下性の作用
についての効力検定が行われる。
本発明の範囲内の化合物は、生物学的組織源、顕著には
哺乳動物の心房組織源から分離し、そして精製すること
ができ、あるいは、固相合成法（solid phase synthesi
s）などのような、当業界で良く知られた手段を用い
て、化学的に合成することができる。当該合成は、アル
ファーアミノで保護されたアミノ酸を用いて、ペプチド
のＣ端末から開始させられる。ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル（Boc）保護基は、全てのアミノ基に対して、他の
保護基が適しているときでさえ、用いることができる。
例えば、Boc−Arg−OHまたはBco−Tyr−OH（即ち、Ｃ末
端のアミノ酸から選択された）は、クロル・メチル化さ
れたポリスチレン樹脂サポート（supports）にエステル
化することができる。当該ポリスチレン樹脂サポート
は、望ましくは、スチレンと、架橋剤としての約0.5か
ら２％のジビニル・ベンゼンとコポリマーであり、当該
架橋剤が、ポリスチレンポリマーを、ある種の有機溶媒
に対して完全に不溶性にする。スチュワート（Stewar
t）ほか、固相ペプチド合成（Solid−phase peptide Sy
nthesis）、W.H.フリーマン社（W.H.Freeman Co.）、サ
ンフランシスコ（1969）およびメリフィールド（Merrif
ield）、J.Am.Chem.Soc.85:2149−2154（1963）を見
よ。
都合の良いことに、ANVP化合物は、徒手技術を用いて、
又は、例えば、バイオサーチ（Biosearch）SAMII自動的
（automatic）ペプチドシンセサイザー（バイオサーチ
社、サンラファエル、カリフォルニア）を、指令マニュ
アルに説明されている通りに、自動的に用いて、合成す
ることができる。
あるいは、本発明の化合物は、組み換えDNA構造の発現
によって生産することができる。この生産は、当該化合
物を多量に提供する上で、又は、当該化合物の代替的実
施例を提供する上で望ましい。
更に詳しく説明すると、種々の形のpre−proANVP、proA
NVPおよびANVP化合物のアミノ酸配列における変形は、
当該化合物の合成を指揮するために用いられるクローン
された構造遺伝子のヌクレオチド配列をいろいろに変え
ることによって実施することができる。DNA配列のこの
変形に含まれるものとして、種々のコドンの、他のコド
ンによる置換がある：但し、この場合、当該他のコドン
は、遺伝暗号の変性に起因して、同アミノ酸の合成を指
揮する。
更に、コードンの置換によって、１つ又はそれ以上のア
ミノ酸残基を、機能的に等価な残基で、上記の通り置換
することができる。
本発明の化合物は、健全な哺乳動物において、および哺
乳動物から分離された腎臓において、ナトリウム尿排泄
亢進性および利尿性の活性を有するように示される。更
にその上、合成化合物を含む本発明の化合物は、血管緊
張低下活性を有し、そしてアルドステロンの分泌を抑制
する。当該アルドステロンの分泌は、酸化によって促進
させられ、そして還元によって減少されられるように示
され、そのことによって、ここで開示された上記一般式
に含まれるシステイン残基間の二硫化物橋状結合の存在
は、上記の生物学的活性にとって必要であることが示さ
れる。
上に列挙した生理学的効果を有するように示される本発
明の化合物は、例えば、ナトリウム尿排泄亢進や、利尿
や、血管拡張を含む多くの治療的応用分野で用いること
ができる。このようにこれらの化合物は、腎臓の非効率
な灌流や、糸球体の低い濾過率に起因する高血圧や腎不
全に加えて、例えば、うつ血性心不全や、ネフローゼ症
候群および肝硬変等の種々の浮種症状の治療における、
治療薬として用いることができる。
これ等の化合物は、家畜などに対する獣医学上の使用の
ために哺乳動物に投与することができ、そして他の治療
薬と同じ方法で、生理学的に受容可能なキャリヤー（ca
rrier）を用いて、臨床的に用いることができる。一般
に、投与量は、約0.01から100μg/kg、より一般的に
は、0.1から10μg/kgが、被投与者の体重に関する割合
の範囲として存在する。あるいは、この範囲内の投与
は、所望の治療効果が得られるまで、通常、24時間を越
える長い時間にわたる一定の注入によって実施すること
ができる。
これらの化合物は、生理的に受容可能な活性または非活
性な他の物質、または、例えば、水または生理食塩水の
ような生理的に妥当なキャリヤーと共に混合されて、き
ちんと施され得る。当該化合物は、経口的に、又は、例
えば注射を用いる場合のように、非経口的に施され得
る。注射は、皮下、静脈内または筋肉注射のいずれでも
よい。
これらの化合物は、薬理的に有効な量だけ好ましい態様
で施され、そしてしばしば、酸付加塩のような薬理的に
受容可能な塩として施される。当該塩は、とりわけ、例
えば、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸
塩、酢酸塩、安息香酸塩、りんご酸塩などを含むことが
できる。
本発明の化合物は、また、標識された試薬、通常は抗体
を用いる免疫学的検定において用いるための抗血清を作
るために用いることができる。好都合にも、ポリペプチ
ドは、ジアルデヒド、特に、４から６個の炭素原子のも
のと脂肪族、またはカルボジイミドによって、抗原に接
合され得る。これらの化合物と免疫学的試薬とは、当業
界において良く知られた技術により、種々のラベルでラ
ベルされる。当該ラベルとして、例えば、発色団、例え
ばフルオレセインまたはローダミンなどの螢光団、また
は、125I、35S、14Cまたは3Hなどのラジオアイソトー
プ、あるいは磁化粒子などがある。
これらの標識された化合物と試薬、または、認識するこ
とができ且つそれ等に特異的に結合することができる標
識された試料は、例えば、診断上の試薬として用いるこ
とができる。生物学的標本から取られたサンプルは、本
発明の化合物と共通する抗原決定基を有する物質の存在
またはその量について、効力検定することができる。更
に、モノクローナル（monoclonal）抗体は、当業界で既
知の方法によって作ることができ、当該抗体は、例え
ば、生体内において、免疫学的に関連した化合物の過剰
生産を制するための治療において用いることができる。
下記の実施例は、例示的目的で提供されるものであっ
て、本発明を限定する目的で提供されるものではない。
実施例 下記に開示される実施例において、ラット及びヒトのDN
A配列から誘導されるpre−proANVPs、proANVPs、ANVPs
は、各々１−152及び１−151と番号を付されたアミノ酸
残基を有し、開示されたアミノ酸配列において相違を示
す。化学的に合成されたANVPsのアミノ酸配列は、ラッ
トから誘導された（rat−derived）配列の位置126およ
びヒトから誘導された（human−derived）配列の位置12
7において見出されるアルギニン残基から番号付けられ
る（第１および第２図を見よ）。
I.心房のナトリウム尿排泄亢進性／血管拡張性ポリペプ
チド化合物の分離と精製 本発明の範囲内の化合物は、下記の実験付随書（protoc
ol）に従って、心房組織から分離された。これらの化合
物とそれらの合成ポリペプチド類似化合物は、集合用語
のANVPsに含まれる。
ポリペプチド化合物は、心房の酢酸抽出液から分離さ
れ、当該抽出液は、無関係の組織およびその生成物を実
質的に含んでいなかった。1400匹の雄のウイスターラッ
ト（wistar rats）からの心房は、1Nの酢酸の８体積（v
olumes）中に均質化され、当該酢酸は下記を含有してい
た:1mMのフェニル・メチル・ズルフォニル弗化物（PMSF
シグマケミカル社（PMSF Sigma Chemical Co.）、セン
トルイス、ミズリー（Mo））;3mMのエチレン・ジアミン
４酢酸（EDTA）；および５μＭのペプスタチンＡ（ペプ
シンおよびレニン抑制物質、シグマケミカル社、セント
ルイス、ミズリー（Mo））。この均質物質は、10,800×
ｇで30分間、遠心分離機にかけられ、そしてペレット
が、初めの（original）緩衝液の４体積中に再均質化さ
れた。当該抽出液からの上澄み液はプールされ、そして
水酸化アンモニウムで中性化された。かくして中性化さ
れた上澄み液は、次いで10,000×ｇで20分間、遠心分離
機にかけられ、そして凍結乾燥された。
当該連結乾燥された心房抽出物は、6mlの緩衝液中で再
構成され、遠心分離機にかけられ、そしてセファデック
ス（登録商標名）G50の2.5×45cmゲル濾過カラム（gel
filtration column）（ファイン、ファルマシア ファ
イン ケミカルズ（fine,Pharmacia Fine Chemical
s）、ピスカタウェイ、ニュージャージー）に詰め込ま
れた：当該カラムは、予め1Nの酢酸で平衡化されてい
た。分画（fraction）の各々からの部分標本（aliquot
s）が乾燥され（サバントスピード−バック濃縮器（Sav
ant SpeedVacconcentrator））、リン酸エステル塩で緩
衝された生理食塩水（PBS）中で再構成され、そしてナ
トリウム排泄増加性活性について健全なラットで効力検
定され、そして血管緊張低下性活性についてウサギの大
動脈輪を用いて効力検定された。
このクロマトグラフィー処理の結果は、第3A図に示され
ている通りであり、そして水平のブラケット内に含まれ
た領域が凍結乾燥され、0.1％の水溶性トリフルオロ酢
酸（trifluoroacetic acid:TFA）で再構成され、プール
（pool）され、そして遠心分離機にかけられた。
プールされた物質は、15％のアセトニトリル（CH3CN）
に適応させられ、そして0.39×30.0センチメートルμ−
ボンダパック（μ−Bondapak）C18カラム（ウォーター
社（Water,Inc）、ミルフォード、マサチュセッツ州（M
A））に、ウォーターU6Kインジェクターおよび溶媒送出
システム（ウォーター社、ミルフォード、マサチュセッ
ツ州（MA））を用いて、詰め込まれた。結合（Bound）
物質は、85:15から45:55の、Ａ（0.1％TFA）:B（CH3C
N）の溶媒の直線的勾配で、40分間、溶出された。
当該分画試料は、ナトリウム排泄増加性について、分離
された腎臓を用いて効力検定され、そして既述の通り、
続いて血管緊張低下性活性についての効力検定が行なわ
れた。ナトリウム尿排泄亢進性活性と血管緊張低下性活
性とが一致する広範な領域の画分が溶出され、そしてこ
れらの画分はプールされ、乾燥された。
かくして得られ乾燥された物質は、A:Bが78:22である溶
媒中で再構成され、そして22から38％Ｂの勾配を用い
て、1.0ml/分の割合で、48分間にわたって、再びクロマ
トグラフィーにかけられた（12の別個の適用例におい
て）。当該分画の部分標本は、既述の通り、ナトリウム
排泄増加性活性および血管緊張低下性活性の双方につい
て、テストされた。その結果を第3B図に示す。３つの活
性ピーク（active peaks）からの分画は、プールされ、
そして夜通し乾燥された。
第２ピーク（第3B図においてカッコでくくられた領域で
表示される）からの組み合わさった分画は、A:Bが77:23
の溶媒中で再構成され、C18カラムに詰められ、23から2
9％Ｂの勾配を用いて、90分間にわたって溶出された。
このリクロマトグラフィーの結果は、第3C図に示される
通りであった：ここでカッコでくくられた領域は、血管
緊張低下性活性を有する分画を示す。６件の適用例から
の活性分画が、プールされた。
かくして得られた物質は、0.39×30cmμ−ボンダパック
CNカラム（ウォーター社、ミルフォード、マサチュセッ
ツ（MA））に詰められた。使用された溶媒系は、Ａ（水
中で0.1％のTFA）とＢ（CH3CN中で0.055％のTFA）であ
った。当該サンプルは、A:Bが90:10である溶媒中で再構
成され、３件の別個の適用例において、10から30％Ｂの
勾配を用いて、60分間にわたり、0.6ml/分の割合で、ク
ロマトグラフィーにかけられた。以下に説明される通
り、血管緊張低下性活性は、ヒスタミンで収縮された大
動脈輪に生じた緊張の低下によって決定された。
第3D図においてカッコで示される最大活性ピークの分画
は、乾燥され、そして配列させられた。当該配列は、ア
プライド・バイオシステムズ470Aガス相シーケンサー
（Applied Biosystems 470A gas−phase sequencer）
（アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティ
ー、カリフォルニア（CA））を、製造者の指示書に従っ
て用いることにより、１ナノモル（nanomole）のタンパ
ク質から決定された。PTHアミノ酸は、0.46×25cmIBM C
Nカラムを用いて、ベックマン（Beckman）334T HPLCで
同定された。適用された勾配は、下記の変更以外は、ハ
ンカピラー、（Hunkapiller）、N.W及びL.F.フード（Ho
od）、酵素学の方法（Methods in Enzymology）、91:48
6−492（アカデミックプレス（Academic Press）、ニュ
ーヨーク）（1983）に示されている通りのものであっ
た：上記で言及した変更:2元（binary）勾配システム
が、３元（ternary）勾配システムで置き換えられ、当
該３元勾配システムにおいて、アセトニトリルとメタノ
ールが、別個のポンプでポンプされ、そしてそれら２者
の比が、勾配プログラムの適当な変更によって、勾配の
推移にわたって、時間と共に変化させられた；パーマフ
ェース（Permaphase）ETH（登録商標名）ガード・カラ
ム（guard cloumn）は、５×0.46センチメートル IBM
CNアナリティカル“ミニーカラム”（analytical “min
i−column"）で置き換えられ、そして当該アナリテイカ
ル“ミニカラム”は、28℃まで加熱された。
分離され、無関係のラット心房組織とその生成物を実質
的に含まない下記化合物は、下式を有する： ここで、Ｘは、OHまたはTry−OHである。
以下に説明されるヌクレオチド鎖から誘導されるラット
とヒトのpre−proANVPsとproANVPsのアミノ酸配列を比
較するために、当該化合物は、rANVP（126−149）（こ
こで、Ｘは、OHである）およびrANVP（126−150）（こ
こで、Ｘは、Try−OHである）として引用される。
以下に説明される対応するヒトDNA鎖から誘導されたこ
れらのANVPsのヒト等価物質は、各々、hANVP（127−15
0）およびhANVP（127−151）として引用される。本発明
のANVP化合物は、既述の通り番号付けされた（126−ラ
ットおよび127−ヒト）NH2末端のアルギニン残基によっ
て番号付けされる。
精製工程の産物を効力検定するために用いられた方法を
根拠とすると、ナトリウム尿排泄亢進性および血管緊急
低下性の双方の活性は、分離され精製されたANVP物質に
固有な特性である。
II.心房のナトリウム尿排泄亢進性／血管拡張性ポリペ
プチドの、組み換えDNAクローニング（Cloning） 以下の実施例において、ラットおよびヒトから取出され
たpre−proANVPsおよびproANVPsを暗号化したデオキシ
リボ核酸（DNA）鎖を説明する。本発明のポリペプチド
の発現を指揮する無数の代替鎖を構成できるようにする
必要がある。
A.ラットのPre−心房のナトリウム尿排泄亢進性／血管
拡張性ポリペプチドcDNAのクローニング 1.ラットの心房のmRNAの分離 RNA全体が、ラットの心房から、（チャーグウイン（Chi
rgwin）、J.M.ほか．生化学（Biochemistry）18:5294−
5299（1979）の）方法によって分離された。当該組織
は、下記溶液中で均質化された：当該溶液は下記の含ん
でいた:6Mのグアニジンチオシアン酸塩;0.005Mのクエン
酸ナトリウム;pH7.0;0.1Mの２−メルカプトエタノール;
0.5％のサルクロシル（Sarcrosyl）。当該均質化物質
は、塩化セシウム中で2.0M作られ、そして0.1MのEDTA中
で、5.7Mの塩化セシウムのクション（cushion）上で層
状にされた。当該RNAは、このクションを介して、115,0
00×ｇで16時間の間、遠心分離機にかけられることによ
り、ペレット化された。次いで、当該RNAは、下記を含
む溶液中に溶解させられた:0.01Mのトリス（Tris）;pH
7.4;0.005MのEDTA;1.0％のナトリウム・ドデシス硫酸塩
（SDS）（sodium dodecylsulfade）、そして4:1の割合
のクロロホルムと１−ブタノールとの混合液で抽出さ
れ、その後、70％のエタノールで沈殿させられた ポリアデニル酸塩化（polyadenylated）RNA（poly A+ R
NA）分画は、アビブ（Aviv）、H.およびP.レダー（Lede
r）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:1408−1412（1972）
によって説明されている通り、オリゴ（dT）セルロース
を用いて、アフィニィティ（affinity）・クロマトグラ
フィーによって得られた。当該poly A+ RNAは、下記を
含む溶液中で、セルロース・マトリックスに結合させら
れた:0.02Mのトリス;pH7.6;0.001MのEDTA;0.1％のSDS;
0.5Mの塩化ナトリウム。非ポリアデニル酸塩化（non−p
oly−adenylated）RNAは、カラムを当該溶液で洗浄する
ことによって除去された。次いで、poly A+ RNAは、塩
化ナトリウムを除去した当該溶液中に溶出させられ、そ
して70％のエタノールで沈殿させられた。これらの技術
を用いて、100μｇのポリアデニル酸塩化RNAが、10gmの
心房組織から分離された。
2.ラット心房のcDNAライブラリー（library）の生成 ヘルフマン（Helfman）、D.M.ほか、proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 80:31−35（1983）によって記述されている通
り、２重鎖cDNAは、逐次的に添加されるEcoRIおよびSal
Iオリゴヌクレオチド・リンカー（linkers）を用いて、
プラスミド・ベクターpUC8（ビエイラ（Vieira）、J.お
よびJ.メッシング（Messing）、遺伝子（Gene）19:259
−268,1982）の中に当該２重鎖cDNAを挿入するために、
合成され、生産される。
第一鎖cDNAは、オリゴ（dT）12-18で感作された鳥（Avi
an）の骨髄芽球病ウィルスからのRNA依存型DNAポリメラ
ーゼによって合成された。次いで、RNA鋳型は、塩基加
水分解によって除去された。第２鎖DNAは、第１鎖分子
の３′末端での自己感作（self−priming）に依存し
て、RNA依存型DNAポリメラーゼによって合成され、それ
によって、２重鎖ヘアピン（hairpin）DNAが形成され
た。これらの分子は、一本鎖領域を満たす大腸菌のDNA
ポリメラーゼＩの大断片を用いて、開放端末をブラント
末端にした（blunt−ended）。EcoRIオリゴヌクレオチ
ドリンカーは、T4−DNAリガーゼを用いて、開放末端に
加えられた。ヘアピン・ループ（loop）は、アスペルギ
ルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）からのS1ヌクレ
アーゼでもって切り開かれ、そして当該分子の末端は、
再び前と同じようにブラント末端にした。SalIオリゴヌ
クレオチド・リンカーは、次いでT4−DNAリガーゼを用
いて加えられた。SalIおよびEcoRI“接着性末端”は、
これらの制限酵素であるエンドヌクレアーゼによる切断
によって開放された。これらの２重鎖、２重リンカー
（doubled−linkered）cDNA分子は、次いで、EcoRIとSa
lIで消化されたpUC8中に結紮され、そして、カサバデン
（Casabaden）、M.およびS.コーエン（Cohen）、J.Mol.
Biol.138:179−207（1980）に記述された塩化カルシウ
ム処理によって、大腸菌MC1061の中に挿入された。
５μｇのラット心房のpoly A+ RNAは、約25ngのcDNAを
産出し、サイズは300塩基対よりも大きく選択され、そ
して約200、000の独立型組み換え体のライブラリーが与
えられた。これらの組み換え体は、ニトロセルロースフ
ィルタ上にメッキ（plated）された。メッキされた鋳型
（replica）とライブラリーは、ハナハン（Hanahan）、
D.とM.メセルソン（Meselson）、遺伝子（Gene）10:63
−67（1980）、およびハナハン、D.とM.メセルソン、酵
素学の方法（Methods in Enzymology）、アカデミック
プレス、ニューヨーク、pp333−342の実験簿（protoco
l）に従って、グリセリンを含浸したフィルター上に−7
0℃で凍結され貯蔵された。
3.ラット心房のcDNAライブラリーのふるい分け（screen
ing） セクションＩで決定された、天然ラットのANVPsのアミ
ノ酸配列は、ワレイス（Wallace）、R.B.ほか、核酸研
究（Nucleic Acids Res.）9:879−894（1981）に記述さ
れている通り、ラット心房のcDNAライブラリーをふるい
分けるためのオリゴヌクレオチド・プローブ（probes）
を設計するために用いられた。遺伝暗号の変性を考慮し
て、各領域に対して、２つのオリゴヌクレオチドのプー
ルが合成された。領域１は、２つのテトラデカマー（te
tradecamer）オリゴヌクレオチドのプールでカバーさ
れ、プローブａとプローブｂは各々、64個の塩基配列か
らなる。領域２は、他の２つのテトラデカマー・プール
でカバーされ、プローブｃとプローブｄは、各々、72個
の配列からなる。これらのオリゴヌクレオチドの配列と
位置は、第４図に示される。４つのオリゴヌクレトチド
混合物の配列と一緒に、天然ラットのANVPのアミノ酸４
−13の配列が示され、ここで、領域１のプローブａと
ｂ、そして領域２のプローブｃとｄにおいて、Ｒは、Ａ
又はＧであり、Ｙは、ＴまたはＣであり、ＮはＡ、Ｇ、
ＴまたはＣである。各オリゴヌクレオチドの混合物は、
エフィモフ（Efimov）.V.A.他、Nuc.Acids Res.10:6875
〜6894（1982）で記述されている通り、凝縮試験として
のＮ−メチルイミダゾールの存在下で、メシチレンスル
ホニル塩化物を用いて、スタンダード・ホスホトリエス
ター法（standard phosphotriester method）を変形さ
せることによって、バイオサーチSAMIオリゴヌクレオチ
ド・シンセサイザー（バイオサーチ社、サンラファイエ
ル、カルフォルニア）で合成され、そしてポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動法によって精製された。
cDNAライブラリーは、次いで、これらのプローブを用い
てコロニー（colony）を雑種形成させることによって、
ふるい分けられた。４つの鋳型フィルタは、各フィルタ
ーから作られ、それによって、各コロニーは、各オリゴ
ヌクレオチド・プローブのプールでふるい分けられた。
フィルターは、真空下で、80℃で、２時間の間、焼成さ
れ、次いで大量の溶液３×SSC（ここで、１×SSCは0.15
Mの塩化ナトリウムと0.15Mのクエン酸ナトリウムとを含
み、pH値は7.5である）0.1％SDSの中で振盪されること
により、68℃で夜通し洗浄された。フィルタは、50℃
で、最小限度２時間の間、下記組成の溶液６×SSC中
で、予備的雑種形成を施こされた：溶液組成:0.1％SDS;
1mM EDTA;5×デンハルツ溶液（Denhardt's solutio
n）；（0.1％Ficoll;0.1％ポリビニルピロリドン;0.1％
ウシ血清アルブミン）;0.05％ピロ燐酸ナトリウム。
次いで、フィルターは、45℃で、振盪水浴中で、100μg
/mlのtRNAを含む雑種形成溶液10ml中で、フィルター毎
に、32pでラベルされた2.5×106cpmのオリゴヌクレオチ
ド・プローブ混合物（マニアチス（Maniatis）、T.ほ
か、分子クローニング、コールド・スプリング・ハーバ
ーラボラトリーズ、1982、pp.122−123に従って、リン
酸化されている）を用いて雑種形成された。１時間後、
恒温装置は、25℃まで冷却され、そして当該浴は、12時
間の間、平衡状態におかれた。フィルターは、６×SS
C、0.1％SDS溶液中で、室温で、15分間にわたって、２
度、洗浄され、次いで、６×SSC、0.1％SDS溶液中で、
（プローブｃとｄについては）35℃で、また（プローブ
ａとｂについては）39℃で、１−２分間にわたって洗浄
された。最後の洗浄温度は、下記の経験式から得られ
た：スグッス（Suggs）、S.V.ほか、精製遺伝子を用い
た発生・生物学（Developmental Biology Using Purifi
ed Genes）（ed.D.D.ブラウン（Brown）およびC.F.フォ
ックス（Fox）アカデミックプレス、ニューヨークpp.68
3−693の経験式、即ち、Td＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋
Ｔ）。かくして雑種形成されたフィルターは、次いで乾
燥されて、デュポン（登録商標）のクロネックス増強ス
クリーン（Dupont Cronex intensifying screens）を用
いて、コダック（登録商標）XARフィルム上で、完全に
曝露が完了するまで、オートラジオグラフィーにかけら
れた。
コロニーは、それが領域番号１からの１つのプローブ
と、領域番号２からの１つのプローブとで雑種形成され
た場合、陽性と考えられた。オリゴヌクレオチド・プロ
ーブ（プローブａとｃ）と強く雑種形成され、そして心
室のcDNAプローブではなくて、ランダムに感作された心
房のcDNAと雑種形成された１つのコロニーが選択され
た。このクローンの配列は、それがラットのpre−proAN
VPsを暗号化していることを示した。このクローンを、p
NF1という。
4.ラットのpre−pro心房のナトリウム排泄増加性／血管
拡張性ポリペプチドcDNAの完全なふるい分け pNF1から得られた、精製されたDNA挿入物は、スモール
・ミニプレプ法（small miniprep methods）（上記のマ
ニアチス（Maniatis）ほか、p.366の）を用いて作ら
れ、そしてアクリルアミド・ゲルにおいて分離された。
次いで、健全なDNA挿入物は、メッシング（Messing）J.
とJ.ビーイラ（Vieira）、遺伝子19:259−268（1982）
で記述されている通りのジデオキシヌクレオチド法（di
deoxynucleotide method）を用いてDNA鎖に対して特異
的に設計された一本鎖バクテリオファージM13の中に、
各々、第５図に示される通り、５′末端と３′末端のEc
oRIとSa1Iサイト（sites）を介して、取り入れられた。
全鎖の初めのリーディング（reading）は、次いで、サ
ンガー（Sanger）ジデオキシヌクレオチド配列技術（サ
ンガー、F.ほか、proc.Nat.Acad.Sci.USA 74:5463−546
9（1977）を用いてこれらのクローン（Clones）から得
られた。この初めの配列を確認するために、他のDNA鎖
の別個のリーディングが必要だった。このために、塩基
340におけるHincIIサイトが用いられた。かくして作ら
れた当該挿入物は、エンドヌクレアーゼHincIIでもって
消化され、その結果生じた消化片は、SmaIとEcoRI（矢
印５）とで切開されたM13mp9の中と、SalIおよびSmaI
（矢印６）とで消化されたM13mp8の中とに、各々、組み
込まれた。追加的確認を取るために、同様のアプローチ
が、塩基647においてPstIサイトを用いて行なわれた
（矢印３と４）。配列（pNF1）のために用いられた初め
のクローンは、第２図に示される通り、鎖の塩基784に
おいて終端したが、他のクローン（pNF4）は、更に３′
まで伸び、３′のpolyA尾部を有する最終の22塩基を含
んだ。このクローンの３′末端の配列は、当該挿入体
（矢印７）のSalI部位に対して、PstIを含むM13クロー
ンを用いて得られ、そして、塩基785−806として第２図
に示される。最後に、DNAの正に５′末端のヌクレオチ
ドは、32pでラベルされた一本鎖DNAのマクサムアンドギ
ルバート配列（Maxam and Gibert Sequencing）（マク
サム、A.アンドW.ギルバート、Proc.Nat.Acad.Sci.USA
74:560−564（1977）を用いて決定された：但し、上記
一本鎖DNAは、塩基１−186に及ぶBg1II断片を用いて、
５′領域に対して相補的にされている。かくして決定さ
れた配列は、塩基１−22として、第２図に含まれた。こ
のようにして、ヌクレオチド配列の分析によって、第２
図の塩基23−784を含むクローンpNF1がANVP前駆体であ
るpre−proANVPを暗号化することが確認された。心房cD
NAライブラリーが、cDNA挿入物でもって再ふるい分けさ
れたときに、約0.5％のコロニーが雑種形成された。こ
のことにより、pre−proANVPmRNAは、ラット心房のmRNA
集団（population）の主要な種であることが示される。
天然ラットのpre−proANVPのアミノ酸配列は、cDNAヌク
レオチド配列から決定された。152アミノ酸配列を暗号
化した単一読取り枠は、塩基85における初めのコドンAT
Gから、位置541における終りのコドンまで伸びるように
開示された。ヒトとラットのpre−proANVPsのアミノ酸
配列（各々、第１図と第２図を見よ）において、生物学
的に活性なANVPs（第５図を見よ）を同定することがで
きる。
5.心房の特異性の決定 心房と心室のpoly A+ RNAは、メチル水銀水酸化物（met
hy−mercuric hydroxide）を含む、1.4％のアガローゼ
（agarose）ゲルにおけ電気泳動法による分画化の後
で、バイレイ（Bailey）、J.M.とN.ダビットソン（Dvid
son）、分析生化学、70:75−85（1976）の方法によるノ
ザン法（Northernblot）分析を受けた。ニック（nick）
で翻訳されたpNF1 DNAを用いて、ノザン法分析の結果が
第6a図に示される：ここで、レーン１は、心房のpoly A
+ RNA含み、そしてレーン２は、心室のpoly A+ RNAを含
む。第6a図に示されている通り、pNFIは、長さ方向に、
約800−900の又クレオチドの心房のmRNAと、雑種形成を
行うが、心室のmRNAとは雑種形成を行わない。
上で決定されたpre−pro ANVPに対するcDNAは、pre−pr
o ANVPが約16,500ドルトンの分子量を有することを示
す。実際の前駆物質のサイズを決定するために、pre−p
ro ANVPをコードする心房のmRNAは、下記処理を受けて
精製された：処理：雑種選択処理（ゴルドベルク（Gold
berg）、M.L.ほか、酵素学の方法68:206−220、アカデ
ミック・プレス、ニューヨーク）;1cm2のニトロセルロ
ース・ディスクにおける５μｇのpNFI DNAの不動化処
理；および溶液（20mMのPIPES;（pH6.4）;1mMのEDTAと;
65％のホルムアミドと;5×SSC;0.1％のSDSとを含む）中
における、50℃での、３時間にわたる５μｇのpoly A+
RNAとの雑種形成処理。フィルターは、70℃で、広範に
わたって、溶液（0mMのトリスー塩化ナトリウムと；（p
H7.5）;0.15Mの塩化ナトリウムと;1mMのEDTAと;0.1％の
SDSとを含む）でもって洗浄された。その後、フィルタ
ーは、SDSを除去した当該溶液、すなわち緩衝液の中で
洗浄された。雑種形成されたRNAは、１分間にわたっ
て、50μｇのイーストtRNAの存在下で、100℃で、水中
に溶出され、そして−70℃で直ちに凍結された。融解
後、RNAは、２容積の無水エタノールを用いて、エタノ
ールで沈殿させられた。
雑種選択されたRNAと全部のpoly A+ RNAとは、ウサギの
網状赤血球溶解液系（ベセスダ（Bethesda）リサーチ・
ラボ、ガイセルベルク、メリーランド）を用いて、250
μCi/mlの［35S］−メチオニンの存在下で、翻訳され
た。かくして得られた翻訳産物は、サンプル毎に、１×
106cpmの酸沈澱性放射能を負荷させることによって、２
元的（２−dimensional）ゲル電気泳動法により、分画
化された。第１次元（the first dimension）は、勾配p
H3.5−10（オファレル（O'Farrell）、P.Z.ほか、細胞1
2:113−1142（1977）を用いた等電位焦点ゲルだった。
当該等電位焦点の産物は、15％のゲルを用いたSDS−PAG
Eにおいて電気泳動法にかけられた。サリチル酸ナトリ
ウム平衡に続いて、当該ゲルは乾燥され、次いで、24時
間にわたって、−70℃で螢光間接撮影された。
その産物は、第6b図と第6c図（ここで、12,000から30,0
00ドルトンの間の分子量を有する幾つかの心房の特異的
な翻訳産物が、矢印で示される）に示された。pNFI雑種
で選択された心房のRNAによって暗号化された翻訳産物
は、第6d図に示される。第6d図において、主要な心房の
特異的な種である分子量が18,000から20,000ドルトンの
間にある少くとも３つの関連タンパク質の種が示され
る。第6e図は、雑種選択によって、いかなる心室の特異
的なタンパク質も認められなかったことを示す。第6d図
のタンパク質は雑種選択されたので、心房特異性であ
り、そして正しい分子量範囲に入っており、それらは、
pre−pro ANVPsを代表する。
B.pre−pro心房性ナトリウム尿排泄亢進性／血管拡張性
ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のクローニング 1.ヒトの天然pre−pro心房のナトリウム尿排泄亢進性／
血管拡張性ポリペプチド遺伝子の分離 ラットのpre−pro ANVPを暗号化したcDNA（pNFIから分
離されたもの）は、ヒト遺伝子を同定するためのプロー
ブを提供した。バクテリオファージCharon 4A（ローン
（Lawn）、R.M.ほか、細胞15:1157−1174（1978））に
おけるヒト・ゲノム・クローン・ライブラリーは、T.マ
ニアチス（Maniatis）博士（バーバード大学）から得ら
れた。約106ファージが、大腸菌K 803で増殖され、そし
て溶菌斑溶液が、ベントン（Benton）、W.DとR.W.デー
ビス（Davis）（サイエンス196:180−182（1977））と
によって記述されている通り、ニトロセルロースのフィ
ルターに移された。これらのフィルターは、ニック翻訳
法（リグビー（Rigby）,P.W.J.ほか、J.Mol.Biol.113:2
37−251（1977））によって32Pで放射能的にラベルされ
たラットのcDNAに対して、雑種形成された。フィルター
は、42℃で、１時間にわたって、雑種形成緩衝液（0.75
Mの塩化ナトリウムと;0.75Mの硝酸ナトリウムと;40％の
ホルムアミドと;0.05％のSDSと;0.02％のウシの血清ア
ルブミンと;0.02％のFicoll−400,000と;0.02％のポリ
ビニルピロリドンと;0.1％のピロ燐酸ナトリウムと;20
μg/mlの変性し、せん断したサケの精液DNAとを含む）
中で、予備洗浄された。新鮮な雑種形成緩衝液の1ml毎
に、32Pでラベルされ、煮沸されたラットのpre−pro AN
VPsが加えられ、そしてフィルターは、この緩衝液の中
で、16時間わたって、42℃で培養された。次いで、フィ
ルターは、50℃で、0.3Mの塩化ナトリウムと、0.3Mの硝
酸ナトリウムと、0.5％のSDSとを含む溶液中で、３回洗
浄され、そして夜通しオートラジオグラフィーに曝露さ
れた。天然のラットのpre−pro ANVP cDNAと雑種形成さ
れた配列を含む６つのクローンが精製された。
天然のヒトのpre−pro ANVP遺伝子のサイズは、クロー
ンの全長の同定が可能なように決定された。ブリン（Bl
in）N.とD.スタフォート（Stafford）の方法（Nuc.Acid
Res.3:2303−2308（1976））によって、20gのラットの
肝臓から、2mgの高分子量のDNAが作られた。このDNA
は、制限酵素であるエンドヌクレアーゼBamHI、BglII、
KpnIおよびSaCIの各々で単独的に消化され、組み合わせ
た状態では、EcoRIで消化され、そして１％のアガロー
ス・ゲルにおいて電気泳動法にかけられ、次いでサザン
（Southern）、E.M.の方法（J.Mol.Biol.98:503−517
（1975））によって、ニトロセルロースのフィルターに
移された。これらのフィルターは、クローンを同定する
ために用いられたのと同じ条件で、天然のラットのpre
−pro ANVPsと対応する配列を求めてプローブされた。
この方法で、独特の2,600塩基対のEcoRI−BamHI DNA断
片が同定され、それは全遺伝子にまたがっているように
見える。
次いで、ラットのpre−pro ANVPs cDNAと雑種形成され
た６つのヒト・ゲノム・クローンは、同サイズの断片の
存在を求めて分析され、そしてTHG6で表示されるそのう
ちの１つは、当該断片を含んだ。
次いで、λHG6 DNAは、EcoRIとBamHIとで消化され、そ
して、DNA断片が、同じエンドヌクレアーゼで予め消化
されていたp BR 322に結合された。結合産物は、既述の
通り、大腸菌MC1061細胞内に移された。かくして、プラ
スミドpHGRBIは、他の断片に対して、クローン間に発生
させられ、そして、グルンスタイン（Grunstein）、M.
とD.ホグネス（Hogness）のコロニー雑種形成法（Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 72:3961−3965（1975）によって同
定された。雑種形成は、上記で説明した通りに実施され
た。次いで、pHGRBIが配列され、さして天然のヒトのpr
e−pro ANVPの全遺伝子の配列が含まれていることか示
された。
2.ヒトの天然のpre−pro心房のナトリウム尿排泄亢進性
／血管拡張性ポリペプチド遺伝子の配列決定 ヒト遺伝子に対して、ラットのcDNAと雑種形成するよう
に示された2589塩基対の断片が、大形プラスミド・プレ
プから、４％ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法によ
って作られた。配列決定を行う前に、大形のDNA断片
は、幾つかの有用な制限酵素であるエンドヌクレアーゼ
が切断するサイトが決定されることを指示した：当該エ
ンドヌクレアーゼは、配列を小断片に細分する。特に有
用なサイトが、位置586（Ps＋Ｉ）、984と1839（Ava
I）、および1581と2374（Ps＋Ｉ）で見出された。これ
らのサイトは、第７図に示される。第７図は、セクショ
ンII.A.4.でラットのcDNAについて説明された方法一致
するヒトの遺伝子配列戦略を示す。両DNA鎖におけるこ
れらの領域をカバーするために、これらのサイト間で、
DNA断片をまたぐことにより、幾つかのM13サブ・クロー
ンが作られた。制限酵素のエンドヌクレアーゼによる切
断と、M13サブ・クローニングとにより生成されたDNA断
片は、第７図において、矢印１−10で示される。その結
果生じた配列が第1A図に示される。かくして得られた配
列の情報は、種々のインテリジェネティックス（Intell
igenetics）（パロ アルト、カリフォルニア）コンピ
ュータ・プログラムを、製造者の指示書に従って用いる
ことにより、分析された。信号（Signal）ペプチドと、
前駆物質配列と成熟ペプチドとを含む領域は、ラットの
天然のpre−pro ANVP cDNAとの比較によって同定され
た。全暗号領域は、BamHIからEcoRIまでの断片に含ま
れ、そして遺伝子の暗号領域は、122と1095の塩基の２
つのイントロン（introns）と；ほぼ塩基の577−696と8
19−1145と2141−2536とにまたがる３つのエキソン（ex
ons）とを含む。転写についての、仮想上の制御信号の
開始点（塩基347−354と、446−452）と、終了点（塩基
2515−2520）の双共に、当該断片に位置する。セクショ
ンＩで分離されたヒトのrANVPsの等価物質は、ヒト遺伝
子の第２と第３のエキソン（exons）にあることが推定
される。
C.ヒトのpre−pro心房のナトリウム尿排泄亢進性／血管
拡張性ポリペプチドcDNAのクローニング 1.ヒトの胎児の心臓のRNAの分離 妊娠の26週間目で得られたヒトの胎児の心臓が、セクシ
ョンIIで述べられた通り、poly A+ mRNAを作るために用
いられた。トータルで1.7gの心臓組織から、60μｇのpo
ly A+ mRNAが分離された。
2.ヒトの胎児の心臓のcDNAライブラリーの生成 二重鎖cDNAは、マニアチス（Manniatis）、T.ほか、
（分子クローニング、コールドスプリングハーバーラボ
ラトリーズ、1982、pp.212−246）が述べているように
調製された。10μｇの鋳型RNAは、オリゴdT12−18で感
作されたAMV逆転写酵素を用いて、第一鎖cDNAに転写さ
れた。次いで、RNA鋳型は、塩基の加水分解によって除
去され、そして二重鎖にされた。DNAは、第一鎖cDNAの
３′末端に当然見出されるヘアピン・ループによる自己
感作に依存するAMV逆転写酵素によって合成された。こ
の結果生じた二重鎖ヘアピンDNAは、次いで、アスペル
ギルス・オリザエからのS1−ヌクレアーゼでもって処理
させてヘアピン・ループが除去され、そしてその結果生
じた分子は、大腸菌DNAポリメラーゼＩの大断片でもっ
て処理されてそれらを丸め端にした。EcoRIオリゴヌク
レオチド・リンカーは、T4−DNAリガーゼを用いて、cDN
Aに付加され、そして凝集したEcoRIの末端は、制限酵素
のEcoRIによる切断により解放された。かくして生じた
二重鎖の、EcoRIで切断されたcDNAは、次いでサイズ
が、バイオゲル（Biogel）Ａ−50mカラム（バイオラド
（BioRad、リッチモンド）で分画化され、そして長さで
500bpよりも大きい10ngのcDNAが回収された。
サイズ的に分画化されたcDNAは、次いでフィン（Huyn
h）、T.V.ほか（cDNAクローニング技術：実務的アプロ
ーチ、ed.D.グロバー（Glover）、（IRL、オックスフォ
ード）1984発行）により説明されている通り、バクテリ
オファージλ−ベクターであるλ gt 10に挿入された。
DNAは、λ gt 10から作られ、そしてEcoRIでもって消化
された。このDNAはEcoRIで切断されたヒトの胎児心臓の
cDNAに結紮され、そしてアメルシアム（Amersham）から
得られるパッケージング・キットを用いて試験内にパッ
ケージされる。かくして得られたファージは、次いで上
記のフィン（Huynh）、T.V.ほかによって記述された大
腸菌株BNN102に入れられた。このようにして、ヒトの胎
児心臓の、個々の約200,000のメンバーのライブラリー
が得られ、そして貯蔵するために増殖され、次いでふる
い分けられた。
3.ヒトの胎児心臓のcDNAライブラリーのふるい分け cDNAライブラリーは、マニアチス（Maniatis）、T.ほか
（pp.320−321）によって述べられている通り、溶菌斑
雑種形成によってふるい分けられた。雑種形成プローブ
は、ラットのpre−pro ANVP、cDNAクローン pNF1（本
願のセクションII.A.3を見よ）からのEcoRI−SalI挿入
物だった。この精製されたDNA断片は、ベセスダ（Bethe
sda）リサーチ・ラボラトリーズから入手することがで
きるキットを用いて、ニック（nick）翻訳により、32P
でラベルされた。
ヒトの胎児心臓の増殖させられたcDNAライブラリーを用
いて、ファージが、宿主菌BNN102を用いて、平板上で平
板培養された。ニトロセルロースフィルターは、これら
の平板から持ち上げられ、真空下で80℃で２時間にわた
って焼成され、そして［32P］でラベルされたラットのp
re−pro ANVP cDNA、pNFI挿入物の５×105cpmと雑種形
成された。雑種形成は、42℃で16時間にわたって、溶液
（諸元:40％ホルムアミド;50mMリン酸ナトリウム;pH6.
5;5×デンハルツ（Denhardts）溶液（諸元:0.1％Ficol
l;0.14Mポリビニルピリジン:0.1％ウシ血清アルブミ
ン）;5×SSC;50μg/mlサケ精液DNA;および50μg/mlイー
スト（yeast）RNA）中で行われた。フィルターは、１×
SSC0.1％SDS溶液中で、50℃で、30分間にわたって、２
回洗浄され、そしてオートラジオグラフィーにかけられ
た。ヒトのpre−pro ANVP cDNAクローンに対応する全部
で20の雑種形成ファージが、次いで同定された。
4.ヒトのpre−pro ANVP cDNAクローンの配列分析 12の、確実に雑種形成するファージが選択され、そして
精製されて再平板培養によって均質化された。ファージ
DNAプレプは、これらのヒトpre−pro ANVP cDNAクロー
ンから作られ、そして当該DNAは、EcoRIでもって消化さ
れてcDNA挿入物のサイズが決定された。ナンバ６のクロ
ーンは、かくして約700の塩基対の挿入物を有するよう
に示され、そしてDNA配列分析のために選び出された。
クローン・ナンバー６のEcoRI挿入物は、M13ベクター
（メシング（Messing）J.＆ビエイラ（Vieira）、J.、
遺伝子19:259−268（1982））内に挿入され、次いで上
記のサンガー（Sanger）、F.ほか、によって説明される
通りのジデオキヌクレオチド鎖終連法によって配列され
た。
ヒトのpre−pro ANVP cDNAクローン・ナンバー６のヌク
レオチド配列を、第1B図に示す。当該クローンは、ラッ
トのpre−pro ANVP cDNAと比較されて、それがヒトのAN
F pre−pro ANVPに対応していることが確認された。こ
のcDNAクローンは、アミノ酸15に対応する領域からヒト
pre−pro ANVP暗号化領域まで伸び、そして３′−未翻
訳領域の全てを含む。従って、それは、ヒトpre−pro A
NVPの生物学的に活性な要素の配列暗号の全てを含み、
そして異質系における発現に適している。
III.心房のナトリウム尿排泄亢進性／血管拡張性ポリペ
プチドの化学的合成 A.合成手順 本発明の化合物の関連化合物は、下記の一般式を有す
る： 但し、ｎ＝19、ここでaanは、下記一般式に関する： 当該一般式は、Ｄ−異性体（Ｄ−isomer）、Ｌ−異性体
およびDL異性体（ラセミ混合体:racemic mixture）残基
を含み、そして、 ここで、 Rnは、水素または、脂肪族、芳香族または、１から10個
の、一般には１から６個の炭素原子を有するアルカリ基
であり、アミド（amido）、チオ（thio）、またはオキ
シ（oxy）としての、２個またはそれ以下の数の、窒
素、酸素または硫黄の置換を有する基を含み、ハイドロ
オキシ（hydroxy）、チオール（thiol）およびエーテル
（ethers）を含む、ここで、エーテルは、一般にアルキ
ル・エーテルであり、例えばメチルのように、一般に１
個の炭素原子を有する； Ｘは、水素、アミド、アセチルであるか、又は、追加的
に、125以下のアミノ酸残基のオリゴペプチド（oligope
ptide）を含み、そのＮ−アセチル誘導体（N:ac−etyl
derivatives）を含む： Ｙは、水酸基、アミドまたは20以下のアミノ酸残基のオ
リゴペプチドであり、そのＣ−末端アミド基誘導体（Ｃ
−terminal amide derivatives）を含み； そして本発明の化合物は、下記一般式を有する： ここで、 AA1、AA8およびAA11は、同一の、又は相違した塩基性の
極性（polar）アミノ酸残基であり、望ましくはアルギ
ニンである； AA2、AA3、AA6、AA7、AA13、AA15、AA16、AA17およびAA
19は、同一の、又は相違した中性の極性アミノ酸残基で
あり、望ましくは、ここで、AA2とAA3はセリンであり、
AA6はグリシンまたはアラニンであり、AA7はグリシンで
あり、AA13はグリシンまたはアラニンであり、AA15はグ
ルタミン酸であり、AA16はセリンであり、AA17はグリシ
ンまたはアラニンであり、そしてAA19はグリシンであ
り；AA5、AA9、AA12、AA14およびAA18は、同一の、又は
相違した中性の非極性アミノ酸残基であり、望ましく
は、ここで、AA5はフェニルアラニンであり、AA9はイソ
ロイシン、メチオニンまたはバリンであり、AA12はイソ
ロイシンであり、AA14はアラニンであり、そしてAA18は
ロイシンである；AA10は、いかなる酸性の極性アミノ酸
残基であってもよい、望ましくはアスパラギン酸であ
る；そしてＸおよびＹは、先に定義した通りであり、固
相（soile−phase）技術によって合成された。合成は、
徒手で、あるいは、ｔ−Bocアミノ酸を用いてバイオサ
ーチSAMII自動ペプチド・シンセサイザー（バイオサー
チ、サンラファエル、カリフォルニア）において、製造
者の指示書に従って実施された。
上記説明に従って、下記手順が、新規なANVPsの化学的
合成を行うために用いられた。
手順Ａ Bco−AAn−AAn-1…………AA1 ハイドロオキシメチルポ
リスチレンエステル 1gのBoc−AAn−Ｏ−ポリスチレン−樹脂（0.2−0.6mモ
ル/g subs）（ペニンスラ ラブ社（peninsula Labs,In
c.）が、スケジュールＡに従って、Boc−AA1−OH…Boc
−AAn-1−OHを取り込むために処理された。
スケジュールＡ １）ジクロル・メタン（CH2CI2）で３回洗浄； ２）１分間にわたって、TFA:CH2Cl2:EDT（45:50:5、但
し、容積比）で処理； ３）20分間にわたって、TFA:CH2Cl2:EDT（45:50:5、但
し、容積比）で処理； ４）CH2Cl2で３回洗浄； ５）１分間にわたって、CH2Cl2における10％（容積比v/
v）のジイソプロピル・エチル・アミン（DIPEA）による
２回の処理； ６）CH2Cl2で２回洗浄； ７）MeOHで２回洗浄； ８）（５−７）のもう一度の繰り返し； ９）CH2Cl2で３回洗浄； 10）CH2Cl2またはDMF/CH2Cl2（容積比で50:50）中に溶
解される適当に保護されたBoc−アミノ酸の予め形成さ
れた対称性無水物の等価物の１−６への付加:Boc−Asn
−OHとBoc−Ala−OHは、Ｎ−ヒドロオキシ・ベンゾ・ト
リアゾールの活性エステルと組み合わされた； 11）CH2Cl2で２回洗浄； 12）10％のDIPEAで２回洗浄； 13）CH2Cl2で２回洗浄； 14）MeOHで２回洗浄； 15）CH2Cl2で２回洗浄； 16）ステップ（11−15）のもう一度の繰り返し； 17）カイザー（Kaiser）ほか（Annal.生化学、24:595
（1970））に従ったニンヒドリン反応によるテスト：当
該反応が完全でない場合には、ステップ（10−16）を繰
り返すか、またはその代わりに、Ｎ−アセチル・イミダ
ゾール（0.30M、但し、DMFにおいて）又はCH2Cl2中の過
剰の無水酢酸を用いることによっての、キャップ合成。
手順Ｂ Boc−AAn−ｐ−メチル・ベンズ・ヒドリル・アミン樹脂
の調製 以下に説明される通り、Boc−AAn−OHは、ジシクロ・ヘ
キシル・カルボ・ジイミドを介して、ｐ−メチル・ベン
ズ・ヒドリル・アミン樹脂に付加される。
スケジュールＢ １）Ｐ−MBHA・HCI樹脂を洗浄； ２）同樹脂を、CH2Cl2中で10％（容積比v/v）のDIPEAで
もって、２回洗浄； ３）CH2Cl2で２回洗浄； ４）MeOHで２回洗浄； ５）CH2Cl2で２回洗浄； ６）CH2Cl2中に溶解される適当に保護されたBoc−アミ
ノ酸の予め形成された対称性の無水物の等価物の、１−
６への付加：ここで、反応時間は、0.5−24時間であ
る。
未反応のアミノ基は、0.30MのＮ−アセチル・イミド・
アゾール：−DMFか、または無水酢酸：CH2Cl2でもっ
て、アセチル化される。
最初の２つの実施例は、ラットの心房から分離された天
然のペプチドの化学的合成を証明する（セクションＩを
見よ）。
実施例III.A.1:rANVP（126−150） 1gのBoc L−Tyr（BrZ）Ｏ−樹脂（ペニンスラ・ラボラ
トリーズ社、0.54meg/g、ベルモント、カリフォルニ
ア）は、要求されるアミノ酸の配列に関して、手順Ａの
処理を受けた（その際に、アミノ酸は下記順序で導入さ
れた： Loc−Arg（Tos）OH,Boc−PheOH,Boc−Ser（Bzl）OH,Boc
−AsnOH,Boc−Cys（４−CH3Bz1）OH,Boc−ClyOH,Boc−L
euOH・H2O,Boc−GlyOH,Boc−Ser（Bzl）OH,Boc−G1nOH,
BocAlaOH,Boc−GlyOH,Boc−IleOH・1/2H2O,Boc−Arg（T
os）OH,Boc−Asp（OBzl）OH,Boc−IleOH・1/2H2O,Boc−
Arg（Tos）OH,Boc−GlyOH,Boc−GlyOH,Boc−pheOH,Boc
−Cys（４CH3Bz1）OH,Boc−Ser（Bzl）OH,Boc−Ser（Bz
l）OH,Boc−Arg（Tos）OH.）。
保護されたペプチディル（protected peptidyl）樹脂
は、１分間にわたって、TFA:CH2Cl2:EDT（45:50:5、但
し容積比v/v/v）でもって処理され、次いで20分間処理
され、そしてCH2Cl2でもって３回洗浄され、MeOHでもっ
て２回洗浄されて、ペプチディル樹脂のTFA塩を生じ、
そして真空中で乾燥された。
当該ペプチディル（peptidyl）樹脂は、次いで10％のア
ニソールと２％のエチル・メチル硫化物とを含む無水フ
ッ化水素（HF）中に懸濁され、−10℃で30分間、そして
０℃で30分間、各々保持された。当該HFは、真空下の蒸
発により除去され、そしてペプチド／樹脂混合物は、ジ
エチル・エーテル中に懸濁された。当該ペプチド／樹脂
混合物は、ジエチル・エーテルで２回、クロロホルムで
１回、ジエチル・エーテルで１回、クロロホルムで１
回、そしてジエチル・エーテルで１回、各々、洗浄され
た。ペプチドは、当該混合物から2.0Mの酢酸で抽出さ
れ、水で希釈され、そして凍結乾燥されて未酸化のジヒ
ドロ・ペプチドが生じた。
この粗ペプチドは、脱酸素化の0.01Mの酢酸アンモニウ
ム（NH4OAc）:pH8中に0.5mg/mlまで溶解され、そして20
分間攪拌されるところの、滴下式によるわずかに0.01M
を超える量のフェリシアン化カリウム（KCN）溶液の添
加により酸化され、そして酢酸でpH値を５に調整され
た。ペプチド溶液は、ダウエクス（DOWEX）AG3×４陰イ
オン交換樹脂で処理され、濾過され、水で希釈され、そ
して凍結乾燥されて原生の環化ペプチドを生じた。
ペプチドの精製は、0.5MのAcOHを溶離液として用いるこ
とによりセファデックスＧ−25Fで脱塩を実施し、次い
でセファロース（ファルマシア ファイン ケミカルズ
社）またはCM−セルロース（ファットマン（Whatman
社）における、pH4.5の0.01Mの酢酸アンモニウムの溶液
への300mMの酢酸アンモニウムの添加によって生じる勾
配溶離を用いたイオン交換クロマトグラフィーの実施に
よって、達成された。かくして収集された分画は、逆相
（reversedphase）HPLCによって最低限でも97％の純度
を有することが認められ、そしてプールされ、次いで水
分を除去するために数回にわたって凍結乾燥されて精製
済のrANVP（126−150）酢酸塩が生じた。
実施例III.A.2:rANVP（126−149） 1.2gのBoc−Arg（Tos）Ｏ…樹脂（バイオサーチ社、サ
ンラファエル、カリフォルニア）は、要求されるアミノ
酸の配列に関して、手順Ａの処理を受けた（その際に、
アミノ酸は下記順序で導入された： Boc−PheOH,Boc−Ser（Bzl）OH,Boc−AsnOH,Boc−Cys
（４−CH3Bzl）OH,Boc−GlyOH,Boc−LeuOH・H2O,Boc−G
lyOH,Boc−Ser（Bzl）OH,Boc−GlnOH,BocAlaOH,Boc−Gl
yOH,Boc−IleOH・1/2H2O,Boc−Arg（Tos）OH,Boc−Ssp
（OBz1）OH,Boc−IleOH・1/2H2O,Boc−Arg（Tos）OH,Bo
c−GlyOH,Boc−GlyOH,Boc−pheOH,Boc−Cys（４CH3Bz
l）OH,Boc−Ser（Bzl）OH,Boc−Ser（Bzl）OH,Boc−Arg
（Tos）OH）． 保護されたペプチディル（protected peptidyl）樹脂
は、１分間にわたって、TFA:CH2CI2:EDT（45:50:5、但
し容積比v/v/v）でもって処理され、次いで20分間処理
され、そしてCH2CI2でもって３回洗浄され、MeOHでもっ
て２回洗浄され、そして真空中で乾燥されてペプチディ
ル樹脂のTFA塩を生じた。
当該ペプチディル（peptidyl）樹脂は、次いで10％のア
ニソールと２％のエチル・メチル硫化物とを含む無水フ
ッ化水素（HF）中に懸濁され、−10℃で30分間、そして
０℃で30分間、各々保持された。当該HFは、真空下の蒸
発により除去され、そしてペプチド／樹脂混合物は、ジ
エチル・エーテル中に懸濁された。当該ペプチド／樹脂
混合物は、ジエチル・エーテルで２回、クロロホルムで
２回、そしてジエチルエーテルで２回、各々、洗浄され
た。ペプチドは、2.0Mの酢酸で抽出され、そして凍結乾
燥されて未酸化のジヒドロ・ペプチドを生じた。
粗ペプチドは、2.0Mの酢酸と10mMの２−メルカプト・エ
タノールを含む溶液中に溶解され、そして同溶液中でセ
ファデクスＧ−25SFカラムによってクロマトグラフィー
にかけられた。次いで、当該ペプチドは凍結乾燥され、
そして、100μg/mlのペプチド濃度で、pH8.0の、0.1Mの
NH4HCO3の溶液中に再懸濁させられた。かくして懸濁さ
れたペプチドは、48時間にわたって空気に曝露されて、
ゆっくりと再酸化された。次いで、当該ペプチドは、凍
結乾燥された。
以下の実施例は、ヒトの心房のナトリウム排泄増加性／
血管拡張性ポリペプチドの化学的合成を証明する。
実施例III.A.3:hANVP（127−151） 1gのBoc L−Tyr（Brz）Ｏ−樹脂（ペニンスラ・ラボラ
トリーズ社、0.54mig/g、ベルモント、カリフォルニ
ア）は、要求されるアミノ酸の配列に関して、手順Ａの
処理を受けた（その際に、アミノ酸は下記順序で導入さ
れた： Boc−Arg（Tos）OH,Boc−PheOH,Boc−Ser（Bzl）OH,Boc
−AsnOH,Boc−Cys（４−CH3Bzl）OH,Boc−GlyOH,Boc−L
euOH・H2O,Boc−GlyOH,Boc−Ser（Bzl）OH,Boc−GlnOH,
BocAlaOH,Boc−GlyOH,Boc−IleOH・1/2H2O,Boc−Arg（T
os）OH,Boc−Asp（OBz1）OH,Boc−MetOH・1/2H2O,Boc−
Arg（Tos）OH,Boc−GlyOH,Boc−GlyOH,Boc−pheOH,Boc
−Cys（４CH3Bzl）OH,Boc−Ser（Bzl）OH,Boc−Ser（Bz
1）OH,Boc−Arg（Tos）OH）。
保護されたペプチディル（protected peptidyl）樹脂
は、１分間にわたって、TFA:CH2CI2:EDT（45:50:5、但
し容積比v/v/v）でもって処理され、次いで20分間処理
され、そしてCH2CI2でもって３回洗浄され、MeOHでもっ
て２回洗浄されてペプチディル樹脂のTFA塩を生じ、そ
して真空中で乾燥された。
当該ペプチディル（peptidyl）樹脂は、次いで10％のア
ニソールと２％のエチル・メチル硫化物とを含む無水フ
ッ化水素（HF）中に懸濁され、−10℃で30分間、そして
０℃で30分間、各々保持された。当該HFは、真空下の蒸
発により除去され、そしてペプチド／樹脂混合物は、ジ
エチル・エーテル中に懸濁された。当該ペプチド／樹脂
混合物は、ジエチル・エーテルで２回、クロロホルムで
１回、ジエチル・エーテルで１回、クロロホルムで１
回、そしてジエチル・エーテルで１回、各々、洗浄され
た。ペプチドは、当該混合物から2.0Mの酢酸で抽出さ
れ、水で希釈され、そして凍結乾燥されて未酸化のジヒ
ドロ・ペプチドが生じた。
この粗ペプチドは、脱酸済みの0.01Mの酢酸アンモニウ
ム（NH4OAc）:pH8中に0.5mg/mlまで溶解され、そして20
分間攪拌されるところの、滴下式によるわずかに0.01M
を超える量のフェリシアン化カリウム（KCN）溶液の添
加により酸化され、そして酢酸でpH値を５に調整され
た。ペプチド溶液は、ダウエクス（DOWEX）AG3×４陰イ
オン交換樹脂で処理され、濾過され、水で希釈され、そ
して凍結乾燥されて粗環化ペプチドを生じた。
ペプチドの精製は、0.5MのAcOHを溶離液として用いるこ
とによりセファデックスＧ−25Fで脱塩を実施し、次い
でセファロース（ファルマシアファインケミカルズ社）
またはCM−セルロースファットマン（Whatman社）にお
ける、pH4.5の0.01Mの酢酸アンモニウムの溶液への300m
Mの酢酸アンモニウムの添加によって生じる勾配溶離を
用いたイオン交換クロマトグラフィーの実施によって、
達成された。かくして収集された画分は、逆相（revers
edphase）HPLCによって最低限でも97％の純度を有する
ことが認められ、そしてプールされ、次いで水分を除去
するために数回にわたって凍結乾燥されて精製済みのhA
NVP（127−151）酢酸塩が生じた。
実施例III.A.4:rANVP（126−148）NH2 1gのBoc−Phe−pMBHA−樹脂は、要求されるアミノ酸の
配列に関して、手順Ｂを用いることにより得られた（こ
の手順Ｂを用いる際に、アミノ酸は、下記順序で導入さ
れた： Boc−Ser（Bzl）OH,Boc−AsnOH,Boc−Cys（４−CH3Bz
l）OH,Boc−GlyOH,Boc−LeuOH・H2O,Boc−GlyOH,Boc−S
er（Bzl）OH,Boc−GlnOH,BocAlaOH,Boc−ClyOH,Boc−Il
eOH・1/2H2O,Boc−Arg（Tos）OH,Boc−Asp（OBz1）OH,B
oc−IleOH・1/2H2O,Boc−Arg（Tos）OH,Boc−GlyOH,Boc
−GlyOH,Boc−PheOH,Boc−Cys（４−CH3Bz1）OH,Boc−S
er（Bzl）OH,Boc−Ser（Bz1）OH,Boc−Arg（Tos）O
H）． 当該ペプチディル（peptidyl）樹脂は、次いで10％のア
ニソールと２％のエチル・メチル硫化物とを含む無水フ
ッ化水素（HF）中に懸濁され、−10℃で30分間、そして
０℃で30分間、各々保持された。当該HFは、真空下の蒸
発により除去され、そしてペプチド／樹脂混合物は、ジ
エチル・エーテル中に懸濁された。当該ペプチド／樹脂
混合物は、ジエチル・エーテルで２回、クロロホルムで
１回、ジエチル・エーテルで１回、クロロホルムで１
回、そしてジエチル・エーテルで１回、各々、洗浄され
た。ペプチドは、当該混合物から2.0Mの酢酸で抽出さ
れ、水で希釈され、そして凍結乾燥されて未酸化のジヒ
ドロ・ペプチドが生じた。
この原生（crude）ペプチドは、脱酸済みの0.01Mの酢酸
アンモニウム（NH4OAc）:PH8中に0.5mg/mlまで溶解さ
れ、そして20分間攪拌されるところの、滴下式によるわ
ずかに0.01Mを超える量のフェリシアン化カリウム（KC
N）溶液の添加により酸化され、そして酢酸でpH値を５
に調整された。ペプチド溶液は、ダウエクス（DOWEX）A
G3×４陰イオン交換樹脂で処理され、濾過され、水で希
釈され、そして凍結乾燥されて原生の環化ペプチドを生
じた。
ペプチドの精製は、0.5MのAcOHを溶離液として用いるこ
とによりセファデックスＧ−25Fで脱塩を実施し、次い
でセファロース（ファルマシア ファイン ケミカルズ
社）またはCM−セルロースファットマン（Whatman社）
における、pH4.5の0.01Mの酢酸アンモニウムの溶液への
300mMの酢酸アンモニウムの添加によって生じる勾配溶
離を用いたイオン交換クロトグラフィーの実施によっ
て、達成された。かくして収集された分画は、逆相（re
versed phase）HPLCによって最低限でも97％の純度を有
することが認められ、そしてプールされ、次いで水分を
除去するために数回にわたって凍結乾燥されて精製済み
のrANVP（126−148）酢酸塩が生じた。
適当な変更を行ないつつ、上記実施例III.A.1−４にお
いて既述された手順に従って、下記のANVPsが合成され
た： 実施例III.A.5:hANVP（127−146） 実施例III.A.6:［Ｄ−Cys129］rANVP（126−150） 実施例III.A.7:［Ｄ−Phe130］rANVP（126−150） 実施例III.A.8:［Ｄ−Ala131］rANVP（126−150） 実施例III.A.9:［Ｄ−Ala132］rANVP（126−150） 実施例III.A.10:［Ｄ−Arg133］rANVP（126−150） 実施例III.A.11:［Ｄ−Met135］hANVP（127−151） 実施例III.A.12:［Ｄ−Val134］rANVP（126−150） 実施例III.A.13:［Ｄ−Arg136］rANVP（126−150） 実施例III.A.14:［Ｄ−Val137］rANVP（126−150） 実施例III.A.15:［Ｄ−Ala138］rANVP（126−150） 実施例III.A.16:［Ｄ−Ala139］rANVP（126−150） 実施例III.A.17:［Ｄ−Gln140］rANVP（126−150） 実施例III.A.18:［Ｄ−Ser141］rANVP（126−150） 実施例III.A.19:［Ｄ−Ala142］rANVP（126−150） 実施例III.A.20:［Ｄ−Leu143］rANVP（126−150） B.天然の、および化学的に生成された心房のナトリウ
ム、尿排泄亢進性／血管拡張性ポリペプチドの生物学的
活性 天然の、および化学的に合成されたANVP化合物とその類
似化合物の生物学的活性は、分離されたラットの腎臓
と、分離されたウサギの胸の大動脈輪と、そして分離さ
れた血管壁の細胞とを含む試験管内システムを用いるこ
とによって決定された。当該活性は、また健全なラット
およびイヌにおいても測定された。
1.試験官内における生物学的効力検定 rANVP（126−149）の活性は、分離されたラットの腎臓
において測定された。カマルゴ（Camargo）、M.J.F.ほ
か、Am.J.Physiol.,246:F447−F456（1984）において記
述されている通りに、閉回路系において、機能的に分離
されたラットの腎臓の灌流が行われた。コントロール・
クリアランス期間（control clearance periods）後、
0.1から1.0μｇの当該化合物が、灌流液に添加された。
多くのパラメータに関する効果が観察された。これらの
ピーク値を、表Ｉに、実験データとして示した。rANVP
（126−149）、尿流量と、尿中へのナトリウム排出と、
濾過分画と、そして糸球体の濾過率とを増大させたこと
は明らかである。
ここで、 GFRは、糸球体濾過率;FFは濾過分画;RVRは腎臓の血管抵
抗;Vは尿流量；FLNaはナトリウムの濾過負荷；TNaはナ
トリウムについての尿細管の再吸収度；UNaＶは尿のナ
トリウム排出率；FENaは分画のナトリウム排出度；UkＶ
は尿のカリウム排出率；FEkは分画のカリウム排出度で
あり；表中の値は、４つの腎臓の平均値±SEであり；ピ
ーク値（Ｐ）マイナス0.05がコントロール欄の値と比較
された（student'sテスト）。これらの結果は、血管収
縮神経がない状態で灌流を受けた腎臓において、本発明
の当該化合物が、腎臓の血管抵抗と、濾過分画と、そし
て糸球体濾過率とを増大させたことをも、また示してい
る。これと対照的に、内因的に生成されたアンギオテン
シンによって予め収縮した分離腎臓においては、本発明
の当該化合物は、血管抵抗を減少させた。当該合成化合
物についてのこれらの効果は、内因的な血管収縮神経の
有無により、ANVPsが、腎臓の血管収縮作用と血管緊張
低下作用の双方の作用を持ち得ることを示す。分離腎臓
において観察されたナトリウム排泄増加性は、選択的
に、遠心性細動脈において発現する腎臓の血管収縮効果
に起因すると考えることができる。
同じ方法で、他のANVPsが、ラットの分離腎臓で試験さ
れた。表IIには、尿流量と、尿のナトリウム排出度と、
そして糸球体濾過率とに関するこれらのペプチドの効果
が各々、要約されている。当該系（system）において試
験されたANVPの全てが、尿流量と尿のナトリウム排出度
の双方を増大させたことに留意されたい。当該ラットの
分離腎臓において、これと同じ方法で、比較的に少数
の、無関係のペプチドが尿流量と、尿のナトリウム排出
度とに作用した。このように、観察された効果は、ANVP
sと、関連するその類似化合物に対して特異的である。
多分、これらの効果は、ANVPsと腎臓内の特異的なレセ
プタサイト（receptor sites）との間の相互作用によっ
てもたされているのであろう。
ラットの分離腎臓は、表Ｉで説明された通りに試験され
た。各化合物のコントロール期間は、Ｃで表示され、そ
して当該化合物の投与に続く実験期間は、Ｅで表示され
る。Ｖは尿流量；UNaＶは尿のナトリウム排出率;GFRは
糸球体濾過率である。データは、３−８の実験の平均値
を示す。
天然のANVPsは、予め収縮させられた血管を弛緩させる
ので、これらのペプチドの効果は、ウサギから分離され
た胸郭の大動脈輪と、ウシから分離された血管壁の細胞
とについて研究された。
合成ANVPsは、部分的に精製された（ゲル濾過段階の）
天然のANVPsと、精製された（HPLC）天然のANVPsの双方
と、ヒスタミンで収縮させられた大動脈輪を弛緩させる
能力について、比較された。大動脈輪は、1.5g引張り力
により生じた受動的な緊張状態で、10mlの通気されたク
レブス緩衝液（krab's buffer）中に吊された。当該大
動脈輪は、５×10-6Ｍのヒスタミンでもって予め収縮さ
せられ洗浄され、そして上記のクライネルト（Kleiner
t,H.D.（1984）によって記述される通りに、元の緊張状
態に戻れるように保持された。精製済みのANVPs、また
は合成化合物の投与量は、異種的な方法で増やされてい
った。第８図に示される通り、緊張状態の変化は、投与
された当該化合物すなわちタンパク質の累積量に関連し
ていることが示された。
図示の通り、精製済みの天然rANVP（126−150）と合成r
ANVP（126−150）は、双方共に、同量で組織を弛緩させ
た。更に、hANVP（127−151）は、この組織のrANVP（12
6−150）と等価である。ゲラー（Geller,ほか、生化
学、生物物理学、Res.Comm.120（２）:333−338（198
4））によって記述されたアトリオペプチンIIIの等価物
であるrANVP（127−150）は、しかしながら、予め収縮
させられたウサギの大動脈を弛緩させる上でほとんど効
果がない。この知見は、最近、ガルシア（Garcia,ほ
か、生化学、生物物理学、Res.Comm.126（１）:178−18
4（1985））によって確認された。
予め収縮させられた大動脈の血管を弛緩させるために
は、先ず初めに、ANVP化合物が、特異的な膜レセプター
と結合しなければならない。この配位子（Ligand）−レ
セプターとの相互作用と組み合わさって、細胞内の環化
GMPが増加する（ウインクスト（Winquist）、ほか、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,81:7661−7664（1984））。環化G
MPは、ANVPや他の化合物に反応するところの、血管緊張
低下性の細胞内両受者（mediator）として同定されてい
るので、当該環化GMPのレベルを検定することによっ
て、ANVP化合物の生物学的作用を知ることができる。従
って、血管壁、例えば、ウシの大動脈平滑筋や内皮細胞
から取られた細胞が用いられて特異的レセプターに対す
るANVP化合物の結合度が求められ、そして、かくして組
み合った環化GMPの増加が測定された。これらの試験に
よって、ウシの血管平滑筋を弛緩させる上でのANVPsの
相対的な有効性が示される。
結合度の検定は、下記の通りに遂行された:ANVPsは、シ
ェンク（Schenk、ほか、J.生化学、259:14941−1451（1
984））の方法に従って、125Iでもってラベルされた。
当該方法は、125IをANVP分子のチロキシに転移させるた
めに、グルコース酸化酵素とラクトパー酸化酵素（lact
operoxidase）によって媒介される酸化作用を利用す
る。次いで125I−ANVPは、血管壁細胞の10mmの融合性培
養細胞に添加され、そして37℃で培養された。
第９図に示される通り、125I−ANVPは、特異的に、そし
て飽和的に細胞と結び付く特異的そして飽和的結び付き
は、ホルモン／レセプター相互作用の必要条件である。
更にその上、125I−ANVPの結び付きは、他のレセプター
・サイトで作用するような種々のホルモン（アンギオテ
ンシン、エピネフリン（epinephrine）、バゾプレッシ
ン（vasopressin）、グルカゴン（glucagon））ではな
くて、未ラベルのANVP化合物で置換することができる。
このように、ANVPsとその類似化合物によって、125I−A
NVPの結び付きが置換されることにより、ANVPが濃縮さ
れて効果的に血管壁と結合して当該血管の緊張を低下さ
せる。血管の平滑筋の細胞の結び付きサイトにおいて、
125I−ANVPをANVPsとその類似化合物でもって置き換え
ることによって達成されるANVPの濃縮について、表III
で略述する： 表III 培養されたウシの血管平滑筋細胞に対する、心房のナト
リウム排泄増加性／血管拡張性ポリペプチドの結び付き ペプチド Ki（nM） hANVP（127−151） 0.5 ［Ｄ−Ala142］rANVP（126−150） 0.6 rANVP（126−150） 0.8 rANVP（127−150） 2.4 rANVP（128−151） 7.0 ［Ｄ−Ala138］rANVP（126−150） 20.0 ［Ｄ−Gln140］rANVP（126−150） 20.0 ［Ｄ−Ser141］rANVP（126−150） 40.0 既述の通り、rANVP（126−150）は、ヨウ素化され、そ
して上に列挙した代表的なペプチドの存在下で、培養平
滑筋細胞でもって培養された。特異的な125I−rANVP（1
26−150）の結び付きを置換する能力を知るために、既
述のペプシドのいろいろな濃度が試験された。最大限度
の半分の置換が観察された濃度を報告する。
これらのデータは、開示された実施例のうち［Ｄ−Ala
142］rANVP（126−150）と、rANVP（126−150）と、そ
してhANVP（127−151）とが、血管壁細胞に対して最も
良く反応したことを証明する。
血管平滑筋におけるANVPの作動薬的作用は、特異レセプ
ターとの結び付きに由来するだけでなく、環化GMPの増
加ともかかわっているので、同じ培養細胞を用いて、環
化GMPの蓄積に関して、ANVPsとその類似化合物の効果が
試験された。第10図は、ANVPで媒介された環化GMPの大
きさが、培養された大動脈平滑筋と内皮細胞において増
加することを示す。第11Aおよび第11B図において、大動
脈平滑筋と内皮細胞における環化GMPについてのANVPと
その類似化合物の相対な活性が示される。データは、投
与量−反応の関係でプロットされている（投与量の対数
値vs環化GMPの増大増加量の％値）。
更に、３つのオーダーの大きさにわたる有効性の分布が
示される。双のタイプの細胞における有効性の等級順序
は：［Ｄ−Ala142］rANVP（126−250）＝［Ｄ−Al
a131］rANVP（126−150）＝rANVP（126−150）＝rANVP
（126−149）＝hANVP（127−151）＞rANVP（127−150）
＝その他のＤアミノ酸代替物質。これらのデータによっ
て、ウシの大動脈における、これらのペプチドの血管拡
張性効力が示される。このように、当該データは、ある
Ｄアミノ酸の置換は効力を増加させるが、他のものは効
力を低下させることを示す。更に、当該データは、カル
ボキシ末端のチロシン残基を除去しても、血管の反応性
にはほとんど影響がないことを示す。更に、当該データ
は、アミノ末端のアルギニン残基が、反応性に対して最
も大きな影響力を有する旨の観察を裏付ける。
2.生体内での効力検定 合成ANVP化合物のrANVP（126−149）と、rANVP（126−1
50）およびhANVP（127−151）も又同様に、健全なラッ
トにおいて、ナトリウム排泄増加性であることが見出さ
れた。これらの化合物は、インアクチン（Inactin）で
麻酔をかけられたラットに対して、濃縮塊注射の方法
（100mg/kg、ラットの平均体重:399g）で投与され、当
該ラットに対して通常の生理食塩水が一定の割合:2.2ml
/毎時で注入された。その結果が表IVに示された：ここ
で各パラメーターの変化は、３つのコントロール期間
（各10分間）の平均値と最初の実験期間（最大反応値）
との間の差によって検定された。当該データは、平均値
±SEとして示される。
ここでＶは尿流量；UNaＶは尿のナトリウム排出率；UK
Ｖは尿のカリウム排出率である。15匹の動物のコントロ
ール値は:Vが10.3±2.0μl/min（分）；UNaＶが0.93±
0.5μEq/min（分）；そしてUKＶが1.6±0.4μEq/min
（分）であった。
腎臓と血行に対する効果も又、測定された。当該測定
は、化合物rANVP（126−149）の一定の割合の注入（１
μg/kg濃縮塊；その後、0.1μg/kg/min（分）：継続時
間:1時間）を受けている麻酔をかけられたイヌにおいて
実施された。即時的効果が血圧と、GFRと、尿流量と、
電解質排率とにおいて認められ、当該効果は、注入が継
続している間、継続した。表IVでこれらのパラメータに
対して提示された“実験”データは、当該注入の期間に
得られた平均値である。確証された利尿性およびナトリ
ウム排泄増加性（表Ｖ）に関連して、動脈の平均血圧
（MAP）は、協調的に、10−15％だけ低下し、一方、GFR
は、25−35％だけ上昇した。これらのパラメータの全て
は回復期間（即ち、注入期間の終了に続く期間）の間
に、コントロール・レベル（即ち、注入か行われる前の
レベル）に戻った。
ここで、MAPは動脈の平均圧（血圧）； は分画の水排出率;PRAは血漿レニン活性:PAは血漿アル
ドスである。その他の略字の定義については、表Ｉの脚
注を見よ。*P＜0.05はコントロール期間の値と比較さ
れ；+P＜0.05は回復期間の値と比較された。
かくして生成されたペプチドは、表Ｖに示される通り、
血漿レニン活性（PRA）と血漿アルドステロンの（PA）
の双方を、かなり減少させた。追加の研究によって、当
該物質は、又、分離された副腎細胞を刺激してアルドス
テロンを生成させるアンギオテンシンの働きをも、抑え
ることが証明された。このように、ANVPsは、幾つかの
レベルにおいて、レニン−アンギオテンシン系の作用を
阻止することができる：（１）それらは、ターゲット器
官（血管や副腎）におけるアンギオテンシンの直接作用
に対抗し；そして（２）レニンの分泌を抑制して、血液
中のアンギオテンシンの生成率を低下させる。
上記データに基づけば、以下のことが明らかである：即
ち、合成ANVPと組織から採取されたANVPの両化合物は、
同じ活性を有する（望ましくは、合成ANVP化合物が酸化
を可能にして二硫化物架橋の形成が促進された後に）。
上記の結果から、下記のことも明らかである：即ち、主
題の化合物を哺乳動物宿主において、有効な血管緊張低
下剤や、利尿剤や、ナトリウム排泄増加剤として用いる
ことができる。
IV.心房のナトリウム尿排泄亢進性／血管拡張性ポリペ
プチドに由来した組み換えDNAの発現 A.pro心房（proatrial）のナトリウム尿排泄亢進性／血
管拡張性ポリペプチドとその関連断片の、大腸菌におけ
る発現 以下の実施例において、大腸菌における、prorANVP（87
−152）と、prorANVP（25−152）、prohANVP（26−15
1）およびprohANVP（102−151）の発明が説明される。
更に、発現ベクターも説明される。これらは単なる例示
に過ぎず、本発明をそれのみに制限することを意図して
いるものではないので、他のpre−proANVPsや、proANVP
sや、又は、ANVPの類似化合物も、同様の方法で発現さ
せることができる。
1.大腸菌発現ベクターの構成 a.PKT52バクテリアの発現プラスミド ｉ）trcプロモータ（promotr）の生成 プラスミドpEA300（アマン（Amman）,E.ほか、遺伝子2
5:167−178,1983）は、Pvu IIとClal（ニューイングラ
ンドバイオラボズ社）でもって消化された。当該消化物
は、上記マニアチス（（Maniatis）,T.ほか、p.157−16
0）によって記述された通り、0.8％のアガローゼ・ゲル
において電気泳動法にかけられた。Clalサイト近くのtr
pプロモータの−35ヌクレオチド領域を含む大断片は、
上記マニチアス（（Maniatis），ほか、P167）によって
記述された通り、UV−シャドウィング（UV−shadowin
g）によって検出され、そしてマクザム（（Maxam）,A.
とW.ギルバート（Gilbert），酵素学の方法、65:449−5
60（1980））によって記述された通り、37℃でゲルから
溶出された。当該大断片のClalサイトは、上記マニアチ
ス（（Maniatis），ほか、p394）によって記述された通
り、50MのdCTPで満たされ、そして残りの一本鎖５′の
オーバーハング（overhang）は、クローカー（（Kroeke
r）,W.ほか、生化学17:3236−3239（1978））によって
記述された通り、ヤエナリ（緑豆）のヌクレアーゼ（フ
ァルマシア（Pharmacia）Ｐ−Ｌバイオケミカル社）で
もって消化されることによって除去された。プラスミド
pGL101（ラウアー（Lauer）,G.ほか、J.Mol.Appl.Gene
t.１:139−149（1981））は、既述の通り、PvuIIとHpaI
I（ニューイングランド バイオラボズ社）でもって消
化された。消化された断片は、上記マニアチス（（Mani
atis），ほか、p.394））の方法で、５ユニットのクレ
ナウ（Klenow）断片）（ベーリンガーマンハイム（Boeh
−ringer−Mannheim）社、マンハイム、FRG）と、追加
的なlCi［32P］−dCTP（アメルシアム（Amersham）、シ
カゴ、イリノイ、800Ci/mM）とによって、37℃で、15分
間にわたって、満たされた。その後、37℃で、３分間に
わたってdCTPとdGTPが、50Mまで添加された。かくし
て、ラベルされ、末端が丸められた（blunt−ended）断
片は、12％のポリアクリル・アミドゲルにおいて、電気
泳動法にかけられ、その後、ウエット（wet）ゲル・オ
ートラジオグラフィーにかけられ、そして55の塩基対
の、端が丸められた（blunted）HpaII−PvuII断片が切
断されて、既述の通りゲルから溶出された。２つの分離
された断片は、上記マニアチス（（Maniatis），ほか、
p.392）によって記述された通りに結紮され、そして上
記マニアチス（p.250−251）によって記述された通り、
大腸菌鎖RB791（R.ブレント（Brent）とM.プタシン（Pt
ashne）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:4204−4208,198
1）を転換するために用いられた。かくして生成された
プラスミドのpKK10−０は、trcプロモータと称される変
異したプロモータを含み、そして上記マニアチス（pp.3
66−367）によっ記述された通り、急速煮沸法によって
分離された。pKK10−０はEcoRI（ベセスダ（Bethesda）
リサーチラボズ社）でもって消化され、そして既述の通
り大腸菌RB791を転換するために用いられた。このプラ
スミドであるPKK10−１は、既述の通り分離され、そし
てPvuIIでもって消化された。かくしてPvuIIで消化され
たプラスミドは、NcoIリンカー（linker）（dACCATGGT,
クリエイティブ・バイオモルキュラーズ社、フオスター
シティ、カリフォルニア）に結紮され、NcoIでもって消
化され、そしてdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPでもって満
たされ、そして既述の通り、リンカーが有するPstIとHi
ndIIIのサイトに結紮された（但し、当該サイトは、２
つの相補的オリゴヌクレオチド（５′−dGCTGCAGCCAAGC
TTGG−３′及び５′−dCCAAGCTTGGCTGCAGC−３′）とし
て、バイオサーチSAMI DNAシンセサイザー（バイオサー
チ社）で合成された）。かくして結紮された混合物は、
BamHIとHindIII（ニューイングランド、バイオラボズ
社）でもって消化され、５％ポリアクリル・アミド・ゲ
ルにおいて、電気泳動法にかけられ、そして既述の通
り、BamHI−HindIII小断片が溶出された。当該小断片
は、trcプロモータを含有する。
ii）trcプロモータ・プラスミドであるPKT 52の構成 PKK10−２（ブロシウス（Brosius）,J.,遺伝子27:161−
172,1984）は、BamHIとHindIIIとでもって、消化され
た。当該大断片は、0.8％アガローゼ・ゲルから分離さ
れて既述の通りtrcプロモータに結紮された。当該結紮
物は、大腸菌RB791を転換するために用いられ、そして
新たなプラスミドであるPKK233−１が既述の通り溶出さ
れた。PKK233−１は、上記マニアチス（p.381）に従っ
て、PvuIでもって完全に消化され、BglIでもって部分的
に消化された。この時、pUC8（ビエイラ（Vieira）、J.
とJ.メッシング（Messing）、遺伝子19、既述）は、Pvu
IとBglIとでもって消化され、そしてアンピシリン抵抗
遺伝子（もはやPst1サイトを含んでいない）からの360
塩基対のPvuI−BglI断片が、５％ポリアクリル・アミド
ゲルから溶出された。この断片は、PvuI−BglIで部分的
に消化されたpKK233−１の混合液と混合され、結紮さ
れ、そして大腸菌RB791を転換するために用いられた。
かくして得られた転換物は、PstIサイトのみを出現させ
るために用いるためにふるい分けられ（screened）、そ
してEcoRI−PstI消化作用によってチェックされ、それ
によって、残りのPstIサイトがtrcプロモータに隣接さ
せられることによりプラスミドpKK233−２が生成され
た。このプラスミドpKK233−２はEcoRIとPvuIIとでもっ
て消化され、dATPとTTPでもって満たされ、結紮され、
そして大腸菌RB791に転換させられた。かくして生成さ
れたベクターがpKT52である（第12A図）。
b.pTrp−233バクテリアの発現プラスミドの構成 ｉ）合成トリプトファンオペロンプロモータおよびオペ
レーター調整配列の構成 第12E図に示される10子のオリゴデオキシヌクレオチド
は、既述の通り合成され、そして精製された。１番目と
10番目を除く500ピコモル（pmole）の各オリゴデオキシ
ヌクレオチドは、個々に、20μｌの溶液（諸元:60mMのT
ris−Cl:pH8;15mMのDTT;10mMのMgCl2:20μciの［32P］
γ−ATP;および20ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ
（P/Lバイオケミカルズ）中で、37℃で30分間にわたっ
てリン酸化された。次いで、10μｌの溶液（諸元:60mM
のTris−HCl;pH8;15mMのDTT;10mMのMgCl2;1.5mMのATPお
よび追加的な20ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ）
が加えられ、その後、更に30分間にわたって、37℃で培
養が行われた。この培養に続いて、サンプルは、100℃
で５分間、培養された。500ピコモルの１番と10番のオ
リゴヌクレオチドは、ATPなしで、上記緩衝液中で、30
μｌまで希釈された。
二重基準対（double standard pair:即ち、第12E図にお
ける、オリゴデオキシヌクレオチドの１と2;3と４等の
対）を構成する各々の16.7ピコモルのオリゴデオキシヌ
クレオチドは、混合され、そして90℃で２分間、培養さ
れ、その後、室温までゆっくりと冷却された。各対は、
次いで、構成的に他者と組み合わされ、そしてフェノー
ル／クロロホルムでもって抽出され、次いでエタノール
で沈澱させられた。当該オリゴデオキシヌクレオチド対
は、30μｌの溶液（諸元:5mMのTris−HCl:pH8:10mMのMg
Cl2;20mMのDTT）中で再構成され、10分間にわたって50
℃に加熱され、次いで室温まで冷却され、その後、0.5m
Mの最終濃度に対してATPが添加され、次いで、800ユニ
ットのT4DNAリガーゼが添加され、そして12−16時間に
わたって12.5℃で培養された。
かくして結紮された混合物は、フェノール／クロロホル
ムでもって抽出され、そしてDNAがフェノールで沈澱さ
せられた。かくして乾燥されたDNAは、30μｌの当該溶
液中で再構成され、そしてEcoRIとPstIとにより35℃で
１時間の間、消化された。当該混合物は、フェノール／
クロロホルムで抽出され、そしてエタノールで沈澱させ
られ、その後、記述の通り、８％ポリアクリル・アミド
・ゲルにおける電気泳動法によって、種々の二重鎖DNA
分節に分離された。DNAの断片は、ウェット・ゲル・オ
ートラジオグラフィーによって視覚化され、そして長さ
で約100bpに対応するバンド（band）が切り出され、そ
して既述の通り、夜通し溶出された。切除された合成DN
Aの断片は、プラスミドM13−mp8とM13−mp9（上記のメ
ッシング.J.とビエリア.J.）とに結紮され、同様にEcoR
IとPstIにより消化され、そして、ジデオキシヌクレオ
チドの配列の分析（上記のサンガー、ほか）に回され
て、第12E図に示される設計配列通りかどうかが確認さ
れる。第12E図に示される配列には、トリプトファンオ
ペロンリーダーペプチドのリボソーム結び付き領域（第
12E図におけるS.D.領域）と共に、トリプトファンオペ
ロン（trp）（第Ａ図における−35と−10領域）のプロ
モータとオペレーター領域を含む。第12E図に示される
配列に類似する配列は、大腸菌内における異種タンパク
質の発現に有用であることが見出されている（ハレウェ
ル（Hallewell,R.A.とエムテイジ（Emtage）,S.遺伝子
９:27−47（1980）、イケハラ、M.ほか、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA81:5956−5960（1984））。
ii）プラスミドpTrp−233を含む合成trpプロモータ／オ
ペレータの構成 プラスミドPKK233−２（セクションIV.A.l.a.ii.を見
よ）は、NdeIでもって完全に消化され、その後、自己の
末端を、上記マニチアス（p.394）の方法によって、５
ユニットの大腸菌ポリメラーゼＩのクレナウ（Klenow）
断片（ベーリンガー−マンハイム社）でもって満たさ
れ、そして５μＭまでdATPと、dCTPと、dGTPおよびTTP
とが加えられた。そして、これは、25℃で、20分間、培
養された。ファノール／クロロホルムによる抽出操作と
エタノールによる沈澱操作に続いて、DNA（NdeIにより
消化済み）は、結紮され、そして大腸菌に転換された
（上記ナカムラ、K.ほか）。この結果、NdeIサイトを欠
いたプラスミドが生成された。当該プラスミドは、pKK
−233−２−Ndeと表示された。
20ナノグラムのプラスミドpKK−233−２−Ndeは、EcoRI
とPSTIとでもって完全に消化され、その後、上記のマニ
アチス（pp.133−134）に従って、子ウシの腸管を用い
たホスファターゼ（phosphatase）処理（ベーリンガー
マンハイム社）を受けた。上述の合成trpプロモータ／
オペレータ配列は、自己の凝集性の５′−EcoRIと３′
−PstIの末端を有し、50ナノグラムの当該配列が、EcoR
I−PstIで消化された10ナノグラムのpKK−233−２−Nde
と混合され、そして既述の通り、T4−DNA−リガーゼで
もって結紮され、その後、大腸菌JA221 1pp-／I1lacI9
に転換された。かくして得られた転換物は、プラスミド
DNAを取り出すためにふるい分けられた。当該プラスミ
ドDNAは、100bp EcoRI−PstI合成trpプロモータ／オペ
レーターを含み、当該プロモータ／オペレーターは、分
離されて第12F図においてpTRP−233として表示された。
2.ラットのproの心房のナトリウム尿排泄亢進性／血管
拡張性ポリペプチドを暗号化する、クローンされたcDNA
の発現 ａ）プラスミドpRNF−6852の構成 プラスミドpNFI（上記）は、HincIIでもって完全に消化
され、その後、フェノール／クロロホルムでもって抽出
され、そしてエタノールでもって沈澱させられた。NcoI
デカマ・リンカー（decamer linker:dAGCCATGGCT）は、
SAM I DNAシンセサイザー（バイオサーチ社）を用いて
合成され、既述の通り、両受体（preparative）ゲル電
気泳動法によって精製され、そして自己の５′末端で、
上記マニアチス（p.396）の方法を用いて、T4−ポリヌ
クレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社）でも
ってリン酸化された。かくしてリン酸化されたリンカー
は、ブラント末端結合（blunt−end ligation）によっ
て、T3−DNAリガーゼを介して、12.5℃で、16時間にわ
たって、（HincIIで消化された）pNFIに添加された。
65℃で６分間の培養に続いて、かくして結紮された混合
物は、100mMの塩化ナトリウムを含むように調整され、
そして、NcoIとPstIと共に、37℃で２時間にわたって培
養され、その後、既述の通り、５％ポリアクリル・アミ
ド・ゲル電気泳動法にかけられた。かくして分離された
DNAは、ウェット・ゲル・オートラジオグラフィーによ
って視覚化され、その後、316dpバンド（band）の切除
が行われ、溶出が行われ、そして既述の通り（上記マク
サム、ＡとW.ギルバート）、エタノールによる沈澱が行
われた。
上記マニアチス（（Maniatis），ほか、pp.133−134）
に従って、発現プラスミドpKT52は、NcoIとPstIとでも
って完全に消化され、その後、子ウシの腸管のフォース
ファターゼ処理（ベーリンガーマンハイム（Boehringer
Mannheim））を受けた。かくして精製された、そしてp
NFIから誘導されたところの316bpNcoI−PstI断片は、Nc
oI−PstIでもって消化されたpKT52と混合され、そして2
5℃で30分間にわたってT4−DNA−リガーゼと共に培養さ
れ、そして12.5℃で４時間、保持された。大腸菌株JA22
1（1pp-,hsdM+′trpE5,leuB6,lacY,recAl/F′，lacIq，
lacZ+，proA+，proB+，ナカムラ、Ｋ、ほか、J.Mol.App
l.Genet.１:289−299（1982））は、塩化カルシウム法
による転換が可能なように処理され、そして上記マニア
チス（（Maniatis），ほか、pp.250−251）に記述れた
通り、結合混合物でもって転換された。かくして生成さ
れたアンピシリン抵抗コロニー（colonies）は、1mlの
溶液中で夜通し、生育され、その中からプラスミドDNA
が、上記マニアチス（（Maniatis），ほか、pp.368−36
9）に記述された通り、アルカリ性溶解菌法によって調
製された。かくして調製されたプラスミドは、適当な挿
入物を調製するために、最初にHindIIIで、次いでKpnI
またはNcoIでもって消化されることによりふるい分けら
れた。各々、約120bpおよび320bpのHindIII−KpnIおよ
びHindIII−NcoIの双方の断片を有するプラスミドが選
択され、そしてpRNF−6852として表示された（第12B
図）。
pKT−52におけるクローンされたproANVP配列のリーディ
ング・フレーム（reading frame）が適当であることを
確認するために、pRNF−6852がEcoRIとPstIとでもって
消化され、その後、既述の通り、ポリアクリル・アミド
ゲク電気泳動法による約509bpのバンド（band）の精製
が行われた。当該EcoRI−PstI断片は、プラスミドM13mp
8とM13mp8（上記メッシング（Messing）,J.とJ.ビエリ
ア（Vieria））とに結合され、そしてジデオキシヌクレ
オチド配列分析操作（上記サンガー（Sanger）ほか）に
回された。
第12B図に示される通り、プラスミドpRNF−6852が消化
されて、87から152までのアミノ酸で構成されるタンパ
ク質を暗号化したラットのproANVP cDNAの断片が発現さ
せられた。
発現ベクターpKT52中へのproANVP cDNAのクローニング
を可能にするために合成デカマー（decamer）NcoIリン
カー（linker）が用いられたので、発現された断片の最
初の２つのアミノ末端のアミノ酸はNH2−Met−Alaであ
り、これにラットのproANVP前駆物質の87から152までの
アミノ酸が続く（第12B図）。
ｂ）プラスミドpRNF−6852の発現 pRNF−6852またはpKT52を含む大腸菌JA221 1pp/F′lacI
qは、37℃で、M9の最小限の塩を含む培地（諸元：ブド
ウ糖が0.4％；チアミンが２μg/ml;硫酸マグネシウム
（MgSO4・７H2Ｏ）が200μg/ml;ロイシンが20μg/ml;ト
リプトファンが20μg/ml;アンピシリンが100μf/ml;そ
してイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
サイド（galactopyranoside）が2mM）において生育させ
られた。細胞密度が約2.5×108cells/mlになったとき
に、Ｌ−［35s］−システイン（100μCi/ml培養（アメ
ルシアム（Amersham）社）、シカゴ、イリノイ、930ci/
ミリモル（mmole））が添加された。30秒間の培養に続
いて、1mlの培養株が除去され、そして0.34mlの、氷冷
却された20％トリクロル酢酸に添加され、次いで1.5ml
のエペンドルフ（Eppendorf）遠心機管内で渦状に攪拌
され、その後、０℃で30分間にわたって静置された。か
くして得られた混合液は、次いでエペンドルフ遠心分離
機を用いて、15,000×ｇで、15分間、４℃で遠心分離さ
れた。かくして得られた上澄み液は捨てられ、そして残
ったペレット（pellet）が1mlの氷冷却アセトンでもっ
て洗浄され、その後、また遠心分離機にかけられた当該
ペレットは、真空中で乾燥させられた。
IgG分画は、1mlの無免疫の血清または抗血清（化学合成
されたラットのANVPペプチドに対して生じたもの）か
ら、プロテインＡ−セファローゼ（登録商標）4B（ファ
ルマシア ファイン ケミカルズ社（pharmacia Fine C
hemicals）、ウプスラ、スウェーデン）クロマトグラフ
ィーを、製造者の指示書に従って用いることによって、
調製され、そして総量で4mlだけ収集された。
乾燥された当該TCAペレットは、40μｌの溶液（諸元:50
mMのTris−HCl;pH8.0;1mMのEDTA;および１％のSDS）中
に再懸濁され、そして100℃で５分間培養された。10μ
ｌのこの混合液（総バクテリアたんぱく質を示す）は、
溶液（諸元:20mMのTris−HCI;pH6.8;20％のグリセリン;
2％のSDS;2％の２−メルカプトエタノール；および0.1
％のブロムフェノールブルー（bromphenolblue）でもっ
て、20μｌにまで希釈され、その後、100℃で５分間に
わたり培養された。当該混合液の残りの30μｌ（免疫吸
収（immunoabsorption）に用いられる）は、溶液（諸
元:50mMのTris−HCI;pH8.0;1mMのEDTA;0.15Mの塩化ナト
リウム；および２％のTriton−X100）でもって、1mlに
まで希釈され、その後、40μｌの精製されたIgGが添加
された：但し、当該IgGは、無免疫血清またはラットのA
NVPに対して生じた抗血清のいずれか一方から誘導され
た。かくして得られた混合液は、室温で30分間、培養さ
れ、次いで０℃で夜通し培養された。
当該夜通しの培養に引き続いて、当該混合液に、50μｌ
のプロテインＡ−セファローゼ（登録商標）4Bが添加さ
れた（但し、当該プロテインＡ−セファローゼ4Bは、溶
液（諸元:50mMのTris−HCI;pH7.5;5mMのEDTA;0.15Mの塩
化ナトリウム;0.5％のノンイデット（Nonidet）Ｐ−40
（NP−40）；および1mg/mlのオボアルブミン（ovalbumi
n））中の10％懸濁液である）。かくして得られた混合
液は、次いでゆっくりと攪拌されながら、４℃で１時間
にわたり培養された。次いで、４℃で遠心分離機にかけ
られ、その結果生じた上澄み液が捨てられ、そしてプロ
テインＡ−セファローゼ（登録商標）ペレットが、0.5m
lの溶液（諸元:50mMのTris−HCI;pH7.5;5mMのEDTA;0.5M
の塩化ナトリウム;0.5％のNP−40;および1mg/mlのオボ
アルブミン（ovalbumin））中に再懸濁させられた。当
該ペレットは、強力な渦流によって洗浄され、その後、
遠心分離機にかけられ、そしてその結果生じた上澄み液
が除去された。
この手順は、更に４回、追加して繰返された。プロテイ
ンＡ−セファローゼ（登録商標）ペレットは、更に２
回、追加して洗浄され、当該洗浄は、溶液（諸元:50mM
のTris−HCI;pH7.5;5mMのEDTA;0.15Mの塩化ナトリウ
ム；および0.5％のNP−40）を用いて行われ、その後、
更に１回、溶液（諸元:10mMのTris−HCI;およびpH7.5）
を用いた洗浄が行われ、そして真空乾燥が行われた。同
真空乾燥に引き続いて、当該ペレットは、60μｌの溶液
（諸元:10mMのTris−HCI;pH6.8;1％のグリセリン;1％の
SDS;1％の２−メルカプトエタノール；および0.05％の
ブロムフェノールブルー（bromphenol blue））中に再
懸濁され、その後、100℃で10分間、培養された。
アンダーソン（（Anderson）,C.W.ほか、J.Virol.12:24
1−252（1973））によって記述された通り、免疫吸収済
み（immunoabsorbed）サンプル全体が、130×200×0.8m
mポリアクリルアミドスラブ（slab）ゲル（諸元:17.5％
のアクリルアミド;0.0735％のbis−アクリルアミド;0.3
35MのTris−HCI;pH8.7;0.04Mの塩化ナトリウム;0.1％の
SDS;0.05％の過硫酸アンモニウム；および0.05％のTEME
D）において、断続的なSDS−ポリアクリルアミド・ゲル
電気泳動法で処理された。当該処理おいて、ブロフェノ
ール・ブロー染料（dye）がゲルの底に到達するまで、3
0mAの一定電流が当該サンプルに流された。かくして分
離されたタンパク質は、溶液（諸元:25％のイソプロピ
ル・アルコール;10％の酢酸；および0.12mg/mlのクーマ
シー・ブリリアント・ブルー（Coomassie Brilliant Bl
ue（シグマケミカルズ社、セントルイス、ミズリー）Ｒ
−250）中で揺動させられることによって当該ゲル内
に、室温での１時間にわたる当該処理の結果、固定さ
れ、その後、溶液（諸元:10％のイソプロピル・アルコ
ール;10％の酢酸；および0.12mg/mlのクーマシー・ブル
ー）中で夜通し培養された。幾つかの変化を伴った３時
間にわたる、10％の酢酸による脱色（destaining）に引
き続いて、当該ゲルは、En3ハンス（En3Hance（商品
名））（ニューイングランドヌクレア社、ボストン、マ
サチュセッツ）を用いて、製造者の指示書に従って処理
され、その後、乾燥され、そしてコダック（登録商標）
XAR−5 X線フィルムを用いて、−70℃で螢光間接撮影さ
れた。
プラスミドpKT−52またはpRNF−6852を含み、記述の通
りＬ−［35S］−システインでもって標識された細胞に
由来するポリペプチドのパターンの比較が第13図に示さ
れる。分子量の大きさが約6200ドルトンのポリペプチド
は、もっぱらレーンＣに現われ、当該ポリペプチドは、
pRNF−6852から誘導された全ポリペプチドを代表する。
当該ポリペプチドは、抗−ANVP IgG（レーンＤ）に対し
てのみ、特異的な免疫反応を示す。更に、免疫性IgG
は、pKT−52（レーンＢ）から誘導された全てのポリペ
プチドに対して、認め得る反応を何ら示さなかった。こ
の結果、pro ANVPの目指す断片が、特異的プラスミドpR
NF−6852を含む細胞内に発現することが結論された。
pRNF−6852を含む大腸菌株JA221 lpp-Ｆ′ lac Iqは、1
984年５月31日付で、アメリカン・タイプ・カルチュア
ー・コレクション（（American Type Culture Collecti
on）（ATCC）12301パークローン・ドライブ、ロックビ
ル、メリーランド（MD）20852）に寄託され、その結
果、受入れ番号第39720番を付与された。
3.ラットのpro心房（proatrial）のナトリウム尿排出亢
進性／血管拡張性ポリペプチド（26−152）を暗号化し
た、クローンされたcDNAの発現 a.プラスミドpRNF 12852の構成 セクションC.2に記述される方法と同じ方法で、完全な
長さのpro心房のペプチドが発現された。このことを達
成するために、プラスミドpNFI（上記参照）は、AccIで
もって完全に消化され、その後、エタノールでもって沈
澱させられた。かくして、AccIでもって消化されたDNA
は、合成二重鎖DNAリンカー（linker）： pCATGAATCCTGT TTAGGACATAP と混合された。当該リンカーは、既述の通り、SAM I DN
Aシンセサイザー（バイオサーチ社）で合成され、そし
てプリパレイティブ（preparative）ゲル電気泳動法で
精製されたものである。かくして得られた上記混合物
に、T4−DNAリガーゼが付加され、それによって、当該
リガーゼは、上記消化産物に結紮された。
かくして結合された当該混合物をHinfIでもって消化す
ることにより、627bpDNA断片が産出された。当該DNA断
片は５％ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法によって
精製され、そして溶出された。かくして精製された627b
pHinfI−断片はクレノウ（Klenow）断片でもって処理さ
れ、そしてPstIでもって消化され、次いでエタノールで
もって沈澱させられた。プラスミドpKT52は、NcoIでも
って消化され、次いでクレノウ酵素（K1enow enzyme）
でもって処理され、そしてPstIでもって消化され、その
後、既述の通り、子ウシの腸管のアルカリ性フォスファ
ターゼ（calf intestinal alkaline phosphatase）（上
記マニアチス、ほか、pp.113−134参照）。HinfI−PstI
で消化されたpNFI断片は、次いでNcoI−PstIで消化され
たpKT52と混合され、そしてT4−DNAリガーゼを用いて結
合された。
当該結合混合物を用いてJA221 lpp-/F′laclqを転換さ
せた後、かくして生じたアンピシリン（ampicillin）抵
抗コロニー（resistant colonies）から誘導されたプラ
スミドのミニ−プレプス（mini−preps）は、適当な挿
入物を得るために、初めにHindIIIを用い次にKpnI又はH
incIIを用いた消化によってふるい分けられた（screene
d）。
各々、約120bpおよび312bpのHindIII−KpnIおよびHindI
II−HincIIの双方の断片を有するプラスミドが選択され
てpRNF−12852として表示された。pKT152における、ク
ローンされた、完全な長さの、pro心房の配列は、ジデ
オキシヌクレオチド配列分析（上記サンガー、ほか、参
照）によって確認された。
プラスミドpRNF−12852（第12図）は、ラットのproANVP
前駆物質の残基25から152までを取り囲むタンパク質を
コードする（但し、当該pro ANVP前駆物質は、残基25に
対するコドン（codon）AATに先行する付加的なメチオニ
ン・コドンATGを有する）。
b.プラスミドpRNF−12852の発現 pRNF−12852またはpKT152を含む大腸菌JA221 lpp-/F′l
acIqは、37℃で生育させられ、そしてセクションIV.A.
2.bで記述された通り、Ｌ−［35S］−システインでラベ
ルされた。抗ANVPIgGによる免疫吸収に引き続いて、か
くしてラベルされそして免疫吸収されたポリペプチド全
体が、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によっ
て分離され、そして既述の通り、オートラジオグラフィ
ーに送られた。
プラスミドpKT−52またはpRNF−12852を含み、既述の通
り、Ｌ−［35S］−システインでもってラベルされた細
胞に由来するポリペプチドのパターンの比較が、第13図
レーンＡおよびレーンＥに、各々示される。約18,400ド
ルトンの分子量を有する大部分のポリペプチドの種は、
pRNF−12852から誘導された全ポリペプチドを代表する
レーンＥ（矢印で示される）に、もっぱら現われる。当
該ポリペプチドは、抗−ANVP IgGに対してのみ、特異的
な免疫反応を示す一方、当該免疫性IgGは、pKT−52から
誘導された全てのポリペプチドに対して、何ら認められ
得る反応を示さなかった。（第13図のレーンＢとレーン
Ｆを比較せよ）。従って、第13図において観察された1
8,400ドルトンのポリペプチドは、ラットのpro ANVPで
あると信じられる。（当該ラットのpro ANVPは、第12D
図に示される通り、イニシエータ（initiator）メチオ
ニン（methionine）に続くアミノ酸25においてスタート
（start）する。
4.ヒト心房性ナトリウム尿排泄亢進／血管拡張性ポリペ
プチド（102−151）の発現 ヒトゲノム（genomic）DNAを含有するプラスミドpH GRB
1はApaIで終りまで消化（digest）され、次にT4−DNAポ
リメラーゼ処理をして、３′−伸張末端を鈍くする。
［マニアチス（maniatis）他の、上記文献第395頁参
照］。合成HindIIIリンカー［pCAAGCTTG、コラボラチブ
リサーチ社（Collaborative Reserch Ine）、レキシン
トン、マサチュセッツ州］は上記のブラント末端連結
（blunt−end litigation）を通って、ブラント末端ヒ
トゲノムDNAに結合する。連結混合物はそれからHindIII
及びNcoIで消化され、次に５％ポリアミドゲル電気泳動
法及び溶離を使用し272bp HindIII−NcoI断片を単離す
る。該272bp HindIII−NcoI断片はHindIII−NcoI消化pB
R329と混合され［コバルビアス（Covarrubias）、L.及
びF.ボリバー（Bolivar）、ジェーン（Gene）17巻：第7
9〜89頁（1982年）］、T4−DNAリガーゼで処理された。
得られたプラスミドpHNF−298はBamHI及びNcoIで消化さ
れ、得られた620bp NcoI−BamHI断片をアガロースゲル
電気泳動で精製した。該620bp NcoI−BamHI断片はMspI
で完了まで消化され次に大腸菌（E.coli）DNAポリメラ
ーゼＩ［クレノウ（Klenow）フラグメント］により５′
伸張末端の修復がされる。合成HindIIIリンカーpTTACTA
AGCTTAGTAAが合成され、精製されリン酸化され鈍化末端
連結を通してMspI消化NcoI−BamHI断片に結合された。
連結混合物はHindIIIで消化され、次に５％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により、156bp HindIII断片を
単離した。上記のように、T4−DNAリガーゼを使用して
子牛の腸のアルカリホスファターゼで処理した該156bpH
indIII断片は、pKT52に結合させた。
JA221 lpp-/F′lacIqの連結混合物での形質転換の次
に、生じるアンピシリン耐性コロニーから誘導されたプ
ラスミドのミニ製造（mini−preps）がNcoIでの消化に
より次のClaI消化により正確に挿入されるために分離し
た。
150bpのNcoI−ClaI挿入を有するプラスミドが選択されp
HNF−5752と名づけられた。pKT52によるクローン化され
たヒトpro ANVP配列の解読わくは上述したようにDNA配
列分析により確認された。
合成HindIII8メートル（mer）リンカーがproANVP cDNA
断片をpKT52のHindIII部位にクローン化させるために使
用し、proANVP配列の先のアミノ酸はMet−Ala−Ala−Al
a−Lys−Leu−Alaである。加えて、合成HindIII 16メー
トル（mer）リンカーが炭素末端アミノ酸残基アルギニ
ン及びチロシンを再構築するのに使用される。それで発
現ヒトproANVP断片がサンジャー（Sanger）他の上記文
献で述べられたように、ジデオキシヌクレオチド配列分
析でNH2 Met Ala Ala Ala Lys Leu Ala Trp Asp Ser Se
r Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala
Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cy
s Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser
Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr COOH あることが決定される。
5.ヒトpro心房性ナトリウム尿排泄亢進／血管拡張性ポ
リペプチド（26−151）をコードする（encoding）クロ
ーン化CDNA a.プラスミドphNF−233の構築 ヒトANVP cDNA（II.C）を含むクローン６からのλファ
ージDNAがEcoRIで消化され、次にポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動及び溶離により713bp断片が単離された。精
製されたEcoRI断片は、同様に消化されたプラスミドpUC
−９と連結され［上述のビエイラ（Vieira）、J.及びメ
ッシング（Messing,J.、ジェーン（Gene）19巻］、次に
前述したように大腸菌に形質転換される。適当な713bp
EcoRI断片と一緒のプラスミドは単離されphNF−pUC−１
と名づけられた。プラスミドphNF−pUC−１はRsaIで完
了まで消化された後フェノール／クロロホルム抽出及び
エタノール沈澱を行う。前述のように合成され精製され
た合成二重鎖DNAリンカー ５′TATGAATCCCATGT3′ ３′ ACTTAGGGTACA5′ と混合し、次にT4−DNAリガーゼを加えて前記リンカー
をRsaI消化生成物に連結する。NdeIとの連結混合物の消
化によりポリアクリルアミドゲル電気泳動及び溶離によ
り精製された370bpDNA断片を生じる。プラスミドpUC−1
9（Vieria,J及びメシング,Jの上記文献）がNdeIで消化
され子牛の腸のホスファターゼで処理し次にフェノール
／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱処理を行った。
上記370bpDNA断片はNdeI消化pUC−19に連結され次に大
腸菌の形質転換を行なった。選択された370bpNdeIヒト
プロANVP cDNA配列を含むプラスミドにおいて形質転換
物質の分離が起こり、phNF−pUC−２と名づけられた。p
hNF−pUC−２はApaI及びEcoRIで消化され次に上述のア
ガロースゲル電気泳動により、より大きな配列の単離が
行なわれた。プラスミドphNF−pUC−１は又、ApaI及びE
coRIで消化し次にポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
溶離により442bp断片を単離する。phNF−pUC−１から誘
導された442bp ApaI−EcoRI断片をApaI−EcoRI消化phNF
−pCU−２に連結し次に大腸菌の形質転換を行なう。生
じた形質転換物質を、NdeI及びPstIでの消化により分離
し、517bp NdeI−PstI断片を含むプラスミドが生じ単離
されphNF−pUC−３と名づけた。
発現プラスミドpTRP−233（第12F図）をNdeI及びPstIで
完了まで消化し次にポリアクリルアミドゲル電気泳動及
び溶離により517bpDNA断片を単離した。phNF−pUC−３
から誘導されるNdeI−PstI断片はNdeI−PstI消化pTRP−
233に連結し、次に大腸菌の形質転換する。pTRP233にお
いて517bp NdeI−PstIを含む、生じたプラスミドを単離
し、phNF−233（第12G図）と名づけた。pTRP−233中の
プロモーター／オペレーター配列の複製及びクローン化
ヒトプロANVP配列の解読わくを確認するために、phNF−
233をEcoRI及びPstIで消化し次にポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動及び溶離によりDNA配列の単離を行う。この
断片はプラスミドM13−mp18（メシング、Ｊ及びビエリ
ア、Ｊの上記文献参照）に連結し、ジデオキシヌクレオ
チド配列分析（サンジャー等の上記文献参照）を行う。
第12図Ｇに示すように、ヒトpre−pro ANVP蛋白の26−1
51の残基を残基26に対応するコドンAATの先の付加的メ
チオニンコドンATGと一緒に取り囲む全長ヒトproANVPを
発現するよう設計される。
b.プラスミドphNF−233中のクローン化全長ヒトpro ANV
P（26−151）cDNAの発現 phNF−233又はptrp−233を含む大腸菌E103S（Hfr,Met,
B,lac Its）をアンピシリン添加のルリアーベルタニ（L
uria−Bertani）培地（マニアチス等の上記文献第68
頁）中で37℃で１晩成長させた。１晩たった培養物はグ
ルコース（0.4％）、チアミン（２μg/ml）、硫酸マグ
ネシウム・７水加物（MgSO4・7H2Ｏ）（200μg/ml）カ
スアミノ酸（Casamino acids）（0.5％）およびアンピ
シリン（100μg/ml）を添加したM9最小培地［ミラー,J,
エクスペリメントインモレキュラージェネティックス
（Experiments in Molecular Genetics）、コールドス
プリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor L
aboratory）、コールドスプリングハーバー（Cold Spri
ng Habor）、ニューヨーク、を参照］を含む培地中で1:
100に希釈し、細胞密度が、0.1のA550になるまで37℃で
成長させ、この時に３−β−インドールアクリル酸（シ
グマケミカル社）を、10mg/mlエタノール溶液から25μg
/mlの最終濃度で加えた。0.50のA550でＬ−［35S］−シ
ステイン［200μCi/ml培養物、ニューイングランドヌク
レアー（New England Nuclear）］を加え１分間培養を
続けた。１ミリリットルの培養物をこの時取出し、340
μｌの氷冷20％トリクロロ酢酸を加え、IV.A.2で述べた
ように処理した。
phNF−233又はpTRP−233を含む細胞から誘導したＬ−［
35S］−システイン標識ポリペプチドの免疫吸収は合成
ラットANVP（127−152）で注射したうさぎで生じた抗血
清を使用して、IV.A.2で述べたようになされる。
全体の及び免疫吸収Ｌ−［35S］−システイン標識ポリ
ペプチドはIV.A.2で述べたようにSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動及び蛍光間接撮影法により分析する。
Ｌ−［35S］−システインで標識されたプラスミドpTRP
−233又はphNF−233を含む細胞からのポリペプチド型の
比較を第14図に示す。分子量約18,000ダルトンのメジャ
ーポリペプチドは、pTRP−233から誘導された全ポリペ
プチドを表わすレーン（lane）Ａと比べ、phNF−233か
ら誘導される全ポリペプチドを表わすレーンＢに独特に
表われる。この18キロダルトンのポリペプチドは抗−AN
VP抗血清に特に免疫反応性があり、一方、pTRP−233か
ら誘導されたポリペプチドとの反応は検出されなかっ
た。（第14図中のレーンＣ及びＤと比較する。）ヒトpr
o−ANVP（26−151）の予測されたポリペプチドはそれ故
特異プラスミドphNF−233を含む細胞に発現する。
pRNF−6852を含む大腸菌種K12 E103S Hfrカバリ、（Cav
alli）、メッツ（met）Ｂ、lacItsはアメリカンタイプ
カルチャーコレクション（ATCC）53085パークローンド
ライブ（Parklaun Drive）、ロックビル、メリーランド
（MD）20852に1985年４月９日に寄託し、取得番号53085
を得た。
c.大腸菌からのヒトpro−ANVP（26−151）の精製及び特
性化 phNF−233を含有する大腸菌をアンピシリン（100μg/m
l）を添加したルリアーベルタニ培地で37℃で１晩成長
させる。培養物の10ミリリットルをIV.5.bで述べた添加
物及び最小塩（minimal salts）を含む培地1000ml中に
希釈し、37℃で成長させ、細胞密度が0.1A550に相当す
るまで成長させる。この時、３−β−インドールアクリ
ル酸を10mg/mlエタノール溶液から最終濃度25μg/mlま
で加えた。細胞は細胞密度が1.0A550に相当するまで成
長させこの時細胞を４℃で7000回／分の遠心分離により
集める。細胞ペレットをpH8の氷冷トリス塩酸10mM溶液
中に再懸濁させ、前記のように遠心分離を行なう。洗滌
した細胞ペレットを１モル酢酸及び20ミリモル塩酸を含
有する水溶液40ml中に再懸濁する。該細胞はヒートシス
テムズ−ウルトラソニックス社Ｗ−225−Ｒ型ソニケー
ター（sonicator）を使用して粉砕する。懸濁液は次に
沸騰水浴中の閉鎖容器内で５分間培養し、次に４℃で1
2,000回／分で20分間遠心分離を行なう。上清（酸抽出
と言う）を除去しpH7.5のトリス塩酸10ミリモル及び１
ミリモルのEDTAで平衡にしたファデックス Ｇ−10［フ
ァルマシア（Pharmacia）］を含む2.5cm×10cmカラムに
かけた。生じた免疫反応性画分は−特異ANVP標識免疫検
定法により検出されるが−プールし凍結乾燥により乾燥
させる。乾燥区分は0.5モルの酢酸中に再懸濁させ、0.5
モル酢酸で前もって平衡にしたセファデックス Ｇ−10
を含む2.5×50cmのカラムにかけた。
生じた免疫反応性のカラム画分はプールし、凍結乾燥し
た。乾燥物質は約4mlの蒸留水に入れ、高性能液体クロ
マトグラフィーHPLC精製を行なう。該物質をパーキン−
エルマーシリーズ（Perkin−Elmer Series）4LCインジ
ェクター及び溶剤デリバリーシステム（パーキン−エル
マー）を使用する１×25センチメートルのビダック（Vy
dac）C18カラムにかけた。結合物質を水性15％アセトニ
トリル（CH3CN）及び0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）で
２分間洗滌し、次にアセトニトリル及び0.1％TFA15:85
から60:40を45分間にわたり一次勾配展開を行なう。１
分からの画分の試料を集め乾燥させ上述のように抗−AN
VP標識免疫検定法で免疫反応性を検定した。免疫反応性
のピークがその後に集められ減圧下で乾燥した。減圧物
質は水中に再懸濁し、凍結乾燥で再び乾燥した。該物質
の100モルを470A型蛋白配列機［アプライドバイオシス
テムズ社（Applied Biosystens Inc.）製］を使用して
自動アミノ酸配列分析を行なう。分析した最初の18のア
ミノ酸は Met−Asn−Pro−Met−Tyr−Asn−Ala−Val−Ser−Asn−
Ala−Asp−Leu−Met−Asp−Phe−Lys−Asn− であった。この分析から他の検出される不純物質は認め
られなかった。IV.2.bで述べたSDS−ポリアクリルアミ
ドゲル分析も又18000ダルトンである明らかな分子の大
きさで移動した精製物質の検出可能な他の不純物質がな
いことを明らかにした。上述のこのポリペプチドの配列
分析から、このポリペプチドが付加的アミノ末端メチオ
ニンと一緒に全長ヒト（26−151）pro−ANVPに対応し、
細菌性ポリペプチドからの検出可能な汚染物質は含まな
いということを結論づけた。
B.サッカロミセスセレビシアエ（Saccharomycescerevis
iae）中のpro心房性ナトリウム尿排泄亢進／血管拡張性
及びpre−pro心房性ナトリウム性排泄亢進性／血管拡張
性ポリペプチドの発現 続く例としてS.セレビシアエ（S.cerevisiae）中の種々
のproANVP及びANVPポリペプチドの発現を述べる。どのp
roANVP又はANVP配列も同様にS.セレビシアエ中に発現さ
れ得る。
1.細胞内発現 pre−proANVPs、proANVPs及び成熟ANVPsを含むproANVPs
の断片を暗号にするcDNAの酵母菌サッカロミセス・セレ
ビシアエ（Saccharomyses cereviseae）においての細胞
内発現のためのベクターの調製を２つの方法で開示す
る。それぞれ酵母菌ホスフォグリセレートキナーゼ（PC
K）遺伝子の前に発現された強プロモーター配列を利用
する。最初の工程では、プラスミドpNF1はHincII［ニュ
ーイングランド・バイオラブス（new England Biolab
s）で消化される。BamHIリンカーオリゴヌクレオチド
［８ヌクレオチド長さ、コラボラチブ・リサーチ社（Co
llaborative Research,Inc.）］は消化生成物に連結さ
れ、生じる分子はBamHIで消化された。成熟ANVP配列を
含有するこの消化物からの454bp断片が次に５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により精製し、酵母のBaHI部
位−大腸菌ベクターpYGK2に連結した。該ベクターは酵
母−大腸菌シャトルベクターYEp13［J.ブローチ（Broac
h）等、Gene、８巻、第121〜133頁（1979年）］を制限
酵母BamHI及びHindIIIで消化し、次に最大の制限断片に
連結し、酵母PGK遺伝子からのプロモーター領域にわた
る制限断片を得る。PGK−プロモーター含有断片は、Hin
dIII制限部位、PGKのATG出発コドンからさかのぼった約
1500塩基対からPGK暗号付け領域内から、BAL−31消化後
ATG出発コドンの領域から下った28塩基対を挿入したBam
HIリンカーオリゴヌクレオチド（８塩基対長さ、コラボ
ラチブ・リサーチ社製）まで及ぶ。
該ベクターを使用して、pre−proANVP配列中のDNAのい
ずれの配列が挿入され得、所望のpre−proANVP断片を常
に発現する。例えば、454bpANVP含有断片を該ベクター
中のBamHIリンカー部位に正しい配向で挿入するとPGKプ
ロモーターからの78−アミノ酸の長さの融合蛋白（PGK
遺伝子のアミノ末端からの９アミノ酸、リンカーオリゴ
ヌクレオチドにより暗号づけされた３つのアミノ酸、pr
oANVP領域の39アミノ酸、成熟ANVP配列の25アミノ酸及
びANVP前駆物質のカルボキシ末端の２つのアルギニン残
基からなる）の合成を行う。
pre−proANVPの細胞内発現の第２の方法も又、proANVP
及びその断片の細胞外分泌を行わせる。第２の方法にお
いて、全pre−proANVP前駆物質暗号づけ領域を含む、制
限断片はプラスミドを制限酵素SalI（ニューイングラン
ド・バイオラブズ製）で第１消化することによりプラス
ミドpNF4から単離する。生じる線長プラスミド分子の末
端上の単鎖領域はDNAポリメラーゼで（クレノウ断片）
で処理され二重鎖にされ、BamHIリンカー類（８ヌクレ
オチド長さのコラボラチブ・リサーチ社製）が次にこれ
らブラント末端に連結する。その線長さプラスミド分子
は次にBamHI及びEcoRIで消化されpre−proANVP断片を含
む約900のbpBamHI（SalI）−EcoRI断片が単離される。
該断片は２つの修正：（１）PGKのATGコドン（に対する
５′）から23bpさかのぼってあり、（２）クローン化cD
NA断片の後は、PGK遺伝子の転写終了領域がくる：他は
上記のpYPGK2ベクターと同一なベクターに連結する。
（PGK部位の３′末端を含むEcoRI−HindIII断片＋３′
−リンカーとしてpBR322からの346bpHindIII−BanHI断
片）。PGKプロモーターからの挿入pre−proANVPcDNAの
発現はpre−proANVPの合成を生ずる。発現されるpre−p
roANVPはもし信号及び／又は処理部位が細胞によってそ
れと認知されそれに基づいて行動されるなら酵母細胞に
より処理され分泌される。分泌された物質はproANVP、
その断片がANVPのみのどちらかである。もし、信号配列
の認知がおこらないなら、全長pre−proANVPかその断片
が細胞内に見出される。
2.細胞外発現 ａ）YEp−α−８発現ベクターの構築 大腸菌−酵母シャトルベクターYEp13［ナスミス（Nasmy
th）、K.及びK.タッチェル（Tatchell）、セル第19巻第
756−764頁（1980年）］における酵母ライブラリー（li
brary）を５′−32P末端標識オリゴデオキシヌクレオチ
ド（５′−CCTGGCCAACCAATG−３′）を使用して分離す
る。（マニアチスらの上記文献の第324−325頁を参
照）。該オリゴヌクレオチドに雑種形成する酵母菌DNA
の挿入を含むプラスミドを次に単離する。これらのプラ
スミドの１つは約15kbの酵母DNAの挿入を含みクルジャ
ン（Kurjan）,J,及びI.ヘルスコヴィッツ（Herskovit
z）のセル30巻：第933〜943頁（1982年）に述べられた
α−因子遺伝子を含む1.7kbのEcoRI断片を含むことが示
された。1.7kb EcoRI断片の末端はDNAポリメラーゼＩ
［クレノウ（Klenow）断片］での培養により鈍化されBa
mHIリンカー類はT4−DNAリガーゼ（マニアチス等の上記
文献第133〜114頁,116頁,392−394頁）を使用して、結
合される。BamHI末端はBamHIでの消化によって粘着性を
帯び次に酵母−大腸菌シャトルプラスミドpCV7−Hin228
のBamHIに連結する。プラスミドCV7のHindIII部位の周
囲の欠失はHindIII消化、PGK暗号付け領域内から、BAL
−31消化後ATG出発コドンを処理することによりなされ
る。
該ベクターを使用して、pre−proANVP配列中のDNAのい
ずれの配列が挿入され得、所望のpre−proANVP断片を常
に発現する。例えば、454bpANVP含有断片を該ベクター
中のBamHIリンカー部位に正しい配向で挿入するとPGKプ
ロモーターからの78−アミノ酸の長さの融合蛋白（PGK
遺伝子のアミノ末端からの９アミノ酸、リンカーオリゴ
ヌクレオチドにより暗号づけされた３つのアミノ酸、プ
ロ−ANVP領域の39アミノ酸、成熟ANVP配列の25アミノ酸
及びANVP前駆物質のカルボキシ末端の２つのアルギニン
残基からなる）の合成を行なう。
pre−proANVPの細胞内発現の第２の方法も又、プロANVP
及びその断片の細胞外分泌を行なわせる。第２の方法に
おいて、全pre−proANVP前駆物質暗号づけ領域を含む、
制限断片はプラスミドを制限酵素SalI（ニューイングラ
ンドバイオラブズ製）で第１消化することによりプラス
ミドpNF4から単離する。生じる線長プラスミド分子の末
端上の単鎖領域はDNAポリメラーゼで［クレノウ（Kleno
w断片）］で処理され二重鎖にされ、BamHIリンカー類
（８ヌクレオチド長さのコラボラチブリサーチ社製）が
次にこれら鈍化末端に連結する。その線長さプラスミド
分子は次にBamHI及びEcoRIで消化されpre−proANVP断片
を含む約900のbpBamHI（SalI）、EcoRI断片が単離され
る。該断片は２つの修正：（１）PGKのATGコドン（に対
する５′）から23bpさかのぼってあり、（２）クローン
化cDNA断片の後は、PGK遺伝子の転写終了領域がくる：
他は上記のpYPGK2ベクターと同一なベクターに連結す
る。（PGK部位の３′末端を含むEcoRI−HindIII断片＋
３′−リンカーとしてpBR322からの346bpHindIII−BamH
I断片）。PGKプロモーターからの挿入pre−proANVP cDN
Aの発現はpre−proANVPの合成を生ずる。発現されるpre
−proANVPはもし信号及び／又は処理部位が細胞によっ
てそれと認知されそれに基づいて行動されるなら酵母細
胞により処理され分泌される。分泌された物質はproANV
P、その断片かANVPのみのどちらかである。もし、信号
配列の認知がおこらないなら、全長pre−proANVPかその
断片が細胞内に見出される。
2.細胞外発現 ａ）YEp−α−８発現ベクターの再構築 大腸菌−酵母菌シャトルベクターYEp13［ナスミス（Nas
myth）、K.及びK.タッチェル（Tatchell）、セル第19巻
第753〜764頁（1980年）］中の酵母菌ライブラリーを、
５′−32P末端標識オリゴデオキシヌクレオチド（５′
−CCTGGCCAACCAATG−３′）を使用して分離する。（マ
ニアチスらの上記文献の第324〜325頁を参照）。該オリ
ゴヌクレオチドに雑種形成する酵母菌DNAの挿入を含む
プラスミドを次に単離する。これらのプラスミドの１つ
は約15kbの酵母菌DNAの挿入を含みクルジャン（Kurja
n）,J.及びI.ヘルスコヴィッツ（Herskowits）のセル30
巻第933〜943頁（1982年）に記載されたα−因子遺伝子
を含む1.7kbのEcoRI断片を含有する事を示した。1.7kb
EcoRI断片の末端はDNAポリメラーゼＩ［クレノウ（Klen
ow）断片］での培養により鈍化され、BamHIリンカーはT
4−DNAリガーゼを使用して結合された。（マニアチスら
の上記文献第113〜114頁、116頁、392〜394頁参照）。B
amHI末端はBamHIでの消化により粘着性にされ、次に酵
母菌−大腸菌シャトルプラスミドpCV7−Hin228のBamHI
部位に連結された。プラスミドCV7のHindIII部位の周囲
の欠失はHindIII消化、エクソヌクレアーゼIIIでの処
理、SIヌクレアーゼ処理によりなされ、T4−DNAリガー
ゼとの連結がプラスミドpCV7−HinΔ228を生じ、すべて
ブローチ（Broach）、J.R及びJB.ヒックス（Hicks）の
細胞21巻第501〜508頁（1980年）に述べられた方法を使
用する。酵母菌α−因子遺伝子を含む該プラスミドは、
第15図に図解されYEp−α−８と名づける。
b.ラットの暗号づけpro心房性ナトリウム尿排泄亢進性
／血管拡張性ポリペプチドのYEp−α−８への挿入 pre−proANVPを暗号化するpNF1（II.A.3.）からのDNAの
断片は制限エンドヌクレアーゼ切断によりYEp−α−８
の特異Hind部位（第15図）に挿入され必須のDNAポリメ
ラーゼＩ（クレノウ断片）でDNA末端に満たし、HindIII
リンカーを加える。（マニアチスらの上記文献第392頁
参照）。DNA断片の末端は次のHindIIIで消化され粘着性
になり、アルカルホスファターゼで処理されたHindIII
切断YEp−α−８に連結された。（マニアチスらの上記
文献第133〜134頁参照）。再結合分子は大腸菌に形質転
換され、コロニーをプラスミドDNAに対して分析した。
（マニアチスらの上記文献第366〜369頁参照）。
マニアチスらの上記文献の第173〜175頁中に示されたよ
うに、HaeIII断片が生じ、述べられているようにポリア
クリルアミドゲルにより大きさが選択される。266bpの
該断片は次のYEp−α−８にクローン化され上述のよう
に発現ベクターYEp−α−NF−５を生ずる。正しい配向
でこの挿入はproANVP配列のアミノ酸121〜152に対応す
る成熟ANVP配列及びアミノ末端に付加的ファニルアラニ
ンを含む33のアミノ酸ペプチドを暗号化（encode）す
る。対照として、挿入の逆配向はYEp−α−８にクロー
ン化されYEp−α−NF−７を表わす。この挿入は異なる
アミノ酸配列を有する無関係な蛋白質をコードする。同
時に、623bpのAccI断片が単離され正しい配向でYEp−α
−８にクローン化され発現ベクターYEp−α−NF−９を
生ずる。この挿入は、ほとんど全proANVP配列（アミノ
酸28−152）及びNH2末端での付加的なチロシンからなる
126のアミノ酸ポリペプチドをコードする。この挿入は
又逆配向でクローン化し調節（control）プラスミドYEp
−α−NF−12を生じる。HindIIIリンカーの添加の後の
ラットproANVPのHaeIII及びAccI断片の挿入は、キメラ
（chimeric）蛋白質を暗号づけするDNA配列を生ずる。
この蛋白質は、α−因子信号／解読ペプチドのために、
スペーサ断片（spacer fragment）及び適切なproANVP断
片を暗号づけする。
DNAはこれらのプラスミドを含む大腸菌の培養から調製
され（マニアチスらの上記文献の第366頁〜369頁を参
照）及びS.セレビサエ菌株W301−18A［αade（アデニン
栄養要求株）２−1,trp1−1,leu2−3,112,can（カナバ
ニン抵抗）１−100,ura（ウラシル栄養要求株）３−1,h
is3−11,15］［クラマー（Kramer）ほか、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.（米国）、81巻、367−370頁（1984年）参照］
をロイシン２原栄養株（prototrophy）に形質転換する
ものである。酵母菌株は標準培地で培養する［シエアマ
ン（Sherman）らのメソッドインイーストジェネティッ
クス（Methods in Yeast Genetics），コールドスプリ
ングハーバープレス（Cold Spring Harbor Press），コ
ールドハーバー，ニューヨーク］。大腸菌からのプラス
ミドDNAは配列を行いα−因子pro−ANVP DNA再構築を認
知するために又M13に再クローン化する。（メシングJ.
及びJ.ビエイラの上記文献を参照） c.S.セレビシアエにおけるラットpro心房性ナトリウム
尿排泄亢進性／血管拡張性ポリペプチド配列の発現及び
分泌 α−因子プロANVP断片製造（processing）技術を第15図
に示す。mRNA転写がベクター中のα−因子配列から始ま
り終ることは酵母菌分泌工程を通りキメラ蛋白質に翻訳
される。この蛋白質の蛋白質製造が分子のα−因子部分
におけるグルタミン−アラニン（Glu−Ala）（QA）残基
及びリジン−アルギニン（Lys−Arg）（KR）残基の両方
でおこる。（クーリャンJ.及びI.ヘルスコビッツの上記
文献参照）この処理を行なった蛋白質の炭素末端部分は
それ故、ラットproANVPの予測アミノ酸である。これら
のプラスミドを含む酵母菌の培養はロイシン欠如の合成
培地で行なわれる。（シエアマンらの上記文献を参照）
酵母菌のプラスミドは比較的不安定で１世代当り約1.0
％失われるのでこの選択は必要である。酵母菌の培養物
はロイシンのない合成培地で４時間0.1〜0.5mCi/ml35S
−システインで標識される。（約1000Ci/ミリモル）。
牛血清アルブミンが最終濃度100μg/mgまで加えられ、
可能な蛋白質分解を防ぐ。試料（1.0ml）を摂取し、細
胞を遠心ろ過で除去し、培地の蛋白質は10％TCA沈澱法
により４℃で15分間濃縮され次いでエッペンドルフミク
ロファージ（Eppendorf microfuge）（15,000×ｇ）中
で遠心ろ過を行なう。生じたペレットをアセトンで洗い
真空下で乾燥し、SDS試料緩衝液に再懸濁を行なう。
［レムリ（Laemlli）、英国、ネーチャー227巻第680頁
〜685頁（1970年）］これらの試料は直接SDS−PAGEゲル
（17.5％アクリルアミド）にし、乾燥ゲルのオートラジ
オグラフィで、全分泌35S−メチオニン（35S−met）蛋
白質の型を検査する。第16A図でわかるように、YEp−α
−NF−９を含む酵母菌培養液の培養液の上清は、約11.1
及び9.4kd（レーン３及び４）で35S−メチオニン（35S
−met）標識バンドを示し、YEp−α−NF−12の培養物か
らの培地（逆構築）は約5kd（レーン５及び６）の35S−
メチオニン標識バンドを示す。これらのバンドの両方と
もプラスミドベクターYEp−α−８（レーン１及び２）
を含む培養液から培地に検出されない。
蛋白質−この合成及び分泌はYEp−α−NF−９により指
示（direct）されるが−の分子量は、エンドゲナス酵母
菌プロテアーゼがこのプラスミドでAccI断片により暗号
化されたproANVP前駆物質からのNNVPペプチドを切断す
る可能性と一致しない。この可能性を確認するためにこ
のプラスミドを宿らせている（harbor）酵母菌の培養
物、それに相当する逆配向（YEp−α−NF−12）及びYEp
−α−NF−５及びYEp−α−NF−７（プロANVPの小断片
を暗号づけするHaeIII断片）を宿らせている酵母菌断片
を特に免疫沈澱性になる35S−標識蛋白質を発現するか
決定するために上記のように35S−メチオニン及び35S−
システインで標識した。35S−メチオニンはプロANVP蛋
白質にとり込まれるがANVPにはとり込まれず、一方35S
−システインは選択的にANVPにとり込まれる。対照（co
ntrol）実験が、ある酵母菌培地成分が直接の免疫沈澱
を防げることを示唆したので新しい部分的な精製技術を
次のように行なった。
細胞を精製により除去し、細胞のない上清を直接か又は
凍結乾燥により濃縮して使用した。この水溶液に10倍量
のアセトンを加え混合物を氷上で10−15分間沈澱させ
る。沈澱物はそれから遠心ろ過でペレット状にしアセト
ンを除去した。水の少量［同量（1 volume）以下］をこ
のペレットに加え再懸濁を容易にする。この混合物に次
に10倍量のメタノールを加え広範囲に混合し沈澱物は遠
心ろ過により集められた。この上清は次に除去され真空
下乾燥する。このペレットは1.0mlの免疫沈澱緩衝液中
に再溶解し免疫沈澱させ、IV.A.2に述べたように洗滌す
る。
第16B図に示したように上記抽出工程後決定される蛋白
質の複雑さは全分泌蛋白質の複雑さと比較すると比較的
単純である。第16B図中のレーン１及び２は、その合成
がメタノール溶解画分中のYEp−α−NF−７及びYEp−α
−NF−５によりそれぞれ指示される、分泌35S−システ
イン標識蛋白質を示す。第16B図においてレーン３及び
４は抗−ANVP免疫グロブリンＧでの両方の場合に免疫沈
澱をする同じ蛋白質を示す。抗血清は特にYEp−α−NF
−５からの3000ダルトンの蛋白質を特に沈澱させ、一方
逆方向（YEp−α−NF−７）から沈澱する蛋白質はな
い。（第16B図、レーン３）それぞれプラスミドYEp−α
−NF−12及びYEp−α−NF−９をもつ酵母菌の培養によ
り条件づけられた培地のメタノール溶解画分に現われる
35S−システイン標識蛋白質の同様な免疫沈澱を示す。
その結果は第16B図レーン３及び４に示されるのと同じ
で3000ダルトンの蛋白質はYEp−α−NF−９を含むS.セ
レビシアエにより条件づけられた培地から特に免疫沈澱
した。
これらの結果は両酵母菌発現プラスミド、YEp−α−NF
−５及びYEp−α−NF−９が、特異の抗−ANVP免疫グロ
ブリンＧにより免疫沈澱する３キロダルトンの35S−シ
ステイン標識蛋白質（約25−30アミノ酸長さ）の合成を
指示することを示唆する。
YEp−α−NF−９を含むS.セレビシアエ菌株W301−18Aは
1984年５月31日にATCCに寄託され取得番号20710を与え
られた。
d.S.セレビシアエ中のヒトpro心房性尿排泄亢進性／血
管拡張性ポリペプチド（128−151）の発現及び分泌 i.PJC1−５発現ベクターの構築 プラスミドYEp−α−８（IV.B.2.b）は消化されHindIII
になり、次に上述のようにアガロースゲル電気泳動によ
り大きな制限断片を精製する。精製DNAは連結され大腸
菌に転換された。１つだけのHindIII制限部位を有する
プラスミドDNAは精製されpJJ−１と名づけた。（第17A
図） プラスミドpJJ−１は、消化されPstI及びSalIになり、
次にアガロースゲル電気泳動により317bpDNA断片の精製
を行なう。PstI−SalI断片は連結され同時にプラスミド
M13mp8を消化する。（メシング、j.及びビエリア、J.の
上記文献参照）。
MPJJ1と名づけた単一鎖組換型ファージM13DNAを単離
し、突然変異誘発性のオリゴデオキシヌクレオチド５′
−GAAGAAGGGGTAAGCTTGGATAAAAGAG−３′を利用するオリ
ゴデオキシヌクレオチド取次ぎ（mediated）−部位−指
示突然変異誘発のための鋳型とに使用する。［ゾーラー
（Zoller）,M.J.及びスミス、M.、メソッドインエンザ
イモロジイ（Methods in Enzymology、第100巻、第468
頁〜500頁（1983年）参照］生じる突然変異誘発はα−
因子遺伝子領域（クルジャン、J.及びヘルスコヴィッ
ツ、I.の上記文献参照）における241〜243の部位に存在
するヌクレオチドコードン−TCT−を、この場所にHindI
II制限部位を導入し、このコードンにより暗号化したア
ミノ酸セリンに変えないAGGに変えた。（第17A図）突然
変異誘発した組換型MP−JJ−１をMP−JJ−５と名づけ
た。プラスミドJJ−１はエチジウムブロマイドの存在に
おいてPstIで部位的に消化され、次にフェノール／クロ
ロホルム抽出及びエタノール沈澱を行なう。DNAはHindI
IIで終了まで消化され次に子牛の腸のフォスファターゼ
処理を行ないアガロースゲル電気泳動により大きな制限
断片を精製した。複写型MP−JJ−５−はPstI及びHindII
Iで消化され次にポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る220bpDNA断片の単離を行なった。5853,2280,993,780
及び220bpのPstI−HindIII制限断片を含むプラスミドは
精製されpJC1−５と名づけられた。（第17A図） ii.ヒトANVP（128−151）をコードする合成DNA配列を含
むプラスミドpJC−２の構築 第17B図に示した合成DNA配列は糖分解酵素を暗号化する
高度に発現された酵母菌遺伝子におけるコドン使用から
誘導された好ましい酵母菌コドンの対で設計された。
第17B図で示された８つのオリゴデオキシヌクレオチド
はIV.A.1.b.で述べられたように集められた。次に連結
しDNAの混合物はHindIIIで消化され次にポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により103bp断片の精製を行なった。H
indIIIに結合した精製DNA断片は、M13−mP18及びM13−m
P19を消化したHindIIIに連結させ（ビラエ、J.及びメシ
ング、J.の上記文献参照）及び第17B図中示した配列に
生じた上記の（サンジァーラの上記文献参照）ジデオキ
シヌクレオチド配列分析を行なう。
プラスミドpJC−２はα−因子信号／解読ペプチを、α
−因子前駆物質のアミノ酸85の後に始まるヒトAVNPペプ
チド配列（128〜151）のフレーム融合でコードした。α
−因子調節の存在及びANPVペプチドの上の分泌配列が84
及び85のそれぞれの場所（17B図）におけるリジン−ア
ルギニン残基に続くKEX2位により暗号化されたプロテア
ーゼにより蛋白質分解をさせ［ジュリウス（Julius）、
D.らのセル37巻：第1075頁〜1089頁（1984年）］、ラッ
トproANVP配列のIV.b.1.cに述べたのと同様なヒトAVNP
（128−151）の細胞外分泌をさせる。プラスミドJC−２
は選択的媒体上で保持されたS.セレビサエに形質転換す
るのに使用された。
iii.S.セレビサエからのひとANVP（128〜151）配列の発
現及び精製 プラスミドJC1−５又はJC−２を含むS.セレビサエW301
〜184を上記選択的合成培地（IV.B.1.c.）で培養の安定
する（stationary phase of growth）まで培養し、その
時細胞を除去し、４℃で遠心ろ過した。表IVに示した結
果はプラスミドJC−２を含むS.セレビサエが免疫反応性
ペプチドを分泌することを示す。
表VI 免疫反応性ペプチド（培養液のmg/l） pJC1−５ 0.0±0.03 pJC−２ 0.57±0.10 免疫反応性ペプチドを明確に同定するためにプラスミド
JC−２を含むS.セレビサエを30℃で安定相になるまで選
択的な合成培地の１中に培養した。遠心ろ過により細
胞を除去した。生じる上清を水酸化アンモニウムでpH8.
0に調整し、次に遠心ろ過を行なった。生じた澄んだ上
清を予じめ0.01モルの酢酸アンモニウムで平衡にしたDE
AE セファセル （フォルマシア）を含む2.5cm×10cm
カラムに入れ、次に溶出液を集め（約1.1）、凍結乾
燥した。乾燥混合物は約12mlの0.5モルの酢酸中に再懸
濁し、再懸濁用液で平衡にしたセファデックス Ｇ−11
を含む2.5cm×50cmカラムに通した。放射性免疫検定
（Ｖを参照）により検定された免疫反応性を含む画分を
集めプールし凍結乾燥した。
乾燥物質を5mlの酢酸中に最懸濁し、IV.A.5.に述べられ
た高性能液体クロマトグラフィーを行なう。
免疫反応性ピーク画分を単離し200pmolesが上記IV.A.5.
のように自動アミノ酸配列分析にかけられた。生じたア
ミノ酸配列は Ｈ−Ser−Ser−Cys−Phe−Gly−Gly−Arg−Met−Asp−A
rg−Ile−Gly−Ala−Gln−Ser−Gly−Leu−Gly−Cys−A
sn−Ser−Phe−Arg−Tyr−OH であった。
加えて、酵母菌ポリペプチドによる汚染物はこの分析法
により探知されなかった。
pJC2を含むS.セレビシアエ株・W301−18Aは1985年４月
９日にATCCに寄託され取得番号は20754だった。
c.培養されたチヤイニーズハムスター卵巣細胞における
pre心房性のナトリウム尿排泄亢進性／血管拡張性ポリ
ペプチドの発現 チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるprorANVP（25
−152）及びprohANVP（26−151）の発現を次の例で述べ
る。これらの例は実施例で示され哺乳動物の細胞におい
て同じようちpre−proANVP,proANVP又はANVPのいずれも
発現しうることが容易に理解されるであろう。
１）ラットpre−pro心房性ナトリウム尿排泄亢進性／血
管拡張性ペリペプチドの発現 哺乳動物の細胞においてラットのpre−pro ANVPの発現
を容易にする為に、ヒトメタロチオネンII（hMTII）遺
伝子から誘導された強力な調節プロモーターに融合し
た、ラットpre−pro ANVPのための暗号づけ染色体中
に、雑種遺伝子が構築された。これは２つの工程により
行なう。第一には、発現ベクターを調整した。発現ベク
ター、pHSI、は暗号領域の隣りの５′非翻訳領域にある
塩基+70への転写の初めに塩基−765で自然に生じるHind
III制限部位からhMTII配列の840ヌクレオチド塩基対を
運ぶ［カリン（Kalin）,Mらのネーチャー第299巻、第79
7頁〜802頁（1982）］。pHSIは又、その中に暗号配列が
挿入されうる領域を運ぶ。pHSIを構築するために、hMTI
I遺伝子を運ぶフラスミドp84Hは制限エンドヌクレアー
ゼBamHIで終りまで消化された次にエクソヌクレアーゼB
al−31で処理して末端ヌクレオチドを除去する。HindII
Iでの消化の次にこの反応生成物は、HindIII及びHincII
の消化で切断されたプラスミドにpUC8に連結された。生
じるプラスミドの組換え型の１つはヌクレオチド配列と
してpHSIの組成物を有した。
雑種遺伝子の構築を完了するために、EcoRI−SalIラッ
トpre−proANVP cDNAをプラスミドpNFl（II.A.）からEc
oRI及びSalIでの消化により単離し、次にポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行なった。pHSIはEcoRIで切断
し、T4−DNAリガーゼでcDNA断片に連結した。反応生成
物は、再循環させるために、次に第２の連結をされる鈍
化末端分子を生じるために、４つのヌクレオチドトリホ
スフェイト及びDNAポリメラーゼＩ［クレノウ（Kleno
w）断片］で次に培養する。組換え型プラスミド分子は
大腸菌MC1061に導入され制限エンドヌクレアーゼ分析に
より分離した（マニチアスら上記文献第104頁参照）。
２つの組換え型、（第18A図）pMT−NFl−10及びpMT−NF
l−20がpSV2:NEO［サザン（Southern）,P及びP.ベルグ
（Berg）,J.Mol.Appl.Jenet.第１巻、第327頁〜第341頁
（1982年）］、ネオマイシン類似物G418抵抗性を与える
機能的遺伝子を運ぶプラスミドでの同時形質転換による
培養細胞のチャイニーズハムスター卵巣（CHO）系統に
投入した。pSV:NEOの500ナノグラム及びpMT−NFl−10の
5ug又はpMT−NFl−20はDNAに４時間さらした後15％のグ
リセロールで２分“ショック（shock）”を含有の標準
試料［ウィグラー（Wigler）,M.らセル第16巻、第777頁
〜785頁（1985年）］によるリン酸カルシウム−DNA同時
沈澱物中に細胞の60mmディッシュ（dish）に適用させ
る。１日後その細胞は1mg/mlでG418にさらす。この工程
はpMT−NFl−10はpMT−NFl−20の安定な遺伝も又認めた
ほとんどのG418抵抗コロニーの１つの（pool）を生じ
た。CHO細胞及び他の培養細胞の先の経験［マコーミッ
ク、Ｆらのモレキュラー アンド セルラー バイオロ
ジー（Molecular and Cellular Biology）４−１第166
頁（1984年）］は、それらが哺乳動物のプリホルモンか
ら信号ペプチドを切断でき、ポリペプチドの残りを栄養
培地に分泌することができる。それによって、pre−pro
ANVP及び関連ペプチドの生産は次に35S−メチオニンで
細胞を培養することにより又、標準蛋白質ゲル分析によ
り放射性標識分泌生産物を検査することにより検査され
る。
培地へ分泌された35S−メチオニン標識蛋白質のオート
ラジオグラムは抗−ANVP免疫グロブリンにより特に免疫
沈澱される18,000ダルトンの蛋白質の外観を明らかにす
る。この蛋白質は対照（control）プラスミドを含む細
胞の35S−メチオニン照射蛋白質においてはみられな
い。このようにpMT−NF−１−10を含むCHO細胞はこれら
の細胞の培地プロANVPsを分泌する。
pMT−NF−１−10を含むチャイニーズハムスター卵巣（C
HO）細胞は、1984年５月31日ATCCに寄託され取得番号は
CRL8569である。
２）培養した哺乳動物細胞におけるヒトpre−心房性ナ
トリウム尿排泄亢進性／血管拡張性ポリペプチドの発現 ヒトpre−proANVPsはヒトゲノムクローンの特徴を説明
するための適切な変更がある同様な方法で発現された。
簡単にはBamHIを、pre−proANVP遺伝子を結びつけるEco
RIヒトゲノム部分に運ぶプラスミド、HGRB1が構築され
部分的に制限エンドヌクレアーゼAccIで部分消化され、
EcoRIで完全に消化された。生じたAccI−EcoRI断片をポ
リアクリルアミドゲル精製により分離する。この断片
は、５′非翻訳領域から遺伝子の３′末端を過ぎる点ま
でのびているものであるが、この断片はAccI及びEcoRI
で切断した発現プラスミドpMT401に結合した。プラスミ
ドpMT401はM13mp7から、（ビエイラ及びメシングらの上
記文献参照）pHSIのBamHI部位へのBamHI結合ポリリンカ
ー領域の挿入により誘導される。この生じた組換型はヒ
トメタロチオネインプロモーターから３′位ヒトpre−p
roANVP遺伝子を含みpHNF−８と名づけられた。この雑種
構築は次に、ラットpre−proANVPsについて上述したの
と同様な方法で発現のために培養CHO細胞に誘導され
る。
pHNF−８で形質転換された培養CHO細胞は、10％子牛の
胎児血清を補なったハリスＦ−12培地を含む皿に低希釈
で細胞を置くことによりサブクローン化（subcloned）
した。個々のサブクローンは続いて除去し、それぞれpr
o−ANVP生産物について放射免疫検定（Ｖ）及び35S−メ
チオニンでの放射性標識の両方により検査を行なった。
35S−メチオニン標識蛋白質はSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分離した。第18B図中にこれらの実
験の結果が示されている。レーン２は対照CHO細胞から
の35S−メチオニン標識蛋白質を示している。レーン１
はサブクローン化する前のpHNF−８での形質転換された
CHOプールからの35S−メチオニン標識蛋白質を示す。レ
ーン３−６はpHNF−８を含む４つのサブクローン（subc
lones）からの35S−メチオニン標識蛋白質を示し、CHO
−8/2−6,CHO−8/2−55,CHO8/2−81,CHO−8/2−93と名
づけられた。サブクローンのそれぞれにおいて、明らか
な35S−メチオニン標識バンドは18,000及び10,000ダル
トンに表われる。そのバンドはproANVP（18,000K）及び
特異抗体での免疫沈澱により、この蛋白質のアミノ酸末
端からなるプロANVP断片として同定される。サブクロー
ンがプロANVPを生産するという事実はV.で述べられた放
射免疫検定によって確認された。
この系において蛋白質分解によりプロANVPの実質的部分
が切断されているということを10,000ダルトン型が含む
ことを注意すべきである。そのような蛋白質分解結果は
アミノ酸末端断片（10,000K）及びより短いANVPのもの
を含むより小さいカルボキシ末端断片を生じる。このよ
うにクローンは、生物学的活性のANVPセグメントがある
か又はないより小さな断片を生じるために重要と考えら
れている。
pHNF−８を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細
胞及びCHO−8/2−81という名のものを1985年４月９日に
寄託し、取得番号CRL−8782であった。
D.pre心房性ナトリウム尿排泄亢進性／血管拡張性ポリ
ペプチド及び心房ナトリウム尿排泄亢進性／血管拡張性
ポリペプチドから誘導された発現生産物の生物学的活性 その発現及び分泌がD.2で述べられた酵母菌α−因子系
及びC.2で述べられた大腸菌系により指示された、種々
のラット及びヒトproANVPs及びANVPsが試験され生物学
的活性を有することが示された。酵母菌の培地（100m
l）は100μg/mlのHSAを含む合成培地を30℃で16時間成
長させる。細胞は遠心分離により除去され培地は凍結乾
燥する。凍結乾燥した粉末は2mlの蒸留水で再構成し10
倍量のアセトンを加える。その溶液を完全に混合し、次
にソルボール（Sorvall）RT6000遠心機中で10分間10,00
0×ｇ遠心分離した［ソルボール インストルメント、
（Sorvall Instruments）、ウィルミントン（Wilmingto
n）、DE］。上清を除去後、そのペレットを1mlの蒸留水
中に再懸濁させ、10倍量のメタノールを加えた。この溶
液を完全に混合し、ソルボールRC5B遠心機で10分間20,0
00×ｇ遠心分離する。1/2の溶液をサバント（Savant）
型蒸発器での回転排気により乾燥した（第１表“メタノ
ール溶解性”画分を参照）。残る溶液を0.5モルの酢酸
で1:1に希釈し、0.5モル酢酸で平衡にしたSP−セファデ
ックス （シグマケミカル社製）の3mlカラムにかけ
る。そのカラムを0.5モル酢酸15mlで洗い次に1.0モルの
酢酸アンモニウム6mlで溶離した。その溶離物質を次に
凍結乾燥により乾燥した（表VIIの“ポースト（post）S
P−セファデックス”画分）。その乾燥メタノール溶解
性及び酢酸アンモニウム溶離物質を0.5mlの蒸留水で再
溶解し、クライネルト（Kleinert）らのハイパーテンシ
ョン６巻増刊１第143頁〜146頁（1984年）中に述べてあ
る予約ラビット胸大動脈環（precontracted rabbit tho
racie aortic ring）モデルを使用して生物学的活性を
試験した。粗凍結乾燥培地から再構成された等量の物
質、メタノール溶解性蛋白質又は1.0モル酢酸アンモニ
ウムでのSP−セファデックス から溶離した蛋白質が５
μモルヒスタミンで予約した（precontracted）大動脈
環（aortic rings）を使用して比較する。そのプラスミ
ドproANVP（アミノ酸26−152）（YEp−α−NF−９）及
びproANVP（アミノ酸121−152）（YEp−α−NF−５）を
暗号化したものである酵母菌培養物により合成された物
質及び同様に対応する逆配向性物質（それぞれYEp−α
−NF−12及びYEp−α−NF−７）を比較する。その結果
を表VIIに表わした。重要な血管拡張活性がメタノール
溶解物質及びYEp−α−NF−５及びYEp−α−NF−９を含
む細胞からの抽出物中のポースト（post）SP−セファデ
ックスに検知できた。逆配向DNAプラスミドを含む細胞
からの抽出物は活性でない。この発見は第16図で示した
免疫沈澱反応データと同様に、酵母菌か成熟ANVPを含む
全長及びより小さいプロANVP断片を生物学的活性能力を
示す型に処理することを表わす。
大動脈環を５μモルのヒスタミンでの予備収縮（precon
tracted）された。大動脈環は次にS.セレビシアエ培養
で得られた蛋白質で次に処理された。その蛋白質は培養
培地のアセトン／メタノール処理により精製し、指示画
分はSP−セファデックスを通過させた。YEp−α−NF−
５及びYEp−α−NF−９は正配向でのproANVP cDNAを含
有し、YEp−α−NF−７及びYEp−α−NF−12は逆配向で
のDNAを含有した。データーはコレイナート（Kleiner
t）の上記文献に述べた予約環（precontracted rings）
の弛援％として表わした。
上記発現物質試料は又、ナトリウム尿排泄亢進性及び利
尿性活性をカマルゴ（Camargo）,M.らのAm.J.Physiol.2
46巻F447〜F456（1984年）に記載されているように単離
された灌流（perfused）ラット賢臓モデルを使用して検
査した。第VIII表に示されたようにYEp−α−NF−５を
含む酵母菌培養により合成され分泌され及びSP−セファ
デックス工程を通って上記のように精製された物質は10
分間ごとにくり返し試験する間に検査されたように、尿
Na+排泄を約３倍、尿量を２倍に増加させる。腎糸球体
のろ過作用も又、この実験において利尿作用と一致して
増加する。逆配向性対照プラスミドYEp−α−NF−７を
含有する酵母菌培養により合成され分泌され、SP−セフ
ァデックス で精製された物質において、同じ試験を行
なう時尿Na+排泄、尿量、腎糸球体ろ過作用、腎抵抗性
において重大な増加はない。
結果は２回の10分対照（control）時間の平均を表わ
し、次に50μｌのSP−セファデックス精製蛋白質を加え
た。実験の測定は３回連続10分間の間に得られた平均値
を表わす。
上記VI.B.2.d.に記載されたように精製したヒトproANVP
（128−151）を上記のように検定し生物学的活性の全範
囲を表わした。
酵母菌発現活性物質に同様な方法で、IV.A及びIV.Cにそ
れぞれ記載されている細菌及び哺乳動物の細胞により発
現されたラット、ヒトpre−proANVPs,proANVPs及びANVP
sは、生物学的活性を有することが示されてきた。
その合成が大腸菌中のプラスミドpRNF−6852及びpRNF−
12852のそれぞれにより指示されたラットproANVP断片87
−152及び26−152を次のように１の細菌細胞から抽出
した。その細胞を5000×ｇで60分間遠心分離を行なって
回収し、pH7.5の50ミリモルトリス10ml中に再懸濁し
た。この懸濁液を加熱システム超音波処理機［ヒートシ
ステムズ（Heat Systems）、ファーミングドル（Farmin
gdale）、ニューヨーク］調節（setting）４を使用して
１分間超音波で処理した。超音波処理物質は次に105,00
0×ｇで遠心分離し、粒状物質を除去し、生じた上清み
を取っておき粗細菌抽出物と粗細菌抽出物の１画分を次
に５分間煮沸させ、１時間pHを2.5に低下させる。次にp
Hを中性にし、煮沸した酸抽出物及び粗細菌抽出物を上
記のようにrabit胸大動脈環に、適用した。表IXで示す
ように、pRNF−6852及びpRNF12852を含有する抽出物か
らの粗細菌抽出物及び煮沸酸抽出物の両方は予備収縮組
織を弛援した。pKT52ベクターを含みANVP DNAがない細
菌からの対照試料は非活性であった。このように酵母菌
発現生成物と同じ方法で細菌性ラットproANVP断片は血
管拡張性がある。さらに、これらの試料の１画分は煮沸
してあり酸抽出され、粗細菌抽出物に関する生物学的活
性の損失なく、次の工程を防ぐので全68アミノ酸断片は
生物学的に活性と考えられた。
IV.A.5.で記載されたように大腸菌から調製された精製
ヒトproANVP（26−151）は血管組織において十分な効果
を有する事が示された。
表IX 大腸菌に発現されたpro心房性ナトリウム尿排泄亢進性
／血管拡張性ポリペプチド断片の血管弛緩作用 試料 弛緩％ 対照 ８±２ proANVP（87−152） 74±８ proANVP（25−152） 65±９ うさぎ胸大動脈管が５μＭヒスタミンで予備収縮され
た。データーは予備収縮管の弛緩％として表わした。
哺乳動物細胞発現の場合、proANVP（25−152）及びproh
ANVP（126−151）の両方が上述のと同様に生物学的活性
を示したCHO細胞において生成された。
酵母菌、細菌及び哺乳動物細胞におけるDNA組換え技術
を述べたことを使って発現されたproANVP蛋白質はすべ
て普通のANVP配列： （式中角型括弧をつけたアミノ酸残基はひとANVPsにお
いてはメチオニンでラットANVPsにおいてはイソロイシ
ンである）を含有する。上記工程で発現されたproANVP
断片は血管弛緩、ナトリウム排泄及び利尿作用能力を示
す。（表VII,VIII及びIX）。これらの同様なそして関連
のある作用は、又、rANVP（126−150）及びhANVP（127
−151）でも明らかになった。このようにこれらの発現
断片は合成ANVPで試験管内調製及びヒト又は動物への生
体に注射した時の両方にすべての特性を共有する。表Ｖ
に示されたように合成ANVPsは普通の心房性血圧、血漿
レニン活性及び血漿アルドステロンを低下させ、尿量及
び尿ナトリウム排泄を低下させた。これらは利尿及び抗
高血圧性物質の望ましい特性である。さらに、proANVPs
及びANVPsは量及び血圧調節の主な中心で作用する。こ
のようにpre−proANVPs.proANVPs及びANVPsは組換えDNA
方法により生成され、上記に匹敵する方法で酵母菌、細
菌又は哺乳動物の細胞に発現された時、浮腫状態（即
ち、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変及び無
効腎灌流）の急性及び慢性治療及び腎不全及び高血圧の
慢性治療に有用性を見出すという事が結論づけられた。
上記実施例で示されたように、開示された方法及び組成
物はpre−proANVPs,proANVPs及びそれらの断片及びANVP
sを発現することにおいて使用を見出し得る。当業者に
とってここに示されたポリペプチドの配列又は断片は、
本発明の範囲内にとどまるがこの開示に重要でない変更
により、発現される。
特に開示されたpre−proANVPsアミノ酸配列のいずれか
が発現されうる。これらの断片はANVPの完全な配列を含
まずしかしANVPsの部分を含むかもしれない。これらの
断片はそれ自身、該化合物に示された作用に匹敵するか
又は補足的な生物学的作用を示す。
加えて、ヒト誘導proANVPs、その断片及びANVPsは、生
物学的活性のラット−誘導ポリペプチドと比べ１つのア
ミノ酸置換を含む。それ故、ヒト誘導化合物を発現し、
前述の方法で調製した酵母菌、細菌及び哺乳動物の細胞
は同様な生物学的作用を示す。
V.心房性ナトリウム尿排泄亢進性／血管拡張性ポリペプ
チド化合物 本発明の化合物は、免疫検定、特に放射免疫検定を、試
料中のANVPsの存在又は量を決定するために使う。
完全なフロイントアジュバント中の子牛血清アルブミン
に接合した250μg ANVPでニュージーランド白うさぎを
皮下及び筋肉内注射で免疫することによりANVPsに対す
る抗体が生成された。ブースト（boost）の後、７−10
日して耳動脈からウサギの血を採取し、その血清をANVP
結合能力を検査した。平行して対照の非免疫血清試料も
又試験された。表Ｖはその中の抗血清の、特にANVPsと
の特に相互に作用する抗血清の能力が試験される代表的
なデーターを表わす。ANVP（500ナノグラム）はポリス
チレンプレートの特有のくぼみに固定された。抗血清の
希釈をいろいろ変えてこれらのくぼみに加え、特異的に
結合した抗体の量を125I−標識羊抗うさぎ免疫グロブリ
ンＧ抗血清を加えて定量した。これは特異抗体定量を決
定する標準的な方法である。表Ｘで示されるように、血
清の1:400の希釈で抗体の意味ある量がANVPsにまで結合
していた。特異的な結合は非免疫血清とともに認められ
なかった。
表XIで表わされた実験は、表Ｘの実験と同じであるが、
非−固定化ANVPsの種々の濃度のものが抗−ANVP抗血清
の1:100希釈と同時に加えられた。示されたように非固
定化ANVPsが固定化ANVPsから抗体結合を、競合的に置き
かえた。このように、これは競合置換検定の例である。
この検定と同様な放射免疫検定は種々の生理学的又は病
理生理学的な状態で組織または血清においてANVPのよう
な免疫反応性を定量するのに使用されうる。これまでは
検定は心房性の抽出物中にANVPを検知するのに使用され
てきた。ANVPは心室の抽出物には検知されてかった。
表XI 遊離心房性ナトリウム尿排泄亢進性／血管拡張性ポリペ
プチドを加えることにより固定化心房性ナトリウム尿排
泄亢進性／血管拡張性ポリペプチドと結合する競合的置
換の抗心房性ナトリウム尿排泄亢進性／血管拡張性ポリ
ペプチド 遊離ANVPの濃度 抗体バウンド （ｎモル） （CPM） ０ 6777 0.002 6343 0.02 5603 0.2 2893 2.0 1223 前記発明を明らかにするためにそして理解するという目
的のためいくらか詳しく記載したが、請求の精神及び範
囲内にある本発明の変更が行なわれうることは当業者に
は理解されるであろう。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＲ (72)発明者 マツカーシー、ブライアン・ジエイ アメリカ合衆国カリフオルニア94022ロ ス・アルトス・ヒルズ、アマスト・コート 14244 (72)発明者 ラーラグ、ジヨン・エイチ アメリカ合衆国ニユー・ヨーク州10021ニ ユー・ヨーク、イーストセブンテイース・ ストリート 435、アパートメント 22ジ エイ (72)発明者 ルウイツキ、ジヨン・エイ アメリカ合衆国カリフオルニア州94087サ ニーベール、ミケランジエロ・ドライブ 954 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．118，Ｎｏ. １，Ｐ．131−139（1984) Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．119，Ｎｏ. ３，Ｐ．933−940（1984)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式:Arg−Ser−Ser−Cys−Phe−Gly−Gly−
    Arg−Ile/Met−Asp−Arg−Ile−Gly−Ala−Gln−Ser−G
    ly−Leu−Gly−Cys−Asn−Ser−Phe−Arg−Tyr（式中、
    Ile/MetはIle又はMetを表わす）で表わされ、その環状
    ジスルフィド形を包含し、Ｎ末端アセチル化形及び／又
    はＣ末端アミド化形を包含する、哺乳動物におけるナト
    リウム尿排泄亢進剤、利尿剤及び／又は血管拡張剤とし
    て有用なポリペプチド。
  2. 【請求項２】式:Arg−Ser−Ser−Cys−Phe−Gly−Gly−
    Arg−Ile/Met−Asp−Arg−Ile−Gly−Ala−Gln−Ser−G
    ly−Leu−Gly−Cys−Asn−Ser−Phe−Arg−Tyr（式中、
    Ile/MetはIle又はMetを表わす）で表わされ、その環状
    ジスルフィド形を包含し、Ｎ末端アセチル化形及び／又
    はＣ末端アミド化形を包含するポリペプチドを生産する
    方法であって、前記コード配列の発現をもたらすことが
    できる制御配列に作用的に結合された前記ポリペプチド
    をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有す
    るように改質された微生物又は細胞培養物を前記ポリペ
    プチドが生産される条件下で培養することそして培養物
    から前記ポリペプチドを回収することを含む、方法。
  3. 【請求項３】哺乳動物におけるナトリウム尿排泄亢進
    剤、利尿剤及び／又は血管拡張剤として治療的有効量
    の、式:Arg−Ser−Ser−Cys−Phe−Gly−Gly−Arg−Ile
    /Met−Asp−Arg−Ile−Gly−Ala−Gln−Ser−Gly−Leu
    −Gly−Cys−Asn−Ser−Phe−Arg−Tyr（式中、Ile/Met
    はIle又はMetを表わす）で表わされ、その環状ジスルフ
    ィド形を包含し、Ｎ末端アセチル化形及び／又はＣ末端
    アミド化形を包含するポリペプチドを薬剤的に許容でき
    る賦形剤との混合物として含む、哺乳動物におけるナト
    リウム尿排泄亢進剤、利尿剤及び／又は血管拡張剤組成
    物。
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