KR100434023B1

KR100434023B1 - 수두바이러스의당단백질을대량발현시키는동물세포주

Info

Publication number: KR100434023B1
Application number: KR1019960005384A
Authority: KR
Inventors: 김천형; 소홍섭; 조중명
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 1996-02-29
Filing date: 1996-02-29
Publication date: 2005-05-09
Also published as: KR970062029A

Abstract

본 발명은 수두 바이러스(Varicella-Zoster Virus: VZV)의 표면항원 단백질을 계속적으로 안정하게 발현시키는 형질전환된 동물세포주에 관한 것으로, 수두 바이러스(VZV)의 표면항원 당단백질 gpII로부터 카복시 말단의 소수성 부위를 제거한 단백질 gpIIs를 코드하는 유전자 및 선별 유전자가 하나의 프로모터에 의해 조절되는 바이시스트로닉 발현벡터로 형질전환된 CHO 세포주를 배양하여 제조된 VZV의 gpIIs 단백질은 VZV에 대해 면역성이 높은 백신으로 사용될 수 있다.

Description

수두 바이러스의 당단백질을 대량발현시키는 동물세포주{ANIMAL CELL LINE EXPRESSING GLYCOPROTEIN OF VARICELLA-ZOSTER VIRUS}

본 발명은 수두 바이러스(Varicella-Zoster Virus: 이하, "VZV"라 함)의 표면항원 당단백질인 gpIIs 유전자를 계속적으로, 안정하게 발현시키는 형질전환된 동물세포주에 관한 것이다. 보다 상세하게는, VZV의 표면항원 당단백질인 gpII로부터 카복시 말단의 소수성 부위를 제거시킨 gpIIs의 유전자를 사이토메갈로바이러스 프로모터를 가진 발현벡터에 삽입시켜 얻은 gpIIs 단백질 발현벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 차이니스 햄스터 오바리(Chinese Hamster Ovary: 이하, "CHO"라 함) 세포주 및 상기 형질전환된 균주를 이용한 VZV의 gpIIs 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

VZV는 헤르페스 바이러스 계통에 속하는 DNA 바이러스로서 수두(Chickenpox)를 일으키는 바이러스이다. VZV에 의해 발생되는 수두는 어린이, 면역성이 약화된 노약자나 환자에게 발병하기 쉬운 전염성이 매우 강한 질환으로 계절적 요인의 영향을 받는다. VZV에 감염되면 약 14 일 경과후 감기 증상과 유사하게 열이 나며, 전신에 반점 형태의 발진이 생성되어 여드름 형태로 발전하는데 심한 경우 치명적인 흉터를 남기게 된다.

VZV는 1차 감염부위인 호흡계에서 주로 증식을 시작하여 흘러나온 후 림프선으로 이동, 확산되어 1차 바이러스혈증(viremia)을 나타낸다. 세포성 면역반응이 약화되거나 결핍되면 다음 단계인 세망내피계(reticuloendothelial system)로 이동하여 피부에서 본격적인 다증식이 이루어지고, 폐와 간으로까지 확대되어 2차 바이러스혈증을 나타낸다. 일반적으로 2차 바이러스혈증은 정상인의 경우 세포성 또는 체액성 면역 방어기작에 의하여 3 일내에 사라지는데, 특히 세포성 면역반응이 수두 바이러스의 억제에 보다 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 2차 바이러스혈증이 사라지더라도 감염후 2 주일이 지나면 수두 바이러스는 면역 방어막을 피해 뇌의 신경절 세포속으로 침투하여 신경 세포 주위를 감싸고 있는 위성세포(satellite cell)에 잠복하는데, 숙주의 세포성 면역반응에 의해 장기간 바이러스 증식이 억제되어 본격적인 잠복기에 들어가게 된다.

이와 같이 잠복상태에 있는 바이러스의 재활성화는 체액성 면역 반응만으로는 막을 수 없으며, 세포성 면역반응에 의해서만 억제가 가능하다. 즉, 면역기작에 의해 생성되는 여러 종류의 사이토카인(cytokine)에 의해 바이러스의 증식이 억제된다. 그러나, 바이러스의 증식을 억제할 수 없을 정도로 면역성이 현저히 떨어진 노년층이나 환자의 경우에는, VZV에 대한 특이 항체가 존재하더라도 이 바이러스가 재활성화되어 신경절 세포에서 증식하게 된다. 이렇게 되면 수두 바이러스는 '잠복'의 역순으로 피부로 다시 이동, 확산하여 대상포진(Herpes zoster)을 일으키게 된다(H. John et al., Virology, 5, 241(1994); D. G. Lawrence et al., Virology, 2, 2011-2054(1990)). 이와 같이 신경절 세포에서 재활성화된 VZV는 1차 수두성 폐렴과 같은 수두성 질병에 걸려 있는 환자의 경우, 보다 심각한 증상을 야기시킨다. 즉, 1 차적으로는 근육 떨림, 근육 저긴장증(마비), 급성 퇴행성과 같은 중앙 신경계에 이상이 시작되며 극히 일부의 경우는 뇌출혈, 말초혈관 원형세포 침윤 등으로 악화되어 신경염이나 뇌척수염으로 발전, 결국 사망에 이르게 되는 치명적인 질환이 되기도 한다.

미국의 경우, 1 년에 4백만명 정도의 수두 환자와 1백만명 정도의 대상포진 환자가 발생하여 100명 이상이 수두성 복합질환에 의해 사망하는데, 특히 백혈병 환자와 같이 면역 억제제를 투여해야 하는 경우 더욱 치명적인 것으로 보고되어 있다(G. Fleisher et al., Am. J. Dis. Child, 135, 896(1981); R. P. Stephen et al., Pediatrics, 68, 14(1981); P. A. Patel et al., Pediatrics, 94, 223(1979)).

VZV를 억제할 수 있는 치료제로는 비다라빈(Vidarabine; adenosine arabinoside), 아사이클로비르(Acyclovir) 등이 개발되어 있으나, 이들의 강한 독성으로 신장이나 뇌의 중앙 신경계에 심한 부작용을 일으키기 때문에 매우 제한적으로 치료에 사용되고 있다(T. H. Weller et al., New England J. Med. 309, 1434(1983)). 따라서 예방 차원의 수두백신 개발은 필수적이라 할 수 있다.

지금까지 수두성 질환을 예방하기 위해 많은 연구가 이루어져 왔지만, 주로 고전적인 생백신(live attenuated vaccine)을 이용한 것으로 고도의 유전공학 기술을 이용한 재조합 백신은 아니었다. 생수두 백신은 1975년 일본 오사카 대학의 다까하시(Takahashi) 그룹에 의해서 처음으로 개발된 후, 비켄(BIKEN)사(Oka strain)에서 제품으로 생산하고 있다. 이 백신은 VZV에 대한 예방효과가 우수하지만, 면역 후 예방 가능 기간에 대한 문제점이 일부 제기되어 있을 뿐 아니라(Johnson, C., Rome, et al., Pediatrcs 84, 418-421(1989)), 나아가서는 자연적인 감염의 경우와 마찬가지로 이 백신이 신경절 세포에 잠복되어 있다가 재활성화되어 수두를 일으킬 수도 있다는 보고도 있다(Hardy, I., Gershon, A. A., Steinberg, S. P., and LaRussa, N., Engl. J. Med., 325, 1545-1550(1991); Plotkin, S. A., Starr, S., Connor, K. and Morton, D., J. Infect. Dis., 159, 1000(1989)). 이에 따라, 서브유니트(subunit) 백신과 같이 바이러스 감염을 예방할 수 있지만 잠복 가능성은 없는 새로운 백신의 개발이 요구되고 있다.

헤르페스 바이러스과(Herpes virus family)에 있어서는 이 과에 속한 여러 바이러스에 대한 서브유니트 백신이 개발되어 왔다(Collett, M. S., Adv. Vet. Sci. Comp. Med., 33, 109-172(1989)). 이들 바이러스에 대한 백신 개발은 바이러스의 당단백질을 중심으로 이루어지고 있는데, 이는 이들 당단백질이 매우 유효한 면역 기작을 유발시킬 뿐 아니라 바이러스 감염시 발생되는 세포성 면역반응과 체액성 면역반응을 함께 일으키기 때문이다(Collett, M. S., Adv. Vet. Sci. Comp. Med. 33, 109-172(1989)).

VZV는 1986년 에이. 제이. 데이비슨(A. J. Davison)에 의해 DNA 염기서열이 완전히 밝혀진 이후(A. J. Davison et al., J. Gen. Virol., 67, 1759(1986)) 본격적으로 연구가 진행되어 왔다. VZV의 표면에는 gpI, gpII, gpIII, gpIV 및 gpV로 명명된 5 가지의 당단백질이 존재하는 것으로 알려져 있는데(A. J. Davison et al., Journal of Virology 57, 1195-1197(1986)), 이중에서 gpI과 gpII는 VZV에 대한 중화항체를 만들 수 있는 것으로 알려졌다(S. A. Plotkin, Science, 265, 1383-1385 (1994); C. Sabella et al., J. Virol., 67, 7673(1993)). 특히, 일리노이대학의 바파이(Vafai) 그룹은 유전공학적인 방법으로 백시니아 발현 시스템을 이용하여 BSC-1 세포에서 60kDa 크기를 갖는 gpI를 발현시킨 후 정제하여 토끼에 면역시킨 결과 천연형의 gpI에 상응하는 중화항체를 만들어 낼 수 있음을 보여 주었다(A. Vafai, Vaccine, 11, 937-940(1993); A. Vafai, Vaccine, 12, 1265-1269(1994)). 또한 루드비코바 등은 gpI이 클로닝된 재조합 백시니아 바이러스를 쥐에 주사하여 중화항체를 만들어 낼 수 있음을 보여 주었다(V. Ludvikova, et. al., J. Gen. Virol. 72, 1445-1449(1991)).

한편, 그로스 등은 VZV의 당단백질인 gpII를 단일항체를 이용해서 VZV가 감염된 세포로부터 분리하여 그 생화학적 특성을 분석한 결과, gpII는 약 140kDa의 분자량을 가짐을 확인하였고 이들이 환원상태에서는 66kDa의 분자량을 가진 2개의 서브유니트가 이황화 결합으로 이루어진 약 140kDa의 분자량을 가지는 것으로 보고하였다(Grose, C., et al., Virol., 132, 138(1984)). 또한 마사 등은 VZV gpII의 3'-말단의 소수성 부위를 제거한 것을 백시니아 바이러스 발현시스템에서 발현시키고 발현된 단백질을 토끼에 주사한 결과 VZV에 대한 중화항체를 생성한다고 보고하였다(Massaer, M., et al., J. Gen. Virol., 74, 491(1993)). 야케 등은 VZV gpII의 3'-말단의 소수성 부위를 제거한 것을 선별 유전자로 글루타치온 합성계를 이용한 포유동물 발현벡터에 클로닝한 후 이를 CHO에서 발현시킨 결과, 약 93kDa의 당화된 gpII를 얻을 수 있었으며, 환원상태에서 약 64kDa과 36 내지 39kDa의 서브유니트로 구성되어 있음을 보고하였다(Jacgust, A., et al., Prot. Exp. Purification, 6, 91(1995)).

그러나, 이와 같은 gpII 당단백질을 백신으로 상업화하기 위해서는 경제적인 gpII 당단백질의 발현 및 정제방법이 요구된다. 이에 따라, 경제성에 매우 중요한 요인이 되는 정제 공정상의 순도 및 수율, 재조합 gpII 당단백질의 후-전사 변형(post-translational modification), 면역발생 능력(immunogenicity), 생체내 체류시간(clearance rate), 그리고 항구적인 생산측면을 고려하면, CHO 세포를 숙주로 사용하는 것이 최적의 조건을 제공하게 된다(Charles F. Goochee, Michael J. Gramer, Dana C. Andersen, Jennifer B. Babr and James R. Rasmussen, Bio/Technology 9, 1347-1355(1991)).

본 발명자들은 이상과 같은 연구결과를 종합하여, VZV의 표면항원 gpII 단백질을 천연형과 유사한 형태로 대량발현시키는 방법을 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, VZV에 대해 면역성이 높은 백신 및 치료제의 개발에 상당한 기여를 할 것으로 기대되는 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 VZV의 표면항원 당단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환되어 VZV 표면항원 당단백질을 계속적으로 안정하게 발현시킬 수 있는 동물세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 VZV의 표면항원 당단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 수두 바이러스(VZV)의 표면항원 당단백질 gpII로부터 카복시 말단의 소수성 부위를 제거한 단백질 gpIIs를 코드하는 유전자 및 선별 유전자가 하나의 프로모터에 의해 조절되는 바이시스트로닉 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 차이니스 햄스터 오바리(CHO) 세포주를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 세포주를 배양하는 것을 포함하는 수두 바이러스(VZV) 표면항원 당단백질 gpIIs의 제조방법을 제공한다.

본 발명을 좀 더 상세히 설명한다.

먼저 VZV의 gpII 유전자의 염기서열 정보(A. J. Davison et al., J. Gen. Virol. 67, 1759(1986))로부터, gpII 단백질을 코딩하는 유전자의 5'-말단과 소수성 부위를 제거한 3'-말단에 대응하는 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR이라 함)용 시발체를 고안 합성한다. 이들 시발체를 이용하여 VZV(Strain Ellen)로부터 추출된 DNA를 주형으로 PCR 반응시켜 gpIIs 유전자를 증폭시킨다.

이 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 적절한 발현벡터, 예를 들면 동물세포 발현벡터인 pLCED4 sf tPA(대한민국 특허출원 제 95-6519 호)에 삽입시킨다(pLCED4 gpIIs). 동물세포 발현벡터로는 gpIIs 유전자와 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dihydrofolate reductase: dhfr) 유전자의 mRNA가 한개의 프로모터로부터 전사되도록 하는 바이시스트로닉 벡터를 사용하는데, 예를 들어 pCED2(대한민국 특허출원 제 94-2967 호)에서와 같이, 사이토메가로 바이러스(CMV) 프로모터에 외래 유전자를 넣고 dhfr 유전자 앞에 엔세팔로마이오카디티스(EMC) 바이러스 RNA의 5'-말단 비암호화 부위(5' non-coding region)를 넣음으로써, mRNA가 생성된 후 라이보솜에 의한 번역(translation)이 외래 유전자 및 dhfr 유전자에 모두 일어나도록 한다.

gpIIs 유전자와 dhfr 유전자를 포함하는 발현벡터로 CHO 세포를 형질전환시켜 염색체에 통합(integration)시키고 dhfr의 저해제인 메소트렉세이트(methotrexate: MTX)를 이용하여 dhfr 유전자를 증폭시킨다. 이 때, dhfr 유전자만 선별적으로 증폭되고 gpIIs 유전자가 제거되는 단점을 최소화하여 dhfr⁺ 형질전환 세포의 80 내지 90% 정도가 gpIIs를 발현하는 세포주로 나타났고, dhfr 유전자와 gpIIs 유전자가 연결되어 있기 때문에 dhfr 유전자가 증폭되는 만큼 gpIIs 유전자도 증폭되는 효과를 나타낸다.

gpIIs 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해서, gpIIs 유전자가 클로닝된 발현벡터, 예를 들어 pLCED4 gpIIs를 dhfr 결핍 CHO 세포에 형질전환시키고 알파배지에서 선별배양한다. 형질전환된 세포의 유전자를 증폭시키기 위해 dhfr의 저해제인 MTX를 배지에 포함하여 배양한다(Kaufman R. J. Method in Enzymology, 185, 537- 566(1989)). 초기 농도 0.025μM의 MTX로부터 시작하여 4배씩 MTX 농도를 높여가면서 10μM 농도까지 선별하여 gpIIs 단백질을 5㎎/ℓ 이상 합성할 수 있는 세포주를 개발하였고, MTX 농도를 1mM까지 높일 경우에는 더 많은 양의 gpIIs 단백질 합성을 기대할 수 있게 되었다. 이 세포주 CHO-gpIIs #3은 1995년 11월 29일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 0213BP 호로서 기탁되어 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

실 시 예 1 : VZV 표면항원 당단백질인 gpIIs 유전자의 증폭

(단계 1)

VZV의 gpII 유전자의 염기서열 정보(A. J. Davison et al., J. Gen. Virol. 67, 1759(1986))로부터, 다음과 같은 시발체를 합성하였다:

시발체 PBXGPII(5'-AAAAAGGATCCTCTAGAATGTTTGT TACGGCGGTTGTG-3')는 VZV gpII 유전자의 1번째 아미노산부터 7번째까지의 아미노산을 코드하는 유전자를 포함하고, 동시에 제한효소 BamHI과 XbaI 인지부위를 갖도록 고안되었고,

시발체 PDELXGPII(5'-AAAAACTCGAGTCAAACGGCCTG GCCCGCGGTCCC-3')는 VZV gpII 유전자의 698번째 아미노산에서 해독이 종료되도록 종료코돈을 가지고, 동시에 제한효소 XhoI 인지부위를 갖도록 고안되었다.

(단계 2)

반응튜브에 시발체 PBXGPII 2㎍과 시발체 PDELXGPII 2㎍을 넣고, VZV로부터 추출된 DNA(VZV Strain Ellen, Advanced Biotechnologies Inc., U. S. A.) 10ng을 주형으로 하여 10㎕의 10배 중합완충용액(500mM KCl, 100mM Tris-HCl, pH 9.0, 1% Triton X-100, 2.5mM MgCl₂), 10㎕의 2mM dNTP(각 2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dCTP 및 2mM dTTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 한 후 95℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 40초(어닐링단계), 72℃에서 2분(중합단계)의 조건으로 25회 PCR을 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에서 분리한 결과 약 2100 염기쌍의 핵산이 증폭되었음을 확인하였고, 동일조건의 아가로즈 겔로부터 분리정제하였다. 이하, 이 DNA 단편을 '단편 gpIIs'라 칭한다. 제 1 도는 수두 바이러스의 표면항원 당단백질 gpIIs의 C-말단부위를 제거한 단편 gpIIs의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

실 시 예 2 : 포유동물 세포발현용 벡터인 pLCED4 gpIIs 발현벡터 제조

먼저 플라스미드 pLCED4 sf tPA(대한민국 특허출원 제 95- 6519 호) 2㎍을 NEB 완충용액 2(50mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂, 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)(pH 7.9))의 조건하에서 제한효소 BamH1과 XhoI으로 완전절단한 후, 1% 아가로즈 겔로 약 5.5kb의 핵산 단편을 분리정제하였다. 이하, 이 단편을 단편 'pLCED4-B/X'라 칭한다.

상기 실시예 1의 단계 2에서 얻은 단편 gpIIs를 NEB 완충용액 2의 조건하에서 제한효소 BamHI 과 XhoI으로 완전절단한 후, 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여(이하, 이 단편을 '단편 gpIIs-B/X'라 칭한다) 20㎕의 TE 용액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 용존시켜 다음과 같이 접합반응을 실시하였다.

접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 단편 gpIIs-B/X와 100ng의 단편 pLCED4-B/X를 넣은 다음, 2㎕의 10배 접합반응용액(50mM Tris-HCl(pH 7.8), 10mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨, 1mM ATP, 25㎍/㎖ 소혈청 알부민)과 10 단위체의 T4 DNA 리가제를 넣고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가하여 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다.

반응이 끝난 뒤 대장균 HB101(ATCC 33694)에 형질전환시켜 단편 gpIIs를 함유한 포유동물용 발현벡터 pLCED4 gpIIs를 얻었다.

제 2 도는 수두 바이러스의 표면항원 당단백질 gpIIs의 C-말단부위를 제거한 단편 gpIIs 유전자를 포유동물 세포발현용 바이시스트로닉 벡터인 pLCED4 gpIIs로 클로닝하는 과정을 도시한 것이다.

실 시 예 3 : 포유동물 세포에서 gpIIs의 발현

(단계 1) 동물세포의 형질전환

gpIIs 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해 먼저 dhfr 결핍 CHO 세포(ATCC CRL9096)를 35mm의 플레이트에 15배 정도 희석 분양한 후 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 70 내지 80% 정도 성장한 것을 확인한 후, 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, et al., Virology 52, 456(1973))으로 pLCED4 gpIIs 플라스미드 DNA를 세포내로 형질감염(transfection)시켰다. 이 때 사용한 배지는 10% 송아지 혈청, 하이포산틴(hypoxanthine)과 티미딘(thymidine)이 각각 10㎍/㎖ 함유된 완전 알파배지(complete alpha medium; Minimum Essential Medium(MEM), GibcoBRL Cat. 12000-022)를 사용하였다. 이틀 후에 하이포산틴과 티미딘이 없고 투석된 송아지 혈청이 10% 함유된 알파배지로 교체하여 형질전환된 CHO 세포만이 성장할 수 있도록 선택배양을 하였다. 선택배양 시작일 67 내지 70일 후부터 살아남는 세포의 콜로니가 형성되기 시작하면, 이중에서 성장속도가 양호한 세포들을 직경 100mm 배양접시당 10⁷ 이상이 될 때까지 배양한 후 일부를 동결 보관하고 일부는 유전자 증폭과정을 실시하였다.

(단계 2) 형질전환된 CHO 세포의 gpIIs 유전자 증폭

형질전환된 CHO 세포에서 gpIIs 유전자를 증폭시키는 과정은, dhfr의 저해제인 MTX를 선택배지에 첨가하여 배양하면서 그 농도를 단계적으로 증가시켜, dhfr 유전자와 함께 gpIIs 유전자의 증폭을 유도해 나가는 과정이다. MTX의 농도는 초기에는 0.025μM에서 시작하여 4배씩 증가시켜 나가는데, 각 MTX 농도에서 최소한 2 내지 3회 이상 계대배양을 실시하여 정상적인 CHO 세포의 성상과 성장속도를 보일 때 다음 단계의 MTX로 그 농도를 증가시켰다. 특히 1.6μM의 MTX 농도에서 성장속도가 양호한 13개의 세포군으로 나누어 gpIIs 단백질의 발현량을 측정한 다음, 그중 발현량이 높은 2개의 세포군을 선택하여 더 높은 농도의 MTX 존재하에서 계대배양을 계속하였다.

(단계 3) 세포 배양액으로 분비되는 gpIIs 단백질 발현의 확인

상기 단계 2에서 얻은 각 세포주가 1.6μM의 MTX와 10%의 투석한 송아지 혈청을 함유한 배양액 중에서, 직경 100mm의 배양접시 면적의 50%까지 자라게 되었을 때 무혈청 배양액(Gibco BRL, CHO-S-SFM 11, Cat. No. 12052-023) 3㎖씩으로 2회 세척해 준 다음 1.6μM MTX를 함유한 무혈청 배양액 10㎖로 이틀 동안 배양하였다. 상기 세포 배양액을 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 상등액을 수거하고, 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680 (1970))에 따라 각 상등액 20㎕씩에 20㎕의 소디움 도데실설페이트(SDS)-전기영동(PAGE) 완충용액을 가한 뒤 3 분간 가열하고 12% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동하였다. 겔상에서 분리된 단백질을 토빈의 방법(Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76, 4750(1979))에 따라 니트로셀룰로즈 막으로 전사하였다. 이 막을 0.2%의 젤라틴이 함유된 PBS에 넣고 30 분간 흔들면서 여분 단백질의 흡착부위를 차단시켰다. 이어서, 0.25% 젤라틴, 1% 트리톤 X-100, 그리고 0.02% 티메로살이 함유된 PBS로 500배 희석한 토끼 항-VZV 항체(Cytimmuneㄾ, Cat. No. 06361, Cortex Biochem Inc., U. S. A.)를 가하여 상온에서 1 시간 동안 약하게 흔들면서 반응시켰다. 상기 막을 0.05% 트윈 20이 함유된 PBS로 4회 세척한 다음, 0.25% 젤라틴, 1% 트리톤 X-100, 그리고 0.02% 티메로살이 함유된 PBS로 500배 희석한 서양 고추냉이 퍼옥시다제(Horse Radish Peroxidase)로 표지된 염소 항 토끼 IgG 항체(Goat anti-Rabbit IgG-HRP: American Qualex, Cat. No. A102 PS)를 가하여 상온에서 1 시간 동안 약하게 흔들면서 반응시켰다. 이어서, 상기 막을 0.05% 트윈 20이 함유된 PBS로 4회 세척한 다음, 50mM 트리스 완충액(pH 8.0)으로 2회 세척해 주었다. 이 막을 400㎍/㎖의 4-클로로-1-나프톨과 0.03%의 과산화 수소수가 함유된 50mM 트리스 완충액(pH 8.0)을 가하여 발색시켰다.

제 3 도는 발현벡터 pLCED4 gpIIs로 형질전환된 포유동물 세포에서 발현된 단백질을 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 후 웨스턴 블롯팅(western blotting)한 결과를 나타낸 것이다. 여기에서, 제 1 열은 표준단백질 분자량 표지이고, 제 2 열은 플라스미드 pLCED4 gpIIs를 함유하지 않은 CHO 세포주의 세포내 발현을 나타낸 것이고, 제 3 열은 플라스미드 pLCED4 gpIIs를 함유하지 않은 CHO 세포주의 세포외 발현을 나타낸 것이고, 제 4 열은 플라스미드 pLCED4 gpIIs를 함유한 CHO 세포주 #3 클론의 세포내 발현을 나타낸 것이고, 제 5 열은 플라스미드 pLCED4 gpIIs를 함유한 CHO 세포주 #3 클론의 세포외 발현을 나타낸 것이고, 제 6 열은 플라스미드 pLCED4 gpIIs를 함유한 CHO 세포주 #p5s5 클론의 세포내 발현을 나타낸 것이고, 제 7 열은 플라스미드 pLCED4 gpIIs를 함유한 CHO 세포주 #p5s5 클론의 세포외 발현을 나타낸 것이다.

이상의 결과에서 보듯이, VZV의 gpIIs 단백질은 형질전환된 CHO 세포를 1.6μM 이상의 MTX 존재하에서 선별배양하였을 때 약 95(65kDa과 39kDa) 정도의 크기로 세포외 발현되었음을 알 수가 있다.

제 1 도는 수두 바이러스의 표면항원 당단백질 gpIIs의 C-말단부위를 제거한 단편 gpIIs의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제 2 도는 수두 바이러스의 표면항원 당단백질 gpIIs의 C-말단부위를 제거한 단편 gpIIs 유전자를 포유동물 세포발현용 바이시스트로닉 벡터인 pLCED4 gpIIs로 클로닝하는 과정을 도시한 것이고,

제 3 도는 본 발명의 발현벡터 pLCED4 gpIIs로 형질전환된 포유동물 세포에서 발현된 단백질을 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 후 웨스턴 블롯팅(western blotting)한 결과를 나타낸 것이다.

Claims

수두 바이러스(VZV)의 표면항원 당단백질 gpII로부터 699 내지 868번째 아미노산으로 이루어진 카복시 말단의 소수성 부위가 제거된 단백질 gpIIs를 코드하는 유전자 및 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dhfr) 유전자가 하나의 프로모터에 의해 조절되는 바이시스트로닉 발현벡터.
제 1 항에 있어서,

상기 dhfr 유전자 앞에 엔세팔로마이오카디티스(EMC) 바이러스 RNA의 5'-말단 비암호화 부위 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 1 항에 있어서,

발현벡터 pLCED4 gpIIs.
제 1 항의 발현벡터로 형질전환된 차이니스 햄스터 오바리(CHO) 세포주.
제 4 항에 있어서,

세포주 차이니스 햄스터 오바리 CHO-gpIIs #3(KCTC 0213BP).
제 4 항의 세포주를 메소트렉세이트(MTX)가 첨가된 배지에서 배양하는 단계;

MTX의 농도를 단계적으로 증가시켜 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dhfr) 유전자와 함께 gpIIs 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및

배양액으로부터 발현된 gpIIs 단백질을 분리하는 단계를 수두 바이러스(VZV) 표면항원 당단백질 gpIIs의 제조방법.