DK172677B1 - Monoklonale antistoffer mod et interferoninduceret protein, fremgangsmåde til fremstilling deraf, hybridomacellelinier som - Google Patents

Description

i DK 172677 B1

Opfindelsen angår monoklonale antistoffer, som er specifikke for proteiner induceret i humane celler ved hjælp af interferon a eller β, monoklonale antistofderivater, hybridoma-5 cellelinier, som udskiller disse monoklonale antistoffer, anvendelsen af monoklonale antistoffer og deres derivater til den kvalitative og kvantitative bestemmelse af disse proteiner og analysesæt indeholdende de monoklonale antistoffer .

10

Interferoner er en klasse naturligt forekommende proteiner, som har vist sig lovende ved forsvaret mod virusinfektioner og ved bekæmpelse af tumorvækst. De synes at gribe ind i cellefunktionerne, som er nødvendige for 15 virusreplikation, og at hæmme cellevækst ved plejotropi-ske virkninger, som endnu ikke er klarlagt på det molekylære niveau.

Desuden stimulerer interferoner aktiviteten af naturlige 20 dræberceller (NK-celler) og modulerer aktiviteten af makrofager, B- og T-celler indenfor et kompliceret netværk af lymfokonvekselvirkninger.

En gruppe Inducerede proteiner kan være involveret i 25 interferonernes antivirale, antiproliferative og immunomo-dulatoriske virkniner. I pattedyrceller inducerer interferoner syntesen af adskillige proteiner, som ikke er påvist, eller som ikke eksisterer, i meget mindre koncentrationer i ubehandlede celler. Nogle af disse Inducerede 30 proteiner er blevet indgående undersøgt, jf. P. Lengyel,

Annu.Rev.Biochem. 51, 251 (1982), men de er stadig dårligt karakteriseret. Interferonbehandlede celler af såvel human oprindelse som fra mus Indeholder forøgede niveauer af 2 1,5 ' -oligoisoadenylatsyntetase- og proteinkinaseaktivite-35 2 DK 172677 B1 ter. Fremstillingen og egenskaberne af museproteinet Mx induceret ved hjælp af interferon a og β er blevet indgående undersøgt, jf. P. Staeheli et al., Cell 44, 147 5 (1986). Dette protein er forbundet med en yderst effektiv og specifik antiviral modstand mod influenzavira, jf. M.A. Horisberger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80, 1910 (1983), M.A. Horisberger og H.K. Hochkeppel, J.Biol.Chem.

260, 1730 (1985). Et beslægtet humanprotein er påvist i 10 interferoninducerede humane perifere blodlymfocyter og fibroblaster, jf. P. Staeheli og 0. Haller, Mol.Cell.

Biol. 5, 2150 (1985). Der er bestemt en molekylvægt på 80 kDa (kilo-Dalton), og proteinet er overvejende lokaliseret' i cellecytoplasmaet, men proteinet er i øvrigt ikke 15 karakteriseret yderligere eller isoleret.

Den hurtige udvikling indenfor rekombinant DNA-teknologien i de senere år har tilvejebragt de almene metoder til fremstillingen af proteiner i store mængder uafhængigt af de primære naturlige kilder for sådanne forbindelser.

20 Identificeringen af et mRNA eller et DNA, der koder for det ønskede polypéptid, er afgørende for et godt resultat af denne teknik. Hvis (partiel) aminosyresekvensinfor-mation er tilgængelig, kan en kemisk fremstillet nuclein-syreprobe føre til isoleringen af kodende mRNA eller DNA 25 fra henholdsvis en blanding af mRNA afledt af celler, som producerer de ønskede polypeptider, eller fra et DNA-bib-liotek. Selv om der kendes mange eksempler på isoleringen af et mRNA eller DNA, som koder for et ønsket polypéptid, og den almene fremgangsmåde principielt er beskrevet, 30 kræver hver enkelt nyt specifikt problem tilpasning af teknikken til det pågældende tilfælde.

Når først et komplementært eller genomisk DNA, som koder for det ønskede polypéptid, er tilvejebragt, kan fremstilling af egnede ekspressionsvektorer, transformering af 35 værter med disse vektorer, fermentering af transformerede værter og isolering af det udtrykte polypéptid gennemføres 3 DK 172677 B1 ved hjælp af standardmetoder. Også her må disse metoder tilpasses til det specifikke problem for at opnå stabil inkorporering af DNA'et og tilstrækkelig høj ekspression 5 af det ønskede polypeptid i en valgt værtorganisme, samt acceptable udbytter af rent, biologisk aktivt, isoleret protein.

Endvidere er det ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi muligt at fremstille polypeptidvarianter ved mutation 10 eller på anden måde at ændre det kodende DNA, som er inkorporeret i en værtsorganisme, hvorved man opnår en forøgelse af de mulige anvendelser af et aktivt princip, som findes i en enkelt polypeptidstruktur i naturen.

Proteiner induceret af interferon har betydning ved 15 diagnose, sygdomsbehandling og terapi i to henseender. På den ene side kan de udøve nogle af de fordelagtige egenskaber, såsom antivirale og antiproliferative egenskaber, som tillægges interferoner, men uden interferonernes uønskede bivirkninger, og på den anden side kan de være 20 værdifulde indikatorer for celleresponset på en interferonterapi. Antistoffer mod sådanne interferoninducerede proteiner muliggør den kvalitative og kvantitative bestemmelse af disse proteiner og er derfor helt nødvendige midler ved overvågningen af en terapi med 25 disse proteiner eller med interferoner.

Polyklonale og monoklonale antistoffer mod muse Mx-protei-net induceret af interferoner er kendt, jf. P. Staeheli og O. Haller, Mol. Cell. Biol. 5, 2150 (1985). Et af disse udviser også en svag krydsreaktivitet med et humant inter-30 feroninduceret protein, men uspecifik krydsreaktion kan imidlertid ikke udelukkes.

Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe mono- DK 172677 B1 4 klonale antistoffer som diagnostiske hjælpemidler til den kvalitative og kvantitative bestemmelse af proteiner induceret i humane celler ved hjælp af interferon a eller β, hybridomaceller, som udskiller sådanne antistoffer, samt 5 fremgangsmåder til fremstilling af disse antistoffer og hybridomaceller.

Opfindelsen angår monoklonale antistoffer soro er specifikke over for et protein kendetegnet ved 10 (1) tilstedeværelse i humane celler induceret ved hjælp af interferon a eller β, men ikke i ubehandlede celler i et rimeligt omfang, 15 (2) en molekylvægt på ca. 78 kDa bestemt ved natrium- dodecylsulf atpolyacrylamidgelelektroforese (SDS--PAGE), (3) et isoelektrisk punkt på ca. 6,3, og 20 (4) en partiel N-terminal aminosyresekvens 5 10 Val-Val-Ser-Glu-Val-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala 25 hvilke antistoffer ikke krydsreagerer med det beslægtede museprotein Mx induceret ved hjælp af interferon, og derivater deraf.

30 Disse proteiner findes især i Namalwaceller eller humane embryone forhudsceller behandlet med et rekombinant-inter-feron a/B, a/O, α/F eller interferon a/B-D-hybrider.

Der foretrækkes især monoklonale antistoffer, som er speci-35 fikke for et protein med en partiel N-terminal aminosyresekvens i 5 DK 172677 B1

5 10 IS

Val-Val-Ser-Glu-Val-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala-Asp-Pro-Ala-Ala-Ala-Ser-Ϊ0 15 JO

His-Pro-Leu-Leu-Leu-Asn-Gly-Asp-Ala-Thr-Val-Ala-Gln-Lys-Asn-Pro-35 so s 5

Gly-Ser-Val-Ala-Glu-Asn-Asn-Leu-Cys-Ser-Gln-Tyr-Glu-Glu-Lys-Val-SO 55

Arg-Pro-Cye-Ile-Asp-Leu-Ile-Asp-.

5

Molekylvægten på 78 kDa er baseret på SDS-PAGE med de sædvanlige molekylvægtmarkører. Ud fra arbejde med det beslægtede museprotein Mx, jf. P. Staeheli et al., Cell 44, 147 (1986), kan det Imidlertid konkluderes, at den 10 faktiske molekylvægt er mindre, sandsynligvis omkring 72 kDa.

Proteinerne er desuden karakteriseret ved aminosyresammen-sætningen bestemt ved en total aminosyreanalyse baseret på en molekylvægt på 72 kDa (tabel 1). Intervallet for det faktiske antal aminosyrer i de analyserede proteiner anført i tabel 1 er beregnet ud fra usikkerheden (standardafvigelse) ved analysemetoden.

20 Tabel 1

Aminosyresammensætning

Aminosyre Mængde Faktisk antal bestemt aminosyrer 25 _(interval)

Asx (Asparaginsyre/asparagin) 56,8 54-60

Glx (Glutaminsyre/glutamin) 96,1 91-101

Ser (Serin) 39,3 37-41

Thr (Threonin) 32,2 30-34

Gly (Glycin) 43,4 41-46

Ala (Alanin) 47,2 45-50

Arg (Arginin) 38,2 36-40

Pro (Prolin) 26,0 24-28

Val (Valin) 39,9 38-42 35 Met (Methionin) 18,0 17-19

Ile (Isoleucin) 43,1 41-46 6 DK 172677 B1

Tabel 1 (fortsat)

Aminosyre Mængde Faktisk antal _ bestemt aminosyrer 5 ___(interval)

Leu (Leucin) 68,1 64-72

Trp (Tryptophan) 0 0-3

Phe (Phenylalanin) 25,4 24-27

Cys (Cystein) 5,9 5-7

Lys (Lysin) 47,5 45-50

His (Histidin) 12,9 12-14

Tyr (Tyrosin) 11,8 11-13 15

Et sådant protein kan fremstilles ved, at celler, som danner proteinet, dyrkes, og proteinet isoleres fra cellesupernatan-ten eller cellelyseringsblandingen og isoleres ved fældning 20 og kromatografiske fremgangsmåder.

Et sådant protein i renset form kan fremstilles ved, at humane celler, fortrinsvis celler fra en kontinuert human cellelinie, f.eks. Namalwaceller eller embryone forhudscel-25 ler, dyrkes i nærværelse af humant interferon a eller β, f.eks. naturligt humant inteferon a eller rekombinant humant interferon a, såsom interferon α/B, a/D, α/F eller o/B-D-hybrider, hvorpå cellerne lyseres, proteinerne i supernatan-terne fældes, f.eks. ved tilsætning af ammoniumsulfat, hvorpå 30 de adskilles ved præparativ gelelektroforese, og proteinet med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 78 kDa elueres, f.eks. ved elektrodialyse.

Humane celler, der er nyttige til fremstillinge af prote-35 inerne, er normale lymfocyter, makrofager eller monocyter, lymfoblastoide celler, f.eks. Namalwaceller eller humane 7 DK 172677 B1 embryone forhudsceller fra en diploid cellelinie.

Fortrinsvis dyrkes Namalwaceller i de sædvanlige celledyrkningsmedier, f.eks. RPM1 1640 medium tilsat vitaminer 5 og/eller hormoner, f.eks. i form af føtait kalveserum, og eventuelt antibiotika. Ved afslutningen af den eksponentielle vækst inkuberes cellerne med rekombinant interferon a, f.eks. a/B undertype eller ot/B-D-hybrider, i koncentrationer fra 5 x 105 til 10? celler pr. ml og 2000-10000 10 internationale interferonenheder pr. ml, fortrinsvis ved en temperatur på ca. 37*C.

Der kan anvendes et vilkårligt af det kendte naturlige eller rekombinantinterferon a eller β til at inducere 15 produktionen af proteinerne ifølge opfindelsen, f.eks. rekombinantinterferonerne beskrevet i beskrivelserne til følgende patentansøgninger: EP nr. 28.033, nr. 32.134, nr.

43.908, nr. 72.541 eller nr. 76.489.

20 Cellerne høstes og lyseres på sædvanlig måde, f.eks. ved hjælp af høje saltkoncentrationer i pufret opløsning, og proteinet fældes, f.eks. ved tilsætning af ammoniumsulfat.

Det ønskede protein er ret tungtopløseligt i de sædvanlige fysiologiske opløsningsmiddelsysterner.

25

Det ønskede protein renses ved geielektroforese. Det foretrækkes at gennemføre den præparative geielektroforese to gange, f.eks. først for at opnå en rå adskillelse fra proteiner med en molekylvægt under 70 kDa og over 85 kDa, 30 derefter ved to-dimensionel adskillelse af den fremkomne proteinblanding ved en kombination af non-æk vi librium pH gradientelektroforese med SDS-polyacrylamidgelelektro-forese. Især sættes proteinblandingen til den sure ende af non-ækvilibrium pH gradientelektroforesegelen, som inde-35 « 8 DK 172677 B1 holder 2% amfolyter, pH 3-10, underkastes elektroforetisk adskillelse, hvorpå der separeres i den anden dimension på en pladegel, som indeholder 10-15%, fortrinsvis 12%, acrylamid og op til 0,5%, f.eks. ca. 0,3%, bis-acrylamid.

5

Fortrinsvis fremstilles proteinet ved rekombinant DNA-teknik, der eksempelvis omfatter dyrkning af en transformeret værtscelle, der udtrykker proteinet som defineret ovenfor, under betingelser, der tillader ekspression af det heterologe 10 polypeptid, og isolering af den ønskede forbindelse. Nærmere betegnet fremstilles det ønskede protein ved a) isolering af et DNA, som koder for proteinet, fra et cDNA eller et genomisk DNA-bibliotek af humane celler, 15 b) inkorporering af DNA'et i en egnet ekspressionsvektor, c) overføring af den dannede hybridvektor til en recipientvært, d) selektering af den transformerede vært fra ikke-trans-20 formerede værter, f.eks. ved dyrkning under betingelser, ved hvilke kun den transformerede vært overlever, e) dyrkning af den transformerede vært under betingelser, som tillader ekspression af det heterologe polypeptid, og f) isolering af det ønskede protein.

25

Trinene, som indgår i fremstillingen af disse polypeptider ved rekombinant DNA-teknik, forklares mere detaljeret i det følgende.

30 DNA'er, som koder for de ovenfor omtalte proteiner, omfatter et DNA med formlen 35 9 DK 172677 B1 1 10

MetValValSerGluValAspIleAlaLysAlaAspProAlaAlaAlaSerHisProLeu Z1-ATGGTTGTTTCCGAAGTGGACATCGCAAAAGCTGATCCAGCTGCTGCATCCCACCCTCTA 1 10 20 30 AO 50 60 20 10

LeuLeuAsnGlyAspAlaThrValAlaGlnLysAsnProGlySerValAlaGluAsnAsn ttactgaatggagatgctactgtggcccagaaaaatccaggctcggtggctgagaacaac 70 80 90 100 110 120 *0 50

LeuCysSerGlnTyrGluGluLysValArgProCysIleAspLeuIleAsp CTGTGCAGCCAGTATGAGGAGAAGGTGCGCCCCTGCATCGACCTCATTGAC-Z* 130 1A0 150 160 170 (I), hvori Z1 er en 5'-ende DNA-rest på 12 nucleotider eller derover indeholdende en promotorsekvens, Z2 er en DNA-rest på mindst 1700 kodende nucleotider, et stopkodon og 5 eventuelt ikke-kodende nucleotider ved 3'-enden, og Z1 og Z2 er eventuelt sammenknyttede, et DNA med formlen I, hvori et eller flere tripletkodoner er erstattet med andre tripletkodoner for de samme aminosyrer, et dobbeltstrenget DNA bestående af et DNA med 10 formlen I og et dermed komplementært DNA, og selve det komplementære DNA.

Et eksempel på et DNA med formlen I er f.eks. cDNA’et, som er afledt af mRNA’et fra en human embryonisk forhudscelle, med formlen Z3-AOCTCTGTGATACCATTTAACTTGTTGACATTACTTTTATTTGAAGGAACGTATATTA -80 -70 -60 -50 -A0 -30 l 1 o

MetValValSerGluValAspIleAlaLysAlaAsp gagcttactttgcaaagaaggaagatggttctttccgaagtcgacatcgcaaaagctgat -20 -10 1 10 20 30 20 30

ProAlaAlaAlaSerHisProLeuLeuLeuAsnClyAspAlalhrValAlaGlnLysAsT) CCACCTGCTGCATCCCACCCTCTATTACTGAATCGAGATCCTACTCTGGCCCACAAAAAT A0 50 60 70 80 90 <10 5 0

ProGlySerValAlaGluAsnAsnLeuCysSerGlnTyrGluGluLysValArgProCys CCAGGCTCGCTGGCTGAGAACAACCTGTGCAGCCACTATGAGGAGAAGGTCCGCCCCTGC 100 110 120 1 30 1A0 150

IleAspLeuIleAsp ATCCACCTCATTGAC-Z* 160 170 (II).

10 DK 172677 B1 hvori Z3 er en 5'-ende DNA-rest på et eller flere nucleotider, og z2 har den under formlen I anførte betydning, især cDNA'et med formlen

Zh-TGGACACGCCTCCCTCGCGCCCTTGCCGCXCACCTGCTCACCCAGCTCAGGGXCTTTCGA -270 -260 -250 -240 -230 -220 ATTCTXTCGCCACACTGCGAGGAGATCGGTTCTGGGTCGGAGGCTACAGGAAGACTCCCA -200 -190 -180 -170 -160 -150 CTCCCTGAAATCTGGAGTGAAGAACGCCGCCATCCACCCACCATTCCAACGAGGTGCAGG -140 -130 -120 -110 -100 -90 agaacagctctgtgataccatttaacttgttgacattacttttatttgaagcaacgtata -80 -70 -60 -50 -40 -30 1 10

MetValValSerGluValAspIleAlaLysAla ttagagcttactttgcaaacaaggaagatggttgtttccgaagtggacatcgcaaaagct -20 -10 1 10 20 30

20 SO

AspProAlaAlaAlaSerHisProLeuLeuLeuAsnGlyAspAlaThrValAlaGlnLys gatccagctgctgcatcccaccctctattactgaatggagatgctactgtggcccagaaa 40 50 60 70 80 90 SO 50

AsnProGlySerValAlaGluAsnAsnLeuCysSerGlnTyrGluGluLysValArgPro aatccaggctcggtcgctgagaacaacctgtccagccagtatgaggagaaggtgcgcccc 100 110 120 130 140 150 tO 70

CysIleAspLeuIleAspSerLeuArgAlaLeuGlyValGluGlnAspLeuAlaLeuPro tgcatcgacctcattgactccctgcgggctctaggtgtggagcaggacctcgccctgcca 160 170 180 190 200 210 B0 9 0

AlalleAlaVallleGlyAspGlnSerSerGlyLysSerSerValLeuGluAlaLeuSer GCCATCGCCGTCATCCGGCACCAGACCTCGGGCAAGAGCTCCGTCTTGCACCCACTGTCA 220 230 240 250 260 270 100 110

ClyValAlaLeuProArgGlySerGlylleValThrArgCysProLeuValLeuLysLeu GGAGTTGCCCTTCCCAGAGGCAGCGGGATCGTGACCAGATGCCCGCTGGTGCTGAAACTG 280 290 300 310 320 330 120

LysLysLeuValAsnGluAspLysTrpArgGlyLysVal i AAGAAACTTGTGAACGAAGATAAGTGGAGAGGCAAGGTCAG-ZS

340 350 360 370 (III), 1 -ti 11 DK 172677 B1 hvori er en 5’-ende DNA-rest på et eller flere nucleotider, og Z^ er en DNA-rest på mindst 1500 kodende nucleotider, et stopkodon og eventuelt ikke-kodende 5 nucleotider ved 3'enden.

Et DNA, som hybridiserer med et DNA med formlen I, II eller III, er f.eks. det 20-mere oligonucleotid med formlen 5'-GCTTTTGCGATGTCCACTTC-3' 10 (IV) det 17-mere oligonucleotid med formlen 5’-CAGCCACCATTCCAAGG-3 ’ (V) og det 21-mere oligonucleotid med formlen 15 5'-CGCACCTTCTCCTCATACTGG-3' (VI)

Et RNA, der koder for proteiner som beskrevet ovenfor, er især et RNA med formlen I, II eller III, hvori Z* til har de ovenfor angivne betydninger, bortset fra at RNA-20 rester erstatter DNA-rester og følgelig uridin (U) erstatter deoxy-thymidin (T).

DiiA'erne, som koder for de ønskede proteiner, kan eksempelvis fremstilles ved dyrkning af en transformeret vært og isolering af det ønskede DNA derfra.

25 Specielt kan sådanne DNA'er fremstilles ved a) isolering af mRNA fra humane celler, selektering af det ønskede mRNA, fremstilling af enkeltstrengede DNA, som er komplementært til mRNA'et, og derefter dobbeltstrenget DNA (ds cDNA) deraf, eller 12 DK 172677 B1 b) isolering af genomisk DNA fra humane celler og selektering af det ønskede DNA under anvendelse af en DNA-probe og 5 c) Inkorporering af ds cDNA fra trin a) eller ds DNA fra trin b) i en egnet ekspressionsvektor, d) transformering af en egnet værtsorganisme med den dannede hybridvektor, e) selektering af den transformerede vært, som indeholder 10 DNA, der koder for det ønskede protein, fra værter, som ikke indeholder kodende DNA, og f) Isolering af det ønskede DNA.

Polyadenyleret messenger RNA isoleres fra humane celler ved anvendelse af kendte fremgangsmåder. Egnede celler er 15 normale lymfocyter, makrofager, monocyter, lymfoblastoide celler, f.eks. Namalwaceller, humane embryoniske diploide forhudsceller eller lignende, induceret med naturligt eller rekombinant interferon a eller (S. Isoleringsmetoder omfatter f.eks. lysering af stimulerede celler I

20 nærværelse af et detergent og eventuelt en ribonuclease-inhibitor, f.eks. heparin, guanidinium isothiocyanat og mercaptoethanol, ekstraktion af mRNA*et med phenol eller egnede chloroform-phenol-blandinger, eventuelt i nærværelse af salt- og pufferopløsninger, detergenter, 25 proteinase og/eller kationchelateringsmidler, og fældning af mRNA fra den tilbageblevne vandige, saltholdige fase med ethanol, isopropanol eller lignende. Det Isolerede mRNA kan renses yderligere ved centrifugering i en cæsiumchloridgradient efterfulgt af ethanolfældning - 30 og/eller ved kromatografiske fremgangsmåder, f.eks.

j affinitetskromatografi, f.eks. kromatografi på oligo(dT)- cellulose eller på oligo(U)-sepharose. Fortrinsvis fraktioneres råt eller renset totalt mRNA efter størrelse ved gradientcentrifugering, f.eks. i en lineær saccharose-35 gradient, eller kromatografisk på egnede størrelsesfraktioneringskolonner, f.eks. på agarosegeler.

n 13 DK 172677 B1

Det ønskede mRNA selekteres ved screening med en DNA-probe eller ved translation i egnede celler i et cellefrit system og screening af de opnåede polypeptider.

5 Fortrinsvis translateres fraktioneret mRNA i celler, f.eks. i frøoocyter, eller i cellefri systemer, f.eks. i reticulocytlysater eller hvedekimekstrakter. De opnåede polypeptider sammenlignes med nativt protein renset som beskrevet ovenfor, f.eks. ved poiyacrylamidgeielektro-10 forese, og mRNA-fraktioner, som giver det ønskede protein, selekteres.

Fremstillingen af et enkeltstrenget komplementært DNA fra den valgte mRNA-skabelon eller templat er velkendt, hvilket også er tilfældet med fremstillingen af et dob-15 beltstrenget DNA ud fra et enkeltstrenget DNA. mRNA-templatet inkuberes med en blanding af deoxynucleo-tid-triphosphater, eventuelt et radioaktivt mærket deoxynucieotid-triphosphat (for at kunne screene resultatet af reaktionen), en primersekvens, såsom en 20 oligo(dT)-rest, som hybridiserer med poly(A)-halen på messenger RNA-'et, og et egnet enzym, f.eks. en revers transskriptase. Efter spaltning af templat mRNA-et inkuberes det komplementære DNA (cDNA) med en blanding af deoxynucleotid-triphosphater og et egnet enzym som ovenfor 25 til dannelse af et dobbeltstrenget DNA. Egnede enzymer er en revers transskriptase, Klenow-fragmentet af Escherichia coli DNA polymerase I eller T4 DNA polymerase. Eventuelt forlænges det enkel tstrengede DNA først med en hale af ens deoxynucleotider for at tillade anvendelsen af en 30 primersekvens af komplentært ens deoxynucleotider, men dannelsen af dsDNA starter sædvanligvis på spontan hårnåledannelse. Sådant dsDNA opnået som følge af hårnåledannelse behandles endvidere med SI nuclease, som skærer hårnålen. Ved en foretrukken alternativ 35 fremgangsmåde behandles mRNA/DNA-hybridet direkte med RNase Η, T4 DNA-ligase og DNA- polymerase I, hvorved man undgår ekstratrinene med en primersekvens og/eller skæring af hårnålen.

14 DK 172677 B1

Som et alternativ til fremstillingen af cDNA ud fra mRNA kan genomisk DNA isoleres og screenes for DNA, som koder for det ønskede polypeptid.

5 Genomisk DNA isoleres fra egnet humant væv, fortrinsvis fra human placenta eller humane føtale leverceller, på kendt måde. Et genomisk DNA-bibliotek fremstilles ud fra dette materiale ved spaltning med egnede restriktionsendo-nucleaser og inkorporering i λ-charonfag, f.eks. λ-charon 10 4A, under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Det genomiske DNA-bibliotek replikeret på nitrocellulosemembraner, screenes med en DNA-probe, f.eks. en syntetisk DNA-probe på mindst 17 nucleotider eller et cDNA afledt af mRNA, som koder for det ønskede polypeptid, som beskrevet 15 ovenfor.

Inkorporeringen af dsDNA fremstillet ud fra mRNA eller af genomisk oprindelse i en egnet vektor er velkendt. F.eks. skæres en passende vektor og forsynes med haler af ens deoxynucleotider. dsDNA'et, som skal annelleres, må da 20 være forsynet med haler af komplementært ens deoxynucleotider, hvilket opnås ved inkubering i nærværelse af det tilsvarende deoxynucleotid-triphosphat og et enzym, såsom terminal deoxynucleotidyltransferase. Endvidere kan dsDNA'et inkorporeres i vektoren ved simpel ligering efter 25 behandling med den samme endonuclease, som danner kompie-ί mentært fremskydende ender, ved hjælp af linkeroligonu- cleotider eller kortendeligering.

, Transformeringen af en egnet værtsorganisme med den dannede hybridvektor er velkendt. Eksempelvis konditione-f 30 res Escherichia coli til transformation ved inkubering i medier, som indeholder calciumchlorid, hvorefter der foretages behandling med hybridvektoren. Transformerede værter selekteres ved hjælp af egnede markører, f.eks. ved hjælp af en antibiotikumresistent markør, f.eks. med 35 resistens overfor tetracyclin, chloramphenicol eller \\ 15 DK 172677 B1 ampicillin, og/eller ved hjælp af en enzymmarkør, f.eks. /3-galactosidasekomplementerende a-protein.

Værter transformeret med det ønskede DNA selekteres 5 fortrinsvis ved anvendelse af en DNA-probe. En sådan hybridlseringsprobe er f.eks. et helsyntetisk DNA bestående af mindst 17 nucleotider, f.eks. ca. 20 nucieo-tider, dannet på basis af den partielle aminosyresekvens bestemt på det ønskede protein isoleret fra interferonin-10 ducerede Namalwaceller. Der fremstilles fortrinsvis blandinger af oligonucleotidprober, hvori hver komponent af blandingen er komplementær til en af de mulige kombinationer af tripletkodoner for den tilsvarende kendte aminosyresekvens.

15 Sådanne DNA-prober fremstilles under anvendelse af kendte fremgangsmåder, fortrinsvis ved trinvis kondensation under anvendelse af phosphotriester-, phosphittriester- eller phosphoramiditfastfasemetoden, f.eks. kondensation af di-20 nucleotidkoblingsenheder ved hjælp af phosphotriestermetoden.

Disse metoder tilpasses til fremstillingen af blandinger af de ønskede oligonucleotider ved anvendelse af blandinger af 2, 3 eller 4 nucleotider dA, dC, dG og/eller dT på beskyttet form eller de tilsvarende dinucleotidkoblingsenheder i 25 et passende kondensat ionstrin som beskrevet af Y. Ike et al., Nucleic Acid Research 1Λ, 477 (1983).

DNA-proberne skal indeholde en markør, således at der kan påvises hybridisering med DNA fra transformerede værter, 30 og værterne kan identificeres og adskilles fra andre værter, som ikke indeholder det ønskede DNA ifølge opfindelsen. Der kan hensigtsmæssigt anvendes f.eks. radioaktive markører, såsom 32P i 5’-endephosphatet i oligonucleotidet eller fluorescerende markører eller en 35 markør, som indeholder biotin, som kan påvises med passende mærket avidin, f.eks. avidin bærende en fluore- 16 DK 172677 B1 scerende markør eller konjugeret med et enzym, såsom péberrodsperoxidase.

Hybridisering af DNA fra transformerede værter med 5 DNA-proberne Indeholdende en markør gennemføres under anvendelse af kendte fremgangsmåder, dvs. i puffer- og saltopløsninger Indeholdende hjælpestoffer, f.eks. calclumchelatorer, viskositetsregulerende forbindelser, proteiner, irrelevant DNA eller tRNA og lignende, ved 10 temperaturer, der fremmer selektiv hybridisering, f.eks. mellem 0 og 70*C, f.eks. fra 40 til 50*C, fortrinsvis ca.

20*C under smeltetemperaturen for hybrid dsDNA'et.

Hybridvektorer, som indeholder et DNA, der koder for de 15 ønskede proteiner, operativt bundet til en ekspressionskontrolsekvens, vælges afhængigt af de værtsceller, som skal anvendes til transformeringen. Som eksempler på egnede værtsceller kan nævnes mikroorganismer, som ikke eller kun i ringe udstrækning har restriktionsenzymer eller modifi-20 ceringsenzymer, såsom gærarter, f.eks. Saccharomyces cere-vislae, f.eks. S. cerevisiae GRF18, og bakteriestammer, især Escherichia coli-stammer, f.eks. E. coli X1776, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221, E. coli JM109 eller E. coli K12 stamme 294, 25 Bacillus subtilis, B. stearothermophilus. Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus og andre, samt tillige celler af højerestående organismer, især etablerede humane eller animalske cellelinier, f.eks. Hela-celler, SV-40 virustransformerede nyreceller fra afrikansk grøn abe COS-7 30 eller kinesisk hamsterovarieceller (CHO-celler). De ovenfor omtalte Escherichia colistammer, f.eks. E. coli JM 109, E. coli HB101, E. coli K12 og E. coli W3110, og Saccharomyces cerevisiae-stammer foretrækkes som værtsorganismer.

i ii i 13 17 DK 172677 B1

Principielt er alle vektorer, som replikerer og udtrykker det ønskede polypeptidgen ifølge opfindelsen i en valgt vært, egnede. Eksempler på vektorer, som er egnede til 5 ekspressionen i en Escherichia colistamme, er bakterio-fager, f.eks. derivater af X eller M13-bakteriofager, eller plasmider, såsom især plasmidet ColEl og dets derivater, f.eks. pMB9, pSF2l24, pBR317 eller pBR322. De foretrukne vektorer ifølge opfindelsen er afledt af plas-10 mid pBR322. Egnede vektorer indeholder et komplet replikon og et markørgen, som muliggør selektering og identificering af værterne transformeret med ekspressionspiasmiderne på basis af et fænotypisk træk, og eventuelt signalsekvenser og såkaldte enhancere. Egnede markørgener bibringer 15 hverken f.eks. resistens mod tungmetaller, antibiotika og lignende. Foruden replikon- og markørgenområderne indeholder foretrukne vektorer ifølge opfindelsen genkendelsessekvenser for restriktionsendonucleaser, således at genet for det ønskede peptid og, om ønsket, ekspressions-20 kontrolsekvensen kan Indsættes på disse steder. Den foretrukne vektor, plasmidet pBR322 og afledte plasmider, f.eks. pUC9, pHRil48 og pPLc24, indeholder et intakt replikon, markørgener, som bibringer resistens mod f.eks. tetracyclin og ampicillin (tetR og ampR), og et antal 25 entydige genkendelsessteder for restriktionsendonucleaser.

Der kan anvendes flere ekspressionskontrolsekvenser til regulering af genekspressionen. Især. anvendes ekspressionskontrolsekvenser for stærkt udtrykte gener i værten, som skal transformeres. I tilfælde af f.eks. pBR322 som 30 hybridvektoren og Escherichia coli som værtsmikroorganismen er ekspressionskontrolsekvenserne (som bl.a. indeholder promotoren og det ribosomale bindingssted) for lactoseoperonet, tryptophanoperonet, arabinoseoberonet, og lignende, ø-lactamasegenet, de tilsvarende sekvenser af 35 fag X N-genet, især sådanne, som indeholder PL-promotoren, eller fag fd-coatproteingenet og andre velegnede. Medens plasmid pBR322 allerede indeholder promotoren for Ø-lacta- 18 DK 172677 B1 masegenet (Ø-lac-gen), skal de andre ekspressionskontrolsekvenser Indføres i plasmldet.

Vektorer, som er egnede til replikation og ekspression i 5 gær, Indeholder en gærreplikat ions start og en selektiv genetisk markør for gær. Hybridvektorer, som indeholder en garreplikationsstart, f.eks. kromosomalt autonomt repiike-rende segment (ars), tilbageholdes ekstrakromosomalt i gærcellen efter transformationen og replikeres autonomt.

10 Der kan endvidere anvendes hybridvektorer, som indeholder sekvenser, der er homologe til gar 2/i-plasmid-DNA’et.

Sådanne hybridvektorer vil blive integreret ved rekombination 1 2/t-pi asmider, som allerede findes i cellen, eller de vil replikere autonomt. 2μ-sekvenser er særligt egnede 15 til plasmider med en høj transformationsfrekvens og tillader store kopital. Den foretrukne garvektor ifølge opfindelsen er plasmid pJB207.

Egnede markørgener for gær er især sådanne, som bibringer værten antibiotisk resistens, eller, i tilfælde af 20 auxotrophe gærmutanter, gener, der komplementerer værtslæsioner. Tilsvarende gener tilvejebringer eksempelvis resistens mod antibiotikumet cycloheximid eller tilvejebringer protophi i en auxotrophisk gærmutant, f.eks.

URA3-, LEU2-, HIS3- eller, især, TRPl-genet. Endvidere 25 indeholder gærhybridvektorer fortrinsvis en replikations-start og et markørgen for en bakterievært, især Escherichia coli, således at konstruktion og kloning af hybridvektorerne og deres intermediator kan finde sted i en bakterievært.

30 Ekspressionskontrolsekvenser, som er egnede til ekspression i gær, er f.eks. sådanne fra stærkt udtrykte gærgener. Der kan således anvendes promotorerne for TRPl-genet, ADHI- eller ADHII-genet, sur phosphatase (PH03 eller PH05)-genet, isocytochromgenet eller en promotor, 35 som indgår i den glycolytiske proces, f.eks. promotoren 19 DK 172677 B1 for enolase-, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH)-, 3-phosphoglycerat-kinase (PGK)-, hexokinase-, pyruvat-decarboxylase-, phosphofructokinase-, glucose-5 6-phosphat-isomerase-, 3-phosphoglycerat-mutase-, pyruvat-kinase-, triosephosphat-isomerase-, phosphoglucose-isomerase- og glucokinase-generne. Foretrukne vektorer ifølge opfindelsen indeholder promotorer med transskriptionel kontrol, f.eks. promotorerne for PH05-, ADHII- og 10 GAPDH-generne, som kan kobles ind eller kobles ud ved at variere vækstbetingelserne. Eksempelvis kan PH05-promoto-ren kobles ud eller genindkobles alene ved at forøge eller formindske koncentrationen af uorganisk phosphat i mediet.

Vektorer, som er egnede til replikation og ekspression i 15 pattedyrceller, Indeholder fortrinsvis DNA af viral oprindelse, f.eks. fra simlanvlrus 40 (SV40), Rous sarcoma- virus (RSV), adenovirus 2, bovint papillomavirus (BPV), papovavirus BK-mutant (BKV) eller cytomegalovirus (CMV) fra mus eller mennesker. Sådanne vektorer indeholder 20 fortrinsvis et replikationsområde og et antibiotikaresistensgen til propågering i Escherichia coli sammen med en eucaryotisk regulatorisk transskriptionssekvens. Specielt kan såkaldte "shuttle"-vektorer konstrueres ud fra et pBR322 Escherichia coli-plasmid og SV40 og/eller CMV 25 enhancer- og promotor-områder. Plasmidet kan eksempelvis indeholde enhancer-promotorenheden fra det såkaldte muse-eller human-cytomegsalovirus-major-immediate-early-gen, SV40-enhanceren kombineret med den humane a-globinpromotor og/eller tillige inducerbare promotorer, såsom sådanne 30 afledt fra varmechok- eller metallothioneingenerne.

Det er endvidere også muligt at anvende promotor- eller kontrolsekvenser, som normalt er forbundet med den ønskede gensekvens. Et replikationsområde kan endvidere tilvejebringes enten ved konstruktion af vektoren, således at 35 den indeholder et exogent område, f.eks. afledt af SV40, andre virale kilder eller tilvejebragt ved hjælp af 20 DK 172677 B1 værtscellens kromosomale repllkatlonsmekanlsme. Hvis vektoren er Integreret i værtscellekromosomet, er sidstnævnte metode ofte mere effektiv.

5 Der foretrækkes hybridvektorer, som kan undergå replikation og fænotypisk selektion i en værtsstamme omfattende en promotor og et DNA, som koder for det ønskede protein, og som er anbragt sammen med transskriptiorisstartsignaler og trans-skriptionstermineringssignaler samt translationsstartsignaler 10 og translationsstopsignaler i hybridvektoren under kontrol af promotoren, således at det i en transformeret vært udtrykkes til dannelse af polypeptidet.

En transformeret vært kan fremstilles ved, at en vært trans-15 formeres eller transficeres med en ekspressionsvektor, som indeholder et DNA reguleret af en ekspressionskontrolsekvens, samt selve de transformerede eller transficerede værter.

Som eksempler på egnede værter kan nævnes de ovenfor 20 anførte mikroorganismer, såsom stammer af Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis og Escherichia coli. Transformeringen med ekspressionsplasmiderne ifølge opfindelsen gennemføres f.eks. som beskrevet i litteraturen, således for S. cerevisiae [A. Hinnen, J.B.

25 Hicks og G.R. Fink, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)], B. subtilis [Anagnostopoulos et al., J.

Bacteriol. 81, 741 (1961)] og E. coli [M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)].

30 I overensstemmelse hermed indbefatter transformationsproceduren for Escherichia coli-celler Ca^+ forbehandling af cellerne for at tillade optagelse af DNA og inkubering med hybridvektoren. Cellerne overføres til et selektivt vækstmedium, som tillader adskillelse af de transformerede 35 21 DK 172677 B1 celler fra moder cel lerne. Celler, som ikke indeholder vektoren, vil ikke overleve i et sådant medium. Transformationen af gær omfatter f.eks. følgende trin: 5 (1) Enzymatisk fjernelse af gærcellevæggen ved hjælp af glucosidaser, (2) behandling af de dannede sfæroplaster med vektoren i nærværelse af polyethylenglycol og Ca^+-ioner og (3) regenerering af cellevæggen ved indlejring af sfæroplasterne i agar. Regenereringsagaren fremstilles 10 fortrinsvis på en sådan måde, at der tillades regenerering og selektering af de transformerede celler på samme tid.

Andre eksempler på egnede værter er de ovenfor nævnte pattedyrceller, f.eks. C0S-7-celler, Helaceller éller kinesisk hamster-ovarieceller (CHO-celler). Vektorerne 15 indføres i pattedyrcellerne ved transfektion i nærværelse af hjælpeforbindelser, f.eks. diethylaminoethyldextran, dimethylsulfoxid, glycerol, polyethylenglycol eller lignende, eller som copræcipitater af vektor-DNA og calciumphosphat. Andre egnede metoder indbefatter direkte 20 mikroinjektion af vektor-DNA i cellekernen og elektroporering , dvs. indføring af DNA ved hjælp af en kort elektrisk strøm, som forøger cellemembranernes permeabilitet. Den efterfølgende selektion af transficerede celler kan gennemføres under anvendelse af 25 en selektionmarkør, som enten er integreret kovalent i ekspressionsvektoren eller tilsat som en særskilt enhed. Selektionsmarkører indbefatter gener, som tilvejebringer antibiotikaresistens, f.eks. G-418 (neomycin) eller hygromycin, eller gener, som kompletterer en genlæsion i 30 værtscellen, såsom mangel på thymidinkinase eller hypoxan-thinphosphoribosyltransf erase.

De transformerede værtsceller dyrkes på i og for sig kendt måde i et væskemedium, som indeholder assimilerbare kilder for kulstof, nitrogen og uorganiske salte.

35 Der kan anvendes forskellige kulstofkilder til dyrkning af 22 DK 172677 B1 de transformerede værter Ifølge opfindelsen. Eksempler på foretrukne kulstofkilder er assimilerbare kulhydrater, såsom glucose, maltose, mannitol eller lactose, eller et 5 acetat, som kan anvendes enten alene eller i egnede blandinger. Som eksempler på egnede nitrogenkilder kan nævnes aminosyrer, såsom casaminosyrer, peptider og proteiner og deres nedbrydningsprodukter, såsom trypton, pepton eller kødekstrakter, gærekstrakter, maltekstrakt og tillige 10 ammoniumsalte, f.eks. ammonlumchlorid, ammonlumsulfat eller ammoniumnitrat, der kan anvendes enten alene eller i egnede blandinger. Uorganiske salte, som også kan anvendes, er eksempelvis sulfater, chlorider, phosphater og carbonater af natrium, kalium, magnesium og calcium.

15 Mediet indeholder endvidere f.eks. vækstfremmende stoffer, såsom sporelementer, f.eks. jern, zink, mangan og lignende, og fortrinsvis stoffer, som udøver et selektionstryk og forhindrer vækst af celler, som har mistet ekspres-sionsplasmidet. Således sættes eksempelvis ampicillin til 20 mediet, hvis ekspressionsplasmldet indeholder et ampR-gen.

En sådan tilsætning af antibiotika har også den virkning, at kontaminerende antibiotikafølsomme mikroorganismer ødelægges. Hvis der som værtsorganisme anvendes en gærstamme, som er auxotrop med hensyn til f.eks. en 25 essentiel aminosyre, indeholder plasmidet fortrinsvis et gen, som koder for et enzym, der kompletterer værtsdefekten. Dyrkningen af gærstammen gennemføres i et minimalmedium, som mangler aminosyren.

Celler fra hvirveldyr dyrkes under vævskulturbetingelser 30 under anvendelse af kommercielt tilgængelige medier, som : eventuelt er tilsat vækstfremmende stoffer og/eller pattedyrsera. Cellerne dyrkes enten fæstnet til et fast bæremateriale, f.eks. en mikrobærer eller porøse glasfibre, eller fritflydende i egnede kulturbeholdere.

* 23 DK 172677 B1

Dyrkningen gennemføres under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur, pH-værdi i mediet og fermenteringstiden, vælges således, 5 at der opnås et maksimalt indhold af polypeptidet ifølge opfindelsen. En Escherichia coll-stamme eller gærstamme dyrkes således fortrinsvis under aerobe betingelser ved submers dyrkning med rystning eller omrøring ved en temperatur på fra ca. 20 til ca. 40'C, fortrinsvis ca.

10 30*C, og ved en pH-værdi på 4-8, fortrinsvis ved pH ca. 7, i fra ca. 4 til ca. 30 timer, fortrinsvis indtil der er opnået maksimale udbytter af polypeptidet.

Når celletætheden har opnået en tilstrækkelig høj værdi, 15 afbrydes dyrkningen, og polypeptidet isoleres. Hvis polypeptidet er fusioneret ved en egnet signalpeptid-sekvens, udskilles det direkte fra cellen til superna-tanten. I modsat fald er det nødvendigt at nedbryde cellerne, f.eks. ved behandling med et detergent, såsom 20 SDS, NP-40, "Triton"® eller deoxycholsyre, eller cellerne må nedbrydes med lysozym, et enzym med lignende virkning eller ved hjælp af ultralyd. Hvis der som værtsmikroorganisme er anvendt gær, kan cellevæggen fjernes ved enzymatisk fordøjelse med en glucosidase. Som en 25 alternativ eller yderligere foranstaltning kan der anvendes mekaniske kræfter, såsom forskydningskræfter (f.eks. X-presse, fransk presse. Dyno mølle) eller rystning med glasperler eller aluminiumoxid eller skiftevis frysning, f.eks. i flydende nitrogen, og 30 optøning, f.eks. til 30-40‘C, såvel som ultralydsbehandling til oplukning af cellerne.

Cellesupernatanten eller opløsningen, der er opnået ved centrifugering af blandingen dannet ved oplukning af cellerne, og som indeholder proteiner, nucleinsyrer eller 35 andre cellebestanddele, opkoncentreres med hensyn til proteiner, herunder polypeptiderne ifølge opfindelsen, på 24 DK 172677 B1 i og for sig kendt måde. Således fjernes f.eks. størsteparten af non-proteinbestanddelene ved polyethyleniminbe-handling, og proteinerne Inklusive polypeptlderne Ifølge opfindelsen fældes f.eks. ved mætning af opløsningen med 5 ammoniumsulfat eller med andre salte. Ellers forrenses cellesupernatanten eller lysatet direkte ved anvendelse af kromatografiske fremgangsmåder.

Polypeptlderne renses ved en kombination af kromatografiske 10 adskillelsesmetoder, fortrinsvis ved en kombination af ionby tterkromatograf i, gelfiltrering og HPLC med omvendt fase.

Der kan anvendes andre adskillelsesmetoder i oprensningstrinet, f.eks. filtrering eller ultrafiltrering med membraner med molekylvægtafskæring, affinitetskromatografi, kromato-15 grafi på hydroxy lapatit, chroma tofokusering og fremgangsmåder med dialysering, opløsning og genfældning i egnede salt-og/eller pufferopløsninger og opløsningsmiddelblandinger.

Et egnet bæremateriale til ionbytterkromatografi kan være 20 af organisk eller uorganisk oprindelse, f.eks. tværbundet agarose, dextran, polyacrylamid, styren/divinylbenzen-copolymer, cellulose eller lignende. Dette bæremateriale har fortrinsvis basiske funktionelle grupper, f.eks. tertiære aminofunktioner eller kvaternære ammoniumgrupper, 25 eller svagt sure grupper, f.eks. carboxymethylfunktioner.

Bærerne kan være egnede til almindelig væskekromatografi, hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC) eller HPLC (high performance-væskekromatografi). Separationerne og rensningerne ved ionbytterkromatografi gennemføres under anven-30 delse af kendte fremgangsmåder, f.eks. i vandige . pufferopløsninger ved en pH-værdi på fra 4-9 indeholdende stigende mængder salt, f.eks. natriumchlorid.

Bærematerialer, som er egnede til gelfiltrering eller 35 kromatografi med størrelsesudelukkelse, indbefatter tværbundet dextran, agarose, passende modificeret polyacryl- 25 DK 172677 B1 amid eller siliciumdioxid og lignende. Disse bærere er eventuelt modificeret med bestanddele, som Indeholder hydroxyfunktioner, f.eks. med 1-hydroxy- eller 1,2-dihydr-5 oxy-iavalkylgrupper. Det kromatografiske materiale vælges således, at der opnås optimal adskillelse af peptider i molekylvægtområdet fra 50.000 til 100.000 Dalton. En sådan gelfiltrering eller størrelsesudelukkelseskromatografi kan gennemføres i søjler, som er egnede til normal 10 væskekromatografi, FPLC eller HPLC som ovenfor under anvendelse af pufferopløsninger omkring neutralpunktet indeholdende varierende mængder salt, f.eks. natrlum-chlorid.

Kromatografi med omvendt fase gennemføres på silicium-15 dioxidbaseret bæremateriale, som bærer hydrofobe grupper, f.eks. alkylgrupper med 1-20 carbonatomer, fortrinsvis 4, 8, 12 eller 18 carbonatomer, eller blandinger af alkylgrupper med henholdsvis 1 og 8 eller 2 og 18 carbonatomer, eller phenylgrupper. Beslægtede med denne fremgangsmåde er 20 den hydrofobe vekselvirkningskromatografi (hydrophobic interaction chromatography), ved hvilken der anvendes agarose eller et beslægtet materiale overtrukket med alkylgrupper med op til 12 carbonatomer og/eller phenylgrupper. Disse kromatograferingsteknikker anvendes 25 under anvendelse af FPLC eller HPLC. Opløsningsmidler til behandling af polypeptiderne ifølge opfindelsen på sili-ciumdioxidbaseret materiale med omvendt fase er vandige syrer, f.eks. vandig trifloureddikesyre, som indeholder stigende mængder polært, vandblandbart organisk opløs-30 ningsmiddel, f.eks. acetonitril, lavere alkoholer, f.eks. methanol, ethanol eller propanol, tetrahydrofuran og lignende, fortrinsvis acetonitril.

Affinitetskromatografi kan også anvendes til rensning af peptiderne ifølge opfindelsen ved anvendelse af et egnet 35 bæremateriale, f.eks. tværbundet agarose, dextran eller polyacrylamid, som bærer molekyler med høj affinitet til 26 DK 172677 B1 de ønskede proteiner, f.eks. antistoffer, især monoklonale antistoffer, som beskrevet i det følgende. Antistofferne kobles derpå til bærematerialet i aktiveret form ved 5 anvendelse af kendte fremgangsmåder. Rensningen af de ønskede proteiner ved affinitetskromatografi gennemføres på i og for sig kendt måde, f.eks. i pufferopløsninger i et pH-interval på fra ca. pH 5 til ca. pH 9 og/eller saltopløsninger, f.eks. NaCl-opløsning, der eventuelt 10 indeholder overfladeaktive stoffer, f.eks. polyethylen- sorbitanfedtsyreestere, hvorpå de ønskede proteiner elueres med pufferopløsninger i et pH-område fra ca. pH..2 til ca. pH 5, såsom glycinpuffer, eller pH-gradienter med varierende sammensætning eller saltopløsninger, f.eks.

15 koncentreret NH4SCN-opløsning.

De antivirale egenskaber ved proteinerne er nyttige til behandlingen af og/eller beskyttelse rood virusinfektioner. Proteinerne kan især anvendes til behandling af influenza 20 og andre virusinfektioner i luftvejene, herpesvirusinfektioner og rabies- og hepatitis-infektion, eventuelt i kombination med andre antivirale midler. Proteinerne kan anvendes i form af farmaceutiske præparater, som indeholder en terapeutisk virksom mængde af den aktive bestanddel, even-25 tuelt sammen med eller i blanding med uorganiske eller organiske, faste eller flydende, farmaceutisk acceptable bærestoffer.

De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen stammer for-30 trinsvis fra dyr af museslægten og er især museantistoffer fremstillet ved hjælp af muse/musehybridomaceller.

Som eksempler på monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan nævnes de monoklonale antistoffer fra mus med be-35 tegneisen 885 S35.8.1, 885 S35.16.ll, 885 S56.55.7.12.48, 885 S56.55.7.21.25, 885 S56.55.7.27.5, 885 S56.55.7.27.11, 885 S56.55.13, 885 S56.55.17 og 885 S56.67.15.

27 DK 172677 B1

Der foretrækkes monoklonale antistoffer med betegnelsen 885 S35.8.1, 885 S56.55.13 og 885 S56.67.15 og derivater deraf. Disse monoklonale antistoffer udskilles af de tilsvarende hybridomacellelinier med betegnelsen 5 885 S35.8.1, 885 S56.55.13 og 885 S56.67.15.

Derivater af monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen er f.eks. antistoffragmenter, radioaktivt mærkede monoklonale antistoffer og konjugater af de monoklonale antistoffer 10 med enzymer, med fluorescerende markører eller lignende.

Fragmenter af monoklonale antistoffer ifølge opfindelséh er f.eks. Fab-, Fab'- eller F(ab')2~fragmenter, som bibeholder deres specificitet for de antigene 15 determinanter, dvs. som bevarer deres specificitet for de humane interferoninducerede proteiner som beskrevet ovenfor.

Radioaktivt mærkede monoklonale antistoffer indeholder 20 f.eks. radioaktivt iod (123j, 125j^ 131j)f kulstof (14C), svovl (35S), tritium (3H) eller lignende. Der foretrækkes monoklonale antistoffer mærket med radioaktivt iod.

Antistofkonjugater ifølge opfindelsen er f.eks. konjugater 23 af monoklonale antistoffer eller fragmenter deraf med enzymer, såsom peberrodsperoxidase, alkalisk phosphatase, ø-D-galactosidase, glucoseoxidase, glucoamylase, carbon-anhydrase, acetylcholinesterase, lysozym, maleat-dehydro-genase eller glucose-6-phosphat-dehydrogenase, med fluore-30 scerende markører, f.eks. fluorescein, eller med avidin eller biotin. I sådanne konjugater er antistoffet bundet direkte til enzymerne eller de fluorescerende markører eller gennem en afstands- eller bindingsgruppe. Der foretrækkes konjugater af monoklonale antistoffer med 23 enzymerne peberrodsperoxidase eller alkalisk phosphatase.

28 DK 172677 B1

Fremgangsmåden ifelge opfindelsen til fremstilling af de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen og derivater deraf er ejendommelig ved at hybridomaceller, som udskiller de monoklonale antistoffer, 5 (a) dyrkes in vitro, og de monoklonale antistoffer isole res fra kultursupernatanten, eller (b) propageres in vitro i et egnet pattedyr, og de monoklonale antistoffer udvindes fra pattedyrets kropsvæsker , 10 og, om ønsket, (c) de opnåede monoklonale antistoffer omdannes til et derivat deraf.

Egnede dyrkningsmedier til in vitro-dyrkningen ifølge 15 fremgangsmåde a) er standardkulturmedier, såsom Dulbecco's Modified Eagle-medium eller RPMI 1640-medium, der eventuelt er tilsat et pattedyrsserum, f.eks. føtalt kalveserum, eller andre vækstfremmende tilsætningsstoffer, såsom 2-aminoethanol, insulin, transferrin, lipoprotein med lav 20 vægtfylde, oleinsyre og lignende, samt sporelementer. Isoleringen af de monoklonale antistoffer gennemføres ved fældning af proteinet i kultursupernatanterne med ammoniumsulfat eller lignende, hvorefter imrounoglobu-linerne renses ved kromatografiske standardmetoder, såsom 25 gelfiltrering, ionbytterkromatografi, kromatografi på DEAE-cellulose eller immunaffinitetskromatografi.

In vitro-produktion muliggør fremstilling i stor målestok af store mængder af de ønskede antistoffer. Teknikker til 30 hybridomadyrkning i stor målestok er kendt og indbefatter homogen suspensionskultur, f.eks. i en airlift-reaktor eller i en kontinuert omrøringsreaktor, eller immobi-liseret eller indesluttet cellekultur, f.eks. i hule 35 29 DK 172677 B1 fibre, mikrokapsler, på agarosemikroperler eller keramiske patroner.

Der kan også opnås store mængder af de ønskede monoklonale 5 antistoffer ved propargering af hybridomaceller ifølge fremgangsmåde b). Cellekloner injiceres i syngene pattedyr, hvilket fremkalder vækst af antistofproducerende tumorer. Efter en til tre ugers forløb udvindes de ønskede monoklonale antistoffer fra pattedyrets legemsvæsker.

10 Eksempelvis injiceres hybridomaceller afledt af Balb/c-mus intraperitonealt til Balb/c-mus, som eventuelt er forbehandlet med et carbonhydrid, såsom pristan, og efter en eller to uger opsamles ascitesvæske fra disse mus. De ønskede monoklonale antistoffer isoleres fra legemsvæsker-15 ne ved anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder, f.eks. ved fældning af proteinerne med ammoniumsulfat eller lignende efterfulgt af rensning af immunoglobulinerne ved kromatografiske standardmetoder, såsom gelfiltrering, ionbytterkromatografi, kromatografi på DEAE-cellulose 20 eller immunaffinitetskromatografi.

Fragmenter af monoklonale antistoffer, f.eks. Fab, Fab’ eller F(ab')¾-fragmenter, som bevarer deres specificitet mod de humane interferoninducerede proteiner, som beskrevet ovenfor, kan opnås ud fra de monoklonale 25 antistoffer fremstillet ifølge fremgangsmåde a) eller b) under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder, f.eks. ved spaltning med enzymer, såsom pepsin eller papaln og/eller spaltning af disulfidbindinger med kemisk reduktion.

30 Monoklonale antistoffer mærket med radioaktivt iod fremstilles ved anvendelse af kendte ioderingsmetoder, f.eks. ved mærkning af monoklonale antistoffer med radioaktivt natrium- eller kaliumiodid og et kemisk oxidationsmiddel, såsom natriumhypochlorit, chloramin T 35 eller lignende eller en enzymatisk oxidant såsom lactoper- 30 DK 172677 B1 oxidase eller glucoseoxidase og glucose. Radioaktivt mærkede monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan også fremstilles ved at sætte radioaktivt mærkede 5 næringsstoffer til kulturmediet for in vitrodyrkningen ifølge trin a). Sådanne mærkede næringsstoffer indeholder f.eks. radioaktivt kulstof (14C), tritium (3H), svovl (35S) eller lignende og er f.eks. L-(14C)-leucin, L(3H)-leucin eller L-(35S)-methionin.

10

Konjugater af monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen fremstilles under anvendelse af kendte fremgangsmåder'/ f.eks. ved at omsætte et monoklonalt antistof fremstillet ifølge fremgangsmåde a) eller b) eller et fragment deraf 15 fremstillet som beskrevet ovenfor med enzymet i nærværelse af et koblingsmiddel, f.eks. glutaraldehyd, periodat, N, N’-o-pheny1endimalelmid, N-(m-maleimidobenzoyloxy)-succinimid, N-(3-[2'-pyridyldithio ]-propionoxy)- succin-lmid, N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid 20 eller lignende. Konjugater med avidin fremstilles på lignende måde. Konjugater med biotin fremstilles f.eks. ved omsætning af monoklonale antistoffer med en aktiveret ester af biotin, såsom biotin-N-hydroxysuccinimidesteren.

•i Konjugater med fluorescerende markører fremstilles i 25 nærværelse af et koblingsmiddel, f.eks. de ovenfor anførte, eller ved omsætning med et isothiocyanat, fortrinsvis fluoresceinisothiocyanat.

Hybridomacellelinierne ifølge opfindelsen er ejendommelige i 30 ved, at de udskiller monoklonale antistoffer, som er speci fikke over for et protein kendetegnet ved (1) tilstedeværelse i humane celler induceret ved hjælp af interferon a eller β, men ikke i ubehandlede 35 celler i et rimeligt omfang, u n 31 DK 172677 B1 (2) en molekylvægt på ca. 78 kDa bestemt ved natrium- dodecylsulf atpolyacrylamidgelelektroforese (SDS- -PAGE), 5 (3) et isoelektrisk punkt på ca. 6,3, og (4) en partiel N-terminal aminosyresekvens 5 10 10 Val-Val-Ser-Glu-Val-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala hvilke antistoffer ikke krydsreagerer med det beslægtede museprotein Mx induceret ved hjælp af interferon.

15 De er især cellelinier, som er hybrider af myelomaceller og B lymfocyter fra et pattedyr immuniseret med renset human interferoninduceret protein med en tilsyneladende molekylvægt på 78 kDa. Disse cellelinier er fortrinsvis hybrider af muse-myelomaceller og B lymfocyter fra en syngenisk mus 20 immuniseret med proteinet.

Eksempler på sådanne cellelinier er hybridomacellelinier-ne med betegnelsen 885 S35.8.1, 885 S35.16.ll, 885 S56.55.7.12.48, 885 S56.55.7.21.25, 885 S56.55.7.27.5, 25 885 S56.55.7.27.11, 885 S56.55.13, 885 S56.55.17 og 885 S56.67.15.

Disse hybridomacellelinier er hybrider af musemyelomacel-lelinien Sp2/0-Agl4 og B lymfocyter fra milten hos Balb/c-30 mus immuniseret med det rensede humane interferoninducerede potein fra Namalwa-celler, som beskrevet ovenfor. De er stabile cellelinier og udskiller de monoklonale antistoffer med den tilsvarende betegnelse. Cellelinierne kan opbevares i kultur eller dybfryses i flydende nitrogen og 35 genaktiveres efter optøning.

32 DK 172677 B1

Specielt foretrækkes hybridomacellelinierne med betegnelsen 885 S35.8.1, 885 S56.55.13 og 885 S56.67.15, der er deponeret den 9. april 1986 i "Collection Nationale de 5 Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, under nummeret henholdsvis 1-545, 1-543 og 1-544.

Fremgangsmåden til fremstilling af hybridomacellelinier, som udskiller monoklonale antistofffer med specificitet for 10 de interferoninducerede proteiner som beskrevet ovenfor, er ejendommelig ved, at et egnet pattedyr immuniseres med et renset protein, eventuelt med et antigent bærestof, anti.-stofproducerende celler fra dette pattedyr fusioneres med myelomaceller, de ved fusionen dannede hybridceller klones, 15 og cellekloner, som udskiller de ønskede antistoffer, selekteres.

Foretrukne pattedyr til immuniseringen af mus, er især HR-mus. Immuniseringerne gennemføres f.eks. ved implan-20 tering af en antigen bærer, f.eks. et stykke nitrocellulose, indeholdende renset 78 kDa-protein fra inducerede Namalwa-celler, og endvidere ved injektion af fra mellem 2 μg og 10 μg af proteinet to til ti gange parenteralt, såsom intraperitonealt og/elier subkutant, med mellemrum 25 på 7 til 30 dage. Injektionsmaterialet indeholder eventuelt et hjælpestof, som stimulerer lymfocytproduktionen, f.eks. komplet eller inkomplet Freund's adjuvans og/eller et adjuvanspeptid.

30 Antistofproducerende celler fra de immuniserede dyr, fortrinsvis miltceller, udtages 2-5 dage efter den første booster-injektion, og de fusioneres med myelomaceller fra en egnet cellelinie i nærværelse af en fusionspromotor.

Der kendes adskillige egnede myelomacellelinier. Der 35 foretrækkes myelomacellelinier, som mangler enzymet 33 DK 172677 B1 0 hypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (HGPRT) eller enzymet thymldinkinase (TK), som derfor ikke overlever i et dyrkningsmedium, som Indeholder hypoxanthin, aminopterin og thymidin (HAT-medium). Især foretrækkes myelomaceller og afledte cellelinier, som ikke 5 overlever i HAT-medium, og som ikke udskiller lmmunogiobuiiner eller fragmenter deraf, såsom cellelinierne X63-Ag8.653 eller Sp2/0-Agl4. Almindelige fusionpromotorer er f.eks. Sendai-virus eller andre paramyxovlra, eventuelt i UV-inaktiveret form, calciumioner, overfladeaktive lipider, såsom lysolecithin, eller polyethylenglycol. Fortrinsvis fusioneres myeloma-celierne med et 3- til 20-dobbelt overskud af miltceller fra immuniserede pattedyr i en opløsning, som indeholder fra 30 til 60% polyethylenglycol med en molekylvægt på 15 mellem 1000 og 4000.

Efter fusionen resuspenderes cellerne, hvorpå de dyrkes i selektivt HAT-medium. På denne måde vil kun hybridomacel-ler overleve, da de kombinerer evnen til at vokse og 20 formere sig in vitro, hvilken evne er arvet fra myelomaceller, med de manglende HGPRT- eller TK-gener, der er nødvendige for overlevelse i HAT-mediet, hvilke gener er arvet fra de antistofproducerende miltceller fra de immuniserede pattedyr.

25

Egnede dyrkningsmedier til formeringen af hybridomacel-lerne er standarddyrkningsmedierne, såsom Dulbecco’s Modified Eagle medium, minimalt essentielt medium, RPMI 1640-medium og lignende, eventuelt tilsat serum, f.eks.

30 10-15% føtalt kalveserum. Fortrinsvis tilsættes såkaldte "feeder"-celler ved begyndelsen af celledyrkningen, f.eks. peritoneale exsudatceller, railtceller, marvknoglemakro-fager eller lignende fra normale mus. Dyrkningsmedierne tilsættes selektivt HAT-medium med regelmæssige mellemrum 35 for at forhindre, at normale myelomaceller overvokser 34 DK 172677 B1 0 hybridomacellerne.

Supernatanterne fra hybridomacellekulturerne screenes for de ønskede monoklonale antistoffer, fortrinsvis ved hjælp af en enzyminununanalyse, f.eks. en prik-ELISA-analyse,

C

eller en radioimmunanalyse. Positive hybridomaceller klones, f.eks. ved begrænsningfortynding, fortrinsvis to eller flere. Eventuelt passeres hybridomaceller gennem dyr, f.eks. mus, ved intraperitoneal injektion, hvorpå der høstes ascites, som stabiliserer hybridoma og øger vækst-10 egenskaberne. De klonede cellelinier kan fryses på sædvanlig måde.

De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen og/eller deres derivater er nyttige til den kvalitative og 15 kvantitative bestemmelse af de interferoninducerede humane proteiner, som beskrevet ovenfor.

De monoklonale antistoffer eller derivater deraf, såsom enzymkonjugater eller radioaktive derivater, kan eksem-20 pelvis anvendes i en vilkårlig af de kendte immunanalyser, der er baseret på bindingsvekselvirkningen mellem den antigene determinant i proteinerne ifølge opfindelsen og

M

] de monoklonale antistoffer. Eksempler på sådanne analyser 1 er radiolmmunanalyser (RIA), enzymimmunanalyser, f.eks.

25 enzym-bundet immunadsorbentanalyse (ELISA), immunfluorescens, immunfaldnlng, latexagglutination og ^ hemagglutination. Sådanne immunanalyser er eksempelvis nyttige til kontrollering eller måling af produktionen og rensning af de ønskede proteiner fra naturlige kilder 30 eller mikroorganismer fremstillet ved gensplejsning og ved den kvalitative og kvantitative bestemmelse af proteinerne i biologiske væsker, f.eks. fra patienter, som behandles • med et protein ifølge opfindelsen eller med interferon, eller som har behov for en sådan behandling.

35 π

"TB

35 DK 172677 B1 0 De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan anvendes som sådanne eller i form af radioaktivt mærkede derivater i en radioimmunanalyse (RIA). Der kan anvendes en vilkårlig af de kendte modifikationer af en RIA, f.eks.

RIA i homogen fase, fastfase-RIA eller heterogen-RlA, 5 enkel-RIA eller dobbelt (sandwich)-RIA med direkte eller indirekte (competitive) bestemmelse af proteinet ifølge opfindelsen. Der foretrækkes en sandwich-RlA, ved hvilken en egnet bærer, f.eks. plastoverfladen på en mikrotiter-plade eller på et prøverør, f.eks. af polystyren, 10 polypropylen eller polyvinylchlorid, glas- eller plastperler, filtrerpapir eller dextran-, celluloseacetat-eller nitrocelluloseark eller lignende, overtrækkes med et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen ved simpel adsorption eller eventuelt efter aktivering af bæreren, 15 f.eks. glutaraldehyd eller cyanbromid, og inkubering med testopløsningen og en opløsning af et monoklonalt antistof, som er mærket radioaktivt med idet det opløste monoklonale antistof genkender en anden epitop af proteinerne ifølge opfindelsen end det bærebundne monoklonale antistof, og mængden af proteinerne ifølge opfindelsen bestemmes ved måling af radioaktiviteten bundet til bæreren. Især foretrækkes en sandwich radioimmunanalyse som beskrevet ovenfor, ved hvilken et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen er bundet til en 25 perle, f.eks. en polystyrenperle, og denne overtrukne perle inkuberes i en testopløsning eller standardopløsning, som Indeholder Interferoninducerede humane proteiner, hvorpå der til slut fremkaldes med et radioaktivt mærket monoklonalt antistof, som genkender en anden 30 epitop.

Det monoklonale antistof ifølge opfindelsen kan anvendes som sådant eller i form af enzymkonjugerede derivater 1 en enzymimmunanalyse. Sådanne Immunanalyser Indbefatter 35 testmetoder, ved hvilke der anvendes enzymmærkede 36 DK 172677 B1 monoklonale antistofderivater ifølge opfindelsen eller enzymmærkede antistoffer, som er i og for sig kendte, der genkender og binder en epitop af antistofferne ifølge 5 opfindelsen.

Der foretrækkes en ELISA (enzymbundet immunadsorbent-analyse), i hvilken en bærer som beskrevet ovenfor for en RIA overtrækkes med et monoklonalt antistof ifølge 10 opfindelsen, inkuberes med en testopløsning indeholdende et interferoninduceret humant protein og derpå med et polyklonalt serum mod proteinet, f.eks. fåreserum, og, til sidst, fremkaldes de bundne antistoffer i det polyklonale serum ved hjælp af enzymmærkede antistoffer, som genkender 15 og binder dem, og mængden af protein bundet bestemmes ved en enzymsubstratreaktion. Et sådant enzymmærket antistof er f.eks. et phosphatase-mærket gede-anti-fåre-immunoglo-bulin.

20 Ved en anden ELISA inkuberes et bærestof overtrukket med et monoklonalt antistof ifølge opfindlesen med en testopløsning og med en opløsning af et monoklonalt antistof, som er konjugeret med et enzym, hvor det opløste monoklonale antistof genkender en anden epitop i det interferoninducerede humane 25 protein, end det er tilfældet med det bærebundne monoklonale antistof. Ved hjælp af enzymsubstratreaktion, som f.eks. resulterer i en farveændring, og som kan iagttages med øjet eller med optisk måleudstyr, bestemmes mængden af bundet enzym, som er proportional med mængden af proteinet i test-30 opløsningen.

Specielt foretrækkes en enzymimmunanalyse, som kaldes immunprikanalyse, ved hvilken test- eller standardopløsninger, som indeholder det Interferoninducerede humane 35 protein, afsættes som pletter på et mikroporøst bærestof i 37 DK 172677 B1

O

med stor indre affinitet til polypeptider, f.eks. på nitrocellulose, hvorpå bæreren, som har en eller flere prikker af prøven, inkuberes i en opløsning af et 5 monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, derpå i en opløsning af et enzymmærket, andet antistof, som genkender og binder monoklonalantistoffet ifølge opfindelsen, og til sidst i en opløsning af et enzymsubstrat, som fører til et påviseligt signal, f.eks. et farvet stof. Sådant enzym-10 mærket andet antistof er f.eks. kanin-antimuse-immu- noglobulin konjugeret med peberrodsperoxidase, der kan fremkaldes med egnede enzymsubstrater, såsom 4-chlor-l-naphthol eller lignende.

15 De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan anvendes som sådanne eller i form af derivater konjugeret med fluorescerende markører i immunfluorescenstests. Sådanne immunfluorescenstests omfatter metoder, hvor der anvendes monoklonale antistofderivater ifølge opfindelsen, f.eks.

20 derivater konjugeret med fluorescein, eller i og for sig kendte antistoffer mærket med en fluorescerende markør, som genkender og binder en epitop i de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen.

25 Der foretrækkes en immunfluoréscenstest, ved hvilken en bærer som beskrevet ovenfor for en RIA overtrækkes under anvendelse af standardmetoder med celler, som skal testes for tilstedeværelse af et protein ifølge opfindelsen, cellerne fikseres og gøres permeable for at muliggøre 30 vekselvirkning af proteinholdige materialer inden i cellen med tilførte opløsninger, hvorpå der inkuberes med en opløsning af et monoklonalt antistofderivat iføle opfindelsen konjugeret med en fluorescerende markør, eller inkuberes med en opløsning af et monoklonalt antistof 35 ifølge opfindelsen efterfulgt af en opløsning af et andet 38 DK 172677 B1 0 antistof, som er mærket med en fluorescerende markør, og som genkender og binder det monoklonale antistof ifølge opfindelsen, f.eks. et fluoresceinmærket kanin-antimuse-immunoglobulin. Tilstedeværelsen af et protein ifølge opfindelsen påvises derpå, og proteinet lokaliseres ved 5 anvendelse af standardfluorescensmikroskopi eller strømningscytometri.

De monoklonale antistoffer Ifølge opfindelsen kan anvendes som sådanne eller i form af radioaktivt mærkede derivater 10 i immunfældningstest. Der foretrækkes en immunfældningstest, ved hvilken celler, som skal testes for deres evne til at producere et protein ifølge opfindelsen, dyrkes i kulturmedier, der indeholder radioaktivt mærkede næringsstoffer, f.eks. næringsstoffer mærket med radioaktivt kul 15 (l^C), tritium (^H), svovl (35$) eller lignende, f.eks.

(35s)_rae-thionin, hvorpå de lyseres til dannelse af en opløsning af radioaktivt mærket proteinholdigt materiale dannet af cellerne. Denne opløsning inkuberes med en opløsning af et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, 20 et vilkårligt kompleks mellem radioaktivt mærket protein dannet i cellen og det monoklonale antistof ifølge opfindelsen fældes eller, fortrinsvis, adsorberes materialet til affinitetskromatografi med høj affinitet for de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen, f.eks.

25 kromatografisk materiale koblet til protein A eller til et antistof, som genkender og binder de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen, f.eks. til kanin-antimuse-immun-globulin, og protein/antistof-komplekset isoleres fra bundfaldet eller affinitetskromatografimaterialet.

30

Forekomsten af det radioaktivt mærkede protein bekræftes derefter ved sædvanlige analytiske metoder, f.eks. SDS-polyacrylamldgel-elektroforese med fluorografi under betingelser, hvorved protein/antistofkomplekset dissocieres.

35 39 DK 172677 B1 0 Anvendelsen Ifølge opfindelsen af monoklonale antistoffer og derivater deraf som beskrevet ovenfor til den kvalitative og kvantitative bestemmelse af de humane interferoninducerede proteiner Indbefatter også andre i og for sig kendte lmmunanalyser, f.eks. latexagglutination med anti-5 stofovertrukne eller antigenovertrukne latexpartikler eller hemagglutination med antistofovertrukne eller antigenovertrukne røde blodlegemer eller lignende.

Opfindelsen angår tillige analysesæt til den kvalitative og 10 kvantitative bestemmelse af humane interferoninducerede proteiner med en tilsyneladende molekylvægt på 78 kDa indeholdende monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen og/eller derivater deraf og, eventuelt, andre monoklonale eller polyklonale antistoffer og/eller hjælpestoffer.

15

Analysesæt ifølge opfindelsen til radioimmunanalyse indeholder f.eks. en egnet bærer, som ikke er overtrukket eller er overtrukket med et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, fortrinsvis frysetørrede eller koncentrerede 20 opløsninger af et monoklonalt eller polyklonalt antistof til et protein ifølge opfindelsen og/eller et radioaktivt mærket derivat deraf, standardopløsninger for dette protein, pufferopløsninger og, eventuelt, polypeptider og detergenter til at forhindre uspecifik adsorption og 25 aggregatdannelse, pipetter, reaktionsbeholdere, kalibreringskurver, instruktionshåndbøger og lignende.

Analysesæt ifølge opfindelsen til en enzymimmunanalyse indeholder f.eks. en egnet bærer, f.eks. mikrotiterplader 30 eller nitrocelluloseark, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et monoklonalt antistof mod et protein ifølge opfindelsen og et enzymmærket monoklonalt eller polyklonalt antistof mod dette protein eller et første antistof, som genkender proteinet, enzym-35 substrater på fast eller opløst form, standardopløsninger 0 40 DK 172677 B1 af et protein Ifølge opfindelsen, pufferopløsninger og eventuelt polypeptider og detergenter, pipetter, reaktionsbeholdere, kalibreringskurver, tabeller med 5 farveskalaer, instruktionshåndbøger og lignende.

Analysesæt ifølge opfindelsen til en immunfluorescenstest indeholder f.eks. en egnet bærer, f.eks. plastdækglas eller glasplader, eventuelt frysetørrede eller koncen-10 trerede opløsninger af et monoklonalt antistof mod etprotein ifølge opfindelsen og af et fluoresceinmærket polyklonalt antistof, som genkender det monoklonale'-antistof, pufferopløsninger og, eventuelt, standardopløsninger indeholdende et protein ifølge 15 opfindelsen, polypeptider og detergenter, pipetter, reaktionsbeholdere, instruktionshåndbøger og lignende.

Analysesæt ifølge opfindelsen til en immunfældningstest indeholder f.eks. en egnet bærer, f.eks. plast- eller 20 glasplader, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et monoklonalt antistof mod et protein ifølge opfindelsen, opløsninger af radioaktivt mærkede | næringsstoffer, f.eks. 35s-methionin, vævskulturopløs- ! ninger, pufferopløsninger, eventuelt frysetørrede eller 25 koncentrerede opløsninger af et interferon a eller β og eventuelt standardopløsninger, som indeholder et protein ifølge opfindelsen, affinitetskromatografimateriale, som binder det monoklonale antistof i et antigen/antistofkompleks, detergenter og polypeptider, pipetter, reak-30 tionsbeholdere, instruktionshåndbøger og lignende.

De monoklonale antistoffer og antistofderivaterne ifølge opfindelsen anvendes til den kvalitative og kvantitative bestemmelse af det humane 78 kDa-protein induceret 35 : Γ3 il vt-m 41 DK 172677 B1 af interferon a eller 0, fortrinsvis i enzymimmunanalyser, immunfluorescenstests eller immunfældningstests. Den pålidelige bestemmelse af en mængde af humant 78 kDa-5 protein i biologiske væsker, vævsafsnit og celler tillader en simpel overvågning af en terapi med det humane 78 kDa-protein eller af en terapi med interferon a eller β. Endvidere kan de monoklonale antistoffer og antistof-derivater anvendes ved isoleringen og rensningen af 10 humant 78 kDa-protein fra naturlige kilder eller fra rekomblnantsværtceller ved immunaffinitetskromatografi.

opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler, hvori der anvendes følgende forkortelser: ATP adenosin-triphosphat 15 BSA okseserumalbumin

cDNA komplementært DNA

cpm tællinger pr. min. (radioaktivt henfald) dA 2'-deoxyadenosin dATP 2'-deoxyadenosin-triphosphat 20 dC 2'-deoxycytidin dCTP 2f-deoxycytidin-triphosphat dG 2'-deoxyguanosin dGTP 2'-deoxyguanosin-triphosphat DNA deoxyribonucleinsyre

25 dNTP blanding af dATP, dCTP, dSTP og dTTP

ds DNA dobbeltstrenget DNA

dT (2 *-deoxy-)thymidin dTTP thymidin-triphosphat EDTA ethylendiarointetraeddikesyre 30 FCS føtalt kalveserum HAT hypoxanthin/aminopterin/thymidin IFN interferon kDa kiloDalton (molekylvægt)

mRNA messenger RNA

35 PBS phosphatpufret natriumchloridopløsning RNA ribonucleinsyre SDS natriumdodecylsulfat 42 DK 172677 B1 TBS Trispufret natriumchloridopløsning

Tris tris(hydroxymethyl)aminornethan

tRNA transfer RNA

5 Der anvendes følgende pufferopløsninger og puffermedier:

Denhardtopløsning 0,1% polyvinylpyrrolidon (PVP-360,

Sigma), 0,1% Flcoll 400 (Pharmacia), 0,1% BSA Hypotonisk puffer 5 mM Tris.HCl, pH 7,4, 1,5 mM KC1, 10 2,5 mM MgCl2 LB-medium 1% "Bacto"® trypton (Difco), 0,5% "Bacto"® gærekstrakt (Difco),

170 mM NaCl, indstillet på pH 7,5 med NaOH

15 Ligeringspuffer 50 mM Tris.HCl, pH 8, 7 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol

Mungbønne- 30 mM NaOAc, pH 5, 50 mM NaCl, 1 mM

nucleasepuffer ZnCl2» 5% glycerol PBS 136 mM NaCl, 2 mM KC1, 8 mM Na2HP04, 20 1,4 mM KH2P04 SSC-puffer 15 mM natriumcitrat, 150 mM NaCl,

indstillet på pH 7,0 med NaOH

TBS 10 mM Tris.HCl, pH 7,6, 0,15 M NaCl TE-puffer 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA.

25 Eksempel 1

Tilførsel af Interferon til Namalwa-celler 1.1 Cellelinie: Namalwa-celler ATCC CRL 1432 dyrkes i et medium bestående af RPMI 1640-medium tilsat 2 g/i NaHC03, I 10^ enheder/l penicillin, 100 mg/1 streptomycin og 10% 30 inaktiveret FCS (inaktivering: 30 minutter ved 56*C) i i suspensionskultur i 1-liter Spinner-kolber (Bellco).

Cellerne podes med en koncentration på 5 x 105 celler pr. ml og underdyrkes, når koncentrationen når 20 x lo5 celler

· -i 3 I

13 43 DK 172677 B1 pr. ml. (ca. tre gange om ugen).

1.2 Inkuberinq med Interferon az 2 1 medium podes med Namalwa-celler ved en koncentration på 5 x 105 celler pr.

5 ml. Cellerne dyrkes i en 3-liter Spinner-kolbe i tre dage ved 37*C. Ved afslutningen af den eksponentielle vaskst har cellerne nået en koncentration på 2-3 x 106 celler pr. ml.

Cellerne centrifugeres ved 800 G i 30 minutter, hvorpå de resuspenderes i 2 1 kulturmedium, og der inkuberes i 6 10 timer ved 37*C. Interferon 5 ^ (α/B-type fremstillet som beskrevet i beskrivelsen til EP-A 76.489) tilsættes til en slutkoncentration på 5000 internationale enheder pr. ml,'* og kulturerne inkuberes yderligere ved 37*C i 20 timer.

1.3 Høstning af celler: Cellerne centrifugeres i 30 15 minutter ved 1000 G. Den fremkomne cellepellet vaskes med PBS. Cellerne centrifugeres i 10 minutter ved 800 G, og den fremkomne pellet suspenderes i hypertonisk puffer.

Cellerne centrifugeres i 10 minutter ved 800 G, og den opnåede pellet fryses hurtigt på fast carbondioxid og 20 holdes ved -20°C.

Eksempel 2

Isolering og rensning af 78 kDa-proteinet 2.1 Proteinekstraktion: Optøede celler fra eksempel 1 lyseres ved 20*C med 200 ml puffer 50 mM Tris.HCl, pH 7,4, 25 og 4 M NaCl. Lysatet klares ved ultracentrifugering ved 80.000 G i 1 time. Det IFN-inducerede protein findes i supernatanten. Til supernatanten sættes langsomt ammoniumsulfat til en slutkoncentration på 30%. Proteinerne fældes i 1 time ved 20°C. Bundfaldet indeholdende det 30 IFN-inducerede protein centrifugeres i 15 minutter ved 3000 G, hvorpå det suspenderes i 3 ml puffer indeholdende 50 mM Tris.HCl, pH 8, 150 mM mercaptoethanol, 6 M urinstof og 2% NP-40. Suspensionen dialyseres udtømmende mod den 44 DK 172677 B1 sanune puffer. Størsteparten af det i FN-inducerede protein forbliver uopløseligt.

2.2 Præparativ gelelektroforese; De uopløselige prote- 5 iner centrifugeres og opløses i sanune puffer, Jf. U.K.

Laemmli og M. Favre, J.Mol.Biol. 80, 575 (1973).

Pladegelerne (tykkelse 1,5 mm og længde 110 mm) fremstilles som beskrevet af Laemmli og Favre. Separationsgelen indeholder 12% acrylamid og 0,32% bis-acrylamid. Ved 10 elektroforesens afslutning gøres proteinerne synlige ved neddypning af gelen i iskoldt 0,25 mM KC1. Det stykke af gelen, som indeholder proteiner med en molekylvægt mellem”

70 kDa og 85 kDa skæres ud. Gelen vaskes grundigt med vand, ækvilibreres med 50 mM N-ethylmorpholiniumacetat, pH 15 8,5, og 0,1% SDS. Til slut skæres gelen i skiver i 2 M

urinstof, 50 mM N-ethylmorpholiniumacetat, pH 8,5, 2% SDS og 50 mM dithiothreitol. Blandingen inkuberes i 1 time ved 37*C.

2.3 Elektrodialyse af proteiner fra gelerne: Et ISCO- 20 prøvekoncentrerings apparat (model 1750) anvendes til at eluere proteinerne fra gelstykkerne som beskrevet af A.J.

Brown og J.C. Bennett, Methods in Enzymology 91^, 450 (1983). Der anvendes N-ethylmorpholiniumacetat, pH 8,5, indeholdende 0,01% SDS og 1 mM dithiothreitol som puffer i 25 de ydre (0,1 M) og indre (0,05 M) kamre i koncentreringstanken. De eluerede proteiner fældes med 5 rumfang acetone.

2.4 Afsluttende rensning ved polyacrylamidgelelektrofo-rese i to dimensioner: 30 Det 2-dimensionale system, som kombinerer non-ækvilibrium pH-gradientelektfoforese (NEPHGE) med SDS-polyacrylamid-gelelektroforese anvendes som beskrevet af P.Z. 0'Farrell et al.. Cell 12, 1133 (1977). Proteinerne i acetonefældningen (eksempel 2.3) gøres opløslige i "lysispuffer A", 35 jf. P.H. O'Farrell, J. Biol. Chem. 250, 4007 (1975), og 45 DK 172677 B1 sættes til den sure ende af non-ækvilibrium pH-gradient-elektroforesegelen, som indeholder 2% ampholyter, pH 3-10. Elektroforeseprocessen gennemføres i 5 timer ved 500 V.

5 Separationsgelen til pladegelelektroforese i den anden dimension indeholder 12% acrylamid og 0,32% bis-acryl-amid. Proteiner gøres synlige ved neddypning af gelen i iskoldt 0,25 M KC1. Det gelstykke, som indeholder IFN-induceret protein, en enkelt plet fri for andre prote-10 iner, udskæres og oparbejdes til elektrodialyse som beskrevet ovenfor i eksempel 2.3. Det rensede protein fældes med 5 rumfang acetone.

Eksempel 3

Karakterisering af det rensede 78 kDa-protein 15 3.1 SDS-Polyacrylamidgelelektroforese; Det rensede protein analyseres ved endimensional gelelektroforese på 12% polyacrylamidgeler på sædvanlig måde. Båndene farves med Coomassie-blåt G250. Der gennemføres parallelforsøg med følgende molekylvægtmarkører (fra Bio-Rad): lysozym 20 (14 kDA), sojabønnetrypsininhibitor (21,5 kDa), carboanhydrase (31 kDa), ovalbumin (45 kDa), bovint serumalbumin (66,2 kDa) og phosphorylase B (92,5 kDa). Det rensede IFN-inducerede protein er homogent ved denne type analyse og migrerer som et protein med en omtrentlig 25 molekylvægt på 78 kDa. Det isoelektriske punkt for det IFN-inducerede protein er 6,3 bestemt i systemet beskrevet af P.H. O'Farre1, J. Biol. Chem. 250, 4007 (1975).

3.2 N-Terminal aminosyresekvens: 32 af proteinet un derkastes en aminosyresekvensanalyse i et Beckman 8906-30 sekvenseringsapparat under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af J.Y. Chang et al., Blo-chem.J. 211, 173 (1983).

Der findes følgende N-terminale sekvens: Val-Val-X3-Glu-Val-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala-Pro-Lys-Ala.

46 DK 172677 B1

Den tredje aminosyre kunne ikke identificeres.

3.3 Total aminosyresammensætning: Den totale aminosyre- sammensætning bestemmes under anvendelse af fremgangsmåden 5 ifølge J.Y.Chang, R. Knecht og D.G. Braun, Methods in Enzymology, bd. j31, 41-48 (1983). Kort beskrevet hydrolyseres proteinet med 6 M HCl, derivatiseres med 4'-dimethylamino-azobenzen-4-sulfonylchlorid i natriumhydro-gencarbonatpuffer og injiceres på en "Zorbax-ODS"® HPLC-10 søjle. Mængden af hver aminosyre bestemmes ved sammenligning med en standardprøve. Resultaterne er samlet i tabel 1.

Eksempel 4

Isolering af mRNA fra celler Induceret med interferon 15 4.1 Induktion af humane embryone forhudsceller med interferon a: Humane embryone forhudsdiploidceiler (Flow No. 7000) dyrkes i Earls minimum essentiel medium tilsat 2 g/1 NaHC03, 10^ enheder/1 penicillin, 100 mg/1 streptomycin og 10% inaktiveret FCS (inaktivering: 30 20 minutter ved 56eC) i plastskåle med en diameter på 14 cm.

Sammenflydende cellemonolag underdyrkes i en trypsin/EDTA-opløsning (Gibco) ved et delingsforhold (split ratio) på 1:3. Sammenflydende cellemonolag inkuberes i frisk medium indeholdende rekombinant interferon 5* (o/B-type, 25 fremstillet i overensstemmelse med beskrivelsen til EP-A 76.489) ved en slutkoncentration på 1000 Internationale enheder pr. ml i 4,5 timer ved 37*C.

4.2 Rensning af cytoplasmisk RNA: Cellemonolaget fra ek sempel 4.1 vaskes med PBS ved 4eC og inkuberes I 30 hypotonisk puffer i 2 minutter ved 4°C. Den cytoplasmiske ekstrakt opnås ved lysering af celler med den hypotoniske puffer indeholdende 1% deoxycholat og 1% NP-40 i 5 minutter vd 4*C. Ekstrakten centrifugeres ved 25000 G I 5 minutter. Til supernatanten på 45 ml sættes 16 mg ii-w-m t » §:| 47 DK 172677 B1 proteinase K, 720 mg NaCl, 1,8 ml 1 M Tris.HCl, pH 7,4, og 6,8 ml 10%'s SDS. Blandingen holdes ved 20aC i 4 timer.

RNA'et ekstraheres tre gange med phenol mættet med en 5 opløsning af 0,1 M Tris.HCl, pH 9, og 0,1% oxyquinolin.

Til den vandige fase sættes NaCl (slutkoncentration 0,1 M), og RNA’et fældes med 2 rumfang ethanol ved -20*C.

4.3 Yderligere rensning af total RNA: 2 mg RNA fra ek

sempel 4.2 i 50% formamid anbringes i et lag på en lineær 10 5-20% saccharosegradient i 5 mM EDTA, 0,01 M Tris.HCl, pH

7,5, 0,2% SDS, 0,05 M NaCl og 50% formamid. Gradienterne centrifugeres ved 20*C i 16 timer ved 40000 o/m i eh‘

Beckman SW41 Ti-rotor. Der udtages 1 ml fraktioner, som indstilles på 0,1 M NaCl, og RNA'et fældes med 2 rumfang 15 ethanol. En RNA-alikvot af hver fraktion translateres 1 et reticulocytlysatcellefrit system (Amersham International No. N90) i overensstemmelse med fabrikantens forskrifter.

Proteiner fremstillet in vitro og mærket med 35s-methionin adskilles ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese i to 20 dimensioner, og påvises ved fluorografi. mRNA, som styrer syntesen af et IFN-induceret protein med en tilsyneladende molekylvægt på 78 kDa, findes reproducerbart i fraktionerne 8 og 9, ved sedimentationsværdier mellem 18S og 28S.

Poly(A) mRNA fra fraktionerne 8 og 9 renses ved 25 kromatografi på oligo(dT)-cellulose.

Eksempel 5

Fremstilling og screening af et cDNA-blbliotek

Ud fra renset mRNA fra eksempel 4.3 fremstilles et cDNA-bibliotek under anvendelse af fremgangsmåden ifølge U.

30 Gubier og B.J. Hoffman, Gene 25, 263-269 (1983) med visse modifikationer.

Til syntesen af den første streng cDNA inkuberes det rensede poly(A) mRNA fra fraktioner 8 og 9 (eksempel 4.3,

150 jtg/ml) i et rumfang på 20-40 μΐ indeholdende 50 mM

48 DK 172677 B1

Tris.HCl, pH 8,3, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 1,25 mM af henholdsvis dGTP, dATP og dTTP, 0,5 mM dCTP, 20 μοί <χ32ρ_^τρ (ca, 3000 Cl/mmol) og 100 μg/ml oligo(dTi2-ie)

5 med 3000 enheder pr. ml "Super" revers transskrlptase fra abemyeloblastosisvlrus (Anglian Blotechnology-Stehelln) 1 30 minutter ved 43*C. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA, produkterne ekstraheres med phenol og fældes med ethanol. Til syntese af den anden streng inkuberes 500 ng 10 af det enkeltstrengede cDNA i 100 μΐ 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2S04, 100 mM KC1, 0,15 mM

Ø-nicotinamid-adenin-dinucleotid, 50 μg/ml BSA og 40 mM af hver dNTP med 8,5 enheder/ml Escherichia coll RNase H, 230’ enheder/ml DNA polymerase I og 10 enheder/ml T4. DNA 15 ligase natten over ved 14*C. ds cDNA'et isoleres som ovenfor.

ds cDNA'et (100 ng i 40 μΐ) forsynes med haler af dTCP (0,9 mM) i 200 mM kaliumcacodylat, pH 6,9, 1 mM CoCl2 og 5 mg/ml BSA med 30 enheder terminal transferase i 60 minut-20 ter ved 37*C, hvorpå der foretages varmeinaktivering.

Dette cDNA forsynet med dC-haler annelleres til dG-halet,

PstI skåret pBR322 (BRL) i 50 μΐ TE-puffer/O,15 M NaCl ved totale DNA koncentrationer på 0,5 ^g/ml DNA i 90 minutter ved 58’C. CaCl^behandlet Escherichia coli MC1061 trans-25 formeres med denne vektor. Cellerne udplades og håndteres ved høj tæthed på nitrocellulosefiltre anbragt ovenpå agarplader som beskrevet af D. Hanahan og M. Meselson,

Methods Enzymol. 100, 333-342 (1983).

En oligodeoxynucleotidblanding fremstilles på basis af den 30 kendte partielle aminosyresekvens fra eksempel 3.2, nemlig I sekvensen Glu-Val-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala. Den 20-mere oligo deoxynucleotidblanding med sammensætningen 5 ’ -GCYTTIGCQATRTCIACYTC-3', hvori A, T, G, C og I betyder henholdsvis adenosin, thymidin, guanosin, cytosin og 35 inosin, Y og R betyder henholdsvis pyrimidiner (T, C) og puriner (A, G), og Q betyder A, G og T, fremstilles under ti 11 49 DK 172677 B1 anvendelse af fremgangsmåden iføgle Y. ike et al.. Nucleic Acid Research 11., 477 (1983). 5' enderne af oligodeoxynu-cleotiderne gøres radioaktive under anvendelse af -y-32p_ 5 dATP (5000 Ci/mmol) og polynucleotid-kinase (Pharmacia) til 2-5 x 108 cpm/ng under anvendelse af standardmetoder, jf. T. Maniat is, E.F. Fritsch og J. Sambrook, "Molecular cloning, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

10 Dobbeltkopier af de bakterielle kloner fra cDNA-bibliote-ket hybridiseres med den ovennævnte nucleotidblånding under anvendelse af den ovenfor omtalte fremgangsmåde ifølge Hanahan og Meselson i et medium indeholdende 6 x SSC, 5 x Denhardt-opløsning, 250 μg/ml tRNA, 50 enheder/ml 15 heparin og 0,1% SDS ved 47*C. Efter hybridisering vaskes filtrene fire gange i 6 x SSC og 0,5% SDS i 20 minutter ved 20'C og i 5 minutter ved 47*C.

Klon Bl,l indeholdende et DNA-plasmid med en indsat del på ca. 850 basepar viser sig at hybridisere med oligonucleo-20 tidproben og dyrkes i LB-medium med 15 μg/ml tetracyclin ved 37®C.

Eksempel 6

Isolering af plasmid DNA

800 ml LB-medium tilsat 15 ftg/ml tetracyclin inokuleres 25 med 1 ml af klon Bl,l (eksempel 5), og der dyrkes ved 37eC til en optisk tæthed OD 550 på 0,7 (ca. 5 timer). Der tilsættes 200 ^g/ml chloramphenicol opløst i ethanol, og dyrkningen fortsættes ved 37*C natten over. Blandingen centrifugeres i 20 minutter ved 0eC med 4000 o/m, 30 bakteriepelleten resuspenderes i 36 ml TE-puffer og overføres til SS34-rør. Suspensionen centrifugeres i 5 minutter ved 0eC med 5000 o/m. Pelleten resuspenderes i

7,5 ml 25%'s saccharose/50 mM Tris.HCl, pH 7,5, behandles med 0,75 ml frisk fremstillet lysozym (10 mg/ml i 250 mM

50 DK 172677 B1

Tris.HCl, pH 7,5) og Inkuberes i 5 minutter på is. Der tilsættes 3,0 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0, og, efter 5 minutter, 12 ml Triton-Sol (0,1% "Triton X-100"® (Sigma), 60 5 mM EDTA, 50 mM Tris.HCl, pH 8,0), og inkuberingen fortsættes i 1 time ved 0*C. Blandingen centrifugeres i en SS34-centrl- fuge ved 18000 o/m i 50 minutter. Supema-tanten hældes omhyggeligt i et måleglas, og rumfanget indstilles på 30 ml med TE-puffer. Der tilsættes 30 g CsCl 10 og 2,58 ml ethi- diumbromid (10 mg/ml), og blandingen centrifugeres 1 16 timer ved 20*C med 48000 o/m i en VTi 50 centrifuge. Det nedre bånd bestående af såkaldt "supercoiled" DNA samles, ekstraheres 5 gange med isopropanol mættet med vandigt 15 CsCl og fortyndes med TE-puffer til fjernelse af uklarhed.

DNA1et fældes med ethanol ved -20“C, hvorpå der renses endnu en gang i en CsCl-gradient som ovenfor.

Eksempel 7

Test til påvisning af, at den selekterede klon koder for 20 det interferoninducerede 78 kDa protein 7.1 Northern blot: Total RNA fra IFN-inducerede humane embryone forhudsceller isoleres ifølge eksempel 4.1 og 4.2 og total RNA fra tilsvarende celler, som ikke er induceret med interferon, denatureres med 1 M glyoxal i 25 50% (r/r) dimethylsulfoxid og 10 mM natriumphosphat- puffer, pH 7,0, elektroforesebehandles på 1,1% agarosegel og overføres til nitrocellulose under anvendelse af 3 M NaCl/0,3 M trinatriumcitrat i alt væsentligt som beskrevet af P.S. Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 30 5201-5205 (1980). Nitrocellulosefiltrene opvarmes i 2 timer ved 80‘C under vakuum, prehybridiseres i en puffer I indeholdende 5 x SSC/50% formamid i 3 timer ved 42'C, j hybridiseres derpå i 20 timer ved 42*C i den samme puffer indeholdende dextransulfat 500 og 0,5-1,0 x 106 cpm/ml DNA 35 fra klon Bl,l (eksempel 6) mærket med 'y32p_(3ATP Qg 51 DK 172677 B1 polynucleotidkinase som beskrevet ovenfor. Filtrene vaskes 4 gange i 5 minutter ved 20‘C i 2 x SSC/0,1% SDS og 2 gange i 20 minutter ved 50*C i 0,1 x SSC/0,1% SDS. Kodak 5 XAR-film med en Cawo-forstærkerskærm eksponeres med de tørre filtre i 6 dage ved -70*C.

DNA’et fra klon Bl,l hybridiserer til en RNA på ca. 23S svarende i størrelse til det forventede mRNA, som koder for det interferoninducerede 78 kDa protein. Dette mRNA 10 påvises kun i interferoninducerede celler.

7.2 Hybridselekteret translation: 10 μg plasmid DNA fra klon Bl,1 (eksempel 6) i 20 μΐ H2O opvarmes til 100*C i 10 minutter, afkøles hurtigt i is, behandles med 20 μΐ 1 M NaOH og inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter.

15 DNA-prøven neutraliseres med 20 μΐ af en opløsning af 1 M NaCl, 0,3 M trinatriumcitrat, 0,5 M Tris.HCl og 1 M HC1, hvorpå den plettes på et nitrocellulosefilter (3x6 mm,

Millipore HAWP). Filtret tørres ved 20eC og opvarmes i 2 timer ved 80‘C i en vakuumovn. Filtret anbringes i et 20 siliconebehandlet 1,5 ml Eppendorf-rør, behandles med 1 ml vand, opvarmes i et kogende vandbad i 1 minut og afkøles i is. Vandet fjernes, og der tilsættes 50 μΐ af en opløsning indeholdende 100 #ig total mRNA fra IFN-inducerede celler (eksempel 4.2) i 0,9 M NaCl, 0,2% SDS, 1 mM EDTA og 20 mM 25 PIPES (1,4-piperazin-diethansulfonsyre, pH 6,4). Filtret inkuberes i 6 timer ved 37°C med konstant omrøring, hvorpå det vaskes fem gange i 1 ml vaskepuffer bestående af 50% formamid, 20 mM NaCl, 8 mM trinatriumcitrat, 1 mM EDTA og 0,5% SDS i 15 minutter ved 37*C. Det hybridiserede mRNA 30 elueres med 100 μΐ 1 mM EDTA indeholdende 10 μg tRNA i et kogende vandbad i 1 minut. Opløsningen fryses ved neddypning i fast carbondioxid, optøs på is, og filtret fjernes. Der tilsættes 7 μΐ 3 M natriumacetat, og blandingen ekstraheres med phenol/chloroform/isoamyl-35 alkohol (1:1:0,04 r/r). Til den vandige fase sættes 250 μΐ ethanol til fældning af mRNA.

52 DK 172677 B1

Det eluerede mRNA translateres i reticulocytlysat (Amersham international No. N90) ifølge producentens forskrifter. En alikvot af proteinerne syntetiseret in vitro 5 adskilles ved polyacrylamidgelelektroforese, og radioaktive proteiner (fra 35g-methionin i translationssystemet) påvises ved fluorografi. En anden alikvot af proteiner immunfældes med monoklonale antistoffer, som er specifikke for 78 kDa proteinet ifølge eksempel 13. Immunfældningen 10 adskilles også ved polyacrylamidgelelektroforese og påvises ved fluorografi.

mRNA'et selekteret ved hybridisering med DNA fra klon Bl,l styrer syntesen af et protein med samme tilsyneladende molekylvægt og samme antigene egenskaber som 78 kDa-pro-15 teinet isoleret fra IFN-inducerede Namalwa-celler (eksempel 2).

Eksempel 8

Subklonlng af plasmid DNA i en M13-vektor

Plasmid DNA’et fra klon Bl,l i eksempel 6 spaltes med 20 restriktionsenzymet Pst I (Boehringer-Mannheim) I overens- ) stemmelse med producentens forskrifter. Den indsatte del eller Insertet Isoleres og fældes med ethanol.

!

Bluescript Ml3-vektor (Stratagene) spaltes med Pstl. 20 μg vektor DNA dephosphoryleres i 50 μΐ opløsning 25 Indeholdende 8 enheder alkalisk phosphatase fra kalvetarm, 100 mM glycin, pH 10,5, 1 mM MgCl2 og 1 mM ZnCl2· Vektor DNA'et isoleres og renses ved ekstraktion med phenol/chloroform.

0,5 μg cDNA fra klon Bl,l og 1,5 μg Ml3-vektor DNA ligeres 30 ved inkubering i 5 timer ved 23*C I 20 ml ligeringspuffer indeholdende 5 enheder T4 DNA-ligase og 0,5 mM ATP. CaCl2” ‘ behandlede Escherichia coli recA“ JM109 transformeres med 11 53 DK 172677 B1 denne DNA-opløsning. Cellerne udplades på LB-plader

Indeholdende 100 ftg/ml ampicillin, 40 jig/ml X-Gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-ø-D-galactopyranosid) og 5 mM 5 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid). Kolonierne dyrkes natten over ved 37eC, og transformanter selekteres ved hjælp af hvid farve fra blå celleplaque indeholdende uændret Ml3-vektor.

Udvalgte individuelle kolonier dyrkes i 1 ml LB-medium 10 indeholdende 50 jig/ml ampicillin natten over ved 37*C.

Efter centrifugering hældes supernatanten bort, og pel leten suspenderes i 100 μΐ 50 mM glucose, 25 mM Tris.HCl, pH 8,0, og 10 mM EDTA. Efter 5 minutter ved 22*C tilsættes 200 μΐ 0,2 N NaOH/1% SDS, blandingen inkuberes 15 ved 0eC i 5 minutter, behandles med 150 μΐ forkølet 3 M natriumacetat, pH 4,8, og holdes ved O'C i yderligere 5 minutter. Blandingen centrifugeres i et Eppendorf-rør i 1 minut. Til supernatanten sættes 1 ml ethanol, og efter 2 minutter ved 20*C centrifugeres blandingen atter i 1 20 minut. Pelleten vaskes med 80% ethanol og resuspenderes i 100 μΐ 300 mM natriumacetat. Der tilsættes 300 μΐ ethanol, og blandingen holdes ved -80*C i 30 minutter, hvorpå den centrifugeres. Pelleten vaskes med 80% ethanol, tørres og suspenderes i 15 μΐ TE-puffer.

25 2 |il af denne DNA-suspension spaltes med PstX. En anden prøve på 2 μΐ underkastes dobbeltspaltning med SacI og Hindi. De opnåede restriktionsfragmenter analyseres ved elektroforese på 7% polyacrylamidgeler til bestemmelse af orienteringen af cDNA-insertet i vektoren.

30 Eksempel 9

Subkloning af plasmid DNA efter ensrettede sletninger

Plasmider fra kloner fra eksempel 8 indeholdende cDNA-insertet i begge retninger isoleres under anvendelse af 54 DK 172677 B1 fremgangsmåden beskrevet i eksempel 6, idet dog klonerne dyrkes 1 LB-medium indeholdende 100 jig/ml ampicillin i stedet for tetracyclin og uden tilsætning af chloramphe-5 nicol.

Plasmid DNA'et spaltes fuldstændigt med Kpnl og Hindlll, hvorpå der ekstraheres med phenol. 18 μg af dette dobbelt-spaltede DNA i 300 μΐ 50 mM Tris.HCl, pH 8, 5 mM MgCl2, 10 /ig/ml tRNA, 20 mM 2-mercaptoethanol indeholdende 900 10 enheder exonuclease Exo III inkuberes ved 23*C. 50 μΐ alikvoter udtages fra reaktionsblandingen hvert minut i op til 6 minutter, sættes til et rør med 80 μΐ 5 x koncentreret mungbønnenucleasepuffer og 270 μΐ vand og fryses i fast carbondioxid. Alikvoterne opvarmes til 68eC 15 i 15 minutter, hvorpå de behandles med 9 enheder mungbønnenuclease i mungbønnenucleasepuffer i 30 minutter ved 30eC. Reaktionen afbrydes med 400 μΐ pufferækvilibre-ret phenol/chloroform pr. alikvot, og DNA’erne Isoleres ved fældning med ethanol.

20 Disse DNA’er genligeres, og de opnåede hybridvektorer anvendes til at transformere Escherichia coli recA_ JM109 som beskrevet i eksempel 8. Transformanter dyrkes i LB-medium indeholdende 100 yg/ml ampicillin natten over ved 37*C. Plasmid DNA isoleres og renses i en CsCl-gra-25 dient som beskrevet i eksempel 6.

Eksempel 10 i i j Bestemmelse af DNA-sekvensen

Sekvensen bestemmes på DNA'erne fra eksempel 6 og 9 med den 20-mere oligonucleotidblanding fra eksempel 5 som en 30 primer under anvendelse af standardmetoder (dideoxynucleo-tidmetoden). Partialsekvensen med formlen II bekræftes ved upstream og downstream sekventering under anvendelse af en anden primer med formlen 5'-CAGCCACCATTCCAAGG-3' og en 55 DK 172677 B1 tredje primer med formlen 5'-CGCACCTTCTCCTCATACTGG-3' fremstillet ifølge Y. Ike et al., Nucleic Acid Research 11, 477 (1983).

5 Kort sagt lineart seres 5 μg plasmid DNA fra eksempel 6 eller 9 med restriktionsenzymet PstI (Boehringer-Mannheim) i overensstemmelse med producentens forskrifter. DNA'et fældes med 3 rumfang ethanol, hvorefter det opløses i 25 μΐ TE-puffer. 8 μΐ af denne opløsning og 2 μΐ TE-puffer 10 indeholdende 0,5 nmol/ml af primeren blandes, blandingen anbringes i et kogende vandbad i 3 minutter, hvorpå det fryses ved neddypning i fast carbondioxid. Der tilsættes Ϊ μΐ 0,1 M Tris.HCl/50 mM MgCl2, pH 7,4, og blandingen inkuberes i 30 minutter ved 42eC. Denne primer/templat-15 blanding behandles med henholdsvis dNTP mix, of-35s-<jATP,

Klenow-fragment og dideoxynucleotiderne ddATP, ddCTP, ddGTP og ddTTP, under anvendelse af standardmetoder, jf.

J.R. Dillon, A. Nasim og E.R. Nestmann, "Recombinant DNA methodology", Wiley 1985 side 90-94. DNA'et denatureres og 20 sættes straks på en sekventerende 6% polyacrylamid 7 M urinstofgel, jf. J.R. Dillon et al., loc. cit., side 89, og gelen køres med 90 mM Tris-borat/1 mM EDTA, pH 8,3.

ATG'en i stilling 1 i formlen II er højst sandsynligt initieringskodonet for proteinet, da upstreamsekvenser 25 indeholder terminerlngskodoner i positionerne -75 (TGA), -65 (TAA), -57 (TGA) og -41 (TGA).

Eksempel 11

Fremstilling af hybridomaceiler 11.1 Immuniserinqsmetode: 5 /»g portioner af det rensede 30 protein (eksempel 2) opløses i 20 fil 2 M urinstofopløsning Indeholdende 0,1% SDS og 50 mM mercaptoethanol. Et stykke nitrocellulose 5 x 5 mm indeholdende 5 μg protein Implan-teres I bughulen hos en HR-hunmus, som er leveret af Dr.

Biozzi, Institute Curie, Paris, se L. Boumsell og A.

56 DK 172677 B1

Bernard, J. Immunol. Methods 38, 225 (1980). Fire uger senere injiceres intraperitonealt. 5 μg 78 kDa-protein i inkomplet Freunds adjuvans Indeholdende 50 μg adjuvanspep-5 tid (Sigma), og der gives 3 intraperitoneale boosterinunu-niseringer med samme sammensætning to gange pr. uge. Efter fire uger udtages serum, og antistoftiteren til 78 kDa-proteinet bestemmes ved prik-immunanalysen i eksempel 12.

Mus med høj antistoftiter immuniseres yderligere med to 10 injektioner to gange om ugen og en afsluttende boosterim-munisering en uge senere. Efter 3 dage udtages milten til fusionen.

11.2 Cellefusion: Alle fusionsforsøgene gennemføres under anvendelse af fremgangsmåden ifølge G. Kchler og C.

15 Milstein, Nature 256, 495 (1975) samt under anvendelse af den ikke-sekreterende Sp 2/0-Agl4-myelomalinie, jf. M.

Shulman, C.D. Wilde og G. Kchler, Nature 276. 269 (1978).

1θ8 miltceller blandes med 10? myelomaceller i nærværelse af 1 ml 50% polyethylenglycol (PEG 1500, Serva). Efter 20 vaskning resuspenderes cellerne i 48 ml standard

Dulbecco's minimum essential medium (Gibco No. 0422501).

Som feederceller tilsættes 3 x 10^ peritoneale exsudat-celler fra normale mus pr. fusion. Cellerne fordeles i 48 x 1 ml Costar-huller, og 3 gange om ugen tilsættes 25 standard HAT-selektionsmedium i 3 til 6 uger. Når væksten af hybridomacellerne bliver synlige, screenes supernatanterne ved hjælp af prik-immunanalysen ifølge eksempel 12. Hybridomacellerne klones ved begrænsningsfortynding i mikrotiterplader mindst m gang, hvorefter de 30 passeres gennem HR-mus ved intraperitoneal Injektion.

Hybridomaceller høstes fra ascites og klones endnu en gang ved begrænsningsfortynding. De ni hybrldomaer udvalgt til yderligere undersøgelser er særligt stabile og udskiller store mængder Immunoglobulin. De har betegnelsen 35 885 S35.8.1, 885 S35.16.ll, 885 S56.55.7.12.48, 885 S56.55.7.21.25, 885 S56.55.7.27.5, 885 S56-55.7.27.11, 885 S56.55.13, 885 S56.55.17 og 885 S56.67.15.

57 DK 172677 B1

Eksempel 12

Prik-immunanalyse til antistofscreening

Det rensede protein fra eksempel 2 opløses 1 2 M urinstof, 5 0,1% SDS og 50 mM mercaptoethanol. Fortyndingerne af proteinet foretages i TBS indeholdende 10% inaktiveret hesteserum. Proteinet påføres i form af prikker (0,2 μΐ) på nitrocellulose (type HAWG fra Millipore Corp., Bedford,

Mass.). Fortyndingerne af antistoffer fra museserum eller 10 hybridomakulturmedium foretages i TBS indeholdende 10% inaktiveret hesteserum. Prik-immunbindingsanalysen, en' modificeret enzymbundet lmmunsorbentanalyse, gennemføres under anvendelse af et kaninantimuse igG-peroxidasekonjugeret andet antistof og H202/4-chlor-l-naphthol i TBS som 15 beskrevet af M.M Derer et al., J. Allergy Clin. Immunol.

74, 85 (1984).

Eksempel 13

Isolering og rensning af monokionale antistoffer 13.1 In vivo-syntese; Balb/c-mus med en alder på 8-10 20 uger (Tierfarm Sisseln, Schweiz) forbehandles intraperi-tonealt med 0,3 ml pristan (Aldrich). 2-3 uger senere foretages intraperitoneal inokulering med 2-5 x 10^ klonede hybridomaceller og 0,2 ml pristan. Efter 8-10 dage opsamles ascitesvæske, som centrifugeres ved 800 G og 25 opbevares ved -20eC.

Optøet ascitesvæske centrifugeres ved 50000 G i 60 minutter. Et fast lag, som flyder på overfladen, fjernes omhyggeligt, og proteinkoncentrationen indstilles på 10-12 mg/ml. Råt immunoglobulin fældes ved dråbevis tilsætning 30 af 0,9 rumfangsækvivalenter mættet ammoniumsulfatopløsning ved 0°C, hvorpå der opløses i 20 mM Tris.HCl/50 mM NaCl (pH 7,9) og dialyseres mod den samme puffer. Der fås en i t 58 DK 172677 B1 immunoglobulinfraktion ved DEAE-D52-cellulose (Whatman) kromatografi under anvendelse af et puffergradientsystem af 20 mM Tris-HCl/25-400 mM NaCl, pH 7,9. Immunoglobulinet 5 fældes igen med ammoniumsulfat og opløses i PBS til en koncentration på 10 mg/ml.

Ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese påvises en renhedsgrad på mere end 95% for alle de monoklonale antistoffer.

13.2 In vitro-syntese; En forkultur af en cellelinie fra 10 eksempel 11.2 opnås ved dyrkning af hybridomaceller ved fysiologisk temperatur (ca. 37*C) i RPMI 1640-medium Indeholdende 10% FCS til en sluttæthed for cellerne på 5 x 10^ til ΙΟ** celler pr. ml. Hele forkulturen fyldes i Bellco dyrkningsbeholdere og indstilles på et samlet rumfang på 15 1500 ml med frisk RPMI 1640-medium/10% FCS. Kulturen omrøres ved ca. 37'C under 5% CO2 med 30 o/m i 2-3 dage, hvorpå den fortyndes til et samlet rumfang på 3000 ml med RPMI 1640/10% FCS og omrøres i yderligere 7-10 dage. På dette tidspunkt er 95% af cellerne døde. Dyrkningsvæsken 20 centrifugeres ved 1000 G i 20 minutter ved 4*C. Superna-tanten filtreres gennem et filter med en porestørrelse på 0,2 μπι under sterile betingelser. Råt immunoglobulin fældes ved langsom dråbevis tilsætning af 0,9 rumfangsækvivalenter mættet ammoniumsulfatopløsning ved 0°C. Dette 25 bundfald renses som beskrevet i eksempel 13.1 og giver monoklonale antistoffer med en renhed på 95% eller derover.

Eksempel 14

Karakterisering af monoklonale antistoffer 30 14.1 Bestemmelse af klasse og underklasse for monoklo nale antistoffer; Klassen og underklassen af monoklonale antistoffer produceret af klonede hybridomaceller bestemmes ved hjælp af den kendte agargelimmunodiffusionsteknik 59 DK 172677 B1 ifølge Ouchterlony under anvendelse af klassespecifikke og underklassespecifikke kaninantistoffer (Bionetics). Resultaterne bekræftes ved en enzymimmunanalyse (ELISA) på 5 følgende måde: Mlcrotlterplader overtrækkes med 1 μg pr. hul af et kanlnlmmunoglobulinprsparat af et klasse- eller underklasse-specifikt serum (Bionetics) i 50 μΐ PBS. Den fri bindingskapacitet på pladen mættes med en puffer af 1% bovint serumalbumin i PBS indeholdende 0,2% NaNø (v/r), pH 10 7,4. 100 μΐ prober Indeholdende monoklonale antistoffer inkuberes i hullerne ved 37eC i 1 time. Pladerne vaskes med PBS, hvorpå de inkuberes ved 37'C i 1 time med et phosphatasekonjugeret kaninimmunoglobulinpræparat med den samme specificitet som anvendt til overtrækning af plåder-15 ne. Det fikserede enzym fremkaldes ved inkubering (37eC, 30 minutter) med en opløsning af enzymsubstratet p-nitrophenylphosphat (1 mg/ml i diethanolaminpuffer 10% indeholdende 0,5 mM MgCl2 og 0,02% (v/r) NaHø, pH 9,8) og måling af den optiske tæthed ved 405 nm. Dimonoklonale 20 antistoffer 885 S35.8.1, 885 S35.16.ll, 885 S56.55.7.12.48, 885 S56.55.7.21.25, 885 S56.55.7.27.5,885 S56.55.7.27.11, 885 S56.55.13, 885 S56.55.17 og 885 S56.67.15 hører alle til klassen IgGi· 14.2 Selektivitet mod humant 78 kDa-protein: Dipioide 25 muse A2G-embryonceller, rottediploide embryonceller, dipioide embryone hamsterceller, dipioide hestenyreceller og celler fra dermiscellelinien NBL-6, ATCC nr. CCL57, dipioide kalvenyreceller, dipioide katteembryone lungeceller, abeceller af verocellelinlen ATCC nr. CCL81, 30 embryone kaninceller, choroide fåreplexusceller og dipioide svinenyreceller og celler fra nyrecellelinien PK-15, ATCC nr. CCL33, Inkuberes med rekombinantinter-feron α/B-D-hybrid som beskrevet for humane celler i eksempel 1.2 og 4.1, jf. M.A. Horisberger og K. de 35 Staritzky, J. gen. Virol. (1987), bind 68. I cellerne fra alle disse arter påvises mindst ét protein beslægtet med det humane 78 kDa-protein. Disse antigenisk beslægtede 60 DK 172677 B1 proteiner identificeres med et polyklonalt antistofserum udvundet fra mus immuniseret med humant 78 kDa-protein ifølge eksempel 11.1. Imidlertid binder de monoklonale 5 antistoffer 885 S35.8.1, 885 S56.55.13 og 885 S56.67.15 kun til human 78 kDa-protein og ikke til de beslægtede proteiner fra ovennævnte arter ved immunfluorescenstesten ifølge eksempel 17, immunfældningstesten ifølge eksempel 18 eller 1 en Western blot. Til Western blot adskilles 10 proteinerne ved hjælp af SDS-polyacrylamidgelelektroforese og overføres til nitrocellulose, hvorpå de testes som beskrevet for immunoprikanalysen i eksempel 16.

Eksempel 15

Enzymimmunanalyse (ELISA) 15 15.1 Mærkning af monoklonalt antistof 885 S35.8.1 med alkalisk phosphatase: 1,4 mg monoklonalt antistof j 685 S35.8.1 i 1,4 ml PBS kobles i 2 timer med en opløsning indeholdende 5 mg alkalisk phosphatase (Sigma P6774, type VII-T) under anvendelse af standardmetoden 20 ifølge Voller et al., Bull. World Health Organ. 53, 55 r (1976) og under anvendelse af glutaraldehyd (0,2% r/r).

Konjugatet overføres til 5 ml Tris-puffer 0,05 M, pH 8,0, indeholdende 1 mM MgCl2, 1% BSA og 0,02% NaN3· Opløsningen opbevares i mørke ved 4eC.

25 15.2 Analysemetode: Polypropylenmikrotiterplader (Dynatech Labs. Inc.) overtrækkes i 2 timer ved 37eC og " natten over ved 4*C med 150 μΐ af en opløsning af det monoklonale antistof 885 S56.55.13 (10 ^g/ml) i en puffer med pH 8,6 (carbonatpufret 0,9% natriumchloridopløsning 30 indeholdende 0,02% natriumazid). Pladerne vaskes fem gange , = med PBS, og de proteinreaktive steder, som stadig findes, 5 =, mættes ved inkubering i 1 time ved 37°C med 250 /xl puffer med pH 7,4 (0,2% gelatine og 0,2% NaN3 i PBS). Plader overtrukket på denne måde kan opbevares ved 4®C i denne ~ 35 puffer i nogle få dage.

61 DK 172677 B1 50 μΐ af en fortyndingsrække af en testopløsning eller standardopløsning Indeholdende 78 kDa-proteinet, 50 μΐ puffer med pH 7,4 og 50 μΐ af en opløsning af det phos-5 phatasemærkede antistof 885 S35.8.1 (eksempel 15.1) fortyndet 1:100 med puffer med pH 7,4 blandes og inkuberes I hullerne i mikrotiterplademe 1 2 timer ved 37*C og 1 30 minutter ved 4#C. Pladerne vaskes fem gange med PBS, hvorpå de Inkuberes 1 30 minutter ved 37eC med 150 μΐ af 10 en opløsning af p-nitrophenylphosphat (1 mg/ml i 10% diethanolaminpuffer, 0,5 mM MgCl2, pH 9,8). Ved måling af den optiske tæthed ved 405 run bestemmes mængden af frigjort p-nitrophenol, som er proportional med mængden af den bundne enzymphosphatase og dermed proportional med 15 mængden af 78 kDa-proteinet i testopløsningen.

Der opnås lignende resultater, når mikrotiterplademe overtrækkes med det monoklonale antistof 885 S35.8.1 eller 885 S56.67.15 og phosphatasekoblet monoklonalt antistof 885 S56.55.13 anvendes som det andet antistof.

20 15.3 Prøvesat til ELISA: Et prøvesæt til analysen beskrevet 1 eksempel 15.2 indeholder følgende: polypropylenmikrotiterplader, 20 ml monoklonalt antistof 885 S56.55.13 (10 μg/ml) i carbonatpufret natriumchloridopløsning (0,9% NaCl, 25 0,42% NaHC03, 0,0072% Na2C03, 0,02% NaN3) 1 ml alkalisk phosphatasekoblet monoklonalt antistof 885 S35.8.1 (eksempel 15.1, 0,3 mg antistof pr. ml) i Trispuffer (0,05 Μ, 1 mM MgCl2, 1% BSA, 0,02%

NaN3, pH 8,0) 30 2 ml standardopløsning indeholdende 5 μg 78 kDa-protein

300 ml PBS

300 ml puffer med pH 7,4 (0,2% gelatine og 0,2% NaN3 i PBS) 50 ml p-nitrophenyl-phosphat (1 mg/ml) i diethanolamin-35 puffer (10%, 0,5 mM MgCl2, 0,02% NaN3, indstillet på pH 8,9 med HC1) 62 DK 172677 B1 kalibreringskurver farveintensitetskala instruktionshåndbog 5 Eksempel 16

Immunoprikanalyse 16.1 Analysemetode; En fortyndingsrække af opløsningen, som skal testes for tilstedeværelse af 78 kDa-protelnet, og af en standardopløsning, fremstilles i TBS indehol- 10 dende 10% inaktiveret hesteserum. Fortyndingerne anbringes i form af prikker (0,2 μΐ) på nitrocellulose (type HAWG,

Millipore Corp., Bedford, Mass.). Overskydende proteinbindingskapacitet på nitrocellulosen blokeres ved inkubering af nitrocellulosen i 2 timer ved 37*C i TBS 15 Indeholdende 10% hesteserum. Nitrocellulosen skæres i passende strimler, som derpå inkuberes med opløsninger af det monoklonale antistof 885 S56.55.13 eller 885 S35.8.1 (2jtg/ml og 10 μg/ml) i TBS i 2 timer ved stuetemperatur.

Strimlerne vaskes 5 gange i TBS og inkuberes yderligere i 20 2 timer i en 10000-ganges fortynding af et kanin-antimuse

IgG-peroxidasekonjugeret andet antistof, vaskes 5 gange i TBS og fremkaldes derpå i en friskblandet peroxidasesub-stratopløsning bestående af 0,6 rumfang 4-chlor-l-naphthol (3 mg/ml i methanol), 10 rumfang TBS og 0,004 rumfang 30% 25 hydrogenperoxid i 15 minutter ved stuetemperatur. Om ønsket kan pletterne scannes med et reflektantdensitometer ved 600 nm (CAMAG, Muttenz, Schweiz).

16.2 Prøvesæt til immunoprikanalyse: Et prøvesæt til analysen beskrevet i eksempel 16.1 indeholder følgende: 30 Nitrocelluloseplader 20 ml monoklonalt antistof 885 S56.55.13 (10 ^g/ml) i TBS indeholdende 10% hesteserum 1 ml af en 1:100-fortynding af kanin-antimuse IgG-konju-geret til peberrodsperoxidase i TBS indeholdende 63 DK 172677 B1 10% hesteserum

2 ml standardopløsning Indeholdende 5 μg 78 kDa-protein 300 ml TBS

5 300 ml TBS indeholdende 10% hesteserum 10 ml 4-chlor-l-naphthol (3 mg/ml i methanol) 10 ml 30% hydrogenperoxid instruktionshåndbog

Eksempel 17 10 Immunofluorescenstest

Celler, som skal testes for tilstedeværelse af proteinet ifølge opfindelsen, dyrkes på dækglas af plast. Eventuelt fæstnes frisk isolerede celler fra menneskeblod, f.eks. lymfocyter eller monocyter, ved cytospincentrifugering på 15 glasplader, som er forbehandlet med poly-D-lysin.

Cellerne vaskes med PBS, fikseres ved 20eC i 10 minutter med 3% vandig paraformaldehyd, permeabiliseres i 5 minutter med 0,5% "Triton X-100"®, vaskes endnu en gang med PBS og inkuberes med en opløsning af det monoklonale 20 antistof 885 S56.55.13 (10 /xg/ml) i PBS i 60 minutter ved 37*C. Cellerne vaskes med PBS, behandles med en opløsning af fluoresceinkonjugeret kanin-antimuse IgG (DAKO, fortyndet 1:40 i PBS indeholdende 5% hesteserum), vaskes med PBS og anbringes som beskrevet af Johnson et al., J. Immunol.

25 Methods 43, 349 (1981). UV-Fluorescensmikroskopi afslører tilstedeværelsen af proteinet ifølge opfindelsen ved en klar fluorescens i cellernes cytoplasma.

Eksempel 18

Immunofældningstest for celler induceret med interferon 30 Celler dyrket i kultur eller celler, som er frisk isoleret fra menneskeblod, fastgøres på plast- eller glasplader som beskrevet i eksempel 17. Cellerne behandles med en opløs- 64 DK 172677 B1 ning af rekombinantinterferon 5^ (α/B-type) ved en koncentration på 5000 internationale enheder pr. ml 1 4 timer ved 37*C, hvorpå der inkuberes i 30 minutter ved 5 37*C med 50 μΟί pr. ml 3%-methionin i Hanks afbalancerede saltopløsning Indeholdende natriumhydrogencarbonat, pufret med 20 mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsyre (HEPES, pH 7,4). Cellerne vaskes med PBS, skrabes af pladerne, samles ved centrifugering, suspenderes i 10 hypotonisk puffer bestående af 5 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM KC1 og 2,5 mM MgCl2 1 5 minutter og samles atter ved centrifugering. Cellerne lyseres med den hypotoniske puffer indeholdende 1% "Triton X-100"® og 1% deoxycholat T 5 minutter ved 4eC, hvorpå de centrifugeres ved 12000 o/m 15 i 5 minutter. Til supernatanten sættes natriumdodecyl-sulfat til en slutkoncentration på 0,5%. 6 μΐ af denne opløsning og 20 μΐ af en puffer bestående af 10 mM Tris.HCl, pH 7,4, og 50 mM NaCl (mættet med phenylmethyl-sulfonylfluorid) blandes og recentrifugeres ved 12000 o/m 20 i 5 minutter. 20 μΐ af supernatanten og 1 μΐ af en opløsning af det monoklonale antistof Θ85 S56,55.13 (40 ng/ml) i PBS indeholdende 0,5% BSA inkuberes i 3 timer ved 4'C og blandes derpå med 20 μΐ af en 50% (r/r) suspension af "protein A-Sepharose"®. Sepharoseperlerne vaskes med 25 500 μΐ af en puffer bestående af 10 mM Tris, pH 7,4, 50 mM NaCl, 1 M saccharose, 0,5% deoxycholat og 0,5% "Triton X-100"®, og antigen/antistofkomplekset elueres med 30 μΐ prøvepuffer, jf. U.K. Laemmli og M. Favre, J. Mol. Biol.

80, 575 (1973). Eluatet analyseres ved endimensional 30 SBS-gelelektroforese på 12% polyacrylamidgeler på sædvanlig måde. Tilstedeværelsen af proteinet ifølge opfindelsen ved en tilsyneladende molekylvægt på 78 kDa påvises ved fluorografi.

65 DK 172677 B1

Eksempel 19

Overvågning af Interferonterapi på mennesker

Blodprøver udtages fra patienter, som har fået 107 5 Internationale enheder rekombinant humaninterferon a («2) subkutant, 24 timer og 48 timer efter injektion,

Lymfocyterne renses ved centrifugering på "Ficoll"® 400 (Pharmacia) densitetgradient. 4,5 x 10® lymfocyter suspenderes i 400 μΐ H2O, hvorpå de fældes med 800 ^1 10 ethanol. Pelleten opløses i dissociationspuffer og adskilles ved endimensional SDS-polyacrylamidgelelek-' troforese. Proteinerne overføres til nitrocellulose, og 78 kDa proteinet påvises og bestemmes kvantitativt som beskrevet i eksempel 16.

15 Sammenlignet med patienter før interferonbehandling og sunde forsøgspersoner stiger niveauet af 78 kDa-proteinet 5 gange 24 timer og 48 timer efter subkutan interferon a2~indektion.

20 25

Claims (19)

1. Monoklonale antistoffer som er specifikke over for et protein kendetegnet ved 5 (l) tilstedeværelse i humane celler induceret ved hjælp af interferon α eller β, men ikke i ubehandlede celler i et rimeligt omfang, (2) en molekylvægt på ca. 78 kDa bestemt ved natrium-dodecylsulf atpolyacry lamidgelelektroforese (SDS-

2. Monoklonale antistoffer ifelge krav l, k endete g n e t ved, at de er produceret af mus/musehybridoma-celler, og derivater deraf.

3. Monoklonalt antistof ifølge krav 2 med betegnelsen

885 S35.8.1 udskilt af hybridomacellelinien med betegnelsen 885 S35.8.1, deponeret i "Collection Nationale des Cultures i des Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, under nummeret 1-545. 30

4. Monoklonalt antistof ifølge krav 2 med betegnelsen 885 S35.8.13 udskilt af hybridomacellelinien med betegnelsen 885 S35.8.13, som er deponeret i "Collection Nationale des Cultures des Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, under 35 nummeret 1-543.

5. Monoklonalt antistof ifølge krav 2 med betegnelsen i i DK 172677 B1

885 S35.8.15 udskilt af hybridomacellelinien med betegnelsen 885 S35.8.15, som er deponeret i "Collection Nationale des Cultures des Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, under nummeret 1-544. 5

6. Monoklonalt antistofderivat ifølge krav 1 eller 2 koblet til alkalisk phosphatase.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale 10 antistoffer og derivater deraf ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hybridomaceller, som udskiller de monoklonale antistoffer, (a) dyrkes in vitro, og de monoklonale antistoffer isole res fra kultursupernatanten, eller 15 (b) propageres in vitro i et egnet pattedyr, og de mono klonale antistoffer udvindes fra pattedyrets kropsvæsker , og, om ønsket, (c) de opnåede monoklonale antistoffer omdannes til et 20 derivat deraf.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at hybridomaceller afledt fra Balb/c mus injiceres intraperitonealt i Balb/c mus eventuelt forbehandlet 25 med et carbonhydrid, ascitesvæske opsamles fra disse mus, og de ønskede monoklonale antistoffer isoleres fra ascites-væsken.

9. Hybridomacellelinier, kendetegnet ved, 30 at de udskiller monoklonale antistoffer ifølge krav 1.

10. Hybridomacellelinier ifølge krav 1, k endetegnet ved, at de er hybrider af musemyelomaceller og B-lymfocyter fra en syngenisk mus. 35

10 -PAGE), (3) et isoelektrisk punkt på ca. 6,3, og (4) en partiel N-terminal aminosyresekvens 5 10

11. Hybridomace Ile linie ifølge krav 9 med betegnelsen DK 172677 B1

885 S35.8.1, som er deponeret i "Collection Nationale des Cultures des Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, under nummeret 1-545.

12. Hybridomacellelinie ifølge krav 9 med betegnelsen

885 S35.8.13, som er deponeret i "Collection Nationale des Cultures des Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, under nummeret 1-543.

13. Hybridomacellelinie ifølge krav 9 med betegnelsen

885 S35.8.15, som er deponeret i "Collection Nationale des Cultures des Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, under nummeret 1-544.

14. Fremgangsmåde til fremstilling af hybridomacelle- linier ifølge krav 9, kendetegnet ved, at et egnet pattedyr immuniseres med det rensede protein ifølge krav l eller med et antigent bærestof indeholdende dette protein, antistofproducerende celler fra dette pattedyr fusioneres med 20 myelomaceller, de ved fusionen dannede hybridceller klones, og cellekloner, som udskiller de ønskede antistoffer, selekteres.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendete g-25 net ved, at antistofproducerende celler fra HR-mus fusioneres med myelomaceller fra cellelinierne X63-AG8.653 eller SP2/0-Agl4.

15 Val-Val-Ser-Glu-Val-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala hvilke antistoffer ikke krydsreagerer med det beslægtede museprotein Mx induceret ved hjælp af interferon, og derivater deraf. 20

16. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendete g-3 0 net ved, at pattedyrene immuniseres ved implantering af et stykke nitrocellulose, som indeholder et protein ifølge krav 1.

17. Anvendelse af de monoklonale antistoffer eller 35 derivater deraf ifølge krav i til den kvalitative og kvantitative bestemmelse eller til isoleringen og rensningen af i DK 172677 B1 et protein kendetegnet ved, (1) dets tilstedeværelse i humane celler induceret ved hjælp af interferon a eller β, men ikke i ubehandlede celler i rimeligt omfang, 5 (2) en molekylvægt på ca. 78 kDa bestemt ved natrium- dodecylsulf atpolyacrylamidgelelektroforese (SDS--PAGE), (3) et isoelektrisk punkt på ca. 6,3, og (4) en partiel N-terminal aminosyresekvens 10 5 10 Val-Val-Ser-Glu-Val-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala

18. Anvendelse ifølge krav 17 af monoklonale anti stoffer og derivater deraf i en enzymimmunanalyse, en immun-fluorescenstest eller en immunfældningstest.

19. Analysesæt til den kvalitative og kvantitative 20 bestemmelse af et protein kendetegnet ved (1) dets tilstedeværelse i humane celler induceret ved hjælp af interferon a eller β, men ikke i ubehandlede celler i rimeligt omfang, (2) en molekylvægt på ca. 78 kDa bestemt ved natrium- 25 dodecylsulf atpolyacry lamidgelelektroforese (SDS- -PAGE), (3) et isoelektrisk punkt på ca. 6,3, og (4) en partiel N-terminal aminosyresekvens 30 5 10 Val-Val-Ser-Glu-Val-Asp-lle-Ala-Lys-Ala indeholdende monoklonale antistoffer ifølge krav 1 og/eller derivater deraf. 35