NO304854B1 - FremgangsmÕte for screening av profylaktiske midler eller terapeutiske midler til sykdommer forÕrsaket av produksjon av moden tumornekrosefaktor (TNF) hormon - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for screening av profylaktiske midler eller terapeutiske midler til sykdommer forårsaket av, forverret av eller assosiert med produksjon av moden tumor nekrosefaktor (TNF) hormon, eller en eller flere lavere molekylvektsarter av nevnte modne proteinhormon, som blir produsert fra et TNF prohormon ved konvertasespaltning av nevnte prohormon.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig området immuno-logi/biokjemi, og spesielt utvikling av sammensetninger og fremgangsmåter for identifisering av inhibitorer av protein-hormondannelse og profylaktiske og terapeutiske anvendelser av inhibitorer for behandling av sykdommer assosiert med forhøyede nivåer av hormoner. Oppfinnelsen letter spesifikt identifikasjon av forbindelser som kan bli anvendt for å behandle forskjellige sykdommer, spesielt sepsis, AIDS og autoimmune sykdommer, og gir dermed legen alternative behandlingsregimer.

I U.S.A. alene utvikles nosocomial bacteremia i omtrent 194.000 pasienter, og av disse dør omtrent 75.000. Maki, D.G., 1981, Nosocomial Infect., (Dikson, R.E., Ed.), side 183, Yrke Medical Books, U.S.A. De fleste av disse dødsfalle-ne skyldes seks hoved gram-negative bacilli, og disse er Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus, Klebsiella, Enterobacter og Serratia. Den gjeldende behandlingen for bacterimia er administrasjon av antibiotika som dessverre har begrenset effektivitet.

Den nøyaktige patologien til bacteriemia er ikke fullstendig kjent, men det er kjent at bakterielle endotoksiner, lipopolysakkarider (LPS), er de primære årsaksmidlene. LPS består av minst tre signifikante antigene regioner, lipid A, kjernepolysakkaridet og O-spesifikt polysakkarid. Sistnevnte blir også betenget O-spesifikk kjede eller bare 0-antigen. Den O-spesifikke kjederegionen er et polysakkarid med lang kjede, dannet av repeterende polysakkaridenheter. Antall polysakkaridenheter varierer blant forskjellige bakterielle arter, og kan variere fra en til så mange som seks eller syv monosakkaridenheter. Den O-spesifikke kjeden varierer blant forskjellige gram-negative bakterier, mens lipid A og kjernepolysakkaridene er like, om ikke identiske.

På grunn av at LPS spiller en hovedrolle i sepsis, har forskjellige tilnærmelser blitt forsøkt for å nøytralisere dets aktivitet. For tiden eksisterer det betraktelig arbeid som foreslår at antistoff mot LPS snart vil være et verdifullt klinisk tilskudd til standard antibiotisk terapi.

LPS initierer en kaskade av biokjemiske hendelser som til slutt forårsaker pasientens død. Det antas at den andre hendelsen, etter introduksjon av LPS, er produksjonen av tumornekrosefaktor (TNF) som et resultat av LPS stimulering av makrofagceller. Det er blitt utført meget arbeid for å produsere nøytraliserende antistoffer mot TNF eller andre molekyler som kan inhibere dets septiske virkninger. Det er sannsynlig at antistoff mot TNF vil ha verdifulle kliniske anvendelser. Tracey, et al., 1987, Nature, 330-662.

TNF eksisterer i både membranbundete og oppløselige utskilte former. Decker, et al., 1987, J. of Immunol., 138-957; Kriegler, et al., 1988, Cell, 53-45. Humant TNF er blitt klonet og vist å bestå av et 17 kd polypeptid, pluss en uvanlig lang 76 aminosyreputativ signalledersekvens. 17 kd molekylet er et nøkkelmiddel involvert i initiering av den biokjemiske kaskaden som er ansvarlig for sepsis. Det er blitt foreslått av Kriegler, et al., 1988, Cell, 53-45, at TNF kan eksistere som både en membranbundet 26 kd form og en oppløselig form som tilsvarer 17 kd arten. 26 kd formen er forløperen, eller prohormonet, til det modne 17 kd molekylet. Det er videre blitt foreslått av Kriegler, et al. ovenfor, at de to formene av TNF kan ha forskjellige biologiske virkninger .

På grunn av at TNF spiller en nøkkelrolle ved dannelsen av sepsis, er det nødvendig å identifisere og utvikle anti-TNF profylaktiske/terapeutiske midler. Som nevnt ovenfor ser anti-TNF-antistoff ut til å være lovende, og er blitt vist å være effektiv i bavianer. Disse studiene har derimot omfattet anvendelse av ikke-humant TNF og ikke-humant TNF antistoff. Fra et praktisk standpunkt vil ikke-humant anti-TNF-antistoff ha begrenset terapeutisk anvendelse, på grunn av immunologisk forkastelse av antistoffet av pasientens immunsystem. Humant antistoff, eller genetisk omkonstruert antistoff bestående av den humane, konstante regionen og den variable regionen til mus, er derfor foretrukket.

TNF, i tillegg til å spille en kritisk rolle i sepsis, har nylig blitt vist å være involvert i initiering av ekspresjonen av det humane immunsviktviruset i humane celler som bærer viruset latent. Folks et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 86, s. 2365 (1989). Derfor vil forhindring eller inhibering av dannelsen av 17 kd eller lavere molekylvektsformer av TNF, være verdifullt profylaktisk for behandling av AIDS pasienter ved forhindring av virusekspresjonen som er latent i pasienten.

TNF spiller også en rolle i forskjellige -autoimmune sykdommer, spesielt arthritis. Duff, et al., 1987, International Conference on Tumor Necrosis Factor and Related Cytotoxins, vol. 175:10. Forbindelser eller fremgangsmåter for inhibering av TNF-virkningen vil derfor anvendes for behandling av forskjellige sykdommer med immunologisk opprinnelse.

I tillegg til antistoff blir det søkt etter andre molekyler med TNF lnhlbitorlsk aktivitet. Ikke-antistoff TNF inhibitorer er beskrevet av Seckinger, et al., 1988, J. Exp. Med., 167-151, og Seckinger, et al., 1989, J. Biol. Chem. 264-11966 og i europeisk patentsøknad nr. 88830365.8, oppfinnere Wallach, et al. Inhibitorene er tilstede i urinen til febrile pasienter, og er blitt renset og vist å ha molekylvekter på omtrent 27.000-33.000. Opptil nå er ingen inhibitorer blitt vist å være effektive for behandling av sepsis.

Fra det ovennevnte fremgår det at det er nødvendig å identifisere og utvikle ytterligere anti-TNF-inhibitorer, både antistoffbaserte eller andre, som effektivt kan bli anvendt for behandling av sepsis.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for screening av profylaktiske midler eller terapeutiske midler til sykdommer forårsaket av, forverret av eller assosiert med produksjon av moden tumor nekrosefaktor (TNF) hormon, eller en eller flere lavere molekylvektsarter av nevnte modne proteinhormon, som blir produsert fra et TNF prohormon ved konvertasespaltning av nevnte prohormon,

kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn:

a) kontakting av nevnte TNF prohormon med en effektiv mengde av nevnte konvertase; b) måling av omdanningen av nevnte TNF prohormon til nevnte TNF modne hormon eller en eller flere arter med lavere molekylvekt av nevnte modne hormon; c) gjentagelse av trinnene (a) og (b) ovenfor, og videre innbefattende et molekyl antatt å være identifisert som en profylaktisk eller terapeutisk sykdom forårsaket av, forverret av eller assosiert med produksjon av nevnte modne TNF hormon; d) måling av omdanning av nevnte TNF prohormon til nevnte modne TNF hormon eller lavere molekyl-vektsart i trinn (c); og e) sammenligning av mengden av omdanning av nevnte prohormon fra trinn (b) og (d), hvori en mindre

spaltning i trinn (d) enn i trinn (b) tyder på at molekylet ifølge trinn (c) er potensielt et

profylaktisk middel eller terapeutisk middel for en sykdom forårsaket av, forverret av eller assosiert med produksjon av modent TNF hormon eller en eller flere arter med lavere molekylvekt av moden TNF hormon.

Hensiktene ifølge oppfinnelsen vil fremkomme etter en betraktning av den detaljerte beskrivelsen av oppfinnelsen vist nedenfor. Figur 1. panel A, viser restriksjonskartet til DNA-sekvensen som koder for 26 kd TNF. Panel B viser et hydrofobisitets-plot av 26 kd TNF, og panel C viser DNA og aminosyresekvensene til molekylet. Figur 2 viser omdanningen av 26 kd TNF ved TNF-konvertase. Kolonnene (A), (B) og (C) viser forskjellige kontroller: TNF 6,8 cellelysat (A), 26 kd transkripsjon/translasjon (B) og inkubasjon (C) kontroller. Kolonnene D, E og F viser omdanningen av transkrlpsjon/translasjonsdannet 26 kd TNF til hovedsakelig 17 kd TNF ved konvertasen som enten er tilstede i HL 60 S-l cytosol uindusert (D) og indusert (E) fraksjonene, eller en P-l pelletfraksjon preparert fra induserte celler. G er en blank kolonne. Figur 3 viser virkningen av konvertaseinhibitorene ved omdanning av 26 kd TNF til formene med lavere molekylvekt, bestemt ved gelelektroforese. Kolonnnene A, B, C og D, ifølge panel 1, viser respektivt immunpresipitasjon av et cellelysat av pFVXM-TNF6 transfektert cellelinje TNF 6,8 (Kriegler, et al., 1988, i Cell, 53-45), immunpresipitasjon av in vitro transkribert/translatert 26 kd TNF, virkningen av (l-((3-((acetyloksyl )-7-metoksy-8-oksy-8-okso-5-tio-l-azabicyklo [4,2,0]okt-2-en-2-yl)karbonyl)morfolin, S,S-dioksid, (6R-cis) på omdanningen av 26 kd TNF, og omdanningen av 26 kd TNF i fravær av (l-((3-((acetyloksyl)-7-metoksy-8-oksy-8-okso-5-tio-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-2-yl)karbonyl)morfolin, S,S- dioksid, (6R-cis). Kolonnene A og B ifølge panel 2, viser henholdsvis immunpresipitasjon av et cellelysat av den pFVXM-TNF6-transfekterte cellelinjen TNF 6,8 (Kriegler, et al., 1988, i Cell, 53-45), og immunopresipitasjon av in vitro transkribert/translatert 26 kd TNF. Kolonne C og D viser omdanning av 26 kd TNF i nærvær og fravær av 3,4-diklor-isokoumarin. Kolonnene E og F viser omdanning av 26 kd TNF i nærvær og fravær av elastinal.

For å lette forståelsen av naturen og rammen av foreliggende oppfinnelse, er flere definisjoner vedrørende forskjellige aspekter av oppfinnelsen presentert nedenfor. Det fremgår at disse definisjonene er generelle i natur, og omfatter betydninger som er velkjente for fagfolk innenfor dette området.

Betegnelsene "prohormon" og "modent hormon" har følgende betydninger. Prohormon skal dekke proteiner, fortrinnsvis med immunologisk opprinnelse, der et peptidsegment av proteinet er fjernet i løpet av dets in vivo produksjon. Fjerning av peptidet tilveiebringer den "modne" formen av hormonet. Den foretrukne utførelsesformen av oppfinnelsen er 26 kd TNF prohormonet, som diskutert nedenfor, og som blir spaltet hovedsakelig til en 17 kd moden form. Andre spaltnings-produkter blir derimot også dannet fra prohormonet, og disse hører inn under betydningen av "modent" hormon. Til slutt er det viktig å merke seg at prohormoner i tillegg til TNF skal komme innenfor rammen av disse definisjonene, og er betraktet som en del av oppfinnelsen. Eksempler på prohormoner er CSF og IL-1.

Sepsis blir heri definert å bety en sykdom som er et resultat av en gram-positiv eller gram-negativ bakteriell infeksjon, idet sistnevnte hovedsakelig er forårsaket av bakteriell endotoksin, lipopolysakkarid (LPS). Det kan bli indusert av minst seks hoved gram-negative bacilli og disse er Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus, Klebsiella, Enterobacter og Serratia. TNF er en faktor som er detekterbar i den tidlige fasen av sykdommen, og som bidrar til denne prosessen. 17 kd molekylet, eller et kortere mutein som er kjent innenfor dette området, er de primære, aktive formene.

Som anvendt heri refererer TNF, som har en molekylvekt på omtrent 26.000, til prohormonformen av TNF. Det er kjent at det aminoterminale peptidet til prohormet varierer i lengde avhengig av artene som det er avledet fra, mens propeptid-segmentet til molekylet er sterkt konservert. I mus er omtrent Sb% av de 79 aminosyrene, som danner den putative ledersekvensen til prohormonet, identisk med de 79 kjente aminosyrene som omfatter prosekvensen til humant TNF. Det vil for fagfolk fremkomme at når det refereres nedenfor til TNF, som har en molekylvekt på omtrent 26.000, være kjent at det som indikeres er et molekyl som ikke er avledet fra en bestemt art, og som kan ha en noe endret ledersekvens sammenlignet med den humane sekvensen som er kjent innenfor dette området.

Betegnelsen "konvertase" eller "TNF konvertase" skal omfatte et enzym som normalt er tilstede i kroppen, og som er ansvarlig for spaltning av 26 kd TNF til én eller flere arter med lavere molekylvekt. Konvertase er vesentlig membranassosiert, til tross for at signifikant aktivitet er lokalisert i cytosolen. En annen egenskap til konvertase, er at det er hovedsakelig assosiert med celler som produserer TNF.

Begrepet "membran assosiert" som anvendt på TNF konvertase, angir en form av konvertasen som er vesentlig uoppløselig som angitt ved tilstedeværelse av det meste av konvertaseaktiviteten i en 30.000 xg pelletfraksjon.

"Rekombinant antistoff" refererer til antistoff hvori en del av hver av aminosyresekvensene til den tunge og lette kjeden, er homolog med den korresponderende sekvensen i antistoffet

avledet fra en bestemt art, eller som hører til en bestemt klasse, mens det gjenværende segmentet av kjedene er homologe med tilsvarende sekvenser i en annen. I et rekombinant antistoff, er den variable regionen til både lett og tung kjede et speilbilde av de variable regionene til antistoffet avledet fra en pattedyrart, mens de konstante regionene er homologe med sekvensene i antistoff avledet fra en annen.

I den mest generelle formen vedrører foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for identifisering av inhibitorer av sykdommer assosiert med produksjonen av modne hormoner fra deres prohormonformer. Den foretrukne utførelsesformen av et prohormon er 26 kd TNF, som blir spaltet til molekyler med lavere molekylvekt, spesielt som har en molekylvekt på 17.000, som er vesentlig involvert for dannelse av sepsis. Inhibitorer som kan interferere med omdanningen av 26 kd formen til TNF, er nyttig for forhindring eller behandling av sepsis.

Analysene beskrevet heri, detekterer omdanningen av et prohormon til dets modne hormonform, der den foretrukne utførelsesformen blir den enzymatiske omdanningen av formen av TNF med 26 kd molekylvekt til fortrinnsvis en 17.000 molekylvektsform. Enzymet ansvarlig for omdanningen, blir betegnet konvertase. Oppfinnelsen blir dermed lettest presentert i fire deler. Del en viser materialene og metodene for realisering av 26 kd formen av TNF. Del to identifiserer kildene av TNF konvertase, og fremgangsmåter for delvis rensing av enzymet. Del tre beskriver analyser for detek-tering og identifisering av forskjellige konvertaseinhibitorer. Til slutt viser del fire en beskrivelse av veier for anvendelse av inhibitorene for å behandle pasienter som lider av sepsis. Hver av disse delene vil nå bli beskrevet separat.

Flere patenter/patentsøknader og naturvitenskapelige referanser er referert til nedenfor. Foreliggende oppfinnelse er basert på noen av materialene og metodene nevnt i disse referansene, og disse referansene er derfor i sin helhet inkorporert som referanse.

Det er viktig å bemerke at en hvilken som helst prosedyre som muliggjør å måle omdanningen av 26 kd TNF artene, kan bli anvendt for å identifisere inhibitorer av TNF. Selv om de rekombinante systemene beskrevet nedenfor gjør 26 kd molekylet oppnåelig i betraktelige mengder, og derfor letter analysering for TNF inhibitorer, er det å bemerke at ikke-rekombinante systemer også kan bli anvendt. Det er videre blitt vist at 26 kd molekylet kan bli identifisert i stimulerte monocytter. Dette er beskrevet av Kriegler, et al., 1988, Cell, 53:45. En egnet analyseprosedyre er å stimulere monocytter til å produsere 26 kd molekylet, og deretter i nærvær av konvertase, måle bortgangen av molekylet til en art med lavere molekylvekt, fortrinnsvis arten med molekylvekt på 17.000.

Med hensyn på omdanningen av 26.000 molekylet, konvertasen, som fremkommer nedenfor, spaltes molekylet ved et indre sete, og kanskje flere. Hovedsetet er ved grensen som separerer den utskilte formen av TNF, dvs. arten med molekylvekt på 17.000 fra ledersekvensen. Sekvensen ved denne grensen er -Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-. Hovespaltningen oppstår mellom alanin og valin, siden valin er kjent for å være den aminoterminale aminosyren til molekylet med molekylvekt på 17.000. Flere andre arter av TNF blir produsert av konvertase, og disse er derved produktene av de sekundære spaltningssetene. Uansett om 26.000 molekyler blir spaltet ved ett eller flere seter, er dette, når det gjelder identifikasjon av inhibitorer for sepsis, av stor viktighet på grunn av at foreliggende analyse kan registrere enten inhibisjonen av omdanningen av 26.000 TNF formen eller tilsynekomsten av en form med lavere molekylvekt.

TNF, enten 26 kd eller 17 kd formene, er blitt klonet og uttrykt i et antall systemer. For eksempel er kloning av kanin TNF beskrevet i EP 146.026, publisert 26. juni 1985 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) og EP 148.311, publisert 17. juli 1985 (Asahi Kasei Kogyo Kabushiki). Kloningen av humant TNF med 151 og 155 aminosyrer (2 og 6 mindre enn den native formen) er beskrevet i EP 155.549, publisert 25. september, 1985 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), og humant TNF som har 155 aminosyrer er beskrevet i EP 158.286, publisert 16. oktober, 1985 (Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha) og tilsvarende GB 1.158.829A, publisert 20. november, 1985. Kloningen av modent TNF (157 aminosyrer) og forskjellige modifiserte former (muteiner) derav, er beskrevet i EP 168.214, publisert 15. januar, 1986 (Genentech) og PCT US 85/01921, inngitt 3. oktober, 1985, (Cetus Corporation). Sistnevnte, PCT 85/01921, tilsvarer W0 86/02381.

I tillegg viser U.S. patent nr. 4.677.063 og 4.677.064 cDNA-sekvenser som koder for 26.000 og 17.000 former av TNF, samt muteiner av disse molekylene.

cDNA-sekvensen som koder for 26 kd TNF arten, blir fortrinnsvis oppnådd fra plasmid pBll, beskrevet i W0 86/02381; og U.S. patenter nr. 4.677.063 og 4.677.064. Plasmidet pBll inneholder SV40 promoteren operabelt bundet til den TNF kodende sekvensen, og er derfor nyttig for uttrykking av 26 kd TNF srtene i eukaryote vertsceller. Et annet plasmid som inneholder hele sekvensen som koder for 26 kd TNF, arten er i tillegg beskrevet i ovennevnte U.S. patentsøknad og patenter. Det er betegnet pE4. Plasmidet pE4 er deponert til American Type Culture Collection, aksesjonsnr. 39894.

cDNA-sekvensen som koder for 26 kd TNF arten er tilstede i plasmid pBll som et Pstl fragment. Det blir derfor lett fjernet og skutt inn i hvilke som helst av et antall egnede ekspresjonssystemer. Det foretrukne ekspresjonssystemet er

plasmid pFVXM, som er deponert til American Type Culture Collection og har aksesjonsnr. 67.103.

pFVXM er en retroviral vektor som var avledet fra plasmidet pEVX, beskrevet av Kriegler, et al., 1984, i Cell, 38:483. pEVX har et Moloney murint leukemivirusavledet spleisedonor-sete 3' til 5' lang terminal gjentagelse. Det ble tidligere vist at denne spléisedonorsekvensen reduserer utbyttet av riktig spleisede translasjonene templater fra retrovirale konstruksjoner. pEVX ble derfor konstruert for å fjerne spleisedonorsetet, og erstattet med et analogt Sma I-fragment fra Harvey murint sarcoma virus genom, som mangler Moloney murin leukemivirus spléisedonorsekvensen. Den resulterende vektor, pFVXM, mangler Moloney murin leukemivirusspleiset donorsekvens, og bærer en viral pakkesekvens. pFVXM har et hensiktsmessig Pst I-sete, der DNA-sekvensene som koder for 26 kd TNF artene kan bli skutt inn.

Forskjellige biologiske materialer er tilgjengelige som kilder for konvertaseaktivitet. Disse omfatter vev, celler eller ekstrakter, eller fluider assosiert dermed, som er fortrinnsvis, men ikke nødvendigvis, av immunologisk opprinnelse. Videre kan etablerte cellelinjer også bli anvendt. Egnede kilder omfatter humane, perifere blodnukleære celler så som leukocytter eller cellelinjer med leukocytt-opprinnelse, fortrinnsvis cellelinjen HL60. På grunn av letthet ved manipulering av etablerte cellelinjer, er foretrukket konvertasekilde HL60. Omdanning av 26 kd TNF arten til 17 kd arten, kan oppnås ved kombinering av 26 kd arten med enten intakte HL60 celler, ekstrakter avledet derfra eller media der HL60 cellene ble dyrket, og som derfor inneholder konvertaseaktivitet. I noen celletyper er konvertaseaktivitet tilstede i kulturmediet etter hensiktsmessig stimulering som er diskutert nedenfor. På grunn av at konvertaseaktiviteten delvis er membranassosiert, er det mulig å oppnå en membranfraksjon som kan bli anvendt. Prosedyrene for isolering av monocytter er velkjente innenfor fagområdet, og det er også andre fremgangsmåter for dyrking av cellelinjer så som HL60. Moncytter kan bli fremstilt fra perifert blod ved sentrifugering først gjennom Ficoll-paque og percoll (49,2$) ved anvendelse av standard prosedyrer. Dette tilveiebringer en anriket populasjon av monocytter og lymfocytter, og monocyttene kan videre bli anriket ved utsåeing av blandingen av celler på vevskulturskåler og inkubering av cellene i en tid som er tilstrekkelig for å muliggjøre at monocyttene adhererer til overflaten av skålene. Lymfocyttene blir deretter vasket av skålene, og etterlater bare adherente monocytter. Disse cellene kan deretter bli anvendt som de er, eller kan bli stimulert for å produsere høyere nivåer av konvertase ved anvendelse av kjente monocyttaktivatorer, fortrinnsvis lipopolysakkarid og forbol myristatacetat. Cellene kan bli fraksjonert, og enten et ekstrakt eller en membranfraksjon kan bli fremstilt derifra og anvendt i analysene beskrevet nedenfor.

Inhibitorer av konvertaseaktivitet kan også være profylaktiske midler eller terapeutiske midler som kan bli anvendt for behandling av sepsis. De kan bli identifisert ved anvendelse av ovennevnte analyse, og videre inkludert i analysereaksjons-blandingsforbindelsene som skal bli testet for lnhlbitorlsk aktivitet. En egnet analyse består av kombinering av 26 kd TNF, konvertase og en putativ inhibitor. Fagfolk er innforstått med at det inhibitoriske materialet kan bli tilsatt til konvertasen før konvertasen blir tilsatt til TNF, eller den kan bli tilsatt til TNF før, eller rett etter, tilsetning av konvertasen. Rekkefølgen av tilsetningen kan lette identifikasjonen av inhibitorene, men er ikke avgjørende. Dersom en forbindelse har inhibitorisk aktivitet, kan dette sees ved elektroforetisk analyse av oppløsningen som vil vise en reduksjon i mengden av 26 kd arten, og tilstedeværelse av TNF molekyler med lavere molekylvekt.

I tillegg til identifisering av forbindelser med ikke antatt anti-konvertaseaktivitet, vil flere forbindelser ha sterk inhibitorisk aktivitet, så som anti-konvertase-antistoff, enten polyklonalt eller monoklonalt, eller rekombinant antistoff, fortrinnsvis humanisert. Monoklonalt antistoff mot konvertase kan bli fremstilt ved anvendelse av de generelle fremgangsmåtene beskrevet av Kohler, G. og Milstein, C, 1975, Nature, 256-495, som er blitt modifisert i de senere årene som kjent innenfor dette området. Disse opprinnelige studiene innbefatter kondensering av murine lymfocytter og medikamentselekterbare plasmacytomas for å produsere hybridomer. Teknikken er derfor blitt anvendt for å fremstille hybride cellelinjer som utskiller humane, monoklonale antistoffer. Sistnevnte prosedyrer er generelt beskrevet i Abrams, P. , 1986, Methods in Enzymology, 121:107, men andre modifikasjoner er kjent innenfor dette området. Uansett om murint eller humant antistoff blir produsert, blir cellene som utskiller antistoffet kombinert med fusjonspartneren og cellene kondensert med et egnet kondenseringsmiddel, fortrinnsvis polyetylenglykol, og mere foretrukket er polyetylenglykol 1000. Sistnevnte blir tilsatt til en cellepellet inneholdende antistoffutskillende celler og fusjonspartneren i små mengder over en kort tidsperiode etterfulgt av forsiktig agitasjon. Etter tilsetning av fusjonsmidlet, blir celleblandingen vasket for å fjerne fusjonsmidlet og eventuelt cellulært debris, og celleblandingen bestående av kondenserte og ukondenserte celler blir sådd ut i hensiktsmessige cellekulturrom inneholdende selektivt vekstmedium. Etter en periode på flere uker er hybride celler synlige og kan bli identifisert med hensyn på antistoffproduksjon, og subklonet, for å forsikre tilgjengeligheten av en stabil hybridcellelinje.

Det foretrukne antistoffet er humant, monoklonalt antistoff som kan bli fremstilt fra lymfocytter sensibilisert med konvertase, enten in vivo eller in vitro, ved udødeliggjøring av antistoffproduserende hybride cellelinjer, for derved å gjøre en permanent kilde av det ønskede antistoffet tilgjengelig. In vivo immuniseringsteknikker er velkjente innenfor dette området, mens in vitro teknikker generelt er beskrevet av Luben, R. og Mohler, M., 1980, Molecular Immunology, 17:635, Reading, D. Methods in Enzymology, 121 (del en): 18, eller Voss, B., 1986, Methods in Enzymology, 121:27. Et antall in vitro immuniseringssystemer er blitt vist å være effektive for sensibilisering av humane B-celler. Reading, C, 1982, J. of Immun, Methods, 53:261.

Det fremgår for fagfolk at i lys av immunisering av individer direkte med konvertase, kan lymfocytter bli isolert fra individer som gjennomgår, eller som har gjennomgått, et bakteremisk angrep. En fraksjon av disse lymfocyttene vil bli sensibilisert for konvertasen, og kan bli anvendt for å produsere permanent antistoffutskillende hybride cellelinjer. Immunokomprimerte humane pasienter er f.eks. generelt mottagelige for bakterielle infeksjoner, spesielt de som lider av forskjellige ondartetheter, omfattende brannsår osv. og lymfocytter isolert derifra kan være en kilde for antistoffutskillende celler.

Sensibiliserte lymfocytter kan bli udødeliggjort ved viral transformasjon. Den foretrukne virale transformasjonsteknik-ken for humane lymfocytter omfatter anvendelse av Epstein-Barr-virus. Viruset kan transformere humane B-celler, og er blitt anvendt for å danne humane monoklonale antistoffer. Crawford, D. et al., 1983, J. of General Virology, 64:697; Kozbor, V. og Roder, J., 1983, J. Immun. Today, 4:72.

En annen fremgangsmåte hvorved sensibiliserte lymfocytter kan bli udødeliggjort, består av en kombinasjon av ovennenvte to teknikker, som er viral transformasjon og cellefusjon. Den foretrukne kombinasjonen består av transformering av antistoffutskillende celler med Epstein-Barr-virus, og deretter kondensering av de transformerte cellene til en egnet fusjonspartner. Fusjonspartneren kan være en musemye- lomcellelinje, en heteromyelomlinje eller en human myelomlin-je eller en annen udødeliggjort cellelinje. PCT-patentsøknad nr. 81/00957; Schlom et al., 1980, PNÅS USA, 77:6841; Croce et 1., 1980, Nature, 288:488. Den foretrukne fusjonspartneren er en muse-human heterohybrid, og mere foretrukket er cellelinjen betegnet F3B6. Denne cellelinjen er deponert til American Type Culture Collection, Accesslon nr. HB8785. Den ble deponert 18. april, 1985. Fremgangsmåtene for dannelse av F3B6 er beskrevet i europeisk patentsøknad, publikasjonsnr. 174.204.

Teknikker som kan anvendes for anvendelse av Epstein-Barr-virustransformasjon og produksjon av udødelige, antistoffutskillende cellelinjer, er presentert av Roder, J. et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:140. Prosedyren består hovedsakelig av isolering av Epstein-Barr-virus fra en egnet kilde, vanligvis en infisert cellelinje, og eksponering av målantistoffutskillende celler for supernatanter som inneholder viruset. Cellene blir vasket og dyrket i et hensiktsmessig cellekulturmedium. Deretter kan viralt transformerte celler som er tilstede i cellekulturen, bli identifisert ved tilstedeværelse av Epstein-Barr-viralt kjerneantigen, og transformerte antistoffutskillende celler kan bli identifisert ved anvendelse av standardmetoder som er kjent innenfor dette området.

Det er å bemerke at idet den foretrukne utførelsesformen av foreliggende oppfinnelse er nøytralisering av anti-konvertase monoklonalt antistoff, enkeltvis eller i kombinasjon, kan antistoffet (antistoffene) bli endret og fortsatt opprettholde biologisk aktivitet. Innbefattet innenfor rammen av oppfinnelsen, er derfor antistoff modifisert ved reduksjon til fragmenter med forskjellig størrelse, så som F(ab')2, Fab, Fv el.l. De hybride cellelinjene som produserer antistoffet, kan også bli betraktet som en DNA-kilde som koder for det ønskede antistoffet som kan bli isolert og overført til celler ved kjente genetiske teknikker, for å produsere genetisk omkonstruert antistoff. Et eksempel på sistnevnte, vil være produksjon av enkeltkjedet antistoff som har antistoff-kombineringssetet til hybridomene beskrevet heri. Enkeltkjedeantistoff er beskrevet i U.S. patent nr. 4.704.692. Et annet eksempel på genetisk omkonstruert antistoff er rekombinant eller chimerisk antistoff. Fremgangsmåter for rekombinant antistoff er vist i U.S. patent nr. 4.816.567, oppfinner Cabilly, et al.; japansk patent-søknad, serie nr. 84169370, inngitt 15. august 1984; britisk patentsøknad 8422238, inngitt 3. september 1984 og japansk patentsøknad nr. 85239543, inngitt 28. oktober 1985. Britisk patentsøknad nr. 867679, inngitt 27. mars 1986, beskriver også fremgangsmåter for fremstilling av et endret antistoff, der i det minste en del av de komplementære bestemmende regionene (CDR) i de variable domenene til lette eller tunge kjeder, er blitt erstattet av analoge deler av CDR fra et antistoff med annen spesifisitet. Ved anvendelse av prosedyrene beskrevet deri, er det mulig å konstruere rekombinant antistoff som har CDR-regionen til en art podet på antistoffet fra en annen art som har erstattet CDR-regionen. Den foretrukne utførelsesformen i dette tilfellet er et murint anti-konvertase antistoff CDR-region som erstatter CDR-regionen til humant antistoff.

I tillegg til antistoff, vil forbindelser som konkurrerer med 26 kd TNF for binding til konvertase, inhibere eller redusere omdanningen av 26 kd TNF til 17 kd formen, og derfor være nyttig for medikamenter for behandling av sepsis. En slik klasse av reagenser består av peptider eller proteiner, eller andre forbindelser som kan fremstilles eller som er naturlig forekommende, som har lignende konvertasebindingsaktivitet som 26 kd formen av TNF. Foretrukket innenfor denne klassen er peptider eller proteiner som har aminosyresekvenser som ligner de som finnes ved grensen mellom 26 kd TNF og 17 kd artene. Denne sekvensen er Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser, der Ala er resten tilstede på den delen av TNF som er igjen i membranen etter spaltningen, og Val er den N-terminale aminosyren til 17 kd TNF. Det er viktig å bemerke at sekvensen viser at den består av 7 aminosyrer, og det minste er en dipeptidsekvens som blir gjenkjent av konvertasen og som er Ala-Val. På grunn av at dipeptidsekvensen kreves som en del av et inhibitorisk peptid eller protein, kan sistnevnte også ha ytterligere aminosyrer som forsterker, eller som er nødvendige, for dipeptidsekvensen, for å bindes til konvertasen og inhibere den enzymatiske aktiviteten derav.

En alternativ utførelse av en peptid/protein konvertasein-hibitor er en som har aminosyresekvensen, en sekvens som er funkjsonelt lik: Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala. Dette peptidet dekker begge konvertase-spaltningsseter, og vil derfor forhindre dannelsen av 17 kd formen av TNF og former med lavere molekylvekt. Det første og dominante spaltningssetet er mellom alanin og valin ved posisjonene -1 og +1; og det andre setet er mellom prolin og valin i posisjonene +12 og +13. Disse posisjonene tilsvarer aminosyresekvensen vist i figur 1.

En annen klasse av konkurrerende inhibitorer består av forbindelsene som har sekvensen vist ovenfor, dvs. Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser eller Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala, men der aminosyrene er blitt mutert eller deletert for å tilveiebringe et ikke-spaltbart substrat. En foretrukket utførelsesform av dette peptidet, er et 26 kd ikke-spaltbart TNF-mutein, produsert ved standard setespesifikke mutageneseteknikker. Mest foretrukket er et mutein hvori alanin og/eller valin er substituert eller deletert.

Peptidene beskrevet ovenfor kan bli fremstilt ved teknikker som er velkjente innenfor dette området, så som f.eks. Merrifield fastfasemetoden beskrevet i Science, 232:341-347

(1985). Fremgangsmåten kan anvende kommersielt tilgjengelig synteseapparatur, så som en Biosearch 9500 automatisert peptidmaskin, der spaltningen av de blokkerte aminosyrene oppnås med hydrogenfluorid, og peptidene blir renset ved preparativ HPLC ved anvendelse av et Waters Delta Prep 3000 instrument, på en 15-20 pm Vydac C4 PrepPAK-kolonne.

Videre er det viktig å være klar over det faktum at spesifi-siteten til konvertasen er lik enzymer som elastase, dvs. som fortrinnsvis spalter mellom nøytralt ladete aminosyrer så som mellom valin, prolin og alaninresidier. I tillegg til peptidinhibitorene nevnt ovenfor, vil derfor også forskjellige andre inhibitorer kjent for å inhibere elastase, også generelt inhibere enzymet som spalter TNF. Ved anvendelse av analysen beskrevet nedenfor, kan de forbindelsene som inhiberer konvertasen, bli identifisert. Forskjellige elastaseinhibitorer er kommersielt tilgjengelige, se for eksempel Boehringer Mannheim Biochemicals kataloger, eller er kjente innenfor fagområdet. Doherty, et al., 1986, Nature, 322:192; U.S. patent nr. 4.711.886, 4.797.396, 4.717.722 og 4.699.904. Foretrukne elastaseinhibitorer er modifiserte cefalosporin-antibiotika, så som vist av Doherty et al., ovenfor. Mere foretrukket er (l-((3-((acetyloksyl)-7-metoksy-8-oksy-8-okso-5-tio-l-azabicyklo[4.2.0]okt-2-en-2-yl)-karbon-yl )morfolin, S,S-dioksid, (6R-cis). Også Stetler et al., 1986, Nucleic Acids Research, 14:7883, beskriver en cDNA-klon som koder for en inhibitor av neutrofil elastase.

De fleste av de rekombinante teknikkene som er beskrevet heri, kan bli anvendt for å transformere celler, fremstille vektorer, ekstrahere messenger RNA o.l., og blir anvendt innen bioteknologi, og de fleste som praktiserer disse teknikkene, er kjent med standardmaterialene og metodene som blir anvendt. Følgende paragrafer angis som retningslinjer. Konstruksjon av egnede vektorer inneholdende den ønskede TNF-kodende sekvensen, anvender standard ligerings- og restrik-sjonsteknikker som er velkjente. Isolerte vektorer, DNA-sekvenser eller syntetiserte oligonukleotider blir spaltet, skreddersydd og religert i ønsket form.

Setespesifikk DNA-spaltning blir utført ved å behandle med egnet restriksjonsenzym, under betingelser som er generelt kjente innenfor området, og detaljer som er spesifisert av fremstilleren av disse kommersielt tilgjengelige restrik-sjonsenzymene. Se f.eks. New England Biolabs, Product Catalog. Generelt blir omtrent 1 pg plasmid eller DNA-sekvens spaltet med en enzymenhet i omtrent 20 pl bufferoppløsning. I eksemplene heri, blir vanligvis et overskudd av restriksjonsenzym anvendt for å forsikre fullstendig spaltning av DNA-substratet. Inkubasjonstider på omtrent en time til to timer ved omtrent 37" C, kan anvendes til tross for at variasjoner kan tolereres. Etter hver inkubasjon blir protein fjernet ved ekstrahering med fenol/kloroform, og kan bli etterfulgt av eterekstraksjon, og nukleinsyren fjernet fra de vandige fraksjonene ved presipitasjon med etanol etterfulgt av kromatografi ved anvendelse av en Sephadex G-50 spinnkolonne. Om ønskelig kan størrelses-separasjon av de spaltede fragmentene bli utført ved polyakrylamidgel eller agarosegelelektroforese ved anvendelse av standard teknikker. En generell beskrivelse av størrelsesseparasjoner finnes i Methods Enzymology, 1980, 65:499-560.

Restriksjonsspaltede fragmenter kan bli butt-endet ved behandling med det store fragmentet av E.coli DNA-polymerase I, dvs. Klenow-fragmentet, i nærvær av de fire deoksynukleo-tid-trifosfåtene (dNTP) ved anvendelse av inkubasjonstider på omtrent 15 til 25 minutter ved 20 til 25° C i 50 mM Tris pH 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6 mM DTT og 10 mM dNTP. Etter behandling med Klenow, blir blandingen ekstrahert med fenol/kloroform og etanolpresipitert. Behandling under hensiktsmessige betingelser med Sl nuklease, resulterer i hydrolyse av enkelt-trådete deler.

Ligeringer blir utført i 15-30 pl volumer under følgende standardbetingelser og temperaturer: 20mM Tris-Cl pH 7,5, 10

mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 pg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl og 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) enheter T4 DNA-ligase ved 4°C for

"klebrig ende" ligering, eller for "butt ende"-ligeringer. Intermolekylære "klebrig ende"-ligeringer blir vanligvis utført ved 33-100 pg/ml total DNA-konsentrasjon. I butt-endeligeringer er den totale DNA-konsentrasjonen til endene omtrent 1 pM.

Ved konstruksjon av vektorer ved anvendelse av "vektor-fragmenter", blir vektorfragmentet vanligvis behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase (BAP) for å fjerne 5'-fosfatet og forhindre religering av vektoren. BAP-splatninger blir utført ved pH 8 i omtrent 150 mM Tris, i nærvær av Na+ og jflg+2 ved anvendelse av omtrent 1 enhet BAP pr. pg vektor ved 60"C i omtrent 1 time. Nukleinsyrefragmentene blir isoler ved ekstrahering av preparatet med fenol/kloroform, etterfulgt av etanolpresipitering. Alternativt kan religering bli for-hindret i vektorer som er blitt dobbelt-spaltet ved ytterligere restriksjonsenzymspaltning av de uønskede fragmentene.

I konstruksjonene angitt nedenfor, blir riktige ligeringer bekreftet ved først transformering av den hensiktsmessige E. coli-stammen med ligeringsblandingen. Vellykkede transformanter blir selektert ved resistens overfor ampicillin, tetracyklin eller andre antibiotikaer, eller ved anvendelse av andre markører avhengig av metoden for plasmidkonsentra-sjon, som fremgår av dette området. Miniprep DNA kan bli fremstilt fra transformanter ved fremgangsmåten til D. Ish-Howowicz et al., 1981, Nucleic Acids Res., 9:2989, og analysert ved restriksjon og/eller sekvensert ved dideoksyme-toden til F. Sanger et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei.

(USA), 74:5463, som ytterligere beskrevet av Messing et al., 1981, Nucleic Acids Res., 9:309, eller ved fremgangsmåten til Maxam et al., 1980 Methods in Enzymology, 65:499.

Verts-stammer anvendt for kloning i M13, består av E.coli-stammer mottagelige for faginfeksjon, så som E.coli K12-stamme DG98 blir anvendt. DG98-stammen er blitt deponert til ATCC, 13. juli 1984, og har aksesjonsnummer 1965.

Avhengig av hvilken vertscelle som blir anvendt, blir transformasjonen utført ved anvendelse av standardteknikker som er hensiktsmessige for slike celler. Kalsiumbehandling som anvender kalsiumklorid, som beskrevet av S.N. Cohen, 1972 Proe. Nati. Acad. Sei (USA) 69:2110, eller RbCl2-metoden beskrevet av Maniatis et al., 1984, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor press, s. 254, kan bli anvendt for prokaryoter. Transfeksjon kan også oppnås ved anvendelse av en modifikasjon av kalsiumfosfatpresipita-sjonsteknikken til Graham, F.L. et al., 1973 Virology 52:456 eller Wigler et al., 1978, Cell, 14:725.

Syntetiske oligonukleotider ble fremstilt ved triestermetoden til Matteucci et al., 1981, J. Am Chem. Soc. 103:3185, eller ved anvendelse av kommersielt tilgjengelig oligonukleotid-synteseapparatur. Kinasebehandling av enkelt-tråder før sammensmeltning eller for merking, oppnås ved anvendelse av et overskudd, fortrinnsvis omtrent 10 enheter polynukleotidkinase til 0,1 nmol substrat i nærvær av 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5mM ditiotreitol, 1-2 mM ATP, 1,7 pmol gamma<32>P-ATP (2,9 mCi/mmol), 0,1 mM spermidin, 0,1 mM EDTA.

Mutagenese kan bli utført ved anvendelse av et hvilket som helst antall prosedyrer som er kjent Innenfor dette området. Disse teknikkene er beskrevet av Smith, 1985, Annual Review og Genetics, 19:423, og modifikasjoner av noen av teknikkene er beskrevet i Methods in Enzymology, 154, del E, (eds.) Wu og Grossman (1978), kat. 17, 18, 19 og 20. Den foretrukne prosedyren er en modifikasjon av Duplex sete-rettet mutagenesemetoden. Den generelle prosedyren er beskrevet av Kramer et al., i kapittel 17 til Methods in Enzymology, ovenfor .

Konvensjonelle M13 mutagenesemetoder omfatter sammensmeltning av et kort, syntetisk oligonukleotid til enkelt-trådet M13 DNA, som har en klonet målkodende sekvens som antas å bli mutagenisert. Oligonukleotidet er nesten, men ikke fullstendig, komplementært til målsekvensen, og har minst ett feilparet nukleotid. Etter sammensmeltningsreaksjonen må den gjenværende delen av enkelt-trådet DNA bli ifylt for å tilveiebringe heterodupleks DNA som kan bli transfektert inn i en egnet vertscelle, som muliggjør ekspresjon av mutasjonen. I den gapinneholdende dupleksmetoden, blir en delvis DNA dupleks konstruert som har bare målregionen eksponert, ulikt de konvensjonelle fremgangsmåter som har målregionen og resten av enkelt-trådet M13 DNA eksponert. Som de konvensjonelle metodene, blir et kort oligonukleotid sammensmeltet til målregionen og utvidet og ligert for å produsere en heterodupleks. På grunn av at bare en liten del av enkelt-trådet DNA er tilgjengelig for hybridisering i den gapinneholdende dupleksmetoden, blir oligonukleotidet ikke sammensmeltet til uønskede seter innenfor M13 genomet. Denne fremgangsmåten har videre den ytterligere fordel av å innføre få feil i løpet av dannelsen av heterodupleksen, på grunn av at bare en liten region av DNA på en av sidene til målregionen må bli ifylt.

Den gapinneholdende dupleks-metoden omfatter spesifikt kloning av mål-DNA-sekvensen inn i en hensiktsmessig M13 fag som inneholder selekterbare markører, så som f.eks. stopp-kodon ambermutasjonen. Sistnevnte muliggjør for negativ seleksjon i en vertscelle som ikke kan undertrykke virk-ningene av mutasjonen. Fagen er fortrinnsvis M13mp9 som inneholder to amberkodoner i de kritiske fag-genene. Sekvensen som koder for 26 kd TNF, blir derfor klonet inn i M13mp9 amber+, og enkelt-trådet DNA blir fremstilt derifra ved anvendelse av standardteknikker. Deretter blir dobbelt-trådet replikativ form DNA fra M13 GAP, et genetisk omkonstruert M13 derivat som mangler amberkodonene, spaltet med Hine II-restriksjonsenzymet. Basesekvensen til M13 GAP er lik M13ml8, som mangler både amberkodonene og sekvensen mellom baseparene 6172 og 6323. Denne delesjonen flankerer de multiple kloningssetene til M13mp-seriene og danner et unikt Hine II-sete. Gapinneholdende dupleks DNA blir dannet ved anvendelse av standard DNA/DNA hybridiseringsteknikker, bestående av enkelt-trådet DNA som har amberkodonene og en andre tråd av DNA fra Hine II spaltet M13 GAP som mangler både amberdokonene og TNF-kodende sekvenser. Dermed, den eneste delen av dupleksen med GAP som er eksponert, er 26 kd TNF målsekvensen. Det ønskede oligonukleotidet blir sammensmeltet til GAP-inneholdende dupleks-DNA, og eventuelle gjenværende gap blir ifylt med DNA-polymerase og og nikkene forseglet med DNA-ligase for å danne en heterodupleks. Sistnevnte blir transfektert, fortrinnsvis i en feilparet repareringssviktende vert, og blandet fag blir dannet. Fra den blandende fag-populasjonen kan fag Inneholdende umutert 26 kd TNF DNA, som også har ambermutasjonene, bli selektert mot, ved infisering av den blandede fag-populasjonen Inn i en vertscelle som ikke kan undertrykke ambermutasjonen. Kloner kan deretter bli utskilt for fag som inneholder den ønskede TNF-mutasj onen.

Forbindelser identifisert å ha konvertaseinhibitorisk aktivitet, vil også ha profylaktiske eller terapeutiske anvendelser for behandling av sepsis. På grunn av at forløpet for sepsis er assosiert med en økning i sirkulerende TNF, kan disse inhibitorene bli anvendt profylaktisk i de tilfellene hvor det er risiko for bakteriell infeksjon, spesielt i et preoperativt oppsett. Likeledes i de tilfellene hvor det er en tidlig diagnose på sepsis, vil inhibitorene ha fordelak-tige, terapeutiske virkninger for vesentlig redusering av mengden av TNF som blir produsert.

En annen medisinsk anvendelse for inhibitorer av konvertase, er for behandling av AIDS. Det er blitt vist at TNF forårsaker aktivering av latent, human immunsviktvirus. Folks et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 86, s. 2365 (1989). Forhindring eller inhibering av dannelsen av 17 kd, eller lavere molekylvektsformer av TNF ved inhibering av konvertase, kan være verdifull profylakse for behandling av AIDS, og vil fortrinnsvis bli anvendt for å behandle pasienter som er infisert med viruset som er i en latent fase.

Nedenfor følge eksempler som illustrerer rammen av oppfinnelsen .

EKSEMPEL 1

Omdanning av 26 kd TNF

Vektor pFVXM, deponert til American Type Culture Collection, aksesjonsnr. 67.103, ble anvendt for å produsere en vektor pFVXM-TNF6, som inneholder DNA-sekvensen som koder for 26 kd TNF-arten. For å produsere sistnevnte vektor, ble plasmid Bli, som inneholder cDNA-sekvensen som koder for 26 kd TNF arten, behandlet med Pst I som spalter ut den kodende sekvensen. Fragmentet ble renset ved anvendelse av standard elektroforetiske teknikker. Deretter ble vektoren pFVXM behandlet med Pst I, og Pst I fragmentet fra pBll inneholdende 26 kd kodende sekvensen ble skutt Inn 1 polylinkerregionen til vektoren ved anvendelse av standardteknikker som beskrevet ovenfor, for å produsere pFVX-TNF6. pFVX-TNF6 ble anvendt for å produsere cellelinjen TNF 6,8, som beskrevet av Kriegler et al., (1988), ovenfor, eller som beskrevet i U.S. patentsøknad med titel "Cleavage Site Blocking Antibody to Prohormon Proteins and Uses Thereof", inngitt på samme dag som foreliggende patentsøknad. Denne søknaden er Cetus Case nr. 2534, med oppfinnerne Kriegler og Perez.

TNF 6,8 uttrykker både 26 kd og 17 kd TNF. Figur 2 viser omdanning av 26 kd TNF ved konvertaseaktiviteten tilstede i HL 60 cellene. Produksjonen av merket 26 kd TNF ved in vitro transkripsjon/translasjon og analyse ved gelelektroforese, er beskrevet nedenfor i eksempel 2. Det er å bemerke at S-l cytosol eller pelletfraksjonene, forårsaker nesten fullstendig omdanning av 26 kd TNF til en 17 kd form. Figur 2 viser også, for sammenligning, 26 kd og 17 kd TNF i et lysat av TNF 6,8 celler.

pFVXM og plasmid pBll ble begge amplifisert i E.coli-stamme HB101. Ligering av fragmentene ble utført ved anvendelse av standard betingelser. Plasmid DNA ble isolert etter liger-ingsprosedyren, og riktig orientering av TNF-kodende sekvenser ble bestemt ved restriksjonsanalyse.

Plasmid DNA ble preparert ifølge fremgangsmåten til Birnboim og Doly, som beskrevet i Nucleic Acid Research, 7:1513

(1979). Plasmid-DNA ble dannet bånd av to ganger i sesium-klorid, og omfattende dialysert mot TE-buffer bestående av 10 mM Tris, pH 8,0 og 1 mM EDTA.

EKSEMPEL 2

Konvertaseanalvse

A. In vitro transkrips. 1on/ translas. 1onsanalvse

Den foretrukne analyseprosedyren består av in vitro trans-kripsjon/translasjon av 26 kd molekylet, etterfulgt av behandling med konvertase i nævær eller fravær av forbindelser som blir testet for konvertaseinhibitorisk aktivitet. Prosedyren omfatter in vitro transkripsjons/trans-lasjon av 26 kd molekylet tilstede i plasmid Bli. Sekvensen blir fjernet fra pBll ved Pst I spaltning og skutt inn i Pst I-setet til pGEM-3 (oppnådd fra Promega Biotec). Det resulterende plasmidet, betegnet pGEM-TNF14, ble amplifisert i E.coli ved anvendelse av etablerte teknikker, og plasmid DNA ble fremstilt ifølge fremgangsmåten til Birnboim og Doly, beskrevet ovenfor. Plasmid DNA ble in vitro transkribert ved lineærisering av dette med Hind III og lineæriserte plasmid-templater, ble anvendt for å danne kappede transkripter med T7 RNA polymerase og et in vitro transkripsjonskit tilført av Promega Biotec. Transkripsjonen ble utført ved anvendelse av standardteknikker som foreslått av forhandlerens Instruk-sjoner .

mRNA ble in vitro translatert i nærvær av 35g_CyS-tein fov ^ produsere<3>^S-cysteinmerket 26 kd TNF. Prosedyren bestod av

anvendelse av et kanin-retikulocyttlysat-translasjonskit, også tilført av Promega Biotec, og ifølge betingelsene foreslått av forhandleren.

<35>S-cystein merket 26 kd TNF, ble anvendt for å analysere for konvertaseinhibitorer som følger. 25 pl in vitro translatert materiale ble kombinert med 250 pl uindusert HL60 konvertaseaktivitet, plus forbindelser som skal bli analysert for inhibitorisk aktivitet. Konvertasen ble produsert ved høsting av 2 x IO<9>HL60 celler, og isolering av S-l og P-30 fraksjonene totalt 18 og 6 ml. 250 X P-30 fraksjonen ble anvendt, til tross for at S-l fraksjonen også kan bli anvendt. Analysen ble utført ved 30°C i 1 time, vesentlig som beskrevet ovenfor. Deretter ble reaksjonsblandingen immuno-presipitert med anti-TNF polyklonalt antisera og protein A sefarose, pelletert og vasket. Det bundede proteinet ble eluert og elektroforert. Gelen ble tørket og utsatt for røntgenfilm og deretter utviklet. Gelelektroforetiske profiler av 26 kd TNF behandlet med varierende fortynninger av HL60 konvertase viste forbindelser med inhibitorisk aktivitet.

Ved anvendelse av ovennevnte analyse ble det bestemt at 3,4-diklorisokoumarin og elastinal ved konsentrasjoner på hhv. 100 pg/ml og 5 mg/ml, inhiberte konvertasen. Det ble også vist at (l-((3-((acetyloksyl )-7-metoksy-8-oksy-8-okso-5-tio-l-azabicyklo[4.2.0.]okt-2-en-2-yl )karbonyl)morfolin, S,S-dioksid, (6R-cis) ved en konsentrasjon på 1 mM inhiberer konvertaseaktiviteten. Disse resultatene er vist i figur 3.

B. Monocvtt- analvse

I tillegg til 26 kd TNF produsert ved in vitro transkrip-sjon/translasjonsanalyse beskrevet ovenfor, kan stimulerte monocytter som produserer 26 kd TNF, som beskrevet av Kriegler, et al., 1988, Cell, 53:45, og dermed bli anvendt som kilde for molekylet. En egnet analyseprosedyre er å stimulere monocytter, og deretter i nærvær av konvertase, måle bortgang av 26 kd arter til en art med lavere molekylvekt, fortrinnsvis 17 kd TNF.

Humane monocytter blir renset fra humant blod ved sentrifu-ger ing, og deretter anriket for basert på adherens av monocytter til cellekulturskålene. Sentrifugeringen bestod av rensing av monocyttene gjennom Ficoll-plaque og perkoll (49,2$), tilgjengelig fra Pharmacia. Forhandlerens anbefalte prosedyrer blir fulgt. Deretter blir blandingen av celler som resulterer fra sentrifugeringstrinnet, bestående av monocytter og lymfocytter, platet ut på vevskulturskåler inneholdende RPMI medium supplementert med 20% fetalt kalveserum. Skålene blir inkubert i 30 minutter ved 37 °C og deretter skylt med samme medium. Denne behandlingen fjernet ikke-adherente lymfocytter, og lar bare adherente monocytter være igjen.

Monocytt 26 kd TNF blir radiomerket som følger. Monocyttene blir inkubert i 3 timer ved 37°C i RPMI medium supplementert med 20% fetalt kalveserum, 100 ng/ml lipopolysakkarid og 10 jjg/ml forbolmyristatacetat i 30 minutter ved 37°C. Sistnevnte to forbindelser induserer ekspresjonen av TNF. RPMI medium er cysteinfritt, og tilstedeværende fetalt kalveserum er i en sluttkonsentrasjon på 5%. Serumet blir dialysert før bruk for å fjerne eventult tilstedeværende cystein. Etter inkubasjonsperioden på 30 minutter blir 100 jjCI<35>S-cystein tilsatt, og cellene radiomerket i 3 timer ved 37°C, hvorpå de blir lysert og anvendt for å analysere for konvertaseaktivitet. Trinnene for utførelse av analysen, samt identifisering av inhibitorene til konvertase, er lik de som er beskrevet ovenfor.

EKSEMPEL 3

TNF mutein/ antistoff/ peptldinhibitorer med konvertaseaktivitet Følgende forbindelser vil ha konvertaseinhibitorisk aktivi-

tet, og kan bli fremstilt som følger og testet for inhibitorisk aktivitet som beskrevet ovenfor.

A. Anti- konvertase- antistoff

Antistoff, enten monoklonalt eller polyklonalt, blir fremstilt som enten nøytraliserer den enzymatiske aktiviteten til konvertasen, eller som bindes til konvertasen og derved sterisk forhindrer konvertase fra binding til 26 kd TNF. Prosedyren består av immunisering av et hensiktsmessig vertsdyr med en membranholdig fraksjon av HL60 celler som produserer konvertase. En tilstrekkelig mengde materiale bør bli anvnedt for å utløse en immunrespons. Dette vil vanligvis bestå av mellom 10 >jg til 10 mg pr. kg. kroppsvekt. Immuniseringen kan bli utført med adjuvant i en biologisk aksepta-bel buffer, kjent innenfor fagområdet. Den beste immuni-seringsveien kan bli bestemt eksperimentelt, og den primære immuniseringen kan bli fulgt av en mer sekundær immunisering avhengig av styrken på immunresponsen til den opprinnelige immun!seringen. Tilstedeværelse av nøytraliserende anti-konvertase-antistof f i sera, kan bli detektert ved anvendelse av konvertaseanalysen beskrevt ovenfor, hvori antisera er tilstede i analyseblandingen. Inhibisjon av omdanningen av 26 kd TNF arten til en art med lavere molekylvekt, indikerer tilstedeværelse av nøytraliserende antistoff. Det antas selvfølgelig at riktige kontroller blir utført, for å forsikre at antisera fra ikke-immuniserte dyr ikke er inhibitoriske. Polyklonalt antistoff kan bli renset som beskrevet nedenfor.

Monoklonalat antistoff til konvertasen kan bli produsert ved anvendelse av enten in vivo eller in vitro immuniseringsteknikker, og sensibiliserte lymfocytter som er et resultat derav, kan bli anvendt for å fremstille hybride cellelinjer som utskiller det hensiktsmessige monoklonale antistoffet. Gnagere, fortrinnsvis av murin opprinnelse eller humant antistoff, er mest foretrukket. In vivo immuniseringsprose-dyren omfatter sensibillserlng av lymfocytter overfor konvertase ved Immunisering av enten mus eller mennesker, og Isolering derfra av antistoffutskillende cellefraksjon og udødeliggjøring av cellene deri ved en eller flere prosedyrer. En alternativ utførelsesform er å isolere lymfocytter som allerede er blitt sensibilisert overfor konvertasen fra septiske pasienter, som beskrevet ovenfor.

(i ) Murint antistoff

For in vivo immunisering av mus, kan prosedyren til Kohler og Milstein, beskrevet i Nature, 256:495 (1975) bli fulgt, eller modifiserte prosedyrer så som de som er vist av Fendly, et al., 1987, Hybridoma, 6:359, Buck, et al., 1988, ln Vitro, 18:377. In vitro teknikker er generelt beskrevet av Luben, R. og Mohler, M. , 1980, Molecular Immunology, 17:635, Reading, C. Methods in Enzymology, 121 (del en): 18, eller Voss. B., 1986, Methods ln Enzymology, 121:27.

Mus blir immunisert med 1 mg/ml av en membranholdig fraksjon HL-60 celler, tidligere vist å være positive for konvertaseaktivitet. Immuniseringen blir utført i fullstendig Freund's adjuvant. To ytterligere immuniseringer, eller boostere, blir utført månedlig uten adjuvant, og en måned etter siste boost, blir musene gitt en I.V. boost på 10 jjg membranholdig materiale. Tre dager etter I.V. boosten, blir musene ofret, miltene fjernet og spinocytter isolert og kondensert til en udødeliggjort medikamentselekterbar myelompartner-cellelinje. Mange slike myelomlinjer er kjent innenfor dette området, og de fleste kan ikke vokse i HAT supplementert cellekulturmedium. En typisk myelomcellelinje er SP-2/0Ag 14. Hybridomene blir derved dannet ved kombinering av splenocytter og myelomceller i et 5:1 forhold, som generelt består av 2 x 10^ myelomceller til 1 x IO<7>splenocytter. Celleblandingen blir pelletert, media fjernet og fusjonen oppnådd ved tilsetning av 1,0 ml 40$ (v/v) oppløsning av polyetylenglykol 1500 ved dråpevis tilsetning over 60 sekunder ved romtemperatur, etterfulgt av en 60 sekunders inkubasjon ved 37°C. Til cellesuspensjonen med forsiktig agitasjon, blir tilsatt 9 ml Dulbecco's modifiserte Eagles medium i løpet av 5 minutter. Celleklumper i blandingen blir forsiktig resuspendert, cellene vasket for å fjerne eventuell gjenværende PEG, og sådd ut i mikrotiterskåler ved omtrent 2 x IO<5>celler/brønn i DMEM supplementert med 2056 fetalt kalveserum. Etter 24 timer blir cellene tilført en 2 x oppløsning av hypoksantin og azaserin-seleksjonsmedium.

Media fra brønner som utviser positiv cellevekst, kan bli screenet for nøytralisering av monoklonalt antistoff mot konvertase. Den foretrukne analysen er konvertaseanalysen beskrevet i eksempel 2 ovenfor, hvori medium som skal bli testet for antistoffaktivitet er tilstede i analysen. Mer foretrukket er å kombinere kultursupernatantene fra 3-8 mikrotiterbrønner og analyse av blandingen. Dersom blandingen er positiv, kan mediet fra hver brønn bli analysert uavhen-gig, for å identifisere de utskillende hybridmomene. Mange analyser er kjent innenfor området, og kan detektere oppløselige eller ikke-oppløselige antigener, og er vist av Langone, J. og Van Vinakis, H. , Methods of Enzymology, 92. del E (1983).

Uansett om antistoffet er polyklonalt eller monoklonalt, er det ønskelig å rense antistoffet ved standardteknikker som kjent innenfor fagområdet eller beskrevet av Springer, 1980, Monoclonal Antibodies,: 194, (Eds. Kennett, T. McKearn og K. Bechtol, Plenum Press, New York. Generelt består dette av minst en ammoniumsulfatpresipitasjon av antistoffet ved anvendelse av en 50% ammoniumsulfatoppløsning. Antistoff-affinitetskolonner kan også bli anvendt.

(ii) Humane, monoklonale antistoff

Perifere blodlymfocytter blir isolert fra septiske pasienter og deretter infisert med Epstein-Barr virus og infiserte lymfocytter, udødeliggjort ved fusjon til en selekterbar myelomcellelinje, og hybridcellelinjene dannet på denne måten blir isolert ogkarakterisertfor antistoffproduksjon. Mononukleære celler blir separert på Ficoll-hypaque (Pharmacia), og monocytter fjernet fra blandingen ved adherens til plast. Standard laboratorieteknikker blir anvendt for å oppnå disse prosedyrene. Deretter blir ikke-adherente celler anriket for antistoffprodusenter ved antigen spesifikk panning. Panning er en teknikk som er generelt kjent innenfor dette området og omfatter inkubasjon av en populasjon av antistoffutskiIlende celler på en plastoverflate belagt med det hensiktsmessige antigenet. De cellene som uttrykker antistoff på deres overflate binder antigen, og adhererer derfor til plastoverflaten, mens celler som ikke uttrykker celleoverflateantistoffer ikke adhererer, og kan bli fjernet ved vasking. Spesifikke antistoffutskillende celler blir anriket for ved denne teknikken.

6-brønnplater (Costar) blir belagt med en membranfraksjon inneholdende konvertase preparert fra enten induserte eller uinduserte HL60 celler som beskrevet ovenfor, slik at 150 pg av membranholdig materiale blir belagt pr. brønn i fosfatbuffret saltvann ved 4°C overnatt. Brønnene blir blokkert etter overnatt Inkubasjonsperioden med fosfatbuffret saltvann inneholdende 1% bovint serumalbumin i minst 1 time ved 4°C, og påfølgende vasking med fosfatbuffret saltvann/BSA. Deretter blir IO<7>lymfocytter i 1 ml PBS/BSA tilsatt til hver brønn i seksbrønnskålene. Lymfocyttene blir inkubert på skålene i 70 minutter, hvorved eventuelle ikke-adherente celler blir fjernet ved utsuging. De adherente cellene blir inkubert med cellekulturmedium (MDM, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) inneholdende 10# fetalt kalveserum.

Adherente celler blir utsatt for Epstein-Barr virus transformasjon ved tilsetning av en lik mengde kulturmedium oppnådd fra dyrking av Epstein-Barr virus infiserte marmosetcelle-linje B95-8, og dermed inneholder virus, til medium som bader de adherente cellene. Cellene ble dyrket i dette miljøet ved 37°C i 3 timer, og på denne måten blir lymfocyttene i den adherente cellepopulasjonen utsatt for Epstein-Barr infeksjon. Etter infeksjonsperioden blir cellene vasket og sådd ut på 96 brønn mikrotiterskåler I en tetthet på omtrent 10<4->10<5>celler/brønn i IMDM medium, pluss 10% fetalt kalveserum og 30% kondisjonert medium. Sistnevnte er avledet fra en lymfoblastoid cellelinje, fortrinnsvis JW5. Mediet inneholder også 5 x 10~<5>M2-merkaptoetanol, 50 ug/ml gentamycinsulfat (Sigma) og 600 ng/ml cyklosporin A (Sandimmun, Sandoz, Basel, Sveits).

Etter omtrent 14 til 21 dagers inkubasjon, blir cellekultur-supernatantene kombinert og screenet for konvertasenøytrali-serende aktivitet som beskrevet ovenfor. Positive hybridomer blir subdyrket ved lav tetthet, påny testet for nøytrali-serende antistoff, og dyrket og kondensert til cellelinjen F3B6, for anvendelse av polyetylenglykol og platefusjons-teknikken kjent innenfor dette området. Sistnevnte teknikk er beskrevet av Larrick, J.W., (1985) i Human Hybridomas and Monoclonal Antlbodies, E.G. Engleman, S.K.H. Foung, J.W., Larrick og A.A. Raubitschek, Editors, Plenum Press, New York, s. 446. F3B6 er en heteromyelomcellellnje som er følsom overfor vekst i media inneholdende 100 pm hypoksantin, 5 pg/ml azaserin og 5 pm ouabain. Til slutt blir de resulterende hybridene påny screenet for å forsikre at de produserer nøytraliserende antis-konvertase-antistoff.

B. 26 kd ikke- spaltbare muteiner

26 kd TNF muteiner er beskrevet som konkurrerer for bindingen til konvertase, for derved å Inhibere eller redusere aktiviteten derav. De foretrukne muteinene er de som har valin i posisjonene 1 og/eller 13; eller alanin i posisjon -1 og/eller prolin i posisjon 12, erstattet/eller deletert. Muteinene blir konstruert ved anvendelse av en modifikasjon av den seterettede muteagenese-gapinneholdende dupleksmetoden .

Følgende oppløsninger/buffere blir anvendt for å utføre de ønskede prosedyrene: 5 x gapinneholdende dupleksbuffer (GDB) bestående av 0,938 M KC1, 0,063 M Tris, pH 7,5, 10 x PEL bestående av 1,0 M KCL, 0,30 M Tris, 0,15 M MgCl2, 0,02 M DTT, pH 7,5; 10 x KB bestående av 0,50 M Tris, 0,10 MgCl2, 0,05 M DTT, 0,001 M EDTA, pH 8,0; en oppløsning inneholdende 0,25 mM dCTP, dATP, dGTP, dTTP, laget frisk fra 10 mM stamoppløsninger; en ATP oppløsning bestående av 0,1 M ATP fremstilt ved oppløsning av 60 mg ATP i 0,80 ml H20 og justering av pH til 7,0 med 0,1 M NaOH i et sluttvolum på 1,0 ml med H20; 20* PEG/2,5 M NaCl; 3,0 M NaOAc; og TE mettet fenol.

Forskjellige bakterielle stammer og fag blir anvendt for å tilveiebringe de ønskede muteinene, og disse er BMH 71-18, JM103 for voksende fagstammer; HB2154; MutL, Su-, gjort kompetente for DNA-transformasjon; og EB2151; Su-, anvendt som beleggsceller i løpet av transformasjon; M13 GAP, RF anvendt for dannelse av gapinneholdende dupleks; og M13mpl9-amber, 26 kd TNF mål-DNA blir klonet i denne vektoren og ssDNA isolert for dannelse av gapinneholdende dupleks.

Fag blir infisert inn i en hensiktsmessig materiell stamme, dyrket og titrert som følger. For dannelse av en preparering i stor skala av enten fag for ssDNA eller celler for dsDNA eller RF DNA, blir den samme infeksjonsprotokollen anvendt.

Plaque-renset fag blir produsert ved anvendelse av standard teknikker. Dette består av stryking av fagsupernatanter på agarskåler, etterfulgt av forsiktig belegging med 4,0 ml softågar og 100 pl frisk overnatt kultur av BMH 71-18. Deretter blir isolerte plaque plukket og inkubert med en 1:50 fortynning av frisk overnatt kultur av BMH 71-18 i R26 eller R17 + 10 mM MgCl2med risting ved 37°C i 4,5-6 timer. R17 (N-Z aminkraft) bestående av 10 g N^Z amin, type A,. 5 g NaCl med H20 til 1 liter, mens R26 består av 8 g trypton, 5 g gjaerekstrakt, 5 g NaCl med vann til 1 liter (YT kraft). Fagstokken blir titret, og fag infisert inn i bakterier ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 10. Etter inkubering av kulturen med risting ved 37" C i 5 timer, blir sellesu-spensjonen pelletert og supernatanten spart for ssDNA-isolasjon, og celler for RF-isolasjon. RF DNA blir isloert ved anvendelse av etablerte plasmid-DNA-isoleringsteknikker, mens ssDNA blir isolert som følger.

250 ml fagsupernatant blir spunnet ned hardt, deretter blir 200 ml av supernatanten dekantert, etterfulgt av tilsetning av 50 ml 20* PEG/2,5 M NaCl og inkubasjon overnatt ved 4°C eller på is i 30 minutter. Denne blandingen blir også spunnet ned hard og supernatanten dekantert. Flasken blir påny spunnet ned for å pelletere fagpresipitatet langs siden av flasken, og det gjenværende fluidet blir aspirert med en Pasteur-pipette. Pelleten blir resuspendert i 5,0 ml 1 x TE og lagret ved 4°C, og 0,5 ml blir ekstrahert to ganger med 0,5 ml TE mettet f enol. Til det vandige laget blir det tilsatt 0,050 ml 3,0 M NaOAc og 1,0 ml 95* etanol. Blandingen blir plassert i et tørrisbad i 10 minutter og sentrifu-gert i 10 minutter i en mikrofuge ved 4"C. Pelleten blir tørket og resuspendert i 200 pl IX TE. Dette materialet kan bli lagret i 0,050 ml aliquoter ved -20°C til bruk i mutagenese av 26 kd TNF.

Følgende ollgonukleotider blir anvendt for å forandre valin i posisjonene 2 og/eller 13, alanin i posisjon -1 og prolin i posisjon 12. 01igonukleotidene og deres tilsvarende muteiner er vist i tabell 1.

TABELL 1

1. Muteiner

(b) Substitusjoner 2. Oligonukleotider

01igonukleotidene blir kinasebehandlet ved anvendelse av følgende reaksjonsoppløsning og betingelser: 3 pl 10 x KB buffer, 3 X 10 mM rATP (1:10 fortynning av 0,1 M rATP stamoppløsning), 2 X mutagenisk oligonukleotid (100 pmol/X), 21 X H2O og 1 X polynukleotidkinase (10 enheter/X). Reaksjonen blir kjørt ved 37°C i 45 minutter, og deretter ved 65-68°C i 5 minutter. Deretter blir 24 X kinasebehandlet oligonukleotid fortynnet med 56 X H2O for å tilveiebringe 2 pmol/X.

Den gapbehandlede dupleksen blir dannet som beskrevet nedenfor, etterfulgt av sammensmelting av oligonukleotidene. Følgende reagenser blir kombinert i et totalt volum på 40 X: 8 X 5 x GDB buffer, 0,50 pmol ss DNA og 0,10 pmol Hine II lineærisert M13 GAP RF DNA. 10 X blir fjernet for senere bruk, og gjenværende 30 X blir behandlet sekvensielt som følger: 100°C i 3 minutter, 65°C i 5 minutter etterfulgt av avkjøling til romtemperatur i 30 minutter, og deretter plassering av reaksjonsblandlngen på is. Deretter blir 10 X gapbehandlet dupleks og 10 X kontroll ugapbehandlet materiale utsatt for elektroforese på en agarosegel for å undersøke gapdannet dupleksdannelse. Ved å anta at gelen viser tilstedeværelse av et tredje bånd, er den gapbehandlede dupleksen blitt dannet og de kinasebehandlede oligonukleotidene kan bli sammensmeltet til dupleksen ved kombiner ing av 16 X gapdupleksreaksjonsblandingen og 4 X fortynnet kinasebehandlet oligonukleotid, og oppvarming av blandingen til 65°C i 3 minutter, etterfulgt av avkjøling til romtemperatur i 20 minutter.

Heterodupleksen blir fullført ved hensiktsmessig ekstensjon og ligeringsreaksjoner bestående av kombinering av følgende reagenser i et totalt volum på 40 X : 10 X gapbehandlet dupleks og primer, 4 X 10 x PEL-buf f er, 4 X dNTP (0,25 mM oppløsning fremstilt fra 10 mM stamoppløsninger, 3 X ATP (10 X 0,1 M ATP stamoppløsning + 1490 X H20 = 0,662 mM), 17 X H20, 1 X Klenow (5 p/X) og 1 X T4 DNA ligase (0,6 Weiss p/X, fortynnet stamoppløsning med 1 x PEL). Reaksjonen blir utført ved 16° C i 2 timer, etterfulgt av transformasjon av 10 X ekstensjon/ligeringsblanding inn i 200 X, tinte kompetente HB2154 celler. Cellene blir holdt ved 0°C i 30 minutter og deretter ved 42 °C i 1,5 minutter, etterfulgt av ut såing av forskjellige volumtransformeringsblanding (f.eks. 50 X, 10 X osv.) med 100 X frisk overnatt kultur av HB2151 celler + 3,0 X bløt agar.

De resulterende plaque blir screenet ved anvendelse av plaque hybridiseringsprosedyren. Forskjellige slike prosedyrer er kjente, og en beksrivelse av den foretrukne prosedyren følger. Platene blir replikert på duplikat-nitrocellulosefII-terpapir (S & S type BA-85) og DNA fiksert til filteret ved sekvensiell behandling i 5 minutter med 0,5 N NaOH pluss 1,5 M NaCl; 1,0 M NaCl pluss 0,5 M Tris-CHl pH 7,4: og 2 x SSC (standard saltvannsitrat). Filtrene blir lufttørket og bakt ved 80°C i 2 timer i vakuum.

Duplikatf Utrene blir prehybridisert ved 55° C i 2 timer med 10 ml pr. filter DNA hybridiseringsbuffer, 5 x SSC, pH 7,0 x Denhardts oppløsning (polyvinylpyrrolidon, pluss Ficoll og bovint serumalbumin; 1 x 0,02* av hver), 50 mM natriumfosfat-buffer pH 7,Om 5 mM EDTA, 0,1* SDS og 100 pg/ml gjær RNA. Prehybridiseringsbufferen blir fjernet og prøvene hybridisert med hensiktsmessig kinasébehandlet probe, dvs. kinasebehandlede oligonukleotider som vist ovenfor, under betingelser som avhenger av ønsket stringenthet. Omtrent 2 x 10<*>>cpm/ml totalt blir anvendt. Vanlige, moderate, stringente betingelser som anvender en temperatur på 42 °C pluss 50* formamid i 24-36 timer med 1-5 ml/filter DNA hybridiserings-buf f er Inneholdende probe. For høyere stringenthet blir høyere temperaturer og kortere tider anvendt. Foretrukne hybridi-seringsbetingelser består av hybridisering av probene til filtrene i 5 x SSC, Denhardts oppløsning, 50 mM NaP04, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,1* SDS og 100 mg/ml gjæ -RNA ved 10° under Trø til oligonukleotidet som ble anvendt for å utføre screeningen. Deretter blir filtrene vasket to ganger, 30 minutter ved hver vask, ved romtemperatur med 2 x SSC, 0,1* SDS, deretter vasket en gang med 2 x SSC og 0,1* SDS ved 5°C under Tjyj til oligonukleotidet anvendt for å screene, og lufttørket. Til slutt blir filtrene autoradiografert ved-70°C i 36 timer. Autoradiografi viser de plaquene som inneholder viruset som inneholder muteinene av interesse. 1 tillegg til konstruering av muteiner hvori valin i posisjon 2 og/eller 13 er blitt deletert eller substituert, kan store delesjonsmuteiner bli produsert som omfatter de to viktigste spaltningssetene til 26 kd TNF. Et foretrukket mutein mangler aminosyrene som dekker regionen -9 til +14, som vist i figur 1. Dette muteinet ble konstruert ved anvendelse av materialene og metodene beskrevet ovenfor og oligonukleotidet, CP375 som har følgende sekvens:

C. Protein/ peptidinhlbitorer

Peptider med følgende aminosyresekvenser blir syntetisert ved fastfasemetoden beskrevet i detalj av Merrifleid, R.B. (1985) i Science, 232:341-347: Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser, Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala; Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala; Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala; og Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro. En Blosearch 9500 automatisert peptidmaskin blir anvendt med hydrogenfluoridspaltning og rensning ved preparativ HPLC ved anvendelse av en Waters Delta prep 3000 instrument, på en 15-20 pm Vydac C4 PrepPAK-kolonne.

At disse peptidene inhiberer konvertaseaktiviteten, er vist ved utførelse av analysen beskrevet ovenfor i nærvær av varierende mengder av hvert peptid. Gel-elektroforese og Western-blotting av reaksjonsblandingen viser en inhibsjon av omdanningen av 26 kd TNF til 17 kd-formen.

EKSEMPEL 4

Beskyttende virkning av konvertaselnhibitorene

for behandling av sepsis

Forbindelser som er effektive inhibitorer av konvertaseaktiviteten, er vist å forhindre sepsis i et bavian-modellsystem som følger. Anti-konvertase-antistoff, murint, humant eller rekombinant, i en konsentrasjon på 5 mg/kg blir administrert i en enkel I.V. bolus 60 minutter før dyrene blir behandlet med en letal dose E.coli og 2 mg/kg samtidig med E.coli-behandllngen. Antistoffet blir administrert i en fysiologisk balansert saltoppløsning, og omtrent 4 x 10^° E.coli-organismer blir anvendt. E.coli-dosen blir infusert over en periode på to timer. Dyrene som mottar antistoffet blir beskyttet i minst 7 dager, mens kontrolldyrene som bare mottar balansert saltoppløsning utgår i løpet av 16 til 32 timer.

Lignende beskyttelse ved TNF muteinkonvertase-inhibitorene vises i eksempel 3. Muteinene blir administrert ved en konsentrasjon på 5 mg/kg i en enkel I.V. bolus 60 minutter før dyrene blir utsatt for 4 x 10<10>E.coli-organismer. Bavianene mottar også 2 mg/kg av muteinene samtidig med E. coli-tilførselen.

Til slutt blir peptidene vist i eksempel 3, dvs. Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser og Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala, testet som beskrevet ovenfor og tilveiebringer lignende beskyttende virkninger.

Foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet med referanse til spesifikke utførelsesformer. Oppfinnelsen skal også dekke forandringer og substitusjoner som kan bli utført av fagfolk uten å fravike rammen av oppfinnelsen og vedlagte krav.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for screening av profylaktiske midler eller terapeutiske midler til sykdommer forårsaket av, forverret av eller assosiert med produksjon av moden tumor nekrosefaktor (TNF) hormon, eller en eller flere lavere molekylvektsarter av nevnte modne proteinhormon, som blir produsert fra et TNF prohormon ved konvertasespaltning av nevnte prohormon,karakterisert vedat den omfatter følgende trinn: a) kontakting av nevnte TNF prohormon med en effektiv mengde av nevnte konvertase; b) måling av omdanningen av nevnte TNF prohormon til nevnte TNF modne hormon eller en eller flere arter med lavere molekylvekt av nevnte modne hormon; c) gjentagelse av trinnene (a) og (b) ovenfor, og videre innbefattende et molekyl antatt å være identifisert som en profylaktisk eller terapeutisk sykdom forårsaket av, forverret av eller assosiert med produksjon av nevnte modne TNF hormon; d) måling av omdanning av nevnte TNF prohormon til nevnte modne TNF hormon eller lavere molekyl-vektsart i trinn (c); og e) sammenligning av mengden av omdanning av nevnte prohormon fra trinn (b) og (d), hvori en mindre spaltning i trinn (d) enn i trinn (b) tyder på at molekylet ifølge trinn (c) er potensielt et profylaktisk middel eller terapeutisk middel for en sykdom forårsaket av, forverret av eller assosiert med produksjon av modent TNF hormon eller en eller flere arter med lavere molekylvekt av moden TNF hormon.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av terapeutiske midler eller profylaktiske midler for behandling av sykdom,karakterisert vedat sykdommen som blir behandlet er forårsaket av et modent TNF hormon eller en art med lavere molekylvekt derav, identifisert ifølge fremgangsmåten i krav 1.

3. Fremgangsmåte for identifisering av profylaktiske midler eller terapeutiske midler for sepsis,karakterisert vedat den omfatter følgende trinn: a) kontakting av TNF prohormon som har en molekylvekt på omtrent 26.000 med en effektiv mengde TNF konvertase; b) måling av omdanningen av TNF prohormon som har en molekylvekt på omtrent 26.000 til en eller flere TNF arter med lavere molekylvekt; c) gjentagelse av trinnene (a) og (b) ovenfor, og videre innbefattende et molekyl antatt å bli identifisert som et profylaktisk middel eller terapeutisk middel for sepsis; og d) måling av inhibisjon til nevnte omdanning av nevnte TNF som har en molekylvekt på omtrent 26.000 til en eller flere TNF arter med lavere molekylvekt.

4. Fremgangsmåte Ifølge krav 3,karakterisertved at måling av inhibisjon av nevnte konvertase omfatter følgende trinn: a) merking av nevnte TNF prohormon med en egnet markør; b) behandling av nevnte merkede TNF prohormon med nevnte konvertase for å omdanne nevnte merkede prohormon TNF til nevnte lavere molekylvekt TNF som har en molekylvekt på omtrent 17.000; c) separering av nevnte merkede TNF prohormon fra nevnte 17.000 molekylvekt TNF; og d) måling av nevnte markør tilstede i nevnte 17.000 molekylvekt TNF eller måling av reduksjon av nevnte markør i merket TNF prohormon.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av profylaktiske midler eller terapeutiske midler ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte profylaktiske midler eller terapeutiske midler omfatter anti-konvertase antistoff.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av profylaktiske midler eller terapeutiske midler ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte profylaktiske midler eller terapeutiske midler omfatter ikke-hydrolyserbare muteiner av TNF prohormonet som har en molekylvekt på omtrent 26.000.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av profylaktiske midler eller terapeutiske midler ifølge krav 6,karakterisert vedat nevnte muteiner har valin i posisjon 2 og valin i posisjon 13 er substituert eller deletert.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av profylaktiske midler eller terapeutiske midler for sepsis ifølge krav 4,karakterisert vedat nevnte profylaktiske midler eller terapeutiske midler omfatter et peptid eller protein som har en aminosyresekvens vesentlig lik en aminosyresekvens tilstede på nevnte 26 kD TNF prohormon som nevnte konvertase bindes til.