NO172855B

NO172855B - Fremgangsmaate for fremstilling av et herpes simplex virusgd glycoprotein

Info

Publication number: NO172855B
Application number: NO832626A
Authority: NO
Inventors: Roger John Watson; John Haynes Weis; Lynn William Enquist
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1982-07-20
Filing date: 1983-07-19
Publication date: 1993-06-07
Also published as: IE56902B1; PT77014A; IL69269A0; IL69269A; PH21239A; EP0101655B1; DK333183D0; IE831690L; ES8505253A1; PL150654B1; GR78647B; NZ204948A; FI832632A; ES529225A0; NO172855C; DE3382072D1; ES524245A0; ES8504254A1; EP0101655A3; EP0101655A2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et Herpes Simplex Virus gD-glycoprotein med en immunoreaktiv og en antigenisk determinant av et Herpes Simplex Virus gD-glycoprotein.

Foreliggende oppfinnelse utnytter rekombinant-DNA-teknikker til å innføre en DNA-sekvens som koder for glycoprotein D (gD), eller en del derav, i en DNA-vektor som viral-DNA, plasmid-DNA eller bakteriofag-DNA, slik at vektoren er i stand til å replikerer og styre ekspresjon av gD-genet i en bakteriell vert eller annet en-cellesystem. Det resulterende rekombinante DNA-molekylet innføres i vertsceller for å muliggjøre produksjon av gD, eller en del eller molekylær variant derav, av vertscellene. Det fremstilte proteinet isoleres derefter, renses og modifiseres for anvendelse som et immunogen i en vaksine mot infeksjon av både HSV type 1 (HSV-1) og type 2 (HSV-2).

REKOMBINANT DNA- TEKNOLOGI OG GEN- EKSPRESJON.

Rekombinant DNA-teknologi omfatter innføring av bestemte DNA-sekvenser i et overføringsmiddel for DNA (vektor) slik at det dannes et rekombinant DNA-molekyl som er i stand til replikasjon i en vertscelle. Vanligvis er den innførte DNA-sekvensen fremmed for det mottagende overføringsmidlet for DNA, det vil si den innførte DNA-sekvensen og DNA-vektoren er avledet fra organismer som ikke utveksler genetisk infor-masjon i naturen, eller den innførte DNA-sekvensen kan være fullstendig eller delvis syntetisk fremstilt. I de senere år er flere generelle fremgangsmåter utviklet som muliggjør oppbygging av rekombinante DNA-molekyler. For eksempel beskriver US-PS 4 237 224 fremstilling av,slike rekombinante plasmider ved å bruk restriksjonsenzymer og fremgangsmåter som er kjent som ligering. Disse rekombinante plasmidene innføres så og replikeres i encellede organismer ved hjelp av transformasjon.

En annen fremgangsmåte for å innføre rekombinante DNA-molekyler i encellede organismer er beskrevet av Colling og Hohn i US-PS 4 304 863. Denne fremgangsmåten benytter et omslutnings/transduksjonssystem med bakteriofagvektorer.

Uansett hvilken fremgangsmåte som brukes for oppbygging, må det rekombinante DNA-molekylet være forenelig med vertscellen, det vil si være i stand til autonom replikasjon i vertscellen. Det rekombinante DNA-molekylet bør også ha en markørfunksjon som tillater utvelgelsen av vertsceller som således er transformert av det rekombinante DNA-molekylet. Dersom i tillegg alle de passende replikasjons-, transkrip-sjons- og translasjonsignalene er korrekt arrangert på plasmidet, vil det fremmede genet bli riktig uttrykt i de transformerte cellene og i deres avkom.

Slik det er karakteristisk for alle viruser som infiserer eukaryote celler, krever Herpes Simplex Virus et eurykaryot vertscellesystem for å replikere sitt genom, uttrykke sine virale gener og frembringe sitt avkom. Signalene og kontrollelementene for DNA-replikasjon, genekspresjon og virussamling i eukaryoter, adskiller seg fra de i prokaryoter. Dette er av kritisk viktighet når forsøk gjøres på å uttrykke i prokaryote-vertsceller et gen som naturlig uttrykkes bare i eukaryote celler.

Disse forskjellige genetiske signalene og fremstillings-innslagene kontrollerer mange nivåer av genekspresjon, for eksempel DNA-transkripsjon og budbringer-RNA-translasjon. Transkripsjon av DNA er avhengig av nærværet av en promoter som er en DNA-sekvens som styrer bindingen av RNA-polymerase og derved fremmer transkripsjon. DNA-sekvensen hos eukaryote promotere adskiller seg fra de hos prokaryote promotere. Videre kan eukaryote promotere og ledsagende genetiske signaler ikke bli gjenkjent i, eller kan ikke virke i, et prokaryotisk system.

På samme måte avhenger translasjon av budbringer-RNA (mRNA) i prokaryoter av nærværet av de passende prokaryote signalene som adskiller seg fra de hos eukaryoter. Virksom translasjon av DNA i prokaryoter krever et ribosombindingssete kalt "Shine Dalgarno" (SD)-sekvensen på mRNA. Denne sekvensen er en kort nukleotidsekvens av mRNA som er lokalisert foran startkodonet (AUG) som koder for metioninet i aminoenden av proteinet. SD-sekvensene er komplementære til 3'-enden av 16S rRNA (ribosomal RNA) og fremmer sannsynligvis binding av mRNA til ribosomer ved dupleksering med rRNA for å gi mulighet til korrekt posisjonering av ribosomet. For en oversikt over hvordan man gjør genekspresjon maksimal skal det henvises til Roberts og Lauer, 1979, "Methods in Enzymology", 68:473.

Mange faktorer kompliserer ekspresjonen av eukaryote gener i prokaryoter selv efter at de passende signalene er innført og plassert i en hensiktsmessig stilling. En klar forståelse av disse faktorers natur og mekanismene som de virker ved, mangler for tiden. En slik faktor er nærværet av et aktivt proteolytisk system i E. coli og andre bakterier. Dette protein-nedbrytende systemet synes selektivt å ødelegge "unormale" eller fremmede proteiner slik som eukaryote proteiner. En veldig nytte ville derfor bli frembragt ved utviklingen av et middel for å beskytte eukaryote proteiner uttrykt i bakterie mot proteolytisk nedbrytning. En strategi er å konstruere hybridgener hvor den eukaryote sekvensen er bundet i fase (det vil si i den korrekte avlesningsramme) med et prokaryotisk gen, noe som resulterer i et sammensatt proteinprodukt (et protein som er en hybrid av prokaryote og fremmede eller eukaryote aminosyresekvenser.

Konstruksjon av hybridgener var fremgangsmåten som ble brukt ved den molekylære kloning av gener som koder for et antall eukaryote proteiner som somatostatin, rotte-proinsulin, veksthormon og ovalbuminlignende proteiner. Dertil er prokaryote promotere blitt bundet til slike sammensatte gensekvenser i tilfellet med ovalbumin og p<->globin (Guarente et al., 1980, "Cell", 20: 543). Systemet til Guarente et al. omfatter Innføring av lac-promoteren, inkludert SD-sekvensen, i varierende avstander foran i ATG i det sammensatte genet. Selv om den molekylære kloning og ekspresjon av flere eukaryote gener er utført, har dette hittil ikke vært gjort med gD-genet. Teknikkens stand er heller ikke slik at ekspresjon av fremmede eller eukaryote gener i prokaryote vertsceller kan utføres rutinemessig.

VAKSINER.

Det er tre grunnleggende fremgangsmåter for å kontrollere og behandle virusinfeksjoner: (1) vaksiner som utløser en aktiv immunrespons, (2) kjemoterapeutiske midler som inhiberer virusreplikasjon og (3) midler som induserer syntesen av interferon. Alle tre kan brukes for å forhindre infeksjon, men er mer virksomme når de anvendes tidlig under infeksjonen. Vaksinasjon eller aktiv immunisering er vanligvis uvirksom efter at infeksjonen har begynt.

Vaksiner fremstilles vanligvis ved å gjøre et virus uskadelig uten å ødelegge dets immunologiske egenskaper. Tradisjonelt utføres dette enten ved å inaktivere virusets infeksjonsevne (det vil si "drepe" viruset, vanligvis ved behandling med forskjellige kjemiske midler som formaldehyd) for anvendelse i inaktiverte vaksiner, eller ved å velge ut et ikke-virulent eller svekket (modifisert) virus for anvendelse i levende vaksiner (svekkede vaksiner). Svekking oppnås ved å tilpasse viruset til uvanlige betingelser (til andre dyreverter og cellekulturer) og ved hyppige overføringer av store virus-inokula for å velge ut mutanter som har mistet virulens og følgelig ikke gir noen symptomer eller bare små symptomer. Noen få vaksiner som fortsatt brukes i veterinærpraksis, består av fullt virulente, smittsomme viruser injisert på et sete hvor virusformering er av liten betydning. Denne fremgangsmåte har vært betraktet som for farlig for anvendelse på mennesker.

Svekkede vimser som brukes i levende vaksiner er vanligvis utmerkede immunogener på grunn av at de svekkede viruser formerer seg i verten og følgelig frembringer langvarig immunitet. Svekkede vaksiner induserer antistoffer i kroppsvæsker rettet mot alle virale antigener, både over-flateantigener og indre antigener i viruspartikkelen. Man støter imidlertid på en rekke problemer ved anvendelsen av levende vaksiner, slik som utilstrekkelig svekking av viruset, genetisk ustabilitet hos viruset, forurensing med fremmedvirus i cellekulturer som brukes til å dyrke vaksine-viruset og endelig ustabilitet av vaksinen (for eksempel varmelabil).

Mens man ved bruken av inaktiverte vaksiner (anvendelse av "drepte" eller inaktiverte viruser som ikke formerer seg) unngår vanskelighetene som følger med bruken av levende vaksiner, formerer drepte viruser seg ikke i det immuniserte dyret og frembringer vanligvis antistoffer som bare er rettet mot overflatebestanddeler. Hovedvanskeligheten med inaktiverte vaksiner ligger imidlertid i det å produsere tilstrekkelig med virus til å gi den nødvendige mengde relevant antigen. Andre vanskeligheter som følger med bruken av inaktiverte vaksiner, er at immuniteten som oppnås er kortvarig og ofte krever tilleggsimmuniseringer, de anti-geniske setene kan endres av den inaktiverende kjemiske behandlingen og følgelig bli mindre immunogene eller kan indusere antistoffer som er mindre effektive til å nøytrali-sere virusinfeksjoner, og vaksinene induserer ofte ikke tilstrekkelig høye nivåer med IgA.

Vaksiner som består av underenheter, inneholder bare det nødvendige og relevante immunogene materialet, slik som kapsid-proteinene fra tjueflatede viruser uten kapsel eller peplomerende (glycoproteinspisser) fra virus med kapsel. Underenhetsvaksiner kan fremstilles ved å isolere den relevante underenhet fra godt rensede virusfraksjoner, eller ved å syntetisere det relevante polypeptidet. En hovedfordel med underenhetsvaksiner er utelatelsen av genetisk materiale av virusopprinnelse og av verts- eller giver-avledede stoffer som virker forstyrrende inn. For tiden er imidlertid fremstilling av underenhetsvaksiner ved å bruke disse fremgangsmåtene for kostbar for utstrakt kommersiell bruk. Rekombinant DNA-teknologi har mye å by på ved fremstillingen av underenhetsvaksiner; den molekylære kloning og vertscelle-ekspresjon av virusgener som koder for de relevante immunogene delene av viruset eller dets proteiner, kan fremstille tilstrekkelige mengder av det relevante immunogenet for anvendelse i en underenhetsvaksine.

Vaksiner administreres ofte i en emulsjon med forskjellige hjelpestoffer. Hjelpestoffene bidrar til å oppnå en mer varig og et høyere nivå av immunitet under anvendelse av mindre mengder antigen i færre doser enn dersom immunogenet ble administrert alene. Mekanismen for hjelpestoffvirkning er kompleks og er ikke fullstendig forstått. Den kan imidlertid omfatte stimuleringen av fagocytose og andre virkninger i retikuloendotelialsystemet likeså vel som en forsinket frigivelse og nedbrytning av antigenet. Eksempler på hjelpestoffer er Freunds hjelpestoff (fullstendig eller ufullstendig), "Adjuvant 65" (som inneholder peanøttolje, mannid-monooleat og aluminium-monostearat), og mineralgeler, slik som aluminiumhydroksyd, aluminiumfosfat eller alum. Freunds hjelpestoff brukes ikke lengre i vaksinepreparater for mennesker eller for dyr som skal brukes til mat, fordi det inneholder ikke-metaboliserbar mineralolje og er et potensielt karcinogen, mineralgenene brukes imidlertid i utstrakt grad i kommersielle vaksiner for dyr.

HERPES VIRUS.

Herpes Virus (Herpetoviridae) er store DNA-virus som er kjent for å etablere latente infeksjoner som kan vedbli gjennom hele livet til verten. Efter den første infeksjon, som ikke behøver å komme til syne, forblir viruset uvirksomt inntil det reaktiveres av ett eller flere antatte stimuli som bestråling eller Immunosuppresjon.

Den aktive tilstanden eller akutte formen av infeksjonen er kjennetegnet ved en produktiv eller lytisk infeksjon, det vil si at viruset replikerer, tar over vertscellens maskineri, produserer fullt utviklede, smittsomme viruspartikler og forårsaker celledød. I den latente tilstanden befinner imidlertid viruset seg i gangliene til verten, og det er lite som tyder på produksjon av smittsomt virus under latens-perioden.

Dé fleste primære infeksjonene oppstår under barndommen og kan være upåaktet. Infeksjon kan skyldes virusinokulering i en slimhinne eller innføringen av virus i huden via et brudd på den epidermale overflaten. Det smittsomme viruset kan således overføres ved nærkontakt. Når man først har fått det, beholdes HSV i kroppen gjennom hele livet og offeret er gjenstand for gjentatte angrep som kan være uten symptomer eller gi en rekke kliniske utslag, slik som slimhinne-sykdommer omfattende herpes labialis (sår på leppen som vanligvis kalles "blemmefeber" eller "forkjølelsessår"), gingivostomatitis (munnen og tannkjøttet blir dekket med blærer som sprekker og blir til sår), pharyngitis, tonsil-litis, keratoconjuctivitis (keratitis eller betennelse av øyets hornhinne som utvikler seg til et dendrittisk sår som til sist kan føre til arrdannelse på hornhinnen og resulterer i blindhet) og genital herpes. Mer sjeldent kan HSV-infeksjon forårsake encephalitis, herpes eksem, traumatisk herpes, hepatitis og neonatal herpes.

Under aktive utbrudd kan smittsomt virus isoleres fra sårene eller fra omgivende væsker, for eksempel fra spytt i tilfellet med herpes labialis. Disse sårene som har en tilbøyelighet til å bryte ut på den samme delen av kroppen hos ethvert bestemt individ, fremkalles av en rekke stimuli som menstruasjon, overdreven eksponering for sollys eller kald vind, hypofyse- eller binyrehormonet, allergiske reaksjoner eller mest vanlig, feber. Under slike utbrudd avgir ofrene virus og kan spre smittsomt virus til andre ved kontakt.

Under det latente stadiet av infeksjonen, har forskere påvist at viruset oppholder seg i et område som er forskjellig fra det hvor sårene senere dannes. Viruset er i dette hvile-stadiet blitt lokalisert i neuronene i sanseorganenes ganglier (i tilfelle med ansiktssår, er vanligvis trigeminus gangliet involvert) og kan ikke isoleres fra det vanligvis berørte området.

Selv om de fleste barn kommer seg raskt igjen efter primær-infeksjonen, overmanner av og til utspredt neonatal herpesinfeksjon kjennetegnet ved hepatitis det angrepne nyfødte spedbarn. De fleste fatale infeksjoner er ervervet ved fødselen fra smittsomme tilstedeværende eller, mer vanlig, fra en smittsom mor når et spedbarn støter på genital herpes i morens fødselskanal. Vulvovaginitis hos kvinner og barn samt infeksjoner i penis ble tidligere antatt å være forårsaket av HSV-2, nyere resultater indikerer imidlertid at enten HSV-1 eller HSV-2 kan være det forårsakende midlet, dertil har venerisk herpesinfeksjon hos kvinner vært forbundet med kreft i livmorhalsen.

I dagens samfunn har herpesinfeksjon nådd epidemisk omfang. For tiden finnes det ikke noe middel mot HSV-infeksjoner og vanlige behandlinger omfatter bruken av forbindelser som inhiberer DNA-syntese. Disse forbindelsene er selvfølgelig ikke-selektive på den måten at de inhiberer cellulær DNA-syntese hos celler som deler seg like så vel som DNA-syntesen hos virus. Dertil er disse forbindelsene nyttige bare under aktiv infeksjon og har hittil ikke hatt noen påvisbar virkning under latensperloden.

Herpes Virus er virus hos eukaryoter og inneholder et rettkjedet, dobbeltkjedet DNA-genom som varierer I størrelse fra 80 x IO<6> til 150 x IO<6> dalton. Hver viruspartikkel har et nukleokapsid med 20 flater og en membrankapsel som dannes ved fjerning fra det cellulære doble lipidlaget hos verten Under modning og okulering. Viruskapselen er et dobbelt lipidlag som inneholder en rekke virus-spesifikke proteiner som selv om de er delvis innleiret i membranen, stikker ut fra membrankapselen. Under primærinfeksjon er membrankapselen nødvendig for den effektive inntrengning av viruspartikkelen i cellen. Antistoffer som bindes spesifikt til virusproteinene på utsiden av det doble lipidlaget, er i stand til å nøytralisere virusets infeksjonsevne. De virusproteinene som er viktigst for virusets inntrengning i cellen, er glycoproteiner (proteinmolekyler med tilknyttede sukker-molekyler). Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1) og type 2 (HSV-2) produserer hver minst fire forskjellige glycoproteiner som er antigenisk forskjellige fra hverandre. Visse av disse proteinene fra HSV-1 og HSV-2 har de samme epitoper (det vil si antigene seter eller antistoff-bindende seter). Et eksempel på et slikt protein er et 49 000 til 58 000 dalton stort glycoprotein betegnet gD. Polyvalent antiserum mot HSV-1 gD er i stand til å nøytralisere både HSV-1- og HSV-2-infeksjoner (Norrild, 1979, "Current Topics in Microbiol." og "Immunol.", 19: 67).

Foreliggende oppfinnelse tar sikte på å forbedre den kjente teknikk og angår således en fremgangsmåte av den innlednings-vis nevnte art og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at den omfatter: a) å dyrke en Escherichia coli-bakterie valgt blant de med ATCC-aksessnumrene 39 159 og 39 160 og NRRL-aksessnumrene B-15449, B-15450, B-15451 og B-15471, inneholdende en rekombinant vektor omfattende en DNA-sekvens som koder for et Herpes Simplex Virus gD-glycoprotein med en immunoreaktiv og antigenisk determinant av Herpes Simplex Virus type 1 gD-glycoprotein som angitt i figur 3 eller type 2 gD-glycoprotein som angitt i figur 12 og i stand til å kunne replikeres, transkriberes og translateres i nevnte Escherichia coli-bakterie; og

b) isolering av polypeptidet fra kulturen.

HSV-1 gD-genet (Isolert fra HSV-1 Patton-stamme) ble

identifisert i virusgenomet ved intertypisk rekombinasjons-analyse og mRNA-kartlegging. Når den først var lokalisert på en bestemt del av DNA, ble nukleotidsekvensen til genet bestemt og aminosyresekvensen til gD-proteinet ble forutsagt.

HSV-2 gD-genet (isolert fra HSV-2 stamme G) ble identifisert i virusgenomet ved å trekke analogt med lokaliseringen av gD i HSV-l-genomet og ved hybridiseringsanalyse.

De isolerte gD-genene eller genfragmentene (type 1 eller type 2) ble derefter innført i plasmidvektorer for å danne rekombinante plasmider som tjener som biologisk funksjonelle replikasjonsenheter. Disse rekombinante plasmidene ble konstruert for å tilfredsstille både replikasjonen og ekspresjonen av gD-genene efter transformasjon av forenelige vertsceller. Dertil gir plasmidene en en-trinns identifika-sjon av transformerte mikroorganismer som aktivt eksprimerer gD-genene. Til slutt beskrives fremgangsmåter for å isolere de uttrykte genproduktene og for anvendelse ved utforming av en vaksine.

Foreliggende oppfinnelse kan forstås mer fullstendig ved henvisning til den følgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen, eksemplene på bestemte utførelsesformer av oppfinnelsen og de vedlagte figurene hvor: Figur la forestiller HSV-l-genomet og angir lokaliseringen av det korte enestående området (Us) hvor gD-genet til HSV-1 ligger (herefter henvist til som gD-l-genet). Figur lb forestiller et restriksjonskart for HSV-1 EcoRI-H-fragmentet innført i \-gtWES::EcoRI-H. Bare de restriksjonssetene som er relevante for rede-gjørelsen er inntegnet. Restriksjonsenzymer som gjenkjenner sekvenser er forkortet på følgende måte: BamHI (Ba4 til Ba8), Bglll (Bg2), BstEII (Bs), EcoRI (RI), Hindlll (H3), Kpnl (Kp), Puvll (Pv), Sacl (Sc), Sali (Sa) og Xhol (Xh). Figur lc forestiller konstruksjonen av pRWF6 som omfatter en innføring av BamHI-8- til BamHI-7-fragmentet av X-gsWES:EcoRI-H i pBR322. Figur ld forestiller restriksjonskartet for HSV-1 Sac-1 DNA-fragmentinnføringen i pSC30-4. Boksen (utvidet område) angir beliggenheten og posisjonen for den gD-1 mRNA kodende sekvensen. Figur 2 forestiller strategien for sekvensbestemmelse og restriksjonskartet for gD-gensekvensen. Det kodende området er angitt med en boks (utvidet område) og det ikke-kodende området med en enkelt linje. Spaltingsseter for restrisjonsendonukleasen som brukes til fragmentisolering, merking og sekundær nedbrytning, er angitt. Horisontale piler angir områdene med sekvensbestemmelse av DNA: De som ligger over restriksjonskartet indikerer at den ikke-kodende kjedesekvensen ble bestemt, de som ligger under restriksjonskartet indikerer at templatkjeden ble sekvensbestemt. Figur 3 forestiller nukleotidsekvensen til gD-l-genet og den forutsatte aminosyresekvensen til gD-l-proteinet. Aktuelle restriksjonsseter er avmerket og de nummererte vertikale pilene ved den amino-kodende enden av gD-1 angir sammenbindings seter hos den gD-1-amino-kodende enden til pJS413 i de følgende rekombinante plasmidene: pEH51, pEH60, pEH62, pEH66, pET71, pEH73 og pEH74 som inneholder resten av gD-1-sekvensen til dens naturlige TAG, og pEH4-2-, pEH82-, pEH3-25- og pEH90-N-seriene som koder for Cro/gD-l/<p->galaktosidase-sammensatte proteiner. De nummererte vertikale pilene ved den karboksylsyre-kodende enden av gD-1 angir sammenbindingsseter hos den gD-l-karboksylsyre-kodende enden til (1) g-galaktosidasegenet (z-gen), til pJS413 i de følgende rekombinante plasmidene: pEH4-2, pEH82, pEH3-25 eller (2) z-genet til pHK414 i pEH90-N-seriene av plasmider. Figur 4 (ikke tegnet i riktig målestokk) forestiller konstruksjonen av pEH25, et rekombinant plasmid avledet fra en del av gD-l-genet, og pJS413, en ekspresjonsvektor for E. coli. Det rekombinante plasmidet pEH25 styrer produksjonen av et HSV-1 gD-beslektet protein, kodet for av omtrent 87# av den gD-l-kodende sekvensen bundet til en "styrer"-sekvens (cro), avledet fra ekspresjonsvektoren. Figur 5 forestiller DNA-sekvensen og forutsagt aminosyre-sekvens for Cro/gD-l-sammenblndingspunktet i pEH25. Figur 6 viser inhiberingen av immunoutfelling av pEH25 gD-produktet ved tilsetningen av konkurrerende antigener som er til stede i lysater av HSV-infiserte HeLa-celler. De åpne sirklene angir lysater av ikke-infiserte HeLa-celler (kontroller), de åpne boksene angir lysater av HeLa-cellene infisert med HSV-1. Figur 7 (ikke tegnet i riktig målestokk) viser oppbyggingen av pEH4-2, et gD-l-ekspresjonsplasmid avledet fra pEH25, hvor 205 mikleotider (69 aminosyrer) fra 3<*->enden av den gD-l-kodende sekvensen er fjernet og erstattet med omtrent 3000 ytterligere nukleotider som koder for 3-galaktosidaseproteinet til E. coli. Dette rekombinante plasmidet åpner muligheten for fremstillingen av et "sandwich"-protein (eller sammensatt protein) med E. coli-forbundne polypeptider (det vil si Cro og P-galaktosidase) bundet til hver ende av det gD-l-spesifikke proteinet. Figur 8 (ikke tegnet i riktig målestokk) forestiller en fremgangsmåte for å fremstille en rekke gD-1-ekspresjonsplasmlder, pEH50+x, som hver Inneholder en variabel del av den amino-kodende enden av gD-genet . Figur 9 (Ikke tegnet i riktig målestokk) forestiller en fremgangsmåte for å gjenoppbygge den amino-kodende enden av gD-l-genet i pEH4-2 slik at et gD-1-protein, bundet til p<->galaktosidase, eksprimeres av vertsceller transformert med pEH82. Figur 10 (Ikke tegnet i riktig målestokk) forestiller konstruksjonen av pEH90-10 am, et gD-l-ekspresjonsplasmid avledet fra pEH3-25 og pHK414. Figur lia forestiller HSV-2-genomet og angir beliggenheten av BglII-fragmentet innenfor det korte, enestående området (Us) hvor gD-genet til HSV-2 ligger (herefter kalt gD-2-genet). Bglll-restriksjonssetene som definerer L-fragmentet er angitt som Bg. Figur 11b forestiller et restriksjonskart for Bglll L-fragmentet innført i pHVl. Bare relevante gjenkjenningsseter for restriksjonsendonuklease er angitt. Gjenkjenningsseter for restriksjonsenzym er forkortet på følgende måte: BamHI (BA), BglII (Bg), Clal (C), Hindlll (H3), PvuII (Pu), Sali (Sa), SacI (Sc), SphI (Sp) og Xhol (Xh). Boksen (utvidet område) angir beliggenheten av og posisjonen for den gD-2 mRNA-kodende sekvensen. Figur lic forestiller restriksjonskartet for HSV-2 Xhol DNA-fragment innført i pHV2. Figur 12 forestiller nukleotidsekvensen for gD-2-genet og den forutsagte aminosyresekvensen for gD-2-proteinet. Aktuelle restriksjonsseter er angitt og de nummererte vertikale pilene ved den amino-kodende enden av gD-2-genet angir sammenbindingssetene for den gD-2-amino-kodende enden til pJS413 i rekombinante plasmider pHV5 (som inneholder hele den karboksylsyre-kodende enden av gD-2) og pHV6. BamHI-setet er sammenbindingssetet for den gD-2-karboksylsyre-kodende enden til z-genet hos pHK414 i pHV6. Figur 13 viser en sammenligning av de forutsagte aminosyre-sekvensene til gD-1 og gD-2. Aminosyrerester er angitt med en-bokstavkoden. Aminosyrerester som er homologe i gD-1 og gD-2 er angitt med prikker i gD-2-sekvensen. gD-2-sekvensen er en aminosyrerest kortere enn gD-l-sekvensen. Den manglende aminosyren i gD-2 er angitt med en stjerne (<*>). Figur 14 (ikke tegnet i riktig målestokk) forestiller konstruksjonen av pHV5, et rekombinant plasmid avledet fra en del av gD-2-genet og pJS411. Det rekombinante plasmidet pHV5 styrer produksjonen av et HSV-2 gD-beslektet protein kodet for av omtrent 90% av den gD-2-kodende sekvensen bundet til en "styrer"-sekvens (Cro), avledet fra ekspresjonsvektoren. Figur 15 forestiller konstruksjonen av pHV6, et gD-2-ekspresjonsplasmid avledet fra pHV5, hvor 259 nukleotider (86 aminosyrer) fra 3'-enden av den gD-

2-kodende sekvens er fjernet og erstattet med omtrent 3000 ytterligere nukleotider avledet fra ekspresjonsplasmidet pEK414 som koder for —galak-tosidaseproteinet fra E. coli. Det rekombinante plasmidet pHV6 åpner muligheten for produksjon av et "sandwich"-protein (eller sammensatt protein) med E. coli-forbundne polypeptider (det vil si Cro og p-galaktosidase) bundet til hver ende av det gD-2-spesifikke proteinet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelsen av rekomblnant-DNÅ-teknikker for å fremstille polypeptider beslektet med HSV-protelner som kan brukes som immunogener i vaksinepreparater. Nærmere bestemt er fremstillingen av gb-beslektede proteiner beskrevet. Eftersom polyvalent antiserum rettet mot HSV-1 gD er i stand til å nøytralisere både HSV-1 og HSV-2, kan det rene gD-proteinet eller enhver antigen signifikant del derav, brukes som en underenhetsvaksine som effektivt vil beskytte mottageren både mot HSV-1- og HSV-2-primærinfeksjoner.

De rekombinante plasmidene, konstruert som her beskrevet, gir hver celleproduksjon av et protein som er et gD-beslektet polypeptid og som er stabilt og resistent mot vertscellé-nedbrytning, slike plasmider muliggjør genereringen av store mengder av et gD-beslektet protein eller sammensatt protein som inneholder immunologiske og antigene determinanter av gD. DNA-preparatene som her er beskrevet er imidlertid ikke begrenset til produksjon av et gD-beslektet protein, og kan brukes til å fremstille polypeptider beslektet med hvilke som helst av HSV-proteinene. Det vil lett ses at forskjellige immunogener og vaksinepreparater kan fremstilles.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan deles opp i de følgende trinn av hensyn til beskrivelsen: (1) Identifisering og isolering av HSV-glycoproteingenet eller -genfragmentet, (2) innføring av genet eller genfragmentet i en klonende ekspresjonsvektor hvorved man får et rekombinant DNA-molekyl som brukes til å transformere en-celleorganismer, (3) identifisering og dyrking av de transformerte en-celle-organismene som er i stand til å replikere og uttrykke genet,

(4) identifisering og rensing av genproduktet og

(5) bestemmelse av immunopotensen til genproduktet ved vurdering av dets evne til å frembringe produksjon av

nøytraliserende antistoffer.

Av hensyn til klarheten vil hele fremgangsmåten bli omtalt i forbindelse med gD-genet. De samme teknikkene kan imidlertid anvendes i en analog form for på lignende måte å fremstille et polypeptid beslektet med et hvilket som helst av HSV-glycoproteinene.

IDENTIFISERING OG ISOLERING AV HSV- GLYCOPROTEINGENER.

HSV-glycoprotein(gD)genet kan erholdes fra enhver HSV-type 1-eller -type 2-stamme. Isolering gD-genet (eller en del derav (omfatter først å isolere HSV-DNA, genere HSV-DNA-fragmentet og identifisere fragmentene som Inneholder glycoprotein-gensekvensene. Før identifisering, bindes vanligvis HSV-DNA-fragmentene inn i klonende vektorer som brukes for å transformere vertsceller, dette muliggjør generering av mange kopier av HSV-DNA-fragmentene, slik at et stort forråd er tilgjengelig for analyse og identifisering.

HSV-DNA kan erholdes enten

(1) ved å isolere DNA direkte fra virus renset fra eukaryote celler Infisert med viruset eller (2) fra bakteriofager eller plasmider som inneholder endel av virusgenomet med gD-genet.

For å generere HSV-DNA-fragmentene, kan DNA spaltes ved bestemte seter under anvendelse av restriksjonsenzymer, eventuelt kan man bruke DNase i nærvær av mangan for å dele opp DNA, eller DNA kan spaltes fysisk, for eksempel ved lydbehandling. De rettkjedede DNA-fragmentene kan derefter separeres efter størrelse ved hjelp av standard teknikker inkludert, men ikke begrenset til, agarose- og polyakrylamid-gelelektroforese og kolonnekromatografi.

Det kan brukes et hvilket som helst restriksjonsenzym eller kombinasjoner av restriksjonsenzymer for å generere HSV-DNA-fragmentet som inneholder gD-sekvensen, under forutsetning av at enzymene ikke ødelegger immunopotensen til gD-genproduktet. For eksempel kan et antigens sete i et protein bestå av fra ca. 7 til ca. 14 aminosyrer. Således kan et protein på størrelse med gD ha mange adskilte antigene seter, muligens tusenvis når man tar i betraktning overlappende sekvenser, sekundære strukturbetraktnlnger og innslag ved fremstillingen, slik som acetylering, glycosylering eller fosforylering. Mange partielle gD-gensekvenser som som derfor koder for et antigens sete. Følgelig kan mange kombinasjoner av restriksjonsenzymer brukes for å frembringe DNA-fragmenter som, når de innføres i en passende vektor, er i stand til i en en-celleorganisme å styre fremstillingen av gD-spesifikke aminosyresekvenser som omfatter forskjellige antigen-determinanter.

Transformasjon av vertsceller med disse rekombinante DNA-molekylene som omfatter HSV-DNA-fragmentene, muliggjør frembringelse av mange kopier av den virale DNA som derefter kan analyseres for å identifisere fragmentet som inneholder gD-gensekvensen. Innføring av HSV-DNA-restriksjonsfragmenter i en klonende vektor utføres lett når den klonende vektoren har komplementære kohesive ender. Dersom imidlertid de komplementære restriksjonssetene som brukes til å dele opp HSV-DNA, ikke er til stede i den klonende vektoren, kan endene til HSV-DNA eller den klonende vektoren modifiseres. Slike modifikasjoner omfatter fremstilling av butte ender ved nedbrytning av en-kjedede DNA-ender eller ved å fylle ut en-kj edede ender, slik at endene kan sammenbindes som butte ender. Alternativt kan hvilket som helst ønsket sete fremstilles ved å binde nukleotidsekvenser (sammenbindere) til DNA-endene, idet disse sammenbinderne kan omfatte spesifikt kjemisk syntetiserte oligonukleotider som koder for gjenkjenningssekvenser for et restriksjonsenzym. I henhold til andre fremgangsmåter kan den spaltede vektoren og HSV-DNA-f ragmentet modifiseres ved homopolymer-påbygging. (For en oversikt, se Morrow, 1979, "Methods in Enzymology", 68:3.)

Identifisering av det bestemte DNA-fragmentet som inneholder gD-genet kan utføres på en rekke måter. For det første er det mulig å dele opp DNA-f ragmentene fra viruset (Maxam og Gilbert, 1980, "Methods in Enzymology", 65:499) og derefter identifisere fragmentet som inneholder gD-gensekvensen ved en sammenligning av den forutsagte aminosyresekvensen med aminosyresekvensen til gb-proteinet. For det annet kan fragmentet som inneholder gD-genet identifiseres ved mRNA-utvelgelse. DNA-fragmentet fra HSV brukes til å Isolere komplementære mRNA-er ved hybridisering. Immunoutfellingsanalyse av in vitro-translasjonsproduktene av de isolerte mRNA identifiserer mRNA og følgelig de komplementære HSV-DNA-fragmentene som inneholder gD-gensekvenser. Endelig kan det selekteres for gD-spesifikke mRNA ved adsorpsjon av polysomer isolert fra HSV-infiserte celler, til immobiliserte monoklonale antistoffer rettet mot gD. En radiologisk merket gD-mRNA eller cDNA kan syntetiseres ved å bruke den utvalgte mRNA (fra de adsorberte polysomene) som et templat. Den radiologisk merkede mRNA eller cDNA kan så brukes som en "sonde" for å identifiseres HSV-DNA-fragmentene som inneholder gD-sekvenser (Southern, 1975, "J. Mol. Biol.", 98: 503; Alwine et al., 1979, "Methods in Enzymology", 68: 220).

Alternativer til å isolere gD-genet omfatter, men er ikke begrenset til, kjemisk syntetisering av selve gensekvensen (under forutsetning av at sekvensen er kjent), eller å fremstille cDNA (komplementært DNA) til den mRNA som koder for gD-genet. For å utføre dette, isoleres mRNA som er spesifikk for gD fra virusinfiserte celler. Ved hjelp av standardteknikker omdannes derefter den isolerte mRNA til en cDNA-kopi og innføres direkte i en kloningsvektor.

Transformasjon av vertsceller med rekombinante DNA-molekyler som innlemmer det isolerte genet, cDNA eller syntetisert DNA-sekvens, muliggjør frembringelse av mange kopier av genet. Følgelig kan genet oppnås i mikrogram-mengder ved å dyrke transformanter, isolere de rekombinante DNA-molekylene fra transformantene og gjenvinne det innførte genet fra den isolerte rekombinante DNA. Alternativt kan mikrogram-mengder av gD-genet oppnås fra kilden for gD-genet, for eksempel Herpes Simplex Virus i infiserte dyreceller, eller bakterier eller fager som inneholder virusgenet i rekombinante plasmider. Virus eller plasmid-DNA isoleres, brytes opp, separeres og ordnes efter størrelse ved hjelp av de samme fremgangsmåter som ble brukt til å lokalisere genet.

INNFØRING AV HSV- GLYCOPROTEINGENET I EN KLONENDE EKSPRESJONSVEKTOR .

Når det først er isolert, innføres gD-genet eller genfragmentet i en passende ekspresjonsvektor, det vil si en vektor som inneholder de nødvendige elementene for transkripsjon og translasjon av det innførte genet (se Roberts og Lauer, 1979, "Methods In Enzymology", 68: 473). For å oppnå effektiv ekspresjon av gD-genet (eller en del av genet), må en promoter være til stede i ekspresjonsvektoren. RNA-polymerase bindes vanligvis til promoteren og starter opp transkripsjon av et gen eller en gruppe sammenbundne gener og regulatorelementer (kalt er operon). Promoteren varierer med hensyn til sin "styrke", det vil si dens evne til å fremme transkripsjon. For formålet med molekylær kloning er det ønskelig å bruke sterke promotere for å oppnå et høyt nivå av transkripsjon og, følgelig, ekspresjon av genet. Avhengig av vertscellesystemet som brukes, kan hvilken som helst av en rekke passende promotere anvendes. Ved kloning i et E. coli-vertscellesystem kan for eksempel en hvilken som helst av promoterne isolert fra E. coli, dens bakteriofager eller plasmider, brukes (for eksempel lac-promoteren). Dertil kan E. coli-promotere fremstilt ved rekombinant DNA eller andre syntetiske DNA-teknikker brukes for å tilveiebringe transkripsjon av det innførte genet. Nærmere bestemt fører Pg- og PL-promoterne fra colifag X til høye transkripsjons-nivåer for tilgrensende DNA-segmenter. I tillegg gir recA-promoteren fra E. coli høye gentranskripsjonsnivåer for tilgrensende fragmenter.

Det er også nødvendig med bestemte oppstartingssignaler for effektiv gentranskripsjon og -translasjon i prokaryot- og —eukaryotceller. Disse oppstartingssignalene for transkripsjon og translasjon kan variere I "styrke" målt ved mengden av henholdsvis genspesifikk mRNa og protein som syntetiseres. DNA-ekspresjonsvektoren som inneholder en promoter kan også inneholde enhver kombinasjon av forskjellige "sterke" oppstartingssignaler for transkripsjon og/eller translasjon. Således kan enhver SD-ATG-kombinasjon som kan utnyttes av vertscelle-ribosomer, anvendes, slike kombinasjoner omfatter, men er Ikke begrenset til SD-ATG-kombinasjonen fra cro-genet eller N-genet fra colifag X, eller fra E. coli tryptofan E-, D-, C-, D- eller A-gener. Dertil kan enhver AD-ATG-kombinasjon fremstilt ved rekombinant DNA- eller annen syntetisk teknikk, anvendes.

Enhver av de tidligere beskrevne fremgangsmåter for inn-føringen av DNA-fragmenter i en vektor kan brukes for å binde en promoter og andre kontrollelementer på bestemte steder i vektoren.

Følgelig kan gD-genet (eller enhver del derav) bindes i en ekspresjonsvektor på et bestemt sted i forhold til vektor-promoteren og kontrollelementene slik at gD-gensekvensen er i den korrekte avlesningsstruktur for translasjon (det vil si i fase) med hensyn til ATG-sekvensen i vektoren. Alternativt kan en gD ATG- eller syntetisk ATG brukes. Det resulterende rekombinante DNA-molekylet innføres så i passende vertsceller ved transformasjon, transduksjon eller transeffeksjon (avhengig av vektoren/vertscellesystemet). Transformanter velges ut basert på ekspresjonen av passende genmarkører som vanligvis er til stede i vektoren, slik som ampicillin-resistens eller tetracyklin-resistens i pBR322 eller thymidin-kinase-aktivitet i eukaryote vertssystemer. Eksprimering av slike markørproteiner indikerer at det rekombinante DNA-molekylet er intakt og replikerer. Ekspresjonsvektorene som vanligvis inneholder en markørfunksjon, kan omfatte men er ikke begrenset til de følgende vektorer eller derivater derav: SV40 og adenovirusvektorer, gjær-vektorer, bakteriofagvektorer som X gt-WES-X B, Charon 28, Charon 4A, X gt-l-X BC, X gt-l-X B, M13mp/, M13mp8, M13mp9 eller plasmid DNA-vektorer som pBR322, pAC105, pVA51, pACY177, pKH47, pACYC184, pUBHO, pMB9, pBR325, Col El, pSClOl, pBR313, pML21, RSF2124, pCRl eller RP4. De ekspresjonsvektorene som brukes i eksemplene i foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i nærmere detalj i US-PS 4 634 678.

I tillegg kan det velges vertscellestammer som inhiberer virkningen av promoteren med mindre den induseres spesifikt. På denne måten kan mer enn 9596 av effektiviteten til vektorens promoter inhiberes i ikke-induserte celler. I visse operoner er tilsetningen av bestemte induksjonsmidler nødvendig for effektiv transkripsjon og translasjon av den innførte DNA, for eksempel induseres lac-operonet ved tilsetningen av laktose eller IPTG (det vil si isopropyltio-P-D-galaktosid). En rekke andre operoner som trp, pro, og så videre, kontrolleres på annen måte. trp-operonet induseres når tryptofan er fraværende i dyrkingsmediene, og Pl~ promoteren til X induseres ved en økning av temperaturen i vertsceller som inneholder et temperaturfølsomt X-repressor-protein, for eksempel CI857. Følgelig kan eksprimering av det genetisk konstruerte gD-proteinet kontrolleres. Dette er viktig dersom proteinproduktet fra det klonede genet er dødelig for vertsceller. I slike tilfeller kan det fremmede genet replikeres, men ikke eksprimeres under dyrkingen av transformantene. Efter at cellene når en passende densitet I dyrkingsmediet, kan promoteren induseres for produksjon av proteinet.

De gD-beslektede proteinene som fremstilles i celler transformert med plasmider konstruert som beskrevet ovenfor, det vil si plasmider som styrer eksprimeringen av gD-beslektede proteiner og stanser ved det naturlige stopp-signalet for gD-translasjon, og som starter opp ved en ATG tilveiebragt av vektoren, gD-genet eller en syntetisk sekvens), angis herefter som ikke-sammensatte gD-proteiner eller ikke-sammensatte gD-beslektede proteiner.

FREMSTILLING AV SAMMENSATTE PROTEINER.

For å maksimere nivået for geneksprimering i en bestemt transformant, kan det være ønskelig å binde det aktuelle genet til et gen som koder for et annet protein, slik som ethvert celleprotein. En ytterligere fordel oppnås dersom vertscelleproteinet naturlig inneholder en målbar funksjon. Eksprimeringen av de sammenbundne genene resulterer i et sammenfattet proteinprodukt (herefter kalt gD-sammensatte proteiner) som kan identifiseres på grunn av dets store molekylvekt og målbare funksjon. For eksempel byr fremstilling av et gD/e-galaktosidase-sammensatt protein på flere fordeler ved kloning og eksprimering av gD i en E. coli-vert. For det første gir dette mulighet for et anslag av protein-fremstillingsnivået (som følge av eksprimering styrt av vektoren ved å bruke en kolorimetrisk analyse som er spesifikk for p<->galaktosidaseaktivitet, ifølge fremgangsmåten til Miller (sidene 47-55 og 352-355 i "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Press, New York, N.Y., 1972). For det annet, forenkler fremstillingen av sammensatt protein identifiseringen og isoleringen av proteinproduktet. Det ikke-sammensatte gD-proteinet fremstilt av E. coli-transformanter er mindre enn det sammensatte gD-p-galaktosidaseprotelnet og kan som sådan forflytte seg sammen med flere andre vertsproteiner som analyseres ved SDS-polyakrylamid-gelelektroforese. Det fremstilte sammensatte protein kan imidlertid lett påvises og identifiseres ved SDS-polyakrylamid-elektroforese (SDS-PAGE) på grunn av dets enestående store molekylvekt.

Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til fremstillingen av et p<->galaktosidase-sammensatt protein; ethvert gen både av eukaryot- og prokaryot-opprinnelse kan bindes i fase med gD-genet (eller ethvert HSV-proteingen) slik at man får lignende fordeler som ved det sammensatte p<->galaktosldase-proteinproduktet. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til galaktokinase, trp D, E eller styrer, pllus-geher og eukaryote gener, som thymidinkinase, p-globin, SV-40 T—antigen eller Rous sarcoma vlrus-transformerende gen.

For å konstruere et gen som koder for et sammensatt protein, må de to genene knyttes sammen innenfor deres kodende sekvens, slik at avlesningsstrukturen for translasjon opprettholdes og ikke påvirkes av avslutningssignaler. Dersom vertscellen er en stamme som inhiberer virkningen av promoteren, vil det sammensatte proteinet dessuten, som tidligere forklart, bli produsert bare som respons på induksjon.

IDENTIFISERING AV GENPRODUKTET.

Så snart transf orinanter som inneholder den korrekte DNA-konstruksjonen er identifisert, er det nødvendig med en analyse av immunoreaktiviteten og de antigene egenskapene til det rekombinante DNA gD-genproduktet. Med mindre vertscellen er i stand til å glykosylere gD-genproduktet, på samme måte som naturlig forekommende HSV-gD, vil gD-genproduktet adskille seg fra det naturlige gD-glycoproteinet. Følgelig er immunologisk analyse spesielt viktig for gD-genproduktet fordi det endelige mål er å bruke det således fremstilte gD-beslektede proteinet i et vaksinepreparat. Analysen av immunoreaktivitet utføres lettest ved å bruk anti-sera rettet mot gD-glycoproteinet I HSV-infiserte celler, men antigen-egenskaper kan undersøkes ved å bestemme titere for antisera som utvikles hos forsøksdyr som respons på immunisering med gD-genproduktet, og antiseraenes evne til å nøytralisere HSV-infeksjon.

Det er tilgjengelig en rekke antisera for å analysere immunoreaktivitet omfattende polyvalente antistoff-preparater rettet mot hele viruset eller gD spesielt. Større spesifi-sitet oppnås ved å bruke monoklonale antistoffer som gjenkjenner bare et antigent sete på gD-proteinmolekylet. Det foreligger en rekke monoklonale antistoffer rettet mot gD, hvorav noen ikke bare spesifikt immunoutfeller gD-genproduktet fra HSV-1 og HSV-2, men også nøytraliserer Infeksjonsevnen til begge virusene.

Identifiseringen av proteinet som her beskrives er derfor basert på to forutsetninger. For det første, bør det gD-beslektede proteinet fremstilles bare som respons på Induksjon av promoteren. For det annet, bør det gD-beslektede proteinet være immunoreaktivt under anvendelse av en rekke polyklonale antistoffer rettet mot HSV eller monoklonale antistoffer rettet mot gD, idet proteinet bør være immunoreaktivt enten det fremkommer fra eksprimering av hele gensekvensen, en del av gensekvensen eller fra to eller flere gensekvenser som er bundet sammen for å styre produksjonen av et sammensatt protein. Denne reaktiviteten kan påvises ved hjelp av standard immunologiske teknikker, slik som immunoutfellinger, immunodiffusjon, radiologisk Immunkonkurranse, lmmunoelektroforese eller den immunologiske påvisning av proteiner som er separert ved polyakrylamid-gelelektroforese og derefter overført til nitrocellulose.

RENSING AV GENPRODUKTET.

Celler som inneholder gD-genet (eller et hvilke som helst HSV-glucoprotein-gen) dyrkes opp i et stort volum og proteinet som fremstilles efter Induksjon av promoteren, isoleres fra slike celler eller fra mediet dersom proteinet utskilles. Proteinet kan isoleres og renses enten ved hjelp av standard kromatografi omfattende ionebytting, harpikser som separeres efter affinitet eller størrelse, ved sentrifugering eller ved en hvilken som helst annen standard teknikk for rensing av proteiner.

Efter som visse sammensatte proteiner danner aggregater når de produseres i for store mengder i celler, og når de foreligger i oppløsning, er en fremgangsmåte for isolering av aggregatdannende proteiner særlig nyttig ved isolering av de sammensatte proteinene som fremstilles ved oppfinnelsens fremgangsmåte. Disse sammensatte proteinene kan derefter brukes i vaksinepreparater. Rensing av sammensatte proteiner (herefter kalt aggregatrensing) omfatter ekstrahering, separering og/eller rensing av aggregatdannende proteiner ved oppbryting av celler efterfulgt av utvasking av det aggregerte materialet. I tillegg kan det aggregerte materialet oppløses ved tilsetning av et oppløsningsmiddel som både er en sterk hydrogenakseptor og en sterk hydrogendonor (eller en kombinasjon av oppløsningsmidler som hver har en av disse egenskapene), derefter kan de aggregatdannende proteinene utfelles ved fortynning med en forenelig buffer. Passende proteinoppløsningsmidler omfatter, men er ikke begrenset til, urea (fra ca. 4M til ca. 8M), formamid (minst ca. 80%, volum/volum basis) og guanidinhydroklorid (fra ca. 4M til ca. 8M). Noen oppløsningsmidler som er i stand til å oppløse aggregatdannende proteiner, for eksempel SDS (natriumdodecylsulfat), 70% maursyre, er ikke egnet for bruk ved denne fremgangsmåten eftersom efterfølgende utfelling av de oppløste aggregatdannende proteinene har vist seg ikke å holde mål. Selv om guanidinhydroklorid og andre lignende midler er denatureringsmidler, viser undersøkelser at denne denatureringen ikke er irreversibel og at denaturering kan oppstå efter fjerning (for eksempel ved dialyse) eller fortynning av denatureringsmidlet, hvilket åpner mulighet for gjendannelse av immunologisk og/eller biologisk aktivt protein.

En utførelsesform av isoleringsteknikken for sammensatt protein er skissert nedenunder (herefter kalt den ikke-denaturerende aggregatrensingsfremgangsmåten): cellepelleten fryses hurtig ned ved å bruke tørris/metanol, veies og 3-4 g celler resuspenderes i minst 25 ml av en bufferoppløsning (for eksempel 50 mM Tris-HCl (tris-hydroksymetylaminometan-hydroklorid), pH 8,0, 2 mM EDTA (etylendiamintetraeddiksyre) og 200 mM NaCl). Det vil si at cellene suspenderes i en bufferoppløsning ved en omtrentlig konsentrasjon på fra ca. 100-200 g celler/liter. Konsentrasjoner mindre enn ca. 160 g/liter er foretrukket. Til denne suspensjon settes lysozym til en sluttkonsentrasjon på ca. 130 pg/ml og den resulterende blanding får stå ved 4"C i 20 minutter med tilfeldig rysting. "Nonidet P40" (NP-40, Shell, varemerke, polyoksyetylen (9) p-tert-oktylfenol), en ikke-ionisk detergent som brukes til å oppløse membraner, tilsettes til en sluttkonsentrasjon på ca. 0, 1% og oppløsningen blandes. Derefter males suspensjonen i omtrent 1 minutt ved å bruke en Polytron-mølle (Brinkman Instruments, Westbury, N.Y.) eller lignende.

Suspensjonen sentrifugeres ved 8000 x g i 30 minutter og pelleten resuspenderes i en vaskebuffer, for eksempel 20 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl og 2% Triton-X 100 (polyoksyetylen (-10) p-tert-oktylfenyl, en Ikke-ionisk detergent), og males med Polytron-møllen. Dette trinnet med sentrifugering, vasking og maling kan gjentas for ytterligere å vaske pelleten og fjerne så mye som mulig av det cellulære nedbrutte materialet.

Alternativt kan pelleten av aggregater behandles videre ved tilsetning av et denatureringsmiddel (herefter kalt den denaturerende aggregatrensingsfremgangsmåten) på følgende måte: Suspensjonen sentrifugeres, supernatanten fjernes fullstendig og pelleten resuspenderes i ca. 1/5 volum med 6M guanidinhydroklorid (I destillert vann). For eksempel bør 3 g celler vasket med 25 ml buffer resuspenderes på dette trinn i 5 ml 6M guanidinhydroklorid-oppløsning. Det kan være vanskelig å resuspendere pelleten på dette trinnet, og det kan være nødvendig med lydbehandling eller homogenisering for å oppnå en homogen oppløsning. Oppløsningen får henstå ved 22°C i 20 minutter og sentrifugeres derefter ved 8000 x g i 30 minutter for å fjerne nedbrutt materiale, idet supernatanten som på dette punktet inneholder det sammensatte proteinet, tas vare på.

Det sammensatte proteinet utfelles fra guanidinhydroklorid-supernatanten ved tilsetningen av ca. 4 volumdeler vandig buffer. Nesten en hvilken som helst vanlig buffer kan brukes på dette trinnet, tilsetningen av en liten mengde ikke-ionisk detergent som 0,5* NP-40 eller Triton X-100 kan imidlertid være nyttig. Denne suspensjonen får stå ved 4°C i 30 minutter og sentrifugeres derefter ved 8000 x g i 10 minutter. Supernatanten kastes, pelleten (som inneholder utfellingen av det sammensatte proteinet) resuspenderes i en passende buffer, for eksempel fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS) i et passende volum. Kortvarig lydbehandling eller homogenisering kan hjelpe til å oppnå en homogen suspensjon eller oppslemmlng (eftersom aggregat-dannende proteiner er uoppløselige i vann).

FREMSTILLING AV IKKE- SAMMENSATT gD- PROTEIN.

Det kan være ønskelig å bruke ikke-sammensatt gD-protein i vaksinepreparater. Transformanter som produserer ikke-sammensatte gD-proteiner gjør imidlertid, som tidligere forklart, dette i mindre mengder enn transformanter som produserer gD-sammensatte proteiner, dette er tilfelle selv når gensekvensen for det ikke-sammensatte proteinet står under kontroll av en induserbar promoter. Dertil kan de ikke-sammensatte gD-proteinene fremstilt av bakterielle transformanter, være mindre stabile enn gD-sammensatte proteiner.

Ved en alternativ utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan en vertscelle-transformant konstrueres til å produsere store mengder av både sammensatt og ikke-sammensatt gD-beslektede proteiner som vil aggregere og lett kan renses. I henhold til denne utførelsesformen endres de rekombinante plasmidene som koder for gD-sammensatte proteiner ved sammenknytningspunktet for gD-gensekvensen og gensekvensen for vertscelle-protein (for eksempel p<->galaktosidase z-gensekvensen) slik at en meningsløs kodonsekvens (det vil si en kjedeavslutningssekvens slik som amber (TAG), oker (TAA) eller opal (TGA) befinner seg mellom de to gensekvensene, idet kjedeavslutningssekvensen må være i fase med avlesnings-strukturene for translasjon til både gD-sekvensen og vertscelle-gensekvensen. En slik forandring kan utføres ved å spalte plasmidet ved et restriksjonssete (eller -seter)) som befinner seg mellom de to gensekvensene og derefter binde en DNA-sammenbindingssekvens som koder for en kjedeavslutter, slik som amber, oker eller opal, inn i det spaltede setet på plasmidet slik at kjedeavslutteren er i fase med avlesningsstrukturen for translasjon til begge gensekvensene.

Innføring av disse amber-, oker- eller opalmodifiserte plasmidene i en vertscelle som inneholder de passende tRNA-suppressorene resulterer i syntesen av både et ikke-sammensatt gD-beslektet protein og et gD-sammensatt protein. Dersom de amber-, oker- eller opalmodifiserte plasmidene brukes til å transformere ikke-suppressor-cellelinjer, vil hovedsakelig det ikke-sammensatte gD-beslektede proteinet produseres.

Det er minst to måter å innføre de amber-, oker- eller opal-modif iserte plasmidene i et suppressor-cellemiljø: (1) transformanten (det vi si en vertscelle transformert med amber-, oker- eller opalmodifisert plasmid) kan infiseres ved en lysogen tranduserende fag som bærer det passende suppressor-tRNÅ-genet (for eksempel bærer 080 pSU3 SupF-suppressoren fra ambermutasJoner), eller (2) de amber-, oker- eller opalmodifiserte plasmidene kan brukes til å transformere cellelinjer som inneholder suppressor tRNA-er fra henholdsvis amber, oker eller opal. Eksempler på slike stammer omfatter, men er ikke begrenset til, LE392 (som inneholder supE- og supF-suppressorer fra ambermutasjoner), YMC (som inneholder supF) og C600 (supE). De forskjellige ambersuppressor tRNA-gener i E. coli omfatter, men er ikke begrenset til: supB, supC, supD, supE, supF, supG, supL, supM, supN, supO, supP, supTJ, supC. De forskjellige oker-suppressor-tRNA-genene i E. coli omfatter, men er ikke begrenset til: supB, supC, supG, supL, supM, supN, supO og supV. De forskjellige opal-suppressor-tRNA-genene i E. coli omfatter, men er ikke begrenset til: supK (se Bachman og Low, 1980, "Microbiological Reviews", 44(1): Vertscellene som inneholder det passende suppressor-tRNA-genet som er transformert med de amber-, oker- eller opalmodifiserte plasmidene, kan fremstille et gD-beslektet protein både som et sammensatt protein og som et Ikke-sammensatt protein (forholdene mellom fremstilt mengde sammensatt gD- og ikke-sammensatt gD-protein avhenger av utstrekningen av supprimering i vertscellen), begge proteiner immunoreagerer med antisera rettet mot HSV. Både det ikke-sammensatte gD og det gD-sammensatte proteinet renses sammen når man bruker den ikke-denaturerende aggregatrensingsfremgangsmåten (i dette tilfellet er fremgangsmåten en ikke-denaturerende ko-aggregat-rensingsfremgangsmåte) beskrevet ovenfor under overskriften "Rensing av genproduktet", idet det ikke-sammensatte gD kan separeres fra det sammensatte gD-

proteinet efter oppløsning på basis av størrelse eller ladning. Som et resultat, kan store mengder av et ikke-sammensatt gD-beslektet protein fremstilt av vertscelle-transformanter lett renses og utformes for anvendelse som en vaksine.

UTFORMING AV EN VAKSINE.

Formålet ved foreliggende oppfinnelse er, ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker, å produsere et HSV-glycoprotein-beslektet polypeptid, for eksempel et gD-beslektet protein, som kan brukes som et immunogen i en vaksine for å beskytte mot HSV-1- og/eller HSV-2-infeksjoner. Dersom det fremstilte gD-beslektede proteinet er immunoreaktivt mot spesifikke HSV-1- og/eller HSV-2-nøytraliserende antistoffer, skulle det antas at det gD-beslektede proteinet ville frembringe en immunrespons som er i stand til å nøytralisere det relevante viruset in vivo. Vaksiner fremstilt fra genetisk konstruerte immunogener burde være tryggere enn konvensjonelle vaksiner fremstilt fra svekket virus eftersom der ikke er noen fare for infeksjon av mottageren. Alternativt kan det genetisk konstruerte gD-produktet brukes til å produsere antistoffer for bruk i passiv immunoterapi.

Selv om det gD/<p->galaktosidase-sammensatte proteinproduktet selv kan være nyttig i et vaksinepreparat, kan det først være nødvendig å fjerne p<->galaktosidaseresten. Alternativt kan gjenoppbygging av den amino-kodende enden av gD-genet være viktig for den immunogene egenskapen til proteinet fordi aminoenden kan inneholde ytterligere betydningsfulle antigene seter. Den amino-kodende enden til gD-genet kan gjenoppbygges ved å binde en DNA-sekvens som koder for aminoenden til gD inn i det passende setet innenfor det gD-kodende området i det rekombinante DNA-molekylet. Efter som det rekombinante DNA-molekylet beholder alle de nødvendige ekspresjons-kontrollelementene, fremstilles et gD-beslektet protein i full lengde (eller nesten full lengde) av celler som er transformert med DNA-molekylet som Inneholder det rekonstru-erte genet.

Endelig kan det genetisk konstruerte gD-beslektede proteinet isoleres og renses fra vertscellene ved å bruke standard proteinisoleringsteknikker eller ved aggregatrensingsfremgangsmåten beskrevet ovenfor. Det endelig rensede produktet kan derefter fortynnes til en passende konsentrasjon og formuleres sammen med ethvert passende vaksine-hjelpestoff, og pakkes for bruk. Egnede hjelpestoffer er, men er ikke begrenset til: overflateaktive stoffer som heksa-decylamin, oktadecylamin, lysolecitin, dimetyldioktadecyl-ammoniumbromid, N,N-dioktadecyl-N'-N-bis(2-hydroksyetyl-propandiamin), metoksyheksadecylglycerol og flerverdige polyoler; polyanioner som pyran, dekstransulfat, poly-IC, polyakrylsyre, karbopol; peptider som muramyldipeptid, dimetylglycin, tuftsin; oljeemulsjoner og alum. Endelig kan proteinproduktet innesluttes i liposomer for anvendelse i et vaksinepreparat eller kan konjugeres til polysakkarider eller andre polymerer.

De her beskrevne genetisk konstruerte DNA-molekylene åpner for stor fleksibilitet ved vaksineproduksjon. For eksempel kan en vaksine utformes ved å bruke et gD-beslektet protein fremstilt av transformanter som inneholder en hvilken som helst del av gD-gensekvensen eller et rekombinant DNA-molekyl som inneholder flere kopier av gD-genet (eller del derav) efter hverandre. gD-gensekvensen (eller en del derav)), kan bindes til gener som koder for andre immunogener, slik at det sammensatte proteinproduktet kan brukes ved fremstilling av flervalente vaksiner. Dertil kan gD-gensekvensen (eller en del derav) bindes til andre HSV-glycoprotein-gensekvenser (eller deler derav) i en hvilken som helst kombinasjon. Endelig kan gD-sekvensen reorganiseres for å øke den immunogene egenskapen til vaksinen. For eksempel kan gensekvensen endres slik at proteinproduktet oppviser bestemte epitoper til immunsystemet (for eksempel et antigent sete i gD som vanligvis ikke eksponeres, kan bringes frem for immunsystemet) eller de områdene i gD-gensekvensene som koder for immunosuppresive deler av proteinet, kan utelates.

EKSEMPEL: HSV- 1 <g>D.

I overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ble gD-l-genet lokalisert og identifisert ved å innføre DNA-fragmenter fra Us-delen av HSV-l-genomet (se figur la) I vektoren pBR322 for å danne rekombinante plasmider som hver inneholdt et forskjellig fragment av HSV-l-genomet. Plasmidet som inneholder gD-l-genet ble identifisert ved å bruke tre teknikker (ikke nødvendigvis i den angitte rekkefølge): (1) DNA-sekvensering, (2) gD-l-spesifikk hybridiseringsundersøkelser av mRNA og (3) in vitro-translasjon av mRNA som hybridiserer til de rekombinante plasmidene.

Så snart plasmidet som inneholder gD-l-genet var identifisert, ble genet karakterisert ved DNA-sekvensering og ved lokalisering av gD-l-genendene innenfor det rekombinante plasmidet. Et DNA-fragment som inneholdt det gD-l-genet som mangler de første 156 nukleotidene av den kodende sekvensen, ble isolert fra det identifiserte plasmidet. Dette DNA-fragmentet ble bundet inn i en DNA-vektor, pJS413, hvorved man fikk pEH25 som ble brukt til å klone og eksprimere genet i E. coli. Genproduktet isolert fra induserte transformanter ble identifisert som et gD-l-spesifikt protein ved immunoutfelling med monoklonale antistoffer rettet mot gD-1 og med polyvalente antistoffer rettet mot HSV-1.

Til slutt ble gD-l-genfragmentet isolert fra pEH25 ved restriksjonsendonukleasespalting ved bestemte seter, slik at avslutningssekvensen (TAG) til den gD-l-kodende sekvensen ble fjernet. Dette DNA-fragment som inneholdt en del av gD-l-genet og promoteren og kontrollelementene fra plasmidet (for eksempel SD-ATG), ble vunnet inn i vektor som inneholdt en p—galaktosidase-kodende sekvens. Det resulterende rekombinante plasmidet, pEH4-2, som inneholdt den gD-l-kodende sekvensen innesluttet mellom plasmidets lac-promoter med et cro SD-ATG og P-galaktosidasegenet, styrte eksprimering av et sammensatt protein i induserte E. coli-transformanter. Dette sammensatte proteinet ble så isolert fra vertscellelysater og utformet for anvendelse som et immunogen. Alternativt ble den amino-kodende enden av gD-l-genet rekonstruert og det resulterende gD-l-proteinet ble utformet for dyreinjeksjoner og førkliniske prøver. En detaljert beskrivelse av hvert trinn i konstruksjonen er gjengitt i udneravsnittene nedenfor.

De her fremstilte gD-l-beslektede proteiner og sammensatte proteiner er ikke glykosylerte og adskiller seg således fra det naturlig forekommende HSV-1 gD-glycoprotein. Det gD-l-beslektede proteinet er imidlertid immunoreaktivt med antistoffer rettet mot HSV-1 og HSV-2 gD.

GENERELLE FREMGANGSMÅTER ANVENDT VED FREMSTILLING AV PLASMIDER.

De efterfølgende underavsnitt beskriver de generelle fremgangsmåtene og materialene som brukes til DNA-isolering, enzymreaksjoner og sammenbindingsreaksjoner.

PLASMID DNA-ISOLERING.

Vertscellebakterier Escherichia coli, (E. coli) ble transformert (Gautler og Bonewald, 1980, "Molec. Gen. Genet.", 178: 375) og store (mikrogram) mengder plasmid DNA ble isolert fra kulturer av E. coli-transformanter dyrket i M-9-dyrkingsvæske (Miller, side 431 i "Experiments in Molecular Genetics"; Cold Spring Harbor Press, New York, N.Y., 1972). Plasmider ble isolert fra celler på et sent stadium av den logarltmiske veksten ved å bruk en modifikasjon av fremgangsmåten til Guerry et al., (1973, "J. Bacteriol.", 116: 1063).

BETINGELSER FOR NEDBRYTNINGER MED RESTRIKSJONSENZYM.

En enzymenhet er definert som mengden som kreves for å bryte ned 1,0 pg X-DNA i løpet av 15 minutter ved 37°C i en total reaksjonsblanding på 50 pl.

Alle fullstendige nedbrytninger med restriksjonsenzym ble utført under følgende betingelser: Hvert 1 pg DNA ble inkubert med 0,5 enheter enzym ved 37<e>C I 60 minutter i 20 pl buffer. Delvise nedbrytninger ble utført ved å modifisere betingelsene som ble brukt ved fullstendig nedbrytning, på følgende måte: Hvert 1 pg DNA ble inkubert med 0,1 enheter enzym ved 37°C i 15 minutter. Omsetningen ble avsluttet ved tilsetningen av 0,1* natriumdodecylsulfat (SDS). Reaksjons-betingelsene ble således justert slik at man fikk et gjennomsnitt på en spalting pr. DNA-molekyl.

RESTRIKSJONSENZYMBUFFERE.

Bufferen som ble bruk til nedbrytninger med SacI, SacII eller Smal, bestod av: 6,6 mM Tris-HCl (pH 7,4), 6,6 mM MgCl2 og 6,6 mM p-ME (p-merkaptoetanol).

Bufferen som ble brukt ved nedbrytninger med Bglll, BstEII, EcoRI, Hindlll, Nrul, Pstl eller PvuII, bestod av: 60 mM NaCl, 6,6 mM Tris-HCl (pH 7,4), 6,6 mM MgCl2 og 6,6 mM P-merkaptoetanol (p-ME).

Bufferen som ble brukt ved nedbrytninger med BamHI, Sali eller Xbal, bestod av: 150 mM NaCl, 6,6 mM Tris-HCl (pH 7,4), 6,6 mM MgCl2 og 6,6 mM p-ME.

Det bør legges merke til at enten det utføres to eller flere restriksjonsnukleasereaksjoner på DNA, utføres omsetningen i buffer med lavt saltinnhold før omsetningen i buffer med høyt saltinnhold. Dersom to enzymer krever den samme buffer, kan omsetningene utføres samtidig.

MODIFIKASJON AV DNA.

Bal 31-nuklease er et flerfunksjonelt enzym som inneholder en høyspesifikk en-kjedet endodeoksyribonuklease-aktivitet og en fremadskridende eksonukleaseaktivitet som samtidig bryter ned både 3'- og 5'-endene i dobbeltkjedet DNA (dsDNA). En enhet nuklease Bal 31 er definert som den mengden som kreves for å frigjøre 1,0 pg syreoppløselige nukleotider fra denaturert kalvethymus DNA (650 pg/ml) i løpet av 1 minutt ved 30°C. Reaksjonsbufferen som brukes til Bal 31, består av: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 600 mM NaCl, 12 mM CaCl2, 1,0 mM EDTA og DNA. Det ble inkubert ved 30'C, nedbrytinger med Bal 31 ble utført med å inkubere 30 pg DNA med 0,5 enheter Bal 31 1 1, 2, 4, 6, 8 og 10 minutter. Reaksjonene ble avsluttet ved tilsetningen av EDTA til 50 mM eller varmeinaktivering av Bal 31 (det vil si 65"C i 10 minutter).

Sl-nuklease bryter ned RNA eller denaturerer DNA (det vil si en-kjedet DNA) til mononukleotider, men vil ikke (under passende betingelser) bryte ned dobbeltkjedet DNA eller DNA/RNA-hybrider. En enhet Sl-nuklease er definert som den mengden med enzym som kreves for å syreoppløse 1 pg denaturert kalvethymus DNA i løpet av 30 minutter ved 37°C. Den anvendte reaksjonsbufferen til Sl-nuklease bestod av 30 mM natriumacetat (pH 4,6), 250 mM NaCl, 1 mM ZnS04 og 5* glycerol. Sl-nedbrytinger ble utført ved å Inkubere 2000 enheter enzym med 0,1 pg DNA og 20 pg RNA ved 45°C 1 30 minutter.

Eksonuklease VII (Exo VII) bryter med en-kjedet DNA (ssDNA). Virkningsmekanismen for ExoVII synes å være den til en trinnvis virkende eksonuklease. En enhet Exo VII defineres som mengden enzym som fremstiller 1 nmol nukleotidmonomerer i løpet av 30 minutter ved 37°C under anvendelse av rettkjedet, denaturert (<3>H)-SV40 DNA som substrat. Reaksjonsblandingen ble som brukt for Exo VII bestod av 10 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10 mM 3-ME og 8 mM EDTA. Exo VII-nedbryt ingen ble utført ved å bruke 4 enheter ExoVIII pr. 0,1 pg DNA 1 et 250 pl stort reaksjonsvolum 1 1 time ved 45'C.

DNA-POLYMERASEOMSETNING.

DNA-polymeraser katalyserer den trinnvise forlengelsen av en DNA-kjede. Kjedevekst skjer 15'- til 3'-retningen (det vil si tilføyelsen av nukleotider skjer i 3'-enden) og polymer-sekvensen bestemmes ved hjelp av sekvensen til tempiaten fordi det inntredende nukleotid må være komplementært med templaten, det vil si danne det korrekte basepar med templatkjeden. De kjente DNA-polymerasene kan ikke initiere kjedesyntese, følgelig kreves det ved DNA-syntese en oppstarterkjede med en fri 3'-hydroksylende festet til en templatkjede. Kjedeforlengelse fortsetter ved de nukleofile angrepet av 3'-hydroksylenden til oppstarteren på 5'-fosfatet hos det inntredende nukleotid. Den nye kjeden er baseparet med og antiparallell til templatkjeden. Som et resultat av DNA-polymerasereaksjonen, "utfylles" den en-kjedede templatkjeden eller omdannes til et dobbeltkjedet DNA-molekyl.

Et annet viktig trekk ved DNA-polymerasene er "korrektur-lesings"-funksjonen. En 3 *->5'-eksonukleaseaktivitet forbundet med DNA-polymerase I virker på ikke-baseparrede ender og kan bryte ned både en- og dobbeltkjedet DNA i retningen fra 3' til 5<*>, og derved gi mononukleotider. Således fjernes et ukorrekt tilføyd nukleotid før polymerisering fortsetter, og påliteligheten til enzymet økes ytterligere. DNA-polymerase I har også en 5 '->3' -eksonukleaseaktivitet som er spesifikk for dobbeltkjedet DNA (som gir 5'-mononukleotider og oligonukleotider) som også kan fjerne områder i DNA som Ikke passer sammen.

Proteolytisk behandling av DNA-polymerase I ved fremgangsmåten til Klenow (Klenow et al., 1971, "Eur. J. Biochem.", 22: 371) gir to fragmenter, stort og lite. Det store fragmentet eller Klenow-fragmentet (76 000 dalton) bibeholder polymerasen og 3*-*5 '-eksonukleaseaktlvlteten. En enhet med DNA-polymerase I eller DNA-polymerase I-stort fragment er definert som den mengde som omdanner 10 nmol deoksyribo-nukleotider til en syreuoppløsellg form i løpet av 30 minutter ved 37°C. Analysebetingelsene for begge enzymer er de samme med unntak av at reaksjonsb landingen for DNA-polymerase I inneholder 67 mM KPO4 (pH 7,5), mens reaksjonsblandingen for Klenow-fragmentet inneholder 40 mM KPO (pH 7,5) i den følgende buffer: 6,6 mM MgCl2» 1»0 mM p-ME, 2 mM dAT-kopolymer, 33 pM dATP, 33 mM <3>HdTTP og enzym.

Når DNA-polymerase stort(Klenow)fragment i foreliggende søknad ble brukt til å utfylle en-kjedet DNA eller kohesive ender som resulterer fra restriksjonsenzymspalting, ble den følgende fremgangsmåte anvendt: Omsetninger med restriksjonsenzym ble avsluttet ved oppvarming til 68°C i 10 minutter. Til den samme reaksjonsblanding ble en sluttkonsentrasjon på 50 pm av hvert deoksynukleosidtrifosfat tilsatt og for hvert mikrogram DNA i reaksjonsblandingen, ble 10-100 enheter DNA-polymerase Klenow-fragment tilsatt. Med andre ord, ble det brukt et overskudd DNA-polymerase Klenow-fragment for å sikre at de en-kjedede endene ble fullstendig utfylt.

GELRENSING AV DNA-FRAGMENTER.

Efter behandling med restriksjonsenzym eller nuklease, ble DNA-fragmenter med varierende størrelse separert ved hjelp av gelelektroforese enten på agarose eller polyakrylamid-plategeler ved lav spenning (omtrent 2 volt/cm for agarose-geler og 10 volt/cm for polyakrylamldgeler), farvet med etidiumbromid og synliggjort under ultrafiolett lys (Southern 1979, "Methods in Enzymology", 68: 152).

For å utvinne bestemte DNA-fragmenter fra geler, ble de passende båndene skåret ut av gelen og DNA ble elektroeluert inn i et dialyserør. DNA ble så isolert på DEAE-cellulose, eller etanolutfelt, og resuspendert i den passende buffer (Smith, 1980, "Methods of Enzymology", 65: 371).

DNA-SAMMENBINDING.

Alle sammenbindinger ble utført ved å bruke T4 DNA-ligase. En enhet T4 DNA-ligase defineres som den mengde som kreves for å gi 50* sammenbinding av HindiII-fragmenter fra bakteriofag X-DNA i løpet av 30 minutter ved 16"C i 20 pl ligasebuffer og en konsentrasjon av 5'-DNA-ender på 0,12 pm (300 ég/ ml).

Sammenbindinger av DNA ble utført i ligasebuffer bestående av: 60 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgClg, 20 mM ditiotreitol (DTT), 1,0 mM ATP og en DNA-konsentrasjon varierende fra 15-50 pg/ml. Sammenbindingsreaksjonene ble inkubert 4-24 timer ved romtemperatur under anvendelse av omtrent 300 enheter T4 DNA-ligase pr. 10 pl reaksjonsvolum.

LOKALISERING OG ISOLERING AV gD- 1- GENET.

Analyse av proteinene som spesifiseres for av HSV-1 x HSV-2-rekombinanter indikerte at gD-l-genet kunne kartlegges til å ligge mellom 0,9 til 0,945 genomkartenheter innenfor Us-området til DNA (Ruyechan et al., 1979, "J. Vlrol.", 29: 667), se figur la og lb. Us-området ble delt opp ved restriksjonsenzymer og disse fragmentene ble innført i kloningsvektorer for å fremstille forskjellige rekombinante plasmider som hver inneholdt en avgrenset del av Us-området. Disse rekombinante plasmidene ble derefter analysert for å lokalisere gD-l-genet innenfor Us-området. Kartposisjonene til gD-1 1 HSV-1 er nylig blitt rapportert av Lee et al., 1982, "J. Virol.", 43: 41.

REKOMBINANTE DNA-PLASMIDER SOM INNEHOLDER AVGRENSEDE DELER AV Us-OMRÅDET TIL HSV-1.

Det ble konstruert flere rekombinante plasmider ved å bruke vektoren, pBR322 og forskjellige fragmenter av Us-området til HSV-1 (Patton-stamme). Et av disse plasmidene, betegnet pRWF6, ble funnet å inneholde hele gD-l-genet. En beskrivelse av pRWF6 følger.

HSV-l-innskuddet av rekombinant plasmid pRWF6 (figur lc) er erholdt fra Us-området til klonen X-gtWES: Eco RI-H (Urnene og Engquist, 1981, "Gene" 13: 251). X-gtWES: EcoRI-H-klonen ble brutt ned fullstendig (total nedbrytning) med EcoRI. EcoRI-H-fragmentet av X-gtWES: EcoRI-H-klonen, omtrent 15-16 kb (kilobaser), inneholder hele Us-området fra HSV-1.

Plasmider pBR322 og EcoRI-H-fragmentet (isolert ovenfor) fra HSV-1 ble begge fullstendig nedbrutt med BamHI. Det resulterende 4,4 kb-fragmentet fra pBR322 og 6,4 kb-fragmentet fra HSV-1 ble festet til hverandre og bundet sammen i et 1:1-forhold, hvilket ga pRWF6.

LOKALISERING AV gD-l-SPESIFIKK mRNA-KODENDE SEKVENS.

For å lokalisere og velge ut den gD-l-spesifikke kodende sekvens i pRWF6, ble virus DNA-innskuddet subklonet, på nytt inn i pBR322. Denaturerte virus DNA-restriksjonsfragmenter fra subklon pSC30-4 (figur ld og beskrevet nedenfor) ble immobilisert på nitrocellulose og brukt til å isolere mRNA (via komplementær basepar-hybridisering) fra cytoplasmiske RNA-ekstrakter av HSV-l-infiserte celler. To mRNA-arter (3,0 kb og 1,7 kb) hybrldiserte til pSC30-4. Translasjon av disse mRNA-artene in vitro viste at enten den 3,8 kb eller den 1,7 store mRNA kodet for gD-l-proteinet. Detaljer ved fremgangsmåten er beskrevet nedenfor og vist i figur 1.

Plasmidet pRWF6 ble isolert fra E. coli-transformanter og brutt ned med restrisjonsenzymet Sacl. Dette frembragte tre fragmenter: et 6,2 kb-fragment som inneholdt hele pBR322-vektoren pluss en del av HSV-1 DNA-sekvensen, et 2,9 kb HSV DNA-fragment og et 1,7 kb HSV-1 DNA-fragment.

For å subklone det 2,9 kb store HSV-1 DNA-fragmentet (se figur ld), ble pBR322 spaltet med PvuII (som gjør pBR322 rettkjedet) og bundet sammen i nærvær av SacI-sammenbindere ved å bruk T4 DNA-ligase. Følgelig ble det unike PvuII-setet til pBR322 omdannet til et unikt Sac I-sete (betegnet Sacl (Pvu II^~^)). Efter spalting av den modifiserte pBR322-véktoren med Sacl-enzym, ble denne vektoren bundet sammen med det 2,9 kb store HSV-1 Sacl DNA-fragmentet, hvilket ga pSC30-4. Dette rekombinante plasmidet ble brukt til å transformere E. coli. Transformanter ble undersøkte og valgt ut ved restriksjonskartlegglng under anvendelse av en mini-lysat-teknlkk (Clewell og Helinski, 1970, "Biochem.", 9: 4428).

Subklonen pSC30-4 ble brukt i mRNA-hybridiseringsutvelgelse på følgende måte: (Ricciardo et ai., 1979, "Proe. Nati. Acad. Sei." USA, 76: 4927). Plasmidet pSC30-4 ble isolert fra E. coli-transformanter og 200 pg pSC30-4 DNA ble brutt ned med Sacl for å fjerne HSV-1 DNA-innskuddet. Det spaltede plasmidet ble ekstrahert med kloroform:fenol (1:1) og etanolutfelt. Pelleten ble resuspendert i 2 ml 0,3M NaOH og inkubert ved romtemperatur i 10 minutter for å denaturere DNA-en. Suspensjonen ble derefter nøytralisert ved tilsetningen av 4,4 ml destillert vann, 0,2 ml 3M HC1, 0,2 ml IM Tris-HCl (pH 7,5) og 3 ml 20 x SSC (SCC er 0,15M NaCl, 0,015M natriumcitrat). Målt med indikatorpapir lå pH mellom 6 og 8. Den denaturerte nøytraliserte DNA ble vakuumfUtrert gjennom et 25 mm nitrocellulosefilter (Schleicher og Schuell, Keene, N.H.) som på forhånd var oppbløtt i destillert vann efterfulgt av 6 x SSC. Efter vakuumfiltrering ble nitrocellulose-f11trene vasket med 6 x SSC, tørket og oppvarmet ved 80°C i 2 timer. Halvparten av nitrocellulosefilteret ble brukt til hybridiseringsfremgangsmåten som beskrevet nedenfor.

Nitrocellulosen som inneholdt den virale DNA ble kuttet opp i små stykker og inkubert med alt cytoplasmlsk RNA som var isolert fra lysater av HSV-l-infiserte Vero-celler fremstilt på følgende måte: Vero-celler ble infisert med 10 plakkdannende enheter (pfu)/celle og inkubert i 7 timer ved 37°C i Dulbecco's medium med 50 <5g/ml cytarabin (p<->cytosin arabino-sid), tilsatt for å forhindre replikasjon av DNA. Cellene ble lysert med 0,65* NP-40 i 0,15M NaCl, 1,5 mM MgCl2 og 0,01M Tris-HCl (pH 7,9). Kjernen ble sedimentert ved sentrifugering ved 3000 x g i 2 minutter og supernatanten ble justert til en sluttkonsentrasjon på 1 mM EDTA (pH 7,9) og 0,5* SDS. Oppløsningen ble ekstrahert 2 ganger med kloroform:fenol (1:1) og en gang med kloroform. Den cytoplasmiske RNA ble etanolutfelt (en sammenløpende roterende flaske med Vero-celler ga ca. 1,5 mg RNA) og delvis tørket. RNA-pelleten (ca. 0,4 til 0,8 mg RNA) ble oppløst i 400 pl hybrldiserings-buffer (50* formamid, 0,4 mM NaCl, 40 mM PIPES, pH 6, 1 mM EDTA og 1* SDS) og tilsatt det oppkuttede nitrocellulosefilteret. Hybridiseringen ble utført ved 55<9>C 1 3 timer i et vannbad under rysting.

Filterstykkene ble derefter vasket 10 ganger med SSC som inneholdt 0,5* SDS ved 60°C, efterfulgt av to vaskinger med 1 ml 2 mM EDTA i SSC ved 60°C. Til slutt ble filterstykkene vasket med 2 mM EDTA, pH 8,0, ved 60 "C i 5 minutter, hvorefter oppløsningen ble fjernet og filterstykkene ble grundig tørket med en bomullsfille.

Den hybridiserte mRNA ble eluert fra nitrocellulosestykkene ved å bruk formamid og oppvarming på følgende måte: 120 pl 95* formamid/10 mM PIPES (pH 6,5) ble satt til filtrene og det ble inkubert i 5 minutter ved 65°C. Eluatet ble overført til en mikrosentrifugerør og oppbevart på is. Ytterligere 120 pl av eluerlngsbufferen ble tilsatt til nitrocellulosestykkene og et ble inkubert på nytt ved 65<*>C i 5 minutter. Dette eluatet ble overført til et annet mikro-sentrifugerør og oppbevart på is. En 720 pl alikvot av sterilt destillert vann satt til filtrene som derefter ble rystet. Ca. 360 pl ble så overført til hvert mikrosentrifuge-rør som inneholdt eluatene. Til den eluerte RNA i mikro-sentrlfugerørene ble 20 pl 5M NaCl, 5 ég av en egnet bærer (for eksempel kaninlever tRNA) og 1 ml absolutt etanol tilsatt. RNA ble utfelt ved å inkubere blandingen i 1 time ved — 70* C eller ved å senke rørene ned i en oppslemming av tørris/EtOH i 20 minutter. Den utfelte RNA ble pelletert (10 minutter ved 12 000 x g) i en mikrosentrifuge og utfellinger fra en tube ble resuspendert 1 1 ml buffer (0,5 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,9) og 0,5* SDS) for å oppløse RNA. Den løste RNA ble satt til dupllkatrøret for å kombinere alikvotene og oppløse all utfelt RNA. Den polyadenylerte RNA (poly(A)RNA) ble isolert fra den oppløst RNA ved kromatografi under anvendelse av 01igo(dT)-cellulose. Poly(A)RNA-en ble eluert fra 01igo(dT)-cellulosen ved å bruke 10 mM Tris-HCl (pH 7,9), og 0,1* SDS som elueringsbuf fer, derefter ble poly(A)RNA-en etanolutfelt som tidligere beskrevet.

To typer mRNA som hybridiserte til pSC30-4 DNA-en ble isolert, en 3,0 kb og ,7 kb mRNA. Disse to typene ble overført in vitro ved å bruke et kaninretikulocytt cellefritt system som inneholdt <35>S-metionin (Pelham og Jackson, 1976, "Eur. J. Biochem.", 67: 247).

In vitro-translasjonsekstraktene ble lmmunoutfelt med monoklonalt antistoff 4S som er rettet mot gD-1 og tilberedt for SDS-PAGE som tidligere beskrevet. Elektroforetisk analyse av de immunoutfelte proteinproduktene fra det cellefrie tranlasjonssystemet viste at disse utvalgte mRNA-er spesifiserte et 50 000 dalton gD-l-spesifIkt protein (data ikke vist). Ifølge størrelsen til gD-l-proteln, må den minimale mRNA-kodende sekvensen være omtrent 1,6 kb, følgelig ble, idet man tok i betraktning mRNA-styrersekvenser og poly-(A)-haler, den største 3,0 kb mRNA antatt å kode for gD-1-polypeptidet.

KARAKTERISERING AV gD-1-mRNA.

Kartlegging av posisjonen for 3,0 kb mRNA-sekvensen Innenfor pSC30-4 og karakterisering av mRNA ble utført ved Sl-kartlegging, det vil si ved å bruke en-kjedet spesifikk nuklease Sl og eksonuklease VII for å kartlegge områdene i DNA-prøver som hybridiserer til komplementære mRNA-sekvenser (Berk og Sharp, 1978, "Proe. Nati. Avad. Sel.", USA, 75: 1274), og ved å dele opp DNA-en i det kodende området av gD-l-genet (Maxam og Gilbert, 1980, "Methods in Enzymology", 65: 499).

Kartleggingsteknikken med Sl viste at den 3,0 kb og den 1,7 kb store mRNA-typen Ikke var sammenskjøtet (det vil sl inneholdt ikke sammenfallende sekvenser eller introner) og at de hadde forskjellige 5'-ender, men felles 3'-ender. En 1608 nukleotid DNA-sekvens omfattende det kodende området ved 5'-enden av den 3,0 kb store mRNA ble bestemt og avlesnlngs-systemet for translasjon ble utledet ved å lokalisere oppstartingskodonet (ATG) nærmest 5'-enden.

Prinsippet ved Sal-kartleggingsteknikken er å tillate dupleksering mellom RNA og en radiologisk merket en-kjedet RNA-(ssDNA)-prøve (for eksempel oppnådd fra pSV30-4). Dersom RNA-en er en fullstendig sammenskjøtet mRNA, vil lntronene danne en ssDNA-løkke. Enzymet nuklease Sl bryter ned alle ssDNA-områdene i den radiologisk merkede DNA som ikke er beskyttet ved dupleksering med RNA, mens eksonuklease VII bryter med ssDNA bare ved endene og vil derfor ikke bryte ned ssDNA-løkkene. Sammenligning av størrelsen av DNA som ikke påvirkes av disse nukleasene (på grunn av hybridisering til RNA) muliggjør påvirkningen av transkripsjonsprodukter fra sammenskjøtet mRNA.

Ved foreliggende oppfinnelse var den radiologisk merkede DNA som Die brukt til å lokalisere 5<*->enden av den 3,0 kb store mRNA, et 3,8 kb BamHI-8/BstEII-f ragment av pRWF6 som var merket med <32>p (ved å bruke enzymet polynukleotidkinase ifølge fremgangsmåten til Maxam og Gilbert, se ovenfor) i dets BstEII 5'-ende før spalting med BamHI. Den radiologisk merkede DNA brukt til å lokalisere 3'-enden av den 3,0 kb store mRNA var et 4,0 kb Hindi I/Sal I-f ragment av pSC30-4 som var merket med <32>P (ved å bruke Klenow-f ragmentet av DNA-polymerase Ifølge fremgangsmåten til Maxam og Gilbert, se ovenfor) ved dets Hindlll 3'-ende før spalting med Sali. Cytoplasmisk mRNA ble Isolert fra HSV-1- infiserte Vero-celler dyrket i 7 timer i nærvær av cytarabin som tidligere beskrevet. Den anvendte Sl-kartleggingsteknikk var en modifikasjon av fremgangsmåten til Berk og Sharp (Watson et al., 1981, "J. Vlrol.", 37: 431). 5'-enden av gD-1 mRNa ble kartlagt til å ligge nær Hindlll-setet til pSC30-4, mens 3'-enden ble kartlagt til å ligge omtrent 2,8 kb efter (figur ld).

Til slutt ble HSV-1 DNA i pSC30-4 sekvensbestemt ved å bruke fremgangsmåten til Maxam og Gilbert. Figur 2 viser sekven-seringsstrategien for det kodende området av HSV-1 gD-genet. Både den kodende og ikke-kodende kjeden ble sekvensbestemt. Figur 3 forestiller DNA-sekvensen erholdt for HSV-1 gD-genet. Det var åpenbart at DNA-sekvensen inneholdt et åpent avlesningssystem med 394 kodoner som strakk seg fra et ATG i posisjon 241. Dette setet ble antatt å være oppstarteren for gD-l-genet, og ble påvist å være det ved kloningen av den antatte gD-l-sekvensen inn i ekpresjonsvektoren pJS413 (se nedenfor).

KLONING OG EKSPRIMERING AV gD- 1- GENET.

Den gD-l-kodende sekvensen ble plassert under kontroll av lac-promoteren. Til denne enden ble en del av det antatte gD-l-genet (herefter kalt gD-l-genet), som manglet oppstarlngs-sekvensen ATG, og de første 156 nukleotidene i den amino-kodende enden (5'-enden i genet), bundet inn i en DNA-klonende ekspresjonsvektor, pSJ413, hvorved det ble dannet pEH25 (se figur 4). Det partielle gD-l-genet ble innført slik at den protein-kodende sekvensen kom i det korrekte avles-ningssytemet med hensyn til vektorens oppstartings-ATG. Som et resultat begynner derpå følgende translasjon av den transkriberte mRNA ved oppstartingssekvensen (ATG) i vektoren gjennom gD-l-genet (som mangler sitt eget oppstartings-ATG og de første 156 nukleotider av den gD-l-kodende sekvensen), til det naturlige avslutningssignal til gD-1.

pEH25-plasmidene som inneholdt gD-l-genet ble brukt til å transformere en E. coli-vertsstamme hvori transkripsjonen av DNA fra lac-operonet inhiberes med mindre promoteren induseres spesifikt, primære transformanter ble analysert med hensyn på legemiddel-resistens (ampicillinresistensgenet bæres på vektoren) og resistente kloner ble analysert videre. Strukturen av det resulterende rekombinante plasmidet pEH25 ble verifisert ved restriksjonsanalyse og DNA-sekvensering. Induksjon av pEH25-transformanter resulterte i fremstillingen av et 46 000 dalton polypeptid som var immunologisk utfell-bart med enten antisera rettet mot HSV eller monoklonale antistoffer rettet mot gD. Disse fremgangsmåter er beskrevet i nærmere detalj i de følgende avsnitt.

EKSPRESJONSVEKTOR pJS413.

Ekspresjonsvektoren pJS413 (figur 4) er et pBR322-derivat som inneholder amp<r->(p<->laktamase)-genet, en lac-promoter (P lac), lac- og cro-rlbosombindende seter (SD og AD er angitt på alle tegningene som henholdsvis SD<Z> og SD<cro>), et kjedeoppstartings-ATG med 69 nukleotider av cro (cro), og et modifisert p-galaktosidasegen (lac i-z-genet, herefter kalt z-genet). Innføring av et gen i det korrekte avlesningssystemet mellom det cro-oppstartende ATG til pJS413 og z-genet (det vil sl innenfor Bglll-, Smal- eller BamHI-kloningssetene til pJS413) åpner muligheten for eksprimering av et sammensatt protein i transformerte celler. Ved det foreliggende eksempel ble imidlertid z-genet fjernet og det partielle gD-l-genet ble bundet i fase med pJS413-cro-oppstartings-ATG'et og cro-nukleotidene.

For å fremstille pJS413 for innføring av gD-l-genet (se figur 4) ble pJS413 brutt ned med Smal (hvilket gir en butt ende) og Sacl (hvilket gir en Sacl 3<*->kohesiv ende), 4,7 kb-fragmentet som inneholder promoteren, SD-sekvenser, oppstartings-ATG og partiell cro-sekvens, ble Isolert ved gelelektroforese. 1,8 kb-fragmentet som inneholdt 5'-enden av z-genet ble fjernet.

INNFØRING AV gD-1-GENET I pJS413.

Efter kartlegging av gD-l-genet innenfor pSC30-4 (se ovenfor) ble et 2,2 kb stort DNA-fragment som inneholdt de siste 1026 bp (basepar) av den karboksylsyre-kodende enten av gD-l-genet, selektivt isolert fra pSC30-4 ved nedbrytning med PvuII (hvilket ga en butt ende) og Sacl (hvilket ga en Sacl 3<*->kohesiv ende) (figur 4).

Det 2,2 kb store PvuII/Sacl pSC30-4-fragmentet og det 4,7 kb store Smal/SacI pJS413-fragmentet ble bundet sammen i et 1:1-forhold ved å bruke T4 DNA-ligase (figur 4). De resulterende rekombinante plasmidene ble brukt il å transformere E. coll-stamme NF1829. E. coli-stammen NF1829 er et K-12 MC1000-derivat som bærer et F'-lac-episom med lac I^-mutasjonen for lac-repressor-overproduksjon. lac z-genet som koder for J-galaktosldase og som er til stede i F'-lac-episomet, inaktiveres ved en Tn 5(transposom)-innføring. I stamme NF1829 må følgelig lac-promoteren induseres for å oppnå eksprimering av et gen innført i pJS413-plasmidet.

IDENTIFISERING AV TRANSFORMANTER SOM UTTRYKKER gD-1-GENET.

De Isolerte plasmidene fra ampicillin-resistente E. coll-transformanter ble analysert ved restriksjonsenzym-kartlegging og ved DNA-sekvensering av sammenknytningene mellom pJS413-vektor og gD-1-gen-innskuddet. Plasmidet pEH25 (figur 4) hadde den korrekte nukleotidsekvensen over Cro-gD-1-sammenknytningen (vist i figur 5) og ble undersøkt med hensyn på dets evne til å styre eksprimeringen av et gD-l-beslektet polypeptid. Eftersom lac-promoteren var transkripsjonelt inaktiv i NF1829 (på grunn av overproduksjonen av lac-repressoren) kunne gD-l-proteinet bare blitt påvist efter induksjon av promoteren med enten 1 mM IPTG eller 1-10 mM laktose.

Klonen transformert med pEH25 ble undersøkt på IPTG-spesifikk induksjon av det gD-l-beslektede proteinet og ble funnet å produsere et 46 000 dalton protein bestående av 23 aminosyrer av cro-protein (kodet for PJS413) og 342 aminosyrer av gD-l-proteinet (det vil si de første 52 aminosyrene av gD-1 mangler). Dette proteinet kunne utfelles immunologisk med helt kaninantisera rettet mot HSV-1 og med monoklonale antistoffer (IS, 4S, 55S og 57S), som er spesifikt rettet mot gD av HSV-1 (Showalter et al., 1981, "Infection and Immunity", 34: 684).

Monoklonale antistoffer IS, 55S og 57S gjenkjenner en rekke bestemte seter på gD-l-molekylet (Eisenberg et al., 1982, "J. Virol.", 41: 478). Følgelig er monoklonal 4S i stand til å nøytralisere infeksjonevnen til HSV-1 og HSV-2 og å immunoutfelle gD-proteinet fremstilt av begge virus. Proteinet fremstilt av pEH25 ble immunoutfelt med 4S-antistoffet, hvilket viste at det pEH25 gD-l-beslektede proteinet hadde antlgen-determinanter som er felles for både HSV-1- og HSV-2-gD-proteiner. I tillegg ble det pEH2 gD-l-beslektede proteinet immunoutfelt med et monoklonale antistoffet IS som nøytraliserer bare HSV-1. Det pEH25 gD-l-beslektede proteinet ble også utfelt med de monoklonale antistoffene 55S og 57S, som ikke nøytraliserer infeksjonsevnen til hverken HSV-1 eller HSV-2. Hver av immunoutfellingene ble analysert med SDS-PAGE, detaljer ved hele fremgangsmåten er forklart nedenfor.

Alle pEH25-transformanter ble dyrket ved å fjerne en alikvot av en kultur som hadde stått over natten (stasjonær fase) i L-dyrkingsvæske ved 37"C, fortynnet 20 ganger i M-)-dyrkingsvæske og dyrket ved 37"C med rysting i 90 minutter (Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Press, New York, N.Y. 1972). I analyser av disse kulturer med hensyn på ekspresjon av gD-l-protein, ble 1 mM IPTG og 25 jjCi/ml <35>S-metionin tilsatt til kulturen (kontroller ble merket med <35>S-metionin, men ble ikke indusert). Efter 60 minutter ved 37"C ble kulturene pelletert ved sentrifugering. For å lysere cellene og frigjøre celleinnholdene, ble hvert pellet med celler resuspendert i et like stort volum med lyseringsbuffer, IP-3 (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1* NP-40, 1* deoksycholat og 0,1* SDS), hurtig nedfrosset i flytende nitrogen og lydbølgebehandlet. Cellelysatet ble sentrifugert ved 5000 x g i 5 minutter ved 4°C og supernatanten ble delt opp i alikvoter. Kontrollsera (ikke-immun- eller pre-immun-sera) eller test-antisera (polyvalente antisera rettet mot HSV-1 eller monoklonale antisera rettet mot gD) ble tilsatt til hver alikvot som derefter ble inkubert ved 4°C i 60 minutter. (Mengden tilsatt antisera bestemmes ved å kalibrere antisera-titeren ved å teste seriefortynninger av antisera under anvendelse av en kjent mengde antigen.)

Immunkompleksene ble samlet ved å tilsette vasket Pansorbin (Staphylococcus aureus protein A, Calbiochem-Behring Corp., LaJolla, Cal.) og ved å sentrifugere (alle sentrifugeringer i denne fremgangsmåten ble kjørt ved 5000 x g i 5 minutter ved 4°C med mindre annet er angitt). Den pelleterte immunoutfellingen ble resuspendert og vasket med IP-2 (identisk med IP-3, men med 30 mg/ml okseserum albumin, BSA, tilsatt for å unngå ikke-spesifikk adsorpsjon), vasket to ganger med IP-3 og resuspendert i IP-1 (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA og 1* NP-40). Suspensjonen ble overført til et nytt rør hvori den ble sentrifugert og pelleten ble resuspendert i SDS-polakrylamid-gel-prøvebuffer (Laemmli, 1970, "Nature", 227: 680). Efter oppvarming ved 95°C i 3 minutter ble prøven sentrifugert i 2 minutter ved 20 000 x g i en mikrosentrifuge for å fjerne uoppløselige bestanddeler. Supernatanten ble fjernet og plassert på en SDS-polyakrylamid-gel (10*). Efter elektroforese ble proteinene farvet med farvestoffet Coomassie blue, behandlet med natriumsalicylat og tørket for fluorografi (Chamberlain, 1979, "Anal. Biochem.", 98: 132). Resultater fra SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) viste det pEH25-rettede 46 000 dalton gD-l-beslektede proteinet som var fremstilt efter induksjon, ble immunoutfelt med full-kaninantisera rettet mot HSV-1, og med monoklonale antistoffer IS, 4S, 55S og 57S.

Til slutt ble det utført konkurreringseksperimentet for å bestemme virkningen av lysater av HSV-l-infiserte HeLa-celler efter immunoutfellingen av det induserte gD-l-beslektede proteinet eksprimert i E. coli NF1829, transformert med pEH25 (se figur 6). En seriefortynning ble gjort med lysater av kontroll (ikke-infisert) og HSV-l-infiserte HeLa-celler (infeksjoner ble utført som tidligere beskrevet for Vero-celler). En 5 pl alikvot av en 100 ganger fortynning av monoklonalt 55S bukhulevæske (et gD-l-spesifikt monoklonalt antistoff) ble tilsatt til hver alikvot i fortynningsseriene av HeLa-cellelysater. Efter inkubering ved 4'C i 30 minutter ble like store mengder <35>S-metionin-merkede proteiner fra lysater av induserte pEH25-transformanter tilsatt til HeLa-cellelysatene og inkubert i ytterligere 60 minutter ved 4°C. Immunkompleksene ble samlet opp ved immunoutfelling og analysert ved SDS-PAGE og fluorografi som beskrevet tidligere. Proteinbåndet som ble spesifikt immunoutfelt, ble skåret ut av gelen og radioaktiviteten ble målt ved scintll-lasjonstelling. Figur 6 viser resultatene av disse ekspe-rimentene: radioaktiviteten for hver prøve, som angir det immunoutfelte merkede proteinproduktet av pEH25, ble plottet som en prosent av kontrollen. De åpne sirklene angir den seriefortynnede kontrollen med (ikke-infisert) HeLa-celle-lysat. Boksene angir det seriefortynnede HSV-l-infiserte HeLa-cellelysatet. Dette viser klart at HSV-l-proteiner med hell konkurrerer med radioaktivt merket pEH25-rettet protein for omdannelsen av Immunkomplekser med 55S monoklonalt antistoff.

FREMSTILLING AV pEH4-2 SOM STYRER PRODUKSJONEN AV ET Cro/gD—1/e-GALAKTOSIDASE-SAMMENSATT PROTEIN.

gD-l-genet ble isolert fra pEH25 slik at dets avslutningssignal ble fjernet. For dette formål ble DNA-fragmentet som inneholdt gD-1-gensekvensen spaltet ved et restriksjonssete på andre siden av gD-l-avslutningssekvensen, TAG, hvorefter TAG ble fjernet ved fremadskridende avbygging av endene med Bal 31, en DNA-nuklease. Dette gD-1-genfragmentet ble så innført i pJS413 for å kode for et sammensatt protein: Cro/gD-l/e-galaktosidase. Fremgangsmåten er beskrevet nedenfor og vist i figur 7.

Plasmidet pEH25 ble utsatt for fullbyrdet nedbrytning med Nrul og for fremadskridende nedbrytning med Bal 31-nuklease. Den resulterende DNA med varierende lengde ble derefter spaltet med restriksjonsenzymet Pstl hvorved man fikk et spektrum av fragmenter, hvorav mange manglet gD-l-avslut-ningskodonet, men beholdt det meste av gD-l-gensekvensen. De passende DNA-f ragmentene (1,5 til 1,9 kb) ble Isolert ved gelelektroforese og eluert som beskrevet tidligere. Vektoren pJS413 ble utsatt for fullbyrdet nedbrytning med Pstl og Smal, og det passende 5,5 kb DNA-f ragmentet ble isolert (figur 7). pEH25-fragmentet og pJS413-fragmentet ble bundet sammen i et l:l-forhold og brukt til å transformere E. coli NF1829. De ampicillln-resistente koloniene ble undersøkt med hensyn på produksjon av sammensatt protein ved å analysere efter p<->galaktosidase-aktivitet på indikator-agarplater (Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Press, New York, N.Y., 1972). De positive koloniene ble undersøkt for nærvær av Cro/gD-l/p-galaktosidase-sammensatt protein ved SDS-PAGE-analyse av de hele lysatene av transformanter indusert med IPTG. En storprodusent av et 160 000 dalton sammensatt protein ble isolert fra de klonene som uttrykte de sammensatte Cro/gD-l/p-galaktosIdase-proteinene, plasmidet i denne klonene ble betegnet pEH4-2 (figur 7). Det sammensatte proteinet fremstilt av E. coli-klonene, transformert med pEH4-l, ble påvist å være induserbart med IPTG og å være kryssimmunoreaktiv med både HSV-1 og HSV-2. pEH4-2-plasmidet ble isolert og analysert ved restriksjonskartlegglng og DNA-sekvensering, pEH4-2 inneholder ikke BamHI-setet til pJS413 (se figur 8).

Et annet E. coli-isolat, transformert med plasmidet, betegnet pEH3-25, produserte et sammensatt Cro/gD-l/<p->galaktosidase-protein i mindre mengder enn hva pEH4-2-transformanten gjorde, pEH3-25-transformanten er omtalt senere (se nedenfor).

pEH4-2-SAMMENSATT PROTEIN REAGERER IMMUNOLOGISK MED ANTI-HSV-1-SERA.

Det sammensatte proteinet fremstilt av E. coli, transformert med pEH4-2, samvirket spesifikt med kaninantisera rettet mot HSV-1 (data ikke vist). IPTG-induserte proteiner av pEH4-2 og pEH25 ble separert ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulose (det vil si en "oppsuging" av protein). Lysater av ikke-induserte pEH4-2- og pEH25-transformanter ble utsatt for den samme fremgangsmåte som kontrollene. Nltrocellulosen ble derefter behandlet med kaninantisera rettet mot HSV-1 efterfulgt av <*25>i_merket antiserum fra geit rettet mot kaninimmunoglobulin som en prøve (Towbin et al., 1979, "Proe. Nati. Acad. Sel.", USA, 76: 4350).

Autoradlogrammer av proteinflekkene viste klart at et 160 000 dalton pEH4-2-spesifisert sammensatt protein reagerte immunologisk med kaninantisera rettet mot HSV-1, og at det 46 000 dalton pEH25-spesifiserte gD-l-beslektede proteinet reagerte immunologisk med kaninantisera rettet mot HSV-1.

ANTISERA RETTET MOT pEH4-2-SAMMENSATT PROTEIN IMMUNOUTFELLER HSV-1- OG HSV-2-PROTEINER.

Antisera rettet mot det pEH4-2-sammensatte proteinet ble vist å være immunoreaktlvt med HSV-l-gD og Hsv-2-gD, hvilket viste at det pEH4-2-sammensatte proteinet inneholder gD-spesifIkke antigenderterminanter. Dette ble vist ved SDS-PAGE-analyse av HSV-l-proteiner og HSV-2-proteiner, immunoutfelt med antisera rettet mot pEH4-2-sammensatt protein, se diskusjonen som følger.

Kaninantisera rettet mot de pEH4-2-sammensatte proteinet ble produsert på følgende måte: E. coli-klonene, transformert med pEH4-2, ble dyrket til midten av den logaritmiske fase og indusert med 1 mM IPTG. 4 timer efter induksjon ble bakterien pelletert ved sentrifugering, lysert med SDS-PAGE-prøvebuffer og plassert på preparatlve SDS-polyakrylamldgeler. Efter elektroforese, ble proteinene synliggjort ved farving av de ytre feltene med farvestoffet Coomassie blue, derefter ble båndet for det 160 000 dalton sammensatte proteinet skåret ut fra gelen. Gelstykket ble senket ned i flytende nitrogen, oppmalt til et pulver og resuspendert 1 PBS. Et like stort volum med Freund's fullstendige hjelpestoffer ble derefter tilsatt. Efter grundig blanding, ble oppløsningen injisert subkutant i to New Zealand-kaniner (018 og 019). Hver kanin ble Injisert med 25-50 pg protein. Efter 28 dager fikk kaninene en innsprøyting med den samme mengde sammensatt protein suspendert i ufullstendig Freund's hjelpestoffer. Dyrene fikk innsprøytninger ytterligere 2 ganger med 10 dagers mellomrom. Serumet som ble samlet opp ved blodprøve fra øret 55 dager efter den første Injeksjonen, ble brukt til immunoutfel1Ingsanalyse.

Immunoutfellinger ble utført på følgende måte: Sammenflytende dyrkede celler ble infisert med HSV ved 10 pfu/celle (10 plakkdannende enheter/celler) og merket med 3E>S-metionin ^ ^5 timer efter infeksjon. (GBK-(Georgia Bovine Kidney)-celler ble infisert med HSV-1, mens HeLa-celler ble infisert med HSV-2, Vero-celler ble infisert med.enten HSV-1 eller HSV-2.) Lysater av de <35>S-metionin-merkede HSV-infiserte cellene ble inkubert med enten 10 pl pre-immun kaninsera, kaninantisera rettet mot det sammensatte pEH4-2-proteinet (for eksempel 018 eller 019 antisera), eller med 1 pl monoklonalt antistoff 4S. Immunokompleksene ble samlet opp ved å bruke Pansorbin som beskrevet ovenfor, og de resulterende radiologisk merkede immunoutfelte proteinene ble separert ved SDS-PAGE og fluorografert. SDS-PAGE-resultater viser at: (1) et 52 000 dalton gD-protein fremstilt av HSV-l-infiserte GBK-celler eller Vero-celler er immunoreaktivt med antisera rettet mot det sammensatte proteinet fremstilt av pEH4-2-transformanter og med 4S monoklonalt antistoff, (2) et 50 000 dalton gD-protein fremstilt av HSV-2-infiserte HeLa-celler eller Vero-celler er immunoreaktivt med antisera rettet mot det sammensatte pEH4-2-proteinet og med 4S monoklonalt antistoff. Den tilsynelatende lavere molekylvekt av gD avledet fra HSV-2 sammenlignet med gD avledet fra HSV-1, er overensstemmende med publiserte observasjoner (Ruyechan et al., 1979, "J. Virol.", 29:677). Resultater fra fluorografi viste at gD-proteinet, fremstilt av celler infisert med enten HSV-1 eller HSV-2, er immunoreaktivt med antiseraene rettet mot det sammensatte proteinet fremstilt av pEH4-2-transformanter.

ANTISERA RETTET MOT pEH4-2 NØYTRALISERER HSV-1- OG HSV-2-INFEKSJON IN VITR0.

Kaninantisera rettet mot det sammensatte pEH4-2-proteinet ble også analysert med hensyn på deres evne til å nøytralisere smittefarlighet av virus. Virusnøytralisering ble målt ved en reduksjon av plakkantallet i infiserte celler i vevskultur (Showalter et al., 1981, "Infection and Immunity", 34: 684), For dette formålet ble 50 til 100 pfu HSV-1 eller HSV-2 preinkubert med fortynninger av preimmunsera (kontroll), immunantisera (018 eller 019) eller monoklonalt antistoff 4S i nærvær eller fraværet av aktivt serum komplement (C). Vero-celler ble infisert med disse preparatene av HSV-1 eller HSV-2. Efter tre til fire dager ble HSV-plakkene tellet og virkningen av antiserum på reduksjon av plakkantallet ble bestemt. Resultatene gjengitt i tabell 1 viser at antisera fra hver kanin var i stand til å nøytralisere HSV-1 og HSV-2 in vitro. Nøytralisering var åpenbar i fravær av aktivt komplement, selv om komplement markert økte nøytraliserings-aktivitet. Nøytralisering var mer effektiv mot HSV-1 enn mot HSV-2.

De fremlagte resultatene viser anvendbarheten av det sammensatte pEH4-2-proteinet i en underenhetsvaksine mot HSV-1 og HSV-2.

GJENOPPBYGGING AV gD-1-GENET I pEH4-2.

Plasmidene pJS413 og pRWF6 ble brukt til å gjenoppbygge gD-l-genet (figur 8).

Følgelig ble pRWF6 brutt ned med Hindi 11 og Bal 31 for å frembringe et spektrum av fragmenter med butte ender i tilfeldige størrelser. Efter nedbryting av disse fragmentene med Sacl, ble de buttendede/SacI-:fragmentene som varierte fra 2,2 til 2,4 kb isolert. Disse fragmentene Inneholdt varierende lengder av den amino-kodende enden av gD-l-genet (se figur 8).

gD-1-fragmentene ble subklonet inn i pJS413. For dette formålet ble pJS413 brutt ned med Smal (hvilket ga en butt ende) og Sacl (hvilket ga en Sacl 3'-kohesiv ende). Det 4,7 kb store Smal/Sacl pJS413-fragmentet ble bundet sammen med det buttendede/SacI pRWF6-fragmentet (2,2-2,4 kb) i et 1:1-forhold og brukt til å transformere E. coli-stamme NF1829. Dette resulterte 1 en populasjon av kloner som var transformert med plasmider som inneholdt gD-l-genet tilfeldig "slettet" ved sin amino-kodende ende (figur 8). I alt ble 24 plasmider merket pEH50+x (hvor x står for 1 til 24), omtrent 7 kb hver, analysert ved å kartlegge gjenkjenningssetene for restriksjonsenzymet. De som inneholdt et PvuII-sete innenfor gD-l-genet (nytten av de 24 transformantene) ble ytterligere analysert for å identifisere klonen som inneholdt den største delen av den amino-kodende enden av gD-1.

I en fullstendig gD-l-gensekvens er avstanden mellom gD-oppstartings-ATG og det indre PvuII-setet, 156 basepar. Følgelig ble hver av de 19 pEH50+x-plasmidene brutt ned med Bglll og PvuII, de resulterende fragmentene ble separert ved gelelektroforese for å bestemme størrelsen på Bglll/PvuII-fragmentet. 15 pEH50+x-plasmider som hadde et Bglll/PvuII-fragment som var mindre enn 160 basepar, ble identifisert, det vil si sluttpunktet for nedbrytingen med Bal 31 vist i figur 8, lå et eller annet sted mellom gD-l-oppstartings-ATG-og PvuII-setet. Disse 15 ble sekvensert for nøyaktig å bestemme setet for sammenbinding til pJS413-plasmidet. Syv plasmider, pEH51, pEH60, pEH62, pEH66, pEH71, pEH73 og pEH74 inneholdt gD-l-sekvensen bundet i fase med avlesningssystemet for oversettelse hos cro-ATG i pJS413 (se figur 3 hvor disse sammenbindingssetene er angitt med det tilsvarende pEH-tall og en vertikal pil). Faktisk koder pEH51 for alle unntatt de første 6 aminosyrene i gD-l-aminoenden.

Transformanter av pEH51, pEH60, pEH62 og pEH71 ble merket med <35>S-metionin med eller uten IPTG-induksjon og cellelysater ble behandlet med monoklonalt antistoff 55S, immunoutfellingene ble analysert med SDS-PAGE som tidligere beskrevet. Transformanter som inneholdt pEH51, pEH60, pEH62 eller pEH71 produserte hver et 46 000 dalton Induserbart protein som ble utfelt med monoklonalt 55S (data Ikke vist).

Til slutt ble rekombinante plasmider som koder for sammensatte proteiner fremstilt ved å bruke den amino-kodende enden av pEH51 for å gjenoppbygge den amino-kodende enden av gD-l-sekvensen som er til stede i pEH4-2 (se figur 9). Plasmidet pEH4-2 ble brutt med Pstl og Sacl og det 6,2 kb store fragmentet som inneholdt det partielle gD-l/P-galaktosidasegenet, ble Isolert. Plasmidet pEH51 ble fullstendig brutt ned med Pstl, men delvis brutt ned med SacII. Det 1,25 kb store Pstl/SaclI-fragmentet av pEH51 ble bundet sammen i et 1:1-forhold med det 6,2 kb store Pstl/SacII-fragmentet av pEH42 for å danne pEE82. Transformanter ble identifisert ved utsortering efter p<->galaktosldaseaktivitet som tidligere beskrevet. E. coli-transformanter som bærer pEH51-plasmidet betegnes E. coli-stamme WW51, de transformantene som bærer pEH82-plasmidet betegnes E. coli-stamme WW82.

Vi har vist at HSV gD-1-sammensatte proteiner kan fremstilles i store mengder i E. coli. De sammensatte proteinene er svært stabile, muligens på grunn av selve oppbyggingen av det sammensatte proteinet eller på grunn av isoleringen av det sammensatte proteinet i tette, uoppløselige innleirings-legemer. Oppfinnerne har påvist at det sammensatte proteinet kan ekstraheres fra E. coli og kan brukes til å immunisere dyr. De fremstilte antisera er i stand til å nøytralisere plakkdannelse både i HSV-1 og HSV-2 in vitro.

FREMSTILLING AV pEH90- 10am LE392 SOM FREMSTILLER BÅDE

CRO/ gD- 1- OG CRO/ gD- 1/ 6- GALAKTOSIDÅSE- SAMMENSATT PROTEIN.

Et rekombinant plasmid, pEH90-10am, som kan styre produksjonen både av et sammensatt og et ikke-sammensatt gD-1-beslektet protein i passende vertsceller, ble konstruert (se figur 10).

pEH90-10am-plasmidet ble avledet fra en serie rekombinante plasmider, pEH-90-N, som igjen var avledet fra pEH3-25 (isolert ovenfor) som koder for et sammensatt Cro/gD-l/<p->galaktosidaseprotein (se figurene 3 og 10). pEH-90-N-seriene er like pEH4-2 (se ovenfor) på den måten at avlesningssystemene for oversettelse hos cro-, gD-1- og z-genet er i fase, pEH-9O-N-seriene inneholder imidlertid ytterligere, enestående gjenkjenningssekvenser for restriksjonsendonuklease, lokalisert ved sammenbindingspunktet mellom gD-l-genet og z-genet.

Det rekombinante plasmidet som er isolert fra en transformant av pEH-9O-N-seriene, betegnet pEH-90-10, ble modifisert videre på følgende måte: (1) pEH-90-10 ble spaltet ved sammenbindingspunktet mellom gD-1-gensekvensen og z-gensekvensen, (2) pEH-90-10 ble derefter bundet sammen i nærvær av DNA-sammenbindingssekvenser som inneholdt avslutningssekvensen for amberkjeden, TAG. Det resulterende rekombinante plasmidet, pEH-90-10am, inneholder en avslutningssekvens for amberkjeden i fase med avlesningssystemene for oversettelse til både gD-l-genet og z-genet.

Når pEH-90-10am ble brukt til å transformere E. coli NF1829, syntetiserte de ampicillinresistente transformanter ikke noe påvisbart sammensatt protein. Når imidlertid pEH90-10am-transformanten ble infisert med en lysogen transduserende fag, 080 SuIII, som bærer et amber-suppressor-tRNA-gen, produserte de induserte transformantene et sammensatt Cro/gD—1/<p->galaktosidaseprotein. Lysogenene betegnes pEH90-10am SuIII.

Alternativt ble pEH90-10am-plasmidet brukt til å transformere E. coli LE392 som bærer to amber-suppressor-mutasjoner (SupE og SupF). pEH90-10am LE392-transformantene produserte et sammensatt Cro/gD—l/J-galaktosidaseprotein både under induserte og Ikke-induserte betingelser. (Le392-celler har ikke lac I^-mutasjonen til NF1829 som resulterer i overproduksjon av lac-repressor.) SDS-PAGE-analyse av proteinene fremstilt med pEH90-10am LE392-transformantene avslørte at både et sammensatt protein (omtrent 160 000 dalton) og et ikke-sammensatt gD-l-beslektet protein (omtrent 38 000 dalton) ble produsert, idet begge proteinene immunoreagerte med kaninanti-HSV-1-serum. pEH90-10am LE392-transformantene synes å produsere begge proteinene i omtrent ekvimolare mengder, og de to proteinene renses sammen når de isoleres via den ikke-denaturerende koaggregatrensingsmetoden beskrevet ovenfor. Detaljer ved metoden er beskrevet nedenfor.

FREMSTILLING AV pEH90-N-SERIER.

Som forklart ovenfor, produserer pEH3-25-transformantene et sammensatt Cro/gD-l/<p->galaktosidaseprotein, riktignok i mindre mengder enn hva pEH4-2-transformanter gjør. pEH3-25-rekombinant-plasmidet er likt med pEH4-2 med unntak av at pEH3-25 inneholder transmembransekvensen til gD-1 (se figur 3). Transmembransekvensen kan være ansvarlig for den uvirksomme eksprimering av sammensatt protein i vertscelle-transformanter.

Ekspresjonsvektoren pHK414 (figur 10) er et pJS413-derivat. Faktisk inneholder pHK414 alle elementene til pJS413, men skiller seg ved sine enestående klonlngsseter på andre siden av cro-z-sammenknytningspunktet. Kloningssetene til pHK414 er: BglII, Eindlll, Smal, BamHI, z-genet er ikke i fase med cro ATG, følgelig styrer ikke det intakte plasmidet produksjonen av p<->galaktosidase. Når Imidlertid et DNA-fragment med den passende lengde (3n+2) Innføres i et hvilket som helst av disse kloningssetene på plasmidet, justeres på nytt avles-nlngssystemet for z-genet med hensyn til cro ATG og, forutsatt at den innførte DNA-sekvensen ikke inneholder avslutningssignaler (for eksempel TGA, TAA eller TAG) som er i fase med cro ATG eller z-genet, vil et sammensatt —galak-tosidaseprotein bli fremstilt av vertscelle-transformanter.

pEH90-N-seriene ble konstruert på følgende måte (se figur 10): pEH3-25 ble først brutt ned med BamHI, det spaltede plasmidet ble så behandlet med Bal 31 for å fjerne gD-1-transmembransekvensen ved den karboksylsyre-kodende enden. Efter Bal 31-nedbrytningen, ble pEH3-25 spaltet med Pstl og en populasjon av DNA-fragmenter varierende fra 1,7 til 1,9 kb karakterisert ved en Pstl-kohesiv ende, den amino-kodende enden til amp<r->genet, lac-promoteren og kontrollelementene for oversettelse, gD-l-genet, med utslettinger av hele eller en del av transmembransekvensen, og en butt ende (BamHI ble Isolert ved agarose-gelelektroforese.

Ekspresjonsplasmidet pHK414 ble først spaltet med Bglll og de Bglll-kohesive endene ble utfylt ved å bruk Klenow-fragmentet av DNA-polymerase. Det rettkjedede, buttendede pHK414 ble så brutt ned med Pstl og et 5,,5 kb DNA-fragment kjennetegnet ved en butt ende (Bglll^<->^), z-genet, den karboksylsyre-kodende enden av amp<r->genet og en Pstl-kohesiv ende ble Isolert ved agarose-gelelektroforese.

De 1,7 til 1,9 kb Pstl/BamHI^~^ DNA-fragmentene av pEH3-25 og det 5,5 kb store Bglll^/Bstl DNA-f ragmentet av pHK414 ble bundet sammen i et 1:1 molart forhold ved å bruke T4 DNA-ligase. Den resulterende populasjon av plasmider, betegnet pEH90-N, ble brukt til å transformere E. coli NF1829 som ble dyrket på indikatoragarplater.

De følgende rekombinante plasmidene avledet fra 10 av de 24 transformantene som produserte sammensatte proteiner, ble analysert ved DNA-sekvensering over sammenbindingspunktet for gD-l-/z-gen (se figur 3): pEH90-2, pEE90-3, pEH90-4, pEH90-5, pEH90-6, pEH90-7, pEH90-9, pEH90-10, pEH90-ll og pEH90-12. Alle med unntak av pEH90-12 inneholder utslettinger av hele eller en del av transmembransekvensen, pEH90-4 og pEH90-5 inneholder omtrent halvparten av transmembransekvensen. Hvert av disse plasmidene, med unntak av pEH90-12, styrte produksjonen av et sammensatt Cro/gD-l/—galaktosidaseprotein på det høye nivået som ble produsert av pEH4-2. Plasmid pEH90-10 ble valgt ut til det neste trinnet i fremgangsmåten (det sammensatte gD-l-proteinet fremstilt av pEH90-10-transformanter er identisk med det som ble produsert av pEH4-2-transformanter med unntak av at de siste 4 aminosyrene til gD-1 fremstilt av pEH4-2-transformanter mangler i det sammensatte proteinet fremstilt av pEH90-10-transformanter).

FREMSTILLING AV pEH90-10am.

For å innføre en avslutningssekvens for amberkjede mellom gD-l-sekvensen og z-genet i pEH90-10-plasmidet, ble den følgende fremgangsmåte brukt (se figur 10): pEH90-10 ble spaltet med HindiII efterfulgt av BamHI som resulterte 1 spalting av plasmidet i dets unike restriksjonsendonukleaseseter lokalisert ved sammenbindingspunktet mellom gD-l-genet og z-genet (se nedenfor):

Det 7,3 kb store HindiII/BamHI-spaltede plasmidet ble isolert ved agarose-gelelektroforese og blindet sammen med (ved å bruk T4 DNA-ligase) et DNA-sammenkobllngsmlddel kjennetegnet ved HindiII/BamHI-kones1ve ender og et indre Xbal-sete og ambersekvens (TAG):

Hver komplementære kjede 1 DNA-sammenkoblingsmidlet ble syntetisert med fast-fasemetoden rapportert av Chow et al., 1981, "Nucleic Acids Res.", 9(12): 2807-2817.

Efter binding av sammenkoblingsmldlet til det spaltede plasmidet, ble de resulterende rekombinante plasmidene spaltet med Xbal, de rettkjedede 7,3 kb store DNA-fragmentene ble isolert med agarose-gelelektroforese og på nytt gjort ringformede ved sammenbinding med T4 DNA-ligase (dette selekterte for det pEH90-10-plasmidene som faktisk inneholdt sammenkoblingssekvensen bundet mellom Hindlll- og BamHI-setene ved gD-l/z-sammenknytningspunktet som er antydet ved nærværet av et enkelt Xbal-sete på plasmidet). Som et resultat av sammenbindingen, var ambersekvensen av DNA-sammenkobleren 1 fase med avlesningssystemet for oversettelse til gD-1- og z-genet (se nedenfor):

Det resulterende plasmid ble betegnet pEH90-10am.

pEH9 0-1Oam-TRANSFORMANTER.

pEH90-10am-plasmidet ble brukt til å transformere E. coli NF1829. Når de ble indusert med IPTG, syntetiserte de ampicillin-resistente transformantene ingen påvisbare nivåer av sammensatt protein (ingen røde kolonier på MacConkey-indikatoragarplater) i Transformantene ble så infisert med den lysogene transduserende fag 080 SuIII som bærer et amber-suppressor-tRNA-gen. De lysogeniserte transformantene indusert med IPTG-produserte røde kolonier på MacConkey-agarplater, hvilket indikerte produksjon av sammensatt protein. Disse lysogener ble betegnet pEH90-10am SuIII.

pEH90-10am-plasmider ble også brukt til å transformere E. coli LE392 som bærer to amber-suppressorer (supE og supF), men har ikke lac I^-mutasjonen til NF1829 og oversyntetiserer derfor ikke lac-repressor. Disse transformantene, betegnet pEH90-10am LE392, produserte et sammensatt protein uansett om de var indusert med IPTG.

ANALYSE AV PROTEINER FREMSTILT AV pEH90-10am LE392-TRANSF0R-MANTER.

Det sammensatte proteinet (omtrent 160 000 dalton) og et 38 000 dalton protein ble produsert av pEH90-10am LE392 transformanter 1 omtrent ekvimolare mengder. Hvert protein ble påvist å lmmunoreagere med kaninantlserum rettet mot HSV-1. For dette formålet ble celleproteiner Isolert ved en mini-aggregatmetode (beskrevet nedenfor), separert med SDS-PAGE og overført til nitrocellulose som derefter ble behandlet med kaninantiserum rettet mot HSV-1 efterfulgt av l^I-merket antiserum fra geit rettet mot kaninimmunoglobulin som en prøve (Towbin et al., 1979, "Proe. Nati. Åcad. Sei.", USA, 74: 4350).

Den følgende mini-aggregatmetode ble brukt til å isolere vertscelle-aggregater for utsorteringsanalyser: (1) Duplikatkultur-rør med 5 ml frisk Luria-næringsvaeske som inneholdt 100 ég/ml ampicillin, ble inokulert med 200 pl celler oppnådd fra en kultur som hadde stått over natten, og dyrket i 90 minutter ved 37°C. Et av hvert duplikat ble indusert ved tilsetningen av 1 mM IPTG (sluttkonsentrasjon). Inokulatene ble derefter dyrket under rysting i ytterligere 5 timer ved 37'C. (2) Cellene som Inneholdt en 3 ml alikvot av kulturen ble pelletert ved sentrifugering I en mikrosentrifuge (12 000 x g) i 2 minutter. (NB! Det totale volumet av et mikrosentrifugerør er 1,5 ml, derfor ble først en 1,5 ml alikvot pelletert og supernatanten ble trukket av, en annen 1,5 ml alikvot ble tilsatt til det samme mlkro-sentrifugerøret og pelletert i samme røret.) (3) Cellepelleten ble resuspendert i 50 pl 25* sukrose som inneholdt 50 mM Tris-HCl, pH 8, og suspensjonen ble nedfrosset ved å plassere røret i et tørris/etanol-bad. (4) Den nedfrosne suspensjonen ble tint opp, 50 pl 10 mg/ml lysozym 1 0,25M Tris-HCl, pH 8, ble tilsatt, og suspensjonen ble inkubert i 10-15 minutter på is. (5) Efter den 10 til 15 minutter lange inkubasjonen ble 400 pl TET-buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM EDTA, 2* Triton X-100; Trlton X-100 er en ikke-ionisk detergent: polyoksyetylen (9-10) p-tert-oktylfenol) tilsatt, suspensjonen forsiktig blandet og Inkubert i 5 minutter

på is. Derefter ble 500 pl 2 x RIPA (2 x RIPE er 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 300 mM NaCl, 2* natrlumdeoksycholat, 2* NP-40, 0,2* SDS) tilsatt og suspensjonen ble blandet forsiktig og inkubert i 5 minutter på is. (6) Cellene 1 suspensjonen ble derefter lydbølgebehandlet I 10 sekunder ved å bruke en mikrosonde, og suspensjonen

ble klare ved sentrifugering i en Sorvall SS34-rotor i

30 minutter ved 20 000 omdr./min. (47 800 x g).

(7) Supernatanten ble dekantert og pelleten, som Inneholder ko-aggregatprotelnene ble resuspendert 1 50 pl destillert H2O hvortil 50 pl 2 x prøvebuffer (2 x prøve-buffer er sammensatt av 10* SDS, 40 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2* p-ME og 0,02 volumdeler mettet oppløsning av brom-fenolblått) ble tilsatt og godt blandet. Blandingen ble kokt i 5 minutter og 25 pl alikvoter ble tilført 10* SDS-polyakrylamidgeler for elektroforese.

Efter at proteinene var separert med SDS-PAGE, ble de overført til nitrocellulose (det vil si en "oppsuging" av protein). Nitrocellulosen ble derefter behandlet med kaninantisera rettet mot HSV-1 efter av ^<25>I-merket antiserum fra geit rettet mot kanin-immunoglobulln som en prøve (Towbin, 1979, supra). Autoradiogrammer av proteinflekkene viste klart at de to båndene immunoreagerte med anti-HSV-1-antistoffene: et 160 000 dalton sammensatt protein (Cro/gD-1/ p-galaktosidase) og et 38 000 dalton gD-l-beslektet (Cro/gD-1) eller ikke-sammensatt gD-protein (Ikke sammensatt i forhold til —galaktosidase). Det ikke-sammensatte proteinet korenses følgelig med det sammensatte proteinet når ko-aggregatmetoden for isolering brukes til å isolere proteinene, og både det ikke-sammensatte gD (Cro/gD-1) og det gD-sammensatte proteinet (Cro/gD-1/—galaktosidase) immunoreagerer med anti-HSV-serum.

EKSEMPEL: HSV- 2 <g>D

Genom-kartet til HSV-1 ble sammenlignet med det til HSV-2. Lokaliseringen av den gP-kodende sekvensen i HSV-l-genomet ble bestemt ved å trekke analogi med posisjonen til og størrelsen av gP i HSV-l-genomet. BglII L-fragmentet fra Us-området i HSV-1 ble innført i pBR322 for å danne et rekombinant plasmid, pHVl. Pen gP-2-kodende sekvensen som befinner seg i pHVl ble lokalisert ved hybridisering under anvendelse av en del av gP-1 PNA, erholdt fra pSC30-4 som en hybridi-serings-"sonde". Pen delen av pHVl som inneholder den gP-2-kodende sekvensen ble derefter subklonet inn i pBR322 for å danne rekombinant plasmid pHV2. PNA-sekvensen til gD-2-genet i pHV2 ble bestemt og sekvensen til gP-2 ble sammenlignet med den til gP-1. PNA-sekvensen til gP-2 er et kodon kortere enn den til gP-1, det er imidlertid betydelig homologi mellom de to sekvensene.

For å plassere gP-2-genet under lac-promoterkontroll, ble en del av gP-2-gensekvensen som mangler de første 120 nukleotidene av den proteinkodende sekvensen isolert fra pHV2. Pette PNA-fragmentet ble bundet til et lite PNA-fragment som koder for lac-promoteren og kontrollelementer for oversettelse. Pet resulterende rekombinante plasmidet, pHV5, styrte produksjonen av et gP-2-beslektet protein i verts-celletransformanter.

Endelig ble gP-2-genfragmentet isolert fra pHV5 ved restriksjonsendonuklease-spalting på bestemte steder slik at avslutningssekvensen (TAG) i den gP-2-kodende sekvensen ble fjernet. Pette DNA-fragmentet som inneholdt en del av gP-2-genet og ekspresjonsplasmidpromoter og kontrollelementer ble bundet inn i pHK414, en vektor som inneholder en P—galaktosi-dase-kodende sekvens. Pet resulterende rekombinante plasmidet, pHV6, som inneholdt den gP-2-kodende sekvensen, innesluttet mellom plasmid-lac-promoteren med et cro SP-ATG og —galaktosidasegenet, styrte ekspresjonen av et fusjons-protein i induserte E. coli-transformanter. Det sammensatte pHV6-proteinet ble isolert fra vertscellelysater og utformet for anvendelse som et immunogen. En detaljert beskrivelse av hvert trinn i oppbyggingen er gitt i avsnittene nedenfor.

GENERELLE FREMGANGSMÅTER BRUKT TIL FREMSTILLING AV PLASMIDENE.

Hvis ikke annet er angitt, ble de generelle metodene beskrevet ovenfor for DNA-isolering, enzymreaksjoner og sammenbindingsreaksjoner anvendt ved kloningen av gD-2.

RESTRIKSJONSENZYMBUFFERE.

Bufferen som ble brukt til nedbrytninger med Smal, bestod av: 6,6 mM Tris-HCl (pH 7,4), 6,6 mM MgCl2 og 6,6 mM p-ME.

Bufferen som ble brukt til nedbrytninger med Bglll, Clal, EcoRI eller Pastl, bestod av: 60 mM NaCl, 6,6 mM Tris-HCl (pH 7,4), 66,6 mM MgCl2 og 6,6 mM p-ME.

Bufferen som ble brukt til nedbrytninger med BamHI, Sali eller Xhol, bestod av: 150 mM NaCl, 6,6 mM Tris-HCl (pH 7,4), 6,6 mM MgCl2 og 6,6 mM P-ME.

Det bør legges merke til at hver gang to eller flere restriksjonsendonukleasereaksjoner utføres på DNA, gjøres reaksjonen i buffer med lavt saltinnhold før reaksjonen i buffer med høyt saltinnhold. Dersom to enzymer krever den samme buffer, så kan reaksjonene utføres samtidig.

LOKALISERING OG ISOLERING AV gD- 2- GENET.

Som forklart tidligere, ble genom-kartene for HSV-1 og HSV-2 sammenlignet for å bestemme den omtrentlige posisjonen og størrelsen til gD innen HSV-2-genomet (se figur lia). gD-2-genet kartlagt til å ligge mellom 0,9 og 0,945 genomkartenheter innenfor Us-området som er beliggende innen det 8,5 kb store BglII L-fragmentet. BglII L-fragmentet ble fjernet fra HSV-2 DNA-en og innført i pBR322 for ytterligere analyser.

OPPBYGGING AV pHVl SOM INNEHOLDER gD-2-GENET.

HSV-2(stamme G)-genomet DNA ble brutt ned med BglII og et DNA-fragment, omtrent 8,5 kb, som inneholdt gD-2-genet ble isolert ved agarose-gelelektroforese. Plasmidet pBR322 ble totalt nedbrutt med BamHI, den resulterende 4,4 kb pBR322 DNA og det 8,5 kb store Bgl 11 L DNA-f ragmentet av HSV-2 ble knyttet sammen (BamHI-kohesive ender og Bglll-kohesive ender er komplementære), og bundet i et l:l-forhold hvilket ga pHVl (figur 11b).

LOKALISERING AV gD-2-SPESIFIKK mRNA-KODENDE SEKVENS.

Den gD-2 mRNA-kodende sekvensen ble lokalisert innen pHVl ved hybridisering (Southern, 1975, "J. Mol. Biol.", 98: 503) ved å bruk en del av gD-1 DNA erholdt fra pSC30-4 som en hybrldiserings-"sonde" med hensyn til protokollen som ble brukt ved "southern"-overføring, se Maniatis et al., 1982, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, sidene 382-389).

pHVl ble følgelig spaltet med Xhol og de resulterende DNA-fragmentene ble separert ved agarose-gelelektroforese. DNA-fragmentene i gelen ble derefter denaturert i alkali, nøytralisert og overført til et nitrocellulosefilter. DNA-fragmentene knyttet til filteret ble derefter hybridisert til den <32>p-merkede gD-l-"sonden".

Den <32>P-merkede gD-l-"sonden" ble fremstilt på følgende måte: pSC30-4 (figur ld og figur 4) ble spaltet med PvuII og det 500 bp store DNA-fragmentet som inneholder de første 52 kodonene (156 nukleotider) av gD-1, ble isolert ved polyakrylamid-gelelektroforese. gD-1 DNA-en ble radiologisk merket ved innsnittsforflytning (BRL Kit). Innsnittsforflytning er den foretrukne fremgangsmåte for in vitro-merking av dobbel-DNA til høy radiospesifikk aktivitet. Denne fremgangsmåten drar nytte av to a de mange virkningene til E. coli DNA-polymerase I: 5 '->3'-eksonukleaseaktiviteten og 5 '-*3*-polymeraseaktivi teten. Ved innsnittsforf lytning bindes enzymet i et innsnitt i en kjede av den doble DNA. 5'-»3'-eksonukleaseaktivitet hydrolyserer så nukleotider i kjeden med innsnitt, foran den fremadskridende polymerase. Inn-snittet beveges (forflyttes) således langs kjeden. Eftersom hydrolysehastigheten er lik polymerisasjonshastigheten, er det ingen netto syntese. I løpet av denne ombyttings-reaksjonen, inkorporeres imidlertid readioaktive deoksy-nukleosldtrifosfater som er til stede i reaksjonsblandingen, i DNA-en (Kelly et al., 1970, "J. Biol. Chem.", 245:39). Den <32>P-merkede gD-1 dupleks-DNA ble derefter denaturert for anvendelse som en en-kjedet "sonde". (Se Maniatis et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratories, sidene 109-112).

Autoradiografi viste at et Xhol/Xhol DNA-fragment av pHVl , omtrent 2,3 kb, var komplementært med den radioaktive gD-1-"sonden" og inneholdt derfor den gD-2-kodende sekvensen.

Xhol/Xhol DNA-fragmentet av pHVl ble derefter subklonet inn i pBR322 for å ytterligere karakterisere den gD-2-kodende sekvensen. For dette formålet ble pHVl brutt ned med Xhol og det 2,3 kb store DNA-f ragmentet som inneholdt den gD-2-kodende sekvensen ble knyttet og bundet inn i et l:l-forhold med rettkjedet pBR322 som tidligere var blitt spaltet med Sali (Sali genererte kohesive ender er komplementære til Xhol-genererte kohesive ender) for å danne pHV2 (figur lic).

KARAKTERISERING AV DEN KODENDE SEKVENSEN FOR gD-2-mRNA.

HSV-DNA fra pHV2 ble sekvensert ved å bruke fremgangsmåten til Maxam og Gilbert (1980, "Methods in Enzymology", 65: 499). Figur 12 forestiller DNA-sekvensen oppnådd for HSV-2 gD-genet. DNA-sekvensen inneholdt et åpent avlesnlngssystem med 393 kodoner (et kodon mindre enn den DNA-kodende sekvensen til gD-1) som strakk seg fra et ATG i posisjon 267. Dette setet ble antatt å være oppstarteren for gD-2-genet og ble påvist å være det ved kloningen av den antatte gD-gensekvensen i ekspresjonsvektorene pJS413 og pHK413 (se nedenfor).

Den forutsagte aminosyresekvensen til gD-2-proteinet ble sammenlignet med den forutsagte aminosyresekvensen til gD-l-proteinet (figur 13). De to sekvensene er omtrent 82* homologe, idet de ikke-homologe områdene synes å opptre i tre områder: styrersekvensen, transmembranområdet og det antatte forankringsområdet. gD-2-proteinet er en aminosyrerest kortere enn gD-l-proteinet.

KLONING OG EKSPRIMERING AV gD- 2- GENET.

For å plassere gD-2-genet under lac-promoterkontroll, ble en del av gensekvensen som antas å mangle de første 120 nukleotidene i den amino-kodende enden (5'-enden av genet) isolert fra pHV2. pHV2 DNA-fragmentet ble bundet til et lite pJS413 DNA-fragment (omtrent 200 bp) som inneholdt lac-promoteren, kontrollelementer for oversettelse, cro ATG og 69 nukleotider er cro. Det resulterende rekombinante plasmidet pHV5 (figur 14) Inneholder alle unntatt de første 40 kodoner i gD-2-sekvensen. Faktisk koder pHV5 for alle unntatt 15 aminosyrer I det fullstendige gD-2-proteinet. Vanligvis avspaltes de første 25 aminosyrerestene i gD- (signal-sekvensen) når det naturlige gD-2-proteinet fremstilles. Oppbyggingen av pHV5 er beskrevet nedenunder.

OPPBYGGING AV pHV5.

Det rekombinante plasmidet pHV2 ble brutt ned med Clal (se figur 14), og de resulterende kohesive endene ble utfelt ved å bruk Klenow-fragmentet av DNA-polymerase. Det buttendede, rettkjedede pHV2 ble derefter spaltet med EcoRI. Et 5,4 kb stort ClaI^~VEcoRI DNA-fragment som inneholdt ampr<r->genet og alle unntatt 120 nukleotider 1 den gD-2-kodende sekvensen, ble isolert med agarose-gelelektroforese.

Ekspresjonsvektoren pJS413 (beskrevet ovenfor) ble spaltet med Smal og EcoRI. Et fragment med 200 basepar (0,2 kb) som koder for lac-promoteren, SD<Z>, SDcro, cro ATG og 69 nukleotider av cro ble isolert ved polyakrylamid-gelelektroforese.

Det 5,4 kb store Call^/CroRI pHV2 DNA-f ragmentet og det 0,2 kb store CroRI/Smal pJS413 DNA-fragmentet ble bundet i et 1:1 molart forhold ved å bruk T4 DNA-ligase. Det resulterende rekombinante plasmidet, pHV5, ble brukt til å transformere E. coli-stamme NF1829.

IDENTIFISERING AV TRANSFORMANTER SOM UTTRYKKER gD-2-GENET.

Plasmidene som var isolert fra de amplcillln-resistente E. coli transformantene ble analysert ved kartlegging med restrlksjonsendonuklease og med hensyn til deres evne til å styre eksprimeringen av et gD-2-beslektet polypeptid. Eftersom lac-promoteren var transkripsjonelt Inaktiv i NF1829, (på grunn av overproduksjon av lac-repressoren), kunne det gD-2-beslektede proteinet bare påvises efter induksjon av promoteren enten med 1 mM IPTG eller 1-10 mM laktose.

Klonen som var transformert med det rekombinante plasmidet betegnet pHV5, ble funnet å produsere et induserbart gD-beslektet protein. Det induserbare proteinet ble påvist å immunoutfelles av kaninantisera rettet mot HSV-2. FREMSTILLING AV PHV6 SOM STYRER PRODUKSJONEN AV ET CRO/ gD- 2/ 6— GALAKTOSIDASE- SAMMENSATT PROTEIN.

For å fremstille et sammensatt protein ble gD-2-sekvensen bundet til en gensekvens fra en bakterievert, slik at avlesningssystemene for oversettelse Ikke ble forstyrret av avslutningssignaler. For dette formål, ble den gD-2-kodende sekvensen av pHV5 avspaltet slik at gD-2-avslutningssignalet (TAG) ble fjernet. pHV5 DNA-fragmentet som inneholder lac-promoteren, kontroller for oversettelse og cro/gD-2-sekvensen ble bundet til et pHK414 DNA-fragment som inneholdt z-genet. Det resulterende rekombinante plasmidet pHV6 (figur 15) koder for et sammensatt Cro/gD-2/p—galaktpsidaseprotein.

OPPBYGGING AV pHV6.

Plasmidet pHV5 ble brutt ned med Pstl og BamHI (se figur 15). Et 1,7 kb stort Pstl/BamHI pHV5 DNA-fragment som koder for en del av den amino-kodende enden av amp<r->genet. lac-promoteren, SD<Z>, SD<cro>, cro ATG og cro/gD-2, ble isolert ved agarose-gelelektroforese.

Ekspresjonsvektoren pHV414 ble butt ned med Pstl og BamHI. Et 5,54 kb stort BamHI/Pstl pHK4l4 DNA-fragment som koder for z-genet og en del av en karboksylsyre-kodende ende av ampr<r->genet ble isolert ved agarose-gelelektroforese.

Det 1,75 kb store Pst/BamHI pHV5 DNA-f ragmentet og det 5,54 kb store BamHI/PstI pHK414 DNA-fragmentet ble knyttet sammen og bundet i et 1:1 molar forhold og brukt til å transformere E. coli NF1829. De ampicillinresistente koloniene ble undersøkt med hensyn på produksjon av sammensatt protein ved å analysere efter p<->galaktosidase-aktivltet på indikator agarplater. De positive koloniene ble prøvet med hensyn på nærvær av det sammensatte Cro/gD-2/p-galaktosidaseproteinet ved SDS-PAGE-analyse av de samlede lysater av transformanter indusert med IPTG. En storprodusent av et 160 000 dalton sammensatt protein ble isolert og plasmidet avledet fra denne transformanten, ble betegnet pHV6.

Det sammensatte proteinet fremstilt av E. coli-klonene, transformert med pHV6, ble påvist å være induserbare med IPTG og å være kryssimmunoreaktlve både med HSV-1 og HSV-2. Det fremstilte, sammensatte proteinet inneholder 265 aminosyrerester fra gD-2-proteinet.

IMMUNOTJTFELLINGSANAL YSE AV ANTISERA RETTET MOT pHV6 - SAMMEN - SATT PROTEIN.

Det sammensatte pHV5-proteinet ble renset ved å bruke denaturerlngsprotokollen beskrevet ovenfor og ble brukt til å fremstille antisera i tre kaniner (R159, R160, R161) på følgende måte: E. coli-klonene, transformert med pHV6, ble dyrket til midt i den logaritmiske fase og indusert med 1 mM IPTG. 4 timer efter induksjon ble bakteriene pelletert ved sentrifugerlng, lysert med SDS-PAGE-prøvebuffer, og plassert på preparative SDS-polyakrylamidgeler. Efter elektroforese ble proteinene synliggjort ved farving av de ytre feltene med farvestoffet Coomassie blue, derefter ble båndet for det 160 000 dalton store sammensatte proteinet skåret ut fra gelen. Gelstykket ble senket ned i flytende nitrogen, oppmalt til et pulver og derefter suspendert i PBS. Et like stort volum med Freund's fullstendige hjelpestoffer ble derefter tilsatt. Efter grundig blanding, ble oppløsningen injisert subkutant i 3 New Zealand-kaniner (R159, R160 og R161). Hver kanin ble injisert med 100-200 pg protein. Efter 28 dager fikk kaninene innsprøytet den samme mengde sammensatt protein, suspendert i ufullstendig Freund's hjelpestoff. Dyrene fikk innsprøytninger 5 ganger (ialt) med 10 dagers mellomrom. Serumet som ble samlet opp 55 dager efter den første injeksjonen (det vil si efter 2 innsprøytninger), ble brukt til immunoutfellingsanalyse.

Immunoutfellingene ble utført på følgende måte: Sammenflytende celler ble infisert med HSV ved 10 pfu/celle (Vero-celler ble Infisert med HSV-1, mens HeLa-celler ble Infisert med HSV-2). Cellene ble merket med <35>S-metlonin i 16 timer efter infeksjon. Lysater av de <35>S-metionin-merkede HSV-1-infiserte Vero-cellene eller HSV-2-Infiserte HeLa-cellene ble inkubert enten med 10 pl prelmmun-kaninsera eller kaninantisera rettet mot det sammensatte pHV6-proteinet (det vil si R159-, R160- eller R161-antisera). Immunokompleksene ble samlet opp ved å bruke Pansorbln som beskrevet ovenfor og de resulterende radiologisk merkede immunoutfelte proteinene ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og fluorografert. SDS-PAGE-resultater viser at et 50 000 dalton gD-protein produsert med HSV-2-infiserte HeLa-celler er immunoreaktivt med antisera rettet mot det sammensatte proteinet fremstilt av transformanter. R159- og R-161-antiseraene er spesifikk for gD-2, mens R160-antiserumet immunout fel ler både gD-1 (et 52 000 dalton gD-protein fremstilt av de HSV-l-infiserte Vero-cellene) og gD-2, R160 er derfor "typefelles". Det bør legges merke til at 018 (se ovenfor), som er rettet mot et sammensatt gD-l-protein, kodet for av pEH4-2, også er typefelles.

NØYTRALISERING AV HERPES SIMPLEX VIRUS IN VITRO.

De ovenfor beskrevne kaninantisera rettet mot det sammensatte pHV6-proteinet ble også brukt til å bestemme dets evne til å nøytralisere infeksjon av HSV in vitro. For dette formålet, ble det utført undersøkelser av virus-nøytrallsering ved å bruke en plakkanalyse som tidligere beskrevet. Hver plate (35 mm) med sammenflytende celler ble infisert med 50 pfu HSV (Vero-celler ble infisert med HSV-1, mens HeLa-celler ble infisert med HSV-2) som var blitt inkubert på forhånd med kontroll (pre-immunsera) eller fortynninger av prøve antisera (de følgende antisera ble prøvet: 018, R159, R160, R161). Efter 3 dager ble cellene fiksert og farvet, og plakkene ble telt. Tabell 2 viser resultatene av to slike eksperimenter. Nøytralisering uttrykkes som den serumfortynning som kreves for å gi en 50* reduksjon i plakkantall. Tabell 2 viser klart at antiseraene rettet mot det sammensatte pHV6-proteinet (R159, R160 og R161) er i stand til å nøytralisere HSV-2-infeksjon in vitro, mens antisera rettet mot det sammensatte pEH4-2-proteinet (018) er i stand til å nøytralisere HSV-1-infeksjon in vitro. Selv om 018 og R160 er typefelles (basert på immunoutfellingsdata ovenfor), er 018 (anti-gD-1-sammensatt protein) mer effektiv til å nøytralisere HSV-1 in vitro og R160 (anti-gD-2-sammensatt protein) er mere effektivt til å nøytralisere HSV-2-infeksjon in vitro).

IMMUNOFLUORESCENSANALYSE AV ANTISERA RETTET MOT SAMMENSATT

pHV6-PR0TEIN.

Immunofluorescensanalyser ble utført på følgende måte: Sammenflytende celler ble infisert med Herpes Virus ved 0,1 pfu/celle i 20 timer ved 37° C (Vero-celler ble infisert med HSV-1, mens HeLa-celler ble infisert med HSV-2). Cellene ble vasket med PBS og derefter fiksert i 90 sekunder ved romtemperatur med aceton:metanol (1:1). Fikseringsmidlet ble fjernet og cellene ble lufttørket. Derefter ble en 20 pl alikvot av hvert av kaninantiseraene (018, R159, R160 og R161) fortynnet 1:20 i PBS tilført cellene på platen som små dråper på merkede steder. Efter en 30 minutters inkubasjon ved 37°C, ble cellene skylt med PBS og lufttørket. Derefter ble en 20 pl alikvot med fluorscein-konjugert svine-anti-kanlnserum tilført de avmerkede stedene. Efter en 30 minutters inkubasjon ved 37°C ble cellene vasket, lufttørket, preparert i glycerol og observert under ultrafiolett lys ved å bruk et UV-mikroskop. Nærværet av fluorescens indikerer at kanin-antiseraene var immunoreaktive med HSV-infiserte celler. Resultatene er vist i tabell 3.

EKSEMPEL. VAKSINASJON.

BESKYTTELSE MOT HSV- 2- INFEKSJON IN VIVO VED Å BRUKE gP- 1-SAMMENSATT PROTEIN I ET VAKSINEPREPARAT.

Tre grupper med 10 Balb C mus hver ble Injisert intraperitonealt (I.P.) med de følgende preparater: Gruppe 1 (lkke-vakslnert kontroll) fikk saltvannsoppløsning, gruppe 2 fikk 3 pg naturlig HSV-1 gD-protein i fullstendig Freund's hjelpestoff, og gruppe 3 fikk 30 pg pEH4-2-sammensatt protein (isolert ved den denaturerende aggregatrensingsmetode beskrevet ovenfor) i saltvannsoppløsning. Alle gruppene fikk 4 injeksjoner IP, idet hver injeksjon ble administrert med 2 ukers mellomrom og innsprøytingene inneholdt 1 pg gD (gruppe

2) eller 10 pg sammensatt protein.

Det ble tatt blodprøver av musene fra baksiden av øyehulen efter den fjerde injeksjonen, og disse seraene ble prøvet med hensyn på nøytralisering av Herpes Virus in vitro (uten komplement) ved å bruke den tidligere beskrevne plakkanalysen.

En uke efter den fjerde inokuleringen, ble musenes immunitet prøvet ved eksponering mot 10 LD50 av HSV-2^stamme 186. HSV-2-stammen ble suspendert i 0,5 ml og injisert intraperitonealt. Overlevelse av de immunologisk prøvede musene indikerer beskyttelse. Resultater er vist i tabell 4.

BESKYTTELSE MOT HSV- 2- INFEKSJONER IN VIVO VED Å BRUKE gD- 2-SAMMENSATT PROTEIN I ET VAKSINEPREPARAT

Fire grupper med 10 mus i hver ble vaksinert med de følgende preparater. Gruppe 1 (kontroll) fikk pNB9-l-okse-veksthormon/e—galaktosidase-sammensatt protein, gruppe 2 fikk pEH4-2 Cro/gD-l/<p->galaktosidase-sammensatt protein (se ovenfor), gruppe 3 fikk pEH82-rekonstruert Cro/gD-l/<p->galaktosidase-sammensatt protein (se ovenfor) og gruppe 4 gikk pHV6 Cro/gD-2/p<->galaktosidase-sammensatt protein (se ovenfor).

De sammensatte proteinene ble isolert fra de forskjellige E. coli-transformantene ved lysozym/detergent-oppbryting av induserte transformanter efterfulgt av pelletering av aggregatene (den ikke-denaturerende aggregat-rensemetode er beskrevet ovenfor).

Immuniseringsplanene var følgende: Balb C-mus (6-7 uker gamle) ble hver inokulert intraperitonealt med 150-200 pg ikke-denaturert sammensatt protein i 0,2 ml saltvannsoppløs-ning. Musene ble på nytt inokulert intraperitonealt (inn-sprøytet) med 75-100 pg sammensatt protein tre ytterligere ganger med 2 ukers mellomrom (i alt 4 inokuleringer). Det ble tatt blodprøver av musene fra baksiden av øyehulen efter den fjerde injeksjonen og disse seraene ble prøvet med hensyn på nøytralisering av Herpes Virus in vitro (uten komplement) ved å bruke den tidligere beskrevne plakkanalysen.

En uke efter den fjerde inokuleringene, ble immuniteten til musene prøvet ved eksponering med 17 LD50 HSV-2-stamme 186. HSV-2 ble suspendert i 0,5 ml og injisert intraperitonealt. Overlevelse av de immunitetsprøvede musene indikerere beskyttelse. Resultater er vist i tabell 5.

SAMMENLIGNING AV VAKSINEPREPARATER

Mus ble immunisert med sammensatte proteinpreparater fremstilt fra pHE4-2- og pEH90-10am LE392-transformanter i en blanding med forskjellige hjelpestoffer beskrevet nedenfor. De resulterende antisera ble vurdert efter deres evne til å immunoutfelle proteiner avledet fra HSV-l-infiserte celler 1 kultur.

Sammensatte proteiner ble isolert fra pEH4-2- og pEE90-10am LE392-transformanter ved hjelp av den ikke-denaturerende teknikken som er beskrevet ovenfor. Aggregater ble på nytt suspendert ved lydbølgebehandling (det ble dannet en oppslemmlng) og oppløst ved behandling 1 varm alkali på følgende måte: 0,5M NaOH ble tilsatt pelleten av aggregater inntil en sluttkonsentrasjon på 50 mM. Aggregatene ble oppløst ved oppvarming ved 65 °C i 15 minutter, oppløsningen ble derefter avkjølt av Tris-HCl, pH 7,5, ble tilsatt (sluttkonsentrasjon 100 mM Tris-HCl).

Preparatene av sammensatte proteiner (oppsiemmings- eller oppvarmede alkalipreparater) ble blandet med de følgende hjelpestoffer før inokulering: (1) L121 (Hunter et al., 1981, "J. of Immunol.", 127(3): 1244-1250: BASF Wyandotte Corporation, Wyandotte, Mich.), et pluronisk polyol (2,5 mg ble administrert pr. dyr),

eller

(2) aluminiumhydroksydgel i en sluttkonsentrasjon på 0,2*.

Disse preparatene ble brukt 11 å immunisere mus (CD-l-stamme) i overensstemmelse med den følgende plan: Hver mus ble gitt en første injeksjon med 100 pg sammensatt protein og på nytt injisert med 50 pg sammensatt protein 22 dager senere. Det sammensatte proteinet ble suspendert i et totalt volum på 0,2 ml som ble injisert intramuskulært i hvert lår. Det ble tatt blodprøver av musene fra baksiden av øyehulen 7 dager efter den siste injeksjonen.

De oppsamlede sera ble analysert ved immunoutfelling på følgende måte: Lysater av <35>S-metionin-merket HSV-l-infiserte Vero-celler ble inkubert med 5 pl musesera (anti-pEH4-2 eller anti-pEH90-10am LE392) preimmunsera (negativ kontroll) eller monoklonalt 4S (positiv kontroll) i 2 timer ved 4" og 5 pl kaninantimuseserum (Dako, 30 minutter ved 4°C). Immunkompleksene ble samlet opp ved å bruke Pansorbin som beskrevet ovenfor og de radiologisk merkede immunoutfelte proteinene ble separert med SDS-PAGE og fluorografert. Resultater av fluorografi avslørte at alle musene som var immunisert med det alkali-oppløste sammensatte proteinet (både pEH4-2 og pEH90-10am LE392) med L121-hjelpestoffet, hadde en sterk immunrespons. Det ble funnet en svakere respons med det alkalioppløste pEH4-2-sammensatte proteinet administrert med aluminlumhydroksyd. De andre musene syntes ikke å gi noen respons, slik det ble bedømt ved denne prøven.

DEPONERING AV MIKROORGANISMER.

Det må forstås at alle baseparstørrelser angitt for nukleotider er omtrentlige og er bruk for beskrivelsesformål.

De følgende E. coli stammer som bærer de angitte plasmidene er deponert ved the American Type Culture Collectlon, Rockville, Md., og har fått de angitte deponeringsnumrene:

De følgende E. coli-stammer som bærer de angitte plasmidene er deponert ved Agricultural Research Culture Collectlon (NRRL), Peoria, 111., og har fått de angitte deponeringsnumrene.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et Herpes Simplex Virus gD-glycoprotein med en immunoreaktiv og en antigenisk determinant av et Herpes Simplex Virus gD-glycoprotein, karakterisert ved at den omfatter: a) å dyrke en Escherichia coli-bakterie valgt blant de med ÅTCC-aksessnumrene 39 159 og 39 160 og NRRL-aksessnumrene B-15449, B-15450, B-15451 og B-15471, inneholdende en rekombinant vektor omfattende en DNA-sekvens som koder for et Herpes Simplex Virus gD-glycoprotein med en immunoreaktiv og antigenisk determinant av Herpes Simplex Virus type 1 gD-glycoprotein som angitt i figur 3 eller type 2 gD-glycoprotein som angitt i figur 12 og i stand til å kunne replikeres, transkriberes og translateres i nevnte Escherichia coli-bakterie; og b) isolering av polypeptidet fra kulturen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at informasjonen som er inneholdt i DNA-sekvensen, ble erholdt fra et Herpes Simplex Virus genom.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at informasjonen inneholdt i DNA-sekvensen ble erholdt fra Herpes Simplex Virus type 1.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at informasjonen inneholdt i DNA-sekvensen ble erholdt fra Herpes Simplex Virus type 2.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man benytter Escherichia coli ATCC-aksessnr.

39 159.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man benytter Escherichia coli ATCC-aksessnr.

39 160.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man benytter Escherichia coli NRRL-aksessnr. B-15449.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man benytter Escherichia coli NRRL-aksessnr. B-15450.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man benytter Escherichia coli NRRL-aksessnr. B-15451.

10. Fremgangsmåte Ifølge krav 1, karakterisert ved at man benytter Escherichia coli NRRL-aksessnr. B-15471.