JPH04500007A

JPH04500007A - ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコード付けするｄｎａの単離方法

Info

Publication number: JPH04500007A
Application number: JP1509232A
Authority: JP
Inventors: ポスト，レオナルド・イー; コンプトン，テレサ; ヌンベルグ，ジャック・エイチ; ペトロフスキイズ，エリック・エイ
Original assignee: ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー; シタス・コーポレイション
Priority date: 1988-08-08
Filing date: 1989-08-02
Publication date: 1992-01-09
Anticipated expiration: 2018-08-25
Also published as: JP3439472B2; EP0427788A1; AU4194089A; CA1340473C; ATE130631T1; DE68924916T2; EP0427788B1; HK41897A; DE68924916D1; WO1990001547A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヘルペスウィルスチミジンキナーゼをコード付；すするＤ　Ｎ　Ａの単離方法発明の要約１の態様において、本発明は、ヘルペスウィルス科のメンバーからチミジンキナーゼをコード付けするＤ　Ｎ　Ａを単離およびクローン化する方法を提供する。

これらの方法は、ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼをコード付けするＤＮＡをプライマーの混合物と混合し、ポリメラーゼ鎖反応によってチミジンキナーゼをコード付けするＤ　Ｎ　Ａを増幅し：次いで該増幅したＤＮＡを単離することよりなり；該プライマーの混合物は、遺伝暗号の縮重による可能なすべてノ変更において、ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ蛋白類の比較的保存されたアミノ酸の第１の配列のすべての変更をコード付けするプライマー、および遺伝暗号の縮重による可能なすべての変更において、ヘルペスチミジンキナーゼ蛋白の比較的保存されたアミ／酸の第２の配列のすへての変更をコード付けする配列に相補的な配列をコード付けするプライマーを含有する。また、本発明は、該方法を実施するのに有用なプライマーのｉ＝物を提供する。

第２の態様において、本発明は、ネコ・ウィルスの鼻気管炎ウィルスとしても公知のネコ・ヘルペスウィルス（ＦＨＶ）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコード付けするＤＮＡ化合物を提供する。ＴＫをフード付けするＤＮＡよりなる組換体ＤＮＡベクターを包含するこれるのＤ　Ｎ　Ａ化合物は、ワクチンおよび発現ベクターとして用いることができる組換体ＦＨＶをつくり出すのに特に有用である。

本明細書中で用いるごとく、ｒＴＫをコード付けするＤＮＡＪとは、ヘルペスチミジンキナーゼのアミノ酸残基配列の部分をコード付ケし、かつヘルペスウィルスゲノム上のかかるＤＮＡの両側にある配列を包含し得るＤＮＡをいう。

第３の態様において、本発明は、チミジンキナーゼ陰性ＦＨＶを構築する方法を提供する。これらの方法は、非機能的ＦＨＶ　ＴＫ遺伝子をコード付けする組換体ＤＮＡベクターを構築し、ＴＫ−陽性Ｆ　ＨＶと非機能的ＴＫ遺伝子をコード付けするプラスミドとの混合物てＦ　ＨＶ−バーミノノブ宿主細砲をトランスフェクトし、１り代ウィルスを単離し、ＦＨＶ−パーミノノブ宿生細胞を該子孫ウィルスで感染させてチミンンキナーゼー陰性ウィルスを得；次いで、該復製ＴＫ −陰性ウイルスを単離することよりなる。該ウィルスは、当該分野でよく知られた方法、例えばチミンンキナーゼ陰性ウィルスのみが複製する条件下で感染宿主細胞を培養することによって単離することがてきる。これろのＴＫ−マイナスウィルスの一部は、ウィルスケツムに組み替えられたプラスミドＴＫ−マイナスをコード付けＤＮＡを含有するであろう。該方法によって産生された組換体Ｆ　ＨＶもまた本発明の重要な態様である。

また、チミ／ンキナーゼ陰性ヘルペスウィルスは薬剤選択、例えば培地中１００ μｇ　／　ｍ　Ｑのチミ／ンアラビノンドによっで単離できる。これらの突然変異は自然にまたは突然変異誘発剤によって誘発てきる。好ましくは、これらの突然変異は欠失を含み、組換えＤ　Ｎ　Ａ法によって作られる。

かくして、第４の態様において、本発明は、機能的ＴＫ遺伝子を含有し？ａ１．）ＦＨＶ、従って「ＴＫ−陰性ｊＦＨＶおよび−ＴＫ−マイナスーＦＨＶというＦＨＶを提供する。かかるＴＫ−マイナスＦＨＶはワクチンとして有用である。

何故ならば、野生型ＦＨＶと比較して、ＴＫ−マイナスＦ）（Ｖは感染動物を病気とする能力が弱めろれているものの、なお野生型Ｆ　ＨＶによるさらする感染から保護する免疫応答を誘導することができるからである。加えて、本発明は、Ｆ　ＨＶのＴＫ遺伝子配列に挿入された発現カセットよりなる組換体ＴＫ−陰性Ｆ　ＨＶを提供する。かかる挿入は、ＦＨＶをＴＫ陰性とし、より重要なことには、該ＦＨＶを発現ベクターとする。本明細書中で用いるごとく、「発現カセット」とは、当該発現カセットかＦ　ＨＶ−感染宿主細胞に存在する場合、プロモーターが、細胞によって蛋白へ翻訳され得るｍＲＮＡ（例えば、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）エンベロープ蛋白をコード付けするもの）の転写を駆動できるように、コーディング配列へ作動可能に連結した該プロモーターをコード付けする組換体ＤＮＡ配列をいう。

第１Ｎ：組換体Ｆ　ＨＶの制限エンドヌクレアーゼ分析（Ａ　）親ＦＨＶ　ＵＴ８８−１７２９（］）および組換体ａ　ｒａＴ−耐性ＦＨＶ−１１３（２）のＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼＣ肖化（Ｂ）パネルＡで可視化したＥｃｏＲＩ−消化Ｄ　Ｎ　Ａをニトロセルロースに移し、ＦＨＶ　ｔｋ遺伝子の３°部分よりなるニックトランスレートしたハイブリダイゼーションブローブを用いることによってｔｋ配列を同定した。親ウィルス（１）におけるｔｋ含有６．６ｋｂＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ断片を、欠陥含有ウィルスＦＨＶ−１１３（２）においてほぼ３４５ｂｐだけ減少させる。分子サイズマーカー（Ｈｉ　ｎ　ｄ■−λＤＮＡ）を示す。両ウィルスＤＮＡマツプにおいてやはり共に移動しないいくつかの他のＥｃｏＲＩ断片はＦＨＶの反復領域に向けてマツプされる（４４）：これらの領域における分子サイズの変動は、Ｆ　ＨＶか集落からプラーク精製される関係のない実験で認められた。

第２図、【ｋ酵素活性のアッセイ結果発明の詳細な記載本発明は、いずれかのヘルペスウィルスのチミジンキナーゼをコード付けするいずれのＤＮＡをも単離する方法を提供する。これろ（Ｄ方法は、（ａ）ヘルペスウィルスＤＩＡをプライマーの混合物と混合し：　（ｂ）ポリメラーゼ鎖反応によってチミジンキナーゼをコード付けするＤ　Ｎ　Ａを増幅し；次いで（Ｃ）該増幅したＤＮＡを単離することよりなり、該プライマーの混合物は、遺伝暗号の縮重による可能なすべての変更において、ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ蛋白類の比較的保存されたアミノ酸の第１の配列のすべての変更をコード付けするプライマー、および遺伝暗号の縮重による可能なすべての変更においてヘルペスチミジンキナーゼ蛋白の比較的保存されたアミノ酸の第２の配列のすべての変更をコード付けする配列にｔ目補的な配列をコード付けするプライマーを含有する。

これらの方法の第１工程は、ヘルペスウィルスＤＮＡをプライマーの混合物と混合することを含む。本明細書中で用いるごとく、「プライマー」とは、ポリメラーゼ鎖反応においてＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼの作用によって伸長できるオリコヌクレオチドをいう。本発明の方法で有用ｔプライマーの設計は２つの因子・　（１）プライマーはポリメラーゼ鎖反応で使用し易いものでなければならないこと：および（ｉｉ　）プライマーはチミジンキナーゼをコード付けするか、あるいはチミジンキナーゼをコード付けする一本鎖ＤＮＡに相補的であるかのいずれかである一本鎖ＤＮＡにハイプリダイズできなければならないこと；によって指示される。これらの各因子を以下で詳細に検討する。

該ポリメラーゼ鎖反応は米国特許第４６９２０２号ならびに他の出願および特許に記載されているＤＮＡ増幅用のよく知ちれた技術である。該ポリメラーゼ鎖反応で用いるプライマーは増幅させるべき二本鎖標的ＤＮＡ配列のうち少なくとも一本の鎖とノ＼イブリタイズできるよう設計する。簡単に言えば、該ポリメラーゼ鎖反応は以下の工程を含む。まず、二本鎖標的配列を変性させる。第２に、第１のプライマーを変性１票的Ｄ　Ｎ　Ａの一方の鎖にアニールし、一方、第２のプライマーを変性（票的ＤＮＡの他方の鎖にアニールする。２っのプライマーは、相互から排除された配列の箇所で、かつその相補体から分離した場合に一方のプライマーの伸長産物が他方のプライマーにハイブリダイズできるような向きで標的Ｄ　Ｎ　Ａにアニールする。一旦所与のプライマーが標的配列にハイブリダイズすると、該プライマーはＤＮＡボリメーゼの作用によって伸長される。次いて、伸長産物を標的配列から変性し、該工程を反復する。

このプロセスの順次のサイクルにおいて、先のサイクルで産生された伸長産物もまたＤＮＡ合成用部位として働く。第２サイクルが開始し、増幅産物は対数速度で蓄積し始める。この産物は二本鎖ＤＮＡ分子であり、そのうち一方の鎖は第１のプライマーの配列を含み、それに続いて標的ＤＮＡの一方の鎖の配列があり、それに続いて第２プライマーの配列に相補的な配列がある。産物の他方の鎖は今丁度記載した第１鎖に対して相補的である。

ポリメラーゼ鎖反応のいくつかの態様は本発明の目的を理解するのに重要である。まず、プライマーは都合良い制限酵素認識配列を該プライマーの５°端部またはその近くに位置させるよう設計できる。ポリメラーゼ鎖反応における伸長産物の形成において、新しいヌクレオチドを添加してプライマーの３゛瑞部て開始させる。これらの新しいヌクレオチドは該プライマーの３°端部が標的配列に水素結合している場合のみ付加され、従って制限酵素認識配列をコード付けする配列は該プライマーの５゛端部またはその近くに位置しなければならない。例えば、一方のプライマーにはその５°端部にＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を含有させ、一方、他方のプライマーにはその５゛端部にＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列を含有させることになろう。増幅の後、産物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、適当に切断したクローニングベクターにクローン化する。

産物中のかかる制限酵素認識部位の存在によりクローニングが大ＬＳに容易となる。

第２に、増幅の標的は一本鎖Ｄ　Ｘ、Ａとすることができる。前記したポリメラーゼ鎖反応法は標的は二本鎖であるという仮定を含むにも拘わらず、−重鎖標的配列も同様に増幅過程で働き得る。−重鎖標的の増幅の最初のサイクルの後、反応混合物は一重鎖漂的およびその相補鎖よりなる二本鎖標的分子を実質的に含有し、従って、増幅の順次のサイクルは前記したごとくに進行する。

本発明の方法で用いるプライマーのａ合物を設計するにおいて第２の重要な因子は、プライマーはいずれかのヘルペスウィルスのチミジンキナーゼをコード付けするＤ　Ｎ　Ａにハイブリダイズできなければならない点にある。公知のヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子はかなり発散しており、非常に短くかつ点在する領域のアミノ酸同一性のみを持つ（キット（Ｋｉｔ）、１９８５、マイクロバイオロジカル・サイエンシズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃｉｅｎｃｅｓ）２　：　３６９　′３７５参照）。例えば、Ｈ３ＶＩ　ＴＫ（マノフナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ）。

１９８０、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　）８：、５９４９）蛋白と仮性狂犬病ウィルス（Ｐｒｖ、米国特許第４５１４４９７号参照）または水痘帯状ウィルス（＼７ＺＶ、ダビソン；＋（Ｄａｖｉｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ）、１９８６．　ジで一ナル・オフ゛・ジェネラル・バイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　）　６ヱ：１７５９〜１８１６）との一対比較法により、４個のアミノ酸のいずれかのストレ／チ内のすべての４個のアミノ酸か対間で同一である７つの共直線領域のみか明らかとされている。同一の地点は一対比較の間で必ずしも保存さ４ｚでいるとは限らない。この発散をさらに説明する別のヘルペスウィルスＴＫ遺伝子はＨ３Ｖ−２（スワインら（Ｓｗａｉｎ、　ｅｔ　ａｌ）、　１９８３　。

／で一ナル・オブ・バイａｏジー（Ｊｖｉｒｏｌ、）４６　：　ｌ　０４３〜１０５０）、Ｍａｔ−ＩＶ　（オーツカら（ＯＬｓｕｋａ　ｅｔ　ａｌ）、１９８４、パイロ口／　（Ｖｉｒｏｌ、）、１３５：３１６〜３３０）、およびＩＢＲ（ＥＰ○２２６，０２９）を含む。公知のＴＫ）、ｉ伝子をプローブに用いる襟章的なハイブリダイゼーション法を介してＦ）（ＶＴＫ遺伝子を単離しようとする努力は実を結ばなかった。何故ならば、ＴＫ蛋白の発散および遺伝暗号の縮重はかかる）・イブリダイセー７ヨン技術を余りにも非特異的なものとしてしまうからである。

しかしなから、本発明は、いずれのヘルペスチミジ／キナーゼをコート付けするＤＮＡをも単離しクローン化する途を提供する。これらの方法では、遺伝暗号の縮主による可能なすべての変更において、公知のヘルペスウィルス・チミ／ンキナーゼ間のアミノ酸配列相同性の非常に小さな領域のすへての変更をコート′１寸けするオリゴヌクレオチドブライマーを利用する。ＴＫをコート付けするＤ　Ｎ　、Ａを単離するために設計した増幅反応におけるプライマー数はかなり犬であるにも拘わらず、ハイブリダイズするプライマーのみが該反応で増幅される。

かくして、本発明の方法は、短く、中程度に保存され１こアミノ酸配列をコード付けする（ま１こはそれをフード付けするＤＮＡに対して相補的ｔ）短く、高度に縮重したオリゴヌクレオチドの使用には、（１１）対向ストランドに（１）アニールする２のプライマーにより（ｉｌｉ　）サイズが予測される産物が生じることを要する点でかなり特別である。本発明の方法を不フ鼻気管炎つィルスＴＫ遺伝子の単離によって説明する。本明細書中ではネコ・ヘルペスウィルス（Ｆ）１〜・′ンというこのウィルスは、これまてに単離または特徴付けされていないＴＫ遺伝子を含有する。短く、高度に縮重したオリゴヌクレオチドブライマーを用い、該ＦＨＶ　ＴＫ遺伝子を本発明の方法によって得た。

本発明の方法は特定のプライマーに限定されるものではないが、本明細書中に例示する以外の保存アミノ酸配列の池の領域がσ在するので、本発明はＴＫをコード付けするＤＮＡを単離する方法で用いる好ましいプライマーを提供する。これろのプライマーはプライマーの５°端部に非相同ＤＮＡを含有し得（すｔわち、前記したごとき、制限酵素認識部位をコート付けするＤＮＡ）、かつ該プライマーは比較的（呆存されたアミノ酸配列をコード付けするので、本発明の好ましいプライマーは、比較的保存されたアミノ酸配列についてのコーディング配列（またはその相補体）よりなると定義される。

所与の「（呆存されたアミノ酸配列」は２またはそれ以上の配列よりなり得、かくして、本発明の方法は「保存されたアミノ酸配列のすへての変更≦に言及することに注意されたい。例えば、残基５５〜６０（保存領域を示す目的でのアミノ酸残基の番号付けはＨＳ　ｖＩ　ＴＫアミノ酸配列をいう）はヘルペスウィルス・チミジンキナーゼ内で比較的１采存されでいる。すなわち、この領域は配列の各位置て各ヘルペスウィルス・チミ／ノキナーゼで同一てないが、なお相同領域として認識さ］を得る。しかしながら、本発明の目的の７こめのかかる保存領域用プライマーを構築するには、遺伝暗号の縮重による可能な各変更において、保存配列の各変更をコード付けするプライマーを設計するだけでよい。本発明の好ましいプライマーを、そのうちいくつかは今記載した変異体である保存アミノ酸配列の参照により、第１表に掲げる。アミノ酸配列は１文字暗号で示し、第２図に掲げる。（Ｈ５Ｖ〜Ｉ　ＴＫに対する）１呆存配列におけるアミノ末端残基の位置は第１表の第１行に示す。特定の保存配列が見い出されるウィルスは各行の左側に示す。遺伝暗号の縮重のため、および本発明の方法は保存アミノ酸配列（およびかかるコーディング配列の相補鎖）についてのす哀での可能なコーディング配列をコード付けするプライマーを利用するので、所与の保存アミノ酸配列をコード付けする該方法で用いるプライマーの実際の数を「プライマー縮重Ｅなる標題の行に示す。最１麦に、第１表は保存配列をコート付けするプライマー部分の実際の長さも示す。いつくかの場合において、コドンの第３位置におけるヌクレオチドの多様性のため、この長さは計算し１こ保存アミノ酸当たりの３個のヌクレオチドよりも１ヌクレオチド短くなり得る。

Ｈ５Ｖ−Ｉ　ＤＧＰＩ（Ｇ　ＧＫＴＴ　ＤＲＩＰ　ＲＰＧＥ　ＤＴＬＦＶＺＶＤＧＡＹＧ　’ＧＫＴＴ　ＤＲＩＰ　ＲＰＧＥ　ＤＴＬＦＰｒＶ　ＤＧＡＹＧ　ＧＫＳＴ　ＤＲＨＰ　ＲＡＧＥ　ＤＴＬＦ？ｖｉａＨＶ　ＤＧＰＨＧ　ＧＫＳＴ　ＤＲＨＡ　ＲＰＧＥ　・＝プライマー長　１４　１１　１１　１１　１２プライマ一縮重　２５６　１１２　４８　１９６　９６第２表アミノ酸　３文字省略法　１文字省略法アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎアスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄグルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅメチオニン　〜１ｅｔ　Ｍフェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ第１表に示すプライマーはベアで組み合わせて用いる。例えば、第１のプライマーが５５位で始まる保存アミノ酸配列をコード付けしく第１表に示すごとく、この第１のプライマーは、遺伝暗号の縮重による可能なすべての変更において、ＤＰＧＨＧをコード付けする配列とＤＧＡＹＧをコード付けする配列よりなるプライマーの混合物となろう）、第２のプライマーが２２０泣で開始する（呆存アミノ酸配列をコート付けする配列に相捕的な配列よりなる（第１表に示すごとく、この第２のプライマーは、遺伝暗号の縮重による可能なすべての変更において、ＲＰＧＥをコード付けする配列にｔ目補的な配列とＲＡＧＥをコード付けする配列よりなるプライマーの混合物である）プライマー対で増幅することによって、ＴＫをコード付けするＤＮＡを単離することができるであろう。増幅産物の予期されるサイズは約４９５塩基対（ｂｐ）の長さであろう（２２０−５５＝１６５．１６５Ｘ３＝４９５）。増幅反応は製造業者のプロトコルに従い、テルムス・アクタティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の熱安定性Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼを用い、パーキンエル？−（Ｐｅｒｋｉｎ　−Ｅｌｍｅｒ）のジータス・インスッルメンツ・サーマル・サイクラ−（ＧｅｔｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ）で行うことができる。加えて、熱安定性ポリメラーゼを用いるポリメラーゼ鎖反応についての反応プロトコルは米国特許第４８８３１９５号および第４６８３２０２号ならびに米国特許出願０６３６４７号（１９８７年６月１７日出願）および８９９５１３号（１９８６年８月２２日出願）に記載されており、これらすべてをここに参照のために挙げる。加えて、ティ・アクアティクス（Ｔ、　Ａｑｕａｔ　１ｃｕｓ）のＤ　Ｓｉ　Ａポリメラーゼを用いテＤ　Ｎ　Ａヲ増幅スル方法は、サイキら（Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ）、１９８８、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３９：４８７〜４９１に記載さＡｔて（＼る。

本発明のＦＨＶ　ＴＫをコード付けするＤ　Ｎ　、Ａを単離する１こ：ま、（増幅産物の引き続いてのクローニング゛を容易とするｔこめ（こ）ＩＩＩμ艮エンドヌクレアーゼ認識部泣を含有する５゛１申長を包含めた第１表に示し７こプライマー対を本発明の方法で用０た。増中晶反応（ま、以下の点を除いて、実質的に製造業者のプロトコルアクタティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の熱安定ｉ生ＤＮＡボ（ノメラーセを用い、バーキノエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ −Ｅｌｍｅｒ）のジータス・インスッｈ）：／’；／　・サーフ／ｌ，−サイクラ−（Ｇｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ）て行った。ＦＨＶ　ＤＮＡ３０ｎｇな（＼し１μｇ（力１．）フォルニア川、ティビス（Ｄａｖｉｓ）、ユニツク−７テイ・オフ゛・力１ノフオルニア・ヘテリナリ弓クール（Ｌ：ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ〜’ｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｈｏｏｌ）の二−ルス・ペターセン（＼ｉｅｌｓ　Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）よ１）入手しｔコＦＨＶのＵＣ−Ｄ株）オヨヒ縮重プライマー１００な（Ｘし８００ｐｍｏ　ｌｙ′−３５０μＣ反応て用０た。熱サイク１ノンク゛（ま３７°Ｃ（こおけるアニール工程付きの最初の５サイクルを含むものであった。

プライマーの一対の組み合わせにより、伸長産物か得られた。このプライマー対は第１表に示した５５と１６４位で開始する保存配列の間の、かつそれを含有する領域を増幅するように設計した。かくして、該プライマー対：ま以下の配列を有していた。第１のプライマーは・、）’　−ＴＣ．ＡＡＡＧＣＴＴＧＡＹＧＧＮＳＣＮＹＡＹＧＧ−３’第２のプライマーは以下のプライマーの同等部分を含有していた：　５’　−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＳＲＴＧＮＣＧＲＴＣ−３”および５’　−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＳＲＴＧＹＣＴＲＴＣ−３’　。

前記プライマーの配列において、Ａはデオキシアデニン残基であり、Ｔはチミジン残基てあり、Ｃはデオキ／ンチジン残基であり、Ｇはデオキシアデン残基であり、Ｎは該プライマーが４種ヌクレオチドの各々が示した位置で起こり得るプライマーの混合物であることを表し、Ｒは該プライマーが２種のプリンヌクレオチド（ＧおよびＡ）のいずれかが示した位置で起こり得るプライマーの混合物であることを表し、Ｙは該プライマーが２種のピリミジンヌクレオチド（ＣおよびＴ）のいずれかが示した位置で起こり得るプライマーの混合物であることを表し、Ｓは該プライマーがＧまたはＣヌクレオチドいずれかが示した位置で起こり得るプライマーの混合物であることを表す。当業者ならば、第１のプライマーは５° 端部近くのＨｉｎｄｎｌ制限酵素認識配列（５′−ＡＡＧＣＴＴ−３°）をコード付けし、および第２のプライマーは５°端部のＥｃｏＲＩ制限部位（　３　’ 　−　Ｇ　Ａ　ＡＴ　Ｔ　Ｃ　−　３　’　）をコード付けすることを認識するであろう。

前記プライマ一対からの予測される産物は約３５０ｂｐ（１６４−５５＝１０９、１０９Ｘ３＝３２７）の長さを有し、増幅反応の礫、混合物を制限酵素ＥｃｏＲ１およびＨ　ｉ　ｎｄｌＩｌて消化し、反応混合物をアクリルアミドゲルに負荷し、電気泳動に付した。はぼ３５０ｂｐの産物を該ケルから切り出し、ＥｃｏＲ　ｌ　−）１　ｉ　ｎｄＩＩＩ、白化のＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔプラスミドベクター（Ｂ］ｕｅＳｃｒｉｐｔはストラタ／ーノ８コーポレー／ヨン（ＳｔｒａＬａｇｅｎｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、力１ノフオルニア９２１２１、サンジエゴ、タンセイ・ストリート（Ｔａｎｓｅｙ　Ｓｔｒｅｅｔ）３７７０番地の商標であり、該ベクターを実質的に製造業者のプロトコルに従って使用した）と結んだ。組換体プラスミドの配列決定を行ってほぼ３５０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［ｌ制限断片がＦＨＶチミジンキナーゼをフード付けすることを確認した。この判断はコーディング配列によってコード付けされるアミノ酸配列と池）公知ノヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ蛋白の配列を比較スることによって行ったが、ハイブリダイゼーションによるクローニング用には余りにも発散しているにも拘わらず、かかる判断を実行できるのに十分なほど同様である。次いで、はぼ３５０ｂｐの該断片を用いて、該３５０ｂｐ断片を標識し、該標識断片をノ・イブリダイジング条件下でライブラリーと接触させ、該断片にハイプリダイズするライブリー中のクローンを単離することによって、完全なＦ）（ＶＴＫ遺伝子をＦ　Ｈ　■のゲ／ミノタライブラリ−から単離した。この方法では、完全なＴＫ遺伝子が２のプラスミド上に単離された。第１の命名した　ｐＴＫ３．８は（カリフォルニア州、う・ジヨウ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）、ストラタシーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）かみ購入した）Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔヘクターにクローン化したＦ）（Ｖ株ＵＣ−Ｄの３９ｋｂ　５ａｉｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片てあり、第２の命名したｐＴＫ５．４デルタＢａｍはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにクローン化したＦ　ＨＶ株ＵＣ−Ｄの１．７ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［ｌ−ＢａｍＨＩ制限断片である。

ＦＨＶＴＫ遺伝子のＤＮＡ配列を決定したが、それを以下に記載する。当業者ならば、ＤＮＡ配列決定ゲルを解釈するのには困難があり、後記配列は現実の配列とは数ヌクレオチド位置具なることを認識するであろう。しかしながら、本発明の方法を用いることによって、いずれのヘルペスウィルスＴＫをフード付けするＤＮＡ配列も単離することができる。加えて、本発明はＴＫ遺伝子の位置をネコ・ヘルペスウィルスのゲノムの特定の制限断片と同一であることを可能とする。

ロータら（Ｒｏｔａ　ｅｔ　ａｌ）は、１９８６．ハイＯＣ’ジー（Ｖｉｒｏｌ、　）、１５４：１６８〜１７９、約２０キロベース（ｋｂ）長の５ａｌｌ制限断片を含有するネコ・ヘルペスウィルスの制限地図を報告している。Ｓａ　ＩＡ断片と呼ぶこの制限断片はネコ・ヘルペスウィルスＴＫ遺伝子を含有する。はとんとのネコ・ヘルペスウィルスはこの報告されたウィルスと実質的に相同であり、これにより当業者は適当な制限断片をクローニングするたけて本発明のＴＫをコード付けするＤＮＡ化合物を単離することが可能となる。配列の記載を容易とするために配列に番号をつける：番号は配列の左側に現れる。コーディング鎖配列のみを示す。下線部の配列は前記した線の上に記載する。ｒ　Ｎ　」は示した位置のヌクレオチドがＡＳＧ。

ＴまたはＣいずれかであることを表す。

ネコヘルペスウィルス株ＵＣ−Ｄのチミジンキナーゼ遺伝子のヌＣＡＡτボックス２０１　ＡＡＧＡＣＡ（：ＴＣＴ　ＧＣＣＧＡＴＡＣＡＧ　ＡＧＣＣＧ弱ＱΔユＡＡＡＣＡＣＴＣＧ　ＡＧＴＣＧ（ｉＴＣＧＣＴＡＴＡボックスコーディング配列の出発点コーディング配列の終止点１４０１　ＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴ　ＡＴＡ（：ＣＡ−品ＡＣＡ胃ＡＧＴＧＧ　ＴＧ貫ＣＣＣＴ＾Ｔ　ＴＡＣＣＣＣＣＣＴＧ１４５１　ＴＧにＴＧＡＡＴにＴ　ＧＴににＡＧＧＴＣＡ　にＧＧＧＡＴＡＡＴＴ　（ＴＡＴＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＧｍＣＡポリ　Ａ本発明の方法によって単離されるに拘わらず、上に示したＴＫをコード付けするＤＮＡ配列は合成法、すなわち当該分野でよく知られている自動ＤＮＡ合成機を使用することによって構築できる。このＴＫをコード付けするＤＮＡ配列、ならびに該配列よりなる組換体ＤＮＡベクターは本発明の重要な態様である。加えて、上に示したＴＫ遺伝子配列は、もし異なるＴＫをコード付けするＤＮＡ配列をもつ池のＦＨＶか存在すると、他のＴ　ＨＶのＴＫをコード付けするＤＮＡ配列と相同であろう。少しだけ相互に相違するかも知れない異なる多数のＦＨＶ株が存在するであろう。これろのＦＨＶ変異体は本発明のＴＫ遺伝子によってコード付けされるＦＨＶ　ＴＫ蛋白とはいくらか異なるチミジン牛ナーセ蛋白をコード付けするであろう。しかしながら、かかる変異はアミノ酸残基位置の１０％未満て起こるであろう。かかる変異体遺伝子は、本発明のＴＫをコード付けするＤＮＡでのハイブリダイゼーシヨンおよび類似ＴＫ−コーディング領域を位置決定する遺伝子マツプの比較を含めた種々の方法によって容易に位置決定できる。か（して、本発明はいずれのＦ　ＨＶからのＴＫをコード付けするＤＮＡも提供する。

前記ＴＫ遺伝子配列はプロモーター（ＣＡ　Ａ　Ｔ領域の上流およびコーディング領域の始点あたりまでの配列を含め得るＣＡＡＴ領域およびＴＡＴＡボックスを包含する配列）、コーディング配列、およびポリＡシグナルを包含する。該プロモーターおよびポリＡシグナルは、組換えＤＮＡ技術の使用を通じて、いずれの所望の遺伝子産物の発現をも駆動する組換体遺伝子を構築するのに用いることができる重要な調節要素である。かくして、ＦＨＶ　ＴＫ遺伝子のプロモーターおよびポリＡ部分もまた本発明の重要な態様である。

ＴＫ遺伝子のコーディング配列は以下に示すアミノ酸残基配列を持つチミンンキナーゼをコード付けする。該配列をアミン末端からカルボキシ末端まで掲げる。

１５１　ＶＧＤＨＴＬＧＳＶＬ　５ｕ４ＡＴＬＰＲＥＰ　ＰＧＧＮＬＷＴＴＬ　ＮＩＥＥＨＬＫＲＬＪＬ　ＧＩＳＲＴＧＥＱＩＤ２０１　ＭＸＬＩＨＡＬＲＮＶ　ＹＭＭＬＶＨＴＫＫＦ　ＬＴＫＮＴＳＷＸＩ；　ＷＧ）ＪＪＩＦＳｔｆＹ　ＥＲＮＲＬＶＥ’ｍ２５１　ＶＳＤＳＴＥＳＤＬＣＤＴＬＦＳＶＦ′ＫＡＲＥＬｉＤＱＮＧＤｕ　ＤＩＧＬＡｍＬ　ＫＥＴＬＱＮＬＱＩＦ３０１　ＴＬＮＬＥ（ＴＰＤＥ　ＣＡＡＡＬＧＡｕＱ　ＤＫＤＭＴＦＴＡＡＣＤＫＨＲＩＳＥＡＩτＩＹＨ当業者ならば、遺伝暗号の縮重のため、示した構造のチミジンキナーゼをフード付けする非常に多数のＤ　Ｎ　Ａ配列を構築できることを理解するであろう。

これらのＩ）ＮＡＡ配列本発明のＦＨＶ　ＴＫをコード付けするＤＮＡに同等である。

ＦＨＶＴＫ遺伝子は弱毒化ＦＨＶ　（ネコ鼻気管炎ウィルス）ワクチンとして１吏用する感染性ＴＫ−マイナスＦＨＶの構築に有用である。本発明は非機能的ＦＨＶ　ＴＫ遺伝子をコード付けする組換体ＤＮＡベクターを構築し、ＦＨＶ−パーミノシブ宿主細胞をＴＫ−陽性Ｆ　ＨＶと非機能的ＴＫ遺伝子をコード付けするプラスミドとの、昆合物でトランスフェクトし；ｉ変成ウィルスを単離し；ネコ・ヘルペスウィルス−パーミノノブ宿主細り包を該後代ウィルスで感染させてチミンンキナーゼー陰性ウィルスを得；次いて、該複製するＴＫ−陰性ウィルスを単離することよりなる組換体Ｆ　ＨＶの構築方法を提供する。得られたＴＫ− 陰性ウィルスはウィルスの混合物を含有し、そのうちの一部のみがプラスミドにより生成したＴＫ配列での組換えの結果ＴＫ−陰性となる。ＴＫ−マイナスウィルスの残りの部分はＴＫ−マイナス状態への自然突然変異の結果である。該方法によって産生された組換体ＦＨＶもまた本発明の重要な態様である。

毒性か減少し、従って弱毒化ウィルスワクチンとして使用できる多数のＴＫ−マイナスヘルペスウィルスが公知である（例えば、欧州特許出願２２６０２９号、およびチミジンキナーゼ遺伝子の欠失の結果いずれかの機能的チミジンキナーゼを産生じなくなったラン・ヘルペスウィルス１型を記載する米国特許出願４７０３００１号参ｐシ。また、この特許は池のヘルペスウィルスに言及している。）。

本発明以前は、活力のあるチミンンキナーゼ陰性ネコ・ヘルペスウィルスをつくることができるか否か、かかるウィルスをいかにしてつくるか、かかるウィルスは不フにおいてビルレントかアビルレントであるか、またはかかるウィルスはネコにおいて保護免疫応答を生じるか否かは知られていなかった。ｔｋ陰性仮性狂犬病ウィルスはネコにおいてビルレントであるという事実は、ｔｋ陰性ヘルペスウィルスはネコにおいてアビルレントであるという考えと反対に教示する。事実、ｔｋマイナスＦＨＶはアビルレントであって保護ワクチンとなることが証明されたのは本発明の結果としてのみである。野生型ＦＨＶによる感染に対しネコおよび他の罹患動物を免疫化するかかるＦＨＶ　ＴＫ−マイナスワクチンを得るには、非機能的ＴＨＶＴＫ遺伝子をコード付けするが、野生型ＦＨＶ　ＴＫ遺伝子および組換え用フランキング配列に対して十分な相同性を保持する組換体ベクターを構築する必要がある。次いで、該非機能的ＴＫ遺伝子をＴＫ−陽性ＦＨ■　ＤＸＡで組換え、ＴＫ−陰性組換体を選択する。１非機能的ｊＴＫ遺伝子は、欠失または挿入（例えば、後記するごとき発現カセットの挿入）またはＴＫ遺伝子を作動不能とする声、突然変異を除き、ＦＨＶケノムと共直線であるＦ　ＨＶケノミノクＤ　Ｎ　Ａのセグメントを包含することに注意するのは重要である。

このテーマにおける変形において、非機能的ＴＫ遺伝子を発現カセットをも包含するように修飾する。好ましい具体例において、この発現カセットは、組換体ウィルスで免疫化した動物に存在させ二場合、池の、感染剤に対する免疫性を誘導する蛋白の発現を駆動する５例えば、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）は免疫化ワクチンを必要とする感染剤である。本発明のＦＨＶ　ＴＫ−マイナス組換体ウィルスは、免疫化動物において発現された場合に該動物をＦｅＬＶに対して耐性とするエンベロープ、ｐｏｌ、またはｇａｇ蛋白のごときＦｅＬＶ蛋白をコード付けするよう容易に修飾される。勿論、不発明の感染性組換体Ｆ　ＨＶはＦＨＶ感染に罹患性のネコ、ネコ細胞、また；ま池の細り包または動物で用いる１こめに池の遺伝子を発現させることができる。例えば、組換体ＴＫ−マイナスＦＨ〜７は、適当な発現カセットを選択するたけて、ネコ感染性腹膜炎（Ｆ　Ｉ　Ｐ）ウィルス、カリチウイルス、狂犬病ウィルス、ネコ免疫不全症ウィルス（ＦＩＶ）、ウィルス（ＦＩＶ）、ネコ・パルホウィルス（ｉＲ白血球減少症）ウィルス、およびネコ・クラミ／アに対するワクチンとして；および遺伝的欠陥を矯正し、またはさらに成長させるための一般化されている発現ベクターとして用いることができる。

ＦＨＶゲ／ム内への外来性配列のＭ換えおよび挿入を達成するに；丈、挿入配列の両側にＦＨＶ配列をもってくる必要がある。ＦＨＶＴＫ遺伝子内への標的化挿入の場合には、外来性遺伝子または発現カセｙ　ｈをＦＨＶ　ＴＫ遺伝子に挿入し、このインサートの両側に　ＦＨＶ　ＴＫ遺伝子を包含するおよび／またはそれを取り囲む共直線配列（５０−５０００ｂｐ）をもってくる必要がある。発現カセットのＦＨＶＴＫ遺伝子内への挿入により、弱毒化生ワクチンとして適する組換体ＴＫ−マイナスＦＨＶを得ル。

以下に記載するプラスミドは本発明のＴＫ遺伝子に挿入できる発現カセットを含有する：得られた構築体をＦＨＶで組み換えて本発明の例示的ＦＨＶ　ＴＫ−マイナス組換体ウィルスを得ることができる。これらの発現カセットは、ＦＨｖｇ染細り包において、色素アッセイによって容易に検出されるヘーターガラクト７ターセマーカー蛋白によって例示されるごとく、いずれの蛋白の発現をも駆動する種々のヘルペスウィルスプロモーターの能力を示す。かかるプロモーターは、ＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨｆ制限断片上の、ロイノマンら（Ｒｏｉｚｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）、１９８２、プロシーディングズ・オブ・す’ｙ＝ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　］、〜ｃａｄ、ｓｃｉ、）、７９：４９１７〜４９２１によって記載されているプラスミドｐＲＢ４０３から単離できる単純庖疹ウィルスのアルファー４プロモーター（ａ４）：Ｓａ　ｌ　ｌ−３ａｃＩｌ制限断片上の、少し修正しに（Ｓａ１１部位はｐｃＭＶ５０２７におけるベクターポリリンカーからのものであり、Ｐｓｔ１部位かＣＸ１〜ｒプロモーターの上流に存在するところにある）ジャフナ−ら（ＳｃｈａｆＴｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、１９８５、セル（Ｃｅｌｌ）４１　：　５２１〜．５３０ｉ二よって３己載されているプラスミドル　ＣＭｖ５０２７から単離てきるサイトメカ七ウィルス即時型プロモーター（ＣＭＶ　Ｉ　Ｅ）：およびＳａ　Ｉ　１−ＥｃｏＲｌ制限断片上に単離てきる（該ＥｃｏＲ１部位はコーチインク配列か開始するＡ　Ｔ　Ｇの約１００ｂｌ）上流にある）前記ＦＨＶＴＫプロモーターを包含する。

これらの各プロモーターを、スベテ：）（Ｓｐａｅｔｅ　ｅｔ　ａｌ）、１９８５、ジで−ナル・オブ・ハイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　）、互６：１３５〜１４３によって記載さているべ・−ターガラクトシダーゼをコード付：すするがプロモーター無しのプラスミドｐＯＮ　ｉの適当な部位にクローン化した。（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、メリーランド州、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、パークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ）　１２３０１から受託番号ＡＴＣＣＣＣＬ９４て入手できる）ＦＨＶ略染ＣＲＦＫ細胞またはＡＴＣＣからのＨ３Ｎ２１−ｑ染Ｖｅｒｏ細胞におけるトランスフエフシンおよびベーターガラクトンターセ発現についてのアッセイは、実質的に、ここに参、ｉ１？のために挙げるスペテら（Ｓｐａｅｔｅ　ｅｔ　ａ１人＋　９８５、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　）立下・１３５〜１４３によって記載されたものと同様であった。結果を第３表に掲げる。

第３表ウィルス　無し　Ｈ３Ｖ　無し　ＦＨＶプロモーター　α４　α４　α４　α４細胞　Ｖｅｒｏ　Ｖｅｒｏ　ＣＲＦＫ　ＣＲＦＫ活性　５．１　３１　１０．３　２８ウイルス　無し　Ｈ３Ｖ　無し　Ｆ　ＨＶブａモー９−　ＦＨＶｔｋ　ＦＨＶｔｋ　ＦＨＶｔｋ　ＦＨＶｔｋ細胞　Ｖｅｒｏ　Ｖｅｒｏ　ＣＲＦＫ　ＣＲＦＫ活性　テストせず　テストせず　１．２　２．８ウイルス　無し　ＨＳ　Ｖ　無し　Ｆ　ＨＶブｏモー９−　Ｃ：’ｖｌＶＩＥ　ＣＭＶＩＥ　ＣＭＶＩＥ　Ｃ：ｋｌＶＩＥ細胞　Ｖｅｒｏ　Ｖｅｒｏ　ＣＲＦＫ　ＣＲＦＫ活性　３２　１０６　３５　１００かくして、すべての発現カセットはＦＨＶ−感染不コＣＲＦＫ細胞：：おいて活性であると考えられ、β−ガラクトシターセの最高発現はＣＭＶ　ＩＥプロモーターからのものであった。偽（ｍｏｃｋ）　−ｈランスフェクト細胞で報告されている最高活性は０．６ｎモル／分／ｍｇであった。ベーターガラクトシダーゼコーディング配列の例えばＦｅＬＶエンヘローブ蛋白コーディング配列での置き換えにより、ＦＨＶおよびＦｅＬＶに対するワクチン接種で使用するのに適した本発明の弱毒化ウィルスを構築するために前記したごとくに使用できる発現カセットを得る。

Ｆ　ＨＶ−感染細胞での発現を駆動できる他のプロモーターも本発明の組換体ＦＨＶで用いる発現カセットの構築で使用できる。これラバ、池のヘルペスウィルス由来のプロモーター、特に強力に発現されるプロモーター、ならびにＦＨＶ由来のもの、特に主要カプシド蛋白遺伝子プロモーターおよび糖蛋白プロモーター（例えば、ｇＢまたはｇＣ相同体）を包含する゛。

本発明のＦＨＶ　’　ＴＫ遺伝子に挿入した第３表記載の発現カセットを含有する多数のプラスミドを構築した。これらのプラスミドを挿入ベクターという。何故なろば、ＴＫ−陽性Ｆ　）Ｉ　Ｖで組み換えた場合、該プラスミドはＴＫ遺伝子を含有する発現カセットをＴＫ−陽性ＦＨＶに挿入して該発現カセットを含有するＴＫ−マイナスＦＨＶが得られるからである。かくして、挿入ベクターｐＴＣ４はヘーターガラクトシダーゼの発現を駆動する位置にあるＣ　Ｍ　ＶＩＥプロモーターよりなる発現カセットを含有する。

単純庖疹ウィルス系においてロイラマン９（Ｒｏｉｚｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）によって開発された（０イツマンら（Ｒｏｉｚｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）、１９８１、セル（Ｒｏｉｚｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）、１９８２、デブ・パイオル・スタンダーグイゼーション（Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ）５２　：　２８７〜３０４　；欧州特許公開０７４８０８号：ロイラマンら（Ｒｏｉｚｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）、１９８５、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２９　：　１２０８〜ｌ　２１４）および水痘庖疹ウィルス系においてローへら（Ｌｏｗｅ　ｅｔ　ａｌ）、１９８７、プロ／−ティングズ・オブ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、８４：２８９６〜３９００によって開発されたのと同様の方法を用い、感染性ＦＨＶゲノミックＤＮＡと一緒に挿入プラスミドｐＴＣ４をＣＲＦＫｆ４Ｂ抱にトランスフェクトした。

感染性ＦＨＶ　ＤＮＡは、低感染多重度にて、ＣＲＦＫ細胞の密集下単鳴をＦ　ＨＶで感染することによって得ることができる。細吻変性効果（ＣＰＥ）が最大に達したときに細胞を収穫する。細胞質ウィルスＤＮＡは、まずＮＰ−４０抽出によって細胞核を取り出し、ＦＪ　Ｑ色質画分を３７°Ｃて１００μｇ／ｍ＋２プロテイナーゼにおよび０２％ＳＤＳ　（ドデンル硫酸ナトリウム）で２時間処理することによって得られる。該ウィルスＤ　Ｎ　Ａはヨウ化ナトリウム密度超遠心法によって精製される。次いで、該Ｄ　Ｎ　Ａを透析し、組換体を得るためにトランスフェク／ヨンで直接用いる。

ウィルス組換体を得るためｌこ、リン酸カルシウム沈殿法（グラノ・ムおよびパンチル・ニブ（Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖａｎｄｅｒ　Ｅｂ）　、ｌ　９７３）を用い、ＴＫＫ伝子に挿入し１こ発現カセットを含有するプラスミドをＦ）ＩＶ　ＤＮＡて共トランスフェクトする。プラスミドＤＮＡ１μｇおよびＦＨＶ　ＤＮＡ３μｇを１２５ｍＭ　ＣａＣ（ｉ２および１×Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）中、室温にて３０分間共沈殿させる。

１０％胎児子ウノ血清（Ｆｅ２）を補足したＤＭＥ〜■培地５ｍｇを含むＣＲＦＫ細り包の２：５ｃｍ’密集下皿にこの沈殿物を添加する。

４時間後、細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＣ３）て洗浄し、１５％グリセロール、１ＸＨＢｓ中で６分間インキュベートする。該細胞を洗浄し、完全なＣＰＥか検出されるまてＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）中てインキー−・−卜する。ウィルスストックを凍結溶解および超音波処理によって収穫する。０５％アカロース、１％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍρチミ／ンキナーゼアラピノノド（ａｒａＴ）を補足した培地１９９中てのインキュヘ−７ヨンによってプラークを単離する。

ヘーターガラクト／ターセ活性か検出されれば、４８時間後にＸ−ｇａｌを添加する（３００μｇ／ｍ（）。感０３日後に青色のプラーりか発生し、つかみ出し、培地１９９（１％ＦＣ３）１ｍρに移し、超音波処理し、ＣＲＦＫ細胞の単層を感染ざるのに用いる。プラーク精製のこのプロセスを３回繰り返して均質ｔウィルスストックを得る。

後代ウィルスを収穫し、ＴＫ−マイナスウィルスについて選択スる１００μｇ　／　ｍρａｒａＴ、チミンンアナログの存在下、ＣＲＦＫ細り色土でプラークを形成させる。スベテら（Ｓｐａｅｔｅ　ｅｔ　ａｌ）、１９８７、プ０／−ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オテ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　、８４　：　７２１３〜７２１７によって記載されているごとく、寒天重層中に色素指示薬：＜−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルーヘーターＤ−カラクトピラ／／ド）を含ませることによって、ベーターガラクトンターゼ活性に一つきプラークを染色する。ヘーターカラクトシターゼ発現について染色したａｒａＴ−’７性のＴＫ−マイナスＦＨＶプラークのほぼ５パーセント（５％）がＸ−ｇａｌ指示指示薬プレートへ−ターガラクト７ターセ活性の存在を示す青色発色を示した。

前記したごとくにこれらのウィルスをプラーク精製する。これらのウィルスはａｒａＴ−耐性（ＴＫ−マイナス）およびベーターカラクトンターセ陽性の表現型を共に発現する。Ｆ）（ＶゲノムのＴＫ遺遺伝円内のＣＭＶ　ＩＥプロモーター／ベーターガラクトシターゼ発現カセットの挿入はＦＨＶケノミノクＤＮＡのサザーン分析によって確認する。このウィルスはネコ用の弱毒化Ｆ　ＨＶワクチン（およびベーターガラクトシダーゼ発現ベクター）として用いることができる。

ベーターガラクトンダーゼ遺伝子をＴＫ−塩基挿入プラスミド内のＦ　ｅ　Ｌ　ＶサブグループＡのエンベロープ遺伝子で置き換えて、同様の方法を介し、ネコにおいてＦｅＬＶエンベロープ遺伝子産物の発現を駆動できる本発明の組換体ＴＫ−マイナスＦＨＶを得る。かかる組換体ＦＨ〜・′はＦ　ｅ　Ｌ　’ｖ’およびＦＨＶ用ワクチンとして用いることができる。

所望の組換体ウィルスを選択するＴＫ−マイナス選択以外の便利な方法は本出顎に記載した研究の結果実行し得る。組換体ワク／ニアウィルスベクターについてなされているごと＜（／テクラバルティら（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ　ｅｔ　ａｌ）、］９８５、モレキｆラー・アンド・セリューラー＋バイオロジー（〜Ｉｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ、）５　：　３４０３〜３４０９）、ベーターガラクトシダーセの発現を駆動できるカセットを、もう１つの異種蛋白発現カセットと共に、例えばＴＫＫ伝子へ共挿入することでかでき、これらの２つの遺伝子は一緒にウィルスゲノムに移すことができる。次いで、組換体ウィルスはベーターガラクトシダーセ特異的色素剤Ｘ−ｇａｌでそれを染色することによって容易にスクリーニラングすることができる。かくして、例えば、ＣＭＶ　ＩＥ７’ロモーター／ベーターガラクトシターゼ発現カセットは前記したごとくにＦＨＶ　ＴＫプロモーター／ＦｅＬＶエンベロープ遺遺伝子産物発現カフノド共にＦＨＶ　ＴＫＫ伝子に挿入することかでき、組換体ウィルスはＸ−ｇａｌで染色することによって単離し得る。

ＴＫ−陽性表現型か、異種発現カセットがＴＫ遺遺伝円内挿入されに組換体ＴＫ −マイナスウィルスで所望されるならば、機能的ＦＨＶＴＫ遺伝子をゲノムのどこか池の所に挿入することかできる。現行の抗−ヘルペスウィルス療法は機能的ＴＫ遺伝子を通じて作用するので、機能的ＴＫ遺伝子をワクチン株に包含させるのが望ましいであろう。これは、現在認可されている組換体ＴＫ−マイナス仮性狂犬病ウィルスワクチン（チクアメリカ（ＴｅｃｈＡｍｅｒｉｃａ）、０ｍｎ１ −Ｖａｃ　ＰＲＹ）の場合には行われていなかった。ＴＫ−マイナス表現型による弱毒化は、発現カセットの組込み部位に拘わらず、ＴＨＶＴＫ遺伝子をに割り込むことによって達成される。加えて、親Ｆ　ＨＶウィルスそれ目体は、ＴＫ遺伝子とは独立に池の手段を通じて弱毒化できる。通常に生産される弱毒化ＦＨＶウィルスはＦＨＶワクチンとして現在使用されている。

Ｆ　ＨＶをネコにおけるワクチン接種用ベクターとして使用することは、ワクシニアウイルスを含めたいずれの（也のウィルスにとっても好ましい。ＦＨＶはネコにおいてよく複製し、弱毒化ウィルスはワクチン接種で現在用いらイ１でいる。さらに、ウィルス宿主範囲は不）に制限される・・・−・・このウィルスは池の動物およびヒトを感染させることは現在知られておらず、かくして、ワクシニアウイルス（これは、クラス２の病因と考えられる。何故ならば天然痘免疫化用ウィルスでのワクチン接種は数年前に停止となったからである。）と同一の衛生関心を公衆に持たせない。

組換体ウィルスの構築：襟卓的な分子クローニング法を用い、同定されｒこＦＨＶｔｋ遺伝子に欠失を含む細菌プラスミドを構築した。

グラハム・エフ・エルおよびエイ・ジェイ・バイデル・ニブ（Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、　Ｌ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｊ、　ｖａｎｄｅｒ　Ｅｂ、　）、１９７３、「アデノウィルス５ＤＮＡの感染性のアッセイ用の新しい技術（Ａ　Ｎｅｖ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒｔｈｅ　Ａｓ５ａｙ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａｄｅｎｏｒｉｒｕｓ　５ＤＮＡ）、バイｏｏジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２　：　４４６〜４６７によって記載されているリン酸カルシウム沈殿法を用い、このプラスミドおよびＦＨＶ株ＵＴ８８１７２９ＤＮＡをＣＲＦＫ細胞に共トランスフェクトした。十分な細胞変性効果が明らかとなったとき、後代ウィルスを収穫し、組換体Ｆ　ＨＶプラークをａ　ｒａＴの存在下で単離した。所望の組換体ウィルスを制限エンドヌクレアーゼ分析によって同定した。

組換体ｔｋ−ＦＨＶの構築・Ｆ　ｅ　Ｌ　Ｖ　エンベロープ挿入前記図表はＦＨＶ−ｇｐ８５組換体ウィルス（ＦＨＶ　１１４）を表す。チミジンキナーゼ遺伝子におけるＥｃｏＲ１部位がらＨｉｎｄ■部泣までの配列を欠失し、ウィルスを弱毒化した。ＦｅＬＶｇｐ８５遺伝子を包含する発現カセットを挿入した。このカセットにおけるプロモーターはＣＭＶ即時型遺伝子からのものである（トムセンら（Ｔｈｏｍｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ）、ＰＮＡＳ　８土：　６５９〜６６３）１９８４）。

ポリアデニル化シグナルをｐＯＮｌから単離した〔スベテおよびモカルスキイ（Ｓｐａｅｔｅ　ａｎｄ　Ｍｏｃａｒｓｋｉ）、ジセーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）５６　：　１３５〜１４３　（１９８５）Ｅ、、このウィルスで感染させたＣＲＦＫ細墜はＦｅＬＶｇｐ８５を合成する。

同定した＋に遺伝子はＦ）（Ｖｔｋをコード付けするという遺伝的および生化学的確認をとるために、本発明者らは該【ｋコーディング配列を推断されるｔｋ蛋白のヌクレオチド結合ドメインを欠失させるように修飾した組換体ＦＨＶを構築した。

細菌プラスミドｐｔｋΔＥｃｏＲＩ　−Ｈｉ　ｎｄＩＩ［（ｐＧＣ１１３）は完全なＦＨＶ　ｔ　ｋ遺伝子および（Ｓａｉ１部位から近位Ｂａｍ８１部位までの）フランキング領域を含有するが、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄ［［部位間のコーディング配列を欠く。合成オリゴヌクレオチドポリリンカーを用いてプラスミド構築体中のこれらの部位を連結した。得られる蛋白はグリシ７；、＋？ないしりジン２３４欠失の部位に挿入された新規なセリン残基を含有することが予測される。

リン酸カルシウム共沈殿法を用いてこの突然変異をＦＨＶに導入してプラスミドおよびヘルペスウィルスのゲノム配列間で相同な組換えを達成した。プラスミドｐｔ△ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩおよびＦＨＶ株ＵＴ８８−＋７２９ゲ／ミツクＤＮＡをＣＲＦＫ細胞に共トランスフェクトし、後代ウィルスを収穫し、１００μｇ／ｍ（ｌ　ｆミ／ンアラビ／／ド（ａｒａＴ）の存在下にＣＲＦＫ細胞上でプラーク形成させて組換体ｔｋ−ウィルスについて選択した。従前のＥＪｆ究は、ｔｋ’ＦＨＶの複製に対するストリンジェント選択を達成するためのこのチミジンアナログを示しており（アール・エフ・シナン、ンイ・ンイ・ウィリアムス、エム・イー・フリノッおよびエイ・ンイ・ナミアス（Ｒ，Ｆ、　５ｃｈｉｎａｚｉ、　Ｃ，Ｃ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ、＼１．　Ｅ、　Ｆｒ１ｔｚ　ａｎｄ　Ａ。

Ｊｊａｈｍｉａｓ）　、ヒトヘルペスウィルス（Ｈｕｍａｎ　Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ）。

（エルセビｘ　（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク、１９８１．６８１〜６８２頁）、本発明者らはこの選択法を用いて自然発生ｔｋ−ＦＨ■を単離した。ＥｃｏＲＶ−Ｈｉ　ｎｄｌＩＩ欠失の存在についての制限エントヌクレアーゼ分析によってａｒａＴ　ｆ＠性ウィルスをスクリーニングした。すへての調へたａｒａＴ耐性ウィルスは予測された欠失を含有していた。１のウィルスをさらにプラーク精製し、ＦＨＶ−１１３と命名した。予測されるごとく、Ｔ）（Ｖ　ｔｋ遺伝子を含有する６、６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片はＦＨＶ−１１３においてほぼ３４５ｂｐたＪナサイズが減少している（第１図）。

ＦＨＶ−１１３のａｒａＴ−耐性表現型は、感染宿主抽出物におｊするｔｋ活性の直接酵素アッセイによってｔｋにおける欠失に帰されることが示さ４また。これらのアッセイの結果（第２図）より、ａｒａＴ−耐性ＦＨＶ、−１１３かｔｋ酵素活性を欠失していることがへ確認される。かくして、遺伝的および生化学的分析は推断されるアミノ酸配列に基づく帰属を支持し、かつ同定された遺伝子がＦＨＶｔｋをコード付けすることを確立する。

実施例Ｉ　ＦＨＶ−１のｔｋ欠失の構築Ｆ　ＨＶ△１１３ウィルスを以下のごとくに構築した。前記したｐＴＫ３．８はｔｋ遺（云子のＮ−末端コーディング配列を含有する３、８ｋｂＳａ　Ｉ　Ｉ／ＨｉｎｄＩ［ｌ断片を含む。このプラスミドの誘導体ｔｋ３．８ΔＥｃｏＲＩはＴＫプロモーターおよびＢｌｕｅ　５ｃｒｉｐｔＫ　Ｓ−１′？ｌ／　１ノンカーにおけるＥｃｏＲ１部位間の配列の欠失によって得た。

前記したプラスミドｐＴＫ５．４は［ｋ遺伝子のＣ−末端コーディング領域および糖蛋白Ｈ遺伝子を含有する５、４ｋｂＨｉｎｄｌｌ／　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒｌ断片を含む。ｔｋのすく下流のＢａｍ８１部位からＢｌｕｅ　５ｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋポリリンカー中のＢａｍ）（１部位までの配列の欠失によってｐ５．４ΔＢａｍＨ１を構築した。

）（ｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位を連結するために合成オリゴヌクレオチドを用い、ｔｋ遺伝子の上流領域と、ｐｔｋ５．４ΔＢａｍＨＩからのＨｉ　ｎｄｎｌ／ＡＡｐａ　ｌ断片を含有するｐｔｋ３．８ΔＥｃｏＲＩからのＡｐａｌ／ＥｃｏＲＩ断片を結ぶことによってｐＧＧＩＩｌを絹み立てた。得られたＥｃｏＲＩおよび）（ｉｎｄｌ）部位間配列はＧ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　ＣＧ　ＣＧ　Ｇ　ＣＣＧ　ＣＡ　Ａ　Ｇ　ＣＴ　Ｔである。

ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩ［部位を連結するための合成オリゴヌクレオチドを用い、ｔｋ遺伝子の５′端部を含有するＥｃｏＲＩ／Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＶ断片（前記Ｄ　Ｎ　Ａ配列中塩基３２１〜７４０）をｐＧＧｆｆＪのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ部位間に挿入することによって、挿入ベクターｐｃｃ　１１３を得た。

得られたＥ　ｃ　ｏ　ＲＶおよびＨｉｎｄ■部泣間の配列はＧ　Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＣＡ　Ａ　Ｇ　ＣＴ　Ｔてあり、Ｈｉｎｄ［１１部位を生じ、新規なりａｍ８１部位を生成する。

ｔｋ欠失ウィルスの親はくテネノー用、７ノクスビル（Ｋｎｏｘｖｉ　ｌ　ｌｅ）、ユニバー／ティ・オブ・テ不シー・ベテリナリ・ティーチング・ホスピタル（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｔｅａｃｈｉｎｇ　Ｈｏ５ｐｉ−ｔａｌ）、マルフルム・マーチンＱｌａｌｃｏ１ｍ　Ｍａｒｔ　ｉｎ）から得た）高ピルレント株ＵＴ８８−１．７２９であった。ワルブーマーズおよびシェケノト　（Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ　ａｎｄ　Ｓｃｈｅｇｇｅｔｔ）　（ハイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、７４．２５６〜２５８．１９７６）の方法によって、ドデシル硫酸ナトリウムープロテイナーゼに処理細胞質ヌクレオチドンドからウィルスＤＮＡを調製した。前記したトランスフェクションプロトコルを用い、ＦＨＶ　ＤＮＡ＋ｐＧＣ１１３ＤＮＡをＣＲＦＫ細胞にトランスフェクトした。チミンンキナーゼ陰性プラークをチミジンアラビノノド選択法によって単離した。

ＦＨＶ−１１３と命名した得られたウィルスはｔｋ欠失を含有する。制限酵素ＥｃｏＲ１によって分析したそのＤ　Ｎ　Ａを第１図に示し、そのｔｋ−表現型を第２図に示す。

プラスミドｐＯＮ１はイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ベータガラクトシダーゼ遺伝子およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（スベテら（Ｓｐａｅｔｅ、　ｅｔ　ａｌ）、ジーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、　ｖｉｒｏｌ、　）、５６．１３５〜４３．１９８５）を含有し、スタッフォード大学のニド・モカルスキイ（Ｅｄ　Ｍｏｃａｒｓｋｉ）から入手した。前記したｐ　ＯＮ−ＣＭＶ　Ｉ　Ｅはヒト・サイトメガロウィルス主要即時型プロモーターをｐＯＮｌに含有する。

ネコ白血病ウィルスＡ亜群（株Ｇｌａｓｇｏｗ　−１）ゲノムからの配列を、グラスゴー大学、ジェイムス・ネイル（Ｊａｍｅｓ　Ｎｅ１ｌ）博士から得たプラスミドｐ　Ｆ　Ｇ　、Ａ　−５にクローン化した。このクローンの構築、その制限酵素切断地図、および関連ＤＮＡ配列はスチュワードら（Ｓｔｅｗａｒｔ、ｅｔ　ａｔ）、ジセーナル・オプ・バイａａシー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ）、５８．８２５〜８３４．１９８６に記載されている。ｅｎｖ遺伝子をＰｓｔｌ／Ｐｓｔｌ断片として単離し、ｐＵｃ１９（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ビスカッタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニューシャーシー州）に挿入して便利なフランキング制限部位（５°端部のＸ　ｂ　ａ　Ｉ　ｓ３“端部の、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とできる５ｐｈｌ”）ヲ得ｆ：。ｐＯＮ−ＩＥＣＭＶのヘーターガラクトシダーゼ遺伝子をＦｅＬＶ　ｅｎｖで置き換えることによってプラスミドｐ　ＣＭ　ＩＥ−ＦｅＬＶｅｎｖを作製した。

ＣＭＶプロモーター　ＦｅＬＶｅｎｖ発現カセットをｐｃＭＶＩＥＦｅＬＶｅｎｖから取り出し、ｔｋ挿入ベクターｐＧｃ１１３（実施例１）に挿入してプラスミドｐＧｃ１１４を得た。このプラスミドはＦＨＶｔｋ遺伝子と同じ向きにｅｎｖ転写単位を含有する。このプラスミドをＦＨＶ　ＵＴ’８８−１７２９ＤＮＡと共にＣＲＦＫ細砲に宿主ンスフェクトし、前記したごとくにａ　ｒａＴ耐性プラーク選択した。得られたウィルスをＦＨＶ−１１４と命名した。ＦＨＶ−１１は、ウェスタンプロ、ト法または（ディビス（Ｄａｖｉｓ）、カリフォルニア大学、ニールス・・ペダーリン（Ｎｉｅｌｓ　Ｐｅｔｅｒｓｅｎ）博士から得た）種々の抗−ＦｅＬＶ単クローンまたは多クローン抗血清での免疫沈降によって測定したごとく、感染したＣＲＦＫ細胞においてＦｅＬＶｇｐ８５の発現を指令する。このウィルスのネコへの鼻孔的投与は対Ｆ　ｅ　Ｌ　Ｖ抗体を誘導することか判明した。

実施例３　組換体ＦＨＶワクチンを用いてのネコのワクチン接種未処方物質としてのＦＨＶΔ１１３、すなわちＦＨＶΔ１１３で感染させた細胞からの培地を鼻孔内接種によってネコに投与した。

ひどいまたは／致死もの病気を引き起こした親ウィルスＵＴ８Ｂ−１７２９とは異なり、ＦＨＶΔ１１３−接種ネコは病気の症状を示さなかった。これらのネコはＦＨＶを中和する抗体を産生じた。これらのネコをビルレントＦＨＶ株で攻撃した場合、これらは未ワクチン接種ネコと同様には呼吸器の徴候を生じなかった。これは、チミジンキナーゼ陰性ＦＨＶはアビルレントであって保護免疫応答を生じることを示し、それらのいずれも本発明以前には知られていなかったものである。

当業者なろば、本発明の開示に照らし、特許請求する発明の方法は種々の態様にて実施できることを理解するであろう。前記した本発明の例示は単に本発明を説明するためのものであり、添付した請求の範囲を限定するものでは断じてない。

当業者に自明な本発明の前記具体例の池の変形は特許請求の範囲内のものである。特に、本発明のごとき弱毒化生ワクチンよりなるワクチンを処方する方法Ｃ二 ■弧ｌ第２図惑染後の時間国際調査報告１剛＊ｍ＊ｆｉ・＋ｖｌ＾−−−幸−ＩＩＭＮ・ＰＣＴノｕｓ８９１０３２８９国際調査報告特表千４−５００００’７　（１９）イサ− 国カリフォルニア州９４６１８、オークランド、セイア７０８６番属国カリフォルニア用９４６１８、オークランド、チャボッ４３３番二国ミシガン州、カラマズー、プロスペクト・ブレイス二国カリフォルニア州９４６ｏ８、エミリービル、フイフテド・ストリー）１４００番

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼをコード付けするＤＮＡをプライマーの混合物と混合し；（ｂ）ポリメラーゼ鎖反応によってチミジンキナーゼをコード付けするＤＮＡを増幅し；次いで、（ｃ）該増幅したＤＮＡを単離することよりなり；該プライマーの混合物は、遺伝暗号の縮重による可能なすべての変更において、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ蛋白類の保存されたアミノ酸の第１の配列のすべての変更をコード付けするプライマー、および遺伝暗号の縮重による可能なすべての変更において、ヘルペスチミジンキナーゼ蛋白類の保存されたアミノ酸の第２配列のすべての変更をコード付けする配列に相補的な配列をコード付けするプライマーを含有することを特徴とするヘルペスウイルスからチミジンキナーゼをコード付けするＤＮＡを単離する方法。
２．さらに、（ａ）ヘルペスウイルスのゲノミックＤＮＡからなる組換体ＤＮＡベクターよりなるヘルペスウイルスのデノミックライプラリーに該増幅したＤＮＡをハイプリダイズさせ；次いで、（ｂ）ハイプリダイズする該ベクター類を単離することよりなる請求の範囲第１項記載の方法。
３．保存されたアミノ酸の該配列がＤＧＰＨＧおよびＤＧＡＹＧ、ＧＫＴＴおよびＧＫＳＴ、ＤＲＨＰおよびＤＲＨＡ、ＲＰＧＥおよびＲＡＧＥ、およびＤＴＬＦよりなる群から選択され、ここに、Ａはアラニン、Ｄはアスバラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｋはリジン、Ｌはロイシン、Ｐはプロリン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、ＴはスレオニンであってＹはチロシンである請求の範囲第１項記載の方法。
４．保存されたアミノ酸の第１の配列の該変更がＤＧＰＨＧおよびＤＧＡＹＧであって、保存されたアミノ酸の第２の配列の該変更がＤＲＨＰおよびＤＲＨＡであり、ここに、Ａはアラニン、Ｄはアスバラギン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｐはプロリン、ＲはアルギニンであってＹはチロシンである請求の範囲第１項記載の方法。
５．請求の範囲第１項記載の方法によって単離されたヘルペスウイルス・チミジンキナーゼをコード付けするＤＮＡ。
６．ネコ・ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼをコード付けするＤＮＡよりなる組換体ＤＮＡ分子。
７．該チミジンキナーゼをコード付けするＤＮＡが以下のＤＮＡ配列：【配列があります】よりなる請求の範囲第６項記載の組換体ＤＮＡ分子。
８．該ＤＮＡ配列が：【配列があります】である請求の範囲第７項記載の組換体ＤＮＡ分子。
９．アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、【配列があります】で表されるアミノ酸残基配列をコード付けし、ここに、アラニンはＡ、アルギニンはＲ、アスパラギンはＮ、アスパラギン酸はＤ、システインはＣ、グルタミンはＱ、グルタミン酸はＥ、グリシンはＧ、ヒスチジンはＨ、イソロイシンはＩ、ロイシンはＬ、リジンはＫ、メチオニンはＭ、フェニルアラニンはＦ、プロリンはＰ、セリンはＳ、スレオニンはＴ、トリプトファンはＷ、チロシンはＹ、およびバリンはＶであるネコ・ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼをコード付けするＤＮＡ配列。
１０．（ａ）非機能的ネコ・ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子をコード付けする組換体ＤＮＡベクターを構築し；（ｂ）チミジンキナーゼー陽性ネコ・ヘルベスウイルスおよび非機能的チミジンキナーゼ遺伝子をコード付けする該ベクターの混合物でネコ・ヘルペスウイルスーバーミッシブ宿主細胞をトランスフェクトし；（ｃ）後代ウイルスを単離し；（ｄ）ネコ・ヘルペスウイルスーパーミッシブ宿主細胞を該後代ウイルスで感染させてチミジンキナーゼー陰性ウイルスを生じさせ；次いで、（ｅ）該チミジンキナーゼー陰性ウイルスを単離することを特徴とする組換体チミジンキナーゼー陰性ネコ・ヘルペスウイルスの構築法。
１１．該増幅工程が該感染宿主細胞をａｒａＴの存在下で培養することよりなる請求の範囲第１０項記載の方法。
１２．該非機能的チミジンキナーゼがＤＮＡ配列：【配列があります】の部分よりなる請求の範囲第１０項記載の方法。
１３．該非機能的チミジンキナーゼ遺伝子が、チミジンキナーゼの発現に必要なＤＮＡを欠失した共直線ネコ・ヘルペスウイルスのゲノミックＤＮＡのセグメントである請求の範囲第１０項記載の方法。
１４．チミジンキナーゼの発現に必要な該ＤＮＡがチミジンキナーゼ遺伝子である請求の範囲第１３項記載の方法。
１５．チミジンキナーゼー陰性ネコ・ヘルペスウイルス。
１６．組換体チミジンキナーゼー陰性ネコ・ヘルペスウイルスである請求の範囲第１５項記載の該ウイルス。
１７．請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ配列の部分からなる非機能的チミジンキナーゼ遺伝子よりなる請求の範囲第１６項記載の組換体チミジンキナーゼー陰性ネコ・ヘルペスウイルス。
１８．請求の範囲第１５項記載のチミジンキナーゼー陰性ネコ・ヘルペスウイルスよりなるワクチン。
１９．請求の範囲第１６項記載のチミジンキナーゼー陰性ネコ・ヘルペスウイルスよりなるワクチン。
２０．請求の範囲第１７項記載のチミジンキナーゼー陰性ネコ・ヘルペスウイルスよりなるワクチン。
２１．請求の範囲第１０項記載の方法によって産生された組換体チミジンキナーゼー陰性ネコ・ヘルペスウイルス。
２２．さらに、ネコ・ヘルペスウイルス感染細胞における遺伝子産物の発現を駆動できるプロモーターおよび該プロモーターからの発現用に位置させたコーディング配列からなる発現カセットよりなる請求の範囲第１６項記載の組換体ネコ・ヘルペスウイルス。
２３．該プロモーターがヘルペスウイルス・プロモーターである請求の範囲第２２項記載の組換体ネコ・ヘルペスウイルス。
２４．該プロモーターが単純性庖疹アルファー４プロモーター、サイトメガロウイルス即時型プロモーター、およびネコ・ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼプロモーターよりなる群か選択される請求の範囲第２３項記載の組換体ネコ・ヘルペスウイルス。
２５．該プロモーターがサイトメガロウイルス即時型プロモーターである請求の範囲第２４項記載の組換体ネコ・ヘルペスウイルス。
２６．該コーディング配列がウイルス遺伝子産物をコード付けする請求の範囲第２２項記載の組換体ネコ・ヘルペスウイルス。
２７．該遺伝子産物がネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎（ＦＩＰ）ウイルス、カリチウイルス、狂犬病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ・パルボウイルス（汎白血球減少症ウイルス）、およびネコ・クラミジアよりなる群から選択される請求の範囲第２６項記載の組換体ネコ・ヘルペスウイルス。
２８．該ウイルス遺伝子産物がネコ白血病ウイルスの遺伝子産物である請求の範囲第２６項記載の組換体ネコ・ヘルペスウイルス。
２９．該遺伝子産物がエンベロープ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子産物よりなる群から選択される請求の範囲第２８項記載の組換体ネコ・ヘルペスウイルス。
３０．該遺伝子産物が分泌されたエンベロープ遺伝子産物である請求の範囲第２９項記載の組換体ネコ・ヘルペスウイルス。
３１．請求の範囲第２２項記載の組換体ネコ・ヘルペスウイルスよりなるワクチン。
３２．請求の範囲第３０項記載の組換体ネコ・ヘルペスウイルスよりなるワクチン。
３３．ネコ・ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子プロモーターよりなる組換体ＤＮＡ分子。
３４．ＤＮＡ配列：【配列があります】よりなる請求の範囲第３３項記載の組換体ＤＮＡ分子。
３５．ＤＮＡ配列：【配列があります】よりなる請求の範囲第３４項記載の組換体ＤＮＡ分子。