JPH07236497A - インターフェロンにより誘導された蛋白質に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ - Google Patents
インターフェロンにより誘導された蛋白質に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマInfo
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- JPH07236497A JPH07236497A JP7026576A JP2657695A JPH07236497A JP H07236497 A JPH07236497 A JP H07236497A JP 7026576 A JP7026576 A JP 7026576A JP 2657695 A JP2657695 A JP 2657695A JP H07236497 A JPH07236497 A JP H07236497A
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- C07K14/4718—Cytokine-induced proteins
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】
【目的】 インターフェロンにより誘導されるヒト蛋白
質に対して反応するがインターフェロンにより誘導され
るネズミ蛋白質と交叉反応しないモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマの提供。 【構成】 次の性質：（１）インターフェロン−α又は
−βにより誘導されたヒト細胞中に存在するが、処理さ
れていない細胞中には合理的な程度に存在しない；
（２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
７８kDa の分子量を有する；（３）約６．３の等電点を
有する；（４）次の配列： Val-Val-Ser-Glu-Val(5)-As
p-Ile-Ala-Lys-Ala(10)-で表わされる部分的Ｎ−末端ア
ミノ酸配列を有する；を有する蛋白質に対して反応し且
つインターフェロンにより誘導されたマウス蛋白質ＭX
と交叉反応しないモノクローナル抗体を分泌することを
特徴とするハイブリドーマセルライン。
質に対して反応するがインターフェロンにより誘導され
るネズミ蛋白質と交叉反応しないモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマの提供。 【構成】 次の性質：（１）インターフェロン−α又は
−βにより誘導されたヒト細胞中に存在するが、処理さ
れていない細胞中には合理的な程度に存在しない；
（２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
７８kDa の分子量を有する；（３）約６．３の等電点を
有する；（４）次の配列： Val-Val-Ser-Glu-Val(5)-As
p-Ile-Ala-Lys-Ala(10)-で表わされる部分的Ｎ−末端ア
ミノ酸配列を有する；を有する蛋白質に対して反応し且
つインターフェロンにより誘導されたマウス蛋白質ＭX
と交叉反応しないモノクローナル抗体を分泌することを
特徴とするハイブリドーマセルライン。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、インターフェロン−α
又は−βによりヒト細胞内で誘導される精製された蛋白
質に対して特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマセルライン及びその製造方法に関する。
又は−βによりヒト細胞内で誘導される精製された蛋白
質に対して特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマセルライン及びその製造方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】インターフェロンはウイルス感染に対す
る防御及び腫瘍の増殖の制御において有望視される天然
蛋白質類である。これらはウイルスの増殖に必要な細胞
機能を妨害し、そして分子レベルではまだ理解されてい
ないプレイオトロピック（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ）効
果により細胞増殖を阻害する様である。さらに、インタ
ーフェロンはナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞の活性を
刺激し、そしてリンホカインの相互作用の複雑なネット
ワーク内でマクロファージ、Ｂ−細胞及びＴ−細胞の活
性を調節する。
る防御及び腫瘍の増殖の制御において有望視される天然
蛋白質類である。これらはウイルスの増殖に必要な細胞
機能を妨害し、そして分子レベルではまだ理解されてい
ないプレイオトロピック（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ）効
果により細胞増殖を阻害する様である。さらに、インタ
ーフェロンはナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞の活性を
刺激し、そしてリンホカインの相互作用の複雑なネット
ワーク内でマクロファージ、Ｂ−細胞及びＴ−細胞の活
性を調節する。
【０００３】インターフェロンの抗ウイルス活性、抗増
殖活性及び免疫調節活性に一群の誘導された蛋白質が関
与するであろう。哺乳類細胞中で、インターフェロンは
未処理細胞内では検出されないか又は極めて低濃度でし
か存在しない幾つかの蛋白質の合成を誘導する。これら
の誘導された蛋白質の幾つかは広く研究されている〔P.
Lengyel, Annu.Rev.Biochem. , 51, 251 (1982)〕が、
しかし今なおあまり特徴付けられていない。インターフ
ェロンで処理されたヒト由来の細胞及びマウス由来の細
胞の両者は上昇したレベルの２′，５′−オリゴイソア
デニレートシンセターゼ活性及びプロテインキナーゼ活
性を含有する。
殖活性及び免疫調節活性に一群の誘導された蛋白質が関
与するであろう。哺乳類細胞中で、インターフェロンは
未処理細胞内では検出されないか又は極めて低濃度でし
か存在しない幾つかの蛋白質の合成を誘導する。これら
の誘導された蛋白質の幾つかは広く研究されている〔P.
Lengyel, Annu.Rev.Biochem. , 51, 251 (1982)〕が、
しかし今なおあまり特徴付けられていない。インターフ
ェロンで処理されたヒト由来の細胞及びマウス由来の細
胞の両者は上昇したレベルの２′，５′−オリゴイソア
デニレートシンセターゼ活性及びプロテインキナーゼ活
性を含有する。
【０００４】インターフェロン−α及び−βにより誘導
されるマウス−プロテインＭX の合成及び性質が詳細に
研究されている〔P.Staeheli等、Cell, 44, 147 (198
6)〕。この蛋白質はインフルエンザウイルスに対して非
常に効果的で且つ特異的な抗ウイルス抵抗性と関連する
〔M.A.Horisberger 等、Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 8
0, 1910 (1983) ；M.A.Horisberger & H.K.Hochkeppel,
J.Biol.Chem., 260 , 1730 (1985) 〕。関連するヒト
蛋白質がインターフェロンで誘導されたヒト末梢血リン
パ球及び線維芽細胞中で検出された〔P.Staeheli & O.H
oller, Mol.Cell Biol., ５, 2150 (1985) 〕。８０kD
a （キロダルトン）の分子量が見出され、そしてこの蛋
白質は支配的に細胞質中に局在したが、しかしこの蛋白
質はこれ以上特徴付けられておらず又は単離されていな
い。
されるマウス−プロテインＭX の合成及び性質が詳細に
研究されている〔P.Staeheli等、Cell, 44, 147 (198
6)〕。この蛋白質はインフルエンザウイルスに対して非
常に効果的で且つ特異的な抗ウイルス抵抗性と関連する
〔M.A.Horisberger 等、Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 8
0, 1910 (1983) ；M.A.Horisberger & H.K.Hochkeppel,
J.Biol.Chem., 260 , 1730 (1985) 〕。関連するヒト
蛋白質がインターフェロンで誘導されたヒト末梢血リン
パ球及び線維芽細胞中で検出された〔P.Staeheli & O.H
oller, Mol.Cell Biol., ５, 2150 (1985) 〕。８０kD
a （キロダルトン）の分子量が見出され、そしてこの蛋
白質は支配的に細胞質中に局在したが、しかしこの蛋白
質はこれ以上特徴付けられておらず又は単離されていな
い。
【０００５】近年における組換ＤＮＡ技法の急速な進歩
は蛋白質の一次天然源とは独立にその蛋白質を多量に製
造するための一般的方法を提供する。所望のポリペプチ
ドをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡの同定はこの方法の
成功のために必須である。もし、（部分的）アミノ酸配
列情報が得られれば、化学合成されたヌクレオチドプロ
ーブが、それぞれ所望のポリペプチドを生産する細胞由
来のｍＲＮＡの混合物から、又はＤＮＡライブラリーか
らのコードｍＲＮＡ又はＤＮＡの単離を導くであろう。
は蛋白質の一次天然源とは独立にその蛋白質を多量に製
造するための一般的方法を提供する。所望のポリペプチ
ドをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡの同定はこの方法の
成功のために必須である。もし、（部分的）アミノ酸配
列情報が得られれば、化学合成されたヌクレオチドプロ
ーブが、それぞれ所望のポリペプチドを生産する細胞由
来のｍＲＮＡの混合物から、又はＤＮＡライブラリーか
らのコードｍＲＮＡ又はＤＮＡの単離を導くであろう。
【０００６】所望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
又はＤＮＡの単離のための多くの例が原理的に記載され
ているが、各新たな特異的な問題点がこの技法の特定の
事例への適用を要求する。所望のポリペプチドをコード
する相補的ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを一度手にすれば、
適当なベクターの調製、これらのベクターによる宿主の
形質転換、形質転換された宿主の発酵、及び発現された
ポリペプチドの単離を標準的方法に従って行うことがで
きる。ここでもやはり、ＤＮＡの安定な挿入、選択され
た宿主細胞での所望のポリペプチドの十分に高い発現、
及び純粋で生物学的に活性な単離された蛋白質の許容さ
れる収量を得るためには、前記の方法が特定の問題に適
合されなければならない。
又はＤＮＡの単離のための多くの例が原理的に記載され
ているが、各新たな特異的な問題点がこの技法の特定の
事例への適用を要求する。所望のポリペプチドをコード
する相補的ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを一度手にすれば、
適当なベクターの調製、これらのベクターによる宿主の
形質転換、形質転換された宿主の発酵、及び発現された
ポリペプチドの単離を標準的方法に従って行うことがで
きる。ここでもやはり、ＤＮＡの安定な挿入、選択され
た宿主細胞での所望のポリペプチドの十分に高い発現、
及び純粋で生物学的に活性な単離された蛋白質の許容さ
れる収量を得るためには、前記の方法が特定の問題に適
合されなければならない。
【０００７】さらに、組換ＤＮＡ技法は宿主に導入され
るコードＤＮＡを変異せしめ又は変形せしめることによ
りポリペプチド変形体の製造を可能にし、これにより天
然の単一ペプチド構成において見出される活性原理の潜
在的用途を拡張する。インターフェロンにより誘導され
る蛋白質は、２つの観点において診断、疾患の管理及び
療法において重要である。一方においてこれらはインタ
ーフェロンの不所望の副作用を伴わないで抗ウイルス活
性又は抗増殖活性のごとく有益な性質を発揮することが
でき、他方においてこれらはインターフェロン療法にお
ける細胞応答の価値ある指示薬である。この様なインタ
ーフェロンにより誘導された蛋白質に対する抗体はこれ
らの蛋白質の定性的及び定量的測定を可能にし、そして
それ由にこれらの蛋白質又はインターフェロンを用いる
療法の監視において必須の手段である。
るコードＤＮＡを変異せしめ又は変形せしめることによ
りポリペプチド変形体の製造を可能にし、これにより天
然の単一ペプチド構成において見出される活性原理の潜
在的用途を拡張する。インターフェロンにより誘導され
る蛋白質は、２つの観点において診断、疾患の管理及び
療法において重要である。一方においてこれらはインタ
ーフェロンの不所望の副作用を伴わないで抗ウイルス活
性又は抗増殖活性のごとく有益な性質を発揮することが
でき、他方においてこれらはインターフェロン療法にお
ける細胞応答の価値ある指示薬である。この様なインタ
ーフェロンにより誘導された蛋白質に対する抗体はこれ
らの蛋白質の定性的及び定量的測定を可能にし、そして
それ由にこれらの蛋白質又はインターフェロンを用いる
療法の監視において必須の手段である。
【０００８】インターフェロンにより誘導されたマウス
ＭX 蛋白質に対するポリクローナル抗体及びモノクロー
ナル抗体が知られている〔P.Staeheli & O.Haller, Mo
l.Cell Biol., ５, 2150 (1985) 〕。これらの内の１つ
はヒトインターフェロン誘導−蛋白質に対して弱い交差
反応性を示すが、しかしながら非特異的交差反応性が排
除され得ない。
ＭX 蛋白質に対するポリクローナル抗体及びモノクロー
ナル抗体が知られている〔P.Staeheli & O.Haller, Mo
l.Cell Biol., ５, 2150 (1985) 〕。これらの内の１つ
はヒトインターフェロン誘導−蛋白質に対して弱い交差
反応性を示すが、しかしながら非特異的交差反応性が排
除され得ない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、インターフ
ェロン−α又は−βにより誘導されたヒト細胞中に見出
される蛋白質と関連するか又はそれと同一の純粋な蛋白
質を提供することを目的とする。この様な蛋白質の工業
的合成の問題は組換ＤＮＡ技術の方法により解決され得
る。従って本発明の他の目的はこの蛋白質をコードする
ｍＲＮＡ，ＤＮＡ及びハイブリドベクター、並びに該ベ
クターにより形質転換された宿主を提供することであ
る。
ェロン−α又は−βにより誘導されたヒト細胞中に見出
される蛋白質と関連するか又はそれと同一の純粋な蛋白
質を提供することを目的とする。この様な蛋白質の工業
的合成の問題は組換ＤＮＡ技術の方法により解決され得
る。従って本発明の他の目的はこの蛋白質をコードする
ｍＲＮＡ，ＤＮＡ及びハイブリドベクター、並びに該ベ
クターにより形質転換された宿主を提供することであ
る。
【００１０】他の目的は、該蛋白質、ｍＲＮＡ，ＤＮＡ
及びハイブリドベクターの製造及び精製の方法、並びに
該ハイブリドベクターを含有する宿主の製造方法を提供
することである。この発明の他の目的は、前記蛋白質の
定性的及び定量的測定のための診断的手段としてのモノ
クローナル抗体、該モノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマ、並びにこれらの抗体及びハイブリドーマの
製造方法、さらには前記蛋白質を含有する医薬の製造方
法を提供することである。
及びハイブリドベクターの製造及び精製の方法、並びに
該ハイブリドベクターを含有する宿主の製造方法を提供
することである。この発明の他の目的は、前記蛋白質の
定性的及び定量的測定のための診断的手段としてのモノ
クローナル抗体、該モノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマ、並びにこれらの抗体及びハイブリドーマの
製造方法、さらには前記蛋白質を含有する医薬の製造方
法を提供することである。
【００１１】
【具体的な説明】この発明は、次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
７８kDa の分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： Val-Val-Ser-Glu-Val(5)-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala(10)- で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する；に
より特徴付けられる本質的に純粋な蛋白質に対して反応
し、インターフェロンにより誘導されたマウス蛋白質Ｍ
X と交叉反応しないモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ、及びその製造方法に関する。
ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
７８kDa の分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： Val-Val-Ser-Glu-Val(5)-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala(10)- で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する；に
より特徴付けられる本質的に純粋な蛋白質に対して反応
し、インターフェロンにより誘導されたマウス蛋白質Ｍ
X と交叉反応しないモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ、及びその製造方法に関する。
【００１２】特に、抗原蛋白質は組換インターフェロン
α／Ｂ，α／Ｄ，α／Ｆ又はインターフェロンα／Ｂ−
Ｄハイブリドにより処理されたヒトの胎児包皮（embryo
nicforeskin）細胞又はナマルワ（Ｎａｍａｌｗａ）細
胞中に見出される。次の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列：
α／Ｂ，α／Ｄ，α／Ｆ又はインターフェロンα／Ｂ−
Ｄハイブリドにより処理されたヒトの胎児包皮（embryo
nicforeskin）細胞又はナマルワ（Ｎａｍａｌｗａ）細
胞中に見出される。次の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列：
【００１３】
【化１】 を有する蛋白質が特に好ましい。
【００１４】７８kDa の分子量は通常の分子量マーカー
を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥに基くものである。しかしな
がら、関連するマウス蛋白質ＭX 〔P.Staeheli等、Cel
l, 44, 147 (1986)〕を用いる研究から、実際の分子量
はさらに低く、おそらく約７２kDa であると推定するこ
とができる。この蛋白質はまた、７２kDa の分子量に基
いて全アミノ酸分析により決定されるアミノ酸組成によ
り特徴付けられる（表１）。表１に示す分析された蛋白
質のアミノ酸の実際の数の範囲は分析方法の不正確さ
（標準偏差）から計算される。
を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥに基くものである。しかしな
がら、関連するマウス蛋白質ＭX 〔P.Staeheli等、Cel
l, 44, 147 (1986)〕を用いる研究から、実際の分子量
はさらに低く、おそらく約７２kDa であると推定するこ
とができる。この蛋白質はまた、７２kDa の分子量に基
いて全アミノ酸分析により決定されるアミノ酸組成によ
り特徴付けられる（表１）。表１に示す分析された蛋白
質のアミノ酸の実際の数の範囲は分析方法の不正確さ
（標準偏差）から計算される。
【００１５】
【表１】 本発明はまた前記蛋白質の製造方法に関し、この方法は
該蛋白質を生産する細胞を培養し、そして細胞上清又は
細胞溶解混合物から該蛋白質を単離し、そして沈澱及び
クロマトグラフ法により精製することを特徴とする。
該蛋白質を生産する細胞を培養し、そして細胞上清又は
細胞溶解混合物から該蛋白質を単離し、そして沈澱及び
クロマトグラフ法により精製することを特徴とする。
【００１６】特に、本発明は純粋な形態の前記蛋白質の
製造方法に関し、この方法はヒト細胞、好ましくは連続
性ヒトセルライン、例えばナマルワ細胞又は胎児包皮細
胞を、ヒト−インターフェロン−α又は−β、例えば天
然ヒト−インターフェロン−α又は組換ヒト−インター
フェロン−α、例えばインターフェロンα／Ｂ，α／
Ｄ，α／Ｆもしくはα／Ｂ−Ｄハイブリドの存在下で培
養し、そして細胞を溶解し、上清中の蛋白質を例えば硫
酸アンモニウムの添加により沈澱せしめ、次に分取用ゲ
ル電気泳動により分離し、そして約７８kDa の見かけ分
子量の蛋白質を例えば電気溶出により溶出することを特
徴とする。
製造方法に関し、この方法はヒト細胞、好ましくは連続
性ヒトセルライン、例えばナマルワ細胞又は胎児包皮細
胞を、ヒト−インターフェロン−α又は−β、例えば天
然ヒト−インターフェロン−α又は組換ヒト−インター
フェロン−α、例えばインターフェロンα／Ｂ，α／
Ｄ，α／Ｆもしくはα／Ｂ−Ｄハイブリドの存在下で培
養し、そして細胞を溶解し、上清中の蛋白質を例えば硫
酸アンモニウムの添加により沈澱せしめ、次に分取用ゲ
ル電気泳動により分離し、そして約７８kDa の見かけ分
子量の蛋白質を例えば電気溶出により溶出することを特
徴とする。
【００１７】この発明の蛋白質の製造のために有用なヒ
ト細胞は正常リンパ球、マクロファージもしくは、単
球、リンパ芽球性細胞、例えばナマルワ細胞、又は二倍
体セルラインからのヒト胎児包皮細胞である。好ましく
は、ナマルワ細胞は、例えばウシ胎児血清の形態でビタ
ミン及び／又はホルモン並びに場合によっては抗生物質
が補充されたＲＰＭＩ １６４０培地のごとき通常の細
胞増殖培地中で培養する。指数増殖の終りに、細胞を組
換インターフェロン−α、例えばα／Ｂサブタイプ又は
α／Ｂ−Ｄハイブリドと共に、５×１０5 〜１０7 細胞
／mlの範囲の濃度及び２０００〜１０，０００国際イン
ターフェロンユニット／mlにおいて、好ましくは約３７
℃にてインキュベートする。
ト細胞は正常リンパ球、マクロファージもしくは、単
球、リンパ芽球性細胞、例えばナマルワ細胞、又は二倍
体セルラインからのヒト胎児包皮細胞である。好ましく
は、ナマルワ細胞は、例えばウシ胎児血清の形態でビタ
ミン及び／又はホルモン並びに場合によっては抗生物質
が補充されたＲＰＭＩ １６４０培地のごとき通常の細
胞増殖培地中で培養する。指数増殖の終りに、細胞を組
換インターフェロン−α、例えばα／Ｂサブタイプ又は
α／Ｂ−Ｄハイブリドと共に、５×１０5 〜１０7 細胞
／mlの範囲の濃度及び２０００〜１０，０００国際イン
ターフェロンユニット／mlにおいて、好ましくは約３７
℃にてインキュベートする。
【００１８】この発明の蛋白質の生産を誘導するため
に、既知の天然又は組換インターフェロン−α又は−
β、例えば特許出願ＥＰ ２８０３３，ＥＰ ３２１３
４，ＥＰ４３９０８，ＥＰ ７２５４１、又はＥＰ ７
６４８９に記載されている組換インターフェロンを使用
することができる。細胞を回収し、そして通常の方法、
例えば緩衝液中高塩濃度により細胞を溶解し、そして蛋
白質を例えば硫酸アンモニウムの添加により沈澱せしめ
る。目的蛋白質は通常の生理的溶剤系中にむしろ不溶性
である。
に、既知の天然又は組換インターフェロン−α又は−
β、例えば特許出願ＥＰ ２８０３３，ＥＰ ３２１３
４，ＥＰ４３９０８，ＥＰ ７２５４１、又はＥＰ ７
６４８９に記載されている組換インターフェロンを使用
することができる。細胞を回収し、そして通常の方法、
例えば緩衝液中高塩濃度により細胞を溶解し、そして蛋
白質を例えば硫酸アンモニウムの添加により沈澱せしめ
る。目的蛋白質は通常の生理的溶剤系中にむしろ不溶性
である。
【００１９】目的蛋白質をゲル電気泳動により精製す
る。分取用ゲル電気泳動を２回行い、例えばまず７０kD
a 未満の分子量を有する蛋白質及び８５kDa より大きい
分子量を有する蛋白質からの粗分離を行い、次に得られ
た蛋白質混合物の二次元分離を、非−平衡pHグラジエン
ト電気泳動とＳＤＳ−ポリアクリルゲル電気泳動を組合
わせることにより行う。具体的には、前記蛋白質混合物
を、２％の両性電解質を含有する非−平衡pHグラジエン
ト電気泳動ゲル（pH３−１０）の酸性末端に適用し、次
に第二次元において１０〜１５％、好ましくは１２％の
アクリルアミド及び０．５％以下例えば約０．３％のビ
ス−アクリルアミドを含有するスラブゲル上で分離す
る。
る。分取用ゲル電気泳動を２回行い、例えばまず７０kD
a 未満の分子量を有する蛋白質及び８５kDa より大きい
分子量を有する蛋白質からの粗分離を行い、次に得られ
た蛋白質混合物の二次元分離を、非−平衡pHグラジエン
ト電気泳動とＳＤＳ−ポリアクリルゲル電気泳動を組合
わせることにより行う。具体的には、前記蛋白質混合物
を、２％の両性電解質を含有する非−平衡pHグラジエン
ト電気泳動ゲル（pH３−１０）の酸性末端に適用し、次
に第二次元において１０〜１５％、好ましくは１２％の
アクリルアミド及び０．５％以下例えば約０．３％のビ
ス−アクリルアミドを含有するスラブゲル上で分離す
る。
【００２０】好ましくは、この発明で使用する蛋白質
は、例えば前記の蛋白質を発現する形質転換された宿主
を異種性蛋白質の発現を許容する条件下で培養し、そし
て目的化合物を単離することを含んで成る組換ＤＮＡ技
法により製造される。さらに詳しくは、目的蛋白質は次
のようにして製造される。
は、例えば前記の蛋白質を発現する形質転換された宿主
を異種性蛋白質の発現を許容する条件下で培養し、そし
て目的化合物を単離することを含んで成る組換ＤＮＡ技
法により製造される。さらに詳しくは、目的蛋白質は次
のようにして製造される。
【００２１】（ａ）ヒト細胞のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮ
Ａライブラリーから前記蛋白質をコードするＤＮＡを単
離し、（ｂ）このＤＮＡを適当な発現ベクターに導入
し、（ｃ）得られたハイブリドベクターを受容体宿主に
移行せしめ、（ｄ）形質転換された宿主のみが生存する
条件下で培養することにより未形質転換宿主から形質転
換された宿主を選択し、（ｅ）この形質転換された宿主
を異種性ポリペプチドの発現を許容する条件下で培養
し、そして（ｆ）目的蛋白質を単離する。
Ａライブラリーから前記蛋白質をコードするＤＮＡを単
離し、（ｂ）このＤＮＡを適当な発現ベクターに導入
し、（ｃ）得られたハイブリドベクターを受容体宿主に
移行せしめ、（ｄ）形質転換された宿主のみが生存する
条件下で培養することにより未形質転換宿主から形質転
換された宿主を選択し、（ｅ）この形質転換された宿主
を異種性ポリペプチドの発現を許容する条件下で培養
し、そして（ｆ）目的蛋白質を単離する。
【００２２】組換ＤＮＡ技法によるこれらのペプチドの
製造に関与する段階を後でさらに詳細に検討する。この
発明はまた、前記の蛋白質をコードするＤＮＡにも関連
する。この発明は特に、次の式（Ｉ）：
製造に関与する段階を後でさらに詳細に検討する。この
発明はまた、前記の蛋白質をコードするＤＮＡにも関連
する。この発明は特に、次の式（Ｉ）：
【００２３】
【化２】
【００２４】（式中、Ｚ1 はプロモーター配列を含む、
１２以上のヌクレオチドから成る５′−末端ＤＮＡ残基
であり、Ｚ2 は１７００以上のコードヌクレオチド、終
止コドン及び場合によっては存在する３′−末端の非コ
ードヌクレオチドから成るＤＮＡ残基であり、そしてＺ
1 及びＺ2 は場合によっては連結されている）で表わさ
れるＤＮＡ、１又は複数のトリプレットが同じアミノ酸
をコードする他のトリプレットにより置き換えられてい
る式（Ｉ）のＤＮＡ、式（Ｉ）のＤＮＡとこれに対して
相補的なＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡ、並びに相補的
ＤＮＡそれ自体であるＤＮＡに関連する。式（Ｉ）のＤ
ＮＡの１例は、例えばヒト胎児包皮細胞のｍＲＮＡに由
来するｃＤＮＡであって、次の式（II）：
１２以上のヌクレオチドから成る５′−末端ＤＮＡ残基
であり、Ｚ2 は１７００以上のコードヌクレオチド、終
止コドン及び場合によっては存在する３′−末端の非コ
ードヌクレオチドから成るＤＮＡ残基であり、そしてＺ
1 及びＺ2 は場合によっては連結されている）で表わさ
れるＤＮＡ、１又は複数のトリプレットが同じアミノ酸
をコードする他のトリプレットにより置き換えられてい
る式（Ｉ）のＤＮＡ、式（Ｉ）のＤＮＡとこれに対して
相補的なＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡ、並びに相補的
ＤＮＡそれ自体であるＤＮＡに関連する。式（Ｉ）のＤ
ＮＡの１例は、例えばヒト胎児包皮細胞のｍＲＮＡに由
来するｃＤＮＡであって、次の式（II）：
【００２５】
【化３】
【００２６】（式中、Ｚ3 は１以上のヌクレオチドから
成る５′−末端ＤＮＡ残基であり、Ｚ2 は１７００以上
のコードヌクレオチド、終止コドン及び場合によっては
存在する３′−末端の非コードヌクレオチドから成るＤ
ＮＡ残基である）で表わされるもの、そして特に次の式
（III ）：
成る５′−末端ＤＮＡ残基であり、Ｚ2 は１７００以上
のコードヌクレオチド、終止コドン及び場合によっては
存在する３′−末端の非コードヌクレオチドから成るＤ
ＮＡ残基である）で表わされるもの、そして特に次の式
（III ）：
【００２７】
【化４】
【００２８】
【化５】
【００２９】（式中、Ｚ4 は１個以上のヌクレオチドか
ら成る５′−末端ＤＮＡ残基であり、そしてＺ5 は１５
００個以上のコードヌクレオチド、終止コドン及び場合
によっては存在する３′−末端の非コードヌクレオチド
から成るＤＮＡ残基である）で表わされるｃＤＮＡであ
る。
ら成る５′−末端ＤＮＡ残基であり、そしてＺ5 は１５
００個以上のコードヌクレオチド、終止コドン及び場合
によっては存在する３′−末端の非コードヌクレオチド
から成るＤＮＡ残基である）で表わされるｃＤＮＡであ
る。
【００３０】さらに、この発明は、式（Ｉ），（II）、
又は（III ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、例
えば次の式（IV）： ５′−GCTTTTGCGATGTCCACTTC−３′ （IV） で表わされる２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチド、次の式
（Ｖ）： ５′−CAGCCACCATTCCAAGG −３′ （Ｖ） で表わされる１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチド、及び次
の式（VI）： ５′−CGCACCTTCTCCTCATACTGG −３′ （VI） で表わされる２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドに関す
る。この発明はまた、前記の蛋白質をコードするＲＮ
Ａ、特に、Ｚ1 〜Ｚ5 が前記の意味を有するが但しＤＮ
Ａ残基の代りにＲＮＡ残基が存在しそしてそれ故にデオ
キシ−チミジン（Ｔ）の代りにウリジン（Ｕ）が存在す
る式（Ｉ），（II）又は（III ）のＲＮＡに関連する。
又は（III ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、例
えば次の式（IV）： ５′−GCTTTTGCGATGTCCACTTC−３′ （IV） で表わされる２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチド、次の式
（Ｖ）： ５′−CAGCCACCATTCCAAGG −３′ （Ｖ） で表わされる１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチド、及び次
の式（VI）： ５′−CGCACCTTCTCCTCATACTGG −３′ （VI） で表わされる２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドに関す
る。この発明はまた、前記の蛋白質をコードするＲＮ
Ａ、特に、Ｚ1 〜Ｚ5 が前記の意味を有するが但しＤＮ
Ａ残基の代りにＲＮＡ残基が存在しそしてそれ故にデオ
キシ−チミジン（Ｔ）の代りにウリジン（Ｕ）が存在す
る式（Ｉ），（II）又は（III ）のＲＮＡに関連する。
【００３１】目的蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば
形質転換された宿主を培養し、これから目的ＤＮＡを単
離することにより製造することができる。特に、この様
なＤＮＡは次の様にして製造することができる。 （ａ）ヒト細胞からｍＲＮＡを単離し、目的のｍＲＮＡ
を選択し、該ｍＲＮＡに対して相補的な単鎖ＤＮＡを調
製し、次にこれから二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ ｃＤＮＡ）を
調製するか、又は（ｂ）ヒト細胞からゲノムＤＮＡを単
離し、そしてＤＮＡプローブを用いて目的のＤＮＡを選
択し、そして（ｃ）段階（ａ）のｃＤＮＡ又は段階
（ｂ）のｄｓＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し、
（ｄ）この得られたハイブリドベクターにより適当な宿
主微生物を形質転換し、（ｅ）目的の蛋白質をコードす
るＤＮＡを含有する形質転換された宿主をコードＤＮＡ
を含有しない宿主から選択し、そして（ｆ）目的のＤＮ
Ａを単離する。
形質転換された宿主を培養し、これから目的ＤＮＡを単
離することにより製造することができる。特に、この様
なＤＮＡは次の様にして製造することができる。 （ａ）ヒト細胞からｍＲＮＡを単離し、目的のｍＲＮＡ
を選択し、該ｍＲＮＡに対して相補的な単鎖ＤＮＡを調
製し、次にこれから二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ ｃＤＮＡ）を
調製するか、又は（ｂ）ヒト細胞からゲノムＤＮＡを単
離し、そしてＤＮＡプローブを用いて目的のＤＮＡを選
択し、そして（ｃ）段階（ａ）のｃＤＮＡ又は段階
（ｂ）のｄｓＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し、
（ｄ）この得られたハイブリドベクターにより適当な宿
主微生物を形質転換し、（ｅ）目的の蛋白質をコードす
るＤＮＡを含有する形質転換された宿主をコードＤＮＡ
を含有しない宿主から選択し、そして（ｆ）目的のＤＮ
Ａを単離する。
【００３２】ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡを既
知の方法によりヒト細胞から単離する。適当な細胞は、
正常リンパ球、マクロファージ、単球、リンパ芽球性細
胞、例えばナマルワ細胞、ヒト胎児包皮二倍体細胞等で
あって天然又は組換インターフェロン−α又は−βによ
り誘導されたものである。単離方法は例えば、刺激され
た細胞を洗剤及び場合によってはリボヌクレアーゼ阻害
剤、例えばヘパリン、イソチオシアン酸グアニジニウム
及びメルカプトエタノールの存在下で溶解し、ｍＲＮＡ
をフェノール又は適当なクロロホルム−フェノール混合
物により場合によって塩及び緩衝液、洗剤、プロテイナ
ーゼ及び／又は陽イオンキレート剤の存在下で抽出し、
そして残留水性塩含有相からｍＲＮＡをエタノール、イ
ソプロパノール等により沈澱せしめることを含む。
知の方法によりヒト細胞から単離する。適当な細胞は、
正常リンパ球、マクロファージ、単球、リンパ芽球性細
胞、例えばナマルワ細胞、ヒト胎児包皮二倍体細胞等で
あって天然又は組換インターフェロン−α又は−βによ
り誘導されたものである。単離方法は例えば、刺激され
た細胞を洗剤及び場合によってはリボヌクレアーゼ阻害
剤、例えばヘパリン、イソチオシアン酸グアニジニウム
及びメルカプトエタノールの存在下で溶解し、ｍＲＮＡ
をフェノール又は適当なクロロホルム−フェノール混合
物により場合によって塩及び緩衝液、洗剤、プロテイナ
ーゼ及び／又は陽イオンキレート剤の存在下で抽出し、
そして残留水性塩含有相からｍＲＮＡをエタノール、イ
ソプロパノール等により沈澱せしめることを含む。
【００３３】塩化セシウムグラジエント中で遠心し次に
エタノール沈澱することにより、及び／又はクロマトグ
ラフ法、例えばアフィニティークロマトグラフ法、例え
ばオリゴ（ｄＴ）セルロース又はオリゴ（Ｕ）セファロ
ース上でのクロマトグラフィーにより、単離されたｍＲ
ＮＡをさらに精製することができる。好ましくは、例え
ば直線シュークロース勾配中でのグラジエント遠心によ
り、又は適当なサイズ分画カラム例えばアガロースゲル
上でのクロマトグラフィーにより、粗製の又は精製され
た全ｍＲＮＡをサイズに従って分画する。
エタノール沈澱することにより、及び／又はクロマトグ
ラフ法、例えばアフィニティークロマトグラフ法、例え
ばオリゴ（ｄＴ）セルロース又はオリゴ（Ｕ）セファロ
ース上でのクロマトグラフィーにより、単離されたｍＲ
ＮＡをさらに精製することができる。好ましくは、例え
ば直線シュークロース勾配中でのグラジエント遠心によ
り、又は適当なサイズ分画カラム例えばアガロースゲル
上でのクロマトグラフィーにより、粗製の又は精製され
た全ｍＲＮＡをサイズに従って分画する。
【００３４】ＤＮＡプローブを用いるスクリーニングに
より、又は適当な細胞もしくは無細胞系での翻訳及び得
られるポリペプチドのスクリーニングにより、目的ｍＲ
ＮＡを選択する。好ましくは、分画されたｍＲＮＡを細
胞中、例えばカエルの卵母細胞中で、又は無細胞系中、
例えば網状赤血球溶解物又は小麦胚抽出物中で翻訳す
る。得られたポリペプチドを前記の様にして得られた天
然蛋白質と、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より比較し、そして目的蛋白質を生じさせるｍＲＮＡ画
分を選択する。
より、又は適当な細胞もしくは無細胞系での翻訳及び得
られるポリペプチドのスクリーニングにより、目的ｍＲ
ＮＡを選択する。好ましくは、分画されたｍＲＮＡを細
胞中、例えばカエルの卵母細胞中で、又は無細胞系中、
例えば網状赤血球溶解物又は小麦胚抽出物中で翻訳す
る。得られたポリペプチドを前記の様にして得られた天
然蛋白質と、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より比較し、そして目的蛋白質を生じさせるｍＲＮＡ画
分を選択する。
【００３５】選択されたｍＲＮＡ鋳型からの単鎖相補的
ＤＮＡの調製、及び単鎖ＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡの調
製は当業界においてよく知られている。ｍＲＮＡ鎖型
を、デオキシヌクレオチドトリホスフェートの混合物、
場合によっては放射能ラベルされたデオキシヌクレオチ
ドトリホスフェート（反応の結果をスクリーニングする
ことができるように）、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルと
ハイブリダイズするオリゴ（ｄＴ）のごときプライマー
配列、及び適当な酵素、例えば逆転写酵素と共にインキ
ュベートする。
ＤＮＡの調製、及び単鎖ＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡの調
製は当業界においてよく知られている。ｍＲＮＡ鎖型
を、デオキシヌクレオチドトリホスフェートの混合物、
場合によっては放射能ラベルされたデオキシヌクレオチ
ドトリホスフェート（反応の結果をスクリーニングする
ことができるように）、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルと
ハイブリダイズするオリゴ（ｄＴ）のごときプライマー
配列、及び適当な酵素、例えば逆転写酵素と共にインキ
ュベートする。
【００３６】鋳型ｍＲＮＡを分解した後、相補的ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）をデオキシリボヌクレオチドトリホスフェ
ート及び上記のごとき適当な酵素と共にインキュベート
して二本鎖ＤＮＡを得る。適当な酵素は逆転写酵素、
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌ
ｅｎｏｗ断片、又はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼである。
場合によっては単鎖ＤＮＡをまず好ましいデオキシヌク
レオチドのテイルにより延長して好ましいデオキシヌク
レオチドと相補的なプライマー配列の使用を可能にする
が、しかしｄｓＤＮＡの形成は通常自発的ヘアピン形成
の後に始まる。
（ｃＤＮＡ）をデオキシリボヌクレオチドトリホスフェ
ート及び上記のごとき適当な酵素と共にインキュベート
して二本鎖ＤＮＡを得る。適当な酵素は逆転写酵素、
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌ
ｅｎｏｗ断片、又はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼである。
場合によっては単鎖ＤＮＡをまず好ましいデオキシヌク
レオチドのテイルにより延長して好ましいデオキシヌク
レオチドと相補的なプライマー配列の使用を可能にする
が、しかしｄｓＤＮＡの形成は通常自発的ヘアピン形成
の後に始まる。
【００３７】ヘアピン形成の結果として得られたこの様
なｄｓＤＮＡを、該ヘアピンを切断するＳ１ヌクレアー
ゼによりさらに処理する。好ましい他の方法において
は、ｍＲＮＡ／ＤＮＡをＲＮアーゼＨ、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼＩにより直接処理して、
プライマー配列による延長及び／又はヘアピン切断の追
加の段階を回避する。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの調製の
別の方法として、ゲノムＤＮＡを単離し、そして目的ポ
リペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニング
することができる。
なｄｓＤＮＡを、該ヘアピンを切断するＳ１ヌクレアー
ゼによりさらに処理する。好ましい他の方法において
は、ｍＲＮＡ／ＤＮＡをＲＮアーゼＨ、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼＩにより直接処理して、
プライマー配列による延長及び／又はヘアピン切断の追
加の段階を回避する。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの調製の
別の方法として、ゲノムＤＮＡを単離し、そして目的ポ
リペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニング
することができる。
【００３８】ゲノムＤＮＡは適当なヒト組織から、好ま
しくはヒト胎盤又はヒト胎児肝細胞から既知の方法に従
って単離する。これを確立された方法に従って適当な制
限エンドヌクレアーゼにより消化し、そしてλシャロン
ファージ、例えばλシャロン４Ａに導入することにより
ゲノムＤＮＡライブラリーを調製する。ニトロセルロー
ス膜上にレプリカしたゲノムＤＮＡライブラリーを、Ｄ
ＮＡプローブ、例えば１７個以上のヌクレオチドから成
る合成ＤＮＡプローブ又は前記の様にして目的ポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡから誘導したｃＤＮＡを用い
てスクリーニングする。
しくはヒト胎盤又はヒト胎児肝細胞から既知の方法に従
って単離する。これを確立された方法に従って適当な制
限エンドヌクレアーゼにより消化し、そしてλシャロン
ファージ、例えばλシャロン４Ａに導入することにより
ゲノムＤＮＡライブラリーを調製する。ニトロセルロー
ス膜上にレプリカしたゲノムＤＮＡライブラリーを、Ｄ
ＮＡプローブ、例えば１７個以上のヌクレオチドから成
る合成ＤＮＡプローブ又は前記の様にして目的ポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡから誘導したｃＤＮＡを用い
てスクリーニングする。
【００３９】ｍＲＮＡから調製されたｄｓＤＮＡ又はゲ
ノム由来のｄｓＤＮＡの適当なベクターへの導入は当業
界においてよく知られている。例えば、適当なベクター
を切断し、そして適切なデオキシリボヌクレオチドのテ
イルを付す。次に、アニールすべきｄｓＤＮＡは相補的
な適切なデオキシヌクレオチドのテイルを担持しなけれ
ばならず、これは対応するデオキシヌクレオチドトリホ
スフェート及びターミナルヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼのごとき酵素の存在下でのインキュベーションに
より達成される。他の方法として、相補的突出末端をも
たらす同じエンドヌクレオチドによる処理の後の単なる
連結により、リンカーオリゴヌクレオチドを用いて、又
は平滑末端連結により、ｄｓＤＮＡをベクターに導入す
ることができる。
ノム由来のｄｓＤＮＡの適当なベクターへの導入は当業
界においてよく知られている。例えば、適当なベクター
を切断し、そして適切なデオキシリボヌクレオチドのテ
イルを付す。次に、アニールすべきｄｓＤＮＡは相補的
な適切なデオキシヌクレオチドのテイルを担持しなけれ
ばならず、これは対応するデオキシヌクレオチドトリホ
スフェート及びターミナルヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼのごとき酵素の存在下でのインキュベーションに
より達成される。他の方法として、相補的突出末端をも
たらす同じエンドヌクレオチドによる処理の後の単なる
連結により、リンカーオリゴヌクレオチドを用いて、又
は平滑末端連結により、ｄｓＤＮＡをベクターに導入す
ることができる。
【００４０】得られたハイブリドベクターによる適当な
宿主微生物の形質転換は当業界においてよく知られてい
る。例えば、Ｅ．コリを塩化カルシウムを含有する媒体
中でインキュベートすることにより形質転換のために条
件調節し、そして次にハイブリドベクターにより処理す
る。形質転換された宿主は、適当なマーカーにより、例
えば抗生物質耐性マーカー、例えばテトラサイクリン、
クロラムフェニコール又はアンピシリン耐性マーカーに
より、及び／又は酵素マーカー、例えばα−プロテイン
を補完するβ−ガラクトシダーゼにより選択する。
宿主微生物の形質転換は当業界においてよく知られてい
る。例えば、Ｅ．コリを塩化カルシウムを含有する媒体
中でインキュベートすることにより形質転換のために条
件調節し、そして次にハイブリドベクターにより処理す
る。形質転換された宿主は、適当なマーカーにより、例
えば抗生物質耐性マーカー、例えばテトラサイクリン、
クロラムフェニコール又はアンピシリン耐性マーカーに
より、及び／又は酵素マーカー、例えばα−プロテイン
を補完するβ−ガラクトシダーゼにより選択する。
【００４１】所望のＤＮＡにより形質転換された宿主は
好ましくはＤＮＡプローブを用いて選択する。この様な
ハイブリダイゼーションプローブは例えば、インターフ
ェロンにより誘導されたナマルワ細胞から単離された目
的蛋白質に基いて決定された部分的アミノ酸配列を基礎
にして構成される１７個以上のヌクレオチド、例えば約
２０個のヌクレオチドから成る全合成ＤＮＡである。好
ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの混合物を調製
し、この場合該混合物の各構成員は対応する既知アミノ
酸配列のためのトリプレットコドンの可能な組合せの１
つに対して相補的である。
好ましくはＤＮＡプローブを用いて選択する。この様な
ハイブリダイゼーションプローブは例えば、インターフ
ェロンにより誘導されたナマルワ細胞から単離された目
的蛋白質に基いて決定された部分的アミノ酸配列を基礎
にして構成される１７個以上のヌクレオチド、例えば約
２０個のヌクレオチドから成る全合成ＤＮＡである。好
ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの混合物を調製
し、この場合該混合物の各構成員は対応する既知アミノ
酸配列のためのトリプレットコドンの可能な組合せの１
つに対して相補的である。
【００４２】この様なプローブもまた本発明を構成す
る。これらは既知の方法に従って、好ましくは固相ホス
ホトリエステル法、ホスファイトトリエステル法又はホ
スホラミダイト法を用いる段階的縮合により、例えばホ
スホトリエステル法によるジヌクレオチドカップリング
ユニットの縮合により合成される。これらの方法は、Y.
Ike 等〔Nucleic Acid Research , 11, 477 (1983)〕に
より記載されている様に適切な縮合段階において、保護
された形の２種類、３種類又は４種類のヌクレオチドｄ
Ａ，ｄＣ，ｄＧ及び／又はｄＴあるいは対応するジヌク
レオチドカップリングユニットの混合物を用いることに
より、目的オリゴヌクレオチドの混合物の合成に適合さ
れる。
る。これらは既知の方法に従って、好ましくは固相ホス
ホトリエステル法、ホスファイトトリエステル法又はホ
スホラミダイト法を用いる段階的縮合により、例えばホ
スホトリエステル法によるジヌクレオチドカップリング
ユニットの縮合により合成される。これらの方法は、Y.
Ike 等〔Nucleic Acid Research , 11, 477 (1983)〕に
より記載されている様に適切な縮合段階において、保護
された形の２種類、３種類又は４種類のヌクレオチドｄ
Ａ，ｄＣ，ｄＧ及び／又はｄＴあるいは対応するジヌク
レオチドカップリングユニットの混合物を用いることに
より、目的オリゴヌクレオチドの混合物の合成に適合さ
れる。
【００４３】形質転換された宿主のＤＮＡとのハイブリ
ダイゼーションを検出し、これを同定し、そしてこの発
明の目的ＤＮＡを含有しない他の宿主から前記宿主を分
離することができる様に、ＤＮＡプローブはマーカーを
含有しなければならない。例えば、オリゴヌクレオチド
の５′−末端リン酸における32Ｐのごとき放射性ラベ
ル、又は蛍光マーカー、あるいは適当にラベルされたア
ビジンにより、例えば蛍光マーカーを有するか又はホー
スラディッシュパーオキシダーゼのごとき酵素と接合し
たアビジンにより検出され得るビオチンを含有するラベ
ルが適当である。
ダイゼーションを検出し、これを同定し、そしてこの発
明の目的ＤＮＡを含有しない他の宿主から前記宿主を分
離することができる様に、ＤＮＡプローブはマーカーを
含有しなければならない。例えば、オリゴヌクレオチド
の５′−末端リン酸における32Ｐのごとき放射性ラベ
ル、又は蛍光マーカー、あるいは適当にラベルされたア
ビジンにより、例えば蛍光マーカーを有するか又はホー
スラディッシュパーオキシダーゼのごとき酵素と接合し
たアビジンにより検出され得るビオチンを含有するラベ
ルが適当である。
【００４４】形質転換された宿主からのＤＮＡとマーカ
ーを含有するＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーショ
ンは既知の方法に従って、例えば助剤例えばカルシウム
キレート剤、粘度調節剤、蛋白質、無関係のＤＮＡ又は
ｔＲＮＡ等を含有する緩衝液及び塩溶液中で、選択的ハ
イブリダイゼーションに好都合な温度、例えば０℃〜７
０℃、例えば４０℃〜５０℃、好ましくはハイブリドｄ
ｓＤＮＡの融点より約２０℃低い温度において行う。本
発明はさらに、目的の蛋白質をコードしそして発現制御
配列に作用可能に連結されているＤＮＡを含んで成るハ
イブリドベクター、及びその製造方法に関する。
ーを含有するＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーショ
ンは既知の方法に従って、例えば助剤例えばカルシウム
キレート剤、粘度調節剤、蛋白質、無関係のＤＮＡ又は
ｔＲＮＡ等を含有する緩衝液及び塩溶液中で、選択的ハ
イブリダイゼーションに好都合な温度、例えば０℃〜７
０℃、例えば４０℃〜５０℃、好ましくはハイブリドｄ
ｓＤＮＡの融点より約２０℃低い温度において行う。本
発明はさらに、目的の蛋白質をコードしそして発現制御
配列に作用可能に連結されているＤＮＡを含んで成るハ
イブリドベクター、及びその製造方法に関する。
【００４５】ベクターは、翻訳のために使用される宿主
細胞に依存して選択される。適当な宿主の例として、制
限酵素又は修飾酵素を欠いているか又はほとんど有さな
い微生物、例えば酵母、例えばサッカロミセス・セレビ
シエー（Saccharomyces cerevisiae）、例えばＳ．セ
レビシエー（S. cerevisiae）ＧＲＦ １８、及び細菌
株、特にエシェリシャ・コリ（Escherichia coli）の
株、例えばＥ．コリＸ１７７６、Ｅ．コリＨＢ１０１、
Ｅ．コリＷ３１１０、Ｅ．コリＨＢ１０１／ＬＭ１０３
５、Ｅ．コリＪＡ２２１、Ｅ．コリＪＭ１０９又はＥ．
コリＫ１２株２９４、バシルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）、
細胞に依存して選択される。適当な宿主の例として、制
限酵素又は修飾酵素を欠いているか又はほとんど有さな
い微生物、例えば酵母、例えばサッカロミセス・セレビ
シエー（Saccharomyces cerevisiae）、例えばＳ．セ
レビシエー（S. cerevisiae）ＧＲＦ １８、及び細菌
株、特にエシェリシャ・コリ（Escherichia coli）の
株、例えばＥ．コリＸ１７７６、Ｅ．コリＨＢ１０１、
Ｅ．コリＷ３１１０、Ｅ．コリＨＢ１０１／ＬＭ１０３
５、Ｅ．コリＪＡ２２１、Ｅ．コリＪＭ１０９又はＥ．
コリＫ１２株２９４、バシルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）、
【００４６】バシルス・ステアロサーモフィルス（Baci
llus stearothermophilus）、シュードモナス（Pseudo
monas ）、ヘモフィルス（Haemophilus ）、ストレプト
コッカス（Streptococcus ）等、並びに高等生物の細
胞、特に樹立されたヒト又は動物のセルライン、例えば
Ｈｅｌａ細胞、ＳＶ−４０ウイルスで形質転換されたア
フリカミドリザルＣＯＳ−７腎細胞、又はチャイニーズ
ハムスター卵巣細胞が挙げられる。Ｅ．コリの前記の
株、例えばＥ．コリＪＭ１０９、Ｅ．コリＨＢ１０１、
Ｅ．コリＫ１２及びＥ．コリＷ３１１０、並びにサッカ
ロミセス・セレビシエーの前記の株が宿主微生物として
好ましい。
llus stearothermophilus）、シュードモナス（Pseudo
monas ）、ヘモフィルス（Haemophilus ）、ストレプト
コッカス（Streptococcus ）等、並びに高等生物の細
胞、特に樹立されたヒト又は動物のセルライン、例えば
Ｈｅｌａ細胞、ＳＶ−４０ウイルスで形質転換されたア
フリカミドリザルＣＯＳ−７腎細胞、又はチャイニーズ
ハムスター卵巣細胞が挙げられる。Ｅ．コリの前記の
株、例えばＥ．コリＪＭ１０９、Ｅ．コリＨＢ１０１、
Ｅ．コリＫ１２及びＥ．コリＷ３１１０、並びにサッカ
ロミセス・セレビシエーの前記の株が宿主微生物として
好ましい。
【００４７】原理的には、選択された宿主中で本発明の
目的のポリペプチド遺伝子を複製しそして発現すること
ができるすべてのベクターが適当である。Ｅ．コリ株中
での発現のための適当なベクターの例として、バクテリ
オファージ、例えばラムダ又はＭ１３バクテリオファー
ジの誘導体、あるいはプラスミド、例えば特にプラスミ
ドＣｏｌ Ｅｌ及びその誘導体、例えばｐＭＢ９，ｐＳ
Ｆ２１２４，ｐＢＲ３１７又はｐＢＲ３２２が挙げられ
る。この発明の好ましいベクターはプラスミドｐＢＲ３
２２に由来する。適当なベクターは完全なレプリコン、
発現プラスミドにより形質転換された宿主を表現形質に
基いて選択しそして同定することを可能にするマーカー
遺伝子、並びに場合によってはシグナル配列及びエンハ
ンサーを含有する。
目的のポリペプチド遺伝子を複製しそして発現すること
ができるすべてのベクターが適当である。Ｅ．コリ株中
での発現のための適当なベクターの例として、バクテリ
オファージ、例えばラムダ又はＭ１３バクテリオファー
ジの誘導体、あるいはプラスミド、例えば特にプラスミ
ドＣｏｌ Ｅｌ及びその誘導体、例えばｐＭＢ９，ｐＳ
Ｆ２１２４，ｐＢＲ３１７又はｐＢＲ３２２が挙げられ
る。この発明の好ましいベクターはプラスミドｐＢＲ３
２２に由来する。適当なベクターは完全なレプリコン、
発現プラスミドにより形質転換された宿主を表現形質に
基いて選択しそして同定することを可能にするマーカー
遺伝子、並びに場合によってはシグナル配列及びエンハ
ンサーを含有する。
【００４８】適当なマーカー遺伝子は宿主に例えば重金
属、抗生物質等に対する耐性を付与する。さらに、この
発明の好ましいベクターは、レプリコン領域及びマーカ
ー遺伝子領域の外側に制限エンドヌクレアーゼのための
認識配列を含有し、これによって目的ポリペプチドの遺
伝子、及び適当な場合には発現制御配列をこれらの部位
に挿入することができる様にされている。好ましいベク
ターであるプラスミドｐＢＲ３２２並びに誘導体プラス
ミド、例えばｐＵＣ９，ｐＨＲｉ１４８及びｐＰＬｃ２
４は無傷のレプリコン、テトラサイクリン及びアンピシ
リンに対する耐性（ｔｅｒR 及びａｍｐR ）を付与する
マーカー遺伝子、並びに制限エンドヌクレアーゼのため
の多数のユニーク認識部位を含有する。
属、抗生物質等に対する耐性を付与する。さらに、この
発明の好ましいベクターは、レプリコン領域及びマーカ
ー遺伝子領域の外側に制限エンドヌクレアーゼのための
認識配列を含有し、これによって目的ポリペプチドの遺
伝子、及び適当な場合には発現制御配列をこれらの部位
に挿入することができる様にされている。好ましいベク
ターであるプラスミドｐＢＲ３２２並びに誘導体プラス
ミド、例えばｐＵＣ９，ｐＨＲｉ１４８及びｐＰＬｃ２
４は無傷のレプリコン、テトラサイクリン及びアンピシ
リンに対する耐性（ｔｅｒR 及びａｍｐR ）を付与する
マーカー遺伝子、並びに制限エンドヌクレアーゼのため
の多数のユニーク認識部位を含有する。
【００４９】遺伝子発現の制御のために幾つかの発現制
御配列を使用することができる。ハイブリドベクターと
してｐＢＲ３２２を使用しそして宿主微生物としてＥ．
コリを使用する場合、例えば、ラクトースオペロン、ト
リプトファンオペロン、アラビノースオペロン等の発現
制御配列（これらは特にプロモーター及びリボゾーム結
合部位を含有する）、β−ラクタマーゼ遺伝子の発現制
御配列、ファージλＮ遺伝子の対応する配列、特にＰL
プロモーターを含有する配列、又はファージｆｄ−コー
ト蛋白質遺伝子の発現制御遺伝子が適当である。プラス
ミドｐＢＲ３２２はすでにβ−ラクタマーゼ遺伝子（β
−ｌａｃ遺伝子）のプロモーターを含有するが、他の発
現制御配列をこのプラスミドに導入しなければならな
い。
御配列を使用することができる。ハイブリドベクターと
してｐＢＲ３２２を使用しそして宿主微生物としてＥ．
コリを使用する場合、例えば、ラクトースオペロン、ト
リプトファンオペロン、アラビノースオペロン等の発現
制御配列（これらは特にプロモーター及びリボゾーム結
合部位を含有する）、β−ラクタマーゼ遺伝子の発現制
御配列、ファージλＮ遺伝子の対応する配列、特にＰL
プロモーターを含有する配列、又はファージｆｄ−コー
ト蛋白質遺伝子の発現制御遺伝子が適当である。プラス
ミドｐＢＲ３２２はすでにβ−ラクタマーゼ遺伝子（β
−ｌａｃ遺伝子）のプロモーターを含有するが、他の発
現制御配列をこのプラスミドに導入しなければならな
い。
【００５０】酵母中での複製及び発現のために適当なベ
クターは酵母複製開始点及び酵母のための選択遺伝マー
カーを含有する。酵母複製開始点、例えば染色体自律複
製セグメント（ａｒｓ）を含有するハイブリドベクター
は、形質転換の後酵母細胞内で染色体外に維持され、そ
して自律複製する。さらに、酵母２μプラスミドＤＮＡ
に相同な配列を含有するハイブリドベクターを使用する
ことができる。この様なハイブリドベクターは細胞内に
すでに存在する２μプラスミドに組換により取り込まれ
るか、又は自律複製するであろう。２μ配列は高形質転
換頻度を有するプラスミドのために特に適当であり、そ
して高コピー数を許容する。この発明の好ましい酵母ベ
クターはプラスミドｐＪＤＢ２０７である。
クターは酵母複製開始点及び酵母のための選択遺伝マー
カーを含有する。酵母複製開始点、例えば染色体自律複
製セグメント（ａｒｓ）を含有するハイブリドベクター
は、形質転換の後酵母細胞内で染色体外に維持され、そ
して自律複製する。さらに、酵母２μプラスミドＤＮＡ
に相同な配列を含有するハイブリドベクターを使用する
ことができる。この様なハイブリドベクターは細胞内に
すでに存在する２μプラスミドに組換により取り込まれ
るか、又は自律複製するであろう。２μ配列は高形質転
換頻度を有するプラスミドのために特に適当であり、そ
して高コピー数を許容する。この発明の好ましい酵母ベ
クターはプラスミドｐＪＤＢ２０７である。
【００５１】酵母のための適当なマーカー遺伝子は特
に、宿主に抗生物質耐性を付与する遺伝子、又は栄養要
求性酵母変異株の場合には宿主の傷害を補完する遺伝子
である。対応する遺伝子は、例えば、抗生物質シクロヘ
キシミドに対する耐性を付与し、又は栄養要求性酵母変
異株に原栄養性を提供する遺伝子、例えばＵＲＡ３，Ｌ
ＥＵ２，ＨＩＳ３、又は特にＴＲＰ１遺伝子である。酵
母ハイブリドベクターはさらに、好ましくは、細菌宿
主、特にＥ．コリのための複製開始点及びマーカー遺伝
子を含有し、これによりハイブリドベクターの造成及び
クローニングを細菌宿主中で行うことができる。
に、宿主に抗生物質耐性を付与する遺伝子、又は栄養要
求性酵母変異株の場合には宿主の傷害を補完する遺伝子
である。対応する遺伝子は、例えば、抗生物質シクロヘ
キシミドに対する耐性を付与し、又は栄養要求性酵母変
異株に原栄養性を提供する遺伝子、例えばＵＲＡ３，Ｌ
ＥＵ２，ＨＩＳ３、又は特にＴＲＰ１遺伝子である。酵
母ハイブリドベクターはさらに、好ましくは、細菌宿
主、特にＥ．コリのための複製開始点及びマーカー遺伝
子を含有し、これによりハイブリドベクターの造成及び
クローニングを細菌宿主中で行うことができる。
【００５２】酵母での発現のために適当な発現制御配列
は例えば高度に発現される酵母遺伝子のそれである。す
なわち、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩ又はＡＤＨII遺伝
子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０３又はＰＨ０５）遺伝
子又はイソチトクローム遺伝子のプロモーター、あるい
は解糖系に関与するプロモーター、例えばエノラーゼ、
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホスホグリセレートキナーゼ
（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデヒドロゲナ
ーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホス
フェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキ
ナーゼの遺伝子のプロモーターを使用することができ
る。この発明の好ましいベクターは転写制御を伴うプロ
モーター、例えば増殖条件の変化によりターンオン又は
ターンオフを行うことができるＰＨ０５遺伝子、ＡＤＨ
II遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターを含有す
る。例えば、ＰＨ０５プロモーターは、培地中の無機リ
ン酸塩の濃度を単に上昇せしめるか又は低下せしめるこ
とにより抑制又は抑制解除され得る。
は例えば高度に発現される酵母遺伝子のそれである。す
なわち、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩ又はＡＤＨII遺伝
子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０３又はＰＨ０５）遺伝
子又はイソチトクローム遺伝子のプロモーター、あるい
は解糖系に関与するプロモーター、例えばエノラーゼ、
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホスホグリセレートキナーゼ
（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデヒドロゲナ
ーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホス
フェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキ
ナーゼの遺伝子のプロモーターを使用することができ
る。この発明の好ましいベクターは転写制御を伴うプロ
モーター、例えば増殖条件の変化によりターンオン又は
ターンオフを行うことができるＰＨ０５遺伝子、ＡＤＨ
II遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターを含有す
る。例えば、ＰＨ０５プロモーターは、培地中の無機リ
ン酸塩の濃度を単に上昇せしめるか又は低下せしめるこ
とにより抑制又は抑制解除され得る。
【００５３】哺乳類細胞中での複製及び発現のために適
当なベクターは好ましくはウイルス起原のＤＮＡ、例え
ばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイ
ルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイル
ス（ＢＰＶ）、パポバウイルスＢＫ変異株（ＢＫＶ）、
又はマウスもしくはヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）からのＤＮＡを有する。好ましくは、この様なベク
ターは、真核生物の転写制御配列と共にＥ．コリ中での
増殖のための複製開始点及び抗生物質耐性遺伝子を含有
する。特に、いわゆるシャトルベクターをＥ．コリプラ
スミドｐＢＲ３２２及びＳＶ４０及び／又はＣＭＶエン
ハンサー及びプロモーター領域から造成することができ
る。
当なベクターは好ましくはウイルス起原のＤＮＡ、例え
ばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイ
ルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイル
ス（ＢＰＶ）、パポバウイルスＢＫ変異株（ＢＫＶ）、
又はマウスもしくはヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）からのＤＮＡを有する。好ましくは、この様なベク
ターは、真核生物の転写制御配列と共にＥ．コリ中での
増殖のための複製開始点及び抗生物質耐性遺伝子を含有
する。特に、いわゆるシャトルベクターをＥ．コリプラ
スミドｐＢＲ３２２及びＳＶ４０及び／又はＣＭＶエン
ハンサー及びプロモーター領域から造成することができ
る。
【００５４】例えば、このプラスミドはヒト又はマウス
のサイトメガロウイルス主要即時初期（immediate-earl
y ）遺伝子のエンハンサー・プロモーターユニット、ヒ
トα−グロビンプロモーターと組合わせたＳＶ４０エン
ハンサー、そして／又はさらに誘導性プロモーター、例
えばヒートショック遺伝子又はメタロチオネイン遺伝子
由来のプロモーターを含有することができる。さらに、
目的遺伝子配列と通常関連しているプロモーター又は制
御配列を使用することができる。複製開始点はＳＶ４０
もしくは他のウイルス源からの外来性複製開始点を含む
様にベクターを構成することにより、又は宿主細胞の染
色体複製機構により設けることができる。ベクターが宿
主細胞の染色体に組み込まれる場合、後者の方法は一層
効果的である。
のサイトメガロウイルス主要即時初期（immediate-earl
y ）遺伝子のエンハンサー・プロモーターユニット、ヒ
トα−グロビンプロモーターと組合わせたＳＶ４０エン
ハンサー、そして／又はさらに誘導性プロモーター、例
えばヒートショック遺伝子又はメタロチオネイン遺伝子
由来のプロモーターを含有することができる。さらに、
目的遺伝子配列と通常関連しているプロモーター又は制
御配列を使用することができる。複製開始点はＳＶ４０
もしくは他のウイルス源からの外来性複製開始点を含む
様にベクターを構成することにより、又は宿主細胞の染
色体複製機構により設けることができる。ベクターが宿
主細胞の染色体に組み込まれる場合、後者の方法は一層
効果的である。
【００５５】好ましい態様において、本発明は宿主株中
で複製及び表現型選択が可能なハイブリドベクターに関
し、このハイブリドベクターはプロモーター及び目的蛋
白質をコードするＤＮＡを含んで成り、このＤＮＡは前
記プロモーターの制御下前記ハイブリドベクター中の転
写開始シグナル及び転写終止シグナル並びに翻訳開始シ
グナル及び翻訳終止シグナルと一緒に配置され、こうし
て形質転換された宿主中で前記蛋白質を生産するために
発現される。この発明はまた、形質転換された宿主の製
造方法に関し、この方法は発現制御配列により制御され
るこの発明のＤＮＡを含有する発現ベクターにより宿主
を形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）又はトラ
ンスフェクションすることを含んでなり、本発明はさら
に形質転換された宿主それ自体に関する。
で複製及び表現型選択が可能なハイブリドベクターに関
し、このハイブリドベクターはプロモーター及び目的蛋
白質をコードするＤＮＡを含んで成り、このＤＮＡは前
記プロモーターの制御下前記ハイブリドベクター中の転
写開始シグナル及び転写終止シグナル並びに翻訳開始シ
グナル及び翻訳終止シグナルと一緒に配置され、こうし
て形質転換された宿主中で前記蛋白質を生産するために
発現される。この発明はまた、形質転換された宿主の製
造方法に関し、この方法は発現制御配列により制御され
るこの発明のＤＮＡを含有する発現ベクターにより宿主
を形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）又はトラ
ンスフェクションすることを含んでなり、本発明はさら
に形質転換された宿主それ自体に関する。
【００５６】適当な宿主の例として、前記の微生物、例
えばサッカロミセス・セレビシエーの株、バシルス・ズ
ブチリスの株、及びエシェリシャ・コリの株が挙げられ
る。この発明の発現プラスミドによる形質転換は、例え
ば文献に記載されている様にして、すなわちＳ．セレビ
シエーについてはA.Hinnen, J.B.Hicks 及びG.R.Fink,
Proc.Natl.Acad.Sci. USA , 75, 1929 (1978) 、Ｂ．ズ
ブチリスについてはAnagnostopoulos 等、J.Bacterio
l., 81, 741 (1961)、そしてＥ．コリについてはM.Mand
el等、J.Mol Biol. , 53, 159 (1970)の方法に従って行
われる。
えばサッカロミセス・セレビシエーの株、バシルス・ズ
ブチリスの株、及びエシェリシャ・コリの株が挙げられ
る。この発明の発現プラスミドによる形質転換は、例え
ば文献に記載されている様にして、すなわちＳ．セレビ
シエーについてはA.Hinnen, J.B.Hicks 及びG.R.Fink,
Proc.Natl.Acad.Sci. USA , 75, 1929 (1978) 、Ｂ．ズ
ブチリスについてはAnagnostopoulos 等、J.Bacterio
l., 81, 741 (1961)、そしてＥ．コリについてはM.Mand
el等、J.Mol Biol. , 53, 159 (1970)の方法に従って行
われる。
【００５７】従って、Ｅ．コリ細胞の形質転換は、ＤＮ
Ａの取り込み可能にするための細胞のＣａ++前処理、及
びハイブリドベクターとのインキュベーションを含む。
親細胞からの形質転換細胞の分離を可能にする選択増殖
培地に細胞を移す。ベクターを含有しない細胞はこの様
な培地中で生存しないであろう。酵母の形質転換は、例
えば、（１）グルコシダーゼによる酵母細胞壁の酵素的
除去、（２）ポリエチレングリコール及びＣａ++イオン
の存在下でのベクターによるスフェロプラストの処理、
及び（３）該スフェロプラストを寒天中に包埋すること
による細胞壁の再生を含む。好ましくは、再生寒天は形
質転換された細胞の細胞壁の再生と選択を同様に可能に
する様に調製される。
Ａの取り込み可能にするための細胞のＣａ++前処理、及
びハイブリドベクターとのインキュベーションを含む。
親細胞からの形質転換細胞の分離を可能にする選択増殖
培地に細胞を移す。ベクターを含有しない細胞はこの様
な培地中で生存しないであろう。酵母の形質転換は、例
えば、（１）グルコシダーゼによる酵母細胞壁の酵素的
除去、（２）ポリエチレングリコール及びＣａ++イオン
の存在下でのベクターによるスフェロプラストの処理、
及び（３）該スフェロプラストを寒天中に包埋すること
による細胞壁の再生を含む。好ましくは、再生寒天は形
質転換された細胞の細胞壁の再生と選択を同様に可能に
する様に調製される。
【００５８】適当な宿主の他の例は上記の哺乳類細胞、
例えばＣＯＳ−７細胞、ヒーラ細胞又はチャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ベクターは、ヘル
パー化合物、例えばジエチルアミノエチルデキストラ
ン、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ポリエチレ
ングリコール等の存在下で又はベクターＤＮＡとリン酸
カルシウムとの同時沈澱として、トランスフェクトによ
り哺乳類細胞に導入される。他の適当な方法には細胞核
へのベクターＤＮＡの直接微量注射、及び電気穿孔、す
なわち細胞膜の透過性を増加する短い電気パルスによる
ＤＮＡの導入が含まれる。
例えばＣＯＳ−７細胞、ヒーラ細胞又はチャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ベクターは、ヘル
パー化合物、例えばジエチルアミノエチルデキストラ
ン、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ポリエチレ
ングリコール等の存在下で又はベクターＤＮＡとリン酸
カルシウムとの同時沈澱として、トランスフェクトによ
り哺乳類細胞に導入される。他の適当な方法には細胞核
へのベクターＤＮＡの直接微量注射、及び電気穿孔、す
なわち細胞膜の透過性を増加する短い電気パルスによる
ＤＮＡの導入が含まれる。
【００５９】これに続く、形質転換された細胞の選択
は、発現ベクターに共有結合により組み込まれた選択マ
ーカー又は別の存在として添加された選択マーカーを用
いて行うことができる。選択マーカーは抗生物質、例え
ばＧ−４１８（ネオマイシン）又はハイグロマイシンに
対する耐性を付与する遺伝子、あるいは宿主細胞の遺伝
子傷害、例えばチアミンキナーゼ又はヒドポキサンチン
ホスホリボシルトランスフェラーゼの傷害を補完する遺
伝子である。形質転換された宿主細胞は、炭素、窒素及
び無機塩の資化性源を含有する液体培地中で従来技術に
おいて知られている方法により培養される。
は、発現ベクターに共有結合により組み込まれた選択マ
ーカー又は別の存在として添加された選択マーカーを用
いて行うことができる。選択マーカーは抗生物質、例え
ばＧ−４１８（ネオマイシン）又はハイグロマイシンに
対する耐性を付与する遺伝子、あるいは宿主細胞の遺伝
子傷害、例えばチアミンキナーゼ又はヒドポキサンチン
ホスホリボシルトランスフェラーゼの傷害を補完する遺
伝子である。形質転換された宿主細胞は、炭素、窒素及
び無機塩の資化性源を含有する液体培地中で従来技術に
おいて知られている方法により培養される。
【００６０】この発明の形質転換された宿主の培養のた
めに種々の炭素源を使用することができる。好ましい炭
素源の例として資化性炭水化物、例えばグルコース、マ
ルトース、マンニトール又はラクトス、あるいは酢酸塩
を挙げることができ、これらはそれ自体として又は適当
な混合物として使用することができる。適当な窒素源の
例としてアミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプチド、並び
に蛋白質及びその分解生成物、例えばトリプトン、ペプ
トン又は肉エキス、酵母エキス、マルトエキス、並びに
アンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム又は硝酸アンモニウムが挙げられ、これらはそれ
自体として又は適当な混合物として使用することができ
る。使用することができる適当な塩は例えばナトリウ
ム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、
塩化物、リン酸塩及び炭酸塩である。
めに種々の炭素源を使用することができる。好ましい炭
素源の例として資化性炭水化物、例えばグルコース、マ
ルトース、マンニトール又はラクトス、あるいは酢酸塩
を挙げることができ、これらはそれ自体として又は適当
な混合物として使用することができる。適当な窒素源の
例としてアミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプチド、並び
に蛋白質及びその分解生成物、例えばトリプトン、ペプ
トン又は肉エキス、酵母エキス、マルトエキス、並びに
アンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム又は硝酸アンモニウムが挙げられ、これらはそれ
自体として又は適当な混合物として使用することができ
る。使用することができる適当な塩は例えばナトリウ
ム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、
塩化物、リン酸塩及び炭酸塩である。
【００６１】培地はさらに、例えば増殖促進物質、例え
ば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、及び好まし
くは選択圧を与えそして発現プラスミドを失った細胞の
増殖を阻害する物質を含有する。すなわち、例えば、発
現プラスミドがａｍｐR 遺伝子を含有する場合には培地
にアンピシリンが加えられる。この様な抗生物質の添加
はまた、抗生物質感受性の汚染微生物が破壊されるとい
う効果も有する。例えば必須アミノ酸において栄養要求
性である酵母株が宿主微生物として使用される場合、プ
ラスミドは好ましくは宿主の傷害を補完する酵素をコー
ドする遺伝子を含有する。酵母株の培養はこのアミノ酸
を欠く最少培地中で行われる。
ば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、及び好まし
くは選択圧を与えそして発現プラスミドを失った細胞の
増殖を阻害する物質を含有する。すなわち、例えば、発
現プラスミドがａｍｐR 遺伝子を含有する場合には培地
にアンピシリンが加えられる。この様な抗生物質の添加
はまた、抗生物質感受性の汚染微生物が破壊されるとい
う効果も有する。例えば必須アミノ酸において栄養要求
性である酵母株が宿主微生物として使用される場合、プ
ラスミドは好ましくは宿主の傷害を補完する酵素をコー
ドする遺伝子を含有する。酵母株の培養はこのアミノ酸
を欠く最少培地中で行われる。
【００６２】脊椎動物細胞は、増殖促進物質及び／又は
哺乳類血清が補充されている場合がある市販の培地を用
いて組織培養条件下で増殖せしめる。細胞は固体支持
体、例えばマイクロキャリャー又は多孔性ガラス繊維に
付着してあるいは適当な培養容器中を自由浮遊しながら
増殖する。培養は当業界において知られている方法によ
り行われる。培養条件、例えば温度、培地のpH値、及び
発酵時間は、この発明のポリペプチドの最大力価が得ら
れる様に選択される。すなわち、Ｅ．コリ又は酵母株
は、好ましくは、振とう又は撹拌を伴う深部培養による
好気的条件下で、約２０℃〜４０℃の温度、好ましくは
３０℃、及び４〜８のpH、好ましくは約pH７において、
約４〜３０時間、好ましくはこの発明のポリペプチドの
最大収量が達成されるまで培養する。
哺乳類血清が補充されている場合がある市販の培地を用
いて組織培養条件下で増殖せしめる。細胞は固体支持
体、例えばマイクロキャリャー又は多孔性ガラス繊維に
付着してあるいは適当な培養容器中を自由浮遊しながら
増殖する。培養は当業界において知られている方法によ
り行われる。培養条件、例えば温度、培地のpH値、及び
発酵時間は、この発明のポリペプチドの最大力価が得ら
れる様に選択される。すなわち、Ｅ．コリ又は酵母株
は、好ましくは、振とう又は撹拌を伴う深部培養による
好気的条件下で、約２０℃〜４０℃の温度、好ましくは
３０℃、及び４〜８のpH、好ましくは約pH７において、
約４〜３０時間、好ましくはこの発明のポリペプチドの
最大収量が達成されるまで培養する。
【００６３】細胞濃度が十分な値に達したとき、培養を
停止し、そしてポリペプチドを単独する。ポリペプチド
が適当なシグナルペプチド配列と融合している場合、こ
れは細胞により上清に直接分泌される。他の場合には、
例えば洗剤、例えばＳＤＳ，ＮＰ−４０、トリトン又は
デオキシコール酸により処理することによって細胞を破
壊しなければならず、あるいはリゾチーム、同様に作用
する酵素又は超音波により細胞を溶解しなければならな
い。
停止し、そしてポリペプチドを単独する。ポリペプチド
が適当なシグナルペプチド配列と融合している場合、こ
れは細胞により上清に直接分泌される。他の場合には、
例えば洗剤、例えばＳＤＳ，ＮＰ−４０、トリトン又は
デオキシコール酸により処理することによって細胞を破
壊しなければならず、あるいはリゾチーム、同様に作用
する酵素又は超音波により細胞を溶解しなければならな
い。
【００６４】宿主微生物として酵母を使用する場合、グ
ルコシダーゼによる酵素的消化により細胞壁を除去する
ことができる。これに代えて、又はこれと組合わせて機
械的力、例えば剪断片（例えばＸ−プレス、フレンチプ
レス、ダイノミル）又はガラスビーズもしくは酸化アル
ミニウムとの振とう、あるいは例えば液体窒素中での凍
結と例えば３０℃〜４０℃での解凍、並びに超音波を用
いて細胞を破壊することができる。
ルコシダーゼによる酵素的消化により細胞壁を除去する
ことができる。これに代えて、又はこれと組合わせて機
械的力、例えば剪断片（例えばＸ−プレス、フレンチプ
レス、ダイノミル）又はガラスビーズもしくは酸化アル
ミニウムとの振とう、あるいは例えば液体窒素中での凍
結と例えば３０℃〜４０℃での解凍、並びに超音波を用
いて細胞を破壊することができる。
【００６５】細胞上清、又は細胞の破壊の後に得られる
混合物の遠心分離により得られた溶液は蛋白質、核酸及
び他の細胞成分を含有しており、これをこの発明のポリ
ペプチドを包含する蛋白質についてそれ自体既知の方法
により富化する。すなわち、例えば、ほとんどの非蛋白
質性成分はポリエチレンイミン処理により除去され、そ
してこの発明のポリペプチドを包含する蛋白質は例えば
硫酸アンモニウム又は他の塩による溶液の飽和により沈
澱する。他の方法として、細胞上清又は細胞溶解物をク
ロマトグラフ法を用いて直接前精製することができる。
混合物の遠心分離により得られた溶液は蛋白質、核酸及
び他の細胞成分を含有しており、これをこの発明のポリ
ペプチドを包含する蛋白質についてそれ自体既知の方法
により富化する。すなわち、例えば、ほとんどの非蛋白
質性成分はポリエチレンイミン処理により除去され、そ
してこの発明のポリペプチドを包含する蛋白質は例えば
硫酸アンモニウム又は他の塩による溶液の飽和により沈
澱する。他の方法として、細胞上清又は細胞溶解物をク
ロマトグラフ法を用いて直接前精製することができる。
【００６６】この発明のポリペプチドは、クロマトグラ
フ分離の組合せにより、好ましくはイオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過及び逆相高速液体クロマトグラフ
ィーの組合わせにより精製される。他の分離法には例え
ば分子量カット−オフ膜を用いる濾過及び限外濾過、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイ
ト上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシン
グ、並びに適当な塩及び／又は緩衝液及び溶剤混合物中
での透析、溶解及び再沈澱が含まれよう。
フ分離の組合せにより、好ましくはイオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過及び逆相高速液体クロマトグラフ
ィーの組合わせにより精製される。他の分離法には例え
ば分子量カット−オフ膜を用いる濾過及び限外濾過、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイ
ト上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシン
グ、並びに適当な塩及び／又は緩衝液及び溶剤混合物中
での透析、溶解及び再沈澱が含まれよう。
【００６７】イオン交換クロマトグラフィーのための適
当なキャリャー材料は有機又は無機性の、例えば架橋さ
れたアガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、
スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー、セルロース等
であることができる。好ましくは、このキャリャー材料
は塩基性官能基、例えば第三アミノ官能基、第四アンモ
ニウム基、又はわずかに酸性の基、例えばカルボキシメ
チル官能基を担持する。これらのキャリャーは正常液体
クロマトグラフィー、固定蛋白質液体クロマトグラフィ
ー（ＦＰＬＣ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）のために適当である。イオン交換クロマトグラフ
ィーによる分離及び精製は確立された方法、例えば増加
する量の塩、例えば塩化ナトリウムを含有するpH４〜pH
９の水性緩衝液中で行われる。
当なキャリャー材料は有機又は無機性の、例えば架橋さ
れたアガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、
スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー、セルロース等
であることができる。好ましくは、このキャリャー材料
は塩基性官能基、例えば第三アミノ官能基、第四アンモ
ニウム基、又はわずかに酸性の基、例えばカルボキシメ
チル官能基を担持する。これらのキャリャーは正常液体
クロマトグラフィー、固定蛋白質液体クロマトグラフィ
ー（ＦＰＬＣ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）のために適当である。イオン交換クロマトグラフ
ィーによる分離及び精製は確立された方法、例えば増加
する量の塩、例えば塩化ナトリウムを含有するpH４〜pH
９の水性緩衝液中で行われる。
【００６８】ゲル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィ
ーのために適当なキャリャー材料には架橋されたデキス
トラン、アガロース、適切に修飾されたポリアクリルア
ミド又はシリカ等が含まれる。場合によってはこれらの
キャリャーはヒドロキシ官能基を担持する置換基、例え
ば１−ヒドロキシ低級アルキル基又は１，２−ジヒドロ
キシ低級アルキル基により修飾されている。クロマトグ
ラフ材料は、５０，０００〜１００，０００ダルトンの
分子量範囲のペプチドの最適分離を示すように選択され
る。この様なゲル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィ
ーは上記のように正常液体クロマトグラフィー、ＦＰＬ
Ｃ又はＨＰＬＣのために適するカラム中で、可変量の
塩、例えば塩化ナトリウムを含有するおよそ中性の水性
緩衝液を用いて行われる。
ーのために適当なキャリャー材料には架橋されたデキス
トラン、アガロース、適切に修飾されたポリアクリルア
ミド又はシリカ等が含まれる。場合によってはこれらの
キャリャーはヒドロキシ官能基を担持する置換基、例え
ば１−ヒドロキシ低級アルキル基又は１，２−ジヒドロ
キシ低級アルキル基により修飾されている。クロマトグ
ラフ材料は、５０，０００〜１００，０００ダルトンの
分子量範囲のペプチドの最適分離を示すように選択され
る。この様なゲル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィ
ーは上記のように正常液体クロマトグラフィー、ＦＰＬ
Ｃ又はＨＰＬＣのために適するカラム中で、可変量の
塩、例えば塩化ナトリウムを含有するおよそ中性の水性
緩衝液を用いて行われる。
【００６９】逆相クロマトグラフィーは、疎水性基、例
えば１〜２０個の炭素原子、好ましくは４，８，１２も
しくは１８個の炭素原子を有するアルキル基、又はそれ
ぞれ１及び８又は２及び１８個の炭素原子を有するアル
キル基の混合、あるいはフェニル基を担持するシリカ性
キャリャー材料上で行われる。アガロース又は１２個ま
での炭素原子を有するアルキル基及び／又はフェニル基
がコートされた関連材料が使用される疎水性相互作用ク
ロマトグラフィーがこの方法に関連する。これらのクロ
マトグラフ技法はＦＰＬＣ又はＨＰＬＣを用いて適用さ
れる。シリカ性逆相材料上で本発明のポリペプチドを処
理するための溶剤は水性酸、例えば、増加する量の極性
水混和性有機溶剤、例えばアセトニトリル、低級アルコ
ール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、
テトラヒドロフラン等、好ましくはアセトニトリルを含
有する水性トリフルオロ酢酸である。
えば１〜２０個の炭素原子、好ましくは４，８，１２も
しくは１８個の炭素原子を有するアルキル基、又はそれ
ぞれ１及び８又は２及び１８個の炭素原子を有するアル
キル基の混合、あるいはフェニル基を担持するシリカ性
キャリャー材料上で行われる。アガロース又は１２個ま
での炭素原子を有するアルキル基及び／又はフェニル基
がコートされた関連材料が使用される疎水性相互作用ク
ロマトグラフィーがこの方法に関連する。これらのクロ
マトグラフ技法はＦＰＬＣ又はＨＰＬＣを用いて適用さ
れる。シリカ性逆相材料上で本発明のポリペプチドを処
理するための溶剤は水性酸、例えば、増加する量の極性
水混和性有機溶剤、例えばアセトニトリル、低級アルコ
ール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、
テトラヒドロフラン等、好ましくはアセトニトリルを含
有する水性トリフルオロ酢酸である。
【００７０】アフィニティークロマトグラフィーはま
た、目的の蛋白質に対して高いアフィニティーを有する
分子、例えば抗体、特に後で記載するモノクローナル抗
体を担持する適当なキャリャー材料、例えば架橋された
アガロース、デキストラン又はポリアクリルアミドを使
用して、本発明のポリペプチドの精製のために期待され
る。抗体は既知の方法により活性化形のキャリャー材料
に連結される。アフィニティークロマトグラフィーによ
る目的ポリペプチドの精製はそれ自体既知の方法によ
り、例えば、場合によっては界面活性剤、例えばポリエ
チレンソルビタン脂肪酸エステルを含有するおよそpH５
〜９の範囲の緩衝液及び／又は塩溶液、例えばＮａＣｌ
溶液中で行い、次に目的の蛋白質をおよそpH２〜５のpH
範囲の緩衝液、例えばグリシン緩衝液、又は異る組成の
pHグラジエント、又は塩溶液、例えば濃ＮＨ4 ＳＣＮ溶
液により溶出する。
た、目的の蛋白質に対して高いアフィニティーを有する
分子、例えば抗体、特に後で記載するモノクローナル抗
体を担持する適当なキャリャー材料、例えば架橋された
アガロース、デキストラン又はポリアクリルアミドを使
用して、本発明のポリペプチドの精製のために期待され
る。抗体は既知の方法により活性化形のキャリャー材料
に連結される。アフィニティークロマトグラフィーによ
る目的ポリペプチドの精製はそれ自体既知の方法によ
り、例えば、場合によっては界面活性剤、例えばポリエ
チレンソルビタン脂肪酸エステルを含有するおよそpH５
〜９の範囲の緩衝液及び／又は塩溶液、例えばＮａＣｌ
溶液中で行い、次に目的の蛋白質をおよそpH２〜５のpH
範囲の緩衝液、例えばグリシン緩衝液、又は異る組成の
pHグラジエント、又は塩溶液、例えば濃ＮＨ4 ＳＣＮ溶
液により溶出する。
【００７１】この発明の蛋白質の抗ウイルス性はウイル
ス感染に対する保護及びウイルス感染の治療のために有
用である。特に、この蛋白質はインフルエンザウイルス
又は他の呼吸器ウイルスの感染、ヘルペスウイルスの感
染、並びに狂犬病及び肝炎ウイルスの感染の治療のため
に、場合によっては他の抗ウイルス剤と組合わせて使用
される。この蛋白質は、場合によっては無機又は有機の
固体又は液体の医薬として許容されるキャリャーと共に
又はこれらとの混合物として有効果の活性成分を含有す
る医薬調製物の形態で適用される。
ス感染に対する保護及びウイルス感染の治療のために有
用である。特に、この蛋白質はインフルエンザウイルス
又は他の呼吸器ウイルスの感染、ヘルペスウイルスの感
染、並びに狂犬病及び肝炎ウイルスの感染の治療のため
に、場合によっては他の抗ウイルス剤と組合わせて使用
される。この蛋白質は、場合によっては無機又は有機の
固体又は液体の医薬として許容されるキャリャーと共に
又はこれらとの混合物として有効果の活性成分を含有す
る医薬調製物の形態で適用される。
【００７２】この発明の医薬は温血動物、例えばヒトへ
の、経腸、例えば直腸又は経口投与のため、そして好ま
しくは非経口、例えば鼻内、筋肉内、皮下又は静脈内投
与のためのものである。意図される投与方法に依存し
て、医薬は単位投与形、例えばアンプル、バイアル、坐
薬、丸剤、錠剤、カプセル、又は液体もしくは固体の鼻
内スプレーであることができる。医薬として有効な投与
すべき化合物の量は温血動物、例えばヒトの状態、例え
ば体重、疾患の種類及び重症度並びに一般的状態、そし
てさらに投与方法に依存し、そして治療にたずさわる医
師の評価に従って決定される。有効量は体重１kg１日当
り０．００１〜１μｇのオーダーである。
の、経腸、例えば直腸又は経口投与のため、そして好ま
しくは非経口、例えば鼻内、筋肉内、皮下又は静脈内投
与のためのものである。意図される投与方法に依存し
て、医薬は単位投与形、例えばアンプル、バイアル、坐
薬、丸剤、錠剤、カプセル、又は液体もしくは固体の鼻
内スプレーであることができる。医薬として有効な投与
すべき化合物の量は温血動物、例えばヒトの状態、例え
ば体重、疾患の種類及び重症度並びに一般的状態、そし
てさらに投与方法に依存し、そして治療にたずさわる医
師の評価に従って決定される。有効量は体重１kg１日当
り０．００１〜１μｇのオーダーである。
【００７３】この発明の医薬は、通常の無機又は有機の
固体又は液体の医薬として許容される担体を、場合によ
っては他の医薬として活性な化合物及び／又は助剤と共
に含有する。好ましくは、活性成分の溶液又は懸濁液、
特に等張水溶液又は懸濁液、あるいはまた使用直前に水
に溶解される凍結乾燥物が使用される。医薬は無菌化さ
れ、そして／又は防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶
解剤、増粘剤、浸透圧調節塩及び／又は緩衝剤を含有す
ることができ、そしてさらに他の蛋白質、例えばヒト血
清アルブミン又はヒト血漿調製物を含有することができ
る。
固体又は液体の医薬として許容される担体を、場合によ
っては他の医薬として活性な化合物及び／又は助剤と共
に含有する。好ましくは、活性成分の溶液又は懸濁液、
特に等張水溶液又は懸濁液、あるいはまた使用直前に水
に溶解される凍結乾燥物が使用される。医薬は無菌化さ
れ、そして／又は防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶
解剤、増粘剤、浸透圧調節塩及び／又は緩衝剤を含有す
ることができ、そしてさらに他の蛋白質、例えばヒト血
清アルブミン又はヒト血漿調製物を含有することができ
る。
【００７４】さらに、この発明は、前記のようにインタ
ーフェロン−α又は−βにより誘導されたヒト蛋白質に
対して特異的なモノクローナル抗体、特に、インターフ
ェロンにより誘導された関連のマウス蛋白質ＭX と交叉
反応しないモノクローナル抗体、及び該抗体の誘導体に
関する。この発明のモノクローナル抗体はネズミ由来の
ものであり、そして特にマウス／マウスハイブリドーマ
細胞により生産されるマウス抗体である。この発明のモ
ノクローナル抗体の例として、８８５ Ｓ３５．８．
１、８８５Ｓ３５．１６．１１、８８５ Ｓ５６．５
５．７．１２．４８、８８５ Ｓ５６．５５．７．２
１．２５、８８５ Ｓ５６．５５．７．２７．５、８８
５ Ｓ５６．５５．７．２７．１１、８８５ Ｓ５６．
５５．１３、８８５ Ｓ５６．５５．１７、及び８８５
Ｓ５６．６７．１５と称するネズミモノクローナル抗
体が挙げられる。
ーフェロン−α又は−βにより誘導されたヒト蛋白質に
対して特異的なモノクローナル抗体、特に、インターフ
ェロンにより誘導された関連のマウス蛋白質ＭX と交叉
反応しないモノクローナル抗体、及び該抗体の誘導体に
関する。この発明のモノクローナル抗体はネズミ由来の
ものであり、そして特にマウス／マウスハイブリドーマ
細胞により生産されるマウス抗体である。この発明のモ
ノクローナル抗体の例として、８８５ Ｓ３５．８．
１、８８５Ｓ３５．１６．１１、８８５ Ｓ５６．５
５．７．１２．４８、８８５ Ｓ５６．５５．７．２
１．２５、８８５ Ｓ５６．５５．７．２７．５、８８
５ Ｓ５６．５５．７．２７．１１、８８５ Ｓ５６．
５５．１３、８８５ Ｓ５６．５５．１７、及び８８５
Ｓ５６．６７．１５と称するネズミモノクローナル抗
体が挙げられる。
【００７５】８８５ Ｓ３５．８．１、８８５ Ｓ５
６．５５．１３及び８８５ Ｓ５６．６７．１５と称す
るモノクローナル抗体及びその誘導体が好ましい。これ
らのモノクローナル抗体は８８５ Ｓ３５．８．１、８
８５ Ｓ５６．５５．１３及び８８５ Ｓ５６．６７．
１５と称する対応するハイブリドーマセルラインにより
分泌される。この発明のモノクローナル抗体の誘導体
は、例えば抗体断片、放射能ラベルされたモノクローナ
ル抗体、及び酵素や蛍光マーカーとモノクローナル抗体
との接合体である。
６．５５．１３及び８８５ Ｓ５６．６７．１５と称す
るモノクローナル抗体及びその誘導体が好ましい。これ
らのモノクローナル抗体は８８５ Ｓ３５．８．１、８
８５ Ｓ５６．５５．１３及び８８５ Ｓ５６．６７．
１５と称する対応するハイブリドーマセルラインにより
分泌される。この発明のモノクローナル抗体の誘導体
は、例えば抗体断片、放射能ラベルされたモノクローナ
ル抗体、及び酵素や蛍光マーカーとモノクローナル抗体
との接合体である。
【００７６】この発明のモノクローナル抗体の断片は、
例えば、抗原決定基に対する特異性を有する、すなわち
前に記載したヒトインターフェロンにより誘導された蛋
白質に対する特異性を保持している、Ｆａｂ断片、Ｆａ
ｂ′断片又はＦ（ａｂ′）2断片である。放射能ラベル
されたモノクローナル抗体は例えば放射性ヨウ素（ 123
Ｉ， 125Ｉ， 131Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、
トリチウム（ 3Ｈ）等を含有する。放射性ヨウ素により
ラベルされたモノクローナル抗体が好ましい。
例えば、抗原決定基に対する特異性を有する、すなわち
前に記載したヒトインターフェロンにより誘導された蛋
白質に対する特異性を保持している、Ｆａｂ断片、Ｆａ
ｂ′断片又はＦ（ａｂ′）2断片である。放射能ラベル
されたモノクローナル抗体は例えば放射性ヨウ素（ 123
Ｉ， 125Ｉ， 131Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、
トリチウム（ 3Ｈ）等を含有する。放射性ヨウ素により
ラベルされたモノクローナル抗体が好ましい。
【００７７】この発明の抗体接合体は、モノクローナル
抗体又はその断片と酵素、例えばホースラディッシュパ
ーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコア
ミラーゼ、カルボアンヒドラーゼ、アセチルコリンエス
テラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ又は
グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、蛍光
マーカー、例えばフルオレッセイン、あるいはアビジン
又はビオケンとの接合体である。これらの接合体におい
ては、抗体は直接に又はスペーサーもしくはリンカー基
を介して酸素又は蛍光マーカーに結合している。
抗体又はその断片と酵素、例えばホースラディッシュパ
ーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコア
ミラーゼ、カルボアンヒドラーゼ、アセチルコリンエス
テラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ又は
グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、蛍光
マーカー、例えばフルオレッセイン、あるいはアビジン
又はビオケンとの接合体である。これらの接合体におい
ては、抗体は直接に又はスペーサーもしくはリンカー基
を介して酸素又は蛍光マーカーに結合している。
【００７８】この発明のモノクローナル抗体及びその誘
導体はそれ自体既知の方法により得られ、この方法は該
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、 ａ）インビトロで培養しそして培養上清からモノクロー
ナル抗体を単離するか、又は ｂ）適当な哺乳類中でインビボ増殖せしめ、そして該動
物の体液からモノクローナル抗体を回収し、そして、所
望により、 ｃ）得られたモノクローナル抗体をその誘導体に転換す
る、ことを特徴とする。
導体はそれ自体既知の方法により得られ、この方法は該
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、 ａ）インビトロで培養しそして培養上清からモノクロー
ナル抗体を単離するか、又は ｂ）適当な哺乳類中でインビボ増殖せしめ、そして該動
物の体液からモノクローナル抗体を回収し、そして、所
望により、 ｃ）得られたモノクローナル抗体をその誘導体に転換す
る、ことを特徴とする。
【００７９】工程ａ）のインビトロ培養のために適当な
培地は標準的培地、例えばダルベコ改変イーグル培地又
はＲＰＭＩ１６４０培地であって、場合によっては哺乳
類血清、例えばウシ胎児血清、又は他の増殖維持補完
剤、例えば２−アミノエタノール、インシュリン、トラ
ンスフェリン、低密度リポプロテイン、オレイン酸等、
及び微量元素が補充されているものである。モノクロー
ナル抗体の単離は、培養上清中に含まれる蛋白質を硫酸
アンモニウム等により沈澱せしめ、次に標準的クロマト
グラフ法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ＤＥＡＥセルロース上でのクロマトグラフィー、
又は免疫アフィニティークロマトグラフィーによって免
疫グロブリンを精製することにより行う。
培地は標準的培地、例えばダルベコ改変イーグル培地又
はＲＰＭＩ１６４０培地であって、場合によっては哺乳
類血清、例えばウシ胎児血清、又は他の増殖維持補完
剤、例えば２−アミノエタノール、インシュリン、トラ
ンスフェリン、低密度リポプロテイン、オレイン酸等、
及び微量元素が補充されているものである。モノクロー
ナル抗体の単離は、培養上清中に含まれる蛋白質を硫酸
アンモニウム等により沈澱せしめ、次に標準的クロマト
グラフ法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ＤＥＡＥセルロース上でのクロマトグラフィー、
又は免疫アフィニティークロマトグラフィーによって免
疫グロブリンを精製することにより行う。
【００８０】インビトロ生産は多量の目的抗体を得るた
めのスケールアップを可能にする。大規模ハイブリドー
マ培養のための技法は当業界においてよく知られてお
り、そして例えばエアーリフト反応器又は連続撹拌反応
器中での均一浮遊培養、及び例えば中空繊維中、マイク
ロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上又はセラミ
ックカートリッジ上での固定化又は捕捉細胞培養を包含
する。
めのスケールアップを可能にする。大規模ハイブリドー
マ培養のための技法は当業界においてよく知られてお
り、そして例えばエアーリフト反応器又は連続撹拌反応
器中での均一浮遊培養、及び例えば中空繊維中、マイク
ロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上又はセラミ
ックカートリッジ上での固定化又は捕捉細胞培養を包含
する。
【００８１】多量の目的とするモノクローナル抗体はま
た、工程ｂ）によるハイブリドーマ細胞の増殖によって
も得ることができる。細胞クローンを同系哺乳類に注射
し、この動物が抗体産生腫瘍を増殖せしめる。１〜３週
間の後、目的のモノクローナル抗体を前記哺乳類の体液
から回収する。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のハイ
ブリド細胞をプリスタンのごとき炭化水素で前処理され
ている場合があるＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、
そして１〜２週間後これらのマウスの腹水を集める。そ
れ自体既知の方法により、例えば蛋白質を硫酸アンモニ
ウム等により沈澱せしめ、次に標準的方法、例えばゲル
濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロ
ース上でのクロマトグラフィー、又はイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより免疫グロブリンを精製す
ることにより体液から目的のモノクローナル抗体を単離
する。
た、工程ｂ）によるハイブリドーマ細胞の増殖によって
も得ることができる。細胞クローンを同系哺乳類に注射
し、この動物が抗体産生腫瘍を増殖せしめる。１〜３週
間の後、目的のモノクローナル抗体を前記哺乳類の体液
から回収する。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のハイ
ブリド細胞をプリスタンのごとき炭化水素で前処理され
ている場合があるＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、
そして１〜２週間後これらのマウスの腹水を集める。そ
れ自体既知の方法により、例えば蛋白質を硫酸アンモニ
ウム等により沈澱せしめ、次に標準的方法、例えばゲル
濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロ
ース上でのクロマトグラフィー、又はイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより免疫グロブリンを精製す
ることにより体液から目的のモノクローナル抗体を単離
する。
【００８２】前記の様にしてヒトインターフェロンで誘
導された蛋白質に対する特異性を維持しているモノクロ
ーナル抗体の断片、例えばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａ
ｂ′）2 断片は、工程ａ）又はｂ）に従って調製された
モノクローナル抗体から、それ自体既知の方法により、
例えばペプシンもしくはパパインのごとき酵素による消
化及び／又は化学的還元によるジスルフィド結合の開裂
により得ることができる。
導された蛋白質に対する特異性を維持しているモノクロ
ーナル抗体の断片、例えばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａ
ｂ′）2 断片は、工程ａ）又はｂ）に従って調製された
モノクローナル抗体から、それ自体既知の方法により、
例えばペプシンもしくはパパインのごとき酵素による消
化及び／又は化学的還元によるジスルフィド結合の開裂
により得ることができる。
【００８３】放射性ヨウ素によりラベルされたモノクロ
ーナル抗体は当業界で知られているヨウ素化法により、
例えば放射性ヨウ化ナトリウム又はヨウ化カリウム及び
化学酸化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミン
Ｔ等により、あるいは酵素的酸化剤、例えばラクトパー
オキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ及びグルコー
スによりモノクローナル抗体をラベルすることにより製
造される。この発明の放射能ラベルされたモノクローナ
ル抗体はまた、段階ａ）のインビトロ培養の培地に放射
能ラベルされた栄養素を添加することによっても製造さ
れる。この様な放射能ラベルされた栄養素は、例えば放
射性炭素（14Ｃ）、トリチウム（ 3Ｈ）、硫黄（35Ｓ）
等を含有し、そして例えばＬ−（14Ｃ）−ロイシン、Ｌ
−（ 3Ｈ）−ロイシン又はＬ−（35Ｓ）−メチオニンで
ある。
ーナル抗体は当業界で知られているヨウ素化法により、
例えば放射性ヨウ化ナトリウム又はヨウ化カリウム及び
化学酸化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミン
Ｔ等により、あるいは酵素的酸化剤、例えばラクトパー
オキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ及びグルコー
スによりモノクローナル抗体をラベルすることにより製
造される。この発明の放射能ラベルされたモノクローナ
ル抗体はまた、段階ａ）のインビトロ培養の培地に放射
能ラベルされた栄養素を添加することによっても製造さ
れる。この様な放射能ラベルされた栄養素は、例えば放
射性炭素（14Ｃ）、トリチウム（ 3Ｈ）、硫黄（35Ｓ）
等を含有し、そして例えばＬ−（14Ｃ）−ロイシン、Ｌ
−（ 3Ｈ）−ロイシン又はＬ−（35Ｓ）−メチオニンで
ある。
【００８４】この発明のモノクローナル抗体の接合体
は、当業界において知られている方法により、例えば工
程ａ）もしくはｂ）に従って調製されたモノクローナル
抗体又は前記の方法により調製された断片を、カップリ
ング剤、例えばグルタルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、
Ｎ，Ｎ′−０−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マ
レイミドベンゾイルオキシ）−サクシンイミド、Ｎ−
（３−〔２′−ピリジルジチオ〕−プロピオノキシ）−
サクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチル−
アミノプロピル）−カルボジイミド等の存在下で、酵素
と反応せしめることにより得られる。
は、当業界において知られている方法により、例えば工
程ａ）もしくはｂ）に従って調製されたモノクローナル
抗体又は前記の方法により調製された断片を、カップリ
ング剤、例えばグルタルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、
Ｎ，Ｎ′−０−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マ
レイミドベンゾイルオキシ）−サクシンイミド、Ｎ−
（３−〔２′−ピリジルジチオ〕−プロピオノキシ）−
サクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチル−
アミノプロピル）−カルボジイミド等の存在下で、酵素
と反応せしめることにより得られる。
【００８５】アビジンとの接合体が同様にして得られ
る。ビオチンとの接合体は例えばモノクローナル抗体を
ビオチンの活性化されたエステル、例えばビオチンＮ−
ヒドロキシサクシンイミドエステルと反応せしめること
により得られる。蛍光マーカーとの接合体は、カップリ
ング剤、例えば前に挙げたカップリング剤の存在下で、
又はイソチオシアネート、好ましくはフルオレッセイン
−イソチオシアネートとの反応により調製される。
る。ビオチンとの接合体は例えばモノクローナル抗体を
ビオチンの活性化されたエステル、例えばビオチンＮ−
ヒドロキシサクシンイミドエステルと反応せしめること
により得られる。蛍光マーカーとの接合体は、カップリ
ング剤、例えば前に挙げたカップリング剤の存在下で、
又はイソチオシアネート、好ましくはフルオレッセイン
−イソチオシアネートとの反応により調製される。
【００８６】この発明はさらに、前記のようにヒトイン
ターフェロンで誘導された蛋白質に対する特異性を有す
るモノクローナル抗体を分泌することを特徴とするハイ
ブリドーマセルラインに関する。特にこの発明は、骨髄
腫細胞と７８kDa の見かけ分子量を有する精製されたヒ
トインターフェロン誘導蛋白質により免疫感作された哺
乳類のＢリンパ球とのハイブリドーマであるセルライン
に関する。好ましくは、これらのセルラインはマウス骨
髄腫細胞と前記蛋白質により免疫感作された同系マウス
のＢリンパ球とのハイブリドである。
ターフェロンで誘導された蛋白質に対する特異性を有す
るモノクローナル抗体を分泌することを特徴とするハイ
ブリドーマセルラインに関する。特にこの発明は、骨髄
腫細胞と７８kDa の見かけ分子量を有する精製されたヒ
トインターフェロン誘導蛋白質により免疫感作された哺
乳類のＢリンパ球とのハイブリドーマであるセルライン
に関する。好ましくは、これらのセルラインはマウス骨
髄腫細胞と前記蛋白質により免疫感作された同系マウス
のＢリンパ球とのハイブリドである。
【００８７】この様なセルラインの例として、８８５
Ｓ３５．８．１、８８５ Ｓ３５．１６．１１、８８５
Ｓ５６．５５．７．１２．４８、８８５ Ｓ５６．５
５．７．２１．２５、８８５ Ｓ５６．５５．７．２
７．５、８８５ Ｓ５６．５５．７．２７．１１、８８
５ Ｓ５６．５５．１３、８８５ Ｓ５６．５５．１
７、及び８８５ Ｓ５６．６７．１５と称するハイブリ
ドーマセルラインが挙げられる。
Ｓ３５．８．１、８８５ Ｓ３５．１６．１１、８８５
Ｓ５６．５５．７．１２．４８、８８５ Ｓ５６．５
５．７．２１．２５、８８５ Ｓ５６．５５．７．２
７．５、８８５ Ｓ５６．５５．７．２７．１１、８８
５ Ｓ５６．５５．１３、８８５ Ｓ５６．５５．１
７、及び８８５ Ｓ５６．６７．１５と称するハイブリ
ドーマセルラインが挙げられる。
【００８８】これらのハイブリドーマセルラインはマウ
ス骨髄腫セルラインＳｐ２／０−Ａｇ１４と、前記の様
なナマルワ細胞からの精製されたヒトインターフェロン
誘導蛋白質により免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウスの
脾臓のＢリンパ球とのハイブリドーマである。これらは
安定なセルラインであり対応する名称のモノクローナル
抗体を分泌する。セルラインは培養において保持される
か、又は液体窒素中での深冷凍結により保持されそして
解凍により再活性化される。８８５ Ｓ３５．８．１、
８８５ Ｓ５６．５５．１３及び８８５ Ｓ５６．６
７．１５と称するハイブリドーマセルラインが特に好ま
しく、これらはそれぞれＩ−５４５，Ｉ−５４３及びＩ
−５４４として、パスツール研究所（パリ）のCollecti
on Nationale de Cultures de Microorganismes に１９
８６年４月９日に寄託された。
ス骨髄腫セルラインＳｐ２／０−Ａｇ１４と、前記の様
なナマルワ細胞からの精製されたヒトインターフェロン
誘導蛋白質により免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウスの
脾臓のＢリンパ球とのハイブリドーマである。これらは
安定なセルラインであり対応する名称のモノクローナル
抗体を分泌する。セルラインは培養において保持される
か、又は液体窒素中での深冷凍結により保持されそして
解凍により再活性化される。８８５ Ｓ３５．８．１、
８８５ Ｓ５６．５５．１３及び８８５ Ｓ５６．６
７．１５と称するハイブリドーマセルラインが特に好ま
しく、これらはそれぞれＩ−５４５，Ｉ−５４３及びＩ
−５４４として、パスツール研究所（パリ）のCollecti
on Nationale de Cultures de Microorganismes に１９
８６年４月９日に寄託された。
【００８９】この発明はまた、前記のインターフェロン
誘導蛋白質に対する特異性を有するモノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマセルラインの製造方法に関
し、この方法は適当な哺乳類を精製された蛋白質によ
り、場合によっては抗原キャリャーと共に免疫感作し、
この哺乳類の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、
この融合において得られたハイブリド細胞をクローン化
し、そして目的の抗体を分泌する細胞クローンを選択す
ることを特徴とする。
誘導蛋白質に対する特異性を有するモノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマセルラインの製造方法に関
し、この方法は適当な哺乳類を精製された蛋白質によ
り、場合によっては抗原キャリャーと共に免疫感作し、
この哺乳類の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、
この融合において得られたハイブリド細胞をクローン化
し、そして目的の抗体を分泌する細胞クローンを選択す
ることを特徴とする。
【００９０】免疫感作のために好ましい動物はマウス、
特にＨＲ−マウスである。免疫感作は、例えば、誘導さ
れたナマルワ細胞からの精製された７８kDa 蛋白質を含
有する抗原キャリャー例えばニトロセルロース片を移植
し、そしてさらに２μｇ〜１０μｇの該蛋白質を２〜１
０回非経口的に、例えば腹腔内及び／又は皮下に７〜３
０日の間隔で注射することにより行われる。この注射は
場合によってはリンパ球の生産を刺激するアジュバン
ト、例えば完全又は不完全フロインドアジュバント及び
／又はアジュバントペプチドを含有する。
特にＨＲ−マウスである。免疫感作は、例えば、誘導さ
れたナマルワ細胞からの精製された７８kDa 蛋白質を含
有する抗原キャリャー例えばニトロセルロース片を移植
し、そしてさらに２μｇ〜１０μｇの該蛋白質を２〜１
０回非経口的に、例えば腹腔内及び／又は皮下に７〜３
０日の間隔で注射することにより行われる。この注射は
場合によってはリンパ球の生産を刺激するアジュバン
ト、例えば完全又は不完全フロインドアジュバント及び
／又はアジュバントペプチドを含有する。
【００９１】最終追加免疫の２〜５日後に採取した免疫
感作された哺乳類の抗体産生細胞、好ましくは脾細胞を
融合促進剤の存在下で適当なセルラインの骨髄腫細胞と
融合せしめる。幾つかの適当な骨髄腫セルラインが当業
界において知られている。酵素グアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は酵素チミジンキ
ナーゼ（ＴＫ）を欠いており、それ故にヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジンを含有する選択培地
（ＨＡＴ培地）中で生存しない骨髄腫セルラインが好ま
しい。
感作された哺乳類の抗体産生細胞、好ましくは脾細胞を
融合促進剤の存在下で適当なセルラインの骨髄腫細胞と
融合せしめる。幾つかの適当な骨髄腫セルラインが当業
界において知られている。酵素グアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は酵素チミジンキ
ナーゼ（ＴＫ）を欠いており、それ故にヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジンを含有する選択培地
（ＨＡＴ培地）中で生存しない骨髄腫セルラインが好ま
しい。
【００９２】ＨＡＴ培地中で生存せずそして免疫グロブ
リン又はその断片を分泌しない骨髄腫セルライン及び誘
導体セルライン、例えばセルラインＸ６３−Ａｇ８．６
５３又はＳｐ２／０−Ａｇ１４が特に好ましい。考慮さ
れる融合促進剤は例えばセンダイウイルス又は他のパラ
ミクソウイルス（場合によってはＵＶで不活性化された
形のもの）、カルシウムイオン、界面活性リピド例えば
リソレシチン、又はポリエチレングリコールである。好
ましくは、骨髄腫細胞を、分子量１０００〜４０００の
ポリエチレングリコール約３０〜約６０％を含有する溶
液中で、免疫感作された哺乳類からの３〜２０倍過剰の
脾細胞と融合せしめる。
リン又はその断片を分泌しない骨髄腫セルライン及び誘
導体セルライン、例えばセルラインＸ６３−Ａｇ８．６
５３又はＳｐ２／０−Ａｇ１４が特に好ましい。考慮さ
れる融合促進剤は例えばセンダイウイルス又は他のパラ
ミクソウイルス（場合によってはＵＶで不活性化された
形のもの）、カルシウムイオン、界面活性リピド例えば
リソレシチン、又はポリエチレングリコールである。好
ましくは、骨髄腫細胞を、分子量１０００〜４０００の
ポリエチレングリコール約３０〜約６０％を含有する溶
液中で、免疫感作された哺乳類からの３〜２０倍過剰の
脾細胞と融合せしめる。
【００９３】ハイブリドーマ細胞の拡張のために適当な
培地は標準的培地、例えばダルベコ改変イーグル培地、
最少必須培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等であって、場合
によっては、血清、例えば１０〜１５％のウシ胎児血清
が補充されたものである。好ましくは、細胞増殖の始め
においてフィーダー細胞、例えば正常マウス腹腔滲出細
胞、脾細胞、骨髄マクロファージ等を加える。ハイブリ
ドーマ細胞に卓越して正常細胞が増殖するのを防止する
ため培地に選択ＨＡＴ培地を一定間隔で補充する。
培地は標準的培地、例えばダルベコ改変イーグル培地、
最少必須培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等であって、場合
によっては、血清、例えば１０〜１５％のウシ胎児血清
が補充されたものである。好ましくは、細胞増殖の始め
においてフィーダー細胞、例えば正常マウス腹腔滲出細
胞、脾細胞、骨髄マクロファージ等を加える。ハイブリ
ドーマ細胞に卓越して正常細胞が増殖するのを防止する
ため培地に選択ＨＡＴ培地を一定間隔で補充する。
【００９４】ハイブリドーマ細胞培養上清を目的のモノ
クローナル抗体について好ましくは酵素イムノアッセ
イ、例えばドット−ＥＬＩＳＡアッセイ、又はラジオイ
ムノアッセイによりスクリーニングする。陽性ハイブリ
ドーマ細胞を、例えば限界稀釈法により、選択的に２回
以上クローン化する。場合によっては、ハイブリドーマ
細胞を、動物、例えばマウスへのｉ．ｐ．注射及び腫水
の収得により継代し、これによりハイブリドーマを安定
化し、そして増殖特性を改良する。
クローナル抗体について好ましくは酵素イムノアッセ
イ、例えばドット−ＥＬＩＳＡアッセイ、又はラジオイ
ムノアッセイによりスクリーニングする。陽性ハイブリ
ドーマ細胞を、例えば限界稀釈法により、選択的に２回
以上クローン化する。場合によっては、ハイブリドーマ
細胞を、動物、例えばマウスへのｉ．ｐ．注射及び腫水
の収得により継代し、これによりハイブリドーマを安定
化し、そして増殖特性を改良する。
【００９５】この発明のモノクローナル抗体及び／又は
その誘導体は、前記のインターフェロン誘導ヒト蛋白質
の定性的及び定量的測定のために有用である。例えば、
モノクローナル抗体又はその誘導体、例えば酵素接合体
又は放射性誘導体は、この発明の蛋白質の抗原決定基と
モノクローナル抗体との間の結合相互作用に基礎を置く
既知のイムノアッセイのいずれかにおいて使用すること
ができる。この様なアッセイの例としてラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ、例えばエンザ
イム・リンクド・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）、イムノフルオレッセンス、免疫沈澱、ラテック
ス凝集、及び赤血球凝集が挙げられる。これらのイムノ
アッセイは例えば天然源又は遺伝子操作された微生物か
らの目的蛋白質の生産及び精製のモニターのため、並び
に例えばこの発明の蛋白質又はインターフェロンによる
治療を受けている患者又はそのような治療を必要とする
患者の生物学的流体中の蛋白質の定性的及び定量的測定
のために有用である。
その誘導体は、前記のインターフェロン誘導ヒト蛋白質
の定性的及び定量的測定のために有用である。例えば、
モノクローナル抗体又はその誘導体、例えば酵素接合体
又は放射性誘導体は、この発明の蛋白質の抗原決定基と
モノクローナル抗体との間の結合相互作用に基礎を置く
既知のイムノアッセイのいずれかにおいて使用すること
ができる。この様なアッセイの例としてラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ、例えばエンザ
イム・リンクド・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）、イムノフルオレッセンス、免疫沈澱、ラテック
ス凝集、及び赤血球凝集が挙げられる。これらのイムノ
アッセイは例えば天然源又は遺伝子操作された微生物か
らの目的蛋白質の生産及び精製のモニターのため、並び
に例えばこの発明の蛋白質又はインターフェロンによる
治療を受けている患者又はそのような治療を必要とする
患者の生物学的流体中の蛋白質の定性的及び定量的測定
のために有用である。
【００９６】この発明のモノクローナル抗体はそれ自体
として、又は放射性ラベルされた誘導体の形でラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）において使用することができ
る。ＲＩＡの任意の既知の変法、例えば均一相ＲＩＡ、
固相ＲＩＡ又は不均一相ＲＩＡ、及びこの発明の蛋白質
の直接又は間接（競争的）測定のためのシングルＲＩＡ
又はダブル（サンドイッチ）ＲＩＡを使用することがで
きる。
として、又は放射性ラベルされた誘導体の形でラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）において使用することができ
る。ＲＩＡの任意の既知の変法、例えば均一相ＲＩＡ、
固相ＲＩＡ又は不均一相ＲＩＡ、及びこの発明の蛋白質
の直接又は間接（競争的）測定のためのシングルＲＩＡ
又はダブル（サンドイッチ）ＲＩＡを使用することがで
きる。
【００９７】サンドイッチＲＩＡが好ましく、この方法
においてはキャリャー、例えばポリスチレン、ポリプロ
ピレン又はポリ塩化ビニルのミクロタイタープレート又
は試験管のプラスチック表面、ガラス又はプラスチック
のビーズ、濾紙、あるいはデキストラン、酢酸セルロー
ス又はニトロセルロースのシート等が単純吸着又は例え
ばグルタルアルデヒドもしくは臭化シアンによるキャリ
ャーの活性化の後に本発明のモノクローナル抗体により
コートされ、そして試験溶液及び 125Ｉで放射性ラベル
されたモノクローナル抗体の溶液、すなわちキャリャー
に結合したモノクローナル抗体とは異る、この発明の蛋
白質の他のエピトープを認識する溶解したモノクローナ
ル抗体と共にインキュベートし、そしてキャリャーに結
合した放射能を測定することによりこの発明の蛋白質の
量を決定する。
においてはキャリャー、例えばポリスチレン、ポリプロ
ピレン又はポリ塩化ビニルのミクロタイタープレート又
は試験管のプラスチック表面、ガラス又はプラスチック
のビーズ、濾紙、あるいはデキストラン、酢酸セルロー
ス又はニトロセルロースのシート等が単純吸着又は例え
ばグルタルアルデヒドもしくは臭化シアンによるキャリ
ャーの活性化の後に本発明のモノクローナル抗体により
コートされ、そして試験溶液及び 125Ｉで放射性ラベル
されたモノクローナル抗体の溶液、すなわちキャリャー
に結合したモノクローナル抗体とは異る、この発明の蛋
白質の他のエピトープを認識する溶解したモノクローナ
ル抗体と共にインキュベートし、そしてキャリャーに結
合した放射能を測定することによりこの発明の蛋白質の
量を決定する。
【００９８】前記のサンドイッチラジオイムノアッセイ
が特に好ましく、この方法においてはこの発明のモノク
ローナル抗体をビーズ、例えばポリスチレンビーズに結
合せしめ、このコートされたビーズをインターフェロン
誘導−ヒト蛋白質を含有する標準溶液又は試験溶液中で
インキュベートし、そして最後に異るエピトープを認識
する放射性ラベルされたモノクローナル抗体により発色
せしめる。この発明のモノクローナル抗体はそれ自体と
して、又は酵素接合誘導体の形態で酵素イムノアッセイ
において使用することができる。この様なイムノアッセ
イには、この発明の酵素ラベルされたモノクローナル抗
体誘導体、又はこの発明の抗体のエピトープを認識しそ
れに結合するそれ自体既知の酵素ラベルされた抗体を使
用する方法が含まれる。
が特に好ましく、この方法においてはこの発明のモノク
ローナル抗体をビーズ、例えばポリスチレンビーズに結
合せしめ、このコートされたビーズをインターフェロン
誘導−ヒト蛋白質を含有する標準溶液又は試験溶液中で
インキュベートし、そして最後に異るエピトープを認識
する放射性ラベルされたモノクローナル抗体により発色
せしめる。この発明のモノクローナル抗体はそれ自体と
して、又は酵素接合誘導体の形態で酵素イムノアッセイ
において使用することができる。この様なイムノアッセ
イには、この発明の酵素ラベルされたモノクローナル抗
体誘導体、又はこの発明の抗体のエピトープを認識しそ
れに結合するそれ自体既知の酵素ラベルされた抗体を使
用する方法が含まれる。
【００９９】ＥＬＩＳＡ（エンザイム・リンクド・イム
ノソルベント・アッセイ）が好ましく、この方法におい
てはＲＩＡについて前記したキャリャーがこの発明のモ
ノクローナル抗体でコートされ、インターフェロン誘導
ヒト蛋白質を含有する試験溶液と共にインキュベートさ
れ、そして次にこの蛋白質に対するポリクローナル血
清、例えばヒツジ血清と共にインキュベートされ、そし
て最後にこのポリクローナル血清の結合した抗体がこれ
らを認識しそしてこれらに結合する酵素ラベルされた抗
体により顕現され、そして結合した蛋白質の量が酵素基
質反応により決定される。この様な酵素ラベルされた抗
体は例えばホスファターゼラベルされたヤギ−抗ヒツジ
免疫グロブリンである。
ノソルベント・アッセイ）が好ましく、この方法におい
てはＲＩＡについて前記したキャリャーがこの発明のモ
ノクローナル抗体でコートされ、インターフェロン誘導
ヒト蛋白質を含有する試験溶液と共にインキュベートさ
れ、そして次にこの蛋白質に対するポリクローナル血
清、例えばヒツジ血清と共にインキュベートされ、そし
て最後にこのポリクローナル血清の結合した抗体がこれ
らを認識しそしてこれらに結合する酵素ラベルされた抗
体により顕現され、そして結合した蛋白質の量が酵素基
質反応により決定される。この様な酵素ラベルされた抗
体は例えばホスファターゼラベルされたヤギ−抗ヒツジ
免疫グロブリンである。
【０１００】さらに、他のＥＬＩＳＡも好ましく、この
方法においてはこの発明のモノクローナル抗体でコート
されたキャリャーを試験溶液及び酵素と接合したモノク
ローナル抗体の溶液、すなわちキャリャーに結合したモ
ノクローナル抗体ではなくインターフェロン誘導−ヒト
蛋白質の他のエピトープを認識する溶解したモノクロー
ナル抗体と共にインキュベートする。他の変化をもたら
しそして肉眼により又は光学測定装置により観察するこ
とができる酵素基質反応により、試験溶液中の蛋白質の
量と比例する結合した酵素の量を測定する。
方法においてはこの発明のモノクローナル抗体でコート
されたキャリャーを試験溶液及び酵素と接合したモノク
ローナル抗体の溶液、すなわちキャリャーに結合したモ
ノクローナル抗体ではなくインターフェロン誘導−ヒト
蛋白質の他のエピトープを認識する溶解したモノクロー
ナル抗体と共にインキュベートする。他の変化をもたら
しそして肉眼により又は光学測定装置により観察するこ
とができる酵素基質反応により、試験溶液中の蛋白質の
量と比例する結合した酵素の量を測定する。
【０１０１】イムノブロット分析と呼ばれる酵素イムノ
アッセイが特に好ましく、この方法においてはインター
フェロン誘導−ヒト蛋白質を含有する試験溶液又は標準
溶液がポリペプチドに対する強い親和性を有するミクロ
ポーラスキャリャー、例えばニトロセルロース上にスポ
ットされ、このサンプルの１個又は複数個のドットを担
持するキャリャーがこの発明のモノクローナル抗体溶液
中でインキュベートされ、次にこの発明のモノクローナ
ル抗体を認識しそして結合する酵素ラベルされた第二抗
体の溶液中でインキュベートされ、そして最後に検出可
能なシグナル、例えば着色された物質をもたらす酵素基
質の溶液中でインキュベートされる。この様な酵素ラベ
ルされた第二抗体は例えば、ホースラディッシュパーオ
キシダーゼと接合したラビット抗マウス免疫グロブリン
であって、これを適当な酵素基質、例えば４−クロロ−
１−ナフトール等により発色せしめることができる。
アッセイが特に好ましく、この方法においてはインター
フェロン誘導−ヒト蛋白質を含有する試験溶液又は標準
溶液がポリペプチドに対する強い親和性を有するミクロ
ポーラスキャリャー、例えばニトロセルロース上にスポ
ットされ、このサンプルの１個又は複数個のドットを担
持するキャリャーがこの発明のモノクローナル抗体溶液
中でインキュベートされ、次にこの発明のモノクローナ
ル抗体を認識しそして結合する酵素ラベルされた第二抗
体の溶液中でインキュベートされ、そして最後に検出可
能なシグナル、例えば着色された物質をもたらす酵素基
質の溶液中でインキュベートされる。この様な酵素ラベ
ルされた第二抗体は例えば、ホースラディッシュパーオ
キシダーゼと接合したラビット抗マウス免疫グロブリン
であって、これを適当な酵素基質、例えば４−クロロ−
１−ナフトール等により発色せしめることができる。
【０１０２】この発明のモノクローナル抗体はそれ自体
として又は蛍光マーカーと接合した誘導体の形で蛍光抗
体試験法において使用することができる。このような蛍
光抗体試験法は、この発明のモノクローナル抗体の誘導
体、例えばフルオレッセインと接合した誘導体、又はこ
の発明のモノクローナル抗体のエピトープを認識しそし
て結合するそれ自体既知の蛍光マーカーラベルされた抗
体を使用する方法を包含する。
として又は蛍光マーカーと接合した誘導体の形で蛍光抗
体試験法において使用することができる。このような蛍
光抗体試験法は、この発明のモノクローナル抗体の誘導
体、例えばフルオレッセインと接合した誘導体、又はこ
の発明のモノクローナル抗体のエピトープを認識しそし
て結合するそれ自体既知の蛍光マーカーラベルされた抗
体を使用する方法を包含する。
【０１０３】次の様な蛍光抗体法が好ましく、この方法
においてはＲＩＡについて記載したようなキャリャーを
標準的方法に従って、この発明の蛋白質の存在について
試験されるべき細胞によりコートし、該細胞を固定し、
そして細胞内の蛋白質性物質と適用された溶液との相互
作用を許容する様に透過性にし、そして蛍光マーカーと
接合したこの発明のモノクローナル抗体誘導体の溶液と
共にインキュベートするか、又はこの発明のモノクロー
ナル抗体の溶液とインキュベートし次にこの発明のモノ
クローナル抗体を認識しそして結合する蛍光マーカーに
よりラベルされた第二抗体、例えばフルオレッセインで
ラベルされたラビット抗マウス免疫グロブリンの溶液と
共にインキュベートする。次に、標準的蛍光顕微鏡法又
はフローサイトメトリーによりこの発明の蛋白質の存在
を検出しそして該蛋白質の位置を決定する。
においてはＲＩＡについて記載したようなキャリャーを
標準的方法に従って、この発明の蛋白質の存在について
試験されるべき細胞によりコートし、該細胞を固定し、
そして細胞内の蛋白質性物質と適用された溶液との相互
作用を許容する様に透過性にし、そして蛍光マーカーと
接合したこの発明のモノクローナル抗体誘導体の溶液と
共にインキュベートするか、又はこの発明のモノクロー
ナル抗体の溶液とインキュベートし次にこの発明のモノ
クローナル抗体を認識しそして結合する蛍光マーカーに
よりラベルされた第二抗体、例えばフルオレッセインで
ラベルされたラビット抗マウス免疫グロブリンの溶液と
共にインキュベートする。次に、標準的蛍光顕微鏡法又
はフローサイトメトリーによりこの発明の蛋白質の存在
を検出しそして該蛋白質の位置を決定する。
【０１０４】この発明のモノクローナル抗体はそれ自体
として、又は放射性ラベルされた誘導体の形態で免疫沈
澱試験において使用することができる。次の免疫沈澱試
験が好ましく、この方法においては、この発明の蛋白質
を生産する能力について試験されるべき細胞を、放射性
ラベルされた栄養素、例えば放射性炭素（14Ｃ）、トリ
チウム（ 3Ｈ）、硫黄（35Ｓ）等によりラベルされた栄
養素、例えば（35Ｓ）−メチオニンを含有する培地中で
増殖せしめ、次に細胞溶解して該細胞によって生産され
た放射性ラベルされた蛋白質性材料の溶液を得る。
として、又は放射性ラベルされた誘導体の形態で免疫沈
澱試験において使用することができる。次の免疫沈澱試
験が好ましく、この方法においては、この発明の蛋白質
を生産する能力について試験されるべき細胞を、放射性
ラベルされた栄養素、例えば放射性炭素（14Ｃ）、トリ
チウム（ 3Ｈ）、硫黄（35Ｓ）等によりラベルされた栄
養素、例えば（35Ｓ）−メチオニンを含有する培地中で
増殖せしめ、次に細胞溶解して該細胞によって生産され
た放射性ラベルされた蛋白質性材料の溶液を得る。
【０１０５】この溶液をこの発明のモノクローナル抗体
の溶液と共にインキュベートし、細胞中で生成した放射
性ラベルされた蛋白質とこの発明のモノクローナル抗体
との間のすべての複合体を沈澱せしめるか、あるいは好
ましくは、この発明のモノクローナル抗体に対する高い
親和性を有するアフィニティークロマトグラフィー材
料、例えばプロテインＡと連結されたクロマトグラフィ
ー材料上に、又はこの発明のモノクローナル抗体を認識
しそして結合する抗体、例えばラビット抗−マウス免疫
グロブリンに吸着せしめ、そして蛋白質／抗体複合体を
該沈澱又はアフィニティークロマトグラフィー材料から
単離する。
の溶液と共にインキュベートし、細胞中で生成した放射
性ラベルされた蛋白質とこの発明のモノクローナル抗体
との間のすべての複合体を沈澱せしめるか、あるいは好
ましくは、この発明のモノクローナル抗体に対する高い
親和性を有するアフィニティークロマトグラフィー材
料、例えばプロテインＡと連結されたクロマトグラフィ
ー材料上に、又はこの発明のモノクローナル抗体を認識
しそして結合する抗体、例えばラビット抗−マウス免疫
グロブリンに吸着せしめ、そして蛋白質／抗体複合体を
該沈澱又はアフィニティークロマトグラフィー材料から
単離する。
【０１０６】次に放射性ラベルされた蛋白質の存在を通
常の分析法、例えばフルオログラフィーを伴うＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、蛋白質／抗体複
合体が解離する条件下で確認する。ヒトインターフェロ
ンで誘導された蛋白質の定性的及び定量的測定のため
の、前記のモノクローナル抗体及びその誘導体のこの発
明に従う使用はまた、それ自体既知の他のイムノアッセ
イ、例えば抗体又は抗原がコートされたラテックス粒子
を用いるラテックス凝集法、あるいは抗原又は抗体がコ
ートされた赤血球を用いる血球凝集法等を含む。
常の分析法、例えばフルオログラフィーを伴うＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、蛋白質／抗体複
合体が解離する条件下で確認する。ヒトインターフェロ
ンで誘導された蛋白質の定性的及び定量的測定のため
の、前記のモノクローナル抗体及びその誘導体のこの発
明に従う使用はまた、それ自体既知の他のイムノアッセ
イ、例えば抗体又は抗原がコートされたラテックス粒子
を用いるラテックス凝集法、あるいは抗原又は抗体がコ
ートされた赤血球を用いる血球凝集法等を含む。
【０１０７】この発明はまた、７８kDa の見かけ分子量
を有するヒトインターフェロン誘導蛋白質の定性的及び
定量的測定のための試験キットに関し、このキットはこ
の発明のモノクローナル抗体及び／又はその誘導体、並
びに場合によっては他のモノクローナル抗体もしくはポ
リクローナル抗体及び／又は補助材を含む。ラジオイム
ノアッセイのためのこの発明のキットは、例えば、この
発明のモノクローナル抗体によりコートされているか又
はコートされていない適当な担体、ここの発明の蛋白質
に対するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗
体及び／又は放射性ラベルされたそれらの誘導体の場合
によっては凍結乾燥されているか又は濃縮されている溶
液、この蛋白質の標準溶液、緩衝液、並びに場合によっ
ては非特異的吸着及び凝集の形成を防止するための洗剤
及びポリペプチド、ピペット、反応容器、換算曲線、指
示書等を含む。
を有するヒトインターフェロン誘導蛋白質の定性的及び
定量的測定のための試験キットに関し、このキットはこ
の発明のモノクローナル抗体及び／又はその誘導体、並
びに場合によっては他のモノクローナル抗体もしくはポ
リクローナル抗体及び／又は補助材を含む。ラジオイム
ノアッセイのためのこの発明のキットは、例えば、この
発明のモノクローナル抗体によりコートされているか又
はコートされていない適当な担体、ここの発明の蛋白質
に対するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗
体及び／又は放射性ラベルされたそれらの誘導体の場合
によっては凍結乾燥されているか又は濃縮されている溶
液、この蛋白質の標準溶液、緩衝液、並びに場合によっ
ては非特異的吸着及び凝集の形成を防止するための洗剤
及びポリペプチド、ピペット、反応容器、換算曲線、指
示書等を含む。
【０１０８】酵素イムノアッセイのためのこの発明のキ
ットは、例えば、適当なキャリャー、例えばミクロタイ
タープレート又はニトロセルロースシート、この発明の
蛋白質に対するモノクローナル抗体の及びこの蛋白質に
対する又はこの蛋白質を認識する第一抗体に対する酵素
ラベルされたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗
体の場合によっては凍結乾燥されているか又は濃縮され
ている溶液、固体又は溶解した形態の酵素基質、この発
明の蛋白質の標準溶液、緩衝液、並びに場合によって
は、ポリペプチド及び洗剤、ピペット、反応容器、換算
曲線、色スケール表、指示書等を含む。
ットは、例えば、適当なキャリャー、例えばミクロタイ
タープレート又はニトロセルロースシート、この発明の
蛋白質に対するモノクローナル抗体の及びこの蛋白質に
対する又はこの蛋白質を認識する第一抗体に対する酵素
ラベルされたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗
体の場合によっては凍結乾燥されているか又は濃縮され
ている溶液、固体又は溶解した形態の酵素基質、この発
明の蛋白質の標準溶液、緩衝液、並びに場合によって
は、ポリペプチド及び洗剤、ピペット、反応容器、換算
曲線、色スケール表、指示書等を含む。
【０１０９】蛍光抗体試験のためのこの発明の試験キッ
トは、例えば、適当な担体、例えばプラスチックカバー
スリップ又はガラススライド、この発明の蛋白質に対す
るモノクローナル抗体の及び該モノクローナル抗体を認
識するフルオレッセインでラベルされたポリクローナル
抗体の場合によっては凍結乾燥されているか又は濃縮さ
れている溶液、緩衝液、並びに場合によってはこの発明
の蛋白質を含有する標準溶液、ポリペプチド及び洗剤、
ピペット、反応容器、指示書等を含む。
トは、例えば、適当な担体、例えばプラスチックカバー
スリップ又はガラススライド、この発明の蛋白質に対す
るモノクローナル抗体の及び該モノクローナル抗体を認
識するフルオレッセインでラベルされたポリクローナル
抗体の場合によっては凍結乾燥されているか又は濃縮さ
れている溶液、緩衝液、並びに場合によってはこの発明
の蛋白質を含有する標準溶液、ポリペプチド及び洗剤、
ピペット、反応容器、指示書等を含む。
【０１１０】免疫沈澱試験のためのこの発明の試験キッ
トは、例えば、適当なキャリャー、例えばプラスチック
又はガラスのプレート、この発明の蛋白質に対するモノ
クローナル抗体の場合によっては凍結乾燥されているか
又は濃縮されている溶液、放射性ラベルされた栄養素、
例えば35Ｓ−メチオニンの溶液、組織培養溶液、緩衝
液、インターフェロン−α又は−βの場合によっては凍
結乾燥されているか又は濃縮されている溶液、並びに場
合によっては、この発明の蛋白質を含有する標準溶液、
抗原／抗体複合体中のモノクローナル抗体と結合するア
フィニティークロマトグラフィー材料、洗剤及びポリペ
プチド、ピペット、反応容器、指示書等を含む。
トは、例えば、適当なキャリャー、例えばプラスチック
又はガラスのプレート、この発明の蛋白質に対するモノ
クローナル抗体の場合によっては凍結乾燥されているか
又は濃縮されている溶液、放射性ラベルされた栄養素、
例えば35Ｓ−メチオニンの溶液、組織培養溶液、緩衝
液、インターフェロン−α又は−βの場合によっては凍
結乾燥されているか又は濃縮されている溶液、並びに場
合によっては、この発明の蛋白質を含有する標準溶液、
抗原／抗体複合体中のモノクローナル抗体と結合するア
フィニティークロマトグラフィー材料、洗剤及びポリペ
プチド、ピペット、反応容器、指示書等を含む。
【０１１１】この発明のモノクローナル抗体及び抗体誘
導体は、インターフェロン−α又は−βにより誘導され
たヒト７８kDa 蛋白質の定性的及び定量的測定のため
に、好ましくは酵素イムノアッセイ、蛍光抗体試験又は
免疫沈澱試験において使用される。生物学的流体、組織
切片及び細胞中のヒト７８kDa 蛋白質の量の確実な決定
は、ヒト７８kDa 蛋白質を用いる療法の又はインターフ
ェロン−αもしくは−βを用いる療法の簡単な監視を可
能にする。さらに、モノクローナル抗体及び抗体誘導体
は、天然源又は組換宿主細胞からのイノムアフィニティ
ークロマトグラフィーによるヒト７８kDa 蛋白質の単離
及び精製において使用することができる。
導体は、インターフェロン−α又は−βにより誘導され
たヒト７８kDa 蛋白質の定性的及び定量的測定のため
に、好ましくは酵素イムノアッセイ、蛍光抗体試験又は
免疫沈澱試験において使用される。生物学的流体、組織
切片及び細胞中のヒト７８kDa 蛋白質の量の確実な決定
は、ヒト７８kDa 蛋白質を用いる療法の又はインターフ
ェロン−αもしくは−βを用いる療法の簡単な監視を可
能にする。さらに、モノクローナル抗体及び抗体誘導体
は、天然源又は組換宿主細胞からのイノムアフィニティ
ークロマトグラフィーによるヒト７８kDa 蛋白質の単離
及び精製において使用することができる。
【０１１２】次に、例によりこの発明をさらに具体的に
説明するが、これによりこの発明の範囲を限定するもの
ではない。例において使用される略号は次の意味を有す
る。 ＡＴＰ アデノシン三リン酸 ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ cpm カウント／分（放射能崩壊） ｄＡ ２′−デオキシアデノシン ｄＡＴＰ ２′−デオキシアデノシン三リン酸 ｄＣ ２′−デオキシシチジン ｄＣＴＰ ２′−デオキシシチジン三リン酸 ｄＧ ２′−デオキシグアノシン ｄＧＴＰ ２′−デオキシグアノシン三リン酸 ＤＮＡ デオキシリボヌクレオチド ｄＮＴＰ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴ
ＴＰの混合物 ｄｓ ＤＮＡ 二本鎖ＤＮＡ ｄＴ （２′−デオキシ）チミジン ｄＴＴＰ チミジン三リン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
説明するが、これによりこの発明の範囲を限定するもの
ではない。例において使用される略号は次の意味を有す
る。 ＡＴＰ アデノシン三リン酸 ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ cpm カウント／分（放射能崩壊） ｄＡ ２′−デオキシアデノシン ｄＡＴＰ ２′−デオキシアデノシン三リン酸 ｄＣ ２′−デオキシシチジン ｄＣＴＰ ２′−デオキシシチジン三リン酸 ｄＧ ２′−デオキシグアノシン ｄＧＴＰ ２′−デオキシグアノシン三リン酸 ＤＮＡ デオキシリボヌクレオチド ｄＮＴＰ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴ
ＴＰの混合物 ｄｓ ＤＮＡ 二本鎖ＤＮＡ ｄＴ （２′−デオキシ）チミジン ｄＴＴＰ チミジン三リン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
【０１１３】ＦＣＳ ウシ胎児血清 ＨＡＴ ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミ
ジン ＩＦＮ インターフェロン kDa キロダルトン（分子量） ｍＲＮＡ メッセンジャーＲＮＡ ＰＢＳ リン酸緩衝化塩溶液 ＲＮＡ リボ核酸 rpm １分間当り回転数 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＴＢＳ Ｔｒｉｓ緩衝液 Ｔｒｉｓ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン ｔＲＮＡ トランスファーＲＮＡ。
ジン ＩＦＮ インターフェロン kDa キロダルトン（分子量） ｍＲＮＡ メッセンジャーＲＮＡ ＰＢＳ リン酸緩衝化塩溶液 ＲＮＡ リボ核酸 rpm １分間当り回転数 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＴＢＳ Ｔｒｉｓ緩衝液 Ｔｒｉｓ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン ｔＲＮＡ トランスファーＲＮＡ。
【０１１４】次の緩衝液及び培地を使用する。 デンハート溶液 ０．１％ポリビニルピロリドン（Ｐ
ＶＰ−３６０、シグマ）、０．１％フィコール４００
（ファルマシア）、０．１％ＢＳＡ。 低張緩衝液 ５mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．
４）、１．５mM ＫＣｌ、２．５mM ＭｇＣｌ2 。 ＬＢ培地 １％バクト（登録商標）トリプトン
（ディフコ）、０．５％バクト（登録商標）酵母エキス
（ディフコ）、１７０mM ＮａＣｌ，ＮａＯＨによりpH
７．５に調整。 連結緩衝液 ５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH
８）、７mM ＭｇＣｌ2 、１mMジチオスレイトール。 マングビーンヌクレアーゼ緩衝液 ３０mM ＮａＯＡｃ（pH５）、５０mM ＮａＣｌ、１mM
ＺｎＣｌ2 、５％グリセロール。
ＶＰ−３６０、シグマ）、０．１％フィコール４００
（ファルマシア）、０．１％ＢＳＡ。 低張緩衝液 ５mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．
４）、１．５mM ＫＣｌ、２．５mM ＭｇＣｌ2 。 ＬＢ培地 １％バクト（登録商標）トリプトン
（ディフコ）、０．５％バクト（登録商標）酵母エキス
（ディフコ）、１７０mM ＮａＣｌ，ＮａＯＨによりpH
７．５に調整。 連結緩衝液 ５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH
８）、７mM ＭｇＣｌ2 、１mMジチオスレイトール。 マングビーンヌクレアーゼ緩衝液 ３０mM ＮａＯＡｃ（pH５）、５０mM ＮａＣｌ、１mM
ＺｎＣｌ2 、５％グリセロール。
【０１１５】ＰＢＳ １３６mM ＮａＣｌ、
２mM ＫＣｌ、８mM Ｎａ2 ＨＰＯ4、１．４mM ＫＨ
2 ＰＯ4 。 ＳＳＣ緩衝液 １５mM クエン酸ナトリウム、１５
０mM ＮａＣｌ，ＮａＯＨにてpH７．０に調整。 ＴＢＳ １０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．
６）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ。 ＴＥ緩衝液 １０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．
５）、１mM ＥＤＴＡ。
２mM ＫＣｌ、８mM Ｎａ2 ＨＰＯ4、１．４mM ＫＨ
2 ＰＯ4 。 ＳＳＣ緩衝液 １５mM クエン酸ナトリウム、１５
０mM ＮａＣｌ，ＮａＯＨにてpH７．０に調整。 ＴＢＳ １０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．
６）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ。 ＴＥ緩衝液 １０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．
５）、１mM ＥＤＴＡ。
【０１１６】例１．インターフェロンによるナマルワ細
胞の誘導 １．１．セルライン ナマルワ細胞ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３２を、２ｇ／ｌ
のＮａＨＣＯ3 、１０ 5 ユニット／ｌのペニシリン、１
００mg／ｌのストレプトマイシン及び１０％の不活性化
ＦＣＳ（５６℃にて３０分間インキュベーション）を補
充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で１ｌのスピンナーフ
ラスコ（ベルコ）中浮遊培養により培養する。細胞を５
×１０5 細胞／mlの濃度で接種し、そして濃度が２０×
１０5 細胞／ml（１週間に約３倍）に達した時に前培養
とする。
胞の誘導 １．１．セルライン ナマルワ細胞ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３２を、２ｇ／ｌ
のＮａＨＣＯ3 、１０ 5 ユニット／ｌのペニシリン、１
００mg／ｌのストレプトマイシン及び１０％の不活性化
ＦＣＳ（５６℃にて３０分間インキュベーション）を補
充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で１ｌのスピンナーフ
ラスコ（ベルコ）中浮遊培養により培養する。細胞を５
×１０5 細胞／mlの濃度で接種し、そして濃度が２０×
１０5 細胞／ml（１週間に約３倍）に達した時に前培養
とする。
【０１１７】１．２．インターフェロン−αによる誘導 ２ｌの培地にナマルワ細胞を５×１０5 細胞／mlの濃度
に接種する。これを３ｌのスピンナーフラスコ中で３７
℃にて３日間培養する。指数増殖の終点において細胞の
濃度が２〜３×１０6 細胞／mlに達する。細胞を８００
×ｇにて３０分間遠心分離し、次に２ｌの培地に再懸濁
し、そして３７℃にて６時間インキュベートする。イン
ターフェロン５1 （ＥＰ−Ａ７６ ４８９に従って調製
されたα／βタイプ）を５０００国際単位／mlの最終濃
度に加え、そして培養物を３７℃にて２０時間さらにイ
ンキュベートする。
に接種する。これを３ｌのスピンナーフラスコ中で３７
℃にて３日間培養する。指数増殖の終点において細胞の
濃度が２〜３×１０6 細胞／mlに達する。細胞を８００
×ｇにて３０分間遠心分離し、次に２ｌの培地に再懸濁
し、そして３７℃にて６時間インキュベートする。イン
ターフェロン５1 （ＥＰ−Ａ７６ ４８９に従って調製
されたα／βタイプ）を５０００国際単位／mlの最終濃
度に加え、そして培養物を３７℃にて２０時間さらにイ
ンキュベートする。
【０１１８】１．３．細胞の収得 細胞を１０００×ｇにて３０分間遠心する。細胞ペレッ
トをＰＢＳで洗浄する。細胞を８００×ｇにて１０分間
遠心し、そしてペレットを低張緩衝液中に懸濁する。細
胞を８００×ｇにて１０分間遠心し、そしてペレットを
ドライアイス上で迅速に凍結し、そして−２０℃に保持
する。
トをＰＢＳで洗浄する。細胞を８００×ｇにて１０分間
遠心し、そしてペレットを低張緩衝液中に懸濁する。細
胞を８００×ｇにて１０分間遠心し、そしてペレットを
ドライアイス上で迅速に凍結し、そして−２０℃に保持
する。
【０１１９】例２．７８kDa 蛋白質の単離及び精製 ２．１．蛋白質の抽出 例１の解凍された細胞を、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．４）及び４ＭＮａＣｌを含有する緩衝液２００
mlにより２０℃にて細胞溶解せしめる。この溶解物を８
０，０００×ｇにて１時間の超遠心分離により透明にす
る。ＩＦＮにより誘導された蛋白質は上清中に存在す
る。この上清に硫酸アンモニウムを徐々に加えて最終濃
度３０％にする。蛋白質を２０℃にて１時間沈澱せしめ
る。ＩＦＮで誘導された蛋白質を含有する沈澱を３００
０×ｇにて１５分間遠心分離し、次に５０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH８）、１５０mMメルカプトエタノール及び
２％ＮＰ−４０を含有する緩衝液３ml中に懸濁する。懸
濁液を同じ緩衝液に対して十分に透析する。ＩＦＮで誘
導された蛋白質のほとんどが不溶性のままである。
（pH７．４）及び４ＭＮａＣｌを含有する緩衝液２００
mlにより２０℃にて細胞溶解せしめる。この溶解物を８
０，０００×ｇにて１時間の超遠心分離により透明にす
る。ＩＦＮにより誘導された蛋白質は上清中に存在す
る。この上清に硫酸アンモニウムを徐々に加えて最終濃
度３０％にする。蛋白質を２０℃にて１時間沈澱せしめ
る。ＩＦＮで誘導された蛋白質を含有する沈澱を３００
０×ｇにて１５分間遠心分離し、次に５０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH８）、１５０mMメルカプトエタノール及び
２％ＮＰ−４０を含有する緩衝液３ml中に懸濁する。懸
濁液を同じ緩衝液に対して十分に透析する。ＩＦＮで誘
導された蛋白質のほとんどが不溶性のままである。
【０１２０】２．２．分取用ゲル電気泳動 不溶性蛋白質を遠心分離し、そしてサンプル緩衝液〔
U.K.Laemmli及び M.Fovre, J.Mol.Biol, 80, 575 (197
3)〕中に溶解する。スラブゲル（厚さ１．５mm、長さ１
１０mm）を Laemmli及び Fovreにより記載された様にし
て調製する。分離ゲルは１２％のアクリルアミド及び
０．３２％のビス−アクリルアミドを含有する。電気泳
動の終りにおいてゲルを氷冷した０．２５mM ＫＣｌに
浸漬することによって可視化する。７０kDa 〜８５kDa
の間の分子量を有する蛋白質を含有するゲル片を切り出
す。このゲルを水により十分に洗浄し、５０mM Ｎ−エ
チルモルホリニウムアセテート（pH８．５）及び０．１
％ＳＤＳを含む溶液により平衡化する。最後にゲルを２
Ｍ尿素、５０mM Ｎ−エチルモルホリニウムアセテート
（pH８．５）、２％ＳＤＳ及び５０mMジチオスレイトー
ルを含有する溶液中で細断し、そしてこの混合物を３７
℃にて１時間インキュベートする。
U.K.Laemmli及び M.Fovre, J.Mol.Biol, 80, 575 (197
3)〕中に溶解する。スラブゲル（厚さ１．５mm、長さ１
１０mm）を Laemmli及び Fovreにより記載された様にし
て調製する。分離ゲルは１２％のアクリルアミド及び
０．３２％のビス−アクリルアミドを含有する。電気泳
動の終りにおいてゲルを氷冷した０．２５mM ＫＣｌに
浸漬することによって可視化する。７０kDa 〜８５kDa
の間の分子量を有する蛋白質を含有するゲル片を切り出
す。このゲルを水により十分に洗浄し、５０mM Ｎ−エ
チルモルホリニウムアセテート（pH８．５）及び０．１
％ＳＤＳを含む溶液により平衡化する。最後にゲルを２
Ｍ尿素、５０mM Ｎ−エチルモルホリニウムアセテート
（pH８．５）、２％ＳＤＳ及び５０mMジチオスレイトー
ルを含有する溶液中で細断し、そしてこの混合物を３７
℃にて１時間インキュベートする。
【０１２１】２．３．ゲルからの蛋白質の電気透析 ＩＳＣＯサンプル濃縮器（モデル１７５０）を用いて、
A.J.Brown及び J.C.Bennett〔Methods in Enzymology
, 91, 450 (1983)〕に記載されている様にしてゲル片
から蛋白質を溶出する。０．０１％ＳＤＳ及び１mMジチ
オスレイトールを含有するＮ−エチルモルホリニウムア
セテート（pH８．５）溶液を緩衝液として濃縮器タンク
の外室（０．１Ｍ）及び内室（０．０５Ｍ）に使用す
る。溶出された蛋白質を５容量のアセトンで沈澱せしめ
る。
A.J.Brown及び J.C.Bennett〔Methods in Enzymology
, 91, 450 (1983)〕に記載されている様にしてゲル片
から蛋白質を溶出する。０．０１％ＳＤＳ及び１mMジチ
オスレイトールを含有するＮ−エチルモルホリニウムア
セテート（pH８．５）溶液を緩衝液として濃縮器タンク
の外室（０．１Ｍ）及び内室（０．０５Ｍ）に使用す
る。溶出された蛋白質を５容量のアセトンで沈澱せしめ
る。
【０１２２】２．４．ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による二次元での最終精製 P.Z.O'Farrell等〔Cell 12, 1133 (1977) 〕により記
載されている様にして、非平衡pHグラジエント電気泳動
（ＮＥＰＨＧＥ）とＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動とを組合わせた二次元系を用いる。アセトン沈澱
（例２．３）の蛋白質を“溶解緩衝液Ａ”〔 P.H.O'Far
rell, J.Biol. Chem. 250 , 4007 (1975) 〕中に溶解
し、そして２％の両性電解質（pH３〜１０）を含有する
非平衡pHグラジエント電気泳動ゲルの酸性末端に適用す
る。５００Ｖにて５時間電気泳動を行う。
による二次元での最終精製 P.Z.O'Farrell等〔Cell 12, 1133 (1977) 〕により記
載されている様にして、非平衡pHグラジエント電気泳動
（ＮＥＰＨＧＥ）とＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動とを組合わせた二次元系を用いる。アセトン沈澱
（例２．３）の蛋白質を“溶解緩衝液Ａ”〔 P.H.O'Far
rell, J.Biol. Chem. 250 , 4007 (1975) 〕中に溶解
し、そして２％の両性電解質（pH３〜１０）を含有する
非平衡pHグラジエント電気泳動ゲルの酸性末端に適用す
る。５００Ｖにて５時間電気泳動を行う。
【０１２３】第二次元におけるスラブゲル電気泳動のた
めの分離ゲルは１２％のアクリルアミド及び０．３２％
のビス−アクリルアミドを含有する。ゲルを氷冷した
０．２５Ｍ ＫＣｌに浸漬することにより蛋白質を可視
化する。ＩＦＮで誘導された蛋白質を含有するゲル片
（他の蛋白質を含有しない単一スポット）を切り出し、
そして例２．３に記載した電気透析のために処理する。
精製された蛋白質を５容量のアセトンにより沈澱せしめ
る。
めの分離ゲルは１２％のアクリルアミド及び０．３２％
のビス−アクリルアミドを含有する。ゲルを氷冷した
０．２５Ｍ ＫＣｌに浸漬することにより蛋白質を可視
化する。ＩＦＮで誘導された蛋白質を含有するゲル片
（他の蛋白質を含有しない単一スポット）を切り出し、
そして例２．３に記載した電気透析のために処理する。
精製された蛋白質を５容量のアセトンにより沈澱せしめ
る。
【０１２４】例３．精製された７８kDa 蛋白質の特徴付
け ３．１．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 精製された蛋白質を通常の方法で１２％ポリアクリルア
ミドゲル上で一次元ゲル電気泳動により分析する。バン
ドをクマッシーブルーＧ−２５０により染色する。並行
して泳動せしめた分子量マーカー（ビオ−ラドより）は
リゾチーム（１４kDa ）、大豆トリプシンインヒビター
（２１．５kDa ）、カルボニックアンヒドラーゼ（３１
kDa ）、オバルブミン（４５kDa ）、ウシ血清アルブミ
ン（６６．２kDa ）、及びホスホリダーゼＢ（９２．５
kDa ）である。精製されたＩＬＭ−誘導蛋白質はこのタ
イプの分析において均一であり、そして分子量約７８kD
aの蛋白質として泳動する。
け ３．１．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 精製された蛋白質を通常の方法で１２％ポリアクリルア
ミドゲル上で一次元ゲル電気泳動により分析する。バン
ドをクマッシーブルーＧ−２５０により染色する。並行
して泳動せしめた分子量マーカー（ビオ−ラドより）は
リゾチーム（１４kDa ）、大豆トリプシンインヒビター
（２１．５kDa ）、カルボニックアンヒドラーゼ（３１
kDa ）、オバルブミン（４５kDa ）、ウシ血清アルブミ
ン（６６．２kDa ）、及びホスホリダーゼＢ（９２．５
kDa ）である。精製されたＩＬＭ−誘導蛋白質はこのタ
イプの分析において均一であり、そして分子量約７８kD
aの蛋白質として泳動する。
【０１２５】P.H.O'Farrell,〔J.Biol.Chem., 250 , 40
07 (1975) 〕により記載された系において決定した場
合、ＩＦＮ−誘導蛋白質の等電点は６．３である。 ３．２．Ｎ−末端アミノ酸配列 J.Y.Chang等〔Biochem.J., 211 , 173 (1983)〕により
記載されている方法でベックマンシーケンサーにおい
て、３２μｇの蛋白質をアミノ酸配列分析にかける。 次のアミノ酸配列： Val-Val-X3-Glu-Val-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala-Pro-Lys-Ala が見出される。第３アミノ酸は同定することができなか
った。
07 (1975) 〕により記載された系において決定した場
合、ＩＦＮ−誘導蛋白質の等電点は６．３である。 ３．２．Ｎ−末端アミノ酸配列 J.Y.Chang等〔Biochem.J., 211 , 173 (1983)〕により
記載されている方法でベックマンシーケンサーにおい
て、３２μｇの蛋白質をアミノ酸配列分析にかける。 次のアミノ酸配列： Val-Val-X3-Glu-Val-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala-Pro-Lys-Ala が見出される。第３アミノ酸は同定することができなか
った。
【０１２６】３．３．全アミノ酸組成 J.Y.Chang, R.Knecht及び D.G.Braun〔Methods in Enzy
mology , Vol 91，41-48 (1983)〕の方法に従って全ア
ミノ酸組成を決定する。要約すれば、蛋白質を６Ｍ Ｈ
Ｃｌにより加水分解し、炭酸水素ナトリウム緩衝液中
４′−ジメチルアミノ−アゾベンゼン−４−スルホニル
クロリドにより誘導体にし、そしてＺｏｒｂａｘ−ＯＤ
Ｓ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに注
入する。各アミノ酸の量を標準サンプルと比較して決定
する。結果を第１表にまとめる。
mology , Vol 91，41-48 (1983)〕の方法に従って全ア
ミノ酸組成を決定する。要約すれば、蛋白質を６Ｍ Ｈ
Ｃｌにより加水分解し、炭酸水素ナトリウム緩衝液中
４′−ジメチルアミノ−アゾベンゼン−４−スルホニル
クロリドにより誘導体にし、そしてＺｏｒｂａｘ−ＯＤ
Ｓ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに注
入する。各アミノ酸の量を標準サンプルと比較して決定
する。結果を第１表にまとめる。
【０１２７】例４．インターフェロンで誘導された細胞
からのｍＲＮＡの単離 ４．１．インターフェロン−αによるヒト胎児包皮細胞
の誘導 ヒト胎児包皮二倍体細胞（Ｆｌｏｗ No.７０００）を、
直径１４cmのプラスチック皿中、２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ
3 、１０5 ユニット／ｌのペニシリン、１００mg／ｌの
ストレプトマイシン及び１０％の不活性化ＦＣＳ（５６
℃にて３０分間不活性化）を補充されたエール（Ｅａｒ
ｌ）最少必須培地中で培養する。コンフルエント細胞モ
ノレーヤーをトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ギブコ）中
１：３のスプリット比で前培養する。コンフルエント細
胞モノレーヤーを、１０００国際単位／mlの最終濃度で
組換インターフェロン５、（ＥＰ−Ａ７６ ４８９に従
って調製されたα／βタイプ）を含有する新鮮な培地中
で３７℃にて４．５時間インキュベートする。
からのｍＲＮＡの単離 ４．１．インターフェロン−αによるヒト胎児包皮細胞
の誘導 ヒト胎児包皮二倍体細胞（Ｆｌｏｗ No.７０００）を、
直径１４cmのプラスチック皿中、２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ
3 、１０5 ユニット／ｌのペニシリン、１００mg／ｌの
ストレプトマイシン及び１０％の不活性化ＦＣＳ（５６
℃にて３０分間不活性化）を補充されたエール（Ｅａｒ
ｌ）最少必須培地中で培養する。コンフルエント細胞モ
ノレーヤーをトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ギブコ）中
１：３のスプリット比で前培養する。コンフルエント細
胞モノレーヤーを、１０００国際単位／mlの最終濃度で
組換インターフェロン５、（ＥＰ−Ａ７６ ４８９に従
って調製されたα／βタイプ）を含有する新鮮な培地中
で３７℃にて４．５時間インキュベートする。
【０１２８】４．２．細胞質ＲＮＡの精製 例４．１．の細胞モノレーヤーをＰＢＳにより４℃にて
洗浄し、そして低張緩衝液中で４℃にて２分間インキュ
ベートする。１％のデオキシコレート及び１％のＮＰ−
４０を含有する低張緩衝液により４℃にて５分間細胞溶
解することにより細胞質抽出物を得る。この抽出物を２
５，０００×ｇにて５分間遠心する。この上清（４５m
l）に１６mgのプロテイナーゼＫ、７２０mgのＮａＣ
ｌ、１．８mlの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）及
び６．８mlの１０％ＳＤＳを加える。この混合物を２０
℃にて４時間保持する。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH９）及び０．１％のオキシキノリンの溶液により飽
和されたフェノールによりＲＮＡを３回抽出する。水相
にＮａＣｌを添加し（最終濃度０．１Ｍ）、そして−２
０℃にて２容量のエタノールによりＲＮＡを沈澱せしめ
る。
洗浄し、そして低張緩衝液中で４℃にて２分間インキュ
ベートする。１％のデオキシコレート及び１％のＮＰ−
４０を含有する低張緩衝液により４℃にて５分間細胞溶
解することにより細胞質抽出物を得る。この抽出物を２
５，０００×ｇにて５分間遠心する。この上清（４５m
l）に１６mgのプロテイナーゼＫ、７２０mgのＮａＣ
ｌ、１．８mlの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）及
び６．８mlの１０％ＳＤＳを加える。この混合物を２０
℃にて４時間保持する。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH９）及び０．１％のオキシキノリンの溶液により飽
和されたフェノールによりＲＮＡを３回抽出する。水相
にＮａＣｌを添加し（最終濃度０．１Ｍ）、そして−２
０℃にて２容量のエタノールによりＲＮＡを沈澱せしめ
る。
【０１２９】４．３．全ＲＮＡの追加の精製 ５０％のホルムアミド中例４．２の２mgのＲＮＡを、５
mM ＥＤＴＡ、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５）、０．２％ＳＤＳ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ及び５０
％ホルムアミド中直線的５−２０％シュークロースグラ
ジエント上に重層する。グラジエントをベックマンＳＷ
４１ Ｔｉローター中で、２０℃にて１６時間４０，０
００rpm で遠心する。１mlの画分を集め、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌとし、そして２容積のエタノールによりＲＮＡを
沈澱せしめる。各画分のＲＮＡのアリコートを網状赤血
球無細胞系（アメルシャム・インターナショナル No.Ｎ
９０）中で製造者の指示に従って翻訳する。
mM ＥＤＴＡ、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５）、０．２％ＳＤＳ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ及び５０
％ホルムアミド中直線的５−２０％シュークロースグラ
ジエント上に重層する。グラジエントをベックマンＳＷ
４１ Ｔｉローター中で、２０℃にて１６時間４０，０
００rpm で遠心する。１mlの画分を集め、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌとし、そして２容積のエタノールによりＲＮＡを
沈澱せしめる。各画分のＲＮＡのアリコートを網状赤血
球無細胞系（アメルシャム・インターナショナル No.Ｎ
９０）中で製造者の指示に従って翻訳する。
【０１３０】インビトロで合成されそして35Ｓ−メチオ
ニンでラベルされた蛋白質を二次元のポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、そしてフルオログラフィ
ーにより検出する。７８kDa の見かけ分子量を有するＩ
ＦＮ−誘導蛋白質のｍＲＮＡにより指令される合成が沈
降値１８Ｓ〜２８Ｓの画分８及び９に再現性よく見られ
る。画分８及び９のポリ（Ａ）ｍＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロース上でのクロマトグラフィーにより精製す
る。
ニンでラベルされた蛋白質を二次元のポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、そしてフルオログラフィ
ーにより検出する。７８kDa の見かけ分子量を有するＩ
ＦＮ−誘導蛋白質のｍＲＮＡにより指令される合成が沈
降値１８Ｓ〜２８Ｓの画分８及び９に再現性よく見られ
る。画分８及び９のポリ（Ａ）ｍＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロース上でのクロマトグラフィーにより精製す
る。
【０１３１】例５．ｃＤＮＡライブラリーの調製及びス
クリーニング 例４．３．の精製されたｍＲＮＡから、U.Gubler及び
B.J.Hoffman, Gene, 25, 263-269 (1983)の方法に幾分
変更を加えて、ｃＤＮＡライブラリーを調製した。第一
鎖ｃＤＮＡの合成のため、画分８及び９の精製されたポ
リ（Ａ）ｍＲＮＡ（例４．３．１５０μｇ／ml）を、５
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、１０mM ＭｇＣ
ｌ2 、１０mMジチオスレイトール、１．２５mMの各ｄＧ
ＴＰ，ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ、０．５mM ｄＣＴＰ、２
０μCiのα−32Ｐ−ｄＣＴＰ（約３０００Ci／mmol）並
びに１００μｇ／mlのオリゴ（ｄＴ12-18 ）を含む２０
〜４０μｌの容量中で、トリ骨髄芽球症ウイルスからの
“Ｓｕｐｅｒ”逆転写酵素（アングリアン−バイオテク
ノロジーステヘリン）３０００ユニット／mlと共に４３
℃にて３０分間インキュベートする。
クリーニング 例４．３．の精製されたｍＲＮＡから、U.Gubler及び
B.J.Hoffman, Gene, 25, 263-269 (1983)の方法に幾分
変更を加えて、ｃＤＮＡライブラリーを調製した。第一
鎖ｃＤＮＡの合成のため、画分８及び９の精製されたポ
リ（Ａ）ｍＲＮＡ（例４．３．１５０μｇ／ml）を、５
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、１０mM ＭｇＣ
ｌ2 、１０mMジチオスレイトール、１．２５mMの各ｄＧ
ＴＰ，ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ、０．５mM ｄＣＴＰ、２
０μCiのα−32Ｐ−ｄＣＴＰ（約３０００Ci／mmol）並
びに１００μｇ／mlのオリゴ（ｄＴ12-18 ）を含む２０
〜４０μｌの容量中で、トリ骨髄芽球症ウイルスからの
“Ｓｕｐｅｒ”逆転写酵素（アングリアン−バイオテク
ノロジーステヘリン）３０００ユニット／mlと共に４３
℃にて３０分間インキュベートする。
【０１３２】ＥＤＴＡの添加により反応を停止し、生成
物をフェノールで抽出しそしてエタノールで沈澱せしめ
る。第二鎖の合成のため、単鎖ｃＤＮＡ（５００ng）
を、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、５mM Ｍ
ｇＣｌ2 、１０mM（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、１００mM ＫＣ
ｌ、０．１５mM β−ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド、５０μｇ／ml ＢＳＡ及び４０mMの各ｄＮＴＰ
を含有する１００μｌの容量中で８．５ユニット／mlの
Ｅ．コリＲＮアーゼ、２３０ユニット／mlのＤＮＡポリ
メラーゼＩ及び１０ユニット／mlのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼと共に、１４℃にて一夜インキュベートする。ｄｓ
ｃＤＮＡを上記の様にして単離する。
物をフェノールで抽出しそしてエタノールで沈澱せしめ
る。第二鎖の合成のため、単鎖ｃＤＮＡ（５００ng）
を、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、５mM Ｍ
ｇＣｌ2 、１０mM（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、１００mM ＫＣ
ｌ、０．１５mM β−ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド、５０μｇ／ml ＢＳＡ及び４０mMの各ｄＮＴＰ
を含有する１００μｌの容量中で８．５ユニット／mlの
Ｅ．コリＲＮアーゼ、２３０ユニット／mlのＤＮＡポリ
メラーゼＩ及び１０ユニット／mlのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼと共に、１４℃にて一夜インキュベートする。ｄｓ
ｃＤＮＡを上記の様にして単離する。
【０１３３】ｄｓ ｃＤＮＡ（４０μｌ中１００ng）を
ｄＣＴＰ（０．９mM）により、２００mMカコジル酸カリ
ウム（pH６．９）、１mM ＣａＣｌ2 及び５mg／ml Ｂ
ＳＡ内で３０ユニットのターミナルトランスフェラーゼ
を用いて３７℃にて６０分間テイル形成し、次に熱失活
せしめる。このｄｃ−テイルｃＤＮＡをｄＧ−テイル化
ＰｓｔＩ切断ｐＢＲ３２２（ＢＲＬ）に、５０μｌのＴ
Ｅ緩衝液／０．１５ＭＮａＣｌ中で０．５μｇ／mlの合
計ＤＮＡ濃度において５８℃にて９０分間アニールせし
める。このベクターによりＣａＣｌ2 処理されたＥ．コ
リＭＣ１０６１を形質転換する。細胞を、 D.Hanahan及
びM.Meselson〔Methods Enzymol., 100 , 333-342 (198
3)〕により記載された様にして、寒天プレート上におか
れたニトロセルロースフィルター上に高濃度でプレート
し、そして取扱う。
ｄＣＴＰ（０．９mM）により、２００mMカコジル酸カリ
ウム（pH６．９）、１mM ＣａＣｌ2 及び５mg／ml Ｂ
ＳＡ内で３０ユニットのターミナルトランスフェラーゼ
を用いて３７℃にて６０分間テイル形成し、次に熱失活
せしめる。このｄｃ−テイルｃＤＮＡをｄＧ−テイル化
ＰｓｔＩ切断ｐＢＲ３２２（ＢＲＬ）に、５０μｌのＴ
Ｅ緩衝液／０．１５ＭＮａＣｌ中で０．５μｇ／mlの合
計ＤＮＡ濃度において５８℃にて９０分間アニールせし
める。このベクターによりＣａＣｌ2 処理されたＥ．コ
リＭＣ１０６１を形質転換する。細胞を、 D.Hanahan及
びM.Meselson〔Methods Enzymol., 100 , 333-342 (198
3)〕により記載された様にして、寒天プレート上におか
れたニトロセルロースフィルター上に高濃度でプレート
し、そして取扱う。
【０１３４】例３．2 ．の既知の部分的アミノ酸配列、
すなわち Glu-Val-Asp-Ile-Ala-Lys-Alaに基いてオリゴ
デオキシヌクレオチドの混合物を調製する。次の組成：
５′−GCYTTIGCQATRTCIACYTC−３′（式中、Ａ，Ｔ，
Ｇ，Ｃ及びＩはそれぞれアデノシン、チミジン、グアノ
シン、シトシン、及びイノシンを表わし、Ｙ及びＲはそ
れぞれピリミジン（Ｔ，Ｃ）及びプリン（Ａ，Ｇ）を表
わし、そしてＱはＡ，Ｇ及びＴを表わす〕を Ike等、Nu
cleic Acid Research , 11, 477 (1983)の方法に従って
合成する。
すなわち Glu-Val-Asp-Ile-Ala-Lys-Alaに基いてオリゴ
デオキシヌクレオチドの混合物を調製する。次の組成：
５′−GCYTTIGCQATRTCIACYTC−３′（式中、Ａ，Ｔ，
Ｇ，Ｃ及びＩはそれぞれアデノシン、チミジン、グアノ
シン、シトシン、及びイノシンを表わし、Ｙ及びＲはそ
れぞれピリミジン（Ｔ，Ｃ）及びプリン（Ａ，Ｇ）を表
わし、そしてＱはＡ，Ｇ及びＴを表わす〕を Ike等、Nu
cleic Acid Research , 11, 477 (1983)の方法に従って
合成する。
【０１３５】これらのオリゴデオキシヌクレオチドの
５′−末端をγ−32Ｐ−ｄＡＴＰ（５０００Ci／mmol）
及びポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア）を用い
て２〜５×１０8 cpm ／μｇに、標準的方法〔T.Maniat
is, EF.Fritsch及びJ.Sambrook, "Molecular cloning,
a laboratory manual", コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー、１９８２〕に従って放射性にする。
５′−末端をγ−32Ｐ−ｄＡＴＰ（５０００Ci／mmol）
及びポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア）を用い
て２〜５×１０8 cpm ／μｇに、標準的方法〔T.Maniat
is, EF.Fritsch及びJ.Sambrook, "Molecular cloning,
a laboratory manual", コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー、１９８２〕に従って放射性にする。
【０１３６】ｃＤＮＡライブラリーの細菌クローンの２
枚のレプリカを Hanahan及びMeselson（前記に引用）の
方法に従って６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、２５０
μｇ／mlのｔＲＮＡ、５０ユニット／mlのヘパリン及び
０．１％のＳＤＳを含有する媒体中で４７℃にて上記の
ヌクレオチド混合物とハイブリダイズせしめる。ハイブ
リダイゼーションの後、フィルターを６×ＳＳＣ及び
０．５％のＳＤＳを含有する溶液中で２０℃にて２０分
間ずつ４回及び４７℃にて５分間洗浄する。約８５０塩
基対の挿入部を有するＤＮＡプラスミドを含有するクロ
ーンＢ１，１がオリゴヌクレオチドとハイブリダイズす
ることが見出され、これを１５μｇ／mlのテトラサイク
リンを補充されたＬＢ培地中で３７℃にて増殖せしめ
る。
枚のレプリカを Hanahan及びMeselson（前記に引用）の
方法に従って６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、２５０
μｇ／mlのｔＲＮＡ、５０ユニット／mlのヘパリン及び
０．１％のＳＤＳを含有する媒体中で４７℃にて上記の
ヌクレオチド混合物とハイブリダイズせしめる。ハイブ
リダイゼーションの後、フィルターを６×ＳＳＣ及び
０．５％のＳＤＳを含有する溶液中で２０℃にて２０分
間ずつ４回及び４７℃にて５分間洗浄する。約８５０塩
基対の挿入部を有するＤＮＡプラスミドを含有するクロ
ーンＢ１，１がオリゴヌクレオチドとハイブリダイズす
ることが見出され、これを１５μｇ／mlのテトラサイク
リンを補充されたＬＢ培地中で３７℃にて増殖せしめ
る。
【０１３７】例６．プラスミドＤＮＡの単離 １５μｇ／mlのテトラサイクリンが補充されたＬＢ培地
８００mlに１mlのクローンＢ１，１（例５）を接種し、
そして３７℃にて光学濃度ＯＤ550 ＝０．７まで（約５
時間）培養する。エタノール中に溶解した２００μｇ／
mlのクロラムフェニコールを加え、そして培養を３７℃
にて一夜続ける。この混合物を０℃にて２０分間４００
０rpm で遠心分離し、細菌ペレットを３６mlのＴＥ緩衝
液中に懸濁し、そしてＳＳ３４チューブに移す。懸濁液
を０℃にて５分間５０００rpm で遠心する。ペレットを
７．２mlの２５％シュークロース／５０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．５）中に再懸濁し、０．７５mlの新しく
調製したリゾチーム（２５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH
７．５中１０mg／ml）で処理し、そして氷上で５分間イ
ンキュベートする。
８００mlに１mlのクローンＢ１，１（例５）を接種し、
そして３７℃にて光学濃度ＯＤ550 ＝０．７まで（約５
時間）培養する。エタノール中に溶解した２００μｇ／
mlのクロラムフェニコールを加え、そして培養を３７℃
にて一夜続ける。この混合物を０℃にて２０分間４００
０rpm で遠心分離し、細菌ペレットを３６mlのＴＥ緩衝
液中に懸濁し、そしてＳＳ３４チューブに移す。懸濁液
を０℃にて５分間５０００rpm で遠心する。ペレットを
７．２mlの２５％シュークロース／５０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．５）中に再懸濁し、０．７５mlの新しく
調製したリゾチーム（２５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH
７．５中１０mg／ml）で処理し、そして氷上で５分間イ
ンキュベートする。
【０１３８】３．０mlの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（pH８．
０）、及び５分間後１２mlのトリトン溶液〔０．１％の
トリトンＸ−１００（シグマ）、６０mM ＥＤＴＡ、５
０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）〕を加え、そして０
℃にて１時間インキュベーションを続ける。混合物をＳ
Ｓ３４遠心器中で１８，０００rpm にて５０分間遠心分
離する。上清を注意深くメスシリンダーに注入し、そし
てＴＥ緩衝液により容量を３０mlに調整する。３０ｇの
ＣｓＣｌ及び２．５８mlの臭化エチジウム（１０mg／m
l）を加え、そして混合物を２０℃にて１６時間４８，
０００rpm でＶＴｉ５０遠心器中で遠心分離する。スー
パーコイルＤＮＡを含む低バンドを集め、水性ＣｓＣｌ
により飽和されたイソプロパノールにより５回抽出し、
そしてＴＥ緩衝液で稀釈して濁りを無くする。ＤＮＡを
エタノールにより−２０℃にて沈澱せしめ、そして上記
のＣｓＣｌグラジエント中で再度精製する。
０）、及び５分間後１２mlのトリトン溶液〔０．１％の
トリトンＸ−１００（シグマ）、６０mM ＥＤＴＡ、５
０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）〕を加え、そして０
℃にて１時間インキュベーションを続ける。混合物をＳ
Ｓ３４遠心器中で１８，０００rpm にて５０分間遠心分
離する。上清を注意深くメスシリンダーに注入し、そし
てＴＥ緩衝液により容量を３０mlに調整する。３０ｇの
ＣｓＣｌ及び２．５８mlの臭化エチジウム（１０mg／m
l）を加え、そして混合物を２０℃にて１６時間４８，
０００rpm でＶＴｉ５０遠心器中で遠心分離する。スー
パーコイルＤＮＡを含む低バンドを集め、水性ＣｓＣｌ
により飽和されたイソプロパノールにより５回抽出し、
そしてＴＥ緩衝液で稀釈して濁りを無くする。ＤＮＡを
エタノールにより−２０℃にて沈澱せしめ、そして上記
のＣｓＣｌグラジエント中で再度精製する。
【０１３９】例７．選択されたクローンが７８kDa イン
ターフェロン誘導蛋白質をコードすることを証明する試
験 ７．１．ノーサンブロット 例４．１．及び４．２．に従って単離されたＩＦＮ−誘
導ヒト胎児包皮細胞由来全ＲＮＡ、及びインターフェロ
ンで誘導されなかった対応する細胞由来の全ＲＮＡを５
０ｖ／ｖ％のジメチルスルホキシド及び１０mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH７．０）中１Ｍグリオキサールによ
り変性し、１．１％アガロースゲル上で電気泳動し、そ
してP.S.Thomas〔Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 77, 5201
-5205 (1980)〕により記載されているのと実質的に同様
にして３Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム
を用いてニトロセルロースに移す。
ターフェロン誘導蛋白質をコードすることを証明する試
験 ７．１．ノーサンブロット 例４．１．及び４．２．に従って単離されたＩＦＮ−誘
導ヒト胎児包皮細胞由来全ＲＮＡ、及びインターフェロ
ンで誘導されなかった対応する細胞由来の全ＲＮＡを５
０ｖ／ｖ％のジメチルスルホキシド及び１０mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH７．０）中１Ｍグリオキサールによ
り変性し、１．１％アガロースゲル上で電気泳動し、そ
してP.S.Thomas〔Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 77, 5201
-5205 (1980)〕により記載されているのと実質的に同様
にして３Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム
を用いてニトロセルロースに移す。
【０１４０】ニトロセルロースフィルターを８０℃にて
２時間真空下で加熱し、５×ＳＳＣ／５０％ホルムアミ
ドを含有する緩衝液中で４２℃にて３時間前ハイブリダ
イズせしめ、次にデキストランサルフェート５００、及
び上記の様にしてγ−32Ｐ−ｄＡＴＰとポリヌクレオチ
ドキナーゼでラベルされたクローンＢ１，１（例６）か
らの０．５〜１．０×１０6 cpm ／mlのＤＮＡを含有す
る同じ緩衝液中で４２℃にて２０分間ハイブリダイズせ
しめる。フィルターを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で
２０℃にて５分間ずつ４回、及び０．１×ＳＳＣ／０．
１％ＳＤＳ中で５０℃にて２０分間ずつ２回洗浄する。
乾燥したフィルターをＣａｗｏ強化スクリーンを用いて
コダック×ＡＲフィルムに−７０℃にて６日間暴露す
る。クローンＢ１，１のＤＮＡは７８kDa のインターフ
ェロン誘導蛋白質をコードすると予想されるｍＲＮＡに
対応するサイズの約２３ＳのＲＮＡにハイブリダイズす
る。このｍＲＮＡはインターフェロンで誘導された細胞
中にのみ検出される。
２時間真空下で加熱し、５×ＳＳＣ／５０％ホルムアミ
ドを含有する緩衝液中で４２℃にて３時間前ハイブリダ
イズせしめ、次にデキストランサルフェート５００、及
び上記の様にしてγ−32Ｐ−ｄＡＴＰとポリヌクレオチ
ドキナーゼでラベルされたクローンＢ１，１（例６）か
らの０．５〜１．０×１０6 cpm ／mlのＤＮＡを含有す
る同じ緩衝液中で４２℃にて２０分間ハイブリダイズせ
しめる。フィルターを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で
２０℃にて５分間ずつ４回、及び０．１×ＳＳＣ／０．
１％ＳＤＳ中で５０℃にて２０分間ずつ２回洗浄する。
乾燥したフィルターをＣａｗｏ強化スクリーンを用いて
コダック×ＡＲフィルムに−７０℃にて６日間暴露す
る。クローンＢ１，１のＤＮＡは７８kDa のインターフ
ェロン誘導蛋白質をコードすると予想されるｍＲＮＡに
対応するサイズの約２３ＳのＲＮＡにハイブリダイズす
る。このｍＲＮＡはインターフェロンで誘導された細胞
中にのみ検出される。
【０１４１】７．２．ハイブリド選択された翻訳 ２０μｌの水中１０μｇのクローンＢ１，１（例６）の
プラスミドＤＮＡを１００℃にて１０分間加熱し氷上で
冷却し、２０μｌの１Ｍ ＮａＯＨで処理しそして室温
にて２０分間インキュベートする。ＤＮＡサンプルを１
Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸三ナトリウム、０．５
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び１Ｍ ＨＣｌの溶液２０μｌ
により中和し、そしてニトロセルロースフィルター（３
×６mm、ミリポアＨＡＷＰ）上にスポットする。このフ
ィルターを２０℃にて乾燥し、そして真空オーブン中で
８０℃にて２時間加熱する。フィルターをシリコン処理
された１．５mlのエッペンドルフ管に入れ、１mlの水で
処理し、沸騰水浴中で１分間加熱し、そして氷中で冷却
する。
プラスミドＤＮＡを１００℃にて１０分間加熱し氷上で
冷却し、２０μｌの１Ｍ ＮａＯＨで処理しそして室温
にて２０分間インキュベートする。ＤＮＡサンプルを１
Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸三ナトリウム、０．５
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び１Ｍ ＨＣｌの溶液２０μｌ
により中和し、そしてニトロセルロースフィルター（３
×６mm、ミリポアＨＡＷＰ）上にスポットする。このフ
ィルターを２０℃にて乾燥し、そして真空オーブン中で
８０℃にて２時間加熱する。フィルターをシリコン処理
された１．５mlのエッペンドルフ管に入れ、１mlの水で
処理し、沸騰水浴中で１分間加熱し、そして氷中で冷却
する。
【０１４２】水を除去し、そして０．９Ｍ ＮａＣｌ、
０．２％ＳＤＳ、１mM ＥＤＴＡ及び２０mM ＰＩＰＥ
Ｓ（１，４−ピペラジン−ジエタンスルホン酸、pH６．
４）中ＩＦＮ−誘導細胞（例４．２）からの１００μｇ
の全ｍＲＮＡを含有する溶液５０μｌを加える。フィル
ターを３７℃にて６時間一定撹拌しながらインキュベー
トし、次に５０％ホルムアミド、２０mM ＮａＣｌ、８
mMクエン酸ナトリウム、１mM ＥＤＴＡ及び０．５％Ｓ
ＤＳを含む洗浄緩衝液１ml中で５回洗浄する。
０．２％ＳＤＳ、１mM ＥＤＴＡ及び２０mM ＰＩＰＥ
Ｓ（１，４−ピペラジン−ジエタンスルホン酸、pH６．
４）中ＩＦＮ−誘導細胞（例４．２）からの１００μｇ
の全ｍＲＮＡを含有する溶液５０μｌを加える。フィル
ターを３７℃にて６時間一定撹拌しながらインキュベー
トし、次に５０％ホルムアミド、２０mM ＮａＣｌ、８
mMクエン酸ナトリウム、１mM ＥＤＴＡ及び０．５％Ｓ
ＤＳを含む洗浄緩衝液１ml中で５回洗浄する。
【０１４３】ハイブリダイズしたｍＲＮＡを、１０μｇ
のｔＲＮＡを含有する１mM ＥＤＴＡ溶液１００μｌに
より沸騰水浴中で１分間溶出する。この溶液をドライア
イス中で凍結し、氷上で解凍し、そしてフィルターを取
り出す。７μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、そして
混合物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ
ール（１：１：０．０４ｖ／ｖ）で抽出する。水相に２
５０μｌのエタノールを添加してｍＲＮＡを沈澱せしめ
る。
のｔＲＮＡを含有する１mM ＥＤＴＡ溶液１００μｌに
より沸騰水浴中で１分間溶出する。この溶液をドライア
イス中で凍結し、氷上で解凍し、そしてフィルターを取
り出す。７μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、そして
混合物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ
ール（１：１：０．０４ｖ／ｖ）で抽出する。水相に２
５０μｌのエタノールを添加してｍＲＮＡを沈澱せしめ
る。
【０１４４】溶出されたｍＲＮＡを網状赤血球溶解物
（アメルシャムインターナショアル No.Ｎ９０）中で製
造者の指示に従って翻訳する。インビトロ合成された蛋
白質のアリコートをポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より分離し、そして放射性蛋白質（翻訳系中の35Ｓ−メ
チオニンから）をフルオログラフィーにより検出する。
蛋白質の他のアリコートを例１３の７８kDa 蛋白質に対
して特異的なモノクローナル抗体により免疫沈澱せしめ
る。次に免疫沈澱物をポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分離し、そしてフルオログラフィーにより検出す
る。クローンＢ１，１からのＤＮＡとのハイブリダイゼ
ーションにより選択されたｍＲＮＡは、ＩＦＮ−誘導ナ
マルワ細胞から単離された７８kDa 蛋白質（例２）と同
じ見かけ分子量及び抗原性を有する蛋白質の合成を指令
する。
（アメルシャムインターナショアル No.Ｎ９０）中で製
造者の指示に従って翻訳する。インビトロ合成された蛋
白質のアリコートをポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より分離し、そして放射性蛋白質（翻訳系中の35Ｓ−メ
チオニンから）をフルオログラフィーにより検出する。
蛋白質の他のアリコートを例１３の７８kDa 蛋白質に対
して特異的なモノクローナル抗体により免疫沈澱せしめ
る。次に免疫沈澱物をポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分離し、そしてフルオログラフィーにより検出す
る。クローンＢ１，１からのＤＮＡとのハイブリダイゼ
ーションにより選択されたｍＲＮＡは、ＩＦＮ−誘導ナ
マルワ細胞から単離された７８kDa 蛋白質（例２）と同
じ見かけ分子量及び抗原性を有する蛋白質の合成を指令
する。
【０１４５】例８．Ｍ１３ベクターへのプラスミドＤＮ
Ａのサブクローニング 例６のクローンＢ１，１のプラスミドＤＮＡを制限酵素
ＰｓｔＩ（ベーリンガーマンハイム）により製造者の指
示に従って断片化する。挿入部を単離しそしてエタノー
ルで沈澱せしめる。ブルースクリプトＭ１３ベクター
（ストラタジーン）をＰｓｔＩで切断する。２０μｇの
ベクターＤＮＡを、８ユニットのウシアルカリ性腸ホス
ファターゼ、１００mMグリシン（pH１０．５）、１mM
ＭｇＣｌ2 及び１mM ＺｎＣｌ2 を含有する溶液５０μ
ｌ中で脱リン酸化する。ベクターＤＮＡを単離しそして
フェノール／クロロホルム抽出により精製する。
Ａのサブクローニング 例６のクローンＢ１，１のプラスミドＤＮＡを制限酵素
ＰｓｔＩ（ベーリンガーマンハイム）により製造者の指
示に従って断片化する。挿入部を単離しそしてエタノー
ルで沈澱せしめる。ブルースクリプトＭ１３ベクター
（ストラタジーン）をＰｓｔＩで切断する。２０μｇの
ベクターＤＮＡを、８ユニットのウシアルカリ性腸ホス
ファターゼ、１００mMグリシン（pH１０．５）、１mM
ＭｇＣｌ2 及び１mM ＺｎＣｌ2 を含有する溶液５０μ
ｌ中で脱リン酸化する。ベクターＤＮＡを単離しそして
フェノール／クロロホルム抽出により精製する。
【０１４６】クローンＢ１，１の０．５μｇのｃＤＮＡ
及び１．５μｇのＭ１３ベクターＤＮＡを、５ユニット
のＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び０．５mM ＡＴＰを含有す
る連結緩衝液２０μｌ中で２３℃にて５時間インキュベ
ートすることにより連結する。ＣａＣｌ2 で処理された
Ｅ．コリｒｅｃA-ＪＭ１０９をこのＤＮＡ溶液により形
質転換する。１００μｇ／mlのアンピシリン、４０μｇ
／mlのＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）及び５mMＩＰＴＧ
（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含
有するＬＢプレート上に細胞をプレートする。コロニー
を３７℃にて一夜増殖せしめ、そして未変化のＭ１３ベ
クターを含有する青色細胞プラークからの白色により形
質転換体を選択する。
及び１．５μｇのＭ１３ベクターＤＮＡを、５ユニット
のＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び０．５mM ＡＴＰを含有す
る連結緩衝液２０μｌ中で２３℃にて５時間インキュベ
ートすることにより連結する。ＣａＣｌ2 で処理された
Ｅ．コリｒｅｃA-ＪＭ１０９をこのＤＮＡ溶液により形
質転換する。１００μｇ／mlのアンピシリン、４０μｇ
／mlのＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）及び５mMＩＰＴＧ
（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含
有するＬＢプレート上に細胞をプレートする。コロニー
を３７℃にて一夜増殖せしめ、そして未変化のＭ１３ベ
クターを含有する青色細胞プラークからの白色により形
質転換体を選択する。
【０１４７】選択された個々のコロニーを５０μｇ／ml
のアンピシリンを含有するＬＢ培地１ml中で３７℃にて
一夜増殖せしめる。遠心分離の後、上清を廃棄し、そし
てペレットを５０mMのグルコース、２５mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH８．０）及び１０mM ＥＤＴＡを含有する溶
液１００μｌ中に懸濁する。２２℃にて５分間の後、２
００μｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ／１％ＳＤＳを加え、溶
合物を０℃にて５分間インキュベートし、１５０μｌの
前冷却された３Ｍ酢酸ナトリウム（pH４．８）で処理
し、そして０℃にてさらに５分間保持する。
のアンピシリンを含有するＬＢ培地１ml中で３７℃にて
一夜増殖せしめる。遠心分離の後、上清を廃棄し、そし
てペレットを５０mMのグルコース、２５mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH８．０）及び１０mM ＥＤＴＡを含有する溶
液１００μｌ中に懸濁する。２２℃にて５分間の後、２
００μｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ／１％ＳＤＳを加え、溶
合物を０℃にて５分間インキュベートし、１５０μｌの
前冷却された３Ｍ酢酸ナトリウム（pH４．８）で処理
し、そして０℃にてさらに５分間保持する。
【０１４８】混合物をエッペンドルフ管中で１分間遠心
する。１mlのエタノールを上清に加え、そして２０℃に
て２分間の後、混合物を再び１分間遠心する。ペレット
を８０％のエタノールで洗浄し、そして１００μｌの３
００mM酢酸ナトリウム中に再懸濁する。３００μｌのエ
タノールを加え、そして混合物を−８０℃にて３０分間
保持し、そして遠心する。ペレットを８０％エタノール
で洗浄し、乾燥し、そして１５μｌのＴＥ緩衝液中に懸
濁する。２μｌのこのＤＮＡ懸濁液をＰｓｔＩにより消
化する。２μｌの他のサンプルをＳａｃＩ及びＨｉｎｄ
Ｉにより二重消化する。得られる制限断片を７％ポリア
クリルアミドゲル上での電気泳動により分析することに
よりベクター中のｃＤＮＡ挿入部の方向を決定する。
する。１mlのエタノールを上清に加え、そして２０℃に
て２分間の後、混合物を再び１分間遠心する。ペレット
を８０％のエタノールで洗浄し、そして１００μｌの３
００mM酢酸ナトリウム中に再懸濁する。３００μｌのエ
タノールを加え、そして混合物を−８０℃にて３０分間
保持し、そして遠心する。ペレットを８０％エタノール
で洗浄し、乾燥し、そして１５μｌのＴＥ緩衝液中に懸
濁する。２μｌのこのＤＮＡ懸濁液をＰｓｔＩにより消
化する。２μｌの他のサンプルをＳａｃＩ及びＨｉｎｄ
Ｉにより二重消化する。得られる制限断片を７％ポリア
クリルアミドゲル上での電気泳動により分析することに
よりベクター中のｃＤＮＡ挿入部の方向を決定する。
【０１４９】例９．単方向除去後のプラスミドＤＮＡの
サブクローニング いずれかの方向にｃＤＮＡ挿入部を含有する例８のクロ
ーンからのプラスミドを例６に記載した方法を用いて単
離する。但し、テトラサイクリンではなく１００μｇ／
mlのアンピシリンを含有するＬＢ培地中でクローンを培
養し、そしてクロラムフェニコールは添加しない。プラ
スミドＤＮＡをＫｐｍＩ及びＨｉｎｄIII により完全消
化し、次にフェノールで抽出する。この二重消化された
１８μｇのＤＮＡを、９００ユニットのエンドヌクレア
ーゼＥｘｏIII を含有する５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH８）、５mM ＭｇＣｌ2 、１０μｇ／ml ｔＲＮ
Ａ、２０mM ２−メルカプトエタノールの溶液中で２３
℃にてインキュベートする。反応混合物から５０μｌの
アリコートを１分間ごとに６分間まで取り出し、８０μ
ｌの５倍濃度のマングビーンヌクレアーゼ緩衝液及び２
７０μｌの水を収容するチューブに加え、そしてドライ
アイス上で凍結する。
サブクローニング いずれかの方向にｃＤＮＡ挿入部を含有する例８のクロ
ーンからのプラスミドを例６に記載した方法を用いて単
離する。但し、テトラサイクリンではなく１００μｇ／
mlのアンピシリンを含有するＬＢ培地中でクローンを培
養し、そしてクロラムフェニコールは添加しない。プラ
スミドＤＮＡをＫｐｍＩ及びＨｉｎｄIII により完全消
化し、次にフェノールで抽出する。この二重消化された
１８μｇのＤＮＡを、９００ユニットのエンドヌクレア
ーゼＥｘｏIII を含有する５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH８）、５mM ＭｇＣｌ2 、１０μｇ／ml ｔＲＮ
Ａ、２０mM ２−メルカプトエタノールの溶液中で２３
℃にてインキュベートする。反応混合物から５０μｌの
アリコートを１分間ごとに６分間まで取り出し、８０μ
ｌの５倍濃度のマングビーンヌクレアーゼ緩衝液及び２
７０μｌの水を収容するチューブに加え、そしてドライ
アイス上で凍結する。
【０１５０】アリコートを６８℃にて１５分間加熱し、
次にマングビーンヌクレアーゼ緩衝液中９ユニットのマ
ングビーンヌクレアーゼにより３０℃にて３０分間処理
する。アリコート当り４００μｌの緩衝液で平衡化され
たフェノール／クロロホルムにより反応を停止し、そし
てエタノール沈澱によりＤＮＡを単離する。これらのＤ
ＮＡを再連結し、そして得られたハイブリドベクターを
使用して例８に記載した様にしてＥ．コリＲｅｃA-ＪＭ
１０９を形質転換する。形質転換体を１００μｇ／mlの
アンピシリンを含有するＬＢ培地に３７℃にて一夜増殖
せしめる。プラスミドＤＮＡを単離し、そして例６に記
載したようにしてＣｓＣｌグラジエント中で精製する。
次にマングビーンヌクレアーゼ緩衝液中９ユニットのマ
ングビーンヌクレアーゼにより３０℃にて３０分間処理
する。アリコート当り４００μｌの緩衝液で平衡化され
たフェノール／クロロホルムにより反応を停止し、そし
てエタノール沈澱によりＤＮＡを単離する。これらのＤ
ＮＡを再連結し、そして得られたハイブリドベクターを
使用して例８に記載した様にしてＥ．コリＲｅｃA-ＪＭ
１０９を形質転換する。形質転換体を１００μｇ／mlの
アンピシリンを含有するＬＢ培地に３７℃にて一夜増殖
せしめる。プラスミドＤＮＡを単離し、そして例６に記
載したようにしてＣｓＣｌグラジエント中で精製する。
【０１５１】例１０．ＤＮＡ配列の決定 例６及び例９のＤＮＡについて、例５の２０−ｍｅｒオ
リゴヌクレオチド混合物をプライマーとして用いて標準
的方法（ジデオキシヌクレオチド法）に従って配列を決
定する。次の配列：５′−CAGCCACCATTCCAAGG −３′の
第二プライマー、及び次の配列：５′−CGCACCTTCTCCTC
ATACTGG −３′の第三プライマーを用いる上流及び下流
配列決定により式（II）の部分配列が確認される。これ
らのプライマーは Y.Ike等、〔Nucleic Acid Research
, 11, 477 (1983)〕に従って合成される。
リゴヌクレオチド混合物をプライマーとして用いて標準
的方法（ジデオキシヌクレオチド法）に従って配列を決
定する。次の配列：５′−CAGCCACCATTCCAAGG −３′の
第二プライマー、及び次の配列：５′−CGCACCTTCTCCTC
ATACTGG −３′の第三プライマーを用いる上流及び下流
配列決定により式（II）の部分配列が確認される。これ
らのプライマーは Y.Ike等、〔Nucleic Acid Research
, 11, 477 (1983)〕に従って合成される。
【０１５２】要約すれば、例６又は９の５μｇのプラス
ミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ（ベーリンガー−マンハ
イム）により製造者の指示に従って線状化する。ＤＮＡ
を３容量のエタノールにより沈澱せしめ、次に２５μｌ
のＴＥ緩衝液中に溶解する。８μｌのこの溶液及び０．
５nmol／mlのプライマーを含有するＴＥ緩衝液２μｌを
混合し、沸騰水浴中に３分間置き、次にドライアイス中
で凍結する。１μｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５
０mM ＭｇＣｌ2 （pH７．４）を加え、そして混合物を
４２℃にて３０分間インキュベートする。
ミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ（ベーリンガー−マンハ
イム）により製造者の指示に従って線状化する。ＤＮＡ
を３容量のエタノールにより沈澱せしめ、次に２５μｌ
のＴＥ緩衝液中に溶解する。８μｌのこの溶液及び０．
５nmol／mlのプライマーを含有するＴＥ緩衝液２μｌを
混合し、沸騰水浴中に３分間置き、次にドライアイス中
で凍結する。１μｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５
０mM ＭｇＣｌ2 （pH７．４）を加え、そして混合物を
４２℃にて３０分間インキュベートする。
【０１５３】このプライマー／鋳型混合物をｄＮＴＰ混
合物、α−35Ｓ−ｄＡＴＰ、Ｋｌｅｎｏｗ断片及びジデ
オキシヌクレオチドｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴ
Ｐ，ｄｄＴＴＰのそれぞれにより、標準的方法〔 J.R.D
illon, A.Nasim及びE.R.Nestmann, "Recombinant DNA m
ethodology" ウイレイ１９８５，９０−９４頁〕に従っ
て処理する。ＤＮＡを変性し、そして配列決定用６％ポ
リアクリルアミド７Ｍ尿素ゲル（J.R.Dillon等、前記に
引用、８９頁）上に直接負荷し、そしてゲルを９０mM
Ｔｒｉｓ硼酸／１mM ＥＤＴＡ（pH８．７）中で泳動せ
しめる。式（II）の位置１のＡＴＧが蛋白質のための出
発コドンであろう。上流は位置−７５（ＴＧＡ），−６
５（ＴＡＡ），−５７（ＴＧＡ）及び−４１（ＴＧＡ）
に終止コドンを含むからである。
合物、α−35Ｓ−ｄＡＴＰ、Ｋｌｅｎｏｗ断片及びジデ
オキシヌクレオチドｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴ
Ｐ，ｄｄＴＴＰのそれぞれにより、標準的方法〔 J.R.D
illon, A.Nasim及びE.R.Nestmann, "Recombinant DNA m
ethodology" ウイレイ１９８５，９０−９４頁〕に従っ
て処理する。ＤＮＡを変性し、そして配列決定用６％ポ
リアクリルアミド７Ｍ尿素ゲル（J.R.Dillon等、前記に
引用、８９頁）上に直接負荷し、そしてゲルを９０mM
Ｔｒｉｓ硼酸／１mM ＥＤＴＡ（pH８．７）中で泳動せ
しめる。式（II）の位置１のＡＴＧが蛋白質のための出
発コドンであろう。上流は位置−７５（ＴＧＡ），−６
５（ＴＡＡ），−５７（ＴＧＡ）及び−４１（ＴＧＡ）
に終止コドンを含むからである。
【０１５４】例１１．ハイブリドーマ細胞の調製 １１．１．免疫感作方法 精製された蛋白質（例２）５μｇを０．１％ＳＤＳ及び
５０mMメルカプトエタノールを含有する２Ｍ尿素２０μ
ｌ中に溶解する。５μｇの蛋白質を含有するニトロセル
ロース片５×５mmを雌性ＨＲ−マウス〔パリ、クリエ研
究所Biozzi博士から入手； L.Boumsen及びA.Bernard J.
Immunol.Methods , 38, 225 (1980)を参照のこと〕の腹
腔に移植する。
５０mMメルカプトエタノールを含有する２Ｍ尿素２０μ
ｌ中に溶解する。５μｇの蛋白質を含有するニトロセル
ロース片５×５mmを雌性ＨＲ−マウス〔パリ、クリエ研
究所Biozzi博士から入手； L.Boumsen及びA.Bernard J.
Immunol.Methods , 38, 225 (1980)を参照のこと〕の腹
腔に移植する。
【０１５５】４週間後、５０μｇのアジュバントペプチ
ド（シグマ）を含有するフロインドの不完全アジュバン
ト中５μｇの７８kDa 蛋白質を腹腔内（ｉｐ．）に注射
し、そして同じサンプルによる２週間に１回の追加免疫
感作を３回ｉ．ｐ．投与により行う。４週間後、血清を
集め、そして７８kDa 蛋白質に対する抗体力価を例１２
のドット−イムノアッセイにより決定する。高抗体価を
有するマウスを２週間に１回の注射によりさらに２回の
免疫感作を行い、そして１週間後に最終追加免疫を行
う。３日後、融合のために脾臓を摘出する。
ド（シグマ）を含有するフロインドの不完全アジュバン
ト中５μｇの７８kDa 蛋白質を腹腔内（ｉｐ．）に注射
し、そして同じサンプルによる２週間に１回の追加免疫
感作を３回ｉ．ｐ．投与により行う。４週間後、血清を
集め、そして７８kDa 蛋白質に対する抗体力価を例１２
のドット−イムノアッセイにより決定する。高抗体価を
有するマウスを２週間に１回の注射によりさらに２回の
免疫感作を行い、そして１週間後に最終追加免疫を行
う。３日後、融合のために脾臓を摘出する。
【０１５６】１１．２．細胞融合 すべての融合実験を、 G.Koehler及びC.Milstein〔Natu
re, 256 , 495 (1975)〕の方法に従って、非分泌性Ｓｐ
２／０−Ａｇ１４骨髄腫セルライン〔M.Shulman, C.
D.Wilde及び G.Koehler, Nature, 276, 269 (1978) 〕
を用いて行う。１０8 個の脾細胞を１０7 個の骨髄腫細
胞と１mlの５０％エチレングリコール（ＰＥＧ１５０
０、セルバ）の存在下で混合する。洗浄した後、細胞を
４８mlの標準ダルベコ最少必須培地（ギブコ No.０４２
２５０１）に再懸濁する。融合当り３×１０6 個の正常
マウス腹腔滲出細胞をフィーダー細胞として加える。細
胞を４８×１mlのコスタルウエルに分配し、そして３〜
６週間にわたって１週間に３回、標準ＨＡＴ選択培地を
供給する。
re, 256 , 495 (1975)〕の方法に従って、非分泌性Ｓｐ
２／０−Ａｇ１４骨髄腫セルライン〔M.Shulman, C.
D.Wilde及び G.Koehler, Nature, 276, 269 (1978) 〕
を用いて行う。１０8 個の脾細胞を１０7 個の骨髄腫細
胞と１mlの５０％エチレングリコール（ＰＥＧ１５０
０、セルバ）の存在下で混合する。洗浄した後、細胞を
４８mlの標準ダルベコ最少必須培地（ギブコ No.０４２
２５０１）に再懸濁する。融合当り３×１０6 個の正常
マウス腹腔滲出細胞をフィーダー細胞として加える。細
胞を４８×１mlのコスタルウエルに分配し、そして３〜
６週間にわたって１週間に３回、標準ＨＡＴ選択培地を
供給する。
【０１５７】ハイブリドーマ細胞の増殖が可視的になっ
たとき、上清を例１２のドット・イムノアッセイにより
スクリーニングする。ハイブリドーマ細胞をミクロタイ
タープレート中で限界稀釈法により少なくとも一度クロ
ーン化し、そしｉ．ｐ．注射によりＨＲマウスを通して
継代する。ハイブリドーマ細胞を腹水から収得し、そし
限界稀釈法により再度クローン化する。さらに研究する
ために選択された９個のハイブリドーマは特に安定であ
り、そして多量の免疫グロブリンを分泌する。これら
を、８８５ Ｓ３５．８．１、８８５ Ｓ３５．１６．
１１、８８５ Ｓ５６．５５．７．１２．４８、８８５
Ｓ５６．５５．７．２１．２５、８８５Ｓ５６．５
５．７．２７．５、８８５ Ｓ５６．５５．７．２７．
１１、８８５ Ｓ５６．５５．１３、８８５ Ｓ５６．
５５．１７、及び８８５ Ｓ５６．６７．１５と称す
る。
たとき、上清を例１２のドット・イムノアッセイにより
スクリーニングする。ハイブリドーマ細胞をミクロタイ
タープレート中で限界稀釈法により少なくとも一度クロ
ーン化し、そしｉ．ｐ．注射によりＨＲマウスを通して
継代する。ハイブリドーマ細胞を腹水から収得し、そし
限界稀釈法により再度クローン化する。さらに研究する
ために選択された９個のハイブリドーマは特に安定であ
り、そして多量の免疫グロブリンを分泌する。これら
を、８８５ Ｓ３５．８．１、８８５ Ｓ３５．１６．
１１、８８５ Ｓ５６．５５．７．１２．４８、８８５
Ｓ５６．５５．７．２１．２５、８８５Ｓ５６．５
５．７．２７．５、８８５ Ｓ５６．５５．７．２７．
１１、８８５ Ｓ５６．５５．１３、８８５ Ｓ５６．
５５．１７、及び８８５ Ｓ５６．６７．１５と称す
る。
【０１５８】例１２．抗体スクリーニングのためのドッ
ト−イムノアッセイ 例２の精製された蛋白質を２Ｍ尿素、０．１％ＳＤＳ及
び５０mMメルカプトエタノール中に溶解する。蛋白質の
稀釈を１０％の不活性化ウマ血清を含有するＴＢＳ中に
行う。蛋白質をドットの形でニトロセルロース（ミリポ
ア社、ベドフォード、ＭａからのタイプＨＡＷＧ）上に
適用する。マウス血清又はハイブリドーマ培養培地から
の抗体の稀釈を１０％の不活性化ウマ血清を含有するＴ
ＢＳ中に行う。ドット免疫結合アッセイ、改変エンザイ
ム−リンクド・イムノソルベント・アッセイを、ラビッ
ト抗−マウスＩｇＧパーオキシダーゼ接合第二抗体及び
ＴＢＳ中Ｈ2 Ｏ2 ／４−クロロ−１−ナフトールを用い
て、 M.M.Derer等 (J.Allergy Clin.Immunol., 74，85
(1984) 〕により記載されたようにして行う。
ト−イムノアッセイ 例２の精製された蛋白質を２Ｍ尿素、０．１％ＳＤＳ及
び５０mMメルカプトエタノール中に溶解する。蛋白質の
稀釈を１０％の不活性化ウマ血清を含有するＴＢＳ中に
行う。蛋白質をドットの形でニトロセルロース（ミリポ
ア社、ベドフォード、ＭａからのタイプＨＡＷＧ）上に
適用する。マウス血清又はハイブリドーマ培養培地から
の抗体の稀釈を１０％の不活性化ウマ血清を含有するＴ
ＢＳ中に行う。ドット免疫結合アッセイ、改変エンザイ
ム−リンクド・イムノソルベント・アッセイを、ラビッ
ト抗−マウスＩｇＧパーオキシダーゼ接合第二抗体及び
ＴＢＳ中Ｈ2 Ｏ2 ／４−クロロ−１−ナフトールを用い
て、 M.M.Derer等 (J.Allergy Clin.Immunol., 74，85
(1984) 〕により記載されたようにして行う。
【０１５９】例１３．モノクローナル抗体の単離及び精
製 １３．１．インビボ合成 ８〜１０週分のBalb／ｃマウス（ティーファーム・シッ
セルン、スイス）を０．３mlのプリスタン（アルドリッ
チ）により腹腔内前処理する。２〜３週間後、２〜５×
１０6 個のクローン化ハイブリドーマ細胞及び０．２ml
のプリスタンを腹腔内に接種する。１０〜１０日後腹水
を集め、８００×ｇにて遠心し、そして−２０℃にて貯
蔵する。
製 １３．１．インビボ合成 ８〜１０週分のBalb／ｃマウス（ティーファーム・シッ
セルン、スイス）を０．３mlのプリスタン（アルドリッ
チ）により腹腔内前処理する。２〜３週間後、２〜５×
１０6 個のクローン化ハイブリドーマ細胞及び０．２ml
のプリスタンを腹腔内に接種する。１０〜１０日後腹水
を集め、８００×ｇにて遠心し、そして−２０℃にて貯
蔵する。
【０１６０】解凍した腹水を５０，０００×ｇにて６０
分間遠心分離する。表面に浮かぶ脂肪層を注意深く除去
し、そして蛋白質濃度を１０〜１２mg／mlに調製する。
０．９容量の飽和硫酸アンモニウムを０℃にて滴加する
ことにより粗免疫グロブリンを沈澱せしめ、次に２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０mM ＮａＣｌ（pH７．９）中
に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析する。２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／２５−４００mM ＮａＣｌ（pH
７．９）の緩衝液グラジエント系を用いるＤＥＡＥ−Ｄ
５２セルロース（ワットマン）により免疫グロブリン画
分を得る。免疫グロブリンを硫酸アンモニウムにより再
度沈澱せしめ、そして１０mg／mlの濃度でＰＢＳ中に溶
解する。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、す
べてのモノクローナル抗体について９５％以上の純度を
示す。
分間遠心分離する。表面に浮かぶ脂肪層を注意深く除去
し、そして蛋白質濃度を１０〜１２mg／mlに調製する。
０．９容量の飽和硫酸アンモニウムを０℃にて滴加する
ことにより粗免疫グロブリンを沈澱せしめ、次に２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０mM ＮａＣｌ（pH７．９）中
に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析する。２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／２５−４００mM ＮａＣｌ（pH
７．９）の緩衝液グラジエント系を用いるＤＥＡＥ−Ｄ
５２セルロース（ワットマン）により免疫グロブリン画
分を得る。免疫グロブリンを硫酸アンモニウムにより再
度沈澱せしめ、そして１０mg／mlの濃度でＰＢＳ中に溶
解する。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、す
べてのモノクローナル抗体について９５％以上の純度を
示す。
【０１６１】１３．２．インビトロ合成 １０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で生
理的温度（約３７℃）においてハイブリドーマ細胞を培
養して５×１０5 〜１０6 細胞／mlの最終細胞濃度にす
ることにより、例１１．２のセルラインの前培養物を得
る。この前培養物全体をベルコ培養器に満たし、そして
新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地／１０％ＦＣＳにより全容
量１５００mlに調整する。この培養物を約３７℃、５％
ＣＯ2 のもと３０rpm にて２〜３日間撹拌し、次にＲＰ
ＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳにより全容量３０００mlに
稀釈しそしてさらに７〜１０日間撹拌する。
理的温度（約３７℃）においてハイブリドーマ細胞を培
養して５×１０5 〜１０6 細胞／mlの最終細胞濃度にす
ることにより、例１１．２のセルラインの前培養物を得
る。この前培養物全体をベルコ培養器に満たし、そして
新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地／１０％ＦＣＳにより全容
量１５００mlに調整する。この培養物を約３７℃、５％
ＣＯ2 のもと３０rpm にて２〜３日間撹拌し、次にＲＰ
ＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳにより全容量３０００mlに
稀釈しそしてさらに７〜１０日間撹拌する。
【０１６２】この後細胞の９５％が死滅する。培養液を
１０００×ｇにて２０分間４℃で遠心分離する。無菌条
件下でポアサイズ０．２μｍのフィルターを通して上清
を濾過する。０．９容量の飽和硫酸アンモニウムを０℃
にてゆっくりと滴加することにより粗免疫グロブリンを
沈澱せしめる。この沈澱を例１３．１に記載されている
様にして精製し、そして９５％以上の純度のモノクロー
ナル抗体を得る。
１０００×ｇにて２０分間４℃で遠心分離する。無菌条
件下でポアサイズ０．２μｍのフィルターを通して上清
を濾過する。０．９容量の飽和硫酸アンモニウムを０℃
にてゆっくりと滴加することにより粗免疫グロブリンを
沈澱せしめる。この沈澱を例１３．１に記載されている
様にして精製し、そして９５％以上の純度のモノクロー
ナル抗体を得る。
【０１６３】例１４．モノクローナル抗体の特徴付け １４．１．モノクローナル抗体のクラス及びサブクラス
の決定 クローン化ハイブリドーマ細胞により生産されたモノク
ローナル抗体のクラス及びサブクラスを、クラス及びサ
ブクラス特異的ラビット抗体（ビオネティクス）を用い
る既知のオークテルロニー寒天ゲル免疫拡散法により決
定する。この結果を、次の様にして酵素イムノアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）により確認する。ミクロタイタープレー
トを、５０μｌのＰＢＳ中１μｇ／ウエルのクラス−又
はサブクラス特異的血清のラビット免疫グロブリン調製
物（ビオネティクス）によりコートする。プレートの遊
離結合容量を０．２％ ＮａＮ3 （ｗ／ｖ）を含有する
ＰＢＳ（pH７．４）中１％ウシ血清アルブミンの緩衝液
により飽和する。モノクローナル抗体を含有するプロー
ブ１００μｌをウエル中で３７℃にて１時間インキュベ
ートする。
の決定 クローン化ハイブリドーマ細胞により生産されたモノク
ローナル抗体のクラス及びサブクラスを、クラス及びサ
ブクラス特異的ラビット抗体（ビオネティクス）を用い
る既知のオークテルロニー寒天ゲル免疫拡散法により決
定する。この結果を、次の様にして酵素イムノアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）により確認する。ミクロタイタープレー
トを、５０μｌのＰＢＳ中１μｇ／ウエルのクラス−又
はサブクラス特異的血清のラビット免疫グロブリン調製
物（ビオネティクス）によりコートする。プレートの遊
離結合容量を０．２％ ＮａＮ3 （ｗ／ｖ）を含有する
ＰＢＳ（pH７．４）中１％ウシ血清アルブミンの緩衝液
により飽和する。モノクローナル抗体を含有するプロー
ブ１００μｌをウエル中で３７℃にて１時間インキュベ
ートする。
【０１６４】プレートをＰＢＳで洗浄し、次にプレート
をコートするために使用したのと同じ特異性を有するホ
スファターゼ接合ラビット免疫グロブリン調製物と共に
３７℃にて１時間インキュベートする。固定された酵素
を酵素基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートの溶液
〔０．５mM ＭｇＣｌ2 及び０．０２ｗ／ｖ％のＮａＮ
3を含有するジエタノールアミン１０％緩衝液（pH９．
８）中１mg／ml〕とのインキュベートにより発色せし
め、そして４０５nmにおける光学濃度を測定する。モノ
クローナル抗体、８８５ Ｓ３５．８．１、８８５ Ｓ
３５．１６．１１、８８５ Ｓ５６．５５．７．１２．
４８、８８５ Ｓ５６．５５．７．２１．２５、８８５
Ｓ５６．５５．７．２７．５、８８５ Ｓ５６．５
５．７．２７．１１、８８５ Ｓ５６．５５．１３、８
８５ Ｓ５６．５５．１７、及び８８５Ｓ５６．６７．
１５はすべてクラスＩｇＧ1 に属する。
をコートするために使用したのと同じ特異性を有するホ
スファターゼ接合ラビット免疫グロブリン調製物と共に
３７℃にて１時間インキュベートする。固定された酵素
を酵素基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートの溶液
〔０．５mM ＭｇＣｌ2 及び０．０２ｗ／ｖ％のＮａＮ
3を含有するジエタノールアミン１０％緩衝液（pH９．
８）中１mg／ml〕とのインキュベートにより発色せし
め、そして４０５nmにおける光学濃度を測定する。モノ
クローナル抗体、８８５ Ｓ３５．８．１、８８５ Ｓ
３５．１６．１１、８８５ Ｓ５６．５５．７．１２．
４８、８８５ Ｓ５６．５５．７．２１．２５、８８５
Ｓ５６．５５．７．２７．５、８８５ Ｓ５６．５
５．７．２７．１１、８８５ Ｓ５６．５５．１３、８
８５ Ｓ５６．５５．１７、及び８８５Ｓ５６．６７．
１５はすべてクラスＩｇＧ1 に属する。
【０１６５】１４．２．ヒト７８kDa 蛋白質に対する選
択性 マウスＡ２Ｇ胎児二倍体細胞、ラット胎児二倍体細胞、
ハムスター胎児二倍体細胞、ウマ腎二倍体細胞、真皮セ
ルラインＮＢＬ−６（ＡＴＣＣ No.ＣＣＬ５７）の細
胞、ウシ腎二倍体細胞、ネコ胎児肺二倍体細胞、ベロ・
セルラインＡＴＣＣ No.ＣＣＬ８１のモンキー細胞、ラ
ビット胎児細胞、ヒツジ脈絡膜叢細胞、ブタ腎二倍体細
胞、及び腎セルラインＰＫ−１５（ＡＴＣＣ No.ＣＣＬ
３３）の細胞を、例１．２及び４．１においてヒト細胞
について記載したようにして組換インターフェロンα／
β−Ｄハイブリドと共にインキュベートする〔 M.A.Hor
isberger及び K.de Starirtzky, J.Gen.Virol. (1987),
Vol 68 〕。
択性 マウスＡ２Ｇ胎児二倍体細胞、ラット胎児二倍体細胞、
ハムスター胎児二倍体細胞、ウマ腎二倍体細胞、真皮セ
ルラインＮＢＬ−６（ＡＴＣＣ No.ＣＣＬ５７）の細
胞、ウシ腎二倍体細胞、ネコ胎児肺二倍体細胞、ベロ・
セルラインＡＴＣＣ No.ＣＣＬ８１のモンキー細胞、ラ
ビット胎児細胞、ヒツジ脈絡膜叢細胞、ブタ腎二倍体細
胞、及び腎セルラインＰＫ−１５（ＡＴＣＣ No.ＣＣＬ
３３）の細胞を、例１．２及び４．１においてヒト細胞
について記載したようにして組換インターフェロンα／
β−Ｄハイブリドと共にインキュベートする〔 M.A.Hor
isberger及び K.de Starirtzky, J.Gen.Virol. (1987),
Vol 68 〕。
【０１６６】これらすべての種の細胞において、ヒト７
８kDa 蛋白質に関連する少なくとも１つの蛋白質が検出
される。これらの抗原的に関連する蛋白質は例１１．１
に従ってひと７８kDa 蛋白質により免疫感作されたマウ
スから得られるポリクローナル抗体によって同定され
る。しかしながら例１７の蛍光抗体法、例１８の免疫沈
澱法又はウエスタンブロット法により試験した場合、モ
ノクローナル抗体８８５Ｓ３５．８．１、８８５ Ｓ５
６．５５．１３及び８８５ Ｓ５６．６７．１５はヒト
７８kDa 蛋白質にのみ結合し、そして上記の種の関連蛋
白質とは結合しない。ウエスタンブロットのためには蛋
白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
離し、そしてニトロセルロースに移行せしめ、次に例１
６のイムノドットアッセイについて記載したようにして
試験する。
８kDa 蛋白質に関連する少なくとも１つの蛋白質が検出
される。これらの抗原的に関連する蛋白質は例１１．１
に従ってひと７８kDa 蛋白質により免疫感作されたマウ
スから得られるポリクローナル抗体によって同定され
る。しかしながら例１７の蛍光抗体法、例１８の免疫沈
澱法又はウエスタンブロット法により試験した場合、モ
ノクローナル抗体８８５Ｓ３５．８．１、８８５ Ｓ５
６．５５．１３及び８８５ Ｓ５６．６７．１５はヒト
７８kDa 蛋白質にのみ結合し、そして上記の種の関連蛋
白質とは結合しない。ウエスタンブロットのためには蛋
白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
離し、そしてニトロセルロースに移行せしめ、次に例１
６のイムノドットアッセイについて記載したようにして
試験する。
【０１６７】例１５．酵素−イムノアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ） １５．１．アルカリ性ホスファターゼによるモノクロー
ナル抗体８８５ Ｓ３５．８．１のラベル化 １．４mlのＰＢＳ中１．４mgのモノクローナル抗体８８
５ Ｓ３５．８．１を、グルタルアルデヒド（０．２ｖ
／ｖ％）を用いてVoller等〔Bull.World Health Orga
n., 53, 55 (1976) 〕の標準的方法に従って５mgのアル
カリ性ホスファターゼ（シグマＰ６７７４、タイプ VII
−Ｔ）を含有する溶液とカップリングせしめる。この接
合体を、１mM ＭｇＳＯ2 、１％ＢＳＡ及び０．０２％
ＮａＮＨ 3 を含有する０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液
（pH８．０）５mlに移す。この溶液を４℃にて暗中に保
持する。
Ａ） １５．１．アルカリ性ホスファターゼによるモノクロー
ナル抗体８８５ Ｓ３５．８．１のラベル化 １．４mlのＰＢＳ中１．４mgのモノクローナル抗体８８
５ Ｓ３５．８．１を、グルタルアルデヒド（０．２ｖ
／ｖ％）を用いてVoller等〔Bull.World Health Orga
n., 53, 55 (1976) 〕の標準的方法に従って５mgのアル
カリ性ホスファターゼ（シグマＰ６７７４、タイプ VII
−Ｔ）を含有する溶液とカップリングせしめる。この接
合体を、１mM ＭｇＳＯ2 、１％ＢＳＡ及び０．０２％
ＮａＮＨ 3 を含有する０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液
（pH８．０）５mlに移す。この溶液を４℃にて暗中に保
持する。
【０１６８】１５．２．アッセイ法 ポリプロピレン製ミクロタイタープレート（ダイナテッ
ク・ラブス）を緩衝液（pH８．６）（０．０２％のナト
リウムアジドを含有する炭酸塩緩衝化０．９％塩溶液）
中モノクローナル抗体８８５ Ｓ５６．５５．１３（１
０μｇ／ml）の溶液１５０μｌにより３７℃にて２時間
及び４℃にて一夜コートする。プレートをＰＢＳにて５
回洗浄し、そして２５０μｌの緩衝液（pH７．２）（Ｐ
ＢＳ中０．２％ゼラチン及び０．２％ＮａＮ3 ）と共に
３７℃にて１時間インキュベートすることにより、なお
存在する蛋白質反応性部位を飽和する。こうしてコート
されたプレートはこの緩衝液中で４℃にて数日間保持す
ることができる。
ク・ラブス）を緩衝液（pH８．６）（０．０２％のナト
リウムアジドを含有する炭酸塩緩衝化０．９％塩溶液）
中モノクローナル抗体８８５ Ｓ５６．５５．１３（１
０μｇ／ml）の溶液１５０μｌにより３７℃にて２時間
及び４℃にて一夜コートする。プレートをＰＢＳにて５
回洗浄し、そして２５０μｌの緩衝液（pH７．２）（Ｐ
ＢＳ中０．２％ゼラチン及び０．２％ＮａＮ3 ）と共に
３７℃にて１時間インキュベートすることにより、なお
存在する蛋白質反応性部位を飽和する。こうしてコート
されたプレートはこの緩衝液中で４℃にて数日間保持す
ることができる。
【０１６９】試験溶液又は７８kDa 蛋白質を含有する標
準溶液の一連の稀釈物５０μｌ、５０μｌの緩衝液（pH
７．４）５０μｌ、及び緩衝液（pH７．４）により１：
１００稀釈されたホスファターゼラベルされた抗体８８
５ Ｓ３５．８．１（例１５．１）の溶液５０μｌを混
合し、そしてミクロタイターウエル中で３７℃にて２時
間及び４℃にて３０分間インキュベートする。プレート
をＰＢＳにて５回洗浄し、次にｐ−ニトロフェニルホス
フェートの溶液（１０％ジエタノールアミン緩衝液／
０．５mM ＭｇＣｌ2 （pH９．８）中１mg／ml〕１５０
μｌと共に３７℃にて３０分間インキュベートする。４
０５nmでの光学濃度を測定することにより放出されたｐ
−ニトロフェノールの量を決定する。この量は結合した
酵素ホスファターゼの量に比例し、そしてそれ故に試験
溶液中の７８kDa 蛋白質の量に比例する。
準溶液の一連の稀釈物５０μｌ、５０μｌの緩衝液（pH
７．４）５０μｌ、及び緩衝液（pH７．４）により１：
１００稀釈されたホスファターゼラベルされた抗体８８
５ Ｓ３５．８．１（例１５．１）の溶液５０μｌを混
合し、そしてミクロタイターウエル中で３７℃にて２時
間及び４℃にて３０分間インキュベートする。プレート
をＰＢＳにて５回洗浄し、次にｐ−ニトロフェニルホス
フェートの溶液（１０％ジエタノールアミン緩衝液／
０．５mM ＭｇＣｌ2 （pH９．８）中１mg／ml〕１５０
μｌと共に３７℃にて３０分間インキュベートする。４
０５nmでの光学濃度を測定することにより放出されたｐ
−ニトロフェノールの量を決定する。この量は結合した
酵素ホスファターゼの量に比例し、そしてそれ故に試験
溶液中の７８kDa 蛋白質の量に比例する。
【０１７０】ミクロタイタープレートをモノクローナル
抗体８８５ Ｓ３５．８．１又は８８５ Ｓ５６．６
７．１５によりコートし、そして第二抗体としてホスフ
ァターゼに連結されたモノクローナル抗体８８５ Ｓ５
６．５５．１３を使用する場合、同様の結果が得られ
る。
抗体８８５ Ｓ３５．８．１又は８８５ Ｓ５６．６
７．１５によりコートし、そして第二抗体としてホスフ
ァターゼに連結されたモノクローナル抗体８８５ Ｓ５
６．５５．１３を使用する場合、同様の結果が得られ
る。
【０１７１】１５．３．ＥＬＩＳＡのための試験キット 例１５．２中に記載したアッセイのための試験キットは
次のものを含む。 ◎ 炭酸緩衝化塩溶液（０．９％ ＮａＣｌ、０．４２
％ ＮａＨＣＯ3 、０．００７２％ Ｎａ2 ＣＯ3 、
０．０２％ ＮａＮ3 ）中モノクローナル抗体８８５
Ｓ５６．５５．１３（１０μｇ／ml）の溶液。２０ml ◎ Ｔｒｉｓ緩衝液（０．０５Ｍ、１mM ＭｇＣｌ2 、
１％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ3 、pH８．０）中アルカ
リ性ホスファターゼに連結されたモノクローナル抗体８
８５ Ｓ３５．８．１（例１５．１、０．３mg／mlの抗
体）の溶液。１ml ◎ ５μｇの７８kDa 蛋白質を含有する標準溶液。２ml ◎ ＰＢＳ。３００ml
次のものを含む。 ◎ 炭酸緩衝化塩溶液（０．９％ ＮａＣｌ、０．４２
％ ＮａＨＣＯ3 、０．００７２％ Ｎａ2 ＣＯ3 、
０．０２％ ＮａＮ3 ）中モノクローナル抗体８８５
Ｓ５６．５５．１３（１０μｇ／ml）の溶液。２０ml ◎ Ｔｒｉｓ緩衝液（０．０５Ｍ、１mM ＭｇＣｌ2 、
１％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ3 、pH８．０）中アルカ
リ性ホスファターゼに連結されたモノクローナル抗体８
８５ Ｓ３５．８．１（例１５．１、０．３mg／mlの抗
体）の溶液。１ml ◎ ５μｇの７８kDa 蛋白質を含有する標準溶液。２ml ◎ ＰＢＳ。３００ml
【０１７２】◎ 緩衝液（pH７．４）（ＰＢＳ中０．２
％ゼラチン及び０．２％ ＮａＮ3 ）。３００ml ◎ ジエタノールアミン緩衝液（１０％、０．５mM Ｍ
ｇＣｌ2 、０．０２％ＮａＮ3 、ＨＣｌにてpH８．９に
調整）中ｐ−ニトロフェニルホスフェート（１mg／ml）
の溶液。５０ml ◎ 換算曲線。 ◎ 色強度スケール。 ◎ 指示書。
％ゼラチン及び０．２％ ＮａＮ3 ）。３００ml ◎ ジエタノールアミン緩衝液（１０％、０．５mM Ｍ
ｇＣｌ2 、０．０２％ＮａＮ3 、ＨＣｌにてpH８．９に
調整）中ｐ−ニトロフェニルホスフェート（１mg／ml）
の溶液。５０ml ◎ 換算曲線。 ◎ 色強度スケール。 ◎ 指示書。
【０１７３】例１６．イムノブロット・アッセイ １６．１．アッセイ法 ７８kDa 蛋白質の存在について試験されるべき溶液及び
標準溶液の一連の稀釈物を１０％の不活性ウマ血清を含
有するＴＢＳ中に調製する。この稀釈物をドットの形で
ニトロセルロース（ミリポア社、ブレッドフォード、Ｍ
ａ、タイプＨＡＷＧ）に適用する。ニトロセルロースを
１０％のウマ血清を含有するＴＢＳ中で３７℃にて２時
間インキュベートすることにより、ニトロセルロースの
過剰の蛋白質結合容量をブロックする。ニトロセルロー
スを適当なストリップに切断し、次にＴＢＳ中モノクロ
ーナル抗体８８５ Ｓ５６．５５．１３又は８８５ Ｓ
３５．８．１（２μｇ／ml及び１０μｇ／ml）の溶液と
共に室温にて２時間インキュベートする。
標準溶液の一連の稀釈物を１０％の不活性ウマ血清を含
有するＴＢＳ中に調製する。この稀釈物をドットの形で
ニトロセルロース（ミリポア社、ブレッドフォード、Ｍ
ａ、タイプＨＡＷＧ）に適用する。ニトロセルロースを
１０％のウマ血清を含有するＴＢＳ中で３７℃にて２時
間インキュベートすることにより、ニトロセルロースの
過剰の蛋白質結合容量をブロックする。ニトロセルロー
スを適当なストリップに切断し、次にＴＢＳ中モノクロ
ーナル抗体８８５ Ｓ５６．５５．１３又は８８５ Ｓ
３５．８．１（２μｇ／ml及び１０μｇ／ml）の溶液と
共に室温にて２時間インキュベートする。
【０１７４】ストリップをＴＢＳ中で５回洗浄し、そし
てさらにラビット抗−マウスＩｇＧパーオキシダーゼ接
合第二抗体の１０，０００倍稀釈物中で２時間インキュ
ベートし、ＴＢＳ中で５回洗浄し、次に０．６容量の４
−クロロ−１−ナフトール（メタノール中３mg／ml）、
１０容量のＴＢＳ及び０．００４容量の３０％過酸化水
素から成る新たに混合されたパーオキシダーゼ基質溶液
中で室温にて１５分間発色せしめる。所望により、スポ
ットを屈折光度計（ＣＡＭＡＧ、ムッテンツ、スイス）
により６００nmにて走査することができる。
てさらにラビット抗−マウスＩｇＧパーオキシダーゼ接
合第二抗体の１０，０００倍稀釈物中で２時間インキュ
ベートし、ＴＢＳ中で５回洗浄し、次に０．６容量の４
−クロロ−１−ナフトール（メタノール中３mg／ml）、
１０容量のＴＢＳ及び０．００４容量の３０％過酸化水
素から成る新たに混合されたパーオキシダーゼ基質溶液
中で室温にて１５分間発色せしめる。所望により、スポ
ットを屈折光度計（ＣＡＭＡＧ、ムッテンツ、スイス）
により６００nmにて走査することができる。
【０１７５】１６．２．イムノドット・アッセイのため
の試験キット 例１６．２．に記載したアッセイのための試験キットは
次のものを含む。 ◎ ニトロセルロースシート。 ◎ １０％ウマ血清を含むＴＢＳ中モノクローナル抗体
８８５ Ｓ５６．５５．１３（１０μｇ／ml）の溶液。
２０ml ◎ １０％ウマ血清を含むＴＢＳ中ホースラディッシュ
に接合したラビット抗−マウスＩｇＧの１：１００稀釈
物。１ml
の試験キット 例１６．２．に記載したアッセイのための試験キットは
次のものを含む。 ◎ ニトロセルロースシート。 ◎ １０％ウマ血清を含むＴＢＳ中モノクローナル抗体
８８５ Ｓ５６．５５．１３（１０μｇ／ml）の溶液。
２０ml ◎ １０％ウマ血清を含むＴＢＳ中ホースラディッシュ
に接合したラビット抗−マウスＩｇＧの１：１００稀釈
物。１ml
【０１７６】◎ ５μｇの７８kDa 蛋白質を含有する標
準溶液。２ml ◎ ＴＢＳ。３００ml ◎ １０％ウマ血清を含有するＴＢＳ。３００ml ◎ ４−クロロ−１−ナフトール（メタノール中３mg／
ml）。１０ml ◎ ３０％過酸化水素。１０ml ◎ 指示書。
準溶液。２ml ◎ ＴＢＳ。３００ml ◎ １０％ウマ血清を含有するＴＢＳ。３００ml ◎ ４−クロロ−１−ナフトール（メタノール中３mg／
ml）。１０ml ◎ ３０％過酸化水素。１０ml ◎ 指示書。
【０１７７】例１７．蛍光光体法 この発明の蛋白質の存在について試験すべき細胞をプラ
スチックカバースリップ上に増殖せしめる別の方法とし
て、ヒトの血液から新たに単離された細胞、例えばリン
パ球又は単球を、ポリ−Ｄ−リジンにより前処理された
ガラススライドにサイトスピン遠心により付着せしめ
る。細胞をＰＢＳにより洗浄し、３％ポラホルムアルデ
ヒドにより２０℃にて１０分間固定し、０．５％トリト
ンＸ−１００により５分間透過性にし、ＰＢＳにて再度
洗浄し、そしてＰＢＳ中モノクローナル抗体８８５ Ｓ
５６．５５．１３（１０μｇ／ml）の溶液と共に３７℃
にて６０分間インキュベートする。
スチックカバースリップ上に増殖せしめる別の方法とし
て、ヒトの血液から新たに単離された細胞、例えばリン
パ球又は単球を、ポリ−Ｄ−リジンにより前処理された
ガラススライドにサイトスピン遠心により付着せしめ
る。細胞をＰＢＳにより洗浄し、３％ポラホルムアルデ
ヒドにより２０℃にて１０分間固定し、０．５％トリト
ンＸ−１００により５分間透過性にし、ＰＢＳにて再度
洗浄し、そしてＰＢＳ中モノクローナル抗体８８５ Ｓ
５６．５５．１３（１０μｇ／ml）の溶液と共に３７℃
にて６０分間インキュベートする。
【０１７８】次に細胞をＰＢＳで洗浄し、フルオレッセ
イン接合ラビット抗−マウスＩｇＧの溶液（５％ウマ血
清を含有するＰＢＳ中に１：４０稀釈されたもの、ＤＡ
ＫＯ）により処理し、ＰＢＳにより洗浄し、そして Joh
nson等〔J.Immunol.Methods, 43, 349 (1981)〕により
記載されている様にして観察する。ＵＶ蛍光顕微鏡観察
は、細胞の細胞質中の明るい蛍光によりこの発明の蛋白
質の存在を示す。
イン接合ラビット抗−マウスＩｇＧの溶液（５％ウマ血
清を含有するＰＢＳ中に１：４０稀釈されたもの、ＤＡ
ＫＯ）により処理し、ＰＢＳにより洗浄し、そして Joh
nson等〔J.Immunol.Methods, 43, 349 (1981)〕により
記載されている様にして観察する。ＵＶ蛍光顕微鏡観察
は、細胞の細胞質中の明るい蛍光によりこの発明の蛋白
質の存在を示す。
【０１７９】例１８．インターフェロンで誘導された細
胞についての免疫沈澱試験 培養物中に増殖した細胞又はヒト血液から新たに単離さ
れた細胞を、例１７に記載した様にプラスチック又はガ
ラスのプレート上に置く。５０００国際単位／mlの濃度
の組換インターフェロン５1 （α／βタイプ）の溶液に
より細胞を３７℃にて４時間処理し、そして２０mM Ｎ
−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタン
スルホン酸（ＨＥＰＥＳ、pH７．４）により緩衝化され
た炭酸水素ナトリウムを含有するハンクの平衡溶液中５
０μCi／mlの35Ｓ−メチオニンと共に３７℃にて３０分
間インキュベートする。
胞についての免疫沈澱試験 培養物中に増殖した細胞又はヒト血液から新たに単離さ
れた細胞を、例１７に記載した様にプラスチック又はガ
ラスのプレート上に置く。５０００国際単位／mlの濃度
の組換インターフェロン５1 （α／βタイプ）の溶液に
より細胞を３７℃にて４時間処理し、そして２０mM Ｎ
−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタン
スルホン酸（ＨＥＰＥＳ、pH７．４）により緩衝化され
た炭酸水素ナトリウムを含有するハンクの平衡溶液中５
０μCi／mlの35Ｓ−メチオニンと共に３７℃にて３０分
間インキュベートする。
【０１８０】細胞をＰＢＳにより洗浄し、プレートから
かき取り、遠心分離により集め、５mM Ｔｒｉｓ（pH
７．４）、１．５mM ＫＣｌ及び２．５mM ＭｇＣｌ2
を含有する低張緩衝液中に５分間懸濁し、そして遠心分
離により再び集める。１％トリトンＸ−１００及び１％
デオキシコレートを含有する低張緩衝液により４℃にて
５分間溶解し、次に１２，０００rpm にて５分間遠心分
離する。ドデシル硫酸ナトリウムを０．５％の最終濃度
となる様に上清に加える。６μｌのこの溶液と、１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）及び５０mM ＮａＣｌ
を含む緩衝液（フェニルメチルスルホニルフルオリドで
飽和されたもの）２０μｌとを混合し、そして１２，０
００rpm にて５分間再遠心分離する。
かき取り、遠心分離により集め、５mM Ｔｒｉｓ（pH
７．４）、１．５mM ＫＣｌ及び２．５mM ＭｇＣｌ2
を含有する低張緩衝液中に５分間懸濁し、そして遠心分
離により再び集める。１％トリトンＸ−１００及び１％
デオキシコレートを含有する低張緩衝液により４℃にて
５分間溶解し、次に１２，０００rpm にて５分間遠心分
離する。ドデシル硫酸ナトリウムを０．５％の最終濃度
となる様に上清に加える。６μｌのこの溶液と、１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）及び５０mM ＮａＣｌ
を含む緩衝液（フェニルメチルスルホニルフルオリドで
飽和されたもの）２０μｌとを混合し、そして１２，０
００rpm にて５分間再遠心分離する。
【０１８１】２０μｌの上清、及び０．５％ ＢＳＡを
含有するＰＢＳ中モノクローナル抗体８８５ Ｓ５６．
５５．１３の溶液（４０μｇ／ml）１μｌを４℃にて３
時間インキュベートし、次にプロテインＡ−セファロー
スの５０ｖ／ｖ％懸濁液０μｌと混合する。１０mM Ｔ
ｒｉｓ（pH７．４）、５０mM ＮａＣｌ、１Ｍシューク
ロース、０．５％デオキシコール酸及び０．５％トリト
ンＸ−１００を含む緩衝液５００μｌで洗浄し、そして
抗原／抗体複合体を３０μｌのサンプル緩衝液〔 U.K.L
aemmli及び M.Fovre, J.Mol.Biol., 80, 575 (1973) 〕
により溶出する。溶出物を常法により１２％ポリアクリ
ルアミドゲル上での一次元ＳＤＳゲル電気泳動により分
析する。７８kDa の見かけ分子量を有するこの発明の蛋
白質の存在がフルオログラフィーにより示される。
含有するＰＢＳ中モノクローナル抗体８８５ Ｓ５６．
５５．１３の溶液（４０μｇ／ml）１μｌを４℃にて３
時間インキュベートし、次にプロテインＡ−セファロー
スの５０ｖ／ｖ％懸濁液０μｌと混合する。１０mM Ｔ
ｒｉｓ（pH７．４）、５０mM ＮａＣｌ、１Ｍシューク
ロース、０．５％デオキシコール酸及び０．５％トリト
ンＸ−１００を含む緩衝液５００μｌで洗浄し、そして
抗原／抗体複合体を３０μｌのサンプル緩衝液〔 U.K.L
aemmli及び M.Fovre, J.Mol.Biol., 80, 575 (1973) 〕
により溶出する。溶出物を常法により１２％ポリアクリ
ルアミドゲル上での一次元ＳＤＳゲル電気泳動により分
析する。７８kDa の見かけ分子量を有するこの発明の蛋
白質の存在がフルオログラフィーにより示される。
【０１８２】例１９．ヒトにおけるインターフェロン療
法の監視 １０7 国際単位の組換ヒトインターフェロン−α
（α2 ）を皮下投与された患者から注射後２４時間目及
び４８時間目に血液サンプルを採取する。フィコール４
００（ファルマシア）密度勾配上での遠心分離によりリ
ンパ球を精製する。４．５×１０6 個のリンパ球を４０
０μｌの水中に懸濁し、次に８００μｌのエタノールに
より沈澱せしめる。ペレットを解離緩衝液中に溶解し、
そして一次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より分離する。蛋白質をニトロセルロース上に移し、そ
して７８kDa の蛋白質を検出し、そして例１６に記載し
た様にして定量する。インターフェロン治療前の患者及
び健康者に比較して、７８kDa 蛋白質のレベルはインタ
ーフェロンα2 の皮下注射の後２４時間及び４８時間後
に５倍に上昇していた。
法の監視 １０7 国際単位の組換ヒトインターフェロン−α
（α2 ）を皮下投与された患者から注射後２４時間目及
び４８時間目に血液サンプルを採取する。フィコール４
００（ファルマシア）密度勾配上での遠心分離によりリ
ンパ球を精製する。４．５×１０6 個のリンパ球を４０
０μｌの水中に懸濁し、次に８００μｌのエタノールに
より沈澱せしめる。ペレットを解離緩衝液中に溶解し、
そして一次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より分離する。蛋白質をニトロセルロース上に移し、そ
して７８kDa の蛋白質を検出し、そして例１６に記載し
た様にして定量する。インターフェロン治療前の患者及
び健康者に比較して、７８kDa 蛋白質のレベルはインタ
ーフェロンα2 の皮下注射の後２４時間及び４８時間後
に５倍に上昇していた。
【０１８３】例２０．非経口投与用医薬 ２００μｇの７８kDa 蛋白質を３mlの５Ｎヒト血清アル
ブミンに溶解する。得れ等る溶液を細菌学的フィルター
に通し、そして濾過された溶液を無菌条件下で１０個の
バイアルに分注する。バイアルを好ましくは冷所、例え
ば−２０℃にて貯蔵する。
ブミンに溶解する。得れ等る溶液を細菌学的フィルター
に通し、そして濾過された溶液を無菌条件下で１０個の
バイアルに分注する。バイアルを好ましくは冷所、例え
ば−２０℃にて貯蔵する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 45/02 8415−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｋ 16/24 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ハインツ−クルト ホッホケッペル スイス国，4147 エシュ，トラウゴット マイエルシュトラーセ １ (72)発明者 ジャン コンタン ベルギー国，1640 ロドゥ−サン−ジュネ ーズ，アベニュ シモーヌ，５
Claims (8)
- 【請求項１】 次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
７８kDa の分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： Val-Val-Ser-Glu-Val(5)-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala(10)- で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する；を
有する蛋白質に対して反応し且つインターフェロンによ
り誘導されたマウス蛋白質ＭX と交叉反応しないモノク
ローナル抗体を分泌することを特徴とするハイブリドー
マセルライン。 - 【請求項２】 マウス骨髄腫細胞と同系マウスのＢリン
パ球とのハイブリドであることを特徴とする請求項１に
記載のハイブリドーマセルライン。 - 【請求項３】 パスツール研究所（パリ）のCollection
Nationale de Cultures de Microorganismes にNo. Ｉ
−５４５として寄託されている８８５ Ｓ３５．８．１
と称する請求項２に記載のハイブリドーマセルライン。 - 【請求項４】 パスツール研究所（パリ）のCollection
Nationale de Cultures de Microorganismes にNo. Ｉ
−５４３として寄託されている８８５ Ｓ５６．５５．
１３と称する請求項２に記載のハイブリドーマセルライ
ン。 - 【請求項５】 パスツール研究所（パリ）のCollection
Nationale de Cultures de Microorganismes にNo. Ｉ
−５４４として寄託されている８８５ Ｓ５６．６７．
１５と称する請求項２に記載のハイブリドーマセルライ
ン。 - 【請求項６】 次の性質： （１）インターフェロン−α又は−βにより誘導された
ヒト細胞中に存在するが、処理されていない細胞中には
合理的な程度に存在しない； （２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した場合約
７８kDa の分子量を有する； （３）約６．３の等電点を有する； （４）次の配列： Val-Val-Ser-Glu-Val(5)-Asp-Ile-Ala-Lys-Ala(10)- で表わされる部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有する；を
有する蛋白質に対して反応し且つインターフェロンによ
り誘導されたマウス蛋白質ＭX と交叉反応しないモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリドーマセルラインの製
造方法であって、精製された該蛋白質により又はこの蛋
白質を含有する抗原キャリャーにより適当な哺乳類を免
疫感作し、この哺乳類の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融
合せしめ、この融合により得られたハイブリド細胞をク
ローン化し、そして所望の抗体を分泌する細胞クローン
を選択することを特徴とする方法。 - 【請求項７】 ＨＲ−マウスの抗体産生細胞をセルライ
ンＸ６３−Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／０−Ａｇ１４の
骨髄腫細胞と融合せしめることを特徴とする請求項６に
記載の方法。 - 【請求項８】 前記蛋白質を含有するニトロセルロース
片を移植することによって哺乳類を免疫感作することを
特徴とする請求項６に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8609162 | 1986-04-15 | ||
| GB868609162A GB8609162D0 (en) | 1986-04-15 | 1986-04-15 | Protein |
| GB8625381 | 1986-10-23 | ||
| GB868625381A GB8625381D0 (en) | 1986-04-15 | 1986-10-23 | Interferon-induced human protein |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62089993A Division JPH0822880B2 (ja) | 1986-04-15 | 1987-04-14 | インタ−フエロンにより誘導されるヒト蛋白質に対するモノクローナル抗体 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07236497A true JPH07236497A (ja) | 1995-09-12 |
| JP2572956B2 JP2572956B2 (ja) | 1997-01-16 |
Family
ID=26290626
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62089993A Expired - Lifetime JPH0822880B2 (ja) | 1986-04-15 | 1987-04-14 | インタ−フエロンにより誘導されるヒト蛋白質に対するモノクローナル抗体 |
| JP7026576A Expired - Lifetime JP2572956B2 (ja) | 1986-04-15 | 1995-02-15 | インターフェロンにより誘導された蛋白質に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62089993A Expired - Lifetime JPH0822880B2 (ja) | 1986-04-15 | 1987-04-14 | インタ−フエロンにより誘導されるヒト蛋白質に対するモノクローナル抗体 |
Country Status (10)
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|---|---|
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| JP (2) | JPH0822880B2 (ja) |
| AT (1) | ATE125304T1 (ja) |
| AU (1) | AU608216B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340289C (ja) |
| DE (1) | DE3751409T2 (ja) |
| DK (1) | DK172677B1 (ja) |
| ES (1) | ES2074420T3 (ja) |
| IE (1) | IE67564B1 (ja) |
| PT (1) | PT84670B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| EP0331635A3 (en) * | 1988-02-29 | 1990-02-28 | The Board of Regents of the University of Texas System | Preparations for treating bladder cancer |
| AU4778193A (en) * | 1992-07-20 | 1994-02-14 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Inhibition of retroviral expression by interferon-induced cellular genes and proteins |
| US5792626A (en) * | 1996-09-18 | 1998-08-11 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human interferon-inducible protein |
| JP2004500821A (ja) * | 2000-02-09 | 2004-01-15 | ファーマ パシフィック プロプライエタリー リミテッド | インターフェロン−アルファに誘導された遺伝子 |
| WO2001059155A2 (en) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Pharma Pacific Pty. Ltd. | Interferon-alpha induced genes |
| EP1294754A1 (en) * | 2000-06-29 | 2003-03-26 | Pharma Pacific Pty. Ltd. | Interferon-alpha induced gene |
| WO2002022682A1 (en) * | 2000-09-14 | 2002-03-21 | Pharma Pacific Pty. Ltd. | Interferon-alpha induced gene |
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| AU2002234755A1 (en) * | 2001-02-26 | 2002-09-12 | Pharma Pacific Pty Ltd | Interferon-alpha induced gene |
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|---|---|---|---|---|
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| ES498343A0 (es) | 1980-01-08 | 1983-09-01 | Biogen Nv | Un metodo de producir un polipeptido que exhibe actividad inmunologica o biologica del interferon de leucocitos humanos. |
| DE3026832A1 (de) | 1980-07-16 | 1982-02-11 | Klöckner-Humboldt-Deutz AG, 5000 Köln | Zerstaeuberduese fuer kontinuierliche brennstoffeinspritzung |
| EP0072541A3 (en) | 1981-08-14 | 1984-04-18 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Human leukocyte interferons, process for their microbial production, intermediates therefor and compositions containing them |
| GB2108510B (en) | 1981-10-03 | 1984-12-12 | Ciba Geigy Ag | Dnas, recombinant dnas, hosts containing them, polypeptides and processes for the production thereof |
| WO1987000864A1 (en) * | 1985-07-31 | 1987-02-12 | Peter Staeheli | Insertion into animals of genes coding for interferon-induced proteins |
-
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- 1987-04-09 ES ES87810225T patent/ES2074420T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-09 EP EP87810225A patent/EP0242329B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-09 AT AT87810225T patent/ATE125304T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-04-13 CA CA000534493A patent/CA1340289C/en not_active Expired - Fee Related
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-
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- 1995-02-15 JP JP7026576A patent/JP2572956B2/ja not_active Expired - Lifetime
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