JPH07508650A - タンパク質ホルモン形成の阻害のための組成物およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質ホルモン形成の阻害のための組成物およびその使用 本出願は、１９８９年８月１６日に出願された米国出願束０７／３９５゜２５３ 号の一部継続出願である。

発明の分野 本発明は免疫学／生化学の領域にあり、そして特にタンパク質ホルモン放出のイ ンヒビターを同定するための組成物および方法の開発、およびホルモンの高レベ ルに伴う疾患を治療するためのこのインヒビターの予防的または治療的使用に関 する。より特定すれば、本発明はＴＮＦ転換酵素のインヒビターを同定するため の組成物および方法の同定を促進する。これらのインヒビターは、種々の疾患、 特に敗血症、リウマチ様関節炎、悪液質、ＡＩＤＳ、および自己免疫疾患を治療 するのに使用され得る、そしてそれにより、医師は治療摂生法を変えることが可 能である。

発明の背景 米国だけでも院内菌血症（ｎｏｓｏｃｏｎｉａｌ　ｂａｃｔｅｒｅｌｒｌｉａ） が年あたり１９４．０００人の患者で起こり、これらのうち約７５．０００人が 死亡している。Ｍａｋｉ、　Ｄ、Ｇ、、１９８１．　Ｎｏ５ｏｃｏｆｆｌｉａｌ 　１ｎｆｅｃｔ、、（Ｄｉｋｓｏｎ。

Ｒ，Ｅ、、り、１８３頁、Ｙｒｋｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｏｏｋｓ、　Ｕ、Ｓ、 ＾、。これらの死亡の大部分は、６つの主要なグラム陰性桿菌−Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ　覗胆紅凹匝、　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃａｄｉ、　Ｐｒｏｔｅｕ ｓ、　ＫＬｅｂｓｉｅｌｌａ、　Ｆ。

ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒおよび５ｅｒｒａｔｉａに起因し得る。現在の菌血症の 治療は、敗血症ショックの治療において有効性が限定されている抗生物質の投与 である。

菌血症の正確な病理学は完全に解明されていない。それにもかかられす、リポ多 糖（ＬＰＳ）と呼ばれる特定の細菌性エンドトキシンが主要な原因物質であるこ とが知られている。ＬＰＳは少なくとも３つの重要な抗原性領域：リピド＾；コ ア多糖；および〇−−異的多糖からなる。後者はまた、〇−特異的鎖または単に 〇−抗原と呼ばれる。この〇−特特異的領領域、繰り返し多糖単位から構築され る長鎖多糖である。多糖単位の数は、異なる細菌種の間で異なり、そして１つか ら６つまたは７つの単糖類単位まで変化し得る。〇−特異的鎖は異なるグラム陰 性細菌の間で変化するが、リピド＾およびコア多糖は同一でなくとも類似である 。

ＬＰＳは敗血症で重要な役割を演じるので、その活性を中和する多くのアプロー チが追求されている。現在、抗ＬＰＳ抗体がまもなく標準抗生物質治療への有益 な臨床付加治療になり得ることを示唆する重要な研究がある。

ＬＰＳは最終的には患者の死を引き起こす生化学反応のカスケードを開始する。

ＬＰＳ導入の初期の結果は、ＬＰＳの結果としてマクロファージ細胞の刺激およ び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の産生であるとか広く信じられている。従って、ＴＮ Ｆに対する中和抗体またはその作用を阻害し得る他の分子を産生ずるためにかな りの努力が費やされた。ＴＮＦに対する抗体が有益な臨床用途を有し得る可能性 がある。Ｔｒａｃｅｙら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、　３３０：６６２゜ＴＮＦ は、膜結合形態および可溶性の分泌形態の両形態で存在することが示されている 。Ｄｅｃｋｅｒら、ｌ９８７、Ｊ、ｏｆ　Ｉｎ＋＋ｎｕｎｏ１．。

１３Ｂ＋９５７；　Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、１９８８、ｑ旦、５３：４５゜ヒトＴ ＮＦはクローン化されており、そして１７ｋＤポリペプチド、に加えて異常に長 い７６アミノ酸の推定シグナルリーダー配列からなることが示されている。この １７ｋＤ分子は敗血症の原因となる生化学的カスケードの開始に関与する鍵とな る物質である。Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、１９８８、Ｃｅ１ｌ、　５３：４５ｉ：よ り、ＴＮＦは膜結合性の２６ｋＤ形態、および１７ｋＤ種に相当する可溶性形態 の両形態で存在し得ることが提案された。この２６ｋＤ形態は成熟１７ｋＤ分子 の前駆体またはプロホルモンである。Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、上記、により、ＴＮ Ｆの２つの形態は、主に組織分布の違いの結果として、異なる生物学的作用を有 し得ることがさらに提案された。

ＴＮＦが敗血症および他の疾患を引き起こすことにおいて重要な役割を演じるの で、抗ＴＮＦ予防法／治療法を同定および開発する必要がある。上記で述べたよ うに、抗ＴＮＦ抗体は有望であるように見え、モしてヒトにおいて有効であるこ とが示された。しかし、これらの研究は、非ヒトＴＮＦおよび非ヒトＴＮＦ抗体 の使用を含んでいる。

実際的な見地からは、非ヒト抗ＴＮＦ抗体は、患者の免疫系による抗体の免疫拒 絶のため、治療用途が限定され得る。その結果、ヒト抗体、またはヒト定常傾城 およびマウス可変領域からなる遺伝子工学による抗体（「ヒト化抗体」）が好ま しい。

ＴＮＦは、敗血症で重要な役割を演じることに加えて、潜伏ウィルスを持つヒト 細胞においてヒト免疫不全ウィルスの発現を開始させることに関与することが最 近示された。Ｆｏｌｋｓら、１９８９、門が胆坦り、銭：２３６５゜従って、Ｔ ＮＦの１７ｋＤまたは低分子量形態の形成を妨害または阻害することは、患者中 に潜伏しているウィルスの発現を妨げることによりＡＩＤＳ患者の処置に有効な 予防法となり得る。

ＴＮＦはまた、種々の自己免疫疾患、特にリューマチ様関節炎におＩ、Ｎテある 役割を演じている。Ｄｕｆｆら、ｌ９８７、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ。

ｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｔｕｉ＋ｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａ ｃｔｏｒ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｃｔｏｔｏｘｉｎｓ、　１７５：１０゜こ のように、ＴＮＦ作用を阻害する化合物または方法は、免疫学的起源の種々の疾 患の治療に対し重要な用途を有し得る。

抗体に加えて、ＴＮＦ阻害活性を有する他の分子がめられている。抗体以外のＴ ＮＦインヒビターは、Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒら、ｌ９８８、シ■Ｌ」封、、　１６ ７：１５１、およびＳｅｃｋｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

」旬１．劃６４：１１９６６、および欧州特許出願第８８８３０３６５．８号、 発明者ｆａｌｌａｃｈら、に記載されている。これらインヒビターは、発熱患者 の尿中に存在し、そして精製され、約２７．０００−３３．０００の分子量を有 することが示された。これらインヒビターは、ＴＮＦレセプターの可溶性形態で あることが現在知られている。

これら分子はＴＮＦ阻害活性を示すけれども、いずれのインヒビターもヒトにお いて敗血症の処置に有効であることは示されていない。

前述の論議から、敗血症の処置に有効な、抗体ベースのまたはそうでない、別の 抗ＴＮＦインヒビターを同定および開発する必要があることは明らかである。

え朝立１１ その最も一般的な形態において、本明細書に記載される本発明は、そのプロホル モン前駆体（プロＴＮＦ）から、ＴＮＦの成熟形態の産生を阻害する方法および 組成物を提供する。これらの組成物は、成熟ＴＮＦの高循環レベルに伴う患者の 疾患を予防または治療するのに有用である。本発明はまた、ＴＮＦの成熟形態の 産生を阻害する分子を同定する方法に関する。そのようなインヒビターは、ＴＮ Ｆを中和する抗ＴＮＦ抗体から区別できる。

この方法は、成熟ＴＮＦの産生により引き起こされる敗血症およびその他の疾患 の治療のための予防薬および／または治療薬などの薬物を同定するのに使用され 得る。これらの薬物は、転換酵素（ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）と呼ばれる酵素によ る、２６ｋＤプロＴＮＦプロホルモンの切断を妨害し得る。従って、これらの薬 物は、低分子量の敗血症誘導性分子（即ち、１７ｋＤ　ＴＮＦ）の産生を阻害す る。

より特定すれば、本明細書に記載されるような好適なインヒビターはＴＮＦ転換 酵素の活性を妨害し、１７ｋＤ　ＴＮＦのようなＴＮＦの成熟形態を生成する、 少な（とも７６アミノ酸シグナル配列を含む２６ｋＤ分子のＮ末端部分の除去を 妨げる。本発明はまた、ＴＮＦ転換酵素のインヒビターであって、そして敗血症 の予防および／または治療に有効である、１つのクラスの化合物を包含する。こ のクラスにおける化合物は、抗転換酵素抗体、結合に対してＴＮＦの２６ｋＤ形 態と競合するタンパク質またはペプチドを包含する。また、ＴＮＦ転換酵素を包 含するプロテアーゼのクラスを特異的に阻害する、または好適には、ＴＮＦ転換 酵素の阻害について選択的な特異性を示す低分子量化合物が請求項に記載される 。

さらに、本発明者らは、ＴＮＦ転換酵素をほぼ均一にまで精製し、そのアミノ酸 配列を解明し、そしてそれを既知のセリンプロテアーゼと比較した。この精製さ れたＴＮＦ転換酵素は、同じ分子量を有する既知の好中球プロテアーゼＰＲ−３ と本質的に同一であるＮ末端アミノ酸配列を含む。本発明者らはまた、ＴＮＦ転 換酵素の種々のインヒビターを同定し、そしてインビトロアッセイおよびインビ ボアッセイでそれらを試験した。

より特定すれば、本発明の目的は、ＴＮＦ転換酵素を特異的に阻害する小分子を 提供することである。

本発明の別の目的は、ＰＲ−３インヒビターを投与することによる、敗血症、敗 血症ショック、脳性マラリア、リューマチ様関節炎、ＡＩＤＳ、悪液質、および 対宿主性移植片病などの疾患を処置するための方法である。

本発明の１つの側面では、ＴＮＦ転換酵素によるプロＴＮＦの切断によりそのプ ロＴＮＦから生成される成熟腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）により引き起こされる疾患 の予防薬または治療薬を同定する方法が提供され、この方法は以下の工程を包含 する：（ａ）プロＴＮＦと、プロＴＮＦを切断するのに有効な量のＴＮＦ転換酵 素とを接触する工程；（ｂ）工程（ａ）におけるプロＴＮＦの成熟ＴＮＦへの転 換を測定する工程；（Ｃ）成熟ＴＮＦにより引き起こされる疾患の予防薬または 治療薬として同定されることがめられる分子をさらに含めて、工程（ａ）および （ｂ）を繰り返す工程；（ｄ）工程（ｃ）でプロＴＮＦの成熟ＴＮＦへの転換を 測定する工程；および（ｅ）工程（ｂ）で測定される転換と、工程（ｃ）で測定 される転換とを比較し、その分子が成熟ＴＮＦによって引き起こされる疾患の適 切な予防薬または治療薬であるかどうかを決定する工程。

本発明の別の局面では、ＴＮＦ転換酵素によるプロＴＮＦの切断によりそのプロ ＴＮＦから生成される成熟ＴＮＦにより引き起こされる疾患を治療するための治 療用または予防用化合物が提供され、この治療用または予防用化合物は以下の工 程を包含する方法により同定される：（ａ）プロＴＮＦと、プロＴＮＦを切断す るのに有効な量のＴＮＦ転換酵素とを接触する工程；（ｂ）工程（ａ）における プロＴＮＦの成熟ＴＮＦへの転換を測定する工程；（Ｃ）成熟ＴＮＦにより引き 起こされる疾患の予防薬または治療薬として同定されることがめられる分子をさ らに含めて、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程；（ｄ）工程（ｃ）でプロ ＴＮＦの成熟ＴＮＦへの転換を測定する工程；および（ｅ）工程（ｂ）で測定さ れる転換と、工程（ｃ）で測定される転換とを比較し、その分子が成熟ＴＮＦに よって引き起こされる疾患の適切な予防薬または治療薬であるかどうかを同定す る工程。

さらに本発明の別の側面では、ＴＮＦ転換酵素によるプロＴＮＦの切断によりそ のプロＴＮＦから生成される成熟ＴＮＦにより引き起こされる疾患を有するまた は疾患にかかり易い患者を処置する方法であって、この方法はそのような処置を 必要とする患者に有効量のＴＮＦ転換酵素のインヒビターを投与する工程を包含 する。好適な実施態様では、上記疾患は敗血症、リウマチ様関節炎、悪液質、脳 性マラリア、ＡＩＤＳ、および対宿主性移植片病からなる群から選択される。

本発明のさらなる局面では、ＴＮＦ転換酵素による該プロＴＮＦの切断によりそ のプロＴＮＦから生成される成熟ＴＮＦにより引き起こされる疾患を処置するた めの薬学的組成物が提供され、この組成物は有効量のＴＮＦ転換酵素のインヒビ ターおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含有する。

１１度交星立盈Ｍ 図１１　パネル＾は、２６ｋＤ　ＴＮＦをコードするＤＮＡ配列の制限酵素地図 を示す。パネルＢは、２６ｋＤ　ＴＮＦの疎水性プロットを示し、そしてパネル Ｃは、この分子のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。

図２は、ｃＤＮ＾ＤＮＡンのＤＮＡ配列に由来する、ヒトＰＲ−３のプロセッシ ングされてない前駆体の推定されるアミノ酸配列を示す。

図３は、ＴＮＦ転換酵素による２６ｋＤ　ＴＮＦの転換を示す。レーン＾、Ｂ、 およびＣは種々のコントロールを示す：　ＴＮＦ　６．８細胞溶解液（＾）コン トロール、２６ｋＤ転写／翻訳（Ｂ）コントロール、およびインキュベーション （Ｃ）コントロール。レーンＤＳ　Ｅ、およびＦは、転写／翻訳生成２６ｋＤ　 ＴＮＦの、ＨＬ６０　Ｓ−１細胞質ゾル非誘導（Ｄ）および誘導（Ｅ）画分、ま たは誘導細胞から調製したｐ−ｔペレット画分のいずれかに存在する転換酵素に よる、１７ｋＤ　ＴＮＦへの優先的な転換を示す。Ｇはブランクレーンである。

図４は、ゲル電気泳動により測定されるように、２６ｋＤ　ＴＮＦの、その低分 子量形態への転換における転換酵素インヒビターの影響を示す。パネル１のレー ンＡ、　Ｂ、　Ｃ１およびＤは、それぞれ、ｐＦＶＸＭ−ＴＮＦ６　トランスフ ェクト細胞系ＴＮＦ　６．８（Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、１９８８、Ｃｅ１ｌ２．５ ３：４５）の細胞溶解液の免疫沈降、インビトロ転写／Ｉｌｌ！訳２６ｋＤ　Ｔ ＮＦの免疫沈降、（１−（（３（（アセチルオキシル）−７−メドキシー訃オキ シー８−オキソ−５−チオ−１−アザビシクロ［４，２，Ｏ］］オクトー２−エ ンー２−イルカルボニル）モルホリン、Ｓ。

Ｓ−ジオキシド、（６Ｒ−シス）の２６ｋＤ　ＴＮＦの転換における影響、およ び（１−（（３（（アセチルオキシル）−７−メドキシー８−オキシ−８−オキ ソ−５−チオー■−アザビシクロ［４，２，０］オクト−２−エン−２−イル） カルボニル）モルホリン、Ｓ、Ｓ−ジオキシド、（６Ｒ−シス）非存在下での２ ６ｋＤ　ＴＮＦの転換に関する影響を示す。パネル２のレーンＡおよびＢは、そ れぞれ、ｐＦＶＸＭ−ＴＮＦ６　トランスフェクト細胞系ＴＮＦ　６．８（Ｋｒ ｉｅｇｌｅｒら、１９８８、ｑす１．５３：４５）の細胞溶解液の免疫沈降、お よびインビトロ転写／翻訳２６ｋＤ　ＴＮＦの免疫沈降を示す。レーンＣおよび Ｄは、それぞれ、３．４ジクロロ−イソクマリンの存在下および非存在下の２６ ｋＤ　ＴＮＦの転換を示す。レーンＥおよびＦは、それぞれ、エラスチナールの 存在下および非存在下の２６ｋＤ　ＴＮＦの転換を示す。

図５は、２６ｋＤ　ＴＮＦに関する別のゲル電気泳動アッセイを示し、種々のセ リンプロテアーゼヒンヒビターによる、ＨＬ−６０細胞由来の精製ヒトＰＲ−３ の阻害を表す。

図６Ａは、２６ｋＤ　ＴＮＦに関する精製ヒト好中球ＰＲ３活性のゲル電気泳動 分析を示し、存在し得るセリンプａテア−ゼインヒビターの特異な阻害活性を示 す。

図６Ｂは、同じ化合物を試験する比色アッセイを用いて得られた類似の結果を示 す。

図７は、ＬＰＳの致死的注入の前に行ったＴＮＦ転換酵素インヒビターを用いる マウスの予防処置の影響を示す：循環血清ＴＮＦレベルは減少する。

図８は、ＬＰＳの致死的注入の前に行ったＴＮＦ転換酵素インヒビターを用いる マウスの予防処置の影響を示す：生存が延長される。

髪■迎」１順【斑■ 定１ 出願人の発明の特徴および範囲の理解を容易にするために、本発明の種々の局面 に関するいくつかの定義を以下に述べる。

しかし、これらの定義は本来一般的であり、そして定義内に包含される意味は当 業者に周知であることが理解され得る。

本明細書で定義される用語「敗血症」は、ダラム陽性またはグラム陰性細菌の感 染から生じる疾患を意味し、後者は主として細菌性エンドトキシン、リポ多糖（ ＬＰＳ）に起因する。それは、少なくとも６つの主要なグラム陰性桿菌Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ阻胆紅凹ｎ、　Ｅｓｈｅ亘ｃｈｉａ　ｃｏＬｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ 、　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、　Ｅｎｔｒ虹αｒａｃｔｅｒおよび５ｅｒｒａｔｉ ａにより誘導され得る。

用語「プロホルモン」および「成熟」ホルモンは以下の意味を有する。「プロホ ルモン」は、ホルモンの「成熟」形態のインビボ産生の間に除去されるペプチド セグメントを含むタンパク質を含むよう意図される。好適には、これらは少なく とも部分的にはＴ細胞またはマクロファージのような免疫系の細胞により産生さ れるタンパク質である。本発明の好適な実施態様は、２１１ｉｋＤ　ＴＮＦプロ ホルモン、すなわち以下に詳細に議論される「プロＴＮＦＪである。プロＴＮＦ は主に１７ｋＤの成熟形態に切断され、好適には「成熟ＴＮＦＪのＮ末端配列、 Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−３ｅｒを有する。しかし、「成熟ＴＮＦＪはプロホル モンから形成される他の切断産物もまた含むよう意図される。これらの切断産物 は、成熟ＴＮＦの１７ｋＤ形態の生物学的特徴を保持し得、そしてプロＴＮＦの 先欠け（即ち切断された）形態であり、ここで、支菫フ上ＪＩＮ末端７６アミノ 酸リーダー配列は除去されている。

本明細書で使用されるように、［プロＴＮＦＪは、ＴＮＦ−ａのプロホルモン形 態である、約２６．０００の分子量を有するＴＮＦをいう（図１のクローン化配 列参照）。プロホルモンのプロペプチドセグメントはそこから由来する種に依存 して長さが異なるが、このセグメントのアミノ酸配列は高度に保存されている。

実際、マウスにおいては、プロホルモンの推定リーダー配列をつくる７９アミノ 酸の約８６％が、ヒトＴＮＦの推定リーダーを構成する７６の既知アミノ酸と同 一である。従って、プｏ　ＴＮＦに対する参照を行なうとき、この分子は、当該 分野で知られるヒト配列に比較してゎずかしか変わらないリーダー配列を有し得 るために、任意の特定の種に由来し得ることが意図され得ることが当業者により 理解され得る。

本明細書で使用されるように、用語「転換酵素（ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）Ｊまた はｒ　ＴＮＦ転換酵素」は、２６ｋＤ　ＴＮＦを、ＴＮＦバイオアッセイで三量 体形態におけるＴＮＦ生物学的活性を有する成熟ＴＮＦに切断し得る動物中に、 通常、存在する１つまたはそれ以上の酵素をいう。非刺激細胞において、転換酵 素は、幾らかの活性は細胞質ゾル中に位置するが、実質的に膜からなる画分中に 大部分回収される。ＴＮＦ転換酵素は、通常、ＴＮＦを産生ずる細胞に伴う。１ つのＴＮＦ転換酵素は、現在、ｒＰＲ〜３」、「Ｐ−２９ＢＪ、または［ミニロ ブラスチン（＋＋＋ｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｎ）Ｊとも呼ばれるセリンプロテアー ゼ「プロテアーゼー３」であることが知られている。

ＴＮＦ転換酵素に適用される語句「膜結合性」は、３０．０ＯＯＸ　ｇペレット 画分中の多量の転換酵素活性の存在により示されるように、実質的に不溶性の形 態で最初に単離される転換酵素の形態を示す。しかし、いくつかのＴＮＦ転換酵 素は、好中球顆粒から単離されるとき可溶性である。

用語「組換え抗体」は、重鎮および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部分が、 特定の種に由来するまたは特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同で あるが、これら鎖の残りのセグメントは他における対応する配列に相同である抗 体をいう。最も一般的には、組換え抗体において、軽鎖および重鎮両者の可変領 域は、哺乳類の１つの種に由来する抗体の可変領域をコピーし、定常領域は他の 種に由来する抗体中の配列に相同である。１つの例は、マウス抗体の定常領域が ヒト定常領域で置き換えられた「ヒト化」マウス抗体である。

その最も一般的な形態において、本願発明は、成熟ホルモンのそのプロホルモン 形態からの産生に伴う疾患のインヒビターを同定するための方法および組成物に 関する。プロホルモンの好適な実施態様は２６ｋＤ　ＴＮＦであり、次いでそれ は、好適には１７ｋＤ、低分子量「成熟」形態に切断される。それは、その多量 体（通常三量体）形態で、生命を脅かす、敗血症に伴う生理学的変化の生成に実 質的に関与する。従って、２６ｋＤ　ＴＮＦの成熟形態への転換を妨害し得る分 子は、敗血症の予防または治療に有用である。

本明細書に記載されるアッセイは、プロホルモンのその成熟ホルモン形態への転 換を検出し、好適な実施態様では、ＴＮＦの２６ｋＤ分子量形態の、好適には、 １７．０００分子量形態への酵素的転換である。この転換に対応する酵素はｒ　 ＴＮＦ転換酵素」と呼ばれる。従って、本発明は４部分に分けて最も容易に与え られる。第１部は、ＴＮＦの２６ｋＤ形態であるプロＴＮＦを実現するための材 料および方法を示す。第２部は、ＴＮＦ−転換酵素の供給源、およびこの酵素を 精製するための方法を同定する。第３部は、種々の転換酵素インヒビターの同定 を記載する。最後に、本発明の第４部は、敗血症または他の疾患にかかった患者 を治療するために、インヒビターを用いる方法の記述が与えられる。これらセク ションの各々は、別々に記載される。

いくつかの特許／特許出願および科学的文献を以下に参照する。本願発明は、こ れら参考において示されたいくつかの材料および方法について引用し、そしてそ れ故、すべての参考が、その全体において、参考として援用されている。

１．２６ｋＤ　ＴＮＦ 本発明のＴＮＦおよびプロＴＮＦは、当該分野で公知の方法により、天然、合成 または組換え形態で得られ得る。以下に述べる組換え系は、２６ｋＤプロＴＮＦ をかなりの量で与え、そしてＴＮＦインヒビターに対するアッセイ手順を容易に するが、非組換え系もまた使用され得ることが理解され得る。例えば、２６ｋＤ 分子が刺激された単球で同定され得ることが示されている。

Ｘｒｉｅｇｌｅｒら、１９８８、Ｃｅ１ｌ、　５３：４５．従って、適切なアッ セイ手順は、単球を刺激して２６ｋＤプロＴＮＦ分子を生成し、そして次いで転 換酵素による作用の結果として２６ｋＤ分子の消失を測定することである。好適 には、１７．０００分子量の成熟ＴＮＦが生成される。この２６ｋＤプロＴＮＦ は、転換酵素により、１つまたはそれ以上の内部部位で切断されて［成熟ＴＮＦ Ｊを生成する。主要部位は、リーダー配列からＴＮＦの分泌形態（１７ｋＤ種） を分離する結合部にある。この結合部の配列は、Ｇｌｎ−＾１ａ−Ｖａｌ−＾ｒ ｇ−５ｅｒ−３ｅｒ−である。バリンが１７ｋＤ分子（主要な成熟形態）のアミ ノ末端アミノ酸であることが知られているので、主要な切断部位はアラニンとバ リンとの間にある。ＴＮＦの他のいくっがの他の種は転換酵素により生成され得 、そしてこれらは、マイナ一または二次的切断部位の産物である：例えば、上記 配列におけるＶａｌとＡｒｇとの間、またはアミノ酸配列中の＋１２および＋１ ３に位置するＰｒｏとＶａｌとの間。本明細書で記載されるアッセイは、２６ｋ ＤプロＴＮＦ種の転換の阻害、またはその切断部位にかかわることのない成熟Ｔ ＮＦ形態の出現をモニターし得る。

プロＴＮＦ形態および成熟ＴＮＦ形態がクローン化され、そして多くの系で発現 されている。例えば、ウサギＴＮＦのクローニングが、１９８５年６月２６日に 公開された欧州特許第１４６．０２６号（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ　Ｐｈａｒｍａｃ ｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｌｔｄ）、および１９８５年７月１７日に公開された 欧州特許第１４８．３１１号（Ａｓａｈｉ　Ｋａｓｅｉ　Ｋｏｇｙｏ　Ｋａｂｕ ｓｈｉｋｉ　Ｋａｉｓｈａ）に開示されている。１５１および１５５アミノ酸（ 天然の成熟形態より２および６少ない）を有するヒトＴＮＦのクローニングが１ ９８５年９月２５日に公開さ′れた欧州特許第１５５．５４９号（Ｄａｉｎｉｐ ｐｏｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｌｔｄ）に開示され、そして １５５アミノ酸を有するヒｌ−ＴＮＦが１９８５年ｌＯ月１６日に公開された欧 州特許第１５８、２８６号（Ａｓａｈｉ　Ｋａｓｅｉ　Ｋｏｇｙｏ　Ｋａｂｕｓ ｈｉｋｉ　Ｋａｉｓｈａ）および対応する１９８５年１１月２０日に公開された ＧＢ　１．１５８．８２９Ａに開示されている。成熟ＴＮＦ（１５７アミノ酸） およびその種々の改変形態（変異タンパク質）のクローニングが１９８６年１月 １５日に公開された欧州特許第１６８．２１４号（Ｇｅｎｅｎ　ｔｅｃｈ　）お よび１９８５年１０月３日１．：出ｊｉ［すれたＰＣＴ　ＵＳ　８５１０１９２ １（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に開示されテいる。

さらに、米国特許第４．６７７、０６３号および第４．６７７、０６４号は、Ｔ ＮＦの２６．０００および１７．０００形態、およびこれら分子の変異タンパク 質をコードするｃＤＮＡ配列を示す。

２６ｋＤ　ＴＮＦ種をコードするｃＤＮ＾配列は、好適には、本出願人が共に所 有する共に係属中の出願、１９８４年１１月９日に出願された米国特許出願第６ ７０．３６０号；ならびに米国特許第４．６７７、０６３号および第４．６７７ 、０６４号に記載されるプラスミドｐＢ１１から得られる。このプラスミドｐＢ ｌｌはＴＮＦコード配列に作動可能に連結するＳＶ４０プロモーターを含み、そ してそれ故、真核宿主細胞での２６ｋＤ　ＴＮＦ種の発現に有用である。さらに 、２６ｋＤ　ＴＮＦ種をコードする完全配列を含む第２のプラスミドが上記の米 国特許出願および米国特許中に記載されている。それはｐＥ４と呼ばれる。この プラスミドｐＥ４は、アメリカンタイプカルチャーコレクション、受託番号第３ ９８９４号で寄託されている。

２６ｋＤ　ＴＮＦ種をコードするｃＤＮＡ配列は、プラスミドｐＢｌｌ中にＰｓ ｔｌ断片として存在する。従って、それは容易に除去され、そして多くの適切な 発現系の任意の１つに挿入される。好適な発現系はプラスミドｐＦＶＸＭであり 、それは共に係属中の、Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｒｉｖｅｒｙ　Ｓ ｙｓｔｅｍと題する、米国特許出願第８５５、８６５号、発明者Ｋｒｉｅｇｌｅ ｒら（１９９０年８月２２日に出願された米国特許出願第５７１．０１７号のた めに放棄された）に記載されている。ｐＦＶＸＭはアメリンカンタイブカルチャ ーコレクションに寄託され、そして受託番号第６７、１０３号を有する。ｐＦＶ ＸＭは、Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、１９８４、Ｃｅ１ｌ、３８：４８３に記載される プラスミドｐＥＶＸｌ：由来したレトロウィルスベクターである。ｐＥＶＸは、 Ｍｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス由来のスプライス供与部位の３′がら５° の長い末端繰り返しを有する。このスプライス供与配列は、レトロウィルス構築 物の、正確にスプライスされた翻訳テンプレートの収率を低下させることが前に 示された。従って、ｐＥｖｘをスプライス供与部位を除去するように作製し、そ してＨａｒｖｅｙネズミ肉腫ウィルスゲノムの類似のＳｍａ　Ｉ断片で置き換え た。Ｈａｒｖｅｙネズミ肉腫ウィルスゲノムは、Ｍｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウ イルスのスプライス供与配列を欠く。得られたベクター、ｐＦＶＸＭは、Ｍｏ１ ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスのスプライス供与配列を欠き、ウィルスパッケー ジング化配列を有する。ｐＦＶＸＭは、２６ｋＤ　ＴＮＦ種をコードするＤＮＡ 配列を挿入し得る、便利なＰｓｔ１部位を有する。

＋＋、ハ組議ＩＪ ＴＮＦ転換酵素活性は、１つまたはそれ以上の酵素タンパク質分解作用から生じ る。種々の生物学的材料がＴＮＦ転換酵素活性の供給源として利用可能である。

これらは、好適には、しかし必ずしも必要ではないが、免疫学的起源の、組織、 細胞、または抽出物、もしくはそれらと関連する液体を包含する。

さらに、確立細胞系もまた利用され得る。−適切な供給源は、白血球または白血 球起源の細胞系、好適には、マクロファージおよび単球、のようなヒト末梢血単 核細胞を包含し得る。

好中球はＴＮＦ転換酵素の特に有用な供給源である。確立細胞系を操作する容易 さから、ＴＮＦ転換酵素の１つの好適な供給源はＦＩＬ６０である。

従って、２６ｋＤプロＴＮＦ種の成熟ＴＮＦへの転換は、２６ｋＤ種と、無傷Ｈ Ｌ６０細胞、それに由来する抽出物、またはＨＬ６０細胞が生育しそしてそれ故 ＴＮＦ転換酵素活性を含む培地のいずれかとの組合わせにより影響され得る。特 定の細胞型では、ＴＮＦ転換酵素活性が適切な刺激の後培養培地中に存在してお り、それは以下でさらに論議される。さらに、ＴＮＦ転換酵素活性は、特定の条 件下で部分的に膜結合性であるので、利用され得る膜画分を得ることが可能であ る。

単球を単離する手順は、ＨＬ６０のような細胞系を培養する他の方法のように、 当該分野で周知である。要約すれば、単球は、最初に、標準法を用いるＦｉｃｏ ｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅおよびＰｅｒｃｏｌｌ（４９，２％）を介する遠心分離に より末梢血から調製され得る。これにより単球およびリンパ球の濃縮集団が得ら れ、そして単球は細胞の混合物を組織培養皿にブレーティングしそして単球がこ の皿の表面に付着できるのに充分な時間細胞をインキュベートすることによりさ らに濃縮され得る。次いでリンパ球を皿から洗い落とし、主に付着単球が残され る。これら細胞は、次いで、そのまま用いられ得るか、または既知の単球アクテ ィベーター、好適にはリポ多糖およびホルボールミリスタートアセタート、を用 いて、高レベルのＴＮＦ転換酵素を生成するように刺激され得る。細胞は分画さ れ得、そしてそこから抽出物画分または膜画分のいずれかが調製され得、以下に 述べるアッセイで使用され得る。

ＴＮＦ転換酵素をＨＬ６０培養の１２リツトルから、細胞膜両分を単離し、０． ５％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０界面活性剤中にそれを可溶化し、この溶液をアニ オン交換クロマトグラフィー、カチオン交換−ＨＰＬＣ，アニオン交換−ＦＩＰ ＬＣ，および逆相ｔｌＰＬｃにかけることにより単離し、２０　ｆｆ１ｇのｔ、 ｏｏｏ倍精製されたＴＮＦ転換酵素を得、これは１８％の収率で約３２０単位に 相当する。転換酵素は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析（銀染色）により、約２９−３０ ｋＤの分子量を有することが見い出された。この転換酵素は配列決定され、そし て−次アミノ酸は、実験誤差の範囲内で、既知の好中球プロテアーゼ、ＰＲ−３ の成熟Ｎ末端配列（Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉら、１９９０、Ｌム１１弓、、１７２ ：１７０９−１７１５）と同一であることが見い出された。精製された転換酵素 は、２６ｋＤプロＴＮＦを１７ｋＤ成熟形態に切断することが示された。

以下により充分記載されるようにＰＲ−３のアミノ酸配列は、図２に示されるｃ ＤＮ＾クローンの配列から推定されるように、解明された。ＰＲ−３は、当該分 野でＴＮＦプロセッシングとは関係しない活性を有するプロテアーゼとして知ら れている。それは、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン 、およびＩＶ型コラーゲンを分解する、ヒト多形核白血球セリンプロテアーゼと して分類されているＨ　Ｒａｏら、１９旧、ＬＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６６： ９５４０−９５４８参照。５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析により、精製ＰＲ−３は、２６ ．８ｋＤの主要バンドと、おそらく別のグリコジル化種を示す、わずかに大きい 分子量を有する２つの小さいバンドとを有することが報告されている。Ｒａｏら 、前出、参照。ＰＲ−３は、エラスターゼ、カテプシンＧ１　マウスのグランチ ームＢ、ラット肥満細胞プロテアーゼＨ、ヒトリンパ球プロテアーゼ、およびキ モトリプシンのような他のセリンプロテアーゼニ構造的ニ類似である；　Ｃａｎ ｐａｎｅｌｌｉら、１９９０、ム」」Ｅｌｌユ１７２　：　１７０９−１７１５ 参照。ＰＲ−３は、ａｘ−？クログロブリン、７　エールメチル−スルホニルフ ルオライド（ＰＭＳＦ）、およびａ＋抗トリプシンによって阻害される。放射標 識された２６ｋＤ　ＴＮＦのＰＲ−３消化産物の配列決定により、切断はＮ末端 ＾ｒｇ−８ｅｒ−３ｅｒ配列（アミノ酸２−４）、またはＶａｌ−Ａｌａ−Ｈｉ ｓ配列（アミノ酸１３１５）を生成するように生じ得るが、ＰＲ−３はプロＴＮ Ｆを切断してＮ末端Ｖａｌ−＾ｒｇ−３ｅｒ配列（１７ｋＤの成熟形態のアミノ 酸１−３）を生成する傾向があることが示された。Ｒａｏら、上述、は、ＰＲ− ３は、基質切断部位において小さな脂肪族アミノ酸を好むことを報告している。

エラスターゼ、カテプシンＧ、およびプラスミンのようなセリンプロテアーゼは 、２６ｋＤプロＴＮＦを１７ｋＤ成熟形態へ効果的に転換しない。

ＰＲ−３はまた、好中球から単離され得る。好中球をヒト血液から分離し、次い で、顆粒および膜を単離し、そしてこの混合物を、以下に述べるように、ＰＲ− ＨＰＬＣ上で分画する。

以下に示されるように、ＰＲ−３は、ペプチドジフェニルホスホネートインヒビ ター、エラスタ−ゼ（ｅｌａｓｔｉｎａｌ）、およびジクロロ−イソクマリン（ ＤＣりにより阻害される。ペプチドシフ　工：　／Ｌ／ホスホネートインヒビタ ーは、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐ（ＯＰｈ）２およびＢｏｃ−Ａｌａ −Ｐｒｏ−Ｖａｔ−ｐ（ＯＰｈ）　ｔを含む。Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ａｌａ ｐ（ＯＰｈ）ｔおよびＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−ｐ（ＯＰｈ） ｚもまた試験され、そしてかなり低い阻害活性を有する。ｒＢｏｃＪは、ｔｅｒ ｔ−ブチロキシカルボニルを意味し、そしてｒｐ（ＯＰｈ）ｚＪは、ジフェニル ホスホネート部分を表し、ここで式−ｃｏｏｎ基は、−Ｐ（＝０）（０−７ｘ　 ＝ル）２で置換される。０１ｅｋｓｙｓｚｙｎら、１９９１．　Ｂｉ。

ｃｈｅｒｒｌ、　、　３０　二４８５参照。他のペプチドジフェニルホスホネー ト分子がＰＲ−３を阻害し得ることが理解され得る。可能性のあるインヒビター は、０１ｅｋｓｙｓｚｙｎら、前出、で示される手順を用い、例えば、小さな脂 肪族ペプチドを用いて構築され得る。一旦可能性のあるインヒビターが作製され ると、それらは以下で示されるアッセイで試験され得る。モデリング研究により 、Ｂｏｃ−ＶａＬ−Ｐｒｏ−ｆｌｉｓ−ｐ（ＯＰｈ）ｚが有効なＰＲ−３インヒ ビターであり得ることが推定される。

１１１、ＴＮＦ　インヒビ　−一　症の　゛　たは′転換酵素活性のインヒビタ ーはまた、敗血症、および、循環ＴＮＦが関係してきた他の疾患（リウマチ様関 節炎および悪液質を含む）の治療に用いられ得る予防薬または治療薬である。

ＴＮＦ転換酵素インヒビターは、プロＴＮＦの成熟ＴＮＦへの転換を測定可能に する手順により、同定され得る。いくつかのこのようなアッセイ手順について、 本明細書中で、および以下の実施例４で説明する。適切なアッセイは、２６ｋＤ プロＴＮＦ、　ＴＮＦ転換酵素、および推定インヒビターを結合することからな る。

この阻害物質が、上記転換酵素がＴＮＦに付加される前に転換酵素に付加され得 ること、または転換酵素の付加の前にまたは付加直後にＴＮＦに付加され得るこ とは、当業者に良く理解される。付加の順序により、インヒビターの同定は促進 され得るが、決定的ではない。物質が阻害的活性を有するならば、この物質は、 溶液の電気泳動分析によって示され得る。この分析により、コントロール反応に 対し、２６ｋＤ種の量の増大、およびそれに付随して、成熟ＴＮＦ種の減少が示 される。本出願人はまた、転換酵素インヒビターを検出するための比色分析アッ セイを同定した。このアッセイは便利であり、モして２６ｋＤＴＮＦの切断に関 するオートラジオグラフアッセイと相関する。

この比色分析アッセイについては、実施例４で詳細に説明する。Ｋａｍら、１９ ９２、■弱、υヱｑ」Ｄ：１１９−１２３も参照。

抗転換酵素活性を有する他の化合物には、抗転換酵素抗体（ポリクローナルまた はモノクローナルのいずれか、あるし）は組換え抗体）が包含される。好ましく は、これらの抗体１よ、ヒト型抗体である。上記転換酵素に対するモノクローナ ル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ、　Ｇ、およびＭｉ　１ｓｔｅｉｎ、　Ｃ，，１９７５ ，Ｎａｔｕｒｅ、　２５６：４９５に記載の一般的手順（当業分野で公知のよう に、これは長年にわたり変更されてきている）を用いて産生され得る。′これら の初期の研究には、ネズミリンパ球および薬物選択可能なプラスマ細胞腫を融合 してハイブリドーマを産生ずることが含まれていた。その後、この手法は、ヒト モノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞株を産生ずるために適用されて きた。後者の手順については、Ａｂｒａｆｆｌｓ、　Ｐ、　、　１９８６．　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ隙旺肌並釘、１２１：１０７に、一般的な記載があるが、他 の変法も当業者に公知である。ネズミまたはヒトの抗体のいずれが産生されるか に関わらず、抗体分泌細胞は、融合相手に結合され、そしてこれらの細胞は、適 切な融合剤（好ましくはポリエチレングリコール、およびさらに好ましくはポリ エチレングリコール１０００）を用いて融合される。後者の融合剤を、抗体分泌 細胞およびその融合相手を含む細胞ペレットに、穏やかに撹拌しながら短時間で 少量添加する。融合剤の添加後、この細胞混合物を洗浄して、融合剤およびいか なる細胞残渣も除去し、そして融合および未融合細胞からなる細胞混合物を、選 択性成長培地を含む適切な細胞培養チャンバー中に植え付ける。数週間後、ハイ ブリッド細胞が現れ、そして、抗体産生について同定され得、そしてサブクロー ン化されて、安定なハイブリッド細胞株を確実に入手し易くし得る。

好ましい抗体は、インビボまたはインビトロのいずれかで転換酵素を用いて感作 されたリンパ球から産生され、そして抗体産生ハイブリッド細胞株として不滅化 され得、それにより所望の抗体の更新可能な供給源を得る、ヒトモノクローナル 抗体である。インビトロでの免疫化手法は、当該分野では公知であり、一方、イ ンビトロでの免疫化手法は、Ｌｕｂｅｎ、　Ｒ。

およびＭｏｈｌｅｒ、Ｍ、、１９８０．Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｌｍ１ｕｎｏｌｏ 　、１７：６３５、Ｒｅａｄｉｎｇ、Ｃ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏ ｌｏ　、１２１．　（第１部）：１８、またはＶｏｓｓ、Ｂ、、１９８６．　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｎｏ　、１２１：２７に記載されている。多 くのインビトロ免疫系が、ヒトＢ細胞の感作に関して有効であることが示されて いる。Ｒｅａｄｉｎｇ、Ｃ，、１９８２，Ｊ、ｏｆｆ＋ｎ＋ｕｎ、　Ｍｅｔｈｏ ｄｓ、５３：２６１゜ＴＮＦ転換酵素を用いて、個体を直接免疫化する代わりに 、菌属性発作を経験中であるか、または経験したことがある個体から、リンパ球 を単離し得ることは、当業者には明らかである。例えば、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫 症を有するヒト患者は、抗ＰＲ−３抗体の天然供給源であり、そしてヒトモノク ローナル抗体の誘導のために適切なヒト細胞も含む。これらのリンパ球の画分を 、転換酵素に対して感作し、そしてこれを用いて永久抗体分泌ハイブリッド細胞 株を産生じ得る。例えば、免疫的に危険な状態のヒト患者、特に、種々の悪性疾 患、広範囲の熱傷などに苦しんでいる患者は、一般に細菌感染し易く、そして彼 らから単離されたリンパ球は、抗体分泌細胞の供給源であり得る。

感作されたリンパ球は、ウィルス形質転換により不滅化され得る。ヒトリンパ球 に対する、好ましい形質転換手法には、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスの使 用が含まれる。このウィルスは、ヒトＢ細胞を形質転換し得、そしてヒトモノク ローナル抗体を生成するために用いられている。Ｃｒａｗｆｏｒｄ、　Ｄ、ら、 １９８３゜Ｊ、ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏ　、　６４：６９７；　Ｋ ｏｚｂｏｒ、　Ｖ、およびＲｏｄｅｒ。

Ｊ、、１９８３．Ｊ、Ｉ＋ｎａ＋ｕｎ、　Ｔｏｄａ　、４ニア２゜それにより感 作されたリンパ球が不滅化され得る、他の手順は、上記の２種の手法、すなわち ウィルス形質転換および細胞融合の組み合わせからなる。好ましい組み合わせは 、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスを用いて抗体分泌細胞を形質転換し、そし てその後形質転換された細胞を適切な融合相手に融合させることからなる。融合 相手は、マウスミエローマ細胞株、ヘテロミエローマ細胞株、またはヒトミエロ ーマ細胞株、あるいは他の不滅化された細胞株であり得る。ＰＣＴ第８１１００ ９５７号；Ｓｃｈｌｏｍら、１９８０．　ｖ情恒辺シΩ、　７７　：　６８４１ 　；Ｃｒｏｃｅら、１９８０．　Ｎａｔｕｒｅ。

２８８：４８８゜好ましい融合相手は、マウス−ヒトへテロハイブリッドであり 、そしてさらに好ましいのは、Ｆ３Ｂ６と命名される細胞株である。この細胞株 は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている（寄託番号ＨＢ８７ ８５）。これは、１９８５年４月１８日に寄託された。Ｆ３Ｂ６を生成するため の手順は、欧州特許出願束１７４、２０４に記載されている。

Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス形質転換および不滅抗体分泌細胞株の産生の 使用に適用可能な手法は、Ｒｏｄｅｒ、　Ｊ、ら、１９８６．　Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　、１２１：１４０に発表されている。基本的に 、この手順は、適切な供給源、一般には感染した細胞株からＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂ ａｒｒウィルスを単離し、そして標的抗体分泌細胞を、ウィルスを含む上清に曝 露することからなる。この細胞を洗浄し、そして適切な細胞培養培地で培養する 。その後、細胞培養中に存在する、ウィルスにより形質転換された細胞は、Ｅｐ ｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス核抗原の存在により同定され得、そして形質転換 された抗体分泌細胞は、当該分野で公知の標準的な方法を用いて同定され得る。

本発明の好ましい実施態様は、中和抗ＴＮＦ転換酵素モノクローナル抗体（単独 でまたは組み合わせても）である。このような抗体は、改変され得、そしてなお 生物学的活性を保持し得ることは、当業者にとって明らかである。従って、種々 の大きさのフラグメントへの短縮により改変された抗体、例えば、Ｆ（ａｂ’） ｚ、Ｆａｂ、　Ｆｖなどは、本発明の範囲内である。抗体を産生ずるハイブリッ ド細胞株も、所望の抗体をコードするＤＮＡの供給源であると考えられ得、これ らは公知の遺伝的手法により、単離され、そして細胞に移入されて遺伝子工学的 に操作された抗体を産生じ得る。後者（ハイブリッド細胞株）の例は、本明細書 中で説明される、ハイブリドーマの抗体結合部位を有する一本鎖抗体の産生であ る。一本領抗体については、米国特許第４．７０４．６９２号に記載されている 。遺伝的に操作された抗体の第２の例は、組換え抗体またはキメラ抗体である。

組換え抗体の産生方法は、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４．８１６．５６７号 、　１９８４年８月１５日に提出された日本国特許出願第８４１６９３７０号、 　１９８４年８月２７日に提出された米国特許出願第６４４．４７３号；　１９ ８４年９月３日に提出された英国特許出願第８４２２２３８号、　１９８５年Ｉ Ｏ月２８日に提出された日本国特許出願第８５２３９５４３号、　１９８５年１ １月１日に提出された米国特許出願第７９３．９８０号、　１９８７年７月２４ 日に提出された米国特許出願第７７、５２８号に示されている。

１９８６年３月２７日に提出された英国特許出願第８６７６７９号には、少なく とも、Ｌ鎖またはＨ鎖の可変ドメインの相補的決定領域（ＣＤＲ）の部分が、異 なる特異性を有する抗体由来のＣＤＲの類似部分により置換されてきたことが記 載されている。この文献に記載されている手順を用いると、置換されるＣＤＲ領 域を有する第２の種に由来する抗体上に移植された、１つの種のＣＤＲ領域を有 する組換え抗体を構築することが可能である。この場合の好ましい実施態様は、 ヒト抗体のＣＤＲ領域を置換する、ネズミ抗転換酵素抗体ＣＤＲ領域である。

抗体に加えて、転換酵素に結合して２６ｋＤプロＴＮＦと競合する化合物が、２ ６ｋＤプロＴＮＦの成熟型への転換を阻害または低減し、そしてこのことにより 、敗血症および他の疾患を治療するための有用な薬物となり得る。１つのこのよ うなりラスの試薬は、２６ｋＤプロＴＮＦと同程度またはより良好なＴＮＦ転換 酵素との結合活性を有する、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、あるい は、合成または天然由来の他の化合物からなる。好ましいペプチドまたはタンパ ク質は、プロＴＮＦの７６アミノ酸リーダー配列と１７ｋＤ成熟型との間の接合 部に見出されるアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパ ク質である。１つのこのような配列は、Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａ ｌ−＾ｒｇ−３ｅｒ−Ｓｅｒ−８ｅｒであり、ここで、２番目のＡｌａは、切断 事象後に膜に残存しているリーダーに存在する残基であり、モしてＶａｌは、成 熟ＴＮＦのＮ末端のアミノ酸である。この配列は９個のアミノ酸からなることが 示される一方で、最小に意図されているのは、少なくとも、転換酵素に認識され るジペプチド配列＾１ａ−Ｖａｌを含むペプチドであることに留意することが重 要である。

ペプチド／タンパク質の転換酵素インヒビターの別の実施態様は、（配列番号： １）と機能的に同様のアミノ酸配列を有するインヒビターである。このペプチド は、２個のＴＮＦ転換酵素切断部位をつなぎ、そしてこれにより、１７ｋＤ成熟 ＴＮＦの形成を防止する。第１の、そして支配的な切断部位は、位置−１および ＋１のアラニンとバリンとの間である。そして第２の部位は、位置＋１および＋ ２のバリンとアルギニンとの間である。そして位置＋１２および＋１３のプロリ ンとバリンとの間である。これらの位置は、図１に示すアミノ酸配列に対応する 。

競合的インヒビターの第２の、クラスは、上記配列、すなわち（配列番号：１） を含む化合物からなるが、ここでは、一定のアミノ酸が変性または欠失されて非 切断性基質を生じる。

このペプチドの好ましい実施態様は、標準的な部位特異的変異処理手法により作 成される２６ｋＤプロＴＮＦ変異タンパク質である。最も好ましいのは、アラニ ン（−１）またはバリン（＋１）あるいはこれら両方が、置換または欠失された 変異タンパク質である。

上記ペプチドは、当該分野で周知の手法、例えば、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２： ３４１３４７（１９８５）に記載されている、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相法によ り作成され得る。この手順では、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　９５００自動ペプチドマ シンのような、市販の合成装置が用いられ得、ブロックされたアミノ酸の切断が フッ化水素によって達成され、そしてペプチドは、１Ｆａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ 　Ｐｒｅｐ　３０００装置を用いて、１５−２０　ｒｎ　Ｖｙｄａｃ　Ｃ４Ｐｒ ｅｐＰＡＫカラムでの分離用ＨＰＬＣにより精製される。

上記ペプチドのジフェニルホスホネートも、インヒビターとして使用される。有 用なペプチドは、Ｂｏｃおよびジフェニルホスホネート部分に結合され得（０１ ｅｋｓｙｓｚｙｎら、１９９１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、３０：４８５を参照）、 そして転換酵素阻害アッセイで試験され得る。好ましいペプチドは、Ｂｏａ−Ｖ ａｌ−Ｐｒｏ４ａｌ−ｐ（ＯＰｈ）２、Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−ｐ（ ＯＰｈ）ｚ、およびＢｏａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ｐ（ＯＰｈ）２である。

しかし、他のペプチドジフェニルホスホネートもまた、以下に記載の阻害アッセ イにおいて用いられ、さらなるＴＮＦ転換酵素インヒビターを同定し得る。この 例は以下に開示され、そして０１ｅｋｓｙｓｚｙｎら、１９９１．　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　、　３０：４８５に示されている。

同定されたＴＮＦ転換酵素ＰＲ−３の特異性は、エラスターゼのような酵素と類 似している。代表的には、バリン、プロリンおよびアラニン残基間のような、中 性に荷電した特定のアミノ酸の後で直ちに切断する。このように、上記のペプチ ドインヒビターの他に、エラスターゼを阻害することが知られている種々の他の インヒビターも、一般に、２６ｋＤプロＴＮＦを切断する酵素を阻害し得る。Ｔ ＮＦ転換酵素を阻害するこれらの化合物は、以下に記載のアッセイを用いて同定 され得る。種々のエラスターゼインヒビターは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎ ｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓのような供給業者から入手可能であり、 当該分野で公知である。Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９８６．　Ｎａｔｕｒｅ、　３２ ２　：１９２　；米国特許第４，７１１、８８６号；同第４．７９７．３９６号 ；同第４．７１７．７２２号；および同４，６９９、９０４号。好ましいエラス ターゼインヒビターは、上記Ｄｏｈｅｒｔｙらによって示されているような、改 変セファロスポリン抗生物質である。さらに好ましいのは、（１−（３−（アセ チロキシル）−７−メトキシ−８オキシ−８−オキソ−５−チオ−１−アザビシ クロ［４゜２．０］オクト−２−エン−２−イル）カルボニル）モルフォリン、 Ｓ、Ｓジオキシド、（６Ｒ−シス）である。５ｔｅｔｌｅｒら、１９８６．　Ｎ ｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１４ニア８８３は、好中性エラ スターゼインヒビターについてコードするｃＤＮＡクローンを記載している。し かし、好ましいインヒビターは、エラスターゼよりも効果的にＰＲ−３を阻害す るインヒビターである。なぜなら、エラスターゼ活性は、例えば、循環ＴＮＦを 分解すること、またはそのかわりに循環ＴＮＦを阻害する、可溶性ＴＮＦレセプ ターを放出することにより、敗血性ショックの回復を補助するからである。（５ ｃｕｄｅｒｉ、　１９９１．Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ｆｖ＋ｕｎｏｌｏ　、１３５： ２９９−３１３を参照）。

さらに、非常に相同性の高いエラスターゼ分子についての既知の構造を適用する ことにより、ＰＲ３の結晶構造をモデル化することによって、インヒビターが見 出され得る。当該分野で既知のコンピュータモデルを用いて、ＰＲ−３の基質結 合部位での重要な接触点を確立し得る。可能性のあるインヒビターが、この情報 に基づいて設計され得、次いで本発明のアッセイシステムおよび敗血性ショック に関する関連動物モデルで試験され得る。

組換え手法を用いることにより、本明細書中で説明される、インヒビター、プロ ＴＮＦ、成熟ＴＮＦまたはＴＮＦ転換酵素を得ることができる。本明細書中で説 明される、細胞を形質転換し、ベクターを構築し、メツセンジャーＲＮＡを抽出 することなどに用いられ得る組換え手法のほとんどは、バイオテクノロジーの分 野で広〈実施されており、そしてほとんどの実施者は、用いられる標準的な物質 および方法を熟知している。しかし、便宜上、指針として以下に記す。

Ａ、−・　ローニン　゛ 所望ＴＮＦのコード配列を含む、適切なベクターの構築には、当該分野でよく理 解されている、標準的な連結・制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）手法が用い られる。単離されたベクター、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドを切 断し、ティリングし、そして所望の形態に再連結する。

部位特異的ＤＮＡ切断は、当該分野で一般に理解されている条件および市販の制 限酵素の製造業者により明記されている条件下で、適切な制限酵素を用いて処理 することにより行われる。例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓの 製品カタログを参照。一般に、約ｌμｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列を、約２ ０μｌの緩衝溶液中の酵素１ユニツトにより切断する。本明細書中の実施例では 、代表的に、過剰の制限酵素を用いて、ＤＮＡ基質の完全な消化を確実に行う。

約３７°Ｃで約１〜２時間インキュベーションを行い得るが、その変法は許容さ れ得る。各インキュベーション後、タンパク質は、フェノール／クロロホルムを 用いた抽出により除去され、そしてエーテル抽出され得、そしてエタノールを用 いた沈澱およびそれに続くセファデックスＧ−５０スピンカラムを用いるクロマ トグラフィーにより、水性画分から核酸を回収し得る。必要に応じて、切断した フラグメントのサイズ分離を、標準的な手法を用いるポリアクリルアミドゲルま たはアガロースゲル電気泳動により行い得る。゛サイズ分離の一般的説明は、ｋ 帥閥１士Ｕ泣症胆匡■、　１９８０．旦５：４９９−５６０に見出される。制限 酵素切断されたフラグメントは、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴ Ｐ）の存在下で、２０〜２５°Ｃで約１５−２５分、トリス５０＋ｎ１ｌＩ、　 ｐＨ７，６、ＮａＣ１５０ｒ＋Ｌ　１１ｇＣ１、６＋ｎＬ　ＤＴＴ　６　ａ＋Ｍ 、およびｄＮＴＰ　１０ｍＭを用いて、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフ ラグメント、すなわち、フレノウフラグメントを用いて処理することにより平滑 末端化され得る。

Ｋｌｅｎｏｖフラグメントを用いた処理の後、混合物をフェノール／クロロホル ムを用いて抽出し、そしてエタノール沈澱させる。Ｓｔヌクレアーゼを用いる適 切な条件下での処理の結果、一本鎖部分の加水分解が起こる。

連結は、以下の標準的条件および温度で、１５〜３０μｌ容量で行われるニドリ ス塩酸２０ｍＭ、　ｐＨ７，５、ＭｇＣ１ｚ　１０ｍＭ、　ＤＴＴ　ｌＯ＋ｎＭ 、　ＢＳＡ　３３μｇ／＋ｎｌ、ＮａＣ１ｌＯ＋ｎト５ｆ）＋ｎＭ、および＾Ｔ Ｐ　１ｎ＋Ｍ、ｒ付着末端」連結または「平滑末端」連結のための４°ＣでのＴ ４ＤＮＡリカーゼ０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニ２．ト　分子間「付着末端 」連結は、通常、総ＤＮＡ濃度３３〜１００μｇ／＋ｎｌで行われる。平滑連結 では、末端の総ＤＮＡ濃度は、約１μＭである。

「ベクターフラグメント」を用いるベクター構築では、５′ホスフエートを除去 し、そしてベクターの自己連結を妨げるために、通常、ベクターフラグメントを 細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理する。ＢＡＰ消化は、ｐＨ８、 トリス約１５０１中で、６０°Ｃで約１時間、Ｎａ”およびＭ　ｇ　＋２の存在 下でベクター１μｇあたりＢＡＰ約１ユニットを用いて行う。調製物をフェノー ル／クロロホルムを用いて抽出し、続いてエタノール沈澱を行うことにより、核 酸フラグメントを回収する。ある０は、所望しないフラグメントを追加の制限酵 素で切断することにより、二重切断されたベクターでの再連結は防止され１辱る 。

以下に記載する構築では、最初に適切な大腸菌株を連結混合物で形質転換するこ とにより、正確な連結が確実に行われる。当該分野で理解されているように、ア ンピシリン、テトラサイクリンまたは他の抗生物質に対する抵抗性により、ある いはプラスミド構築の態様に応じた他のマーカーを用（することにより、成功し た形質転換株を選択する。ミニプレ・ノブ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮ八へま、Ｉ ｓｈ−Ｈｏｖｏｗｉｃｚら、１９８１．　Ｎｕｃｌ＋■ｃ　Ａｃ１ｄｓ　ＲｅＳ 、、　９：２９８９の方法により形質転換株から調製され得、そして制限酵素処 理によって分析され、そして／または、Ｍｅｓｓｉｎｇら、１９８１、Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−、９：３０９によりさらに記載されているように 、Ｓａｎｇｅｒら、１９７７　、５、７４：５４６３のジデオキシ法により、ま たは、Ｍａｘａｍら、１９８０．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｆｆ１ｏｌ ｏ　。

６５：４９９の方法により、配列決定され得る。

１１３でのクローニングに用いられる宿主株は、大腸菌Ｋ１２株系ＤＧ９８のよ うな、ファージ感染を受けやすい大腸菌株からなる。ＤＧ９８株は、１９８４年 ７月１３日にＡＴＣＣに寄託され、その寄託番号は１９６５である。

用いられる宿主細胞に依存して、形質転換は、このような細胞にとって適切な標 準的手法を用いて行われる。Ｃｏｈｅｎ、１９７２、ヒ尤胆（ト）υ、　６９： ２１１０に記載されているような、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、ま たはＭａｎｉａｔｉｓら、１９８４゜ｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａｌＪ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、第２５４頁に記載されているＲｂＣ１ｚ法が、原核生物に 対して用いられ得る。トランスフェクションも、Ｇｒａｈａｆｆｌら、１９７３ ．　ｂ工ｄ旦■、５２：４５６またはｆｉｇｌｅｒら、１９７８．　Ｃｅ１１． 、　ｉ４ニア２５のリン酸カルシウム沈澱手法の変法を用いて達成され得る。

ｈｅ＋ｎ、　Ｓｏｃ、、１０３：３１８５のトリエステル法により、または市販 の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いることにより調製される。アニーリン グの前の、または標識のための一本鎖のキナーゼ処理は、過剰のキナーゼ、例え ば、トリス５０Ｉ［１Ｍ５ｐＨ７゜６、ＭｇＣ１ｚ　ｌｏｎ＋Ｍ１　ジチオトレ イトール５ｏＭ、＾ＴＰＩ　〜２１１１Ｍ、　７”Ｐ−ＡＴＰ　１．７ｐｍｏ１ （２，９ｍＣ１／ＩＩ１ｍｏｌ）、スペルミジン０．１ｍＷ、　ＥＤＴＡＯ，ｂ ＋Ｍの存在下で、基質０．　ｉｎｍｏｌに対し、ポリヌクレオチドキナーゼ約Ｉ Ｏユニットを用いて達成される。

Ｃ０支ｌ透１ 変異誘発は、当該分野で公知の多くの手順のいかなるものによっても行われ得る 。これらの手法は、Ｓｍ１ｔｈ、　１９８５．　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　 ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１９：４２３に記載されており、そしてこれらの手 法のいくつかの変法が、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　。

１５４、第８部、ＷｕおよびＧｒｏｓｓ＋ｎａｎ編、（１９８７）、第１７．１ ８．１９、および２０章に記載されている。好ましい手順は、ギャップ二重鎖部 位特異的（ｇａｐｐｅｄ−ｄｕｐｌｅｘ　５ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）変異誘 発法の変法である。一般的手順は、Ｋｒａｍｅｒら、上記Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　ＥｎｚＬ匣旦訂の第１７章に記載されている。

従来のＭ１３変異変異性には、変異誘発されるべき、クローン化された標的コー ド配列を有する一本鎖ＤＮＡ　ＤＮＡに、短い合成オリゴヌクレオチドをアニー リングすることが含まれる。このオリゴヌクレオチドは、標的配列に対してほと んど相補的であるが、完全に相補的ではなく、そして少なくとも１つのミスマツ チしたヌクレオチドを有する。アニーリング反応後、−重鎖ＤＮＡの残余部分を フィルインして、変異体の発現を可能とする適切な宿主細胞の中にトランスフェ クトされ得る、ヘテロ二本鎖ＤＮＡを与えなければならない。−重鎖Ｍ１３　Ｄ ＮＡの標的領域および残り部分のいずれもが曝露される従来の方法とは異なり、 ギヤツブ二重鎮法では、標的領域のみが曝露される、部分的なりＮＡ二本鎖が構 築される。従来の方法と同様に、短いオリゴヌクレオチドは、標的領域にアニー リングされ、そして伸長および連結されてヘテロ二本鎖を生成する。しかし、ギ ヤツブ二重鎮法では、小さい一本鎖ＤＮＡしか、ハイブリダイゼーションのため に利用できないため、オリゴヌクレオチドは、Ｍ１３ゲノム内の所望されない部 位にはアニーリングしない。さらに、この方法は、ヘテロ二本鎖の形成の間のエ ラー導入がより少ないという、他の利点を有する。なぜなら、標的領域のどちら か一方側のＤＮＡの非常に狭い領域のみがフィルインされるはずだからである。

さらに特異的には、ギヤツブ二重鎮法には、例えば停止コドンアンバー変異体の ような、選択可能なマーカーを運ぶ適切なＭ１３ファージの中に、標的ＤＮＡ配 列をクローニングすることが含まれる。後者（停止コドンアンバー変異体）は、 変異効果を抑制し得ない宿主細胞においては、負の選択を可能とする。好ましく は、このファージは、不安定なファージ遺伝子中に２個のアンバーコドンを含む Ｍ１３ｍｐ９である。このように、２６ｋＤ　ＴＮＦをコードする配列をＭ１３ ｕ＋ｐ９アンバー十にクローニングし、そしてそれらから、標準的手法を用いて 、−重鎖ＤＮＡを調製する。次いで、アンバーコドンの欠失した、遺伝的に操作 されたＭ１３誘導体である、Ｍ１３　ＧＡＰから二本鎖複製ＤＮＡを、数匹１ｒ 制限酵素を用いて切断する。５ｌ１３　ＧＡＰの塩基配列は、Ｍ１３ｍｐ１８と 同様であり、アンバーコドンおよび塩基対６１７２と６３２３との間の配列が欠 失している。この欠失は、Ｍ１３ｎｑｐ系のマルチプルクローニング部位の側面 に位置し、そして唯一のＨｉｎｃｒ１部位を形成する。標準的なりＮＡ／ＤＮＡ ハイブリダイゼーション手法を用いて、ギャップ二重鎖ＤＮＡが形成され、これ はアンバーコドンを有する一本鎖ＤＮＡならびにアンバーコドンおよびＴＮＦコ ード配列の両方が欠失している、ＦＩｉｎｃ［Ｉ切断Ｍ１３　ＧＡＰから得た二 本鎖ＤＮＡからなる。従って、曝露されるギャップ二重鎖の唯一の部分は、２６ ｋＤ　ＴＮＦ標的配列である。所望のオリゴヌクレオチドを、上記ギャップ二重 鎖ＤＮＡにアニーリングし、そして残存ギャップはＤＮＡポリメラーゼを用いて フィルインし、そしてＤＮＡリガーゼを用いてニックをシールして、ヘテロ二本 鎖を生成する。後者を、好ましくは、ミスマツチ修復能欠損宿主にトランスフェ クトし、生成したファージを混合する。

混合されたファージ個体群から、未変異２６ｋＤ　ＴＮＦ　ＤＮＡ　（これもア ンバー変異を有する）を運搬するファージを選択し得る。

これはアンバー変異を抑制し得ない宿主細胞の中に感染させることによる。クロ ーンは次いで、所望のＴＮＦ変異を運搬するファージに関して、スクリーニング し得る。

（以下余白） ＩＶ、　ＴＮＦ　インヒビ　−の　゛ ＴＮＦ転換酵素阻害活性を有すると同定される化合物はまた、敗血症の治療にお いて予防的または治療的用途を有する。敗血症の発病は、循環成熟ＴＮＦの増加 に関係があるため、これらのインヒビターは、細菌感染の危険があるような場合 、特に、外科手術前段階において、予防的に使用され得る。同様に、敗血症の早 期診断の場合、これらのインヒビターは、生成される可溶性１７ｋＤ型ＴＮＦの 量を充分に低下する、有益な治療効果を有する。

循環成熟ＴＮＦの増加はまた、リウマチ様関節炎、悪液質、脳性マラリア、゛お よび対宿主性移植片病に関係する。従って、本発明のインヒビターはまた、これ らの疾患の治療において予防的または治療的用途を有する。

転換酵素インヒビターに関する他の医学的用途は、ＡＩＤＳの治療のためのもの である。ＴＮＦが潜伏性ヒト免疫不全ウィルスの活性化を引き起こすことが示さ れている。Ｆｏｌｋｓら、１９８９、ハ至旧坦す、　８６　：　２３６５゜従っ て、ＴＮＦ転換酵素の阻害により、成熟ＴＮＦの生成を防止または阻害すること は、ＡＩＤＳに対する価値のある治療であり、そして好ましくは、潜伏段階にい るウィルスに感染している患者を治療するために用いられる。

本発明のインヒビターは、敗血症、ＡＩＤＳなどの予防に対して治療的に有効な 濃度で投与され得る。これらの目的を達成するために、ペプチドおよび化学的化 合物は、非経口的に（すなわち、血管内（動脈内または静脈内）、筋肉内、また は皮下経路を介して）、投与される。この投与を達成する方法は、当業者に公知 である。

患者への投与の前に、処方剤または薬学的に受容可能な賦形剤が、ペプチドおよ び化学的化合物に添加され得る。液体処方物が好ましい。例えば、これらの処方 剤には、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、緩衝液、アルブミン、 界面活性剤または増量剤が包含される。好ましくは、炭水化物には、単糖類、三 糖類または多糖類のような糖または糖アルコール、あるいは水溶性グルカンが包 含される。これらの糖類またはグルカンには、果糖、デキストロース、乳糖、ブ ドウ糖、マンノース、ソルボース、キシロース、麦芽糖、ショ糖、デキストラン 、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、可溶性澱粉、ヒド ロキシエチル澱粉、およびカルボキシメチルセルロース、またはこれらの混合物 が包含され得る。糖アルコールは、−０１（基を有するＣ４〜Ｃ８の炭化水素と 定義され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソル ビトール、グリセロール、およびアラビトールが包含される。マンニトールが最 も好ましい。これらの上記糖または糖アルコールは、個別に、または組み合わせ て使用され得る。糖または糖アルコールが水性調製物において可溶である限りは 、使用量に制限はない。好ましくは、　糖または糖アルコール濃度は、１．　Ｏ ｗ／ｖ％と７．　Ｏｗ／ｖ％との間であり、さらに好ましくは、２．　Ｏｗ／ｖ ％と６．　Ｑｖ／ｖ％との間である。好ましくは、アミノ酸には、左旋（Ｌ）型 のカルニチン、アルギニン、およびベタインが包含される；しかじ、他のアミノ 酸もまた添加され得る。好ましいポリマーには、平均分子量が２．０００と３． ０００との間であるポリビニルピロリドン（ｐｖｐ）、または、平均分子量が３ ．０００とｓ、　ｏｏｏとの間であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が包含 される。組成物に緩衝液を用いて、凍結乾燥前または再形成後の溶液のｐＨ変化 を最小にすることも好ましい。生理学的緩衝液はたいていいずれも用いられ得る が、クエン酸、リン酸、コハク酸、およびグルタミン酸緩衝液またはこれらの混 合物が好ましい。最も好ましいのはクエン酸緩衝液である。好ましくは、その濃 度は０．０１〜０．３モーラ−である。処方物に添加され得る界面活性剤は、欧 州特許第２７０．７９９号および同第２６８．１１０号に示されている。

さらに、本発明のペプチドおよび化学的化合物は、ポリマーへの共有性結合によ り修飾されて、例えば、循環半減期を増加し得る。好ましいポリマーおよびこれ らをペプチドに付ける方法は、米国特許第４．７６６、１０６号、同４．１７９ ．３３７号、同４゜４９５、２８５号、および同第４．６０９．５４６号に示さ れており、これらの特許全体を本明細書中で参考として援用する。好ましいポリ マーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ ）である。ＰＥＧは室温で水に可溶であり、そして以下の一般式を有する：　Ｒ （０−ＣＨＩ−ＣＬ）、０−Ｒここで、Ｒは、水素あるいはアルキルまたはアル カノール基のような保護基である。好ましくは、この保護基は、１個と８個の間 の炭素を有し、さらに好ましくはメチルである。記号ｎは、正の整数であり、好 ましくは１と１．０００との間であり、さらに好ましくは、２と５００との間で ある。ＰＥＧの好ましい平均分子量は、１０００と４０．０００との間であり、 さらに好ましくは、２０００と２０．０００との間であり、最も好ましくは、３ ．０００と１２．０００との間である。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも１個 のヒドロキシ基を有し、さらに好ましくは、そのヒドロキシ基は、末端ヒドロキ シ基である。好ましくは活性化されて、インヒビター上のフリーのアミン基と反 応するのは、このヒドロキシ基である。

水溶性のポリオキシエチル化ポリオールも、本発明で有用であり得る。これらに は、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化ブドウ糖、ポリオキ シエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などが包含される。ＰＯＧが好ましい。１つ の理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、例えば、動 物およびヒトにおいて、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドに天然 に存在する骨格と同様であるからである。従って、この分枝は、必ずしも体内で 異質な薬物と見られることはない。ＰＯＧの好ましい分子量は、ＰＥＧと同様の 範囲である。ＰＯＧの構造は、Ｋｎａｕｆら、１９８８．　Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃ ｈｅｆｆｌ、　２６ｕ’　１５０６４−１５０７０に示されており、そしてｐｏ ｃ結合体（ｃｏｎ　ｊｕｇａｔｅ）の議論は、米国特許第４．７６６、１０６号 に見出される。これらの両方全体を本明細書中で参考として援用する。

液状薬学的組成物を調製した後、好ましくは凍結乾燥して分解を防止し、そして 無菌性を保存する。液状組成物の凍結乾燥法は、当業者に公知である。使用直前 に、滅菌希釈剤（例えば、リンゲル液または滅菌生理食塩水）を用いて、この組 成物を再構成し得る。これらの希釈剤は他の成分を含有し得る。再構成して、組 成物は、当業者に公知の方法を用いて、好ましくは被験者に投与される。

不溶性インヒビターは、１種またはそれ以上の可溶化剤との組み合わせにより処 方され得る。好ましい可溶化剤には、以下が包含される：エタノール；トウモロ コシ油のような油、　ＰＥＧ　、プロピレングリコール；および非イオン性界面 活性剤。

好ましい補助溶剤（ｃｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ）は、分子量が５０と１．０００との 間であり、さらに好ましくは、１００と６００との間である。好ましくは、これ らの濃度は、１と７５％ｗ／ｗとの間であり、さらに好ましくは、ＩＯと５０％ との間である。エタノールの濃度は、好ましくは、０．１％と２０％との間であ り、さらに好ましくは、１と５％との間である。好ましい非イオン性界面活性剤 は、親水性−親油性バランスが１４と４０との間であり、さらに好ましくは、１ ５と２０との間であり、最も好ましくは、１７と１９との間である。好ましくは 、この非イオン性界面活性剤は、分子量が１００と２５０．０００との間であり 、さらに好ましくは、４．０００と２００、０００との間であり、最も好ましく は、６．０００と１５０．０００との間である。好ましくは、この非イオン性界 面活性剤は、０．００５％〜ｌＯ％ｗ／　ｖ、さらに好ましくは、０．０１％〜 ５％ｗ／ｖ、最も好ましくは、５〜２．５％Ｗ／Ｖの範囲の濃度で有効である。

好ましくは、この非イオン性界面活性剤には、製薬、食品、および化粧品工業で 通常用いられる界面活性剤が包含される。好ましい非イオン性界面活性剤には、 以下が包含される：ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（すなわちＴ ｗｅｅｎ類）、ポリエチレングリコールエステル、ポリエチレン脂肪酸エステル 、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロックコポリマー（すなわち 、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ類）、エチル化脂肪アルコールエーテル（すなわち、１ａｕ ｒｅｔｈ−１２）、オクチルフェノキシポリエチオキシエタノール化合物（すな わち、ＴｒｉｔｏｎＭ）、およびポリオキシエチル化ヒマシ油（すなわち、Ｃｒ ｅｍｏｐｈｏｒ）。

これらの非イオン性界面活性剤は、当該分野で公知の手段により生成または商業 的供給業者から購入され得る。

他の非イオン性界面活性剤は、本発明のスクリーニング法を用いることにより測 定され得る。この方法では、非イオン性界面活性剤を不溶性インヒビターに添加 する。得られる溶液を混合またはホモジナイズし、そして室温で２４時間放置す る。ＲＰ−ＨＰＬＣ，ＧＣあるいは目視または分光測定透過度により測定された ときに、インヒビターが溶液中にある場合は、界面活性剤は、インヒビターを可 溶化するのに有用である。

呂願人の発明であり得る事柄について概要を説明してきたので、以下に本発明の 範囲を例示する実施例を示す。本発明の範囲から逸脱せずに多数の置換が行われ 得るので、これらの実施例が、本発明を、示される物質および方法に限定するも のとして構築されることを意図していないことは、当業者に理解される。

実１」口２ ＴＮＦ　酵　の　゛　びロ ＨＬ６０細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＳＭＤ）から得、そして２０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）およびＬ−グルタミ ンを補填したＲＰＭＩ　１６４０培地を含むＴ−１７５フラスコ中で生育させた 。合計３リツトルのＨＬ６０細胞のバッチを生育させ、併せて回収した。この細 胞を約１２０Ｔｎｌの低張緩衝液中に再懸濁し、そして窒素キャビテーション（ ４００ｐｓｉ、　３０分、４℃）により溶解した。このホモジネートを１０．０ ００　ｘ　ｇで１０分間遠心分離し、そして上清液および細胞残渣ペレットの両 方を一２０℃で保存した。

ＨＬ６０細胞培養３バッチからのｆＴＬ６０細胞残渣を、２５０ｍ１の、０゜５ ％ＮＰ−４０、ＳｎＭ　ＥＤＴＡ、および２μｇ／ｍｌｏイペプシン（ＤＥＡＥ 緩衝液）を含むｌ１０１ｎトリスｐＨ８，５中に融解し、そして同緩衝液中で４ 時間透析した。精製中に使用されたプロテアーゼインヒビターは、ＨＬ６０溶解 液中に検出される転換酵素活性には影響しないことが示された。粒子を遠心分離 （１０，０００ｘ　ｇＳ１０分）により除去し、そして試料を、０〜０．８Ｍの 、６８０　ｍｌのＮａＣｌグラジェントを用いて溶出される、ＤＥＡＥセファロ ースカラム（２，６Ｘ２１　ｃｒｎＳＰｈａｒｍａｃｉａ）上のアニオン交換ク ロマトグラフィーにより分画した。ＴＮＦ転換酵素活性を含む画分は、８８Ｓプ ロＴＮＦ転換酵素アツセイを用いる精製を通じて同定された。プールされたＤＥ ＡＥ画分を０．１％ＮＰ−４０，ｌ　ｍＷ　ＥＤＴＡ、および１μｇ／ｍｌロイ ペプシンを含む、ｐＨ６，５の２０ｎＭリン酸ナトリウム緩衝液に対して透析し 、３つの等蓋部分に分け、そして各々を、４５分間の、０〜０．６Ｍの塩化ナト リウムのグラジェントで溶出する、ＴＳＫ〜５Ｐ−５ＰＷカラム（７，５Ｘ　７ ５　ｒｎｔｎＳＢｉｏＲａｄ）上のカチオン交換ＨＰＬ、Ｃにかけた。転換酵素 活性が濃縮された画分をプールし、そして０．１％ＮＰ−４０を含むＤＥＡＥ緩 衝液に対して透析した。ＳＰカラムからプールされた材料を３つの部分に分け、 そして各々を４５分間の、０〜０．６Ｍの塩化ナトリウムのグラジェントで溶出 する、ＴＳに−ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（７，５ｘ７５　ｎ＋＋ｎ、　ＢｉｏＲ ａｄ）上のアニオン交換ＨＰＬＣにかけた。転換酵素活性のプールを、さらに、 アセトニトリル１０，１％ＴＦＡ移動相を用いるＶｙｄａｃ　ＣＪシカラム上Ｒ Ｐ−ＨＰＬＣにより精製した。

この処理は、ｌ、　０００倍の精製、１８％の収率で、２０μｇの転換酵素（約 ３２０ユニツト）を提供した。ＲＰ−１（ＰＬＣからの画分を転換酵素活性につ いて試験し、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥ上でサイズ分画した。

転換酵素活性を含む画分は、約２８〜３１ｋＤの分子量を有するタンパク質を含 んでいた。この転換酵素を配列決定し、そしてＮ末端で１８アミノ酸配列がセリ ンプロテアーゼＰＲ−３のそれと同一であることがわかった。ＰＲ−３を引き続 いて、本質的に公開された手法を用いてヒト好中球から単離し、そしてａＳＳプ ロＴＮＦアッセイにおいてＴＮＦ転換酵素と同じ活性を有することが見い出され た。

ＰＲ−３のＴＮＦ転換酵素としての同定は、さらに、シアノチンブロマイド切断 断片のＮ末端配列決定、およびＰＲ−３のアミノ酸組成により支持された。これ ら両者は、成熟型の活性ＰＲ−３の公開されたアミノ酸配列（Ｃａｆｆｌｐａｎ ｅｌｌｉら、１９９０．ムＪ」し１世よ。

出：　１７０９−１７１５）と（実験誤差内で）一致する。

実」１医」よ ヒ　ＰＲ−３の　ローニン　゛　び　−ＦＩＬ６０細胞からＲＮＡを精製し、モ してｃＤＮＡライブラリーをプラスミドｐＧＥＭ中に構築した。ｃＤＮＡの構築 には、ｃＤＮＡのＣティリングおよびベクターのＣティリング、次いで上記プラ スミド中への連結（Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏ ｎ、　１９９０．１１４−１３５頁）を用いた。得られたクローンをミニロブラ スチンの既知の配列（Ｂｏｒｉｅｓら、１９８９、Ｃｅ１ｌＳ５９　：　９５９ −９６８）に由来する、独特のオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニ ングした。

１つのクローンＭＹＬ７の配列決定を、プラスミド二本鎖配列決定、ならびにシ ーケナーゼキットおよび自動化ＡＢＩシーケンサ−を用いて実行した。ＭＹ１７ の配列を図２に示す。この配列の新規な特徴は、Ｂｏｒｉｅｓら、１９８９、Ｃ ｅ１ｌ、５９：９５９−９６８による元の公開との５つのヌクレオチドの違い、 およびＣａｌ１ｌｌｐａｎｅｌｌｉら、１９９０、Ｌ■ＬｈＬ、出：１７０９− １７１５との３つのヌクレオチドの違いを含む。付加的な５°配列および付加的 な５゛メチオニンコ一ド配列が見い出された。ＰＲ−３中の２つのカルボキシル 末端アミノ酸、アルギニンおよびプロリンは、Ｂｏｒｉｅｓら（前述）のそれら と類似であるが、Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉら（前述）のグリシンおよびプロリン配 列と異なる。

ＰＲ−３のトランジェント（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）＃乳類発現を、ＭＹ１７から （７）１．０　ＫｂノＨｉｎｌｌｌＥｃｏＲＩ　ＰＲ−３断片を、ＳＲ−（Ｘ　 ヘク９−　（７）　Ｐｓｔ１部位中にクローニングすることにより行った。ｃｏ ｓ細胞を、ＤＥＡＥ／デキストラン法を用いて一時的にトランスフェクトした。

Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、　１９９０．　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ　Ｅｘ 　ｒｅｓｓｉｏｎ、　ｐｐ、９９−１００、５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ０ト ランジヱント発現は、ウェスタンプロット分析により低レベルのＰＲ−３発現を 示した。ＰＲ−３を変異させ、哺乳類、細菌および昆虫発現系におけるその発現 を最適化した。ｐＧＥＭベクター中のＰＲ３遺伝子をオリゴヌクレオチド部位特 異的変異誘発により変異させた。２つの構築物が作製された；Ａ）デルタチモー ゲンＰＲ−３、およびＢ）デルタシグナルペプチドＰＲ−３゜ Ａ）デルタチモーゲンＰＲ−３を、−１および一２位のアミノ酸（それぞれ、グ ルタミン酸およびアラニン）に対するコドンを欠失するオリゴヌクレオチドを用 いて作製した。この遺伝子は、ｐｃＥＭからＥｃｏＲＩ消化により除去され得、 そしてこの遺伝子は一時的な哺乳類での発現のためにＳＲ−αに、そして安定な トランスフエクタント生成のためにｐｃＤＮＡ　１に移した。

Ｂ）デルタシグナルペプチドＰＲ−３は、リーダーを欠き、そして成熟型タンパ ク質の１位のイソロイシンに先行する＾ＴＧを付加したオリゴヌクレオチドを用 いて作製した。この遺伝子は、ｐＧＥＭからＥｃｏＲＩ消化により除去され得、 そして一時的なおよび安定な哺乳類での発現のために５Ｒ−ａおよびｐｃＤＮＡ 　Ｉに移した。

さらに、この構築物を、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏリポソーム結合部位から ８−１２ヌクレオチドの位置で、ＤＧ１６０ａλＰ１ベースの細菌発現ベクター 中に配置した。

別の構築物、セクロピンＢ　ＰＲ−３構築物を作製し、セクロビンＢに関する昆 虫リーダーを、成熟ＰＲ−３タンパク質の１位のイソロイシンの前に置いた。こ れを昆虫ベクター、ｐＡｃｃ１３中に置いた。

Ｄ）細菌発現を最適化するために、デルタシグナルＰＲ−３の最初の２〜８アミ ノ酸に対するコドン中のプリンからピリミジンへの３番目のヌクレオチドの変異 を、オーバーラツプする合成オリゴヌクレオチドおよび合成断片のポリメラーゼ 連鎖反応による増幅を用いて行った。この断片は、ＰＲ−３の５°側±■部位中 にクローニングされ得、５′側ＲＮ＾のＧＣ含量を減少させ、そして発現を促進 する。

アメリカンタイプカルチャーコレクション、受託番号第６７゜１０３号’ｔ’寄 託サレすヘクターｐＦｖｘＭヲ、２６ｋＤ　ＴＮＦｉｌヲ：Ｉ　−）’するＤＮ Ａ配列を含む、ベクターｐＦＶＸＭ−ＴＮＦ６を生成するために用いた。後者の ベクターを生成するために、２６ｋＤ　ＴＮＦ種をコードするｃＤＮＡ配列を含 むプラスミドＢｌｌを、コード配列を切除するＰｓｔｌで処理した。断片を標準 的な電気泳動手法を用いて精製した。次に、ベクターｐＦＶＸＭをＰｓｔｌで処 理し、そして上記２６ｋＤコ一ド配列を含むｇ）ＢｌｌからのＰｓｔｌ断片を、 上記標準的手法を用いてベクターのポリリンカー領域中に挿入し、ｐＦＶＸ−Ｔ ＮＦ６を生成した。ｐＦＶＸ−ＴＮＦ６を、Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、１９８８　（ 上記）に記載されるように、または１９８９年８月１６日に出願された、「プロ ホルモンタンパク質に対する切断部位ブロッキング抗体およびその使用」と題す る米国特許出願第３９５．２５４号に記載されるように、細胞株ＴＮＦ６．８を 生成するために使用した。

ＴＮＦ６．８は、２６ｋＤおよび１７ｋＤ　ＴＮＦの両方を発現した。図３は、 ＨＬ６０細胞中に存在する転換酵素活性による２６ｋＤ　ＴＮＦの転換を示す。

ラベルされた２６ｋＤ　ＴＮＦの、インビトロ転写／翻訳系による生産、および ゲル電気泳動による分析は、実施例４に記載される。Ｓ−を細胞質ゾルまたはペ レット画分は２６ｋＤ　ＴＮＦの１７ｋＤ種へのほぼ完全な転換を引き起こすこ とに留意のこと。図３はまた、比較の目的に、ＴＮＦ６．８細胞の溶解液中の２ ６ｋＤおよび１７ｋＤ　ＴＮＦを示す。

ｐＦＶＸＭオヨびプラスミドｐＢ１１（７）両者を、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ 株中テ増幅した。これら断片の連結を標準条件を用いて実行した。

プラスミドＤＮＡを連結手法の後で単離し、モしてＴＮＦコード配列の正確な向 きを制限酵素分析により確認した。

プラスミドＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ヱ：　 １５１３（１９７９）に記載されるように、ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙら の手法に従って調製した。プラスミドＤＮＡをセシウムクロライド中で、２回バ ンド化し、そしてｌ１０ｌＴｌトリス、ｐＨ８，０、およびＩ　ＩｎＭ　ＥＤＴ ＡからなるＴＥ緩衝液に対して完全に透析した。

（以下余白） 尖ＩＬ■ 好適なアッセイ手法は、インビトロ転写／翻訳系から成り、２６ｋＤ分子を生成 し、次いで、転換酵素阻害活性について試験される化合物の存在下または非存在 下で転換酵素で処理する。

この手法は、プラスミドＢｌｌ中に存在するＴＮＦ　ｃＤＮ＾のインビトロ転写 ／翻訳を必要とする。従って、配列がｐＢｌｌからＰｓｔｌ消化により除去され 、そしてｐＧＥＭ−３（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃから入手可能）のＰｓｔ １部位中に挿入された。ｐＧＥＭ−ＴＮＦ１４と命名した、得られたプラスミド を、確立された手法を用いてＥ、ｃｏｌｉ中で増幅し、そしてプラスミドＤＮＡ を、上記のＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの手法に従って調製した。プラスミ ドＤＮＡを、Ｂｉｎｄｌｌｌを用いてそれを直鎖状にすることによりインビトロ 転写し、そして直鎖状プラスミドテンプレートを、Ｐｒｏｎｅｇａ　Ｂｉｏｔｅ ｃにより提供される、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼおよびインビトロ転写キットと 共にキャップ化転写物を調製するために用いた。転写を、製造者の指示により教 示されたように標準手法を用いて行った。

このｍＲＮ＾を３６８−システィンの存在下で翻訳し１６Ｓ−システィンラベル された２６ｋＤ　ＴＮＦを生成した。ウサギ網状赤血球溶解液翻訳キット（Ｐｒ ｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃにより提供される）を使用し、製造者により推奨され る条件に従った。

１％Ｓ−システィンラベルされた２６ｋＤ　ＴＮＦを、以下のように、転換酵素 インヒビターに対するアッセイに使用した。２５μｌのインビトロ翻訳された材 料を、非誘導のＨＬ６０細胞から部分精製された転換酵素活性の２５０μｍと組 み合わせ、阻害活性についてアッセイされる化合物を加える。転換酵素を、２ｘ 　ｌＯ’ＨＬ６０細胞を回収し、そしてそれぞれ合計１８および６０ＩＬのＳ− １およびＰ−３０画分を単離することにより生成した。Ｓ−１画分もまた使用し 得るが、Ｐ−３０画分の２５０μｍを使用した。アッセイを、本質的に上記のよ うに、３０℃で１時間行った。次に、反応混合物を抗−ＴＮＦポリクローナル抗 血清およびプロティンＡセファロースを用いて免疫沈降し、ペレット化しそして 洗浄した。結合タンパク質を溶出し、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動 した。このゲルを４０％メタノール、１０％酢酸中で固定化し、Ｅｎｌｉｇｈｔ ｅｎｉｎｇ（Ｄｕｐｏｎｔ）中に浸し、乾燥し、そしてＸ−線フイルムに感光さ せ引き続き展開した。ＨＬ６０転換酵素で処理された２６ｋＤＴＮＦのゲル電気 泳動プロファイルおよび活性な阻害化合物の種々の希釈液は、これら化合物が阻 害活性を有することを示した。

上記アッセイを用いて、３．４−ジクロロ−イソクマリンおよびエラスチナール が、それぞれ、１００μｇ／ｎｌおよび５＋ｎｇ＃＋１の濃度で、転換酵素を阻 害することを測定した。ＩＩ［ＩＭの濃度で、（１−（３−（アセチルオキシル ）−７−メトキシル訃オキシー訃オキソー５−チオー１−アザビシクロ［４，２ ，０］オクト−２−エン−２−イル）カルボニル）モルホリン、Ｓ、Ｓ−ジオキ シド、（６Ｒ−シス）が、転換酵素活性を阻害することもまた示された。これら の結果は図４に示される。

上記のアッセイはまた、図５に示されるように、純粋なＨＬ６０細胞ＰＲ−３と 共に使用され、ＴＮＦ転換酵素阻害活性について種々のプロテアーゼインヒビタ ーを試験した。純粋なＰＲ−３（０゜３μｇ／ｌｒ＋１）を、５６Ｓ−ラベルさ れた２６ｋＤ　ＴＮＦの添加の前に以下のインヒビターを用いて３０分間ブレイ ンキュベートし、そして上記のようにアッセイした：　ＤＣＩ（４５μＭ）、α −２−マクログロブリン（１ｍｇ／ｍｌ）、ＰＭＳＦ（２０μＭ）、ロイペプシ ン（２μｇ＃＋１）、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）、またはペプスタチン（２μｇ＃＋ １）。これらインヒビターの最初の３つは顕著な阻害活性を示した。

記載されるように、２６ｋＤ　ＴＮＦを生成する単球を刺激することにより生成 され得る。要約すれば、ヒト単球をヒト血液から遠心分離により精製し、そして 続いて細胞培養皿への単球の付着を基に濃縮される。遠心分離は、Ｐｈａｒｗ＋ ａｃｉａから入手し得る、Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅおよびパーコール（、 ４９，２％）を介して単球を精製することから成る。製造者は以下の手法を推奨 する。

遠心分離工程から得られた細胞の混合物（単球およびリンパ球から成る）は、次 に、２０％の仔ウシ胎児血清を補填したＲＰＭＩ培地を含む組織培養皿上にプレ ートされた。この皿を同培地で充分にリンスした後、３０分間３７℃でインキュ ベートする。

この処理は、非付着のリンパ球を除去し、そして付着単球のみを残す。

単球２６ｋＤ　ＴＮＦは以下のように放射ラベルされる。単球を３７℃で３時間 、２０％の仔ウシ胎児血清を補填したＲＰＭＩ培地中で、１１００ｎ＃＋ｌ　リ ポ多糖、および１０μｇ／ｍｌホルボールミリスタートアセタートを補填したＲ ＰＭＩ培地中、３７℃で３０分インキュベートする。後者の２つの化合物はＴＮ Ｆの発現を誘導する。ＲＰＭＩ培地はシスティンマイナスであり、そして子ウシ 胎児血清が最終濃度５％で存在する。この血清は使用の前に透析し、存在する全 てのシスティンを除去する。３０分のインキュベーション後、１００ｕＣｉ”Ｓ −システィンが添加され、そして細胞が３７°Ｃで３時間放射ラベルされ、その 後細胞は溶解され、転換酵素活性をアッセイするために使用される。アッセイを 実行するための工程、および転換酵素インヒビターを同定する工程は、上記のそ れらと同様である。

Ｃ６且　に　１、セイ ＴＮＦ転換酵素阻害はまた、比色アッセイにより測定され得る。

このタイプのアッセイでは、プロＴＮＦの成熟ＴＮＦへの実際の転換を比色性の ＴＮＦ転換酵素基質を用いて間接的に測定する。用語「比色性ＴＮＦ転換酵素基 質」は、ＴＮＦ転換酵素により切断され、特定の周波数の光を吸収する化合物を 遊離する化合物をｔ味する。ソノような基質のひとつは、Ｂｏｃ−ＡｌａＯＮｐ （ＢａｃｈｅｆｆｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ、、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈ ｉａ、　ＰＡ）である。その他のそのような基質は、ＴＮＦ転換酵素および他の セリンプロテアーゼの構造から識別され得る。本明細書の実施例では、ＴＮＦ転 換酵素として、精製された天然のＰＲ−３を使用するが、組換えＰＲ−３または 他のＴＮＦ転換酵素が、このアッセイで同様に使用され得ることが予期される。

０１ｅｋｓｙｓｚｙｎおよびＰｏｗｅｒｓら、１９９１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ３０：４８５−４９３に記載されるように、ペプチドジフェニルホスホネートイ ンヒビターが合成され、そして凍結乾燥された固形物として貯蔵された。インヒ ビター溶液（１０ｍｇ／ｎｔｌ）を、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ ）中に調製し、そして実験の開始に際し水性緩衝液中に希釈した。３，４．ジク ロロ−イソクマリンは、ＣａＬＢｉｏｃｈｅ幻から購入した。精製したＰＲ−３ （１０μＬ　Ｏ，１ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ７， ０の２０　＋ｎｌｉｎｌミリンリウム緩衝液中で、種々の濃度のプロテアーゼイ ンヒビター（最終容量４００μｌ）と混合した。選択された時間でアリコート（ ４０μｍ）を取り出し、そして転換酵素の比色アッセイ中にｌ／１０に希釈され る。

これは、０．１Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸ナトリ ウム緩衝液中に、０．５−１　ｍＭ　ＢＯＣ−Ａｌａ−ＯＮｐ（１００％メタノ ール中の５０　ｍＭストックから用時調製）を含む。吸光度の増加を、Ｈｅｗｌ ｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　８４５０Ａスペクトロフオトメーターで、３４７ｎｍ でモニターし、そして５．５ｘｌＯ”　Ｍ−’ｃｎ＋−’吸光係数を用いた。

夾五１ ＴＮＦ　のペプ　ジ　エニルホスホ゛、−ンヒビ　−幾つかのペプチドジフェニ ルホスホネートを阻害活性について試験した：　ＢｏｃＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ −ｐ（ＯＰｈ）−（ｖＰｖ）、Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒ。

−Ｖａｌ−ｐ（ＯＰｈ）ｔ（ＡＰＶ）、Ｂｏｃ−＾１ａ−Ｇｌｎ−＾１ａ−ｐ（ ＯＰｈ）ｔ（＾Ｑ＾）、およびＢｏｃ−Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−ｐ（ ＯＰｈ）ｚ（ＬＡＱＡ）。これらのペプチドを、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を用い る化学合成により調製し、そしてジフェニルホスホネートを、０１ｅｋｓｙｓｚ ｙｎら（前述）中で示された方法と同様の方法に従って調製した。

上記ペプチドジフェニルホスホネートを、ＴＮＦ転換酵素／ＰＲ−３活性の阻害 に対して、実施例３中で記載された比色アッセイで試験した。結果を図６中に示 す。ｖＰｖおよびＡＰＶが阻害活性を示した。＾ＱＡおよびＬＡＱＡは、試験さ れた濃度で阻害があってもごく僅かであった。ジクロロイソクマリン（ＤＣＩ） はアッセイ中で１００％阻害を示した。

（以下余白） 実ＪＪＩ旦 ＴＮＦ　ンパ　のペプ　゛　ンヒビ 久二 以下の化合物は転換酵素阻害活性を有し、そして以下のようにして調製され得る 。これらの化合物は、上記実施例４に記載のようにして阻害活性を試験され得る 。

Ａ、匠に１国１五碧 モノクローナルまたはポリクローナル抗体を調製する。この抗体は、転換酵素に 結合することによって、転換酵素が２６ｋＤ　ＴＮＦに結合することを妨げ、あ るいは転換酵素の酵素活性を中和する。この手法は、適切な宿主動物をＴＮＦ転 換酵素を産生ずるＨＬ６０細胞の膜画分で免疫化する工程からなる。あるいは天 然または組換え供給源由来の精製ＴＮＦ転換酵素を用い得る。

例えば、ヒト好中球由来のＰＲ−３は、抗ＴＮＦ転換酵素抗体を誘導し得る。充 分な量の材料を、免疫反応を誘導するために用い得、通常、これは体重１ｋｇあ たり１０μｇとｌＯ＋ｎｇとの間である。

当該技術分野で公知のように、免疫化は、生物学的に受容可能な緩衝液中のアジ ュバントを用いて遂行し得る。最良の免疫ルートは実験的に決定され得、そして −次免疫化に続いて、最初の免疫化に対する免疫反応の強さに応じて一回または それ以上の二次免疫化を行い得る。血清中の中和抗転換酵素抗体の存在は、上記 の抗血清がアッセイ混合物中に存在している転換酵素アッセイを用いて検出し得 る。２６ｋＤ　ＴＮＦ種の成熟ＴＮＦの分子量を有する種への転換の阻害は、中 和抗体の存在を示す。もちろん、非免疫化動物由来の抗血清が阻害活性のないこ とを確認するために適切なコントロールを用いること仮定している。ポリクロー ナル抗体を下記のようにして精製し得る。

転換酵素に対するモノクローナル抗体を、インビトロまたはインビボでの免疫化 技術のどちらかを用いて産生させ得、そしてその結果得られる感作リンパ球を、 好適なモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞系を調製するために用い 得る。げっし動物、好ましくはネズミ起源のげつし動物の抗体、またはヒトの抗 体が最も好ましい。インビトロでの免疫化手法は、マウスまたはヒトのいずれか を免疫することによりリンパ球を転換酵素に対して感作させること、およびそこ から得られた抗体分泌細胞画分を単離し、いくつかの手法の１つにより細胞を不 死化することを包含する。別の実施態様は、既に転換酵素に対して感作されたリ ンパ球を敗血症患者またはＷｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症患者から上記のようにして単 離することである。

（ｉ）木久主試碧 インビボでのマウスの免疫用に、Ｎａｔｕｒｅ、　２５６：４９５（１９７５） に記載のＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの手法、またはＦｅｎｄｌｙら、 １９８７゜敗垣１ｄｏｎ＋ａ、６：３５９　；　Ｂｕｃｋら、１９８８．　Ｉｎ 　Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７に示されるような改変法を用い得る。インビトロで の手法は、一般にＬｕｂｅｎ、　ＲおよびＭｏｈｌｅｒ、　ＭＳ１９８０．　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｒｍｆｆｌｕｎｏｌｏ　。

１７：６３５、Ｒｅａｄｉｎｇ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　 、１２１（Ｐａｒｔ　１）：１８、またはＶｏｓｓ、　１９８６．　Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｆｆ１ｏｌｏ　、　１２１：２７によって記載されている 。

マウスを、予め転換酵素活性に陽性であることが示されたＨＬ６０細胞の膜画分 ｌｆｆ１ｇ／ｆｆｌ■で免疫化する。あるいは、少量の精製ＴＮＦ転換酵素を用 い得る。免疫化をＦｒｅｕｎｄ完全アジュバント中で遂行する。アジュバントな しで隔月で２回さらに免疫化を行うかまたはブーストを行い、そして最後のブー スト、から１力月後に、マウスに１０８ｇの膜物質の！、■、ブーストを施す。

１、Ｖ、ブーストの３日後に、マウスを屠殺して膵臓を取り出し、そして膵臓細 胞を単離し、不死化薬剤で選択可能な骨髄腫パートナ−細胞系に融合する。多く のそのような骨髄腫細胞系は、当該技術分野では公知であり、これらの大部分は ＨＡＴを補填細胞培養培地中では生育できない。代表的な骨髄腫細胞系はＳＰ− ２１０Ａｇ１４である。このように、膵臓細胞と骨髄細胞を５：１の割合で結合 することによってハイブリドーマが形成され、これは一般に、１ｘＬＯ’の膵臓 細胞に対して２ｘｌＯ’の骨髄腫細胞からなる。細胞混合物をペレット化し、培 養液、を取り除き、そして室温でポリエチレングリコール１５００の４０％（ｖ ／ｖ）溶液ｌ。

Ｏｍｌを６０秒以上かけて滴下して添加し、続いて３７℃で６０秒インキュベー トして融合する。細胞懸濁液に、緩やかに撹拌しなから９＋ｎｌのダルベツコの 改変イーグル培地を５分以上かけて添加する。混合物中の細胞の固まりを緩やか に再懸濁し、細胞を洗浄して残存するＰＥＧを取り除き、そして、マイクロタイ タープレートに２０％仔ウシつ児血清を補填したＤＭＥＭ中約２Ｘ１０’細胞／ ウェルでブレーティングする。２４時間後、ハイポキサンチンおよびアザセリン 選択培地の２倍濃縮溶液を細胞に与える。

陽性の細胞増殖を示すウェルから培養液を取り出して、転換酵素の中和モノクロ ーナル抗体についてスクリーニングし得る。好ましいアッセイは、上記実施例２ に記載の転換酵素アッセイであり、ここで培養液にはアッセイで抗体活性が存在 することについて試験される。より好ましいアッセイは、３〜８個のマイクロタ イターウェルからの培養液上清を合わせて、この混合物をアッセイすることであ る。混合物が陽性の場合、次いで各ウェルからの培養液を個々にアッセイして分 泌性ハイブリドーマをアッセイし得る。当該技術分野では多くのアッセイが知ら れており、可溶性または不溶性抗原を検出し得、これらはＬａｎｇｏｎｅ、　Ｊ 、およびＶａｎ　Ｖｉｎａｋｉｓ、　Ｈ，、Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚ　ｍｏｎｏ　、　９２．　Ｐａｒｔ　Ｅ　（１９８３）に示 されている。

抗体がポリクローナルまたはモノクローナルであるかに関係なく、当分野に公知 、またはＳｐｒｉｎｇｅｒ、　１９８０．　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉｂｏ ｄｉｅｓ、：１９４．　（Ｋｅｎｎｅｔｔ、　Ｔ、　ＭｃＫｅａｒｎおよびに、 　Ｂｅｃｈｔ。

１［ＳＰｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に記載の標準的技術に よって抗体を精製することが好ましい。通常、これは少なくとも１回の、５０％ 硫酸アンモニウム溶液を用いる抗体の硫酸アンモニウム沈殿からなる。抗体親和 性カラムもまた用い得る。

（１１）ヒ　モ　ロー　ルー 末梢血液リンパ球を敗血症患者から単離し、続いてエプスタイン−バーウィルス を感染させ、そして感染リンパ球を選択可能な骨髄腫細胞系に融合することによ って不死化させ、生成したハイブリッド細胞系を単離して抗体産生について特徴 付ける。

さらに特定すると、Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上 で単核細胞を分離し、そしてプラスチックへの付着により混合物から単細胞を取 り出す。標準的な実験室技術を用いてこれらの手法を行った。次に、非付着細胞 を抗体産生体について抗原特異的選別（ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐ ａｎｎｉｎｇ）により濃縮する。

選別（ｐａｎｎｉｎｇ）は当分野で一般に公知の技術であり、適切な抗原でコー トしたプラスチック表面上の抗体分泌細胞集団をインキュベートすることを含む 。細胞表面に抗体を発現するこれらの細胞は抗原を結合し、最終的にプラスチッ ク表面に付着する。一方、細胞表面抗体を発現しない細胞は付着せずに、洗浄に よって除かれる。従って、特定の抗体を分泌する細胞はこの技術によって濃縮さ れる。

さらに特定すると、精製ＴＮＦ転換酵素、あるいは、誘導または未誘導ＦＩＬ６ ０細胞のどちらかから調製された転換酵素を含む膜画分を用いて、上記のように 、６−ウェルプレート（Ｃｏ５ｔａｒ）をコートする。ここで、このコートはリ ン酸緩衝生理食塩水中４６Ｃで一晩、ウェルあたり１５０Ｍｇの膜物質がコート されるように行う。−晩のインキュベーションの後、ウェルを１％のウシ血清ア ルブミンで少なくとも４°Ｃで１時間ブロックし、続いてリン酸緩衝生理食塩水 ／ＢＳＡで洗浄する。次に、ＰＢＳ／ＢＳＡの１ｍｌ中１０７個のリンパ球を６ −ウェルプレートの各ウェルに加える。リンパ球をプレート上で７０分インキュ ベートし、その後、非付着細胞を吸引により取り除く。付着細胞を、ｌｏ％仔ウ シ胎児血清を含む細胞培養液（ＩＭＤＭ、　５１ｇｆｆ１ａ　Ｃｈｅ＋＋＋１ｃ ａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いてインキュベ ートする。

付着細胞を浸漬した培養液に、エプスタイン−バーウィルス感染マーモセット細 胞系Ｂ９５−８の増殖で得られた同量の培養液（それ故ウィルスを含む）を添加 することによって、付着細胞をエプスタイン−バーウィルス形質転換に供する。

この環境下、３７°Ｃで３時間細胞を培養し、そしてこのようにして付着細胞集 団中のリンパ球をエプスタイン−バー感染に供した。感染期の次に、細胞を洗浄 し、そして１０％仔ウシつ児血清、および３０％調整培地をを添加した、ＩＭＤ Ｍ培地中、約１０’−１０’細胞／ウエルの密度で９６−マイクロタイタープレ ート上にブレーティングする。後者は、リンパ芽球層（ｌｙＩｌ′１ｐｈｏｂｌ ａｓｔｏｉｄ）細胞系、好ましくはＪＷ５に由来する。培養液はまた、５ｘｌＯ −’Ｍの２メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（Ｓｉ ｇｍａ）、および６００Ｍｇ／ｍｌのサイクロスポリン１へ（ＳａｎｄｉＩｎｆ ｆｌｕｎ、　５ａｎｄｏｚ、　Ｂａ５ｅ１．５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む。

１４日から２１日のインキュベーションの後、細胞培養液上清を一緒にして、上 記のようにしてＴＮＦ転換酵素中和活性につぃてスクリーニングする。陽性のハ イブリドーマを低密度で継代培養し、中和抗体について再試験し、そして増殖さ せて、ポリエチレングリコールおよび当分野で公知のプレート融合技術を用いて 細胞系Ｆ３Ｂ６に融合する。後者の技術は、Ｌａｒｒｉｃｋ、　１９８５．Ｈｕ ｍａｎ　Ｈｂｒｉｄｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ、　Ｅ。

Ｇ、Ｅｎｇｌｅ＋＋＋ａｎ、　Ｓ、に、Ｆｌ、　Ｆｏｕｎｇ、　Ｊ、Ｗ、、　Ｌ ａｒｒｉｃｋ、および＾、Ａ、　Ｒａｕｂｉｔｓｃｈｅｋｌｉ、Ｐｌｅｎｕｍ　 Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　４４６頁に記載されている。Ｆ３Ｂ６は、 １００μＶのハイポキサンチン、５μｇ／ｍｌのアザセリンおよび５μＭのウア バイン（ｏｕａｂａｉｎ）を含む培地中で増殖に敏感なペテロ骨髄腫細胞系であ る。最後に、得られたハイブリッドを再びスクリーニングして、中和性抗転換酵 素抗体を産生ずることを確認する。

Ｂ、２６ｋＤ　′　ンパ 転換酵素への結合に対して競合し、それによってその活性を阻害するかまたは低 下させる２６ｋＤ　ＴＮＦ変異タンパク質を記載する。好ましい変異タンパク質 の実施態様は、１位および／または１３位にバリン；または１位にアラニンおよ び／または１２位にプロリンを有するか、置換または欠失している変異タンパク 質である。これらの変異タンパク質を、部位特異性的変異ギャップ−二重鎖（ｇ ａｐｐｅｄ−ｄｕｐｌｅｘ）法の改変を用いて構築する。

次の溶液／緩衝液を用いて、所望の手法を遂行する：０．９３８■のＫＣＩ、０ ．０６３Ｍのトリス、ｐＨ７，５からなる５×ギャップ一二重鎖緩衝液（ＧＤＢ ）　；　１．　ＯＭのＫＣＬ、０．３０Ｍのトリス、０．１５ＭのＭｇＣ１□、 ０．０２１のＤＴＴ、　ｐＨ７，５からなる１０ｘＰＥＬ　；　０．５０Ｍのト リス、０．　ＩＯＭのＭｇＣ１□、０．０５ＭのＤＴＴ、　Ｏ，ＯＱＬＭのＥＤ ＴＡ、　ｐＨ８−０からなる１ＱｘＫＢ；０．２５ｍＷのｄＣＴＰ、　ｄＡＴＰ ＳｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰを含む、１ｈ＋Ｍのストック溶液から新たに調製される 溶液；　６０ｍｇのＡＴＰを水０−８（ｌｎｌに溶解し、０．１ＭのＮａＯＨで ｐＨ７，０に調整し、水で最終体積り、　Ｏ＋ｎｌにした０、１ＭのＡＴＰから なる＾ＴＰ溶液溶液１気０びＴＥ飽和フェノール。

種々の細菌株およびファージを使用して所望の変異１タンパク質を得る。これら は、ファージ生長させるＢＭＨ　７１−１８、ＪＭＩ０３　；　ＨＢ２１５４　 ：　ＭｕｔＬ，　５ｕ−１ＤＮＡ形質転換受容可能な（コンピテント）；および ＨＢ２１５１　：　５ｕ−１形質転換の間、下層細胞（ｌａｗｎ　ｃｅｌｌ）と して使用される；　Ｍ１３ＧＡＰ，　ＲＦがギャップ−二重鎖の形成に使用され る；およびＭ１３ｍｐ１９アンバー、このベクターにおいて２６ｋＤ　ＴＮＦ標 的ＤＮＡがクローンされ、そしてギャップ−二重鎖の形成のために５ｓＤＮ＾が 単離される。

ファージを適切な細菌株に感染させ、増殖させ、そして次のように滴定する。５ ｓＤＮＡ用フアージまたはｄｓＤＮＡ用細胞、あるいはＲＦ　ＤＮＡのラージス ケールの調製において、同一の感染プロトコルを使用する。

プラーク精製ファージを標準技術を用いて産生ずる。要約すれば、これは、ファ ージ上清液を寒天プレート上に画線し、続いて軟寒天４．　０ｍｌおよびＢＭ［ （７１−１８の新鮮−晩培養液１００μｍを注意深く重層する。次に、単離した プラークを釣り上げ、そしテＲ２６またはＲ１７４１０＋＋＋Ｍ　ＭｇＣＬｔ中 のＢＭＨ７１−１８の新鮮−晩培養液のｌ：５０希釈液を用いて３７℃で４．５ −６時間装置しながらインキュベートする。　Ｒ１７（Ｎ−Ｚアミンブロス）は 、１０ｇのＮ−Ｚアミン、タイプＡ、５ｇのＮａＣ１からなり、水で１リツトル とする。一方、Ｒ２６は、８ｇのトリプトファン、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮ ａＣ１からなり、水で１リツトルとする（ＹＴブロス）。ファージストックを滴 定し、そしてファージを細菌に感染多重度１０（ＭＯＩ）で感染させる。培養を ３７°Ｃで５時間据置してインキュベートした後、細胞懸濁液をペレット化し、 そして５ｓＤＮＡ単離のために上溝を、そしてＲＦ単離のために細胞をを確保す る。ＲＦ　ＤＮＡを、確立されたプラスミドＤＮＡ単離技術を用いて単離する。

一方、５ｓＤＮＡを次のようにして単離する。

２５ｈ＋１のファージ上清液を固く遠心分離し、その後、上滑液２００ｍ１を捨 て、続いて５０ａ＋１の２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ　ＮａＣ１のを加えて、４℃で 一晩または氷上で３０分インキュベートする。この混合物もまた、固く遠心分離 し、そして上清を捨てる。ボトルを再び遠心分離しファージの沈降物をボトルの 壁に沿ってペレット化し、そして残った液体をパスツールピペットで吸引する。

ペレットを５．ｈ＋ｌの１ｘＴＥのに再懸濁し、４℃で貯蔵し、その後０、　５ ｎｌのＴＥ飽和フェノールで懸濁液０．　５ｎｌを２回抽出する。水層に０．　 ０５０ｒｎｌの３．０　Ｍ　Ｎａ０Ａｃ，およびｌ’．ｏ＋ｎｌの９５％エタノ ールを加える。この混合物をドライアイスバス中に１０分間置き、そして小型遠 心分離機中、４℃で１０分間遠心分離する。ペレットを乾燥し、そして２００μ ｌの１ｘＴＥに再懸濁する。この物質を０。

０５０＋ｎｌアリコート中に、−２０°Ｃで、２６ｋＤ　ＴＮＦの変異に使用す るまで貯蔵し得る。

以下の表１の欠失および置換は、好ましいプロＴＮＦ変異タンパク質である。こ れらの変異タンパク質を、適切なオリゴヌクレオチドを用いて当分野で公知の方 法によって調製し得る。

（以下余白） 表１ ム ■ （ＶＡＬ　１　−＋　ＡＬＡ　１）　＋　（ＶＡＬ　１３　−＊　ＡＬＡ　１３ ）（ＶＡＬ　１　→ＧＬＹ　１）　＋　（ＶＡＬ　１３　−＋　ＧＬＹ　１３） （ＶＡＬ　１　→ＬＥＵ　１）、＋　（ＶＡＬ　１３　→ＬＥＵ　１３）（ＶＡ Ｌ　１　→ＭＥＴ　１）　＋　（ＶＡＩ、１３　→ＭＥＴ　１３）（ＶＡＬ　Ｉ →ＰＲＥ　１）　＋　（ＶＡＬ　１３　→ＰＨＥ　１３）（ＶＡＬ　１　−＋　 ＨＩＳ　１）　＋　（ＶＡＬ　１３　−）　ＨＩＳ　１３）オリゴヌクレオチド を、次の反応溶液および条件を用いてキナーゼ処理すル：　１ＯｘＫＢ　ＭａＦ Ｆ液３μｍ、１０　ＩＭ（７）　ｒＡＴＰ（０．　１　ＭのｒＡＴＰストック溶 液の１：ｌＯ希釈液）３μｍ、変異原性オリゴヌクレオチド（１００ｐｍｏｌ／ 　ｕ　Ｌ）２μｍ、水２１μｍ、およびポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニッ ト／μｍ）１μｍ。反応を３７℃で４５分行い、次いで６５−６８°Ｃで５分行 う。次に、キナーゼ処理オリゴヌクレオチド２４μｍを水５６μｍで希釈して２ ｐｍｏｌ／μｍにする。

ギャップ−二重鎖を下記のようにして形成し、続いてオリゴヌクレオチドをアニ ールする。次の試薬を組合わせて総容積４０μｍにする：５ＸＧＤＰ緩衝液８μ ｍ、０．５０　ｐＩＩＩｏｌの５ｓＤＮＡ、および０．１０ｐＩｏｏｌ（７）　 Ｈｉｎａｌｌ線状化１１１３　ＧＡＰ　ＲＦ　ＤＮＡ０後ノ使ＦＵＤりめに１０ μｍを取り出し、そして残りの３０μｍを続いて次のように処理した＋　１００ °Ｃで３分、６５℃で５分、続いて３０分間で室温まで冷却して、そして次いで 反応混合物を氷上に置く。次に、ギヤツブ−二重鎖ｌＯμｍおよびコントロール の非ギャップ物質ｌＯμｌを、アガロースゲル上で電気泳動にかけてギャップ− 二重鎖の形成をチェックする。ゲルが第３のバンドの存在を示す場合、ギャップ −二重鎖が形成されており、そしてギャップ−二重鎖反応混合物１６μｍと希釈 キナーゼ処理オリゴヌクレオチド４μｍとを一緒にして、この混合物を６５°Ｃ まで３分間加熱し、続いて２０分間室温にまで冷却することによって、キナーゼ 処理オリゴヌクレオチドを二重鎖にアニールし得る。

ペテロ二重鎖を、全容積４０μｍ中で次の試薬を組合わせることからなる適切な 伸長および連結反応によって完結する：ギャップー二重鎖およびプライマーｌＯ μｍ、１０ｘＰＥＬ緩衝液４μｍ、ｄＮＴＰ（１０ｎ＋Ｍのストック溶液から作 製した０、　２５ｍＭ溶液）４μｍ、＾ＴＰ（０，１ＭのＡＴＰストック１０μ ｍに水１４９０μｌを加えて０．６６２ａ＋Ｍに調整）３μｍ、水１７μｌ、フ レノウ（５ｕ／μｌ）１μｌ、およびＴ４　ＤＮ＾リガーゼ（０，６Ｗｅｉｓｓ 　ｕ／ｌｔ　１．１ｘＰＥＬを用いた希釈ストック溶液）１μｍ。反応を１６６ Ｃで２時間行い、続いて、伸長／連結混合物１０μｍを、解凍された２００μｍ のコンピテントＨＢ２１５４細胞に形質転換する。細胞を０°Ｃで３０分保持し 、次いで４２°Ｃで１．５分間維持し、続いてＨＢ２１５１細胞の新鮮−晩培養 液１００μｍ＋軟寒天３．０μｍとともに、種々の容積の形質転換混合物（例え ば、５０μｍ、１０μｍなど）をブレーティングする。

得られたプラークを、プラークハイブリダイゼーション法を用いてスクリーニン グする。このような手法は種々知られているが、好ましい手法の記述は次の通り である。プレートを重複してニトロセルロース濾紙（Ｓ　＆　Ｓ　ｔｙｐｅ　Ｂ Ａ８５）上にレプリカし、そして、０．５Ｎ　ＮａＯＨプラス１．５Ｍ　ＮａＣ １；　１．　（ｉｌｌ　ＮａＣ１プラス０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＦＩＣＩ　ｐＦＩ ７．４　；および２ＸＳＳＣ（標準生理食塩水クエン酸）を用いる５分間の連続 的処理によりＤＮＡをフィルター上に固定する。フィルターを風乾して、減圧下 、８０°Ｃで２時間加熱する。

２つのフィルターを、フィルターあたり１０　ｒｎｌのＤＮＡハイブリダイゼー ション緩衝液、５ｘＳＳＣＳｐＨ７，ｏ、５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（ポリビ ニルピロリドンにフィコールおよびウシ血清アルブミンを加えたちの；各１　ｘ 　Ｏ，０２％）、５０　ｍＭ、　ｐＨ７，０のリン酸ナトリウム緩衝液、５ａ＋ ＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、および１００　ｔｔ　ｇ／ｎｌの酵母ＲＮＡ を用いて、５５℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行う。プレハイブリダ イゼーション緩衝液を取り除き、そしてサンプルを、適切なキナーゼ処理プロー ブ、特定すれば、上記のキナーゼ処理オリゴヌクレオチドで、所望の緊縮度（Ｓ ｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）に依存した条件下でハイブリダイズする。合計的２ｘｌＯ ＠ｃｐｎ／ｎｌを用いる。代表的な緊縮度の条件は、４２°Ｃ１５０％ホルムア ミド添加、２４〜３６時間で、プローブを含む１〜５ＩＩ＋１７フイルターのＤ ＮＡハイブリダイゼーション緩衝液を用いる。より高い緊縮度は高温でより短時 間で行なわれる。好ましいハイブリダイゼーション条件は、スクリーニングに使 用されるオリゴヌクレオチドのＴＭより１０℃低い温度で、５ｘＳＳＣ，Ｄｅｎ ｈａｒｄｔ溶液、５０　ｆｆ１ＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７，０，５ｍＭのＥＤＴＡ 、　０．１％ＳＤＳ、および１００　Ｉｎｇ＃＋１酵母ＲＮＡ中で、プローブを フィルターにハイブリダイズすることからなる。次に、フィルターを、室温で、 ２回、２ＸＳＳＣ，および０．１％ＳＤＳを用いて各３０分間洗浄を行い、次い で、スクリーニングに使用されるオリゴヌクレオチドのＴ、より５°Ｃ低い温度 で、１回、２ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて洗浄して風乾する。最後に 、フィルターを一７０℃で３６時間オートラジオグラフィーにかける。オートラ ジオグラフィーは、目的の変異タンパク質を保持するウィルスを含むプラークを 示す。

２位および／または１３位のバリンが欠失または置換されている変異タンパク質 の構築に加えて、２６ｋＤ　ＴＮＦの２つの主要な切断部位を含む大きな欠失の 変異タンパク質が産生され得る。

好ましい実施態様における変異タンパク質は、図１に示されるように、−９位か ら１１４位にわたる領域アミノ酸を欠く。この変異タンパク質を、上記の材料お よび方法、ならびに次の配列（配列番号４）を有するオリゴヌクレオチドＣＰ３ ７５を用いて構築した。

Ｃ１ンパ　ペプ　゛インヒビ　一 次のアミノ酸配列を有するペプチドを、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　１９８５゜５ ｃｉｅｎｃｅ、↓：３４１−３４７によって詳細に記載される固相法によって合 成する：　Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−＾ｒｇ−８ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ　；　（ 配列番号２）；（配列番号５）；（配列番号６）；および（配列番号７）。フッ 化水素切断、および１５−２０μ１ＩＩｖｙｄａｃ　Ｃ４ＰｒｅｐＰＡＫカラム を使用してＷａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ　Ｐｒｅｐ　３０００装置で調製ＥＩＰＬ Ｃによる精製とともに、Ｂｉｏｓｅｒｃｈ　９５００自動ペプチド合成機を用い る。

これらのペプチドのＴＮＦ転換酵素阻害活性は、変化する量の各ペプチドの存在 下で、上記アッセイを行うことで示される。

反応混合物のゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングは、２６ｋＤプロＴ ＮＦの１７ｋＤ成熟形態への転換の阻害を示す。

人」１医１− Ｌ９２９マウス　のＤＣＩのＴＮＦ ＤＣＩは、下記に示すように、マウスマクロファージからＴＮＦの放出を抑制す るが、ＩＬ−６の放出は抑制しない。

ＬＰＳによる刺激後のマクロファージによるＴＮＦの放出は、ＴＮＦの主要な供 給源である。これらの研究においては、腹膜マクロファージを付着によって精製 し、２４−ウェルプレート中で培養し、そしてＬＰＳをＴＮＦの分泌を誘導する ために添加した。ＴＮＦ放出の動力学の分析は、３時間口に最大ピークを示した 。次いで、ＤＣＩをジメチルスルホキシド賦形剤で培養物に加えた。

コントロール培養物は、相当する濃度のＤＭＳＯのみを有した。

上清を集め、そしてＴＮＦおよびＩＬ−６についてアッセイした。結果は、ＤＣ ＩによりＴＮＦ分泌が著しく抑制され、コントロール賦形削では抑制されないこ とを示した。対照的に、ＩＬ−６応答は顕著に変化しなかったことから、非特異 的な毒性効果ではない（表２を参照のこと）。

ＤＣＩは、ネズミマクロファージにおいて、特異的にＬＰＳ誘導ＴＮＦ分泌を抑 制し得たので、ＬＰＳを用いたＤＣＩのマウスへの注射による投与の治療効果を 調べた。

安定性および製剤化の研究は、ＤＣＩをコーン油に溶解した場合にＤＣＩは安定 でセリンプロテアーゼ活性が保持することを示した。ＤＣＩ／油のマウスへの感 染は、１　ｍｇ／ｎｌの用量でＬＤ　５０％を示した。これは投与され得るＤＣ Ｉの最大許容用量を表した。

ＬＰＳの致死量を注射したマウス中のＴＮＦおよびＩＬ−６の動力学を研究した 。ＴＮＦは２時間でベースラインに戻る鋭いピークを示した。ＩＬ−６はより遅 いゆっくりとした増加を示した。ＬＰＳ投与投与１剪 こと）の阻害をもたらした。また、測定された６時間目までＴＮＦの遅延増加は なかった。ＥＩＪＳＡによって測定された免疫反応性マウスＴＮＦおよびＬ９２ ９細胞の溶解によって測定される生物活性ＴＮＦのどちらについてもこれは真実 である。ＩＬ−６レベルは、この治療によって低下しなかった。

２４時間までに１００％の動物の死をもたらすＬＰＳの用量を注射したマウスの 生存へのＤＣＩの効果もまた評価した。結果は、ＤＣＩを用いた予防的治療が、 マウスの生存を延長し得ることを示した（図８を参照のこと）。０．　５＋ｎｇ よりも０．　７５１ｆ１ｇの方がより効果的であるという注目される用量一応答 関係があった。

以上より、これらの研究は、ＤＣＩは、ネズミマクロファージによるＬＰＳ誘導 性ＴＮＦ産生を特異的に阻害し得ることを示す。

このＴＮＦ阻害の特異性はまた、致死量のＬＰＳを注射したマウスにおいても見 出され得た。さらに、用量に関係した様式でＤｅｌ治療を用いてマウスの生存が 延長された。これらの研究は、ＤＣＩ（セリンプロテアーゼインヒビター）は、 敗血症モデルにおいて、ＴＮＦの全身的放出の抑制による延命に有益であり得る ことを示す。

衷ヱ サンプル　ＴＮＦ（ｎｇ／ａ１１）　ＩＬ−６（ｐｇ／ｍｌ）ＤＭＳＯコントロ ール　６．　９　２９９ＤＣｒ　２０（ａ＋ｇ／ｆｆ１１）　０．０５　１８９ 付着性腹膜７　クロア　７　’）　（１０’／ｌｌｌ１）Ｊ−１ＬＰＳ，　オヨ びＤＭＳＯ＊，？．：はＤＣＩ　ＤＭＳＯのいずれかを用いて培養した。細胞を ３時間培養し、そして上清を集めた。ＴＮＦをＥＬＩＳＡにより測定し、ルー６ をＢ９バイオアッセイにより測定した。

（以下余白） 実ＪＬ医」− 症の汁　におζるＴＮＦ　酵　インヒビ　ーの　を転換酵素活性の効果的インヒ ビターである化合物が、ヒビモデル基において敗血症を防ぐことを以下に示す。

抗ＴＮＦ転換酵素抗体、ネズミ、ヒト、または組換え体を、動物に致死量のＥ． ｃｏｌｉを投与する６０分前に、５ｏｇ／ｋｇの濃度で単回の静脈内ポーラス投 与し、そしてＥ．ｃｏｌｉの投与と同時に２ｗ＋ｇ／ｋｇ濃度を投与する。抗体 を生理食塩水溶液で投与し、そして約４×１０１０個Ｅ．ｃｏｌｉ菌を用いる。

Ｅ．ｃｏｌｉ用量を２時間以上かけて注入する。

抗体を投与された動物は少なくとも７日保護され、一方、生理食塩水だけ投与さ れたコントロールの動物は、１６から３２時間以内に死ぬ。

同様の保護は、実施例５で示されるＴＮＦ変異変異タンパ転質転換酵素インヒビ ターある。動物に４ＸＩＯ１０のＥ．ｃｏｌｉ菌を投与する６０分前に、変異タ ンパク質を、５ａ＋ｇ／ｋｇの濃度で、単回の静脈内ポーラス投与する。ヒビは また、Ｅ．ｃｏｌｉを投与と同時に２ｍｇ／ｋｇ濃度の変異タンパク質を投与さ れる。

最後に、実施例５に示されるペプチド、すなわちＧｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒ ｇ−３ｅｒ−３ｅｒ−８ｅｒおよび（配列番号１）を上記のようにして試験し、 類似の保護効果を得る。

（以下余白） 冥１１引見 ＴＮＦ転換酵素ＰＲ−３についてのモデルを、ＰＲ−３と他のセリンプロテイナ ーゼとの間にある構造的類似性を決定することによって構築した。ＰＲ−３配列 が、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）と最も高い程度の配列相同性を有するこ とをまず決定することによって、最終的な酵素の３−Ｄモデルが生まれた。ＨＮ Ｅの結晶構造（　Ｎａｖｉａら，　１９８９．　ＰＮ分Ｑ，　８６：７）を骨格 として用いて、コンピュータープログラムＨｏＩｌｌＩｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｓｙ ＩＱ，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）によりＰＲ−３タンパク質の３次元形象を組み立 てた。コンピュータープログラムＤｉｓｃｏｖｅｒ（Ｂｉｏｓｙｍ，　Ｓａｎ　 Ｄｉｅｇｏ）を用いた２回の最小化によりモデルをさらに洗練した。ＨＮＥとＰ Ｒ−３とを区別する可能なインヒビターのデザインを、これらの酵素の活性部位 に見い出される独特および類似のアミノ酸により決定する。最も顕著には、この クラスのプロテアーゼに一般的な触媒部位の３つ組（ｔｒｉａｄ）は空間的に保 存されている。Ｐ１残基（Ｓｌサイト）の結合ポケット内ではアミノ酸側鎖にお けるいくつかの重要な相違がモデルで提案される。次に述べる本発明の目的化合 物は、ＰＲ−３モデルの８１ポケツト内に見い出される独特のアミノ酸、アスパ ラギン酸およびロイシンを考慮に入れており、次の一般式で表される。

（以下余白） ここで、Ｒ’、Ｒ”は低級アルキル、必要に応じて、置換アル（低級）アルキル 、シクロ（低級）アルキル（低級）アルキル、または必要に応じて、置換へテロ 環状（低級）アルキル、天然アミノ酸、−０口、−ＮＬ、低級アルキルイミノま たは低級アＲｓは、ピロリル、イミダゾイル、ブチルアミン、またはエチル−エ ポキシド；および Ｒ４は、アルデヒド、ジホスホニレート、エトキシクマリニル、クロロメチルお よびジフルオロメチルケトニルである。

このモデルに基づ（ＰＲ−３インヒビターの例は、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈ ｉｓｐ（ＯＰｈ）　！である。このような化合物によるＰＲ−３活性の阻害は、 エラスターゼとＰＲ−３とは選択的に結合してヒスチジンとは全く異なる残基、 即ち、アラニンのような短い脂肪族炭素側鎖を有する残基の後を切り放すという 一般に受け入れられている事実を考慮すると予想できない。

本発明は、特定の実施態様を参考に記載された。しかし、この出願は、添付のク レームの思想および範囲から逸脱することなく当業者によってなされ得る変更お よび置換をも網羅することを意図している。

配置１表 ＧＩｎ−Ａｌａ−ＶａＪ−Ａｒｇ−５ｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ− Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＶａＪ−Ａｌａiｐ１７１．！、ｓ ／７ｄｚｇ　２ ｃ＋ｒｒｒａｃ−ｒＡｃＡＡＣＡＴＧＧＡＧＧＴ　ＣＣＣＴＧＧＧＧＧＡ　（１ ＝ｔｉ１杉＋　２）Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＧＩｎ−ＡＩａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ −Ｓｅｔ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ |Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ− …雀−Ｖａｌ−Ａｌａ　（梶シ鳩９：３）Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａ ｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＶａＪ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−ＶａＪ−Ａｌａ　（ ４５ｉｙ７ｐＳ　：　S） Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ｅｒ−５ｅｒ− ５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　（４９’／ｆｌ’５　：@５） （Ｌに下承勾） （ｘｌ）配列：配列番号Ｉ Ｇ’１ＴｒＧＣＴＡ（Ｊ　ＡＣＡ３　ＣＣＣＴＯＧＧＧＧＪＬＡｒｇ　Ｔｈｒ　 Ｐｒｏ　５ａｒ　Ａｊｐ　Ｌｙｅ　Ｐｒｅ　Ｖｌｌｌ　Ａ１１ｌ　Ｈｉｓ　Ｖａ ｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ（ｘｌ）配列：配列番号Ｓ： ＣＴｃ　ｃｃｃ入ＡＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＣＣＣＣＪ−αＫ　 ＴＣＣＡＧＧ　ＣＧＧ　ＴＧＣＴＴＧ　ＴＴＣ９６Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｅ　Ｌ ｙｓ　Ｔｈｒ　ＧＬｙ　Ｇｌｙ　ｐｒｏ　ＧＬｎ　Ｇｌｙ　Ｂａｒ　Ａｘｇ　Ａ ｒｇ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ・ｇｏ　−ｓｓ　・ｓｏ　−鴫５ ＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴｒｌ：　ＴＣ（ＴＴＣＣＴＧ　Ａπ（ｉＴＧ　ＧＣＡ　Ｇ ＧＣＧＣＣＡＣＣＡｃｅ　Ｃ’ｒＣＴＴＣ１４４Ｌ＠ｕ　５ａｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈ ｓ　５ａｒ　Ｐｈ＠Ｌａｕ　Ｘｉ＠ＶａＬ　Ａｌａ　Ｇｌｙん、ａ　Ｔｈｒ　Ｔ ｈｒ　Ｌａｕ　Ｐｈａ−４０−３！＋　−３０ ｔｃｃ　ｃｗ　ＣＴｃ　ＣＡＣｍ　ＧＧ＾Ｇ？’Ｇ　ＡＴＣＧＧＣＣＣＣｘＡＧ ＯＧＡＡ　ＧＡＱ　ＴＣＣＣＣＣ１！２Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｐｈ ａ　Ｇｌｙ　ＶａｌＡｌａ　Ｇａｙ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ｋｇ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　 Ｓａｔ　ＰｒロＡＧＧＧＡＣＣＴＣ？’ｉ　ＣＴＡ　Ａ’！’ＣＡＣＣＣＣＴ　 Ｃ’１℃ＧＣＣＣＡＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴ　２４０Ａｒｇ　Ａｓｐ 　Ｌａｕ　Ｂａｒ　Ｌａｕ　ＸＬ＠　Ｂａｒ　Ｐｒｏ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ 　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　５ｓｒＴ（”ｒＣＧＡＡｃＣＣｅＧＡＧＴ ＧｊＪ：ＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡ丁σＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＣＣＣ丁２８ ８ＳｅｒＡｒｇＴｈｒＰｒｏ５＠ｒＡｓｐＬ、ｙｍＰｒｏＶａｌＡｌａＨｉｓＶ ａｔＶａｌＡ１ｍＡｓロｐｒロ５　ｉｏ　１５　２０ ＣＩＩＪＬ　ＧｔｌＴ　ＧＡｌｌｍ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＴＩ：　ＧＡＧ　ＴＧ Ｇ　ＣＴＯＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣ）ＪＴ　ＧＣＣＣＴＣR３Ｇ Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌｓｕ　 Ａｊｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌａｕス５３０３５ ｅ丁ａ　ａｃｃ　ＡＡＡＧＧＣＧＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＧＡ　ＧＡτＡＡＣ こＡＧ　ｃ’ｒ’ｃ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　丁ＣＡ　３P１４ Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　ＪＬｊｎ　Ｇｌｙ　ＶａＩＧｌｕ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　 Ｊｕｎ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　５ｓｒ４０　４５　Ｓ。

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＜　Ｏｊ　−ｄ’Ｙ本ｆ ＦＩＧ、　ＩＣ（１ｏｆ　２） ＦＩＧ、　ＩＣ（２ｏｆ　２） 轡 ：＝３２：ｉ　５ｉＥ臣　＄； 旦芽　ミコ　旨須；■〜ミジ 含 ドξ　奪ジ　■　■　ｌ 瑚ジ　■　■　ｌ　師 Ｑ２！＜ロ　Ｕ−ωロ　く口 ３（Ｍ臣′Ｆ：、ｇ　：：　：： （Ｊ：ｌ　（Ｊα　くロ　υａ　−０口１−Ｗ　（ＪＷ　（Ｊα　く哨ω口α υ−くψ　Ｑ龜　（Ｊ（−（Ｊ（ 臼Ｉ＆ｌ　リα　ロ２−叶　叶 ＝ｔＪＩ＆＋　（−％Ｏ（−＼（ｊ＞ ｇＬ　（ｖＩ（Ｊ（！ｌ　ｗ−１（ＪＦｅ　Ｉ−Ｌ）眠　朋韮も〜■デど１ （５２ｖｓｔｓｚ　ｃｐｚ　−←（Ｑ騙５ポ　讐５ポ　ゝ５ポ　零８ポ　＃ｌ Ｕ−−υコ　くロ　ｃＪｔ！Ｊ　（Ｊ−＼←（Ｗｅ−１ａｌｃＪα　Ｕα　←く 口＞　ｆ’ｌ”）ＣＪ−（ＪＡ　υ（ｔＪ＞一＜＞　Ｌ！ｊＪ　（Ｊα ロロー　トく　ミに 一コ（りＵ　（り〉 ＣＪｌａＪ　ＣＪ騙　Ｑコ　くく ！：正　ｌ：ｌ＃″″“　ロー Ｕ−←口 （ＪＩａＪ　Ｌ）Ｌ　（−＜Ｊｔ！ｊ ＋−（１／Ｉ　←く　ｕα く−ロ（ｆＪ＞　υく Ｑく　く＞　ロα　−Ｕの Ｑ−１ロー Ｕ（ゆ（！ｌ　は芒　に≧七 駐　計　ボｙ−■ ＦＩＧ、３ ＡＢＣＤ １７ｋＤ−６，・ ＦＩＧ、４Ａ Ａ　ＢＣＤＥＦ ＦＩＧ、４Ｂ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６Ａ ＦＩＧ、　６Ｂ ＦＩＧ、７ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８１００　 ＡＢＮ ＤＹ ３９／３９５　ＡＥＢ　Ｄ　９２８４−４ＣＣ１２Ｎ　９／６４　９１５２−４ ８ ＧＯＩＮ　３３１５７３　Ａ　７０５５−２Ｊ／／　ＣＯ７Ｋ　５１０８３　８ ３１８−４Ｈ１４１５２５８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡ （Ｃ１２Ｎ　９／６４ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ１：９１） ９４５５−４Ｃ ９２８１−４Ｂ （７２）発明者　ペレス、カール アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２１２２゜サン　ディエゴ、ナンバー３２ ６．チャーマント　ドライブ　７２７５ Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＢＮ ＢＣ Ｃ１２Ｎ　１５１００　ＺＮＡ　Ａ （Ｃｌ２Ｎ　１５１００　ＺＮＡ　Ａ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　バレンベック、ロバート　エフ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４９０１゜サン　ラフアニル、スプリング 　グローブアベニュー　１３６ フロントページの続き （７２）発明者　シュエル、ディピッド　エイ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４０６５゜サウサリート、ナンバー３０７ ．シャーウッド　ドライブ　４２７ （７２）発明者　コス、カーストン　イー。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４５３０゜エル　セリート、ミア　ビスツ 　ドライブ

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．成熟腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）により引き起こされる疾患の予防薬または治療 薬を同定する方法であって、該成熟ＴＮＦはＴＮＦ転換酵素によるプロＴＮＦの 切断により該プロＴＮＦから生成され、該方法は以下の工程を包含する： （ａ）プロＴＮＦと、プロＴＮＦを切断するのに有効な量のＴＮＦ転換酵素とを 接触させる工程； （ｂ）工程（ａ）におけるプロＴＮＦの成熟ＴＮＦへの転換を測定する工程； （ｃ）さらに成熟ＴＮＦにより引き起こされる疾患の予防薬または治療薬として 同定されることが求められる分子を含有させて、工程（ａ）および（ｂ）を繰り 返す工程；（ｄ）工程（ｃ）におけるプロＴＮＦの成熟ＴＮＦへの転換を測定す る工程；および （ｅ）工程（ｂ）で測定される転換と、工程（ｃ）で測定される転換とを比較し 、該分子が成熟ＴＮＦによって引き起こされる疾患の適切な予防薬または治療薬 であるかどうかを決定する工程。
2. ２．前記プロＴＮＦが２６ｋＤ　ＴＮＦである、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記疾患が敗血症、リウマチ様関節炎、悪液質、脳性マラリア、ＡＩＤＳ、 および対宿主性移植片病からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. ４．前記疾患が敗血症である、請求項３に記載の方法。
5. ５．前記ＴＮＦ転換酵素がプロテイナーゼー３（ＰＲ−３）である、請求項１に 記載の方法。
6. ６．前記ＰＲ−３が天然のＰＲ−３である、請求項５に記載の方法。
7. ７．前記ＰＲ−３が組換えＰＲ−３である、請求項５に記載の方法。
8. ８．前記工程（ｂ）および（ｄ）におけるプロＴＮＦから成熟ＴＮＦへの転換が 、比色性ＴＮＦ転換酵素基質のＴＮＦ転換酵素切断を測定する比色アッセイによ り概算される、請求項１に記載の方法。
9. ９．成熟ＴＮＦにより引き起こされる疾患を治療するための治療または予防用化 合物であって、該成熟ＴＮＦはＴＮＦ転換酵素によるプロＴＮＦの切断により該 プロＴＮＦから生成され、該治療または予防用化合物は以下の工程を含む方法に より同定される（ａ）プロＴＮＦと、プロＴＮＦを切断するのに有効な量のＴＮ Ｆ転換酵素と接触する工種； （ｂ）工程（ａ）におけるプロＴＮＦの成熟ＴＮＦへの転換を測定する工程； （ｃ）さらに成熟ＴＮＦにより引き起こされる疾患の予防薬または治療薬として 同定されることが求められる分子を含有させて、工程（ａ）および（ｂ）を繰り 返す工程；（ｄ）工程（ｃ）におけるプロＴＮＦの成熟ＴＮＦへの転換を測定す る工程；および （ｅ）工程（ｂ）で測定される転換と、工程（ｃ）で測定される転換とを比較し 、該分子が成熟ＴＮＦによって引き起こされる疾患の適切な予防薬または治療薬 であるかどうかを同定する工程。
10. １０．前記プロＴＮＦが２６ｋＤ　ＴＮＦである、請求項９に記載の治療または 予防用化合物。
11. １１．前記疾患が敗血症、リウマチ様関節炎、悪液質、脳性マラリア、ＡＩＤＳ 、および対宿主性移植片病からなる群から選択される、請求項９に記載の治療ま たは予防用化合物。
12. １２．前記疾患が敗血症である、請求項１１に記載の治療または予防用化合物。
13. １３．前記ＴＮＦ転換酵素がプロテイナーゼー３（ＰＲ−３）である、請求項９ に記載の治療または予防用化合物。
14. １４．前記ＰＲ−３が天然のＰＲ−３である、請求項１３に記載の治療または予 防用化合物。
15. １５．前記ＰＲ−３が組換えＰＲ−３である、請求項１３に記載の治療または予 防用化合物。
16. １６．ＴＮＦ転換酵素によるプロＴＮＦの切断により該プロＴＮＦから生成され る成熟ＴＮＦにより引き起こされる疾患を治療するための治療用化合物であって 、ＴＮＦの非切断性変異タンパク質である化合物。
17. １７．前記非切断性の変異タンパク質がアミノ酸１位（バリン）またはアミノ酸 １３位（バリン）での置換または欠失を含む、請求項１６に記載の治療用化合物 。
18. １８．ＴＮＦ転換酵素によるプロＴＮＦの切断により該プロＴＮＦから生成され る成熟ＴＮＦにより引き起こされる疾患にかかっているまたはかかり易い患者を 治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に有効量のＴＮＦ転換 酵素のインヒビターを投与する工程を包含する、方法。
19. １９．前記プロＴＮＦが２６ｋＤ　ＴＮＦである、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．前記疾患が敗血症、リウマチ様関節炎、悪液質、脳性マラリア、ＡＩＤＳ 、および対宿主性移植片病からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法 。
21. ２１．前記疾患が敗血症である、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．前記ＴＮＦ転換酵素がプロテイナーゼ−３（ＰＲ−３）である、請求項１ ８に記載の方法。
23. ２３．前記ＰＲ−３が天然のＰＲ−３である、請求項２２に記載の方法。
24. ２４．前記ＰＲ−３が組換えＰＲ−３である、請求項２２に記載の方法。
25. ２５．前記インヒビターが式Ｂｏｃ−Ｘ−ｐ（ＯＰｈ）２を有するペプチドジフ ェニルホスホネートであり、ここでＸは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｐ ｒｏ−Ｖａｌ、およびＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓからなる群から選択されるオリゴ ペプチドである、請求項１８に記載の方法。
26. ２６．前記ＸがＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓである、請求項２５に記載の方法。
27. ２７．前記インヒビターがＰＲ−３に対する中和抗体である、請求項１８に記載 の方法。
28. ２８．ＴＮＦ転換酵素によるプロＴＮＦの切断により該プロＴＮＦから生成され る成熟ＴＮＦにより引き起こされる疾患を治療するための薬学的組成物であって 、有効量のＴＮＦ転換酵素のインヒビターおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含 有する、組成物。
29. ２９．前記疾患が敗血症、リウマチ様関節炎、悪液質、脳性マラリア、ＡＩＤＳ 、および対宿主性移植片病からなる群から選択される、請求項２８に記載の薬学 的組成物。
30. ３０．前記疾患が敗血症である、請求項２９に記載の薬学的組成物。
31. ３１．前記ＴＮＦ転換酵素がプロテイナーゼ−３（ＰＲ−３）である、請求項２ ８に記載の薬学的組成物。
32. ３２．前記ＰＲ−３が天然のＰＲ−３である、請求項３１に記載の薬学的組成物 。
33. ３３．前記ＰＲ−３が組換えＰＲ−３である、請求項３１に記載の薬学的組成物 。
34. ３４．前記インヒビターが式Ｂｏｃ−Ｘ−ｐ（ＯＰｈ）２を有するペプチドジフ ェニルホスホネートであり、ここでＸは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｐ ｒｏ−Ｖａｌ、およびＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓからなる群から選択されるオリゴ ペプチドである、請求項２８に記載の薬学的組成物。
35. ３５．前記ＸがＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓである、請求項３４に記載の薬学的組成 物。
36. ３６．式Ｂｏｃ−Ｘ−ｐ（ＯＰｈ）２を有するペプチドジフェニルホスホネート ：ここでＸは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、およびＶａ ｌからなる群から選択されるオリゴペプチドである。
37. ３７．前記ＸがＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓである、請求項３６に記載のペプチドジ フェニルホスホネート。
38. ３８．自己免疫疾患の患者を治療する方法であって、そのような治療が必要な患 者に有効量のＴＮＦ転換酵素のインヒビターを投与する工程を包含する方法。