JPS5890596A - α―インターフェロン活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子系 - Google Patents

α―インターフェロン活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子系

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JPS5890596A
JPS5890596A JP57174426A JP17442682A JPS5890596A JP S5890596 A JPS5890596 A JP S5890596A JP 57174426 A JP57174426 A JP 57174426A JP 17442682 A JP17442682 A JP 17442682A JP S5890596 A JPS5890596 A JP S5890596A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インターフェロン上ポリペプチドのためにコ
ード化される、ヒトリンパ芽球細胞ｌＳら誘導されたＤ
ＮＡ５　　、挿入体として、対応するＤＮＡ配列を含む
、組み換えＤＮＡ５　（ベクトルマ・ｃｔｏｒｓ）ｓ該
組み換えＤＮＡ５で形雀転換したホスト、およびインタ
ーフェロン一様活性をもつポリペプチドに関するもので
ある。本発明は、該ＤＮＡａ　、該組み換えＤＮＡｍ、
該ホスト、および該インターフェロン一様ポリペグチド
の製造方法、すなわち組み換えＤＮＡ技術（手段）を用
いて行がうことを提供するものである。本発明のポリペ
プチドは免疫モデレータ−（調節体）として有用であり
、脣に抗−ウィルス性、抗癌性、および抗−腫優性剤で
ある。
従って、該ポリペプチドを含む医薬組成物およびウィル
ス性感染、陥および腫瘍の治療方法をも提供する。
インターフェロン（”　ＩＦＮ　’　）は分子量１００
００から４００００である大部→グリコシド化したポリ
ペプチドである。それは、ウィルス、二重鎖ＲＮＡ　、
細胞内微生物、微生物の生成物または種々の化学剤のよ
りなＩＦＮ誘発物雀に触れることによってを椎の細胞に
よって生成される（１）。ＩＦＮ！ｌは正常な細胞にお
いては通常見られない、ウィルス性感染および他の攻撃
物から防瞳するために背椎動物の正常細胞を補助する。
ＩＦＮｓは免疫モデレータ−活性を有することが発見さ
れている。インターフェロン・ポリペプチドの学名はま
だ確立していない、最近の勧告によると、分類は動物の
種（たとえばｌ　ＨｕＩＩヒト由来を示す）、抗原特異
性（α、βおよびγ型、各々α−１β−１″またはγ−
ＩＦＮ−抗体との抗原−抗体反応に基づく）、構造およ
び生理学上の相違（サプタイグはアラビア数字、すなわ
ちα１．α２などで表わす）、およぴ細胞由来のタイプ
（Ｌ・け白ＩｆｌＩ球由来であり、Ｌｙはリンパ芽球細
胞由来であ゛す、Ｆは線維芽細胞由来である）に基づい
ている。たとえばＨｕＩＦＮ−α１（Ｌｙ　）またはＨ
ｕＬｙＩＦＮ−α１は、サブタイプ１のα−タイプイン
ターフェロンを示し、それはヒトリンパ芽球細胞から誘
導される。これらの命名（ｍ類）に加えて、インターフ
ェロンが直接１ｒ細胞（ｐｒｏｇ＠ｎ１ｔｏｒ　ｃ＊ｌ
’ｌ　）から厘接得ら／Ｌるか、または微生物内で合成
から得られるか分類することおよびインターフェロンが
特別のサブタイプであるかまたは２つもしくは七れ以上
のインターフェロンサブタイプの混合物Ｔ゛あるか明ら
かにすることが必要である。
ＩＦＮポリペプチドのためのコード化のＤＮＡ配列、組
み換えＤＮＡ　’分子およびそれらを含むホストに関す
る学名もまたまだ確立していない。インターフェロンに
関するＤＮＡ配列に対して用いられている学名は、省略
形でコード化されており、たとえば大ａｍ自　Ｅａｃｈ
＠ｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｉｌ　　ＨＢ　　１０１　　（
Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐａｔ　）　／　ＨｃＩＦ−２ｈ　
）は、組み換えプラスミド。
（ｐｌａｓｍｉｄ　）　ＤＮＡＺ　−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｉｔ　）／ＨｃＩＦ−２ｈを含む細菌株（Ｅ、　ｃｏｌ
ｌ　ＨＢ　１０１　）すなわちＰｉｔ　ＩＯ位ａ（異な
る外来のＤＮＡの挿入の位置）にＨｃｌＦ−α１挿人体
を含むプラス（）’ｐＢＲ３２２でチューリッヒ（２）
）で発明されたことを示す。′Ｈ１はヒト由来であり′
″Ｃ”は相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　
）を示しおよびα１はサグタイプを表わす［ｃｆ、　Ｃ
，ワイスマン、（３）　）。与えられた令名の場合、　
ＩＦＮ遺伝子（白血球）の由来を表示してはいない０本
出願において、同様の部名を採用されるが、ＩＦ’Ｎ遺
伝子の由来を（リンパ芽球細胞）表わす。
現在までＨｕＩＦＮｓの三つの類が同定され：ＨｕｌＦ
Ｎ−α、ＨｕｌＦＮ−βおより、ＨｕｌＦＮ　−ｒが挙
げられる。ＨｕＩＦＮ−α（以前はＬ＠ＩＦＮと命名さ
れ、白血球インターフェロンもしくはｉ、ｙｉｉ’Ｎ、
リン／９芽球インターフェロン）はヒト白血球（ヒトの
供与血液から得られる新鮮な細胞）およびたとえばウィ
ルスの誘発によるリン／４芽球細胞［Ｅ、Ａ、ハアベル
ら、（４）およびＡ、　Ｄ、サガルら、（５）〕によっ
て生成される。ｐＨ２で安定であり（ＩＦＮｉは酸に対
して安定であり、以前は“タイプ■“として表わされて
いた）、主としてグルコシル化の程度ＮＦＩＩ、Ｍ、ル
ピンスタインら、（６）およびアミノ酸組成（下記参照
）〕が異なる個々のインターフェロンポリペプチドの混
合物からなる。単離され、精製された二つの成分、一方
は、分子量１５（１００から１８０００で、グルコシル
化されていす、他方は、分子量２１０００から２２００
０で、グルコシル化されている。Ｗ、　Ｅ、ステユワー
ト、１１ら（７Ｈｆ、非−グルコシル化インターフェロ
ンは、はとんどもしくはすべてのＨｕＩＦＮ−α活性を
保有していることを報告している。リンパ芽球細胞から
のアミノ酸配列の部分は報告されている［Ｋ、Ｃ，ゾー
ンら、（８））。構造的に、生理学的に異なったＩ（ｕ
ＩＦＮ−αの神々の型はすでに知られている。特にヒ１
ト個体は、ＨｕＩＦＮ−αの対立形質多様性を生ずる可
能性がある。
ＨｕＩＦＮ−β（以前にＦＩＦＮもしくはＦＳＦＮ、　
”タイプ■“と称する）はｄ　ｓ　ＲＮＡの誘発から生
ずるヒトの線維芽細胞（たとえば新生児の包皮）によっ
ておよびごくわずかの程度ｓ　ＨｕｌＦ？Ｊ−αととも
に、ウィルスの誘発から生ずるヒトリンパ芽球細胞によ
って生成する。ＨｕＩＦＮ−βもｐＨ２で安定（従って
“タイプＩ＃に属する）である。少なくて４ｂＨｕＩＦ
’Ｎ−βの二つのタイプは記載されている３３．４８Ｌ
分子蓄は、約２００００および２２０００である。アミ
ノ酸配列は部分的に知られている。
ＨｕｌＦＮ−γ〔以前はＩＩＦＮと称する（免疫インタ
ーフェロンもしくけ１タイプＩ１１インターフエロン）
〕は抗原屯しくはミドダン（ｍｉｔｏｇ＠ｎ　）に対応
してＴ−リン／臂球によって生成される。ｐＨ２で酸不
安定であり、　ＨｕＩＦＮ−αおよびＨｕＩＦＮ−βは
、血清学上区別される。
ＨｕＩＦ”Ｎａは抗−ウイルス性、抗−癌性および抗−
馳瘍性剤として有用である。
抗−ウィルス性剤として、たとえばウィルス性呼吸器感
染、ヘルペスシンプレックスケラプラス、急性出血性結
膜炎、水覆帯状庖疹、肝炎Ｂ％巨大細胞封入体症および
他の治療のために用いられる。
抗−癌性着たは抗−腫腸性剤としてＨｕＩＦＮｓは骨肉
腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄−、ホドキンス病、
メラノマ、胸痛、リンパ肉肺および乳頭腫および他の治
療のたぬに用いられる。
ＨｕＩＦＮｓは、経口もしくは非経口的投与たとえば、
局部的に、静脈内、筋肉内、鼻内、皮肉または皮下投与
のために医薬として許容され得る形状で、たとえば経口
投与用として錠剤、バイアル、シロップ、粉末、溶液ま
たは懸濁液、注射もしくは注入溶液、または懸濁液、目
薬、軟膏、スプレー、およびその個存在する。
製剤は、通常たとえば筋肉内に一日に１〜３回約１０６
−１０７ユニツト用量（病気に適用の状態および患者の
状態によって）を投与する。ウィルス感染では通常、毎
日または一日に三回まで数日間−数週間にわたって処理
し、一方晶およびｌ］！！！瘍では数カ月−数年にわた
って一日に１回−数回または週に一回一数回処理する。
現在までＨｕｌＦＮ−αの不十分な量が誘発ヒト細胞、
たとえばヒトリンパ芽球細胞（ｅｉｌｌ、プルキットス
リン７４″′ナワルワ（Ｎａｍａｌｌｗａ　）　”細胞
）または、供与者の新鮮な血液から伜られるヒト白血球
からのみ生成されている。ＨｕＩＦＮ−βは主にヒト線
維芽細胞から得られる。粗Ｈｕ　Ｉ　Ｆ’Ｎ−α（２，
６Ｘ１０？ＩＵ）は培養ナワルワ細胞の８００１から得
られ、粗ＨｕＩＦＮ−αの約１０１１１０は毎年血液セ
ンターで（列ヘルシンキのフィンランド赤十字センター
）で得られる。ＨｕＩＦＮ−αの特異活性は、４　Ｘ　
１０８−１０？　Ｕ　Ｉ／■の範囲である。広範囲でか
つ市販用に適用のために要するＨｕｌＦＮ−αの量は、
他の医薬用化合物に比して非常に低い。
純粋なＨｕＩＦＮ−αの１００ｇは１０−３０００万投
与量を提供しり−る。しかし透からこのよう々量は工業
的に合理的なコストでヒト組織培養、かつヒト白血球を
用いての経費および技術酌に生産することはできない・ 大規模生産への他の欠点としては、インターフェロン−
混合物が得られ、それらを各々のサブ−タイプに５＋岨
するのには厄介であり、費用がかかりすぎる。従って純
粋な、個々のインターフェロン稀の治療への適用に際し
ては、満足すべき計価を得ることはむずかしい。
これらの方法の工業的応用は、培養できるヒト細胞（ヒ
ト腫瘍細胞およびある種の線維芽細胞）または相対的に
多量得ることので六るヒト細胞（白血球およびリンパ球
）によって生成されるＨｕＩＦＮｓに限られる。しかし
ながらこれらの方法は、費用がかかりかつ複雑である。
インターフェロンの個々の種の工業的な大量生成の丸め
の問題への解決は分子生物学の進歩から、すなわち細菌
細胞における特異性非−細菌性成熟核遺伝子を発現する
ことが可能になったことからなされた。最近、Ｓ、　Ｎ
、コーエンとＨ，Ｗ、ボイヤー（９）は生物学的に機能
を有するＤＮＡ配列を抜製する一般方法について報告し
ている。この方法は槙状プラスミドＤＮＡを開裂して第
一の線状（棒状）ＤＮＡ断片（Ｓｅｇｍ・ｎｔ）を与え
る段階；この第一の断片に表現型体質のための遺伝子を
持った第二の線状ＤＮＡ断片を挿入して組み換えＤＮＡ
分子を与える（修復された環状シラスミド）段階；組み
排えＤＮＡ分子を持つ単細胞微生物への形質転換；形質
転換体を適当な栄養条件下に非−形質転換微生物と°と
もに増殖させる；およびＰ−単細胞微生物から形質転換
体を分離する仁とからなる。形質転換体（寸望ましい蛋
白質を生成しうる。
先行技術： Ｆ！ｕＩＦＮ−α−およびＨｕＩＦＮ−β一様活性をも
っ゛ポリペプチドのためにコード化されたヒト白血球お
よび線維芽細胞から誘導したＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列
を含む組み換えＤＮＡ分子、該組み換えＤＮＡ分子で形
質転換したホスト、ポリ（デチド、ＵＩポリペプチドを
含む培養液およびこれに関する組成物の生成についての
方法は種々の特許用願書および他の田版物においてｉ１
１載されている。センダイウィルスで誘発されたヒト白
血球、いくつかのＨｕｌＦＮ−α一様活性をもつＤＮＡ
配列をも・っポリペプチド、組み換えＤＮＡ　、および
それらの製造のためのホストを出発物嘴として用いるＣ
とがＣ，ワイスマンによって報告されている［　３　；
　Ｓ、ナガタら、（１０）、Ｎ、センタイら、（１１）
およびＭ、ストロポリら、（１２）参照〕。
白血球、特にセンダイウィルスで誘発されたヒト骨髄芽
球細胞ラインＫＧ−１から銹導された、部分的に精製し
た分子量２１０００をもつＨｕＩＦＮ−α一様ポリペプ
チド、対応するＤＮＡａ同じく８つの異なるヒトＬｓＩ
ＦＮｃＤＮＡｓの構造はり、　Ｖ、ゴエデルら、（１３
，１４）Ｋよって報告されている。
ＨｕＩＦＮ−α一様活性をもつプリペプチドの製造方法
は、ヒトリンノ母芽球ナワルワ細胞またはヒト血液白血
球で開始し、二−−キクスル病ウィルスで誘発されるこ
とが一般的概念でヨークツノ４特詐出願番号３４３０７
（１５）に開示されているがしかし、具体的なデータお
よび詳細は述べられていない。
ヒト線維芽細胞、特に新生児の包皮から得られたものか
ら開始し、ＨｕＩＦＮ−βのためコード化に。
ポ１バＩ）：ポＩＪ　（Ｑ　ＤＮＡ５によって誘発され
た１組み換えＤＮＡ分子、およびそれらを含む微生物は
、ヨー口、）や特許出願２８０３３（（１６）：タニグ
チら、（１７））、デアニクら、（１８）およびゴエデ
ルら、（１９）参照〕に記載されている。
ｍＲＮＡ５　ｅ　ＤＮＡ５　＋組み換えＤＮＡ分子およ
びＨｕＩＦＮ−β１およびＨｕＩＦＮ−β２を生成でき
る細菌株は英国特許出願２，０６３，８８２（２０）記
載のように二重らせんポリ（Ｉ）：ポリ（ｑで誘発され
たヒト線維芽細胞、！に包皮細胞ＦＳＩＩまたはｓｖｓ
。
から開始する遺伝子工学の方法によって得られる。
ＤＮＡ１、組み換えＤＮＡ分子、後者を含むＥ。
ｅｏｌｉおよびヒト線維芽細胞から得られたｔｎＲＮＡ
経て製造された。　ＨｕＩＦＷ−β活性をもつポリペプ
チド、特にポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）で誘発されたヒト包
皮ＦＢ−４およびそれを製造するための方法は、ベルイ
ー９軒番号８８７３９７（２）に開示されている。
一般的に、いかなる具体的なデータ、または詳細なしに
ＨｕＩＦＮ−β一様活性を持つポリペプチドを製造する
ための方法は、ポＩＪ　（Ｉ）　：ポリ（Ｃ）で誘発さ
れるヒト線維芽細胞（新生児の包皮）からの開始は、”
ｉ　　ｏ　、ｚ４％許出３１１３４３０６（２２）Ｋ開
示されている。
ヒトリンハ芽球インターフェロン″ＨｕＩＦＮ　（Ｌ＞
’　）’は柚々の鋳発体での刺激によってナマルワ細胞
において多様な量を生成することができる［　Ｍ、　Ｏ
。
ジョンストンら（２４））。センダイウィルスによって
誘発されたナマルワ細胞によって生成したＨｕＩＦＮ　
（Ｌｙ　）け、ＨｕＩＦ？Ｊ−α（Ｌｙ）（７０−９０
％）お工ひＨｕＩＦＮ−β（Ｌｙ）（１０−３０１）を
含むことが示されている。それは少なくても７つの成分
からなる［：　Ｋ、　Ｃ，ゾーンら、（８）およｒｚＧ
、アレンら（２５）；Ｅ、Ａ、ノ・アベルら、（４）お
よびＡ、　Ｄ、サーガルら、（５）参照〕。リンフ９芽
球インターフェロンポリペプチドの全構造は現在まで未
知であるけれども＊　ＨｕＩＦＮ−α（Ｌｙ）はＨｕＩ
ＦＮ−α（Ｌｓ）とは異なっている。１ノン・母芽球イ
ンターフェロンの主成分のグルコシル（ヒバ＃ｔとんど
ないように思われる。種々の成分は〜まだ単離されてお
らず精製されていない。
発明の目的 臨床試験はリンパ゛芽球ＨｕＩＦＮｓの混合物で行なわ
れており、すれらの治療効能を測定するためには個々に
生成し、および種々の成分に分解することが望ましい、
＃紀絨の組み換えＤＮＡ過程のいずれもヒトリンフ９芽
球インターフェロンの合成に指図されていない０本発明
の目的はこの間眺を組み換えＤＮＡ技術（手段）で解決
することである。更に本発明の目的は、ＨｕＬｙｌＦＮ
ｍの種々のサブタイプの構造（アミノ酸配列）を飲明す
ることであり、および多くの患者の治療のために安全な
供給をするために十分な蒼の個々のインターフェロンを
製造することを可能にせしめることである。
発明の要約 本発明は量において（多量）リンパ芽球ＨｕＩＦＮｓと
同様の生物学的活性を持つ個々のポリペプチドの生成の
間組を解決することである。単一ポリペプチドは今まで
知られているＨｕＩＦＮ−α（Ｌ・）およびＨｕＩＦＮ
−βの灰分と同一であるか異なっているかのどちらかで
ある。免疫学上、および生物宇土ＨｕＬｙＴＦＮ−αま
たはＨｕＬｙＩＦＮ−βの活性を示すポリペプチドを含
む医業用剤および使用方法を提供する。
手詰、使用される省略語についての説明クローン（ＣＩ
ｏｎｅ　）　：単細胞から無性的に誘導された細胞個体
群。このような個体群は遺伝的に同一であると仮定する
。
オペロン（Ｏｐ＠ｒｏｎ　）　：ＩＩＲ接した遺伝子か
らなる遺伝子ユニットは対等にオペレーターおよびレグ
レサー〇制闘下に表わす・ コントロール配列の発現（表示）　（Ｅｘｐｒ・ｍ５ｌ
ｏｎｃｏｎｔｒｏｌ　ｓ＠ｑｕ＠ｎｃｅ　）　：実施的
に遺伝子に連結じている場合、構造遺伝子の発現を制（
財）し、調整するヌクレオチドの配列、他の間すなわち
プロモーターおよびＩＪ　、ｙシームの結合位置を含む
。
デ０％−ター（Ｐｒｏｍｏｔｏｒ　）　：　ＲＮＡポリ
メラーゼが結合しおよび転写を始めるＤＮＡ断片（セグ
メン　ト　）。
リボゾームの結合位１ｉ１１　（Ｒｌｂｏｓｏｍａｌ　
ｂｉｎｄｉｎｇｓｌｔｓ　’）　：翻訳のためにかくこ
とのできない＋７　＆シームへのｍＲＮＡの結合をさせ
る配列 発現（Ｋｘｐｒｅｓｍｉｏｎ　）　：転写および翻訳か
らなる過程 転写（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　）　：　ＤＮＡに
含まれる遺伝情報をＲＮＡ　釦に相補的な環基配列をも
つように刻まれる塩基対を含む過程 翻訳（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　）：　ｍＲＮＡに看守
する遺伝情報を蛋白′Ｊｔ合成中特別のアミノ酸を刻む
ようにする過程。
ヌクレオチド（Ｎｕｅｌｅｏｔｉｄ・）：デリン、ピリ
ミジン塩基、リボースまたは２−デオキシリが一ス残基
およびリン酸残基からなる核酸の４１Ｎ成体、リゲヌク
レオテド地基けＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり、一方デオキ
シリ〆ヌクレオチドにおいてはＵはＴで噴き換わる。
ベクトルまたはクローニングベイクル（Ｖｅｃｔｏｒｏ
ｒ　ｃｌｏｎＩｎｇ　ｖｅｈｉｃｌｅ　）　：　ＤＮＡ
配夕１］、たとえばグラスミドまたはファージＤＮＡ、
それはホスト細胞において自主的に複軸で宵、形質転換
細胞の制定における使用に適するマーカーを含む、たと
えばテトラサイクリン抵抗性（不応性）もしくはアンピ
シリン抵抗性（不応性）、および他のＤＮＡ断片（セグ
メント）は付詣した断片（セグメント）の複製をもたら
すように冥験的に付着させうる。
プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ　）：ホスト細胞で？Ｊ製
で芦るクロマトシーム外の環状の二軍鎖ＤＮＡ　。
組み換え（交１！　）　ＤＮＡ　［：　Ｒｅｃｏｍｂｌ
ｎａｎｔ　（ｈｙｂｒｉｄ　’）ＤＮＡ　）　：生きて
いる細胞の外で金倉する異なった遺伝子からのＤＮＡ断
片（セグメント）からなり。
あるホスト細胞を感染することができ、十の中で持続で
きる〇 ヌクレアーゼ（Ｎｕｅｌｓａｓ＊　）：核酸のホスホジ
エステル結合の鎖を開裂することができる酵素。
リゾヌクレアーゼ（Ｒｌｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　）　：
　ＲＮＡのホスホジエステル結合をｒ！４裂することが
できる′＃累。
制限エンドヌクレアーゼ（Ｒ＠５ｔｒｉｅＨｏｎｅｎｄ
ｏｎｕｅｌｓａｓ＊　）：重合体鎖以内で特別の目標配
列マパポリヌクレオチドを切断する酵素。開裂化合物は
、′プラントｂｌｕｎｔ”（″′フラッジ、　ｆｌｕｓ
ｈｅｄ’）末端もしくは“スタガニドｓｔａｇｇｅｒ＠
ｄ”（“ステラキイｍｔｉｅｋｙ”）末端を持つＤＮＡ
断片（フラグメント）を増加させる。
エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　）　：
鎖の末端からＤＮＡを分解する酵素。
リゾチーム（Ｌｙｓｏｚ）ｒｍ・）：ある細菌の細胞壁
にある多糖類を分解する酵素。
リバーストランスクリグターゼ（Ｒ・Ｖ＠ｒｌ・ｔｒａ
ｎｓ　ｃｒｌｐｔａｉ＊　’）　：　ＲＮＡテンプレー
トから相補的な一本Ｑ　ＤＮＡを台成し、そのＤＮＡ鎖
を二１らせん型に転換するＲＮＡ　膿瘍ウィルスに１っ
てコード化された酵素。
ＤＮＡ　４？リメラーゼ（ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ　）　：　ＤＮＡの３’−５’ホスホジエステルの結
合の生成ｔ−触１１ｔ−る酵素。
ＤＮＡりが−ゼ（ＤＮＡ　ｌｉｇａｍｅ　）　：エンド
ヌクレアーゼによって導入された型の一水銀ＤＮＡホス
ホジエおチル納会の開裂の修復を触媒する＃累。
ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｋｉｎ口・）：　ＤＮＡの５′−位の水酸基のリン
酸化を触媒する酵素。
形質転換（Ｔｒａｎｉ＋ｆｏｒｍａｔｌｏｎ　）　：外
因性のＤＮＡ。
たとえばグラスミドまたは交雑ＤＮＡを細胞内への導入
は細胞内における該ＤＮＡの確立という結果になる。
略飴 Ａ：アデノシンもしくはデオキシアデノシン−リン酸残
基 Ｕ：ウリジン−リン酸残基 Ｔ：デオキシチミジンーリン酸残基 Ｃニジｆジンもしくけデオキシシチジン−リン酸残基 Ｇ：グアノシンもしくはデオキシグアノシン−リン酸残
基 Ｉ：イノシンーリン＃残基 ｄＡＴＰ　：デオキシアデノシン三すン酸ｄＴＴＰ　：
デオキシチミジン三すン酸ｄＣＴＰ　：ブナキシシチジ
ン三すン酸ｄＧＴＰ　：デオキシダ７ノシン三すン酸ｄ
ＣＭＰ：デオキシシチジン−リン酸 ｄＧＭＰ：デオキシシチジン−リン酸 ＲＮＡ　：リボ核酸 ｍＲＮＡ　：メッセンジャーりざ核酸 ｔＲＮＡ　：転移リボ核酸 ｒＲＮＡ　：すメゾ〜ムリボ核酸 ｄｓＲＮＡ　：二１鎖リボ核酸 ＤＮＡニデオキシリ？核酸 ｅＤＮＡ　：相補性デオキシシチジン（酵素的にｍＲＮ
Ａ配列から合成される） ｄｓｅＤＮＡ：二重鎖相補性デオキシリが核酸ＡｐＰｒ
　：β−ラクト了メーゼ遺伝子のコントロール配列の発
現 ＩＦＮ：インターフェロン ＨｕＬｙ　：ヒトリンパや芽球絽胞 本琴−けインターフェロン一様ポリペプチド１＆ＦｉＭ
ＤＮＡＩＣ交雑（雑檜）するためにコード化されるＤＮ
Ａ％特に組み換えＤＮＡ、ヒ）　ＩＪンパ芽球細胞から
誘導されたＤＮＡ配列、または該配列の断片、質種また
は突然変１４体を含むＤＮＡ。
該組み換えＤＮＡ−の少なくとも１つで形質転換したホ
スト、ヒトリンノナ芽球インターフェロン％または断片
またはその誘４体の免疫学上および生物学士の活性を示
すポリペプチド％該ペゾチドを宮んでなる医薬組成物お
よびヒトにおけるウィルス性感染、癌、腫瘍の治療で、
該医薬組成物の形路で該ポリペプチドの効果的な量を投
与すること、に関するものである。
本発明は、該組み換えＩ）ＮＡの少なくとも１つで形質
転換したホストを培養し、望ましいポリペプチドを集め
ることを特徴とする、ヒトリンパ芽球インターフェロン
の免疫学および生物学上活性を示すポＩＪ−＜デチドを
生成する方法および形質転換（、たホスト微生物を生成
するための方法に関するものである。
形質転換したホスト微生物の生成のための方法は、次の
段階からなる： （１）誘発ヒトリンパ芽球細胞からヒドリンツヤ芽球ポ
リ（Ａ）ＲＮＡを分離し、ＨｕＬｙｌＦＮ　−ｍＲＮＡ
のために濃縮する。
（２）コのテンプレート（鋳型）から−重鎖相補性ＤＮ
Ａを、そこから二本＠ｃＤＮＡ製造する。
（３）　　ｄ　ｍ　ａＤＮＡを適当なベクトルＤＮＡに
導入する、（４）得られた組み換えＤＮＡで適当なホス
ト微生物を形質転換する、 （５）ヒトリンパ芽球ＩＦ？ＪｃＤＮＡもしくはＩ）Ｎ
Ａ断片で形質転換（７た、クローンを選択しおよびホス
ト微生物を培養する、任意に、形質転換したホストから
組み換えＤＮＡ　ｓを分離し、必要に応じてＩＦＮ活性
をもつポリペプチドのレベルを改善するために、組み換
えＤＮＡ＠を変異させ、（４）および（５）の段階を再
び行なう。
１、　ヒドリンツタ芽球細胞の誘発およびＨｕＬｙＩＦ
Ｎｍ　−ＲＮＡのために濃縮したヒドリン・量芽球Ｉリ
　。
（Ａ　）ＲＮＡの雄錬 ＨｕＬｙｌＦＮ　ｍ　−ＲＮＡの九めに濃縮したヒトリ
ンパ芽球／　ＩＪ　（Ａ）ＲＮＡの分離は、種々の既知
の方法によって達成され得る６本発明において用いられ
る方法は次の段階から々る： ａ、　　ＬｙＩＦ’Ｎ合成のためヒドリン・ｆ芽球細胞
の誘発１ ｂ、誘発細胞の破壊、 Ｃ０蛋白、す／蛋白＊　ＤＮＡ５およびＪ！種のＲＮＡ
　ａを混同物からのリンパ芽球ポＩＪ　（Ａ）ＲＮＡの
分離・ｄ、　　ＬｙＩＦＮ％異性ｍＲＮＡのための濃縮
。
ａ、　　ＬｙＩＦＮ合６Ｍのためヒトリンフ４芽球細胞
の誘発 ＩＦＮ誘発体への露出の結果として、ヒ）　＋７ンノ９
芽球細胞は、Ｌｙ　Ｉ　ＦＮｍＲＮＡおよび続いてヒト
Ｌ）ｒＩＦＮを生成する。
適するＩＦＮ誘発体は、たとえば釉々の化学剤、二本鎖
ＲＮＡ　Ｃ列Ｉす（１）：ポリ（Ｃ）〕、または特にあ
る種のウィルス％特にパラミクンウイルス、ゾンイドミ
クンウイルスおよびレオピリジモル科であり、列として
はニューカッスル病ウィルス（株１１０、Ｂ１．う・ツ
タまたはテキサス）、センダイウィルス、青舌病ウィル
ス、麻疹ウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、パラーイ
ンフルエンザＩ型、Ｉ型または■型またはセムリキ森林
ウィルスが挙げられる。
ヒトリンパ芽球細胞は好都合にプルキ、トスリンパ腫の
患者から得られる。このような細胞系統の１つであるナ
マルワはウィルス性の刺激で、ＩＦＮの高レベル、をに
叙する（　２６　’）−、・ナマルワ細胞とは別に、ｌ
Ｊンノ４芽球細胞、たとえばダウディ細胞、アクパ細胞
％ＮＣ−３７細胞％ＲＮ−２細胞および当該分野で既知
の他の細胞が用いられる。
誘発以前に、リン・母芽球細胞は低級直鎖アルカン酸、
たとえば、リンパ芽球細胞によるＩＦＮ生成を高めるこ
とが知られているブチル酸もしくはその塩で前処理する
（２７．２８）、更に必要に応じてもしくは所望ならば
リンパ芽球細胞を、同類ＫＩ＾の少量と処理することに
よって！ライマー化する。
リンパ芽球細胞の誘発は、文献記載の類似の方法を用い
て行なう、リンパ芽球細胞、たとえばナマルワ細胞は、
慣向上の栄養培地（列ＲＰＭ１１６４０培地）、で約１
０４胎生血清を加え、十分な細胞密度（列、　　１０６
−１０７細胞／ｄ）で増殖させる。
遠心によ・りて培地から＋ｍした細胞は栄養培地で懸濁
し、適するウィルスを適当な期間で（列、５−１６時間
）１０６細胞に対して約２００血球凝集ユニットの＃度
になるように添加（例、二、−カッスル病ウィルス）し
て、誘発させる。誘発細胞が十分な滴定量（力価）で、
ＩＦＮを生成したらすぐに、細胞は採取し、セして更に
下記載のように処理する。ＴＦＮ活性はたとえばアーム
ストロング（２９）によって考案された色票−吸収法に
よって測定する。
ｂ）誘発細胞の破壊 核酸分離における第一段階は、細胞破壊物からなる成分
からの分離、混合している蛋白を除去することである。
細胞破壊に用いられる方法は、くり返して凍結および解
凍することおよび、機械的な破壊、たとえばがラスーホ
モｒナイザーでモータ一つきのテフロン棒でホモク９ナ
イズすること。
浸透圧によって破裂させること、超音波による破＊、お
よびアニオン浄化剤のような溶菌化できる化学剤、たと
えば硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ　）畿酸ドｒシル
リチウム、４−アミンサリチル酸ナトリウム、サルコシ
ンドデシルナトリウム、またはトリーインプロピルナフ
タレンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。ある場合に
は、アニオン浄化剤の適用は蛋白−複合体から核酸を部
分的に遊離するお工び部分的にＲＮＡ５ｅ活性を抑制す
る結果となりやする。好ましくは、操作は高濃度の浄化
剤でおよび、核酸特に爺小限度の分解であるＲＮＡの完
全な遊離を遅成するために簡単な露出期間で行なう。
好都合に、誘発細胞は適当なアニオン浄化剤（レリ、硫
酸ドデシルナトリウム）を慣例的な緩衝液（列、Ｘ）中
で、作用させ溶菌化する。簡単々露出期間後、懸濁液は
、Ｃ項記載のように脱蛋白剤と処理する。
Ｃ）蛋白、リポ蛋白、ＤＮＡ　ａおよび異種のＲＮＡ５
の混同物からのリンパ芽球ポ！Ｊ　（Ａ）ＲＮＡの分離
得られた核酸混合物の脱蛋白は、化学剤、たとえば１−
４％１−ペンタノールを含むクロロホルム・または特に
フェノール、の作用によって遅成し得る。蛋白はたとえ
ばプロナーゼもしくはプロテアーゼｐ、いかなる蛋白も
アミノ酸にほとんど分解しうるプロテアーゼによる分解
によっても除去し得る。蛋白を完全に除去するために２
つの化学説蛋白剤、フェノールとクロロホルム、モジ〈
はプロテアーゼ処理後、続いて化学説蛋白剤（列、フェ
ノール）で処理するような組み合わせで行なっても良い
。
特に、核酸混曾物の脱蛋白は、プロテアーゼ（列、プロ
ナーゼ）と培養し、得られた混合物をフェノールで、次
いでクロロホルムで抽出をくり返す。フェノール系を適
用すると、すべての変性した、かつ分解した蛋白はフェ
ノール相および中間相に移る。
ポＩＪ　（Ａ）ＲＮＡ回収のためのこの段階および続く
次の段階は放射能活性のあるラベルしたマーカーｍＲＮ
Ａ　Ｃ列、１２５Ｉ−グロビンｍＲＮＡ　）の少量を加
えることによってｔｎＲＮＡ分解のための制御すること
ができる・ 精製したデオキシリがヌクレアーゼ（ＲＮＡａｓ・を含
まない）は混同したＤＮＡを分解するために用いられる
。
必要に応じて、’　ＲＮＡはＣ５Ｃｔグラジエントにお
ける平衡遠心によって、ＤＮＡと混同することなく得ら
れる。更に、ＲＮＡはクロマトグラフィー（列、ヒドロ
キシ燐灰石カラムクロマトグラフィ）によってＤＮＡか
ら分離することができる。
純粋な溶液中に存在しているｍＲＮＡけ、他のＲＮＡ種
、（列、ｔ　ＲＮＡもしくはｒＲＮＡ　）から、その３
′−末端でアデノシンヌクレチドの長い非−中断排列（
１００−２００残基長さ）によって異なる。ポリ（Ａ）
鎖は、常法、たとえはオリゴ（ｄＴ　）セルロース４Ｌ
＜け（ＩＪ）セファロースへのくす返しのパッチ吸収、
によって、　ｍＲＮＡを選択することが利用される。結
合−したポリ（Ａ　）ＲＮＡは１次いで１弱いイオン強
度で溶液１列、水）の数回の洗浄で溶出される。
たとえば誘発細胞（段階１ｂ）のプロテアーゼ溶解化後
、得られ九核酸混合物からなるポリ（Ａ’ＪＲＮＡの分
離の好ましい具体化け、変性した、および分解した蛋白
を除去のために、フェノール次いでクロロホルムで抽出
し、得られた溶液をオリが（ｄＴ　）セルロースクロマ
トグラフィーにかけ、結合し７ｊ／す（Ａ　）ＲＮＡを
水で溶出する。所望ならばまたは必要に応じて、オリゴ
（ｄＴ）セルロースへの吸収を数回くり返す。
この段階でポリ（Ａ　）ＲＮＡは、イン、ビトロ、翻訳
系（例、レティキュロサイト翻訳系、セツデスラエビス
）におけるＨｕＩＦＮ活性を示すポリイグチドの合成効
力を直接に測定することができる。　ＩＦＮ％異性ポリ
ペゾチドは放射線免疫検査または特に細胞病理生物検査
を用いて同定できる。この目的のために、回収したポリ
（Ａ　）ＲＮＡを適当な溶媒、たとえ６は水、希釈した
（　ＶＡＪ　１　ｍＭ　）　ＥＤＴＡ溶液または慣−列
上の緩衝液に溶解し、コルマンら％　（３０）に従って
、アフリカン、２０−、トート（ゼノプスラエビス）の
卵母細胞にマイクロ−注入をする。卵母細胞において生
成したＩＦＮは細胞病理生物検査たとえばアームストロ
ング（２９）による色素−結合分析の使用によってまた
はスチュワートら、（３１）による適する攻撃ウィルス
たとえば小水庖性口内炎ウィルス（ＶＳＶ　）をヒト細
胞系統、たとえばＣＣＬ　−２３細胞またはＨｏｐ　−
２細胞への適用に基づく細胞病理効果の減少を用いて測
定する。
所望ならばここで記載の操作のいかなる段階でも、いか
なる′ｎＩＭ形態で分離されたもしくは対応するＤＮＡ
　カら銹導さｉ＊（ＰＩＪ、４鎖ｃＤＮＡ　）　ＲＮＡ
　（ＤＨｕＩＦｍＲＮＡ活性は、上記載のいずれかの検
査方法によって測定できる。
ｄ）　　ＬｙＩＦ′Ｎ特異性ｍＲＮＡのための濃縮他と
混同しているＲＮＡ　＆、たとえばｔＲＮＡ　。
ｒＲＮＡまたはＤＮＡ（ｌｅｉ参照）の除去後、０．５
ｍＭ１　ｍＭＥＤＴＡ中のポリ（Ａ）ＲＮＡ　溶液は、
フェノールでの付加的抽出によっておよび二価カチオン
を除去するためにキレ、クス（Ｃｂｅ１＠ｘ　）カラム
を通すことによって精製する。
リンノｆ芽球Ｈｕ　Ｉ　ＦＮｍＲＮＡのためのポリ（Ａ
　’）ＲＮＡ画分の濃縮は、文献から知られているいろ
いろの方法によって達成し得る。本質的に合体した単−
ｍＲＮＡ　ａｌｌの異なる分子蓄の大きさに基づく。
大声さに基づくポ＋）　（Ａ）ＲＮＡ０画分は、たとえ
ばデキストラン誘導体またはシリアクリルアミドのカラ
ムグルろ過、七の場８−、ダル粒子中により小さい分子
はいろいろの程度で入りこみ、大きい分子はとどまるこ
となく容易に通過することによって得ることができる。
更にポリ（Ａ）ＲＮＡ　Ｍｌの混合物は、ポリアクリル
アミド、澱粉またはアガロースダルのゾーン電気泳動に
よって分画することができる。ポリ（Ａ　）ＲＮＡは５
−２３％のシュクロース酢液をダレディエンドとしての
シュクースデンシティダレディエント（軸密度勾配）を
用いての遠心によって沈降速度に基づいて分離する。
たとえば、ポリ（Ａ）ＲＮＡ混合物の画分は、次のよう
にして得られる。他の混同したＤＮＡおよびＲＮＡ　＠
から遊離したＩす（Ａ　）ＲＮＡ溶液は、ごく少蕾のＥ
ＤＴＡを含む慣例上の緩衝液中のシュクロース、デンシ
ティダレディエン）（Ｅｌ’ｌＪ、５−２３１）を用い
ての遠心によって、大きさに基づいて分画する。画分は
集め、前記載（ｌｃ項）のようにＩＦＮｍＲＮＡ活性の
測定をする。最も高いＩＦＮｍＲＮＡ活性を示す画分は
、合わせてオリゴ（ｄＴ）セルロースまたはポリ（Ｕ）
セファロースカラムにかける。
ＨｕＬｙＩＦＮｍＲＮＡのためにかなり濃厚である結合
したポリ（Ａ　）ＲＮＡは水で溶出され、ヤしてエタノ
ールで沈澱する。
この段階で、ＨｕＬｙＩＦＮｍＲＮＡ活性を、再開、＃
記載の方法（ｌｃ墳参照）によって測定する。一般的に
、シュクロース、ダレディエンド遠心でＨｕＬｙＩＦＮ
ｍＲＮＡ　１　ｎ　−２０倍濃縮した結果を得ることが
できる。
２、　　）ＩｕＬｙＩＦＮｄｓｅＤＮＡを含むリンパ芽
球二重鎖ｃＤＮＡの製造 前記載（１ｄＪＪ）のように得られたＨｕＬｙＩＦＮｍ
ＲＮＡのために濃縮さねたポリ（Ａ　）ＲＮＡけ、二重
鎖ｃ　ＤＮＡを得るためのテンプレートとして用いるこ
とができる。この転＃は、単一鎖ｅＤＮＡの製造第二の
ＤＮＡ鎖の合成および第一段階で生じた終末端の“ヘア
ーピンｈａｉｒ　ｐｉｎ“構造の分解を含む。
ａ、単一鎖ｅＤＮＡの製造 前記載（ｌｄ項）のポリ（Ａ　）ＲＮＡに相補性を示す
（Ａ）一本領ＤＮＡけ、該ＲＮＡの送転与によって製造
することができる。合成はＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメ
ラーゼ（リバーストランスクリデターゼ）、−たとえば
鳥類の骨髄芽球ウィルス（ＡＭＶ　）　Ｋよって触媒さ
れる。ＡＭＶリバーストランスクリデターゼは一本鎖Ｒ
ＮＡ上のＤＮＡ＆ｌｆｔを開始しない。ＲＮＡテンプレ
ート鎖をもつ塩基一対合である遊離３′−水酸基をもつ
プライマーを必要とするＤＮＡポ１ツメラーゼと同様で
ある。というのはポリ（Ａ）末端はｍＲＮＡ−の３′−
終末に付着し、好ましくは、たとえばプライマーとして
オリゴデオキンチミジレート〔オリゴ（ｄＴ’ｌ）また
はポリ（Ｕ’）を用いる。排列情報が役に立つ場合、興
味ある遺伝子のために選択的にｃＤＮＡ合成を前もって
キテなうことかＴ＝ｆ能である。
たとえば、一本ｄ　ｃＤＮＡの合成は次のように行なわ
れる。前記載のように分離され、精製されたｙｌ　ＩＪ
　（Ａ）ＲＮＡは、慣例上の緩衝液中でプライマー、タ
トエばオリゴ（ｄＴ　”）、マグネシウム塩（列、塩化
マグネシウム）、メルカプトン、ジチオスレイトール（
ＤＴＴ　）、　　ｄＡＴＰ％　ｄＧＴＰ％　ｄＣＴＰ、
　　ｄＴＴＰおよびＡＭＶリバーストランスクリデター
ゼと混合い反応させる。好ましくは、デオキシヌクレオ
シド）　ＩＪホスフェートの高濃度は、実物大模写の曾
成をうながすために選択される。続いての一本鎖ＲＮＡ
上 シヌクレオシドトリホスフェートの１つが５２ｐでラベ
ルされている場合、容易に行なうことができる０反応は
たとえばＥＤＴＡおよびＳＤ８を含む阻害の混合物の添
加によって停止する０反応の停止後、生成物はたとえば
、フェノールおよびクロロホルムでの溶液の抽出によっ
て脱タン／ｆ／し１次いで、塩および取り込まれないデ
オキシヌクレオシドトリホスフェートを除くためにセフ
ァデックスカラムでクロマト処理する。合成されたｃＤ
ＮＡ（デオキシヌクレオシドトリホスフェートの一つが
３２ｐでラベルされたのが提供され・用いられる画分の
同定は、容易にセレンコツ放射線によって達成できる）
を含む画分はプールし、核酸（ＲＮＡおよびｃＤＮＡ　
）は、たとえばエタノールによる沈澱によって分離する
。テンプレートＲＮＡはり〆ヌクレアーゼたとえばＲＮ
Ａ５＊ＡまたばＲＮＡＩ＠Ｔ１もしくは好ましくは、た
とえば水酸化ナトリウムのようなアルカリ加水分解くよ
って、除去する。残りのｃＤＮＡの大きさは、アルカリ
アガロースダルもしくは知られた長さのマーカーＤＮＡ
５　　（列、３２）を用いて適切なポリアクリルアミド
ダルにおける電気泳動移動度から測定できる。
ｂ）二重鎖ｃＤＮＡの製造 前記載のように製造された一本鎖ｃ　ＤＮＡは３′−終
末端“ヘアーピン”構造を有する。この“へアービン”
構造は、続いての第二のＤＮＡ鎖の合成のために、ｃＤ
ＮＡセルフープライミンダ（＠ａｌｆ−ｐｒｉｍｌｎｇ
　）をする短二重鎖領域を構成する。従って付加的なプ
ライマーは必要としない。
二重鎖ｃＤＮＡは、ＲＮＡ−依存性ＤＮＡ　−ｙＪ？リ
メラ−４’（％Ｊ、ＡＭＶリバース、トランスクリプタ
ーゼ）によって、一本領ｃ　ＤＮＡの合成における前記
載と同様の操作で（ポリ（Ａ　）ＲＮＡを一本鎖ｃＤＮ
Ａによって置換しおよびプライマーを省くことを除いて
）＠−成することができる。任意に、デオキシリがヌク
レオチド前駆物質からＤＮＡ０台成を合成する他の酵素
も同様に用いることができ、列としてＴ　４　ＤＮＡポ
リメラーゼ、　Ｅ、　ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ（フ
レノウ断片）４たは好ましくは、Ｅ、　ｃｏｌｔＩ）Ｎ
Ａ　Ｊリメラーゼ■が挙げられる。
第二鎖の合成は、一本領ｃＤＮＡ　ｓマグネシウム塩（
列、塩化マグネシウム）、メルカプタン、ジテオスレイ
トール（ＤＤＴ）、４つのデオキシヌクレオシドトリホ
スフェート、（そのなかの１つは放射能的に、たとえば
３Ｈでラベルされ念）、およびＤＮＡポ□リメラーゼ（
列、Ｅ、　ｃａｌｌ　ＤＮＡポリメラーゼＩ）を含む緩
衝液を用いて行なう０反応の停止後・混合物の脱タン・
譬り（２ａ項参照）シ。
ＤＮＡはエタノールで沈澱させる。
得られたｄｓＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖に関連する−へ
７−ピン”ループを含む。ループは、Ｓｌヌクレアーゼ
で切断し塩基一対会終末端をもつｄｓｃＤＮＡを得る１
分解は緩衝混合液中で、亜鉛塩（ｐＨ％硫酸亜鉛）の存
在下に、第二鎖合成の生成物を８１ヌクレアーゼで処理
することで行なわれる。分解はＳＤＳおよびＥＤＴＡの
添加によって停止することができる。フェノールで脱タ
ンパク後、溶液は七ファデックスカラムでクロマト処理
する。
ｃｌｓｃＤＮＡを含む一分（たとえば各々の画分をセレ
ンコツ放射線を測定することによって決定できる）はプ
ールし、　　ｃＤＮＡはエタノールで沈澱させる。
好都合なことに、まだ多くの異種からなる合成されたｄ
ｍｃＤＮＡは、更に、この段階で、央物太ｄｓｃＤＮＡ
のために濃縮化される。この目的のために適する方法と
しては、ｒルろ過、ポリアクリルアミドもしくはアガロ
ースゲルでの電気泳動、まタハシ、クロース、ダレディ
エンドを用いての遠心が挙けられる。既知分子量のＤＮ
Ａ分子の補助的電気泳動または遠心を行ない、期待され
るＩＦＮｄｓｃＤＮＡｓ　（先に出版されたデータ：１
４．１６゜１８．３３によると、７００−１２００塩基
一対合である）の分子量を所有するｄｓｃＤＮＡ分子の
局在化を可能にする０ たとえば、慣例上の緩衝溶媒中に溶解したｄｓｃＤＮＡ
ヲシュクロースグレデイエント（Ｆｉｌ、５−２３％）
を用いての遠心にかける。適するマーカーＤＮＡより早
く沈降するＤＮＡ種を平行してダレディエンド（例、７
００−８００塩基対会マーカー）にかけ、分離する。
３、　　ＨｕＬｙＩＦＮｄｓｃＤＮＡのために濃縮した
ｄｓ　ｃＤＮＡ　（７）　９　ローニンク１、一般的な
考慮 前記載のように（２ｂ項）得られたｄｓｃＤＮＡのクロ
ーニングは、既知の方法によってできる。操作には、ｄ
ｓｃＤＮＡを適当表ベクトルＤＮＡ　Ｋ会合させｔおよ
び複製することができる適当なホスト細胞中に得られる
組み換えＤＮＡを転移する（形質転換）ことを含む。
ベクトルＤＮＡは、ホスト細胞に転移する場合。
その自己複製を確実にする遺伝的機能を含むＤＮＡ分子
である。更に、プラスミド−運搬ホスト細胞（形質転換
体）を細胞の大集団、その大部分はプラスミドを含まな
い細胞から選択されることによる遺伝子を含むベクトル
ＤＮＡが望ましい。遺伝子工学で通常用いられるベクト
ルＤＮＡ　ｓの岡は、実験的にｄｓｃＤＮＡが付着しう
るバクテリオファージの環状プラスミドＤＮＡおよびＤ
ＮＡであり、例として、バクテリオファージ人の誘導体
、％にプラスミドｃｏｌ　Ｅ　１または七の誘導体、た
とえばｐＭ８９　。
ｐｓＦ２１２４．ｐＢＲ３１７および特にｐＢＲ３２２
が挙げられる。記載のプラスミドはアンピシリン抵抗性
（不応性）および部分的にテトラサイクリン抵抗性に対
する遺伝子を有する。従ってこのようなプラスミドを含
むホスト細胞は、親（ｐ）ホストから形質転換体を分離
できつる一８現型を示す。
たとえば組み換えＤＮＡ分子を得るために、好適なプラ
スミド（列、ｐＢＲ３２２）を開裂し、ｄｓｃＤＮＡヲ
線状プラスミド中に挿入し、環を再閉して挿入したｄｓ
ｅＤＮＡ断片からなる増補した組み換えプラスミド分子
形成する。好都合なことＫ。
！ラスミドＤＮＡは限定された位置で開裂する。この目
的の之めに、制限エンドヌクレアーゼの多数は、有効で
あり、それには特異性ＤＮＡ排列を認めることができる
。いくつかの制限エンドヌクレアーゼは、両ＤＮＡ鎖を
同一点で開裂し、′プラント”終末端を生ずる。他の制
限エンドヌクレアーゼは、二、三のヌクレオチドによっ
て、お互いから分離される結合の開裂を触媒し、開裂さ
れた遊離の一本銀領埴で分子の各々の終末端（′″スタ
ガード末端を生ずる。
ＤＮＡ断片は１通常一本鎖結合力のある終末端で会合し
、ＤＮＡリガーゼ（列、Ｔ４諏Ａリガーゼ）によって、
共有結合的に閉じられる。相補性末端は、二つの限定し
た方法において：″スタガード切断をするおよび結合力
のある末端生成する制限ｒ！＃素による開裂または制限
された一本鎖排列の添加ｉＱ、ホモポリメリ、り末端）
によって行なわれる。任意に、十分に塩基一対合したＤ
ＮＡ−重複。
プラント−終末端は、Ｔ　４　’Ｊガーゼによって会合
さｈａる。たとえばプラスミド（的、ｐＢＲ３２２）は
適する制限エンドヌクレアーゼ（列％ｐｓｔｌ）によっ
てｒＷＪ裂され、線状シラスミドおよび挿入されうるｄ
ｍｃＤＮＡは、各々適当な酵Ｒ（的、末端デオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼ）の存在下に、−水銀ホ
モポリメリ、り末端ともに延長する。たとえばポＩＪ（
ｄＣ）末端は、１方のＤＮＡ製造に加えることができ、
ポリ（ｄＧ）末端は他（任意にｄＡおよびｄＴ末端は同
じく選択できる）に加えることができる。ＤＮＡの二つ
の型はそれらの相補性末端を通じて会合されうる。
有用なホストとして、たとえば酵母、特に形質転換に可
能表組−１および制限酵素および修復（修正）酵素を欠
く細菌九とえは大腸菌株（列。
Ｅ、ｃｏ１１Ｘ１７７６ｅＥ、ｃｏｌｉＨＢｌｏｌ）１
ヒたは枯草菌系統〔例、パシルメステアロサーモフィラ
ス（Ｂａｅｌｌｌｕｓ　ｓｔ＠ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ　’）　ｓ　ｆｉミソイトモナス　Ｐｇ＊ｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　）、ヘモフィルス（Ｈａ＠ｍｏｐｈｉｌ
ｕｍ　）、ストレゾコツカス（Ｓｔｒ＠ｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ　）および他の細菌〕オヨヒソノ突然変異体が挙げ
られる。
前記載のように製造され九組み換えＤＮＡ分子は、通常
のたとえばホスト細胞のＣａ＋十前処理を含む形質転換
操作によって、適するホスト細胞に転移することができ
る。ホス・ト細胞への表現型特性〔列、テトラサイクリ
ン抵抗性（不応性）〕を授けられている組み換えプラス
ミドＤＮＡを含む細胞は、アがロースプレート上の選択
的（％Ｊ、テ）：Ｉｔサイクリン−含有）栄養培地にお
ける平板培養によって選択される。
本発明において、好ましいベクトルＤＮＡはグラスミド
ｐＢＲ３２２であり、それは適当な制限エンドヌクレア
ーゼ、特にＰａｔｌによる開裂後、相補性ホ七ポリメリ
、り末端、特にｄＧ　：　ｄＣ−末端を経てｄａ　ｃＤ
ＮＡに結鎖する。得られる組み換えＤＮＡは、Ｅ、Ｃｏ
１１　ＨＢ　１０１に転移する。
前記載に基づ（ｄａ　ｃＤＮＡ合成経路を経て製造され
たＩＦＮ遺伝子のかわりに、対応するクロマトシームＤ
ＮＡは、同様ＫＩＦＮ活性をもつポリペプチド生成可能
なりローンの製造のために用いられる。
クロマトシームＤＮＡは、ナマルワ細胞のようなヒ）　
ＩＪン／４芽球細胞から、当該分野において既知の方法
、たとえば全クロマトシームＤＮＡのＡｌｕ　ｌＫよる
部分的な開裂および得られた断片のλカロン４Ａアー亡
（λＣｈａｒｏｎ　４Ａ　ａｒｍｓ）に連結するＥｃｏ
　ＲＩによる会合するか憧たに制限酵素（例。
Ｋｐｎ　ｌまたはＨｉｎｄ　Ｉ　）によるクロマトシー
ム鳳の開裂によっておよび得られた断片をプ゛ラスミド
ｐＢＲ３２２またはコスミド（ｅｏａｍｌｄ　）　ＤＮ
ＡのようなベクトルＤＮＡに連結することによって得ら
れる。組み換えベクトルＤＮＡはＥ、ｃｏｌｉのような
ホストに形質転換することができる。クロマトシームＩ
ＦＮαおよびβ遺伝子を含むコロニーはコロニー交雑に
よって、（４１章参照）放射能でラベルした合成オリゴ
デオキシヌクレオチドモジくハ放射能でラベルしたαお
よびβ特異性ＩＦＮ　ｅＤＮＡを試験材料として、使用
することによって同定される。サブ−フラグメント（断
片）は、適当なエンドヌクレアーゼによる同定された断
片を制限することによってもしくはそれらを適当なエン
ドヌクレアーゼで分解することによって得られる。
従って、本発明は、ヒトリンノや芽球細胞もしくは断片
から誘導されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ　ｉ棟または、
インターフェロン一様ポリペプチドのためのコード化の
該配列の突然変異体または該ＤＮＡに交雑するＤＮＡの
製造方法に関するものであり、次の過程を含む。
（１）　　ＨｕＬｙＩＦＮ−ｍＲＮＡから一本鎖相補性
ＤＮＡを製造する、必要に応じてそこから二本鎖ｃ　Ｄ
ＮＡまたは（２）・ヒトリンノや芽球細胞のクロマトシ
ームＤＮＡの部分的開裂、およびクロマトシームＬｙＩ
ＦＮ遺伝子を含む断片の選択、該配列の断片が必要な場
合、該ＤＮＡを適当なエンドヌクレアーゼで限定し、ま
たは該１）ＮＡを適当なエキソヌクレアーゼで分解しま
たは組み換えＤＮＡが必要な場合、適当なベクトルＤＮ
Ａに該虱を導入する。
ｂ、線状（棒状）、デオキシヌクレオチド−延長したｐ
ＢＲ３２２の製造 本発明に係る好ましいベクトル、シラスミドｐＢ、Ｒ３
２２眸４３６１壇基一対からなる小さなプラスミドであ
る。細菌受容体細胞で各々アンピシリンおよびテトラサ
イクリン抵抗性（不応性）を授けられる２つの遺伝子（
ａｍｐｒ、　Ｌｅｔｒ）を含む、そしてそれは形質転換
した細胞の選択および同定のために用いられる。ｐＢＲ
３２２内には、いくつかの限定位置が存在する。単−Ｐ
ｓｔ１位置はａｍｐｒ遺伝子内にあり、一方ｍｏｌｅ　
ＢａｍＨ１、Ｈｉｎｄ　［１およびＳａｌ　１位ｔＩＬ
はｔｅｔｒ遺伝子内にある。単−ＥｃｏＲ１位置はどこ
にでも存在する（３４）。異名の制限エンドヌクレアー
ゼの一つを適当する場合、ａｍｐｒ遺伝子またはｔｅｔ
ｒ遺伝子のどちらかまたは両方の遺伝子はそのまま残る
。従って例証された酵素のどちらかが開裂およびｐＢＩ
’Ｌ　３２２の線状化に適する。
プラスミドｐＢＲ３２２を線状化の後、デオキシヌクレ
オチド鎖は終末端デオキシヌクレオチ・ゾルトランスフ
ェラーゼの存在下に両３′−末端に加えられ得る。好ま
しくは、約２０−５０デオキシヌクレオチド残余体を相
補性デオキシヌクレオチド鎖によって延長したｄｓ　ｃ
ＤＮＡに、安定な結合を確実にするために加える。
たとえばプラスミドｐＢＲ３２２を、塩化マグネシウム
、メルカプタン（例、２−メルカプトエタノール）およ
び担体タン／４り源（牛血清アルブミン、グラチン）を
含む適当に緩衝化した水溶液で、付加的に制限エンドヌ
クレアーゼ（例、　Ｐｓｔ　ｌ　）とともに処理する。
分解が終了した後、溶液は、たとえばフェノールで脱タ
ンパクする。デオキシヌクレオチジル残余体の最終的ガ
添加を、塩化マグネシウム、カコジルナトリウムおよび
担体タン・譬り（例、牛血清アルブミン）を含む慣例上
の緩衝液系において、デオキシヌクレオシドトリホスフ
ェートの十分な量（例、ｄＧＴＰ　）および末端デオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼとともに処理する
。
Ｃ，デオキシヌクレオチド−延長したｄａ　ｅＤＮＡの
製造 前記載のように（２ｂ項）得られたｄｓ　ｃＤＮＡの延
長は、相補性デオキシヌクレオシドトリホスフェート（
例、ｄＧＴＰの代りにｄＣＴＰ　）を用いて、好ましく
は塩化マグネシウムの代りに塩化コバルトを用いての線
状のデオキシヌクレオチド−延長したプラスミドｐＢＲ
３２２（３ｂ項参照）の合成のように同様の方法で行な
う。
たとえばｄｓ　ｃＤＮＡはカコジルナトリウム、塩化コ
バルト、タンノ々り（例、牛血清アルブミン）、対応す
るデオキシヌクレオシドトリホスフェート（例、ｄＣＴ
Ｐ　）および末端デオキシヌクレ、オチジルトランスフ
ェラーゼを含む緩衝液で培養する。
ｄ、ＩＩＪ状の、鎖−延長したｐＢＲ３２２および鎖−
延長したｄｓ　ｅＤＮＡのアニール化 線状の、鎖−延長したプラスミドｐＢＲ３２２および鎖
−延長したｄａ　ｃＤＮＡ　Ｆｉアニール化でき、常法
で、すなわち相補性デオキシヌクレオチド鎖の塩基一対
合によりて再環状化できる。
環生成の促進およびコンカドマー（ｃｏｎｃａｔｏｍｓ
ｒｓ）を妨げる（異なる線状交雑プラスミドの結合）た
めに、反応は両鎖−延長したｄｓ　ｃＤＮＡおよび線状
ｐＢＲ３２２分子の低濃度で行なわなければならない。
たとえば、デオキシヌクレオチド−延長した（例、ｄＣ
ＭＰ−延長した）　ｄｓ　ｃＤＮＡおよび線状のデオキ
シヌクレオチド−延長しｆｃ（例、　ｄＧＭＰ−延長し
７’ｊ）ｐＢＲ３２２の混合物は、４連続１ｈ段階で異
なった温度（例、６５℃、４６℃、３７℃および２０℃
）で培養する。アニール化したＤＮＡ　ｉ、適合した細
菌（例、＆ｃｏｌｌＨＢ１０１）への形質転換のた結に
直接用いることができる。
この点において、アニール化操作（方法）による生成物
は、組み換えＤＮＡ分子を含み、その中でごく２，３が
ＨｕＬｙＩＦＮに関連しており、なぜならば組み換えの
大部分ｉｊ　Ｌｙ　Ｉ　ＦＮｍＲＮＡよりも他のｍ　Ｒ
ＮＡから誘導されたｃＤＮＡ挿入体を含む。
・、アニール化した交雑プラスミドを用いてのＣｅｏＨ
ＨＢ　１０１の形質転換 得うれたアニール化交雑シラスミドは、Ｅ、ｃｏｌｌＨ
ＢＩＯＩの形質転換に用いることができる。グラスミド
は細胞内で複製され、プラスミド複製体は、細胞分裂の
際娘−細胞ＶＣ配分される。アニール化交雑プラスミド
でのＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１の形質転換は、文献に
記載の既知の方法で行なう。この操作にＦｉＤＮＡの利
用（摂取）　（ＤＮＡ　ｕｐｔａｋｅ　）をさせる〔例
、　（３５））と同様に細胞の（：Ａ＋＋−前処理およ
び交雑グラスミドとの培養を含む。次いで細胞は、親細
胞から形質転換した細胞の分離をする選択的増殖培地へ
転移する。なぜなら、交雑プラスミドはｔ＠ｔｒ遺伝子
を含み、成長阻害物質として、テトラサイクリンを含む
アガール（寒天）培地は好都合に選択される。たとえば
交雑グラスミドおよびＣａ”＋で前処理したＥ、ｃｏｌ
ｉ　ＨＢ　１０１細胞をＣｍ″塩（例、塩化カルシウム
）およびＭｇ＋＋塩（例、塩化マグネシウム）を含む緩
衝液で培養する。十分な培養時間（例、１０−４０分）
後、細菌を熱−ノ４ルス（３５−４２℃）に、短時間（
１−５分）かけ、細胞は冷却し、たとえばトリプトン・
アガール、またはマ、クコンケイ・アガールで、テトラ
サイクリンの十分量で補足した寒天培地で平板培養する
。このような培地で生き残った細胞は再１状プラスミド
もしくは交雑プラスミドＤＮＡを含む。従って増殖した
コロニーは、通常なりローンのためのスクリーンするた
めに用いられる。
４、リンパ芽球Ｉ　ＦＮ　ｃ　ＤＮＡを含むクローンの
同定ａ、　ＬｙｌＦＮｃＤＮＡを含むクローンの同定の
ために適する方法 特異遺伝子を含むコロニーはいろいろの方法によって同
定することができ、たとえば一方ではＲＮＡ選択交雑、
特異交雑、合成検体での交雑によって同定することがで
き、または他方では特別な遺伝生成物を生成するクロー
ンは、免疫学的または生物学的（分析）検査によって同
定できる。
一方免疫学的または生物学的アプローチは、免疫学的ま
たは生物学的に検出可能な遺伝生成物の生成により、初
めの一連の方法は、基本的に、非−特異性交雑生成を妨
げるために、十分に精製された条件下にある適当な検体
の入手可能性に依存している。適する検体は望ましいも
しくは対応するｃＤＮＡ［相補的なｍＲＮＡである。
ヒト白血球および締維芽細胞ＩＦＮを含む細菌クローン
のためのスクリーニングに関するいくつかのアプローチ
は知られている。たとえばゴエデルら、（１３）および
スガノら、（１６）ｔ’！、ＩＦＮ遺伝子を二つの交雑
セットの視覚的比較によって同定する。第一のセットは
、プライマーとして合成デオキシアンデカヌクレオチド
（：Ｉ＃エダル）またはオリゴ（ｄＴ）（スガノ）およ
びラベル剤として５２ｐ−ラベルしたＣＴＰを用いて、
誘発細胞から得られ九ｍＲＮＡ混合物の、逆転写によっ
て合成された放射性ｃＤＮＡと交雑化する。第二のセッ
トは、未誘発細胞から得られ九ｍＲＮＡ混合物から同様
の操作で生成された放射能ｃ　ＤＮＡと交雑化する。こ
の操作は、示めされたデータからは明らかなように、特
異性および再現性を欠くことに特徴がある。ワイスマン
によって報告された他のアプローチは、ＲＮＡ選択交雑
操作を用いており、望ましいクーロンのために、根気の
いる、困難な、多くの段階の探索からなる。
記載の方法は、ＬｙＩＦＮ−αおよびＬＹ　Ｉ　ＦＮ−
β遺伝子の分離のための本発明の目的に適用することは
できない、理由はＩＦＮ−βの濃度はヒトＬＹＩＦＮに
おけるＩＦＮ−αの約１０チに相当するからである。
この少量はそれらの方法の検出限界下にある。
この発明に関する当該分野の不満足なアプローチの結果
として、新規の方法が開発され、ＩＦ′Ｎ−αおよびＩ
ＦＮ−βｍＲＮＡ５に相補的な５′−末端ラベル化シタ
オリゴデオキシヌクレオチドの合成、プライマーとして
、該オリゴデオキシヌクレオチドを用いてＬｙ　Ｉ　Ｆ
ＮｍＲＮＡのために濃縮享れたポリ（Ａ）　ＲＮＡの逆
転写およびイン・シトウでのラベルしたｃ　ＤＮＡ検体
を用いてのフィルター−結合プラスミドＤＮＡ５のコロ
ニー交雑化からなる。このアプローチは、合成されたプ
ライマーオリゴデオキシヌクレオチドの塩基配列を含む
ＩＦＮ−αおよび一β遺伝子の特異的、迅速なおよび直
接の検出を可能にし、先行当該分野記載のように、更に
厄介な交雑−翻訳分析（検査）をする必要がない。イン
・シトウでのコロニー交雑ハ、グルンスタインとホッグ
ネス（３６）によって報告された方法もしくはその変形
に基づいている。この操作において、コロニー交雑化し
、またはニトロセルロースフィルターに転移し、アルカ
リ処理によって溶菌化し、イン・シトウでフィルターに
固定する。望ましい遺伝子に相補的な放射能ラベルした
接散の検体を、順次にフィルター結合ＤＮＡに交雑化す
る。交雑化した検体はオートラジオグラフで検出するこ
とができ、交雑化されうるＤＮＡを含む対応するコロニ
ーハ、ニトロセルロースフィルターの参照セットから分
離することができる。
クローン化したヒトＩＦＮ−αおよび’ＩＦＮ−βのｃ
ＤＮＡｓの伸長コード化の比較は、両方ｃＤＮＡｓ　（
および、自明に対応するｍＲＮＡ５）は共通である１３
ヌクレオチドの伸長を示めす（２３）。従って、上δ己
載の隣接塩基配列をもつ合成、１３−ｍａｒ第１Ｊコ゛
でオキシヌクレオチドは、ヒトリンフ９芽球ＩＦＮ−α
およびＩＦＮ−βｍＲＮＡからｃＤＮＡ合成のプライム
イヒのために用いることができる。
ｂ、３２ｐ　−ラヘに化１．タヒ）　ＩＦＮ−αオヨｒ
Ｅ　ＩＦＮ−β特異性ｅＤＮＡ検体の製造 与えられた構造のオリゴデオキシヌクレオチド（３７）
を合成するために、いくつかの証明されたアプローチが
ある。たとえば第１Ｊゴデオキシヌクレオチド合成は化
学的方法、たとえばジエステルまたはトリエステル法に
よって影響される。ジエステル法の基礎的な段階はホス
ホゾエステル結合ヲ含ｔｒジデオキシヌクレオチド生成
のために、二つの適する保護されたジオキシヌクレオチ
ドの連結をすることである。トリエステル法は）　ＩＪ
エステル法から区別され、有機溶媒にデオキシヌクレオ
チドおよびオリゴデオキシヌクレオチドを可溶にするリ
ン酸基から生ずる付加的有機保護基の存在下に行なう。
任意に、合成はポＩＪヌクレオチドホスホリラーゼを用
いて酵素的に行ない、その際、制御された条件下に、優
位に単一デオキシヌクレオチドを短オリゴデオキシヌク
レオチドに加える。
反応は溶液中または最近、高度に完成された固体箱技術
（手段）で行なうことができる。
たとえば式５′−ＣＣＴＴ′ｃＴＧＧＡＡＣＴＧ−３′
のヒトＩＦ″Ｎ−αおよびＩＦＮ−βｍＲＡに相補的な
、】３−ｍ＠ｒオリがデオキシヌクレオチドの合成は、
出発物質として保護されたモノ−、ジー、およびトリデ
オキシヌクレオチドを用いるイタクラ（３８）およびデ
ローイジイ（３９）によって報告されたように、トリエ
ステル−法によって行なうことができる。操作（方法）
の単一段階はジヌクレオチドの合成を示めした次の図式 １ Ｏ−Ｐ−ＯＲ３ Ｒ２ （式中、Ｒ，、Ｒ２およびＲ３Ｖｉ保護基であり、ｄＮ
およびｄＮ’はプリンもしくばピリミジン塩基であり、
ｃｏｎｄは縮合剤である） で表わされる。
本合成に用いられる出発物質（保護されたまたは部分的
に保護されたモノ−、ジー、またはトリデオキシヌクレ
オチド）は文献記載から知られている。好都合に、ヌク
レオチド３／　−Ｓ／一連結の開裂なしに緩和な条件下
に継続的に除去することができるような保護基を選択す
る。適する保護基Ｒ４は、たとえばモノメトキシトリチ
ル基またはジメトキシトリチル基であり、Ｒ２は、たと
えば２−クロロフェニル基、およびＲ３は、たとえば２
−シアンエチル基である。
アデニン、グアニンおよびシトシン残基における環外の
アミン機能は、特にアシル基、たとえばベンゾイル基ま
たはイソブチリル基によって保護される。縮合剤として
、たとオげ２，４．６−）リイソゾロビルベンゼンスル
フォン酸が用いられる・中間化合物における単一保護基
（例Ｒ，，Ｒ４およびＲ２）の特別の除去および十分に
保護された１３−ｍｅｒオリゴデオキシヌクレオチドの
脱鱗ｙａ（脱遮断）Ｆｉ、既知の方法によって行なわれ
る。たとえば２−シアノエチル基Ｒ３はアルカリ処理に
よって除去でき、モノメトキシトリチル基Ｒ４は８０％
酢酸処理によって除去でき、２−クロロフェニル基Ｒ２
はテトラブチルアンモニウムフルオライド処理によって
除去できる。当該分野で知られている他の方法も、同じ
く用いることができる。合成の各各の段階は図２で示め
す。
製造された１３−ｍａｒオリゴデオキシヌクレオチドプ
ライマーは、常法のクロマトグラフィ法たとエバＤＥＡ
Ｅ−セファデックスクロマトグラフィまたは／および高
度液体クロマトグラフィー（）ＩＰＬＣ）によって精製
する。プライマーは継続のシ・Ｂ′、操作における交雑
検体の検出を可能にせしめる５′−３２Ｐ−ラベル化さ
れている。ラベル化は、ラベル化したリン酸化剤、たと
えば〔ｒ−３２ｐ）で合成されたプライマーと常法で用
いられる緩衝混合液におけるＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼと反応させることによってなされる。３２Ｐ−ラベ
ルしたプライマーを含む得られた溶液は脱タン・９り（
例、フェノール）、クロマト処理（例、セフアゾ、クス
クロマトグラフイーまたはポリアクリル了ミドｒル電気
泳駒によって精製する。
Ｌｙ　Ｉ　ＦＮｍＲＮＡのために濃縮したポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡ（段階１ｄ参照）は次のようにＩＦＮ−αおよびＩ
ＦＮ−β特異性ｃ　ＤＮＡ検体の合成のためにテンプレ
ートとして用いる：　ｃＤＮＡ合或は、５′−ラベルし
た合成芽すゴデオキシヌクレオチドをオリゴ（ｄＴ）の
代りにプライマーとして用いることをのぞいて、前記載
（段階２１）のように同様の操作でもたらされる。ラベ
ルしたｅ　ＤＮＡ生成物は、たとえばフェノールで脱タ
ンパクし、エタノールでの沈澱によって集める。更に精
製は、たとえばｃ　ＤＮＡ生成物のポリアクリルアミド
グル電気泳動によって行なうことができる。生成物は、
オートラジオグラフで目に見えるようにすることができ
る。
誘発細胞からのポＩＪ　（Ａ）ＲＮＡに特異的でありお
よび非銹発細胞からのポリ（Ａ　）ＲＮＡの使用によっ
て得られた生成物に存在しない単−ＤＮＡ帯は、グルか
ら抽出される。その大きさは、たとえば既知の長さのラ
ベルしたマーカーＤＮＡ５との関係における相対的移動
度から決定する。生成物は、　Ｐ−ラベルしたヒトＬｙ
ＩＦＮ−αおよび−β特異ｃ　ＤＮＡ実験材料（検体）
である。
Ｃ，リン／ｆＦ芽球Ｉ　ＦＮ　ｃＤＮＡを含むクローン
のためのスクリーニング テトラサイクリンで補足した寒天培地（３０項参照）で
生き残りそして増殖したコロニーを、リンパ芽球ＩＦＮ
ｃＤＮＡを含むクローンのためにスクリーンする（ふる
い分ける）。この目的のために、イン・シトウでコロニ
ー交雑操作は、前記載のように選択する（４ａ項）。形
質転換コロニーは、ニトロセルロースフィルターに転移
し、およびそれらのコロニーの引例のセットは、付加的
寒天グレートにレプリカ平板培養によって得られる。フ
ィルター上のコロニーは、溶菌化され、ＤＮＡ　祉変性
シ、イン・シトウでフィルターに固定する（３６）。
交軸操作前に、フィルター上で変性ＤＮＡは、低いパッ
クグランドを得、および非−特異性交雑位置を飽和する
ために、たとえば異由来のＤＮＡを含む混合物で、有利
に前−交雑化する。続いて、前記載のように製造した（
４ｂ項）放射能ラベルしたｃＤＮＡ検体を鉱油でカバー
したフィルター結合ＤＮＡに交雑化する。フィルターか
ら鉱油および他の混同物（汚染物質）を除いた後、交雑
化の結果ｈ、ｘ−ｉフィルム上のオートラジオグラフ分
析によってモニターすることができる。コロニーは、Ｘ
線露出に陽性（＋）反応を示めし、引例セットから見分
けることができ、更に研究のために用いることができる
。
好ｔしくけ、形質転換コロニーの１部分はニトロセルロ
ースフィルターに転移する。残りのコロニーは、更に下
記に詳細に記載のスクリーンニング操作に用いられる（
４ｄ項）。たとえば、ニトロセルロースフィルターに固
定したＤＮＡは、変性ＤＮＡ　、たとえば変性こうし一
胸腺ＤＮＡ　、牛面清アルブミン、フィコールおよびポ
リビニルピロリドンを含む常法の前−交雑混合液で処理
し、次いで標準交雑操作を用いての・臂うフイン油のも
とて放射能ラベルしたｅ　ＤＮＡ検体（４ｂ項参照）で
交雑化する（３６）。交雑が終了した後、フィルターは
、連続的に／々ラフイン油および未−交雑ｃ　ＤＮＡを
除去するために、クロロホルムおよびＳＤ８および低い
塩を含む緩衝液で洗浄する。フィルターは、オートラジ
オグラフィーのためにＸ線フィルムに露光させる。交雑
コロニーは、陽性（＋）反応を示めし引例セットから見
分けることができる。
同定したコロニーハ、ｃＤＮＡ検体に相補的な挿入体を
有する絹み換えＤＮＡ５すなわち、ヒトリンノ！芽球遺
伝子またはその断片に対応するＤＮＡ断片を含む。時折
一種以上の組み換えＤＮＡ分子、交雑プラスさドＤＮム
を含む形質転換した細胞の第一のクローンは、陽性に交
雑化したクローンから分離さねう前記載（３・項）のよ
うｔｃ　１．　ｅ＠ｌ　ｉ　ＨＢ　１０１の再形質転換
のために用いる。交雑デラスミｙＤＮム−は、たとえく
、次の方法はよって分離される。初めに、同定された各
々のコロニーは適当な栄養培地、たとえばトリグトン培
地、いかなるプラス々げも含まない混同（汚染）ＩＩ胞
を除去するためにテトラサイクリンの存在下に培養する
。生き残シの細胞を採収し、慣例上の緩衝系に溶解し、
細胞外膜内にクロモゾゾームが残るように緩和な条件で
破壊する。この過程には、九とえばりゾチーム、ＥＤＴ
ムおよび非イオン性浄化剤（例、トリトン）の連続的添
加が含まれる。
細胞破片物、およびクロマトシームＤＮＡは遠心によっ
て分離される。上澄液は脱タンパクしく例、７８ノール
）、脈ムはＲＮＡＩ＠（例、ＲＮＡ＠＠ム）で分解する
。
交雑！ラスイドＤＮＡＦｉ、／リエチレンダリ；−ルに
よる沈澱によってＲＮＡ断片から分離され、エタノール
による再沈澱によって精製される。
この段階で、各々分離された交雑ＤＮＡの開袈パターン
は、適ＩＩＡｆｋ制隈エンドヌクレアーゼによるＷａＩ
Ｉによって決定することができ、この酵素は特にｄｓ　
ｅＤＮＡが挿入（３ｂ項参照）されゐ位置で、ｐｍｌＲ
３２２を線状化するために用いる。制限断片の大きさは
、九とえば既知の長さのマーカーＤＮＡ５に関連して、
アＰａ−スｒルにおける電気線動移動度から−ｊ定でき
る。
分離された交雑ＤＮＡ　ｓの各々は、Ｋ、ａ＠１ｌＨ１
１０１へ再形質転換し、テトラサイクリンを含む適当な
寒天培地（３・項参照）で増殖させる。
缶々の再形質転換から、いくつかのり四−ンを見分け１
各々のクローンの交雑グラスンドＤＮム―を再度、制限
分析をし、５ＤＮＡ挿入体の完全なまたは部分的なヌク
レオチド排列分析を、更に進牧処置めために適する交雑
［）ＮＡｓの選択のために行なう、更に、部分的な排列
分析は、挿入されたＩＦＮｅＤＮＡ断片がヒドリンΔ芽
球ＩＦＮ−４または−β遺伝子に対応するかどうか明ら
かにする・現在までに、いくつかの迅速法は、　ＤＮム
分子配列化のために有効である。主要な合成法で、特に
サンｆｆ−（４０）によって開発された方法社、プライ
マーとして、制限エンドヌクレアーゼ分解によって生成
し九放射能でラベルしたＤＮＡ断片を用いて、−重鎖Ｄ
ＮＡテングレートの相補性模写を正確に合成するＤＮＡ
　／リフ２−ゼの効力（能力）を使用するものである。
マ、クサムおよびシルバードら（４１）によって開発さ
れた任意の化学的ＤＮＡ配列化法を選択することも可能
である。この方法において、配列化されるＤＮＡは、末
端−ラベル化、特に４つの異なった反応において４つの
塩基の各々で開裂化し、生成物は、大きさによって、た
とえば変性する条件下でのｒルミ気泳動の手段で分画す
る。ＤＮム配列社、放射性帯の・臂ターンから解読する
ことができる。ＤＮＡの選択された伸長の完全なヌクレ
オチド排列を決定するために、この領域のＤＮＡを切断
する制限エンドヌクレアーゼを必要とする。
！、クサムとシルバードの方法によシ、切断から同方向
における１σ０−１５０塩基までの配列は、一つの実験
で解読することができ得る。
たとえば、分離された交雑ＤＮＡ−は、適する制限エン
ドヌクレアーゼ（例−Ｐａｔ　１ｓｌｏｏＲＩ　ｐＢｇ
ｌ　＊　、　Ｐｖｍ　Ｉ　ｔたはム１ｓｓｌ）で、ｅＤ
Ｎム挿人偉人体内こる位置で、分解される。得られたＤ
ＮＡ断片は末端にたとえば（ｒ、ｊ２ｐ）−ムＴＰで、
４リヌクレオチドキナー髪の存在下で２ベルし、ｄ＠Ｄ
ＮＡの一本鎖だけが末端に２ベルされて残るように、第
二の制限エンドヌクレアーゼで開裂する。適当なりＮＡ
断片は、たとえばぼりアクリルア建ドｒル電気詠動によ
って分離される。次いで１．ＤＮＡ断片をマ、クサムと
シルバード（４１）によって報告された塩基−特異性開
裂反応に処する。生成物を電気泳動（例、Ｉリアクリル
ア建Ｐｒル）によって、変性する条件下に（例７Ｍ尿素
）分画し、ＤＮＡ断片をオートラジオグラフで目で見分
ける仁とができる。
ｄ、リンツク茅球ＩＦＮ　ｅＤＮＡを含む付加的りμｍ
ンの同定前記載のように（４ａ項）、形質転換コロニー
の一部ハニトロセルロースフィルターニ転移し、その固
定されたＤＮＡは、イン、シトウで、検体として放射能
でラベルしたｅＤＮＡ　（例、　ＩＦＮ特異ｏＤＮム検
体）を用いてのコロニー交雑化を行なう。陽性の交雑化
コ日ニーの組み換えＤＮＡ−は、同じもしくは関連した
ＤＮＡ挿入体（例、ＩＦＮに関連した排列）をもつ組み
換えＤＮＡ分子を含む付加的なりローンのためのスクリ
ーンに用いることｔ監できる。
この目的のために、最初のスクリーン操作（４ｃ項）に
おいて得られた同定され九コロニーの各々のプラスｚ　
ＰＤＮＡＩ　（異なったＩＦＮ遺伝子または遺伝子断片
に対応して）は、前記載のように分離され、ＩＦＮ　＠
ＤＮＡ挿入体もしくはその一部分を含むプラスミド断片
が得られるように制限エンドヌクレアーゼで開裂する。
これらのプラスミド断片を５１−末端にラベルした後、
適当なりＮＡ断片（例。
放射能でラベルしたＩＦＮ挿人体もしくはその一部分）
を、たとえば？リアクリルア建ドｒル電気泳動によって
分離し、それらを単一にもしくは任意に、混合物として
用いることができる。交雑化のために、形質転換コロニ
ー（前記載）は、ニド四セルロースフィルターに転移し
、溶菌化する。それらの■ムは変性化し、イン、シトク
でフィルターに固定しダルンスメインとホッグネス（３
６）の報告に基づいて、ＩＦＮ％異性、放射能でラベル
したＤＮＡ断片と交雑する。交雑コロニーはオートラジ
オグラフィーで目で見ることができ引例セットから見分
ける仁とができる。
検体として、同一のもしくは類似のｅ　ＤＮＡ挿入体を
もつ組み換えＤＮＡ分子を★む同一コロニーを用いる＠
このスクリーン操作によって、付加的クローンがリンパ
芽球ＩＦ）Ｊ−αもしくは一β夏バ遺伝子ｔたはその断
片を含むことを同定できる。各々同定したコｏニーの７
ｐラス建ドＤＮＡは分離でき、前記載（４ｃ項）のよう
に制限分析および部分的排列分析によって特徴づけるこ
とができる・５、　　ＨｕＬｙＩ）’Ｎ−特異性組み換
えＤＮＡ５を含むＥ、ζｏｌｉによるＨｍＬｙ　ＩＦＮ
一様活性を４つポリペプチドの合成、 本発明に係るＨｗＬｙ　ＩＦＮ　ｃＤＮＡ挿入体は、ｐ
ＢＲ３２２のＰｓｔ　１位置に交雑を経て挿入される（
前記載）０なぜならｐＢＲ３２２のＰａｔ　１位置は、
β−ラクトア（ラクタ）マーゼ遺伝子内にあシ、ｅＤＮ
Ａ挿入体を転写に関する特有な配向における位置、およ
び翻Ｅに関する特有解読のフレームにおける位置に連結
（開裂と、共役して結合力“る際、癒合（合着）したタ
ンノ々りとなシうる。もし挿入されるｃＤＮＡはそれ自
体開始信号および／ｌたは停止信号をβ−２クトア（ラ
クタ）マーゼ配列をもつ相において有する場合、開始お
よび／または再開始は第二の開始信号で起ζシ、非−癒
合（合着）タン／譬りが得られる。それＫもかかわらず
、それらのクローンは重要であＪ）　、ＨｕＬｙ　ＩＦ
Ｎ　ｃＤＮＡは存在するけれども、いかなるＩＦＮ活性
も示さない。この場合、ｅＤＮＤＮＡ挿入体分離され、
望ましい４リペ！チドの発現の高レベルを得るために、
適当な様式で（７項参照）発現対照領域に連結さ□れる
。ＨｕＬｙ　ＩＦＮ　ｅＤＮム挿人体をもつ組み換えＤ
ＮＡを含むクローン拡、常法によってＩＦＮ活性のため
のテストをすることができる。たとえに１培養は十分な
細胞密度に増殖されうる。細胞は採取し、再懸濁し、溶
菌化する（ｌｂ項参照）。無細胞抽出物はたとえば細胞
病理バイオアッセイを用いて分析できる・ 十分な程度に装置Ｌｙ　ＩＦＮ活性をもつｆリペグチド
を合成するクローン祉、大規模学童に適合する。
クローンは培養され、ポリペプチドは７章および８章に
記載のように回収することができる。
６、ＨａＬｙ　ＩＦＮ活性をもつ？リペプチドの高レベ
ルを発現することができる組み換えｆラスミドの構成、 十分に発現させるために、遺伝子は正しく転写の開始体
（プロモーター）および翻訳（リゲゾーム結合位置）を
含む対照領域に関して局在化（集積化）されねばならな
い・ 前記載のように（３４項）、グラスンドｐＢＲ３２２は
ｔ適当な制限エンドヌクレアーヤで開裂し、ＨｗＬｙ　
ｅＤＮＡと連結する。得られた組み換えプラスミドＤＮ
ＡＪｄ、Ｅ、　＠ｅｌｌ　ＨＢ　１０１を形質転換する
ために用いられる。たとえば、もしＰａｔ　ｌを制限エ
ンドヌクレアーゼとして使用する場合、ＨｕＬｙｃＤＮ
Ａの挿入はｐＢＲ３２２のβ−ラクトア（ラクタ）マー
ゼ内に起とる。更に連結が、特有の配向および特有の解
読フレームで行なわれるならば、癒合（合着）し九タン
・りは、ＨａＬｙ　ＩＦＮアミノ酸配列配列うβ−２ク
トアマーヤ鎖の部分からなる結果になる。ｃＤＮＡが特
有の解読フレームおよび／または配向に挿入されない場
合は１得られるタンパクは、いかなるＩＦＮ活性も示さ
ない。不適蟲な配向の場合、プラスミドは適する制限エ
ンドヌクレア＝ぜ（本発明においてすべての挿入体は、
Ｐｉｔ　Ｉによって切断される）でｃＤＮＤＮＡ挿入体
断することによって再配向できおよびｃＤＮＡと線状プ
ラスミドの再連結（開裂と共役して結合）することがで
きる。得られた交雑プラスミドは、Ｅ、ａｏｌｉ　ＨＢ
　１０１に形質転換でき、セして順次に通常ＩＦＮ活性
の検査（分析）ができる。
ＨａＬｙ　ＩＦＮ　＠ＤＮム挿入発現の効率を高めるた
めに、過剰でないヌクレオチド（および従ってアミ）酸
）が先の遺伝子（および従りてＨｕＬｙＩＦＮ活性をも
つ４リペグチド）であるように前記載の発現対照配列の
付近で、ＨｗＬｙ　ＩＦＮ　ｃＤＮＡを局在化すること
が必要である。更Ｋ　ＨｗＬｙ　ＩＦＮｓの場合におい
て、第一の翻訳生成物線、成熟インターフェロンのＮ−
末端に付着した信号ペプチドからなるプレーインターフ
エ四ンである。信号ペプチド排列は、Ｉスト−翻訳的に
初めのプロダニター細施に移すＯしかしながら）、ｔｅ
ｌｉは蛋白質融解的にプレー排列を移すことはで意ない
。従って、プレー排列は、好都合Ｋ　ｃＤＮＡ挿入から
、第一の翻訳生成物が成熟ＩＦＮ一様ｌリペグチドであ
シ得るように適当な方法（下記参照）Ｋよって除去でき
る。この目的のために１成熟ＨａＬｙＩＰＩＪのための
コード化遺伝子は、イン、ビトロで再構成され、発現対
照配列に付着した（操作的に連結した）プラスミド（例
。
β−２クトアメーぜ遺伝子の発現対照排列）に再挿入す
る。他の発現対照配列、プロモーターおよび９がシーム
結合位置も同様に用いることができ、九とえばラクトー
スオペロンの対照配列１　トリジドアアンオペロン、ア
ラビノースオペロンその他対応するファージスＮ−遺伝
子の排列およびファージｆｄコートタンパク遺伝子、ま
た紘当骸分野で知られている他の排列のようなものを挙
げることができる。発現対照配列は、すてにｃ　ＤＮＡ
挿人偉人体むプラスオドに挿入でき、または両ＤＮム断
片を継続的に７’ラス建ドに挿入できる。
たとえば成熟ＨｕＬｙ　ＩＦＮ　ｅＤＮＡは、β−−２
クトアマーゼ現対照配列の制御下におくことができる。
なぜなら成熟ＨｍＬｙＩＦＮ一様Ｉリベプチドのための
コード化成熱ｃＤＮＡ挿入線、翻訳開始のために必要で
ある暗号（コドン）　ＡＴＧで開始されず、ＡＴＧ−）
ＩＪグレ、トは、合成的に入れなければならない。たと
えば知られているヌクレオチド塩基配列およびその結果
として、ｐＢＲ３２２およびＨａＬｙ　ＩＦＮ　ｖＤＮ
ムの制限ヌクレアーゼパターンは、次のアプローチに用
いることができる。！２スミドｐＢＲ３２２をβ−ラク
トアマーゼ遺伝子内Ｐａｔ　１で開裂し、エキソヌクレ
アーゼ、たとえばＢａ１３１で分解し、β−ラクトアマ
ーセコード化配列を短くする。任意に、１．ｅｏｌｌか
らのλ−エキソヌルアーーｋｌｌ（５′−エキソヌクレ
アーゼ）もしく紘３′−エキンヌクレアーゼおよび８１
ヌクレアーゼの併用は、同じく用いることができる。制
限されたプラスオドは、合成されることのできる、（た
とえば前記載（４ｂ項）のトリエステルアプローチによ
って）ｄｓＤＮムリンカー（Ｌ１＋ａｋ＠ｒ）と連結さ
せる。
リンカ−は嘱適当な制限エンドヌクレアーゼ、たとえは
Ｂ・１１（５１口３ム）の認知配列を含む。得られたグ
ラスきド断片祉、アニール化したリンカ−（例Ｂｅｌ　
Ｉ）へ％微のある制限エンドヌクレアーゼで、および次
いでＥｅｏＲＩ　（β−ラクトアマ−ぜ発現対照配列の
付近に局在化するｐＨＲ３２２内に１＠ｏＲＩ位置が存
在する）で開裂する。得られたＤＮＡ断片（例、　Ｅｅ
ｏＲＩ−ＢＩ３　１　ＤＮＡ断片）は本質的にβ−２ク
トアマーゼ（ムｐＰｒ）の発現対照配列およびアニール
化リンカ−からなシ、−リアクリルアミド電気泳動によ
って分離すゐヒとができる。
一方において、ＨａＬｙ　ＩＦＮ　ｅＤＮＡ　ｌｉｐ入
は、それを含む組み換えＤＮム分子から（４４項）、た
とえと制限エンドヌクレアーゼＰｉｔ　Ｉによる分解に
よって、切断する。単離されたＨｕＬｙＩ）’Ｎ　ｃＤ
Ｎム挿入は、信号ペプチドのためのロード化するＤＮＡ
排列を移すために更に他の制限エンドヌクレアーゼで（
必要ならば、二つの他の制限エンドヌクレアーゼおよび
部分的再連結された）開裂される。得られ九成熟１’１
ｗＬｙ　ＩＦＮ　＠ＤＮＡ　ｄ、前記龜Ｏ＆ｐＰｒＤＮ
ム断片（例Ｓａｕ　３Ａ”ステ、キイ”終末端）に相補
的な１ステ、キイ”終末端をもつ。成熟ＨａＬｙＩＦ？
（ｃＤＮＡおよびＡｐＰｒ　ＤＮＡ断片は、通常りが−
ぜによってアニール化される（３４項参照）。アニール
化は、特有の解読フレームを確立するために、成熟ｃＤ
ＮＡの第一暗号に先んするＡＴＧ暗号の生成の結果にな
らねばならない。得られる交雑ＤＮＡはβ−２クトアマ
ーゼ発現対照領域、ＡＴＧ翻訳開始暗号、完全なＨｕＬ
ｙ　ＩＦＨのためのコード化ＤＮＡ配列、および開裂さ
れたプラスオドｐＢＲ３２２における交雑ＤＮＡを挿入
するために適する二つの制限工ンドヌクレアーセー終末
端（例、　ＥｅｏＲＩおよびＰａｔｌ終末端）を含む。
得られた交雑！ラスギド紘、Ｅ、ｅｏｌｉ　［８１０１
の形質転換およびＨｍＬｙ　Ｉへ活性をもつポリペプチ
ドの高レベルの合成に導くために用いられる。
７、　　ＨａＬｙ　ＩｒＮ−特異性組み換えＤＮＡ５を
含むり四−ンの培養、 本発明に係る形質転換したホストは、ＨｕＬｙ　ＩＦＮ
活性を一つ４リペデチド生成のために用いることができ
る。該４リベプチドを生成する方法は、形質転換ホスト
、％に形質転換し九Ｅ、ｅｏｌ１株（系統）は炭素、窒
素および無機塩の同化できる源を含む液体栄養培地で培
養することを特徴とする。
いろいろの炭素源を用いるととができる。たとえば好ま
しい炭素源として、グルコース、マルトース、マンニア
トールま九はラクトースまた拡アセテートのような同化
できる炭化水素であル、単一もしくは適する混合物で使
用することができる。
好適な窒素源として、たとえばカスアミノ酸（＊ａｓａ
ｍｉｎ＠ａｅ１ｄ）のようなアオノ酸、ペプチドおよび
タンパク質およびその分解生成物（例トリプトン、ペプ
トン）ｔたは肉抽出物更に酵母抽出物、麦芽抽出物、コ
ーン浸液、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムまたは
硝酸アンモニウムのようなアンモニウム塩が挙げられ、
革−もしくは適する混合物で使用することができる。使
用される無機塩としては、たとえば硫酸塩、塩化物、リ
ン酸塩およびナトリウム、カリウム、マグネシウム。
およびカルシウム塩が挙げられる。
任意に、栄養培地は、増殖を助長する物質および／ｌた
はＨ＠Ｌｙ　ＩＦＮ　−４Ｉ異性組み換えＤＮＡのロス
を妨げるために選択的圧力を加える物質を含む。
増殖を助長する物質に社、たとえば鉄、亜鉛、マンガン
、その他の微量元素および特有のアミノ酸がある。Ｈｕ
Ｌｙ　ＩＦＮ活性をもつポリペプチドのためのコード化
遺伝子は別として、本発明に係る組み換えＤＮＡ５は、
好ましくは、抗生抵抗性（不応性）たとえばアンピシリ
ンおよび／ｌたはテトラサイクリンに対する抵抗性（不
応性）を授けられる遺伝子を含む・このような抗生物質
を培地に加える場合、組み換えＤＮＡを含む細胞は、生
き残シ、増殖し、一方該組み換えＤＮＡまたは培地に混
同する外来抗生−感受性微生物を含まない細胞は、生き
残ること杜ない・ 培養は常法による手段で行なう。温度、培地の−および
発酵時間のような培養条件ｔＬ　　ＩＦＮ一様ポリペプ
チドの最大値を得られるようなやシ方で選択する。好ま
しくは選択されたｉｉ、＠ａｌｔ株は、好気的条件下に
、約２０−４０℃の温度で好ましくは３０℃で−４−９
で、好ましく鉱ＰＨ７で、約４−２０時間、好ましくは
８−１２時間、攪拌しながらまたは振シながら深部培養
する。培養の結果として、ＩＦＮ一様ポリペプチドは、
細胞内に集積する。
８、　　ＩＦＮ活性をもつポリペプチドの分離および精
製 本発明に係るヒトリンノ譬芽球インターフェロンは、形
質転換したホスト細胞から骸Ｉリペプチドの遊離および
精製の段階を含んでなる培養肉汁からの回収である。
形質転換したＥ、＠ｏｌｉ細胞を満足すべき細Ｊｌｉ書
度に増殖した後、発現された（表現）ポリペプチドの回
収のための第一段階は細胞内部からそれの遊離を含む。
この目的のために細胞は、５ＤＳｔたはトリトンのよう
な浄化剤によって溶菌イヒする。
任意に、剪断力のような機械力、（例Ｘ−プレス、フレ
ンチプレス）ｔたはｆラスピーｘｌ＊Ｉａフルミナと振
り回シことによって、細胞を破壊する。
得られたポリペプチド混合物は、常法によって１すなわ
ち硫酸アンモニウムまたはトリクロロ酢酸による沈澱、
ｒルミ気泳動、透析、クロマトグラフィー（例、イオン
交換クロマトグラフィー、サイズ−排除（排他）クロマ
トグラフィー、または反転相ＨＰＬＣおよびその他）を
用いて、と）　Ｌ７！バを濃縮する。最終的な精製紬の
精製は、たとえば、抗体親和性クロマトグラフィーによ
ってなされる。主に精製段階は、ヒト白血球インターｈ
ロンの精製のために開発したステエフニリンら（５１）
の方法によって行なわれる。
九とえに１と）ＬＦＩＦＮＣ）精製および分離は、次の
段階を経て行なう： （１）！、ｃｏｌｉ細胞の嬢曹化 （２）ポリエチレンイミン処理による非−蛋白質分解物
質の一部の除去 （３）硫酸アンモニウムでの溶液飽和によるポリペプチ
ドの沈澱 （４）適尚な緩ＩＩ混合箪における透析（５）　ＤＩＡ
Ｉ−セルロースのカラムクロマトグラフィ（６）親和性
モノクロナル抗体のカラムクロマトグラフィー （７）適合するセフアゾ、クス■の分子サイズのカラム
クロマトグラフィー 十分な精製生成物を得るために、付加的な精製段階が、
必要とされる、たとえばカチオン、またはアニオン交換
クロ１トゲ’）ｙ４−＊水酸化燐灰石への吸収１反転相
ＨＰＬＣなどがある。一方前記の段階の１つもしくはそ
れ以上、可能ならば、削除することができるし、または
段階の順序を変えることもできる。
本発明紘、本発明に係るポリペプチドの誘導体および断
片を含んでなシ、たとえば蛋白質融解的に開裂したＩリ
ペプ外ド、十分にもしくは部分的に保護された、たとえ
ばアシル化、シリル化および特にグリコモル化ポリペゾ
チド、およびその塩およびそれらの製造の丸めの常法に
よる過程を含む。
本発明は、特に本発明の結果として精製された形態での
ＤＮＡａおよびポリペプチド、および物別にＤＮＮｌ２
形質転換したホスト、／リペデチド、および実施例で記
載のように’ｔ　（２）Ｉｆ！造過種に関するものであ
る。
本発明の／ＩＪペプチドおよび適するその誘導体、たと
えばグリコジル化した生成物は、ヒトの癌。
腫瘍、およびウィルス感染の治療のために知られている
インターフェロンと類似して用いられ、必要に応じて他
の抗ウイルス性、抗癌性、ｔたは抗腫瘍性剤と併用して
用いられ、好ましくは、活性成分とともにまたは、有機
もしくは無機の固体ま丸線液体、好ましくは非経口投与
に適する医薬として許容され得る担体と混合して、効果
量含む医薬製剤の形である。
本発明に係る医薬として活性のある化合物祉、好ましく
は製剤でまたは非経口（例、筋肉注射。
静脈注射）のための注入溶液の形態である。このような
溶液は、好ましくは使用前に製造され九等張性水涛液ま
た＃ｉ懸濁液であシ、それは活性成分のみまた杜医薬と
して許容されうる担体を含む凍結乾燥（Ｍ液性化）した
調合物から製造する。医薬製剤は、殺菌しおよび／ｌた
は補助薬、たとえば保存剤、安定剤、湿潤剤および／ま
たは乳化剤。
可溶化剤、浸透圧を調整するための塩、および／または
緩５ｉｌｌを含む。本医薬製剤は、所望ならば、更に医
薬的に価値のある物質を含むこともでき、既知の方法に
よって主意され、たとえば、常法によって溶解した夛、
凍結乾燥（親液性化）によって行ない、活性成分は約０
．１−１０ＯＬ特に約１−５０　％、凍結乾燥（Ｉｉ液
性化）の場合は１０〇−まで含むことができる。
本発明ａ、＠薬として活性ある化合物を、医薬として許
容されうる担体と混合することを特徴とする医薬組成分
を生成する方法に関するものである・ 病症の本質（％性）、および患者の容態に依存して、製
剤社、たとえば筋肉内に一日に三回約１０’−１０’ユ
ニットの投与量で投与する。
次の実施例は、本発明を図示しておシ、その限界として
解釈するものではない。
以下全白 実施例 次の略語は、実施例において用いられる。
ＩｔＢｒ：　　　エチジウムブロマイド１１８Ａ：　　
　　牛血清アルブミン ＥＤＴＡ　：　　　　エチレンシアオン四酢酸８Ｄ８：
　　　　　ドデシイル硫酸ナトリウムメタン Ｔｒｉｓ・ＨＣｊ：　　）リス１ｊＪ［１１１、Ｈｗｌ
ＦＴ軸田Ｎムのために濃縮され九ポリ（４）１（ト）ム
の分離（図１） ａ）ナマルワ細胞の誘発 ナマルワ細胞は、胎子牛血清１０憾を含む培養培地ＲＰ
Ｍ１１６４０で３７℃のもとで増殖させる。
細胞の密度が、３・７０６゛細胞／−に到達した時、懸
濁液を室温で８００Ｘｇで１０分関連心する。
集められ九細胞は、グルタイン（０，０２７１１／Ｗ積
）、ペニシリン（２００ユニツ）／ＩＩｊ）およびスト
レプトマイシン（５０μｇ／−）を含む培地（２００１
４）に再ａｓｈする。細胞は、９０分間３７℃で二五−
力ｙ　スル病ｔ　４　ルｘ　（ＮＤＶＩ　１０　）　ｔ
−１９０ＨＡＵ／１０’細胞（ＨＡＵ　：血球凝集ユニ
ット）の割合で培養する。
新しい培地を添加することによって、細胞の密度１−３
・１０’細胞／ＩＩｊＫ調整し、１１ａｌ胞懸濁ｗｅ３
４℃で１０　Ｏｒ、ｐ、ｒｈで振り回すｅ１２時間後、
６・１０’細胞は、採収し、リン酸−ｆｔｊｋ（ＩＮ化
した塩水（５０ＷＪ）（ＰＢ８　’　：　１１　ＰＢＳ
は、塩化ナトリウム（８０ｊｉ’）、塩化カリウム（２
Ｐ）、リン酸水嵩ナトリウム（１４，４７）およびリン
酸２水素カリウム（２ｔ）ｔ−含む〕に再懸濁する。細
胞を採収する前に、サンプルを移し、インターフェロン
活性を、チャレンジウィルスとして、小水庖性口内炎ウ
ィルスおよびＣＣＬ−２３細胞を用いて、アーム細胞懸
濁液（６・１０９細胞１５０ａＪＰＢＳ）を、室温で、
０．０５Ｍ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、０．１Ｍ塩化ナ
トリウム、５　ｍＭ　ＥＤＴＡおよび２％８０８Ｃ結晶
、研究用、セルパ）からなる溶−緩衝液（８０〇−冷加
える。ＳＳ化したものは、前培養した（３７℃で２時間
）グロテアーゼ（グロテアーゼＰＸｖ［、シグマ）　（
０，２ＩＱ／ｄ）加えて、室温のもとで攪拌しながら１
時間分解する。溶液’ｉ　ＴＮＩ飽和−７エノール（５
ｏ０１１Ｊｘ３）およびクロロホルム（５００ｍｘｓ）
で抽出することによって脱タンノ臂り化するｅ２６０ｎ
ｍの吸収によって測定されるように核ｉｆ！（５００ｍ
９功よ得られる。
・）混合しているＤＮＡおよびＲＮＡの除去前記載のよ
うに得られたかすかにビスコース状水溶液（段階１ｋ）
は、０．３Ｍ塩化ナトリウムで調整し、オリｆ　（ｄＴ
）セルロース（１ｔ）（７型、Ｐ−Ｌ生化学）を加える
。ｌｌＩ！濁液を室温で３０分間攪拌した後、室温でツ
ルパルＲＣ−３遠心機を用いて１ｊツルパル管で、４０
００ｒｐｒｘで１０分間遠心し、得られたオリｆ　（ｄ
Ｔ）セルロースースラリイを、９．５　％　８Ｄ８　’
ｉ含むＴＮＥ　（４０ａｔＸ２）洗浄する。結合し九ポ
リ囚四Ａは、水（２，５−）で、５回連続的洗浄によっ
て浴出する。ポリ囚ＲＮＡ（７２０μｇＮ）収量は、光
学的濃度を測定することによって決定する。初めの吸着
からの上置ＲＮＡ溶液は、二回目ｔｌｃオリｒ　（ｄＴ
）セルロース（１／−）に吸着させ、前記載のように溶
出し、Ｉす（Ａ）ＲＮＡ（３２０μ？）か得られる。溶
出液はプールしＴＮＥでｙ４ＩＩシ、Ｉす（４）ＲＮＡ
ｒｓ　７　＊ｘｆｉ／　−ルテ−２０℃ノモトて１０時
間で沈澱させる。　ＲＮＡはソルノ（ルＲＣ−５Ｂ遠）
し・機を用いて、１０分間０℃のもとで１１００００ｒ
ｐで遠心することによって、集めることができる。沈澱
物（１＃）は、１　ｒＩＭＥＤＴＡ（ｌａｕ）に溶解す
る。
ＲＮムハ、次のようにゼノグルラエビスの卵母細胞への
注入によりて、ＨｕＩＦＮｍＲＮＡ活性のための分析を
することができる：　ＲＮＡ溶液（５０ｎＡ）ｔ２０卵
母細胞の各々に注入する。卵母細胞は、ゴルドン（４２
）、ノ母−ス（４３）およびコルマンら（３０）による
パース培地（２ｍＭ　）リス、８８ｍｋｌｉ塩化ナトリ
塩化カリウム化カリウム、０．３３−硝酸カルシウム、
１結晶水、０．８２ｍＭ硫酸マグネシウム・７結晶水、
２．４ｍＭ炭酸水素ナトリウム、０．０１＃／−ペニシ
リン、０．０１ダ／ｍｊストレグトマイシンを含む溶液
を塩酸で−７，６に鯛贅する）で培養する。注入した卵
母細胞は、４２−４８時間培養し、培地を除去し、エツ
ペンドル７遠心機で５分関連心し、上置みは分析に使用
するまで一２０℃または一８０ｃで貯蔵する。　ＩＦＮ
活性は、本質的にアームストロング（２９）に基づいて
、〔ｖＳｖｔチャレンジウィルスとしてＨリ−２細胞（
フローラーラトリイー）に用いることを除いて〕分析す
る。卵母細胞抽出物は、注入された助はμ？につき６０
０　ＩＵインターフエ四ンの特異活性をもつ。
ｄ）　Ｈａｌ？Ｎ　ｒｍＲＮムのためのＩす（Ａ）ＲＮ
Ａ濃縮Ｉり囚ＲＮＡを、０．５−ぺ、トー容積のキレツ
ククー１００カラム（２００−４００メ、シ畠、ビオ−
ラド）に通過させる。カラムは１　ｍＭ　１ｃＤＴ人（
１−）でリンスする。
溶出液（／すに）ＲＮＡ　１ダ／１０↑ム一）を２分間
１００℃で加熱し、シ１クロースデンシティダレディエ
ン）　Ｃ６５０ｍＭ　）リス−塩ＩＩ＆（ｐＨ７，５）
、０．２Ｍ塩化ナトリウムおよびｌ　ｍＭ　ｆｆＤＴ人
　を含ｔｒ１４１１ｊシークロース溶液を５修がら２３
　ｆｂ　（ｍ／Ｖ）まて濃度を増加させる〕を用いて遠
心する。遠心は、ＴＳＴ４１０−ター（コントロンＡＧ
　）を用いて、３５０００　ｒｐｍで１６時間、５℃の
もとで行なう。
０．３−ずつの画分は、ｌ８ＣＯグレデイエントコレク
ターで集める。各々の画分にエタノール２答蓋加えて、
溶液を１０時間−２（ｌで放置する。沈澱したｍＲＮＡ
は遠心（ツルパル、Ｈト４０−タを用いて、１１０００
ＱｉｒｐでＩ　Ｏ分子１Ｊ１０Ｃの４とで）をする、各
々の画分の沈澱物は、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（２５μｔ
）に再溶解して、前記載（段階１ａ）のように（２０の
かわＤＫ、Ｍｈサンダルにつき１ｏ卵母＃胞に注入され
ることを除いて）ヒ）　ＩＦＮ　ｍＲＮＡ活性のために
分析する。結果は、表１に示めす。
以下ｊ〈白 表　１　＝ シ轟りロースデンシティダレディエントの画分のＨ＋！
ＩＦＮｍＲＮＡ活性 画分２３−２９をブールし、ポリ囚ＲＮＡは、次のよう
に精製する： ポリ（Ａ）　ＲＮＡ溶液は、０．５　％　８０８を含む
２　Ｘ　ＴＮｇで調整し、オリｆ　（ａＴ）セルロース
カラム（２００μＬ）にかける。カラムｔ−Ｏ，Ｓチ８
Ｄ８を含む２ＸＴＮＩＥで洗浄し、ポリ囚団ムは水（０
，５１ｊＸ５）で柵出する。溶出液は、ＴＮＩＣでｌｌ
＆１整し、同容量のＴＮＥ飽和−７エノールで２回揄出
し、更に同容蓋のクロロホルムで２回抽出する。ポリ（
Ａ）　ＲＮＡ　ｆ：エタノール（２容量）で−２０℃の
もとで、１０時間沈澱させ、前記載のようにＨＢ−４０
−ターを用いての遠心によって沈澱を得る。
Ｉす（Ａ）ＲＮＡは、Ｏ−５ｒｒＭＥＤＴＡ　（１００
μＺ）に溶解する。収量は（４０μ？）光学的濃度を測
定することによって決定される。
ポリ囚ＲＮＡの部分は、前記載のように、分析につ＠２
０卵母細胞を用いて、ヒ）ＩｒＮ活性のための分析を行
なう。ポリ（４）ＲＮＡ製剤はＲ％Ａ（Ｊｊ’）につき
８１００　ＩＵインター７、ロンの特異活性をもつ− ２、二重−鎖＠ＤＮム・の製造（図１）胞Ｉ　ＦＮ　ｍ
ＲＮＡの九めに換縮され九ポリ（Ａ四Ａ（段階１ｄ参照
）は、本質的に工７ストラテアデスら（４４Ｌマニアテ
スら（４５）ｊ？よびホエイジｉ−カーら（４６）によ
りて報告されているように、二重鎖ｅＤＮＡを製造する
ためのテング′Ｖ−トとして用いる。
ａ）第−鎖の合成 ４０　ａＭ　）リス、塩酸（ｐ）１７゜５）、３０ｍＭ
塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、ｏ、５ｒｍ
ＭＤＤＴ　（カルビオケ建）　、１１１Ｍ　４Ｔ’Ｐ　
−ｄＣＴＰ　、４ηテＣＰＬ生化学）および１　ｍ１１
［”Ｐ−ｄＡＴｆ’　（アマースハム比活性５００００
　ｅｐｉｍｎ＞ｏｌｅ）＊　２０μｔ／ｌｊオリｆ（ｄ
Ｔ）１２−１６（Ｐ−Ｌ生化学）、４０μｔ／ｌｄポリ
（４）理法および鳥類骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）　
ＩＪパーストランスクリ！ターゼ（ライフ、サイエンス
、Ｉｍａ−ｔ　ａｔペータースプルグ、フロリダ）を含
む反応混合物（２５０μＬ）を８０分間３７℃で培養す
る０反応は、溶液ｔ−１０ｗＭ　ＥＤＴＡおよび０．１
％８Ｄ８で調整することによりて停止する６反応混合物
ｔ−７８ノールの１容量で一回抽出する。水相をクロロ
ホルム（１容量）で再抽出し、セフアゾ。
リスＧ−５０（７丁−マシア、）丁イン）カラム（３−
）にかける、各−分（０，１１７）を集める。
各々の画分の放射能活性は、セレンコツ放射ｍｔ−測定
することによって決定する。放射能画分は、ブール・し
、核酸はエタノール（２容量）で、−２０Ｃのもとで１
０時間沈澱させる。この画分を、ＨＢ−４Ｃ！−ターを
用いてＩ　Ｏ，０００ｒｐｍで０℃のもとて２０分間遠
心する。沈澱を水（９５μｔ）に溶解する。１ＯＮ水酸
化ナトリウム（５μｔ）を加えて混合物を２５℃のもと
て４０分間培養する。
５Ｍ酢酸中和後、水（５０μｔ）およびエタノール（２
容量）を加え、−２０℃のもとて１０時間放置する。沈
澱は、前記載のように遠心によりて集め、０．１　ｍＭ
　ＩＤＴＡ　（２００μｔ）に再溶解する。−重鎖＠Ｄ
ＮＡの収量は３．７μパある。−ＤＮＡのサイズは、既
知の長さのマーカーＤＮＡ５に関連して（３２ｘ７Ｍ尿
素を含むトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ　Ｃ）リス（１０Ｓ
？＞、ＥＤＴム２ナトリウム塩（９，３Ｐ）、ホウｇｌ
！（５５ｉＰ）を含むｐＨ８，３であるｌ！溶液〕にお
ける６チポリアクリルア建ドｒルの電気泳動の移動度か
ら測定されるように７００−１５００夏クレオチドの長
さである。
ｂ）第二の鎖の合成およびＳ１工ンドヌクレアーゼ分解 得られたｅＤＮＡ溶液は１００℃で９０秒間加熱し、冷
却し、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（−５、９）　、
１０　！ａＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭＤＴｒ（カル
バイオケｉ　）　Ｉ　ＩａＭｄＡＴＰ　、　１　ｍＭ　
ｄｃＴＰ　、　ｋｍｄＴＴＰ　（Ｐ−Ｌ、生化学）、１
　ｍＭｊＨ−ｄＧＴＰ　（アマースハム、Ｊ比活性の４
０００すｍ／ｎｍｏｌ・）および１、　＠ｏ口ＤＮＡ　
／リメラーゼｌ（パイオラが、二島−イングランド）（
１６５ユニット／−ｊ）からなる反応混合物（４００μ
ｔ）で１５℃のもとて８時間培養する０反応は、ＥＤＴ
Ａおよび８Ｄ８を加えて、最終濃度各々１０ｍＭおよび
０．１％になるようにして停止する。濡合物は７８ノー
ルおよびりｃ１０ホルムテ抽出し、セフアゾ、リスＧ−
５０（７フーマシア、ファイン、ペマト容量２１１ｊ）
テクロマト処理し、前記載（段階２＆）のようにエタノ
ールで沈澱させる。
得られたＤＮＡは、０．２５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）およびＳ１エンドヌク
レアーゼ（Ｐ−Ｌ生化学）の６二二、）を含む１　ｍＭ
　（ｊｌｌ［亜鉛を含む培養溶媒（５０ｆｉｔ＞で３７
Ｃの４とで３０分間培養する０反応Ｉｆｉ０．１　＊Ｓ
Ｄ８および１０　ｍＭＥＤＴＡで停止する。反応混合物
はフェノール（５０ｍＭ酢酸ナトリウムで飽和した、Ｐ
Ｈ４，５）およびクロロホルムの１容量で脱タンノ臂り
化する。水相は、セフアゾ、リスＧ　−５０（ファーマ
シア、ファイン）（２１１７）カラムでＴＮＩ中でクロ
マト処理をする’、１００μを画分は集められ、各々の
画分におけるセレンコツ放射線を測定する。
除外された一分はブールし、ＤＮＡは、エタノール量（
２容量）で前記載のように一２０℃のもとて１０時間沈
澱させる。沈澱は、ＨＢ−４０−ター（下記参照）を用
いて遠心し、集められた沈澱は、１０　ｒｎＭ　）リス
・塩＃（ＰＩ（７，５）および０．５ｍＭＥＤＴ人を含
む１００μＬに溶解する。ＤＮＡ（４μｉＰ）が得られ
る。ＤＮＡは５０　ｍＭ　）リス・塩＃　（ＰＨ７，５
）および１　ｍＭ　ＥＤＴＡでのシ為クロース、デンシ
ティ１クレデ４　工７ト（５−２３１）”ｔ’Ｔ８Ｔ−
６００−／−（コントロンＡＧ　）を用いて分画化する
。遠心は、５５０００ｒｐａａで５時間１５℃のもとで
行なう、８００塩基対マーカーＤＮＡより速く沈降する
ＤＮＡをノ＃ラレルグレディエントで行ない、ブールし
、ＴＮＩで調整し、６７１６エタノールで一２０℃のも
とて１０時間沈澱させる。二重鎖ａＤＮＡ（０，４μ？
）が得られる。
３、　９Ｂ１３２２一連結したａＤＮＡの製造（図１）
ａ）　　ｄ−ＣＭＰ−延長した＠ＤＮＡの農造得られた
ｄｓ　＠ＤＮム（０，１μｉＰ）の３′−末端は、１０
０　ｍＭカコゾレートナトリウム（−７，２）、２、５
　ｍＶ塩化コパル）、Ｂ８ム（カルバイオケミ）（５０
Ａ？／ＩＬＪ）　、１ｍＭｄＣＴＰおよび末端デオキシ
ヌクレチオゾルトランスフ、ラー−ｉ／（Ｐ−Ｌ生化学
）（１０ユニット／ｄ−・ＤＮＡμ？）を含む反応容積
（１０μｔ）中でポリ（ｄＣ）末端（尾）に提供（反応
）する、培養後（２７℃で２０分間）、ＥＤＴＡ　＃ｉ
１０　ｍＭになるように加え、使用するまで一２０℃で
保存する・ ｂ）　　Ｐ虐ｔＩ開裂したｄＧＭＰ延長したｐＢｌ’Ｌ
　３２２の製造 ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮ＾（１０μ？）を５０ｍＭ
塩化ナト１ｊ゛ウム、６　ｍＭ　）リス・塩［（ｐＨ７
，５）、６ｍＭ塩化マグネシウム、６ｍＭ２−メルヵ７
”トエタノールおよび１００μ？／Ｎ　ｌ’ラテンを含
む溶液（１００μｔ）にＰｓｔ　Ｉエンドヌクレアーゼ
（パイオラー）の１０ユニツトで１時間３７℃で分解す
る。ｓｗは、フェノールおよびクロロホルムの１８量で
抽出する。溶液をＴＮＥで調整し、線状（棒状）　ＤＮ
Ａはエタノール（２ｇｔ）で−２ｏ℃のもとで５時間沈
澱させる。
線状（棒状）グラスミド０８人は、１００ｍＭカコデレ
ートナトリウム（ＰＨ７，２）、５ｍＭ塩化マグネシウ
ム、２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、ＢＡＡ（５０μ
Ｐ／ｄ　）、Ｉｎ＆　ｄＧＴＰ、末端デオキシヌクレオ
チジルトランスフェラーゼ（Ｐ−Ｌ生化学）（１００ｓ
−二、ト）ｔ−含む反応容量（２００ｔｔｔ）における
ｄ　ＧＭＰで延長する。３７℃で２０分間培養後、ＥＤ
ＴＡを１０ｍＭになるように加え、反応混合物を使用す
るまで−２（ｌで凍結する。
ａ）　　ｄＧＮＰ−延長したｐＢＲ３２２０ｄｃＭＰ−
延長したｄａ　ｅＤＮＡへのアニール化 ＴＮＩ緩衝液におけるｄ　ＣＭＰ−延糞した二重鎖ｅＤ
ＮＡ（０，１μ？）およびｄＧＭＰ−終末端線状化した
ｐＢＲ３２２（０，５４？）　Ｏ混合物を６５℃で１時
間、４６℃で１時間、３７℃で１時間、２０℃で１時間
培養する。　ＦＩＩＲ−３２２一連結したｅＤＮＡを含
む溶液を氷上に置き、形質転換のために直ちに使用する
。
４．７ニール化した交雑（雑種）ｆラスミドをもつＥ、
　ｅｏｌｉ　ＨＢ　１０１の形質転換カルシウム処理し
たＥ、　ｅｏｌｉ　ＨＢ　１０１は、マンデルら（３５
）の方法によりて形質転換のために準備する。
前記載（段階３ｅ）のように製造されたアニール化した
ｐＢＲ３２２交雑！ラスミドＤＮＡ５を含む反応混合物
（１０μｔ）を、１０ｍＭ塩化マグネシウムにおけるカ
ルシウム処理したＥ、　ｃｏｌｌ　ＨＢ　１０１（１５
０ｆｉＬ）、１０ｍＭ塩化カルシウムおよび１０ｍＭ　
）リス・塩酸（ｐＨ７，５）ｔ−含む混合物（全量２０
０μｔ）に加える。
混合物を氷上で２０分間冷却し、４２℃で１分間加熱し
、２０℃で１０分間培養する。トリグトン培地〔トリグ
トン培地は、蒸留水（ｌり中にバクトートリプトン（１
０ｉＰ）（デ７コ）、酵母抽出液（１？）（デフコ）、
グルコース（ＩＰ）、塩化ナトリウム（８？）および塩
化カルシウム、２結晶水を含む）　（１ｊＪ）を加え、
混合物を３０分間３７℃で３００ｒｐｎａで振り回しな
がら培養する。
混合物をテトラサイクリン（１０μ？／１１４）（シグ
マ）で補足した２寒天グレート（マツクコンケイアガー
ル、デ７コ；　０．６ＷＪ／ｆレート）にかける。グレ
ートは、３７℃のもとで１２−１７時間培養する。
形質転換したＥ、　ｃｏｉｌ　ＨＢ　１０１の約５６０
０テトラサイクリン抵抗性コロニーが製造される。
以下ｊ、白 ５、　　ＨｕＩＦＮｅＤＮＡを含むクローンの同定ａ）
　１３−ｍ＠ｒオ”リゴデオキシヌクレオチド！ライマ
ーの合成（図２） ）（ｕＩＦＮ−αｌおよびＨｕＩＦＮ−１ｍ　ＲＮＡを
共有する１３ヌクレオチドの伸長に相補的オリゴデオキ
シヌクレオチドは、ホスホトリエステル法〔イタクラら
（３８）、ローイジら（３９））によって、化学的に合
成される。合成の個々の段階は、図２に概略しである。
図２のライン１で示された出発物質（保護基を運ぶモノ
およびジデオキシヌクレオチド）は、文献から知ること
ができる。保護基は、イタクラらによって報告されたよ
うな方法で開裂（解ｊｌ）させることができる：水酸基
を置換した５′−モノメトキシトリチル基（Ｍ）もしく
はジメトキシトリチル基（Ｄ）の脱鱗離は、室温で酢ｅ
ｌ！（８０％）で行なわれ、およびβ−シアノエチルリ
ン酸基は、室温でジオキサン−水（４：１）における０
、ＩＮ水酸化ナトリウムで行なわれる。
生成ブロックの縮合は、活性化剤としてトリイソグロピ
ルバンゼンスルフォニルクロ２イドヲ用いて、図２のラ
イン７に表示した十分に保睦した１３−ｍ＠ｒ７’ライ
マーまでのオリゴデオキシヌクレオチドを得るために行
なう。最終段階（すべての保護基の完全な除去）は次の
ように行なうニジオキサン（３ａｊ）およびアセトニト
リル（１ｄ）中に十分保護された１３−ｍａｒオリがデ
オキシヌクレオチド（６４，６■）を含む溶液は、シン
−ｐ−ニトロペンツ１ルドキシン（２００１ｖ）オｊび
Ｎ’　、Ｎ’　、Ｎ５ｓ　Ｎ’−テトラメチルグアニジ
ン（ＸＺ４＊）と反応させ、２７時間放置する。２５チ
゛アンモニア（１０ａｊ）を加え、溶液は、５０℃で２
４時間保持する。溶媒を、真空下に蒸発させた後、残留
物は、水に溶解し、酢酸でｐＨ４に調整し、溶液をクロ
ロホルムで２０回抽出する。水溶液は、真空下で蒸発さ
せ、残留物は８０ｓ酢酸（１ｄ）に溶解する。溶液を一
時間放置し、水（６ＩＲ１）で希釈し、クロロホルムで
３回抽出し、凍結乾燥する。得られた粗生成物の発はＤ
ＥＡＥ　−セファデックスＡ２５のクロマトグラフィー
（カラムサイズ：１０・１・３国）を用いて、０．２−
１．２Ｍトリエチルアンモニウム２カルボン酸塩ダレデ
イエンド（２００１１／）を通して精製する。主な画分
の溶出は、ダレディエンド濃度が０．８７Ｍで起こる。
主画分は、ＨＰＬＣテス）Ｋよって示されているように
純粋な生成物からなり、３倍に、濃縮し、ダウエックス
５０Ｗ（アンモニウム［）、（１０ａｄ）でろ過し、凍
結乾燥する。ＨＰＬＣ（、？−マフエースＡＡＸ、カラ
ムサイズ９０・０．３ｍ、６０℃、２ａｊ分；グレディ
エント：Ａ寓０，００５Ｍリン酸二水素カリウム、Ｂ−
０，５Ｍリン酸二水素カリウム、０．５Ｍ塩化カリウム
、ｐ！（４，５：２０％Ａ→１００チＢ３０分間）：を
鳳１１．８分Ｏｂ）　　　ｐ−ラベルヒトＩＦＮ−αお
よびＩｒＮ−β特異性ｃＤＮＡ　（実験材料検体）の製
造（図３）合成１３−ｍ＠ｒオリｆデオキシヌクレオチ
ドグライマー（段階５ｍ）（４０ｐｍｏｌ）および（ｒ
　−”Ｐ）−ＡＴＰ（５７００Ｃ１−ｍｍｏｌ−’　、
アマースハム）（４０ｐｍｏｌ）を１０ｍＭ塩化マグネ
シウムおよびＳｍＭＤＴＴを含む５０　ｍＭ　）すｘ−
塩１１１（ｐＨ９，５）　（１００μｔ）中で結合させ
る。Ｔ４／リヌクレオチドキナーゼ（ｐ−Ｌ生化学）（
５０ユニツト）をカロえ、３７℃で３０分後、更に酵素
の２０ユニツトをカロえて、培養は更に３７℃のもとて
１５分間続ける。　Ｐ−ラベルしたシライヤーを含む水
溶液は、フェノール抽出によって精製する。更に精製は
、４ｔ／セ′ファデ、クスＧ−５０カラム（ファーマシ
ア、ファイン）のクロマトグラフィを用いて１ｍＭ　ト
１ノス・塩酸（ｐＨ８，０）で処理する。各画分（０，
１＃Ｉ／）を集める。各々の画分の放射能は、セレンコ
ツ放射線の測足によって決定する。４・１０　　セレン
コアｅｐｍ／オリゴデオキシヌクレオチドｐｍｏｌｅの
比活性が得られる。５２ｐ−ラベルブライマー（４０ｐ
ｍｏｌ）は凍結乾燥し、Ｉす（４）ＲＮＡ　（段階１で
Ｂ己載のように誘発ナマルワ細胞から製造された）（１
４ｐｇ）を含む水（９５μｔ）に再懸濁し、ｉｏｏ℃で
６０秒間加熱する。４Ｍ塩化カリウム（９μｔ）をカロ
え、混合物を２５℃で６０分間培養する。リノ々−スト
ランスクリグターゼミックス（４５０ＩＩｔ）ｔ４０μ
Ｍ４０ｐ・塩ｒｌｌ　（ｐＨ８）　、　４　ａＭ塩化マ
グネシウム、１ｍＭ　ＤＴＴ（カルｉ４イオケミ・Ｉｎ
ｃ　）　１７４　ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ　ｄＡＴＰ
、１ｍＭ　ｄＧＴＰ、１ｍＭｄＣＴＰ、　　１ｍＭ　ｄ
ＴＴＰ（Ｐ　−Ｌ生化学）および鳥類骨髄芽球症ウィル
スの９０ユニｙ）からなる反応容量にするように加える
。培養は、３７℃で１時間続ける。溶液はフェノール（
ＴＮＥで飽和した）（１容量）で抽出し、核酸は、エタ
ノール（２容量）で、−２０℃のもとて１０時間沈澱さ
せる。
沈澱ハ、遠心（ＨＢ−４ｏ−ター　、　２０分間、１０
０００ｒｐｒｎ　＊　０℃）で集め、９０％（容量／容
量）ホルムアミド（メルク、グロアナリシス）　、　１
　ｍＭ　ＥＤＴＡ　。
０．０５％ブロモ・フェノールブルーおよヒｏ、ｏｓチ
キシレンシγノールブルーを含む色素混合液（２（ｌｔ
）に溶解する。サンプルを９０℃のもとて２分間加熱し
、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ　（ピーコックら（３２）
　）における５％ポリアクリルアミドゲルにかける。単
一体は、グラスミドｐＢＲ３２２のＨａ＠１分解から得
られた２６７　ｂｐと４３５ｂｐ　　Ｐ−ラベルしたマ
ーカーＤＮＡ断片の間に移動するオートラジオグラム上
で見ることができる。　Ｐ−ラベルｃＤＮＡ断片は、グ
ルから抽出し、ミューラ−らによって報告されたように
（４７）ｆｆ製する。
５２Ｐ−ラベルしたヒ）ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β特
異性ｃＤＮＡ検体の２００００セレンコフＣｐｍが得ら
れる。
ｅ）　　ＨｕＩＦＮ　ｃＤＮＡを含むコロニーのための
スクリーン化（図３） 前記載（段階４゛）のように製造し九形質転換コロニー
＋７）１６５０は、ニトロセルロースフィルターＢＡ８
５（シュ２イヒル＆シユーエに、８３直径）・に移す。
細胞は、溶菌化し、それらのＤＮＡＦｉ、変性させ、グ
ルンスタインおよびホックネス（３６）に基づいてイン
シトウで、フィルターに固定する。
コロニーのついたフィルターは、４　Ｘ　ＳＥＴ　（０
，１５Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ
８，０）。
１ｍＭＥＤＴＡを含む溶液）、０．１％（重量／容量）
７４コ　ｘ４００　（７ｙ−マシ７）Ｉ　Ｏ，１５６（
重量／容量）ポリビニールピロリドン（ＰＶＰ−３６０
。
シグマ）、０．１％Ｃ容量／容＠　）　ＢＳＡ、　０．
５％ＳＤ８゜およびｓ　Ｏｔｔｌ／ｍｌ変性牛−胸腺Ｄ
ＮＡ　Ｃ次のように製造される：５Ｍ９牛−胸腺ＤＮＡ
（Ｃｌ型、シグマ）を１０分間、０．５Ｍ水酸化すｌラ
ム中でＤＮＡｔ−１ｒ断賢形するために煮沸し、５Ｍ酢
酸で中和し、エタノール（２容量）で−２０℃のもとで
沈澱させる。沈澱は、ＨＢ−４０−ターを用いて、１０
分間θ℃のもとて遠心して集め、０．５　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ（５００μｔ）に再溶解する〕を含むフィルターにつ
き２０ｄの混合溶液で、６５℃のもとで、４時間前交雑
（Ｍｍ）化Ｌ、ニトロセルロースフィルターに２き３２
Ｐ−ラベルした検体の１０セレ／コフｅｐｍで、５Ｘ　
ＢＥＴ　、　０．０２％（重量／容ｉｔ）フィコール。
０．０１５６ポリビニールビロリドン、０．０２％（容
量／容量）　ＢＳＡ、　０．２　’］Ｉ　ＳＤＢおよび
５ｏｔｔｌ／ｄ変性十−胸腺ＤＮＡを含む溶液において
交雑化する。
交雑化は、６５℃のもとて３６時間行なう。
フィルターは一回クロロホルムで、二回ＳＥＴ　。
０、５　％　ＳＤＢで室温のもとでリンスし、６０℃の
もとて二回ＳＥＴ　、　０．５　％　８ＤＢで１時間、
および室温のもとで一回３ｍＭ）リズマ塩基でリンスす
る。
フィルターを、３ＭＭ−ペーパー（ホワトマン）で吸い
取ることによって乾燥し、Ｘ−線フィルム（フッ）で、
スクリーン（イルフォード増強スクリーン）を用いて、
−８０℃のもとて７２時間フィルターに露出させる。
９つの陽性（＋）コロニーが、オートラジオグラム上で
同定され、更に研究に用いられる。
形質転換した細胞の第一クローンは、しばしば組み換え
ＤＮＡ分子の１種以上を含み、交雑グラスミドＤＮＡ５
は、９つ陽性の交雑クローンから分離され、前記載のよ
うに再形質転換Ｅ、　ｃｏｌｉのために用いられる。
交雑プラスミドＤＮＡは、次のようｒ分離する：１コロ
ニーはエルレンマイヤーフラスコ（２５ｍ／）内に前記
載のようにテトラサイクリン（１０μｇ／ｒ！Ｌｌ）で
補足したトリグトン培地（１０ｍｌ）に、接種する。培
養は、３７℃で１５−１８時間３００ｒｐｍで振り回し
ながら行なう。細胞は、遠心によ−ｐて（ソＡ／４に、
Ｈ８−４ＣＩ−ター、　４００　ｒｐｍで１０分間、４
℃）採収する。約１９の細胞が得られ、５０ｒｎＭトリ
ス・塩酸（ｐＨ８，０）　（ｘｙ）に再懸濁する。リゾ
チーム溶液（０，２５＋／）、［’）ゾチーム１０ＷＩ
９１５０ｍＭ　　？リス・塩酸（ｐＨ８，０）・リゾチ
ームはシグマから得られた〕を加え、００℃で１０分間
培養後、０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）（０１
５ｄ）加える。更に０℃で１０分間培養後、２％トリト
ンＸ−１００（メルク）（６０μｔ）を加える。
０℃で３０分間保持した後、サンゾルは、１５０００ｒ
ｐｍで３０分間４℃のもとで、ソルノ櫂ル８　Ａ　−６
００ローターを用いて遠心する。上澄みは、フェノール
（ＴＮＥで飽和し九）（１容量）で脱タンノ４り化する
。相を遠心（ンルパルＨＢ−４０−ター）によって、５
０００ｒｐｍで４℃のもとで、分離する・上相ハ、クロ
ロホルム（１容量）で２回抽出する。
膵職のＲＮＡ５＠Ａ　（シグマ；８５℃で１０分前−加
熱したＴＮＥＩＩ（に１θ■溶解する）を最終濃度２５
μＩ／ｄになるように加え、混合物を３７℃で４０分間
培養する。溶液を１Ｍ塩化ナトリウムおよび１０％ポリ
エチレングリコール６０００　（ブルカ、１２０℃で２
１分間圧熱滅菌する）で調整した後、−１０℃で２時間
培養する。沈澱は、ツルパルＨＢ−４ｏ−ター（０℃の
もとで１００００ｒｐｍで２０分間）を用いての遠心に
よって集め、ＴＮＥ（１００μｔ）に再溶解する。ＤＮ
Ａ溶液は、フェノール（１容量）で抽出し、ＤＮＡは、
エタノール（２容量）で、−８０℃のもとて１０分間沈
澱させる。沈澱物は、エッペンドルフ遠心機を用いての
遠心によって集める。ＤＮＡは、０．５　ｍＭＥＤＴＡ
を含む１０ｍＭ　トリス・塩酸（ＰＨ７，５＞　（２０
１Ｊ１）に再溶解する。交雑プラスミドＤＮＡ（８−１
０μ１１）は培養液（ｌＱｍ）から回収される。
Ｅ、　ｃｏｉｌ　ＨＢＩＯＩは、９つの分離された交雑
ＤＮＡａの各々で形質転換され、形質転換した細胞は、
前記載のように、（段階４）テトラサイクリンを含む寒
天プレートに平板培養する。各々の形質転換から、抵抗
性クローンをとりあげ、１０ｄ培養を製造し、前記載の
ように培養から交雑ＤＮＡ５を分離する。
再形質転換前および後のＤＮＡサングルのすべてはＰｓ
ｔ’　Ｉエンドヌクレアーゼによる開裂および１ｍＭ　
ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ　トリス−酢酸塩（ｐＨ７，８
）における電気泳動によって分析する。すべてのサング
ルは、再形質転換前および後に、同一の開裂パターンを
示すｅ 再クローン化した組み換えＤＮＡ分子の１つは、２つの
帯を示し、一方はＰａｔ　Ｉ−開裂したｐＢＲ３２２の
移動度をもち他方は、約１０００ｂｐに対応する移動度
をもつ。それはＣＧ　−ｐ　ＢＲ３２２／）Ｌｙｅ　Ｉ
Ｆ′Ｎ−ｉ’ｂｔ−意味する。
他の組み換えＤＮＡは３つの帝を示し、一つは、Ｐａｔ
　Ｉ−開裂したｐＢＲ３２２の移動度をもち、一つは約
６００ｂｐの移動度をもち、一つは約１５０　ｂｐの移
動度をもつ。このクローンにおける組み換えＤＮＡ分子
は、ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β１を示す
・ ｄ）クローンＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｅ　ＩＦＮ−
１’ｂおよびＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｅ　ＩＦＮ−
β１の特徴クローンｃｃ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ−１’ｂおよびＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ
−β、の輯み換えプラスミドＤＮＡ５は、前記載のよう
に（段階５ｅ）培養から分離され、マックサムとシルバ
ード（４１）によって報告され丸刃法を用いて、ｑＤＮ
Ａ挿入のヌクレチド配列を確立することによって特徴づ
けられる。基本的には、次のアプローチが用いられる二
分離された組み換えグラスミドＤＮＡは、種々の制限エ
ンドヌクレアーゼで分解される。酵素は、本質的に供給
源にューイングランド・イイオラゲ）によって記載され
ているように（酵素緩衝液において、ＢＳＡをグラチン
によって［０換えることを除いて）通用する。制限され
たＤＮＡを含む溶液ヲ、フェノール（中ＮＥで飽和した
）で脱タン・やりする。ＤＮＡはエタノールで沈澱させ
、５０ｍＭトリス、塩酸（ＰＨ８，０）に、５０μ９７
ＩＬＩの濃度で再溶解し、牛腸アルカリホスファターゼ
（ペーリン！　−）　０．１　ユ＝　ｙト／　ＤＮＡ５
　’末端ｐｍｏ　ｌ　ｅを用いて、３７℃で３０分間培
養する。酵素は、溶液を６５℃で６０分間加熱すること
によって不活性化させる。ＤＮＡを、ミューラーら（４
７）によって報告されているようにＤＥＡＥ−セルロー
スクロマトグラフィーによって精製し、エタノールで沈
澱させる。次いでＤＮＡを５′−末端に（ｒ−ｓ２Ｐ：
）−ＡＴＰ（＞５０００Ｃ１／ｍｍｏｌｅアマースノ・
ム）で２ベルし、マックサムとシルバードによって報告
されているように（４１）Ｔ、／リヌクレオチドキナー
ゼ（Ｐ−Ｌ生化学）　（ＤＮＡをキナーゼ反応前に変性
させないことを除いて）と反応させる。一般的に、比活
性は１−３　・１０　’　ｅｐｍ／ｐ　ｍｏｌｅ　５’
−末端になる。
ラベルしたＤＮＡ断片を、第二の制限エンドヌクレアー
ゼで、開裂し、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液におけ
る６チ、８チまたは１（ｌポリアクリルアミドゲルの電
気泳動によって生成物を分離する。　ＤＮＡ断片をグル
から抽出し、ミ、−２−らによって報告された（４７）
ように精製する。ヌクレオチド配列の決定のために、　
ＤＮＡ断片を、化学的に分解し、生成物をマツクサムと
ジルノ櫂−トによって報告された（４１）ように４リア
クリルアミド電気泳動によって分離する。
特に、クローンＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｅ　ＩＦ’
Ｎ−１’ｂの単離されたグラスミドＤＮＡ５は、次のよ
うに処理する。一方において、！２スミドＤＮＡ（５μ
ｇ）を５′末端でラベルし九Ｂｇｌｌ［で分解し、Ｐｖ
ｕｌｌで開裂させる＊　Ｐｖｕｌ−Ｂｇｌ　Ｎ”　（”
ラベルされた位置を示す）およびＢｇｌ　ＩＩ−Ｐｖｕ
　ＩＩ　ＤＮＡ断片は、６−ポリアクリルアミドゲルで
分離する。他方において、プラスミド（５μｇ）を５′
−末端でラベルしたＡｌｕ　［で分解し、Ｐｓｔｌで開
裂させる。ＰｓｔＩ−Ａｌｕ　ｌ”　ＤＮＡ断片を８％
ポリアクリルアミドゲルで分離する０個々の断片は、順
次に分解し、マックサムとシルバードの報告に基づいて
、連鎖させる。
得られたヌクレオチド配列は、図４に示されている。約
２５−３５デオキクグアノシン残基の伸長は、ｃＤＮＡ
挿入の５′−終末端で先に起こる。示されているヌクレ
オチド配列は、いくぶんかゴエテルら［（１４）、バイ
スマン（３）〕によって報告されたＩＰ’Ｎ−α（Ｆ型
）　ｃＤＮＡに類似しており、それにもかかわらず、得
られるアミノ酸（図４）に影響する多くの明らかな偏位
（一点の突然変異）を示す・クローンＣＧ　−ｐ　ＢＲ
３２２／ＨＬｙｏ　Ｉ　ＦＮ−β、の分離された！ラス
ミドＤＮＡを同様の方法で処理する。
グラスミド（５ｄ’）ｔＰｖｕｌｌで分解し、５′−末
端でラベル化する。混合物の半分をｐｓｔｌで開裂し、
残りはＢｇｌＩＩで開裂する。ＰａｔＩ−Ｐｖｕｌｌ　
　およびＢｇｌ　ｉｔ　−Ｐｖｕ　ｌ”断片は、６％ポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動によって、分離され、
前記載のように分離する。ヌクレオチド配列（Ｎ−末端
配列）は、図５に示されておシ、ｃＰＮＡ挿入が、タニ
グテら（１７）によって報告されているようにＩＦＮ−
β１．　ｃＤＮＡのヌクレオチド信号１０２で開始する
ことを示している。従って、ｃＤＮＡ挿入は、Ｎ−末端
で、１１７建ノ酸を欠くヒトＩＦ’Ｎ−β、のためにコ
ード化する力をもつ。ｃＤＮＤＮＡ挿入約２０−２５デ
オキシグアノシン残基のストレッチ（伸張）によって５
′−終末端で攻撃され、位置１５３で一点の突然変異を
示し、得られるアミノ酸に影響をすることなくｃをＴ残
基に転換する。
・）　　ＣＧ−ＰＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１’ｂ
およびＣＧ−ｐ　ＢＲ３２２／ＨＬｙｅ　ＩＦＮ−β、
の挿入体に交叉−交雑化（交雑−雑種化）する組み換え
ＤＮＡ分子を含むクローンの同定 クローンＣＧ−ｐ　ＢＲ３２２／ＨＬｙａ　ＩＦＮ−１
’ｂおよびＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙａＩＦＮ−β、
の組み換えグラスオドＤＮＡ５を、前記載（段階５ｃ）
のように培養がら分離する。ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬ
ｙｅＩＦＮ−１’ｂプラスミドＤＮＡ（５＃＃）を、５
′−末端でラベルされたＢｇｌｌ［で分解し、Ｐｖｕｆ
［で開裂させる。一方において、分離したＣＧ−ｐ　Ｂ
Ｒ３２２／ＨＬｙｅＩＦＮ−βプラスミド（５ｐｌりを
、５′−末端でラベルしたｐｖｕ　■で分解し、Ｂｇｌ
ｌで開裂させるｏ　Ｐｖｕ　［−Ｂｇｌｍ　（３５１ｂ
ｐ）ＤＮＡ断片（検体Ａ）およびＰｖｕｌｌ　−Ｂｇｌ
Ｎ（３６８ｂｐ）ＤＮＡ断片（検体Ｂ）は、前記載のよ
うＫ　（段階５ｄ）　８％ポリアクリルアミドゲルで分
離し、イン・シトウでコロニーの交雑化（雑種化）（下
記参照）のために用いる。！ラスミドＤＮＡ５の制限、
ＤＮＡ断片のラベル化および精製化は、前記載（段階５
ｄ）のように同様の方法で行なう。
以下余し。
前記載のように（段階４）製造した形質転換コロニー（
４０００）’ｉニトロセルロースフィルターＢＡ８５（
シ、ライヒル＆シューエル、８３直径）に移す、細胞を
ＩＩ化し、それらのＤＮＡｔ−変性させ、グルンスタイ
ンとホ、グネース（３６）の方法に基づいて、イン・シ
トウでフィルターに固定する。検体人およびＢ（両方の
検体を混合する）への交雑化（Ｍ種化）は、前記載のよ
うにＣ，段階５・）行なう、６つの陽性コロニーは、オ
ートラジオグラフィーによって固定され、それら３つは
次のようであシ、： Ｅ、　ｃｏｉｌ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２２７
ＨＩＪｙｅＩＦ’Ｎ−４，。
Ｅ、　ｃｏｉｌ　ＨＢ　１０ｉ　ＣＧ−ｐＢＲ３２ｇ／
１（ＬｙｅＩＦＮ−５，およびＹ、、　ｃｏｌｉ　ＨＢ
　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２し肛ｙｅＩ庫−８．′更に
研究のために用いられる。それらのクローンの！ラスミ
ドＤＮＡ農は、分離され、再形質転換され、前記載のよ
うに（段階５　ｅ　ｔ　５　ｄ　）のように再分離する
。
組み換えＤＮＡ　ｓの挿入の特性を確立するために、Ｄ
ＮＡ挿入のヌクレオチド配列（部分的もしくは完全Ｋ）
は、前記載（段階５ｄ）のように一般的アプローチを用
いることによって明らかにすることができる。
特に、分離されたプラスミドＤＮＡａ　ＣＧ−ｐＢＲ３
２２／ｆＨＬｙｅＩＦＮ−４，（５ｘ＃　）およびＣＧ
−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−８，′（５μｉｔ＞
’ｔ、各々ダー未満でラベルしたＰｖｕ　Ｍで分解し、
Ｐａｔ　ｌで開裂する。　ＤＮＡ断片を、８−／リアク
リルアミドダル上で分画し８；ＤＮＡからＰａｔ　Ｉ−
ＰＹＩＩ　ｆｉ”　（〜１２０　ｐｂ　）およ°び４．
ＤＮＡからＰｓｔ　Ｉ−Ｐｖｕ■（８２ｐｂ　）を例の
とおシに分離する。
分離されたプラスミドＤＮＡ　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／）
ｉＬｙｃＩＦＮ−５，１％次のように処理する。一方に
おいてプラスミドＤＮＡ　（５μＩＩ）を５′−未満で
２ベルした亀・■で分解し、Ｐａｔ　Ｉで開裂させる。
Ｐｓｔ　５−Ｈｍ＠１ｌ（５７ｂｐ）ＤＮＡ断片は、１
０％ポリアクリルアミドダルで分離する。他方において
、プラスずド（５μｍ１　）　ｔ　５’−未満でラベル
したＥｅｏＲ・■で分解し、Ｐａｔ　ｌで開裂させる。
Ｐａｔ　１−ＥｃｓＲＩ”（２３５ｂｐ　）オ！？、Ｉ
’Ｅ＠ｏＲＩ”−Ｐａｉｌ　（〜７００ｂｐ　）罠は、
８％ポリブクリルアミドｒルで分離する。
イロイロのＤＮＡ断片を、マツキサムとジルベルト（４
１）による配列分析をする＊　ｃＤＮＡ挿入ヌクレオチ
ド配列を、図６−８に示めす。図６において％０Ｇ−ｐ
ＢＲ３２２／）ｆＬｙ＊ＩＦ？ＩＪ　４１のｅＤＮＡ挿
入の部分的配列を示めす、挿入は、２３−デオキシグア
ノシン残基のストレッチによりてダー終未満で攻撃１　
　され、ストロイリら（１２）によって報告されたＩＦ
Ｎ−α２　（ｔ、・）　＠ＤＮＡの部分からなる。３′
−エクストラシストロニ、り領域（ｅｘｔｒａ　＠１ｓ
ｔｒｏｎｌｅｙ＠ｇｌｏｎ）において、いくつかの少な
い偏位（一点の突然変異）および付加的３１８ヌクレオ
チドのストレッチがある。　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬ
ｙｅｌＦＮ−８’のａ　ＤＮＡ挿入のヌクレオチド配列
は、図７に示めす。
挿入は２０−２３デオキシグアノシン残基のストレッチ
によってぎ一終未満で攻撃され、がニブルら（（１４）
、マンタイら（１１）参照〕によって報告されたＩＦＮ
−α（Ｄ　Ｗｉ）　ｃＩＮＡに類似しているが、同一で
はない。前述のｅＤＮＡ領域における相違とは別に、ひ
き続いてのＩＦＮコード化配列配列ＴＣおよびＧＴＧの
かわシにアラニンのためにコード化するおよびバリンの
ためにコード化する２８−３０　ＧＣＧ　）リプレット
および４０９−４１１α℃トリプレ、トの位置にＩＦＮ
遺伝子を含む、結局、ＣＧ−ｐＢＲ３２２，／）ＩＬｙ
　ｅ　ＩＦＴＪ−５、のｃＤＮＡ挿入のヌクレオチド配
列（図８）は、ぎ−終未満で、１７デオキシグアノシン
のストレッチを示めす。ヌクレオチド配列は、ｔニブル
ら（１４）によって報告されｆｃｌＦＮ−α（Ｂｆｉ）
ｃＤＮＡの配列に関保がある−０しかしながら、ＨＬｙ
ｃＩＦＮ−５，０５′−終未満に付加的なヌクレオチド
かあシ、エクストラジストロニック領域において、一点
の突然変異、除去、挿入およびＩＦＮコード化配列配列
いて、特に２２および３６１−３７２の位置に、同様に
存在する。
６、ヒ）　ＩＦＮ−特異性組み換えα法分子を含むＥ、
　ａｏｌｉによるヒトインターフェロンの合成し）　Ｉ
ＦＮ特異性組み換え膀ａ分子を含むことを示めす５つの
クローン、すなわち に、ａｏｌｉ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２２ＡＪ
ｙｅＩＦＮ−１’ｂＬｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−
ｐＢＲ３２ｇ／ＨＬｙｅＩＦＮ−４１゜Ｅ、ｃｏｌｉ　
ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２ｇ／）ＬｙｃＩＦＮ−
５，。
Ｅ、ｃｏｌＩ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／４
ｉＬｙｃＩＦ？Ｊ−８’４．およびＥ、ｅｏｌＩ　ＨＢ
　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２ｇ／ＤＩ、ｙｃＩ）ｉ？’
Ｊ−β、。
は、ＩＦＮ活性をテストし、各々は次のような方法で行
なう：対応する１、ｅｏ１１クローン（３０ｍ１１／懸
濁液）の培養は、トリプトン培地で光学的濃度（ｏＤ６
５０）１に増殖させる。細胞を採収し、３０ｍＭ塩化ナ
トリウムおよび５０　ｍＭ　）リス・ｍｌ！（ｉＪ−１
８，０）’ｉ含む水溶液（０，５ｍ）に再懸濁する。リ
ゾチーム（１ｍ％Ｆ／ｌｌ１）　（’／／”マ）ｔ−加
えル＊Ｏ’Ｃで３０分間保持した後、凍結（液体窒素）
させ、５回解凍（３７℃で）させ、４℃のもとで、５ｓ
３４　ソに一’４１０−ターを用いて２００００　ｒｐ
ｍで２０分間遠心する。上澄み管、段階１ｃで記載のよ
うにアームストロング（２９）の方法に基づいて、サイ
ト・タテ、クパイオア、セイ（細胞病理的生物活性法）
を用いてＴＦＮ活性を測定する。次の活性が検出される
： 以Ｆ全白 抽出材料　　　　　　　　　　　ＩＦＮ活性組み換えＤ
ＮＡｔ−含むＥ、　ａｏｌ　ｉＨＢ　１０１　　　　　
（ＩＵ／−）ＣＧ−ｐＢＲ３２ｇ／ＨＬｙｃ　ＩＦＮ−
１’ｂ　　　　　　Ｏ：　０ω−ｐＢＲ３２２／４Ｌｙ
ｃＩＦＮ−４，０：０ω−ｐＢＢ　３２ｇ／匪ｙｃＩＦ
Ｎ−５，１０（資）Ｏ：１００（４）艶−ｐＢＲ３２ν
ＨＬｙｅ　Ｉ酎−ぎ、　　　　　１■；１（資）ＣＧ−
ｐＢＲ３２ｇ／ＨＬｙｃＩＦ’Ｎ−β、０；０測定でき
番いＩＦＮ活性を示めすクローンは、ＨｕＣｙＩＦＮ−
ｃＤＮＡ−挿入が、転写の方向に関連して不適当な配向
にある組み換え）徨易を含む可能性もある。従って、実
物大ｃＤＮＡ挿入を含むこのようなりローン（ＣＧ−ｐ
ＢＲ３２２／和ａｙｃ＋Ｉ耐−１′ｂ）の組み換えＤＮ
Ａは、次のように再配向される：１　ｏ　−ｙ　Ｅ、　
ｅｅｌ　ｉ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／）［
、ｙｃｌＦＴ’Ｊ−１’ｂの１７″ラスｉドＤＮＡ　ｔ
−１前記載（段階５ｃ）のように分離し、Ｐａｔ　Ｉで
開裂する。開裂したａｍ（０，５μＩＩ）を２０−トリ
ス・塩酸（ｐＨ７，８）１．１０ｍＭｔＪｉ化マクネシ
ウム、１０　ｍＭ　ｌ７ＩＴ　、　２５　ｍＭ塩化ナト
リウムおよび５０μｍ１／８１０’ラチンを含む緩衝液
（２０μＩ）中で、ＴＡＤＮ＆リガーゼ（バイオラメ）
（０，２二二、ト）および０．５　ｍＭ　ＡＴＰ　で、
１５℃のもとて２時間反応させる。Ｌｃｏｌｉ　ＤＢｌ
ｏｌは、前記載のように（段階４　）　ｃＤＮＡ混合物
で形質転換される。形質転換されたコロニーはへテトラ
サイクリンで補足したマッグ・コ４タイ寒天グレートで
選択し、ニトロセλロースフィルターに、レプリカ−平
板化する０組み換えＤＮＡ　ＣＧ−ｐＢＲ３２２７％ｙ
ｃｌＦＮ−１’ｂ　（段階５・）の　Ｐ−ラベルＰｖａ
　ｊ−Ｂｇｌ　ＩＩ”断片（３５１ｐｂ）に交線化（Ｉ
Ｉ１１種化）する４−バクテリア、コ゛ロニーは、Ｅ、
ｅｏｌｉ）ＩＢｌｏｌ　ＣＧ−ｐＢＲ３２ｇ／’）ＩＩ
−ｙｅ　ＩＦＮ−１’ｂ　、−１’ｂ　４に示めされる
。４・クローンの抽出物は、前記載のように、！■活性
の丸めに準備され、テストされる６次の活性が検出され
る： 抽出材料　　　　　　　　　　ＩＦＮ活性組み換えＤＮ
Ａを含むＬ　ｃｏｔ　ｉ　ＨＢ　１０１　　　　（ＩＵ
、／＋４！　）ＣＧ−ｐＢＲ３２ｇ／１（ＬｙｅＩＦ？
Ｊ−１’ｂ１　　　　０　；　０ＣＧ−ｐＢＲ３２Ｖ延
ｙｃＩＦＮ−１’ｂｚ　　　　　Ｏ：　０ＣＧ−ｐＢＲ
３２２Ａｒ１ＪｙｅＩＦ？Ｊ−ｉ’ｂｓ　　　　　Ｏ：
　０ＣＧ−ｐＢＲ３２ｇ／）ＬｙｅＩ団−ｔ’ｂ４３０
：３０プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／１（ＬｙｅＩＦ
Ｎ−１’ｂ４Ｕ、ＩＦＮ活性をもつポリベグチドの合成
を方向づけることのできるｅＤＮＡ挿入を含む・ ？、　　ＩＦＮ活性ｔもつぼりペプチドの高レベル生成
のできる組み換えグラスミドの構成およびそれらのグラ
スミドをもつＥ、ａｏｌＩ　ＨＢ　１０１の形質転換Ａ
、　　ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩ団−α−１組み換
えプラスミドの構成 りｏ　−ンＥ、ａｏｌ　ｉ　Ｉ（Ｂ　１０１　ＣＧ−ｐ
ＢＲ３２シ和、ｙｃｌＦＮ−１′ｂ、のＩＦＮ特異性タ
ン・々り収ｉｔｔ改良するために、図９に系統的に示め
し九ように次の作成が行なわれる。
＠　　ｅＤＮＡ挿入の製造 クローンＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３
２２／ＨＬｙｅＩＦＮ−１’ｂの組み換えプラスミドＩ
ｍ（１５０μＩ）を標準法（段階５ｄ）を用いてｐ畠ｔ
　Ｉ　（□”イオラゴ）で開裂させる。次いでフェノー
ルで抽出し、エタノールで沈澱させ、除去された挿入は
、５０−トリスｅ塩ｆｌ’（ｐＨ８，０）およびｌ　ｙ
４　ＥＤＴＡ　ｌ含むシュクロース、デンシティダレデ
ィエン）遠心（５−２３１によって分離する。遠心は、
１５℃のもとでＴＳＴ　４１０−ター（コントロンＡＧ
）を用いて、３５０００　ｒｐｍで１６時間行なう、各
々の画分（Ｑ、３１Ｌ／）ｉ　ｌ８ＣＯダレデイエンド
コレクターを用いて１１７分の速度で集める。小さい断
片を含む画分（例、挿入体）は、プールする。ＤＮＡを
エタノールで、例のように沈澱させ、沈澱物は０℃のも
とで、ＨＢ−４０−ター（ツルパル）ヲ用いて、１００
００　ｒｐｍで１０分関連心することによって集める。
沈澱物は、１０ｍＭ）リス・塩酸（ｐ）１７．５）およ
びＱ、　０５　ｍＭ　Ｅｌ）ＮＡを含む緩衝液（６０μ
Ｊ）に再溶解する。ＤＮＡ（３０１１ＩＩ）は、光学的
濃度を測定することによって決定され、回収される。
挿入ＤＮＡ　（１０μＩＩ）を、Ｈａ＠　ＩＩＩ　（パ
イオラが）で分解し、断片は５０　ｍＶ　）リス、５０
−ホウ酸、ｌ　ＷＭＥＤＴムおよび０．５μＩＩ／Ｍｌ
エチジウムブロマイドを含む溶液における２チアガロー
スグル上で分画化する。最も大きいＤＮＡ断片、ＨＡｅ
酊−Ｐａｔｌ（８６９ｂｐ）およびＨａｓ　Ｍ−Ｈａ＠
ｍ　（８２ｂｐ　。
図９参照、断片３および４）は各々グルから切シ取シ、
０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５ｏ−トリス・塩酸（ｐ）
１８．０）、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液（５ｄ）中
に注射器のついた細い針を通じて積出させ、−夜振とり
することによって溶出する。溶出液は、）徨を吸着させ
るために１００μＩ　ＤＥ−５２（ポヮトフン）ノ青ス
ツールピペットカラムを通過させる。
カラムを同じ緩衝液（２１１７）で洗浄し、ＤＮＡ　１
に１．５Ｍ［化ナトリウム、５０　ｍＭ　）リス（ｐ）
（８，０）＞　ヨｒＪ　Ｉ　ＷＩＭＥＤＮＡ　を含む溶
液（４００Ｉｌｌ　）で溶出する＠　ＤＮＡは、エタノ
ール（２容量）で−２０℃のもとて一夜沈澱させる。沈
澱物を、工、ｄンドルフ遠心機での遠心によって集める
。
Ｈｉｓ　ｌ［１−Ｈａｓ　ＩＩＩ　ＤＮＡ断片（８６ｐ
ｂ）は、再溶解し、Ｓａｕ　３Ａ　（パイオラが）で分
解する。酸素は６５℃もと３０分間で熱−不活性化する
。亀ａｌｌ−Ｐａｔ　１階徨断片（８６９ｂｐ’）（１
Ａｇ）を加え、溶液を１０ｍＭ塙化ナ塩化ウム、１０Ｗ
ｔｙｉｒｙｒＴオヨび０．５−ＡＴＰで調整し、Ｔ　４
　Ｉ）ＪＡリガーゼ（パイオラが）（３０ユニ、ト／μ
ｌ）、反応容器に加える。Ｓ液を・　１５℃のもとて１
０時間培養する０次いでフェノールおよびクロロホルム
で抽出し、混合物を、エチジウムブロマイドの存在下に
、）リス−ホウ酸−ＥＤＴＡＩＣ１？ける２チアガロー
スグル上で分画化する。Ｓａｍ−３Ａ−Ｐａｔ　ｌ　Ｄ
ＮＡ断片（図９参照、断片５）は前記載のように抽出さ
れ、エタノールで沈澱させ、１０ｍＭ）リス・塩１１（
Ｆ）１７．５）および０、０５　ｗａｌｌ　ＥＤＴＡを
含む溶液（１０μｊ）ＫＭ溶解する。
ｂ、　　ｐＢＲ３２２のβ−ラクトア（ラクタ）アマー
ゼ調整領域（ＡｐＰｒ　）　ｔ−含むＤＮＡ断片の製造
プラスミドｐＢＲ３２２をＰｓｔＩ（段階３ｂ）で開裂
し１エキソヌクレアーゼＢａｌ　３１　（ペネスダ、リ
サ−−Ｆ−１うＭ　）　（４３−二ｙ　）／Ｍｌ）　Ｔ
３０　”ＣＯもとで４−１０分間、β−ラクトアマーゼ
コード化断片を除去する皮めに処理する。
式５’−ＡＴＧＴＧＴＧＡＴＣＡＣＡＣＡＴ−３’　Ｏ
化ナトリウム−は、前記載（段階５ｍ）の方法を用いて
合成される。リンカ−は、好都合に連結することによっ
てＢａｌ　３１処理したｐＢＲ３２２ＤＮＡ　Ｋ加える
。得られる交紬（雑種）分子を、制限エンドヌクレアー
ゼＢ（１１（パイオラざ）およびＥｃｏＲＩで開裂させ
る。分解した生成物は前記載のように（段階２ｍ）トリ
ス−ホウ酸−ＥＤＴＡにおける８％／リアクリルアＺト
グルで分画する。ＤＮＡ断片（ＡｐＰｒ　Ｊ値断片）は
１８４ｂｐおよび２３４　ｂｐママ−−ＤＮＡ５の間に
移動し、前記載のように（段階７ｍ）分離され、例のよ
うにエタノールで沈澱させる。沈澱物は１０？ＦＩＭ）
リス・塙ａｌ（ｐＨ７，５）および０．０５ｔｒＭ　Ｅ
ＤＴＡを含む溶液に再溶解する。
ｃ、　　ＡｐＰｒＤＮＡ断片のａＤＮＡ挿入への連結お
よびプラスミドｃｃ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙｘｒＮ−α
−１の製造ＡｐＰｒ　ＤＮＡ断片およびｅＤＮＡ挿入を
含む溶液をブールする。混合物１１０ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１０ｒｒＭ　ＤＴＴおよび０．５　ｖＭ　ＡＴＰ
で調整し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（パイオラが）（３０ユ
ニ、ト／μＪ）で、１５℃のもとて１２時間培養する。
次いでフェノールおよびクロロホルムで抽出し、混合物
を０．１−低融解するアガロースゲル（バイオラド）で
分画化する。得られｆ　ＡｐＰｒ−ｅＤＮＡ断片を、Ｐ
ｓｔＩ（バイオラボ）およびＥｅｏＲ（バイオラボ）で
次の操作で開裂した大きな断片に加える。ＡｐＰｒｃＤ
ＮＡ断片（約２０　ｆｉｌ）を含むダル部分を、ｐＢＲ
３２２のＰｉｔ　１−ＥｃｏＲＩ断片と混合し、６５℃
の４とで２分間融解し、３７℃に冷却し、０．５−ＡＴ
Ｐ。
１０ｖｄｄ　ＤＴＴ　、および１０ｔｔｌｌ壇化マグネ
シクムで調整し、組み換えグラ、Ｘ　ｉ　）’　ＣＧ−
ｐＢＲ（ＡＰＩ／ＬｙＩＦ？Ｊ−α−１を含む溶液を得
るために、１２時間、１５℃のもとでＴ４ＤＮＡリガー
に（パイオラ＆）（３０ユニ、ト／μｌ）で培養する。
４１、　　プラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／Ｌ）’Ｉ
厨−α−１をもつＥ、ｔｏｌｌ　Ｈｌｉ　１０１の形質
転換１００　ｖｎＭ　）リス・塩酸（ｐ）Ｊ７．５）、
１００−塩化カルシウム、および１０〇−塩化マグネシ
ウムを含む溶液１／１０に、プラスミド国−ＰＢＲ（Ａ
Ｐ）／Ｌ７ｒｒＮ−α−１１−含む溶液に加える０合わ
せた溶液管、１０分間、６５℃で、ＩＪ　／４−ゼで不
活性化し、３７℃のもとで冷却する。１液を、前記載（
段階４）のようにＣ、ｊ＋処理し九Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢ
　１０１に形質転換するためにとシ、テトラサイクリン
１０μｉ／Ｋｌで補足したマックコンケイ寒天プレート
に平板化する、形質転換したコロニーは、ＩＦＮ活性（
段階６）のためにスクリーンする。１厨活性の最も高い
レベル金生成するクローンを選択し、Ｅ、ｃｏｌｌＨＢ
　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−Ｑ−１
ｋ　企図ｆ　：ｂ。ｈｐｏ　−ｙ　Ｅ、　ｃａｌ　ｉ　
）ＩＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／Ｉ（Ｌ）’ｅＩ
ＦＮ−１’ｂ　Ｋ比して、１３００倍刺激を示めす、４
００００（ＩＵ／Ｍ）の活性が、検出される。
クローンＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／Ｌ７４ＦＮ−α−１の
組み換えグラスミドＤＮＡは、前記載のように（段階３
ｅ）培養から分離し、ｅＤＮＡ挿入（ＩＦＮ遺伝子）の
ヌクレオチド配列およびβ−ラクトアマーゼ調節領域を
確立することによって特徴づけられる。結果を図１０に
まとめて示めす。
Ｂ、　　！ｇみ換えプラスミド圓−ｐＢＲ（ＡＰ）Ｌｙ
ＩＦＮ−α−３クローンＥ、ｅｏｌｉ　ＨＢ　１０１　
ＣＧ−ｐＢＲ３２ＶＨ１ＪｃＩＦＷ−８１′のＩＦＮ％
異性タ異性タン収量は、次のように改良される（図、１
１）： ａ、　　ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦ？Ｊ−α−１
からβ−ラクトアマーゼ調節領域を含むａｍ断片の製造 ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−Ｉ　ＤＮＡ　
（１００μＩＩ）を、Ｈｌｎｄ　Ｉ　（パイオラ−〆）
およびＢｇｌ（■）　（パイオラが）で開裂させる。次
いでフェノール抽出およびエタノール沈澱、切断除去し
た論断片を、５〇−トリス・塙ｉ１！ｐ）ｉ８．０およ
び１　ｍＭ　ＥＩ庁Ａを含むシュクロースデンシティダ
レディエン）ａ心（５−２３％）によって分離する。遠
心は、ＴＳＴ　６０ローター（コントロンＡＧ）を用い
て５８０００ｒｐｍで１５℃のもとて４時間行なう、各
画分（０，２Ｍ１）ｋ前記載のように集める。小さ々断
片（Ｉ（１ｎｄ１−　ＢｇＩ　Ｉ　）を含む画分け、ブ
ールし、ＤＮＡ　ｉ。
エタノールで例のように沈澱させる。沈澱物全１０艷ト
リス・塩１１！（Ｐ）１７．５）および０．０５　ｍＭ
　１ｍ）ＴＡを含む２０μノに再Ｓ解する。
ｂ、　　ｃＤＮＡ挿入の製造 ｅＤＮＡ挿入は、前記載のように（７ｍ章）ＰａｔＩで
、組み換えプラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／１（Ｌｙａ
ｌＦＮ−ぎ、から切断除去する。
ｃＤＮＡ挿入（２、ｍＪＦ）　ｔ−Ｓａｕ　３　Ａ　（
パイオラが）（２，５ユニツト）、臭化エチル（１０ｎ
Ｍ／ｍ　）中で分解し、３７℃で６０分間培養する。分
解物（消化物）を、フェノールで抽出し、ＩＮＡ　ｔエ
タノールで前記載のように沈澱させる。ＤＮＡ断片は、
５０　ｍＭ　）リス、５０ｍＭホウ酸、１　ｆｎＭＥＤ
ＴＡおよヒ０，５μｍ１／ｌｉｔ　　エチジウム−ブロ
マイドの溶液４Ｃオｔｉル１．２　％アガロースゲルで
分画化する。
第二の最も大きいＤＮＡ　（８ａｕ　３Ａ−Ｐｓｔ　Ｉ
　：　６９３ｂｐ）をダルから抽出し、７ｍ）章記載の
ように精製する。　ＤＮＡ　ｆ　ｌ　Ｏ−）リス−塩酸
（ｐＨ７，５）および０．０５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｔ′
含む溶液（２０μｌ）に再溶解する。
ｃ、　　ｅＤＮＡ挿入（８ａｕ　３Ａ−Ｐｓｔ　ｌ　）
　ヘのＨｌｎｄｌｌｌ−８ａｕ　３Ａ　ＤＮＡ断片の連
結 両方の口法断片（〜５０ｎ９）の等量を、１０ｍＭ塩化
マグネシウム、１０　ｖＭ　ＤＴＴ　、　　ＴＡ　ＤＮ
Ａリガーゼ（パイオラｄｆ）（３０Ｌ二、ト／μｌ）を
含む０．５　ｍＭ　ＡＴＰに加え３時間、１５℃のもと
で、培養する。混合物を、８０℃で１５分間培養し、５
０ｔｎＭ塩化ナトリウムで一整する。α値混合物を、Ｐ
ａｔ　ｌ　（パイオラが）（０，５二二、ト）およびＨ
ｌｎｄ璽（バイオラが）（１ユニ、ト）で２０分間、３
７℃で分解させる。鵬は、フェノール抽出し、エタノー
ルで沈澱させ、１０？ＰＩＭトリス・塩＊（ｙ）ｔ７．
５）および０．０５　ｄｌｌ　ＥＤＴＡからなる液（２
０μりに再溶解する。
得られた混合物のＶ２は、１０ｍＭ塩化マグネシウム、
１０ｍＭＤＴＴ％　Ｔ４′″ＤＮＡリカーゼ（パイオラ
＆）（３０ユニ、ト／μｌ）を含むＡＴＰにおけるプラ
スイドｐＢＲ３２２（〜１００　ｍｌ　）の大きいＨｌ
ｎｄ曹−ＰｓｔｌＤＮＡ断片に加え、２時間、１５℃の
もとで、組み換えプラスミドω−ｐＢＲ（ＡＰ）／Ｌｙ
ＩＦＮ−α−３を含む溶液１得るまで、連結化させる。
ｄ、プラスミドＣＧ−ＰＢＲ（ＡＲ″）／Ｌｙ　Ｉ几−
α−３をもつＥ、ａｏｌｌ　ＨＢ　１０１の形質転換前
記の１／１０１液は、段階４）に記載のようにＥ、＠ｏ
ｌｉ　ＨＢ　１０１　ｔ−形質転換するために用いる。
形質転換し九コロニーは、前記載のようにＩＦ’Ｎ活性
のためのテストに用いられる。
ＩＦＮ活性の最も高いレベルを生成するクローンを選択
し、Ｅ、ａｏｌｉ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ
）／Ｌ）’ＩＦＮ−α−陸企図する。
ＩＦ’Ｎ活性を、前記載のように（段階６）測定する。
１りｏ　−ンＥ、ｃｏｌ　ｉ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐ
ＢＲ３２２／４（ＬｙｅＩＦＮ−ぎ、に比し、て７００
倍刺激會示めす。７００００（ＩＵ／Ｍｌ　’）の活性
が検出される。
クローンα；ｐＢＲ（ＡＰ）、／Ｌｙ　ＩＦ’Ｎ−α−
３の組み換えプラスミドＤＮＡは、前記載（段階３ａ）
のように培養から分離され、ｃ　ＤＮＡ挿入のヌクレオ
チド配列およびβ−ラクトアマーゼ詞節飴域の確立によ
って、特徴づけられる。結果を図１２にまとめて示めす
。
プラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ″ＶＬＦＩＦＮ−α−３
のための構成（作成）プロトコールは、すべてのα−Ｉ
ＦＮ　ｅＤＮＡ遺伝子に対して用いることができ、また
は適当に、一般的にクロマトシームα−ＩＦＮ遺伝子を
切断することもできる。
たとえば、グラスオドＣＧ−ｐＢＲ３２ン延ｙｃｒＦ？
Ｊ−５゜から開始して、プラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ
）／Ｌ）’Ｉ庫−α−２が、グラスミドα；−ｐＢＲ（
ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３に対し７て記載されたと同
様の方法で得られる。この新しいプラスミドは、ＧＣ−
ｐＢＲ３２２／）ＩＬｌｙ＜ｌ　ＩＰ’？Ｊ−５ｓの鳳
挿入、オヨヒＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬＦ　ＩＦ？Ｊ−
α−１からのβ−ラクトアマーゼ調節領域を含む。前記
載のように、企図されたクローン、Ｅ、ｅｏｌｌ　ＨＢ
　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬＦＩＦ’Ｎ−α−
２を選択する＊　ＩＦ　Ｅ、ｅｏｌｉ　ＨＢ　１０１０
Ｇ−ｐＢＲ３２２／ＩＬｙ　ｃ　ＩＦＮ−５、に比して
、５倍刺激を示めす。
５００００（ＩＵ／耐）のＩＦＮ活性が検出される。
ｅＤＮＡ挿入のヌクレオチド配列およびグラス書ド国−
ｐＢＲ（ＡＰ）／Ｌ）’Ｉ厨−α−２のβ−ラクトアマ
ーゼ調節領域は、前記載のように確立され、図１３に示
めす。
８、Ｅ、・ｏｌｉ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ
）／ＬｙＩ庫−α−３株の発酵規模での培養 Ｅ、ｅｃＩｌｉ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）
／ＬｙＩＦＮ−α−３株は、１溶液につき次の成分を含
む培地番号Ｘで培養するニリン［１水素ナトリウム−７
結晶水　　　１３．２５　１！リン＃Ｒ２水素カリウム
　　　　　　　　　　　３．０塩化ナトリウム　　　　
　　　　　　　　　　Ｏ，Ｓ塩化アンモニウム　　　　
　　　　　　　　　１．０塩化カルシウム・２結晶水　
　　　　　　　０．０１５硫酸マグネシウム・７結晶水
　　　　　　　０．２５クエン酸鉄（厘）　　　　　　
　　　　　　　ｏ、ｏｏｓカスアミノｌ［！　　　　　
　　　　　　　　　ｔｓ、。
酵母抽出物　　　　　　　　　　　　　　２．０セレロ
ース　　　　　　　　　　　　　　８．０テトラサイク
リン　　　　　　　　　　　　０ρ１培地集団とは別に
、セレロースおよびテトラサイクリンは、加熱滅菌およ
び殺菌ろ過で各々殺菌する。培地番号Ｘの５００１を含
む３つの２）−振とりフラスコ中に、良く増殖した蜂天
グランドから細胞′ｔ−接種する。振とりフラスコ１に
４つの・９ツフル装置をし、３０℃のもとで、１１時間
回転振とり培養をする。この前培養の１．５７　’Ｉｋ
培地番号Ｘの３００１を含む５００１発酵の／？ツフル
に移し、次の県件下で培養する：振と５３５０−５００
ｒｐｍ　（平板な翼タービン）通気速度０．３−１．（
１／　１　ｗｉｎ　ｓ発酵上部圧０．３　ｂａｒ　、温
度３０℃、溶解した酸素のレベルは、通気速度を増加さ
せることによって５０９６飽和以下に落ちることから妨
げられ、必要に応じて、振とり速度を最大値にすること
かできる。
−は、水酸化ナトリウムを添加することによりて６．８
以上に調整する。約１０時間の培養後、培養は最大イン
ターフェロン滴定値に達し〔アームストロング（２９）
の方法によって測定〕、採収する。
以下ぷ白 ９、　　ＨＬｙｌＦＮ−α−３の分離および精製１）モ
ノクローン抗体カラムのためのポリペプチド製造 ｐＨ７，２Ｃ）培養肉汁（２８０りをｉｏ′ｃＫ冷却し
、細胞をＡｌｆａ　−Ｌａｖ＠ｌ　ＢＲＰＸ−２０７ｄ
ｓ−Ｓｌｕｄｇ＠ｒを用いて分離する。上澄みは、ＩＦ
Ｎ−活性を示めさない、集める前に１細胞塊は、ｄ・−
Ｓｌｕｄｇ＠ｙの固いメウル内に集積し、上澄みを、２
０１溶曹化（溶解化緩衝液〔５０ｍＭ　）リス、塩酸、
５０　ｍＭＥＤＴム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、１　ｍ
Ｍ　ＰＭＳＦ　（フェニルメチルスルホニルフルオライ
ドＬ１ｍＭＬ−システィンを含むＷ！Ｌを塩酸で−８，
２に調整する〕に移し、遠心ゲウルの中味（７１）を全
−ｄ・−Ｓｌｕｄｇ１ｎｇで排出する＊　ｄｅ−Ｓｌｕ
ｄｇ＠ｒを、３回溶菌化緩衝液ムで洗浄する。得られた
細胞塊は、緩衝液ムでａｉｍ螢して２０ｊＫｌ、、−６
，９にする。
５−１０℃に冷却後、ａｍ液を、ポリウレタン振と２デ
スクおよび１１７０１１１７ガラス球（［径０．５−〇
、７５ｍｍ）を用いて、振とぅ速度３３５０　ｒ、ｐｔ
ｌ１１供給速度５１Ａで、ＤＹＮＯ＠−ミ＃　（ｍ　Ｋ
ＤＩ、−Ｐム１ａｔｅ１．４１）を通過させ、細胞を破
壊する。溶菌化緩衝液Ａ　（８００ｍｌ　）　（／　Ｉ
Ｊ　ｘｆｖンイミンｔｏｏｙを加えて塩酸でｐＨ８，２
Ｋｉｍｍ整する）を破壊した細胞の懸濁１４ｃ２℃もと
でおだやかＫかきまぜながら加える。約ｐＨ７，６の懸
濁液は、３時間−２℃に冷却し、遠心する。上澄み液（
１７，２７）Ｋ硫酸アンモニウム（３０２８Ｊ’）加え
る。かすかに混濁した混合物を、６℃で一時間放置した
後、遠心する・上澄み液を硫酸アンモニウム（４３２４
１９＞加え、−夜装置した後、３０００ｒｐｍで遠心す
る・湿りた遠心化物（約１２２４ｊ　）は、緩衝液Ｂ（
２５ｍＭ）すｘ−ｉｎ酸に１０　μＭ　ＰＭＳｉＦを加
えて塩酸でｐＨ８，５Ｋｌｌ！Ｉする）に望ましいペプ
チドを含む液（２８００Ｍ）を得るために溶解する。
Ｉリペゾチド溶液７００ｍを、室温で緩衝液Ｂ（７））
を用いて、アｉコンＤＣ−２ホローフィーパーシステム
（紐ム５ａｙｓ　ＤＣ−２ｅ　ＨｏｌｌｏｗＦゑｂｒｖ
　８ｙａｔ＊ｍ）　Ｋよって、ＨＩＰＩＯホロー・フィ
ルター・カートリ、ジを通して分離ろ過する。フィルタ
ーカートリッジ緩衝液Ｂで洗浄し、分離ろ過した液と洗
浄液を合わせて（１４４０ｉＪ）、前もって緩衝液Ｂで
平衡化した４５０１のべ、ト容積のＤＥＡＮカラム（ト
リサクリル０Ｍ　ＤＥＡＥ　、　ＬＫＢ２２０５−３０
０）に、流速２００ｄ／）ｔで、通過させる＠２８０ｎ
ｍでＵＶ吸収をも２第１ポリペプチド画分は捨てる。カ
ラムを更に緩衝液Ｂで、少なくても５倍のベット容量が
、２８０ゴｍでベースライン吸収をもつまで洗浄する吸
着されたポリペプチドを、緩衝液Ｃ（０，２Ｍ塩化ナト
リウム、２５城トリス・塩酸、ｐＨ８，５）で溶出する
。カラムクロマトグラフィーは、４℃で行なう、溶出液
はアームストロング（２９）の方法によって測定し、Ｉ
ＦＮ活性１・４・１０　　ＩＵ／９ポリペグチドを示め
す。
溶出液は、２Ｍ！ｗ！ＩでＰＨ７，４に１１１ＥＬ、液
（１００ゴ）は、モノクロナル抗体カラムに使用するま
で、−２０℃もとで、凍結しておく。
ｂ）モノクロナル抗体カラムでのヒトＬ７ＩＦＮ−α−
３の精製 モノクロナル抗体カラムＩＫ２−２０（ぺ、ド容槓０．
８１下記参照）をＰＨ８（リン酸−緩衝化塩化ナトリウ
ム：０．１３７Ｍ塩ｆヒナトリクム、０．００２７Ｍ塩
化カリウム、０．００７７Ｍリン酸１水素ナトリウム、
１２結晶水、０．００１５Ｍリン酸２水素カリウム、ｐ
Ｈ７，４）で平衡化し、前記ポリペプチド溶液（１０１
７）をこのカラムに、室温のもとで、流速１０岐りで適
用する。吸収されないポリペプチドを含む最初の画分お
よびＰＨ８洗浄液（３′１１ｔ）を捨てる。更に非特異
性結合ポリペプチドを、付加的０．５Ｍ塩化ナトリウム
および０．２１）リドン×１００を含むＰＨ８（３１１
ｔ）で溶出する。カラムをＰＨ８（３１１Ｚ）で洗浄し
、特異的に吸収したポリペプチドを、緩衝液Ｄ（０゜１
Ｍクエン酸、０．３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ２）（ａｄ
）で溶出する。どの画分と続いてのＰＢ＆−洗浄液を合
わせて、２Ｎ水酸化ナトリウムでｐｉ４６．３に１４整
し、４℃のもとで液浸用−ＣＸ？Ｍ分子分離器（イリボ
レ＠）を用いて１０倍にａ細する。濃縮液を、０．０２
５Ｍヒスチノン・塩酸ｐＨ６゜３で平衡化したセファｆ
ｙクスＧ−２５７アインカラム（２，６Ｘ　３４℃ｍ　
−２００１１４ぺ２．ト容積）に、適用する・４℃のも
とて１カラムは、流速４２１１７／ｈで、０．０２５Ｍ
ヒスチジン・塩酸ｐＨ６，３で溶出し、各々の画分（１
０，５ｍ−ｇ）で２０画分を集める。ポリペプチドを含
む画分を、２８０　ｎｍでの吸収で検査する。−分７お
よび８にアームストロング（２９）の方法によって検査
されるようにＩＦＮ活性をもつポリペプチドが含まれる
＊　ＬｙＩＦＮ−α−３を含む活性画分を、更に使用す
るまで一２０℃で保存し、または水浴におく。
画分のＩＦＮ活性は、１・８・１０８ＩＵ／１１１９　
　ポリペプチド（２９）である。
前記画分を凍結乾燥することによって、１ν溶液からポ
リペプチド（２０−４０μｌ）が得られる。
得られたＩＪＩＦＮ−α−３のＳＤＳ　＆リアクリルア
ミドダル電気泳動［（４９）参照〕の結果は、分子ＪＬ
約１８にダルトンであることを示めす。
ポリアクリルアミドグル（１００μＭ）上でウルトラ薄
層等電性フォーカスで−４，５−６，５の範囲内で、Ｂ
、Ｊ、ラド−）（５０）Ｋ方法に基づいて行ない、純粋
な活性ヒトＬ７　Ｉ　ＦＮ−α−３の５．３−５．４−
ユニットの轡電点を示めす。
＠）モノクロナル抗体カラムＩＫ２−２０の製造囚　マ
ウスの免疫法 Ｂａｌｂ１ｇマウス（８週目、り、セルン動物農場、ス
イス）Ｋ、ヒト白血球ｌ１ＦＮの（純度１チ）の３×１
０５ユニツト〔完全な７０イドの補助剤（デフマ）ＶＣ
おいて、４フート４ｙ　）　（ｆｏｏｔ　ｐａｄｓ　）
Ｋ配分して〕を注入する。３０日目に、不完全なフロイ
ド補助剤におけるＩＭの同量を、同様の方法で注入する
４１第三の注入は、８５日目に行なわれ、塩化ナトリウ
ムにおけるヒト白血球工ｖＮの４Ｘ　１０’ユニツト管
腹腔内に注入する。四日後に、牌臓は融合の丸めにとり
出される拳 （Ｂ）ハイブリドマｘ　（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）の製
造Ｘ６３−Ａｇ３−６５３ｔ工ロ！系列（５２）を用い
てのすべての融合実験は、ケー２−とミルスｆｉ４：／
Ｃ５３）の方法に基づいて、５０Ｓ４リエテレングリコ
ール（ＰＥＧ１５００．セルパ）の１鰹に１０’牌１Ｉ
ｌｆｌＮ＆と１０’　ｉ　工ｏ　ｗ　（ｍｙ＠ｌｏｍａ
）細胞を混合すると表によって（５４）、本質的に行な
ゎれる。洗浄後、細胞を、標準ドルベコ（Ｄｕｌｂ＠ｃ
ｃｏ’ｓ）最小エキス借地（キプコｔＱｌｂｃｏ　）　
４８１ＬｊＫ再懸濁する。融合につき１５−胎子牛血清
および正常マウス腹腔浸出細胞（３Ｘ　１０’　）を供
給細胞として加える。細胞を４８Ｘ１１１Ｊコスタ−１
，ウィル（ｃｏａｔａｒ　ｖ＠ｉ１ｍ）に分配する。培
養に週に二回、標準選択培地（５３）′Ｉｋ３−６週間
供給する。雑種が増殖した後、凍結し、上澄み液は下記
載のよりに抗−ＩＦＮ活性の検査をする。雑種細胞（ｈ
ｙｂｒｉｄｏｍａ　ｓ＠ｌ１ｍ）のクローニングは、ミ
クロ−滴定（ｍｉｅｒｏｔ１ｔ＠ｒ）グレートにおける
希釈の限界によってなされる。
伸）抗体分析（検査） ＩＦＮ−α（最終１０−２０ユニｙ　）　ＩＮＦＱ／ｉ
ｕ）の上澄み（５μｔ）の抗−ＩＦＮ活性のテストのた
めに、室温のもとで、培養上澄み（５０μｔつと培養し
、３０−６０分後ＩＦＮの残余活性を、標準ＩＦＮ分析
法によって、テストする。この方法は、好都合な抗体の
ために、失敗したか、もしくはハイツリド又上澄みの分
析のために非再現性の結果を与えるかにとって具合が良
い・次の組み合わせ免疫−沈降（沈澱）−生物検査は、
この目的のたメニ開発し九＊　粗ＩＦＮ　−（ｔ　（１
０’　Ｕ／’ｌｊ　）　５０　μＬを同量の培養上澄み
と混合（マイクロチ、−プ３８１０中で、工、ペンドル
フ）シ、混合物は、２−４時間３７℃で培養する。次い
で、先に滴定したラビット抗−マウス■１抗体Ｃノルｒ
イク）５０μｔを加え、混合物を、はじめ３７℃で１時
間、次いで４℃のもとて１６時間免疫コンプレックスが
生成するまで培養する。テ、−ノは５分間冷冨内で１２
．０００ｒｐｎで遠心する。上澄みをとり、沈澱は、一
度緩衝化塩化ナトリウムＰＨ７，２（１ｉ１ｔ）、で洗
浄する・洗浄後、沈澱を塩化す）　ＩＪウム液−２，２
（２００μｊ）Ｋ再溶解する・ＩＦＮ活性はアームスト
ロング（２９）の方法に基づいて測定する・゛（ロ）腹
水液から分離した抗−Ｉｉ’Ｎ抗体の精製＠Ｂａ１ｂｌ
ｅマウスに１前もりて腹腔内に！リスタン０．４ｍ（カ
ールルス）を注入する。−週間後、マウスに腹腔内にハ
イブリドマ細胞を注入する・腹水液をくり返し、各々の
マウスから採液する・液は、プールし、−８０℃で凍結
する。上部の脂肪は吸い上げて捨てて、残破片物（ｆプ
リス）のない上澄みは、とっておく。必要な場合、遠心
をくし返す、粗イムノグロブリン画分は、室温のもとて
腹水液を１８１硫酸ナトリクム沈澱させることによって
得られる０次いで、この画分をセファアクリルＧ２００
（ファーｉシア）にかけファーマシアによる指示どおｊ
）ＫＯ，ＩＭ）リス・塩酸緩衝液ｐＨ８，２を用いて溶
出する。活性画分をプールし、アイコンＸＭ５０フィル
ター（アイコン）で濃縮する。タンツクは、２８０ｎｍ
で１３のキ、べ、トを使用して、タン・ダク１！！１ｇ
で１．２吸収になるように調整して、０ＤＺ８０で測定
する・（ト）免疫吸収カラムＩＫ２−２０ 安定させたアフイーグル（Ａｆｆｉ　−Ｇ＠１）　１０
（バイオ−ラド）ＩＪＩＥｊＩＣ，パイオーラドの指示
に従って、モノクロナル抗−ＩＦＮ抗体のイムノグロブ
リン（１５１Ｉｇ　）と力、ブリングさせる＝７フイー
グル１００は、ガラスで接続した漏斗上で冷蒸留水、次
いで０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム液ｐＨｓ、　０（カッ
プリング緩衝液）で洗浄する。力、！ブリング衝液にお
けるｓｏ＊ｙルを、グラスチアクチ、−ｆに移し、同量
の精製した抗体溶液と混合し、４時間室温で回転させる
。力、！クリング後グルをカップリング緩衝液で洗浄し
、未反応位置をし中断するために、ｒルνにり龜ＩＭエ
タノールアミンー塙酸（ｐ）１８．０　）　０．１Ｊ−
１Ｉ［ＭＯｌ：で反応させる。グルは、１０ｍＭ三窒化
ナトリウムの存在下で、リン酸−緩衝化塩化ナトリウム
で洗浄し１４℃で保つ、得られるグル０．８ｄは、ヒト
Ｌｙ■Ｎ（上記参照）の製造のために使用するモノクロ
ナル抗体カラム（ＩＭ２−２０）製造のために用いる。
１０、医薬用製造（非経口的投与） リンｔ４芽球インターフェロン（２ダ）、たとえば、ｌ
・８・１０　　ユニｙト／ｍの特異活性をもつクローン
Ｅ、　ｇｏｌｆ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ＰＢＲ（ＡＰ）
／ＬｙＩＦ’Ｎ−α−３（例９参照）から分離したＬ７
Ｉｉ’Ｎ−α−３ｔ５Ｎヒト血清アルｆミン（３０１１
７）に溶解すル、得うレる溶液ｔａ直学で用いられるフ
ィルターを通過させ、ろ液を無菌条件下に、精製したり
：ｙｚ４芽球インターフェロン各々３．６Ｘ１０：３−
ニットを含む１００バイヤルに分ける。このノ４イヤル
は非経口投与に適しておシ、好ましくは冷暗所（例−２
０℃）Ｋ保存する。
同様の操作で、７．２Ｘ１０’もしくはｌ、Ｑｘｉｏ’
ユニ、トを含むバイヤルを、各々上記のリン／９芽球イ
ンターフェロン４もしくは６〜を用いて製造することも
可能である。
準備された微生物の保管 ここで記載された方法によって製造された組み換えＤＮ
Ａ分子および微生物社、培養によって例示され、農学研
究培養コレクシ、ン（ＮＲＲＬ　）（１９８１年９月１
４日）の培養コレクシ、ンにおいて保管されており、次
の継承番号が割り尚てられている。
以下４白 Ｅ、　ｃｏｉｌ　ＨＢ　１０１　Ｃ０−ｐＢＲ３２２／
）ＩＬｙｄＦＮ−β１　：ＮＲＲＩ、　’Ｂ−１２５２
８ Ｅ、　　Ｃｏ１１　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２２
／ＭＬｙａＩＦＮ−４１：ＮＲＲＬ　Ｂ−１２５２９ Ｅ、　　ｃｏｉｌ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２２
／）（ＬｙｖＩＦＮ−１ｂ：ＮＲＲＬ　Ｂ−１２５３０ Ｅ、　　ｃｏｉｌ　ＨＢ　１０１　Ｃ０−ｐＢＲ３２２
／ＨＬｙｃＩＦＮ−５１：ＮＲＲＬ　Ｂ−１２５３１ Ｅ、　＠Ｏ１ｌ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／
１（ＬｙｅＩＦＮ−８；　：ＮＲＲＬ　Ｂ−１２５３２ 以１儀自 参考文献 １．　Ｗ、Ｅ、スチ工ワート、■、インターフ、ロンシ
ステム。
スゲリンガ−出版社、ピエンナ（１９７９）２、インタ
ーフェロンノメンクラチャー＊Ｎａｔｕｒ・２８６巻、
１１０ページ（１９８０） ３、Ｃ，ヴエイスマン”　ＤＮＡ配列１組み換えＤＮＡ
分子およびヒトインターフェロン一様Ｉリペデチド生成
のための方法”ヨークツノ４特許出願番号３２１３４　
（バイオケンＮ、Ｖ、） ４．１．Ａ、ハヘＪｋＣ：、　、　＠ヒトリンフ９１１
（ナマルバインターフェロンの特性＝　＊　Ｊ、　（）
＠ｎ、　Ｖｌｒｏｌ、　３８巻、５１−５９ページ（１
９７７） ５、Ａ、Ｄ、サーガルラ、＠センダイウィルスー誘発ヒ
トリンノ”Ｍ（ナマルバ）細胞オよびニエーキャスル病
つィルスー銹発ムリ／＃！維芽■細胞の異質性”。
Ｎｕ＠１．Ａｅｌｄｓ　Ｒａｇ、９巻、１４９−１６０
ペーノ（１９８１） ６、Ｍ、ルペンスタインラ、＠ヒト白血球インターフェ
ロン生成、同質性への精製および第一の特徴”。
Ｐｒｅｓｓ　ＮａｔＬ、Ａａａｄ、　８ａｉ−Ｕ８Ａ　
７６巻、６４゜−６４４ページ（１９７９） ７、　　ＷＪ・メチ１ワード、■ら１ヒト日直球インタ
ーフェロンの生成および特性についてのグリコジル化阻
害剤の影響”、　Ｖｔｒｏｌｏｇｙ　９７巻、４７３−
４７６（−）（１９７９） ８、　　Ｋ、Ｃ，ゾーンら、′ヒトリンパ芽球細胞イン
ターフェロンの主な成分のアミノ末端排列”、Ｓａｉ・
ｍｅ・２０７巻、５２７−５２８ページ（１９８０）９
、　８．Ｎ、コーエンおよびＨ，Ｗ、＆イヤー１生物学
的に機能のある分子キメラス（＠ｈｉｍ＠ｒａｓ）生成
のための方法”米国特許番号４，２３７，２２４（レラ
ンドスタンフォードＪｒ、大学） ｌＯ０８・ナガメら（１，＠ヒト白血球インター７８０
／活性をもつポリペグチドのＥ、　ｃｏｌｔにおける合
成１゜Ｎａｔｕｒｅ　２８４巻、３１６−３２０ページ
（１９８０）１１、　Ｎ、マンタイら、＠クローン化し
たヒト白血球インターフェロンとＤＮＡのヌクレオチド
配列”、　Ｇ＠１１・１０巻、１−１０ページ（１９８
０） １２、　Ｍ、ストロイリイら、＠少なくても三つのヒト
α型インターフェロン：α２の構造’＊８ａｉ＊ｎｅ＊
　２０９巻Ｉ２１３４３−１３４７ページＣ１９８０）
１３゜１）、ｖ、ゴエデルら、″Ｅ、ｃｏｌｉによって
生成されたヒト白血球インターフェロンは生物学的に活
性がある１゜Ｎａｔｕｒｅ　２８７巻、４１１−４１６
ページ（１９８０）１４、　Ｄ、Ｖ、ゴエデルら、＠８
つの明らかなりローン化したヒト白血球インターフェロ
ン＠ＤＮＡ５”Ｎａｔｕｒ＠２９０巻、２０−２６ペー
ジ（１９８１）１５、Ｊ、クローネペルグら１ｇ″ヒト
インターフェロンのアぐノ酸配列をもつ微生物学的に合
成されたポリペグチド、ＤＮＡおよび！ラスミド、この
配列のためにコード化された微生物、それはこの遺伝情
報を含むおよびその合成方法１ヨーロツ・＃特許出願番
号３４３０７（ヒエーヒストアクチェ／ｒゼルシャフト
）：１６、　Ｈ，スガノら、＠新規なりＮＡ　、　クロ
ーン化したＤＮＡ。
ＤＮＡｔ−さむ組み換え！ラスミド、組み換え！ラスミ
ドを含む微生物およびそれらの生成のための過程”ヨー
ロッパ特許徹顯番号２８０３．３（日本癌研究財団） １７、　Ｔ、タニグチら、１ヒト線維芽＃胞インターフ
エロンｃＤＮＡのヌクレオチド配列’Ｇｏｎｏ　１０巻
、１１−１５ペーゾ（１９８０） １８、　Ｒ，デルイ二りら、＠ヒト線維芽細胞インター
フェ關ン遺伝子の分離および構造“、Ｎａｔｕｒ・２８
５巻。
５４２−５４７ページ（１９８０） １９、　Ｄ、Ｖ、　ｆニブルらｒ　＠ｇ、ｅｏ亀１によ
るヒト線維芽細胞インターフェｉンの合成”＊Ｎｕ＠１
．Ａｃ１ｄａ　Ｒ・畠・８巻、４０５７−４０７５ペー
ジ（１９８０）２０、　Ｍ、レベルら、′遺伝子工学に
よるインターフェロンの生成”英国％杵出願番号２，０
６３，８８２（イエダ研究および開発会社） ２１、＠ヒトインターフ、ロンに類似のタンノヤク質を
発現するための遺伝子、ＩＩ導され九グラスＺド組み換
えおよび修正されたバクテリア細胞１ベルギ一特許番号
８８７．３９７（シイーレ＆Ｃｏ、） ２２、　Ｊ、グローネペルグラ、＠ヒトインターフェロ
ンのアミノ酸配列ｔもつ微生物学的に合成され九Ｉリペ
グチド、ＤＮＡおよび！ラスミド１この配列のためにコ
ード化した微生物、それはこの遺伝情報を含みおよびそ
。
れらの合成方法”ヨーロッ７４％許出願番号３４３０６
（ヒエ−ヒスドアクチエングー１Ｉ＃ルシヤフト）２３
、Ｔ、　　タニグチら、＠ヒト白血球および縁轍芽＃１
胞インターフェロンは構造的に関係がある”Ｎａｔｕｒ
ｖ　２８５巻、５４７−５４９ペーゾ（１９８０）２４
、　Ｍ、Ｄ、ノ曹ンストンら、＠ヒドリン・Ｉ芽球細胞
によるインターフェロンの生成に影響する要因”　、　
Ａｄマ。
Ｅｘｐ、　Ｍ＠ｄ、　Ｂｌｏｌ−１１０巻、６１−７４
ページ（１９７８） ６、Ｇ、アレンら、″″ヒトリンノｆ芽球白血球−型）
インターフェロンの庭めの構造上のｔ伝干系列″Ｎａｔ
ｕｒｅ　　２ｇ７４，４０８−４１１　へ・−：／　（
１’ｔＲｏ）２６、　Ｈ，ストランダ−ら、＠とトリン
ノ９芽球インターフェロンの生成”、１巻、１１６−１
１７ページ（１９７５）２７、　Ｍ、Ｄ、ゾ曹ンストン
１インターフェロン生成の過程におけるま九は過程に関
連する改良”、ヨーロッパ斐出願番号５２０（ウェルカ
ム財団） ２８、　Ｐ、スゲエトリイら、′″リンノ中芽球細胞か
あヒトイン　　−ターフェロンの合成に関する改頁法１
．ドイツ公開公開公報番号２，９４６，２７５（）マエ
）四、アームストロング、′ラビットインターフェロン
のためのセミ−ミクロ色素−結合分析”＊　Ａｐｐｌ、
Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ。
２１巻、７２３−７２５ページ（１９７１，）（資）、
Ａ、コルマンラ、＠ゼノグスラエピスの卵母細胞カラ蛋
白質の輸送”、０＠１１１７巻、５１７−５２６ペーＸ
）（１９７９） ３ｉ、　ＷＪ、ステユワー）１ら、１実験的にラピイウ
ィルスで感染したハムスターにおけるインターフェロン
生成”Ｐｒｏｃ、　８ｏｃ、　ｌｉｐ、　Ｂｌｏｌ、　
Ｍ＠ｄ、１２３巻、６５０−６５３−２−ゾ（１９６６
） ３２、　Ａ、　Ｃ，ピーコ、りら、″ｍｍポリアクリル
アドｒグル気泳動による多様なり♂核酸棟の解析”Ｊｉ
ｏｅｈ＊ｍ１ａｔｒｙ見％、１８１８−１８２７−（−
）（１９６７）３３、　Ｐ、Ｂ、　８＊ｈｇａｌ　＠ｔ
　ａｌ、＋″″ＲＮＡ種におけるポリ（■）、ポ喀）−
ｎ発ヒト線維芽細胞インター７！ロンの異質性”。
Ｎａｔｕｒ＠１４柑Ｅ、　９５−９７ページ（１９８０
）３４、　Ｊ、Ｇ、ストクリッフＪｃ″″ＤＮム配列か
ら誘導されたｐＢＲ３２２制限地図：　４３６１ヌクレ
オチド対−長までの正確なりＮＡサイズマーカー’Ｎｕ
ｔｌｅ＝＾、ｅｉｄｓ　Ｒａｍ、　５巻、　　２７２１
−２７２８ページ（１９７８） ３５、　Ｍ、マンデルら、＠カルシウムー依存性パクリ
オファーゾＤＮＡ感染’　Ｊ、　ｉ＆＋１．　Ｂｉｏｌ
、　５３巻、　１５ｌ５９−１６Ｓノ（ｉ９７０）３６
、　Ｍ、グルンスタインおよヒｏ、ｓ、ｓックネス、′
コロニー交雑二特異性遺伝子を含むクローン化したＤＮ
Ａの分離方法’Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ、Ｓｅ
１．７詩、　３９６１−３９６５（−ゾ（１９７９） ３７、　Ｋ、イタクラら、＠化学的なりＮＡ合成および
組み換えｌム研究’、　Ｓａｌ＠ｎａ＠都狙査、　１４
０１−１４０５ページ（１９８０）３８、　Ｋ、イタク
ラら、′ペンタデカチミノリン酸合成のための改喪トリ
エステルアグローデ’Ｊ、Ａｎ、　Ｓａｃ、　９７巻、
７３２７−７３３２ぼ−ノ（１９７５） ３９、　Ｊ、Ｆ、Ｍ、デローイゾら、′″ホスホトリエ
ステル中間体ヲ経ての相補性ＮＮＡｌ析片の合成’ｒ　
Ｒ＠ｃ１　、　Ｔｒａｖ、　Ｃｈｌｍ、　Ｐａｙｓ−Ｂ
ａｓ　９８巻、５３７−５４８−’？−ノ（１９７９）
４０、　Ｆ、サンが−ら、′″鎖−末端阻害体をもつＤ
ＮＡ配列”。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　８ｃｉ、　ＵＳＡ
７４巻、５４６３−５４６７本ヅ（１９ｍ４１、　Ａ、
Ｍ、マ、クサムおよびＷ、ギルバート′″ＤＮＡ配列の
ための新規な方法＋Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ
、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７４巻、５６０−５６４ページ
（１９７７）；な臼ブにｈｔｈ、　ｈｘｙｍ、　６５巻
、４９９−５５９イーノ（１９８０） ４２、　Ｊ、Ｂ、ｆｓ−）”／　、　Ｊ、Ｆｋｒｂ　ｒ
ｙｏ　１．ｌ＋ｃｐ、Ｍｏｒ　ｐｈ、鴇４０１−４１４
”−ジ（１９６１４３、）’−Ｘ、Ｊ、Ｅｍｒｙｏ１．
ｋｐ、Ｍｎｒｐｂ、７巻、２１０−２２２−（−／（１
９５９）祠、Ａ６　工７ストラテアデスら、実物大およ
びグロビンおよびコリオンｍｌ［Ａの別個の部分的な逆
転写、Ｃｌ１ｌ±巻、３６７−３７８ページ（１９７５
）４５、Ｔ、マニアテスら、＠インビトロで合成され九
β−グロビン遺伝子の拡張および特性化”＃Ｃ＠１１Ｃ
ｌ。
１６３−１８２ペー−／（１９７６） ４６、Ｊ、Ｈ，Ｊ、ホエイゾ！−カスら、′トリノ々ノ
ゾースゾルセイの異なる表面グケコプロテインの九めの
ｍＲＮムに相補的ＤＮＡｔ−含む！ラスミドの分離’、
Ｇ＠ｎ＊８巻、３９１−４１７−（−ジ（１９８０）４
７、Ｗ−ミ、−ラーら、　＠ＤＮＡにおける位置−配向
性の突然変異：アンノ酸１２１−１２３に対応する位置
でクローン化βグロビン相補性）法における変異特性の
発生”、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｌｅｌ、　１２４巻、３４３
−３５８ページ（１９７８） ｕ、ｚ、ｙアイセンパ、ハら、＠ヒト繊維芽細胞におけ
る２つりインター７．ａン：インビトロにおける翻訳お
よびＥｅｏｌｉ　クローニング研究’　、Ｐｒｏｅ、Ｎ
ａｔｌ。
ムｃａｄ、８ｃｉ、Ｕ１１Ａ７７巻、７１５２−７１５
１１ページ（１９８Ｇ）。
４９、Ｕ、に、Ｌエンリ、Ｎａｔｕｒ＠２２７巻、６８
０−６８５ページ（１９７０）。
父、Ｂ、Ｊ、ラドラ、′電気泳動”、Ｐ、７９−９４．
ワルターデグルイターベルリン一二、−！！−り１９８
０　。
５１、　Ｔ、　ステエヒリンら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃ
ｋ＠ｍ、２５６巻。
９７５０−９７５４ページ（１９８１）。
５２、Ｊ、Ｆ、ケルネイらｍ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
、１２３巻、　１５４８ページ（１９７９）− 田、Ｇ、ケエトおよびＣ，ミルスタイン、Ｎａｔｕ、ｒ
＠呈ｌｉ巻、４５９ページ（１９７５）。
８、Ｇ、ガルフレら、Ｎａｔｕｒ＊２６６巻、５５０ペ
ーノ（１９７７）。
以下余白 ４−、　　［！１６ｏ、７）駒ＪＰ−与説明第１凹１ゴ
　＋Ｘルワ　ｄｇＣＤ員八め合へゾロ乞スおよび°維み
談えＩ）Ｎ、Ａ分子Φ講威Ｏ説明日Ｚδす、 第２ＥＪば　び□およびβ　ｌ１ｌｌ　　實ＲＮＡへの
粕袖的’Ｊｒ）ＨＡプライマー（１Ｂ制Ｏの合成７°ロ
ｔス６Ｑ能明Ｉ２１Ｉ７−あり、 第３ＥＩＩｉｌ−１ｕＩＦＮ−βオヨびＨｕＩＦＮ−区
特選性梗牛の在入７°ロｔスちよ℃ｒヒトリンノ（１珠
ＬＦＮ−含有２０−７の同定のんぬのだ用の説明図７あ
り、８４図１１組み嵌えプラスミド゛し？４Ａ　　０斤
−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩｌ−ＦｔＡ　−Ｉｂ　〕ｃ
−１）ＨＡｊ’ｆ入Ａヌクレオ＋ド配り扮説明日７・あ
り、 第５図１？　ｉＨみ撞えグラスミドレＮハ　ＣＣ（−ｐ
ＢＲ３２２／　ＨＬ　ｙｅ　Ｉ　Ｆ　Ｎ−βＩＣ−レ凶
ハ耕入のヌ２しオ千ド配列の説明図２あり、 ８ｔ４１　Ｋみ掬え７ラスミＶ：しＮＡ　　ｃｅｒ−Ｐ
旺３：２：２／　ＨＬ、、ＱＩ　’Ｆ　Ｎ−４１ｔｙｒ
　ｃ−Ｕ）ｔ４ハ神入のスクン皮ナト°配？１の説明２
あり、 拓Ｙ図１１　　融み験えプラスミドレＮ　Ａ　　Ｃ＆−
Ｆ　ＳＲ’３２２／）−ＩＬｙｃＩＦｔ４−＆’１ａｃ
−Ｃ）ＮＡ才牟入のヌクレオ千ド配ｊ１１の説５明柵２
−あり、 ８ｅＢ＋−＋　　／ｍみ挨え１ラスミ￥ｐ目Ａ　　ＣＣ
ｒ−ＦＦ３Ｆ？：３２２／　ＨＬｙｃ　ＩＦＮ−５ｚ　
ｊ＋’入ｎヌクレオ子ド酌ごＦＪの琥βｎ司Ｚ妬り、 ＄　’ｔ　ｅｌ＋２　　ＣＣｒ　−ＰＢＲ（Ａ　Ｐ）／
Ｌｙ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　　ｇ−１ｋｈ模えｒ＞）４Ａひ項Ａ
′凸説明図２あり、ｊＡｌｏａｎ　　　Ｃｅｒ−，１３
Ｆ？、（ＡＰ）ＬＸ工丁　１−ｓ、−１の配列ρ説明図
２あり、 拓１１ｍ１訃　缶み求えＣＩＩＩＡアラスミト°Ｃθ−
ヒＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩ王ドー凶−３３築久の酋−開目
Ｚ−あり第１２ｆ３１ｘ　　ＣＣｒ−ＰＦ３Ｒ（ＡＰ）
ｌＬｙＸＦ邑−久−３ひに２１６跣ｍ聞３・あり、 第１３　Ｈ＋−ｓ　　ご６　ｐＦ３Ｒ（ＡＶ）／Ｌｙ工
１：：１−ｃ１．−２の西乙列ひｔえ明日２ある・ 第２日子　Ｍｌよ七ノメト朴ト’）テｗ％？−Ａろ、　
　　以下余白芭　４−８７・イ　田々柩１　。
・纏ＶＬ　　　　ヌクレオチド交挾　　　　′−−−−
−　　　　　先行白ｐ；−分野７・・示めマ名でいｆＪ
　６　＋配列マ　　　　　　先行′：１に勺“野７・の
ボり了テ゛二シイ乙めａｔ↓　　　　　ヌクレオチドの
唸去 ↑　　　　ヌルオ斗ド■神入 Ｃ１２Ｐ　　１９／３４ Ｃ１２Ｒ１／１９ 優先権主張　＠１９８２年３月２６日Φイギリス（ＧＢ
）■８２０８９８８ ■１９８２年９月１日■イギリス （ＧＢ）■８２２４８７１ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 °昭和５７年　特許顧　　第１７４４２６号３、補正を
する者 事件との関係　　特許出願人 名称　　チバーガイギー　アクチ、ンゲゼルシャフト４
、代理人 ＆　補正の対象 明細書の「図面の簡単な説明」の欄 Ｚ　補正の内容 明細書の「図面の簡単な説明」の欄の浄書（内容に変更
なし） ８、添付書類の目録 浄書（至）面の簡単な説明）　　　　　　　１通第１図
は　＋マルヮ　ｄａ　ｃＤＮＡの合成プロセスおよび組
み換えＤＮＡ分子の構成の説明図であり・ ８１１１２図はα１およびβ　ＩＦＮ　　ｍＲＮＡへの
相補的なりＮＡプライマー（１３ｍａｒ）　　の合成プ
ロセスの説明図であり、 第３図ｔ！ＨｕＩＦＮ−βおよびＨｕＩＦＮ−α特異性
検体の合成プロセスおよびヒ）　ＩＪンパｌＦ球ＩＦＮ
−含有クローンの同定のための使用の説明図であり、萬
４図は組み換えプラスミドＤＮＡ　　ＣＧ−ｐＢＲ３２
２／ＨＬｙｃＩＦＮ−Ｉｂのｃ−ＤＮＡ挿入のヌクレオ
チド配列の説明図であり、 ｇｓ図は組み換えプラスミドＤＮＡ　　ＣＧ−ｐＢＲ３
２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β１ｃｍＤＮＡ挿入のヌクレオ
チド配列の説明図であり、 纂６図は、組み換えプラスミドＤＮＡ　ＣＧ−ｐＢＲ３
２２／ＨＬ　ｙｃ　Ｉ　ＦＮ　−４１のｅ　−Ｄ　Ｎ　
Ａ挿入のヌクレオチド配列の説明であシ、 第７図は　組み換えプラスミドＤＮＡ　ＣＧ−ｐＢＲ３
２２／ＨＬ　）’ｃ　Ｉ　ＦＮ−ｇｌのｃ−ＤＮＡ挿入
のヌクレオチド配列の説明図であり、 第８図は　組み換えプラスミドＤＮＡ　ＣＧ−ｐＢＲ３
２２／ＨＬ　’Ｉｃ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−５１挿入のヌクレ
オド配列の説明図でめり、 第９図は　ＣＧ−ｐＢＲｔＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−１
組み換えＤＮＡの構成の説明図であり、ｇｌｏ図に　Ｃ
Ｇ−ｐＢＲ（ＡＰ）ＬｙＩＦＮ−α−１の配列の説明図
であり、 １１！１１ｒｊｔＪｄ　　組み換、ｊＤＮＡ７ラスミド
ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３の構成の説
明図であり、 謳１２図１ｒｉ　　ＣＧ−、ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦ
Ｎ−α−３の配列の説明図であり、 ｌ１１３図は　ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／Ｌ７ＩＦＮ−α
−２の配列の説明図である。− １［２図中　Ｍはモノメトキシトリチル基である０ｓｘ
−ｔ’　：ミ自 手続補正書（自発） 昭和別年Ｖイ０鷺日 一；、；゛ 特許庁長官　若杉　和夫　殿 １、事件の表示 昭和５７年　特許顧　　第１７４４２６号プチドおよび
それらの製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　　チバーガイギー　アクチェンゲゼルシャフト４
、代理人 （外３　名） ５、補正の対象 （１）　　明細書の「発明の詳細な説明」の欄（２）図
面第９図 ６　補正の内容 （１）■　明細書第３２頁第２行 ［Ｗナワルワ（Ｎａｍａｌｗａ　）　’細胞」を「１ナ
マルワ（Ｎａｍａｌｗａ　）″細胞」　に補正する。
（１）■　明細書第６８頁第４行 「・・・・・・分解し」を 「・・・・・・部分的に分解し」に補正する。
（１）■　明細書第９４頁第１行、１４行、１６行、１
７行、および１９行、第９５頁第４行および第８行、第
９６ｊＸ１２行および１５行および第９７頁第１４行 「発現対照配列」を 「発現コントロール配列」に補正する。
（１）■・明細書第１４０頁第１６行および第１４１頁
第６行 「５′−終未満」を 「５′−終末端」に補正する。
（１）■　明細書第１４０頁第５行から第６行「・・・
・・・部分的配列」を 「・・・・・・配列」に補正する。
（１）■　明細書第１８０頁２行 「ナマルワｄ＊ｏＤＮＡＪを 「ナマルワ（１１５ＱＤＮＡＪに補正する。
（２）第９図を添付第９図のとおり補正する。
ｌ　添付書類１銖

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、　インターフェロン様ポリペプチドのためにコード
    化される、ヒドリン・母芽球細胞から誘導したＤＮＡ配
    列または該配列の断片、変種普たは突然変異体を含むＩ
    ）ＮＡもしくは該ＤＮＡへ交雑化（雑種化）するＤＮＡ
    。 ２、インターフェロン様ポリペプチドのためにコード化
    されるヒトリンパ芽球細胞から誘導された挿入）＾、該
    挿入ＤＮＡの断片、変Ｓま九は突然変異体もしくは該挿
    入ＩＩＮＡ　Ｋ交雑化（雑種化）する）祷を含む組み換
    えα値である特許請求の範囲第１項に記載される囲Ａ。 ３、ナマルワ細胞（Ｎａｍａｌｖｉ　）から誘導された
    挿入１１１（Ａを含む組み換えＤＮＡである特許請求の
    範囲第２項に記載されるＤＮＡ。 ４、　　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／　ＨＬｙｃｌＦＮ　−１
    ’ｂの挿入ＤＮＡの配列： ＡＴＡＧＡＴＣＴＡＡＴＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＴＧＡ
    ＡＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴ’ｌ’ＡＴＴＡＧＡＴＴ
    ＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴＧＴＣＣＡＴＧＴＡＡＴＡＴ
    ’ｌ’ＡＴＧＴＧＴＡＣＴＴＴＴＣＧ−ｐＢＲ３２２／
    　ＨＬｙｅＩＦＮ　−４＋　’の挿入Ｄ−ＮＡの配夕Ｉ
    Ｉ：ＴＣＴＴＴＧＴＡＴ’ｒＴＧＧＴＡＣＡＴ’ｒＴＡ
    ＴＴＴＴＧＴＧＴ’Ｉ’ＧＴｒＣＡＴＴＧＡＡＣＴＴＴ
    ＴＧＣＴＡＴＧＧＡＡＣＴＴＩ’ｒＧＴＡＣＴＴＧＴＴ
    ＴＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＣＧ−ｐＢＲ３
    ２２／ＨＬｙｃ　ＩＦＮ−５１の挿入ＤＮＡの配列：Ａ
    ＴＧＡＧＡＣＣＴＧＧＴＡＣＡＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧ
    ＡＴＴＣＴＴＡＴＡＧＡＣＴＡＡＴＡＣＡＧＣＡＧＣＴ
    ＣＡＣＡＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＴＴＧＴＧＣＴＣＴＴＴ
    ＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃ■
    ＦＮ−８’１の挿入ＤＮＡの配列：ＧＧＡＧＧＡＧ　Ａ
    ＧＧＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＣＴＣＣＣＣＴＧＡＴＧｋｐ
    、ＴＧＣＧＧＡＣＴＣＣＡＴＣＴＴＧＧＣＴＧＴＧＡＡ
    ＧＡＡＡＴＡＣＴＴＣＣＧＡＡＧＡＡＴＣＡＣＴＣＴＣ
    ＴＡＴＣＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β１の
    挿入ＤＮＡの配列：ＧＧＧＡＧＧＡＴＴＣＴＧＣＡＴＴ
    ＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＴＣＡ
    ＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＡＴＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧ
    ＧＡＡＡＴＣＣＴＡＡＧＧＡＡＣＴＴＴＴＡであるＤＮ
    Ａおよび該挿入ＤＮＡの断片、変種、および突然異変体
    または該挿入ＤＮＡのいずれかに交雑化（雑種化）する
    ＤＮＡからなるグループから選択された挿入Ｉ）ＮＡを
    含む組み換えＤＮＡである特許請求の範囲Ｍ２項に記載
    されるＤＮＡ。 ５、組み換えＤＮＡ　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／　ＨＬｙｃ
    　ＩＦＮ−１’ｂおよびその断片、変種および突然変異
    体である特許請求の範囲第２項に記載されるＤＮＡ。 ６、組み換えＤＮＡ　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／　ＨＬｙｃ
    ｌＦＮ−４１およびその断片、変種および突然変異体で
    ある特許請求の範囲第２項に記載されるＤＮＡ。 ７、組み換えＤＮＡ　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／　ＨＬｙｃ
    　ＩＦＮ−５１およびその断片、ｆ撞および突然変異体
    である特許請求の範囲第２項に記載されるα法。 ８、組み換えＤＮＡ　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／　ＨＬｙａ
    ＩＦＮ−８’１およびその断片、変種および突然変異体
    である特許請求の範囲８２項に記載されるＤＮＡ。 ９、組み換えＤＮＡ　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／　ＨＬｅｙ
    ＩＦＮ−β１およびその断片、変種および突然変異体で
    ある特許請求の範囲第２項に記載されるＩＩＡ。 １０、　　該ＤＮＡ配列がオペロン的に対照配列式に連
    結する特許請求の範囲１ｇ２項記載の組み換えＤＮＡ　
    。 １１、　　β−ラクトアメーゼ（β−１ａｃｔａｍｉｓ
    ＠）遺伝子の対照配列式を含む特許請求の範囲第１０項
    記載の組み換えＩＩＮＡ。 １２、　　ヒドリン／量芽球１’Ｆ’Ｎ活性をもつポリ
    ペプチドのためにコード化される次の配列：ＧＧＡＧＧ
    ＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡ
    ＧＧＣＴＣＡＡＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＴ
    ＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣ
    ＴＣＴＴＣＡを含む組み換えＤＮＡ　ＣＧ−ｐＢＲ（Ａ
    Ｐ　）／Ｌ７１Ｆ’Ｎ−α−１およびその断片、変種お
    よび突然変異体である特許請求の範囲第２項に記載され
    るＤＮＡ。 １３、　　ヒトリンフ４芽球ＩＦＭ活性をもつポリペプ
    チドのためにコードされる次の配列： ＡＡＣＡＴＣＡＴＧＴＧＣＡＴＣＴｒＴＡＣＡＣＴＧＴ
    ＧＧＴＴＡＧＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＣＣＴ
    ′ＴＡＴＡＴ′ＴＩＴＡｃＴｃＡＡＡＴ１′ｒｃＡＴＴ
    ＡＴＴＴＩＴ。 を含む組み換えＤＮＡ　ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ　）　Ｌ７
    ＩＦＮ−α−３ふよびその断片、変種および突然変異体
    である％豹請求の範囲第２項に記載されるＤＮＡ　。 １４、　　ヒトリンノｆ芽球ＩＦＭ活性をもつＩリペプ
    チドのためにコード化される、次の配列：ＧＧＴＡＣＡ
    ＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＴＡＴＡＧＡＣＴＡ
    ＡＴＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＣＡＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧ
    Ｔ’ｒＧＴＧＣＴＣＴＴｒＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＴＧＴ
    ＴＴＣＴＧＣを含む組み換えＤＮＡ　ＣＧ−ＰＢＲ（Ａ
    Ｐ　）　／ＬＹＩＦＮ−α−２およびその変種および突
    然変異体である特許請求の範囲第２項および第１０項の
    いずれかに記載されるＤＮＡ　＠ １５、　　特許請求の範囲第２項から第１４項までのい
    ずれかに記載の少なくとも一つの組み換えＤＮＡをもつ
    形質転換したホストおよびその突然変異体。 １６、バチルス、酵母、カビ、他の動物または植物ホス
    トまたはヒト組繊細胞から選択した特許請求の範囲第１
    ５項に記載の形質転換したホスト。 １７、特許請求の範囲第１６項記載の形質ｉ換したＥ、
    Ｃｏ１１株（大腸菌）およびその突然変異体。 １８、特ｗ！ｆ請求の範囲第１７項記載の形質転換した
    ホストＥ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３
    ２２／Ｈ１、ｙｃｌＦＮ−１’ｂ　（ＮＲＲＬ　Ｂ−１
    ２５３０）およびその突然変Ｊ！体。 １９、％許請求の範囲第１７項記載の形質転換したホス
    トＥ、　ｃａｌｆ　）ｆＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２
    ２／ＨＬｙａＩＦＮ−ｈ　（ＮＲＲＬ　Ｂ−１２５２９
    ）およびその突然変異体。 ２、特許請求の範囲第１７項記載の形質転換したホスト
    Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／
    ＨＬｙｃＩＦＮ−５１（ＮＲＲＬ　Ｂ−１２５３１）お
    よび七の突然変異体。 ２、特許請求の範囲第１７項何Ｃ載の形質転換したホス
    トＥ、　ｅｏｌｉ　ｆ（８１０１ＣＧ−ｐＢＲ３２２Δ
    （ＬｙｅＩＦＮ−８’１（ＮＲＲＬ　Ｂ−１２５３２）
    およびその突然変異体。 ２、特許請求の範囲第１７項記載の形質転換したホスト
    Ｅ、　ｅｏｌＩ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ３２２／
    ＨＬｙｃＩＦＮ−βｌ　（ＮＲＲＬ　Ｂ−１２５２８）
    およびその突然変異体。 ２、特許請求の範囲第１７項記載の形質転換したホスト
    Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ　
    ）／ＬｙＩＦＮ−α−１およびその突然変異体。 ２、特許請求の範囲第１７項記載の形質転換したホスト
    Ｅ、　ｃｏｉｌ　）ｔ８１（’）Ｉ　ＣＧ−ＰＢＲ（Ａ
    Ｐ　）／ＬｙＩＦＮ−α−３およびその突然変異体。 ２、特許請求の範囲第１７項記載の形質転換し九ホスト
    Ｅ、　ｅｏｌ　ｉ　ＨＢ　１０１　ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ
    　’）　／Ｌ７ＩＦＮ−α−２およびその突然変異体。 ２６、　　ヒトリンフ９芽球インターフェロンまタハそ
    の断片もしくは誘導体の免疫学的および生物学的活性を
    示すポリペプチド。 ２７、　　特許請求の範囲第２項から第１４項までのい
    ずれかによるＤＮＡ配列によりてコード化されることを
    特徴とする特許請求の範囲第２６項１敏のＩリペプチド
    またはその断片もしくは誘導体。 ２８　ナマルワインターフェロンまたはその断片もしく
    は誘導体の免疫学的または生物学的活性を示す特許請求
    の範囲第１６項記載の＄ｒ）−ｅｆチド。 ２９、！＃許請求の範囲第１５項から第２５項までのい
    ずれ≠）に記載の形質転換したポストまたはその断片も
    しくけｔＡ誘導体よって生成した特許請求の範囲第２６
    項から第２９項までのいずれかにａｉ’、載のポリペプ
    チド。 ３０．＃Ｆ許請求の範囲第２３項記載の形質転換したホ
    ストまたは七の断片もしくは誘導体によって生成した特
    許請求の範囲第２６項から９２９項までのいずわかに記
    載のポリペプチド。 ３１、特許請求の範囲第２４項記軟の形質転換したホス
    トまたはその断片もしくは誘導体によって生成された特
    許請求の範囲第２６項から第２９項着でのいずれかに記
    載のポリペプチド。 ３２、特許請求の範囲第２５項記載の形質転換したホス
    トまたはその断片もしく１寸誘導体によって生成された
    ％ＦＦ精求０範囲ｌ７ｆＪ２６項から第２９項までのい
    ずハかに記載のポリペプチド・。 ３３、特許請求の範囲第２６項から第２９項までのいず
    れかに記載の次の配りし ＭＥ’ｒ　ＡＬＡ　ＬｗＳＥＲＰ耶ＳＥＲＬＩＩＪ　Ｌ
    ＥＬＴ　ＭＩｉＴ　ＡＬＡ　Ｖ肚ＬＥＩＪ　ＶＡＬ　Ｌ
    ＥＩＪ　ＳＥＲＴＹＲＬＹＳ　ＳＥＲＩＬＥ　ＣＹＳ　
    ＳＥＲＩＪＵＧＬＹ　ＣＹＳ　ＡＳＰ　ＬＥＵ　ＰＲＯ
    ＧＬＮ　ＴＨＲＨＩＳ　ＳＥＲＩ、ｌ１ｌｔＴ　ＧＩ、
    ＹＡＳＮ　Ａ囮ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＬＥＵ　ＩＬＥ　Ｌｍ
    り厨ＡＩ、Ａ　Ｇ訳胡灯ＧＬＹ　ＡＲＧ　ＩＬＥ　ＳＥ
    ＲＰＲＯＰＨＥ　ＳＥＲＣＹＳ　ＬＥＩＪ　ＬＹＳ　Ａ
    ＳＰＡＲＧ　ＨＩＳ　ＡＳＰ　Ｐ北ＧＬＹ雁ＰＲＯＧＬ
    Ｎ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　Ｐ囲ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＡＳＮ　Ｇ
    ＬＮ　ＰＨＥ　ＧＬＮ　ＬＹＳルＡＧΔ肚Ａ　ＩＬＥＳ
    ＥＲＶＡＬ　ＬＥｔＴ　Ｉ（Ｉｓ　ＧＬＵ　ＭＥＴ　Ｉ
    ＬＥ　ＧＬＮ　ＧＬＮ　ＴＨＲＰＩＥＡＳＮ　ＬＥＬＪ
    　ＰＨＥ　ＳＥＲＴＨＲＬＹＳ　ＡＳＰ　１ｓＥＲＳＥ
    ＲＡＬＡ　Ｔｌ（ＲＴＲＰ　ＧＬＵ　ＧＬＮ　８ＥＦｔ
    　ＬＩＩＪ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＬＹＳ　Ｐ北５ＥＦｔπ
    迅ＧＬＵ　ＬＦ５ＪＡＳＮ　ＧＬＮ　ＧΔＬｌｉｌｔＴ
    　ＡＳＮ超ＰＬ囮ＧＬＵルＡＣＹＳ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　
    ＧＬＮ　ＧＬＵ　ＶＡＬ　ＧＬＹ　ＭＡＬ　ＧＬＵ　Ｇ
    ＬＵ　ＴＨＲＰＲＯＬ）ＩＪ　ＭＩ１７　ＡＳＮ　ＶＡ
    Ｌ　ＡＳＰ　５ＥＲＩＬＥ　ＬＥＵ　ＡＬＡ　ＶＡＬＬ
    ＹＳ　ＬＹＳ　ＴＹＲＰＨＥ　ＧＬＮ　ＡＲＧ　ＩＬＥ
    　諾ＬＩＩＪ　ＴＹＲＬＥＵＴＨＲＧＬＵ　ＬＹＳ　Ｌ
    ＹＳ　ＴＹＲＳＥＲＰＲＯＣＹＳ　ＡＩ、Ａ　ＴＲＰ　
    ＧＬＵＶＡＬ　ＶＡＬ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＩＩ
    、Ｅ　［ＡＲＧ　８ＥＲＰＨＥ　５ＥＲＬＥＵ　ＳＥＲ
    ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＰＨＥけΔＧＬＵ　Ａ囮ＬＥＵ　Ａ囮
    ＭのＬＹＳ　ＧＬＵ　　。 をもつポリペプチド。 ３４、％許請求の範囲第２６項から第２９項までのいず
    れかに記載の次の配列： ＩＲＳＥＲＡＬＡ　ＡＬＡ　ＴＲＰ　Ａｓ〆ＧＬＬＴ釘
    化ＬｗＬ団超ＰＬＹ８　ＰＨＥ　ＴＹＲＴＨＲＧＬＩＪ
    　Ｌ皮胃ＲＧ對ＧΔＬ乱ＡＳＮＡＳＰ　ＬＪＸＴ　ＧＬ
    Ｕ　ＡＬＡ　ＣＹＳ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　ＧＵＮ　ＧＬＹ
    　ＶＡＬ　ＧＬＹＶＡＬ　ＴＨＲＧＬＬＪ　ＴＨＲＰＲ
    ＯＩＪＩＪ　ＭＥ’ｒ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＡＳＰ　５Ｅ
    ＲＩＬＥ　ＬＩＩＪ　ＡＬＡ　ＶＡＬ　ＡＲＧ　ＬＹＳ
    　ＴＹＲＰＨＥ　ＧＬＮ　、ｍ　ＩＬＥＴＨＲＬＩＸＩ
    　ＴＹＲＬ団ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＴＹＲ
    ＳＥＲＰ帥ＣＹＳ　ＡＩ、Ａ　ＴＲＴ’　ＧＬＵ　ＶＡ
    Ｌ　ＶＡＬ　ＡＰ、Ｇ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＩＬＥｆｆｉ
    ＡＲＧ　ＳＥＲＰＩ　ＳＥＲＬ匝ＳｇＲ脣Ｉ　ＡＳＮ　
    ＬＩＸＴ　ＧＬＮ　ＧＬＵＳＦＲＬＥＩＪ　ＡＲＧ　Ｓ
    ＥＲＬＹＳ　ＧＬＵ　。 をもつポリペプチド。 ３５、特許請求の範囲第２６項から第２９項までのいず
    れかに記載の次の配列： Ｙ灯ＡＬＡ　ＬＥｔＪ　Ｔ皿Ｐ）ＩＥソｒＹＲＬＩＩＪ
    　ＬＥＵ　ＶＡＬ肚Ａ　ＬＥｔＪＶＡＬ　ＶＡＬ　ＬＥ
    Ｕ　ＳＥＲＴＹＲＬＹＳ　ＳＥＲＰＨＥ　ＳＥＲＳＥＲ
    ＬＥＩＴＪＧＬＹ　ＣＹＳ　ＡＳＰ　Ｌ乱ＰＲＯＱＬＮ
    詣Ｈ１ｓ　ＳＥＲＬＥＵ　ＧＬＹＡＳＮ　ＡＲＧ珊厄Ａ
    ｎ、■ＩＩＪ　ＬＥＩＪ　ＬＩＩＪ　ＡＬＡ　Ｇ団■π
    ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＩＬＥ　ＳＥＲＰＲＯＰＨＥ　ＳＥＲ
    ＣＹＳ　ＬＦｙＪＬＹＳ　ＡＳＰＡＲＧ　Ｔ（ＩＳ　Ａ
    ＳＰ　ＰＨＥ　ＧＬＵ　ＰＨＥ　ＰＲＯＧΔＧＬＵ　Ｇ
    ＬＵ　Ｐ厄ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＬＹＳ　ＧＬＮ　Ｐ部ＧΔ
    ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＧΔルＡ　ＩＬＥＳＥＲＶＡＬ　ＩＪ
    Ｕ　ＨＩＳ　ＧＬＬＪ　ＭＥＴ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＧＬ
    Ｎ　ＴＨＲＰＨＥＡＳＮ　Ｌ厨Ｐ厄ＳＥＲ諾ＬＹＳ　Ａ
    ＳＰ　ＳＥＲＳＥＲルＡ肚ＡＬＩｉｌｔＴ　ＡＳＰ　Ｇ
    ＬＵ　ＴＨＲＬ加ＬＩＩＩＪ　ＡＳＰ　ＧＬＵ　Ｐ厄買
    ＲＩＬＥＧＬＵ　ＩＪＪ　ＡＳＰ　ＧＬＮ　ＧＬＮ　Ｉ
    ＪＪ　ＡＳＮ　ＡＳＰ　ＬＥＬＴ　ＧＬＵ　５ＥＲＣＹ
    Ｓ　ＶＡＬ　ｙｒｇｒ　ＧＬＮ　ＧＬＵ　ＶＡＬ　ＧＬ
    Ｙ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　ａｕｓ　５ＥａＰＲＯＬＩＩＪ　
    ＭＦＶｒ　ＴＹＲＧＬＵ　ＡＳＰ　ＳＥＲＩＬＥ　ＬＥ
    ＩＪ　ＡＬＡ　ＶＡＬＡＲＧ　ＬＹＳ　ＴＹＲＰＨＥ　
    ＧＬＮ　ＡＲＧ　ＩＬＥ　ＴＩ（ＲＬＩＩＩＴ　ＴＹＲ
    ＬＥＩＪＴＨＲＧＬＵ　ＬＹＳ　　ＬＹＳ　ＴＹＲＳＥ
    ＲＳＥＲＣ’ＹＳ　ＡＬＡ　ＴＲＰ　ＧＬＵＶＡＬ　Ｖ
    ＡＬ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＩＬｇ　ＭＥＩＴ　Ａ
    ＲＧ　ＳＥＲＰＨＥ　５ＥＲＬＥＩ７　ＳＥＲＩＬＥ　
    ＡＳＮ　ＬｇＵＧＬＮ　ＬＹＳ　ＡＲＧ　ＬＩＩＪ　Ｌ
    ＹＳ　５ＥＲＬＹＳ　ＧＬＵ　　。 をもつポリペプチド。 ３６、特許請求の範囲第２６項から１８２９項までのい
    ずれかＫ【載の次の配夕１ド Ｍ）？ｒ　ＡＬＡ　ＳＥＲＰＲＯＰ）ＩＦ　ＡＬＡ　Ｌ
    ＥＩＪ　ＬＩＩＪ　ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＬＩＩＶＡＬ　Ｖ
    ＡＬ　ＬＦ’Ｕ　ＳＥＲｃＹＳ　ＬＹＳ　ＳＥＲＳＥＲ
    ＣＹＳ　ＳＥＲＬＥＴＪＧＬＹ　ＣＹＳ　ＡＳＰ　ＬＩ
    ＩＪ　ＰＲＯＧＬＵ　ＴＨＲＨＩＳ　ＳＥＲＩＪＵ　Ａ
    ＳＰＡＳＮ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＴＨＲＬ田■πＬ甜り甜
    肚ＡＧ団■灯ＳＥＲＡＲＧ　ＩＩ、Ｅ　ＳＥＲＰＲＯ５
    Ｉ１２ＲＳＥＲαＳ　ＩＪＪ■πＡＳＰＡＲＧ　Ｈｉｓ
    　ＡＳＰ　ＰＨＥ　ＧＬＹ　Ｐ部ＰＩＧΔＧＬＵ　ＧＩ
    、Ｕ　ＰＲＥＡＳＰ　ＧＬＹ　ＡＳＮ　ＧＬＮ　Ｐ冊Ｇ
    ＬＮ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＰＲＯ肚Ａ　ＩＬＥＳＥＲＶＡ
    Ｌ　ＬＩＸＴ　）（Ｉｓ　ＧＬＵ　Ｌｍ　ＩＩＪ　ＧＬ
    Ｎ　ＧＬＮ　ＩＬＥ　ＰＨＥＡＳＮ　Ｌ［ＰＨＥ　ＴＨ
    ＲＴ）ＩＲＬＹＳ　ＡＳＰ　８ＥＲＩＲＡＬＡ　ＡＬＡ
    ＴＲＰ　ＡＳＰ　ＧＬＵ　ＡＳＰ　ＬＩＩＪ　ＬＩＸＴ
    超Ｐ　ＬＹＳ　ＰＨＥ　（１’Ｙｓ酎ＲＧＬＵ　ＬＩＸ
    Ｔ　ＴＹＲＧＬＮ　ＧＬＮ　ＩＬ）ＩＪ　ＡＳＮ　ＡＳ
    Ｐ　ＬＬ’Ｕ　ＧＬＵ　ＡＬＡＣＹＳ　ＶＡＬ　ＭＨＧ
    ＬＮ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＡＲＧ　ＶＡＬ　ＧＬＹ　ＧＬ
    Ｕ　ＴＨＲＰＲＯＬＩＸＴ　ＭＦｖｒＡＳＮ　ＡＬＡ　
    ＡＳＰ　ＳＥＲＩＬＥ　Ｌｆｆｌ　ＡＬＡ　ＶＡＬＬＹ
    Ｓ　ＬＹＳ　ＴＹＲＰＨＥ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＩＬＥ　
    ＴＨＲＬＩ　ＴＹＲＬＩＮＴＴＨＲＧＬＵ　ＬＹＳ　Ｌ
    ＹＳ　ＴＹＲＳＥＲＰＲＯＣＹＳ　ＡＬＡ　ＴＲＰ　Ｇ
    ＬＵＶＡＬ　ＶＡＬ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＩＬＥ
    ＭＦＴ　ＡＲＧ　ＳＥＲＩ、ＥＩＪ　５ＥＲＬＩｉＩＪ
    　ＳＥＲＴＨＲＡＳＮ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＧＬＵ　ＡＲ
    Ｇ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＡＲＧＬＹＳ　ＧＬＵ　　。 をもつポリ（デチド。 ３７、％許請求の範囲第２６項から第２９頂までのいず
    れかに記載の次の配列： ８ＥＲＳＥＲＡＳＮ　ＰＨＥ　ＧＬＮ　ＣＹＳ　ＧＬＮ
    　ＬＹＳ　ＬＥｌｔＴ　ＬＥＵ　ＴＲＰＧＬＮ　ＬＥＵ
    　ＡＳＮ　ＧＬＹ　ＡＲＧ　ＬＩＸＴ　ＧＬＵ　ＴＹＲ
    ＣＹＳ　ＬＩＸＴ　ＬＹＳＡＳＰ　ＡＲＧ　ＭＥＴ　Ａ
    ＳＮ　ＰＨＥ　ＡＳＰ　ＩＬＥ　ＰＲＯＧＬＵ　ＧＬＵ
    　ＩＬＥＬＹＳ　ＧＬＮ　Ｌ廚ＧΔＧΔＰ部ＧΔＬＹＳ
    　ＧＬＵ　ＡＳＰルＡＡＬＡ　Ｌ甜ＴＨＲＩＬｇ買ＲＧ
    ＬＵ■πＬＥＬＴ　ＧΔＡＳＮ　ＩＬＥＰ耶ＡＬＡ　Ｉ
    ＬＥ　Ｐ匪Ａ囮ＧΔＡＳＰ　ＳＥＲＳＥＲＳＥＲＴＨＲ
    ＧＬＹ　ＴＲＰ　ＡＳＮ　’ＧＬＵ　ＴＨＲＩＬＥ　Ｖ
    ＡＬ　ＧＬｔＪ　ＡＳＮ　ＩＪＵ　ＬＩＡＬＡ　ＡＳＮ
    　ＶＡＬ　ＴＹＲＨＩＳ　ＧＬＮ　ＩＬＥＡＳＮ　ＨＩ
    Ｓ　ＬＩＸＴ　ＬＹＳＴＨＲＶＡＬ　ＬＩＸＪ　ＧＬＵ
    　ＧＬＵ　ＬＹＳ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　
    ＡＳＰＰ亜ＴＨＲＡＲＧ　ＧＬＹ　ＬＹＳ　ＬＥＵ　Ｍ
    ＥＴ　５ＥＦＬ　ＳＥＲＬ皮ＨＩＳｔ、ＥＵ　ＬＹＳ　
    ＡＲＧ　ＴＹＲＴＹＲＧＬＹ　ＡＲＧ　ＩｔＪ　ＬＥＵ
    　Ｈｌｓ　ＴＹＲＬＥＵ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＬＹＳ　Ｇ
    ＬＵ　ＴＹＲＳＥＲＨＩＳ　ＣＹＳ　ＡＬＡ　ＴＲＰＴ
    ＨＲＩＬＥ　ＶＡＬ　ＡＲＧ　ＶＡＬ　ＧＬＵ　ＩＬＥ
    　Ｌｍ’ＡＲＧ　ＡＳＮ　ｐＨＥＴＹＲＰＨＥ　ＩＬＥ
    　ＡＳＮ　ＡＲＧ　ＩＪＵ　ＴＨＲＧＬＹ　ＴＹＲＬＥ
    Ｕ　ＡＲＧＡＳＮ　　。 をもっポリペプチド・ ３８、特許請求の範囲第２６項から第２９項までのいず
    れかに記載の次の配夕１ド ＭＥ’ｒ　ＣＹＳ　ＡＳＰ　ＬＩＸＴ　ＰＲＯＧＬＮ　
    ＴＨＲＨＩＳ　ＳＥＲＩ、ＥＵ　ＧＬＹＡＳＮ　ＡＲＧ
    　ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＬＩＩＪ　ＩＬＥ　ＩＪＪ　Ｌｌｌ
    ｌ　ＡＩ、Ａ　ＧＬＮ　Ｍｌｉ’ｒＧＬＹ　Ａ妬ＩＬＥ
    　ＳＥＲＰＲＯＰ部ＳＥＲαＳＬ厨ＬＹＳ　ＡＳＰＡＲ
    Ｇ　）（Ｉｓ　ＡＳＰ　ＰＨＥ　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＰＲ
    ＯＧＬＮ　ＧＬＵ　ＧＬＵ丹正ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＡＳＮ
    　ＧＬＮ　Ｐ厄ＧΔＬＹＳ　ＡＬＡ　ＧひＴ　ＡＬＡ　
    ＩＬＥＳＥＲＶＡＬ　ＬＷ　ＨＩＳＧＩ、Ｕ　ＭＥＴ　
    ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＧひＪ　ＴＨＲＰＨＥＡＳＮ　ＩＪＵ
    　Ｐ）ｔＥ　ＳＥＲＴＨＲＬＹＳ　ＡＳＰ　ＳＥＲＳＥ
    ＲルＡ鉗ＲＴＲＰ　ＧＬＵ　ＧＬＮ　ＳｇＲＬＩ　ＬＩ
    ＩＪ　ＧＬＵ　ＬＹＳ　ＰＨＥ　５ＥＦＬ　ＴＴ（ＲＧ
    ＬＵ　ＩＪＵ　ＡＳＮ　ＧＬＮ　ＧＬＮ　ＬＥＵ　ＡＳ
    Ｎ　ＡＳＰ　ＩＪＵ　ＧＬＵ　ＡＬＡＣＹＳ　ＶＡＬ　
    ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＧＬｔＪ　ＶＡＬ　ＧＬＹ　ＶＡＬ　
    ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＴＨＲＰＲＯＩＪＪ　ＭＥＴ　ＡＳＮ
    　ＶＡＬ　ＡＳＰ　ＳＥＲＩＬＥ　ＬＩＸＴ　ＡＬＡ　
    ＶＡＬＬＹ８　ＬＹＳ　ＴＹＲＰ耶ＧΔ脚ＩＬＥ皿り団
    胃ＲＬＥＩＪＴＨＲＧＬＵ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＴＹＲＳ
    ＥＲＰＲＯＣＹＳ　ＡＬＡ　ＴＲＰ　ＧＬＵＶＡＬ　Ｖ
    ＡＮ、ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＩＩＪ　ＭＥＴ　ＡＲ
    Ｇ　ＳＥＲＰＨＥ　５ＥＲＬ匝５ＥＦｔ　ＬＹＳ　ＩＬ
    ＥＰＨＥ　ＧΔＧＬＵ　ＡＲＧ　Ｌ掠ＴＡ■Ａ囮ＬＹＳ
    　ＧＬＵ　　。 をもっ゛ポリペプチド。 ３９、％軒請求の範囲第２６項から１２９項までのいず
    れかに記載の次の配列： Ｍ訂ＣＹＳ　ＡＳＰ　Ｌ団Ｐ帥ＧＬＵ耐ＲＨＩＳ　ＳＥ
    ＲＬＥＩＪ　ＡＳＰＡＳＮ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＴＨＲＩ
    Ｊ見留り甜り饋Ｊ　ＡＬＡ　ＧｌＮ聞ＳＥＲＡＲＧ　Ｉ
    ＬＥ　ＳＥＲＰＲＯＳＥＲ５ＥＦｔ　ＣＹＳ　ＬＴＩＪ
    　ＭＥＴ　ＡＳＰＡＲＧ　Ｈｌｓ　ＡＬＰ　ＰＨＥ　Ｇ
    ＬＹ　Ｐ耶ＰＲＩＧΔＧＬＵ　（’、ＬＵ　Ｐ）（ＥＡ
    ＳＰ　ＧＬＹ　ＡＳＮ　ＧＬＮ　ＰＨＥ　ＧＬＮ　ＬＹ
    Ｓ　ＡＬＡ　Ｐ囮ＡＬＡ　ＩＬＥＳＥＲＶＡＬ　ＬＩＩ
    Ｊ　ＨＩＳ　ＧＬＵ　ＬＥＵ　ＩＩＪ　ＧＴ、Ｎ　ＧＬ
    Ｎ　ＩＩ、ＥＰＨＥＡＳＮ　Ｌ団Ｐ）（Ｅ　ＴＨＲＴＨ
    ＲＬＹＳ　ＡＳＰ　ＳＥＲＳＥＲＡＬＡ　Ａｌ、ＡＴＲ
    Ｐ　ＡＳＰ　ＧＬＵ　ＡＳＰ　Ｌ囮Ｉ、団ＡＳＰ　ＬＹ
    Ｓ　Ｐ亜ＣＹＳ　ＴＨＲＧＬｔＪ　ＬＥＬＪ　−ＴＹＲ
    ＧＬＮ　ＧＬＮ　ＬＥＵ　ＡＳＮ　ＡＳＰ　ＬＥＬＪ　
    ＧＬＵ　ＡＬＡＣＹＳ　ＶＡＬ　ＭＥＴ　ＧΔＧＬＵ　
    ＧＬＵ　ＡＲＧ　ＶＡＬ　ＧＬＹ　ＧＬＵ　Ｔ）（ＲＰ
    ＲＯＬＦＵ　ＭｇｒＡＳＮ　ＡＬＡ　ＡＳＰ　ＳＥＲＩ
    ＬＥＬＥＵ　ＡＬＡ　ＶＡＬＬＹＳ　ＬＹＳ　ＴＹＲＰ
    北Ａ囮Ａ囮ＩＬＥＴ皿■−団買ＲＬＥＵＴ）（ＲＧＬＵ
    　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＴＹＲＳＥＲＰＲＯＣＹＳ　ＡＬＡ
    　ＴＲＰ　ＧＬＵＶＡＬ　ＶＡＬ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　Ｇ
    ＬＵ　ＩＬＥ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　ＳＥＲＬＥＬＴ　５Ｅ
    ＲＬＥＵ　ＳＥＲＴＨＲＡＳＮ　ＩＪＪ　ＧＬＮ　ＧＬ
    Ｕ　ＡＲＧ　Ｉ５　ＡＲＧ　ＡＪのＬＹＳ　ＧＬＵ　　
    。 をもつぼりペプチド。 ４０　特許請求の範囲第２６項から第２９項までのいず
    れかに記載の次の配列： ｙＩＥｙｒαＳ　ＡＳＰ　Ｌｍ　ＰＲＯＧＬＮ　Ｔ）ｆ
    ＲＨＩＳＳＥＲＬＥＵ　ＧＬＹＡＳＮ　ＡＲＣＡＲＧ　
    ＡＬＡ　Ｌ甜ＩＩ、ＥＬ甜り団肚ＡＧΔ■１１ＡＲＧ　
    ＡＲＧ　ＴＬＥ　ＳＥＲＰＲＯＰＨＥ　８ｇＲαＳＬ厨
    ＬＹＳ　ＡＳＰＡＲＧ　Ｈｌｓ　ＡＳＰ　ＰＨＥ　ＧＬ
    Ｕ　Ｐ）ＴＥ　ＰＲＯＧＬＮ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　Ｐ北Ａ
    ＳＰ　ＡＳＰ　ＬＹＳ　ＧＬＮ　Ｐ北ＧＬＮ　ＬＹＳ　
    ＡＬＡ　Ｇ對息ＩＬＥＳＥＲＶＡＬ　ＬＥＵ　ＨＩＳ　
    ＧＬＵ　Ｗ　ＴＬＥ　ＧＵＮ　ＧＬＮ　ＴＨＲＰＨＥＡ
    ＳＮ　ＬＥＵ　Ｐ）ｒＥ　ＳＥＲＴ皿ＬＹＳ　ＡＳＰ　
    ＳＥＲＳＥＲルＡルＡＬＥＩＪ　ＡＳＰ　ＧＬＵ　ＴＨ
    ＲＬＥＵ　ＬＩ　ＡＳＰ　ＧＬＵ　ＰＨＥ　ＴＹＲＩＬ
    ＥＧＬＵ　ＬＥＸＪ　ＡＳＰ　ＧＬＮ　ＧＩλ画ＡＳＮ
    　ＡＳＰ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＳｇＲＣＹＳ　ＭＡＬ　Ｍ
    ＥＴ　ＧＬＮ　ＧＬＩＪ　ＶＡＬ　ＧＬＹ　ＶＡＬ　Ｉ
    ＬＥ　ＧＬＵ　５ＥＲＰＲＯＬＥＩＪ　Ｍ）ｒ　ＴＹＲ
    ＧＬＵ　ＡＳＰ　ＳＥＲＩＬＥ　ＬＥＵ　ＡＬＡ　ＶＡ
    ＬＡＲＧ　ＬＹＳ　ＴＹＲＰＩＥ　ＧＬＮ　ＡＲＧ　Ｉ
    ＩＪ　ＴＨＲＬＩＩＪ　ＴＹＲＬＥＵＴＨＲＧＬＵ　Ｌ
    ＹＳ　ＬＹＳ　ＴＹＲＳＥＲ８ＥＲＣＹＳ　ＡＬＡ　Ｔ
    ＲＰ　ＧＬＵＶＡＬ　ＶＡＬ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＧＬＵ
    　ＩＩ、Ｅ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　ＳＥＲＰＨＥ　ＳＥＲＬ
    ＥＴＪ　ＳＥＲＩＬＥ　ＡＳＮ　ＬＩＸＴ　ＧＬＪ’Ｊ
    　ＬＹＳ　ＡＲＧ　ＬｈＵ　ＬＹＳ　５ＥＲＬＹＳ　Ｇ
    ＬＵ　　。 をもつポリペプチド。 ４１、インターフェロン様ポリペプチドのためにコード
    化されるヒトリンパ芽球細胞から誘導したＤＮＡ配列を
    含むＤＮＡ該配列の断片、変種または突然変異体、もし
    くは該ＤＮＡに交雑化（雑程化）するＤＮＡを製造する
    に当たり。 （１）　　ＨｕＬｙＩＦ’Ｎ−ｍＲＮＡ−水銀相補的Ｄ
    ＮＡおよび必快に応じて二重鎖ｃ　−ＤＮＡから製造す
    るかまたは （２）　　ヒトリンパ芽球細胞のクロマトシームＤＮＡ
    を部分的に開裂するかおよびクロマトシームＬ７１Ｆ’
    Ｎ遺伝子を含む断片を選択するか、および該配列の断片
    を要する場合適当なエンドヌクレアーゼで該ＤＮＡを制
    限するかもしくは適当なエキソヌクレアーゼで該ＤＮＡ
    を分解（消化）するかまたは組み換えＤＮＡを要する場
    合、適当なベクトルＤＮＡに該ＤＮＡを導入することか
    らなることを特徴とする製造方法。 ４２、　　インターフェロン様ポリペプチドのためにコ
    ード化せる、特許請求の範囲第２項から第１４項までの
    いずれかに記載のＤＮＡをベクトルＤＮＡに導入する工
    程を含む特許請求の範囲＃Ｉ４１項記載の組み換えＤＮ
    Ａの製造方法。 ４３、％許請求の範囲第１５項から第２５項までのいず
    れかに記載の形質転換したホス°トを培養しおよｑポリ
    ペプチドを分触することを特徴とする特許請求の範囲第
    ２６項から第４０項までのいすｈかに記載のポリペプチ
    ドを生ｂｒｉする方法。 ４４、％許請求の範囲第２項から第１４項までのいずれ
    かに記載の組み換えＤＮＡをもつボスト微生物に形質転
    換する工程を含む特許請求の範囲第１５項から第２５項
    までのいずれかに記載の形質転換したホストを生成する
    方法。 ４５、％許請求の範囲＃！２６項から第４０項までのい
    ずれかに記載の／　ＩＪペゾチドからなる医薬組成物。 ４６、特許請求の範囲第４５項記載の医薬組成−の形態
    でポリペプチドの効能量を投与することからなるは乳類
    （ヒトを除く）におけるウィルス性感染、癌または腫瘍
    の治療方法。 ４７、特許請求の範囲第４３項記載の得られるポリペプ
    チド。 ４８、特許請求の範囲第２６項から第４０項までのいず
    れかに記載の実質上純粋なポリペプチド。
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