KR100408817B1

KR100408817B1 - 헤르페스심플렉스바이러스의당단백질을대량발현시키는동물세포주

Info

Publication number: KR100408817B1
Application number: KR1019950022864A
Authority: KR
Inventors: 김천형; 소호섭; 조중명
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 2004-02-25
Also published as: KR970006485A

Abstract

본 발명은 헤르페스 심플렉스 바이러스 3형(Herpes Simplex Virus-2: HSV-2)의 표면항원 단백질을 계속적으로 안정하게 발현시키는 형질전환된 동물세포주에 관한 것으로, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)의 표면항원 당단백질(gD)로부터 카복시 말단의 소수성 부위를 제거한 단백질(gDs)를 코드하는 유전자 및 선별 유전자가 하나의 프로모터에 의해 조절되는 바이시스트로닉 발현벡터로 형질전환된 CHO 세포주를 배양하여 제조된 HSV-2의 gDs 단백질은 HSV에 대해 면역성이 높은 백신으로 사용될 수 있다.

Description

헤르페스 심플렉스 바이러스의 당단백질을 대량발현시키는 동물세포주

본 발명은 헤르페스 심플렉스 바이러스 2형(Herpes Simplex Virus-2: 이하, "HSV-2"라 함)의 표면항원 당단백질인 gDs 유전자를 계속적으로 안정하게 발현시키는 형질전환된 동물세포주에 관한 것이다. 보다 상세하게는, HSV-2의 표면항원 당단백질인 gD로부터 카복시 말단의 소수성 부위를 제거시킨 gDs의 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 차이니스 햄스터 오바리(ChineseHamster Ovary: 이하, "CHO"라 함) 세포주 및 상기 형질전환된 균주를 이용한 HSV-2의 gDs 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus; 이하 HSV)는 헤르페스 바이러스 속에 속하는 DNA 바이러스로서 약 175nm의 크기를 가지는 비교적 큰 바이러스이며, 인간에게 널리 퍼져 있는 감염체이다. 단순포진 감염은 HSV 1형(이하, "HSV-1"라 함) 및 HSV 2형(이하, "HSV-2"라 함)의 감염으로써, 점막이나 피부를 침범하는 급성 수포성 질환이며 아토피가 있는 사람에게서 흔히 볼 수 있는 감염질환이다. HSV-1은 주로 입과 안구 주위에, HSV-2는 성기 주위에 수포를 형성시킨다. 이러한 HSV의 감염은 면역기능이 저하되어 있는 환자들에게는 그 정도가 심하게 진행되며 경부암의 원인으로도 작용하는 것으로 보고되어 있다(Melnick, J. L., Adam, E. and Rawls, W., Concer, 34, 1355-1385(1974); Cabral, G. A., Fry, D., Marciono-Carbral, F., Lumplcin, C., Mercer, L. and Goplerud, D., Am. J. Obstet. Gynecol., 145, 79-86(1983)). 또한, 신생아나 태아의 경우에는 스스로 HSV 항체를 생성하지 못할 뿐 아니라 모체의 항체가 태아에게 넘어가지 못하기 때문에, 일단 감염되면 대부분 치명적인 결과를 초래하게 된다고 알려져 있다. 현재, HSV-1에 의한 안구질환의 경우는 미국내에서만 일년에 약 50 만명의 환자가 발생하며 이중 1000 명 이상은 안구 이식수술을 받고 있는 것으로 알려져 있다(Nesburn, A. B., Vision Research: national plan 1983-1987, vol. II, part III, The C. V. Mosby Co., St. Louis. (1983); Smith, R. E. et al., Arch. Ophthalmol 98, 1226(1980)). HSV-2의 경우 약 95%는 활동성 병변이 있는 상대방과의 성적 접촉을통해 감염되는 것으로 알려져 있는데, 미국 성인중 약 20∼30%가 HSV-2에 감염되어 있으며, 이중 20 내지 50%는 재발성 성기포진을 갖는 것으로 보고되어 있다(Johnson R. E. et al., N. Engl. J. Med., 321, 7(1989); Breinig M. K. et al., J. Infect. Dis., 162, 299(1990); Langenberg A. et al., Ann. Intern. Med., 110, 882(1989); Koutsky L. A. et al., N. Engl. J. Med., 326, 1533(1992)).

HSV는 초기 감염 후에 피부나 점막 표피세포에서 복제를 시작하여 신경조직을 따라 이동한 후, 전 생애에 걸쳐 척추신경절에 잠복하고 있다가 면역기능이 저하될 경우 재활성화 되어 감염부위로부터 여러가지 질환을 발생시키는 것으로 알려져 있다(Corey L., Sexually transmitted disease, 2nd ed., New York: McGraw Hill, (1990)). HSV에 의한 감염질환에 대한 치료제로는 뉴클레오사이드(nucleoside) 유도체인 아시클로비르(Acyclovir)가 초기감염에 매우 효과적인 것으로 알려져 있으나(Bryson, Y. J. et al., N. Engl. J. Med., 308, 916(1983); Mertz G. J. et al., Am. Med. Assoc., 252, 1147(1984)), 이 약제의 효과를 유지하기 위해서는 약제를 계속적으로 투여해야 하며, 투여가 중단될 경우 HSV에 의한 감염질환이 재발하는 것으로 알려져 있다(Mindel A. et al., Lancet i: 926-928(1988); Straus S. E. et al., N. Engl. J. Med., 310, 1545(1984)). 또한 HSV의 최초 감염에 대한 치료 후 재발하는 경우에는 치사율이 높다고 보고되어 있다(Nahmias, A. J. and Coleman, R. M., Immunobiology of Herpes Simplex Virus Infection CRC Press, Boca Raton, PP. 92-102(1984)).

지금까지 이러한 HSV의 감염을 예방하기 위한 백신이 개발되어 왔으나, 바이러스 자체를 약화시켜 사용하는 생백신(live attenuated vaccine)은 HSV의 게놈이 종양발생(oncogenesis)에 직접 관여한다는 사실이 밝혀짐으로 인해서 그 사용이 금지되어 왔다(Cappel, R., Sprecher, S., De Cuyper, F. and De Braekeleer, J., J. Med. Virol., 16, 137-145(1985)). 따라서, HSV와 감염을 예방하기 위한 백신은 바이러스의 핵산(DNA)이 없어야 하며, 또한 그 기능상 최초 감염의 예방뿐 아니라 잠복되어 있던 바이러스에 의한 재감염도 예방할 수 있어야 한다.

최근에 상기한 기능을 가진 백신을 제조하기 위한 연구들이 진행된 결과, 효능 및 안정성을 고려할 때 HSV의 일부분(subunit)중 특히 gD 당단백질이 백신으로 사용될 수 있음이 밝혀졌다(Torseth, J. W., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Berman, P. W., Lasky, L. A., Cerrni, C. P. et al., J. Virol., 61, 1532-1539(1987)).

HSV에는 표면항원인 당단백질이 8개 존재하며 이중 gD 당단백질은 HSV의 감염시 바이러스의 표면(envelope)부분과 감염되는 세포 표면을 연결시켜 주는 기능을 수행하는 당단백질로써(Campadalli-Fium G et. al., J. Virol, 62, 159(1988)), 바이러스의 초기 감염에 매우 중요한 역할을 수행한다(Campadalli-Fium G et. al., J. Virol,. 166, 598(1988); Fuller, A. O. and Spear, P. G., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84, 5454-5458(1987)). 또한, 중화항체(neutralizing antibody)를 만들어 내는 것으로 알려졌으며(Cohen, G. H., et. al., J. Virol., 27, 172-181(1978)), 세포면역반응(cellular immune responses)의 중요한 표적이 되기도 한다(Blacklaws B. A., Nash, A. A. and Darby, G., J. Gen. Virol., 68, 1103-1114(1987); Martin, S., Moss, B., Berman, P. W., Lasky, L. A. and Rouse, B. T., J. Virol., 61, 726-734(1987)).

버크 등은 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dihydrofolate reductase, 이하 "dhfr"라 함)를 포함하는 유전자와 HSV-1의 gD 유전자 중 카복시 말단의 소수성 부위를 제거한 gD 유전자를 서로 다른 두개의 발현벡터에 클로닝하여 dhfr 결핍 CHO 세포에 동시에 형질전환시킨 다음, 메소트랙세이트(Methotraxate: MTX)로 유전자를 증폭시켜 gD 단백질 발현 세포주를 선별하였고, 정제된 gD 단백질을 기니픽에 접종한 결과, HSV의 1 차 감염을 예방할 수 있을 뿐 아니라 이미 감염된 HSV의 재발을 방지하는 치료 백신으로 사용할 수 있음을 제시하였다(Burke R. L., REV. Infect. Dis., 13, S906(1991); Sanchez-Pescador L. et al., J. Immunol., 141, 1720(1988)). 미시킨 등은 HSV-1을 베로세포(vero cell)에 감염시켜 바이러스를 대량 배양한 다음, 단일항체를 이용한 친화 크로마토그래피로 gD 단백질을 정제하여 쥐, 기니픽, 원숭이 등에 주사한 후 HSV를 감염시킨 결과, 그 예방이 가능할 뿐 아니라 이미 감염된 HSV의 재발도 방지됨을 보여주었다(Mishikin E. M. et al., Viral Immunol., 5, 151(1992)). 또한 번스타인 등은 HSV-2를 베로세포에 감염시켜 배양한 다음 렉틴 크로마토그래피로 gD 단백질을 정제하여 면역 보조제인 이미퀴모드(Imiquimod)와 혼합하여 기니픽에 주사한 후 HSV-2를 감염시킨 결과, 매우 우수한 예방효과가 있음을 보고하였다(Bernstein D. I. et al., J. Infect. Dis., 167, 731(1993)). 미쉬킨 등은 HSV-2의 gD 유전자를 곤충세포 발현벡터에 클로닝하여 발현벡터를 만든 다음 곤충세포에서 57kDa의 분자량을 가진 gD를 발현시켰고, 이를 쥐에 주사한 결과 중화항체가 형성됨을 보여주었다(Landolfi, V. et al., Vaccine, 11, 407(1993)). 또한 코헨 등은 HSV-1의 gD 유전자에서 카복시 말단의 소수성 부위를 제거한 gD 유전자를 멜리틴 리더 염기서열 뒤에 접합시켜 곤충세포에서 발현시킨 결과, gD 단백질이 세포외로 대량 분비됨을 보고하였다(Sisk, W. P. et al., J. Virology, 68, 766(1994)).

그러나, 상기와 같이 HSV를 베로세포에 감염시켜 gD 단백질을 분리정제하는 방법은 수율이나 순도면에서 바람직하지 못하고, 곤충 세포에서 발현시킨 gD의 경우는 당화 정도가 천연형과는 많은 차이가 있다는 문제점이 있다. 또한 CHO 세포주에서의 gD 발현방법은 수율면에서 만족할 만한 결과를 얻지 못하고 있으며, MTX 선별에 의한 dhfr 유전자의 증폭과 gD 유전자의 증폭이 1 : 1 로 나타나지 않기 때문에 수많은 클론을 선별해야 하는 단점을 가지고 있다.

본 발명자들은 이상과 같은 연구결과를 종합하여, HSV-2의 표면항원 gD 단백질을 천연형과 유사한 형태로 대량발현시키는 방법을 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, HSV-2에 대해 면역성이 높은 백신 및 치료제의 개발에 상당한 기여를 할 것으로 기대되는 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 HSV-2의 표면항원 당단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환되어 HSV-2 표면항원 당단백질을 계속적으로 안정하게 발현시킬 수 있는 동물세포 주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 헤르페스 심플렉스 바이러스 2형(HSV-2)의 표면항원 당단백질(gD)로부터 카복시 말단의 소수성 부위를 제거한 단백질(gDs)를 코드하는 유전자 및 선별 유전자가 하나의 프로모터에 의해 조절되는 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 발현벡터로 형질 전환된 차이니스 햄스터 오바리(CHO) 세포주를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 세포주를 배양하는 것을 포함하는, HSV-2 gDs 단백질의 제조방법이 제공된다.

본 발명은 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저 HSV-2의 gD 유전자의 염기서열 정보(Watson R. J. Gene 26: 307(1983))로부터, gD 단백질을 코드하는 유전자의 5'-말단과 소수성 부위를 제거한 3'-말단에 대응하는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)용 시발체를 고안, 합성한다. 이들 시발체를 이용하여 HSV-2(Strain G)로부터 추출된 DNA를 주형으로 PCR 반응하여 gDs 유전자를 증폭시킨다.

이 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 적절한 발현벡터, 예를 들면 동물세포 발현벡터인 pLCED4 sf tPA(대한민국 특허출원 제 95-6519 호)에 삽입시킨다(pLCED4 gDs). 동물세포 발현벡터로는 gDs 유전자와 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dihydrofolate reductase: dhfr) 유전자의 mRNA가 한개의 프로모터로부터 전사되도록 하는 바이시스트로닉 벡터를 사용하였는데, 예를 들어 pCED2(대한민국 특허출원 제 94-2967 호)에서와 같이, 사이토메가로 바이러스(CMV) 프로모터에 외래 유전자를 넣고 dhfr 유전자 앞에 엔세팔로마이오카디티스(EMC) 바이러스 RNA의 5'-말단 비암호화 부위(5' non-coding region)를 넣음으로써, mRNA가 생성된 후 라이보솜에 의한 번역(translation)이 외래 유전자 및 dhfr 유전자에 모두 일어나도록 한다.

gDs 유전자와 dhfr 유전자를 포함하는 발현벡터로 CHO 세포를 형질전환시켜 염색체에 통합(integration)시키고 dhfr의 저해제인 메소트렉세이트(Methotrexate: MTX)를 이용하여 dhfr 유전자를 증폭시킨다. 이 때, dhfr 유전자만 선별적으로 증폭되고 gDs 유전자가 제거되는 단점을 최소화하여, dhfr⁺형질전환 세포의 80 내지 90% 정도가 gDs를 발현하는 세포주로 나타났고, dhfr 유전자와 gDs 유전자가 연결되어 있기 때문에 dhfr 유전자가 증폭되는 만큼 gDs 유전자도 증폭되는 효과를 나타낸다.

gDs 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해서는, gDs 유전자가 클로닝된 발현벡터, 예를 들어 pLCED4 gDs를 dhfr 결핍 CHO 세포에 형질전환시키고 알파배지에서 선별배양한 후, 형질전환된 세포의 유전자를 증폭시키기 위해 dhfr의 저해제인 MTX를 배지에 포함하여 배양한다(Kaufman R. J. Method in Enzymology 185, 537-566(1989)). 초기 농도 20nM MTX로부터 시작하여 4배씩 MTX 농도를 높여가면서 1.6μM 농도까지 선별하여 gDs 단백질을 5mg/L 이상 합성할 수 있는 세포주를 개발하였고, MTX 농도를 1mM까지 높일 경우에는 더 많은 양의 gDs단백질 합성을 기대할 수 있게 되었다. 이 세포주 CHO-gDs는 1995년 6월 23일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 0175BP 호로서 기탁 되어 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 : HSV-2 표면항원 당단백질 gDs 유전자의 증폭

(단계 1)

HSV-2의 gD 유전자의 염기서열 정보(Watson R. J., Gene 26, 307(1983))로부터, 다음과 같은 시발체를 합성하였다:

시발체 PBXGD2(5'-AAAAAGGATCCTCTAGAATGGGGCGTTTGACCTCCGGC-3')는 HSV-2 gD 유전자의 1번째 부터 7번째 아미노산을 코드하는 유전자를 포함하고, 동시에 제한효소 BamHI과 XbaI 인식부위를 포함하고 있다.

시발체 PDELXGD2(5'-AAAAACTCGAGTCAGTCCTGGATCGACGGGATGTG-3')는 HSV gD 유전자의 326번째 아미노산부터 해독이 종료되도록 종료코돈을 가지고 있으며, 동시에 제한효소 XhoI 인식부위를 포함하고 있다.

(단계 2)

반응튜브에 시발체 PBXGD2 2μg과 시발체 PDELXGD2 2μg을 넣은 다음, 주형으로 HSV-2로부터 추출된 DNA(HSV-2 Strain G, Advanced Biotechnologies Inc., U. S. A.) 10ng, 10μℓ의 10배 중합완충 용액(500mM KCl, 100mM Tris-HCI, pH 9.0,1% Triton X-100, 2.5mM MgCl₂),10μℓ의 2mM dNTP(각 2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dCTP 및 2mM dTTP), 2.5단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피를 100μℓ로 한 후 95℃에서 1분(denaturation), 55℃에서 40초(annealing), 72℃에서 2분(Polymerization)의 조건으로 25회 PCR을 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴아미드겔에서 분리한 결과 약 1000 염기쌍의 핵산이 증폭되었음을 확인하였고, 동일 조건의 폴리아크릴아미드겔로부더 분리정제하였다. 이하, 이 DNA 단편을 '단편 gDs'라 칭한다. 제 1 도는 gDs의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

실시예 2 : 포유동물 세포발현용 벡터인 pLCED4 gDs 발현벡터 제조

먼저 플라스미드 pLCED4 sf tPA(대한민국 특허출원 제 95-6519 호) 2μg을 제한효소 BamHI과 XhoI으로 NEB 완충용액 2(50mM Nacl, 10mM Tris-Hcl, 10mM MgCl₂, 1mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol)(pH 7.9))의 조건하에서 완전절단한 후, 1% 아가로오즈 겔로 약 5.5kb의 핵산 단편을 분리정제하였다. 이하, 이 단편을 단편 'pLCED4-B/X'라 칭한다.

상기 실시예 1의 (단계2)에서 얻은 '단편 gDs'를 제한효소 BamHI과 XhoI으로 NEB 완충용액 2의 조건하에서 완전절단한 후, 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여(이하, 이 단편을 단편 'gDs-B/X'라 칭한다) 20μℓ의 TE(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 용액에 용존하여 다음과 같이 접합반응을 실시하였다.

접합 반응튜브에 상기에서 얻은 100ng의 '단편 gDs-B/X'와 100ng의 '단편pLCED4-B/X'를 넣은 다음, 2μℓ의 10배 접합반응용액(50mM Tris-HCl(pH 7.8), 10mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨, 1mM ATP, 25μg/mℓ 소혈청 알부민), 10 단위체의 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20μℓ가 되도록 증류수를 가하여 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다.

반응이 끝난 뒤 대장균 HB101(ATCC 33694)에 형질전환시켜 단편 gDs를 함유한 'pLCED4 gDs'를 얻었다.

제 2 도는 gDs 유전자를 포함하는 플라스미드 pLCED4 gDs의 제작과정을 나타낸 것이다.

실시예 3 : 포유동물 세포에서 gDs의 발현

(단계 1) 동물세포의 형질전환

gDs 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해 먼저 dhfr 결핍 CHO 세포(ATCC CRL9096)를 35mm의 플레이트에 15배 정도 희석 분양한 후 37℃, CO₂배양기에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 70 내지 80% 정도 성장한 것을 확인한 후, 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, et al., Virology 52, 456(1973))으로 pLCED4 gDs 플라스미드 DNA를 세포내로 형질감염(transfection)시켰다. 이 때 사용한 배지는 10% 송아지 혈청, 하이포산틴(hypoxanthine)과 티미딘(thymidine)이 각각 10μg/mℓ 함유된 완전 알파배지(complete alpha medium; Minimum Essential Medium(MED), GibcoBRL Cat. 12000-022)를 사용하였다. 이틀 후에 하이포산틴과 티미딘이 없고 투석된 송아지 혈청이 10% 함유된 알파배지로 교체하여 형질전환된CHO 세포만이 성장할 수 있도록 선택배양을 하였다. 선택배양 시작일 7 내지 10일 후부터 살아남은 세포의 콜로니가 형성되기 시작하면, 이중에서 성장속도가 양호한 세포들이 직경 100mm 배양접시당 10⁷이상이 될 때까지 배양한 후 일부를 동결 보관하고 일부는 유전자 증폭과정을 실행하였다.

(단계 2) 형질전환된 CHO 세포의 gDs 유전자 증폭

형질 전환된 gDs 유전자의 증폭과정은 dhfr의 저해제인 MTX를 선택배지에 첨가하여 세포를 배양하면서 그 농도를 단계적으로 증가시켜, dhfr 유전자와 함께 gDs 유전자의 증폭을 유도해 나가는 과정이다. MTX의 농도는 초기에는 20nM에서 시작하여 4배씩 증가시켜 나가는데, 각 MTX의 농도에서 최소한 2 내지 3회 이상 계대배양을 실시해서 정상적인 CHO 세포의 성상과 성장속도를 보일 때 다음 단계의 MTX로 그 농도를 증가시켰다. 특히 1.6μM의 MTX 농도에서 성장속도가 양호한 13개의 세포군으로 나누어 gDs 단백질의 발현량을 측정한 다음, 그 중 발현량이 높은 P3S1, P3S3 및 P2S1의 3개의 세포군을 선택하여 더 높은 농도의 MTX 존재하에서 계대배양을 계속하였다.

(단계 3) 세포 배양액으로 분비되는 gDs 단백질 발현의 확인

상기 단계 2에서 얻어지는 각 세포주가 직경 100mm의 배양접시에서 1.6μM의 MTX와 10%의 투석한 송아지 혈청을 함유한 배양액에서 배양접시 면적의 50%까지 자라게 되었을 때, 3mℓ씩 무혈청 배양액(Gibco BRL, CHO-S-SFM 11, Cat. No. 12052-023)으로 2회 세척해준 다음 10mℓ의 1.6μM MTX를 함유한 무혈청 배양액으로 이틀동안 배양하였다. 상기 세포배양액을 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 상층액만을 수거한 다음, 100μℓ씩에 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 의해 20μℓ의 소디움 도데실 설페이트(SDS)-전기영동(PAGE) 완충액을 가한 뒤 3 분간 가열하고 12% 폴리아크릴아미드겔상에서 전기 영동하였다. 겔상에서 분리된 단백질을 토빈의 방법(Towbin et al., Proc. NatI. Acad. Sci. U. S. A. 76, 4750(1979))에 의해 니트로셀룰로오즈 막으로 전사하였다. 이 막을 0.2%의 젤라틴이 함유된 PBS에 넣고 30 분간 흔들면서 여분 단백질의 흡착부위를 차단시켰다. 이어서, 0.25% 젤라틴, 1% 트리톤 X-100, 그리고 0.02% 티메로살이 함유된 PBS로 500배 희석한 토끼 항-HSV 항체(American Qualex, U. S. A. Cat. No. R3140)를 가하여 상온에서 1시간 동안 약하게 흔들면서 반응시켰다. 상기 막을 0.05% 트윈 20이 함유된 PBS로 4회 세척한 다음 0.25% 젤라틴, 1% 트리톤 X-100, 그리고 0.02% 티메로살이 함유된 PBS로 500배 희석한 서양 고추냉이 퍼옥시다제(Horse Radish Peroxidase)로 표지된 염소 항 토끼 1gG 항체(Goat anti-Rabbit IgG-HRP: American Qualex, U. S. A., Cat. No. A102 PS)를 가하여 상온에서 1 시간 동안 약하게 흔들면서 반응시켰다. 이어서, 상기 막을 0.05% 트윈 20이 함유된 PBS로 4회 세척한 다음, 50mM 트리스 완충액 (pH 8.0)으로 2회 세척해 주었다. 이 막을 400μg/mℓ의 4-클로로-1-나프톨과 0.03%의 과산화 수소수가 함유된 50mM 트리스 완충액(pH 8.0)을 가하여 발색시켰다. 제 3(A) 도는 12%의 SDS-PAGE 후 겔상에서 분리된 단백질을 쿠마시 블루(Coomassie Brilliant Blue R250)로 염색한 결과를 나타낸 것이다. 여기에서, 제 1 열은 표준 단백질 분자량을 나타낸 것이고, 제 2 열은 플라스미드pLCED4 gDs를 함유하지 않은 CHO 세포주를 나타낸 것이고, 제 3 열 내지 제 15 열은 pLCED4 gDs를 함유한 CHO 세포주 #38 클론(3열), P3S1 클론(4열), P3S2 클론(5열), P3S3 클론(6열), #12 클론(7열), P4S1 클론(8열), P4S2 클론(9열), P2S1 클론(10열), #5 클론(11열), #7 클론(12열), #4 클론(13열), P#1 클론(14열) 및 P#2 클론(15열)을 나타낸 것이다.

제 3(B) 도는 이와 같이 본 발명의 형질전환된 포유동물 세포에서 발현된 단백질의 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기에서, 제 1 열은 표준 단백질 분자량을 나타낸 것이고, 제 2 열 내지 제 6 열은 pLCED4 gDs를 함유한 CHO 세포주 #38 클론(2열), P3S1 클론(3열), P3S3 클론(4열), P2S1 클론(5열) 및 #7 클론(6열)을 나타낸 것이고, 제 7 열은 pLCED4 gDs를 함유하지 않은 CHO 세포주를 나타낸 것이다.

이상의 결과에서 보듯이, HSV-2의 gDs 단백질은 형질전환된 CHO 세포를 1.6μM이상의 MTX 존재하에서 선별배양하였을 때 약 43kDa 정도의 크기로 세포내에서 대량 발현되었음을 알 수가 있다.

제 1 도는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 표면항원 당단백질인 gDs의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제 2 도는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 표면항원 당단백질인 gDs 유전자를 포함하는 플라스미드 pLCED4 gDs의 제조과정을 나타낸 것이고,

제 3(A) 도는 본 발명의 형질전환된 포유동물 세포에서 발현된 단백질의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 결과를 나타낸 것이고,

제 3(B) 도는 본 발명의 형질전환된 포유동물 세포에서 발현된 단백질의 웨스턴 블롯팅 분석(Western Blotting analysis) 결과를 나타낸 것이다.

Claims

헤르페스 심플렉스 바이러스 2형(HSV-2)의 표면항원 당단백질(gD)로부터 카복시 말단의 소수성 부위를 제거한 단백질(gDs)를 코드하는 유전자, 엔세팔로마이오카디티스(EMC) 바이러스 RNA의 5'-말단 비암호화 부위 서열 및 디하이드로플레이트 리덕테이즈(dhfr) 유전자를 순서대로 포함하는 것을 특징으로 하는, gDs 유전자 및 dhfr 유전자가 하나의 프로모터에 의해 조절되는 바이시스트로닉 발현벡터.
제 1 항에 있어서,

발현벡터 pLCED4 gDs.
제 1 항 또는 제 2 항의 발현벡터로 형질전환된 차이니스 햄스터 오바리(CHO) 세포주.
제 3 항에 있어서,

상기 형질전환된 CHO 세포주에 메소트렉세이트(MTX)를 첨가하여 배양함으로써 HSV-2의 gDs 유전자를 증폭시킨 세포주.
제 3 항에 있어서,

세포주 차이니스 햄스터 오바리(CHO)-gDs(KCTC 0175BP).
제 3 항의 세포주를 배양하는 것을 포함하는 헤르페스 심플렉스 바이러스 2형(HSV-2) 표면항원 당단백질(gDs)의 제조방법.