JPS62270599A - インターフェロンにより誘導されるヒト蛋白質に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は、インターフェロン−α又は−βによりし１〜
細胞内で誘導される精製された蛋白質；該蛋白質をコー
ドするＲＮＡ、ＤＮＡ及びハイブリドベクター；この様
なハイブリドベクターにより形質転換された宿主；これ
らの蛋白質、ＤＮＡ、ベクター及び宿主の製造及び精製
方法；これらの蛋白質に対して特異的なモノクローナル
抗体、モノクローナル抗体誘導体；これらのモノクロー
ナル抗体を分泌するハイブリドーマセルライン；これら
め蛋白質の定性質及び定量的測定におけるモノクローナ
ル抗体及びその誘導体の使用；モノクローナル抗体を含
む試験キット；並びにこの蛋白質を含有する医薬に関す
る。

〔発明の背景〕

インターフェロンはウィルス感染に対する防御及び腫瘍
の増殖の制御において有望視される天然蛋白質類である
。これらはウィルスの増殖に必要な細胞機能を妨害し、
そして分子レベルではまだ理解されていないプレイオト
ロピック（ｐｌｅｉｏ−ｔｒｏｐｉｃ）効果により細胞
増殖を阻害する様である。

さらに、インターフェロンはナチュラル・キラー（ＮＫ
）細胞の活性を刺激し、そしてリンホカインの相互作用
の複雑なネットワーク内でマクロファージ、Ｂ−細胞及
びＴ−細胞の活性を調節する。

インターフェロンの抗ウィルス活性、抗増殖活性及び免
疫調節活性に一群の誘導された蛋白質が関与するであろ
う。哺乳類細胞中で、インターフェロンは未処理細胞内
では検出されたいか又は極めて低濃度でしか存在しない
幾つかの蛋白質の合成を誘導する。これらの誘導された
蛋白質の幾つかは広く研究されている〔Ｐ、Ｌｅｎｇｙ
ｅｌ　、昼肥ＪもＹ−ユ旧−９免ｊＬ９ユ、５−ｊ、２
５１（１９８２）　’］が、しかし今なおあまり特徴付
けられていない。インターフェロンで処理されたヒト由
来の細胞及びマウス由来の細胞の両者は上昇したレベル
の２’、５’−オリゴイソアゾニレ−Ｉ・シンセターゼ
活性及びプロティンキナーゼ活性を含有する。インター
フェロン−α及び−βにより誘導されるマウス−プロテ
ィンＭにの合成及び性質が詳細に研究されているＩ’Ｐ
、５ｔａｅ−ｈｅｌｉ等、む上１．４４，１４７（１，
９８６）　）　、この蛋白質はインフルエンザウィルス
に対して非常に効果的で且つ特異的な抗ウイルス抵抗性
と関連する（１４．八。

Ｈｏｒｉｓｈｅｒｇｅｒ等、叶ｏｃ、ｔ４ａｔ上、Ａｃ
ａ−す、Ｓｃｉ、ＩＩＳ＾、旦凱１９１０（１９８３）
　、　Ｍ、＾、ｔｌｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ　＆　ｔｌ、
に、Ｈｏｃｈｋｅｐｐｅｌ、Ｊ。

Ｂｉ、ｏｊ−、Ｃ！′！ｅｍ、、２ＱＯ，１７３０（＋
９８５）　）　。関連するヒＩ、蛋白質がインターフェ
ロンで誘導されｔ：ヒト末梢血リンパ球及び線維芽細胞
中で検出された［Ｐ、Ｓｊ、ａｅ−ｈｅｌｉ　＆　０．
Ｈｏ１ｌｅｒ、−９ｊ、ｃｃＨｊ４３−ｉｏｌ、、’ｉ
、２１５０（１９８５）］。

８０ｋＤａ（キロダルＩ・ン）の分子酸が見出され、そ
してこの蛋白質は支配的に細胞質中に局在したが、しか
しこの蛋白質はこれ以上特徴付けられておらず又は単離
されていない。

近年における組換ＤＮＡ技法の急速な進歩は蛋白質の一
次天然源とは独立にその蛋白質を多量に製造するための
一般的方法を提供する。所望のポリペプチドをコードす
るｍＲＮＡ又はＤＮＡの同定はこの方法の成功のために
必須である。もし、（部分的）アミノ酸配列情報が得ら
れれば、化学合成されたヌクレオチドプローブが、それ
ぞれ所望のポリペプチドを生産する細胞由来のｍＲＮＡ
の混合物から、又はＤＮＡライブラリーからのコードｍ
ＲＮＡ又はＤＮＡの単離を導くであろう。所望のポリペ
プチドをコードするｍＲ，ＮＡ又はＤＮＡの単離のため
の多くの例が原理的に記載されているが、各所たな特異
的な問題点がこの技法の特定の事例への適用を要求する
。所望のポリペプチドをコードする相補的ＤＮＡ又はゲ
ノムＤＮＡを−・度手にすれば、適当なベクターの調製
、これらのベクターによる宿主の形質転換、形質転換さ
れた宿主の発酵、及び発現されたポリペプチドの単離を
標準的方法に従って行うことができる。ここでもやはり
、ＤＮＡの安定な挿入、選択された宿主細胞での所望の
ポリペプチドの十分に高い発現、及び純粋で生物学的に
活性な単離された蛋白質の許容される収量を得るために
は、前記の方法が特定の問題に適合されたければならな
い。

さらに、組換ＤＮＡ技法は宿主に導入されるコードＤＮ
Ａを変異せしめ又は変形せしめることによりポリペプチ
ド変形体の製造を可能にし、これにより天然の単一ペプ
チド構成において見出される活性原理の潜在的用途を拡
張する。

インターフェロンにより誘導される蛋白質は、２つの観
点において診断、疾患の管理及び療法において重要であ
る。一方においてこれらはインク−フェロンの不所望の
副作用を伴わないで抗ウィルス活性又は抗増殖活性のご
とく有益な性質を発揮することができ、他方においてこ
れらはインターフェロン療法における細胞応答の価値あ
る指示薬である。この様なインターフェロンにより誘導
された蛋白質に対する抗体はこれらの蛋白質の定性的及
び定量的測定を可能にし、そしてそれ山にこれらの蛋白
質又はインターフェロンを用いる療法の監視において必
須の手段である。

インターフェロンにより誘導されたマウスＭＸ蛋白質に
対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が知
られている（Ｐ、５ｔａｅｈｅｌｉ　＆０．８ａｌｌｅ
ｒ、Ｍｏ、Ｉ　、Ｃ：、ｑｊｊ−［％ｉ９．ｊ、−，う
、２１５０（１９８５）　）　、これらの内の１つはヒ
トインターフェロン誘導−蛋白質に対して弱い交差反応
性を示すが、しかしながら非特異的交差反応性が排除さ
れ得ない。

〔発明の目的〕

本発明は、インターフェロン〜α又は−βにより誘導さ
れたヒト細胞中に見出される蛋白質と関連するか又はそ
れと同一の純粋な蛋白質を提供することを目的とする。

この様な蛋白質の工業的合成の問題は組換ＤＮＡ技術の
方法により解決され得る。従って本発明の他の目的はこ
の蛋白質をコードするｈＩＲＮ　Ａ　、　Ｄ　Ｎ　Ａ及
びハイブリドベクター、並びに該ベクターにより形質転
換された宿主を提供することである。

他の目的は、該蛋白質、ｍＲ，ＮＡ、ＤＮＡ及びハイブ
リドベクターの製造及び精製の方法、並びに該ハイブリ
ドベクターを含有する宿主の製造方法を提供することで
ある。

この発明の池の目的は、前記蛋白質の定性的及び定量的
測定のための診断的手段としてのモノクローナル抗体、
該モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ、並び
にこれらの抗体及びハイブリドーマの製造方法、さらに
は前記蛋白質を含有する医薬の製造方法を提供すること
である。

〔具体的な説明〕

この発明は、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
ヒ１−ｍ胞中に存在するが、処理されていない細胞中に
は合理的な程度に存在しない；（２）ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ　−
ＰＡ（：Ｅ　”）により測定した場合約７８ｋＤａの分
子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する： （４）次の配列： で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； により特徴付けられる本質的に純粋な蛋白質に関する。

特に、これらの蛋白質は組換インターフェロンα／Ｂ、
α／Ｄ、α／Ｆ又はインターフェロンα／Ｂ、−Ｄハイ
ブリドにより処理されたヒトの胎児包皮（ｅｍｂｒｙｏ
ｎｉｃ　ｆｏｒｅｓｋｉｎ）細胞又はナマルワ（Ｎａｍ
ａｌｗａ）細胞中に見出される。

次の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列： Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−＾５ｐ−１
１ｅ−＾１ａ−１、ｙｓ−＾］ニー＾５ｐ−Ｐｒｏ−＾
１ａ−＾１ａ−＾１ａ−Ｓｅｒ−１１ｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｅｕ−１，ｅｕ−］、］ｅｕ−＾５ｎ−Ｇｌｙ−＾ｓｐ
−＾１ａＴｈｒ−Ｖａｌ−＾１ａ−Ｇｌｎ−１．ｙｓ−
＾５ｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａト八へａ−Ｇ：
ｌｕ−へｓｎ−へ５ｎ−１，ｅｕ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−＾ｒ
）７−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−１１ｅ−＾５ｐ−１．ｅｕ−１
１ｅ−＾ｓｐ−を有する蛋白質が特に好ましい。

７８ｋＤａの分子量は通常の分子量マーカーを用いる５
ＯＳ−ＰＡＧＥに基くものである。じがしながら関連す
るマウス蛋白質Ｍｘ　（Ｐ、５ｔａｅｈｅｌｉ等、Ｃｅ
ｊ±。

４４．１４７（１９８６）　）を用いる研究がら、実際
の分子量はさらに低く、おそらく約７２’ｋＤａである
と推定することができる。

この蛋白質はまた、７２ｋＤａの分子量に基いて全アミ
ノ酸分析により決定されるアミノ酸組成により特徴付け
られる（第１表）。第１表に示す分析された蛋白質のア
ミノ酸の実際の数の範囲は分析方法の不正確さく標準偏
差）から計算される。

以下余白 ％１−衣 アミ！敢組成 Ａｓｘ（アスパラギン酸／アスパラギン）　　　５６．
８　　　　５４−６０Ｇｌｘ　（グルタミン酸／グルタ
ミン）　　　　　９６．１　　　　９１．−１０１Ｓｅ
ｒ　（セリン）　　　　　　　　　　　　　　　Ｒ９，
：’ｌ　　　　　３７−４１Ｔｈｒ　（スレオニン＞　
　　　　　　　　　　　３２．２　　　　３Ｏ−３４Ｇ
ｌｙ　（グリシン）　　　　　　　　　　　　　　４：
’１．４　　　　４１−４６＾ｌａ（アラニン）　　　
　　　　　　　　　　　４７．２　　　　４５−５０＾
ｒｇ（アルギニン）　　　　　　　　　　　　３８．２
　　　　３６−４０Ｐｒｏ　（プロリン）　　　　　　
　　　　　　　　２６．０　　　　２４−２８Ｖａｌ　
（バリン）　　　　　　　　　　　　　　　３９．９　
　　　３８−４２Ｎｅｔ　（メチオニン）　　　　　　
　　　　　　１８．０　　　　１７−１９１１ｅ　（イ
ソロイシン）　　　　　　　　　　　　４３．１　　　
　４１−４６１、ｅｕ　（ロイシン）　　　　　　　　
　　　　　　６８．１　　　　８４−７２Ｔｒｐ（）リ
プトファン）　　　　　　　　　　　Ｏ０−３Ｐｈｅ　
（フェニルアラニン）２５．４　　　　２４−２７Ｃｙ
ｓ　（システィン）　　　　　　　　　　　　　５．９
　　　　５−７Ｌｙｓ　（リジン＞　　　　　　　　　
　　　　　４７．５　　　　４５−５０１１ｉｓ　（ヒ
スチジン）　　　　　　　　　　　　１２．９　　　　
１２−１．４Ｔｙｒ　（チロシン）　　　　　　　　　
　　　　１１、８　　　　１．１−１３本発明はまた前
記蛋白質の製造方法に関し、この方法は該蛋白質を生産
する細胞を培養し、そして細胞上清又は細胞溶解混合物
から該蛋白質を！Ｆ離し、そして沈澱及びクロマトグラ
フ法により精製することを特徴とする 特に、本発明は純粋な形態の前記蛋白質の製造方法に関
し、この方法はヒト細胞、好ましくは連続性ヒトセルラ
イン、例えばナマルワ細胞又は胎児包皮細胞を、ヒト−
インターフェロン−α又は−β、例えば天然ヒト−イン
ターフェロン−α又は組換ヒト−インターフェロン−α
、例えばインターフェロンα／Ｂ、α／Ｄ、α／Ｆもし
くはα／１３−Ｄハイブリドの存在下で培養し、そして
細胞を溶解し、上清中の蛋白質を例えば硫酸アンモニウ
ムの添加により沈澱せしめ、次に分取用ゲル電気泳動に
より分離し、そして約７８ｋＤａの見かけ分子量の蛋白
質を例えば電気溶出により溶出することを特徴とする。

この発明の蛋白質の製造のために有用なヒト細胞は正常
リンパ球、マクロファージもしくは、単球、リンパ芽球
性細胞、例えばナマルワ細胞、又は二倍体セルラインか
らのヒト胎児包皮綿１１ｍである。

好ましくは、ナマルワ細胞は、例えばウシ胎県血清の形
態でビタミン及び／又はホルモン並びに場合によっては
抗生物質が補充されたＲ１”Ｍｌ　１．６４０培地のご
とき通常の細胞増殖培地中で培養する。

指数増殖の終りに、細胞を組換インターフェロン−α、
例えばα／Ｂサブタイプ又はα／Ｂ−Ｄハイブリドと共
に、５Ｘ１０５〜１０７細胞／ｍ１の範囲の濃度及び２
０００〜１０，０００国際インターフェロンユニッｐ−
７ｍ１において、好ましくは約３７℃にてインキュベー
Ｉ・する。

この発明の蛋白質の生産を誘導するために、既知の天然
又は組換インターフェロン−α又は−β、例えば特許出
願ＥＰ　２８０３３、ＥＰ　３２１３４、ＥＰ　４３９
０８、Ｅｌ’　７２５４１、又はＥＰ　７６４８９に記
載されている組換インターフェロンを使用することがで
きる。

細胞を回収し、そして通常の方法、例えば緩衝液中高塩
濃度により細胞を溶解し、そして蛋白質を例えば硫酸ア
ンモニウムの添加により沈澱せしめる。目的蛋白質は通
常の生理的溶剤系中にむしろ不溶性である。

目的蛋白質をゲル電気泳動により精製する。分取用ゲル
電気泳動を２回行い、例えばまず７０ｋＤａ未満の分子
量を有する蛋白質及び８５ｋＤａより大きい分子量を有
する蛋白質からの粗分離を行い、次に得られた蛋白質混
合物の二次元分離を、非−平衡ｐｌ＋グラジェント電気
泳動と５ＤＳ−ポリアクリルゲル電気泳動を組合わせる
ことにより行う。

具体的には、前記蛋白質混合物を、２％の両性電解質を
含有する非−平衡ｒ＋Ｈグラジエン！・電気泳動ゲル（
ｐＨ３−１０）の酸性末端に適用し、次に第二次元にお
いて１．０〜１５％、好ましくは１２％のアクリルアミ
ド及び０．５％以下例えば約０．３％のビス−アクリル
アミドを含有するスラブゲル上で分離する。

好ましくは、この発明の蛋白質は、例えば前記の蛋白質
を発現する形質転換された宿主を異種性蛋白質の発現を
許容する条件下で培養し、そして目的化合物を単離する
ことを含んで成る組換ＤＮＡ技法により製造される。さ
らに詳しくは、目的蛋白質は次のようにして製造される
。

（、）ヒト細胞のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリ
ーから前記蛋白質をコードするＤＮＡを単離し、 （ｂ）このＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し、（ｅ
）得られたハイブリドベクターを受容体宿主に移行せし
め、 （ｄ）形質転換された宿主のみが生存する条件下で培養
することにより未形質転換宿主から形質転換された宿主
を選択し、 （ｅ）この形質転換された宿主を異種性ポリペプチドの
発現を許容する条件下で培養し、そして（ｆ）目的蛋白
質を単離する。

組換ＤＮＡ技法によるこれらのペプチドの製造に関与す
る段階を後でさらに詳細に検討する。

この発明はまた、前記の蛋白質をコードするＤＮＡにも
関する。この発明は特に、次の式（Ｉ）：（Ｉ） （式中、Ｚｌはプロモーター配列を含む、１２以上のヌ
クレオチドから成る５′−末端ＤＮＡ残基であり、Ｚ２
は１７００以上のコードヌクレオチド、終止コドン及び
場合によっては存在する３′−末端の非コードヌクレオ
チドから成るＤＮＡ残基であり、そしてＺｌ及びＺ２は
場合によっては連結されている） で表わされるＤＮＡ、１又は複数のトリプレットが同じ
アミノ酸をコードする他のトリプレットより置き換えら
れている弐Ｎ）のｒ）ＮＡ、式（１）のＤＮＡとこれに
対して相補的なりＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡ、並びに
相補的ＤＮＡそれ自体であるＤＮＡに関する。

式（Ｉ）のＤＮＡの１例は、例えばヒ１〜胎児包皮細胞
のｍＲ．ＮＡに由来するｃＤＮＡであって、次の式（■
）： Ｚ’−ＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＴＡＣＣＡＴＴＴＡＡＣＴ
ＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＡＣＴＴＴＴＡＴ八１ａ＾１ａｓ
ｅｒｔｌｉｓＰｒｏ！、ｅｕＬｅｕｌ、ｅｕＡｓｎＧｌ
ｙＡｓｐＡｌａＴｈｒＶａ１９０　　　　　１００　　
　　　１１．０　　　　　１２０１．３０　　　　　１
４０　　　　　１５０　　　　　１６０（ＩＩ） （式中、Ｚ３は１以上のヌクレオチドから成る５′−末
端ＤＮＡ残基であり、Ｚ２は１７００以上のコートヌク
レオチド、終止コドン及び場合によっては存在する３′
−末端の非コードヌクレオチドから成るＤＮＡ残基であ
る） で表わされるもの、そして特に次の式（■）：以−ト余
白 Ｚ’　４ＧＧ　八ＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣ
ＣＴＴＧＣＣＧＣＸＣＡＣＣＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＣ
ＴＣＡＧＧＣＸＣＴＴＴＧＧ＾＾ＴＴＣＴＸＴＧＧＣＣ
ＡＣＡＣ’Ｔ（：Ｃ’ＧＡＧＧＡＧ＾ＴＣＧＧＴＴＣＴ
ＧＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＴＡＣＡＧＧ＾八ＧＡＣＴＣＣ
ＣＡＣＴＣＣＣＴＧ＾−１８０−１７０−１６０、−１
５０−１４０＾＾ＴＣＴＧＧＡＧＴＧ＾＾Ｇ＾＾ＣＧＣ
ＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＴＣＣΔ八ＣＧ−
１３０−１２０−１１０−＋００ 八ＧＧＴＧＣΔＣＧＡＣ八八ＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＴ
八ＣＣＡＴＴＴ八＾ＣＴＴＧＴＴＧＡＣ＾ＴＴＡＣ，Ｔ
ＴＴＴＡＴＴＴＧ八八〇Ｇ＾八ＣＧへへＴ八ＴへＡＧ：
へＧへＴＴＡＣＴＴＴＧＣ＾＾−５０＝４０　　　　　
−３０　　　　　−２０　　　　　−１．０Δｓｎｌ、
ｅｕＣｙｓＳｅｒＧ　Ｉ　ｎＴｙｒＧ　Ｉ　ｕＧ　Ｉ　
ｕ！＋ｙｓＶａ　Ｉ＾ｒｇＰｒｏｃｙｓ２８０　　　　
　２９０　　　　　３００　　　　　３］０（ＩＩＩ） （式中、Ｚ４は１個以上のヌクレオチドがら成る５′−
末端ＤＮＡ残基であり、そしてＺ５は１５００個以上の
コードヌクレオチド、終止コドン及び場合によっては存
在する３′−末端の非コードヌクレオチドから成るＤＮ
Ａ残基である） で表わされるｃＤＮＡである。

さらに、この発明は、式（Ｉ）、（ＩＴ）、又は（ＩＩ
Ｉ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、例えば次の
式（■）： ５　′−ＧＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＧＴＣＣＡＣＴＴＣ−
３’（ＩＶ） で表わされる２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチド、次め式
（Ｖ）： ５　’−ＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＴＣＣΔ＾ＧＧ−３’（
Ｖ） で表わされる１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチド、及び次
の式（■）： ５　’−ＣＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＣＴＧＧ
−３′（Ｖｒ） で表わされる２　１−　ｍｅｒオリゴヌクレオチドに関
する。

この発明はまた、前記の蛋白質をコードするＦ？、　Ｎ
　Ａ、特に、Ｚｌ〜Ｚ５が前記の意味を有するが但しＤ
ＮＡ残基の代りにＲＮＡ残基が存在しそしてそれ故にデ
オキシ−チミジン（Ｔ＞の代りにウリジン（Ｕ）が存在
する弐Ｎ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のＲ，ＮＡに関す
る。

目的蛋白質をコードするＤＮＡは、例えは形質転換され
た宿主を培養し、これから目的ＤＮＡを単離することに
より製造することができる。

特に、この様なりＮＡは次の様にして製造することがで
きる。

（ａ）ヒト細胞からｍＲＮＡを単離し、目的のｎ＋ＲＮ
Ａを選択し、該ｍＲＮＡに対して相補的な単鎖ＤＮＡを
調製し、次にこれから二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ　ｃＤＮＡ）
を調製するか、又は（１１）ヒ）・細胞からゲノムＤＮ
Ａを単離し、そしてＤＮＡプローブを用いて目的のＤＮ
Ａを選択し、そして （ｃ）段階（ａ）のｃＤＮＡ又は段階（ｂ）のｄｓＤＮ
Ａを適当な発現ベクターに導入し、 （ｄ）この得ちれたハイブリドベクターに．Ｉ：り適当
な宿主微生物を形質転換し、 （ｅ）目的の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質
転換された宿主をコードＤＮＡを含有しない宿主から選
択し、そして （「）目的のＤＮＡを単離する。

ポリアデニル化メツセンジャーＲＮＡを既知の方法によ
りヒＩ−細胞から単離する。適当な細胞は、正常リンパ
球、マクロファージ、惟球、リンパ芽球性細胞、例えば
ナマルワ細胞、ヒト胎児包皮二倍体細胞等であって天然
又は組換インターフェロン−α又は−βにより誘導され
たものである。単離方法は例えば、刺激された細胞を洗
剤及び場合によってはりボヌクレアーゼ阻害剤、例えば
ヘパリン、イソチオシアン酸グアニジニウム及びメルカ
ブ）・エタノールの存在下で溶解し、ｍＲ，ＮＡ　をフ
ェノール又は適当なりロロホルムーフェノール混合物に
より場合によって塩及び緩衝液、洗剤、プロテイナーゼ
及び／又は陽イオンキレート剤の存在下で抽出し、そし
て残留水性塩含有相からｍＲＮＡ　　をエタノール、イ
ソプロパツール等により沈澱せしめることを含む。塩化
セシウムグラジェント中で遠心し次にエタノール沈澱す
ることにより、及び／又はクロマトグラフ法、例えばア
フィニティークロマトグラフ法、例えばオリゴ（ｄＴ）
セルロース又はオリゴ（Ｕ）セファロース上でのクロマ
トグラフィーにより、単離されたｍＲＮＡ　をさらに精
製することができる。好ましくは、例えば直線シューク
ロース勾配中でのグラジェント遠心により、又は適当な
サイズ分画カラム例えばアガロースゲル上でのクロマト
グラフィーにより、粗製の又は精製された全ｍＲＮＡを
サイズに従って分画する。

ＤＮＡプローブを用いるスクリーニングにより、又は適
当な細胞もしくは無細胞系での翻訳及び得られるポリペ
プチドのスクリーニングにより、目的＋ｎ　Ｒ，Ｎ　Ａ
を選択する。好才しくは、分画されたｍＲＮＡを細胞中
、例えばカエルの卵母細胞中で、又は無細胞系中、例え
ば網状赤血球溶解物又は小麦胚抽出物中で翻訳する。得
られたポリペプチドを前記の様にして得られた天然蛋白
質と、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動により比
較し、そして目的蛋白質を生じさせる＋ｎ　Ｒ，Ｎ　Ａ
画分を選択する。

選択されたｍＲＮＡ鋳型からの単鎖相補的ＤＮＡの調製
、及び単鎖ＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡの調製は当業界に
おいてよく知られている。ｍＲＮＡ鎖型を５デオキシヌ
クレオチドトリホスフェートの混合物、場合によっては
放射能ラベルされたデオキシヌクレオチドトリホスフェ
−１へ（反応の結果をスクリーニングすることができる
ように）、ｍＲ，ＮＡのポリ（Ａ）テイルとハイブリダ
イズするオリゴ（ｄＴ　）のごときプライマー配列、及
び適当な酵素、例えば逆転写酵素と共にインキュベ−１
・する。鋳型ｍＲ，ＮＡを分解した後、相補的ＤＮＡ（
ｃＤＮＡ）をデオキシリボヌクレオヂドトリポスフェー
ト及び」−記のごとき適当な酵素と共にインキ、エベー
トして二本鎖ＤＮＡを得る。適当な酵素は逆転写酵素、
Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ
ＩのＫｌｅｎｏｗ断片、又はＴ４　　ＤＮＡポリメラー
ゼである。場合によっては単鎖ＤＮＡをまず好ましいデ
オキシヌクレオチドのテイルにより延長して好ましいデ
オキシヌクレオチドと相補的なプライマー配列の使用を
可能にするが、しかしｄｓＤＮＡの形成は通常自発的ヘ
アピン形成の後に始まる。ヘアピン形成の結果として得
られたこの様なｄｓＤＮＡを、該ヘアピンを切断するＳ
１ヌクレアーゼによりさらに処理する。好ましい他の方
法においては、＋ｎ　ＲＮ　Ａ、　／　Ｄ　Ｎ　Ａ　を
Ｒ，ＮアーゼＨ１Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポ
リメラーゼＩにより直接処理して、プライマー配列によ
る延長及び／又はヘアーピン切断の追加の段階を回避す
る。

＋ｎＲＮＡからのｃＤＮＡＪ’ｌ調製の別の方法として
、ゲノムｌ’）ＮＡを単離し、そして目的ポリペプチド
をコードするＤＮＡについてスクリーニングすることが
できる。

ゲノムＤＮＡは適当なヒト組織から、好ましくはヒト胎
盤又はヒト胎県肝細胞から既知の方法に従って４１離す
る。これを確立された方法に従って適当な制限エンドヌ
クレアーゼにより消化し、そしてλシャロンファージ、
例えばλシャロン４Ａに導入することによりゲノムＩ’
）ＮＡライブラリーを調製する。二Ｉ〜ロセルロース膜
上にレプリカしたゲノムＤＮＡライブラリーを、ＤＮＡ
プローブ、例えば１７個以−Ｆのヌクレオチドから成る
合成りＮＡプローブ又は前記の様にして目的ポリペプチ
ドをコードするＩＩＩＲ，ＮＡから誘導しなｃＤＮＡを
用いてスクリーニングする。

ｍＲ，ＮＡ　かち調製されたｄｓＤＮＡ又はゲノム由来
のｄｓＤＮＡの適当なベクターへの導入は当業界におい
てよく知られている。例えば、適当なベクターを切断し
、そして適切なデオキシリボヌクレオチドのテイルを付
す。次に、アニールずべきｄｓＤＮＡは相補的な適切な
デオキシヌクレオチドのテイルを担持しなければならず
、これは対応するデオキシヌクレオチＦ　ｌ−リポスフ
ェ−１・及びターミナルヌクレオデジル１〜ランスフエ
ラーゼのごとき酵素の存在下でのインキュベーションに
より達成される。他の方法として、相補的突出末端をも
ならず同じエンドヌクレオチドによる処理の後のｉＨｔ
なるｊ土納により、リンカーオリゴヌクレオヂドを用い
て、又は平滑末端連結により、ｄｓＤＮＡをベクターに
導入することができる。

得られたハイブリドベクターによる適当な宿主微生物の
形質転換は当業界においてよく知られている。例えば、
Ｅ、コリを塩化カルシウムを含有する媒体中でインキュ
ベ−１・することにより形質転換のために条件調節し、
そして次にハイブリドベクターにより処理する。形質転
換された宿主は、適当なマーカーにより、例えば抗生物
質耐性マーカー、例えばテトラサイクリン、クロラムフ
ェニコール又はアンピシリン耐性マーカーににす、及び
／又は酵素マーカー、例えばα−プロティンを補完する
β−ガラクＩ・シダーゼにより選択する。

所望のＤＮＡにより形質転換された宿主は好ましくはＤ
ＮＡプローブを用いて選択する。この様なハイブリダイ
ゼーションプローブは例えば、インターフェロンにより
誘導されたナマルワ細胞から単離された目的蛋白質に基
いて決定された部分的アミノ酸配列を基礎にして構成さ
れる１７個以」二のヌクレオチド、例えば約２０個のヌ
クレオチドから成る全合成りＮＡである。好ましくは、
オリゴヌクレオチドプローブの混合物を調製し、この場
合該混合物の各構成員は対応する既知アミノ酸配列のた
めのトリプレットコドンの可能な組合せの１つに対して
相補的である。

この様なプローブもまた本発明を構成する。これらは既
知の方法に従って、好ましくは固相ホスホトリエステル
法、ポスファイＩ−１−リエステル法又はホスホラミダ
イト法を用いる段階的縮合により、例えばホスホ１ヘリ
エステル法によるジヌクレオチドカップリングユニット
の縮合により合成される。これらの方法は、Ｙ、Ｉｋｅ
等ｒ：ＮＨ＋ｑ、Ｉｑｉｑ−＾ｃＨ−ｉ、ｄ−叶胛−リ
仙、１］　、４７７　（１９８３）　）により記載され
ている様に適切な縮合段階において、保護された形の２
種類、３種類又は４種類のヌクレオチドｄＡ　、　ｄＣ
。

ｄＧ及び／又はｄＴあるいは対応するジヌクレオチドカ
ップリングユニットの混合物を用いることにより、目的
オリゴヌクレオチドの混合物の合成に適合される。

形質転換された宿主のＤＮＡとのハイブリダイゼーショ
ンを検出し、これを同定し、そしてこの発明の目的ＤＮ
Ａを含有しない他の宿主から前記宿主を分離することが
できる様に、ＤＮＡプローブはマーカーを含有しなけれ
ばならない。例えば、オリゴヌクレオチドの５′−末端
リン酸における３２ｐのごとき放射性ラベル、又は蛍光
マーカー、あるいは適当にラベルされたアビジンにより
、例えば蛍光マーカーを有するか又はホースラディツシ
ュパーオキシダーゼのごとき酵素と接合したアビジンに
より検出され得るビオチンを含有するラベルが適当であ
る。

形質転換された宿主からのＤＮＡとマーカーを含有する
ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションは既知の方
法に従って、例えば助剤例えはカルシウムキレート剤、
粘度調節剤、蛋白質、無関係のＤＮＡ又はｔＲＮＡ等を
含有するＭ衝液及び塩溶液中で、選択的ハイブリダイゼ
ーションに好都合な温度、例えば０℃〜７０℃、例えば
４０℃〜５０℃、好ましくはハイブリドｄｓＤＮＡの融
点より約２０℃低い温度において行う。

本発明はさらに、目的の蛋白質をコードしそして発現制
御配列に作用可能に連結されているＤＮＡを含んで成る
ハイブリドベクター、及びその製造方法に関する。

ベクターは、翻訳のために使用される宿主細胞に依存し
て選択される。適当な宿主の例として、制限酵素又は修
飾酵素を欠いているか又はほとんど有さない微生物、例
えば酵母、例えばサツカロミセス・セレビシェ−（５駐
４琢ｒ卯ｙｃｅ狙鵠ｒｅν１ｓｉａｃ、）例えばＳ、セ
レビシェ−（Ｓ−、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＲＦ　１
８、及び細菌株、特にニジエリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｊ社道ｃ、、ｏ　ｌ　ｉ　）の株、例えばＥ、コリＸ
１７７６、Ｅ、コリ１１１１１０１、Ｅ、コリ阿３１１
０、Ｅ、コリ１（Ｂ１０１．／ＬＭ１０３５、Ｅ、コリ
Ｊ＾２２１、Ｅ、コリＪＭ１０９又はＥ、コリＫ１２株
２９４、バシルス・ズブチリス（Ｂａａ　ｉｊ　ｊｕｓ
ｓｕｂｔｉｊｉｓ）、バシルス・ステアロサーモフィル
ス（Ｂａｃｉ士順且蛙並ワリーハ虹−９ｐ屓」−リ壜−
）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、）、ヘ
モフィルス（ｔｌ　ａ　ｅ　堅ｐ　１−１−ｕ　ｐ　＞
、ストレプトコッカス（針ｒｅｐ１９朋９鼎ジ）等、並
びに高等生物の細胞、特に樹立されたヒト又は動物のセ
ルライン、例えば１ｌｅｌａ細胞、５Ｖ−４０ウイルス
で形質転換されたアフリカミドリザルＣ０８−７腎細胞
、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられる。

Ｅ、コリの前記の株、例えばＥ、コリＪＭ１０９、Ｅ、
１１月ｌＢ１０１、Ｅ、コリＩり１２及びＥ、コリ１１
１３］１０、並びにサツカロミセス・セレビシェ−の前
記の株が宿主微生物として好ましい。

原理的には、選択された宿主中で本発明の目的のポリペ
プチド遺伝子を複製しそして発現することができるすべ
てのベクターが適当である。Ｅ。

コリ株中での発現のために適当なベクターの例として、
バクテリオファージ、例えばラムダ又はＭ１３バクテリ
オファージの誘導体、あるいはブラスミド、例えば特に
プラスミドＣｏｌ　Ｅｌ及びその誘導体、例えば１Ｍ８
９　、　．５Ｆ２１．２４　、　ｐＢＲ３１７又はｐＢ
Ｒ３２２が挙げられる。この発明の好ましいベクターは
プラスミドｐＢＲ３２２に由来する。適当なベクターは
完全なレプリコン、発現プラスミドにより形質転換され
た宿主を表現形質に基いて選択しそして同定することを
可能にするマーカー遺伝子、並びに場合によってはシグ
ナル配列及びエンハンサ−を含有する。適当なマーカー
遺伝子は宿主に例えば重金属、抗生物質等に対する耐性
を付与する。さらに、この発明の好ましいベクターは、
レプリコン領域及びマーカー遺伝子領域の外側に制限エ
ンドヌクレアーゼのための認識配列を含有し、これによ
って目的ポリペプチドの遺伝子、及び適当な場合には発
現制御配列をこれらの部位に挿入することができる様に
されている。好ましいベクターであるプラスミドｐＨＲ
３２２並びに誘導体プラスミド、例えばｐＵＣ９、ｐＨ
Ｒ１１４Ｂ及びｐＰＬｃ２４は無傷のレプリコン、テト
ラサイクリン及びアンピシリンに対する剛性（ｖ　ｅ　
ｒ　”及びａｍｐ”　）を付与するマーカー遺伝子、並
びに制限エンドヌクレアーゼのための多数のユニーク認
識部位を含有する。

遺伝子発現の制御のなめに幾つかの発現制御配列を使用
することができる。ハイブリドベクターとしてｐＢＲ３
２２を使用しそして宿主微生物としてＥ。

コリを使用する場合、例えば、ラクトースオペロン、ト
リプトファンオペロン、アラビノースオペロン等の発現
制御配列（これらは特にプロモーター及びリボゾーム結
合部位を含有する）、β−ラクタマーゼ遺伝子の発現制
御配列、ファージλＮ遺伝子の対応する配列、特にＰＬ
プロモーターを含有する配列、又はファージｆｄ−コー
■・蛋白質遺伝子の発現制御遺伝子が適当である。プラ
スミド、ＢＲ３２２はすでにβ−ラクタマーゼ遺伝子（
β−１ａｃ遺伝子）のプロモーターを含有するが、他の
発現制御配列をこのプラスミドに導入しなければならな
い。

酵母中での複製及び発現のために適当なベクターは酵母
複製開始点及び酵母のための選択遺伝マーカーを含有す
る。酵母複製開始点、例えば染色体自律複製セグメン１
ｉａｒｓ）を含有するハイブリドベクターは、形質転換
の後酵母細胞内で染色体外に維持され、そして自律複製
する。さらに、酵１’Ｊ：　２μプラスミドＤＮＡに相
同な配列を含有するハイブリドベクターを使用すること
ができる。この様なハイブリドベクターは細胞内にすで
に存在する２　Ｂプラスミドに組換により取り込まれる
か、又は自律複製するであろう。２μ配列は高形質転換
頻度を有するプラスミドのために特に適当であり、そし
て高コピー数を許容する。この発明の好ましい酵母ベク
ターはプラスミドｐＪｒｌＢ２０７である。

酵母のための適当なマーカー遺伝子は特に、宿主に抗生
物質耐性を付与する遺伝子、又は栄養要求性酵母変異株
の場合には宿主の傷害を補完する遺伝子である。対応す
る遺伝子は、例えば、抗生物質シクロヘキシミドに対す
る耐性を付与４し、又は栄養要求性酵母変異株に原栄養
牲を提供する遺伝子、例えばＵ−ｆｉ八へ、１興？、！
！−Ｔ昶、又は特に訓即遺伝子である。酵母ハイブリド
ベクターはさらに、奸才しくけ、細菌宿主、特にＥ、コ
リのための複裂開始点及びマーカー遺伝子を含有し、こ
れにＪ：リハイプリドベクターの造成及びクローニング
を細菌宿主中で行うことができる。

酵母での発現のために適当な発現制御配列は例えば高度
に発現される酵母遺伝子のそれである。

すなわち、工６？」遺伝子、Ａｒ１１ｌｌ−又は〜−Ｄ
ＩＩＩＴ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＩｊ０３又は
ＰＨ０５）遺伝子又はイソチトクローム遺伝子のプロモ
ーター、あるいは解糖系に関与するプロモーター、例え
ばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ポスフェ＝ト
デヒドロゲナーゼ（９則＋１）、３−ホスホグリセレー
トキナーゼ（Ｐｑ−Ｋ）、ヘギソキナーゼ、ピルベート
デヒドロゲナーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコー
ス−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスポグリセ
レー１〜ムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホ
スフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラー
ゼ及びグルコキナーゼの遺伝子のプロモーターを使用す
ることができる。

この発明の好ましいベクターは転写制御を伴うプロモー
ター、例えば増殖条件の変化によりターンオン又はター
ンオフを行うことができるＩｊｊ　Ｑ　５遺伝子、へＷ
！！」−遺伝子及びｑへり］（遺伝子のプロモーターを
含有する。例えば、ｆｆｌ！ＩＱ−５−プロモーターは
、培地中の無機リン酸塩の濃度を単に上昇せしめるか又
は低下せしめることにより抑制又は抑制解除され得る。

哺乳類細胞中での複製及び発現のために適当なベクター
は好ましくはウィルス超厚のＤＮＡ、例えばシミアンウ
ィルス４．０　（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウィルス（Ｒ
８Ｖ）、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫ウィルス（Ｂ　
Ｐ　Ｖ）、パボバウイルスＢＫ変異株（ＢＫＶ）、又は
マウムもしくはヒトのサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）
からのＤＮＡを有する。好ましくは、この様なベクター
は、真核生物の転写制御配列と共にＥ、コリ中での増殖
のための複製開始点及び抗生物質耐性遺伝子を含有する
。特に、いわゆるシャトルベクターをＥ、コリプラスミ
ド０口Ｒ３２２及びＳＶ４０及び／又はＣＭＶエンハン
サ−及びプロモーター領域から造成することができる。

例えば、このプラスミドはヒト又はマウスのサイトメガ
ロウィルス主要即時初期（ｉｍｍｅｄｉａｌ、ｅ−ｅａ
ｒｌｙ）遺伝子のエンハンサ−・プロモーターユニット
、ヒＩ〜α−グロビンプロモーターど組合わぜなＳＶ４
０エンハンザ−１そして／又はさらに誘導性プロモータ
ー、例えばヒートショック遺伝子又はメタロチオネイン
遺伝子由来のプロモーターを含有することができる。さ
らに、目的遺伝子配列と通常関連しているプロモーター
又は制御配列を使用することができる。複製開始点はＳ
Ｖ４０もしくは他のウィルス源からの外来性複製開始点
を含む様にベクターを構成することにより、又は宿主細
胞の染色体複製機構により設けることができる。ベクタ
ーが宿主細胞の染色体に組み込まれる場合、後者の方法
は一層効果的である。

好ましい態様において、本発明は宿主株中で複製及び表
現型選択が可能なハイブリドベクターに関し、このハイ
ブリドベクターはプロモーター及び目的蛋白質をコード
するＤＮＡを含んで成り、このＤＮＡは前記プロモータ
ーの制御上前記ハイブリドベクター中の転写開始シグナ
ル及び転Ｖ終ｆ（−シグナル並びに翻訳開始シグナル及
び翻訳終止シグナルと一緒に配置され、こうして形質転
換された宿主中で前記蛋白質を生産するために発現され
る。

この発明はまた、形質転換された宿主の製造方法に関し
、この方法ζＪ発現制御配列により制御されるこの発明
のＤＮＡを含有する発現ベクターにより宿主を形質転換
（Ｌｒａｎｓ４ｏｒｍａｔ　１ｏｎ）又はｌ・ランスフ
エクションすることを含んでなり、本発明はさらに形質
転換された宿主それ自体に関する。

適当な宿主の例として、前記の微生物、例えばサツカロ
ミセス・セレビシェ−の株、バシルス・ズブチリスの株
、及びニジエリシャ・コリの株が挙げられる。この発明
の発現プラスミドによる形質転換は、例えば文献に記載
されている様にして、ずなわちＳ、セレビシェ−につい
ては＾　ｌ１ｉｎｎｅｎ、Ｊ、Ｉｌ、　ｆｌｉｃｋｓ及
びＧ、Ｒ，Ｆｉｎｋ、　Ｐｒｏｃフ４ａｔ．Ｉ　、Ａ−
ｃａｄユ鉢亘−ｇ、ｓ、ｘ　、″Ｌ匡、　１．９２９（
１，９７８＞、Ｂ、ズブチリスについてはΔｎａｇｎｏ
ｓｔｏｐｏｕ　ｌｏｓ等、Ｊ、Ｂａｃｔ、ｅｒｉｏｌ　
、、　１３上、７４１（１，９６１，）、そしてＥ、コ
リについてはＭ、　Ｍａｎｄｅｌ等、！」り一肝−阻ユ
、降、　１５９（１９７０）の方法に従って行われる。

従って、Ｅ、コリ細胞の形質転換は、ＤＮＡの取り込み
可能にするための細胞のＣａ＋１前処理、及びハイブリ
ドベクターとのインキュベーションを含む。親細胞から
の形質転換細胞の分離を可能にする選択増殖培地に細胞
を移す。ベクターを含有しない細胞はこの様な培地中で
生存しないであろう。酵母の形質転換は、例えば、（１
）グルコシダーゼによる酵母細胞壁の酵素的除去、（２
）ポリエチレングリコール及びＣａ＋＋　イオンの存在
下でのベクターによるスフェロプラストの処理、及び（
３）該スフェロプラストを寒天中に包埋することによる
細胞壁の再生を含む。好ましくは、再生寒天は形質転換
された細胞の細胞壁の再生と選択を同様に可能にする様
に調製される。

適当な宿主の他の例は上記の哺乳類細胞、例えばＣ０８
−７細胞、ヒーラ細胞又はヂャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞である。ベクターは、ヘルパー化合物、
例えばジエチルアミノエチルデキストラン、ジメチルス
ルホキシド、グリセロール、ポリエチレングリコール等
の存在下で又はベクターＤＮＡとリン酸カルシウムとの
同時沈澱として、Ｉ・ランスフェクトにより哺乳類細胞
に導入される。

他の適当な方法には細胞核へのベクターＤＮＡの直接微
景注射、及び電気穿孔、ずなわち細胞膜の透過性を増加
する短い電気パルスによるＤＮＡの導入が含まれる。こ
れに続く、形質転換された細胞の選択は、発現ベクター
に共有結合により絹み込まれた選択マーカー又は別の存
在として添加された選択マーカーを、用いて行うことが
できる。選択マーカーは抗生物質、例えばＧ−４１８（
ネオマイシン）、又はハイグロマイシンに対する耐性を
付与する遺伝子、あるいは宿主細胞の、遺伝的傷害、例
えばチアミンキナーゼ又はヒドボキ、サンチンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼの傷害を補完する遺伝子であ
る。

形質転換された宿主細胞は、炭素、窒素及び無機塩の資
化性源を含有する液体培地中１で従来技術において知ら
れている方法により培養される。

この発明の形質転換された宿主の培養のために種々の炭
素源を使用することができる。好ましい炭素源の例とし
て資化性炭水化物、例えばグルコース、マルトース、マ
ンニＩ・−ル又はラフＩ・ス、あるいは酢酸塩を挙げる
ことができ、これらはそれ自体として又は適当な混合物
として使用することができる。適当な窒素源の例として
アミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプチド、並びに蛋白質
及びその分解生成物、例えばトリプトン、ペプＩ・ン又
は肉エキス、酵母エキス、マルトエキス、並びにアンモ
ニウム塩、例えば塩化アンモニウム、Ｖｌ酸アンモニウ
ム又は硝酸アンモニウムが挙げられ、これらはそれ自体
として又は適当な混合物として使用することができる。

使用することができる適当な塩は例えばナトリウム、カ
リウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、塩化物
、リン酸塩及び炭酸塩である。

培地はさらに、例えば増殖促進物質、例えば微１元素、
例えば鉄、亜鉛、マンガン等、及び好ましくは選択圧を
与えそして発現プラスミドを失つな細胞の増殖を阻害す
る物質を含有する。すなわち、例えば、発現プラスミド
がａＩＩｌｐＲ遺伝子を含有する場合には培地にアンピ
シリンが加えられる。

この様な抗生物質の添加はまた、抗生物質感受性の汚染
微生物が破壊されるという効果も有する。

例えば必須アミノ酸において栄養要求性である酵母株が
宿主微生物として使用される場合、プラスミドは好まし
くは宿主の傷害を補完する酵素をコードする遺伝子を含
有する。酵母株の培養はこのアミノ酸を欠く最少培地中
で行われる。

を椎動物細胞は、増殖促進物質及び／又は哺乳類血清が
補充されている場合がある市販の培地を用いて組織培養
条件下で増殖せしめる。＃！Ｉｌｌ胞は固体支持体、例
えばマイクロキャリヤー又は多孔性ガラス繊維に付着し
であるいは適当な培養容器中を自由浮遊しながら増殖す
る。

培養は当業界において知られている方法により行われる
。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ値、及び発酵時間
は、この発明のポリペプチドの最大力価が得られる様に
選択される。すなわち、Ｅ。

コリ又は酵斤株は、好ましくは、振どう又は撹拌を伴う
深部培養による好気的条件下で、約２０℃〜４０℃の温
度、好ましくは３０℃、及び４〜８のｐＨ値、好ましく
は約ｐＨ７において、約４〜３０時間、好ましくはこの
発明のポリペプチドの最大収量が達成される才で培養す
る。

細胞濃度が十分な値に達しなとき、培養を停市し、そし
てポリペプチドを単独する。ポリペプチドが適当なシグ
ナルペプチド配列と融合している場合、これは細胞によ
り上清に直接分泌される。

他の場合には、例えば洗剤、例えばＳＯＳ、ＮＰ−４０
、トリトン又はデオキシコール酸により処理することに
よって細胞を破壊しなければならず、あるいはりゾチー
ム、同様に作用する酵素又は超音波により細胞を溶解し
なければならない。宿主微生物として酵母を使用する場
合、グルコシダーゼによる酵素的消化により細胞壁を除
去することができる。これに代えて、又はこれと組合わ
せて機械的力、例えば剪断片（例えばＸ−プレス、フレ
ンチプレス、ダイノミル）又はガラスピーズもしくは酸
化アルミニウムとの振とう、あるいは例えば液体窒素中
での凍結と例えば３０℃〜４０℃での解凍、並びに超音
波を用いて細胞を破壊することができる。

細胞上清、又は細胞の破壊の後に得られる混合物の遠心
分離により得られた溶液は蛋白質、核酸及び他の細胞成
分を含有しており、これをこの発明のポリペプチドを包
含する蛋白質についてそれ自体既知の方法により富化す
る。すなわち、例えば、はとんどの非蛋白質性成分はポ
リエチレンイミン処理により除去され、そしてこの発明
のポリペプチドを包含する蛋白質は例えば硫酸アンモニ
ウム又は他の塩による溶液の飽和により沈澱する。

他の方法として、細胞上清又は細胞溶解物をクロマトグ
ラフ法を用いて直接前精製することができる。

この発明のポリペプチドは、クロマトグラフ分離の組合
せにより、好ましくはイオン交換クロマトグラフィー、
ゲル沢過及び逆相高速液体クロマトグラフィーの組合わ
ぜにより精製される。他の分離法には例えば分子量カッ
Ｉ・−オフ膜を用いる濾過及び限外濾過、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト上でのク
ロマｌルブラフィー、クロマＩ〜フォーカシング、並び
に適当な塩及び／又は緩衝液及び溶剤混合物中での透析
、溶解及び再沈澱が含まれよう。

イオン交換クロマトグラフィーのための適当なキャリヤ
ー材料は有機又は無機性の、例えば架橋されたアガロー
ス、デキストラン、ポリアクリルアミド、スチレン／ジ
ビニルベンゼンコポリマー、セルロース等であることが
できる。好ましくは、このキャリヤー材料は塩基性官能
基、例えば第三アミノ官能基、第四アンモニウム基、又
はわずかに酸性の基、例えばカルボキシメヂル官能基を
担持する。これらのキャリヤーは正常液体クロマトグラ
フィー、固定蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰｌ、
Ｃ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＩＩＰＬＣ）の
ために適当である。イオン交換クロマトグラフィーによ
る分離及び精製は確立された方法、例えば増加する量の
塩、例えば塩化すＩ・リウムを含有ずるｐ１１４〜ｐ１
（９の水性緩衝液中で行われる。

ゲル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィーのなめに適
当なキャリヤー材料には架橋されたデキストラン、アガ
ロース、適切に修飾されたポリアクリルアミド又はシリ
カ等が含まれる。場合によってはこれらのキャリヤーは
ヒドロキシ官能基を担持する置換基、例えば１−ヒドロ
キシ低級アルキル基又は１．２−ジヒドロキシ低級アル
キル基により修飾されている。クロマトグラフィーは、
５０．０００〜１００，０００ダルトンの分子量範囲の
ペプチドの最適分離を示すように選択される。この様な
ゲル涙過又はサイズ排除クロマトグラフィーは」−記の
ように正常液体クロマＩ・クラフィー、Ｆ　Ｐ　ＬＣ又
はｌＩＩ’Ｌｃのために適するカラム中で、可変量の塩
、例えば塩化すｌ・リウムを含有するおよそ中性の水性
Ｍｌ液を用いて行われる。

逆相クロマトグラフィーは、疎水性基、例えば１〜２０
個の炭素原子、好ましくは４．．８．１２もしくは１８
個の炭素原子を有するアルキル基、又はそれぞれ１及び
８又は２及び１８個の炭素原子を有するアルキル基の混
合、あるいはフェニル基を担持するシリカ性キャリヤー
材料上で行われる。

アガロース又は１２個までの炭素原子を有するアルキル
基及び／又はフェニル基がコートされた関連材料が使用
される疎水性相互作用クロマトグラフィーがこの方法に
関連する。これらのクロマトグラフ技法はＦＰＬＣ又は
肝ＬＣを用いて適用される。

シリカ性逆相材料上で本発明のポリペプチドを処理する
ための溶剤は水性酸、例えば、増加する量の極性水混和
性有機溶剤、例えばアセトニトリル、低級アルコール、
例えばメタノール、エタノール、プロパツール、テＩ・
うしドロフラン等、好ましくはアセトニトリルを含有す
る水性トリフルオロ酢酸である。

アフィニティークロマトグラフィーはまた、目的の蛋白
質に対して高いアフィニティーを有する分子、例えば抗
体、特に後で記載するモノクローナル抗体を担持する適
当なキャリヤー材料、例えば架橋されたアガロース、デ
キストラン又はポリアクリルアミドを使用して、本発明
のポリペブチドの精製のために期待される。抗体は既知
の方法により活性化形のキャリヤー材料に連結される。

アフィニティークロマトグラフィーによる目的ポリペプ
チドの精製はそれ自体既知の方法に３上り、例えば、場
合によっては界面活性剤、例えばポリエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステルを含有するおよそｐｌ＋５〜９の範囲
の緩衝液及び／又は塩溶液、例えばＮａ（１！溶液中で
行い、次に目的の蛋白質をおよそｐＨ２〜５のｐｉ範囲
の緩衝液、例えばグリシンＭ衝液、又は異る組成のｐ＋
＋グラジェント、又は塩溶液、例えば濃ＮＩ１．ＳＣＮ
溶液により溶出する。

この発明の蛋白質の抗ウイルス性はウィルス感染に対す
る保護及びウィルス感染の治療のために有用である。特
に、この蛋白質はインフルエンザウィルス又は他の呼吸
器ウィルスの感染、ヘルペスウィルスの感染、並びに狂
犬病及び肝炎ウィルスの感染の治療のために、場合によ
っては他の抗ウィルス剤と組合わせて使用される。この
蛋白質は、場合によっては無機又は有機の固体又は液体
の医薬として許容されるキャリヤーと共に又はこれらど
の混合物として有効量の活性成分を含有する医薬調製物
の形態で適用される。

こめ発明の医薬は温血動物、例えばヒトへの、経腸、例
えば直属又は経口投与のため、そして好ましくは非経口
、例えば鼻内、筋肉内、皮下又は静脈内投与のためのも
のである。

意図される投与方法に依存して、医薬は相位投与形、例
えばアンプル、バイアル、生薬、火剤、錠剤、カプセル
、又は液体もしくは固体の鼻内スプレーであることがで
きる。

医薬として有効な投与ずべき化合物の量は温血動物、例
えばヒトの状態、例えば体重、疾患の種類及び重症度並
びに一般的状態、そしてさらに投与方法に依存し、そし
て治療にたずされる医師の評価に従って決定される。有
効量は体重１ｋｇ１日当り０．００１へ一１／１ｇのオ
ーダーである。

この発明の医薬は、通常の無機又は有機の固体又は液体
の医薬として許容される担体を、場合によっては他の医
薬として活性な化合物及び／又は助剤と共に含有する。

好丈しくは、活性成分の溶液又は懸濁液、特に等張水溶
液又は懸濁液、あるいけまた使用直前に水に溶解される
凍結乾燥物が使用される。医薬は無菌化され、そして／
又は防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶解剤、増粘剤
、浸透圧調節塩及び／又は緩衝剤を含有することができ
、そしてさらに他の蛋白留、例えばヒト血清アルブミン
又はヒト血漿調製物を含有することができる。

さらに、この発明は、前記のようにインターフェロン−
α又は−βにより誘導されたヒト蛋白質に対して特異的
なモノクローナル抗体、特に、インターフェロンにより
誘導された関連のマウス蛋白質Ｍｘと交差反応しないモ
ノクローナル抗体、及び該抗体の誘導体に関する。

この発明のモノクローナル抗体はネズミ由来のものであ
り、そして特にマウス／マウスハイブリドーマ細胞によ
り生産されるマウス抗体である。

この発明のモノクローナル抗体の例として、８８５　Ｓ
３５．８．１．８８５　Ｓ３５．１６．１．Ｉ、８８５
　Ｓ５６．５５．７゜１２゜４８．８８５　Ｓ５６．５
５．７．２＋、、２５．８８５　Ｓ５６．５５．７．２
７．５、８８５　Ｓ５６．５５．７．２７．１１．８８
５　Ｓ５６．５５．１３．８８５　Ｓ５８゜５５、＋７
、及び８８５　Ｓ５６．６７．１．５と称するネズミモ
ノクローナル抗体が挙げられる。

８８５　Ｓ３５．８．１．８８５　Ｓ５６．５５．１３
及び８８５　Ｓ５６．６７゜１５と称するモノクローナ
ル抗体及びその誘導体が好ましい。これらのモノクロー
ナル抗体は８８５゜ｓ３５．ｅｙ＋、８８５　Ｓ５６．
５５．１３及び８８５５５ｆ３．６７．１５　と称する
対応するハイブリドーマセルラインにより分泌される。

′ この発明のモノクローナル抗体の誘導体は、例えば抗体
断片、放射能ラベルされたモノクローナル抗体、及び酵
素や蛍光マーカーとモノクローナル抗体との接合体であ
る。

この発明のモノクローナル抗体の断片は、例えば、抗原
決定基に対する特異性を有する、すなわち前は記載した
ヒトインターフェロンにより誘導された蛋白質に対する
特異性を保持している、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ　’断片又
はＦ（ａｂ’）２断片である。

放射能ラベルされたモノクローナル抗体は例えば放射性
ヨウ素（＋２ｆｆ　■、＋２５　）、＋３翳）、炭素（
＋４ｃ）、硫黄（３５３）、Ｉ・リチウム（３Ｈ）等を
含有する。放射性ヨウ素によりラベルされたモノクロー
ナル抗体が好ましい。

この発明の抗体接合体は、モノクローナル抗体又はその
断片と酵素、例えばホースラディツシュパーオキシダー
ゼ、アルカリ性ボスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カ
ルボアンヒドラーゼ、アセデルコリンエステラーゼ、リ
ゾチーム、マレートデヒＦロゲナーゼ又はグルコース−
６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、蛍光マーカー、例
えばフルオレッセイン、あるいはアビジン又はビオケン
との接合体である。これらの接合体においては、抗体は
直接に又はスペーサーもしくはリンカ−基を介して酸素
又は蛍光マーカーに結合している。

この発明のモノクローナル抗体及びその誘導体はそれ自
体既知の方法により得られ、この方法は該モノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、 ａ）インビＩ・口で培養しそＬ７て培養上清からモノク
ローナル抗体を単離するか、又は ｂ）　　適当な哺乳類中でインビボ増殖せしめ、そして
該動物の体液からモノクローナル抗体を回収し、そして
、所望により、 Ｃ）得られたモノクローナル抗体をその誘導体に転換す
る、 ことを特徴とする。

工程ａ）のインビトロ培養のために適当な培地は標準的
培地、例えばダルベコ改変イーグル培地又はＲＭＭ１１
６４０培地であって、場合によっては哺乳類血清、例え
ばウシ胎児血清、又は他の増殖維持補完剤、例えば２−
アミノエタノール、インシュリン、トランスフェリン、
低密度リボプロティン、オレイン酸等、及び微量元素が
補充されているものである。モノクローナル抗体の単離
は、培養上清中に含まれる蛋白質を硫酸アンモニウム等
により沈澱せしめ、次に標準的クロマトグラフ法、例え
ばゲル濾過、イオン交換クロマ１〜クラフイー、叶＾Ｅ
セルロース上でのクロマ）・グラフィー、又は免疫アフ
ィニティークロマトグラフィーによって免疫グロブリン
を精製することにより行う。

インビＩ・口生産は多量の目的抗体を得るためのスケー
ルアップを可能にする。大規模ハイブリドーマ培養のた
めの技法は当業界においてよく知られており、そして例
えばエアーリフＩ・反応器又は連続撹拌反応器中での均
一浮遊培養、及び例えば中空繊維中、マイクロカプセル
中、アガロースマイクロビーズ」−又はセラミックカー
Ｉ〜リッジ」二での固定化又は捕捉細胞培養を包含する
。

多量の１］的とするモノクローナル抗体はまた、工程１
〕）によるハイブリドーマ細胞の増殖によっても得るこ
とができる。細胞クローンを同系明乳類に注射し、この
動物が抗体産生腫瘍を増殖せしめる．Ｉ〜３週間の後、
目的のモノクローナル抗体を前記哺乳類の体液から回収
する。例えば、Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来のハイブリド細
胞をブリスタンのごとき炭化水素で前処理されている場
合があるＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、そして１
〜２週間後これらのマウスの腹水を集める。それ自体既
知の方法により、例えば蛋白質を硫酸アンモニウム等に
より沈澱せしめ、次に標準的方法、例えばゲル沢過、イ
オン交換クロマトグラフィー、ＩＩＥ八Ｆへルロース」
−でのクロマトグラフィー、又はイムノアフィニティー
クロマトグラフィーにより免疫グロブリンを精製するこ
とにより体液から目的のモノクローナル抗体を相離する
。

前記の様にしてヒ１〜インターフェロンで誘導された蛋
白質に対する特異性を維持しているモノクローナル抗体
の断片、例えばＦａｂ、　Ｆａｈ’又はＦ（ａｂ’）２
断片は、工程ａ）又はｂ）に従って調製されたモノクロ
−→ヘル抗体から、それ自体既知の方法により、例えば
ペプシンもしくはパパインのごとき酵素による消化及び
／又は化学的還元によるジスルフィド結合の開裂により
得ることができる。

放射性ヨウ素によりラベルされたモノクローナル抗体は
当業界で知られているヨウ素化法により、例えば放射性
ヨウ化すトリウム又はヨウ化カリウム及び化学酸化剤、
例えば次亜塩素酸すｌ〜リウム、クロラミンＴ等により
、あるいは酵素的酸化剤、例えばラクトパーオキシダー
ゼ又はグルコースオキシダーゼ及びグルコースによりモ
ノクローナル抗体をラベルすることにより製造される。

この発明の放射能ラベルされたモノクローナル抗体はま
た、段階ａ）のインビトロ培養の培地に放射能ラベルさ
れた栄養素を添加することによっても製造される。この
様な放射能ラベルされた栄養素は、例えば放射性炭素（
”Ｃ）、■・リチウム（３Ｈ）、硫黄（３５Ｓ）等を含
有し、そして例えばＪ、　　（＋　４　Ｃ）−ロイシン
、Ｌ−（’Ｈ）−ロイシン又はＬ−（３５Ｓ）−メチオ
ニンである。

この発明のモノクローナル抗体の接合体は、当業界にお
いて知られている方法により、例えば工程ａ）もしくは
）〕）に従って調製されたモノクローナル抗体又は前記
の方法にｊ：り調製された断片を、カップリング剤、例
えばグルタルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ、Ｎ’−０
−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（＋ｎ−マレイミドベ
ンゾイルオキシ）−サクシンイミド、Ｎ−（３−（２’
−ピリジルジチオ〕−プロピオノキシ）−サクシンイミ
ド、Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチル−アミツブＩ−
７ピル）−カルボジイミド等の存在下で、酵素と反応せ
しめることにより得られる。アビジンとの接合体が同様
にして得られる。ビオチンとの接合体は例えばモノクロ
ーナル抗体をビオチンの活性化されたエステル、例えば
ビオチンＮ−ヒドロキシザクシンイミドエステルと反応
せしめることにより得られる。蛍光マーカーとの接合体
は、カップリング剤、例えば前に挙げたカップリング剤
の存在下で、又はイソチオシアネート、好ましくはフル
オレッセインーイソチオシアネートとの反応により調製
される。

この発明はさらに、前記のようにヒトインターフェロン
で誘導された蛋白質に対する特異性を有するモノクロー
ナル抗体を分泌することを特徴とするハイブリドーマセ
ルラインに関する。

特にこの発明は、骨髄腫細胞と７８ｋＤａの見かけ分子
鼠を有する精製されたヒトインターフェロン誘導蛋白質
により免疫感作された哺乳類のＢリンパ球とのハイブリ
ドーマであるセルラインに関する。好ましくは１．これ
らのセＪレラインはマウス骨髄腫細胞と前記蛋白質によ
り免疫感作された同系マウスのＢリンパ球とのハイブリ
ドである。

この様なセルラインの例として、８８５　Ｓ３５．８゜
１．８８５　Ｓ３５．１６．１＋、８８５　Ｓ５６．５
５．７．１．２．４８．８８５Ｓ５Ｂ、５５．７．２１
．２５．８８５　Ｓ５６．５５．７．２７．５．８８５
　Ｓ５６゜５５．７．２７．１１、８８５　Ｓ５６．５
５．１．３．８８５　Ｓ５６．５５．１．７、及び８８
５　Ｓ５６．６７．１５と称するハイブリドーマセルラ
インが挙げられる。

これらのハイブリドーマセルラインはマウス骨髄腫セル
ラインＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４と、前記の様なナマルワ細
胞からの精製されたヒトインターフェロン誘導蛋白質に
より免疫感作された１３ａｌｂ／ｃマウスの牌臓のＢリ
ンパ球とのハイブリドーマである。

これらは安定なセルラインであり対応する名称のモノク
ローナル抗体を分泌する。セルラインは培養において保
持されるか、又は液体窒素中での深冷凍結により保持さ
れそして解凍により再活性化される。

８８５　Ｓ３５．８．１．８８５　Ｓ５６．５５．１３
及び８８５　Ｓ５６．６７゜１５と称するハイブリドー
マセルラインが特に好ましく、これらはそれぞれ■−５
４５、！−５４３及び■−５４４として、パスツール研
究所（パリ）のＣｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ　　Ｎａｔｉｏ
ｎａｌｅ　　ｄｅ　　Ｃｕｆｔｕｒｅｓ　　ｄｅ　　Ｍ
ｉｃｒｏｏｒＨａｎｉｓｍｅｓに１９８６年４月９日に
寄託された。

この発明はまた、前記のインターフェロン誘導蛋白質に
対する特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するハ
イブリドーマセルラインの製造方法に関し、この方法は
適当な哺乳類を精製された蛋白質により、場合によって
は抗原キャリヤーと共に免疫感作し、この哺乳類の抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、この融合において
得られたハイブリド細胞をクローン化し、そして目的の
抗体を分泌する細胞クローンを選択することを特徴とす
る。

免疫感作のために好ましい動物はマウス、特にＨＲ−マ
ウスである。免疫感作は、例えば、誘導されたナマルワ
細胞からの精製された７８ｋＤａ蛋白質を含有する抗原
キャリヤー例えばニトロセルロース片を移植し、そして
さらに２μｇ〜１０μｇの該蛋白質を２〜１０回非経口
的に、例えば腹腔内及び／又は皮下に７〜３０日の間隔
で注射することにより行われる。この注射は場合によっ
てはリンパ球の生産を刺激するアシュバン１〜、例えば
完全又は不完全フロインドアジュバント及び／又はアジ
ュバン１〜ペプチドを含有する。

最終追加免疫の２〜５日後に採取した免疫感作された哺
乳類の抗体産生細胞、好ましくは牌細胞を融合促進剤の
存在下で適当なセルラインの骨髄腫細胞と融合せしめる
。幾つかの適当な骨髄腫セルラインが当業界において知
られている。酵素グアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（ＩＩＧＰＲＴ）又は酵素チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）を欠いており、それ故にヒボキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含有する選択培地（ＨＡ、Ｔ培地
）中で生存しない骨髄腫セルラインが好ましい。ＨＡＴ
培地中で生存ぜずそして免疫グロブリン又はその断片を
分泌しない骨髄腫セルライン及び誘導体セルライン、例
えばセルラインＸ６３−Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／Ｏ
−＾ｇ１４が特に好ましい。考慮される融合促進剤は例
えばセンダイウィルス又は他のパラミクソウィルス（場
合によってけＵＶで不活性化された形のもめ）、カルシ
ラノ、イオン、界面活性リピド例えばリソ１／シヂン、
又はポリエチレングリコールである。奸才しくけ、骨髄
腫細胞を、分子量１００〇−，４０００のポリエチレン
グリコール約３０〜約６０％を含有する溶液中で、免疫
感作された哺乳類からの３〜２０倍過剰のＩｌ！！ｌ＃
ｌ１１胞と融合せしめる。

ハイブリドーマ細胞の拡張のために適当な培地は標準的
培地、例えばダルベコ改変イーグル培地、最少必須培地
、ＲＰＭ１１６４０培地等であって、場合によっては、
血清、例えば１０〜１５％のウシ胎児血清が補充された
ものである。好ましくは、細胞増殖の始めにおいてフィ
ーダー細胞、例えば正常マウス腹腔滲出細胞、肺細胞、
骨髄マクロファージ等を加える。ハイブリドーマ細胞に
卓越して正常細胞が増殖するのを防止するため培地に選
択１−ｆ　Ａ、　Ｔ培地を一定間隔で補充する。

ハイプリドーマ細胞培養上清を目的のモノクローナル抗
体について好ましくは酵素イムノアッセイ、例えばドツ
ト−Ｅｌ、Ｉｓ＾アッセイ、又はラジオイムノアッセイ
によりスクリーニングする。陽性ハイブリドーマ細胞を
、例えば限界稀釈法により、選択的に２回以上クローン
化する。場合によっては、ハイブリドーマ細胞を、動物
、例えばマウスへのｉ、ｐ、注射及び原水の収得により
継代し、これによりハイブリドーマを安定化し、そして
増殖特性を改良する。

この発明のモノクローナル抗体及び／又はその誘導体は
、前記のインターフェロン誘導しｌ−蛋白質の定性的及
び定量的測定のなめに有用である。

例えば、モノクローナル抗体又はその誘導体、例えば酵
素接合体又は放射性誘導体は、この発明の蛋白質の抗原
決定基とモノクローナル抗体との間の結合相互作用に基
礎を置く既知のイムノアッセイのいずれかにおいて使用
することができる。

この様なアッセイの例としてラジオイムノアッセイ（Ｒ
，ＩＡ）、酵素イムノアッセイ、例えばエンザイム・リ
ンクド・イムノツルベン１〜・アッセイ（ＥＬＴＳ＾）
、イムノフルオレッセンス、免疫沈澱、〈８８） ラテックス凝集、及び赤血球′ａ集が挙げられる。

これらのイムノアッセイは例えば天然源又は遺伝子操作
された微生物からの目的蛋白質の生産及び精製のモニタ
ーのため、並びに例えばこの発明の蛋白質又はインター
フェロンによる治療を受けている患者又はそのような治
療を必要とする患者の生物学的流体中の蛋白質の定性的
及び定量的測定のために有用である。

この発明のモノクローナル抗体はそれ自体として、又は
放射性ラベルされた誘導体の形でラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ、）において使用することができる。ＲＴ　Ａ
の任意の既知の変法、例えば均一相ＲＴＡ、固相ｒ（Ｉ
Ａ又は不均一相Ｒ，Ｔ　Ａ、及びこの発明の蛋白質の直
接又は間接（競争的）測定のためのシングルＲ丁Ａ又は
ダブｌしくサンドイッチ）ＲＩＡを使用することができ
る。サンドイッチＲＴ　Ａが好才しく、この方法におい
てはキャリヤー、例えばポリスチレン、ポリプロピレン
又はポリ塩化ビニルのミクロタイタープレー１・又は試
験管のプラスチック表面、ガラス又はプラスチックのビ
ーズ、濾紙、あるいはデキストラン、酢酸セルロース又
はニトロセルロースのシー１〜等が単純吸着又は例えば
グルタルアルデヒドもしくは臭化シアンにＪ：るキャリ
ヤーの活性化グ）後に本発明のモノクローナル抗体によ
りコートされ、そして試験溶液及び１２５Ｔで放射性ラ
ベルされたモノクローナル抗体の溶液、すなわちキャリ
ヤーに結合したモノクローナル抗体とは異る、この発明
の蛋白質の他のエピトープを認識する溶解したモノクロ
ーナル抗体と共にインキュベートシ、そしてキャリヤー
に結合した放射能を測定することによりこの発明の蛋白
質の量を決定する。

前記のサンドイッチラジオイムノアッセイが特に好まし
く、この方法においてはこの発明のモノクローナル抗体
をビーズ、例えばポリスチレンビーズに結合せしめ１．
二のコーＩ・されたビーズをインターフェロン誘導−ヒ
１〜蛋白質を含有する標準溶液又は試験溶液中でインキ
ュベートし、そしてＲ後に異るエピト−プを認識する放
射性ラベルされたモノクローナル抗体により発色せしめ
る。

この発明のモノクローナル抗体はそれ自体として、又は
酵素接合誘導体の形態で酵素イムノアッセイにおいて使
用することができる。この様なイムノアッセイには、こ
の発明の酵素ラベルされたモノクローナル抗体誘導体、
又はこの発明の抗体のエビＩ−−ブを認識しそれに結合
するそれ自体既知の酵素ラベルされた抗体を使用する方
法が含まれる。

ＥＬＩＳ＾（エンザイム・リンクド・イムノソルベント
・アッセイ）が好ましく、この方法においてはＲＩＡに
ついて前記したキャリヤーがこの発明のモノクローナル
抗体でコーＩ・され、インターフェロン誘導ヒト蛋白質
を含有する試験溶液と共にインキュベートされ、そして
次にこの蛋白質に対するポリクローナル血清、例えばヒ
ツジ血清と共にインキュベートされ、そして最後にこの
ポリクローナル血清の結合した抗体がこれらを認識しそ
してこれらに結合する酵素ラベルされた抗体により顕現
され、そして結合した蛋白質の量が酵素基質反応により
決定される。この様な酵素ラベルされた抗体は例えばホ
スファターゼブラベルされたりギー抗ヒツジ免疫グロブ
リンである。

さらに、他のＩ：ＬｒＳ＾も好ましく、この方法におい
てはこの発明のモノクローナル抗体でコートされたキャ
リヤーを試験溶液及び酵素と接合したモノクローナル抗
体の溶液、すなわちキャリヤーに結合したモノクローナ
ル抗体ではなくインターフェロン誘導−ヒト蛋白質力他
のエピト−プを認識する溶解したモノクローナル抗体と
共にインキュベートする。他の変化をもたらしそして肉
眼により又は光学測定装置により観察することができる
酵素基質反応により、試験溶液中の蛋白質の量と比例す
る結合した酵素の量を測定する。

イムノブロワ１〜分析と呼ばれる酵素イムノアッセイが
特に好ましく、この方法においてはインターフェロン誘
導−ヒト蛋白質を含有する試験溶液又は標準溶液がポリ
ペプチドに対する強い親和性を有するミクロポーラスキ
ャリヤー、例えば二ｌ〜ロセルロース上にスポットされ
、このザンプルの１個又は複数個のドツトを担持するキ
ャリヤーがこの発明のモノクローナル抗体溶液中でイン
キュベ−１・され、次にこの発明のモノクローナル抗体
を認識しそして結合する酵素ラベルされた第二抗体の溶
液中でインキュベーＩ・され、そして最後に検出可能な
シグナル、例えば着色された物質をもならす酵素基質の
溶液中でインキュベーｌ〜される。

この様な酵素ラベルされた第二抗体は例えば、ホースラ
ディツシュパーオキシダーゼと接合したラビット抗マウ
ス免疫グロブリンであって、これを適当な酵素基質、例
えば４−クロロ−１−ナフト−ル等により発色せしめる
ことができる。

この発明のモノクローナル抗体はそれ自体として又は蛍
光マーカーと接合した誘導体の形で蛍光抗体試験法にお
いて使用することができる。このような蛍光抗体試験法
は、この発明のモノクローナル抗体の誘導体、例えばフ
ルオレッセインと接合した誘導体、又はこの発明のモノ
クローナル抗体のエビ１〜−ブを認識しそして結合する
それ自体既知の蛍光マーカーラベルされた抗体を使用す
る方法を包含する。

次の様な蛍光抗体法が好ましく、この方法においてはＲ
，Ｔ　Ａについて記載したようなキャリヤーを標準的方
法に従って、この発明の蛋白質の存在について試験され
るべき細胞によりコー１〜し、該細胞を固定し、そして
細胞内の蛋白質性物質と適用された溶液との相互作用を
許容する様に透過性にし、そして蛍光マーカーと接合し
たこの発明のモノクローナル抗体誘導体の溶液と共にイ
ンキュベーｌ〜するか、又はこの発明のモノクローナル
抗体の溶液とインキュベ−１−Ｌ次にこの発明のモノク
ローナル抗体を認識しそして結合する蛍光マーカーによ
りラベルされた第二抗体、例えばフルオレッセインでラ
ベルされたラビット抗マウス免疫グロブリンの溶液と共
にインキュベ−１・する。次に、標準的蛍光顕微鏡法又
はフローサイトメトリーによりこの発明の蛋白質の存在
を検出しそして該蛋白質の位置を決定する。

この発明のモノクローナル抗体はそれ自体として、又は
放射性ラベルされた誘導体の形態で免疫沈澱試験におい
て使用することができる。次の免疫沈澱試験が好ましく
、この方法においては、この発明の蛋白質を生産する能
力について試験されるべき細胞を、放射性ラベルされた
栄養素、例えば放射性炭素（＋４ｃ）、トリチウム（’
！−１）、硫黄（３５Ｓ）等によりラベルされた栄養素
、例えば（ｉｓＳ）−メチオニンを含有する培地中で増
殖せしめ、次に細胞溶解して該細胞によって生産された
放射性ラベルされた蛋白質性材料の溶液を得る。

この溶液をこの発明のモノクローナル抗体の溶液と共に
インキュベートし、細胞中で生成した放射性ラベルされ
た蛋白質とこの発明のモノクローナル抗体との間のずべ
ての複合体を沈澱せしめるか、あるいは好ましくは、こ
の発明のモノクローナル抗体に対する高い親和性を有す
るアフィニティークロマトグラフィー材料、例えばプロ
ティンＡと連結されたクロマトグラフィー材料」二に、
又はこの発明のモノクローナル抗体を認識しそして結合
する抗体、例えばラビット抗−マウス免疫グロブリンに
吸着せしめ、そして蛋白質／抗体複合体を該沈澱又はア
フィニティークロマトグラフィー材利から単離する。次
に放射性ラベルされた蛋白質の存在を通常の分析法、例
えばフルオログラフィーを伴うＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により、蛋白質／抗体複合体が解離する
条件下で確認する。

ヒトインターフェロンで誘導された蛋白質の定性的及び
定量的測定のための、前記のモノクローナル抗体及びそ
の誘導体のこの発明に従う使用はまた、それ自体既知の
他のイムノアッセイ、例えば抗体又は抗原がコーｌ〜さ
れたラテックス粒子を用いるラテックス凝集法、あるい
は抗原又は抗体がコートされた赤血球を用いる血球凝集
法等を含む。

この発明はまた、７８ｋＤａの見かけ分子量を有するヒ
トインターフェロン誘導蛋白質の定性的及び定量的測定
のための試験キラＩ・に関し、このキットはこの発明の
モノクローナル抗体及び／又はその誘導体、並びに場合
によっては他のモノクローナル抗体もしくはポリクロー
ナル抗体及び／又は補助材を含む。

ラジオイムノアッセイのためのこの発明のキットは、例
えば、この発明のモノクローナル抗体によりコーＩ・さ
れているか又はコートされていない適当な担体、この発
明の蛋白質に対するモノクローナル抗体もしくはポリク
ローナル抗体及び／又は放射性ラベルされたそれらの誘
導体の場合によっては凍結乾燥されているか又は濃縮さ
れている溶液、この蛋白質の標準溶液、緩衝液、並びに
場合によっては非特異的吸着及び凝集の形成を防止する
ための洗剤及びポリペプチド、ピペツＩ・、反応容器、
換算曲線、指示書等を含む。

酵素イムノアッセイのためのこの発明のキットは、例え
ば、適当なキャリヤー、例えばミクロタイタープレート
又はニトロセルロースシー１〜、この発明の蛋白質に対
するモノクローナル抗体の及びこの蛋白質に対する又は
この蛋白質を認識する第一抗体に対する酵素ラベルされ
たモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の場合に
よっては凍結乾燥されているか又は濃縮されている溶液
、固体又は溶解した形態の酵素基買、この発明の蛋白質
の標準溶液、緩衝液、並びに場合によっては、ポリペプ
チド及び洗剤、ピペツｌ−１反応容器、換算曲線、色ス
ケール表、指示書等を含む。

蛍光抗体試験のためのこの発明の試験キットは、例えば
、適当な担体、例えばプラスチックカバースリップ又は
ガラススライド、この発明の蛋白質に対するモノクロー
ナル抗体の及び該モノクローナル抗体を認識するフルオ
レッセインでラベルされたポリクローナル抗体の場合に
よっては凍結乾燥されているか又は濃縮されている溶液
、緩衝液、並びに場合によってはこの発明の蛋白質を含
有する標準溶液、ポリペプチド及び洗剤、ピペツｌ〜、
反応容器、指示書等を含む。

免疫沈澱試験のためのこの発明の試験キットは、例えば
、適当なキャリヤー、例えばプラスチック又はガラスの
プレート、この発明の蛋白質に対するモノクローナル抗
体の場合によっては凍結乾燥されているか又は濃縮され
ている溶液、放射性ラベルされた栄養素、例えば３９３
−メチオニンの溶液、組織培養溶液、緩衝液、インター
フェロン−α又は−βの場合によっては凍結乾燥されて
いるか又は濃縮されている溶液、並びに場合に、１：っ
では、この発明の蛋白質を含有する標準溶液、抗原／抗
体複合体中のモノクローナル抗体と結合するアフィニテ
ィークロマトグラフィー材料、洗剤及びポリペプチド、
ピペット、反応容器、指示書等を含む。

この発明のモノクローナル抗体及び抗体誘導体は、イン
ターフェロン−α又は−βに、Ｊ：り誘導されたヒト７
８ｋＤａ蛋白質の定性的及び定量的測定のために、好ま
しくは酵素イムノアッセイ、蛍光抗体試験又は免疫沈澱
試験において使用される。

生物学的流体、組織切片及び細胞中のヒト７８ｋＤａ蛋
白質の址の確実な決定は、ヒト７８ｋＤａ蛋白質を用い
る療法の又はインターフェロン−αもしくは−βを用い
る療法の簡単な監視を可能にする。

さらに、モノクローナル抗体及び抗体誘導体は、天然源
又は組換宿主細胞からめイムノアフィニティークロマト
グラフィーによるヒト７８ｋＤａ蛋白質の単離及び精製
において使用することができる。

次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明するが、
これによりこの発明の範囲を限定するもめではない。

例において使用される略号は次の意味を有する。

＾ＴＩ’　　　アデノシン三リン酸 ＢＳ＾　　ウシ血清アルブミン ｃＤＮ＾　　相補的ＤＮＡ ｃｐｍ　　　カランｌ−／分（放射能崩Ｊ１りｄ＾　　
　２′−デオキシアデノシン ｄＡＴＰ２’−デオキシアデノシン三リン酸ｄＣ２’−
デオキシシチジン ｄＣＴＰ　　　２’−デオキシシチジン三リン酸ｄＧ　
　　　２′−デオキシグアノシンｄＧＴＰ　　　２’−
デオキシグアノシン三リン酸ＤＮＡ　　デオキシリボヌ
クレオヂド ｄＮＴＰｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの
混合物ｄｓ　ＤＮＡ　　二本鎖ＤＮＡ ｄＴ　　　　（２’−デオキシ）チミジンｄＴＴＰ　　
　チミジン三リン酸 （＋００） Ｆ．Ｉ］Ｔ＾　　エチレンジアミン四醇酸ＦＣ５ウシ胎
児血清 １１＾Ｔ　　ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミ〜
ジン ＩＦＮ−インターフェロン ｋＤａ　　　キロダルＩ・ン（分子量）ｍＲＮ＾　　メ
ツセンジャーＲ，Ｎ　Ａｐｒｙｓ　　　リン酸緩衝化塩
溶液 ＲＮ＾　　　リボ核酸 ｒｐｍ　　　１分間当り回転数 ＳＤＳ　　　ドデシルｔｌａ酸ナトリウムＴＤＳ　　　
Ｔｒｉｓ緩衝液 Ｔｒｉｓ　　　Ｉ□リス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タンｔＲＮＡ　　　ｔ□ランスファーＲ，Ｎ　Ａ　。

次の緩衝液及び培地を使用する。

デンハート溶液　　０．１％ポリビニルピロリドン（Ｐ
ＶＰ−３６０、シグマ）。

０．１％フィコール４００（ファル マシア）、０．１％ＢＳ＾。

低張Ｍ衝液　　　　５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−１１ｃｌ（ｐ
Ｈ７，４）　。

（１，０１） １、．５ｍＭ　Ｋ（Ｊ！　。

２．５悄Ｍ　ＨｇＣｌ２゜ １、Ｂ培地　　　　　　１％バクト＠トリプＩ・ン（デ
ィフコ）、０．５％バクト０酵 母エキス（ディフコ）　、　１７０ｍＭＮａＣ（１、Ｎ
ａ０ＦＩによりｐＨ７，５に調整。

連結緩衝液　　　　５０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ　１Ｉｃ１（
ｐＨ８）　。

７　ｍＭ　ＭＨＣｔ！２．１．　ｍ１４ジチオスレイト
ール。

マングビーンヌク　３０ｍＭ　ＮａＯ＾ｃ（ｐ！（５）
　、　５０ｍＭレアーゼ緩衝液　　ＮａＣ１、１ｍＭ　
ＺｎＣｌ２゜５％グリセロール。

ＰＢＳ　　　　　　　　　１．３６ｍＭ　Ｎａ（Ｊ　、
　２ｍＭ　ＫＣＩ　。

８ｍＭ　Ｎ１１２１１ＰＯ４。

１、．４．ｍＨＫｔ１２ＰＯ４゜ ＳＳＣＭ衝液　　　　　１５吐クエン酸すトリウム。

１．５０ｍＭ　Ｎａ１ｌ！　、　Ｎａ０ｔｌにてｐｌ＋
７．０に調整。

ＴＢＳ　　　　　　　　　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ｔｌ
ｃ／（ｒ＋Ｈ７，６）。

０．１５Ｍ　ＮａＣ４’。

ＴＥ緩衝液　　　　　］Ｏｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ　・ＩＩｃ
Ｉ（ｐＨ７、５）　。

］、ｍＭ　　Ｅｌ）Ｔ八。

例し　イガ−ニー！≦（咲ζよ一タブーマールー７−細
胞の誘−導− １，１，欠四ｊＱ〔乙 ナマルワ細胞＾ＴＣＣＣＲ１，１４３２を、２ｇ／Ｖの
Ｎａ１ｌＣＯ：＋　、　１．０５ユニット／！のペニシ
リン、１００ｍＢ／（ｌのストレプトマイシン及び１０
％の不活性化ＦＣ８（５６℃にて３０分間インギュベー
シコン）を補充されたＲＰＨ＋１６４０培地中で１１の
スピンナーフラスコ（ベルコ）中浮遊培養に、Ｊ：り培
養する。

細胞を５Ｘ１（’）５細胞／ｍｌの濃度で接種し、そし
て濃度が２０×１０５細胞／社（１週間に約３倍）に達
した時に前培養どする。

１・２．　　イーとｊケ−１７−舌」７−ンー７、、−
ｃ＜−はＪ辷ろｌ丙−導−２１の培地にナマルワ細胞を
５×１０５１＋ＩＩＩ胞／ｍｅの濃度に接種する。これ
を３４のスピンナーフラスコ中で３７℃にて３日間培養
する。指数増殖の終点において細胞の濃度が２〜３×１
０６細胞／ｍｌに達する。細胞を８００Ｘ、にて３０分
間遠心分離し、次に２４の培地に再懸濁し、そして３７
°Ｃにて６時間インキュベー１〜する。インターフェロ
ン５．（ＥＰ−八７６４８９に従って調製されたα／Ｂ
タイプ）を５０００国際単位／ｍｌの最終濃度に加え、
そして培養物を３７℃にて２０時間さらにインキュベ−
１・する。

Ｌユ１．細」Ｌの一収得一 細胞を１．ｏｏｏｘＨにて３０分間遠心する。細胞ペレ
ットをＰＢＳで洗浄する。細胞を８００　Ｘ　ｇにて１
０分間遠心し、そしてペレットを低張緩衝液中に懸濁す
る。細胞を８００　Ｘ　ｇにて１０分間遠心し、そして
ペレットをドライアイス上で迅速に凍結し、そして−２
０℃に保持する。

例λ、　Ｔ凡りａ　ｉ−白一質一の連部〃二精Ｉ−２，
１，近日−質−Ｃ抽−出− 例１の解凍された細胞を、５０　＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ　−
１１（Ｊ！（Ｐ１１７．４）及び４．ＭＮａＣβを含有
する緩衝液２００ｍｆにＪ：す２０℃にて＃Ｉ胞溶解せ
しめる。この溶解物を８０．０００ｘＨにて１時間の超
遠心分離により透明にする。ＩＦＮにより誘導された蛋
白質は一１１清中に存在する。この上清にＶｉ酸アンモ
ニウムを徐々に加えて最終濃度３０％にする。蛋白質を
２０°Ｃにて１時間沈澱せしめる。ＴＦＮで誘導された
蛋白質を含有する沈澱を３０００　ｘ　ｇにて１５分間
遠心分部し、次に５　（’）ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃ１
（ｐＨ１８）　、１５０＋ｎＭメルカプトエタノール及
び２％ＮＰ−４０を含有するＭｌ液３ｖａｌ中に懸濁す
る。懸濁液を同じ緩衝液に対して十分に透析する。ＩＦ
Ｎで誘導された蛋白質のほとんどが不溶性のま才である
。

ζス、　分ＩＬＩＬゲ１に電車ｊ永動−不溶性蛋白雪を
遠心分離し、そしてサンプル緩衝液（ｌＪ、に、Ｉ、ａ
ｅｍｍｌｉ及びＭ　、　Ｆｏｖｒｅ　、　、１．ｔ４ｏ
４−４ｊｉｏｊ−。

ｄｃＬ、　５７５（１９７３＞　〕中に溶解する。スラ
ブゲル（厚さ１．５１、長さ１１０ｍｍ＞をＬａｅｍｍ
ｌｉ及びＦａｖｒｅにより記載された様にして調製する
。分離ゲルは１２％のアクリルアミド及び０．３２％の
ビス−アクリルアミドを含有する。電気泳動の終りにお
いてゲルを水冷した０、２５ｍＭ　ＫＣｉ’に浸漬する
ことによって可視化する。７０ｋＤａ〜８５ｋＤａの間
の分子量を有する蛋白貫を含有するゲル片を切り出す。

このゲルを水により十分に洗浄し、５０ｍＭＮ−エチル
モルポリニウムアセテ−７・（ｐＨ８，５＞及び０．１
％ＳＤＳを含む溶液により平衡化する。最後にゲルを２
Ｍ尿素、５０ｍＭＮ−エチルモルポリニウムアセテ−１
〜（ｐ！１８．５）、２％５ｒ）Ｓ及び５０ｍＭジヂオ
スＩ／イＩ・−ルを含有する溶液中で＃ｌｌ断し、そし
てこの混合物を３７℃にて１時間インキュベー１・する
。

４μｓ−１タフ１ｚ力）ｈ深」し白１［の電気迫−析＝
ＩＳＣＯサンプル濃縮器（モデル１．７５０）を用いて
、八、Ｊ、Ｂｒｏｗｎ及び、１．Ｃ，Ｂｅｎｎｅｔ、ｔ
　Ｉ：Ｍｅｔｌ＋ｏｄｓ　ｉｎ−Ｆ、ｎｚｙ−靭」邦ｙ
、吐、　４５０　（１９８３）　）に記載されている様
にしてゲル片から蛋白質を溶出する。０．０１％ＳＤＳ
及び１．ｍＭジチオスレイＩ・−ルを含有するＮ−エチ
ルモルホリニウムアセテ−１□　（ｐＨ８，５）溶液を
Ｍ衝液として濃縮器タンクの外室（０，１Ｍ）及び内室
（０，０５Ｍ）に使用する。溶出された蛋白質を５容量
のアセトンで沈澱せしめる。　以下余白（１０Ｂ） ２．４．　４７−史アク已〜レアミ町池に電−気泳勉（
３−る一二３次ｊ１で）と妓〃ｌ青１娼 Ｐ、２．０　’Ｆａｒｒｅｌ　Ｉ等〔Ｃμ其＋２　、　
ｊ−１３３−（１９７７）：）により記載されている様
にして、非平衡ｐｌ＋グラジェント電気泳動（ＮＥＰＩ
ＩＧＥ）と５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と
を組合わせた二次元系を用いる。

アセトン沈澱く例２．３）の蛋白質をパ溶解緩衝液へ”
〔Ｐ、１１．Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ　　　、　　シ、Ｂｉ
≧ｏ　ｌ　、　　Ｃ！！朋ユ２−５Ｑ　。

４００７（１９７５）　：ｌｌ中に溶解し、そして２％
の両性電解質（ａｌ１３〜１０）を含有する非平衡ｐｌ
＋グラジェント電気泳動ゲルの酸性末端に適用する。５
００Ｖにて５時間電気泳動を行う。第二次元におけるス
ラブゲル電気泳動のための分離ゲルは１２％のアクリル
アミド及び０，３２％のビス−アクリルアミドを含有す
る。ゲルを水冷した０、２５Ｍ　ＫＣｌに浸漬すること
により蛋白質を可視化する。ＴＦＮで誘導された蛋白質
を含有するゲル片（他の蛋白質を含有しない単一スポッ
ト）を切り出し、そして例２．３に記載した電気透析の
ために処理する。精製された蛋白質を５容量のアセトン
により沈澱せしめる。

例−影　精１し１れた７８に−Ｄａ蛋子１１の特−魯什
十九灯 精製された蛋白質を通常の方法で１２％ポリアクリルア
ミドゲル上で一次元ゲル電気泳動により分析する。バン
ドをクマツシーブルーＧ−２５０により染色する。並行
して泳動せしめた分子１．マーカー（ビオ−ラドより）
はりゾチーム（１，４ｋＤａ）、大豆１〜リプシンイン
ヒビター（２１，５ｋＤａ　）　、カルボニックアンヒ
ドラーゼ（３１，ｋＤａ）、オバルブミン（４５ｋＤａ
）、ウシ血清アルブミン（６６，２ｋＤａ）、及びホス
ホリダーゼＢ　（９２，５ｋＤａ　）である。精製され
たＩＬＮ−誘導蛋白質はこのタイプの分析において均一
であり、そして分子量約７８ｋＤａの蛋白質として泳動
する。

Ｐ．ＩＬＯ’Ｆａｒｒｅｌ　ｌ　ＣＪ、Ｂｉｏｊ　、Ｃ
ｈｅｍ、　、　２５ｆｌ、　４００７（１９７５）　）
により記載された系において決定した場合、ＴＦＮ−誘
導蛋白質の等電点は６，３である。

３．２．　　シ末一端アユミ又酸配列−，１，Ｙ、Ｃｈ
ａｎｇ等（Ｂｉｏｃｈ、ｅｍＪユ、　２且、　１．７３
（１９８３）　）により記載されている方法でベックマ
ンシーケンサ−において、３２μｇの蛋白質をアミノ酸
配列分析にかける。

次のアミノ酸配列： Ｖａｔ−Ｖａｔ−Ｘ、−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−＾５ｐ−Ｔｌ
ｅ−＾１ａ−［、ｙｓ−Δ１ａ−Ｐｒｏ−１、ｙｓ−＾
１ａ が見出される。第３アミノ酸は同定することができなか
った。

３．３．　　衾γ−Ｓ／隨組成５ ．１．Ｙ、Ｃｈａｎｇ、　Ｒ，Ｋｎｅｃｈｔ及びり、Ｇ
、Ｂｒａｕｎ　［Ｍ−ｅ倶！組辷ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏ（Ｈｙ−、Ｖｏ１９１　、４ｌ−４８（１９８３）　
）の方法に従って全アミノ酸組成を決定する。要約すれ
ば、蛋白質を６ＭＩＩ（Ｊ！により加水分解し、炭酸水
素すトリウム緩衝液中４′−ジメチルアミノ−アゾベン
ゼン−４−スルホニルクロリドにより誘導体にし、そし
てＺｏｒｂａｘ−ＯＤＳ高速高速液体クロマトラグラフ
イーＩＰＬｃ）カラムに注入する。各アミノ酸の量を標
準サンプルと比較して決定する。結果を第１表に（１，
０９） 例４．り乙久−入Ｌｌ乙交遁導た扛た細引鴨−＠ヒト胎
児包皮二倍体細胞（Ｆ１０…Ｎ０１７０００）を、直径
１４ｃｎ＋のプラスチック皿中、２ｇ／（ｌのＮａ１ｌ
ＣＯ３゜１０５ユニツト／ｌのペニシリン、１．ｏｏｍ
ｇ／Ｎのストレプトマイシン及び１０％の不活性化ＦＣ
８（５６℃にて３０分間不活性化）を補充されたエール
（Ｅａｒｌ）最少必須培地中で培養する。コンフルエン
ト細胞モルレーヤーを１へリプシン／Ｅｌ’）ＴＡ溶液
（ギブコ）中１；３のスブリツＩ・比で前培養する。

コンフルエント細胞モルレーヤーを、１０００国際単位
／ｍｔ！の最終濃度で組換インターフェロン５、（ＥＰ
−＾７６４８９に従って調製されたα／βタイプ）を含
有する新鮮な培地中で３７℃にて４．５時間インキュベ
ー１〜する。

４・２・　柩胞ｌ上下−Ｎの苛ｌ− 例４．１゜の細胞モルレーヤーをＰＢＳにより４℃にて
洗浄し、そして低張緩衝液中で４℃にて２分間インキュ
ベ−１・する．Ｉ％のデオキシコレート及び１％のＮＰ
−４０を含有する低張Ｍ衝液により４°Ｃにて５分間細
胞溶解することにより細胞質抽出物を得る。この抽出物
を２５，０ＯＯＸ＠にて５分間遠心する。この上清（４
５ｍｌ）に１６ＢのブロテイナーゼＫ、７２０ｍｇのＮ
ａｃｌ、］、８８ｍのＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＪ！（
ｐ１１７．４＞及び６．８ｍ１２の１０％ＳＤＳを加え
る。この混合物を２０°Ｃにて４時間保持する。０．Ｉ
ＭＴｒｉｓ−ｔｌｃＲ（ｐＨ９）及び０．１％のオキシ
キノリンの溶液により飽和されたフェノールによりＲＮ
Ａを３回抽出する。水相にＮａＣｊ！を添加しく最終濃
度０．１ＭＬそして一２０℃にて２容量のエタノールに
よりＲＮＡを沈澱せしめる。

４．３．　　金＆町Ｎの１！旧ケ精１ ５０％のホルムアミド中例４．２の２ｍｇのＲＮＡを、
５ｍＭＥＤＴ＾、０．０１　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　
（ｐＨ７，５＞、０．２％ＳＤＳ、０．０５Ｍ　ＮａＣ
＆及び５０％ホルムアミド中直線的５−２０％シューク
ロースグラジェント士。

に重層する。グラジエンＩ・をベックマン５１４４］Ｔ
ｉローター中で、２０℃にて１６時間４０．００Ｏｒｐ
ｍて遠心する．Ｉｍｌの両分を集め、０．１Ｍ　ＮａＣ
１とし、そして２容積のエタノールによりＲＮＡを沈澱
せしめる。各両分のＲ，Ｎ　Ａのアリコートを網状赤血
球無細胞系（アメルシャム・インターナショナルＮｏ、
Ｎ９０）中で製造者の指示に従って翻訳する。インビト
ロで合成されそして３５Ｓ−メチオニンでラベルされた
蛋白質を二次元のポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分離し、そしてフルオログラフィーにより検出する。

７８ｋＤａａ見かけ分子量を有するＴＦＮ−誘導蛋白質
のｍＲＮＡ　により指令される合成が沈降値１８Ｓ〜２
８Ｓの画分８及び９に再現性よく見られる。画分８及び
９のポリ（Ａ）ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース」
−でのクロマトグラフィーにより精製する。

ＶＡ５．（ト）ルリ／ブラーｙ二の一１仄仄μ升＝式乙
乙 例４，３．の精製されたｍＲＮＡ　から、Ｕ、Ｇｕｂｌ
ｅｒ及びＢ、Ｊ．Ｉ１ｏｆ　ｆｍａｎ　、　釦！Ｆｅ　
、　２５　、２６３−２０９（１，９８３）の方法に幾
分変更を加えて、ｃＤＮＡ　　ライブラリーを調製した
。

第−鎖ｃＤＮＡの合成のため、画分８及び９の精製され
たポリ（Ａ）ｍＲＮＡ（例４．３．１５０７ｔ　Ｂ／　
ｍｅ）を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＦ　（ｐＨ１８
，３＞、］、　ＯｍＭ　ＭｇＣＬ、１、ＯｍＭジチオス
レイＩ・−ル、１．２５ｍＭの各ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ及
びｄＴＴＰ、０．５ｍＭ　ｄｃＴＰ、２０．４ｚＣｉの
α−３２ｐ−ｄＣＴＰ（約３０００Ｃｉ／　ｍｍｏｌ）
並びに１００μｇ／ｍ／のオリゴ（ｄＴ＋ｚ−１ｓ）を
含む２０〜４０μｌの容量中で、１・り骨髄芽球症ウィ
ルスからの“’５ｕｐｅｒ’″逆転写酵素（アングリア
ンーバイオテクノロジーステヘリン）３０００ユニット
／ｒｎ１と共に４３℃にて３０分間インキュベートする
。ＥＴＩＴ＾の添加により反応を停止し、生成物をフェ
ノールで抽出しそしてエタノールで沈澱せしめる。第二
鎖の合成のため、単鎖ｃＤＮＡ　（５００μｇ）を、２
０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｎ（ｐＨ７，５）、５ｍＭＨ
ｇＣ１２，１０ｍＨ（Ｎ１１−）２ＳＯ４，１００ｍＭ
　ＫＣ＆’、０　、１５ｍＭβ−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド、５０ｉｔｇ／ｍ（ＩＢｓＡ及び４０
ｍＭの各ｄＮＴＰを含有する１００１１１の容量中で８
．５ユニツト／ｌ１ｌ（ｌのＥ、コリＲＮアーゼ、２３
０ユニット／社のＤＮＡポリメラーゼ■及び１０ユニツ
ト／ｌｎ１のＴ４　　ＤＮＡリガ−ゼと共に、１４℃に
て一夜インキュベー１・する。

ｄｓｃＤＮＡを１−記の様にして単離する。

ｄｓ　ｃＤＮＡ（４０μＩ中１．ＯＯｎｇ）をｄＣＴ　
Ｐ　（０，９ｍＭ）により、２００ｍＭカコジル酸カリ
ウム（，１１６，９）、］、ｍＭＣｏＣｆ２及び５岡／
社ＢＳＡ内で３０ユニツトのターミナルトランスフェラ
ーゼを用いて３７℃にて６０分間テイル形成し、次に熱
失活せしめる。このｄｃ−テイルｃＤＮＡをｄＧ−テイ
ル化ＰｓｔＩ切１１ＴｒｐｒｌＲ３２２（Ｂ　ＲＬ　）
に、５０ノ１１のＴＥＭ衝液／　Ｏ、］−５ＭＮａＣ１
中で０．５）ｔｇ／ｍｌの合計ＤＮＡ濃度において５８
°Ｃにて９０分間アニールせしめる。このベクターによ
りＣａＣｌ２処理されたＥ、コリＭＣ１０６１を形質転
換する。細胞を、Ｄ、１Ｉａｎａｈａｎ及びＨ，Ｍｅｓ
ｅｌｓｏｎ〔１旦４１値戸吐、　、　１００　、３３３
−３４２　（１９８３）　：］により記載された様にし
て、寒天プレート上におかれた二Ｉ〜口セルロースフィ
ルター−Ｆに高濃度でプレー１−　Ｌ、そして取扱う。

例３，２．の既知の部分的アミノ酸配列、ずなわちＧｌ
ｕ−Ｖａｌ−へ５ｐ−ｒｌｅ−＾１ａ−Ｌｙｓ−八１ａ
に基いてオリゴデオキシヌクレオチドの混合物を調製す
る。次の組成：　５’−ＧＣＹＴＴＩＧＣＱＡＴＲＴＣ
ＩＡＣＹＴＣ−３′（式中、Ａ、Ｔ、Ｇ、（’：及び丁
はそれぞれアデノシン、チミジン、グアノシン、シトシ
ン、及びイノシンを表わし、Ｙ及びＲはそれぞれピリミ
ジン（Ｔ、Ｃ）及びプリン（Ａ、Ｇ）を表わし、そして
ＱはＡ、Ｇ及びＴを表わす〕をＩｋｅ等、ｔ４ｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃｊ旦Ｒ翳ｑｑ、ｒｃｊ　。

ｊｉ　、　４７７　（１９８３）の方法に従って合成す
る。これらのオリゴデオキシヌクレオチドの５′末端を
γ−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（５０００Ｃｉ／ｍｍｏ１）及び
ポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア）を用いて２
〜５×１１０１１ｃｐ／ｚｚｇに、標準的方法（Ｔ、　
Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＥＦ。

Ｆｒ１ｔ、ｓｃｈ及びＪ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　、　”Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

ａ　！ａｂｏｒａ１．ｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ”、コール
ドスプリングハーバ−ラボラトリ−１１９８２）に従っ
て放射性にする。

ｃＤＮＡ　ライブラリーの細菌り１コーンの２枚のレプ
リカを１１　ａ　ｎ　ａ　ｈ　ａ　ｎ及びＭｅｓｅｌｓ
ｏｎ（前記に引用文）の方法に従って６ｘＳＳＣ，５Ｘ
デンハーＩ〜溶液、２５０１１ｇ／ｍｆ（７）ｔＲ，Ｎ
Ａ、５０−’−ニッｌ□　７ｍ（！　ノヘハリン及び０
．１％のＳＤＳを含有する媒体中で４７°Ｃにて上記の
ヌクレオチド混合物とハイブリダイズせしめる。ハイブ
リダイゼーションの後、フィルターを６ＸＳＳＣ及び０
．５％のＳＤＳを含有する溶液中で２０℃にて２０分間
ずつ４回及び４７℃にて５分間洗浄する。

約８５０塩基対の挿入部を有するＤＮＡプラスミドを含
有するクローンＢ１，１がオリゴヌクレオヂドとハイブ
リダイズすることが見出され、これを１５ｇｇ７ｍｌの
テＩ・ライブリーを補充されたＬＢ培地中で３７℃にて
増殖せしめる。

例６−１　　スラメ多１シ：　Ｄ　Ｎ　Ａ−９単−離１
５）１ｇ／社のテトラザイクリンが補充されたＬ　Ｂ培
地８００ｍ１に１ｍＮのクローンＢ　］、　、　］、　
（例５）を接種し、そして３７℃にて光学濃度０Ｄｓｓ
ｏ−〇、７まで（約５時間）培養する。エタノール中に
溶解した２００μ８／ｍ１のクロラムフェニコールを加
え、そして培養を３７℃にて一夜続ける。この混合物を
０°Ｃにて２０分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、細菌
ペレッ１〜を３６ｍ１のＴＥ緩衝液中に懸濁し、そして
５Ｓ３４チユーブに移す。懸濁液を０℃にて５分間５０
００ｒｐｍで遠心する。ペレットを７．２＋ｎＮの２５
％シュークロース／　５０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ’
　ｂ＋ＩＩ７．５）中に再懸濁し、０．７５ｍ１の新し
く調製したりゾヂーム（２５０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ−１１
ＣＩ、ｐ　Ｈ７，５中１−　Ｏｔａｇ／　ｍｌ）で処理
し、そし手水上で５分間インキュベー■・する。３．０
ｍｌの０．２５Ｍ　ＥＩ′ｌＴ＾（ｐＨ８，０）、及び
５分間後１．２＋ｎｊ’のトす）−ン溶液〔０，１％）
１〜リドンｘ−１００（シグマ）。

６（１ｍＨＥＤＴ＾、　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ
！　（ｐＨ８，ｏ）　：］を加え、そして０℃にて１時
間インキュベーションを続ける。混合物を５Ｓ３４遠心
器中で１８．００Ｏｒｐｍにて５０分間遠心分術する。

」：清を注意深くメスシリンダーに注入し、そしてＴＥ
［衝液により容量を３０ｍ１に調整する。３０ｇのＣ５
Ｃｊ！及び２．５８ｍ１２の臭化エチジウム（］、　Ｏ
ｍｇ／　ｍｌ）を加え、そして混合物を２０℃にて１６
時間４８．００ＯｒｐｍでＶＴｉ５０遠心器中で遠心分
離する。スーパーコイルＤＮＡを含む低バンドを集め、
水性ＣｓＣ１により飽和されたイソプロパツールにより
５回抽出し、そしてＴＥｇ衝液で稀釈して濁りを無くす
る。ＤＮＡをエタノールにより一２０℃にて沈澱せしめ
、そして上記のＣ３ＣＩ２グラジエンＩ・中で再度精製
する。

例″７．　　４−ｔｆｆ　Ｅ　１なシ？−ワ−７；ゲ’
　７　８−ｊＨｊｑａ　　−イー良くづ（ニー−７例４
．１、及び４．２．に従って惟離されたＴＦＮ−誘導し
１・胎児包皮細胞由来全Ｒ，Ｎ　Ａ、及びインターフェ
ロンで誘導されたかった対応する細胞由来の全ＲＮＡを
５０ｖ／ｖ％のジメチルスルホキシド及び］、Ｏ＋ｎＭ
リン酸すｌ・リウム緩衝液（ｐＨ７，０）中１Ｍグリオ
キザールにより変性し、１．１％アガロースゲル上で電
気泳動し、そＬ７てＰ、Ｓ、Ｔｈｏｍａｓ　ＣＰｐｏｃ
。

ト什赤−ａｄ、！ｉｑｊユＵＳ＾、７７、５２０＋、−
５２０５（１９８０））により記載されているのと実質
的に同様にして３ＭＮａＣ１１０，３Ｍクエン酸三ナト
リウムを用いて二ｌ−ロセルロースに移ず。二ｌ・ロセ
ルロースフィルターを８０°Ｃにて２時間真空下で加熱
し、５ＸＳＳＣ１５０％ホルムアミドを含有する緩ｍ液
中で４２℃にて３時間前ハイブリダイズせしめ、次にデ
キストランザルフェート５００、及び上記の様にして？
−−３２Ｐ−ｄＡＴＰ　とポリヌクレオチドキナ（１，
１８） −ゼでラベルされたクローンＢｌ、１（例６）からの０
．５〜１　、０　Ｘ　１．０６ｅｐＩｌ／　ｍｌのＤＮ
Ａを含有する同しＭ衝液中で／１２℃にて２０時間ハイ
ブリダイズせしめる。フィルターを２ＸＳＳＣ１０，１
％ＳＤＳ中で２０°Ｃにて５分間ずつ４回、及び０．１
ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で５０℃にて２０分間ずつ
２回洗浄する。乾燥したフィルターをＣａｗｏ強化スク
リーンを用いてコダックＸ　Ａ、　Ｒフィルムに＝７０
℃にて６日間暴露する。

クローンＢ１，１のＤＮＡは７８ｋＤａのインターフェ
ロン誘導蛋白質をコードすると予想されるｍＲＮＡ　に
対応するサイズの約２３３のＲＮＡにハイブリダイズす
る。このｍＲ，ＮＡ　はインターフェロンで誘導された
細胞中にのみ検出される。

７．２．　１ｓ４−り］］Ｌト選−択濠−た翻訳−２０
ノｔ（ｌの水中１０μｇのクローンＢ　１．　、１（例
６）のプラスミドＤＮＡを１００℃にて１０分間加熱し
氷」二で冷却し、２０μｌ　（７）　Ｉ　Ｍ　　Ｎａ０
ｔｌで処理しそして室温にて２０分間インキュベートす
る。

ＤＮＡサンプルを１．　Ｍ　ＮａＣ１，０，３Ｍクエン
酸三すＩ・リウム、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ１及び
ＩＭＩｔ（Ｊ！の溶液２０）ｔｌにより中和し、そして
二トロセルロースフィＪレタ＝（３Ｘ６ｍ＋ｎ、ミリボ
アＩＩへ讐Ｐ）上にスボッＩ・する。このフィルターを
２０℃にて乾燥し、そして真空オーブン中で８０℃にて
２時間加熱する。フィルターをシリコン処理された１、
５ｍ１２のエッペンドルフ管に入れ、１ｍｌの水で処理
し、沸騰水浴中で１分間加熱し、そして水中で冷却する
。

水を除去し、そして０．９Ｍ　ＮａＣ（、０，２％ＳＤ
Ｓ、１ｍＭＥＤＴ＾及び２０ｍＭ　Ｐｌｒ’ＥＳ　（］
　、　］４−ピペラジンージエタンスルホン酸　ｐｌｔ
６．４）中ＴＦＮ−誘導細胞（例４．２）からの１００
７１ｇの全＋＋＋　Ｒ，Ｎ　Ａを含有する溶液５０μｌ
を加える。フィルターを３７°Ｃにて６時間一定撹拌し
ながらインキュベ−１〜し、次に５０％ポルムアミド、
２０　ｍＭ　ＮａＣ（１，８ｍＭクエン酸すＩ・リウム
、］、　ｍＭ　ＥＤＴΔ及び０．５％ＳＤＳを含ｔＪ’
洗浄緩衝液１社中で５回洗浄する。ハイブリダイズした
ｍＲＮＡを、１０／１ｇのｔ　Ｒ，Ｎ　Ａ　を含有する
ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液１００μｌにより沸騰水浴中で
］分間溶出する。この溶液をドライアイス中で凍結し、
氷上で解凍し、そしてフィルターを取り出す。７メＬｌ
の３Ｍ酢酸すＩ・リウムを添加し、そして混合物をフェ
ノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（１：　
１　：　０．０４ν／Ｖ）で抽出する。水相に２５０μ
ｅのエタノールを添加してｍＲＮＡを沈澱せしめる。

溶出されたｍＲ，ＮＡを網状赤廂球溶解物（アメルシャ
ムインターナショナルＮｏ、Ｎ９０）中で製造者の指示
に従って翻訳する。インビトロ合成された蛋白質のアリ
コートをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し
、そして放射性蛋白Ｍ（翻訳系中の３５８−メチオニン
から）をフルオログラフィーにより検出する。蛋白質の
他のアリコートを例１３の７８ｋＤａ蛋白質に対して特
異的なモノクローナル抗体により免疫沈澱せしめる。次
に免疫沈澱物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分離し、そしてフルオログラフィーにより検出する。

クローンＢ１，１からのＤＮＡとのハイブリダイゼーシ
ョンにより選択されたｍＲ，ＮＡ　は、ＩＦＮ−誘導ナ
マルワ細胞から単離された７８ｋＤａ蛋（１，２１） 白質（例２）と同じ見かけ分子量及び抗原性を有する蛋
白質の合成を指令する。

例８．．−　址Ｌ３ベクターへＯスラヌ柊１り入Ｎ４．
灼井久久ロニ三２久 例６のクローンＢ１．１のプラスミドＤＮＡを制限酸素
ＰｓｔＩ（ベーリンガーマンハイム）により製造者の指
示に従って断片化する。挿入部を柑離しそしてエタノー
ルで沈澱せしめる。

ブルースクリズトＭ１３ベクター（スＩ・ラタジーン）
をＰｓｔＩで切断する。２０７１ｇのベクターＤＮＡを
、８ユニットのウシアルカリ性腸ホスファターゼ、１０
０ｍＭグリシン（ｐＨｌｏ、５）、１．　ｍＭ　ＭＨＩ
ｊ！２及び１　ｍＭ　ＺｎＣｌ２を含有する溶液５Ｏｌ
ｌｅ中で脱リン酸化する。ベクターＤＮＡを単離しそし
てフェノール／クロロボルム抽出により精製する。

クローンＢ１，１の０．５μｇのｃＤＮＡ及び１．５μ
ｇのＭ１３ベクターＤＮＡを、５ユニツＩ〜の１′４Ｏ
ＮＡリガーゼ及び０．５ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐを含有する連
結Ｍ衝液２０μ！中で２３℃にて５時間インキュベート
することにより連結する。Ｃ８，ＣＬ！２で処理され（
１，２２） たＥ、コリｒｅｃ”、ＩＭ］０９をこのＤＮＡ溶液によ
り形留転換する．Ｉ００μｇ／ｍｌのアンピシリン、４
０）ｉｇ／ｍｌのＸ　　Ｇａ１（５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクＩ・ピラノシド）及
び５ｍＭ　ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラク
トピラノシド）を含有するＬＢプレート」二に細胞をプ
レー１−する。コロニーを３７℃にて一夜増殖せしめ、
そして未変化のＭ１３ベクターを含有する青色細胞プラ
ークからの白色により形質転換体を選択する。

選択された個々のコロニーを５０．＋１ｇ／社のアンピ
シリンを含有するＬＢ培地１ｍｌ中で３７℃にて一夜増
殖せしめる。遠心分離の後、−１１清を廃棄し、そして
ペレットを５Ｏｎ＋Ｍグルコース、２５ｍＭＴｒｉｓ−
ＩＩＣｌ（ｐＨ８，ｏ）及び１０ｍＭ　ＥＤＴ＾を含有
する溶液１００μ！中に懸濁する。２２℃にて５分間の
後、２００μＮの０．２Ｎ　ＮａＯＨ／　１％ＳＤＳを
加え、溶合物を０℃にて５分間インキュベート−Ｌ、１
５０μｌの前冷却された３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，
８）で処理し、そして０℃にてさらに５分間保持する。

混合物をエッペンドルフ管中で１分間遠心する．Ｉｍｌ
のエタノールを一］二清に加え、そして２０°Ｃにて２
分間の後、混合物を再び１分間遠心する。ペレットを８
０％のエタノールで洗浄し、そして１００μｐの３００
ｍＭ酢酸ナトリウム中に再懸濁する。３００７ｉｆのエ
タノールを加え、そして混合物を一８０℃にて３０分間
保持し、そして遠心する。ペレッＩ・を８０％エタノー
ルで洗浄し、乾燥し、そして１５μりのＴＥＭ衝液中に
懸濁する。

２μｐのこのＤＮＡ懸濁液をＰｓｔＩにより消化する。

２μｐの他のサンプルを５ａｃＩ及び旧ｎｄｌにより二
重消化する。得られる制限断片を７％ポリアクリルアミ
ドゲル上での電気泳動により分析することによりベクタ
ー中のｃＤＮＡ挿入部の方向を決定する。

例ル　取方伺−険人後のプラスミｌ’Ｄ　１ＵＣｒ［Ａ
乙旦二ニング いずれかの方向にｃＤＮＡ挿入部を含有する例８のクロ
ーンからのプラスミドを例６に記載した方法を用いて単
離する。但し、テトラサイクリンではなく　ｉｏｏμｇ
／ｌｎ１のアンピシリンを含有するＬＢ培地中でクロー
ンを培養し、そしてクロラムフェニコールは添加しない
。

プラスミドＤＮＡをＫｐＴａ）及び旧ｎｄＴＩＩにより
完全消化し、次にフェノールで抽出する。この二重消化
された１８μｇのＤＮＡを、９００ユニツトのエンドヌ
クレアーゼＥに０■を含有する５　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
Ｉｔ（Ｊｌ　（ｐＨ８）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０μ
ｇ／１ｏ１ｔＲＮＡ、２０ｄ２−メルカプトエタノール
の溶液中で２３℃にてインキュベートする。反応混合物
から５０μｌのアリコートを１分間ごとに６分間まで取
り出し、８０μｌの５倍濃度のマングビーンヌクレアー
ゼ緩衝液及び２７０μｌの水を収容するチューブに加え
、そしてドライアイス上で凍結する。

アリコートを６８℃にて１５分間加熱し、次にマングビ
ーンヌクレアーゼ緩衝液中９ユニツトのマングビーンヌ
クレアーゼにより３０℃にて３０分間処理する。アリコ
ート当り４００μｌの緩衝液で平衡化されたフェノール
／クロロホルムにより反応を停止し、そしてエタノール
沈澱によりＤＮＡを単離する。

これらのＤＮＡを再連結し、そして得られたハイブリド
ベクターを使用して例８に記載した様にしてＥ、コリＲ
ｅｃ＾−ＪＭ１．０９を形質転換する。形質転換体を１
１００）ｔ／ｍ１のアンピシリンを含有するＬＢ培地に
３７℃にて一夜増殖せしめる。プラスミドＤＮＡを単離
し、そして例６に記載したようにしてＣ８Ｃ１グラジェ
ント中で精製する。

匠追、仄■へ五剖！鈴Ｕヒ 例６及び例９のＤＮＡについて、例５の２０−ｍａｒオ
リゴヌクレオチド混合物をプライマーとして用いて標準
的方法（ジデオキシヌクレオチド法）に従って配列を決
定する。次の配列：　５’　−ＣＡＧＣＣ上流及び下流
配列決定により式（ｎ）の部分配列がが確認される。こ
れらのプライマーはＹ、Ｉｋｅ等、［Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１４−Ｒｅｓｅａｒｃｌｉ　、　１１　、４７７（
１９８３）　］に従って合成される。

要約すれば、例６又は９の５μｇのプラスミドＤＮＡを
制限酵素Ｐｓｔ丁（ベーリンガーーマンハイム）により
製造者の指示に従って線状化する。

ＤＮＡを３容量のエタノールにより沈澱せしめ、次に’
；！、５７１１のＴＥ緩衝液中に溶解する。８μｐのこ
の溶液及び０．５０泊ｏｎ／ｍ１のプライマーを含有す
るＴ　Ｅ　Ｍ衝液２ノ１１を混合し、沸騰水浴中に３分
間置き、次にドライアンス中で凍結する．Ｉμｅめ０．
ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃ４／　５０　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ
　（ｐＨ７，４）を加え、そして混合物を４２℃にて３
０分間インキュベー１・する。このプライマー／鋳型混
合物をｄＮＴＰ混合物、ａ　−”　Ｓ　−ｄＡ　Ｔ　Ｐ
　、Ｋｌｅｎｏｗ断片及びジデオキシヌクレオチドｄｄ
ＡＴＰ、　ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、　ｄｄＴＴＰのそ
れぞれにより、標準的方法（Ｊ、Ｒ，Ｄｉｌｌｏｎ、＾
、Ｎａ５１ｍ及びＥ、Ｒ，Ｎｅ５ｌ；ｍａｎｎ、”Ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｏｄｏ！ｏｇｙ
”ライ・レイ１９８５゜９０−９４頁〕に従って処理す
る。ＤＮＡを変性し、そして配列決定用６％ポリアクリ
ルアミド７Ｍ尿素ゲル（Ｊ、Ｒ，Ｄｉｌｌｏｎ等、前記
に引用、８９頁）上に直接負荷し、そしてゲルを９０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ硼酸／１、　ｎ＋Ｍ　ＥＤＴ＾（ｐＨ１８
，７）中で泳動せしめる。

式（ＩＩ）の位置１のＡ　Ｔ　Ｇが蛋白質のための出発
コドンであろう。」１流は位置〜７５（Ｔ（：Ａ）、−
６５（ＴＡＡ）、−５７（ＴＧ＾）及び−４１（ＴＧ八
）に終止コドンを含むからである。

例↓１．　へ／ブリドーヱ１１９失肌賢１、　］、　、
　１．　、　　免班凋団り看却精製された蛋白質（例２
　）　５　）、ｔ　ｇを０．１％ＳＤＳ及び５０ｍＭメ
ルカプトエタノールを含有する２Ｍ尿素２０μｅ中に溶
解する。５μｇの蛋白質を含有するニトロセルロース片
５Ｘ、５ｍ＋ｎを雌性トＩＲ，−マウス〔パリ、フリエ
研究所Ｂｉｏｚｚｉ博士士がら入手；Ｌ、Ｂｏｕ＋ｎ５
ｅｎ及び＾、Ｂｅｒｎａｒｄ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　、
Ｍｅｔｌ！旦４旦。

３８　、２２５（１９８０）を参照のこと〕の腹腔に移
植する。

４週間後、５０μｇのアジュバンｌ〜ペプチド（シグマ
）を含有するフロイントの不完全アジュバント中５μｇ
の７８ｋＤａ蛋白質を腹腔内（ｉｐ、　）に注射し、そ
して同じサンプルによる２週間に１回の追加免疫感作を
３回ｉ、ｐ、投与により行う。４週間後、血清を集め、
そして７８ｋＤａ蛋白質に対する抗体力価を例１２のド
ツト−イムノアッセイにより決定する。高抗体価を有す
るマウスを２週間に１回の注射によりさらに２回の免疫
感作を行い、そして１週間後に最終追加免疫を行う。３
日後、融合のために牌臓を摘出する。

１１、．２．　　＠胞徹企 すべての融合実験を、Ｇ、ＫＯｈｌｅｒ及びＣ，Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ〔−↓す！、翻６　、４９５（１９７５）　
）の方法に行って、非分泌性Ｓ、２１０−Ａｇ１４骨髄
腫セルライン（Ｍ、Ｓｈｕｌｍａｎ。

Ｃ，Ｄ、Ｗｉｌｄｅ及びＧ、ＫＯｈｌｅｒ　、　Ｎａｔ
ｕｒｅ　、　２７６　、２６９（１，９７８））を用い
て行う．Ｉ０８個の牌細胞を１０７個の骨髄腫細胞とｌ
ｌ１１Ｎの５０％エチレングリコール（ＰＥＧ１５００
、セルバ）の存在下で混合する。洗浄した後、細胞を４
８ｍ１の標準ダルベコ最少必須培地（ギブコＮｏ、０４
２２５０１　）に再懸濁する。融合当り３×１０６個の
正常マウス腹腔滲出細胞をフィーダー細胞として加える
。細胞を４８Ｘ１．ｍＮのコスタルウエルに分配し、そ
して３〜６週間にわたって１週間に３回、標準ＨＡＴ選
択培地を供給する。ハイブリドーマ細胞の増殖が可視的
になったとき、」１清を例１２のドツト・イムノアッセ
イによりスクリーニングする。ハイブリドーマ細胞をミ
クロタイタープレート中で限界稀釈法により少なくとも
一度クローン化し、そしてｉ、ｐ、注射によりＨＲマウ
スを通して継代する。ハイブリドーマ細胞を腹水から収
得し、そして限界稀釈法により再度クローン化する。さ
らに研究するために選択された９個のハイブリドーマは
特に安定であり、そして多量の免疫グロブ刃ンを分泌す
る。これらを、８８５　Ｓ３５．８．１．８８５３３５
．＋６．１１、８８５　Ｓ５６．５５．７．１．２゜４
８．８８５　Ｓ５６．５５．７．２＋　、２５．８８５
　Ｓ５６．５５．７．２７．５．８８５Ｓ５６．５５．
７．２７．１１、８８５　Ｓ５６．５５．１３．８８５
　Ｓ５６゜５５．１．７、及び８８５　Ｓ５６．６７．
１５と称する。

健唄、抗体スクリーニングのカー吟９ずツＩ・−イ春ノ
フ一ム±／− 例２の精製された蛋白質を２Ｍ尿素、０，１％ＳＤＳ及
び５０−メルカプトエタノール中に溶解する。蛋白質の
稀釈を１０％の不活性化ウマ血清を含有するＴＢＳ中に
行う。蛋白質をドツトの形でニトロセルロース（ミリポ
ア社、ベトフォード、Ｍａからのタイプ１］＾−Ｇ）上
に適用する。マウス血清又はハイブリドーマ培養培地か
らの抗体の稀釈を１０％の不活性化ウマ血清を含有する
ＴＢＳ中に行う。ドラ）〜免疫結合アッセイ、改変エン
ザイムーリンクド・イムノソルベント・アッセイを、ラ
ビット抗−マウスＴｇＧパーオキシダーゼ接合第二抗体
及びＴＢＳ中１１２０□／４−クロロ−１−ナフト−ル
を用いて、Ｍ、Ｍ、Ｄｅｒｅｒ等（Ｊ、ＡＩ　Ｉｅ−ｐ
Ｈ２−リーｉ−虹１婁懸！！Ｏ−１，，η−、８５（１
９８４）　〕に」：り記載されたようにして行う。

例１刊、　干、へ２」−二−すＪｋ抗−俸！ト東Ｍプｋ
ｕ精製−］、３．１．　１ンよ１旬１え ８〜１０週分のＢａｌｂ／ｃマウス（ティーファーム・
シッセルン、スイス）を０，３社のブリスタン（アルド
リッチ）により腹腔的前処理する。２〜３週間後、２〜
５Ｘ１０’個のクローン化ハイブリドーマ細胞及び０．
２＋ｎ１のプリスタンを腹腔内に接種する。

１０〜１０日後腹水を集め、８００Ｘｇにて遠心し、そ
して−２０℃にて貯蔵する。

解凍した腹水を５０，０００ｘｇにて６０分間遠心分離
する。表面に浮かぶ脂肪層を注意深く除去し、そして蛋
白質濃度を１０〜１２ｍｇ／ｍｌに調製する。

０．９容量の飽和硫酸アンモニウムを０℃にて滴加する
ことにより粗免疫グロブリンを沈澱せしめ、次に２０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｌｉｃ１／　５０　ｍＨＮａＣ１（ｐ
Ｈ７，９）中に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析
する。

２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−１１ｃ１／　２５−４００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ７，９）の緩衝液グラジェント系を
用いるＤＥＡＥ−０５２セルロース（ワラ１〜マン）に
より免疫グロブリン画分を得る。

免疫グロブリンを硫酸アンモニウムにより再度沈澱せし
め、そして］、Ｏｍｇ／ｍ１の濃度でＰＢＳ中に溶解す
る。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動け、すべてのモ
ノクローナル抗体について９５％以上の純度を示す。

１、３　、２　、　　　イエンＥ、Ｌ！？台、戊−１０
％のＦｅ２を含有するＲＰＭｌｌ、６４０培地中で生理
的ｉ品度（約３７℃）においてハイブリドーマ細胞を培
養して５Ｘ１０５〜１０６細胞／ｍ１の最終細胞濃度に
することにより、例１１．２のセルラインの前培養物を
得る。この前培養物全体をベルコ培養器に満たし、そし
て新鮮なＲＰＰｒ１６４０培地／１０％ＦＣ８により全
容量１．５００ｍＭに調整する。この培養物を約３７℃
、５％Ｃ０２のもと３０ｒｐｍにて２〜３日間撹拌し、
次にＲＰＭｌｌ、６４０／　］、　Ｏ％ＦＣ８により全
容量３０００ｍｆに稀釈しそしてさらに７〜１０日間撹
拌する。この後細胞の９５％が死滅する。培養液を１１
００Ｏｘにて２０分間４℃で遠心分離する。無菌条件下
でポアサイズ０．２μ係のフィルターを通して上清をＰ
遇する。０．９容量の飽和硫酸アンモニウムを０℃にて
ゆっくりと滴加することにより和免疫グロブリンを沈澱
せしめる。この沈澱を例１３．１に記載されている様に
して精製し、そして９５％以上の純度のモノクローナル
抗体を得る。

同士し　千！−λＶ：リコヒ崩体！ｌケ徴−付」九１４
．１．　　シクロ−ナノ＋／−抗体９ノ凪バ久幻久んへ
汲定 クローン化ハイブリドーマ細胞により生産されたモノク
ローナル抗体のクラス及びサブクラスを、クラス及びサ
ブクラス特異的ラビット抗体（ピオネティクス）を用い
る既知のオークテルロニー寒天ゲル免疫拡散法により決
定する。この結果を、次の様にして酵素イムノアッセイ
（ＥＬＩＳ＾）により確認する。ミクロタイタープレー
トを、５０１．ｔ　１のＩ”　Ｂ　Ｓ中１μｇ／ウェル
のクラス−又はザブクラス特異的鹿清のラビッＩ・免疫
グロブリン調製物（ピオネティクス）によりコートする
。プレートの遊離結合容量を０．２％ＮａＮ５（ＩＩＩ
／ｖ）を含有するＰｒ３Ｓ　（ｐＨ７，４）中１％ウシ
血清アルブミンの緩衝液により飽和する。モノクローナ
ル抗体を含有するプローブ１００７１Ｉをウェル中で３
７℃にて１時間インキュベートする。プレー１へをＰＢ
Ｓで洗浄し、次にプレートをコーＩ・するために使用し
たのと同じ特異性を有するホスファターゼ接合ラビット
免疫グロブリン調製物と共に３７℃にて１時間インキュ
ベートする。固定された酵素を酵素基質ｐ−ニトロフェ
ニルホスフェートの溶液（０，５ｍＭ　ＨｇＣ（１２及
び０．０２ｕ＋／ｖ％のＮａＮ３を含有するジェタノー
ルアミン１０％緩衝液（ｐｌ＋９．８）中１　ｍｇ／社
〕とのインキュベートにより発色せしめ、そして４０５
ｍｍにおける光学濃度を測定する。モノクローナル抗体
、８８５　Ｓ３５．８．１．８８５　Ｓ３５．］、］６
．１−１Ｓ８５　Ｓ５６．５５．７．＋２゜４８．８８
５　Ｓ５６．５５．７．２１．．２５．８８５　Ｓ５Ｂ
、５５．７．２７．５．８８５　Ｓ５６．５５．７．２
７．］］、８８５　Ｓ５６．５５．＋３．８８５　Ｓ５
６゜５５．１７、及び８８５　Ｓ５６．６７．１５はず
べてクラスＩｇＧ１に属する。

？４．２．　　ｈ　）シー８−ｊＤｑ　ｍ−肝順（・＝
呼ｔＡ１択性マウスＡ、　２　Ｇ胎児二倍体細胞、ラッ
ト胎児二倍体細胞、ハムスター胎児二倍体細胞、ウマ腎
二倍体細胞、真皮セルラインＮＢＬ−６（ΔＴＣＣＮｏ
。

ＣＣＬ５７）の細胞、ウシ腎二倍体細胞、ネコ胎児肺二
倍体細胞、ベロ・セルライン＾ＴＣＣＮｏ、ＣＣＩ、８
１のモンキー細胞、ラビット胎児細胞、ヒツジ脈絡改造
細胞、ブタ腎二倍体細胞、及び腎セルラインＰＫ−１５
（＾ＴＣＣＮｏ、ＣＣ１，３３）の細胞を、例１，２及
び４．１においてヒト細胞について記載したようにして
組換インターフェロンα／β−Ｄハイブリドと共にイン
キュベートする〔８．＾、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ及び
に、ｄｅＳｔａｒｉｒｔｚｋｙ　、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖ垣
Ｖ、（１９８７）　、　Ｖｏｌ　６８）　。これらのす
べての種の細胞において、ヒト７８ｋＤａ蛋白質に関連
する少なくとも１つの蛋白質が検出される。これらの抗
原的に関連する蛋白質は例１１．１に従ってヒト７８ｋ
Ｄａ蛋白質により免疫感作されたマウスから得られるポ
リクローナル抗体によって同定される。しかしながら例
１７の蛍光抗体法、例１８の免疫沈澱法又はウェスタン
プロット法により試験した場合、モノクローナル抗体８
８５　Ｓ３５．８．］、８８５　Ｓ５６．５５．１３及
び８８５　Ｓ５６．６７．１５はヒ１□　７８　ｋｒｌ
ａ蛋白質にのみ結合し、そして上記の種の関連蛋白質と
は結合しない。ウェスタンプロットのためには蛋白質を
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、
そして二）・ロセルロースに移行せしめ、次に例１６の
イムノドツトアッセイについて記載したようにして試験
する。

例−１５，［ｌｊ−累一イムノアッ暫イ’　（、ｊｊ−
１ｊ−鋤ｙ１、、ｈｌのＰＢＳ中１．４Ｂのモノクロー
ナル抗体８８５　Ｓ３５．８．］を、グルタルアルデヒ
ド（０，２ｖ／ｖ％）を用いてＶｏｌｌｅｒ等（腕」ｊ
　、Ｗｏ−ｒｌｄ　ｔｌｅａｌｔｂ　Ｏｒｌｌａ−ｇ−
、。

５、ｆｉ、　、　５５（１，９７６＞　）の標準的方法
に従って’５ｍｇのアルカリ性ボスファターゼ（シグマ
Ｐ６７７４　、タイプＶ■−Ｔ）を含有する溶液とカッ
プリングせしめる。

この接合体を、］ｍＭ　ＭｇＳＯ２，１％ＢＳＡ及び０
．０２％ＮａＮｔ１３を含有する０、０５Ｍ　Ｔｒｉｓ
　Ｍ衝液（ｐＨ８，０）　５ｍｌ！に移す。この溶液を
４°Ｃにて暗中に保持する。

１５．２．　　Δム暫不法− ポリプロピレン製ミクロタイタープレート（ダイナチッ
ク・ラプス）を緩衝液（ｐＨ８，６＞　（０，０２％の
すＩ〜ツリウムジドを含有する炭酸塩緩衝化０．９％塩
溶液）中モノクローナル抗体８８５　Ｓ５６．５５．１
３　（ＩＱμｇ／ｍｆ）の溶液１５０７ｚ１により３７
℃にて２時間及び４°Ｃにて一夜コートする。プレート
をＰＢＳにて５回洗浄し、そして２５０７．ｚｌのＭ衝
液（ｐＨ７，２）（Ｐ　Ｂ　Ｓ中０．２％ゼラチン及び
０，２％ＮａＮ−）と共に３７℃にて１時間インキュベ
ート・することにより、なお存在する蛋白質反応性部位
を飽和する。こうしてコートされたブレーＩ・はこの緩
衝液中で４℃にて数日間保持することができる。

試験溶液又は７８ｋＤａ蛋白質を含有する標準溶液の一
連の稀釈物５０７１１．５０μｌの緩衝液（ｐｌ＋（１
，３７＞ ７．４）５０μｆｆｉ、及び緩衝液（ｐｔ１７．４）ニ
より］、：１００稀釈されたホスファターゼラベルされ
た抗体８８５Ｓ３５．８．１（例１５．１．）ノ溶液５
０μＮを混合し、そしてミクロタイターウェル中で３７
℃にて２時間及び４℃にて３０分間インキュベー１・す
る。プレートをＰＢＳにて５回洗浄！２、次にｐ−二１
〜口フェニルホスフェートの溶液（１０％ジェタノール
アミン緩衝液１０．５ｍＭ　ＭｇＣ１，（ｐｔ１９．８
）中１．　Ｂ／　ｍｅ　）　］　５０μｐと共に３７℃
にて３０分間インキュベーＩ〜する。４０５ｎｍでの光
学濃度を測定することにより放出されたｐ−二トロフェ
ノールの量を決定する。

この量は結合した酵素ホスファターゼの量に比例し、そ
してそれ故に試験溶液中の７８ｋＩ）ａ蛋白質の量に比
例する。

ミクロタイタープレートをモノクローナル抗体８８５　
Ｓ３５．８．１又は８８５　Ｓ５６．６７．１５により
コートし、そして第二抗体としてホスファターゼに連結
されたモノクローナル抗体８８５　Ｓ５Ｂ、５５．１３
を使用する場合、同様の結果が得られる。　　１゛ノド
”余白（１，３８） １．５．３１！ｉＬ畢υ消−の慣り上 側１５．２中に記載したアッセイのための試験キラ０．
４２％ＮａｔｌＣ０３，０，００７２％Ｎａ２ＣＯ３。

０．０２％ＮａＮ＝）中モノクローナル抗体８８５　Ｓ
５６．５５．１３（１０μｇ７ｍ（１）の溶液。

◎　Ｔｒｉｓ緩衝液（０，０５Ｍ　、　］、　ｍＨＨｇ
Ｃｌ２．　　１社１％Ｂ　Ｓ　Ａ、　、　０．０２％Ｎ
ａＮ３．　ｐＨ８，０）中アルカリ性ホスファターゼに
連 結されたモノクローナル抗体８８５ Ｓ３５．８．１（例１５．１．，０．３Ｂ／　ｍｌの抗
体）の溶液。

◎　”）ＪＬｇの７　’８　ｋＤａ蛋白質を含有する　
　２ｍｌ標準溶液。

◎　Ｐ　Ｂ　Ｓ　０３００ｎ＋１ ◎　緩衝液（ｐＨ７，４＞（Ｐ　Ｂ　Ｓ中０．２％ゼ　
　３００ｎＮラチン及び０．２％隅Ｎ３）。

◎　ジェタノールアミン緩衝液（１０５０ｍ４％、　０
．５ｍＭ　ＨｇＣｌ２．０．０２％ＮａＮ３　。

１１ｃｊ！にてｐｌ＋８．９に調整）中ｐ−ニトロフェ
ニルボスフェート（］、ｍｇ／拍１）の溶液。

◎　換算曲線。

◎　色強度スケール。

◎　指示書。

胆、イムノプロット・アッセイ １６．１．、　　τム１（汲 ７８ｋＤａ蛋白質の存在について試験されるべき溶液及
び標準溶液の一連の稀釈物を１０％の不活性ウマ血清を
含有するＴＢＳ中に調製する。この稀釈物をドツトの形
でニトロセルロース（ミリポア社、ブレッドフォード、
Ｍａ、タイプＩＩＡＷＧ）に適用する。ニトロセルロー
スを１０％のウマ血清を含有するＴＢＳ中で３７℃にて
２時間インキュベートすることにより、ニトロセルロー
スの過剰の蛋白質結合容量をブロックする。二Ｉ〜口セ
ルロースを適当なストリップに切断し、次にＴＢＳ中モ
ノクローナル抗体８８５　Ｓ５６．５５．１．３又は８
８５　Ｓ３５．８゜１（２μｇ／ｍｌ及び１０Ｍｇ／悄
１）の溶液と共に室温にて２時間インキュベニ１・する
。ストリップをＴＢＳ中で５回洗浄し、そしてさらにラ
ビッＩ〜抗−マウスＩｇＧパーオキシダーゼ接合第二抗
体の１０．０００倍稀釈物中で２時間インキュベートし
、ＴＢＳ中で５回洗浄し、次に０．６容量の４−クロロ
−１−ナフトール（メタノール中３Ｂ／社）、１０容量
のＴＢＳ及び０．００４容量の３０％過酸化水素から成
る新たに混合されたパーオキシダーゼ基質溶液中で室温
にて１５分間発色せしめる。所望により、スポットを屈
折光度計（ＣＡＭＡＧ、ムッテンツ、スイス）により６
００ｎｍにて走査することができる。

１６．２．　　毛ムノ」ット・アッセモへな杵の試−例
１６．２．に記載したアッセイのための試験キラＩ・は
次のものを含む。

◎　ニトロセルロースシート。

０１０％ウマ血清を含むＴＢＳ中　　２０ｍ１モノクロ
一ナル抗体８８５　Ｓ５６．５５゜１３（１０Ｍｇ／−
）の溶液。

０１０％ウマ血清を含むＴＢＳ中　　　　１ｍｌホース
ラディツシュに接合した ラビット抗− マウスＩｇＧの１：１００稀釈物。

◎　５．＋４１？の７８ｋＤａ蛋白質を含有　　　　２
ｍＭする標準溶液。

◎　Ｔ　Ｂ　Ｓ　、　　　　　　　　　　　　　　３０
０ｍ１０１０％ウマ血清を含有するＴＢＳ。　３００ｍ
（◎　４−クロロ−１−ナフト−ル（メ　　１．Ｏｍｆ
ｍフタノール中Ｂ１社）。

◎　３０％過酸化水素。　　　　　　　　１０ｍ１◎　
指示書。

訓、斃弥危代直 この発明の蛋白質の存在について試験すべき細胞をプラ
スチックカバースリップ上に増殖せしめる別の方法とし
て、ヒトの血液から新たに単離された細胞、例えばリン
パ球又は単球を、ポリーＤ−リジンにより前処理された
ガラススライドにサイトスピン遠心により付着せしめる
。

細胞をＰＢＳにより洗浄し、３％ボラホルムアルデヒド
により２０℃にて１０分間固定し、０．５％トリトンＸ
−１，００により５分間透過性にし、ＰＢＳに、て再度
洗浄し、そしてＰＢＳ中モノクローナル抗体８８５　Ｓ
５６．５５．１３（］、　Ｏｔｔｇ／岬）の溶液と共に
３７℃にて６０分間インキュベートする。次に細胞をＰ
ＢＳで洗浄し、フルオレッセイン接合うビット抗−マウ
スＩｇＧの溶液（５％ウマ血清を含有するＰＢＳ中に１
：４０稀釈されたもの、ＤＡＫＯ）により処理し、ＰＢ
Ｓにより洗浄し、そしてＪ　ｏ　ｈ　ｎ　ｓ　ｏ　ｎ等
（Ｊ　、　Ｉ　ｍ　ｍ　ｕ　■↓、Ｍ倶１ｏｄｓ　、　
４３−　、３４９（１９８１）］により記載されている
様にして観察する。ＵＶ蛍光顕微鏡観察は、細胞の細胞
質中の明るい蛍光によりこの発明の蛋白質の存在を示ず
。

培養物中に増殖した細胞又はヒト血液から新たに単離さ
れた細胞を、例１７に記載した様にプラスチック又はガ
ラスのプレート上に置く。５０００国際単位／社の濃度
の組換インターフェロン５ｉ（α／βタイプ）の溶液に
より細胞を３７℃にて４時間処理し、そして２０１１Ｍ
　Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン＝Ｎ′−２−エ
タンスルホン酸（ｔｌＥｒ’Ｅｓ　、　ｐｌ（７，４）
によりＭ衝化された炭酸水素ナトリウムを含有するバン
クの平衡溶液中５０μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メヂオニン
と共に３７℃にて３０分間インキュベーＩ・する。細胞
をＰＢＳにより洗浄し、プレートからかき取り、遠心分
離により集め、５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐｔ１７．４　）
、１．５ｍＭＫＣｌ及び２．５　ｍＭ　Ｈｇ（Ｃ２を含
有する低張緩衝液中に５分間懸濁し、そして遠心分離に
より再び集める．Ｉ％トリＩ・ンＸ−１００及び１％デ
オキシコレートを含有する低張緩衝液により４℃にて５
分間溶解し、次に１２．ＯＯＯｒｐｍにて５分間遠心分
離する。ドデシル硫酸すトリウムを０．５％の最終濃度
となる様に上清に加える。

６μｍのこの溶液と、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｎ（
ｐｔ１７．４　）及び５０ｍＭ　ＮａＣ１を含む緩衝液
〈フェニルメチルスルホニルフルオリドで飽和されたも
の）２０μｐとを混合し、そして１２，０ＯＯｒｐ＋ｏ
にて５分間再遠心分離する。２０μｐの上清、及び０．
５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中モノクローナル抗体８８
５　Ｓ５６．５５゜１３の溶液（４０μｓ／ｍＮ）１μ
ｌを４℃にて３時間インキュベートし、次にプロティン
Ａ−セファロースの５０ｖ／ｖ％懸濁液２０μｌと混合
する．Ｉ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，４）、５０　ｍＭ
　ＮａＣ１！、１Ｍシュークロース、０．５％デオキシ
コール酸及び０．５％トリＩ・ンｘ、−ｔｏｏを含む緩
衝液５００μ！で洗浄し、そして抗原／抗体複合体を３
０μｌのサンプル緩衝液〔口、に、Ｌａｅｍｍｌ　ｉ及
びＭ、Ｆｏｖｒｅ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、ＥｊＯ
，５７５（１，９７３））により溶出する。溶出物を常
法により１２％ポリアクリルアミドゲル上での一次元Ｓ
ＤＳゲル電気泳動により分析する。７８ｋｌ’）ａの見
かけ分子量を有するこの発明の蛋白質の存在がフルオロ
グラフィーにより示される。

利用、　ヒトにお番る　ンターフェロン、夫へ１視− １０７国際単位の組換ヒトインターフェロン−α（Ｃ２
）を皮下投与された患者から注射後２４時間目及び４８
時間目に血液サンプルを採取する。

フィコール４００　（ファルマシア）密度匂配上での遠
心分離によりリンパ球を精製する。４．５Ｘ１０６個の
リンパ球を４００μｐの水中に懸濁し、次に８００μｌ
のエタノールにより沈澱せしめる。ペレットを解ＭＭ衝
液中に溶解し、そして−次元ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分離する。

蛋白質をニトロセルロース上に移し、そして７８ｋＤａ
の蛋白質を検出し、そして例１６に記載した様にして定
量する。

インターフェロン治療前の患者及び健康者に比較して、
７８ｋＤａ蛋白質のレベルはインターフェロンα２の皮
下注射の後２４時間及び４８時間後に５倍に」１昇して
いた。

昨竣、弗経狙ｍ月１１ ２００μｇの７８ｋＤａ蛋白質を３ｍｌの５Ｎヒト血清
アルブミンに溶解する。得られる溶液を細菌学的フィル
ターに通し、そして濾過された溶液を無菌条件下で１０
個のバイアルに分注する。バイアルを好ましくは冷所、
例えば−２０℃にて貯蔵する。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
   ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
   合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を特徴とする本質的に純粋な蛋白質。 ２、次の配列： 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質。 ３、組換インターフェロンα／Ｂ、α／Ｄ、α／Ｆ又は
   インターフェロンα／Ｂ−Ｄハイブリドで処理されたナ
   マルワ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞中に見出されることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質。 ４、次のアミノ酸組成範囲：Ａｓｘ５４−６０、Ｇｌｘ
   ９１−１０１、Ｓｅｒ３７−４１、Ｔｈｒ３０−３４、
   Ｇｌｙ４１−４６、Ａｌａ４５−５０、Ａｒｇ３６−４
   ０、Ｐｒｏ２４−２８、Ｖａｌ３８−４２、Ｍｅｔ１７
   −１９、Ｈｅ４１−４６、Ｌｅｕ６４−７２、Ｔｒｐ０
   −３、Ｐｈｅ２４−２７、Ｃｙｓ５−７、Ｌｙｓ４５−
   ５０、Ｈｉｓ１２−１４、及びＴｙｒ１１−１３を特徴
   とする特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項に記載
   の蛋白質。 ５、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
   ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
   合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列； 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を有する蛋白質の製造方法であって、該蛋白質を生産す
   る細胞を培養し、細胞上清又は細胞溶解混合物から該蛋
   白質を単離し、そして沈澱法及びクロマトグラフ法によ
   り精製することを特徴とする方法。 ６、ヒト細胞をインターフェロン−α又は−βの存在下
   で培養し、細胞を溶解せしめ、上清中の蛋白質を沈澱せ
   しめ、分取用電気泳動により分離し、そして約７８ｋＤ
   ａの分子量の蛋白質を溶出することを特徴とする特許請
   求の範囲第５項に記載の方法。 ７、前記ヒト細胞がナマルワ細胞である特許請求の範囲
   第６項に記載の方法。 ８、前記ヒト細胞をインターフェロンα／Ｂ、α／Ｄ、
   α／Ｆ又はα／Ｂ−Ｄハイブリドの存在下で培養する特
   許請求の範囲第６項又は第７項に記載の方法。 ９、異種性蛋白質の発現を許容する条件下で前記蛋白質
   を発現する形質転換された宿主を培養し、そして目的化
   合物を単離することを含んで成る特許請求の範囲第５項
   に記載の方法。 １０、ａ）ヒト細胞のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブ
   ラリーから前記蛋白質をコードするＤＮＡを単離し、 （ｂ）このＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し、（ｃ
   ）得られたハイブリドベクターを受容体宿主に移行せし
   め、 （ｄ）形質転換された宿主のみが生存する条件下で培養
   することにより未形質転換宿主から形質転換された宿主
   を選択し、 （ｅ）この形質転換された宿主を異種性ポリペプチドの
   発現を許容する条件下で培養し、そして（ｆ）目的蛋白
   質を単離する、 段階を含んで成る特許請求の第９項に記載の方法。 １１、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
   ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
   合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。 １２、次の式（ I ）： 【遺伝子配列があります】 （ I ） （式中、Ｚ＾１はプロモーター配列を含む１２以上のヌ
   クレオチドから成る５′−末端ＤＮＡ残基であり、Ｚ＾
   ２は１７００以上のコードヌクレオチド、終止コドン及
   び場合によっては存在する３′−末端の非コードヌクレ
   オチドから成るＤＮＡ残基であり、そしてＺ＾１及びＺ
   ＾２は場合によっては連結されている） で表わされるＤＮＡ、１又は複数のトリプレットが同じ
   アミノ酸をコードする他のトリプレットにより置き換え
   られている式（ I ）のＤＮＡ、式（ I ）のＤＮＡとこ
   れに対して相補的なＤＮＡとから成る二、本鎖ＤＮＡ、
   並びに相補的ＤＮＡそれ自体である特許請求の範囲第１
   １項に記載のＤＮＡ。 １３、次の式（II）： 【遺伝子配列があります】 （II） （式中、Ｚ＾３は１以上のヌクレオチドから成る５′−
   末端ＤＮＡ残基であり、Ｚ＾２は１７００以上のコード
   ヌクレオチド、終止コドン及び場合によっては存在する
   ３′−末端の非コードヌクレオチドから成るＤＮＡ残基
   であり、そしてＺ＾３及びＺ＾２は場合によっては連結
   されている） で表わされる特許請求の範囲第１１項又は第１２項のい
   ずれか１項に記載のＤＮＡ。 １４、次の式（III）： 【遺伝子配列があります】 （III） （式中、Ｚ＾４は１個以上のヌクレオチドから成る５′
   −末端ＤＮＡ残基であり、そしてＺ＾５は１５００個以
   上のコードヌクレオチド、終止コドン及び場合によって
   は存在する３′−末端の非コードヌクレオチドから成る
   ＤＮＡ残基である） で表わされる特許請求の範囲第１１項、第１２項又は第
   １３項に記載のＤＮＡ。 １５、式（ I ）、（II）、又は（III）のＤＮＡとハイ
   ブリダイズするＤＮＡ。 １６、次の式（IV）： ５′−ＧＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＧＴＣＣＡＣＴＴＣ−３
   ′（IV） で表わされる２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドである特
   許請求の範囲第１５項に記載のＤＮＡ。 １７、次の式（Ｖ）： ５′−ＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＧＧ−３′（Ｖ
   ） で表わされる１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドである特
   許請求の範囲第１５項に記載のＤＮＡ。 １８、次の式（VI）： ５′−ＣＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＣＴＧＧ−
   ３′（VI） で表わされる２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドである特
   許請求の範囲第１５項に記載のＤＮＡ。 １９、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
   ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
   合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を有する蛋白質をコードするＲＮＡ。 ２０、Ｚ＾３が１個以上のヌクレオチドから成る５′−
   末端ＲＮＡ残基であり、Ｚ＾２が１７００個以上のコー
   ドヌクレオチド、終止コドン及び場合によっては存在す
   る３′−末端非コード配列からなるＲＮＡ残基であり、
   そしてＴの代りにＵが存在する式（II）で表わされる特
   許請求の範囲第１９項に記載のＲＮＡ。 ２１、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
   ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
   合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を有する蛋白質をコードするＤＮＡの製造方法であって
   、形質転換された宿主を培養し、そしてこれから目的Ｄ
   ＮＡを単離することを含んで成る方法。 ２２、（ａ）ヒト細胞からｍＲＮＡを単離し、目的のｍ
   ＲＮＡを選択し、該ｍＲＮＡに対して相補的な単鎖ＤＮ
   Ａを調製し、次にこれから二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ　ｃＤＮ
   Ａ）を調製するか、又は （ｂ）ヒト細胞からゲノムＤＮＡを単離し、そしてＤＮ
   Ａプローブを用いて目的のＤＮＡを選択し、そして （ｃ）段階（ａ）のｃＤＮＡ又は段階（ｂ）のｄｓＤＮ
   Ａを適当な発現ベクターに導入し、 （ｄ）この得られたハイブリドベクターにより適当な宿
   主微生物を形質転換し、 （ｅ）目的の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質
   転換された宿主をコードＤＮＡを含有しない宿主から選
   択し、そして （ｆ）目的のＤＮＡを単離する、 ことを含んでなる特許請求の範囲第２１項に記載の方法
   。 ２３、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
   ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
   合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を有する蛋白質をコードするＤＮＡが発現制御配列に作
   用可能に連結されているハイブリドベクター。 ２４、プラスミドｐＢＲ３２２に由来する特許請求の範
   囲第２３項に記載のハイブリドベクター。 ２５、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
   ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
   合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列； 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を有する蛋白質をコードするＤＮＡが発現制御配列に作
   用可能に連結されているハイブリドベクターにより形質
   転換された宿主細胞。 ２６、エシャリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
   ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第２５項に記載の宿主
   細胞。 ２７、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
   ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
   合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を有する蛋白質に対して特異的なモノクローナル抗体、
   及びその誘導体。 ２８、マウス／マウス・ハイブリドーマ細胞により生産
   されることを特徴とする特許請求の範囲第２７項に記載
   のモノクローナル抗体及びその誘導体。 ２９．８８５　Ｓ３５．８．１、８８５　Ｓ３５．１６
   ．１１、８８５　Ｓ５６．５５．７．１２．４８、８８
   ５　Ｓ５６．５５．７．２１．２５、８８５　Ｓ５６．
   ５５．７．２７．５、８８５　Ｓ５６．５５．７．２７
   ．１１、８８５　Ｓ５６．５５．１３、８８５Ｓ５６．
   ５５．１７Ｎ及び８８５　Ｓ５６．６７．１５と称する
   モノクローナル抗体から成る群から選択された特許請求
   の範囲第２８項に記載のモノクローナル抗体。 ３０、８８５　Ｓ３５．８．１と称する特許請求の範囲
   第２８項に記載のモノクローナル抗体。 ３１、８８５　Ｓ５６．５５．１３と称する特許請求の
   範囲第２８項に記載のモノクローナル抗体。 ３２、８８５　Ｓ５６．６７．１５と称する特許請求の
   範囲第２８項に記載のモノクローナル抗体。 ３３、アルカリ性ホスファターゼに連結された特許請求
   の範囲第２７項又は第２８項に記載のモノクローナル抗
   体の誘導体。 ３４、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
   ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
   合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を有する蛋白質に対して特異的なモノクローナル抗体及
   びその誘導体の製造方法であって、該モノクローナル抗
   体を分泌するハイブリドーマ細胞を、ａ）インビトロで
   培養しそして培養上清からモノクローナル抗体を単離す
   るか、又は ｂ）適当な哺乳類中でインビボ増殖せしめ、そして該動
   物の体液からモノクローナル抗体を回収し、そして所望
   により、 ｃ）得られたモノクローナル抗体をその誘導体に転換す
   る、 ことを特徴とする方法。 ３５、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のハイブリドーマ細胞を
   炭水化物により前処理されている場合があるＢａｌｂ／
   ｃマウスに腹腔内注射し、これらのマウスの腹水を集め
   、そして該腹水から目的のモノクローナル抗体を単離す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第３４項に記載の方
   法。 ３６、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
   ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
   合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を有する蛋白質に対して特異的なモノクローナル抗体を
   分泌することを特徴とするハイブリドーマセルライン。 ３７、マウス骨髄腫細胞と同系マウスのＢリンパ球との
   ハイブリドであることを特徴とする特許請求の範囲第３
   ６項に記載のハイブリドーマセルライン。 ３８、８８５　Ｓ３５．８．１、８８５　Ｓ３５．１６
   ．１１、８８５　Ｓ５６．５５．７．１２．４８、８８
   ５　Ｓ５６．５５．７．２１．２５、８８５　Ｓ５６．
   ５５．７．２７．５、８８５　Ｓ５６．５５．７．２７
   ．１１、８８５　Ｓ５６．５５．１３、８８５　Ｓ５６
   ．５５．１７、及び８８５　Ｓ５６．６７．１５と称す
   るハイブリドーマセルラインから選択された特許請求の
   範囲第３７項に記載のハイブリドーマセルライン。 ３９、パスツール研究所（パリ）のＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
   ｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄ
   ｅ　ＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓにＮｏ． I −５
   ４５として寄託されている８８５　Ｓ３５．８．１と称
   する特許請求の範囲第３７項に記載のハイブリドーマセ
   ルライン。 ４０、パスツール研究所（パリ）のＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
   ｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄ
   ｅ　ＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓにＮｏ． I −５
   ４３として寄託されている８８５　Ｓ５６．５５．１３
   と称する特許請求の範囲第３７項に記載のハイブリドー
   マセルライン。 ４１、パスツール研究所（パリ）のＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
   ｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄ
   ｅ　ＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓにＮｏ． I −５
   ４４として寄託されている８８５　Ｓ５６．６７．１５
   と称する特許請求の範囲第３７項に記載のハイブリドー
   マセルライン。 ４２、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導れたヒ
   ト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には合
   理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を有する蛋白質に対して特異的なモノクローナル抗体を
   分泌するハイブリドーマセルラインの製造方法であって
   、精製された該蛋白質により又はこの蛋白質を含有する
   抗原キャリヤーにより適当な哺乳類を免疫感作し、この
   哺乳類の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、この
   融合により得られたハイブリド細胞をクローン化し、そ
   して所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択すること
   を特徴とする方法。 ４３、ＨＲ−マウスの抗体産生細胞をセルラインＸ６３
   −Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４の骨髄腫細
   胞と融合せしめることを特徴とする特許請求の範囲第４
   ２項に記載の方法。 ４４、前記蛋白質を含有するニトロセルロース片を移植
   することによって哺乳類を免疫感作することを特徴とす
   る特許請求の範囲第４２項に記載の方法。 ４５、特許請求の範囲第１項の蛋白質の定性的もしくは
   定量的測定のため又は単離及び精製のための、特許請求
   の範囲第２７項に記載のモノクローナル抗体及びその誘
   導体の使用。 ４６、エンザイム・イムノアッセイ、蛍光抗体試験又は
   免疫沈澱試験における特許請求の範囲第４５項に記載の
   モノクローナル抗体及びその誘導体の使用。 ４７、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
   ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
   合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を有する蛋白質の定性的及び定量的測定のための試験キ
   ットであって、該蛋白質に対して特異的なモノクローナ
   ル抗体及び／又はその誘導体、並びに場合によっては他
   のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及び／
   又はアジュバントを含んでなるキット。 ４８、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
   ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
   合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
   ７８ｋＤａの分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： 【遺伝子配列があります】 で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する； を有する蛋白質の療法的有効量を医薬として許容される
   キャリヤーと共に含んで成る医薬。 ４９、ウィルス感染の治療のための医薬を製造するため
   の特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質の使用。 ５０、特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質の有効量を
   投与することを特徴とするウィルス感染を有する温血動
   物の治療方法。