FI83974B - Framstaellning av herpes simplex- virusets gd-glykoprotein. - Google Patents

Description

1 83974

Herpes simplex-viruksen gD-glykoproteiinin valmistus 1. Keksinnön ala

Keksintö koskee menetelmiä sellaisten proteiinien valmistamiseksi, jotka ovat Herpes simplex-viruksen (HSV) gD-glyko-proteiinin kaltaisia.

Keksinnössä käytetään yhdistelmä-DNA-tekniikkaa, jonka avulla glykoproteiini D:tä (gD) tai sen osaa koodittava DNA-sekvenssi liitetään DNA-vektoriin, joka on virus-DNA:ta, plasmidi-DNA:ta tai bakteriofagi-DNA:ta niin, että vektori kykenee toisiintumaan ja ohjaamaan gD-geenin ilmentymistä bakteeri-isännässä tai muussa yksisoluisessa systeemissä. Saatu yhdistelmä-DNA-molekyyli siirretään isäntäsoluihin niin, että isäntäsolut kykenevät tuottamaan gD:tä tai sen osaa tai sen jollakin tavalla muuntunutta molekyyliä. Sitten tuotettu proteiini eristetään, puhdistetaan ja muunnetaan käytettäväksi immuunisuutta aiheuttavana aineena rokotteessa sekä HSV-tyypin 1 (HSV-1) ja tyypin 2 (HSV-2) aiheuttamaa tartuntaa vastaan.

2. Keksinnön tausta 2.1. Yhdistelmä-DNA-tekniikka ja geenien Ilmentäminen Yhdistelmä-DNA-tekniikassa liitetään tiettyjä DNA-sekvensse-jä DNA-apuvälineeseen (vektoriin) niin, että muodostuu yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka kykenee toisiintumaan isän-täsolussa. Yleensä liitetty DNA-sekvenssi on vieras vastaanottajana toimivalle DNA-apuvälineelle, so. liitetty DNA-sekvenssi ja DNA-vektori on johdettu organismeista, jotka eivät vaihda keskenään geneettistä informaatiota luonnossa, tai liitetty DNA-sekvenssi voi olla täysin tai osittain synteettisesti valmistettu. Viimevuosina on kehitetty useita yleisiä menetelmiä, joilla on mahdollista rakentaa yhdistel-mä-DNA-molekyylejä. Esimerkiksi US-patentissa 2 83974 4 237 224 kuvataan tällaisten plasmidien tuotantoa käyttämällä restriktioentsyymejä ja yhteenliittämismenetelmiä. Sitten nämä yhdistelmäplasmidit siirretään yksisoluisiin organismeihin, joissa ne toisiintuvat, josta siirtämisestä käytetään nimitystä transformointi. Koska tekniikan yleinen soveltaminen on selos-tetty US-patenttijulkaisussa 4 237 224, se sisällytetään viitteeksi nyt käsillä olevaan selostukseen.

Vielä erästä menetelmää yhdistelmä-DNA-molekyylien siirtämiseksi yksisoluisiin organismeihin on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 304 863, joka myös sisällytetään viitteeksi tässä. Kyseisessä menetelmässä käytetään bakteriofagivektoreilla tapahtuvaa pak-kaus/transduktiosysteemiä.

Huolimatta rakentamismenetelmästä pitää yhdistelmä-DNA-molekyylin olla yhteensopiva isäntäsolun kanssa, so. sen pitää kyetä toi-siintumaan autonomisesti isäntäsolussa. Yhdistelmä-DNA-molekyylin pitäisi myös sisältää sellainen merkki, joka mahdollistaa yhdis-telmä-DNA-molekyylillä transformoituneiden isäntäsolujen valitsemisen. Lisäksi, jos plasmidissa on tarvittavat toisiintumis-, transkriptio- ja luentasignaalit oikein ryhmittyneinä, vieras geeni ilmentyy transformoituneissa soluissa ja niiden jälkeläisissä oikein.

Kuten kaikille viruksille, jotka infektoivat eukaryoottisia soluja, on myös Herpes simplex-virukselle ominaista se, että se vaatii eukaryoottisen isäntäsolusysteemin voidakseen replikoida perimänsä, ilmentää virusperäisiä geenejänsä ja luoda jälkeläisiä. Eukaryooteissa esiintyvä virusjoukko ja geenin ilmentymisen ja DNA:n toisiintumisen signaalit ja ohjausyksiköt eroavat prokaryoottien vastaavista. Tämä on erittäin tärkeätä, kun prokaryoottisissa isäntäsoluissa halutaan ilmentää geeni, joka luonnossa ilmentyy vain eukaryoottisissa soluissa.

Nämä erilaiset geneettiset signaalit ja prosessointitapahtumat ohjaavat monia geenin ilmentymisen tasoja, kuten DNA-transkriptiota

II

3 83974 ja lähetti-RNA:n luentaa. DNA:n transkriptio on riippuvainen promoterin läsnäolosta, joka on DNA-sekvenssi, joka ohjaa RNA-polymeraasin sitoutumista ja näin ollen vauhdittaa transkriptiota. Eukaryoottisten promoterien DNA-sekvenssit eroavat prokaryoot-tisten promoterien vastaavista. Lisäksi saattaa olla niin, että prokaryoottiset systeemit eivät tunnista eukaryoottisia promote-reja ja niihin liittyviä geneettisiä signaaleja tai ne eivät toimi prokaryoottisissa systeemeissä.

Vastaavasti lähetti-RNA:n (mRNA) luenta prokaryooteissa riippuu sopivien prokaryoottisten signaalien läsnäolosta, jotka eroavat eukaryoottien vastaavista. mRNA:n tehokas luenta prokaryooteissa vaatii sen, että mRNA:ssa on ribosomaalinen sidoskohta, jonka nimi on Shine Dalgarno-sekvenssi (SD). Tämä sekvenssi on mRNA:ssa oleva lyhyt nukleotidisekvenssi, joka sijaitsee ennen alkukodonia (AUG), joka koodittaa proteiinin aminopään metioniinia. SD-sek-venssit ovat komplementaarisia 16S-rRNA:n (ribosomi-RNA) 3'-pään suhteen ja luultavasti edistävät mRNA:n sitoutumista ribosomeihin pariutumalla rRNA:n kanssa niin, että tapahtuu oikea asettuminen ribosomille. Geenien ilmentämisen maksimoinnista ovat Roberts ja Lauer esittäneet katsauksen julkaisussa Methods in Enzymology, 68: 473, 1979.

Monet tekijät vaikeuttavat eukaryoottisten geenien ilmentymistä prokaryooteissa vielä senkin jälkeen, kun signaalit on liitetty ja saatu oikeisiin asemiin. Selkeä tieto näiden tekijöiden luonteesta ja niiden toimintamekanismeista puuttuu tällä hetkellä.

Yksi tällainen tekijä on aktiivisen proteolyyttisen systeemin läsnäolo E.colissa ja muissa bakteereissa. Tämä proteiineja hajottava järjestelmä näyttää selektiivisesti tuhoavan "epänormaalit" tai vieraat proteiinit, kuten eukaryoottiset proteiinit. Näin ollen olisi erittäin hyödyllistä, jos löytyisi tapa suojella bakteereissa ilmentyneitä eukaryoottisia proteiineja pro-teolyyttiseltä hajoamiselta. Yksi lähestymistapa on rakentaa yhdistelmägeenejä, joissa eukaryoottinen sekvenssi on liitettynä vaiheeseen (so. oikeaan lukukehykseen)prokaryoottisen geenin 4 83974 kanssa niin, että syntyy yhdysproteiinituote (proteiini, joka on prokaryoottisten ja eukaryoottisten aminohappojärjestysten yhdistelmä).

Yhdistelmägeenien rakentaminen oli lähestymistapa, jota käytettiin eukaryoottisia proteiineja, kuten somatostatiinia, rotan proinsuliinia, kasvuhormonia ja ovalbumiinin kaltaista proteiinia, koodittavien geenien molekulaarisessa kloonauksessa. Lisäksi prokaryoottisia promotereja on liitetty tällaisiin yhteen-liittyneisiin geenisekvensseihin ovalbumiinin ja β-globiinin ollessa kyseessä (Guarente et ai., 1980, Cell 20:543). Guarente et ai:n järjestelmässä liitetään lac-promoteri, SD-sekvenssi mukaanluettuna, eri etäisyyksille yhdistelmägeenin ATG:n eteen. Vaikka useiden eukaryoottisten geenien molekulaarinen kloonaus ja ilmentäminen onkin saatu aikaan, näin ei ole vielä tapahtunut gD-geenin kohdalla. Tekniikan tasokaan ei liioin ole tällä hetkellä sellainen, että vieraiden tai eukaryoottisten geenien ilmentäminen prokaryoottisissa isäntäsoluissa voitaisiin suorittaa rutiininomaisesti.

2.2. Rokotteet

Virusinfektioiden hallinnassa ja hoidossa on olemassa kolme perustapaa: (1) rokotteet, jotka antavat aktiivisen immuunireaktion; (2) kemoterapeuttiset aineet, jotka estävät virusten lisääntymisen; ja (3) aineet, jotka saavat aikaan interferonisynteesin. Kaikkia kolmea tapaa voidaan käyttää tartunnan saannin ehkäi- -syssä, mutta ne ovat tehokkaampia tartunnan alkuvaiheessa käytettyinä. Rokottaminen tai aktiivinen immuuniksitekeminen ovat tavallisesti tehottomia sen jälkeen, kun tartunta on jo saatu.

Rokotteet valmistetaan yleensä tekemällä virus haitattomaksi sen immunologisia ominaisuuksia tuhoamatta. Perinteisesti tämä tehdään joko inaktivoimalla viruksen tarttuvuus (so. "tappamalla" virus tavallisesti käsittelemällä erilaisilla kemiallisilla aineilla, kuten formaldehydillä), jonka jälkeen sitä voidaan käyttää inaktivoiduissa rokotteissa, tai valitsemalla avirulentti tai heikentynyt (muunnettu) virus käytettäväksi elävissä rokot- li 5 83974 teissä (heikennetyt rokotteet). Heikentyminen saadaan aikaan sopeuttamalla virus epätavallisiin olosuhteisiin (eri eläin-isäntiin ja soluviljelmiin) ja käymällä läpi useita suuria virus-siirrosteita sellaisten mutanttien valitsemiseksi, jotka ovat menettäneet virulenttisuutensa ja näin ollen eivät aiheuta lainkaan oireita tai aiheuttavat vain vähäisiä oireita. Muutamat vieläkin eläinten lääkityksessä käytetyt rokotteet sisältävät täysin virulenttia, tarttuvaa virusta, joka injektoidaan kohtaan, jossa viruksen lisääntymisellä on vain vähäisiä vaikutuksia. Tämä menettely on katsottu liian vaaralliseksi ihmisen kohdalla.

Elävissä rokotteissa käytetyt heikennetyt virukset ovat yleensä erinomaisia immunogeenejä, koska heikentynyt virus lisääntyy isäntäsolussa antaen pitkäaikaisen immuunisuuden. Heikennetyt rokotteet aikaansaavat nesteen mukana kulkevia vasta-aineita, jotka kohdistuvat kaikkiin virusantigeeneihin, sekä virionin pinnassa että sisällä oleviin antigeeneihin. Kuitenkin elävien rokotteiden käyttöön liittyy lukuisia vaikeuksia, kuten viruksen riittämätön heikentyminen, viruksen geneettinen epästabiilisuus, satunnaisten virusten aiheuttama kontaminoituminen soluviljelmissä, joita käytetään rokoteviruksen kasvattamisessa, ja lopuksi rokotteen epästabiilisuus (esim. lämpölabiilisuus).

Vaikka inaktivoiduilla rokotteilla (käyttämällä "tapettua" tai inaktivoitua virusta, joka ei lisäänny) vältetään elävien rokotteiden käytössä kohdatut vaikeudet, eivät tapetut virukset lisäänny immunisoitavassa eläimessä ja tavallisesti ne tuottavat vasta-aineita, jotka kohdistuvat vain pintakomponentteihin. Inaktivoitujen rokotteiden kohdalla on kuitenkin päävaikeutena se, miten tuottaa riittävästi virusta, jotta saataisiin aikaan riittävä määrä relevanttia antigeeniä. Muita inaktivoitujen rokotteiden käyttöön liittyviä vaikeuksia ovat ne, että saavutettu immuniteetti on lyhytaikainen ja vaatii usein lisärokotusker-toja, antigeeniset kohdat saattavat muuttua inaktivoivassa kemiallisessa käsittelyssä ja olla näin vähemmän immunogeenisiä tai ne voivat saada aikaan vasta-aineita, jotka ovat vähemmän 6 83974 tehokkaita virusinfektioiden neutraloinnissa, eivätkä rokotteet useinkaan aikaansaa tyydyttäviä IgA-pitoisuuksia.

Osarokotteet sisältävät vain tarpeellisen ja tarkoitukseen sopivan immunogeenisen materiaalin, kuten koteloitumattomien ikosa-hedraalivirusten kapsidiproteiinit tai koteloituneiden virusten peplomeerit (glykoproteiinipiikit). Osarokotteet voidaan valmistaa eristämällä tarkoitukseen sopiva alayksikkö erittäin hyvin puhdistetuista virusjakeista tai syntetisoimalla tarkoitukseen sopiva polypeptidi. Osarokotteisiin liittyvä pääetu on siinä, että voidaan sulkea pois virusperäinen geneettinen materiaali ja isännästä tai luovuttajasta peräisin olevat haittaavat aineet. Kuitenkin näillä menetelmillä tapahtuva osarokotteiden valmistus on liian kallista laajaa kaupallista käyttöä ajatellen. Yhdis-telmä-DNA-tekniikalla on paljon tarjottavaa osarokotteiden valmistukselle, sillä sellaisten virusgeenien molekulaarinen kloonaus ja ilmentäminen isäntäsoluissa, jotka koodittavat tarkoitukseen sopivia viruksen immunogeenisiä osia tai proteiineja, voi tuottaa riittäviä määriä sopivaa immunogeeniä osarokotteessa käytettäväksi.

Rokotteet annetaan usein erilaisia apuaineita sisältävinä emulsioina. Apuaineet auttavat siten; että saavutetaan kestävämpi ja suurempi vastustuskyky käyttämällä pienempiä määriä antigeeniä vähempinä annoksina kuin olisi laita, jos immunogeeni annettaisiin sellaisenaan. Apuaineiden toimintamekanismi on monimutkainen, eikä sitä ymmärretä vielä täysin. Kuitenkin kyseessä saattaa olla fagosytoosin stimuloituminen tai muut retikuloendo-teliaalisen järjestelmän toiminnat sekä antigeenin viivästynyt vapautuminen ja hajoaminen. Esimerkkeinä apuaineista voidaan mainita Freund'in apuaine (täydellisenä tai epätäydellisenä), Adjuvant 65 (sisältää maapähkinäöljyä, mannidimono-oleaattia ja alumiinimonostearaattia) ja mineraaligeelit, kuten alumiinihydroksidi, alumiinifosfaatti ja aluna. Freund'in apuainetta ei enää käytetä rokoteformulaatioissa ihmisillä tai ravinnoksi käytetyillä eläimillä, koska se sisältää aineenvaihdunnassa hajoamatonta mineraaliöljyä ja se on mahdollinen syöpääaiheuttava aine;

II

7 83974 kuitenkin mineraaligeelejä käytetään laajasti kaupallisissa eläinten rokotteissa.

2.3. Herpesvirukset

Herpesvirukset (herpetoviridiae) ovat suuria DNA-viruksia, joille on ominaista se, että ne saavat aikaan latentteja infektioita, jotka voivat säilyä isännän koko elinajan. Esi-infektion, joka saattaa olla huomaamaton, jälkeen virus säilyy lepotilassa siihen asti, kunnes se aktivoituu uudestaan erilaisten stimuloivien vaikutusten vuoksi, joiksi epäillään sellaisia kuin säteily tai immunosuppressio.

Aktiivisessa tilassa tai infektion akuutissa muodossa on tyypillistä produktiivisen tai lyyttisen infektion esiintyminen, so. virus lisääntyy, valtaa isäntäsolun toimintamekanismin, tuottaa kypsiä, tarttuvia virioneja ja aiheuttaa solun kuoleman. Lepo-vaiheessa virus taas säilyy isännän ganglioissa, eikä ole juuri lainkaan todisteita siitä, että tartuttavia viruksia valmistuisi lepovaiheen aikana.

Useimmat esi-infektiot tapahtuvat lapsuudessa ja ne voivat olla huomaamattomia. Tartunta voi aiheutua viruksen siirtymisestä limakalvoon tai viruksen joutumisesta ihoon epidermikerroksen pinnassa olevan haavan kautta. Näin ollen virus voi siirtyä läheisessä kosketuksessa. Kun HSV kerran on saatu, se säilyy kehossa koko elinajan ja uhri joutuu sen toistuvien hyökkäysten kohteeksi, jotka voivat olla oireettomia tai johtaa erilaisiin kliinisiin ilmenemismuotoihin, kuten ihon limakalvon sairauksiin, joita ovat mm. herpes labialis (haavoja huulessa, joita usein nimitetään "kylmärakoiksi"), gingivostomatitis (suu ja ikenet peittyvät rakkuloilla, jotka puhkeavat ja muuttuvat haavoiksi), pharyngitis, tonsillitis, keratoconjuctivitis (keratitis tai silmän sarveiskalvon tulehdus, joka etenee haaraiseksi haavaksi, ja voi lopulta johtaa sarveiskalvon arpeutumiseen ja sokeuteen) ja sukuelinherpes. Harvemmin HSV-tartunta voi aiheuttaa sairauksia, joiden nimet ovat encephalitis, eczema herpeticum, traumaattinen herpes, hepatitis ja vastasyntyneen herpes.

8 83974

Aktiivisten puhkeamisten aikana voidaan tartunnan aiheuttanut virus eristää haavoista tai niitä ympäröivistä nesteistä, esim. syljestä, kun kyseessä on herpes labialis. Näiden vammojen, jotka ovat taipuvaisia puhkeamaan kyseisen yksilön samoissa kohdissa, syntymistä edesauttavat lukuisat ärsykkeet, kuten menstruaatio, pitkä altistuminen auringonvalolle tai kylmälle tuulelle, aivolisäke- ja lisämunuaishormonit, allergiset reaktiot tai erittäin tavallisesti kuume. Tällaisten puhkeamisten aikana sairastuneet levittävät virusta ja voivat aiheuttaa tartunnan muille kosketuksen välityksellä.

Tutkimuksissa on osoitettu,että infektion latentin vaiheen aikana virus pesii muussa paikassa kuin mihin vammat myöhemmin muodostuvat. Lepovaiheessa virus on paikannettu tuntoganlioiden neuroneista (kasvovammojen ollessa kyseessä, usein mukana on kolmihaarainen ganglio) eikä sitä voida eristää tavallisista vaikutusalueista.

Vaikka useimmat lapset toipuvat nopeasti esi-infektiosta, joskus saattaa käydä niin, että hepatiitille ominainen hajapesäkkeinen vastasyntyneen herpestartunta valtaa koko vastasyntyneen. Kohta-lokkaimmat tartunnat saadaan synnytyksen yhteydessä tartuntaa kantavilta apuhenkilöiltä tai tavallisemmin tartuntaa kantavalta äidiltä, kun lapsi joutuu kosketukseen synnytyskanavassa olevan sukuelinherpeksen kanssa. Vulvovaginitis naisilla ja lapsilla ja penisinfektiot miehillä katsottiin aikaisemmin HSV-2:n aiheuttamiksi, mutta viimeaikaiset tulokset osoittavat, että joko HSV-1 tai HSV-2 voi olla syyllinen; lisäksi herpeksen aiheuttaman veneerisen tartunnan on naisilla katsottu olevan yhteydessä kohdunkaulan syöpään.

Herpeksen aiheuttamat tartunnat ovat saavuttaneet epidemian mittasuhteet nyky-yhteiskunnassa. Tällä hetkellä ei ole olemassa parantavaa hoitoa HSV-tartunnoille ja käytössä olevissa hoidoissa käytetään yhdisteitä, jotka estävät DNA-synteesiä. Nämä yhdis-V teet ovat tietysti epäspesifisiä siten, että ne estävät jakautuvien solujen solu-DNA:n synteesiä ja virus-DNA:n synteesiä.

9 83974

Lisäksi nämä yhdisteet ovat hyödyllisiä vain infektion aktiivisessa vaiheessa eikä niillä ole tähän mennessä osoitettu olevan vaikutusta lepovaiheessa.

Herpesvirukset ovat eukaryoottien viruksia ja ne sisältävät lineaarisen, kaksisäikeisen DNA~perimän, jonka koko on 80 x 10^ - 150 x 10° daltonia. Jokaisella virionilla on ikosahedraalinen nukleo-kapsidi ja kalvokuori, joka muodostuu ottamalla isännästä solun lipidikaksoiskerrosta kypsymisen ja silmikoitumisen aikana.

Viruksen kuori on lipidikaksoiskerros, joka sisältää useita virukselle ominaisia spesifisiä proteiineja, jotka osaksi tunkeutuvat kalvon ulkopuolelle, vaikka ovatkin osaksi kalvon ympäröimiä. Kalvokuorta tarvitaan esi-infektion yhteydessä, jotta virushiuk-kanen pystyy tehokkaasti tunkeutumaan soluun. Vasta-aineet, jotka spesifisesti sitoutuvat lipidikaksoiskerroksen ulkopuolella oleviin virusproteiineihin, kykenevät neutraloimaan viruksen tarttuvuuden. Ne viruksen proteiinit, jotka ovat oleellisimpia viruksen soluuntunkeutumiselle, ovat glykoproteiineja (proteiini-molekyylejä, joihin on liittyneinä sokerimolekyylejä). Herpes simplex-viruksen tyypit 1 (HSV-1) ja 2 (HSV-2) tuottavat kukin vähintään neljää erilaista glykoproteiinia, jotka eroavat toisistaan antigeeniominaisuuksiltaan. Eräillä näistä HSV-1- ja HSV-2-proteiineista on samoja epitooppeja (so. antigeenikohtia tai vasta-aineen kiinnittymiskohtia). Yksi esimerkki tällaisista proteiineista on glykoproteiini, jolle on annettu nimitys gD, ja jonka koko on 49 000-58 000 daltonia. Polyvalenttinen HSV-1-gD:n vastainen antiseerumi kykenee neutraloimaan sekä HSV-1-että HSV-2-infektioita (Norrild, 1979, Current Topics’in Microbiol, and Immunol. ]^9: 67) .

3. Yhteenveto keksinnöstä

Keksintö tarjoaa menetelmiä ja seoksia HSV-glykoproteiinin geenin kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi yksisoluisessa isäntä-organismissa. Myös kuvataan menetelmiä näiden yksisoluisten organismien viljelemiseksi niin, että saadaan HSV-geenituote, ja menetelmiä geenituotteen puhdistamiseksi. Tässä kuvatuilla yhdistelmä-DNA-menetelmillä valmistettu gD:n kaltainen proteiini 10 83974 voidaan formuloida käytettäväksi vastustuskyvyn aiheuttavana aineena rokotteissa antamaan suoja HSV-1- ja HSV-2-infekti-oita vastaan. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

HSV-1:n gD-geeni (eristetty HSV-1 Patton-kannasta) identifioitiin viruksen perimästä tyyppienvälisellä yhdistelmäana-lyysillä (intertypic recombinational analysis) ja mRNA-kartoituksella. Kun kyseessä oleva DNA-jakso oli paikannettu, geenin nukleotidijärjestys määritettiin ja sen perusteella voitiin ennustaa gD-proteiinin aminohappojärjestys.

HSV-2:n gD-geeni (eristetty HSV-2-kannasta G) identifioitiin viruksen perimästä vastaavasti kuin gD paikannettiin HSV-l:n perimästä ja hybridisaatioanalyysillä.

Sitten eristetyt gD-geenit tai geenijaksot (tyyppi 1 tai tyyppi 2) liitettiin plasmidivektoreihin niin, että saatiin yhdistelmäplasmideja, jotka toimivat biologisina replikoitu-misyksikköinä. Nämä yhdistelmäplasmidit rakennettiin siten, että gD-geenit pystyivät sekä replikoitumaan että ilmentymään sen jälkeen, kun sopivat isäntäsolut olivat transformoituneet. Lisäksi plasmidit ovat sellaisia, että niillä voidaan yksivaiheisella toimenpiteellä identifioida sellaiset transformoituneet mikro-organismit, jotka ilmentävät gD-geenejä aktiivisesti. Lopuksi kuvataan menetelmiä ilmentyneiden geenituotteiden eristämiseksi ja käyttämiseksi rokotteen formuloinnissa.

4. Liitteenä olevat kuvat

Keksintö voidaan ymmärtää täydellisemmin seuraavan yksityiskohtaisen selostuksen, keksinnön toteutustapaesimerkkien ja liitteenä olevien kuvien avulla, joista:

Kuva la esittää HSV-1:n perimää ja osoittaa yhden ainoan lyhyen alueen (Us) paikan, jossa HSV-1:n gD-geeni sijaitsee (käytetään tästä lähtien nimitystä gD-l-geeni).

li 11 83974

Kuva Ib esittää lambda gtWES::EcoRI-H:ssa olevan liitetyn HSV-1-EcoRI-H-palasen restriktiokarttaa. Vain selostuksen kannalta oleelliset katkaisukohdat on merkitty kuvaan. Restriktioentsyy-mien tunnistuskohdat on lyhennetty seuraavalla tavalla: BamHI (Ba4-Ba8); Bglll (Bg2); BstEII (Bs); EcoRI (Rl); Hindlll (H3); Kpnl (Kp); PvuII (Pv); Sacl (Se); Sali (Sa) ja XhoI (Xh).

Kuva le esittää plasmidin pRWF6 rakentamista, jossa lambda gtWES:EcoRi-H:n BamHI-8-BamHI-7-palanen liitetään plasmidiin pBR322.

Kuva Id esittää pSC30-4:ään liitetyn HSV-l-Sac I-DNA-palasen restriktiokarttaa. Paksunnettu alue kuvaa gD-l-mRNA:ta koodit-tavan sekvenssin sijaintia ja asemaa.

Kuva 2 esittää gD-l-geenin sekvenssinmääritystapaa ja restriktiokarttaa. Koodittava alue on merkitty paksunnettuna ja kooditta-maton alue pelkällä ohuella viivalla. Palasten eristämisessä, radioaktiivisessa merkitsemisessä ja sekundäärisessä hajotuksessa käytetyt restriktioendonukleaasien katkaisukohdat on merkitty. Vaakasuorat nuolet edustavat niitä alueita, joiden DNA-sekvenssi on määritetty: restriktiokartan yläpuolella olevat nuolet merkitsevät, että koodittamattoman säikeen sekvenssi määritettiin; restriktiokartan alapuolella olevat nuolet merkitsevät, että templaattisäikeen sekvenssi määritettiin.

Kuva 3 esittää gD-l-geenin nukleotidisekvenssiä ja gd-l-proteii-nin ennustettua aminohapposekvenssiä. Relevantit restriktio-kohdat on merkitty kuvaan ja numeroidut pystysuorat nuolet gD-l:n aminoa koodittavassa päässä osoittavat kohtaa, jossa gD-l:n aminoa koodittava pää on liittynyt pJS413:een seuraavissa yhdistelmäplasmideissa: pEH51, pEH60, pEH62, pEH66, pEH71, pEH73 ja pEH74, jotka sisältävät loput gD-l-sekvenssistä sen luonnolliseen TAG:hen asti; ja pEH4-2, pEG82, pEH3-25 ja pEH90-N-sarja, jotka koodittavat Cro/gD-1/β-galaktosidaasiyhdys-proteiineja. gD-l:n karboksipäässä olevat numeroidut pystysuorat nuolet tarkoittavat kohtia, joissa gD-l:n karboksia i2 83974 koodittava pää on liittynyt (1) pJS413:n 6-galaktosidaasigee-niin (z-geeni) seuraavissa yhdistelmäplasmideissa: pEH4-2, pEH82, pEH3-25; tai (2) pHK414:n z-geeniin pEH90-N-sarjan plas-mideissa.

Kuva 4 (ei ole piirretty mittakaavaan) esittää pEH25:n rakentamista, joka on yhdistelmäplasmidi, joka on johdettu gD-l-geenin osasta ja E. colin ilmentämisvektorista pJS413. Yhdistelmäplasmidi pEH25 ohjaa HSV-l-gD:lle sukua olevan proteiinin tuotantoa, jota koodittaa noin 87 % gD-l:tä koodittavasta sekvenssistä, joka on liitetty ilmentämisvektorista johdettuun "johtosekvens-siin" (ero).

Kuva 5 esittää pEH25:ssä olevan Cro/gD-l-liitoksen DNA-sekvenssiä ja ennustettua aminohapposekvenssiä.

Kuva 6 esittää pEG25-gD-tuotteen immuunisaostumisen inhiboitu-mista, kun lisätään HSV:llä infektoituneiden HeLa-solujen lysaa-teissa olevia kilpailevia antigeenejä. Avoimet ympyrät edustavat infektoitumattomien HeLa-solujen lysaatteja (verrokit); avoimet neliöt edustavat HSV-l:llä infektoituneiden HeLa-solujen lysaatteja.

Kuva 7 (ei ole piirretty mittakaavaan) esittää pEH4-2:n rakentamista, joka on pEH25:stä johdettu gD-l:n ilmentämisplasmidi, jossa gD-l:tä koodittavan sekvenssin 3'-päästä on poistettu 205 nukleotidia (69 aminohappoa) ja korvattu noin 3000 lisänukleoti-dilla, jotka koodittavat E. colin β-galaktosidaasiproteiinia. Tällä yhdistelmäplasmidilla voidaan tuottaa "voileipäproteiinia" (tai yhdysproteiinia), jossa E. coliin liittyviä polypeptidejä (so. Cro ja β-galaktosidaasi) on liittynyt gD-l-spesifisen proteiinin päihin vastaavasti.

Kuva 8 (ei ole piirretty mittakaavaan) esittää menetelmää useiden gD-l:tä ilmentävien plasmidien, pEH50+x, tuottamiseksi, joista kukin sisältää eripituisen jakson gD-geenin aminoa koodittavasta päästä.

H

13 83974

Kuva 9 (ei ole piirretty mittakaavassa) esittää menetelmää, jolla pEH4-2:n gD-l-geenin aminoa koodittava pää rekonstruoidaan niin, että plasmidilla pEH82 transformoituneet isäntäsolut ilmentävät gD-l-proteiinia, joka on liittynyt B-galaktosidaasiin.

Kuva 10 (ei ole piirretty mittakaavassa) esittää pEH90-10am-plasmidin rakentamista, joka on pEH3-24:stä ja pHK414:stä johdettu gD-l:n ilmentämisplasmidi. Yhdistelmäplasmidi pEH90-l0am tekee mahdolliseksi sekä erillisen että β-galaktosidaasiin liittyneen gD-l:n valmistamisen E.coli-transformanteilla, jotka sisältävät kullanruskean (amber) suppressori-tRNA:ta.

Kuva 11a esittää HSV-2-perimää ja siihen on merkitty Bglll-pala-sen sijainti ainoassa, lyhyessä alueessa (Us), joka sisältää HSV-2:n gD-geenin (käytetään tästä lähtien nimitystä gD-2-geeni). Bglll-katkaisukohdista, jotka määrittelevät L-palasen, on käytetty merkintää Bg.

Kuva 11b esittää pHVl:een liitetyn Bglll L-palasen restriktio-karttaa. Ainoastaan relevantit restriktioendonukleaasien tunnis-tuskohdat on merkitty esiin. Restriktioentsyymien tunnistuskoh-dat on lyhennetty seuraavasti: BamHI (Ba); Bglll (Bg); Clal (C); Hindlll (H3); PvuII (Pv); Sali (Sa); Sacl (Se); Sphl (Sp) ja XhoI (Xh). Paksunnettu alue tarkoittaa gD-2-mRNA:ta kooditta-van sekvenssin sijaintia ja asemaa.

Kuva 11c esittää pHV2:n liitännäisen HSV-2-XhoI-DNA-palasen restriktiokarttaa.

Kuva 12 esittää gD-2-geenin nukleotidisekvenssiä ja ennustettua gD-2-proteiinin aminohapposekvenssiä. Relevantit restriktiokoh-dat on merkitty ja numeroidut pystysuorat nuolet gD-2-geenin aminoa koodittavassa päässä tarkoittavat kohtia, joissa gD-2:n aminoa koodittava pää on liittynyt pJS413:een yhdistelmäplasmi-deissa pHV5 (joka sisältää gD-2:n karboksia koodittavan pään kokonaan) ja pHV6. BamHI-kohta on se kohta, jossa gD-2:n i4 83974 karboksia koodittava pää on liittynyt pHK414:n z-geeniin pHV6:ssa.

Kuva 13 esittää gD-l:n ja gD-2:n ennustettujen aminohapposekvenssien vertailua. Aminohappotähteet on merkitty yhden kirjaimen koodilla. Ne aminohappotähteet, jotka ovat homologisia gD-1-ja gD-2-sekvenssissä on merkitty viivoilla gD-2-sekvenssiin. gD-2-sekvenssi on yhtä aminohappotähdettä lyhempi kuin gD-1-sekvenssi. gD-2:sta "puuttuva" aminohappo on merkitty tähdellä (*) .

Kuva 14 (ei ole piirretty mittakaavassa) esittää pHV5:n rakentamista, joka on gD-2-geenin osasta ja pJS413:sta johdettu yhdiste lmäplasmidi . Yhdistelmäplasmidi pHV5 ohjaa HSV-2:n gD:lle sukua olevan proteiinin tuotantoa, jota proteiinia koodittaa noin 90 % gD-2:ta koodattavasta sekvenssistä, joka on liitetty ilmentämisvektorista johdettuun "johtosekvenssiin" (Cro) .

Kuva 15 esittää pHV6:n rakentamista, joka on pHV5:stä johdettu gD-2:n ilmentämisplasmidi, josta on poistettu 259 nukleotidia (86 aminohappoa) gD-2:ta koodittavan sekvenssin 3'-päästä ja korvattu noin 3000 lisänukleotidilla, jotka on johdettu ilmentä-misplasmidista pHK414 ja koodittavat E.colin β-galaktosidaasi-proteiinia. Yhdistelmäplasmidi pHV6 tekee mahdolliseksi yhdys-proteiinin ("sandwich" protein, fusion protein) tuotannon, jossa E. colille sukua olevat polypeptidit (so. Cro ja 3-galaktosidaasi) on liitetty gD-2:lle sukua olevan proteiinin päihin vastaavasti .

5. Keksinnön kuvaus Tämä keksintä koskee yhdistelmä-DNA-tekniikan käyttöä HSV-proteii-neille sukua olevien proteiinien valmistamiseksi, joita voidaan käyttää vastustuskyvyn aiheuttavina aineina rokotteissa. Tarkemmin sanottuna tässä kuvataan gD:lle sukua olevien proteiinien valmistus. Koska polyvalenttinen antiseerumi, joka kohdistuu HSV-l-gD:hen, kykenee neutraloimaan sekä HSV-l:n että HSV-2:n, voidaan puhdasta gD-proteiinia tai sen antigeenisesti merkittävää is 83974 osaa käyttää osarokotteessa, joka suojaa rokotteen saajan tehokkaasti sekä HSV-l:n että HSV-2:n aiheuttamilta primäärisiltä infektioilta.

Yhdistelmäplasmidit, jotka on rakennettu tässä selostetulla tavalla, saavat aikaan sen, että isäntäsolu tuottaa proteiinia, joka on gDrlle sukua oleva polypeptidi, ja joka on stabiili eikä hajoa isäntäsolun vaikutuksesta; tällaiset plasmidit tekevät mahdolliseksi tuottaa suuria määriä gD:lle sukua olevaa proteiinia tai yhdysproteiinia, jolla on gD:n immunologiset ja antigeeniset ominaisuudet. Kuitenkaan tässä kuvatut DNA-raken-teet eivät rajoitu pelkästään gD:lle sukua olevien proteiinien valmistamiseen, vaan niitä voidaan käyttää mille tahansa HSV-proteiineille sukua olevien polypeptidien valmistamiseen. On helposti ymmärrettävissä, että erilaisia immunogeenejä ja rokotteita voidaan valmistaa.

Selostuksen kannalta tämän keksinnön kohteena oleva menetelmä voidaan jakaa seuraaviin vaiheisiin: (1) HSV-glykoproteiinigee-nin tai -geenijakson identifiointi ja eristäminen, (2) geenin tai geenijakson liittäminen kloonauksessa käytettyyn ilmentämis-vektoriin niin, että saadaan yhdistelmä-DNA-molekyyli, jolla transformoidaan yksisoluiset organismit, (3) sellaisten transformoituneiden yksisoluisten organismien tunnistaminen ja kasvatus, jotka kykenevät replikoimaan ja ilmentämään geenin, (4) geeni-tuotteen identifiointi ja puhdistus ja (5) geenituotteen immuuni-suutta aiheuttavan tehon määrittäminen mittaamalla sen kyky herättää neutraloivien vasta-aineiden tuotanto. Selvyyden vuoksi koko menetelmää selostetaan gD-geeniä käyttäen. Kuitenkin samoja menetelmiä voidaan käyttää vastaavalla tavalla mille tahansa HSV-glykoproteiinille sukua olevan polypeptidin valmistamiseksi.

5.1. HSV-glykoproteiinigeenien identifiointi ja eristäminen HSV-glykoproteiinigeeni (gD) voidaan saada mistä tahansa HSV-tyypin 1 tai 2 kannasta. HSV-geenin (tai sen osan) eristämisessä eristetään ensin HSV-DNA, aikaansaadaan HSV-DNA-palaset ja tunnistetaan ne palaset, jotka sisältävät glykoproteiinigeeni- ie 83974 sekvenssejä. Ennen tunnistamista HSV-DNA-palaset tavallisesti liitetään kloonausvektoreihin, joilla transformoidaan isäntä-solut; näin on mahdollista valmistaa suuri määrä HSV-DNA-palas-ten kopioita niin, että niitä on tarjolla runsas määrä analyysin ja tunnistamisen suorittamista varten.

HSV-DNA voidaan saada joko (1) eristämällä suoraan viruksesta, joka on puhdistettu viruksella infektoiduista eukaryoottisista soluista, tai (2) bakteriofageista tai plasmideista, joihin sisältyy osa viruksen perimää, jossa on gD-geeni.

HSV-DNA-palasten aikaansaamiseksi voidaan DNA katkaista tietyistä kohdista restriktioentsyymejä käyttämällä; vaihtoehtoisesti voidaan käyttää DNAasia mangaanin läsnäollessa DNA:n katkomiseksi; tai DNA voidaan leikata fysikaalisesti esim. sonikaatiolla. Sitten lineaariset DNA-palaset voidaan erottaa koon mukaan tavanomaisilla menetelmillä, kuten esim. agaroosi- tai polyakryyliamidi-geelielektroforeesilla ja pylväskromatografisesti. Mitä tahansa restriktioentsyymiä tai restriktioentsyymiyhdistelmää voidaan käyttää gD-sekvenssin sisältävän HSV-DNA-palasen aikaansaamiseksi edellyttäen, että entsyymit eivät tuhoa gD-geenituot-teen immuunisuutta aiheuttavaa tehoa. Proteiinin antigeeninen kohta voi sisältää noin 7 - noin 14 aminohappoa. Näin ollen proteiini, joka on gD:n kokoa, voi sisältää monia erillisiä antigeenisiä kohtia, mahdollisesti tuhansia, kun otetaan huomioon päällekkäiset sekvenssit, sekundääriset rakenteet ja pro-sessointitapahtumat, kuten asetylointi, glykosylointi ja fosfory-lointi. Näin ollen monet osittaiset gD-geenin sekvenssit voivat koodittaa antigeenistä kohtaa. Siksi voidaan käyttää monia restriktioentsyymiyhdistelmiä sellaisten DNA-palojen aikaansaamiseksi, jotka sopivaan vektoriin liitettyinä kykenevät yksi-soluisessa organismissa ohjaamaan spesifisten gD-aminohappo-sekvenssien tuotantoa, joilla on erilaisia antigeenisiä ominaisuuksia.

Kun isäntäsolut transformoidaan näillä yhdistelmä-DNA-molekyyleillä, jotka sisältävät HSV-DNA-palaset, voidaan tuottaa suuri

II

IV 83974 määrä virus-DNA:n kopioita, jotka voidaan analysoida sen palasen tunnistamiseksi, joka sisältää gD-geenisekvenssin. HSV-DNA-restriktiopalasten liittäminen kloonausvektoriin voidaan suorittaa helposti, jos vektorilla on komplementaariset kohesiiviset päät. Kuitenkin., jos niitä kompelementaarisia katkaisukohtia, jotka aiheutuivat HSV-DNA:n katkaisussa, ei ole läsnä kloonaus-vektorissa, voidaan HSV-DNA:n tai kloonausvektorin päät muuntaa. Näissä muutostoimenpiteissä mm. muodostetaan tylppiä päitä hajottamalla pois yksisäikeisiä DNA-päitä tai täyttämällä yksisäi-keisiä päitä niin, että päät voidaan liittää yhteen tylppinä. Vaihtoehtoisesti voidaan muodostaa mikä tahansa haluttu katkaisu-kohta liittämällä DNA:n päihin nukleotidisekvenssejä (sidoksen-muodostajia); nämä liitetyt sidoksenmuodostajat voivat olla erityisiä kemiallisesti syntetisoituja oligonukleotideja, jotka koodittavat restriktioentsyymien tunnistussekvenssejä. Toisten menetelmien mukaan voidaan katkaistu vektori ja HSV-DNA-jakso modifioida homopolymeerisilla hännillä (vrt. Morrow'n esittämää katkaisua julkaisussa Methods in Enzymology, 1979, 68:3).

gD-geenin sisältävän erityisen DNA-palasen identifiointi voidaan suorittaa eri tavoin. Ensinnäkin on mahdollista määrittää viruksen DNA-palasten emäsjärjestys (Maxam and Gilbert, 1980, Methods in Enzymology 6_5:49 9) ja sen jälkeen identifioida gD-geenin sekvenssin sisältävä palanen vertaamalla ennustettua aminohappojärjestystä gD-proteiinin aminohappojärjestykseen. Toisaalta gD-geenin sisältävä palanen voidaan identifioida mRNA-valinnalla. HSV-DNA-palasia käytetään komplementaarisen mRNA:n eristämiseen, joka tapahtuu hybridisoinnilla. Eristettyjen mRNA-laatujen in vitro-luentatuotteiden immuunisaostusanalyysi identifioi mRNA:n ja näin ollen komplementaariset HSV-DNA-palaset, jotka sisältävät gD-geenisekvenssejä. Vielä eräs mahdollisuus valita gD:n suhteen spesifiset mRNA:t on suorittaa HSV:llä infektoiduista soluista eristettyjen polysomien adsorptio immobilisoituihin monoklonaali-siin vasta-aineisiin, jotka kohdistuvat gD-proteiiniin. Radioaktiivisesta merkitty gD-mRNA tai -cDNA voidaan syntetisoida käyttämällä valittua mRNA:ta (adsorboituneista polysomeista) templaat-tina. Radioaktiivisesti merkittyä mRNArta tai cDNAsta voidaan is 83974 sen jälkeen käyttää koettimena niiden HSV-DNA-palasten identifioimiseksi, joissa on gD-sekvenssejä (Southern, 1975, J.Mol.Biol.

98: 503; Alwine et ai., 1979, Methods in Enzymology, 68:220).

Sopivia tapoja gD-geenin eristämiseksi ovat mm. itse geenin kemiallinen syntetisointi (edellyttäen, että sekvenssi tunnetaan) tai cDNA:n (komplementaarinen DNA) tekeminen mRNA:lle, joka koo-dittaa gD-geeniä. Tätä varten gD:n suhteen spesifinen mRNA eristetään viruksella infektoiduista soluista. Eristetty mRNA muunnetaan sen jälkeen tavanomaisilla menetelmillä cDNA-kopioksi ja liitetään suoraan kloonausvektoriin.

Kun isäntäsolut transformoidaan yhdistelmä-DNA-molekyyleiliä, jotka sisältävät eristetyn geenin, cDNA:n tai syntetisoidun DNA-sekvenssin, voidaan saada aikaan suuri määrä geenin kopioita.

Näin ollen geeniä voidaan saada mikrogrammojen luokassa olevina määrinä, kun transformantteja kasvatetaan, eristetään yhdistelmä-DNA-molekyylit transformanteista ja otetaan liitetty geeni eristetystä yhdistelmä-DNA:sta. Vaihtoehtoisesti voidaan gD-geeniä saada mikrogrammojen luokassa olevina määrinä gD-geenin lähteestä, esim. herpes simplex-viruksen infektoimista eläinsoluista tai sellaisista bakteereista tai fageista, joissa on virusgeeni yhdistemäplasmideissa. Viruksen tai plasmidin DNA eristetään, katkotaan paloiksi, fraktioidaan ja määritetään palojen koko samoilla menetelmillä, kuin käytettiin geenin paikantamisessa.

5.2. HSV-glykoproteiinigeenin liittäminen kloonauksessa käytettyyn ilmentämisvektoriin_

Kun gD-geeni tai sen palanen on saatu eristetyksi, se liitetään sopivaan ilmentämisvektoriin, so. vektoriin, joka sisältää kaikki liitetyn geenin transkription ja luennan kannalta tarpeelliset elementit (ks. Roberts and Lauer, 1979, Methods in Enzymology, 68: 473). Jotta gD-geeni (tai sen osa) ilmentyisi tehokkaasti, pitää ilmentämisvektorissa olla promoottori. RNA-polymeraasi sitoutuu tavallisesti promoottoriin ja aloitaa geenin tai yhteen-liittyneiden geenien ja ohjauselementtien (nimeltään operoni) i9 83974 transkription. Promoottorien "vahvuus" vaihtelee eli ts. niiden kyky edesauttaa transkriptiota. Kun on kyseessä molekulaarinen kloonaus, on edullista käyttää vahvoja promoottoreita, jotta saadaan tapahtumaan suuri määrä transkriptiota ja sen seurauksena suuri määrä ilmentynyttä geeniä. Käytetystä isäntäsolusta riippuen voidaan valita joku lukuisista sopivista promoottoreista. Esimerkik si kloonattaessa E. coli-isäntäsolu voidaan käyttää mitä tahansa promoottoria, joka on eristetty E. colista, sen bakteriofageista tai plasmideista (esim. lac-promoottori). Liitetyn geenin transkription aikaansaamiseksi voidaan myös käyttää sellaisia E. colin promoottoreita, jotka on saatu aikaan yhdistelmä-DNA-tekniikalla tai muilla synteettisillä DNA-menetelmillä. Tarkemmin sanottuna kolifagi lambdan PR- ja PL-promoottorit ohjaavat niihin liittyneiden DNA-palasten transkriptiota niin, että syntyy suuria määriä. Myös E. colin rec-promoottori saa aikaan liittyneiden palasten geenitranskription suurina määrinä.

Jotta geenin transkriptio ja luenta tapahtuisi tehokkaasti pro-karyoottisissa ja eukaryoottisissa soluissa, tarvitaan tietyt aloitussignaalit. Nämä transkription ja luennan aloitussignaa-lit voivat vaihdella "vahvuudeltaan", kun mitataan geenin suhteen spesifisen mRNA:n ja syntetisoituneen proteiinin määrinä vastaavasti. DNA:n ilmentämisvektori, joka sisältää promoottorin, voi sisältää myös minkä tahansa yhdistelmän "vahvuudeltaan" erilaisia transkription ja/tai luennan aloitussignaaleja. Näin ollen voidaan käyttää mitä tahansa SD-ATG-yhdistelmää, jota isäntäsolujen ribosomit voivat käsitellä, joita ovat mm. SD-ATG-yhdistelmä, joka on saatu kolifagi lambdan ero-geenistä tai N-geenistä tai E.colin tryptofaani E-, D-, C-, B- tai A-geenistä. Myös voidaan käyttää mitä tahansa SD-ATG-yhdistelmää, joka on valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla tai jollakin muulla syntetisointitek-niikalla.

Mitä tahansa edellä kuvattuja menetelmiä, joita kuvattiin DNA-palasten liittämiseksi vektoriin, voidaan käyttää promoottorin ja muiden ohjauselementtien liittämiseksi tiettyihin kohtiin vektorin sisällä.

2o 83974 Näin ollen gD-geeni (tai mikä tahansa sen osa) voidaan liittää ilmentämisvektoriin tiettyyn kohtaan suhteessa vektorin sisältämään promoteriin ja ohjauselementteihin niin, että gD-geenin sekvenssi on oikeassa luentakehyksessä (so. faasissa) vektorin ATG-sekvenssiin nähden. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää gD:n ATG-kodonia tai synteettistä ATG-kodonia. Saatu yhdistelmä-DNA-molekyyli siirretään sen jälkeen sopivaan isäntäsoluun transformaatiolla, transduktiolla tai transfektiolla (riippuen vektori-isäntäsolusysteemistä). Transformantit valitaan sen mukaan, miten ne ilmentävät vektorissa tavallisesti läsnäolevia geeni-merkkejä, kuten vastustuskyky ampisilliinin tai tetrasykliinin suhteen pBR322:ssa tai tymidiinikinaasiaktiivisuus eukaryootti-sessa isäntäsysteemissä. Tällaisten merkkiproteiinien ilmentyminen osoittaa, että yhdistelmä-DNA-molekyyli on ehyt ja replikoituu. Sopivia merkkifunktion sisältäviä ilmentämisvektoreita ovat mm. seuraavat vektorit ja niiden johdannaiset: SV40 ja adenovirus-vektorit, hiivavektorit, bakteriofagivektorit, kuten lambda gt-WES-lambda B, Charon 28, Charon 4A, lambda gt-l-lambda BC, lambda gt-l-lambda B, M13mp7, M13mp8, M13mp9 tai plasmidi-DNA-vektorit, kuten pBR322, pAC105, pVA51, pACY177, pKH47, pACYCl84, pUBllO, pMB9, pBR325, Col El, pSClOl, pBR313, pML21, RSF2124, pCRl tai RP4.

Lisäksi voidaan valita sellaisia isäntäsolukantoja, jotka kykenevät estämään promoottorin toiminnan, ellei toimintaa erityisesti käynnistetä. Tällä tavalla yli 95 % vektorin promoottorin tehokkuudesta voidaan inhiboida, jos soluja ei indusoida. Tiettyjen operonien ollessa kyseessä pitää lisätä erityisiä indusoijia, jotta saataisiin aikaan liitetyn DNA:n tehokas transkriptio tai luenta; esimerkiksi lac-operoni indusoidaan lisäämällä laktoosia tai IPTG:tä (so. isopropyylitio-B-D-galaktosidaasia). Lukuisat muut operonit, kuten trp, pro jne., ovat erilaisen ohjauksen alaisia. Trp-operoni käynnistyy, kun kasvualusta ei sisällä tryptofaania, ja lambdan PL-promoottori käynnistyy, kun kohotetaan sellaisten isäntäsolujen lämpötilaa, joissa on lämpöherkkä lambdan repressoriproteiini, esim. CI857. Näin ollen geenitekniikalla aikaansaadun gD-proteiinin ilmentymistä voidaan ohjata.

2i 83974 Tämä on tärkeätä, jos kloonatun geenin proteiinituote on letaali-nen isäntäsoluille. Tällaisissa tapauksissa vieras geeni voidaan saada replikoituinaan, mutta ei ilmentymään transformanttien kasvun aikana. Kun solut ovat saavuttaneet sopivan tiheyden kasvualustassa, voidaan promoteri indusoida tuottamaan kyseessä olevaa proteiinia.

gD:lle sukua olevista proteiineista, joita edellä kuvatulla tavalla transformoidut, plasmideilla (so. plasmidit, jotka ohjaavat gDrlle sukua olevien proteiinien ilmentymistä, joka päättyy luonnolliseen gD:n luennan päätössignaaliin, ja joka alkaa ATG-kodonista, joka on peräisin vektorista, gD-geenistä tai synteesi-toimenpiteestä) transformoituneet solut tuottavat, käytetään tästä lähtien nimitystä erilliset gD-proteiinit tai erilliset, gDrlle sukua olevat proteiinit.

5.3. Yhdysproteiinien valmistus

Jotta ilmentyvän geenin määrä saataisiin mahdollisimman suureksi tietyssä transformantissa, saattaa olla toivottavaa liittää kyseinen geeni sellaiseen geeniin, joka koodittaa toista proteiinia, kuten isäntäsolun omaa proteiinia. Lisäetuna on myös se, jos isäntäsolun proteiini sisältää myös jonkin mitattavissa olevan suureen. Yhteenliittyneiden geenien ilmentymistuote on yhdys-proteiini (käytetään tästä lähtien nimitystä gD-yhdysproteiinit), joka voidaan identifioida suuren molekyylipainonsa ja mitattavissa olevan ominaisuutensa perusteella. Esimerkiksi gD/g-galaktosi-daasiyhdysproteiinin tuottaminen tarjoaa useita etuja, kun kloonataan ja ilmennetään gD-proteiinia E. coli-isännässä. Ensinnäkin tämä tekee mahdolliseksi vektorin ohjaaman proteiinituotannon määrän arvioinnin (siis ilmentymisen arvioinnin), kun käytetään β-galaktosidaasiaktiivisuuden suhteen spesifistä kolorimetristä määritystä Miller'in menetelmällä (ss. 47-55 ja 352-355, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press,

New York, N.Y., 1972). Toiseksi yhdysproteiinien tuottaminen yksinkertaistaa proteiinituotteen identifiointia ja eristämistä. Erillinen gD-proteiini, jota E. coli-transformantit tuottavat, on pienempi kuin gD/(3-galaktosidaasiyhdysproteiini ja sellaisenaan 22 83974 se voi liikkua samanaikaisesti useiden muiden isännän proteiinien kanssa, kun analyysi suoritetaan SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla. Valmistettu yhdysproteiini sen sijaan voidaan helposti ilmaista ja tunnistaa SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla (SDS-PAGE) ainutlaatuisen, suuren molekyyli-kokonsa perusteella.

Tämä keksintö ei rajoitu β-galaktosidaasiyhdysproteiinin valmistamiseen, vaan mikä tahansa joko eukaryoottista tai prokaryoottis-ta alkuperää oleva geeni voidaan liittää faasiin gD-geenin (tai minkä tahansa HSV-proteiinin geenin) kanssa niin, että saavutetaan samanlaisia etuja, kuin liittyy β-galaktosidaasiyhdysproteiini-tuotteeseen. Tästä voidaan mainita esimerkkeinä mm. galaktoki-naasi, trp D, E tai johtogeeni (leader), pilus-geenit ja eukaryoot-tiset geenit, kuten tymidiinikinaasigeeni, β-globiinigeeni, SV-40 T-antigeenin geeni tai Rous Sarcoma-viruksen transformointi-geeni.

Jotta yhdysproteiinia koodittava geeni saataisiin rakennetuksi, molemmat geenit pitää liittää yhteen niiden koodittavien sekvenssien alueella siten, että luentakehys säilyy eikä keskeydy päätössignaalien vaikutuksesta. Kuten jo edellä selostettiin, valmistuu yhdysproteiinia vain indusoitaessa, jos isäntäsolukanta on sellainen, joka inhiboi promoottorin toimintaa.

5.4. Geenituotteen tunnistaminen

Kun oikean DNA-rakenteen sisältävät transformantit on ensin tunnistettu, pitää yhdistelmä-DNA:n gD-geenituotteen immunoreak-tiivisuus ja antigeenisyys analysoida. Jos isäntäsolu ei kykene glykosyloimaan gD-geenituotetta samalla tavalla kuin luonnossa esiintyvää HSV-gD:tä, eroaa gD-geenituote luonnossa esiintyvästä gD-glykoproteiinista. Näin ollen immunologinen analyysi on erittäin tärkeä gD-geenituotteen kohdalla, koska lopullinen päämäärä on käyttää näin saatua gD:lle sukua olevaa proteiinia rokoteformulaatioissa. Immunoreaktiivisuusanalyysi on edullisinta suorittaa käyttämällä vastaseerumeja, jotka reagoivat HSV:llä infektoitujen solujen gD-glvkoproteiinia vastaan, kun 23 83974 taas antigeenisyys voidaan arvioida mittaamalla koe-eläinten vastaseerumitiitterit, jotka kehittyvät vasteena gD-geenituot-teella tapahtuvalle immunisoinnille, ja vastaseerumien kyky neutraloida HSV-infektio.

Immunoreaktiivisuuden analysointiin on tarjolla useita vastasee-rumeja, mukaanlukien polyvalenttiset vasta-ainevalmisteet, jotka on suunnattu koko virusta vastaan tai erityisesti gD:tä vastaan. Suurempi spesifisyys saadaan käyttämällä monoklonaali-sia vasta-aineita, jotka tunnistavat vain yhden antigeenisen kohdan gD-proteiinimolekyylissä. On olemassa useita monoklonaa-lisia vasta-aineita, jotka kohdistuvat gD:tä vastaan, joista vasta-aineista jotkut sekä spesifisesti immunosaostavat HSV-l:n ja HSV-2:n gD-geenituotteen että neutraloivat kummankin viruksen infektoimiskyvyn.

Näin ollen tässä keksinnössä selostetun proteiinin identifiointi perustuu kahteen edellytykseen. Ensinnäkin gD:lle sukua olevaa proteiinia pitäisi valmistua vain promoottorin indusoinnin tuloksena. Toiseksi gD:lle sukua olevan proteiinin pitäisi olla immuno-reaktiivinen, kun käytetään useita polyklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu HSV:tä vastaan, tai monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu gD:tä vastaan; ja proteiinin pitäisi olla immunoreaktiivinen oli se sitten peräisin koko geenin sekvenssin ilmentymisestä, geenin sekvenssin osan ilmentymisestä tai kahden tai useampien sellaisten geenisekvenssien ilmentymisestä, jotka on liitetty yhteen ohjaamaan yhdysproteiinin ilmentymistä. Reaktiivisuus voidaan osoittaa tavanomaisilla immunologisilla menetelmillä, kuten immunosaostuksilla, immunodiffuusiolla, radioimmuunikompetitiolla, immunoelektroforeesilla tai ilmaisemalla immunologisesti proteiinit, jotka on erotettu poly-akryyliamidigeelielektroforeesilla ja sen jälkeen siirretty nitro-selluloosaan .

5.5. Geenituotteen puhdistus gD-geenin (tai minkä tahansa HSV-glykoproteiinigeenin) sisältäviä soluja kasvatetaan suuressa tilavuudessa ja promoottorin indusoinnin 24 83974 jälkeen syntynyt proteiini eristetään tällaisista soluista tai väliaineesta, jos proteiini erittyy. Proteiini voidaan eristää ja puhdistaa joko tavanomaisilla kromatografisilla menetelmillä, kuten ioninvaihdolla, affiniteetti- tai koonerotushartseilla, sentrifugoimalla tai millä tahansa tavanomaisella proteiinien-puhdistusmenetelmällä.

Koska tietyt yhdysproteiinit muodostavat aggregaatteja solujen tuottaessa niitä erittäin paljon tai ollessaan liuoksessa, on tässä keksinnössä valmistettujen yhteenliittyneiden proteiinien eristämisessä erittäin edullista käyttää aggregaatteja muodostavien proteiinien eristysmenetelmää. Sen jälkeen näitä yhdys-proteiineja voidaan käyttää rokotteiden valmistuksessa. Yhdys-proteiinien puhdistuksessa (käytetään tästä lähtien nimitystä aggregaatin puhdistus) suoritetaan aggregaatteja muodostavien proteiinien uutto, erotus ja/tai puhdistus rikkomalla solut ja sen jälkeen pesemällä aggregoitunut materiaali. Lisäksi aggregoi-tunut materiaali voidaan liuottaa lisäämällä liuotinta, joka on sekä vahva vedynvastaanottaja että vahva vedynluovuttaja (tai voidaan käyttää liuotinyhdistelmää, joka antaa nämä molemmat ominaisuudet); sen jälkeen aggregaatteja muodostavat proteiinit voidaan saostaa laimentamalla sopivalla puskurilla. Sopivia liuottimia ovat mm. urea (välillä noin 4M - noin 8M), formamidi (vähintään noin 80 tilavuus-%) ja guanidiinihydrokloridi (noin 4M - noin 8M). Eräät liuottimet, jotka kykenevät liuottamaan aggregaatteja muodostavia proteiineja, kuten esim, SDS (natriumdodekyyli-sulfaatti) ja 70-prosenttinen muurahaishappo, eivät sovellu tässä menetelmässä käytettäviksi, koska sen jälkeen tapahtuva liuenneiden aggregaatteja muodostavien proteiinien saostuminen on osoittautunut tehottomaksi. Vaikka guanidiinihydrokloridi ja muut samanlaiset aineet ovat denaturoivia aineita, tutkimukset osoittavat, että tämä denaturoituminen ei ole luonteeltaan irreversiibeliä, ja että renaturoituminen voi tapahtua sen jälkeen, kun denaturoiva aine on poistettu tai laimennettu (esim. dialyysillä), jolloin immunologisesti ja/tai biologisesti aktiivinen proteiini muodostuu uudestaan.

25 83974

Eräs yhdysproteiinin eristysmenetelmä on pääpiirteissään seu-raava (seuraavassa siitä käytetään nimitystä denaturoimaton aggregaatinpuhdistusmenetelmä): solupelletti jäädytetään nopeasti käyttämällä hiilihappojään ja metanolin seosta, punnitaan ja 3-4 g soluja suspendoidaan uudestaan vähintään 25 ml:aan puskuriliuosta /esim. 50 mM tris.HCl (tris-hydroksimetyyliamino-metaanihydrokloridi), pH 8,0, 2 mM EDTA (etyleenidiamiinitetra-etikkahappo) ja 200 mM NaC_l/. Näin ollen solut siis suspendoidaan puskuriliuokseen niin, että väkevyydeksi tulee noin 100-200 g soluja/litra. Väkevyydet, jotka ovat alle noin 160 g/1, asetetaan etusijalle. Tähän suspensioon lisätään lysotsyymiä niin, että lopulliseksi väkevyydeksi tulee 130 ,ug/ml ja saadun seoksen anne-taan seisoa 4 C:ssa 20 minuuttia silloin tällöin ravistellen. Lisätään Nonidet P40 (NP-40 on Shell-yhtiön tavaramerkki, poly-oksietyleeni (9) p-tert.-oktyylifenoli), joka on kalvojen liuottamiseen käytetty ei-ioninen pinta-aktiivinen aine, lopulliseen väkevyyteen 0,1 % ja liuos sekoitetaan. Sitten suspensiota jauhetaan noin 1 minuutti käyttämällä Polytron-myllyä (Brinkman Instruments, Westbury, N.Y.) tai vastaavaa.

Suspensiota sentrifugoidaan nopeudella 8000 x g 30 minuuttia ja pelletti suspendoidaan uudestaan pesupuskuriin, esim. 20 mM Tris.HCl (pH 7,2), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl ja 2 % Triton-X lOO (polyoksietyleeni (9-10) p-tert.-oktyylifenoli, ei-ioninen pinta-aktiivinen aine) ja jauhetaan Polytron-myllyllä. Tämä vaihe, jossa suoritetaan sentrifugointi, pesu ja jauhaminen, voidaan toistaa, jotta pelletti saadaan pestyksi paremmin ja mahdollisimman paljon rikkoutunutta solumateriaalia poistetuksi.

Vaihtoehtoisesti aggregaattipelletti voidaan vielä käsitellä lisäämällä denaturoivaa ainetta (seuraavassa käytetään nimitystä denaturoiva aggregaatinpuhdistusmenetelmä): Suspensio sentrifu goidaan, emäliuos poistetaan täysin ja pelletti suspendoidaan uudestaan noin 1/5 tilavuuteen 6M guanidiinihydrokloridia (tislatussa vedessä). Esimerkiksi 3 g soluja, jotka on pesty 25 ml:lla puskuriliuosta, pitäisi nyt suspendoida uudestaan 5 ml:aan 6M guanidiinihydrokloridiliuosta. Saattaa olla vaikeata suspen- 26 8 3 9 7 4 doida pelletti uudestaan tässä vaiheessa ja saatetaan tarvita sonikaatiota tai homogenointia, jotta saadaan homogeeninen liuos. Liuoksen annetaan seisoa 22°C:ssa 20 minuuttia ja sen jälkeen sentrifugoidaan 30 minuuttia nopeudella 8000 x g rikkoutuneen solumateriaalin poistamiseksi ja säilytetään emäliuos, joka tässä vaiheessa sisältää yhdysproteiinin.

Yhdysproteiini saostetaan guanidiinihydrokloridiemäliuoksesta lisäämällä noin 4 tilavuutta veteen tehtyä puskuria. Tässä vaiheessa voidaan käyttää melkeinpä mitä tahansa veteen tehtyä puskuria, mutta kuitenkin on edullista lisätä pieni määrä ei-ionista pinta-aktiivista ainetta, kuten 0,5 % NP-40 tai Triton X-100. Tämän suspension annetaan seisoa 30 minuuttia 4°C:ssa ja sen jälkeen sitä sentrifugoidaan 10 minuuttia nopeudella 8000 x g. Emäliuos heitetään pois, pelletti (joka sisältää yhdys-proteiinisakan) suspendoidaan uudestaan sopivaan puskuriin, esim. fosfaatilla puskuroitu fysiologinen suolaliuos (PBS) minä tahansa sopivana tilavuutena. Lyhyt sonikaatio tai homogenointi voi auttaa homogeenisen suspension tai lietteen aikaansaamisessa (koska aggregaatteja muodostavat proteiinit ovat veteenliukene-mattornia).

5.6. Erillisen gD-proteiinin valmistus

Rokotteissa saattaa olla toivottavaa käyttää erillistä gD-proteiinia. Kuitenkin, kuten aikaisemmin on selostettu, erillisiä gD-proteiineja valmistavat transformantit tuottavat pienempiä määriä kuin ne transformantit, jotka tuottavat yhdysproteiineja; tämä pätee, vaikka erillisen proteiinin geenisekvenssi olisi indusoitavan promoottorin ohjauksessa. Lisäksi bakteeritransformant-tien tuottamat erilliset gD-proteiinit voivat olla vähemmän stabiileja kuin gD-yhdysproteiinit.

Tämän keksinnön vaihtoehtoisessa toteutustavassa isäntäsolutrans-formantti voidaan saada tuottamaan suuria määriä sekä gD:lle sukua olevia yhdysproteiineja että erillisiä proteiineja, jotka seka-aggregoituvat ja voidaan puhdistaa helposti. Tämän toteutustavan mukaan gD-yhdysproteiineja koodittavia yhdistelmä- 27 83 974 plasmideja muunnetaan gD-geenin sekvenssin ja isäntäsolun proteii-nigeenin sekvenssin (esim. β-galaktosidaasin z-geenisekvenssin) liitoskohdassa niin, että kyseisten kahden geenisekvenssin väliin sijoitetaan mitään merkitsemätön kodonisekvenssi (non-sense codon), so. ketjun katkaisusekvenssi, kuten kullanruskea (TAG), okra (TAA) tai opaali (TGA); ketjunkatkaisijän pitää olla faasissa sekä gD-sekvenssin että isäntäsolun geenisekvenssin lukukehysten kanssa. Tällainen muutos voidaan saada aikaan katkaisemalla plas-midi sellaisesta katkaisukohdasta (tai kohdista), joka sijaitsee näiden kahden geenisekvenssin välissä ja sen jälkeen liittämällä katkenneeseen plasmidin kohtaan sidoksenmuodostaja-DNA-sekvenssi, joka koodittaa ketjun katkaisua, kuten kullanruskea, okra tai opaali niin, että ketjunkatkaisija on faasissa molempien geenien sekvenssien luentakehysten kanssa.

Kun nämä kullanruskealla, okralla tai opaalilla muunnetut plas-midit siirretään isäntäsoluun, joka sisältää sopivia tRNA-tukah-duttajia (tRNA suppressors), syntetisoituu sekä gD:lle sukua olevaa erillistä proteiinia että gD-yhdysproteiinia. Jos kullanruskealla, okralla tai opaalilla muunnetuilla plasmideilla transformoidaan tukahduttamattomia soluja, saadaan pääasiassa gD:lle sukua olevaa erillistä gD-proteiinia.

On olemassa vähintään kaksi tapaa siirtää kullanruskealla, okralla tai opaalilla muunnettu plasmidi tukahdutettuun soluun: (1) trans- formantti (so. isäntäsolu, joka on transformoitunut kullanruskealla, okralla tai opaalilla muunnetulla plasmidilla) voidaan infektoida lysogeenisellä transduktiofagilla (esim, 080 pSU3 kantaa kullanruskeiden mutaatioiden SupF-tukahduttajaa); tai (2) kullanruskealla, okralla tai opaalilla muunnettuja plasmideja voidaan käyttää sellaisten solukantojen transformointiin, jotka sisältävät kullanruskean, okran ja opaalin tukahduttaja-tRNA:n vastaavasti. Esimerkkejä tällaisista kannoista ovat mm. LE392 (jossa on kullanruskeiden mutaatioiden supE- ja supF-tukahdutta-ja), YMC (sisältää supF:n) ja C600 (supE). Erilaisia E. colissa olevia kullanruskean tukahduttaja-tRNA-geenejä ovat mm. supB, supC, supD, supE, supF, supG, supL, supM, supN, supO, supP, supU ja supV; E. colissa olevia erilaisia okran tukahduttaja-tRNA- 28 83974 geenejä ovat mm. supB, supC, supG, supL, supM, supN, supO ja supV; erilaisiin E. colissa oleviin opaalin tukahduttaja-tRNA-geeneihin kuuluu mm. supK (ks. Bachmann and Low, 1980, Microbiological Rewiews 44(1): 1-56).

Isäntäsolut, jotka sisältävät sopivan tukahduttaja-tRNA-geenin, ja jotka ovat transformoituneet kullanruskealla, okralla tai opaalilla muunnetuilla plasmideilla, voivat tuottaa gDrlle sukua olevaa proteiinia sekä yhdysproteiinina että erillisenä proteiinina (gD-yhdysproteiinin ja erillisen gD-proteiinin määrien suhde riippuu isäntäsolussa ilmenevän tukahdutuksen vahvuudesta) ; molemmat proteiinit saavat aikaan immuunireaktion HSV:tä vastaan suunnattujen vastaseerumien kanssa. Sekä gD-yhdys-proteiini että erillinen gD-proteiini puhdistuvat yhdessä, kun käytetään denaturoimatonta aggregaatinpuhdistusmenetelmää (tässä tapauksessa menetelmä denaturoimaton seka-aggregaatinpuhdistus-menetelmä), joka on selostettu kohdassa 5.5.; liuotuksen jälkeen erillinen gD voidaan erottaa gD-yhdysproteiinista koon tai varauksen perusteella. Näin ollen voidaan transformoituneilla isäntä-soluilla tuotettuja erillisiä gD:lle sukua olevia proteiineja puhdistaa helposti suuria määriä ja formuloida rokotteissa käytettäviksi .

5.7. Rokotteen formulointi Tämän keksinnön tarkoituksena on tuottaa yhdistelmä-DNA-teknii-kan avulla HSV-glykoproteiinille sukua oleva polypeptidi, kuten gD:lle sukua oleva proteiini, jota voidaan käyttää immunogeeninä rokotteessa, joka antaa suojan HSV-1- ja/tai HSV-2-tartuntoja vastaan. Jos valmistettu gD:lle sukua oleva proteiini saa aikaan immuunireaktion tiettyjen HSV-1:n ja/tai HSV-2:n neutraloivien vasta-aineiden kanssa, on odotettavissa, että gD:lle sukua oleva proteiini saa aikaan immuunireaktion, joka neutraloi kyseisen viruksen in vivo. Geenitekniikalla aikaansaaduista immunogee-neistä tehtyjen rokotteiden oletetaan olevan turvallisempia kuin tavanomaiset rokotteet, jotka on tehty heikennetystä viruksesta, koska ei ole olemassa sitä vaaraa, että rokotteen saaja saisi infektion. Vaihtoehtoisesti voidaan geenitekniikalla valmis tettua gD-tuotetta käyttää aikaansaamaan vasta-aineita passii visessa immunoterapiassa käytettäviksi.

29 8 3 974

Vaikka gD/β-galaktosidaasiyhdysproteiini voi sinänsä olla käyttökelpoinen rokoteformulaatioissa, saattaa olla tarpeen ensin poistaa β-galaktosidaasiyksikkö. Vaihtoehtoisesti saattaa proteiinin immunogeenisyyden kannalta olla tarpeen rekonstruoida gD-geenin aminopää, koska aminopää saattaa sisältää tärkeitä antigeenisiä lisäkohtia. gD-geenin aminopää voidaan rekonstruoida liittämällä gD-proteiinin aminopäätä koodittava DNA-sekvenssi sopivaan kohtaan yhdistelmä-DNA-molekyylin sisältämässä gD:tä koodittavassa aluessa. Koska yhdistelmä-DNA-molekyylissä on kaikki tarpeelliset ilmentymisen ohjauselementit, rekonstruoidulla DNA-molekyylillä transformoituneet solut tuottavat täyspitkää (tai lähes täyspitkää) gD:lle sukua olevaa proteiinia.

Lopuksi geenitekniikalla tuotettu, gD:lle sukua oleva proteiini voidaan eristää ja puhdistaa isäntäsoluista tavanomaisia proteiinien eristämismenetelmiä käyttämällä tai käyttämällä tässä kuvattua aggregaatinpuhdistusmenetelmää. Lopullinen tuote voidaan sen jälkeen laimentaa sopivaan väkevyyteen ja formuloida minkä tahansa sopivan rokotteissa käytetyn apuaineen kanssa ja pakata käyttöä varten. Sopivia apuaineita ovat mm. pinta-aktiiviset aineet, esim. heksadekyyliamiini, oktadekyyliamiini, lysolesitiini, dimetyylidioktadekyyliammoniumbromidi, N,N-dioktadekyyli-N',N'-bis(2-hydroksietyyli-propaanidiamiini), metoksiheksadekyyliglyse-roli ja "Pluronic"-polyolit; polyanionit, esim. pyraani, dekstraani-sulfaatti, poly-IC, polyakryylihappo, "Carbopol"; peptidit, esim. muramyylidipeptidi, dimetyyliglysiini, tuftsiini; öljyemulsiot; ja aluna. Proteiinituote voidaan myös sisällyttää rokotteiden formuloinnissa käytettyihin liposomeihin tai ne voidaan liittää polysakkarideihin tai muihin polymeereihin.

Tässä kuvatut geenitekniikalla aikaansaadut DNA-molekyylit antavat suurta joustavuutta rokotteiden valmistukselle. Voidaan 3o 83974 esimerkiksi formuloida rokote käyttämällä gD:lle sukua olevaa proteiinia, joka on tuotettu transformanteilla, jotka sisältävät minkä tahansa osan gD-geenin sekvenssistä tai yhdistelmä-DNA-molekyylin, jossa on useita gD-geenin kopioita (tai niiden osia) peräkkäisesti. gD-geenin sekvenssi (tai sen osa) voidaan liittää sellaisiin geeneihin, jotka koodittavat muita inununogeenejä niin, että saatua yhdysproteiinituotetta voidaan käyttää multi-valenttisten rokotteiden valmistuksessa. Lisäksi gD-geenin sekvenssi (tai sen osa) voidaan liittää muiden HSV-glykoproteiinigeenien sekvensseihin (tai niiden osiin) minä tahansa yhdistelmänä. Lisäksi gD-sekvenssi voidaan ryhmittää uudelleen, jotta rokotteen immunogeenisyys kasvaa. Geenin sekvenssiä voidaan esimerkiksi muuntaa siten, että proteiinituote edustaa immuunijärjestelmän spesifisiä epitooppeja (esim. gD:n antigeenikohta, joka ei tavallisesti ole esillä, voidaan tuoda immuunijärjestelmään); tai sellaiset gD-geenin sekvenssit, jotka koodittavat proteiinin immunosuppressiivisia kohtia, voidaan poistaa.

6. Esimerkki: HSV-l:n _2D

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti gD-l-geeni paikannettiin ja identifioitiin liittämällä HSV-l:n perimän Us-osan DNA-palasia (ks. kuva la) vektoriin pBR322 niin, että muodostui yhdistelmäplasmideja, joista kukin sisälsi eri palasen HSV-1-perimästä. gD-geenin sisältävä plasmidi identifioitiin käyttämällä kolmea menetelmää (ei välttämättä tässä luetellussa järjestyksessä) : (1) DNA-sekvenssin määritys, (2) gD-l:n suhteen spesifi set mRNA-hybridisaatiotutkimukset ja (3) yhdistelmäplasmideihin hybridisoituvan mRNA:n luenta in vitro.

Kun gD-l-geenin sisältävä plasmidi oli identifioitu, geeni karakterisoitiin DNA-sekvenssin määrityksellä ja paikantamalla gD-l-geenin päät yhdistelmäplasmidin sisältä. Identifioidusta plasmidista eristettiin DNA-palanen, joka sisälsi gD-l-geenin, mutta josta puuttui koodittavan sekvenssin ensimmäiset 156 nukleotidia. Tämä palanen liitettiin DNA-vektoriin pJS413 niin, että saatiin pEH25, jota käytettiin geenin kloonaukseen ja 3i 83974 ilmentämiseen E. colissa. Indusoiduista transformanteista eristetty geenituote todettiin gD-l-tyyppiseksi proteiiniksi suorittamalla immuunisaostus monoklonaalisilla vasta-aineilla, jotka on suunnattu gD-l:tä vastaan, ja polyvalenttisilla vasta-aineilla, jotka on suunnattu HSV-l:tä vastaan.

Lopuksi pEH25:stä eristettiin gD-l-geenipalanen suorittamalla restriktioentsyymikatkaisu tietyistä kohdista niin, että gD-l:tä koodittavan sekvenssin päätössekvenssi (TAG) poistui. Tämä DNA-palanen, joka sisälsi gD-l-geenin osan ja plasmidin promoottori- ja ohjauselementit (esim. SD-ATG), liitettiin vektoriin, jossa oli β-galaktosidaasia koodittava sekvenssi. Näin saatiin yhdistelmä-plasmidi, pEH4-2, joka sisälsi gD-l:tä koodittavan sekvenssin, jonka toisella puolella sijaitsi plasmidin lac-promoottori ja ero SD-ATG ja toisella puolella β-galaktosidaasigeeni, ja tämä plas-midi ohjasi yhdysproteiinin ilmentymistä indusoiduissa E. coli-transformanteissa. Sitten tämä yhdysproteiini eristettiin isäntä-solulysaateista ja formuloitiin immunogeeninä käytettäväksi. Vaihtoehtoisesti gD-geenin aminopää rekonstruoitiin ja saatu gD-1-proteiini formuloitiin eläimille tarkoitettuihin ruiskeisiin ja esikliinisiin kokeisiin. Tarkka kuvaus jokaisesta rakennusvaiheesta esitetään seuraavassa.

Tässä valmistetut gD-l:lle sukua olevat proteiinit ja yhdyspro-teiinit eivät ole glykosvloituneita ja näin ollen ne eroavat luonnossa esintyvästä HSV-l-gD-glykoproteiinista. Kuitenkin gD-l:lle sukua oleva proteiini on immunoreaktiivinen sellaisten vasta-aineiden kanssa, jotka on suunnattu HSV-1:n ja HSV-2:n gD:tä vastaan.

6.1. Plasmidien valmistuksen yleisperiaate

Seuraavissa selostuksen jaksoissa kuvataan DNA:n eristämisen, entsyymireaktioiden ja liitosreaktioiden yleisperiaatteita ja materiaaleja.

32 83974 6.1.1. Plasmidi-DNA:n eristäminen

Escherichia coli-isäntäbakteerit (E. coli) transformoitiin (Gautier and Bonewald, 1980, Molec.Gen.Genet. 178; 375) ja suuri määrä (mikrogramma) plasmidi-DNA:ta eristettiin E.coli-trans-formanteista, joita oli kasvatettu M-9-liemessä (Miller, s. 431, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press,

New York, N.Y., 1972). Plasmidit eristettiin soluista solujen myöhäisessä logaritmisessa kasvuvaiheessa käyttämällä Guerry et al:n menetelmän muunnosta (1973, J. Bacteriol. 116: 1063).

6.1.2. Olosuhteet restriktioentsyymeillä tapahtuvissa katkaisuissa_ Tässä hakemuksessa käytetyt restriktioentsyymit saatiin yhtiöstä New England Biolabs, Inc., Beverly, Ma., ellei toisin ole ilmoitettu. Etnsyymiyksikkö määritellään siksi määräksi, joka tarvitaan hajottamaan 1,0 ^,ug lambda-DNA:ta 15 minuutissa 37°C:ssa, kun reaktioseoksen kokonaistilavuus on 50 ^ul.

Kaikki täydelliset restriktioentsyymeillä tapahtuneet hajotukset suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: kutakin 1 ^ug DNA:ta inkuboitiin 0,5 yksiköllä entsyymiä 37°C:ssa 60 minuuttia 20 ^,ul:ssa puskuria. Osittaiset hajotukset tehtiin muuntamalla kokonaishajotuksessa käytettyjä olosuhteita seuraavalla tavalla: kutakin 1 ^ug DNA:ta inkuboitiin 0,1 yksiköllä entsyymiä 15 minuuttia. Reaktiot katkaistiin lisäämällä 0,1 % natriumdodekyyli-sulfaattia (SDS). Näin ollen reaktio-olosuhteet säädettiin niin, että saatiin keskimäärin yksi katkaisu per DNA-molekyyli.

6.1.3. Restriktioentsyymien puskurit

Sacl-, SacII- ja Smal-katkaisuissa käytetty puskuri oli seuraava: 6,6 mM Tris.HCl (pH 7,4), 6,6 mM MgC^ ja 6,6 mM β-ΜΕ (β-merkapto-etanoli).

Bglll-, BstElI-, EcoRI-, Hindlll-, NruI-, PstI- ja PvuII-katkai-suissa käytetty puskuri oli seuraava: 60 mM NaCl, 6,6 mM Tris.HCl (pH 7,4), 6,6 mM MgC^ ja 6,6 mM β-merkaptoetanolia (β-ΜΕ).

33 83974

BamHI-, Sali- ja Xbal-katkaisuissa käytetty puskuri oli seuraava: 150 mM NaCl, 6,6 mM Tris.HCl (pH 7,4), 6,6 raM MgCl^ ja 6,6 mM e-ME.

Huomattakoon, että mitkä tahansa kaksi tai useampia restriktio-endonukleaasireaktioita suoritetaan DNA:lie, suolapitoisuudeltaan pienessä puskurissa suoritettava reaktio viedään läpi ennen suolapitoisuudeltaan suuressa puskurissa tapahtuvaa reaktiota.

Jos kaksi entsyymiä vaatii saman puskurin, voidaan reaktiot suorittaa samanaikaisesti.

6.1.4. DNA:n muuntaminen

Bal31-nukleaasi on multifunktionaalinen entsyymi, jolla on erittäin spesifinen yksisäikeinen endodeoksiribonukleaasiaktiivisuus ja prosessiivinen eksonukleaasiaktiivisuus, joka hajottaa samanaikaisesti sekä kaksisäikeisen DNA:n (dsDNA) 3’- että 5’-päitä.

Yksi yksikkö Bal31-nukleaasia (New England Biolabs, Inc. Beverly, Ma.) määritellään sellaiseksi määräksi, joka tarvitaan vapauttamaan 1,0 yUg happoon liukenevia nukleotideja denaturoidusta vasikan kateenkorva-DNA: sta (650 ^,ug/ml) minuutissa 30°C:ssa. Bal31:n reaktiopuskuri oli seuraava: 20 mM Tris.HCl (pH 8,0), 600 mM NaCl, 12 mM CaCl^, 12 mM MgCl2, 1,0 mM EDTA ja DNA. Inkuboinnit suoritettiin 30°C:ssa; Bal31-katkaisutuotteet saatiin inkuboimalla 30 ^.ug DNA:ta 0,5 yksikön kanssa Bal31:tä 1, 2, 4, 6, 8 ja 10 minuuttia. Reaktiot katkaistiin lisäämällä EDTA:ta väkevyyteen 50 mM tai inaktivoimalla Bal31 lämmön avulla (esim. 65°C, 10 minuuttia).

Sl-nukleaasi hajottaa RNA:ta tai denaturoitunutta DNA:ta (so. yksisäikeistä DNA:ta) mononukleotideiksi, mutta se ei (oikeissa olosuhteissa) hajota kaksisäikeistä DNA:ta tai DNA/RNA-hybridejä. Yksi yksikkö Sl-nukleaasia (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) määritellään sellaiseksi entsyymimääräksi, joka tarvitaan liuottamaan happoon 1 ^,ug denaturoitua vasikan kateenkorva-DNA:ta 30 minuutissa 37°C:ssa. Sl-nukleaasia varten käytetyssä reaktiopuskurissa oli 30 mM natriumasetaattia (pH 4,6), 250 mM NaCl, 1 mM ZnSO^ ja 5 % glyserolia. S1-hajotukset aikaansaatiin inkuboimalla reaktioseosta, jossa oli 2000 yksikköä entsyymiä ja 0,1 ^ug DNA:ta ja 20 ^ug RNArta 45°C:ssa 30 minuut tia.

34 83974

Eksonukleaasi VII (Exo VII) hajottaa yksisäikeistä DNA:ta (ssDNA). Exo VII:n mekanismi näyttää olevan sellainen kuin prosessiivi-sella eksonukleaasi11a. Yksi Exo Vll-yksikkö (Bethesda Research Laboratories, Rockville, Md.) määritellään sellaiseksi entsyymi-määräksi, joka tuottaa 1 nmol nukleotidimonomeereja 30 minuutissa 37°C:ssa, kun substraattina käytetään lineaarista, denaturoitua l_ ^H/-SV40-DNA:ta . Exo VII :n reaktiopuskuri oli seuraava: 10 mM Tris.HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10 mM β-ΜΕ ja 8 mM EDTA. Exo VII-hajotukset suoritettiin käyttämällä 4 yksikköä Exo VII tää per 0,1 ^,ug DNA:ta 250 ^,ul:n reaktiotilavuudessa 1 tunti 45°C:ssa.

6.1.5. DNA-polymeraasireaktio DNA-polymeraasit katalysoivat DNA-ketjun asteittaista pitenemistä. Ketjun kasvu tapahtuu suunnassa 5':sta 3':uun (so. nukleotidien lisääminen tapahtuu 3’-päässä) ja polymeerin sekvenssi määräytyy templaatin sekvenssin mukaan, koska liitettävän nukleotidin pitää olla komplementaarinen templaatille eli sen pitää muodostaa oikea emäspari templaattisäikeen kanssa. Tunnetut DNA-polymeraasit eivät voi aloittaa ketjun synteesiä, vaan DNA-synteesi vaatii templaattiin liittyneen sytytinsäikeen, jossa on vapaa 3'-hydrok-syylipää. Ketjun piteneminen tapahtuu nukelofiilisellä hyökkäyksellä, joka ilmenee sytyttimen 3'-hydroksyylipään ja tulevan nukleotidin 5'-fosfaatin välillä. Uusi ketju koostuu templaattia vastaavista parin muodostavista emäksistä ja on antiparallelli templaatin suhteen. DNA-polymeraasin toiminnan tuloksena yksi-säikeinen templaatti "täydentyy" tai muuttuu kaksisäikeiseksi DNA-molekyyliksi.

Toinen DNA-polymeraasien toiminta on niiden suorittama "oikoluku”. DNA-polymeraasiin I liittyvä suunnassa 3':sta 5':uun tapahtuva eksonukleaasiaktiivisuus kohdistuu emäsparittomiin päihin ja voi hajottaa sekä yksi- että kaksisäikeistä DNA:ta suunnassa 3':sta 5':uun tuottaen mononukleotideja. Näin ollen väärin lisätty nukleotidi poistuu ennen kuin polymeroituminen jatkuu ja 35 83974 entsyymin toiminnan uskollisuus paranee. DNA-polymeraasi I:llä on myös suunnassa 5':sta 3':uun tapahtuva eksonukleaasiaktiivi-suus, joka kohdistuu spesifisesti kaksisäikeiseen DNA:han (jolloin syntyy 5'-mononukleotideja ja oligonukleotideja), ja se voi myös leikata DNA:sta pois yhteensopimattomia alueita.

Kun DNA-polymeraasi I käsitellään proteolyyttisesti Klenowin menetelmällä (Klenow et ai., 1971, Eur. J.Biochem. 22_, 371) saadaan kaksi palasta, suuri ja pieni. Suuri palanen eli Klenow-palanen (76 000 daltonia) on säilyttänyt polymeraasi- ja 3 * —5 ' — eksonukleaasiaktiivisuuden, kun taas pieni palanen on säilyttänyt 5'-3'-eksonukleaasiaktiivisuuden. Yksi yksikkö DNA-polymeraasia I tai DNA-polymeraasi I:n suurta palasta (New England Biolabs, Beverly, Ma.) määritellään määräksi, joka muuntaa 1 nmol deoksi-ribonukleotideja happoon liukenemattomaan muotoon 30 minuutissa 37°C:ssa. Kummankin entsyymin kohdalla määritysolosuhteet ovat samat paitsi, että DNA-polymeraasi I:n reaktioseos sisältää 67 mM KPO^ (pH 7,5), kun taas Klenow-palasen reaktioseos sisältää 40 mM KPO^ (pH 7,5) seuraavassa puskurissa: 6,6 mM MgCl2, 1,0 mM β-ΜΕ, 2 mM dAT-kopolymeeriä, 33 ^uM dATP, 33 ^uM ^H-dTTP ja entsyymi.

Käytettäessä DNA-polymeraasin suurta (Klenow) palasta tässä keksinnössä täydentämään yksisäikeistä DNA:ta tai kohesiivisia päitä, jotka syntyvät restriktioentsyymin katkaisutuloksina noudatettiin seuraavaa toimintatapaa: restriktioentsyymireaktiot katkaistiin kuumentamalla 10 minuuttia 68°C:ssa. Samaan reaktio-seokseen lisättiin lopullisena väkevyytenä 50 yUM kutakin deoksi-nukleosiditrifosfaattia ja kutakin DNA-mikrogrammaa kohti lisättiin 10-100 yksikköä DNA-polymeraasin Klenow-palasta. Toisin sanoen käytettiin ylimäärin DNA-polymeraasin Klenow-palasta, jotta yksisäikeiset päät täydentyivät täydellisesti.

6.1.6. DNA-palasten puhdistus geelin avulla

Restriktioentsyymeillä tai nukleaaseilla tapahtuneen käsittelyn jälkeen eri kokoja edustavat DNA-palaset erotettiin geelielektro-foreesilla joko agaroosi- tai polyakryyliamidilaatoissa matalassa 36 83974 jännitteessä (noin 2 V/cm agaroosigeelillä ja 10 V/cm polyakryyli-amidigeelillä), värjättiin etidiumbromidilla ja tehtiin näkyväksi ultraviolettivalolla (Southern, 1979, Methods in Enzymology 68:152).

Jotta tietyt DNA-palaset saataisiin talteen geelistä, kyseiset kaistat leikattiin irti ja DNA elektroeluoitiin dialyysiputkeen. Sitten DNA eristettiin DEAE-selluloosalla tai saostettiin etanolilla ja suspendoitiin uudestaan sopivaan puskuriin (Smith, 1980, Methods in Enzymology 6J3: 371) .

6.1.7. DNA:n yhteenliittäminen

Kaikki yhteenliittämiset suoritettiin käyttämällä T4 DNA-ligaasia (New England Biolabs, Inc., Beverly, Ma.). Yksi yksikkö T4 DNA-ligaasia määritellään siksi määräksi, joka tarvitaan saamaan aikaan bakteriofagi lambdan Hindlll-palasten 50-prosenttinen yhteenliittyminen 30 minuutissa 16°C:ssa 20 ^ul:ssa ligaasipuskuria ja 5 '-DNA-päiden konsentraation ollessa 0,12 ^,uM (300 ^ug/ml) .

DNA-yhteenliittämisissä käytetty ligaasipuskuri oli seuraava: 60 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl^, 20 mM ditiotreitoli(DTT), I, 0 mM ATP ja DNA:n väkevyys alueella 15-50 ^ug/ml. Yhteenliittä-misreaktioseoksia inkuboitiin 4-24 tuntia huoneen lämpötilassa käyttämällä noin 300 yksikköä T4 DNA-ligaasia per 10 ^,ul reaktio-tilavuutta.

6.2. gD-l-geenin paikantaminen ja eristäminen Kun HSV-lxHSV-2-yhdistelmien määrittämät proteiinit analysoitiin, havaittiin, että gD-l-geeni oli kartalla 0,9 ja 0,945 perimä karttayksikön välissä DNA:n Us-alueella (Ruyechan et ai., 1979, J. Virol. 2J): 667); ks. kuva la ja Ib. Us-alue pilkottiin restrik-tioentsyymeillä ja palaset liitettiin kloonausvektoreihin niin, että saatiin erilaisia yhdistelmäplasmideja, joista jokainen sisälsi tietyn osan Us-aluetta. Sitten nämä yhdistelmäplasmidit analysoitiin, jotta saatiin paikannetuksi gD-l-geeni Us-alueella. Lee et ai., 1982, J. Virol. 43:41, ovat äskettäin raportoineet gD-l:n sijainnin HSV-l-kartassa.

37 8 3 9 7 4 6.2.1. Yhdistelmä-DNA-plasmidit, jotka sisältävät tiettyjä osia HSV-l:n Us-alueesta_

Useita yhdistelmäplasmideja rakennettiin käyttämällä pBR322-vektoria ja HSV-l:n (Patton-kanta) Us-alueen eri palasia. Yhden näistä plasmideista, jolle annettiin nimi pRWF6, havaittiin sisältävän koko gD-l-geenin. Seuraavassa selostetaan pRWF6:tta.

Yhdistelmäplasmidin pRWF6 HSV-l-liitännäinen (kuva le) saatiin lambda gtWES: Eco RI-H-kloonin Us-alueesta (Umene and Enquist, 1981, Gene 1^: 251). Lambda gtWES:EcoRI-H-klooni pilkottiin täysin (kokonaishajotus) EcoRI:llä. Lambda gtWES: EcoRI-H-kloonin EcoRI-H-palanen, jonka koko on noin 15-16 kb (kiloemästä), sisältää HSV-l:n koko Us-alueen.

pBR322-plasmidi ja HSV-l:n EcoRI-H-palanen (eristetty edellä) hajotettiin kumpikin täysin Bam HIrllä. Saatu pBR322:n 4,4 kb:n palanen ja HSV-l:n 6,4 kb:n palanen liitettiin yhteen suhteessa 1:1, jolloin saatiin pRWF6.

6.2.2. gD-l:n suhteen spesifistä mRNA:ta koodittavan sekvenssin paikantaminen___

Jotta pRWF6:n sisältä voitaisiin paikantaa ja valita spesifisesti gD-l:tä koodittava sekvenssi, virus-DNA-liitännäinen alakloonat-tiin uudestaan pBR322:een. Alakloonin pSC30-4 (kuva Id ja seuraa-va selostus) denaturoidut virus-DNA-palaset immobilisoitiin nitroselluloosaan ja niitä käytettiin mRNA:n eristämiseen (komplementaarisen parikkiemäshybridisaation kautta) HSV-l:llä infektoitujen solujen sytoplasma-RNA-uutteista. Kaksi mRNA-lajia (3,0 kb ja 1,7 kb) hybridisoitui pSC30-4:n kanssa. Kun nämä mRNA-lajit luettiin in vitro, havaittiin, että sekä 3,0 kb:n että 1,7 kb:n mRNA kooditti gD-l-proteiinia. Tämän toimenpiteen yksityiskohdat on selostettu jäljempänä ja kuvassa 1.

Plasmidi pRWF6 eristettiin E. coli-transformanteista ja pilkottiin restriktioentsyymillä Sacl. Näin saatiin kolme palasta: 6,2 kb:n palanen, joka sisälsi koko pBR322-vektorin sekä osan 38 83974 HSV-l-DNA-sekvenssiä, 2,9 kb:n HSV-DNA-palanen ja 1,7 kb:n HSV-1-DNA-palanen.

Jotta 2,9 kb:n HSV-l-DNA-palanen (ks. kuva Id) voitaisiin ala-kloonata, pBR322 katkaistiin PvuII:lla (joka linearisoi pBR322:n) ja liitettiin Sacl-sidoksenmuodostajien (New England Biolabs,

Inc., Beverly, Ma.) läsnäollessa käyttämällä T4 DNA-ligaasia.

Näin pBR322:ssa oleva ainoa PvuII-kohta muunnettiin ainoaksi Sacl-kohdaksi /annetaan nimitys Sacl (PvuII^ ^]_7· Kun muunnettu pBR322-vektori on katkaistu Sacl-entsyymillä, tähän vektoriin liitetään 2,9 kb:n HSV-l-SacI-DNA-palanen ja saadaan pSC30-40. Tällä yhdistelmäpläsmidilla transformoitiin E.coli. Transforman-tit seulottiin ja valittiin restriktiokartoituksella käyttämällä minilysaattitekniikkaa (Clewell and Helinski, 1970, Biochem. 9_: 4428) .

Alakloonia pSC30-40 käytettiin mRNA-hybridisaatiovalinnassa seu-raavalla tavalla: (Ricciardo et ai., 1979, Proc. Natl. Acad.

Sei., USA, 7_6: 4927). Plasmidi pSC30-4 eristettiin E. coli-transformanteista ja 200 ^ug p3C30-4-DUA:ta hajotettiin Sacl:11a, jotta saatiin leikatuksi HSV-l-DNA-liitän-näinen irti. Katkaistu plasmidi uutettiin kloroformi-fenoli-seoksella (1:1) ja saostettiin etanolilla. Pelletti suspendoitiin uudestaan 2 ml:aan 0,3 M NaOH ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 minuuttia, jotta DNA saatiin denaturoiduksi. Sitten suspensio neutraloitiin lisäämällä 4,4 ml tislattua vettä, 0,2 ml 3M HCl, 0,2 ml IM Tris.HCl (pH 7,5) ja 3 ml 20 x SSC (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumsitraattia). pH, indikaattoripaperilla mitattuna, 011 välillä 6 ja 8. Denaturoitunut, neutraloitu DNA suodatettiin vakuumissa 25 mm:n nitroselluloosasuotimen läpi (Schleicher and Schuell, Keene, N.H.), joka oli etukäteen liotettu tislatussa vedessä ja sen jälkeen 6 x SSC:ssä. Vakuumisuodatuksen jälkeen nitroselluloosasuotimet pestiin 6 x SSC:llä, kuivattiin ja kuumennettiin 2 tuntia 80°C:ssa. Puolet nitroselluloosasuotimesta käytettiin seuraavassa kuvatussa hybridisointitoimenpiteessä.

39 83974

Virus-DNA:n sisältävä nitroselluloosa leikattiin pieniksi palasiksi ja inkuboitiin täydellisen sytop lasini sen RNA:n kanssa, joka oli eristetty HSV-l:llä infektoitujen Vero-solujen lysaa-tista, joka oli valmistettu seuraavalla tavalla: Vero-solut infektoitiin 10 täpliä muodostamalla yksiköllä (pfu)/solu ja inkuboitiin 7 tuntia 37°C:ssa Dulbeccon kasvualustassa, johon oli lisätty 50 ^ug/ml sytarabiinia (β-sytosiiniarabinoosia) DNA:n replikaation estämiseksi. Solut lysoitiin 0,65 %:lla NP-40 seoksessa, jossa oli 0,15 M NaCl, 1,5 mM MgCl^ ja Ο,ΟΙΜ Tris.HCl (pH 7,9). Tumat laskeutuivat, kun sentrifugoitiin 2 minuuttia nopeudella 3000 x g, ja emäliuoksen väkevyydeksi säädettiin 1 mM EDTA (pH 7,9) ja 0,5 % SDS. Liuos uutettiin kahdesti kloroformi-fenoliseoksella (1:1) ja kerran kloroformilla. Sytoplasman RNA saostettiin etanolilla (yhdestä yhtyvästä pullollisesta (one confluent roller bottle) Vero-soluja saatiin noin 1,5 mg RNA:ta) ja kuivattiin osittain. RNA-pelletti (noin 0,4-0,8 mg RNA:ta) liuotettiin 400 ^ul:aan hybridisointipuskuria (50 % formamidia, 0,4 M NaCl, 40 mM PIPES, pH 6,4, 1 mM EDTA ja 1 % SDS) ja lisättiin paloiksileikattuun nitroselluloosasuotimeen. Hybridisointi suoritettiin 3 tunnissa 55°C:ssa ravistellussa vesihauteessa.

Sen jälkeen suodattimenpalaset pestiin 10 kertaa 60°C:ssa SSC:llä, jossa on 9,5 % SDS-liuosta, ja sen jälkeen 60°C:ssa 2 kertaa 1 ml:lla liuosta, jossa on 2 mM EDTA SSC:ssä. Lopuksi suodattimen-palasia pestiin 2 mM EDTA:lla, pH 8,0, 60°C:ssa 5 minuuttia ja liuos poistettiin ja suodattimenpalaset kuivattiin perusteellisesti pumpulitukolla.

Hybridisoitunut mRNA eluoitiin nitroselluloosapalasista formami-din ja lämmön avulla seuraavalla tavalla: Suotimiin lisättiin 120 ^ul 95 %:n formamidin ja 10 mM PIPES:n (pH 6,5) seosta ja inkuboitiin 5 minuuttia 65°C:ssa. Eluaatti siirrettiin mikrosentri-fugiputkeen ja pidettiin jään päällä. Toista eluointipuskuria lisättiin 120 yul nitroselluloosapalasille ja inkuboitiin uudestaan 5 minuuttia 65°C:ssa. Tämä eluaatti siirrettiin toiseen mikro-sentrifugiputkeen ja pidettiin jään päällä. Suotimille lisättiin 720 ^ul steriiliä tislattua vettä ja sen jälkeen sekoitettiin.

4o 83974

Sen jälkeen 360 ^ul siirrettiin kuhunkin mikrosentrifugiputkeen , joissa oli eluaatit. Mikrosentrifugiputkissa olevaan eluoituun RNA:han lisättiin 20 ^ul 5M NaCl, 5 ^ug sopivaa kantoainetta (esim. kanin maksan tRNA) ja 1 ml absoluuttista etanolia.RNA saostettiin inkuboimalla seosta 1 tunti -70°C:ssa tai upottamalla putket hiilihappojään ja EtOH:n muodostamaan lietteeseen 20 minuutiksi. Saostunut RNA pelletoitiin (10 minuuttia nopeudella 12 000 x g) mikrosentrifugissa ja yhden putken sisältämä sakka suspendoitiin uudestaan 1 ml:aan puskuria /0,5 M NaCl , 10 mM Tris.HCl (pH 7,9) ja 0,5 % SDS/ RNA:n liuottamiseksi. Liuennut RNA lisättiin toiseen samanlaiseen putkeen erien yhdistämiseksi ja kaiken RNA:n liuottamiseksi. Polyadenyloitunut RNA (poly(A)RNA) eristettiin liuenneesta RNA:sta kromatografisesti käyttämällä oligo(dT)selluloosaa (Bethesda Research Laboratories, Inc., Rockville, Md.). Poly(A)RNA eluotiin oligo(dT)selluloosasta käyttämällä eluointipuskurina liuosta, jossa oli 10 mM tris-HCl (pH 7,9) ja 0,1 % SDS; ja sen jälkeen poly(A)RNA saostettiin etanolilla edellä kuvatulla tavalla.

Kaksi mRNA-lajia, 3,0 kb:n mRNA ja 1,7 kb:n mRNA, jotka hvbridi- soituivat pSC30-4-DNA:n kanssa, eristettiin. Nämä kaksi lajia luettiin in vitro käyttämällä kanin retikulosyyttisoluvapaata 35 systeemiä, jossa oli S-metioniiniä (Pelham and Jackson, 1976,

Eur. J. Biochem. 6J7 : 247).

In vitro-luentauutteet immuunisaostettiin monoklonaalisen vasta-aineen 4S kanssa, jonka vaikutus kohdistuu gD-l:tä vastaan (saatu M. Zweigilta, National Institute of Health) ja valmistettu SDS-PAGE:a varten edellä kuvatulla tavalla. Kun soluvapaalla luenta-systeemillä saaduille immuunisaostetuille proteiinituotteille suoritettiin elektroforeettinen analyysi, havaittiin, että nämä valitut mRNA:t vastasivat 50 000 daltonin suuruista gD-l-spesi-fistä proteiinia (tuloksia ei ole esitetty). gD-proteiinin koon perusteella arvioituna olisi pienin mRNA:ta koodittava sekvenssi noin 1,6 kb, kun otetaan lukuun mRNA-johtosekvenssi ja poly(A)-hännät, suuremman mRNA:n (3,0 kb) oletettiin koodittavan gD-1-polypeptidiä.

I: 4i 83974 6.2.3. gP-l-mRNA:n karakterisointi 3,0 kb:n mRNA-sekvenssin aseman kartoitus pSC30-4:n sisällä ja mRNA karakterisointi suoritettiin Sl-kartoituksella, so. käyttämällä yhden säikeen suhteen spesifistä Sl-nukleaasia ja eksonukleaa-sia VII niiden DNA-alueiden kartoittamiseen, jotka hvbridisoitu-vat komplementaaristen mRNA-sekvenssien kanssa (Berk and Sharp, 1978, Proc. Natl. Acd. Sei., USA, 75_: 1274), ja määrittämällä gD-l-geeniä koodittavan alueen DNA-sekvenssi (Maxam and Gilbert, 1980, Methods in Enzymology, 6^: 499).

Sl-kartoitustekniikka osoitti, että sekä 3,0 kb:n että 1,7 kb:n mRNA-palaset olivat lomittumattomia (unspliced) (so. ne eivät sisältäneet välisekvenssejä eivätkä introneja), ja eteä niillä oli eri 5'-päät, mutta samat 3'-päät. 1608 nukleotidia sisältävä DNA- sekvenssi, jossa oli 3,0 kb:n mRNA:n 5'-pään kooditusalue, määritettiin ja luentakehys pääteltiin paikantamalla se alkukodoni (ATG), joka oli lähinnä 5'-päätä.

Sl-kartoitustekniikan periaate on se, että katsotaan, miten muodostuu parikkeja RNA:n ja radioaktiivisesti merkityn vksisäikeisen DNA-koettimen välille (ssDNA) (esim. saatu pSC30-4:stä). Jos RNA on kypsä, lomittunut (spliced) mRNA, niin intronit muodostavat ssDNA-silmukan. Sl-nukleaasientsyymi hajottaa kaikki radioaktiivisesti merkityn DNA:n ssDNA-alueet, joita RNA:n muodostama parikki ei suojaa, kun taas eksonukleaasi VII hajottaa ssDNArta vain päistä, eikä näin ollen hajota ssDNA-silmukoita. Kun verrataan niiden DNA-molekyylien kokoja, jotka eivät ole alttiita näille nukleaaseille (koska tapahtuu hybridisoituminen RNA:n kanssa), voidaan saada selville lomittuneet mRNA-transkriptit.

Tässä keksinnössä 3,0 kb:n mRNA:n 5'-pään paikantamisessa käytetty, radioaktiivisesti merkitty DNA oli pRWG6:sta saatu 3,8 kb:n

BamHI-8/BstEII-palanen, joka oli merkitty BstEII-5'-päästään 32 P:llä (käyttämällä polynukelotidikinaasientsyymiä Maxam' in ja Gilbert'in menetelmän mukaisesti, supra) ennen BamHI:llä tapahtuvaa pilkkomista. 3,0 kb:n mRNA:n 3'-pään paikantamisessa käytetty radioaktiivinen DNA oli pSC30-4:stä saatu 4,7 kb:n Hindlll/Sall- 32 42 8 3 9 7 4 palanen, joka oli merkitty HindIII-3'-päästään P:llä (käyttämällä DNA-polymeraasin Klenow-palasta Maxam'in ja Gilber'in menetelmän mukaisesti, suora) ennen Sallrllä tapahtuvaa pilkkomista. Sytoplasman mRNA eristettiin HSV-l:llä infektoiduista Vero-soluista, joita kasvatettiin 7 tuntia sytarabiinin läsnäollessa, kuten edellä on kuvattu. SI-kartoitustekniikkana käytettiin muunnettua Berk'in ja Sharp'in menetelmää (Watson et al., 1981, J.Virol. 3_7; 431). gD-l-mRNA:n 5'-pää oli kartalla lähellä pSC30-4:n Hindlll-kohtaa, kun taas 3'-pää oli noin 2,8 kb:tä ala-virtaan (kuva Id).

Lopuksi pSC30-4:n sisältämän HSV-l-DNA:n sekvenssi määritettiin Maxam'in ja Gilbert'in menetelmällä. Kuvassa 2 on esitetty HSV-l-gD-geenin kooditusalueen sekvenssinmääritystapa. Sekä koo-dittavan että koodittamattoman säikeen sekvenssi määritettiin. Kuvassa 3 on esitetty HSV-l-gD-geenille saatu DNA-sekvenssi. Oli ilmeistä, että DNA-sekvenssissä oli 394 kodonia sisältävä avoin lukukehys, joka alkoi kohdassa 241 olevasta ATGrstä. Tämän kohdan oletettiin olevan gD-l-geenin alkukohta, ja asian osoitettiin olevankin niin, kun tämä otaksuttu gD-l-geenisekvenssi kloonattiin ilmentämisvektoriin pJS413 (ks. kohta 6.3.).

6.3. gD-l-geenin kloonaus ja ilmentäminen gD-l:t- koodittava alue asetettiin lac-promoterin ohjaukseen.

Tätä varten oletetun gD-l-geenin (käytetään tästä lähtien nimitystä gD-l-geeni) osa, jossa ei ollut aloitussekvenssiä, ATG, eikä aminoa koodittavan pään (geenin 5'-pää) 156 ensimmäistä nukleotidia, liitettiin DNA-kloonauksen ilmentämisvektoriin pJS413 niin, että muodostui pEH25 (ks. kuva 4). gD-l-geenin osa liitettiin niin, että proteiinia koodittava sekvenssi oli oikeassa lukukehyksessä vektorin aloitus-ATG:n suhteen. Tämän seurauksena alkaa transkriboidun mRNA:n luenta vektorin aloitussekvenssistä (ATG) ja jatkuu gD-l-geenin läpi (josta puuttuu oma aloitus-ATG ja gD-l:tä koodittavan sekvenssin ensimmäiset 156 nukleotidia) aina gD-l:n luonnolliseen päätössignaaliin asti.

43 83974

Plasmideilla pEH25, jotka sisälsivät gD-l-geenin, transformoitiin E. coli-isäntäkanta, jossa DNA:n transkriptio inhiboituu lac-operonin vuoksi, jos promoteria ei erityisesti indusoida. Primääriset transformantit tutkittiin lääkeaineen vastustuskyvyn suhteen (vektori kantaa geeniä, joka antaa vastustuskyvyn ampisil-liinin suhteen) ja vastustuskykyisille klooneille tehtiin jatkotutkimuksia. Saadun yhdistelmäplasmidin, pEH25, rakenne todettiin restriktioanalyysillä ja DNA:n sekvenssinmäärityksellä. Kun pEH25-transformantteja indusoitiin, saatiin 46 000 daltonin polypepti-di, joka immuunisaostui sekä HSV:tä vastaan suunnattujen vastasee-rumien kanssa että gD:tä vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Näitä toimenpiteitä kuvataan seuraavassa.

6.3.1. Ilmentämisvektori pJS413

Ilmentämisvektori pJS413 (kuva 4) on pBR322:sta johdettu ja sisältää ampr-geenin (β-laktamaasi), lac-promoottori (P lac) , lac-

lcLC Z CTO

ja cro-ribosominsidoskohdan (SD ja SD on merkitty kaikkiin kuviin merkinnöillä SD ja SD , vastaavasti), ketjun aloitus-ATG:n, jossa on 69 cronukleotidia (ero), ja modifioitu β-galaktosi-daasigeeni (lac i-z-geeni, josta tästä lähtien käytetään nimitystä z-geeni). Kun geeni liitetään oikeaan lukukehykseen pJS413:n cro-aloitus-ATG:n ja z-geenin väliin (so. pJS413:n Bglll-, Smal-tai BamHI-kloonauskohtien alueelle), kykenevät transformoituneet solut ilmentämään yhdysproteiinin. Nyt käsillä olevassa esimerkissä kuitenkin z-geeni poistettiin ja osittainen gD-l-geeni liitettiin faasiin pJS413 cro-aloitus-ATG:n ja cro-nukleotidien kanssa.

Jotta pJS413 saataisiin valmistetuksi-gD-l-geenin liittämistä varten (ks. kuva 4), pJS413 katkaistiin Smalrllä (jolloin syntyi tylppä pää) ja Saclillä (jolloin syntyi SacI-3'-kohesiivinen pää).

4,7 kb:n palanen, joka sisälsi promoottorin, SD-sekvenssit, aloitus-ATGrn ja osittaisen ero-sekvenssin, eristettiin geelielektroforee-silla. 1,8 kg:n palanen, joka sisälsi z-geenin 5’-pään, poistettiin.

6.3.2. gp-l-geenin liittäminen pJS413:een

Kun gD-l-geeni oli kartoitettu pSC30-4:n sisältä (kohta 6.2.3), pSC30-4:stä eristettiin selektiivisesti 2,2 kb:n DNA-palanen, 44 83974 jossa oli gD-l-geenin karboksinkoodituspään viimeiset 1026 emäsparia, suorittamalla katkaisu Pvulrllä (syntyi tylppä pää) ja Sacl:llä (syntyi SacI-3'-kohesiivinen pää) (kuva 4).

2,2 kb:n PvuII/SacI-pSC30-4-palanen ja 4,7 kb:n SmaI/SacI-pJS413-palanen liitettiin suhteessa 1:1 käyttämällä T4 DNA-ligaasia (kuva 4). Saaduilla yhdistelmäplasmideilla transformoitiin E. coli-kanta NF1829. E. coli-kanta NF1829 on K-12 MC-1000-johdannainen, jossa on F'-lac-episomi ja lac I^-mutaatio lac-repressorin ylituotantoa varten. F'-lac-episomissa läsnä oleva β-galaktosidaa-sia koodattava lac z-geeni inaktivoidaan Tn5-liitännäisellä (transposon). Näin ollen pitää kannassa NF1829 lac-promoteri indusoida, jotta saadaan aikaan plasmidiin pJS413 liitetyn geenin ilmentvminen.

6.3.3. Sellaisten transformanttien identifiointi, jotka ilmen- tävät gD-l-geenin_

Plasmidit, jotka eristettiin ampisilliinin suhteen vastustuskykyisistä E.coli-transformanteista, analysoitiin suorittamalla restriktioentsvymikartoitus ja DNA:n sekvenssinmääritvs pJS413-vektorin ja gD-l-geenin välisestä liitoskohdasta. Plasmidilla pEH25 (kuva 4) oli oikea nukleotidisekvenssi cro-gD-l-liitoksen yli (esitetty kuvassa 5), ja tutkittiin, miten se kykeni ilmentämään gD-l:lle sukua olevaa polypeptidiä. Koska lac-promoottori oli transkriptionaalisesti inaktiivinen NFl829:ssä (lac-repressorin ylituotannon vuoksi), voitiin gD-l-proteiini saada esiin vain, kun promoteri indusoitiin 1 mM IPTG:llä tai 1-10 mM laktoosilla.

Klooni, joka oli transformoitunut pEH25:llä, tutkittiin IPTG:n indusoiman, gD-l:lle sukua olevan proteiinin suhteen ja sen havaittiin tuottavan 46 000 daltonin proteiinia, joka sisälsi 23 ero-proteiinin aminohappoa (pJS413:n koodittama) ja 342 gD-1-proteiinin aminohappoa (so. gD-l:n ensimmäiset 52 aminohappoa puuttuvat). Tämä proteiini voitiin immuunisaostaa kanin kokonaisen antiseerumin kanssa, jota oli suunnattu HSV-l:tä vastaan (DAKO Chemicals, Inc., Hicksville, N.Y.), ja monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa (IS, 4S, 55S ja 57S), jotka olivat erityisesti li 45 83974 suunnatut HSV-l:tä vastaan (Showalter et ai., 1981, Infection and Immunity, 3_4 : 684) .

Monoklonaaliset vasta-aineet IS, 4S, 55S ja 57S tunnistavat lukuisia tiettyjä kohtia gD-l-molekyylistä (Eisenberg et ai., 1982, J.Virol. 4jL: 478). Huomattakoon, että 4S kykenee neutraloimaan HSV-l:n ja HSV-2:n infektointikyvyn ja immuunisaostamaan kummankin viruksen tuottaman gD-proteiinin. pEH25:n tuottama proteiini immuunisaostui 4S-vasta-aineen kanssa, mikä osoitti, että pEH25:n aikaansaama, gD-l:lle sukua oleva proteiini omasi sellaisia antigeenisiä ominaisuuksia, jotka ovat yhteisiä sekä HSV-1- että HSV- 2-gD-proteiineille. Lisäksi pEH25:n tuottama gD-l:lle sukua oleva proteiini immuunisaostettiin lS-monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka neutraloi vain HSV-l:n. pEH25:n tuottama gD-l:lle sukua oleva proteiini saostettiin myös 55S- ja 57S-monoklonaalis-ten vasta-aineiden kanssa, jotka eivät neutraloi HSV-l:n eivätkä HSV-2:n infektiokykyä. Jokainen immuunisakka analysoitiin SDS-PAGErllä, jonka koko toimenpiteen yksityiskohdat on selostettu seuraavassa.

Kaikkia pEH25-transformantteja kasvatettiin ottamalla yön yli L-liemessä 37°C:ssa kasvaneesta kasvustosta (stationäärifaasi) näyte, laimentamalla se 20-kertaisesti M-9-kasvualustaan ja kasvattamalla 37°C:ssa ravistellen 90 minuuttia (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press, New York, N.Y., 1972). Jotta näistä viljelmistä saataisiin tutkituksi gD-l-pro- teiinin ilmentyminen, viljelmiin lisättiin 1 mM IPTG:tä ja 25 35 35 ^uCi/ml S-metioniiniä (verrokit merkittiin S-metioniinillä, mutta ei indusoitu). 60 minuutin kuluttua (37°C:ssa) viljelmät pelletoitiin sentrifugoimalla. Solujen lysoimiseksi ja niiden sisällyksen vapauttamiseksi, kukin pelletti suspendoitiin uudestaan yhtä suureen määrään lysointipuskuria IP-3 (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % NP-40, 1 % deoksikolaattia ja 0,1 % SDS), jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja sonikoitiin. Solulysaattia sentrifugoitiin 5 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 5000 x g ja emäliuos jaettiin eriin. Verrokkiseerumit 46 83974 (ei-immuuni ja esi-immuuni) tai koevastaseerumit (polyvalenttiset vastaseerumit, jotka kohdistuivat HSV-l:tä vastaan tai monoklonaaliset vastaseerumit, jotka kohdistuivat gD:tä vastaan) lisättiin näytteisiin ja sen jälkeen inkuboitiin 60 minuuttia 4°C:ssa. (Lisätyn vastaseerumin määrä määritetään kalibroimalla vasta-ainetiitterit mittaamalla vastaseerumien sarjalaimennukset tunnettuja antigeenimääriä käyttämällä.)

Immuunikompleksit otettiin talteen lisäämällä pestyä Pansorbiinia (Staphylococcus aureus-proteiini A, Calbiochem-Behring Corp., LaJolla, Cal.) ja sentrifugoimalla (kaikki sentrifugoinnit suoritettiin nopeudella 5000 x g 5 minuuttia 4°C:ssa, ellei toisin ole ilmoitettu). Pelletoitu immuunisakka suspendoitiin uudestaan ja pestiin IP-2:lla (identtinen IP-3:n kanssa, mutta sisältää 20 mg/ml naudan seerumialbumiinia (BSA) ei-spesifisen adsorption välttämiseksi), pestään kahdesti IP-3:lla ja suspendoidaan uudestaan IP-l:een (20 mM Tris.HCl (pH 8,1), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA ja 1 % NP-40). Suspensio siirrettiin uuteen putkeen, jossa se sentrifugoitiin ja pelletti suspendoitiin uudestaan SDS-polyakryy-liamidigeelinäytepuskuriin (Laemmli, 1970, Nature 227: 680). Kun oli kuumennettu 3 minuuttia 95°C:ssa, näytettä sentrifugoitiin 2 minuuttia nopeudella 12 000 x g mikrosentrifugissa liukenemattomien aineosien poistamiseksi. Emäliuos otettiin talteen ja ladattiin SDS-polyakryyliamidigeeliin (10 %). Elektroforeesin jälkeen proteiinit värjättiin Coomassie-sinivärillä, käsiteltiin natrium-salisylaatilla ja kuivattiin fluorografiaa varten (Chamberlain, 1979, Anal. Biochem. 98: 132). SDS-polyakryyliamidigeelielektro-foreesin (SDS-PAGE) osoittivat selvästi, että indusoimalla tuotettu pEH25:n ohjaama, 46 000 daltonin suuruinen, gD-l:lle sukua oleva proteiini immuunisaostui kanin kokonaisen seerumin kanssa, joka kohdistui HSV-l:tä vastaan, ja monoklonaalisten vasta-aineiden IS, 4S, 55S ja 57S kanssa.

Lopuksi suoritettiin kilpailukokeet, jotta saataisiin määritetyksi HSV-l:llä infektoitujen HeLa-solujen lysaattien vaikutus niiden indusoitujen gD-l:lle sukua olevien proteiinien immuunisaostumiseen, jotka ilmentyvät pEII25:llä transformoituneessa E. coli NFl829 :ssä 47 83974 (ks. kuva 6). Verrokki-HeLa-solulysaateista (infektoitumattomat) ja HSV-l:llä infektoitujen HeLa-solujen lysaateista tehtiin sarjalaimennukset (infektoituminen saatiin aikaan samoin kuin edellä on kuvattu Vero-solujen kohdalla). 5 ^ul 100-kertaisesti laimennettua monoklonaalista 55S-askitesnestettä (gD-l:n suhteen spesifinen monoklonaalinen vasta-aine) lisättiin kuhunkin laimennetun HeLa-solulysaatin näytteeseen. Kun oli inkuboitu 30 minuuttia 4°C:ssa, yhtä suuret määrät ^5S-metioniinilla merkittyjä proteiineja, jotka oli saatu indusoiduista pEH25-transformanteista, lisättiin HeLa-solulysaatteihin ja inkuboitiin vielä 60 minuuttia 4°C:ssa. Immuunikompleksit otettiin talteen immuunisaostuksella ja analysoitiin SDS-PAGE:n ja fluorografiän avulla edellä kuvatulla tavalla. Se proteiinikaista, joka oli spesifisesti immuunisaos-tunut, leikattiin irti geelistä ja radioaktiivisuus mitattiin tuikelaskurilla. Kuva 6 esittää näiden kokeiden tuloksia: jokaisen näytteen radioaktiivisuus, joka edustaa pEH25:n immuunisaostunutta, radioaktiivisesti merkittyä proteiinituotetta, merkittiin käyrään prosentteina verrokista laskettuna. Avoimet ympyrät edustavat sarjalaimennettua, verrokkina käytettyä HeLa-solulysaattia (infek-toimattomat). Neliöt edustavat sarjalaimennettua, HSV-l:llä infektoitujen HeLa-solujen lysaattia. Tämä osoittaa selvästi, että HSV-l-proteiinit ja radioaktiivisesti merkittv, pEH25:n ohjaama proteiini kilpailevat menestyksekkäästi keskenään, kun 55S-monoklo-naalisen vasta-aineen kanssa muodostuu immuunikompleksi.

6.4. Plasmidin pEH4-2 valmistus, joka ohjaa Cro/gD-l/0-galaktosi- daasiyhdysproteiinin valmistusta_ gD-l-geeni eristettiin pEH25:stä niin, että geenin päätössignaali poistettiin. Tätä tarkoitusta varten gD-l-geenisekvenssin sisältävä DNA-palanen leikattiin irti gD-l:n päätössekvenssin, TAG, takana olevasta restriktiokohdasta ja sen jälkeen TAG poistettiin suorittamalla päiden prosessiivinen katkaisu Bal31:llä, joka on DNA-nukleaasi. Sitten tämä geenipalanen liitettiin plasmidiin pJS413, jotta saataisiin kooditetuksi yhdysproteiini: Cro/gD-1/β-galaktosidaasi. Menetelmää selostetaan seuraavassa ja kuvassa 7.

48 83974

Plasmidi pEH25 katkaistiin täysin Nrulrlla ja prosessiivisesti Bal31-nukleaasilla. Saatu pituudeltaan vaihteleva DNA katkaistiin sen jälkeen restriktioentsyymillä PstI, jolloin saatiin palaspektri, jonka monista paloista puuttui gD-l:n päätöskodoni, mutta suurin osa gD-l-geenin sekvenssistä oli jäljellä. Mielenkiinnon kohteena olevat DNA-paiaset (1,5-1,9 kb) eristettiin geeli-elektroforeesilla ja eluoitiin edellä kuvatulla tavalla. Vektori pJS413 katkaistiin täysin Pstl:llä ja Smal:llä ja tarvittava 5,5 kb:n DNA-palanen eristettiin (kuva 7). pEH25-palanen ja pJS413-palanen liitettiin yhteen suhteessa 1:1 ja liitostuotteella transformoitiin E. coli NF1829. Ampisilliinin suhteen vastustuskykyiset pesäkkeet tutkittiin yhdysproteiinin tuotantokyvyn kannalta mittaamalla β-galaktosidaasiaktiivisuus indikaattoriagarlevyillä (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press, New York, N.Y., 1972). Positiiviset pesäkkeet tutkittiin Cro/gD-l/B-galaktosidaasiyhdysproteiinin läsnäolon suhteen suorittamalla SDS-PAGE-analyysi IPTGrllä indusoitujen transformanttien kokonaislysaateille. Cro/gD-l/6-galaktosidaasiyhdysproteiinia ilmentävistä klooneista eristettiin yksi klooni, joka tuotti suuren määrän 160 000 daltonin yhdysproteiinia; tämän kloonin sisältämälle plasmidille annettiin nimi pEH4-2 (kuva 7). pEH4-2:lla transformoituneen E. coli-kloonin tuottaman yhdysproteiinin havaittiin olevan indusoitavissa IPTGrllä ja reagoivan immunologisesti ristikkäin sekä HSV-l:n että HSV-2:n kanssa. pEH4-2-plasmidi eristettiin ja analysoitiin restriktiokartoituksella ja DNA-sekvens-sin määrityksellä; pEH4-2 ei sisällä pJS413:n BamHI-kohtaa (ks. kuva 8).

Toinen eristetty E.coli, joka oli transformoitunut plasmidilla pEH3-25, tuotti Cro/gD-l/B-galaktosidaasiyhdysproteiinia, mutta vähemmän kuin pEH-4-2-transformantti. pEH3-25-transformanttia selostetaan myöhemmin tässä tekstissä (ks. kohta 6.5).

6.4.1. pEH4-2-yhdysproteiini aikaansaa immuunireaktion HSV-1- vastaseerumien kanssa_ pEH4-2:lla transformoituneen E. colin tuottama yhdysproteiini reagoi spesifisesti kanin vastaseerumien kanssa, jotka kohdistuivat 49 83974 HSV-l:tä vastaan (tuloksia ei ole esitetty). IPTGtllä indusoidut pEH4-2:n ja pEH25:n proteiinit erotettiin SDS-PAGE:llä ja siirrettiin nitroselluloosaan (so. suoritettiin "proteiinipilku-tus" (protein"blot”)). Indusoimattomien pEH4-2- ja p-EH25-trans-fcrir.anttien lysaatit käsiteltiin samalla menetelmällä verrokkeina. Sen jälkeen nitroselluloosa käsiteltiin HSV-l:tä vastaan kohdistetuilla kanin vastaseerumeilla ja vielä koettimena käytetyllä, 125 kanin immunoglobuliinia vastaan kohdistetulla, I:llä merkityllä vuohen vastaseerumilla (Towbin et ai., 1979, Proc. Natl. Acad.

Sei., USA, 76: 4350).

Proteiinipilkkujen autoradiogrammit osoittivat selvästi, että 160 000 daltonin suuruinen, spesifinen pEH4-2-yhdysproteiini reagoi immunologisesti HSV-l:tä vastaan kohdistettujen kanin vasta-seerumien kanssa, ja että 46 000 daltonin suuruinen, spesifinen pEH25-gD-l-proteiini reagoi immunologisesti HSV-l:tä vastaan kohdistuvien kanin vastaseerumien kanssa.

6.4.2. pEH4-2-yhdysproteiinia vastaan suunnatut vastaseerumit saostuvat immunologisesti HSV-1- ja HSV-2-proteiinien kanssa_ _ _ pEH4-2-yhdysproteiinin vastaisten vastaseerumien osoitettiin reagoivan immunologisesti HSV-l-gD:n ja HSV-2-gD:n kanssa, mikä todistaa, että pEH4-2-yhdysproteiini sisältää gD-spesifisiä antigeenisiä ominaisuuksia. Tämä osoitettiin suorittamalla SDS-PAGE-analyysi HSV-l-proteiineilie ja HSV-2-proteiineille, jotka saostuvat immunologisesti sellaisten vastaseerumien kanssa, jotka on suunnattu pEH4-2-yhdysproteiinia vastaan; vrt. seuraavaa selostusta.

pEH4-2-yhdysproteiinia vastaan kohdistetut kanin vastaseerumit valmistettiin seuraavalla tavalla: E. coli-klooneja, jotka olivat transformoituneet pEH4-2:lla, kasvatettiin keskilogaritmifaasiin ja indusoitiin 1 mM IPTG:llä. Neljän tunnin kuluttua indusoinnista bakteerit pelletoitiin sentrifugoimalla, lysoitiin SDS-PAGE-näyte-puskurilla ja ladattiin preparatiivisiin SDS-polyakryyliamidi- so 83974 geeleihin. Elektroforeesin jälkeen proteiinit tehtiin näkyviksi värjäämällä ulkokaistat coomassiesinivärillä ja sen jälkeen 160 000 daltonin suuruinen yhdysproteiini leikattiin irti geelistä. Geelipala upotettiin nestetyppeen, jauhettiin jauheeksi ja suspendoitiin uudestaan PBS:ään. Lisättiin yhtä suuri tilavuus Freund'in täydellistä apuainetta. Kun oli sekoitettu perusteellisesti, liuos injektoitiin subkutaanisesti New Zealand-kaneihin (018 ja 019). Kuhunkin kaniin injektoitiin 25-50 yug proteiinia.

28 vuorokauden kuluttua kaneille annettiin tehostuksena sama määrä yhdysproteiinia suspendoituna epätäydelliseen Freund'in apuaineeseen. Eläimille annettiin tehosteet vielä kaksi kertaa 10 vuorokauden välein. Seerumia, joka saatiin ottamalla verta korvasta 55 vuorokauden kuluttua alkuperäisestä injektiosta lukien, käytettiin immuunisaostusanalyysissä.

Immuunisaostukset suoritettiin seuraavasti: yhtyvästi kasvatetut solut tartutettiin HSV:llä määränä 10 pfu/solu (10 täplänmuodostus-yksikköä per solu) ja merkittiin S-metioniinilla 16 tunnin kuluttua tartutuksesta. /GBK-solut (GBK = Georgia Bovine Kidney, Georgia-naudan munuainen) infektoitiin HSV-l:llä, kun taas HeLa-solut infektoitiin HSV-2:lla; Vero-solut'infektoitiin joko HSV-l:llä tai HSV-2:lla7· HSV:llä infektoitujen, 35S-metioniinilla merkittyjen solujen lysaatteja inkuboitiin 10 ^ul:n kanssa joko esi-immuunia kanin seerumia, kanin vastaseerumia, joka oli suunnattu pEH4-2-yhdysproteiinia vastaan (esim. 018- tai 019-vasta-seerumi) tai 1 ^ul:n kanssa monoklonaalista vasta-ainetta 4S. Immuunikompleksit kerättiin Pansorbiinia käyttämällä kohdassa 6.3.3. kuvatulla tavalla ja saadut radioaktiivisesti merkityt, immuunisaostuneet proteiinit erotettiin SDS-PAGE:n avulla ja fluorografoitiin. SDS-PAGE-tulokset osoittivat, että: (1) 52 000 daltonin suuruinen gD-proteiini, jota HSV-l:llä infektoidut GBK-solut ja Vero-solut tuottavat, saostuu immunologisesti sellaisten vastaseerumien kanssa, jotka kohdistuvat pEH4-2-transformanttien tuottamaa yhdysproteiinia vastaan, ja 4S-monoklonaalisen vasta-aineen kanssa; (2) 50 000 daltonin suuruinen gD-proteiini, jota HSV-2:lla infektoidut HeLa-solut ja Vero-solut tuottavat, reagoi immunologisesti vastaseerumien kanssa, jotka kohdistuvat pEH4-2- si 83974 yhdysproteiinia vastaan, ja 4S-monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. HSV-2:sta johdetun gD:n ilmeinen pieni molekyylipaino verrattuna HSV-l:stä johdetun gD:n molekyylipainoon pitää yhtä julkaistujen havaintojen kanssa (Ruyechan et ai., 1979, J.Virol.

2 9: 677). Fluorografiatulokset osoittivat, että sekä HSV-l:llä että HSV-2:lla infektoituneiden solujen tuottama gD-proteiini reagoi immunologisesti vastaseerumien kanssa, jotka on suunnattu pEH4-2-transformanttien tuottamaa yhdysproteiinia vastaan.

6.4.3. pEH4-2:ta vastaan suunnattu vastaseerumi neutraloi HSV-1- ja HSV-2-infektion in vitro_ pEH4-2-yhdysproteiinia vastaan suunnatut kanin vastaseerumit analysoitiin myös sen suhteen, miten ne kykenivät neutraloimaan viruksen infektointikykyä. Viruksen neutraloituminen mitattiin täplien lukumäärän vähenemisenä tartunnan saaneissa soluissa kudosviljel-mässä (Showalter et ai., 1981, Infection and Immunity 34:684).

Tätä tarkoitusta varten 50-100 pfu HSV-l:tä tai HSV-2:ta esi-inkuboitiin esi-immuunien seerumien (verrokit), immuunien vasta-seerumien (018 ja 019) tai monoklonaalisen vasta-aineen 4S laimennusten kanssa aktiivisen seerumikomplementin (C *) läsnäollessa tai ilman sitä. Vero-solut infektoitiin näillä HSV-1- tai HSV-2-valmisteilla. 3-4 vuorokauden kuluttua HSV-täplät laskettiin ja vastaseerumin vaikutus täplälukuun määritettiin. Taulukossa 1 esitetyt tulokset osoittavat, että kummastakin kanista saadut vastaseerumit kykenivät neutraloimaan HSV-1:n ja HSV-2:n in vitro. Neutraloituminen oli selvä ilman aktiivisen komplementin läsnäoloa, mutta komplementti lisäsi neutraloitumista huomattavasti. Neutraloituminen oli tehokkaampaa HSV-1:n kohdalla kuin HSV-2:n kohdalla.

52 83974

Taulukko 1 HSV:n neutralointi anti-pEH4-2-yhdisproteiinilla

Neutralointi'*' HSV-1 HSV-2

Vasta-aine -C1 +C' -C1 +C' 018 128 768 8 32 2 512^ 200 + 2 019 128 512 12 32 2 256 2002

Monoklonaalinen 4S 20 000+ 20 000+ 20 000+ 20 000+ ^Kanien 018 ja 019 seerumit tutkittiin virusta neutraloivan vaikutuksen suhteen käyttämällä 5 % lämmöllä inaktivoitua komplementtia (56°C, 30 minuuttia, -C1) tai aktiivista marsukomplementtia (+C') Vero-soluykskerroksissa. Luvut esittävät vasta-ainetiittereitä niiden seerumilaimennusten käänteisarvoina, jotka vähensivät täplälukua 50 prosentilla.

2 Näissä kokeissa käytettiin GBK-soluja Vero-solujen tilalla.

Nämä tulokset osoittavat, että pEH4-2-yhdysproteiinia voidaan käyttää osarokotteissa (subunit vaccine) HSV-1:tä ja HSV-2:ta vastaan.

6.4.4. pEH4-2:n sisältämän gD-l-geenin muokkaus gD-geenin muokkauksessa käytettiin plasmideja pJS413 ja pRWF6 (kuva 8) .

Tätä varten pRWF6 hajotettiin HindIII:lla ja Bal31:llä niin, että saatiin kooltaan mielivaltaisten, tylppäpäisten palasten spektri. Kun nämä palaset oli hajotettu Sacl:llä, tylppäpää/SacI-palaset, joiden koko oli välillä 2,2-2,4 kb, eristettiin. Nämä palaset sisälsivät gD-l-geenin aminopään eri pituuksina (ks. kuva 8).

53 83974 gD-l-palaset alakloonattiin plasmidiin pJS413. Tätä varten pJS413 hajotettiin Smalrllä (jolloin syntyi tylppä pää) ja Sacl:llä (jolloin syntyi SacI-3'-kohesiivinen pää). 4,7 kb:n SmaI/SacI-pJS413-palanen liitettiin tylppäpää/SacI-pRWF6-palaseen (2,2-2,4 kb) suhteessa 1:1 ja liitännäisellä transformoitiin E. coli-kanta NF1829. Näin saatiin joukko klooneja, jotka olivat transformoituneet plasmideilla, jotka sisälsivät gD-l-geenin, jonka aminopäästä oli poistettu pituudeltaan mielivaltainen osa (kuva 8). Kaikkiaan 24 plasmidia, joista käytetään merkintää pEH50+x (jossa x on 1-14), kukin noin 7 kb, analysoitiin kartoittamalla restriktioentsyymikohdat. Ne, jotka sisälsivät PvuII-kohdan gD-l-geenin sisällä (19 transformanttia 24:stä), analysoitiin tarkemmin, jotta löydettäisiin se klooni, joka sisälsi pisimmän osan gD-l:n aminoa koodittavasta päästä.

Täydellisessä gD-l-geenisekvenssissä gD:n aloitus-ATG:n ja sisäisen PvuII-kohdan välimatka on 156 emäsparia. Näin ollen kukin yhdeksästätoista pEH50+x-plasmidista hajotettiin BglII:lla ja PvuII:lla; saadut palaset erotettiin geelielektroforeesilla Bglll/PvuII-palasen koon määrittämiseksi. Näin löydettiin viisitoista plasmidia, joiden Bglll/PvuII-palanen oli alle 160 emäsparia, so. Bal31-hajotuksen loppukohta, joka on esitetty kuvassa 8, on jossakin gD:n alku-ATG:n ja PvuII-kohdan välissä. Näiden 15 sekvenssi määritettiin tarkkaan, jotta saatiin määritetyksi kohta, jossa liitosplasmidiin pJS413 oli tapahtunut. Seitsemän plasmidia, pEH51, pEH60, pEH62, pEH66, pEH71, pEH73 ja pEH74, sisälsivät gD-l-sekvenssin liittyneenä faasiin pJS413:n cro-ATG-luentakehyksen kanssa (ks. kuva 3, jossa nämä liitoskohdat on merkitty vastaavalla pEH-numerolla ja pystysuoralla nuolella). Itse asiassa pEH51 koodittaa kaikkia, paitsi 6 ensimmäistä gD-l:n aminopään aminohappoa.

pEH51-, pEH60-, pEH62- ja pEH71-transformantit merkittiin ^-S-metioniinilla ja suoritettiin indusointi IPTGrllä tai ei suoritettu ja solulysaatit käsiteltiin monoklonaalisella vasta-aineella 55S; immuunisakat analysoitiin SDS-PAGE:llä edellä kuvatulla tavalla.

54 83974

Kukin transformanteista pEH51, pEH60, pEH62 ja pEH71 tuotti 46 000 daltonin suuruista indusoitavissa olevaa proteiinia, joka saostui monoklonaalisen 55S:n kanssa (tuloksia ei ole esitetty).

Lopuksi tehtiin yhdysproteiineja koodittavia yhdistelmäplasmideja siten, että käytettiin pEH51:n aminoa koodittavaa päätä pEH4-2:ssa olevan gD-l-geenin aminoa koodittavan pään rekonstruointiin (ks. kuva 9). Plasmidi pEH4-2 hajotettiin Pstlrllä ja SacIIrlla ja 6,2 kb:n palanen, joka sisälsi osittaisen gD-1/3-galaktosidaasi-geenin, eristettiin. Plasmidi pEH51 hajotettiin täysin Pstl:llä ja osittain SacII:lla. pEH51:n 1,25 kb:n Pstl/SacII-palanen liitettiin suhteessa 1:1 pEH4-2:n 6,2 kb:n Pstl/SacII-palaseen niin, että saatiin pEH82. Transformantit seulottiin β-galaktosidaa-siaktiivisuuden suhteen edellä kuvatulla tavalla. E. coli-trans-formanteille, joissa on pEH51-plasmidi, annetaan nimeksi E. coli, kanta WW51; niille transformanteilie, joissa on plasmidi pEH82, annetaan nimeksi E. coli, kanta WW82.

Nyt on osoitettu, että HSV-gD-l-yhdysproteiineja voidaan tuottaa suuria määriä E.colin avulla. Yhdysproteiinit ovat hyvin stabiileja, mikä johtuu ehkä yhdysproteiinin omasta rakenteesta tai siitä, että yhdysproteiini on valikoitu tiiviiseen, liukenemattomaan sulkeumaan. Nyt on osoitettu, että yhdysproteiini voidaan uuttaa E. colista ja käyttää eläinten immunisointiin. Tuotettu vastaseerumi kykenee neutraloimaan sekä HSV-l:n että HSV-2:n täplien muodostumisen in vitro.

6.5. pEH90-10am LE392:n valmistus, joka tuottaa sekä cro/gD-1- että cro/gP-l/B-galaktosidaasiyhdysproteiinia_

Rakennettiin plasmidi pEH90-10am, joka kykenee ohjaamaan sekä pelkän gD-1:lie sukua olevan proteiinin että vastaavan yhdysproteiinin tuotantoa sopivissa isäntäsoluissa (ks. kuva 10).

Plasmidi pEH90-10am johdettiin yhdistelmäplasimidisarjasta pEH90-N, joka vuorostaan johdettiin pEH3-25:stä (esitetty kohdassa 6.4.), joka koodittaa cro/gD-l/6-galaktosidaasiyhdysproteiinia (ks. kuva 3 ja kuva 10). pEH90-N-sarja on samanlainen kuin pEH4-2 (kohta li 55 83974 6.4.) siinä suhteessa, että ero-, gD-1- ja z-geenin luentakehyk-set ovat faasissa, mutta pEH90-N-sarja sisältää lisäksi restriktio-endonukleaasin yhden ainoan tunnistuskohdan, joka sijaitsee gD-1-geenin ja z-geenin liitoskohdassa.

Yhdistelmäplasmidi, joka eristettiin yhdestä pEH90-N-sarjan transformantista, nimitettiin pEH90-10:ksi ja tutkittiin tarkemmin seuraavalla tavalla: (1) pEH90-10 katkaistiin gD-l-geeni- sekvenssin ja z-geenisekvenssin liitoskohdasta; (2) sitten pEH90-10 liitettiin yhteen sellaisen DNA-sidoksenmuodostajasekvenssin läsnäollessa, joka sisälsi kullanruskean ketjunkatkaisusekvenssin, TAG. Saatu yhdistelmäplasmidi pEH90-10am sisältää kullanruskean katkaisusekvenssin, joka on faasissa sekä gD-l-geenin että z-geenin luentakehyksen kanssa.

Kun E. coli NF1829 transformoitiin pEH90-l0am:llä, eivät ampisil-liinin suhteen vastustuskykyiset transformantit syntetisoineet mitään havaittavissa olevaa yhdysproteiinia. Kuitenkin, kun pEH90-l0am-transformantti infektoitiin lysogeenisellä transduktio-fagilla, 080 SuIII, jossa on kullanruskea suppressori-tRNA-geeni, tuottivat näin indusoituneet transformantit cro/gD-l/8-galaktosidaa-siyhdysproteiinia. Lysogeeneille annettiin nimi pEH90-10am SuIII.

Vaihtoehtoisesti plasmidilla pEH90-10am transformoitiin E. coli LE392, joka kantaa kahta kullanruskean suppressorimutaatiota (SupE ja SupF). pEH90-l0am LE392-transformantit tuottivat cro/gD-l/6-galaktosidaasiyhdysproteiinia sekä indusoiduissa että indusoimattomissa olosuhteissa. (LE392-soluissa ei ole NF1829:n lac I^-mutaatiota, joka johtaa lac-repressorin ylituotantoon). pEH90-10am LE392-transformanttien tuottamien proteiinien SDS-PAGE-analyysi osoitti, että valmistui sekä yhdysproteiinia (noin 160 000 daltonia) että pelkkää gD-1:lie sukua olevaa proteiinia (noin 38 000 daltonia); kumpikin proteiini reagoi immuunisti kanin HSV-l-vastaseerumin kanssa. pEH90-l0am LE392 transformantit näyttävät tuottavan kumpaakin proteiinia suunnilleen ekvimolaariset määrät, ja molemmat proteiinit puhdistuvat yhdessä, kun suoritetaan 56 83974 denaturoimaton seka-aggregaatinpuhdistus, jota on selostettu kohdassa 5.5. Menetelmän yksityiskohtia selostetaan seuraavassa.

6.5.1. pEH90-N-sarjän valmistus

Kuten edellä kohdassa 6.4. on selostettu, pEH3-25-transformantit tuottavat cro/gD-l/g-galaktosidaasiyhdysproteiinia, mutta pienemmässä määrin kuin pEH4-2-transformantit. pEH3-25-yhdistelmä-plasmidi on samanlainen kuin pEH4-2 paitsi, että pEH3-25 sisältää gD-l:n transmembraanisekvenssin (ks. kuva 3). Transmembraani-sekvenssi voi olla syyllinen yhdysproteiinin tehottomaan ilmentymiseen transformoituneissa isäntäsoluissa.

Ilmentämisvektori pHK414 (kuva 10) on pJS413:n johdannainen.

Itse asiassa pHK414 sisältää kaikki pJS413:n elementit, mutta sen ainoat cro-z-liitoksen yli ulottuvat kloonauskohdat ovat erilaiset. pHK414:n kloonauskohdat ovat Bglll, Hindlll, Smal ja BamHI. z-geeni ei ole faasissa cro-ATG:n kanssa, joten ehyt plasmidi ei ohjaa 3-galaktosidaasin tuotantoa. Kuitenkin isäntä-solutransformantit tuottavat β-galaktosidaasia, kun pituudeltaan sopiva DNA-palanen (3n+2) liitetään mihin tahansa näistä plasmidin kloonauskohdista, sillä tällöin z-geenin lukukehys tulee uudelleen säädetyksi cro-ATG:n suhteen, edellyttäen, että liitetty DNA-sekvenssi ei sisällä päätössignaaleja (esim. TGA, TAA tai TAG), jotka ovat faasissa cro-ATG:n tai z-geenin kanssa.

pEH90-N-sarja rakennettiin seuraavalla tavalla (ks. kuva 10): pEH3-25 hajotettiin ensin BamHI:llä ja sen jälkeen katkaistu plasmidi käsiteltiin Bal31:llä, jotta karboksia koodittavasta päästä saatiin poistetuksi gD-l:n transmembraanisekvenssi. Bal31-hajotuk-sen jälkeen pEH3-25 katkaistiin Pstl:llä ja agaroosigeelielektro-foreesilla eristettiin DNA-palasten sarja, jossa koot vaihtelivat välillä 1,7-1,9 kb, ja jolle olivat tunnusomaista Pstl-kohesiivi-nen pää, amp -geenin aminoa koodittava pää, lac-promoteri ja luen-nanohjauselementit, gD-l-geeni, jonka transmembraanisekvenssi oli poistettu osaksi tai kokonaan, ja tylppä pää (BamHI^ ^).

ti 57 83974

Ilmentämisplasmidi pKH414 katkaistiin ensin BglII:lla ja kohe-siiviset Bglll-päät täytettiin käyttämällä DNA-polymeraasin Klenow-palasta. Sitten lineaarinen, tylppäpäinen pKH414 hajotettiin Pstl:llä ja agaroosigeelielektroforeesilla erotettiin 5.5 kb:n DNA-palanen, jolle olivat tunnusomaista tylppä pää (Bglll ), z-geeni, amp -geenin karboksipää ja Pstl-geenin kohesiivinen pää.

pEH3-25:n 1,7-1,9 kb:n Pstl/BamHI^ ^-DNA-palaset ja pHK414:n 5.5 kb:n Bglll^ ^/Pstl-DNA-palanen liitettiin yhteen moolisuhtees-sa 1:1 käyttämällä T4-DNA-ligaasia. Näin saadulla plasmidisar-jalla, jolle annettiin nimi pEH90-N, transformoitiin E. coli NF1829, jota kasvatettiin indikaattoriagarlevyillä.

Seuraavat 24 transformantista johdetut yhdistelmäplasmidit, jotka tuottivat yhdysproteiineja, analysoitiin suorittamalla DNA-sekvens-sin määritys gD-l/z-geeniliitoksen yli (ks. kuva 3): pEH90-2, PEH90-3, pEH90-4, pEH90-5, pEH90-6, pEH90-7, pEH90-9, pEH90-10, pEH90-ll ja pEH90-12. Kaikista, paitsi pEH90-12:sta, on trans-membraanisekvenssi poistunut kokonaan tai osittain; pEH90-4 ja pEH90-5 sisältävät noin puolet transmembraanisekvenssistä. Kaikki nämä plasmidit, lukuunottamatta plasmidia pEH90-12, ohjasivat cro/gD-l/B-galaktosidaasiyhdysproteiinin tuotantoa, jota syntyi yhtä suuri määrä kuin pEH4-2:n tuottamana. Plasmidi pEH90-l0 valittiin käytettäväksi menetelmän seuraavassa vaiheessa (pEH90-l0-transformanttien tuottama gD-l-yhdysproteiini on identtinen sen kanssa, jota pEH4-2-transformantit tuottavat paitsi, että pEH4-2-transformanttien tuottaman gD-l:n neljä viimeistä aminohappoa puuttuu pEH90-10-transformanttien tuottamasta yhdysproteiinista).

6.5.2. pEH90-10am-plasmidin valmistus

Jotta saataisiin liitetyksi kullanruskea ketjunkatkafsusekvenssi plasmidin pEH90-10 gD-l-sekvenssin ja z-geenin väliin, käytettiin seuraavaa menetelmää (ks. kuva 10): pEH90-10 katkaistiin Hindlll: 11a ja sen jälkeen BamHI:llä, jolloin plasmidi katkesi ainoista restriktioendonukleaasikohdistaan, jotka sijaitsivat gD-l-geenin ja z-geenin liitoskohdassa (katso alla): 58 83974

Hindlll Sinai BamHI

qD- lsGA.TCT.AAG.CTT.CCC.GGGiGAT.CCA.AGA.TCCti- z sCT.AGA.TTC.GAA.GGG .CCC.CTA.GGT.TCT.AGG :

Hindlll/BamHI

gD- I:GA.TCT.A GAT.CCA.AGA.TCC: i- 2

CT.AGA.TTC.G A GT.TCT.AGG

7,3 kb:n Hindlll/BamHI:llä katkaistu plasmidi eristettiin agaroo-sigeelielektroforeesilla ja liitettiin (T4 DNA-ligaasia käyttämällä) DNA-sidoksenmuodostajaan, jolle oli ominaista Hindlll/BamHI-kohesiiviset päät ja keskellä oleva Xbal-kohta ja kullanruskea sekvenssi (TAG):

Xbal AG.CTC. ItAgI .ACG.

G. ATC .TGC .CTA.G

Kukin DNA-sidoksenmuodostajan komplementaarinen säie syntetisoitiin kiinteäfaasimenetelmällä, jota Chow et ai., 1981,

Nucleic Acids Res 9_ (12): 2807-2817, ovat selostaneet.

Kun sidoksenmuodostaja oli liitetty katkaistuun plasmidiin, saadut yhdistelmäplasmidit katkaistiin Xbal:llä, lineaariset 7,3 kb:n DNA-palaset eristettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja tehtiin uudestaan rengasmaisiksi liittämällä yhteen T4 DNA-ligaasilla (näin saatiin valituksi sellaiset pEH90-10-plasmidit, jotka todella sisälsivät sidoksenmuodostajasekvenssin, joka oli liittynyt Hindlll- ja BamHI-kohtien väliin gD-l/z-liitoskohdassa, mitä todistaa yhden ainoan Xbal-kohdan läsnäolo plasmidissa). Liitoksen tuloksena DNA-sidoksenmuodostajan kullanruskea sekvenssi oli faasissa gD-Ι- ja z-geenin luentakehyksen kanssa (ks. alla):

Hindlll^ Xbal BamHI

i * ,__ i gD:GA.TCT.AAG.CTC. ITAGI .ACG. GAT.CCA.AGA.TCC:i-z CT.AGA.TTC.GAG.ATC.TGC.CTA.GGT.TCT.AGG.

Näin saadulle plasmidille annettiin nimi pEH90-10am.

Il 59 83974 6.5.3 . pEH90-l0am-transformantit pEH90-l0am-plasmidilla transformoitiin E. coli NF1829. Kun suoritettiin indusointi IPTG:llä, ampisilliinin suhteen vastustuskykyiset transformantit eivät syntetisoineet mitään havaittavissa olevia yhdysproteiinimääriä (ei lainkaan punaisia pesäkkeitä MacConkey-indikaattoriagarlevyillä). Sen jälkeen transformantit infektoitiin lysogeenisellä transduktiofagilla, 080 SuIII, joka sisältää kullanruskean suppressori-tRNA:n geenin. Lysogenoidut transformantit, jotka oli indusoitu IPTG:llä, tuottivat punaisia pesäkkeitä MacConkey-agarlevyillä, mikä osoitti yhdysproteiinin tuotantoa. Näille lysogeeneille annettiin nimi pEH90-10am SuIII.

pEH90-10am-plasmidilla transformoitiin myös E. coli LE 392, jossa on kaksi kullanruskean suppressoria (supE ja supF), mutta siinä ei ole NFl829:n lac I^-mutaatiota ja näin ollen se ei voi syntetisoida liikaa lac-repressoria. Nämä transformantit, joille annettiin nimi pEH90-10am LE392, tuottivat yhdysproteiinia sekä IPTGrllä indusoitaessa että ilman indusointia.

6.5.4. pEH90-l0am LE392-transformanttien tuottamien proteiinien analyysi_ pEH90-10am LE392-transformantit tuottivat yhdysproteiinia (noin 160 000 daltonia) ja 38 000 daltonin suuruista proteiinia suunnilleen yhtä suuret määrät. Kummankin proteiinin havaittiin reagoivan immunologisesti HSV-l:tä vastaan suunnatun kanin vastaseeru-min kanssa. Tätä tarkoitusta varten solun proteiinit eristettiin miniaggregaattimenetelmällä (kuvattu jäljempänä), erotettiin SDS-PAGE:llä ja siirrettiin nitroselluloosaan, joka sen jälkeen käsiteltiin ensin HSV-l:tä vastaan suunnatulla kanin vastaseerumilla 125 ja sen jälkeen koettimena käytetyllä I:llä merkityllä vuohen vastaseerumilla, joka oli suunnattu kanin immunoglobuliinia vastaan (Towbin et ai., 1979, Proc .Natl. Acad.Sci. , USA, 7_6: 4350).

Seuraavaa miniaggregaattimenetelmää käytettiin isäntäsoluaggre-gaattien eristämiseksi seulonta-analyysiä varten: 6o 83974 (1) Kahteen rinnakkaiseen putkeen, joissa oli 5 ml tuoretta Luria-alustaa, joka sisälsi 100 ^,ug/ml ampisilliiniä, siirros-tettiin 200 ^ul yön yli kasvatettuja soluja, ja kasvustoa inku-boitiin 90 minuuttia 37°C:ssa. Toinen kustakin kahdesta rinnak-kaiskokeesta indusoitiin lisäämällä 1 mM IPTG:tä (lopullinen väkevyys) . Viljelmiä kasvatettiin ravistelussa vielä 5 tuntia 37°C:ssa.

(2) 3 ml:n näytteen sisältämä solumäärä pelletoitiin sentrifu-goimalla mikrosentrifugissa (12 000 x g) 2 minuuttia (N.B., mikro-sentrifugiputken kokonaistilavuus on 1,5 ml, joten ensin pelletoitiin 1,5 ml:n erä ja emäliuos heitettiin pois ja sen jälkeen samaan mikrosentrifugiputkeen lisättiin toinen 1,5 ml:n erä ja pelletoitiin).

(3) Solupelletti suspendoitiin uudestaan 50 ^ul:aan 25-prosent-tista sakkaroosia, jossa oli 50 mM Tris.HCl, pH8, ja suspensio jäädytettiin sijoittamalla putki hiilihappojää/etanolihauteeseen.

(4) Jäätynyt suspensio sulatettiin, lisättiin 50 ^ul liuosta, jossa oli 10 mg/ml lysotsyymiä 0,25 M Tris.HClrssa, pH8, ja suspensiota inkuboitiin 10-15 minuuttia jään päällä.

(5) Kun oli inkuboitu 10-15 minuuttia, lisättiin 400 ^,ul TET-puskuria (100 mM Tris.HCl, pH8, 50 mM EDTA, 2 % Triton X-100; TritonX-100 on ei-ioninen pinta-aktiivinen aine eli polyoksiety-leeni (9-10) p-tert.-oktyylifenoli), suspensiota sekoitettiin hitaasti ja inkuboitiin 5 minuuttia jään päällä. Sitten lisättiin 500 ^ul 2 x RIPA-liuosta (2 x RIPA = 20 mM Tris.HCl, pH 7,4, 300 mM NaCl, 2 % natriumdeoksikolaattia, 2 % NP-40, 0,2 % SDS) ja suspensiota sekoitettiin varovasti ja inkuboitiin 5 minuuttia jään päällä.

(6) Sen jälkeen suspension soluja sonikoitiin 10 sekuntia käyttämällä mikrosondia ja suspensio kirkastettiin sentrifugoimalla Sorvali SS34-roottorissa 30 minuuttia nopeudella 20 000 1/min (47 800 x g).

li ei 83974 (7) Emäliuos dekantoitiin ja pelletti, joka sisälsi proteiini-seka-aggregaatin, suspendoitiin uudestaan 50 ^ul:aan tislattua vettä ja sen jälkeen lisättiin 50 ^ul 2 x näytepuskuria (2 x näytepuskuri = 10 % SDS, 40 mM Tris.HCl, pH 6,8, 2 % β-ΜΕ ja 0,02 tilavuutta kyllästettyä bromifenolisinistä). Seosta keitettiin 5 minuuttia ja 25 ^ul:n erät sijoitettiin 10 % SDS-polyakryy-liamidigeeleihin elektroforeesia varten.

Kun proteiinit oli erotettu SDS-PAGE:llä, ne siirrettiin nitro- selluloosaan (so. tehtiin "proteiinipilkutus"). Sitten nitrosel- luloosa käsiteltiin ensin HSV-l:tä vastaan suunnatulla kanin 125 vastaseerumilla ja sen jälkeen koettimena käytetyllä I:llä merkityllä vuohen vastaseerumilla, joka oli kohdistettu kanin immunoglobuliinia vastaan (Towbin, 1979 supra). Proteiinipilkku-jen autoradiogrammit osoittivat selvästi, että kaksi kaistaa reagoi immunologisesti anti-HSV-l-vasta-aineiden kanssa: 160 000 daltonin suuruinen yhdysproteiini (cro/gD-l/6-galaktosidaasi) ja 38 000 daltonin suuruinen gD-l:lle sukua oleva proteiini (ei ole liittynyt β-galaktosidaasiin). Näin ollen erillinen proteiini puhdistuu yhdessä yhdysproteiinin kanssa, kun proteiinien eristämisessä käytetään seka-aggregaattieristysmenetelmää, ja sekä erillinen gD (cro/gD-1) että gD-yhdysproteiini (cro/gD-l/B-galakto-sidaasi) aikaansaivat immuunireaktion anti-HSV-seerumin kanssa.

7. Esimerkki: HSV-2-gD

HSV-l:n geenikarttaa verrattiin HSV-2:n geenikarttaan. gD:tä koo-1· dittavan sekvenssin paikka HSV-2-perimässä määritettiin vertaamalla sitä gD:n paikkaan ja kokoon HSV-l-perimässä. HSV-2:n Us-alueen Bglll-L-palanen liitettiin pBR322:een niin, että saatiin yhdistelmaplasmidi pHVl. pHVl:n sisältämä gD-2:ta koodittava sekvenssi paikannettiin hybridisaatiolla käyttämällä hybridisointi-koettimena pSC30-4:stä saatua gD-l:n DNA-jaksoa. Se pHVl:n osa, joka sisälsi gD-2:ta koodittavan sekvenssin, alakloonattiin pBR322:een, jolloin saatiin yhdistelmäplasmidi pHV2rn sisältämän gD-2-geenin DNA-sekvenssi määritettiin ja gD-2:n sekvenssiä verrattiin gD-l:n sekvenssiin. gD-2:n DNA-sekvenssi on yhtä kodonia lyhempi kuin gD-l:n sekvenssi, mutta näiden kahden 62 83974 sekvenssin välillä on kuitenkin huomattavaa homologiaa.

Jotta gD-2-geeni saataisiin asetetuksi lac-promoterin ohjaukseen, pHV2:sta eristettiin sellainen gD-2-geenin osa, josta puuttui proteiinia koodittavan sekvenssin 120 ensimmäistä nukleotidia.

Tämä DNA-palanen liitettiin pieneen DNA-palaseen, joka kooditti lac-promoteria ja luennan ohjauselementtejä. Saatu yhdistelmä-plasmidi, pHV5, ohjasi gD-2:lle sukua olevan proteiinin tuotantoa transformoituneissa isäntäsoluissa.

Lopuksi gD-2-geenipalanen eristettiin pHV5:stä suorittamalla katkaisu restriktioendonukleaaseilla tietyistä kohdista niin, että gD-2:ta koodittavan sekvenssin sisältämä päätössignaali (TAG) poistui. Tämä DNA-palanen, joka sisälsi gD-2-geenin osan ja il-mentämisplasmidin promoterin ja ohjauselementit, liitettiin pHK414:ään, joka on β-galaktosidaasia koodittavan sekvenssin sisältävä vektori. Näin saatu yhdistelmäplasmidi, pHV6, jossa oli plasmidin lac-promoteri ja croSD-ATG, gD-2:ta koodittava sekvenssi ja β-galaktosidaasigeeni, tässä järjestyksessä, ohjasi yhdyspro-teiinin ilmentymistä indusoiduissa E. coli-transformanteissa. pHV6-yhdysproteiini eristettiin isäntäsolun lysaateista ja formuloitiin immunogeeninä käytettäväksi. Seuraavassa tämä rakentamistoimenpide selostetaan yksityiskohtaisesti.

7.1. Plasmidien valmistuksessa käytetty yleismenetelmä

Ellei toisin ole ilmoitettu käytettiin gD-2:n kloonauksessa kohdassa 6 ja sen alakohdissa kuvattua DNA:n eristämistä, entsyymi-reaktioita ja liittämisreaktioita.

7.1.1. Restriktioentsyymipuskurit

Smal-hajotuksissa käytetty puskuri oli seuraava: 6,6 mM Tris.HCl (pH 7,4), 6,6 mM MgCl2 ja 6,6 mM β-ΜΕ.

Bglll-, Clal-, EcoRI- tai Pstl-hajotuksissa käytetty puskuri oli seuraava: 60 mM NaCl, 6,6 mM Tris.HCl (pH 7,4), 66,6 mM MgCl2 ja 6,6 mM S-ME.

63 83974

BamHI-, Sali- tai Xhol-hajotuksissa käytetty puskuri oli seuraa-va: 150 mM NaCl, 6,6 mM Tris.HCl (pH 7,4), 6,6 mM MgC^ ja 6,6 mM β-ΜΕ.

Huomattakoon, että katkaistaessa DNA kahdella tai useammalla restriktioendonukleaasireaktiolla suoritetaan reaktio vähäsuolaisessa puskurissa ennen enemmän suolaa sisältävässä puskurissa tapahtuvaa reaktiota. Jos kaksi entsyymiä vaatii saman puskurin, voidaan reaktiot suorittaa samanaikaisesti.

7.2. gP-2-geenin paikantaminen ja eristäminen Kuten edellä on selostettu, HSV-l:n ja HSV-2:n geenikarttoja verrattiin toisiinsa, jotta voitiin määrittää gD:n asema ja koko suurin piirtein HSV-2-perimässä (ks. kuva 11a). gD-2-geeni sijoittui 0,9 ja 0,945 perimäkarttayksikön välille Us-alueella joka sisältyy 8,5 kb:n Bglll L-palaseen. Bglll L-palanen leikattiin irti HSV-2-DNA:sta ja liitettiin pBR322:een jatkoanalyysiä varten.

7.2.1. gD-2-geenin sisältävän pHVl:n rakentaminen HSV-2:n (kanta G) perimä-PNA katkaistiin Bglll:11a ja PNA-palanen, jonka koko oli noin 8,5 kb, ja joka sisälsi gP-2-geenin, eristettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Plasmidi pBR322 hajotettiin täysin BamHI:llä ja saatu 4,4 kb:n pBR322-PNA ja HSV-2:n sisältämä 8,5 kb:n Bglll L PNA-palanen liitettiin yhteen (BamHI-kohesiiviset päät ja Bglll-kohesiiviset päät ovat komplementaarisia) suhteessa 1:1, jolloin saatiin pHVl (kuva 11b).

7.2.2. gP-2:n suhteen spesifistä mRNA:ta koodittavan sekvenssin paikantaminen_ gP-2:n mRNA:ta koodittava sekvenssi paikannettiin pHVl:n sisältä hybridisaatiolla (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 9j): 503) käyttämällä hybridisointikoettimena pSC30-4:stä saatua gO-l-BNA-palas-ta (Southernin siirtomenetelmän osalta ks. Maniatis et ai., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ss. 382-389).

64 83974 Tätä varten pHVl katkaistiin Xholrllä ja saadut DNA-palaset erotettiin agaroosigeelielektroforeesi11a. Geelin sisältämät DNA-palaset denaturoitiin alkalissa, neutraloitiin ja siirrettiin nitroselluloosasuotimelle. Suotimeen kiinnittyneet DNA- 32 palaset hybridisoitiin sen jälkeen P:llä merkittyyn gD-l-koet-timeen.

o o P:llä merkitty gD-l-koetin valmistettiin seuraavalla tavalla: pSC30-4 (kuva Id ja kuva 4) katkaistiin PvuIIrlla ja 500 bp:n DNA-palanen, joka sisälsi gD-l:n ensimmäiset 52 kodonia (156 nukleotidia) eristettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. gD-l-DNA merkittiin radioaktiivisesti loviluennalla (nick translation) (BRL Kit, Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithesburg, MD). Loviluenta on tarkoitettu DNA-kaksoissäikeen suuren radiospesifisen aktiivisuuden saavuttamiseen merkitsemällä radioaktiivisesti in vitro. Tässä menetelmässä käytetään hyväksi kahta E.colin DNA-polymeraasi I:n useista aktiivisuuksista: 51-31-eksonukleaasiaktiivisuutta ja 5'-3'-polymeraasiaktii-visuutta. Lovi luennassa entsyymi sitoutuu DNA-kaksoissäikeen yhden säikeen loveen (nick). Sitten 51-3'-eksonukleaasi hydrolysoi lovitettavan säikeen nukleotideja ennen kuin polymeraasi tulee perässä. Näin lovi siirtyy (tulee luetuksi) pitkin säiettä. Koska hydrolyysinopeus on sama kuin polymeroitumisnopeus, ei tapahdu mitään nettosynteesiä. Kuitenkin tämän vaihtoreaktion kuluessa saadaan reaktioseoksessa läsnä olevat radioaktiiviset deoksinukleosiditrifosfaatit sisällytetyiksi DNA:hän (Kelly 32 et ai., 1970, J.Biol.Chem. 245: 39). Sen jälkeen P:llä merkitty gD-l-DNA-kaksoissäie denaturoitiin käytettäväksi yksisäikei-senä koettimena (ks. Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, ss. 109-112).

Autoradiografia osoitti, että pHVl:n XhoI/XhoI-DNA-palanen, jonka koko oli noin 2,3 kb, oli komplementaarinen radioaktiivisen gD-l-koettimen kanssa ja näin ollen sisälsi gD-2:ta koodittavan sekvenssin.

li 65 83974

Sitten pHVlrn XhoI/XhoI-DNA-palanen alakloonattiin pBR322:een, jotta gD-2:ta koodittava sekvenssi voitiin tutkia tarkemmin.

Tätä tarkoitusta varten pHVl hajotettiin XhoI:llä ja gD-2:ta koodittavan sekvenssin sisältävä 2,3 kb:n DNA-palanen liitettiin suhteessa 1:1 lineaariseen pBR322:een, joka oli sitä ennen pilkottu Sall:llä (Sali sai aikaan kohesiiviset päät, jotka ovat komplementaarisia XhoI:n aikaansaamien kohesiivisten päiden kanssa), niin että saatiin pHV2 (kuva 11c).

7.2.3. gD-2:n mRNA:ta koodittavan sekvenssin karakterisointi pHV2:n HSV-DNA:n sekvenssi määritettiin Maxam'in ja Gilbert'in menetelmällä (1980, Methods in Enzymology, 65: 499). Kuva 12 esittää HSV-2-gD-geenille saatua DNA-sekvenssiä. DNA-sekvenssi sisälsi 393 kodonin suuruisen avoimen lukukehyksen (1 kodoni vähemmän kuin gD-l:tä koodittavassa sekvenssissä), joka lähti alkuun kohdassa 267 olevasta ATG:stä. Tämän kohdan arvioitiin olevan gD-2-geenin alullepanokohta ja näin osoittautuikin olevan, kun tämä oletettu gD-2-geenisekvenssi kloonattiin ilmentämis-vektoreihin pJS413 ja pHK413 (infra).

gD-2-proteiinin ennustettua aminohapposekvenssiä verrattiin gD-1-proteiinin ennustettuun aminohapposekvenssiin (kuva 13). Kyseiset kaksi sekvenssiä ovat noin 85-prosenttisesti homologisia; ei-homologiset alueet näyttävät esiintyvän kolmella alueella: johtosekvenssi, transmembraanialue ja oletettu ankkurialue. gD-2-proteiini on yhtä aminohappotähdettä lyhempi kuin gD-l-pro-teiini.

7.3. gD-2-geenin kloonaus ja ilmentäminen

Jotta gD-2-geeni saataisiin asetetuksi lac-promoterin ohjaukseen, pHV2:sta eristettiin osa oletetusta geenisekvenssistä, josta puuttui ensimmäiset 120 nukleotidia aminoa koodittavasta päästä (geenin 5'-päästä). pHV2-DNA-palanen liitettiin pieneen pJS413-DNA-palaseen (noin 200 bp), joka sisälsi lac-promoterin, luennan ohjauselementit, cro-ATG:n ja 69 nukleotidia sisältävän eron. Näin saatu yhdistelmäplasmidi pHV5 (kuva 14), sisältää kaikki paitsi gD-2-sekvenssin ensimmäiset 40 kodonia. Itse 66 83 974 asiassa pHV5 koodittaa kaikkia paitsi 15 kypsän gD-2:n aminohappoja. Tavallisesti gD-2:n ensimmäiset 25 aminohappoa (signaa-lisekvenssi) pilkkoutuvat pois, kun gD-2-proteiinia prosessoidaan. Seuraavassa kuvataan pHV5:n rakentamista.

7.3.1. pHV5:n rakentaminen

Yhdistelmäplasmidi, pHV2, hajotettiin Clal:llä (ks. kuva 14) ja syntyneet kohesiiviset päät täytettiin käyttämällä DNA-polymeraasin Klenow-palasta. Sitten tylppäpäinen, lineaarinen pHV2 katkaistiin EcoRI:llä. Agaroosigeelielektroforeesilla ( - j eristettiin 5,4 kb:n Clal /EcoRI-DNA-palanen, jossa oli amp - geeni ja kaikki, paitsi 120, gD-2-geeniä koodittavat nukleotidit.

Ilmentämisvektori pJS413 (selostettu kohdassa 6.3.1.) katkaistiin

Smal:llä ja EcoRI:llä. Polyakryyliamidigeelielektroforeesilla eristettiin 200 bp:n (0,2 kb) palanen, joka kooditti lac-z ero promoteria, SD :aa, SD :ta, cro-ATG:tä ja eron 69 nukleotidia.

5,4 kb:n Cla^ ^/EcoRI-pHV2-DNA-palanen ja 0,2 kb:n EcoRI/Smal-pJS413-DNA-palanen liitettiin yhteen moolisuhteessa 1:1 käyttämällä T4 DNA-ligaasia. Saadulla yhdistelmäplasmidilla, pHV5, transformoitiin E. coli-kanta NF1829.

7.3.2. Niiden transformanttien identifiointi, jotka ilmentävät gD-2-geenin_

Ampisilliinille vastustuskykyisten E. coli-transformanttien plas-midit eristettiin ja ne analysoitiin restriktioendonukleaasi-kartoituksella ja sen suhteen, miten ne kykenivät ilmentämään gD-2:lie sukua olevaa polypeptidiä. Koska lac-promoteri oli transkriptionaalisesti inaktiivinen NFl829:ssa (johtuen lac-repressorin ylituotannosta), gD-2:lie sukua oleva proteiini voitiin havaita vain indusoitaessa promoteri joko 1 mM IPTG:llä tai 1-10 mM laktoosilla.

Yhdistelmäplasmidilla pHV5 transformoituneen kloonin havaittiin tuottavan indusoitavaa gD-2:lie sukua olevaa proteiinia. Indusoitavan proteiinin havaittiin saostuvan immunologisesti kanin vastaseerumin kanssa, joka kohdistui HSV-2:ta vastaan.

li 67 83974 7.4. pHV6:n valmistus, joka ohjaa cro/gD-2/3-galaktosidaasi- yhdysproteiinin tuotantoa____

Jotta saataisiin tuotetuksi yhdysproteiinia, gD-2-sekvenssi liitettiin bakteeri-isännän geenisekvenssiin niin, etteivät luenta-kehykset keskeytyneet päätössignaaleilla. Tätä varten pHV5:n gD-2:ta koodittava sekvenssi katkaistiin niin, että gD-2:n päätössignaali (TAG) poistui. pHV5-DNA-palanen, joka sisälsi lac-promoterin, luennan ohjauselementit ja cro/gD-2-sekvenssin, liitettiin pHK414-DNA-palaseen, jossa oli z-geeni. Näin saatu yhdistelmäplasmidi, pHV6 (kuva 15), koodittaa cro/gD-2/6-galakto-sidaasiyhdysproteiinia.

7.4.1. pHV6:n rakentaminen

Plasmidi pHV5 hajotettiin Pstl:llä ja BamHIrllä (ks. kuva 15).

Agaroosigeelielektroforeesilla eristettiin 1,75 kb:n Pstl/BamHI- pHV5-DNA-palanen, joka kooditti osaa amp -geenin aminoa koodit- z ero tavasta päästä, lac-promoteria, SD :aa, SD :ta, cro-ATG:tä ja cro/gD-2:ta.

Ilmentämisvektori pHK414 katkaistiin Pstlrllä ja BamHI:llä. Agaroosigeelielektroforeesilla eristettiin 5,54 kb:n BamHI/Pstl-pHK414-DNA-palanen, joka kooditti z-geeniä ja ampr-geenin karbok-sia koodittavaa päätä.

1,75 kb:n PstI/BamHI-pHV5-DNA-palanen ja 5,54 kb:n BamHI/Pstl-pHK414-DNA-palanen liitettiin yhteen moolisuhteessa 1:1 ja liitännäinen käytettiin E. coli NFl829:n transformointiin. Ampisil-liinin suhteen vastustuskykyiset pesäkkeet tutkittiin yhdysprote-iinin tuotannon suhteen mittaamalla 8-galaktosidaasiaktiivisuus indikaattoriagarlevyillä. Positiiviset pesäkkeet testattiin cro/gD-2/3-galaktosidaasiyhdysproteiinin läsnäolon suhteen suorittamalla SDS-PAGE-analyysi IPTGrllä indusoitujen transformant-tien kokonaislysaateille. Transformantti, joka tuotti suuren määrän 160 000 daltonin suuruista yhdysproteiinia, eristettiin ja tästä transformantista johdetulle plasmidille annettiin nimi pHV6.

68 83974 pHV6:lla transformoituneiden E.ooli-kloonien tuottaman yhdys-proteiinin havaittiin olevan indusoitavissa IPTGillä ja ristik-käin immunoreaktiivinen sekä HSV-l:n että HSV-2:n kanssa.

Tuotettu yhdysproteiini sisältää 265 gD-2-proteiinin aminohappotähdettä .

7.4.2. pHV6-yhdysproteiinia vastaan suunnattujen vastaseerumien immuunisaostus___ pHV6-yhdysproteiini puhdistettiin käyttämällä kohdassa 6.4.2. selostettua menetelmää ja sillä tuotettiin vastaseerumia kolmen kanin avulla (R159, R160, R161) seuraavalla tavalla: E. coli-klooneja, jotka olivat transformoituneet pHV6:lla, kasvatettiin keskilogaritmifaasiin ja indusoitiin IPTGillä. Neljän tunnin kuluttua indusoinnista bakteerit pelletoitiin sentrifugoimalla, lysoitiin SDS-PAGE-näytepuskurilla ja ladattiin preparatiivisiin SDS-polyakryyliamidigeeleihin. Elektroforeesin jälkeen proteiinit tehtiin näkyviksi värjäämällä ulkokaistat coomassiesini-värillä; sen jälkeen 160 000 daltonin yhdysproteiinikaista leikattiin irti geelistä. Geelipala upotettiin nestemäiseen typpeen, jauhettiin jauheeksi ja suspendoitiin sen jälkeen PBSiään. Sen jälkeen lisättiin yhtä suuri tilavuus Freund'in apuainetta.

Kun oli sekoitettu perusteellisesti, liuos injektoitiin subkutaa-nisti kolmeen New Zealand-kaniin (R159, R160 ja R161). Jokaiseen kaniin injektoitiin 100-200 ^ug proteiinia. 28 vuorokauden kuluttua kaneille annettiin tehosteena sama määrä yhdys-proteiinia, joka oli suspendoitu epätäydelliseen Freund'in apuaineeseen. Eläimille annettiin tehosteena viisi kertaa (kaikkiaan) 10 vuorokauden välein. Seerumi, joka otettiin 55 vuorokauden kuluttua alkuperäisestä injektiosta laskien (so. kahden tehostuksen jälkeen), käytettiin immunologisessa saos-tusanalyysissä. Immunologiset saostukset suoritettiin seuraavalla tavalla: yhtyvät (confluent) solut infektoitiin HSV:llä määränä 10 pfu/solu (Vero-solut infektoitiin HSV-l:llä ja HeLa- 35 solut infektoitiin HSV-2:lla). Solut merkittiin S-metionii- 35 nilla 16 tunnin kuluttua infektoinnista. S-metioniinilla merkittyjen, HSV-l:llä infektoitujen Vero-solujen tai vastaavasti merkittyjen HSV-2:lla infektoitujen HeLa-solujen lysaatteja

II

69 83974 inkuboitiin 10 ^ul:n kanssa esi-immuuneja kanin seerumeja tai pHV6-proteiinia vastaan suunnattuja kanin vastaseerumeja (so. R159, R160 tai R161). Immuunikompleksit kerättiin käyttämällä Pansorbiinia kuten kohdassa 6.3.3. on kuvattu ja saadut radio-aktiivisesti merkityt, immunologisesti saostuneet proteiinit erotettiin SDS-PAGE:llä ja fluorografoitiin. SDS-PAGE-tulokset osoittivat, että HSV-2:lla infektoitujen HeLa-solujen tuottama 50 000 daltonin gD-proteiini reagoi immunologisesti transformant-tien tuottamaa yhdysproteiinia vastaan suunnattujen vastaseeru-mien kanssa. R159- ja Rl61-vastaseerumit ovat spesifisiä gD-2:n suhteen, kun taas Rl60-vastaseerumi saostuu immunologisesti sekä gD-l:n (52 000 daltonin gD-proteiini, jota HSV-l:llä infektoidut Vero-solut tuottavat) ja gD-2:n kanssa; näin ollen R160 on "tyyppiyhteinen". Huomattakoon, että 018 (kohta 6.4.2.), joka kohdistuu pEH4-2:n tuottamaa gD-l-yhdysproteiinia vastaan, on myös tyyppiyhteinen.

7.4.3. Herpes simplex-viruksen neutralointi in vitro Edellä kuvatuista pHV6-yhdysproteiinia vastaan suunnatuista kanin vastaseerumeista tutkittiin myös niiden kyky neutraloida HSV-infektioita in vitro. Tätä tarkoitusta varten suoritettiin virusten neutralointikokeet täplämäärityksellä edellä kuvatulla tavalla. Jokainen malja (35 mm), joissa oli yhtyviä (confluent) soluja, infektoitiin 50 pfu:lla HSV:tä (Vero-solut infektoitiin HSV-l:llä, kun taas HeLa-solut infektoitiin HSV-2:lla), joita soluja oli esi-inkuboitu vertailuseerumilla (esi-immuuni seerumi) tai tutkittavien vastaseerumien laimennuksilla (seuraavat vasta-seerumit tutkittiin: 018, R159, R160 ja R161). 3 vuorokauden kuluttua solut fiksattiin ja värjättiin ja täplät laskettiin. Taulukossa 2 on esitetty kahden tällaisen kokeen tulokset. Neutraloituminen on ilmaistu sinä seerumilaimennuksena, joka vaadittiin, jotta täplämäärä väheni 50 %:lla. Taulukko 2 osoittaa selvästi, että pHV6-yhdysproteiinia vastaan suunnatut vasta-seerumit (R159, R160 ja R161) kykenevät neutraloimaan HSV-2-infektion in vitro, kun taas pEH4-2-yhdysproteiinia vastaan suunnattu vastaseerumi (018) kykenee neutraloimaan HSV-l-infek-tion in vitro.

7o 83974

Vaikka 018 ja R160 ovat tyyppiyhteisiä (perustuen kohdassa 7.4.2. saatuihin immunologisiin saostuksiin), on 018 (anti-gD-1-yhdysproteiini) tehokkaampi HSV-l:n neutraloija in vitro ja R160 (anti-gD-2-yhdysproteiini) on tehokkaampi HSV-2:n neutraloija in vitro.

Taulukko 2 pHV6-yhdysproteiinia vastaan suunnattujen vastaseerumien kyky neutraloida HSV-1 ja HSV-2_

Neutraloituminen'*'

Vastaseerumi HSV-1 HSV-2 018 128 8 R159 16 48 R160 24 64 R161 8 32 ^Numerot tarkoittavat vasta-ainetiitteriä sen seerumilaimennuksen käänteislukuna, joka vähensi täplien lukumäärää 50 %:lla. Määritykset suoritettiin seerumikomplementin läsnäollessa.

7.4.4. pHV6-yhdysproteiinia vastaan suunnattujen vastaseeru- mien immunofluoresenssianalyysi_

Immunofluoresenssimääritykset suoritettiin seuraavalla tavalla: yhtyviä (confluent) soluja infektoitiin herpesviruksella määränä 0,1 pfu/solu 20 tunnin ajan 37°C:ssa (Vero-solut infektoitiin HSV-1:llä, kun taas HeLa-solut infektoitiin HSV-2:11a). Solut pestiin PBS:llä ja sen jälkeen niitä fiksattiin 90 sekuntia huoneen lämpötilassa asetonimetanoliseoksella (1:1). Fiksa-tiivi poistettiin ja solut kuivattiin ilmassa. Sitten 20 ^ul:n erä kutakin PBS:ään suhteessa 1:20 laimennettua kanin vasta-seerumia (018^ R159, R160 ja R161) sijoitettiin levylle erillisinä tippoina merkittyihin kohtiin. Kun oli inkuboitu 30 minuuttia 37°C:ssa, solut huuhdeltiin PBS:llä ja kuivattiin ilmassa. Sitten merkittyihin kohtiin laitettiin 20 ^,ul fluoreseiiniin konjugoitua sian seerumia, joka oli suunnattu kania vastaan.

Kun oli inkuboitu 30 minuuttia 37°C:ssa; solut pestiin, kuivattiin ilmassa ja sijoitettiin glyseroliin ja katsottiin ultra-

II

7i 83974 violettivalolla käyttämällä uv-mikroskooppia. Fluoresenssin ilmeneminen merkitsee sitä, että kanin vastaseerumit saavat aikaan immuunireaktion HSVrllä infektoitujen solujen kanssa. Tulokset on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3

Yhdysproteiinivastaseerumien ristikkäinen immunologinen reaktii- visuus HSVzllä infektoitujen solujen kanssa_ HSV:llä infektoituneiden solujen immunofluoresenssi^_

Vasta seerumi^- HSV-1 HSV-2 018 +++ + R159 + + R160 + ++ R161 + ++ '''Vastaseerumit käytettiin 1:20 laimennettuina.

2 +++ tarkoittaa voimakkainta solujen värjäytymistä.

++ tarkoittaa keskimääräistä solujen värjäytymistä.

+ tarkoittaa positiivista, mutta vähemmän voimakasta värjäytymistä .

8. Esimerkki: Rokottaminen 8.1. Suojaaminen HSV-2-infektiota vastaan in vivo käyttämällä gD-l-yhdysproteiinia rokoteformulaatiossa__

Kolmelle ryhmälle, joissa kussakin oli 10 kpl Balb C-hiiriä, annettiin vatsaontelonsisäisesti (i.p.) seuraavia valmisteita: ryhmä 1 (rokottamaton vertailuryhmä) sai fysiologista suolaliuosta; ryhmä 2 sai 3 ^ug natiivia HSV-l-gD-proteiinia täydellisessä Freund'in apuaineessa; ja ryhmä 3 sai 30^.ug pEH4-2-yhdysproteiinia (eristetty denaturoivalla aggregaatin puhdistus-menetelmällä, jota on selostettu kohdassa 5.5.) fysiologisessa suolaliuoksessa. Kaikki ryhmät saivat neljä ruisketta i.p.; kukin ruiske annettiin 2 viikon välein ja tehosteet sisälsivät 1 yug:n gD:tä (ryhmä 2) tai 10 ^ug yhdysproteiinia.

Hiiriltä otettiin verta silmäkuopan takaa neljännen injektion jälkeen ja nämä seerumit testattiin herpesviruksen neutraloinnin suhteen in vitro (ilman komplementtia) käyttämällä edellä kohdissa 6.4.3. ja 7.4.2. kuvattuja täplämäärityksiä.

72 8 3 9 7 4

Viikon kuluttua neljännestä ruiskeesta lukien hiirille annettiin 10 LDj-Q-annosta HSV-2-kantaa 186. HSV-2 suspendoitiin 0,5 ml:aan ja injektoitiin vatsaontelonsisäisesti. Tartutettujen hiirten eloonjääminen merkitsee vastustuskyvyn olemassaoloa. Tulokset on esitetty taulukossa 4.

Taulukko 4

Hiirten rokottaminen ja aikaansaatu vastustuskyky, kun annettiin HSV-2-tartunta_____

Vastustuskyky HSV-2-tartuntaa _vastaan_

Rokote Eloonjääneet/ Eloonjäämis- kokonaismäärä _%_ 1 (vertailu) 1/11 9 2 (natiivi gD-1) 10/10 100 3 (pEH4-2-yhdysproteiini) 8/10 80 8.2. Suojaaminen HSV-2-infektiota vastaan in vivo käyttämällä gD-2-yhdysproteiinia rokotevalmisteessa_

Neljälle ryhmälle, joissa kussakin oli 10 hiirtä, annettiin rokotteina seuraavia valmisteita: ryhmä 1 (vertailuryhmä) sai pNB9-l naudan kasvuhormoni/B-galaktosidaasiyhdysproteiinia; ryhmä 2 tai pEH4-2 cro/gD-l/g-galaktosidaasiyhdysproteiinia (ks. kohta 6.4.); ryhmä 3 sai pEH82:n muokattua cro/gD-l/8-galaktosidaasi-yhdysproteiinia (ks. kohta 6.5.); ja ryhmä 4 sai pHV6 cro/gD-2/8-galaktosidaasiyhdysproteiinia (ks. kohta 7.4.).

Yhdysproteiinit eristettiin eri E. coli-transformanteista hajottamalla indusoidut transformantit lysotsyymillä ja pinta-aktiivisella aineella ja suorittamalla sen jälkeen aggregaattien pelletointi (denaturoimaton aggregaatinpuhdistusmenetelmä, jota on kuvattu kohdassa 5.5.).

Immunisointitapahtuma oli seuraava: Balb C-hiirille (6-7 viikon ikäisiä) annettiin kullekin vatsaontelonsisäisesti 150-200 ^ug

II

73 83974 denaturoimatonta yhdysproteiinia 0,2 ml:ssa fysiologista suolaliuosta. Sitten hiirille annettiin vatsaontelonsisäisesti tehosteena 75-100 ^ug yhdysproteiinia vielä kolme kertaa kahden viikon välein (kaikkiaan 4 rokotusta). Neljännen rokotuksen jälkeen hiiriltä otettiin verta silmäkuopan takaa ja saatu seerumi testattiin herpesviruksen neutraloinnin suhteen in vitro (ilman komplementtia) käyttäen edellä kuvattua täplämittausta, kohdat 6.4.3. ja 7.4.2.

Viikon kuluttua neljännestä rokotuskerrasta hiiriin tartutettiin 17 LD,-Q-annosta HSV-2-kantaa 186. HSV-2-suspendoitiin 0,5 ml:aan ja injektoitiin vatsaontelonsisäisesti. Tartutettujen hiirten eloonjääminen merkitsee vastustuskyvyn olemassaoloa. Tulokset on esitetty taulukossa 5.

Taulukko 5

Hiirten rokottaminen ja aikaansaatu vastustuskyky, kun annet- tiin HSV-2-tartunta_

Vastustuskyky HSV-2- HSV:n neutralointi tartuntaa vastaan_ seerumilla^_

Rokote^" Eloonjääneet/ Eloonjää- HSV-1 HSV-2 _ kokonaismäärä mis-%_ _ _ pNB9-l (vertailu) 0/10 0 <4 <4 pEH4-2 6/9 67 16 4 pEH82 3/9 33 16 <4 pHV6 8/10 80 <4 8 ^Fysiologiseen suolaliuokseen suspendoidut yhdysproteiinit annettiin i.p.

2

Seerumi tutkittiin HSV-1:n ja HSV-2:n neutraloinnin suhteen ilman komplementtia. Numerot tarkoittavat vasta-ainetiittereitä ilmaistuina sen seerumilaimennuksen käänteislukuina, jotka vähensivät täplien määrää 50 %:lla.

8.3. Rokoteformulaatioiden vertailu

Hiiret immunisoitiin pEH4-2- ja pEH90-10am LE392-transformanteis-ta saaduilla yhdysproteiinivalmisteilla, joihin sekoitettiin 74 83974 seuraavassa kuvattuja erilaisia apuaineita. Saadut vasta-seerumit arvioitiin mittaamalla niiden kyky immunisaostaa proteiineja, jotka oli saatu HSV-l:llä infektoiduista soluviljelmistä .

Yhdysproteiinit eristettiin pEH4-2- ja pEH90-l0am LE392-trans-formanteista kohdassa 8.2. kuvatulla denaturoimattomalla tekniikalla. Aggregaatit suspendoitiin uudestaan sonikaatiolla (muodostui liete) ja tehtiin liukeneviksi käsittelemällä kuumassa alkalissa seuraavalla tavalla: aggregaattipellettiin lisättiin 0,5 M NaOH niin, että lopulliseksi väkevyydeksi tuli 50 mM. Aggregaatit liuotettiin kuumentamalla 15 minuuttia 65°C:ssa ja sen jälkeen liuos jäähdytettiin ja lisättiin Tris-HCl pH 7,5 (lopullinen väkevyys 100 mM Tris-HCl).

Yhdysproteiinivalmisteisiin (liete tai kuuma alkalivalmiste) sekoitettiin seuraavia apuaineita ennen rokottamista: (1) L121 (Hunter et ai., 1981, J. of Immunol. 127 (3): 1244-1250; BASF Wyandotte Corporation, Wyandotte, Mich.), pluroninen polyoli (2,5 mg annettiin eläintä kohti); tai (2) alumiinihydroksidigeeli (Reheis Chemical Company, Berkeley Heigths, N.J.) lopulliseen väkevyyteen 0,2 %.

Näillä valmisteilla immunisoitiin hiiret (CD-l-kanta) seuraavalla tavalla: Jokaiselle hiirelle annettiin esiruiskeena 100 ^ug yhdysproteiinivalmistetta ja sen jälkeen 22 vuorokauden kuluttua lisäruiskeena 50 ^ug yhdysproteiinia. Yhdysproteiini suspendoitiin 0,2 ml:n kokonaistilavuuteen, joka injektoitiin kumpaankin reiteen. Hiiriltä otettiin verta silmäkuopan takaa 7 vuorokauden kuluttua viimeisestä ruiskeesta lukien.

Saadut seerumit analysoitiin immunologisella saostuksella 35 seuraavalla tavalla: S-metioniinilla merkittyjen, HSV-l:llä infektoitujen Vero-solujen lysaatteja inkuboitiin 5 ^ul:n kanssa hiiren seerumia (anti-pEH4-2 tai anti-pEH90-l0am LE392), esi-immuunia seerumia (negatiivinen vertailukoe) tai monoklonaa-lista 4S:ää (positiivinen vertailukoe) 2 tuntia 4°C:ssa ja l< 75 83974 5 yul:n kanssa kanin antihiiriseerumia (Dako, 30 minuuttia 4°C:ssa). Immuunikompleksit kerättiin talteen käyttämällä Pansorbiinia kohdassa 6.3.3. kuvatulla tavalla ja radioaktii-visesti merkityt, immunosaostuneet proteiinit erotettiin SDS-PAGE:llä ja fluorografoitiin. Fluorografiatulokset osoittivat, että kaikilla hiirillä, jotka oli tehty immuuneiksi alkaliin liuotetulla yhdysproteiinilla (sekä pEH4-2 että pEH90-l0am LE392) käyttämällä Ll21-apuainetta oli voimakas immuunireaktio. Kun alkalin avulla liuotettu pEH4-2-yhdysproteiini annettiin alumiinihydroksidin kanssa, havaittiin heikompi reaktio. Muut hiiret eivät tämän kokeen mukaan näyttäneet reagoivan.

9. Mikro-organismien taltiointi

Huomattakoon, että kaikki parikkiemäskoot, jotka on annettu nukleotideille, ovat likiarvoja ja annettu vain selventävässä tarkoituksessa. Lisäksi on selvää, että tähän keksintöön voidaan edellä selostetun pohjalla tehdä monia muunnoksia ja sovellutuksia, silti poikeamatta keksinnön hengestä ja sen kattamasta alasta. Yksityiskohtaiset toteutustapaesimerkit on annettu vain selventävässä tarkoituksessa, sillä keksintö rajoitetaan ainoastaan liitteenä olevissa vaatimuksissa.

Seuraavat E. coli-kannat, joissa on luetellut plasmidit, on taltioitu kokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Md., ja niille on annettu luetellut kokoelmanumerot: E. coli-kanta Plasmidi Kokoelmanumero K-12, MC1000, NF1829 (WW51) pEH51 ATCC 39 159 K-12, MC1000, NF1829 (WW82) pEH82 ATCC 39 160

Seuraavat E. coli-kannat, joissa on luetellut plasmidit, on taltioitu kokoelmaan Agricultural Research Collection (NRRL); Peoria, 111., ja niille on annettu luetellut kokoelmanumerot: 76 83974 E.coli-kanta Plasmidi Kokoelmanumero K-12, MC1000, NF1829 pEH4-2 NRRL B-15471 K-12, MC1000, NF1829 pHV5 NRRL B-15449 K-12, MC1000, NF1829 pHV6 NRRL B-15450 K-12, LE392 pEH90-10am NRRL B-15451

Keksintöä ei rajoiteta taltioituihin mikro-organismeihin, koska ne on vain tarkoitettu selventämään tämän keksinnön eri puolia. Edellä olevan selostuksen ja liitteenä olevien kuvien perusteella voivat alaan perehtyneet helposti kehittää erilaisia muunnelmia. Tällaisten muunnelmien on tarkoitus kuulua liitteenä olevien patenttivaatimusten kattamaan alaan.

Claims (7)

1. 77 83974