PL150654B1

PL150654B1 - Production of herpes simplex viral proteins

Info

Publication number: PL150654B1
Application number: PL1983243134A
Authority: PL
Inventors: Roger J Watson; Lynn W Enquist; John H Weis
Original assignee: Molecular Genetics Inc
Priority date: 1982-07-20
Filing date: 1983-07-20
Publication date: 1990-06-30
Also published as: PT77014A; IL69269A; FI832632A; ES8505253A1; NZ204948A; NO172855B; DE3382072D1; IE831690L; NO172855C; CA1295561C; FI83974C; ES529225A0; DK333183A; FI832632A0; EP0101655A3; PT77014B; GR78647B; ES8504254A1; EP0101655B1; DK333183D0

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 150 654 POLSKA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 83 07 20 (P. 243134)

Int. Cl.⁵ C12N 15/38

Pierwszeństwo: 82 07 20 dla zastrz. 1, 2, 4, 6, 7

07 06 dla zastrz. 3, 5, 8, 9, 10, 11,

12, 13, 14

Stany Zjednoczone

Ameryki

Zgłoszenie ogłoszono: 84 08 13

Opis patentowy opublikowano: 1990 10 31

Twórcy wynalazku: Roger John Watson, Lynn William Enąuist, John Haynes Weis

Uprawniony z patentu: Molecular Genetics, Inc.,

Minnetonka (Stany Zjednoczone Ameryki)

Sposób wytwarzania immunogennego polipeptydu

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania immunogennego polipeptydu zawierającego immunoreaktywną i antygenową determinantę glikoproteiny gD-1 i gD-2 wirusa Herpes simplex typu 1 (HSV-1) i typu 2 (HSV-2) czyli wirusa opryszczki.

Znane jest wytwarzanie polipeptydów techniką rekombinacji DNA. Technika rekombinacji DNA obejmuje insercję specyficznych sekwencji DNA do nośnika (wektora) DNA dla wytworzenia zrekombinowanej cząsteczki DNA zdolnej do replikacji w komórce-gospodarzu. Ogólnie, wprowadzona sekwencja DNA jest obca dla nośnika DNA, to znaczy wprowadzana sekwencja DNA i wektor DNA pochodzą z organizmów, które nie wymieniają informacji genetycznych w naturze, względnie wprowadzana sekwencja DNA może być wytworzona częściowo lub całkowicie na drodze syntezy. W ostatnich latach opracowano ogólne metody umożliwiające konstruowanie zrekombinowanych cząsteczek DNA.

W opisie patentowym St. Zj. Ameryki nr 4237 224 ujawniono wytwarzanie zrekombinowanych plazmidów z użyciem enzymów restrykcyjnych i metod znanych jako łączenie (ligacja). Zrekomninowane plazmidy wprowadza się następnie do organizmów jednokomórkowych i replikuje poprzez transformację.

W opisie patentowym St. Zj. Ameryki nr 4304863 opisano inną metodę wprowadzania zrekombinowanych cząsteczek DNA do organizmów jednokomórkowych. W metodzie tej stosuje się układ upakowania/transdukcji z wektorami bateriofagowymi.

Bez względu na metodę konstrukcji, zrekombinowana cząsteczka DNA musi być zgodna z komórką-gospodarzem, to znaczy musi wykazywać zdolność do autonomicznej replikacji w komórce-gospodarzu. Zrekombinowana cząsteczka DNA musi także mieć marker genetyczny, co pozwala dokonać selekcji komórek-gospodarzy, które uległy transformacji pod jej wpływem. Ponadto, jeśli wszystkie sygnały właściwej replikacji, transkrypcji i translacji są prawidłowo umiejscowione w plazmidzie, to wówczas obcy gen będzie mieć prawidłową ekspresję w transformowanych komórkach i ich potomstwie.

150 654

Podobnie jak w przypadku wszystkich wirusów, które zakażają komórki eukariotyczne, dla HSV konieczny jest układ eukariotycznych komórek-gospodarzy, w którym będzie on replikował swój genom, wykazywał ekspresję swoich genów wirusowych i generował potomstwo. Sygnały i elemety kontrolujące replikację DNA, ekspresję genów i nagromadzenie wirusów są różne w eukariontach i prokariontach. Ma to decydujące znaczenie gdy próbuje się spowodować w prokariotycznych komórkach-gospodarzach ekspresję genu, który normalnie jest ekspresjonowany wyłącznie w komórkach eukariotycznych. Te różne sygnały genetyczne i etapy procesu kontrolują wiele poziomów ekspresji genów, np. transkrypcję DNA i translację informacyjnego RNA. Transkrypcja DNA jest zależna od obecności promotora, to jest sekwencji DNA, która kieruje wiązaniem polimerazy RNA, a zatem umożliwia transkrypcję. Sekwencje DNA promotorów eukariotycznych różnią się od sekwencji DNA promotorów prokariotycznych. Co więcej, promotory eukariotyczne i towarzyszące sygnały genetyczne mogą pozostać nierozpoznane w układzie prokariotycznym lub mogą w nim nie działać.

Podobnie, translacja informacyjnego RNA (mRNA) w prokariantach zależy od obecności odpowiednich sygnałów prokariotycznych, które różnią się od sygnałów w eukariontach. Skuteczna transmisja mRNA w prokariontach wymaga miejsca przyłączenia rybosomu, zwanego sekwencją Shine Delgamo (SD) na mRNA. Sekwencja ta jest krótką sekwencją nukleotydową mRNA, umiejscowioną przed kodonem inicjacyjnym (AUG), który koduje aminokońcową grupę metioniny. Sekwencje SD są kompementame względem końca 3Ί6 S rRNA (rybosomowy RNA) i prawdopodobnie stanowią promotory wiązania mRNA do rybosomów poprzez duplikację z rRNA dla umożliwienia prawidłowego umiejscowienia rybosomu. Omówienie sposobów maksymalizacji ekspresji genów omówili Roberts i Laner (Methods in Enzymology, 68:473/1979/).

Wiele czynników komplikuje ekspresję genów eukariotycznych w prokariontach nawet po insercji prawidłowych sygnałów we właściwe pozycje. Brak jest jeszcze pełnego zrozumienia charakteru tych czynników i mechanizmów ich działania. Jednym z tych czynników jest obecność układu proteolitycznego w E. coli i innych bakteriach. Ten rozkładający proteiny układ wydaje się selektywnie niszczyć „nienormalne lub obce proteiny, takie jak proteiny eukariotyczne. Niezwykłą użyteczność uzyskałoby się zatem opracowując środki chroniące eukariotyczne proteiny powstałe w wyniku ekspresji w bakteriach przed degradacją proteolityczną. Jedną z metod jest konstruowanie genów hybrydowych, w których sekwencja eukariotyczna jest połączona w fazie (to jest w prawidłowej fazie odczytu) z genem prokariotycznym, czego rezultatem jest sprzężony produkt proteinowy (proteina będąca hybrydą prokariotycznych i obcych czyli eukariotycznych sekwencji aminokwasów).

Konstrukcja genów hybrydowych to sposób stosowany w klonowaniu genów kodujących pewną liczbę protein eukariotycznych, takich jak somatostatyna, proinsulina szczurza, hormon wzrostu i proteiny podobne do owoalbuminy. Ponadto, promotory prokariotyczne przyłączano do takich sekwencji genów sprzężonych w przypadku owoalbuminy i β -globiny (Guarente i inni, 1980, Celi 20, 543). System Guarente'a i innych obejmował insercję promotora lac, włącznie z sekwencją SD w różnych odległościach przed ATG genu sprzężonego. Jakkolwiek klonowanie cząsteczkowe i ekspresja kilku genów eukariotycznych powiodły się, nie udało się dotąd przeprowadzić tego w przypadku genu gD. Nie jest także znane rutynowe ekspresjonowanie genów obcych czyli eukariotycznych w prokariotycznych komórkach-gospodarzach.

Wirusy opryszczki są wirusami eukariotycznymi i zawierają liniowy genom DNA o podwójnej nici i rozmiarach 80 X106-150 X10® daltonów. Każdy wirion zawiera dwudziestościenny nukleokapsyd i osłonkę błoniastą, która tworzy się z dwuwarstwowej lipidowej błony komórkowej gospodarza w trakcie procesu dojrzewania i pączkowania. Osłonę wirusa stanowi dwuwarstwowa błona lipidowa zawierająca szereg protein specyficznych dla wirusa, które chociaż są częściowo zanurzone w Wonie, wystają na zewnątrz osłony Woniastej. Przy zakażeniu pierwotnym osłonka Wonista jest konieczna dla zapewnienia skutecznej penetracji cząstki wirusa do komórki. Przeciwciała, które wiążą się swoiście z proteinami wirusa na zewnątrz osłonki Woniastej posiadają zdolność do zneutralizowania zakaźności wirusa. Proteiny wirusa, których obecność jest najbardziej istotna przy wnikaniu wirusa do komórki to glikoproteiny (cząsteczki protein z przyłączonymi do nich cząsteczkami cukrów). Wirus Herpex simplex typu 1(HSV-1) i typu 2(HSV-2)

150 654 wytwarzają niezależnie od siebie przynajmniej po cztery różne glikoproteiny, które różnią się zdolnością wytwarzania przeciwciał. Niektóre z protein pochodzących od HSV-1 i HSV-2 mają te same epitopy (tzn. miejsca antygenowe lub miejsca przyłączenia przeciwciał). Przykładem takiej proteny jest glikoproteina oznaczona symbolem gD o rozmiarach 49000-58000 daltonów. Wieloważna surowica odpornościowa przeciwko gD HSV-1 wykazuje zdolność do neutralizacji zakażenia wywołanego zarówno przez HSV-1, jak i przez HSV-2 (Norrild, 1979, Current Topics in Microbiol. and Immuno. 19, 67).

Obecnie w społeczeństwie zakażenia opryszczką przybrały rozmiar epidemii. Jak dotąd nie ma lekarstwa na zakażenie opryszczką i aktualnie stosowane metody leczenia oparte są na stosowaniu związków inhibitujących syntezę DNA. Związki te są oczywiście nieselektywne, ponieważ hamują one syntezę DNA zarówno w dzielących się komórkach, jak i w wirusie. Ponadto związki te są użyteczne jedynie podczas aktywnej fazy zakażenia i jak dotąd nie wykazują widocznych skutków podczas fazy utajonej. Istnieje zatem potrzeba wyprodukowania szczepionki, która wywołuje czynną reakcję systemu immunologicznego i chroni przed zakażeniem wirusem Herpes simplex. Obecnie nieoczekiwanie okazało się, że te pożądane cechy wykazuje immunogenny polipeptyd wirusa Herpes simplex wytwarzany sposobem według wynalazku. Sposób ten pozwala na otrzymanie potrzebnego materiału immunogennego z wydajnością wystarczającą i po kosztach dostatecznie niskich na to, aby można było go stosować w praktyce w szczepionkach podjednostkowych.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 3 lub fig. 12 rysunku lub części tego polipeptydu, zawierających immunoreaktywną i antygenową determinantę glikoproteiny odpowiednio gD-Ι i gD-2 wirusa Herpes simplex odpowiednio typu 1 i typu 2. Cechą tego sposobu jest to, że hoduje się Escherichia coli zawierającą nadający się do replikacji, transkrypcji i translacji zrekombinowany wektor zawierający sekwencję DNA genu gD-Ι lub gD-2 przedstawioną odpowiednio na fig. 3 i fig. 12 rysunku, lub jej część, kodującą immunogenny polipeptyd lub jego część, które zawierają immunoreaktywną i antygenową determinantę glikoproteiny odpowiednio gD-Ι lub gD-2 wirusa Herpes simplex, po czym wyodrębnia się ten immunogenny polipeptyd z hodowli.

Zrekombinowane plazmidy konstruowane zgodnie z wynalazkiem zapewniają wytwarzanie w komórkach-gospodarzach proteiny będącej polipeptydem pokrewnym gD, trwałej i odpornej na degradację w komórce-gospodarzu, takie plazmidy umożliwiają wytwarzanie olbrzymich ilości proteiny pokrewnej gD lub proteiny sprzężonej zawierającej immunogenne i antygenowe determinanty gD. Tak wytworzona proteina lub jej antygenowa znacząca część może być stosowana w szczepionce podjednostkowęj, która skutecznie chroni, przyjmującego szczepionkę przed pierwotnymi zakażeniami HSV-1 i HSV-2.

Gen gD HSV-1 (wyizolowany ze szczepu HSV-1 Patton) zidentyfikowano pod względem genomu wirusowego drogą intertypowej analizy rekombinacyjnej i poprzez mapowanie mRNA. Po zlokalizowaniu specyficznego fragmentu DNA określono nukleotydową sekwencję genu i przewidziano sekwencję aminokwasów proteiny gD.

Genom wirusowy genu gD HSV-2 (szczep G HSV-2) zidentyfikowano przez analogię do położenia gD w genomie HSV-1 i drogą analizy hybrydyzacyjnej.

Wyizolowane geny lub fragmenty genów (typ 1 lub typ 2) poddano następnie insercji do wektorów plazmidowych dla utworzenia plazmidów zrekombinowanych służących jako biologicznie funkcjonalne jednostki replikacyjne. Te zrekombinowane plazmidy skonstruowano tak, aby ułatwić zarówno replikację, jak i ekspresję genów gD po transformacji komórek-gospodarzy. Ponadto, plazmidy umożliwiają jednoetapową identyfikację transformowanych komórek, które aktywnie wykazują ekspresję genu gD. Opisano wreszcie sposoby izolowania wytworzonych produktów genowych i ich zastosowanie w wytwarzaniu szczepionki.

Wynalazek staje się bardziej zrozumiały po zapoznaniu się z następującym szczegółowym opisem, przykładami wariantów wykonania i rysunkiem, na którym: fig. la przedstawia genom HSV-1 i wskazuje lokalizację krótkiego unikalnego regionu (Us), w którym znajduje się gen gD HSV-1 zwany dalej genem gD-Ι; fig. lb - mapę restrykcyjną fragmentu EcoRI-H HSV-1 insertu lambda gtWES:EcoRI-H. Przedstawiono jedynie miejsca restrykcyjne właściwe dla opisywanych genów. Sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne oznaczono następującymi skrótami: BamHI (Ba4 do Ba8), BgUI (Bg2), BstEII (Bs), EcoRI (RI), Hindlll (H3), KpnI (Kp), PvuII (Pv),

150 654

SacI (Sc), Sali (Sa) i Xhol (Xh); fig. lc - konstrukcję pRWF6 zawierają insercję fragmentu BamHI-8 - BamHI-7 lambda gtWES:EcoRI-H wprowadzonego do pBR322; fig. ld - mapę restrykcyjną fragmentu SacI DNA HSV-1 insertu pSC30-4. Obszar poszerzony odpowiada lokalizacji i pozycji sekwencji mRNA kodującej gD-1; fig. 2 - strategię sekwencyjną i mapę restrykcyjną sekwencji genu gD-1. Region kodowania zobrazowano jako obszar poszerzony, a obszar dekodujący przedstawiono linią pojedynczą. Wskazano miejsca rozszczepienia przez endonukleazę restrykcyjną używane do wyodrębnienia fragmentów, oznaczenia i wtórnego trawienia. Poziome strzałki odpowiadają sekwencjonowanym regionom DNA, strzałki nad mapą restrykcyjną oznaczają, że określono sekwencję nici dekodującej, a pod mapą, że wysekwencjonowano nić matrycową; fig. 3 - sekwencję nukleotydową genu gD-1 i przewidywaną sekwencję aminokwasów proteiny gD-1. Wskazano właściwe miejsca restrykcyjne, a ponumerowane pionowe strzałki na końcu amino-kodującym końca gD-1 wskazują miejsca przyłączenia amino-kodującego końca gD-1 do pJS413 w zrekombinowanych plazmidach: pEH51, pEH60, pĘH62, pEH66, pEH71, pEH73, pEH74, które zawierają resztę sekwencji gD-1 do jej naturalnego TAG, a także pEH4-2, pEH82, pEH3-25 i pEH90-N, które kodują proteiny sprzężone Cro(gD-l) β -galaktozydazy. Ponumerowane strzałki pionowe przy karboksy-kodującym końcu gD-1 wskazują miejsca przyłączania karboksy-kodującego końca gD-1 do (1) genu β -galaktozydazy (z-genu) pJS413 w plazmidach zrekombinowanych pEH4-2, pEH82 lub pEH3-25 albo (2) z-genu pHK414 w seriach plazmidów pEH90-N; fig. 4 (nie narysowana w skali) -konstrukcję pEH25, zrekombinowanego plazmidu pochodzącego z części genu gD-1 i pJS413, wektora ekspresyjnego dla E. coli. Zrekombinowany plazmid pEH25 kieruje wytwarzaniem proteiny pokrewnej gD HSV-1, enkodowanej przez około 87% sekwencji kodującej gD-1, przyłączonej do sekwencji „lidera (ero) pochodzącej z wektora ekspresyjnego; fig. 5 - sekwencję DNA i przewidywaną sekwencję aminokwasów połączenia Cro/gD-1 w pEH25; fig. 6 - zahamowanie immunoprecypitacji produktu pEH25 gD przez dodanie konkurencyjnych antygenów obecnych w lizatach komórek HeLa zakażonych HSV. Otwarte koła oznaczają lizaty nie zakażonych komórek HeLa (kontrola); otwarte kwadraty oznaczają lizaty komórek HeLa zakażonych HSV-1; fig. 7 (nie narysowana w skali) przedstawia konstrukcję pEH4-2, ekspresyjnego plazmidu zawierającego gD-Ι pochodzący od pEH25, w którym 205 nukleotydów (69 aminokwasów) końca 3' sekwencji kodującej gD-Ι uległo degradacji i zostało zastąpione przez około 3000 dodatkowych nukleotydów kodujących proteiną β galaktozydazy E. coli. Ten zrekombinowany plazmid umożliwia produkcję protein „sandwich (czyli protein sprzężonych) z polipeptydami pokrewnymi E. coli (to jest Cro i β -galaktozydazą) przyłączonymi do każdego z końców specyficznej proteiny gD-1; fig. 8 (nie narysowana w skali) — sposób wytwarzania pewnej liczby plazmidów z ekspresją gD-Ι, pEH50 + x, z których każdy zawiera zmienną część amino-kodującego końca genu gD; fig. 9 (nie narysowana w skali) - sposób rekonstruowania amino-kodującego końca genu gD w pEH4-2, zgodnie z którym proteina gD-1 sprzężona z β -galaktozydazą jest ekspresjonowana przez komórki-gospodarzy transformowane przez pEH82; fig. 10 (nie narysowana w skali) - konstrukcję pEH90-10am, plazmidu z ekspresją gD-Ι pochodzącego od pEH3-25 i pHK414. Zrekombinowany plazmid, pEH90-10am, umożliwia wytwarzanie gD-Ι zarówno sprzężonej jak i nie sprzężonej z β -galaktozydazą w transformantach E. coli zawierających supersorowe tRNA typu amber; fig. 1 la -genom HSV-2 i wskazuje lokalizację fragmentu BgUI w krótkim unikalnym regionie (Us), w którym leży gen gD HSV-2 (zwany dalej genem gD-2). Miejsca restrykcyjne BgUI określające fragment L oznaczono jako Bg; fig. Ilb -restrykcyjną mapę fragmentu BgUI L insertu pHVl. Zaznaczono tylko właściwe dla istoty omawianych problemów miejsca restrykcyjne rozpoznawalne przez endonukleazę. Sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne oznaczono następującymi skrótami: BamHI (Ba), BgUI (Bg), Ciał (C), HindlH (H3), PvuII (Pv), Sali (Sa), SacI (Sc), Sphł (Sp) i Xhoł (Xh). Poszerzony obszar oznacza lokalizację i pozycję sekwencji mRNA kodującej gD-2; fig. lic - mapę restrykcyjną fragmentu Xhoł DNA HSV-2 insertu pHV2; fig. 12 -sekwencję nukleotydową genu gD-2 i przewidywaną sekwencję aminokwasów proteiny gD-2. Wskazano odpowiednie miejsca restrykcyjne, a ponumerowane strzałki pionowe na końcu amino-kodującym genu gD-2 oznaczają miejsca przyłączenia amino-kodującego genu gD-2 do pJS413 w zrekombinowanych plazmidach pHV5 (które zawierają cały karboksy-kodujący koniec gD-2) i pHV6. Miejsca BamHI jest miejscem przyłączenia karboksy-kodującego końca gD-2 do z-genu pHK414 w pHV6; fig. 13 - porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasów w gD-Ι i gD-2.

150 654

Reszty aminokwasowe oznaczone są kodem jednoliterowym. Reszty aminokwasowe, które są homologiczne w gD-Ι i gD-2 oznaczono kreskami w sekwencji gD-2. Sekwencja gD-2 jest o jedną resztę aminokwasową krótsza od sekwencji gD-1. „Brakujący** aminokwas oznaczono w sekwencji gD-2 gwiazdką; fig. 14 (nie narysowana w skali) - konstrukcję pHV5, zrekombinowanego plazmidu pochodzącego z części genu gD-2 i pJS413. Zrekombinowany plazmid pHV5 kieruje wytwarzaniem proteiny pokrewnej gD HSV-2 kodowanej przez około 90% sekwencji kodującej gD-2 przyłączonej dó sekwencji „lidera** (Cro) pochodzącej z wektora ekspresyjnego; fig. 15-konstrukcję pHV6, plazmidu ekspresyjnego gD-2 pochodzącego z pHV5, w którym 259 nukleotydów (86 aminokwasów) końca 3' sekwencji kodującej gD-2 uległo delecji i zastąpionych zostało około 3000 dodatkowych nukleotydów pochodzących z plazmidu ekspresyjnego pKH414 kodującego proteinę β -galaktozydową E. coli. Zrekombinowany plazmid pHV6 umożliwia wytwarzanie proteiny „sandwich** (proteiny sprzężonej) z polipeptydami pokrewnymi E. coli (to jest Cro i β - galaktozydazą) przyłączonymi do każdego z końców specyficznej proteiny gD-2).

Sposób według wynalazku można podzielić na następujące etapy: (1) identyfikacja i wyodrębnienie genu lub fragmentu genu glikoproteiny HSV, (2) insercja genu lub fragmentu genu do wektora ekspresyjnego klonującego dla wytworzenia zrekombinowanej cząsteczki DNA stosowanej do transformacji jednokomórkowych organizmów, (3) identyfikacja i wzrost transformowanych jednokomórkowych organizmów zdolnych do replikacji i ekspresji genu, (4) identyfikacja i oczyszczanie produktu genowego i (5) określenie immunogenności produktu genowego poprzez zbadanie jego zdolności do wywoływania powstawania neutralizujących przeciwciał.

W dalszej części opisu omówiono dokładniej poszczególne etapy sposobu według wynalazku.

Gen glikoproteiny HSV (gD) można otrzymać z jakiegokolwiek szczepu HSV typu 1 lub 2. Wyodrębnienie genu gD (lub jego części), obejmuje najpierw wyodrębnienie DNA HSV, wytwarzanie fragmentów DNA HSV, oraz identyfikację fragmentów, które zawierają sekwencje genu glikoproteiny. Przed identyfikacją fragmenty DNA HSV włącza się zazwyczaj do wektorów klonujących, których używa się do transformowania komórek-gospodarza, co ułatwia tworzenie licznych kopii tych fragmentów DNA HS V tak, że otrzymuje się materiał wystarczający do analizy i identyfikacji.

DNA HSV można otrzymać albo (1) przez wyodrębnienie DNA bezpośrednio z wirusa oczyszczonego z komórek eukariotycznych zakażonych tym wirusem, albo (2) z bakteriofaga lub plazmidów, zawierających część genomu wirusowego zawierającego gen gD.

W celu wytwarzania fragmentów DNA HSV, DNA można rozszczepić w specyficznych miejscach używając enzymów restrykcyjnych, można użyć DN-azy w obecności manganu lub też można pociąć DNA działaniem fizycznym, jak np. nadźwiękawianie. Liniowe fragmenty DNA można rozdzielić pod względem wielkości zwykłymi metodami, włącznie, ale bez ograniczenia do nich, z elektroforezą w żelu agarozowym lub poliakryloamidowym i chromatografią kolumnową.

Do wytwarzania fragmentów DNA HSV zawierających sekwencję gD można użyć jakiegokolwiek enzymu restrykcyjnego lub kombinacji enzymów restrykcyjnych pod warunkiem, że enzym nie uszkodzi immunogenności produktu genu gD. Na przykład miejsce antygenowe proteiny może się składać z około 7 do około 14 aminokwasów. Tak więc, proteina o wielkości gD może mieć wiele oddzielnych miejsc antygenowych, być może tysiące,biorąc pod uwagę nakładające się sekwencje, zależność od struktury drugorzędowej i możliwości przetworzenia, takie jak acetylacja, glikozylacja i fosforylacja. Tak więc, wiele częściowych sekwencji genu gD może kodować miejsce antygenowe. A zatem można użyć wielu kombinacji enzymów restrykcyjnych do wytwarzania fragmentów DNA, które po insercji do odpowiedniego wektora są zdolne do takiego ukierunkowania organizmu jednokomórkowego, aby wytwarzał specyficzne sekwencje aminokwasów gD zawierające różne determinanty antygenowe. Transformacja komórek gospodarza tych zrekombinowanymi cząsteczkami DNA z włączonymi fragmentami DNA HSV umożliwia tworzenie licznych kopii wirusowego DNA, które następnie można analizować w celu zidentyfikowania fragmentu, który zawiera sekwencję genu gD. Insercji fragmentów restrykcyjnych DNA HSV do wektora klonującego dokonuje się łatwo, gdy ma on komplementarne lepkie końce. Tym niemniej, jeśli nie ma w wektorze klonującym komplementarnych miejsc restrykcyjnych użytych do przeprowadzania DNA HSV we fragmenty, to można zmodyfikować końce DNA HSV lub też wektora klonującego. Taką modyfikacją jest wytwarzanie tępych końców przez strawienie jednoniciowych

150 654 końców DNA, lub uzupełnienie tępych końców tak, aby końce te mogły być połączone jako tępe. Alternatywnie, można wytwarzać każde pożądane miejsce przez przyłączenie sekwencji nukleotydów (łączników) do końców DNA. Te przyłączone łączniki mogą zawierać specyficzne chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy kodujące sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne. Zgodnie z innymi metodami, rozszczepiony wektor i fragment DNA HSV można zmodyfikować przez dosyntetyzowanie jednoniciowych zakończeń („homopolymer tailing“) (przegląd literatury patrz: Morrow, Methods in Enzymology, 68, 3, 1979).

Identyfikacji specyficznego fragmentu DNA zawierającego gen gD dokonuje się różnymi sposobami. Po pierwsze, można wykonać analizę sekwencji fragmentów wirusowego DNA (Maxam i Gilber, Methods in Enzymology, 65, 499 /1980/) i następnie zidentyfikować fragment zawierający sekwencję genu gD na podstawie porównania przewidywanej sekwencji aminokwasów z sekwencją aminokwasów proteiny gD. Po drugie, fragment zawierający gen gD można zidentyfikować za pomocą selekcji mRNA. Fragment DNA HSV używa się do wyodrębniania komplementarnych mRNA za pomocą hybrydyzacji. Immunoprecypitacyjna analiza produktów translacji mRNA in vitro identyfikuje mRNA, a przez to komplementarne fragmenty DNA HSV, które zawierają sekwencje genu gD. Podsumowując, mRNA specyficzne wobec gD można wyselekcjonować za pomocą adsorpcji polisomów wyodrębnionych z komórek zakażonych HSV na unieruchomionych monoklonalnych przeciwciałach skierowanych przeciw gD. Promieniotwórczy mRNA lub cDNA gD można syntetyzować używając jako matrycy wyselekcjonowanego mRNA z zaadsorbowanych polisomów. Promieniotwórczo znakowanego mRNA lub cDNA można następnie użyć jako sondy do zidentyfikowania fragmentów DNA HSV zawierających sekwencje gD (Southern, J. Mol. Biol., 98, 503/1975), Alvine i wsp. Methods in Enzymology, 69, 220/1979).

Inną możliwością, aczkolwiek nie jedyną, wyodrębniania genu jest chemiczna synteza samej sekwencji genu (gdy sekwencja jest znana) lub wytworzenie cDNA (komplementarny DNA) do mRNA, który jest kodowany przez gen gD. Dla osiągnięcia tego celu wyodrębnia się z komórek zakażonych wirusem, mRNA specyficzny dla gD. Kopię cDNA wyodrębnionego mRNA tworzy się następnie zwykłymi metodami i wprowadza bezpośrednio do wektora klonującego.

Transformacja komórek gospodarza zrekombinowanego cząsteczkami DNA, do których włączono wyodrębniony gen, cDNA, lub syntetyczną sekwencję DNA, ułatwia tworzenie licznych kopii genu. Tak więc gen można otrzymać w mikrogramowych ilościach przez prowadzenie wzrostu transformantów, wyodrębnianie zrekombinowanych cząsteczek DNA z tych transformantów i odzyskanie włączonego genu z wyodrębnionego zrekombinowanego DNA.

Alternatywnie, mikrogramowe ilości gD można otrzymać ze źródła genu gD, na przykład komórek zwierzęcych zakażonych wirusem Herpes simplex, względnie bakterii lub faga zawierającego gen wirusowy w zrekombinowanym plazmidzie. Wirusowy lub plazmidowy DNA wyodrębnia się, przeprowadza we fragmenty i frakcjonuje pod względem wielkości tymi samymi metodami, których używa się do zlokalizowania genu.

Gdy już został wyodrębniony gen lub gD lub jego fragment wprowadza się do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, to jest wektora, który posiada elementy niezbędne do transkrypcji i translacji wprowadzonego genu (patrz: Roberts i Lauer, Methods in Enzymology, 68, 473/1979).

W celu uzyskania odpowiedniej ekspresji genu gD (lub części genu) w wektorze ekspresyjnym musi być obecny promotor. Polimeraza RNA wiąże się zwykle z promotorem i inicjuje transkrypcję genu lub grupy połączonych genów z elementami regulatorowymi (operonów). Promotory różnią się w swojej „sile“, to jest zdolności do inicjowania transkrypcji. Przy molekularnym klonowaniu pożądana jest obecność wielu silnych promotorów, aby spowodować transkrypcję na wysokim poziomie, a przez to ekspresję genu. W zależności od użytego układu komórek gospodarza, można użyć jakiegokolwiek odpowiedniego promotora. Na przykład przy klonowaniu do E. coli jako układu komórek-gospodarzy można użyć jakiegokolwiek z promotorów wyodrębnionych z E. coli, jej bakteriofagów lub plazmidów (np. promotora lac). Dodatkowo, można użyć promotorów E. coli wytworzonych techniką rekombinowanego DNA, lub inną techniką syntetycznego DNA, w celu zapewnienia transkrypcji włączonego genu. Bardziej szczegółowo, promotory Pr i Pl colifaga wywołują transkrypcję na wysokim poziomie sąsiadujących segmentów DNA. Oprócz tego, promotor recA z E. coli zapewnia transkrypcję genową na wysokim poziomie sąsiadujących fragmentów.

150 654

Ί

Wymagane są również specyficzne sygnały inicjacji w celu wydanej transkrypcji i translacji genów w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych. Sygnały transkrypcji i translacji mogą różnić się „siłą, co można ustalić na podstawie ilości informacyjnego RNA genowo specyficznego i odpowiednio zsyntetyzowanej proteiny. Ekspresyjny wektor DNA, zawierający promotor, może również posiadać jakąkolwiek kombinację sygnałów transkrypcji i/lub translacji o różnej „sile. Tak więc, można zastosować jakąkolwiek kombinację SD-ATG, która może być wykorzystana przez rybosomy komórki gospodarza. Do tych kombinacji należą, chociaż nie są one jedynymi, takie jak kombinacja SD-ATG z genu ero albo genu N colifaga lambda, względnie z genów tryptofanowych E, D, C, B lub A. Dosatkowo, można użyć jakiejkolwiek kombinacji SD-ATG wytworzonej techniką rekombinowanego DNA lub inną syntetyczną techniką.

Można zastosować jakąkolwiek z poprzednio opisanych metod insercji fragmentów DNA do wektora, aby włączyć promotor lub inne elementy kontrolne w specyficzne miejsca w wektorze.

Zgodnie z tym gen gD (lub jakąkolwiek jego część) włącza się do wektora ekspresyjnego w specyficznym miejscu, w odniesieniu do promotora i elementów kontrolnych tak, że sekwencja genu gD znajduje się w prawidłowej translacyjnej fazie odczytu (to jest w fazie) w odniesieniu do wektorowej sekwencji ATG. Alternatywnie można użyć ATG gD lub syntetycznego ATG. Powstałą zrekombinowaną cząsteczkę DNA można następnie wprowadzić do odpowiednich komórek gospodarza przez transformację, transdukcję lub transfekcję (zależnie od układu wektor/komórka gospodarza). Transformanty selekcjonuje się na podstawie ekspresji odpowiednich markerów genowych normalnie obecnych w wektorze, takich jak oporność na ampicylinę lub tetracyklinę w pBR322, albo aktywność kinazy tymidynowej w układach komórek eukariotycznych jako gospodarzy. Ekspresja tych markerowych protein wskazuje, że zrekombinowana cząsteczka DNA jest nie uszkodzona i replikuje się. Do wektorów ekspresyjnych, które zwykle zawierają funkcję markerową należą, chociaż nie są do nich ograniczone, następujące wektory lub ich pochodne: SV40 i wektory adenowirusów, wektory drożdży, wektory bakteriofagowe, takie jak lambda gt-WES-lambda-B, Charon 28, Charon 4A, lambda gt-l-lambda-BC, lambda gt-l-lambda-B, Μ13mp7, Μ13mp8, Μ13mp9, lub plazmidowe wektory DNA takie jak pBR322, pAC 105, pVA51, pACY177, pKH47, pACY184, pUBllO, pMB9, pBR325, Col El, pSCIOl, pBR313, pML21, RSF2124, pCRl lub RP4. Wektory ekspresyjne użyte do niniejszego wynalazku opisane są bardziej szczegółowo w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych nr kolejny 449 187 złożonym 13 grudnia 1982.

Oprócz tego można wybrać szczepy komórek-gospodarza, które hamują działanie promotora, jeżeli nie zostaną specyficznie zaindukowane. W ten sposób można zahamować w 95% działanie promotorów wektora w nie indukowanych komórkach. W przypadku pewnych operonów dodanie specyficznych induktorów jest niezbędne, aby zapewnić skuteczną transkrypcję i translację włączonego DNA, na przykład operon lac indukuje się dodatkiem laktozy lub IPTG (to jest izopropylotio-/5-D-galaktozydu). Inne operony, takie jak trp, pro itd są pod inną kontrolą. Operon trp jest indukowany, gdy nie ma tryptofanu w podłożach wzrostowych. Promotor Pl jest indukowany przez wzrost temperatury w komórkach-gospodarzach zawierających wrażliwy na temperaturę represor, np. 0857. Tak więc, można skutecznie kontrolować ekspresję proteiny gD. Jest to ważne, jeśli proteinowy produkt klonowanego genu jest letalny dla komórek-gospodarzy. W tych przypadkach obcy gen może się replikować, ale nie wykazywać ekspresji podczas wzrostu transformantów. Po osiągnięciu przez komórki w podłożu wzrostowym odpowiedniej gęstości, można indukować promotor w celu wytwarzania proteiny.

Proteiny pokrewne gD wytworzone w komórkach transformowanych plazmidami skonstruowanymi jak wyżej opisano (to jest plazmidami, które kierują ekspresją protein pokrewnych gD zakończonych naturalnym sygnałem zakończenia translacji gD z inicjacją ATG pochodzącą od wektora, genu gD lub syntetyczną) są w niniejszym opisie określone jako nie sprzężone proteiny gD lub nie sprzężone proteiny pokrewne gD.

W celu zmaksymalizowania ekspresji genów w specyficznych transformantach, można połączyć gen, o który chodzi, z genem kodującym inną proteinę, taką jak proteina komórkigospodarza. Osiągana jest przy tym dodatkowa korzyść, jeśli proteina komórki-gospodarza zawiera funkcję przydatną do badań. W wyniku ekspresji połączonych genów otrzymuje się

150 654 sprzężony produkt proteinowy (określony w dalszej części opisu jako sprzężone proteiny gD), który można zidentyfikować na podstawie jego dużej masy cząsteczkowej i funkcji przydatnej do badań. Na przykład wytwarzanie sprzężonej proteiny gD//?-galaktozydozy daje szereg korzyści przy klonowaniu i ekspresji gD w E. coli jako gospodarzu. Po pierwsze, pozwala na przybliżone określenie poziomu tworzenia proteiny (tutaj - ekspresji) kierowanej przez wektor posługując się badaniem kalorymetrycznym zgodnie z metodą Millera [Experiments in Molecular Genetics, Gold Spring Harbor Press, New York, Ν. Y., strony 47-55 i 352-355 (1972)]. Po drugie, wytwarzanie proteiny sprzężonej ułatwia identyfikację i wyodrębnienie produktu proteinowego. Nie sprzężona proteina gD wytworzona przez transformanty E. coli jest mniejsza od sprzężonej proteiny gD/j3galaktozydoza i jako taka może migrować wspólnie z szeregiem innych protein gospodarza analizowanych za pomocą elektroforezy SDS - żel poliakryloamidowy. Wytworzoną sprzężoną proteinę łatwo wykrywa się i identyfikuje za pomocą elektroforezy SDS - żel poliakryloamidowy (SDS-PAGE) dzięki unikalnej, dużej masie cząsteczkowej.

Zakres niniejszego wynalazku nie jest ograniczony do wytwarzania proteiny sprzężonej z /J-galaktozydozą. Można połączyć jakikolwiek gen pochodzenia zarówno eukariotycznego jak i prokariotycznego w fazie z genem gD (lub jakimkolwiek fragmentem genu proteiny HSV), aby uzyskać korzyści podobne jak w przypadku j8-galaktozydozowego sprzężonego produktu proteinowego. Do przykładów należą, chociaż nie stanowią ograniczenia, galaktokinoza, typ D, E lub lider, geny pili oraz geny eukariotyczne takie jak kinaza tymidynowa, β -globina, antygen SV-40 T lub transformujący wirus mięsaka Rousa.

W celu skonstruowania genu, który koduje proteinę sprzężoną łączy się dwa geny w obszarze ich kodujących sekwencji tak, aby utrzymać translacyjną fazę odczytu nie przerywaną sygnałami zakończenia. Tak więc, jak uprzednio wyjaśniono, jeśli komórka gospodarza należy do szczepu, który hamuje działanie promotora, proteina sprzężona zostanie wytworzona w odpowiedzi na indukcję.

Po zidentyfikowaniu transformantów zawierających prawidłową konstrukcję DNA, przeprowadza się analizę immunoreaktywności i antygenowości produktu genu gD w zrekombinowanym DNA. Jeśli komórka gospodarza jest niezdolna do glikozylacji produktu gD w taki sam sposób, jak naturalnie występującego gD HSV, produkt genu gD będzie się różnić od naturalnej glikoproteiny gD. Tak więc, immunologiczna analiza jest szczególnie ważna dla produktu genu gD, ponieważ ostatecznym celem jest użycie tak wyprodukowanej proteiny pokrewnej gD do formułowania szczepionki. Analizę immunokreatywności najłatwiej przeprowadzić stosując surowice odpornościowe przeciw glikoproteinie gD z zakażonych HSV komórek, podczas gdy antygenowość można ocenić przez określenie miana przeciwciał, tworzących się u zwierząt doświadczalnych, które powstają w odpowiedzi na immunizację produktem genu gD i zdolności tych przeciwciał do zneutralizowania zakażenia HSV.

Dostępne są różne przeciwciała do analizy immunoreaktywności, w tym preparaty poliwalentnego przeciwciała przeciw pełnemu wirusowi, lub przeciw gD w szczególności. Wyższą specyficzność uzyskuje się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, które rozpoznają tylko jedno miejsce antygenowe w cząsteczce proteiny gD. Istnieją różne przeciwciała monoklonalne przeciw gD, przy czym niektóre z nich nie tylko tworzą specyficzne immunoprecypitaty z produktem genu gD HSV-1 i HSV-2, ale także neutralizują zakaźność obydwu wirusów.

Identyfikacja protein opisanych w niniejszym opisie jest oparta na 2 wymaganiach. Po pierwsze, proteina pokrewna gD powinna być wytwarzana tylko w odpowiedzi na indukcję promotora. Po drugie, proteina pokrewna gD powinna być immunoreaktywna przy użyciu różnych przeciwciał poliklonalnych przeciw HSV i monoklonalnych przeciwciał przeciw gD, przy czym proteina powinna być immunoreaktywna, niezależnie od tego, czy jest wynikiem ekspresji nienaruszonej sekwencji genowej, części sekwencji genowej lub dwóch, lub więcej, sekwencji genowych połączonych w celu bezpośredniego wytworzenia proteiny sprzężonej. Tę reaktywność można wykazać za pomocą standardowych metod immunologicznych, takich jak immunoprecypitacja, immunodyfuzja, radioimmunokompetycja, immunoelektroforeza albo immunologiczne wykrywanie protein rozdzielonych za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym i następnie przeniesionych na nitrocelulozę.

150 654

Komórki zawierające gen gD (lub jakikolwiek glikoproteinowy gen HSV) hoduje się w dużej objętości i proteinę wytworzoną po indukcji promotora wyodrębnia się ze wspomnianych komórek, lub z podłoża, jeśli proteina jest wydzielana. Proteinę można wyodrębnić i oczyścić albo za pomocą standardowej chromatografii, włączając w to chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa lub żywice z różnicowaniem wielkości, przez wirowanie, lub jakąkolwiek inną standardową techniką oczyszczania protein.

Ponieważ niektóre sprzężone proteiny tworzą agregaty gdy są tworzone w nadmiarze przez komórki i gdy znajdują się w roztworze, metoda wyodrębniania protein tworzących agregaty jest szczególnie użyteczna przy wyodrębnianiu sprzężonych białek wytworzonych sposobem według niniejszego wynalazku. Tych protein sprzężonych można użyć do formułowania szczepionki. Oczyszczanie sprzężonych protein (dalej określane jako oczyszczanie agregatów) obejmuje ekstrakcję, rozdzielanie i/lub oczyszczanie protein tworzących agregaty z mieszanin proteinowych, takich jak lizaty hodowli komórek otrzymane przez rozbicie komórek, a następnie przemycie zagregowanego materiału. Dodatkowo, zagregowany materiał można solubilizować przez dodanie rozpuszczalnika, który jest zarówno silnym akceptorem wodoru, jak i silnym donorem wodoru (albo kombinacji rozpuszczalników, z których każdy wykazuje jedną z tych właściwości). Proteiny tworzące agregaty można następnie wytrącić przez rozcieńczenie nie działającym szkodliwie buforem. Do odpowiednich rozpuszczalników protein należą, lecz nie są do nich ograniczone, mocznik (od około 4 moli do około 8 moli) co najmniej 80% obj.(obj.) oraz chlorowodorek guanidyny (od około 4 moli do około 8 moli). Niektóre rozpuszczalniki, które są zdolne do sulubilizowania protein tworzących agregaty, np. SDS (siarczan sodowo-dodecylowy), 70% kwas mrówkowy, są nieodpowiednie do użycia w tym postępowaniu, ponieważ zachodząca po tym precypitacja solubilizowanych protein tworzących agregaty nie będzie skuteczna. Chociaż chlorowodorek guanidyny i inne podobne czynniki działają denaturująco, badania wskazują, że ta denaturacja nie jest nieodwracalna, i renaturacja może nastąpić po usunięciu (np. za pomocą dializy) lub rozcieńczeniu czynnika denaturującego, co pozwala na ponowne utworzenie immunologicznie i/lub biologicznie aktywnej proteiny.

Jedno z zastosowań metody wyodrębniania sprzężonej proteiny można przedstawić następująco (dalej określane jako niedenaturująca metoda oczyszczania agregatów).

Osad komórek szybko zamraża się za pomocą układu suchy lód/metanol, waży i 3-4 g komórek suspenduje się ponownie w co najmniej 25 ml roztworu buforowego [np. 50 mmoli Tris-HCl (chlorowodorek trój-/hydroksymetylo/aminometanu/ pH 8,0, 2 mmoli EDTA (kwas etylenodwuaminoczterooctowy) i 200 mmoli NaCl]. Tak więc komórki suspenduje się w roztworze buforowym w przybliżonym stężeniu od około 100 do 200 g komórek/litr. Korzystne są stężenia poniżej około 160 g/litr. Do tej zawiesiny dodaje się lizozymu do końcowego stężenia około 130 pg/ml i powstałą mieszaninę odstawia się na 20 minut w temperaturze 4°C przy sporadycznym wstrząsaniu. Dodaje się Nonidet P40 (NP-40, znak towarowy Shell, poliksyetylen/9/ p-IIIrzęd.oktylofenol), niejonowy detergent, używany do solubilizowania membran, do końcowego stężenia 0,1% i miesza się roztwór. Następnie mieszaninę rozciera się przez około 1 minutę w młynie Polytron (Brinkman Instruments, Westbury, N, Y.) lub równoważnego urządzenia.

Zawiesinę wiruje się przy 8000x g przez 30 minut i granulki suspenduje się ponownie w buforze do przemywania np. 20 mmoli Tris-HCl (pH 7,2), 1 mmol EDTA, 150 mmoli NaCl i 2% Triton Χ100 (polioksyetylen (9-10) p-III-rzęd.-oktylofenol, detergent niejonowy) i rozdrabnia za pomocą młyna Polytron. To stadium wirowania, przemywania i rozcierania można powtórzyć w celu dalszego przemycia granulek i usunięcia komórkowych pozostałości w takiej ilości, w jakiej jest to pożądane.

Alternatywnie granulki agregatów można dalej potraktować przez dodanie czynnika denaturującego (co jest dalej określane jako denaturująca metoda oczyszczania agregatów) w następujący sposób. Zawiesinę wiruje się, supernatant usuwa całkowicie i granulki suspenduje się ponownie w około 1/5 objętości 6 molowego roztworu chlorowodorku guanidyny w wodzie destylowanej. Na przykład 3 g komórek przemytych 25 ml buforu powinno być w tym stadium ponownie suspendowanych w 5 ml 6 molowego roztworu chlorowodorku guanidyny. Ponowne suspendowanie granulek może być w tym stadium trudne i może okazać się potrzebne nadźwiękawianie w celu otrzymania homogenicznego roztworu. Roztwór odstawia się na 20 minut w temperaturze 22°C, a

150 654 następnie wiruje przy 8000xg przez 30 minut w celu usunięcia pozostałości komórkowych, pozostawiając supernatant, który w tym przypadku zawiera agregaty sprzężonej proteiny.

Sprzężoną proteinę wytrąca się z supernatantu w chlorowodorku guanidyny przez dodanie około 4 objętości wodnego buforu. W tym stadium można użyć prawie każdego wodnego buforu, tym niemniej dodanie małej ilości niejonowego detergentu, takiego jak 0,5% NP-40 lub Triton Χ100 okazać się może pomocne. Tę zawiesinę odstawia się na 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie wiruje przy 8000 xg przez 10 minut. Supernatant odrzuca się, a granulki zawierające strąt sprzężonej proteiny suspenduje się ponownie w odpowiednim buforze, np. roztworem soli buforowanym fosforanami (PBS) w dowolnej odpowiedniej ilości. Krótkie nadźwiękawianie lub homogenizacja może pomóc w otrzymaniu homogenicznej zawiesiny lub papki (ponieważ proteiny tworzące agregaty są nierozpuszczalne w wodzie).

Może być pożądane użycie do formułowania szczepionki nie sprzężonej proteiny gD. Jednakże, jak powyżej wyjaśniono, transformanty które wytwarzają nie sprzężone proteiny gD czynią to w mniejszych ilościach niż transformanty tworzące sprzężone proteiny gD. Jest to prawdziwe nawet wtedy, gdy sekwencja genowa dla nie sprzężonej proteiny znajduje się pod kontrolą indukowalnego promotora. Oprócz tego, nie sprzężone proteiny gD wytwarzane przez transformanty bakteryjne mogą być mniej stabilne niż sprzężone proteiny gD.

W alternatywnym zastosowaniu mniejszego wynalazku, transformant komórek-gospodarzy może być tak zaprojektowany, aby wytwarzał duże ilości zarówno sprzężonych jak i nie sprzężonych protein pokrewnych gD, które mogą wspólnie agregować i mogą być łatwo oczyszczone. Zgodnie z tym zastosowaniem zrekombinowane plazmidy, które kodują sprzężone proteiny gD, zostają zmienione w połączeniu sekwencji genu gD i sekwencji genu komórki gospodarza (np. sekwencji genu z β -galaktozydazy) tak, że sekwencja nonsensownego kodonu, to jest sekwencja zakończenia łańcucha, taka jak sekwencja typu „amber (TAG), „ochrę (TAA) lub „opal (TGA) jest zlokalizowana między dwiema sekwencjami genowymi, przy czym sekwencja zakończenia łańcucha musi być w fazie z translacyjnymi fazami odczytu zarówno sekwencji gD jak i genu komórki-gospodarza. Takiej zmiany można dokonać przez rozszczepienie plazmidu w miejscu restrykcyjnym (lub miejscach) zlokalizowanym między sekwencjami dwóch genów i połączenie następnej sekwencji DNA łącznikiem kodującym sygnał zakończenia łańcucha, taki jak sygnał typu amber, ochrę lub opal w miejscu rozszczepienia plazmidu tak, że sygnał zakończenia łańcucha jest w fazie z translacyjnymi fazami odczytu obu sekwencji genowych. Wprowadzenie tych plazmidów z modyfikacjami typu amber, ochrę lub opal do komórki gospodarza zawierającej supresorowy tRNA daje w wyniku syntezę zarówno nie sprzężonej proteiny pokrewnej gD jak sprzężonej proteiny gD. Jeśli plazmidy z modyfikacjami typu amber, ochrę lub opal użyje się do transformowania linii komórkowych niesupresorowych, tworzą się głównie nie sprzężone proteiny pokrewne gD.

Istnieją co najmniej dwa sposoby wprowadzania plazmidów z modyfikacją typu amber, ochrę lub opal do komórki supresorowej. 1) Transformant (to jest komórka gospodarza transformowana plazmidem z modyfikacją typu amber, ochrę lub opal) można zakazić lizogennym fagiem transkodującym, który przenosi odpowiedni supresorowy gen tRNA (np. pSU3 przenosi gen supresorowy SupF mutacji typu amber), lub 2) można użyć plazmidów z modyfikacją typu amber, ochrę lub opal do transformowania linii komórkowych, które zawierają supresorowy tRNA typu, odpowiednio, amber, ochrę lub opal. Przykłady takich szczepów obejmują, ale nie są do nich ograniczone, LE392 (zawierający supresorowy SupE i SupF mutacji typu amber), YMC (zawierający SupF) i C600 (SupE). Różne geny supresorowe tRNA typu amber w E. coli obejmują, chociaż nie są do nich ograniczone, supB, supC, supD, supE, supF, supG, supL, supM, supN, supO, supP, supV, supU; różne geny supresorowe tRNA typu ochrę w E. coli obejmują chociaż nie są do nich ograniczone, supB, supC, supG, supL, supM, supN, supO, supV; a różne geny supresorowe tRNA typu opal w E. coli obejmują, chociaż nie są do nich ograniczone, supK [patrz: Bachman i Low, Microbiological Reviews, 44, (1), 1-56 (1980)].

Komórki gospodarza zawierające odpowiedni gen supresorowy tRNA, transformowane plazmidami z modyfikacją typu amber, ochrę lub opal mogą wytwarzać proteinę pokrewną gD zarówno jako proteinę sprzężoną jak i proteinę nie sprzężoną (proporcja wytworzonej stężonej gD

150 654 do nie sprzężonej proteiny gD zależy od stopnia supresji w komórce gospodarza), przy czym obydwie proteiny reagują immunologicznie z surowicami odpornościowymi skierowanymi przeciw HSV. Zarówno nie sprzężone gD jak i sprzężoną proteinę gD oczyszcza się razem z zastosowaniem niedenaturującej metody oczyszczania agregatów (w tym przypadku metodą jest niedenaturująca metoda oczyszczania koagregatów) opisana poprzednio. Po solubilizacji nie sprzężoną proteinę gD można odzielić od sprzężonej proteiny gD w oparciu o wielkość lub ładunek. W wyniku tego duże ilości nie. sprzężonej proteiny pokrewnej gD można łatwo oczyścić i formułować do użycia jako szczepionkę. . ' · ' . .

Celem niniejszego wynalazku jest wytwarzanie, techniką zrekombinowanego DNA, polipeptydu pokrewnego glikoproteinie gD HSV, którego można użyć jako immunogen w szczepionce w celu ochrony przed zakażeniem zarówno HSV-1 jak i HSV-2. Jeśli wytworzona proteina pokrewna gD jest immunoreaktywna ze specyficznymi przeciwciałami neutralizującymi przeciw HSV-1 jak i HSV-2, można oczekiwać, że proteina pokrewna gD będzie wywoływać odpowiedź immunologiczną wyrażającą się zdolnością do neutralizacji wirusa in vivo. Szczepionki wykonane z immunogenami wytworzonymi metodami inżynierii genetycznej są bezpieczniejsze od zwykłych szczepionek przygotowanych z atenuowanego wirusa, ponieważ nie ma w tym przypadku ryzyka zakażenia biorcy. Alternatywnie produktu gD wytworzonego metodami inżynierii genetycznej można użyć do wytworzenia przeciwciał do użycia w biernej immunoterapii.

Chociaż sprzężonej proteiny gD/j3-galaktozydaza można użyć jako takiej przy formułowaniu szczepionki, może okazać się niezbędne usunięcie wpierw części /ł-galaktozydazy. Alternatywnie, rekonstrukcja amino-kodującego końca genu gD może być ważna dla immunogenności proteiny, ponieważ koniec aminowy może zawierać dodatkowe istotne miejsca antygenowe. Aminokodujący koniec genu gD można rekonstruować przez włączenie do sekwencji DNA, która koduje aminowy koniec gD do odpowiedniego miejsca w regionie kodującym gD w zrekombinowanej cząsteczce DNA. Ponieważ zrekombinowana cząsteczka DNA zachowuje wszystkie niezbędne elementy kontroli ekspresji, proteina pokrewna gD o pełnej (lub prawie pełnej) długości łańcucha zostaje wytworzona przez komórki transformowane cząsteczką DNA zawierającą zrekonstruowany gen.

A zatem, proteinę pokrewną gD, wytworzoną metodami inżynierii genetycznej, można wyodrębnić i oczyścić z komórek-gospodarzy za pomocą zwykłych metod wyodrębniania białek albo metody oczyszczania agregatów przedstawionej w niniejszym opisie. Końcowy oczyszczony produkt można następnie rozcieńczyć do odpowiedniego stężenia, formułować z jakimkolwiek użytecznym adiuwantem szczepionkowym i przygotowywać w opakowaniach do użytku.

W poniższych przykładach I i II opisano wytwarzanie gD-1 i gD-2 sposobem według wynalazku, natomiast przykłady III i IV ilustrują działanie biologiczne wytworzonego sposobem według wynalazku immunogennego polipeptydu.

Przykład I. Wytwarzanie gD HSV-1.

Sposobem według niniejszego wynalazku lokalizuje się gen gD i identyfikuje przez włączenie fragmentów DNA części Us genomu HSV-1 (patrz, fig. la) do wektora pBR322,aby utworzyć zrekombinowane plazmidy, z których każdy zawiera inny fragment genomu HSV-1. Plazmid zawierający gen gD-1 identyfikuje się trzema metodami, wymienionymi niekoniecznie w kolejności: 1) analiza sekwencji DNA, 2) badanie hybrydyzacji mRNA specyficznego dla gD-1, oraz 3) translacja in vitro, który hybrydyzuje się ze zrekombinowanymi plazmidami.

Po zidentyfikowaniu plazmidu zawierającego gen gD-1, gen ten charakteryzuje się przez przeprowadzenie analizy sekwencji DNA i przez zlokalizowanie końców genu gD-1 w zrekombinowanym plazmidzie. Ze zidentyfikowanego plazmidu wyodrębnia się fragment DNA zawierający gen gD-1, w którym brak pierwszych 158 nukleotydów sekwencji kodującej. Ten fragment DNA włącza się do wektora DNA, pJS413 z wytworzeniem pEH25, którego używa się do klonowania i ekspresji genu w E. coli. Produkt genowy wyodrębniony z indukowanych transformantów identyfikuje się jako specyficzną proteinę gD-1 za pomocą immunoprecypitacji monoklonalnymi przeciwciałami skierowanymi przeciw gD-1 i poliwalentnymi przeciwciałami skierowanymi przeciw HSV-1.

Wreszcie fragment genu gD-1 wyodrębnia się z pEH25 przez rozszczepienie endonukleazą restrykcyjną w specyficznych miejscach tak, że ulega delacji sekwencja zakończenia (TAG) sek12

150 654 wencj i koduj ącej gD-1. Ten fragment DN A, który zawiera część genu gD-1, promotor plazmidowy i elementy kontrolne (np. SD-ATG) włącza się do wektora zawierającego sekwencję kodującą /J-galaktozydazę. Powstały zrekombinowany plazmid pEH4-2, zawierający sekwencję kodującą gD-1 między plazmidowym promotorem lac z ero SD-ATG a genem /J-galaktozydazy, kieruje ekspresją sprzężonej proteiny w indukowanych transformantach E. coli. Tę sprzężoną proteinę wyodrębnia się następnie z lizatów komórek gospodarza i nadaje się mu postać leku stanowiącego immunogen. Alternatywnie rekonstruuje się amino-kodujący koniec genu gD-1 i powstałej proteiny gD-1 nadaje się postać preparatu do wstrzykiwania zwierzętom w badaniach przedklinicznych. Dokładny opis każdego stadium konstrukcji jest przedstawiony poniżej.

Proteiny pokrewne gD-1 i proteiny sprzężone, wytworzone sposobem według niniejszego wynalazku, nie są glikozylowane i przez to różnią się od naturalnie występującej glikoproteiny gD HSV-1. Tym niemniej, proteina pokrewna gD-1 jest immunoreaktywna z przeciwciałami przeciw gD HSV-1 i HSV-2.

1-1. Ogólne metody używane przy wytwarzaniu plazmidów. Następujące podpunkty opisują ogólne metody i materiały używane przy wyodrębnianiu DNA, reakcjach enzymatycznych i reakcjach łączenia.

I-l.a. Wyodrębnianie plazmidowego DNA. Escherichia coli (E. coli), która jest komórkągbspodarzem, transformuje się [Gautier i Bonewald, Molec. Gen. Genet. 178, 375, (1980)] i wyodrębnia się duże (mikrogramowe) ilości plazmidowego DNA z hodowli transformantów E. coli w bulionie M-9 [Miller, w: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press, New York, Ν. Y. (1972)]. Plazmidy wyodrębnia się z komórek w późnej logarytmicznej fazie wzrostu stosując zmodyfikowaną metodę Guerry i wsp. [J. Bacteriol. 116, 1063 (1973)].

I-l.b. Warunki trawienia enzymami restrykcyjnymi. Enzymy restrykcyjne używane w sposobie według wynalazku otrzymano, jeśli tego nie wskazano inaczej, z New England Biolabs, Inc. Beverly, Ma. Jednostkę enzymatyczną definiuje się jako ilość wymaganą do strawienia 1 pg DNA faga lambda w ciągu 15 minut w temperaturze 37°C przy całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej 50 pg (/J-merkaptoetanol).

Wszystkich procesów całkowitego strawienia enzymami restrykcyjnymi dokonuje się w następujących warunkach: 1 //g DNA inkubuje się z 0,5 jednostek enzymu w temperaturze 37°C przez 60 minut w 20pg buforu. Częściowego strawienia dokonuje się przez zmodyfikowanie warunków całkowitego trawienia w następujący sposób: lpg DNA inkubuje się z 0,1 jednostki enzymu w temperaturze 37°C przez 15 minut. Reakcję kończy przez dodanie 0,1% siarczanu sodowododecylowego (SDS). Tak więc warunki reakcji są takie, aby otrzymać średnio jedno roszczepienie na jedną cząsteczkę DNA.

I-l.c. Bufory dla enzymów restrykcyjnych. Bufory uzyskane w trawieniu SacI,SacII lub Smal składają się z: 6,6 moli Tris-HCl (pH 7,4), 6,6 mola MgCU i 6,6 mola /?-ME (/5-merkaptoetanol).

Bufory używane w trawieniu BgUI, BstElI, EcoRI, Hindlll, Nrul, Pstl lub PvuII składają się z: 60 moli NaCl, 6,6 mola Tris-HCl (pH 7,4), 6,6 mola MgCk i 6,6 mola j6-merkaptoetanolu G8-ME).

Bufory używane w trawieniu BamHI, Sali lub Xbal składają się z: 150 mmoli NaCl, 6,6 mmola Tris-HCl (pH 7,4), 6,6 mmola MgCb i 6,6 mola /J-ME.

Należy zauważyć, że jeżeli przeprowadza się trawienie DNA dwoma, lub więcej, endonukleazami restrykcyjnymi, reakcję w buforze o niższym stężeniu soli przeprowadza się przed reakcją w buforze o wyższym stężeniu soli. Jeśli dwa enzymy wymagają tego samego buforu reakcję można przeprowadzać jednocześnie.

I-l.d. Modyfikacja DNA. Nukleaza Bal 31 jest wielofunkcyjnym enzymem, wykazującym w wysokim stopniu specyficzną aktywność, endodeosyrybonukleazy wobec pojedynczej nici i egzonukleazową aktywność, dzięki czemu degraduje jednocześnie zarówno końce 3'jak i 5' dwuniciowego DNA (ds DNA). Jedną jednostkę nukleazy Bal 31 (New England Biolabs, Inc. Beverly, Ma) definiuje się jako ilość wymaganą do uwolnienia 1,0 jug rozpuszczalnych w kwasie nukleotydów ze zdenaturowanego DNA grasicy cielęcej (650//g/ml) przez 1 minutę w temperaturze 30°C. Bufor używany do reakcji z Bal 31 składa się z 20 mmoli Tris-HCl (pH 8,0), 600 mmoli NaCl, 12 mmoli CaCk, 12 mmoli MgCb, 1,0 mmola EDTA i DNA. Inkubacje prowadzi się w temperaturze 30°C, trawienia enzymem Bal 31 dokonuje się przez inkubację 30 pg DNA z 0,5 jednostki Bal 31

150 654 13 przez 1, 2,4, 6, 8 i 10 minut. Reakcję kończy się dodaniem EDTA do 50 mmoli lub inaktywację cieplną Bal 31 (to jest 65°C przez 10 minut).

Nukleaza SI degraduje RNA lub zdenaturowany DNA (to jest jednoniciowy DNA) do mononukleotydów, ale w prawidłowych warunkach nie degraduje dwuniciowego DNA lub hybryd DNA/RNA. Jedną jednostkę nukleazy SI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) definiuje się jako ilość enzymu niezbędną do przeprowadzenia do kwasu 1 //g zdenaturowanego DNA grasicy cielęcej w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C. Bufor używany do reakcji z nuldeazą S1 składa się z: 30 mmoli octanu sodowego (pH 4,6), 25Ó mmoli NaCl, 1 mmola ZnSO< i 5% gliceryny. Trawienia nukleazą SI dokonuje się przez inkubację 2000 jednostek enzymu z 0,1 pg.DNA i 20pg RNA w temperaturze 45° przez 30 minut.

Egzonukleaza VII (Εχο VII) degraduje jednoniciowy DNA (ssDNA). Okazuje się, że mechanizm działania Εχο VII polega na egzonukleazowym stopniowym przetwarzaniu. Jedną jednostkę Εχο VII (Bethesda Research Laboratories, Rockville, Md) definiuje się jako ilość enzymu, która tworzy 1 mmol monomerów nukleotydów przez 30 minut w temperaturze 37° przy użyciu liniowego zdenaturowanego [^_3H]-SV40 DNA jako substratu. Bufor używany do reakcji z Εχο VII składa się z: 10 mmoli Tris-HCl (pH 7,9), 100 mmoli NaCl, 10 mmoli /3-MEi 8 mmoli EDTA. Trawienie Εχο VII prowadzi się z użyciem 4.jednostek Εχο VII na 0,1 pt DNA w mieszaninie reakcyjnej o objętości 250pg przez 1 godzinę w temperaturze 45°C.

I-l.e. Reakcja prowadzona przez polimerazę DNA. Polimeraza DNA katalizuje stopniowe wydłużanie łańcucha DNA. Rozrost łańcucha następuje w kierunku 5' do 3' (tak więc dodawanie nukleotydów następuje na końcu 3') i sekwencja polimeru jest determinowana sekwencją matrycy, ponieważ dochodzący nukleotyd musi być komplementarny do matrycy to znaczy tworzyć prawidłową parę zasad z nicią matrycową. Znane polimerazy DNA nie mogą inicjować syntezy łańcucha, tak więc synteza DNA wymaga nici primerowej z wolną grupą hydroksylową na końcu 3' przyłączoną do nici matrycowej. Wydłużenie łańcucha zachodzi na zasadzie nukleofilowego ataku hydroksylowej grupy końcowej 3' primera na pozycję 5' fosforanu dochodzącego nukleotydu. Nowy łańcuch ma sparowane zasady i jest antyrównoległy do nici matrycowej. W wyniku reakcji polimerazy DNA jednoniciowa matryca zostaje uzupełniona czyli przeprowadzona dwuniciową cząsteczkę DNA.

Drugą ważną cechą polimerazy DNA jest funkcja „próbnego odczytywania. Polimeraza DNA z aktywności? egzonukleazową 3' do 5' działa na nie sparowane końce i może degradować zarówno jednoniciowy jak i dwuniciowy DNA w kierunku 3' do 5' dostarczając monuklećtydów. Tak więc nieprawidłowo dodany nukleotyd jest usuwany przed dalszą polimeryzacją, a dokładność działania enzymu zwiększa się. Polimeraza DNA I wykazuje również aktywność egzonukleazową w kierunku 5' do 3' specyficzną wobec dwuniciowego DNA (dostarczając 5'-mononukleotydów i oligonukleotydów), może ona również wyciąć nieuporządkowane regiony w DNA.

Proteolityczne działania na polimerazę DNA I metodą Klenowa [Klenow i wsp. Eur. J. Biochem. 22,371 (1971)] dostarcza 2 fragmentów: dużego i małego. Duży fragment, czyli fragment Klenowa (76000 daltonów) pozostaje polimerazą i zachowuje egzonukleazową aktywność 3'-5', podczas gdy mały fragment zachowuje egzonukleazową aktywność 5-3'. Jedna jednostka polimerazy DNA I lub dużego fragmentu polimerazy DNA I (New England Biolabs, Beverly, Ma) jest zdefiniowana jako ilość przeprowadzająca 10 mmoli dezoksyrybonukleotydów w postać nierozpuszczalną w kwasie przez 30 minut w temperaturze 37°C. Warunki badania są dla obydwu enzymów takie same z tym wyjątkiem, że mieszanina reakcyjna dla polimerazy DNA I zawiera 67 mmoli KPO. (pH 7,5) podczas gdy mieszanina reakcyjna dla fragmentu Klenowa zawiera 40 mmoli KPO4 (pH 7,5) w następującym buforze: 6,6 mmola MgCk, 1,0 mmola)8-ME, 2 mmole kopolimeru dAI, 33 //moli dATT, 33 //moli ³H-dTTP i enzym.

W niniejszym wynalazku, kiedy używa się dużego fragmentu (Klenowa) polimerazy DNA w celu uzupełnienia jednoniciowego DNA lub lepkich końców, postępuje się następująco. Reakcję enzymu restrykcyjnego kończy się przez ogrzewanie w temperaturze 68°C przez 10 minut. Do tej samej mieszaniny reakcyjnej dodaje się każdego z trójfosforanów dezoksynukleozydów do końcowego stężenia 50//moli i na każdy pg DNA w mieszaninie reakcyjnej 10-100 jednostek fragmentu

150 654

Klenowa polimerazy DNA. Innymi słowy używa się nadmiaru fragmentu Klenowa polimerazy DNA w celu całkowitego uzupełnienia jednoniciowych końców.

1-1 ,f. Oczyszczanie fragmentów DNA na żelu. Po potraktowaniu enzymem restrykcyjnym lub nukleazą fragmenty DNA różnej wielkości rozdziela się za pomocą elektroforezy w żelu na płytkach z żelem albo agarozowym, albo poliakryloamidowym przy niskim napięciu (około 2V/cm dla żelu agarozowego i 10V/cm dla żelu poliakryloamidowego), barwi się bromkiem etydyny i uwidacznia w świetle UV [Southern in Enzymology, 68, 152 (1979)].

W celu odzyskania z żelu określonych fragmentów DNA wycina się z żelu odpowiednie pasma i odzyskuje DNA za pomocą elektroelucji do woreczka do dializy. Następnie wyodrębnia się DNA na DEAE-celulozie lub wytrąca się etanolem i suspenduje się ponownie w odpowiednim buforze [Smith, Methods in Enzymology, 65, 371 (1980)].

I-l.g. Łączenie DNA. Wszystkich procesów łączenia dokonuje się za pomocą ligazy DNA T4 (New England Biolabs, Inc., Beverly, Ma). Jedną jednostkę ligazy DNA T4 definiuje się jako ilość wymaganą do 50% połączenia fragmentów Hindlll DNA bakteriofaga lambda przez 30 minut w temperaturze 16°C w 20/rl buforu dla ligazy, przy stężeniu końców DNA 5' 0,12a3mmola (300//g/ml).

Łączenie DNA dokonuje się w buforze dla ligazy składającym się z: 60 mmoli Tris-HCl (pH 7,8), 10 mmoli MgCk, 20 mmoli dwutiotreitolu (DTT), 1,0 mmola ATP przy stężeniu DNA w zakresie 15-50 //g/ml. Mieszaniny reakcyjne w reakcji łączenia inkubuje się od 4 do 24 godzin w temperaturze pokojowej z użyciem około 300jednostek ligazy DNA na 10//1 objętości mieszaniny.

1-2. Lokalizacja i wyodrębnianie genu gD-Ι. Analiza specyficznych protein w zrekombinowanych HSV-1 i HSV-2 wskazuje, że gen gD-Ι znajduje się między 0,9-0,945jednostek masy genomu w regionie Us DNA [Ruyechan i wsp. J. Virol, 29, 667 (1979)], patrz, fig. la i lb. Region Us przeprowadza się we fragmenty enzymami restrykcyjnymi i włącza się je do wektorów klonujących w celu utworzenia różnych zrekombinowanych plazmidów, z których każdy zawiera określoną część regionu Us. Następnie te zrekombinowane plazmidy analizowano, aby zlokalizować gen gD-Ι w regionie Us. O pozycji na mapie gD-Ι w HSV-1 ostatnio donieśli Lee i wsp. [J. Virol. 43,41 (1982)].

I-2.a. Zrekombinowane plazmidy DNA zawierające określoną część regionu Us HSV-1. Skonstruowano kilka plazmidów zrekombinowanych używając wektora pBR322 i różnych fragmentów regionu Us HSV-1 (szczep Pattona). Jeden z tych plazmidów, oznaczony pRWF6 zawiera jak stwierdzono, nienaruszoną sekwencję genu gD-1.

Insert HSV-1 w zrekombinowanym plazmidzie pRWF6 pochodzi z regionu Us lambda gtWES: klon EcoRI-H [Umene i Enąuist, Gene 13, 251 (1981)]. Lambda gtWES: klon EcoRI strawiono całkowicie EcoRI. Fragment EcoRI-Η lambda gtWes: klon EcoRI, około 15-16 kb (kilozasad) zawiera nienaruszony region HSV-1.

Plazmid pBR322 i fragment EcoRI-Η HSV-1 (wyodrębniony powyżej) zostały całkowicie strawione za pomocą BamHI. Utworzony tak fragment pBR322 o 4,4 kb (kilozasady) i fragment HSV-1 o 6,4 kb (kilozasady) zostały w pRWF6 połączone w stosunku 1:1.

I-2.b. Umiejscowienie specyficznej sekwencji gD-Ι kodującej mRNA. W celu umiejscowienia i wyboru specyficznej sekwencji kodującej gD-Ι w obrębie pRWF6, inserty wirusowego DNA subklonuje się ponownie do pBR322. Zdenaturowane wirusowe fragmenty restrykcyjne DNA subklonu pSC30-4 (fig. ld, omówionego w dalszej części opisu) immobilizuje się na nitrocelulozie i stosuje do izolowania mRNA (poprzez komplementarną hybrydyzację pary zasad) z cytoplazmatycznych ekstraktów RNA z komórek zakażonych HSV-1. Dwa rodzaje mRNA (3,0 kb i 1,7 kb) hybrydyzuje się z pSC30-4. Translacja tych rodzajów mRNA in vitro wykazuje, że albo mRNA o 3,0 kb albo mRNA o 1,7 kb koduje proteinę gD-Ι. Szczegóły postępowania omówiono w dalszej części i przedstawiono na fig. 1.

Plazmid pRWF6 izoluje się z transformantów E. coli i trawi enzymem restrykcyjnym SacI, w wyniku czego powstają trzy fragmenty: fragment o 6,2 kb zawierający cały wektor pBR322 plus części sekwencji DNA HSV-1, fragment o 2,9 kb DNA HSV i fragment o 1,7 kb DNA HSV-1.

W celu subklonowania fragmentów o 2,9 kb DNA HSV (patrz, fig. ld), pBR322 rozszczepia się za pomocą PvuII (który linearyzuje pBR322) i łączy w obecności łączników SacI (New England Biolabs, Inc., Beverly, Ma) stosując ligazę DNA T4. Tak więc jedyne miejsce PvuII w pBR322 przekształca się w jedyne miejsce SacI [oznaczone SacI (PvuII^<_’)]. Po rozszepieniu zmodyfikowa150 654 nego wektora pBR322 enzymem SacI, wektor ten wiąże się z fragmentem o 2,9 kb SacI DNA

HSV-1 otrzymując pSC30-4. Ten zrekombinowany plazmid stosuje się do transformowania E.

coli. Transformanty analizuje się i selekcjonuje się przez mapowanie restrykcyjne Stosując technikę mini-lizatu (Clevell i Heliński, 1970, Biochem. 9,4428).

Subklon pSC30-4 stosuje się do hybrydyzacyjnej selekcji mRNA w następujący sposób (Ricciardo i wsp. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76,4,927). Plazmid, pSC3O-4, izoluje się z transformantów E. coli, a 200/ig pSC30-4 DNA trawi się SacI w celu wycięcia insertu DNA HSV-1. Rozszczepiony plazmid ekstrahuje się mieszaniną chloroform-fenol (1 : 1) i wytrąca etanolem. Granulkę ponownie śuspenduje się w 2 ml 0,3 moli NaOH i inkubuje w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut w celu zdenaturowania DNA. Następnie zawiesinę neutralizuje się dodając 4,4 ml wody destylowanej, 0,2 ml 3 molowego HCl, 0,2 ml 1 molowego Tris-HCl (pH 7,5) i 3 ml 20 X SSC (SSC jest to 0,15 mola NaCl i 0,015 mola cytrynianu sodowego). Odczyn, mierzony papierkiem wskaźnikowym, wynosi od pH 6 do 8. Zdenaturowany, zneutralizowany DNA sączy się pod próżnią przez filtr nitrocelulozowy o grubości 25 mm (Scheicher and Schuell. Keene, Ν. H.) wstępnie namoczony w wodzie destylowanej, a potem w 6X SSC. Po filtracji próżniowej filtry nitrocelulozowe przemywa się 6 X SSC, suszy i ogrzewa w piecu w temperaturze 80°C w ciągu 2 godzin. Połowę filtru nitrocelulozowego stosuje się do hybrydyzacji w sposób opisany poniżej.

Nitrocelulozę zawierającą wirusowy DNA tnie się na małe kawałki i inkubuje z całkowitym cytoplazmatycznym RNA wyizolowanym z lizatów komórek Vero zakażonych HSV-1, wytworzono następująco. Komórki Vero zakaża się za pomocą 10 jednostek tworzących łysinki (pfu) komórkę i inkubuje się w ciągu 7 godzin w temperaturze 37°C w podłożu Dublbecco z 50jug/ml cytarabiny (arabinozydu j3-cytozyny) dodanej dla zapobieżenia replikacji DNA. Komórki poddaje się lizie za pomocą 0,65% NP-40 w 0,15 mola NaCl, 1,5 mola MgCk i 0,01 mola Tris-HCl (pH 7,9). Jądra osadza się przez wirowanie przy 3000 g w ciągu 2 minut, a ciecz znad osadu doprowadza się do końcowego stężenia 1 mmola EDTA (pH 7,9) i 0,5% SDS. Roztwór ekstrahuje się dwukrotnie mieszaniną chloroform-metanol (1 : 1) i raz chloroformem. Cytoplazmatyczny RNA wytrąca się etanolem (jedna dwustrumieniowa kolba obrotowa zawierająca komórki Vero dostarcza około 1,5 mg RNA) i częściowo suszy się. Granulkę RNA (około 0,4-0,8 mg RNA) rozpuszcza się w 400μΐ buforu hybrydyzacyjnego (50% formamid, 0,4 mola NaCl, 40 mmola PIPES (pH 6,4), 1 mmola EDTA i 1% SDS) i dodaje do pociętego filtru nitrocelulozowego. Hybrydyzację prowadzi się w temperaturze 55°C w ciągu 3 godzin we wstrząsanej kąpieli wodnej.

Kawałki filtru przemywa się 10 razy SSC zawierającym 0,5% SDS w temperaturze 60°C i następnie 2 razy 1 ml 2 mmolowego EDTA w SSC w temperaturze 60°C. Ostatecznie kawałki filtru przemywa się 2 mmolowym EDTA o pH 8,0 w temperaturze 60°C w ciągu 5 minut. Roztwór usuwa się, a kawałki filtru suszy się dokładnie wacikiem bawełnianym.

Zhybrydyzowany mRNA eluuje się z kawałków nitrocelulozy stosując formamid i ogrzewając jak następuje. Do filtrów dodaje się 120 μΐ mieszaniny 95% formamid - 10 mmoli PIPES (pH 6,5) i inkubuje się w ciągu 5 minut w temperaturze 65°C. Eluat przenosi się do mikrowirówki rurowej i pozostawia na lodzie. Do kawałków nitrocelulozy dodaje się drugą porcję 120μΐ buforu eluującego i ponownie inkubuje w temperaturze 65°C w ciągu 5 minut. Ten eluat przenosi się do drugiej mikrowirówki rurowej i pozostawia na lodzie. Do filtrów dodaje się podwielokrotną ilość 720μΐ sterylnej wody destylowanej, po czym miesza się. Następnie około 360μΐ przenosi się do każdej mikrowirówki zawierającej eluaty. Do wyeluowanego RNA w mikrowirówkach dodaje się 20μΐ 5 molowego NaCl, 5 μg odpowiedniego nośnika (np. tRNA z wątroby królika) i 1 ml absolutnego etanolu. RNA wytrąca się przez inkubowanie mieszaniny w ciągu 1 godziny w temperaturze -70°C albo przez zanurzenie probówek w zawiesinie suchy lód - C2H5OH w ciągu 20 minut. Wytrącony RNA granuluje się (10 minut przy 1200 g) w mikrowirówce, a osad z jednej probówki ponownie dysperguje się w 1 ml buforu (0,5 mola NaCl, 10 mmoli Tris—HCl (pH 7,9) i 0,5% SDS) w celu rozpuszczenia RNA. Rozpuszczony RNA dodaje się do duplikatowej probówki w celu połączenia podwielokrotnych ilości i rozpuszczenia całego wytrąconego RNA. Z rozpuszczonego RNA izoluje się poliadenylowy RNA [poli(A)RNA] metodą chromatografii stosując oligo(dT)-ceIulozę (Bethesda Research Laboratories, Inc., Rockville, Md). Z oligo(dt)-celulozy eluuje się poli(A)RNA stosując 10 mmoli Tris-HCl (pH 7,9) i 0,1% SDS jako bufory elucyjne. Poli(A)RNA wytrąca się etanolem jak to opisano uprzednio.

150 654

Izoluje się dwa rodzaje mRNA o 3,0 i 1,7 kb, które hybrydyzuje się z pSC30-4. Te dwa rodzaje poddaje się translacji in vitro stosując bezkomórkowy układ z retykulocytów królika zawierający ³⁵S-metioninę. (Pelham i Jackson, 1976, Eur. J. Biochem. 67, 247).

Ekstrakty po translacji in vitro poddaje się immunoprecypitacji za pomocą monoklonalnego przeciwciała 4S skierowanego przeciwko gD-Ι (dostarczonego przez M. Zweig'a, National Institute of Health) i przygotowuje do SDS-PAGE jak to opisano uprzednio. Analiza elektroforetyczna proteinowych produktów immunoprecypitacji wytworzonych w bezkomórkowym układzie translacyjnym wykazuje, że te wyselekcjonowane mRNA odpowiadają specyficznej proteinie gD-Ι o 50000 daltonów. Zgodnie z wielkością proteiny gD-Ι, minimalna sekwencja kodująca mRNA byłaby w przybliżeniu sekwencją o 1,6 kb. Zatem, biorąc pod uwagę liderowe sekwencje mRNA i końce poli(A) oczekuje się, że większy mRNA (3,0 kb) koduje polipeptyd gD-1.

I-2.c. Charakteryzowanie mRNA gD-Ι. Mapowanie pozycji sekwencji mRNA o 3,0kb w obrębie pSC30-4 i charakteryzowanie mRNA przeprowadza się metodą mapowania SI, to jest stosując nukleazę SI specyficzną wobec pojedynczej nici i egzonukleazę VII do mapowania regionów sondami DNA, które hybrydyzują z komplementarnymi sekwencjami mRNA (Berk i Sharp, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1274), oraz za pomocą analizy sekwencji DNA z regionu kodującego gen gD-Ι (Maxam i Gilbert, 1980, Methods in Enzymology, 65, 499).

Technika mapowania S1 wykazuje, że oba rodzaje RNA o 3,0 kb i o 1,7 kb są nie łączone (to jest nie zawierają wtrąconych sekwencji lub intronów) i że mają one różne końce 5', lecz zwykłe końce 3'. Określono sekwencję 1608 nukleotydów DNA zawierającą region kodujący przy końcu 5' o 3,0 kb mRNA i wydedukowano fazę odczytu przy translacji (ATG) najbliższego od końca 5'.

Zasada techniki mapowania SI polega na tym, że dopuszcza się do tworzenia dupleksów pomiędzy RNA i sondą znaczonego izotopem promieniotwórczym jednoniciowego DNA (ssDNA) np. otrzymaną z pSC30-4. Jeżeli RNA jest dojrzałym łączonym mRNA wówczas introny będą tworzyć pętlę ssDNA. Enzym nukleaza SI rozkłada regiony ssDNA znaczonego izotopem promieniotwórczym, które nie są zabezpieczone przez utworzenie dupleksów z RNA, podczas gdy egzonukleaza VII trawi ssDNA tylko na końcach i dlatego nie rozkłada pętli ssDNA. Porównanie wielkości DNA niewrażliwego na te nukleazy (na zasadzie hybrydyzacji z RNA) umożliwia wykrycie łączonych transkryptów mRNA.

W sposobie według wynalazku znaczony izotopem promieniotwórczym DNA stosowany do umiejscowienia końca 5' o 3kb mRNA jest fragmentem o 3,8 kb BamHI-8 (BstEII pRWF6), znaczonym za pomocą ³²P (stosując enzym, kinazę polinukleotydową, zgodnie z metodą Maxam'a i Gilberfa, patrz praca cytowana uprzednio) przy swym BstEII końcu 5' przed rozszczepieniem za pomocą BamHI. Znaczony izotopem promieniotwórczym DNA stosowany do umiejscowienia końca 3' RNA o 3,0 kb jest fragmentem Hindlll (Sali o 4,7 kb pSCS30-4 znaczonego za pomocą (³²P) stosując fragment Klenowa polimerazy DNA zgodnie z metodą Maxam'a i Gilberfa, patrz praca cytowana uprzednio), przy swym końcu 3' Hindlll przed rozszczepieniem za pomocą Sali. Cytoplazmatyczny mRNA izoluje się z komórek Vero zakażonych HSV-1 hodowanych w ciągu 7 godzin w obecności cytarabiny jak to opisano poprzednio. Stosowana technika mapowania S1 jest modyfikacją metody Berk'a i Sharp'a (Watson i wsp. 1981, J. Virol., 37, 431). Koniec 5' mRNA gD-Ι mapuje się blisko miejsca Hindlll pSCS30-4, natomiast koniec 3' mapuje się w przybliżeniu 2,0 kb z prądem (fig. Id).

Ostatecznie, DNA HSV-1 pSC30-4 sekwencjonuje się stosując metodę Maxam'a i Gilberfa. Strategię sekwencjonowania dla regionu kodującego gen gD HSV-1 pokazuje fig. 2. Sekwencjonuje się obie nici: kodującą i niekodującą. Fig. 3 przedstawia sekwencję DNA otrzymaną dla genu gD HSV-1. Jest oczywiste, że sekwencja DNA zawiera otwartą fazę odczytu złożoną z 394 kodonów rozciągających się od ATG w pozycji 241. Podejrzewano, że to miejsce jest inicjatorem genu gD-Ι i stwierdzono to przez klonowanie tej domniemanej sekwencji genu gD-Ι do wektora ekspresyjnego pJS413.

1-3. Klonowanie i ekspresja genu gD-Ι. Sekwencję kodującą gD-Ι umieszcza się pod kontrolą promotora lac. Część domniemanego genu gD-Ι (określonego tutaj jako gen gD-Ι) bez sekwencji inicjacji ATG i pierwszych 156 nukleotydów końca amino-kodującego (końca 5' genu) włącza się do ekspresyjnego wektora klonującego DNA pJS413, z wytworzeniem pEH25 (patrz fig. 4).

150 654

Częściowy gen gD-Ι włącza się tak, że sekwencja kodująca proteinę jest w prawidłowej fazie odczytu w odniesieniu do inicjacyjnego ATG wektora. W wyniku tego kolejna translacja transkrybowanego mRNA zaczyna się od sekwencji inicjacyjnej (ATG) wektora poprzez gen gD-Ι (nie zawierający swego własnego inicjacyjnego ATG i pierwszych 156 nukleotydów sekwencji kodującej gD-Ι) do naturalnego sygnału zakończenia gD-1.

Plazmidy pEH25 zawierające gen gD-Ι stosuje się do transformowania szczepu gospodarza E. coli, w którym inhibituje się transkrypcję DNA z operonu lac o ile promotor jest specyficznie indukowany. Pierwotne transformanty poddaje się badaniom na oporność na leki (gen oporności na ampicylinę jest przeniesiony do wektora) i dalej poddaje się analizie oporne klony. Struktura powstałego zrekombinowanego plazmidu pEH25 została potwierdzona przez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie DNA. Indukcja transformantów pEH25 powoduje wytworzenie polipeptydu o 46000 daltonów, który poddaje się immunoprecypitacji za pomocą albo surowic odpornościowych skierowanych przeciwko HSV albo monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko gD. Takie sposoby postępowania opisano bardziej szczegółowo w dalszej części opisu.

I-3.a. Wektor ekspresyjny pJS413. Wektor ekspresyjny pJS413 (fig. 4) jest pochodną pBR322 zawierającą gen amp^r (j8-laktamazy), promotor lac (P lac), miejsca przyłączenia rybosomów lac i cro (SD^lac i SD^cro przedstawiono odpowiednio na wszystkich figurach jako SD^Z i SC^cr0), ATG inicjacji łańcucha z 69 nukleotydami cro (cro) i zmodyfikowany gen )3-galaktozydazy (gen lac i-z, określony tutaj jako gen z). Insercja genu w prawidłowej fazie odczytu pomiędzy cro inicjacyjny ATG pJS413 i gen z (to jest w obrębie miejsc klonujących BgUI, Smal lub BamHI pJS413) pozwala na ekspresję sprzężonej proteiny w transformowanych komórkach. W niniejszym przykładzie usunięty został jednak gen z, a częściowy gen gD-Ι został połączony w fazie z inicjacyjnym ATG cro pJS413 i nukleotydami cro.

W celu przygotowania pJS413 dla insercji genu gD-Ι (patrz fig. 4), pJS413 trawi się za pomocą Smal (powstaje tępy koniec) i SacI (powstaje lepki koniec 3'). Fragment o 4,7 kb zawierający promotor, sekwencje SD, inicjacyjny ATG i częściową sekwencję cro, izoluje się przez elektroforezę żelową. Fragment o 1,8 kb zawierający koniec 5' genu z usuwa się.

1-3.b. Insercja genu gD-Ι dopJS413. Po mapowaniu genu gD-Ι w obrębie pSC30-4 fragment o

2,2 kb DNA zawierający ostatnie 1026 bp (parę zasad) karboksy-kodującego końca genu gD-1 selektywnie izoluje się z pSC30-4 przez trawienie za pomocą PvuII (powstaje tępy koniec) i SacI (powstaje lepki koniec 3' Sacl/fig. 4).

Fragment PvuII/SacI pSC30-4 o 2,2 kb i fragment Smal/SacI pJS413 o 4,7 kb łączy się w stosunku 1 : 1 stosując ligazę DNA T4 (fig. 4). Otrzymane w wyniku tego zrekombinowane plazmidy stosuje się do transformowania E. coli szczepu NF1829. Szczep NF1829 E. coli jest pochodną K-12 MC 1000 zawierającą episom F'-lac z mutacją lac 1° dla nadprodukcji represora lac. Gen lac z kodujący β-galaktozydazę obecny w episomie F'-lac dezaktywuje się przez włączenie Tn5 (transpozen). Tak więc w szczepie NF 1829 promotor lac musi być indukowany, aby uzyskać ekspresję genu włączonego do plazmidu pJS413.

I-3.c. Identyfikacja transformantów powodujących ekspresję genu gD-Ι. Plazmidy wyizolowane z opornych na ampicylinę transformantów E. coli analizuje się za pomocą mapowania enzymem restrykcyjnym i badania sekwencji DNA połączenia pomiędzy wektorem pJS413 a insertem genu gD-Ι. Plazmid pEH25 (fig. 4) ma prawidłową sekwencję nukleotydów po obu stronach połączenia Cro-Gd-1 (pokazanego na fig. 5). Plazmid ten bada się pod względem jego zdolności kierowania ekspresją polipeptydu pokrewnego gD-Ι. Ponieważ promotor lac jest transkrypcyjnie nieaktywny w NF 1829 (wskutek nadprodukcji represora lac) proteina gD-Ι mogłaby być wykryta tylko po indukcji promotora za pomocą albo 1 mmola IPTG albo 1-10 mmoli laktozy.

Klon transformowany za pomocą pEH25 bada się pod względem IPTG - specyficznej indukcji proteiny pokrewnej gD-Ι i stwierdza się, że wytwarza proteinę o 46000 daltonów składającą się z 23 aminokwasów proteiny cro (kodowanej w pJS413) i 342 aminokwasów proteiny gD-Ι (brak pierwszych 52 aminokwasów proteiny gD-Ι). Tę proteinę można poddać immunoprecypitacji za pomocą całkowitych króliczych surowic odpornościowych skierowanych przeciw HSV-1 (DAKO Chemicals, Inc., Hicksville, N. Y.) i przeciwciał monoklonalnych (1S, 4S, 55S i 57S) specyficznie skierowanych przeciwko gD HSY-l (Showalter i wsp. 1981, Infection and Immunity, 34, 684).

150 654

Monoklonalne przeciwciała 1S, 4S, 55S i 57S rozpoznają pewną ilość odrębnych miejsc w cząsteczce gD-Ι (Eisenbergi wsp., 1982, J. Virol,41,478). Godne uwagi jest to, że monoklonalne 4S jest zdolne do neutralizowania zakaźności HSV-1 i HSV-2 i wykazuje immunoprecypitację proteiny gD wytwarzanej przez oba wirusy. Proteinę wytwarzaną przez pEH25 poddaje się immunoprecypitacji przeciwciałem 4S, co wskazuje, że proteina pokrewna gD-Ι zależna od pEH25 powoduje ekspresję antygenowych determinat protein zarówno HSV-1 jak i HSV-2. W dodatku, proteinę pokrewną gD-Ι zależną od pEH25 poddaje się immunoprecypitacji monoklonalnym przeciwciałem 1S neutralizującym tylko HSV-1. Proteinę pokrewną gD-Ι zależną od pEH25 również wytrąca się monoklonalnymi przeciwciałami 55S i 57S, które nie neutralizują zaraźliwości ani HSV-1 ani HSV-2. Każdy z immunoprecypitatorów analizowano za pomocą SDS-PAGE. Szczegóły całego postępowania objaśniono dalej.

Wszystkie transformanty pEH25 hoduje się pobierając podwielokrotne ilości całonocnej kultury (faza stacjonarna) w bulionie L w temperaturze 37°C, rozcieńczając 20-krotnie bulionem M-9 i hodując w temperaturze 37°C, przy czym co 90 minut stosuje się wstrząsanie (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Gold Spring Harbor Press, New York, N. Y. 1972). W celu zbadania ekspresji proteiny gD-Ι w tych kulturach dodaje się do nich 1 mmol IPTG i 25// Ci/ml ³⁵S-metioniny (próbki kontrolne znaczono ³⁵S-metioniną, lecz ich nie indukowano). Po 60 minutach w temperaturze 37°C kultury granuluje się przez wirowanie. W celu wywołania lizy komórek i uwolnienia ich zawartości, każdą granulkę komórek ponownie suspenduje się w równej objętości buforu do lizy IP-3 (20 mmoli Tris-HCl (pH 8,1), 100 mmoli NaCl, 1 mmol EDTA, 1% NP-40 1% dezoksycholan i 0,1% SDS), szybko zamraża się w ciekłym azocie i poddaje się nadźwiękowieniu. Lizat komórkowy wiruje się przy 5000 g w ciągu 5 minut w temperaturze 4°C, ciecz znad osadu rozdziela się na ilości podwielokrotne. Do każdej takiej ilości cieczy dodaje się kontrolne surowice (surowice nieodpornościowe i surowice preodpornościowe) lub badane surowice odpornościowe (poliwalentne surowice odpornościowe skierowane przeciwko HSV-1 lub monoklonalne surowice odpornościowe skierowane przeciwko gD), po czym inkubije się w temperaturze 4°C w ciągu 60 minut. (Ilość dodanych surowic odpornościowych określa się kalibrując miano tych surowic, w testowych seryjnych rozcieńczeniach przeciwciał, przy użyciu znanej ilości antygenu).

Kompleksy odpornościowe oddziela się dodając przemyty Pansorbin (proteina A Staphylococcus aureus, Calbiochem. Behring. Corp. La Jolla, Cal.) i wirując (wszystkie operacje wirowania w tym toku postępowania prowadzi się przy 5000 g w ciągu 5 minut w temperaturze 4°C, o ile nie wskazano inaczej). Granulowany immunoprecypitat ponownie suspenduje się i przemywa IP-2 (identyczny jak IP-3, lecz z 20mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, BSA, dodanej aby wyeliminować nie swoistą adsorpcję), przemywa się dwukrotnie IP-3 i znów suspenduje w IP—1 (20 mmoli Tris-HCl (pH 8,1), lOOmmoliNaCl, 1 mmol EDTAi 1%NP-4O). Zawiesinę przenosi się do nowej probówki, w której wiruje się ją, a granulki ponownie suspenduje się w buforze z próbką żelu poliakryloamidowego SDS [Laemil, 1 Naturę 227,680 (1970)]. Po ogrzaniu w temperaturze 95°C w ciągu 3 minut próbkę wiruje się w ciągu 2 minut przy 12000g w mikrowirówce usuwając składniki nierozpuszczalne. Supernatant pobiera się i nanosi na żel poliakryloamidowy SDS (10%). Po elektroforezie proteiny barwi się niebieskim barwnikiem Coomassie, zadaje salicylanem sodu i suszy do fluorografii (Chamberlain 1979, Anal. Biochem., 98, 132). Wyniki elektroferezy przy użyciu żelu poliakryloamidowego z SDS (SDS-PAGE) jasno wykazują, że kierowana przez pEH25 proteina pokrewna gD-Ι o 46000 daltonów, tworząca się po indukcji, ulega immunoprecypitacji za pomocą pełnych króliczych surowic odpornościowych skierowanych przeciwko HSV-1 oraz monoklonalnych przeciwciał 1S, 4S, 55S i 57S.

Wreszcie, przeprowadzono doświadczenie porównawcze, aby określić wpływ lizatów komórek HeLa zakażonych HSV-1 (zakażenia dokonano tak jak to opisano uprzednio w przypadku komórek Vero) na immunoprecypitację indukowanej proteiny pokrewnej gD-Ι powstałej w E. coli NF 1829 transformowanej pEH25 (patrz fig. 6). Przygotowano seryjne rozcieńczenia lizatów kontrolnych komórek HeLa zakażonych i niezakażonych HSV-1 (zakażenia dokonano tak, jak opisano w przypadku komórek Vero). Do każdej podwielokrotnej ilości seryjnie rozcieńczonych lizatów komórek HeLa dodaje się 5//1 podwielokrotnej ilości 100-krotnie rozcieńczonego puchlinowego płynu z monoklonalnym 55S (specyficzne monoklonalne przeciwciało wobec gD-1).

150 654

Po inkubacji w temperaturze 4°C w ciągu 30 minut, do lizatów komórek HeLa dodaje się równe ilości znaczonych “S-metioniną protein z lizatów indukowanych transformantów pEH25, po czym inkubuje się je w ciągu dodatkowych 60 minut w temperaturze 4°C. Kompleksy immunologiczne oddziela się przez immunoprecypitację i analizuje stosując SDS-PAGE i fluorografię jak to opisano uprzednio. Pasmo proteiny, która uległa swoistej immunoprecypitacji, wykrawa się z żelu i mierzy się radioaktywność stosując licznik scyntylacyjny. Wyniki tych doświadczeń przedstawia fig. 6. Radioaktywność każdej próbki, charakteryzująca poddany immunoprecypitacji znaczony promieniotwórczo produkt proteinowy pEH25 wyrażono procentowo w stosunku do próbek kontrolnych. Otwarte kółka reprezentują seryjnie rozcieńczone próbki kontrolne (nie-zakażone) lizatu komórek HeLa. Prostokąty reprezentują seryjnie rozcieńczone lizaty komórek HeLa zakażonych HSV-1. Wykres jasno wykazuje, że proteiny HSV-1 z powodzeniem konkurują ze znaczoną izotopem promieniotwórczym proteiną skierowaną przeciwko pEH25 w wytwarzaniu kompleksów immunologicznych z przeciwciałem monoklonalnym 55S.

1-4. Wytwarzanie pEH4-2 kierującego wytwarzaniem sprzężonej proteiny Cro (gD-1) βgalaktozydaza. Gen gD-1 izoluje się z pEH25 tak, aby usunąć sygnał jego zakończenia. Rozszczepia się fragment DNA zawierający sekwencję genu gD-1 w miejscu restrykcyjnym poza sekwencją końcową gD-1 TAG. TAG usuwa się przez stopniowe trawienie końców za pomocą BaI31 czyli nukleazy DNA. Ten fragment genu gD-1 włącza się do pJS413 w celu zakodowania sprzężonej proteiny: Cro(gD-l)/J-galaktozydaza. Tok postępowania omówiono w dalszej części opisu i przedstawiono na fig. 7.

Plazmid pEH25 trawi się całkowicie za pomocą Nrul i stopniowo nukleazą Bal31. Powstały DNA o zmiennej długości rozszczepia się za pomocą enzymu restrykcyjnego Pstl uzyskując spektrum fragmentów, z których wiele nie zawiera kodonu zakończenia gD-1, lecz zatrzymuje większość sekwencji genu gD-1. Właściwe fragmenty DNA (1,5-1,9 kb) izoluje się za pomocą elektroforezy żelowej i eluuje jak opisano uprzednio. Wektor pJS413 trawi się całkowicie za pomocą Pstl i Smal, a właściwy fragment o 5,5 kb DNA izoluje się (fig. 7). Fragment pEH25 i fragment pJS413 łączy się w stosunku 1 : 1 i stosuje się do transformowania E. coli NF 1829. Kolonie oporne na ampicylinę bada się na wytwarzanie sprzężonej proteiny określając aktywność β-galaktozydazy na płytkach agaru wskaźnikowego (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press, New York, Ν. Y. 1972). Kolonie dodatnie bada się na obecność' sprzężonej proteiny Cro(gD-l) jS-galaktozydaza za pomocą analizy SDS-PAGE całkowitych lizatów transformantów indukowanych IPTG. Z klonów wykazujących ekspresję sprzężonych protein Cro(gD-l) /5-galaktozydaza izoluje się jeden, który bardzo wydajnie wytwarza sprzężoną proteinę o 160000 daltonów. Plazmid zawarty w tym klonie oznaczono jako pEH4-2 (fig. 7). Okazuje się, że sprzężona proteina wytworzona przez klon E. coli transformowany pEH4-2 daje się indukować za pomocą IPTG i wykazuje krzyżową immunoreaktywność z HSV-1 i HSV-2. Plazmid pEH4-2 izoluje się i analizuje przez mapowanie restrykcyjne i oznaczanie sekwencji; pEH4-2 nie zawiera miejsca BamHI i pJS413 (patrz fig. 8).

Inny izolat E. coli transformowany plazmidem oznaczonym pEH3-25 wytwarza sprzężoną proteinę Cro(gD-l) j8-galaktozydaza w mniejszej ilości niż transformant pEH4-2. Transformant pEH3-25 omówiono w dalszej części opisu.

I-4.a. Sprzężona proteina zależna od pEH4-2 reaguje immunologicznie z surowicami przeciwko HSV-1. Sprzężona proteina wytwarzana przez E. coli transformowaną pEH4-2 swoiście współreaguje z odpornościowymi surowicami króliczymi skierowanymi przeciwko HSV-1. Proteiny pEH4-2 i pEH25 indukowane IPTG oddziela się i przenosi na nitrocelulozę (nanosząc plamkę proteiny). Lizaty nie indukowanych transformantów pEH4-2 i pEH25 poddaje się takiemu samemu postępowaniu jak próbki kontrolne. Nitrocelulozę zadaje się odpornościowymi surowicami króliczymi skierowanymi przeciwko HSV-1, a następnie znaczoną ¹²⁸J odpornościową surowicą kozią skierowaną przeciwko immunoglobulinie króliczej jako sondą (Towbin i wsp. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 4350). Autoradiogramy plamek proteiny jasno wykazują, że sprzężona proteina zależna od pEH4-2 i o wartości 160000 daltonów reaguje immunologicznie z odpornościowymi surowicami króliczymi skierowanymi przeciwko HSV-1 i że proteina pokrewna gD-1 zależna od pĘH25 o 46000 daltonów, reaguje immunologicznie z odpornościowymi surowicami króliczymi skierowanymi przeciwko HSY-l.

150 654

I-4.b. Surowice odpornościowe skierowane przeciwko sprzężonej proteinie zależnej od pEH4-2 wykazują immunoprecypitację z proteinami HSV-1 i HSV-2. Surowice odpornościowe skierowane przeciwko sprzężonej proteinie zależnej od pEH4-2 okazały się immunoreaktywne z gD-1 HSV-1 i gD HSV-2 wykazując, że sprzężona proteina zależna od pEH4-2 zawiera gD swoiste antygenowe determinanty. Wykazuje to analiza SDS-PAGE protein HSV-1 i protein HSV-2 poddanych immunoprecypitacji z surowicami odpornościowymi skierowanymi przeciwko sprzężonej proteinie zależnej od pEH4-2.

Królicze surowice odpornościowe skierowane przeciwko sprzężonej proteinie zależnej od pEH4-2 wytwarza się następująco. Klony E. coli transformowane pEH4-2 hoduje się do środkowej fazy logarytmicznej i indukuje za pomocą 1 mmola 1PTG. W cztery godziny po indukcji bakterie granuluje się przez wirowanie, poddaje się lizie buforem z próby SDS-PAGE i nanosi na preparatywne żele SDS-poliakryloamidowe. Po elektroforezie, proteiny uwidacznia się barwiąc zewnętrzne przejścia niebieskim barwnikiem Coomassie, po czym wycina się z żelu pasmo sprzężonej proteiny o wartości 160000 daltonów. Kawałki żelu zanurza się w ciekłym azocie, miele na proszek i ponownie suspenduje w PBS, po czym dodaje się równą objętość kompletnego adiuwantu Freunda. Po dokąadnym wymieszaniu roztwór wstrzykuje się podskórnie dwóm nowozelandzkim królikom (016 i 019). Każdemu królikowi wstrzykuje się 25-50//g proteiny. Po 28 dniach królikom podaje się taką samą ilość sprzężonej proteiny suspendowanej w niekompletnym adiuwancie Freunda. Zwierzętom podaje się ją jeszcze dwukrotnie co 10 dni. Surowicę, pobraną z krwawiącego ucha w 55 dni po początkowym wstrzyknięciu, stosuje się do analizy immunoprecypitacyjnej.

Immunoprecypitację prowadzi się następująco. Komórki w hodowli w zlewającej się warstwie zakaża się HSV przy użyciu 10 pfu (komórkę) 10 jednostek tworzących łysinki (komórkę) i znaczy ³⁵S-metioniną 16 godzin po zakażeniu [komórki GBK (Georgia Βονϊηο Kidney - nerka bydlęca z Georgii) i zakaża się HSV-1, matomiast komórki HeLa zakaża się HSV-2; komórki Vero zakaża się albo HSV-1 albo HSV-2]. Lizaty znaczonych ³⁵S-metioniną komórek zakażonych HSV inkubuje się z 10 ml albo preodpornościowych surowic króliczych, odpornościowych surowic króliczych skierowanych przeciwko sprzężonej proteinie zależnej od pEH4-2 (np. surowice odpornościowe 018 lub 019) albo z Ipl monoklonalnego przeciwciała 4S. Kompleksy odpornościowe oddziela się stosując Pansorbin jak opisano powyżej, a otrzymane znaczone izotopem promieniotwórczym i poddane immunoprecypitacji proteiny rozpuszcza się w SDS-PAGE i poddaje fluorografii. Wyniki analizy metodą SDS-PAGE wykazują, że: (1) proteina gD o wartości 52000 daltonów wytwarzane przez komórki GBK lub komórki Vera zakażone HSV-1 jest immunoreaktywna z surowicami odpornościowymi skierowanymi przeciwko sprzężonej proteinie wytworzonej przez transformanty pEH4-2 i z monoklonalnym przeciwciałem 4S.

Wyraźnie niższa masa cząsteczkowa gD pochodzącej z HSV-2 w porównaniu z masą gD pochodzącą z HSV-1 jest zgodna z opublikowanymi obserwacjami (Ruyechan i inni, 1979, J. Virol. 29, 677). Wyniki fluorografn wykazują, że proteina gD wytwarzana przez komórki zakażone HSV-1 lub HSV-2 jest immunoreaktywna z surowicami odpornościowymi skierowanymi przeciwko sprzężonej proteinie wytworzonej przez transformanty pEH4-2.

1-4. c. Surowice odpornościowe skierowane przeciwko pEH4-2 neutralizują zakażenie HSV-1 i HSV-2 in vitro. Surowice odpornościowe królicze skierowane przeciwko sprzężonej proteinie pEH4-2, uzyskiwanemu w reakcji łączenia, analizowano także pod kątem jej zdolności do neutralizacji zakaźności wirusa. Neutralizację wirusa badano określając zmniejszenie liczby łysinek w zakażonych komórkach kultury tkankowej (Showatter i inni, 1981, Infection and Immunity 34:684). W tym celu 50 do 100 pfu HSV-1 lub HSV-2 preinkubowano z rozcieńczonymi preodpornościowymi surowicami (kontrola), odpornościową surowicą (018 lub 019) lub przeciwciałem monoklonalnym 4S, w obecności lub nieobecności aktywnego dopełniacza surowicy (C'). Komórki Vero zakażono tak przygotowanymi preparatami HSV-1 lub HSV-2. Po trzech lub czterech dniach policzono łysinki HSV i oznaczono wpływ surowicy odpornościowej na zmniejszenie liczby łysinek. Wyniki zamieszczone w tabeli 1 wskazują, że odpornościowa surowica każdego królika jest zdolna do neutralizacji HSV-1 i HSV-2 in vitro. Neutralizacja występuje w nieobecności aktywnego dopełniacza, chociaż jego obecność powodowała znaczny wzrost aktywności neutralizacyjnej. Neutralizacja ta była bardziej skuteczna wobec HSV-1 niż wobec HSY-2.

150 654 21

Tabela 1

Neutralizacja HSV przez przeciwciała przeciw sprzężonej proteinie zależnej od pEH4

Przeciwciało	Neutralizacja¹
HSV-1	HSV-2
018	-C'	+c -c	+ C -
	128	768 8 512² 200+²	32
019	128	512 12 256² 200²	32
Monoklonalne 4S	20000 +	20000 + 20000 +	20000+

1. Surowicę z królików 018 i 019 badano pod względem neutralizacji wirusa w obecności 5% deaktywowanego termicznie dopełniacza (56°C przez 30 minut,-C) lub aktywnego dopełniacza ze świnki morskiej ( + C) na jednocząsteczkowej warstwie komórek Vero. Liczby oznaczają miano przeciwciała podane jako odwrotność rozcieńczenia surowicy, przy którym liczba łysinek ulega zmniejszeniu o 50%.

2. W tych próbach stosowano komórki GBK zamiast komórek Vero.

Przedstawione wyniki wykazują użyteczność sprzężonej proteiny zależnej od pEH4-2 w szczepionce podjednostkowej przeciwko HSV-1 i HSV-2.

I-4.d. Rekonstrukcja genu gD-Ι w pEH4-2. Do rekonstrukcji genu gD-Ι użyto plazmidów pJS413 i pRWF6 (fig. 8). Zgodnie z tym pRWF6 strawiono Hindlll i Bal31, aby otrzymać spektrum o przypadkowej wielkości fragmentów z tępymi końcami. Fragmenty strawiono SacI i wydzielono fragmenty tępy koniec/SacI w zakresie pomiędzy 2,2 i 2,4 kb. Fragmenty te zawierały różnej długości amino-kodujący koniec genu gD-Ι (patrz fig. 8).

Fragmenty gD-Ι subklonowano do pJS413. W tym celupJS413 strawiono Smal (co dało tępy koniec) i SacI (co dało lepki koniec SacI-3'). Fragment Smal/SacI pJS413 o 4,7 kb połączono w stosunku 1:1 z fragmentem tępy koniec/SacI pRWF6 o 2,2-2,4 kb i użyto do transformacji E. coli szczep NF 1829. W wyniku uzyskano populację klonów transformowanych plazmidami, które zawierały gen gD-Ι z przypadkowymi „delecjami na jego amino-kodującym końcu (fig. 8). Wszystkie 24 plazmidy, oznaczono jako pEH50 + x (gdzie x oznacza liczbę 1-24) o około 7kb analizowano za pomocą mapowania miejsc rozpoznania enzymów restrykcyjnych. Te, które zawierały miejsce PvuII wewnątrz genu gD-1 (19 z 24 transformantów) analizowano dalej w celu zidentyfikowania klonu zawierającego największą część amino-kodującego końca genu gD-Ι. W całkowitej sekwencji genu gD-Ι odległość pomiędzy miejscem inicjacji ATG gD i wewnętrznym miejscem PvuII wynosi 156 par zasad. Tak więc każdy z 19 plazmidów pEH50 + x strawiono Bglll i PvuII, otrzymane fragmenty rozdzielono metodą elektroforezy na żelu w celu określenia rozmiaru fragmentu BglII/PvuII. Zidentyfikowano 15 plazmidów pEH50 + x zawierających fragment BglII/PvuII mniejszy niż 150 par zasad, tzn. punkt końcowy trawienia Bal31 przedstawiony na fig. 8 znajdował się pomiędzy inicjacyjnym ATG gD i miejscem PvuII. Te 15 plazmidów poddano badaniom sekwencji w celu precyzyjnego określenia miejsca ich łączenia z plazmidem pJS413. Siedem plazmidów: pEH51, pEH60, pEH62, pEH66, pEH71, pEH73 i pEH74 zawierało sekwencję gD-Ι połączoną w fazie z translacyjną fazą odczytu ero ATG pJS413 (patrz fig. 3, w której miejsca połączenia oznaczono odpowiednim numerem pEH i pionową strzałką). W rzeczywistości pEH51 koduje wszystkie, z wyjątkiem sześciu pierwszych, aminokwasy z aminowego końca gD-Ι. Transformanty pEH51, pEH60, pEH62 i pEH71 zaznaczone ³⁵S-metioniną z indukcją IPTG lub bez niej i lizaty komórkowe traktowano monoklonalnym przeciwciałem 55S, immunoprecypitaty analizowano metodą SDS-PAGE jak opisano poprzednio. Transformanty zawierające pEH51, pEH60, pEH62 lub pEH71 wytwarzały proteinę o 46000 daltonów, która strącała się z monoklonalnym 55S.

Zrekombinowane plazmidy kodujące sprzężone proteiny wytworzono stosując aminokodujący koniec pEH51 do rekonstrukcji amino-kodującego końca sekwencji genu gD-Ι obecnego w pEH4-2 (patrz fig. 9). Plazmid pEH4-2 trawiono Pstl i SacII i wydzielono fragment o 6,2 kb zawierający częściowy gen gD-l/j8-galaktozydaza. Plazmid pEH51 uległ całkowitemu trawieniu przez Pstl, ale częściowemu przez SacII. Fragment Pstl/SacII plazmidu pEH51 o 1,25 kb połą22

150 654 czono w stosunku 1 : 1 z fragmentem Pstl/SacII plazmidu pEH4-2 o 6,2 kb, otrzymując pEH82. Transformanty zidentyfikowano badając aktywność /J-galaktozydazy, jak opisano poprzednio. Transformanty E. coli zawierające plazmid pEH51 oznaczono E.coli szczep WW51, transformanty zawierające plazmid pEH82 oznaczono E. coli szczep WW82.

Pokazano, że w E. coli można wytwarzać znaczne ilości sprzężonej proteiny gD-Ι HSV. Proteiny te są bardzo stabilne może ze względu na ich konstrukcję lub też ze względu na ich oddzielanie się w postaci gęstych, nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych o dużej gęstości. Pokazano, że taką sprzężoną proteinę można wyekstrahować w E. coli i użyć do uodpornienia zwierząt. Tak utworzona odpornościowa surowica jest zdolna do neutralizowania wytwarzania łysinek in vitro przez HSV-1 i HSV-2.

1-5. Otrzymywanie pEH90-10am LE392, który wytwarza zarówno Cro/gD-1 jak i sprzężoną proteinę Cro/gD-1//J-galaktozydaza. Skonstruowano zrekombinowany plazmid pEH90-10am, który może kierować wytwarzaniem zarówno sprzężonej jak i niesprzężonej proteiny pokrewnej gD-Ι w odpowiednich komórkach-gospodarzach (patrz fig. 10).

Plazmid pEH90-10am wywodzi się z serii zrekombinowanych plazmidów ρΕΗ-90-Ν, która z kolei wywodzi się z pEH3-25, kodującego sprzężoną proteinę Cro(gD-l) /J-galaktozydaza (patrz fig. 3 i fig. 10). Seria ρΕΗ-90-Ν jest podobna do pEH4-2 w tym, że translacyjne fazy odczytu ero, gD-Ι i genu z są w fazie, jednakże seria ρΕΗ-90-Ν zawiera dodatkowo unikalne sekwencje rozpoznawane przez restrykcyjne endonukleazy zlokalizowane na połączeniach genu gD-Ι i genu z.

Zrekombinowany plazmid wydzielony z jednego z transformantów serii ρΕΗ-90-Ν, oznaczony pEH-90-10, modyfikowano dalej w sposób następujący: (1) rozszczepiono pEH-90-10 na połączeniu sekwencji genu gD-Ι i sekwencji genu z, (2) pEH-90-10 połączono następnie w obecności sekwencji łącznikowych DNA zawierających sekwencję zakończenia łańcucha typu „amber“ TAG. Otrzymany zrekombinowany plazmid pEH-90-10am zawiera sekwencję zakończenia łańcucha typu „amber“ w fazie z translacyjnymi fazami odczytu zarówno genu gD-Ι jak i genu z. Kiedy pEH90-10am zastosowano do transformacji E. coli NF 1829 uzyskane oporne na ampicylinę transformanty nie wytwarzały wykrywalnych ilości sprzężonej proteiny. Jednak gdy transformant pEH90-10am zakażono lizogennym fagiem transdukującym 0 80 Sulli niosącym gen supresorowy tRNA typu amber, to wtedy indukowane transformanty wytwarzały sprzężoną proteinę Cro(gD-l)/J-galaktozydaza. Lizogeny te oznaczono jako pEH90-10am Sulli.

Alternatywnie plazmid pEH90-10am zastosowano do transformacji E. coli LE392, nosiciela dwóch mutacji supresora typu amber (supE i supF). Transformanty pEH90-10am LE392 wytwarzały sprzężoną proteinę Cro(gD-l) /5-galaktozydaza w warunkach indukcji jak i bez indukcji (komórki LE392 nie mają mutacji lac 1° NF 1829, która prowadzi do nadprodukcji represora lac). Analiza metodą SDS-PAGE protein wytworzonych przez transformanty pEH90-10am LE392 wykazała, że powstaje zarówno sprzężona proteina (około 160000 daltonów) jak i proteina niesprzężona spokrewniona z gD-Ι (około 38000 daltonów), przy czym obie proteiny reagują immunologicznie z surowicą odpornościową królika przeciwko HSV-1. Wydaje się, że transformanty pEH90-10am LE392 wytwarzają obie proteiny w przybliżeniu w równomolowych ilościach i że te proteiny wspólnie oczyszcza się po wydzielaniu za pomocą niedenaturacyjnej metody oczyszczania agregatów. Szczegóły tej metody opisano poniżej.

1-5.a. Wytwarzanie serii ρΕΗ-90-Ν. Jak już podano poprzednio, transformanty pEH3-25 wytwarzają sprzężoną proteinę Cro(gD-l) /J-galaktozydaza, chociaż w ilościach mniejszych niż transformanty pEH4-2. Zrekombinowany plazmid pEH3-25 przypomina pEH4-2 z tym, że pEH3-25 zawiera transmembranową sekwencję gD-Ι (patrz fig. 3). Obecność tej sekwencji może stanowić przyczynę niewystarczającej ekspresji sprzężonej proteiny w transformantach komórekgospodarzy.

Wektor ekspresji pHK414 (fig. 10) jest pochodną pJS413. W rzeczywistości pHK414 zawiera wszystkie elementy pJS413, ale różni się miejscami klonowania usytuowanymi po obu stronach połączenia cro-z. Miejscami klonowania pHK414 są: Bglll, Hindlll, Smal, BamHI. Gen z nie jest w fazie z ero ATG, a więc nienaruszony plazmid nie kieruje wytwarzaniem jS-galaktozydazy. Jednak gdy do któregokolwiek z miejsc klonowania plazmidu wprowadza się fragment DNA o wystarczającej długości (3n + 2), faza odczytu genu-z przystosowuje się względem cro-ATG i w

150 654 przypadku, gdy wprowadzona sekwencja DNA nie zawiera sygnałów zakończenia (np. TGA, TAA lub TAG) będących w fazie z croATG lub genem z, transformanty komórek-gospodarzy wytwarzają proteinę sprzężoną β-galaktozydazę.

Serię pEH90-N uzyskano w następujący sposób (patrz fig. 10): pEH3-25 trawiono najpierw BamHI, rozszczepiony plazmid potraktowano następnie Bal31 w celu usunięcia sekwencji transmembranowej gD-Ι na końcu karboksy-kodującym. Po strawieniu Bal31,pEH3-25 rozszczepiono przy użyciu Pstl i stosując elektroforezę na żelu agarozowym wydzielono populację fragmentów DNA o 1,7-1,9 kb scharakteryzowanych przez lepki koniec Pstl amino-kodujący genu amp^r, promotor lac i elementy kontroli translacji, gen gD-Ι z delecją całkowitą lub częściową sekwencji transmembranowej oraz tępy koniec (BamHI^/-/.

Ekspresyjny plazmid pHK414 rozszczepiono najpierw Bglll i lepkie końce Bglll uzupełniono stosując fragment Klenowa polimerazy DNA. Liniowy pHK414 o tępym końcu trawiono następnie Pstl i stosując elektroforezę na żelu agarozowym wydzielono fragment DNA o 5,5 kb charakteryzujący się tępym końcem (BglII^/-/), genem z, karboksy-kodującym końcem genu amp^r oraz lepkim końcem Pstl.

Fragmenty DNA PstI/BamHI^/-/ o 1,7-1,9 kb wywodzące się z pEH3-25 i fragment DNA BglII^/-//PstI o 5,5 kb wywodzący się z pHK414 łączono w stosunku molowym 1:1 stosując ligazę DNA T4. Uzyskaną populację plazmidów, oznaczonych pEH90-N stosowano do transformacji E. coli NF1829 hodowanych na płytkach agarowych.

Następujące zrekombinowane plazmidy wywodzące się od 10 z 24 transformantów wytwarzających sprzężoną proteinę analizowano określając sekwencję DNA po obu stronach gD-Ι (gen z) (patrz fig. 3), pEH90-2, pEH90-3, pEH90-4, pEH90-5, pEH90-6, pEH90-7, pEH90-9, pEH90-10, pEH90-ll i pEH90-12. Wszystkie, z wyjątkiem pEH90-12, wykazują delecję całości lub części sekwencji transmembranowej, przy czym pEH90-4 i pEH90-5 zawierają w przybliżeniu połowę tej sekwencji. Każdy z tych plazmidów, z wyjątkiem pEH90 —12, kierował wytworzeniem sprzężonej proteiny Cro(gD-l) /)-galaktozydaza na wysokim poziomie, takim jak pEH4-2. Do następnego etapu postępowania wybrano plazmid pEH90-10 (sprzężona proteina gD-Ι wytwarzana przez transformanty pEH90-10 jest identyczna jak wytwarzana przez transformanty pEH4-2 z wyjątkiem tego, że w sprzężonej proteinie wytwarzanej przez transformanty pEH90-10 brakuje 4 końcowych aminokwasów gD-Ι wytwarzanego przez transformanty pEH4-2).

I-5.b. Wytwarzanie pEH90-10am. W celu wprowadzenia sekwencji zakończenia łańcucha typu „amber“ pomiędzy sekwencję gD-Ι i genu-z plazmidu pEH90-10 zastosowano następujący sposób postępowania (patrz fig. 10). pEH90-10 rozszczepiono przy użyciu Hindlll, a następnie BamHI, co doprowadziło do rozszczepienia plazmidu w jego miejscach rozpoznawanych przez restrykcyjne endonukleazy, znajdujących się przy połączeniu pomiędzy genem gD-Ι i genem-z (patrz poniżej):

Hindlll SmalBamHI

Gd-l:GA.TCT.AAG.CTT.CCClGGGtGAT.CCA.AGA.TCC:i-z

CT.AGA.TTC.GAA.GGG.CCC.CTA.GGT.TCT.AGG.

Hindlll/BamHI gD-1 :GA.TCT. A I GAT.CCA. AGA.TCC:i-z

CT.AGA.TTC.GA? GT.TCT.AGG

Rozszczepiony plazmid Hindlll/BamHI o 7,3 kb wydzielono metodą elektroforezy na żelu agarozowym i połączono (przy użyciu ligazy DNA T4) z łącznikiem DNA charakteryzującym się obecnością lepkich końców Hindlll/Bglll, wewnętrznego miejsca Xbal i sekwencji typu „amber“ (TAG): “

Xbąi ag.ctc|tag]acg.

G.ATC.TGC.CTA.G.

Każdą komplementarną nić łącznika DNA zsyntetyzowano metodą fazy stałej opisanej przez Chow i innych (Nucleic Acids Res. 9/12/: 2807-2817,1981). Po ligacji łącznika do rozszczepionego

150 654 plazmidu otrzymane zrekombinowane plazmidy rozszczepiono Xbal, metodą elektroforezy na żelu agarozowym wydzielono liniowe fragmenty DNA o 7,3 kb i przywrócono im postać kolistą przez łączenie ligazą DNA T4 (wybraną dla plazmidów pEH90-10, które zawierają łącznik pomiędzy miejscami Hindlll: BamHI przy połączeniu gD-Ι (z zaznaczonym obecnością pojedynczego miejsca Xbal w plazmidzie). W wyniku łączenia sekwencja typu „amber łącznika DNA jest w fazie z translacyjną fazą odczytu gD-Ι i genu-z (patrz poniżej).

Hindni^/_'XbaI ' BamHI' gD:GA-TCT-AAGCTClTAGlACGi}AT.CCAAGA.TCC:i-z CT.AGA.TTC.GAG.ATC.TGC.CTA.GGT.TGT.AGG.

Otrzymany plazmid oznaczono pEH90-10am.

I-5.c. Transformanty pEH90-10am. Plazmidu pEH90-10am użyto do transformacji E. coli NF1829. Po indukcji IPTG transformanty oporne na ampicylinę nie wytwarzały wykrywalnych ilości sprzężonej proteiny (brak czerwonych kolonii na wskaźnikowych płytkach agarowych MacConke/a). Transformanty zakażono następnie lizogennym fagiem transdukującym 0 80 Sulli, nosicielem genu supresorowego tRNA typu amber. Zlizogenizowane transformanty indukowane IPTG tworzyły czerwone kolonie na płytkach MacConke/a, co wskazywało na wytwarzanie sprzężonej proteiny. Lizogeny te oznaczono pEH90-10am SuM.

Plazmidu pEH90-10am użyto również do transformacji E. coli LE392, która zawiera dwa supresory typu amber (supE i supF), ale nie ma mutacji lac I°NFI829, co powoduje, że nie występuje nadprodukcja represora lac. Transformanty te, oznaczone pEH90-10am LE392 wytwarzały sprzężoną proteinę zarówno przy indukcji jak i bez indukcji IPTG.

I-5.d. Analiza protein wytwarzanych przez transformanty pEH90-10am LE392. Transformanty pEH90-10am LE392 wytwarzają sprzężoną proteinę (o 160000 daltonów) i proteinę o 38000 daltonów w ilościach w przybliżeniu równomolowych. Stwierdzono, że każda z tych protein jest immunoreaktywna z surowicą odpornościową królika skierowaną przeciwko HSV-1. W tym celu proteiny komórkowe wydziela się stosując metodę miniagregatów (opisaną poniżej), rozdziela się je metodą SDS-PAGE i przenosi na nitrocelulozę, potraktowaną następnie surowicą odpornościową królika skierowaną przeciwko HSV-1, a potem surowicą odpornościową kozy znakowaną ^12SJ skierowaną przeciwko immunoglobulinie królika (Towbin i inni, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350).

Do wydzielania agregatów komórek-gospodarza w celu analizy zastosowano poniższą metodę miniagregatów:

(1) Podwójne probówki do hodowli zawierające 5 ml świeżego bulionu Luria zawierającego lOOpg/ml ampicyliny zainkulowano 200pl komórek uzyskanych z całonocnej hodowli i hodowlę prowadzono przez 90 minut w temperaturze 37°C. Jedną z każdej pary probówek indukowano dodatkiem 1 mmola IPTG (stężenie końcowe). Szczepom pozwolono wzrastać przez dalsze 5 godzin w temperaturze 37°C, przy czym były one wytrząsane.

(2) Komórki zawarte w 3 ml podwielokrotnej części hodowli oddzielono drogą odwirowania w wirówce (12000 xg) przez 2 minuty (Μ. B. ponieważ całkowita objętość probówki mikrowirówki wynosi l,5pl, to najpierw odwirowano pierwszą porcję o objętości l,5pl podwielokrotnej części hodowli i usunięto ciecz znad osadu, potem dodano l,5pl podwielokrotnej części hodowli do tej samej probówki mikrowirówki i poddano je odwirowaniu w tej samej probówce).

(3) Granulki komórek suspendowano ponownie w 50pl 25% roztworu sacharozy zawierającego 50 mmoli Tris-HCl, pH 8 i zawiesinę zamrożono poprzez umieszczenie probówki w łaźni suchy lód/etanol.

(4) Zamrożoną zawiesinę rozmrożono, dodano 50pl roztworu 10 mg/ml lizozymu w 0,25 moli Tris-HCl, pH8 i zawiesinę inkubowano przez 10-15 minut na lodzie.

(5) Po 10-15 minutach inkubacji dodano 400pl buforu TET (100 mmoli Tris-HCl, pH 8,50 mmoli EDTA, 2% TritonX-100) (TritonX-100 jest detergentem niejonowym polioksyetylen/9-10/p-III-rz.-oktylofenol), po czym zawiesinę delikatnie mieszano i inkubowano przez 5 minut na lodzie. Następnie dodano 500 ml 2 X RIPA (RIPA jest to 20 mmoli Tris-HCl, pH 7,4,300 mmoli NaCl, 2% dezoksycholan sodowy, 2% NP-40,0,2% SDS) i zawiesinę mieszano łagodnie i inkubowano przez 5 minut na lodzie.

150 654 (6) Komórki w zawiesinie poddano nadźwiękawieniu przez 10 sekund stosując mikrosondę i zawiesinę sklarowano przez odwirowanie w wirówce Sorvoll S634 przez 30 minut przy 20000 obr/min (47800 xg).

(7) Ciecz znad osadu zdekantowano i granulki zawierające koagregaty protein suspendowano ponownie w 50 ml wody destylowanej, do której dodano 50μ\ 2XSample Buffer (2XSample Buffer składa się z: 10% SDS, 40 mmoli Tris-HCl, pH 6,8,2% j8-ME i 0,02 objętości nasyconego roztworu błękitu bromofenylówego) i dobrze mieszano. Mieszaninę gotowano przez 5 minut i 25 μ\ podwielokrotnej części próbki naniesiono na 10% żel SDS-poliakryloamidowy do elektroforezy. Po oddzieleniu protein metodą SDS-PAGE przeniesiono je na nitrocelulozę (to znaczy zrobiono plamę proteinową). Nitrocelulozę poddano działaniu odpornościowej surowicy królika skierowanej przeciwko HSV-1, a następnie jako sonda surowicy odpornościowej kozy znakowanej ¹²⁵J skierowanej przeciwko immunoglobulinie królika f^owbin, 1979 supra).

Autoradiogramy plamek protein wyraźnie ukazują, że 2 pasma reagują immunologicznie z przeciwciałami przeciw HSV-1, proteina sprzężona o 160000 daltonów (Cro-gD-l//ł-galaktozydaza) i proteina pokrewna gD-Ι o 38000 daltonów (Cro/gD-1) lub proteina nie sprzężona gD (nie sprzężona z /J-galaktozydazą). Tak więc proteinę nie sprzężoną można oczyścić wraz z proteiną sprzężoną, gdy do ich rozdziału stosuje się metodę koagregatów, a zarówno proteina nie sprzężona gD-Ι (Cro/gD-1), jak i proteina sprzężona (Cro/gD-l/jS-galaktozydaza) reagują immunologicznie z surowicą odpornościową przeciw HSV.

Przykład II. Wytwarzanie gD HSV-2.

Porównano mapę genomowąHSV-l i HSV-2. Lokalizację sekwencji kodującej gD w genomie HSV-2 określono przez analogię do pozycji i rozmiaru gD w genomie HSV-1. Fragment Bglll L regionu Us w HSV-2 wprowadzono do pBR322 w celu utworzenia zrekombinowanego plazmidu pHVl. Sekwencję kodującą gD-2 zawartą w pHVl zlokalizowano przez hybrydyzację stosując jako sondę hybrydyzacyjną część gD-Ι DNA otrzymaną z pSC30-4. Część pHVI zawierającą sekwencję kodującą gD-2 subklonowano do pBR322 w celu wytworzenia zrekombinowanego plazmidu pHV2. Oznaczono sekwencję DNA genu gD-2 zawartego w pHV2 i porównano ją z sekwencją gD-Ι. Sekwencja DNA gD-2 jest o jeden kodon krótsza niż gD-Ι, jednak wykazują one znaczne podobieństwa.

Aby umieścić gen gD-2 pod kontrolą promotora lac, z pHV2 wyodrębnia się część sekwencji genowej gD-2 bez pierwszych 120 nukleotydów sekwencji kodującej proteinę. Ten fragment DNA przyłącza się do małego fragmentu DNA kodującego promotor lac i elementy kontroli translacji. Otrzymany zrekombinowany plazmid, pHV5, kieruje wytwarzaniem proteiny pokrewnej gD-2 w transformantach komórek-gospodarzy.

W końcowym etapie fragment genu gD-2 wydziela się z pHV5 poprzez rozszczepienie restrykcyjną endonukleazą w specyficznych miejscach tak, że ulega delecji sekwencja zakończenia (TAG) sekwencji kodującej gD-2. Ten fragment DNA, który zawiera część genu gD-2, promotor plazmidu ekspresyjnego i elementy kontroli przyłącza się do pHK414, wektora zawierającego sekwencję kodującą /J-galaktozydazę. Otrzymany zrekombinowany plazmid, pHV6, zawierający sekwencję kodującą gD-2 zawartą pomiędzy plazmidowym promotorem lac z cro SD-ATG i genem βgalaktozydazy kieruje ekspresją sprzężonej proteiny w transformantach E. coli. Sprzężoną proteinę pHV6 wydziela się z lizatów komórek-gospodarzy i formułuje do użycia jako immunogen. Szczegółowy opis każdego etapu tej konstrukcji zamieszczono poniżej.

II-1. Ogólny sposób postępowania stosowany przy wytwarzaniu plazmidów. O ile nie określono inaczej, ogólne sposoby opisane w przykładzie I stosowano do wydzielania DNA, w reakcjach enzymów i reakcjach łączenia używanych przy klonowaniu gD-2.

II-1.a. Bufory dla enzymów restrykcyjnych. Bufor stosowany w trawieniu Smal składa się z: 6,6 mmoli Tris-HCl (pH 7,4), 6,6 mmoli MgCU i 6,6 mmoli y3-ME. Bufor stosowany w trawieniu Bglll, Ciał, EcoRI lub Pstl składa się z: 60 mmoli NaCl, 6,6 mmoli Tris-HCl (pH 7,4), 66,6 mmoli MgCk i 6,6 mmoli j8-ME. Bufor stosowany do trawienia BamHI, Sali lub Xhol składa się z: 150 mmoli NaCl, 6,6 mmoli Tris-HCl (pH 7,4), 6,6 mmoli MgCk i 6,6 mmoli/J-mE. Należy zauważyć, że kiedy przeprowadza się trawienie w dwóch lub więcej reakcji z endonukleazami restrykcyjnymi reakcja w buforze o niskiej zawartości soli przebiega przed reakcją w buforze o wysokiej zawartości

150 654 soli. Jeśli dwa enzymy wymagają użycia tego samego buforu, wówczas reakcje można prowadzić jednocześnie.

II-2. Lokalizacja i wydzielanie genu gD-2. Jak wyjaśniono poprzednio, porównano mapy genomowe HSV-1 i HSV-2 w celu określenia przybliżonej pozycji i wielkości gD w genomie HSV-2 (patrz fig. 1 la). Gen gD-2 znajduje się pomiędzy 0,9-0,95 jednostek mapy genomowej zawartych w regionie Us, który z kolei zawiera się wewnątrz fragmentu Bglll L o 8,5 kb. Fragment Bglll L wycięto z DNA HSV-2 i włączono do pBR322 do dalszej analizy.

II-2.a. Konstrukcja pHV-l zawierającego gen gD-2. Genomowy DNA HSV-2 (szczep G) trawiono Bglll i metodą elektroforezy w żelu agarozowym wydzielono fragment DNA o około 8,5 kb zawierający gen gD-2. Plazmid pBR322 całkowicie strawiono BamHI. Otrzymany DNA pBR322 o 4,4 kb i fragment Bglll L DNA HSV-2 o 8,5 kb złączono (lepkie końce BamHI i lepkie końce Bglll są komplementarne) i połączono w stosunku 1:1, co dało pHVl (fig. Ilb).

II-2.b. Lokalizacja specyficznej sekwencji kodującej mRNA genu gD-2. Sekwencję kodującą mRNA genu gD-2 zlokalizowano w pHVl przez hybrydyzację (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98: 503) stosując jako sondę hybrydyzacyjną część DNA gD-1 otrzymanego z pSC3O-4. (Sposób postępowania przy przenoszeniu metodą Southeręa opisał Maniatis i inni, 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 382-389). Zgodnie z tym, pHV-l rozszczepiono Xhol i otrzymane fragmenty DNA rozdzielono metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Fragmenty DNA w żelu następnie zdenaturowano alkaliami, zobojętniono i przeniesiono na filtr nitrocelulozowy. Fragmenty DNA przyłączone do filtru hybrydyzowały następnie z sondą gD-1 znakowaną “P. Sondę gD-1 znakowaną “P otrzymano jak następuje: pSC30-4 (fig. ld i fig. 4) rozszczepiono PvuII i fragment DNA genu gD-1 o 500 par zasad zawierający pierwsze 52 kodony (156 nukleotydów) wydzielono drogą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym. DNA gD-1 znakowano radioaktywnie poprzez translację typu nick (BRL Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Translacja typu nick to metoda wyboru do znakowania in vitro nadającego podwójnemu DNA wysoką aktywność radiospecyficzną.

Metoda ta wykorzystuje dwie spośród kilku aktywności polimerazy I E. coli, aktywność egzonukleazy 5' do 3' i aktywność polimerazy 5' do 3'. W translacji typu nick enzym łączy się z bruzdą w jednej nici dupleksowego DNA. Aktywność egzonukleazy 5' do 3' powoduje następnie hydrolizę nukleotydu nici z bruzdą, przed postępującą polimerazą. W ten sposób bruzda przesuwa się (przenosi) wzdłuż nici. Ponieważ szybkość hydrolizy jest równa szybkości polimeryzacji w wyniku ostatecznym synteza nie zachodzi. Jednakże w trakcie tej reakcji wymiany, radioaktywne trójfosforany dezoksynukleotydów obecne w mieszaninie reakcyjnej wchodzą do DNA (Kelly i in., 1970, J. Biol. Chem. 245,39). Dupleks DNA gD-1 znaczony ³²P zdenaturowano, aby użyć go jako jednoniciową sondę (patrz Maniatis i in., Molecular Cloning. A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratories, str. 109-112).

Jak wykazała autoradiografia fragment Xhol/Xhol DNA pHVl o około 2,3 kb był komplementarny do radioaktywnej sondy gD-1, a zatem zawierał sekwencję kodującą gD-2.

Fragment Xhol/Xhol DNA pHVl subklonowano następnie do pBR322 w celu dalszego charakteryzowania sekwencji kodującej gD-2. W tym celu pHVl strawiono Xhol i fragment DNA o 2,3 kb zawierający sekwencję kodującą gD-2 złączono i połączono w stosunku 1:1 z liniowym pBR322, który uprzednio rozszczepiono Sali (lepkie końce tworzon przez Sali są komplementarne do lepkich końców tworzonych przez Xhol) wytwarzając pHV2 (fig. 1 lc).

II-2.C. Charakteryzacja sekwencji kodującej mRNA gD-2. Metodą Maxama i Gilberta (1980, Methods in Enzymology, 65:499) zanalizowano sekwencję DNA HSV z pHV2. Fig. 12 przedstawia sekwencję DNA otrzymaną dla genu gD HSV-2. Sekwencja DNA zawiera w otwartej fazie odczytu 393 kodony (1 kodon mniej niż sekwencja DNA kodująca gD-1) rozciągając się od ATG w pozycji 267. Podejrzewano, że miejsce to jest inicjatorem genu gD-2 i wykazano, że tak jest, przez klonowanie tej domniemanej sekwencji genu gD-2 do ekspresyjnych wektorów pJS413 i pHK413 (infra).

Przewidywaną sekwencję aminokwasów proteiny gD-2 porównano z przewidywaną sekwencją aminokwasów proteiny gD-1 (fig. 13). Obie sekwencje były homologiczne w około 82%, obszary niehomologiczne wydawały się występować w 3 regionach: sekwencji liderowej, w regio150 654 27 nie transmembranowym i w regionie przypuszczalnego zakotwiczenia. Proteina gD-2 jest o jedną resztę aminokwasową krótsza od proteiny gD-1.

II-3. Klonowanie i ekspresja genu gD-2. W celu umieszczenia genu gD-2 pod kontrolą promotora lac, z pHV2 wyizolowano część przypuszczalnej sekwencji genu, w której brakowało pierwszych 120 nukleotydów amino-kodującego końca (koniec 5' genu). Fragment DNA pHV2 połączono z małym fragmentem DNA pJS413 (około 200 par zasad /bp/) zawierającym promotor lac, elementy kontroli translacji, cro ATG i 69 nukleotydów cro. Otrzymany zrekombinowany plazmid pHV5 (fig. 14) zawiera wszystkie, z wyjątkiem pierwszych 40 kodonów sekwencji gD-2. W rzeczywistości pHV5 faktycznie koduje wszystkie, oprócz 15, aminokwasy proteiny gD-2. Normalnie, reszty 25 pierwszych aminokwasów gD-2 (sekwencja sygnałowa) odszczepia się, przy naturalnej proteiny gD-2. Konstrukcję pHV5 opisano poniżej.

II-3.a. Konstrukcja pHV5. Zrekombinowany plazmid pHV2 trawiono Ciał (patrz fig. 14) i powstałe lepkie końce uzupełniono za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy DNA. Tępo zakończony liniowy pHV2 rozszczepiono następnie EcoRI. Wyizolowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym fragment Clal^/-/ (EcoRI) DNA o 5,4 kb zawierający gen amp^r i wszystkie oprócz 120 nukleotydów, sekwencji kodującej gD-2.

Wektor ekspresyjny pJS413 rozszczepiono Smal i EcoRI. Za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym wyizolowano fragment o 200 parach zasad (0,2 kb) kodujący promotor lac, SD^Z, SD^cro, cro ATG i 69 nukleotydów cro. Fragment ClaI^/_/ (EcoRI) DNA pHV2 o 5,4 kb i fragment EcoRI/Smal DNA pJS413 o 0,2 kb połączono w stosunku molowym 1:1 używając ligazy DNA T4. Otrzymany zrekombinowany plazmid pHV5, użyto do transformowania E. coli szczep NF1829.

II-3.b. Identyfikacja transformantów, które wykazuję ekspresję genu gD-2. Plazmidy wyizolowane z transformantów E. coli opornych na ampicylinę analizowano przez mapowanie endonukleazami restrykcyjnymi i pod względem zdolności kierowania ekspresją polipeptydu pokrewnego gD-2. Ponieważ promotor lac jest w NF 1829 nieaktywny transkrypcyjnie (z uwagi na nadprodukcję represora lac) proteina pokrewna gD-2 może być wykryta jedynie po indukcji promotora bądź za pomocą 1 mmola IPTG bądź 1-10 mmola laktozy.

Klon transformowany zrekombinowanym plazmidem oznaczonym pHV5 produkuje indukowalną proteinę pokrewną gD-2. Stwierdzono, że indukowalna proteina wykazuje immunoprecypitacje z surowicami odpornościowymi królika skierowanymi przeciw HSV-2.

II-4. Wytwarzanie pHV6, który kieruje wytwarzaniem sprzężonej proteiny cro(gD-2) βgalaktozydaza. W celu wytworzenia sprzężonej proteiny sekwencję gD-2 połączono z sekwencją genu gospodarza bakteryjnego tak, że translacyjne fazy odczytu były nieprzerywane przez sygnały zakończenia. W tym celu sekwencję kodującą gD-2 pHV5 rozszczepiono w ten sposób, że uległ delecji sygnał zakończenia gD-2(TAG). Fragment DNA pHV5 zawierający promotor lac, kontrolę translacji i sekwencję Cro/gD-2 połączono z fragmentem DNA pHK414 zawierającym gen z. Otrzymany zrekombinowany plazmid pHV6 (fig. 15) koduje sprzężoną proteinę Cro(gD-2) /5-galaktozydazy.

II-4.a. Konstrukcja pHV6. Plazmid pHV5 trawiono Pstl i BamHI (patrz fig. 15). Fragment Pstl/BamHI DNA pHV5 o 1,75 kb kodujący część amino-kodującego końca genu amp^r, promotor lac, SD^Z, SD^cro, cro ATG i cro/gD-2 wyizolowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Wektor ekpresyjny pHK414 trawiono Pstl i BamHI. Fragment BamHI/Pstl DNA 5,54 kb pHK414 kodujący gen z i część karboksy-kodującego końca genu amp^r wyizolowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Fragment Pstl/BamHI DNA pHV5 o 1,75 kb i fragment BamHI/Pstl DNA pHK414 o 5,54 kb złączono i połączono w stosunku molowym 1 : 1 i użyto do transformowania E. coli NF1829. Kolonie oporne na ampicylinę badano na wytwarzanie sprzężonej proteiny przez oznaczenie aktywności /5-galaktozydazy na indykatorowych płytkach agarowych. Kolonie z wynikiem dodatnim badano na obecność sprzężonej proteiny Cro(gD-2) /5-galaktozydaza metodą analizy SDS-PAGE całkowitych lizatów transformantów indukowanych IPTG. Wyizolowano transformant, który wytwarzał proteinę sprzężoną o 160000 daltonów na wysokim poziomie i plazmid otrzymany z tego transformanta oznaczono pHV6.

150 654

Wykazano, że sprzężona proteina wytworzona przez klony E. coli transformowane pHV6 jest indukowalna przez IPTG i wykazuje krzyżową immunoreaktywność zarówno z HSV-1 jak i

HSV-2. Wytworzone sprzężone proteiny zawierają 265 reszt aminokwasowych proteiny gD-2.

II-4.b. Immunoprecypitacyjna analiza surowic odpornościowych skierowanych przeciw sprzężonej proteinie zależnej od pHV6. Sprzężoną proteinę zależną od pHV6 oczyszczono za pomocą denaturowania opisanego poprzednio i zastosowano do wytworzenia przeciwciał w trzech królikach (R159, R160, R161) następująco: Klony E. coli transformowane pHV6 hodowano do średniej fazy logarytmicznej i indukowano 1 mmolem IPTG. Cztery godziny pó indukcji bakterie granulowano przez odwirowanie, poddano lizie za pomocą buforu dla próbki SDS-PAGE i naniesiono na preparatywny żel SDS-poliakryloamidowy. Po elektroforezie proteiny uwidoczniono przez zabarwienie ścieżek zewnętrznych błękitem Coomassie, następnie pasmo sprzężonej proteiny o 160000 daltonów wycięto z żelu. Płatek żelu zanurzono w ciekłym azocie, zmielono na proszek, a następnie suspendowano w PBS. Następnie dodano taką samą objętość kompletnego adiuwanta Freunda. Po starannym wymieszaniu roztwór wstrzyknięto powtórnie trzem królikom nowozelandzkim (R159, R160, R161). Każdemu królikowi wstrzyknięto 100-200//g proteiny. Po 28 dniach wspomagano działanie podając królikom taką samą ilość sprzężonej proteiny suspendowanej niekompletnym adiuwantem Freunda. W sumie pięciokrotnie wspomagano działanie u zwierząt w odstępach 10 dniowych.Surowicę pobraną 48 dni po początkowym wstrzyknięciu (tzn. po dwukrotnym wspomaganiu działania) użyto do analizy immunoprecypitacyjnej.

Immunoprecypitację prowadzono następująco: komórki w hodowli w zlewającej się warstwie zakażono HSV przy lOpfu/komórkę (komórki Vero zakażono HSV-1, zaś komórki HeLa zakażono HSV-2). Komórki znakowano “S-metioniną 16 godzin po zakażeniu. Lizaty znakowanych ^S-metioniną komórek Vero zakażonych HSV-1 albo komórek HeLa zakażonych HSV-2 inkubowano z 10 μ\ króliczych surowic preodpomościowych albo króliczych surowic odpornościowych skierowanych przeciw sprzężonej proteinie pHSV6 (tzn. odpornościowym surowicom R159, R160 lub R161). Immunokompleksy zebrano stosując Pansorbin tak jak opisano w przykładzie 1-3. c. Otrzymane, znakowane radioaktywnie i poddane immunoprecypitacji proteiny, rozpuszczono ponownie za pomocą SDS-PAGE i poddano fluorografii. Wyniki SDS-PAGE wykazały, że proteina gD o 50000 daltonów wytworzona przez komórki HeLa zakażone HSV-2 jest immunoreaktywną z surowicami odpornościowymi skierowanymi przeciw sprzężonej proteinie wytworzonej przez transformanty. Surowice odpornościowe R159 i R161 są specyficzne wobec gD-2, podczas gdy surowica odpornościowa R160 daje immunoprecypitatory zarówno z gD-Ι (sprzężona proteina gD o 52000 daltonów wytworzona przez komórki Vero zakażone HSV-1) jak i gD-2, a zatem R160 jest „typowo nieswoista. Należy zwrócić uwagę, że 018 (przykład 1-4. b.), która jest skierowana przeciw sprzężonej proteinie gD-Ι kodowanej przez pEH4-2 jest również typowo nieswoista.

II-4.C. Neutralizacja in vitro wirusa Herpes simplex. Wyżej opisane odpornościowe surowice królika skierowane przeciw sprzężonej proteinie pHV6 stosowano również do oznaczania ich zdolności neutralizowania zakażenia spowodowanego HSV in vitro. W tym celu badano neutralizację wirusa stosując badanie na płytkach tak jak opisano powyżej. Każdą płytkę (35 mm) z komórkami w zlewającej się warstwie zakażono 50 pfu/komórkę (komórki Vero zakażono HSV-1, zaś komórki HeLa zakażono HSV-2), któryby! wstępnie inkubowany z rozcieńczeniami kontrolnych surowic preodpomościowych albo badanych surowic odpornościowych). Badano następujące odpornościowe surowice: 018, R159, R160, R161). Po 3 dniach komórki utrwalono, zabarwiono i policzono łysinki. W tabeli 2 przedstawiono wyniki dwóch takich doświadczeń. Neutralizację wyrażono jako rozcieńczenie surowicy wymagane do 50% zmniejszenia łysinek. Tabela 2 jasno wykazuje, że odpornościowe surowice skierowane przeciw sprzężonej proteinie zależnej od pHV6 (R159, R160 i R161) są zdolne do zneutralizowania zakażenia HSV-2 in vitro, zaś odpornościowe surowice skierowane przeciw sprzężonej proteinie zależnej od pEH4-2 (018) są zdolne do zneutralizowania zakażenia HSV-1 in vitro. Chociaż 018 i R160 są typowo niespoiste (na podstawie danych o immunoprecypitacji, w przykładzie II-4. b.), 018 (przeciw sprzężonej proteinie gD-Ι) jest bardziej skuteczna przy neutralizowaniu HSV-1 in vitro, zaś R160 (przeciw sprzężonej proteinie gD-2) przy neutralizacji zakażenia HSV-2 in vitro.

Neutralizacja HSV-1 i HSV-2 przez odpornościowe surowice skierowane przeciw sprzężonej proteinie zależnej pHV6

150 654

Tabela 2

Surowice odpornościowe	Neutralizacja¹
HSV-1	HSY-2
018	128	8
R159	16	48
R160	24	64
R161	8	32

¹ Liczby oznaczają miano przeciwciała jako odwrotność rozcieńczenia surowicy, które zmniejsza liczbę łysinek o 50%. Próby przeprowadzono w obecności dopełniacza surowiczego.

II-4.d. Analiza immunofluorescencyjna surowic odpornościowych skierowanych przeciw sprzężonej proteinie zależnej od pHV6. Próby immunofluorescencyjne przeprowadzono następująco: w zlewającej się warstwie komórki zakażono wirusem opryszczki przy 0,1 pfu/komórkę przez 20 godzin w temperaturze 37°C (komórki Vero zakażono HSV-1, zaś komórki HeLa zakażono HSV-2). Komórki przemyto PBS, a następnie utrwalono w ciągu 90 sekund w temperaturze pokojowej mieszaninę 1 : 1 acetonu z metanolem. Mieszaninę utrwalającą usunięto i komórki osuszono na powietrzu. Następnie 20 μΐ podwielokrotnej części każdej z surowic odpornościowych królika (018, R159, R160 i R161) rozcieńczono w stosunku 1:20 z PBS i naniesiono na komórki na płytce w postaci drobnych kropelek w oznaczonych miejscach. Po 30 minutach inkubowania w temperaturze 37°C komórki spłukano PBS i osuszono na powietrzu. Następnie naniesiono na oznaczone miejsca 20 μ\ podwielokrotnej części, połączonej z fluoresceiną, świńskiej surowicy odpornościowej przeciw surowicy króliczej. Po 30 minutach inkubowania w temperaturze 37°C komórki przemyto, osuszono na powietrzu, umieszczono w glicerynie i oglądano w świetle ultrafioletowym za pomocą mikroskopu UV. Obecność fluorescencji wskazuje, że surowice odpornościowe królika były immunoreaktywne z komórkami zakażonymi HSV. Wyniki przedstawia tabela

3.

Tabela 3

Krzyżowa immunoreaktywność surowic odpornościowych przeciw sprzężonej proteinie z komórkami zakażonymi HSV

Surowice odpornościowe¹	Immunofluorescencja komórek zakażonych HSV²
	HSV-1	HSV-2
018	+ + +	+
R159	+	+
R160	+	+ +
R161	+	+ +

¹ Surowice odpornościowe stosowane w rozcieńczeniu 1 : 20 ² + + + oznacza najintensywniejsze zabarwienie komórek; + + oznacza pośrednie zabarwienie komórek; + oznacza dodatnie, ale mniej intensywne zabarwienie

Przykład III. Działanie profilaktyczne przeciw zakażeniu HSV-2 in vivo. Trzem grupom po 10 myszy szczepu Balb C podano dootrzewnowo (I. P.) następujące preparaty: Grupa 1 (nie zaszczepiona grupa kontrolna) otrzymała roztwór soli. Grupa 2 otrzymała 3//g natywnej proteiny gD HSV-1 w kompletnym adiuwancie Freunda. Grupa 3 otrzymała 30/<g sprzężonej proteiny zależnej od pEH4-2 (wyizolowanej denaturującą metodą oczyszczania agregatów opisaną poprzednio) w roztworze soli. Wszystkie grupy otrzymały cztery wstrzyknięcia I. P., przy czym wstrzyknięć dokonano w odstępach dwutygodniowych, zaś dawka wspomagająca zawierała l pg gD (grupa 2) lub lOjLfg sprzężonej proteiny.

Myszy były wykrwawione ze splotu pozagałkowego po czwartym wstrzyknięciu i surowice te badano na neutralizację wirusa opryszczki in vitro (bez dopełniacza), stosując badania na płytkach uprzednio opisane.

150 654

Po upływie tygodnia od czwartego zaszczepienia myszy prowokowane za pomocą 10 dawek

LDso HSV-2 szczepu 186. HSV-2 suspendowano w 0,5 ml i wstrzyknięto dootrzewnowo. Przeżycie przez myszy wskazywało na ochronę. Wyniki przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4

Szczepienie i ochrona myszy poddanych prowokacji HSV-2

Szczepionka	Ochrona przed zakażeniem HS V-2
Dość osobników, które przeżyły/ całkowita ilość osobników	% osobników, które przeżyły
1 próba kontrolna	1/11	9
2 (negatywne gD-1)	10/10	100
3 proteina sprzężona	¹ 8/10	80
zależna od pEH4

Przykład IV. Działanie profilaktyczne przeciw zakażeniu HS V-2 in vivo przy użyciu proteiny sprzężonej gD-2. Cztery grupy po 10 myszy zaszczepiono następującymi preparatami: grupa 1 (kontrolna) otrzymała zależny od pNB9-l bydlęcy hormon wzrostu pNB9-l proteina sprzężona /J-galaktozydaza. Grupa 2 otrzymała sprzężoną proteinę zależną od pEH4-2 Cro(gD-l) βgalaktozydaza. Grupa 3 otrzymała sprzężoną proteinę zależną od zrekonstruowanego pEH82 Cro(gD-l) 3-galaktozydaza. Grupa 4 otrzymała sprzężoną proteinę zależną od pHV6 Cro(gD-2) j8-galaktozydaza.

Proteiny sprzężone izolowano z różnych transformantów E. coli za pomocą lizozyno/detergentowego rozerwania indukowanych transformantów i granulowania agregatów (niedenaturująca metoda oczyszczania agregatów).

Immunizację przeprowadzono następująco: myszom szczepu Balb C (w wieku 6-7 tygodni) podano dootrzewnowo 150-200//g niedenaturowanej sprzężonej proteiny w 0,2 ml soli. Myszy ponownie zaszczepiono dootrzewnowo (w celu wzmożenia działania) 75-100jug sprzężonej proteiny. Zwierzęta te były szczepione jeszcze trzykrotnie, w odstępach dwutygodniowych (w sumie 4 szczepienia). Myszy wykrwawiono ze splotu pozagałkowego po czwartym wstrzyknięciu i surowice te badano na neutralizację wirusa opryszczki in vitro (bez dopełniacza) za pomocą badania na płytkach opisanego uprzednio.

Po tygodniu od czwartego szczepienia myszy poddano prowokacji przy użyciu 17 dawek LDso HSV-2 szczep 186. HSV-2 w zawiesinie w 0,5 ml wstrzykiwano dootrzewno. Myszy, które przeżyły próbę wykazały ochronę. Wyniki przedstawiono w tabeli 5.

Tabela 5

Szczepienie i ochrona poddanych prowokacji HSV-2 myszy

Ochrona przed zakażeniem HSV-2 Neutralizacja HSV przez surowicę

Szczepionka¹	Ilość osobników, które przeżyły/ całkowita ilość osobników	% osobników które przeżyły	HSV-1	HSV-2
pNB9-l
(próba kontrolna)	0/10	0	4	4
pEH4-2	6/9	67	16	4
pEH82	3/9	33	16	4
pHV6	8/10	80	4	8

' Proteiny sprzężone suspendowane w roztworze soli zastosowano do zaszczepienia I. P.

² Surowicę badano na neutralizację HSV-1 i HSV-2 bez dopełniacza. Liczby oznaczają miana przeciwciał wyrażone jako odwrotność rozcieńczenia surowicy, która zmniejsza liczbę łysinek o 50%.

Porównanie receptur szczepionki. Myszy uodporniono za pomocą preparatów sprzężonej proteiny wytworzonych z transformantów pEH4-2 i pEH90- lOam LE392 w mieszaninie z różnymi adiuwantami opisanymi poniżej. Otrzymane odpornościowe surowice oceniono na podstawie ich zdolności do immunoprecypitacji protein pochodzących z hodowli komórek zakażonych HSV-1.

150 654

Proteiny sprzężone wyizolowano z transformantów pEH4-2 i pEH90-10am LE392 niedenaturującą metodą opisaną poprzednio. Agregaty ponownie suspendowano przez nadźwiękowienie (tworzenie zawiesiny) i rozpuszczono gorącymi alkaliami: do zbrylonych agregatów dodano 0,5 mola NaOH do końcowego stężenia 50 mmoli. Agregaty solubilizowano przez ogrzewanie w temperaturze 65°C przez 15 minut, następnie roztwór ochłodzono i dodano Tris-HCl pH 7,5 (końcowe stężenie 100 mmoli Tris-HCl).

Preparaty protein sprzężonych (zawiesina lub sporządzonych w gorących alkaliach) mieszano przed szczepieniem z następującymi adiuwantami: (1) L121 (Hunter i in. 1981, J. of Immunol. 127(3), 1244-1250, BASF Wyandotte Corporation, Wyandotte, Mich.) niejonowy poliol typu kopolimeru tlenku etylenu i tlenku propylenu (2,5 mg podawano na jedno zwierzę) lub (2) wodorotlenek glinu w żelu (Reheis Chemical Company, Berkley Heights. N. Y.) o końcowym stężeniu 0,2%. Preparaty te stosowano do uodpornienia myszy (szczep CD-I) zgodnie z następującym schematem: każdej myszy najpierw wstrzyknięto 100/zg proteiny sprzężonej i ponownie wstrzyknięto 50/zg proteiny sprzężonej po 22 dniach. Sprzężoną proteinę suspendowano w 0,2 ml całkowitej objętości, którą wstrzyknięto domięśniowo w każde udo. Myszy wykrwawiano ze splotu pozagałkowego w 7 dni po ostatnim wstrzyknięciu.

Zebrane surowice analizowano metodą immunoprecypitacji w następujący sposób: lizaty komórek Vero znakowanych S-metioniną zakażonych HSV-1 inkubowano z 5 /zl surowic myszy (przeciw pEH4-2 lub przeciw pEH90-10am LE392) surowic preodpornościowych (próba ujemna) lub monoklonalnego przeciwciała 4S (próba dodatnia) przez 2 godziny w temperaturze 4°C i 5 /zl króliczej surowicy przeciw antygenom mysim (Dako, 30 minut w temperaturze 4°C). Immunokompleksy zbierano przy użyciu Pansorbinu jak opisano poprzednio i radioaktywnie znakowane poddane immunoprecypitacji proteiny rozpuszczono za pomocą SDS-PAGE i fluorografowano. Wyniki fluorografii pozwoliły na ocenę, że wszystkie myszy, które były uodpornione sprzężoną proteiną solubilizowaną alkaliami (zarówno zależną od pEH4-2 jak i od pEH90-10am LE392) z adiuwantem L121 miały silny odczyn immunologiczny. Słabszy odczyn zaobserwowano przy sprzężonej proteinie zależnej od pEH4-2 solubilizowanej alkaliami podawanej z wodorotlenkiem glinu. Inne myszy wydawały się nie mieć odczynu, według oceny przeprowadzonej w tej próbie.

Depozyt mikroorganizmów. Następujące szczepy E. coli zawierające wyszczególnione plaz-

midy zdeponowano w American Type Culture Collection, Rockville, Md, i otrzymały następujące numery rejestracyjne:
Szczep E. coli K-12, MC1000	Plazmid	Numer kolekcji
NF1829 (WW51) K-12, MC1000,	pEH51	ATCC 39159
NF1829 (WW82)	pEH82	ATCC 39160

Następujące szczepy E. coli zawierające wyszczególnione plazmidy zostały zdeponowane w Agriculture Research Culture Collection (NRRL), Peoria, 111. i otrzymały następujące numery rejestracyjne:

Szczep E. coli	Plazmid	Numer kolekcji
K-12, MC 1000
NF1829	pEH4-2	NRRL B-15741
K-12, MC1000
NF1829	pHV5	NRRL B-15449
K-12, MC1000
NF1829	pHV6	NRRL B-15450
K-12, LE392	pEH90-10am	NRRL B-15451

150 654

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania immunogennego polipeptydu o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 3 rysunku lub części tego polipeptydu zawierających immunoreaktywną i antygenową determinantę glikoproteiny gD-1 wirusa Herpes simplex typu 1, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli zawierającą nadający się do replikacji, transkrypcji i translacji: zrekombinowany wektor zawierający sekwencję DNA genu gD-Ι przedstawioną na fig. 3 rysunku lub jej część, kodujące immunogeny polipeptyd lub jego część, które zawierają immunoreaktywną i antygenową determinantę glikoproteiny gD-1 wirusa Herpes simplex typu 1, po czym wyodrębnia się immunogenny polipeptyd z hodowli.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli zawierającą zrekombinowany wektor pEH51.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli zawierającą zrekombinowany wektor pEH4-2.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli zawierającą zrekombinowany wektor pEH82.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli zawierającą zrekombinowany wektor pEH90-10am.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli ze szczepu ATCC

39159. ,
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli ze szczepu ATCC 39160.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli ze szczepu NRRL B-15471.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli ze szczepu NRRL B-15451.
10. Sposób wytwarzania immunogennego polipeptydu o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 12 rysunku lub części tego polipeptydu, zawierających immunoreaktywną i antygenową determinantę glikoproteiny gD-2 wirusa Herpes simplex typu 2, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli zawierającą nadający się do replikacji, transkrypcji i translacji zrekombinowany wektor zawierający sekwencję DNA genu gD-2 przedstawioną na fig. 12 rysunku lub jej część, kodujące immunogenny polipeptyd lub jego część, które zawierają immunoreaktywną i antygenową determinantę glikoproteiny gD-2 wirusa Herpes simplex typu 2, po czym wyodrębnia się immunogenny polipeptyd z hodowli.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli zawierającą zrekombinowany wektor pHV5.
12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli zawierającą zrekombinowany wektor pHV6.
13. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli ze szczepu NRRL B-15449.
14. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że hoduje się Escherichia coli ze szczepu NRRL B-15450.

150 654

FIG. 1 (α) hsv-1 hsv-1 jednostki mapy

o.e

0,9 p BR 322 j ^S4 p^{3 S}t|!^^Rt (-amp^r-H-)pBR322 kdozasady

RI PytOpyKP» a Sc¹?³ o. Sc Bg P*e- Kp Xb ^RI(b) Rat WES::EcoRI-H AgtWES^*#¹ |p* ft ή | H ^Sc~mŚ|£^{So λ1}*

Ba7j*Bo€ BaS Bo4 (c) pRW F6 (d) p SC30-4 p8R322Het' Bell*¹

P»ui¹' φ 2/) gD mRNA ,3' kBctE H *1° (-*—omp¹’-) pBR322

K¹' ’s«cl ^H,Bdl

Accl η AccH /1 1.

Nrul Nrul f\' \

SacI

PvwH

FIG. 2 kilozosadi)

0 0.2 0,4 0.· 0,9 1,0 1,2 1.4 I,· 1,9 1,0

I-1-1-1-i-4--'l-1-1

SacI

H uin/ΐπτ PvuH τ Accl Sau3A Δ_ναπ

4 ^H q 4 4**/ źj“‘ *\ν ^łq‘ , νγ.ι

PvuH

Rsal / sal ) Rsal (HinflT

SaclI Rsal Sau3A Rsal ^lHlnf I

0,2 0,4 0,6 Oy.8

-+

-ł-I v>

150 454

FIG ³

GTC OCC CCC OCC CCC AAC AU UT CAC GGt AGC OCC OCC GTC TCA CAC TAT C*T CCA TAC .06

CGA CCA CAC CGA CGA ACC CCT AM 60C GAC 606 CCA TTT TAC GAC GAC GAC 666 TAT AAC «6

Mci

6A6 OK OCC CM AR CTC COC OOC OCC TCC GU GAC CTC COC AU CU CCC TAC AAC CTC «00

16· CŁU AU MO GU IU UAL AK CŁY AU SM GUI M* UAL AM LM GU MO T1B ABB LM

ACC ATC OCT TOG TTT COC ATG OSA OCC AAC T6T CCT ATC CCC ATC ACC CTC ATG GAC TAC 666 m m iu ała n> m ak nr cły oly abn cm au iu no iu τη tal nr ou tia

ACC 6AA 1OC TCC TAC AAC AAC χρτ CTC GGG OCC TCT CCC ATC CGA ACC CAC CCC COC TOG TM •41 TM OU CM OM TM ABN LM βη LBU OLY AU CM *M IU AM TM OU MO AM TB*

AACTACTATGACAOCTTCAOCOCCGTCAOC GAG GAT AAC CTC OCO RC CTC ATC CAC OK *60 •61 na na ra ab* an *n cn ala tal in glu ab* asm lbu oly *n uu nr bu alb

CK OOC TR CM ACC GOC GOC ACC TAC CTC COC CTC CTC AM ATA AAC GAC TOG ACC £M 640

Ml *66 AU PM OLU TR AU CLI TM TM LKU AM LBU UAL LM IU ABB AB* 166 TU GUI

ATT ACA CM RT ATC CTC CM CAC CCA OCC AM OOC TCC TR AM TAC GCC CTC 008 CT* 600

661 ILB TM GUI MB ILB L66 6UI III AM ALA LM GLT CU CM LM TIA ALA LU *60 UO _ COC ATC CCC CCC TCA OCC TCC CTC TCC CCC CAC GCC TAC cn cn OOC CTC ACC CTC GAC 0C6 **· am iu no no cm au cm lm cn no clb ala tia cia cia glt tal tu tal as*

AOC ATC OM ATC CTC CCC COC TTC ATC CCC GAG AAC CM COC ACC OTC OCC CTA TAC AOC 16*0

641 BU IU OLI NR LBI no AM *M IU *M GLU ABB GU AM TU TAL AU. TAL TIA IB

TTG AM ATC OCC OOC IX CAC OOC CCC AM OCC CCA TAC ACC AOC ACC CTC CTC CCC 006 1606

Ml UU LM IU AU CLT TA* BIB CLI MO LM AU *M TIA TB BKA TU LBU LBU MO MO lBO-1 |BO-B

OM CTC TCC GAG ACC CCC AAC OCC ACC CM CCA GAA CTC OCC CTC CM CAC CCC GM GAT ·»*0

Ml GLU LSU IM GU TM MO ABB AM TM GU MO GU LBU ALA PBO GLU M* MO GLU M* |Β0-ΒΛΙΙ ABO-t

TCC OCC CTC RC GM CAC COC GTG OOC ACC CTC OCC CCC CAA ATC CCA CCA AAC TOC CAC **00 *61 CU AU LBU UU GLU M* MO UAL OLY TM TAL AU *A0 GU IU *M MO MB TA* BIS

Ucho A4-c,bs r

ATC Ac TCC ATC CM CAC CCC OCC ACC CCT TAC CAT COC CCC GCC ACC CCC AAC AAC I ATC ·*·° mi iu no *n iu cu ab* au au τηi no tyb bis no mo au tub no mm aamJ»·^

I OOC CTC ATC OCC OOC CCC CTC OOC flOCWT CTTCCTC OC* OCC CTC CTC ATT TCC 06A ATT '*»0 >41 I CLT UU IU AU CLI AU TAŁ CLI CLT SM UU UU AU AU UU TAŁ IU CW 6Ł1 AU

IBO-It «BO CIO TAC TM ATC CAC OOC CCC ACT CCC AAA GCC CCA AAO COC ATA COC CTC CCC CAC ATC Ml | AM TU AM LM AU no LYS ABG IU AM UU no BIB IU OM GAA GAC CAC ac ccc TCC TCC CAC CAC CCC TTC TTT TAC TAG ATA CCC CCC CTT UT w«o *01 AM OLU AB* AB* GU PM cn en BIB CU no UU PU TYB ··· OM TOC 000 OOC CTC AGO TCT OCC OCO TTC CGA TOC GAC CTT AAC TCC ATA TU ACC CM IMO TCT OGA AOC OOC CAA AOC COC ACA CTC GAT Mrw I AAC TCC CTA CCC OOC CAC OCO CAC CTC TTC »40

COC CTC TCC CAC CCA CAC CTT TTT CCC GAA CCC TCC CCT TTT CCC CAT ····

150 654

PvuH

Smal

Smal/SacI kilO2asady kdozasady

Ligaza dna T4

FIG. 5 cno

ATG MET GAA GLU CAA GLN CGC ARG ATA ILE ACC THR CTG LEU AAA LYS GAT ASP TAT TYR GCA ALA ATG MET COC ARG TTT PHE GGG GLY CAA GLN ACC THR AAG LYS ACA THR GCT ALA AAA LYS GAT ASP CTG LEU CCC PRO gD-1 CTG ŁBU ACC TUR GAC ASP CCT. PRO.

Zahamowanie (%)

FIG.6

EcoRI

Smal/Pstl

Nrul Ba 131 Pstl

Pf E_S.RI ΐ¹ f” Py¹

Γ-l PlqcSD^łSD^^<>Cfo|k<At).^;W^ ll U Z I i~

I — 5,5 kilozasady

1,5-1,9

I !

kilozasady

Ligaza. dna T4

Nrup'· Smal**¹

BamHI

EcoRI

Pstl

FIG. 8

Pvul

AccI

Sod

BamHI

Hlndl PvuH

Hindlll

EcoRI

Pstl

EcoRI

Hindm ą_ccj ▼ AccI Pstl smol ^Bqins /MW-i r-» g I atnp^r PtacSl/SO^Yrol kilozasady kiiozasady

Liga za DNA T4

EcoRI

Smolt’ Hindm*’

Bgll\iLJ ^ΡνυΙ vAccI

Pstl

Hińdm⁴*’

FIG.9

Pstl/SacK ^ίίϊΛίΙ i I r³

EcoRI

Pstl kilozasady kilozasody

-β.2

Ligaza. JNAT4

Soch P^vuIr^Soc11Bgll K z^AccI

BamHI

Ecol

Pili

Ligoza J)IVA T4

EcoRI

FIG. 11

O_ <y jednostki^ fYKipy y_y_<y_ίχ

FIG. 12

12/15 >2 •2

112

192

172

192

212

222

292

272

CTT 006 •08 TTA AOC coc TM AAC TTT TTC OCC CYC ALA LEO CCC TCC no IU CAO CTC CŁO ŁAD CCC TTC no DOA coc ACC AM ra OAC OCC OLU AL* OCT ATC AŁA ILI TOC CCC CIO no OAT AAC AOD MM CTA OTO ŁAD TAL OCC TCC AŁA on OCC TAC AŁA TTA AAC CAC AON CŁA CCC TAC no TTA

COC ACC 010 OCC CTA TAC AOC TTA AAA ABC TU TAŁ AU LW T« IH ŁW ΙΠ

ACC AOC ACC CTC CTC CCC CCC CAC CTC TM BU TU 1X0 1X0 MO MO OLU ŁBU

OTO TOC ATC 000 TAT CAC OCC ATC OOC nr CŁY CTA CTT CTC CCC OTC OOA CTC COC CTC LU TAŁ TAŁ AŁA TAL CŁY Ln AM TAŁ »NVMiCM CTT AAC ATC OCC OAT CCC AAT CCA TTT 1X0 ŁM MT ALA AAD OAO ni AM MB ACC CAC COC CCC 006 CTC AAC CCT CTT τη MD no no IŁY TAL ŁYD AM TAŁ CAO CCC COC AOC ATC CCC ATC ACT CTC OLA no no on xix no ila τη tał CTC CTC CTA CAT OCC CCA TOC CAC OOC TAŁ ŁAD 1X0 IU AŁA OM on CŁO AŁA CCA AAC CAC ACC TAC AAC CTC AOC ATC AM 1» ίο τη TTA MW 1X0 τη XIX CCC ATC ACC CTT ATC CM TAC ACC OAC no XIX TM TAL nr ołd τη τη cłu ATC CC* ACC CAC CCC COC TOC AOC TAC ILA AM τη CŁA no am nr on τη CTC CCA TTC CTC ATC CAC OOC COC OCC ŁAD OŁY DBA ŁAD nr BID AŁA no AŁA AAC ATA AAC CAC T00 ACC OM ATC AC* τη τη ołd ile τη TCC AAO TAC OCT CTC COC CTC COC ATC Cli ŁYD TYA AŁA 1X0 no 1X0 AM XIX CAA CAO OOC OTO ACC 09C OAC AOC ATC CŁA CŁA

βΟΒ 008 008 <M OM ACT MA AAC ACA

TOC 006 ACC CAC COC ACC ACC ATA CTC

AOA 000 OAC ATT CCA TTT TTA COA OO*

TCA AOC CCA CM CCC ATC CCA CM OM COA TTC GAC CAC ATA TOC AAC CM ATC OOA CG* CTA TM TAG AOT CTT TCT GTT AOC TCC ATT OCG AAC CAC TAG TCC CCC COT TTC ACC TCC OOC CTC GGC ACC GCC AAC IXU τη ra GLY TAL GLY TAR AŁA CTC TCC CCC AM TAC OCC TTA GCA GAC TAŁ cn AŁA Ln τη AŁA ŁAD ALA MD coc 006 AAC AAC CTT CCC CTT TTC GAC AM OŁY Ln AM ŁAD no TAŁ ŁAD MD TAC c*c ATT CAC CCC AGC CTG GAG GAC τη AIO ILE GŁM OAO on 1X0 CŁU MD TAC TAC GCA CTC CTG GM CCT OCC TCC τη τη AŁA TAŁ ŁAD CŁD AM AŁA cn CCC CAO ATC OTC COC OOC OCT TCC GAC OOO OLA ILA TAL AAG CŁY AŁA ra AOD OOC TOG TAT COC ATC OGA GAC AAT TCC AŁA TAD τη AM MT CŁY AAD MM cn TOC ccc TAC AAC AAC TCC TTC 006 CTC CYM no τη MM Ln AAD ŁAD GLY TAŁ TAT GAC AOC TTT ACC CCC CTC AGC GAG τη AAD AU DBA ra AŁA TAŁ 8» CŁU TTC GAC ACC OCG OCT ACC TAC CTG ccc on CŁU τη ALA CŁY τη τη LAD AAC CM TTT ATC CTC OAC CAC CCC GCC COC CŁA DBA ILA ŁAD OLU BIA AM AŁA AM CCC CCC GCA OCG TOC CTC ACC TCC AAC no no AŁA AŁA cn ŁAD τη on Ln 008 ATC τη CCC coc TTT ATC ccc GM CŁY nr ŁAD AAO AM DBA ILA OAO OŁD ATC OCC GOC TOC CAC OOC CCC AAG CCC XIX AŁA GŁY TAD 0X8 GŁY no łyi DAO TOC GAC ACC ACC AAC GCC ACC CM CCC ALA τη GŁM no

•9

180

100

240

380

420

400

940

800

720

780

040

1.020

1.000

1.140

1.200

GM CYC CTT CCC OM OAC ccc CM OAC TCC OCC CYC TTA CAC CAT CCC OCC OOC ACC CTC 1X0 1X0 CŁD AAD DAO AŁA CŁY TU TAŁ 1.280 202 OŁD 1X0 TAŁ DAO OLU MD no OLU MD on AŁA TCT TOG CAC ATC CCC CCA AAC TOO CAC ATC CCC TCC ATC CAC GAC CTC OCG CCO CAC CAC 1.120 >12 on on CŁA XIX no DAO MA TAD 0X0 XIX OAO IU ilb GŁM AOD TAŁ AŁA DAO 0X0 AIO OCC CCC OCC OCC CCC AOC AAC CCO OOC CTC ATC ATC GOC OCG CTC OCC OOC ACT ACC CTG 1,300 212 AŁA DAO AŁA AŁA DAO on AM no OŁY 1X0 ILA ILB GŁY AŁA 1X0 ALA GŁY OU TM LEU OCG OCC CTC OTC ATC OOC BOT ATT OCO TTT TOG CTA COC COC COC OCT CAC ATC GCC CCC 1,440 192 ALA ALA LEU TAŁ XIX OŁY OŁY ILA AŁA DBA TAD TAŁ AM AM AM ALA GŁM MT AŁA OAO AAG COC CTA COT CYC ccc CAC ATC COC OAT GAC GAC GCC CCC CCC TCC CAC CAC CCA TTC 1.500 272 Ł18 AM LEU AM ład no AIO XIX AM MD MD AOD AŁA DAO DAO On AIO CŁA RO LEU >02 TTT TAC DAE τη TAG AAO AOT TTC ccc GTT CCC OTO TAC CTC TOC OCC CCT CTG CCA OOC TCC CCC 1,580 OOC TAT TTC OCT 666 ACT TOC ACT CCO CAT AM GGC ACT CTC GM OCA 006 AM CTA OGA 1,820 CAO TTC ACA GCC ATA ACC OOC TCC COO OAO ACC COT OM OCO COC ACC OCC TCC OCA CCA TTA OCC ACC OCG CCC 1,800 1,780

FIG. 13

Sypnął ^! gD-Ι MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLTDPPGVRR gD-2 |--RŁTSGV-TAA-L—A RV-CA|------P-------------N-------------KgD-1 VYHIQAGLPDPFQPPSLPITVYYAVLERACRSVLLNAPSEAPQIVRGASEDVRKQPYNLTI gD-2-----PS-E-------1------------------H-------------DEA--HT----gD-Ι AWFRMGGNCAIPITVMEYTECSYNKSLGACPIRTQPRWNYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAF gD-2 —Y—-D..............P------V-........S......................

gD-Ι ETAGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRAKGSCKYALPLRIPPSACLSPQAYQQGVTVDSIGM gD-2---------------------------RA------------A---TSK------------gD-1 gD-2 gD-1 gD-2

LPRFIPENQRTVAVYSLKIAGWHGPKAPYTSTLLPPELSETPNATQPELAPEDPEDSALLE

-D-TDPVGTVAPQIPPNWHIPSIQDAATPYHPPATPN --A---SS-------------V-*-H-A—A-Stran^membranony GLI AG AVGGS L LAALVICG I VYWMhR

P---I--LA--T------G--AF-VR61

122

183

244

305

366

394 gD-Ι RTRKAPKRIRLPHIREDDQPSSHQPLFY gD-2 -AQM----L------D--A-P------150654

Clol

Sod*'*

OChoI** ^c Ύ¹ om_Pr-L ί—v -=H>

FIG. 14

EcoRI

EcoRI |SnpI

L^RIaeSO^SO^C ro| —“ kilozasady kdozasady

EcoRI

Ligaza J>fVA T4

Pstl kilozasady \ Z Kilozasady

Ligaza J>NA T4