JPH0678774A - インターフェロンをコードする遺伝子 - Google Patents
インターフェロンをコードする遺伝子Info
- Publication number
- JPH0678774A JPH0678774A JP5062065A JP6206593A JPH0678774A JP H0678774 A JPH0678774 A JP H0678774A JP 5062065 A JP5062065 A JP 5062065A JP 6206593 A JP6206593 A JP 6206593A JP H0678774 A JPH0678774 A JP H0678774A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- ifn
- interferon
- rna
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/142—Interferon
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 常法で得られそしてタイプαまたはタイプβ
のインターフェロンに対しての遺伝子情報を担う微生物
およびそれらの変異株を分離し、それにより、これらの
インターフェロンを生産する基本的必要条件を提供す
る。 【構成】 ＩＦＮ−α２（Ａｒｇ）をコードするＤＮＡ
配列（Ｉ）を有するポリデオキシリポヌクレオチド、こ
のＤＮＡ配列を含有するプラスミド、ならびにこのポリ
デオキシリポヌクレオチドを含有するか、あるいはこの
プラスミドにより形質転換された微生物。
のインターフェロンに対しての遺伝子情報を担う微生物
およびそれらの変異株を分離し、それにより、これらの
インターフェロンを生産する基本的必要条件を提供す
る。 【構成】 ＩＦＮ−α２（Ａｒｇ）をコードするＤＮＡ
配列（Ｉ）を有するポリデオキシリポヌクレオチド、こ
のＤＮＡ配列を含有するプラスミド、ならびにこのポリ
デオキシリポヌクレオチドを含有するか、あるいはこの
プラスミドにより形質転換された微生物。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＩＦＮ−α２（Ａｒｇ）
をコードするＤＮＡ配列を有するポリデオキシリボヌク
レオチド、このＤＮＡ配列を含有するプラスミド、およ
びこのポリデオキシリボヌクレオチドを含有する微生物
に関するものである。
をコードするＤＮＡ配列を有するポリデオキシリボヌク
レオチド、このＤＮＡ配列を含有するプラスミド、およ
びこのポリデオキシリボヌクレオチドを含有する微生物
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】３つの型のインターフェロン、つまり、
白血球インターフェロン（インターフェロンα、ＩＦＮ
−αと略記）、繊維芽インターフェロン（インターフェ
ロンβ、ＩＦＮ−βと略記）および免疫インターフェロ
ン（インターフェロンγ、ＩＦＮ−γと略記）が文献に
記載されている（Ｗ．Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｔ ＩＩ、“Ｔ
ｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ”、Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｖｉｅｎｎａ／Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、第２版（１９８１）参照）。ヒト白血球または
ヒト骨髄芽細胞は、ウイルスで刺激すると白血球インタ
ーフェロンを産生し、ヒト繊維芽細胞はウイルスまたは
適当な核酸で誘導すると繊維芽インターフェロンを生成
し、そして、マイトジエン、たとえばコンカナバリンで
誘導したヒト−Ｔ淋巴球は免疫インターフェロンを生成
する。
白血球インターフェロン（インターフェロンα、ＩＦＮ
−αと略記）、繊維芽インターフェロン（インターフェ
ロンβ、ＩＦＮ−βと略記）および免疫インターフェロ
ン（インターフェロンγ、ＩＦＮ−γと略記）が文献に
記載されている（Ｗ．Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｔ ＩＩ、“Ｔ
ｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ”、Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｖｉｅｎｎａ／Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、第２版（１９８１）参照）。ヒト白血球または
ヒト骨髄芽細胞は、ウイルスで刺激すると白血球インタ
ーフェロンを産生し、ヒト繊維芽細胞はウイルスまたは
適当な核酸で誘導すると繊維芽インターフェロンを生成
し、そして、マイトジエン、たとえばコンカナバリンで
誘導したヒト−Ｔ淋巴球は免疫インターフェロンを生成
する。
【０００３】さらに、たとえばセルストレインＮＣ−３
７、Ｎａｍａｌｗａ、ＡｋｕｂａまたはＲＰＭＩ１７８
８により代表されるようなＢ−淋巴球型のヒト細胞は、
ウイルスで刺激すると白血球インターフェロンおよび繊
維芽インターフェロンを同時に生産する（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３８、５
１−５９（１９７７））。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β
の生産量の比率は誘導条件の選択で変えうる（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ２、準備中（１９８２））。たとえばＳｅｎｄａｉウ
イルスで誘導した種々のセルストレインよりつぎの割合
でＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βが得られる：
７、Ｎａｍａｌｗａ、ＡｋｕｂａまたはＲＰＭＩ１７８
８により代表されるようなＢ−淋巴球型のヒト細胞は、
ウイルスで刺激すると白血球インターフェロンおよび繊
維芽インターフェロンを同時に生産する（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３８、５
１−５９（１９７７））。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β
の生産量の比率は誘導条件の選択で変えうる（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ２、準備中（１９８２））。たとえばＳｅｎｄａｉウ
イルスで誘導した種々のセルストレインよりつぎの割合
でＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βが得られる：
【０００４】
【表１】
【０００５】さらに、白血球よりのＩＦＮ−α遺伝子の
分子クローニング（Ｎａｔｕｒｅ２８４、３１６−３２
０（１９８０）；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９、１３４３−
１３４７（１９８０）およびＥＰ−Ａ１−０．０３２．
１３４参照）、および骨髄芽細胞よりのＩＦＮ−α遺伝
子のクローニング（Ｎａｔｕｒｅ ２８７、４１１−４
１６（１９８０）、同上２９０、２０−２６（１９８
１）およびＧＢ−Ａ−２．０７９．２９１）は、少なく
とも１０種の区別しうる遺伝子より成立つ遺伝子族によ
りＩＦＮ−αがコードされるという結果を与えた。
分子クローニング（Ｎａｔｕｒｅ２８４、３１６−３２
０（１９８０）；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９、１３４３−
１３４７（１９８０）およびＥＰ−Ａ１−０．０３２．
１３４参照）、および骨髄芽細胞よりのＩＦＮ−α遺伝
子のクローニング（Ｎａｔｕｒｅ ２８７、４１１−４
１６（１９８０）、同上２９０、２０−２６（１９８
１）およびＧＢ−Ａ−２．０７９．２９１）は、少なく
とも１０種の区別しうる遺伝子より成立つ遺伝子族によ
りＩＦＮ−αがコードされるという結果を与えた。
【０００６】このことは、また、これらのＤＮＡ配列の
遺伝子生成物が、単一の均一な蛋白質を構成しないこと
を意味する。このことはまた、ＩＦＮ−αが類似の蛋白
質の混合物であることを意味する。これらのサブ−タイ
プは、文献中では、ＩＦＮ−α１，２，３・・・と呼称
されており（Ｎａｔｕｒｅ ２８７、４０１−４０８
（１９８０）およびＧｅｎｅ １５，３７９−３９４
（１９８１））、またはＬｅＩＦＮ Ａ，Ｂ，Ｃ・・・
（Ｎａｔｕｒｅ ２９０、２０−２６（１９８１））と
呼称されている。
遺伝子生成物が、単一の均一な蛋白質を構成しないこと
を意味する。このことはまた、ＩＦＮ−αが類似の蛋白
質の混合物であることを意味する。これらのサブ−タイ
プは、文献中では、ＩＦＮ−α１，２，３・・・と呼称
されており（Ｎａｔｕｒｅ ２８７、４０１−４０８
（１９８０）およびＧｅｎｅ １５，３７９−３９４
（１９８１））、またはＬｅＩＦＮ Ａ，Ｂ，Ｃ・・・
（Ｎａｔｕｒｅ ２９０、２０−２６（１９８１））と
呼称されている。
【０００７】他方、ＩＦＮ−βに対しては均一ＤＮＡ配
列が見出だされている。このことは、ただひとつの遺伝
子が繊維芽インターフェロンをコードすること、すなわ
ち、サブ−タイプはまったく知られていない（Ｎａｔｕ
ｒｅ ２８５、５４２−５４７（１９８０））ことを意
味する。
列が見出だされている。このことは、ただひとつの遺伝
子が繊維芽インターフェロンをコードすること、すなわ
ち、サブ−タイプはまったく知られていない（Ｎａｔｕ
ｒｅ ２８５、５４２−５４７（１９８０））ことを意
味する。
【０００８】ＩＦＮ−α遺伝子とＩＦＮ−β遺伝子との
あいだでは、ＩＦＮ−α遺伝子族内でおこるのとは逆
に、クロス−ハイブリダイゼーションはおこらないが、
配列は約４５％相同である（Ｎａｔｕｒｅ ２８５、５
４７−５４９（１９８０））。（７のうち５個の）ＩＦ
Ｎ−αとして働らく遺伝子とＩＦＮ−β遺伝子とのあい
だで、完全な相同性が存在する最も長い配列フラグメン
トは、１３の長さのヌクレオチドである。このトリデカ
ヌクレオチドは文献より知られている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５、８−９（１９８１））。この
トリデカヌクレオチドを含有するＩＦＮ−α遺伝子はＬ
ｅＩＦＮ Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇであり、１３ヌクレオチ
ドのうち１２だけがＬｅＩＦＮＡおよびＨに存在してい
る（Ｎａｔｕｒｅ ２９０、２０−２６（１９８１）参
照）。
あいだでは、ＩＦＮ−α遺伝子族内でおこるのとは逆
に、クロス−ハイブリダイゼーションはおこらないが、
配列は約４５％相同である（Ｎａｔｕｒｅ ２８５、５
４７−５４９（１９８０））。（７のうち５個の）ＩＦ
Ｎ−αとして働らく遺伝子とＩＦＮ−β遺伝子とのあい
だで、完全な相同性が存在する最も長い配列フラグメン
トは、１３の長さのヌクレオチドである。このトリデカ
ヌクレオチドは文献より知られている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５、８−９（１９８１））。この
トリデカヌクレオチドを含有するＩＦＮ−α遺伝子はＬ
ｅＩＦＮ Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇであり、１３ヌクレオチ
ドのうち１２だけがＬｅＩＦＮＡおよびＨに存在してい
る（Ｎａｔｕｒｅ ２９０、２０−２６（１９８１）参
照）。
【０００９】
【発明の開示】驚くべきことに、あらゆる種類のリコン
ビナントＤＮＡ分子を含有する、既知の方法で得られる
細菌の混合物を採取し、そして、このトリデカヌクレオ
チドを用いるコロニーハイブリダイゼイションによりイ
ンターフェロンに対する情報を担う細菌を同定し、それ
により、同時操作でＩＦＮ−α配列およびＩＦＮ−β配
列をうることにより、タイプαおよびタイプβのインタ
ーフェロンの調製を改良しうることが分った。
ビナントＤＮＡ分子を含有する、既知の方法で得られる
細菌の混合物を採取し、そして、このトリデカヌクレオ
チドを用いるコロニーハイブリダイゼイションによりイ
ンターフェロンに対する情報を担う細菌を同定し、それ
により、同時操作でＩＦＮ−α配列およびＩＦＮ−β配
列をうることにより、タイプαおよびタイプβのインタ
ーフェロンの調製を改良しうることが分った。
【００１０】本発明の目的は、常法で得られそしてタイ
プαまたはタイプβのインターフェロンに対しての遺伝
子情報を担う微生物およびそれらの変異株を分離し、そ
れにより、これらのインターフェロンを生産する基本的
必要条件を提供することにある。
プαまたはタイプβのインターフェロンに対しての遺伝
子情報を担う微生物およびそれらの変異株を分離し、そ
れにより、これらのインターフェロンを生産する基本的
必要条件を提供することにある。
【００１１】この目的を達成するには、たとえばつぎの
操作を用いうる。たとえばＳｅｎｄａｉウイルスで誘導
後、ＩＦＮ−αおよびさらにＩＦＮ−βの双方を生産す
る適当なセルストレインを選択する。Ｂ−淋巴球型の適
当なヒト細胞には、たとえばＮａｍａｌｗａ、ＮＣ−３
７、ＡｋｕｂａまたはＲＰＭＩ１７８８があるが、Ｎａ
ｍａｌｗａ株が有利である。
操作を用いうる。たとえばＳｅｎｄａｉウイルスで誘導
後、ＩＦＮ−αおよびさらにＩＦＮ−βの双方を生産す
る適当なセルストレインを選択する。Ｂ−淋巴球型の適
当なヒト細胞には、たとえばＮａｍａｌｗａ、ＮＣ−３
７、ＡｋｕｂａまたはＲＰＭＩ１７８８があるが、Ｎａ
ｍａｌｗａ株が有利である。
【００１２】選択された細胞は、ＩＦＮ−ｍＲＮＡ合成
が最大の時点で、代表的には、ウイルス誘導後６から１
２時間、なるべくは９時間で適当に変性させる。核を除
いたあと、細胞質よりのＲＮＡをフェノール抽出そして
アルコール沈殿で精製する。ついでポリ（Ａ）+ ＲＮＡ
をオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーで分離
し、インターフェロン−特異的配列（図１の左側カラ
ム）に関連して勾配遠心で濃縮する。
が最大の時点で、代表的には、ウイルス誘導後６から１
２時間、なるべくは９時間で適当に変性させる。核を除
いたあと、細胞質よりのＲＮＡをフェノール抽出そして
アルコール沈殿で精製する。ついでポリ（Ａ）+ ＲＮＡ
をオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーで分離
し、インターフェロン−特異的配列（図１の左側カラ
ム）に関連して勾配遠心で濃縮する。
【００１３】このように精製したポリ（Ａ）+ ＲＮＡ
は、逆転写酵素を用いての一本鎖ｃＤＮＡの製造のため
のマトリックスとして用いる。この一本鎖のＤＮＡに相
補的の第２のＤＮＡ鎖は、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩを用
いて合成する。ｃＤＮＡ−合成および相補的ＤＮＡ合成
は、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシチジン
のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの混合物を含
有する溶液中で実施した。得られる二本鎖ｃＤＮＡ混合
物は、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて鎖の両端において変型
して、それぞれの鎖のはみ出ている領域を除き、少なく
とも６００塩基対を含有する二本鎖ＤＮＡ分子を勾配遠
心で分ける。得られるｃＤＮＡ混合物は、各鎖の３′末
端にオリゴデオキシシチジンを付加することにより末端
トランスフェラーゼで約１５ヌクレオチド分伸ばし、リ
コンビナント分子合成のためのひとつの成分を製造する
（図１の左欄をみよ）。
は、逆転写酵素を用いての一本鎖ｃＤＮＡの製造のため
のマトリックスとして用いる。この一本鎖のＤＮＡに相
補的の第２のＤＮＡ鎖は、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩを用
いて合成する。ｃＤＮＡ−合成および相補的ＤＮＡ合成
は、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシチジン
のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの混合物を含
有する溶液中で実施した。得られる二本鎖ｃＤＮＡ混合
物は、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて鎖の両端において変型
して、それぞれの鎖のはみ出ている領域を除き、少なく
とも６００塩基対を含有する二本鎖ＤＮＡ分子を勾配遠
心で分ける。得られるｃＤＮＡ混合物は、各鎖の３′末
端にオリゴデオキシシチジンを付加することにより末端
トランスフェラーゼで約１５ヌクレオチド分伸ばし、リ
コンビナント分子合成のためのひとつの成分を製造する
（図１の左欄をみよ）。
【００１４】第２の成分として、なるべくはＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉより得られた環状二本鎖プラス
ミド、たとえばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉプラ
スミドｐＢＲ３２２、を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉを用いて直線状として、ｃＤＮＡ混合物と同様にし
て、分子の３′末端にオリゴデオキシグアニジンを付加
させオリゴデオキシグアニジンのはみでた末端とする。
これらの末端はｃＤＮＡ分子の遊離のオリゴデオキシシ
チジン末端と安定な二本鎖ＤＮＡ領域を形成する（図１
の右側のカラムをみよ）。たとえばｐＢＲ３２２および
ｃＤＮＡより得られるハイブリドプラスミドを用いて、
微生物、たとえばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１を、このＤＮＡの複製および発現のおこる宿
主に形質転換する。
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉより得られた環状二本鎖プラス
ミド、たとえばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉプラ
スミドｐＢＲ３２２、を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉを用いて直線状として、ｃＤＮＡ混合物と同様にし
て、分子の３′末端にオリゴデオキシグアニジンを付加
させオリゴデオキシグアニジンのはみでた末端とする。
これらの末端はｃＤＮＡ分子の遊離のオリゴデオキシシ
チジン末端と安定な二本鎖ＤＮＡ領域を形成する（図１
の右側のカラムをみよ）。たとえばｐＢＲ３２２および
ｃＤＮＡより得られるハイブリドプラスミドを用いて、
微生物、たとえばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１を、このＤＮＡの複製および発現のおこる宿
主に形質転換する。
【００１５】このようにして得られたクローンのうち、
ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βに特異的な配列を含有する
クローンを、コロニーハイブリダイゼーションで同定す
る。用いる試験物質は、インターフェロン配列に特異的
であるトリデカヌクレオチド５′ｄＣＣＴＴＣＴＧＧＡ
ＡＣＴＧ３′をプライマーとし、ＩＦＮ−ｍＲＮＡを含
有するＲＮＡの逆転写により合成される放射ラベルｃＤ
ＮＡである。この目的にはトリデカヌクレオチドを、な
るべくは、γ−32Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４−ポリヌクレオ
チドキナーゼを用い、その末端において放射ラベルす
る。ラベルされたトリデカヌクレオチドの過剰およびＳ
ｅｎｄａｉウイルスで誘導された細胞よりのポリ（Ａ）
+ ＲＮＡを用いる逆転写反応のための開始複合物を、前
記条件で製造する（図２をみよ）。
ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βに特異的な配列を含有する
クローンを、コロニーハイブリダイゼーションで同定す
る。用いる試験物質は、インターフェロン配列に特異的
であるトリデカヌクレオチド５′ｄＣＣＴＴＣＴＧＧＡ
ＡＣＴＧ３′をプライマーとし、ＩＦＮ−ｍＲＮＡを含
有するＲＮＡの逆転写により合成される放射ラベルｃＤ
ＮＡである。この目的にはトリデカヌクレオチドを、な
るべくは、γ−32Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４−ポリヌクレオ
チドキナーゼを用い、その末端において放射ラベルす
る。ラベルされたトリデカヌクレオチドの過剰およびＳ
ｅｎｄａｉウイルスで誘導された細胞よりのポリ（Ａ）
+ ＲＮＡを用いる逆転写反応のための開始複合物を、前
記条件で製造する（図２をみよ）。
【００１６】したがって、このようにして製造されたｃ
ＤＮＡは、トリデカヌクレオチドを有する、逆転写反応
のための開始複合物が生成された時のみに、放射ラベル
される。つまり、ラベルはトリデカヌクレオチドのみに
含まれるからである。その結果、本発明は、このトリデ
カヌクレオチドに相補的ＤＮＡ配列を有するＤＮＡを認
識する際の高度の選択性を保証し、これによって、α−
およびβ−インターフェロンＤＮＡ認識のための高度の
選択性が保証される。用いたトリデカヌクレオチドに対
し相補性のＤＮＡ配列を有するハイブリドプラスミドを
含有する、これらの転換された細菌のコロニーはオート
ラジオグラフィーにより示される（図３をみよ）。
ＤＮＡは、トリデカヌクレオチドを有する、逆転写反応
のための開始複合物が生成された時のみに、放射ラベル
される。つまり、ラベルはトリデカヌクレオチドのみに
含まれるからである。その結果、本発明は、このトリデ
カヌクレオチドに相補的ＤＮＡ配列を有するＤＮＡを認
識する際の高度の選択性を保証し、これによって、α−
およびβ−インターフェロンＤＮＡ認識のための高度の
選択性が保証される。用いたトリデカヌクレオチドに対
し相補性のＤＮＡ配列を有するハイブリドプラスミドを
含有する、これらの転換された細菌のコロニーはオート
ラジオグラフィーにより示される（図３をみよ）。
【００１７】このようにして、約１３，０００個の転換
された細菌コロニーより、トリデカヌクレオチドで開始
されたｃＤＮＡを有する、陽性シグナルを与えた１９０
クローンを分離した。つまり、ジーンバンク中のすべて
のクローンの約１％が特異的配列ｄＣＣＴＴＣＴＧＧＡ
ＡＣＴＧを含有する。
された細菌コロニーより、トリデカヌクレオチドで開始
されたｃＤＮＡを有する、陽性シグナルを与えた１９０
クローンを分離した。つまり、ジーンバンク中のすべて
のクローンの約１％が特異的配列ｄＣＣＴＴＣＴＧＧＡ
ＡＣＴＧを含有する。
【００１８】リコンビナントＤＮＡ分子中のインターフ
ェロン特異的核酸は、ＲＮＡトランスファーハイブリダ
イゼーション、ハイブリド分離、制限マッピングおよび
核酸配列の決定により同定する。生成するインターフェ
ロンポリペプチドの生物学的同定は、抗ウイルス活性の
測定により、インターフェロンの型は免疫学的方法で行
なう。
ェロン特異的核酸は、ＲＮＡトランスファーハイブリダ
イゼーション、ハイブリド分離、制限マッピングおよび
核酸配列の決定により同定する。生成するインターフェ
ロンポリペプチドの生物学的同定は、抗ウイルス活性の
測定により、インターフェロンの型は免疫学的方法で行
なう。
【００１９】このようにして分離されたインターフェロ
ン遺伝子は細菌中で発現される。しかし、酵母のような
他の生物でもよい。さらに、リボゾーム結合配列に組合
わせてプロモーターを挿入すると、自発的発現の約１０
4 倍に達する発現値をうることができる。それで、本発
明により、２つの類似する群の遺伝子、つまり２つの群
のＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βを１回だけの操作で分離
するという本発明の目的が達成され、そして、必要とす
るＲＮＡの分離のための出発材料としてＢ−淋巴球型の
細胞を選びそしてハイブリダイゼーション標品として用
いる、ｃＤＮＡのためのプライマーとしてインターフェ
ロン特異的のオリゴヌクレオチドを用いることにより、
これら２つの群の遺伝子がインターフェロンの生産に用
いるに適当であることを示し得た。
ン遺伝子は細菌中で発現される。しかし、酵母のような
他の生物でもよい。さらに、リボゾーム結合配列に組合
わせてプロモーターを挿入すると、自発的発現の約１０
4 倍に達する発現値をうることができる。それで、本発
明により、２つの類似する群の遺伝子、つまり２つの群
のＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βを１回だけの操作で分離
するという本発明の目的が達成され、そして、必要とす
るＲＮＡの分離のための出発材料としてＢ−淋巴球型の
細胞を選びそしてハイブリダイゼーション標品として用
いる、ｃＤＮＡのためのプライマーとしてインターフェ
ロン特異的のオリゴヌクレオチドを用いることにより、
これら２つの群の遺伝子がインターフェロンの生産に用
いるに適当であることを示し得た。
【００２０】
【実施例】つぎに実施例により本発明をより詳しく説明
する。 例 Ａ ヒトＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β−ｍＲＮＡを含有す
る、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ生産のための適当なセルストレ
インの選択 文献記載の方法によりインターフェロンを生産するよう
に、Ｓｅｎｄａｉウイルスで、種々のヒト細胞株を誘導
した。２４から４８時間後に、ある型に特異的の抗血清
で中和し、細胞上清のＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β含量
を測定した。試験したセルストレインのあるものに見出
だされるＩＦＮ−α対ＩＦＮ−βの割合は前記の表に示
されている。たとえば、Ｎａｍａｌｗａ細胞が、Ｓｅｎ
ｄａｉウイルス誘導後に、たとえば５０％より多くのＩ
ＦＮ−αを生産し、約５０％までのＩＦＮ−βを生産す
ることは明らかである。
する。 例 Ａ ヒトＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β−ｍＲＮＡを含有す
る、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ生産のための適当なセルストレ
インの選択 文献記載の方法によりインターフェロンを生産するよう
に、Ｓｅｎｄａｉウイルスで、種々のヒト細胞株を誘導
した。２４から４８時間後に、ある型に特異的の抗血清
で中和し、細胞上清のＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β含量
を測定した。試験したセルストレインのあるものに見出
だされるＩＦＮ−α対ＩＦＮ−βの割合は前記の表に示
されている。たとえば、Ｎａｍａｌｗａ細胞が、Ｓｅｎ
ｄａｉウイルス誘導後に、たとえば５０％より多くのＩ
ＦＮ−αを生産し、約５０％までのＩＦＮ−βを生産す
ることは明らかである。
【００２１】中和試験はつぎのように実施した。Ｓｅｎ
ｄａｉウイルスで誘導した細胞培養物の上清よりの約１
０インターフェロン単位を、つぎの材料と３７℃で６０
から９０分インキュベートした。 １． ＩＦＮ−αに対する抗血清；最終希釈１：１０
０；（ＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂｒａｎ
ｃｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ
Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄ
ｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ，ＵＳＡより
入手）。 ２． ヒトβ−ＩＦＮに対する抗血清；最終希釈１：３
００；（Ｄｒ．Ｙ．Ｈ．Ｔａｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｃａｌｇａｒｙ，Ｃａｎａｄａより入手）。 ３． １および２の混合物。 インキュベーションのあと、残留インターフェロン活性
はプラーク減少試験（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅ
ｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２，ｉｎｐｒｅｐａ
ｒａｔｉｏｎ（１９８２）をみよ）で測定した。
ｄａｉウイルスで誘導した細胞培養物の上清よりの約１
０インターフェロン単位を、つぎの材料と３７℃で６０
から９０分インキュベートした。 １． ＩＦＮ−αに対する抗血清；最終希釈１：１０
０；（ＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂｒａｎ
ｃｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ
Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄ
ｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ，ＵＳＡより
入手）。 ２． ヒトβ−ＩＦＮに対する抗血清；最終希釈１：３
００；（Ｄｒ．Ｙ．Ｈ．Ｔａｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｃａｌｇａｒｙ，Ｃａｎａｄａより入手）。 ３． １および２の混合物。 インキュベーションのあと、残留インターフェロン活性
はプラーク減少試験（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅ
ｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２，ｉｎｐｒｅｐａ
ｒａｔｉｏｎ（１９８２）をみよ）で測定した。
【００２２】例 Ｂ Ｓｅｎｄａｉウイルスで誘導したＮａｍａｌｗａ細胞か
らの、ヒトＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β−ｍＲＮＡ含有
ポリ（Ａ）+ ＲＮＡの調製 Ｎａｍａｌｗａ細胞の培養およびＳｅｎｄａｉウイルス
を用いる誘導は、文献既知の方法で実施した（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８
Ａ，６９−７５頁（１９８１），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｅｓｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋをみよ）。ｍＲＮＡ調製
の時点は誘導後９時間とした（６から１２時間）。この
理由は、この時間をすぎるとインターフェロン特異的ｍ
−ＲＮＡの割合が極大になるゆえである。
らの、ヒトＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β−ｍＲＮＡ含有
ポリ（Ａ）+ ＲＮＡの調製 Ｎａｍａｌｗａ細胞の培養およびＳｅｎｄａｉウイルス
を用いる誘導は、文献既知の方法で実施した（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８
Ａ，６９−７５頁（１９８１），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｅｓｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋをみよ）。ｍＲＮＡ調製
の時点は誘導後９時間とした（６から１２時間）。この
理由は、この時間をすぎるとインターフェロン特異的ｍ
−ＲＮＡの割合が極大になるゆえである。
【００２３】細胞は、１０００ｇで２０分遠心し、ＮＰ
−４０緩衝液（０．１４Ｍ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 ，１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）中
で１度洗い、０．５％の非イオン性洗浄剤ＮＰ−４０
（Ｓｈｅｌｌ製）および２ｍｇ／ｍｌのベントナイトを
含有するＮＰ−４０緩衝液中に懸濁させた。氷浴中５分
後に、上記のように遠心して細胞核を球粒とし、細胞質
（ＲＮＡ含有）分画（上清）を、フェノール−クロロホ
ルムで３度そしてクロロホルムで１度（２％ＳＤＳ，５
ｍＭのＥＤＴＡおよび５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ添加
後）抽出し、ＲＮＡをアルコールで沈殿させた。
−４０緩衝液（０．１４Ｍ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 ，１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）中
で１度洗い、０．５％の非イオン性洗浄剤ＮＰ−４０
（Ｓｈｅｌｌ製）および２ｍｇ／ｍｌのベントナイトを
含有するＮＰ−４０緩衝液中に懸濁させた。氷浴中５分
後に、上記のように遠心して細胞核を球粒とし、細胞質
（ＲＮＡ含有）分画（上清）を、フェノール−クロロホ
ルムで３度そしてクロロホルムで１度（２％ＳＤＳ，５
ｍＭのＥＤＴＡおよび５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ添加
後）抽出し、ＲＮＡをアルコールで沈殿させた。
【００２４】ポリ（Ａ）+ ＲＮＡは文献既知の方法で精
製した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ．６９，１４０８−１４１２（１９７２））。つま
り、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーに処
し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ中５−２０％スクロース勾配中で遠心し
（２５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で２０時間、Ｓｐｉｎｃｏ
ＳＷ２７ローター使用）分子の大きさに従って分け、
大きさで６Ｓ（沈降単位）から１８Ｓまでの分子を集め
た（簡単のために“１２Ｓ−ＲＮＡ”と称する）（図１
の左側をみよ）。
製した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ．６９，１４０８−１４１２（１９７２））。つま
り、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーに処
し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ中５−２０％スクロース勾配中で遠心し
（２５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で２０時間、Ｓｐｉｎｃｏ
ＳＷ２７ローター使用）分子の大きさに従って分け、
大きさで６Ｓ（沈降単位）から１８Ｓまでの分子を集め
た（簡単のために“１２Ｓ−ＲＮＡ”と称する）（図１
の左側をみよ）。
【００２５】インターフェロン−特異的ｍＲＮＡ（ＩＦ
Ｎ−αおよびＩＦＮ−β−ｍＲＮＡ）の含量は、“１２
Ｓ−ＲＮＡ”をＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓの卵細胞
にミクロ注入し（Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．およびＥｘｐｅ
ｒ．Ｍｏｒｐｈ．２０，４０１−４１４（１９６８）を
みよ）、そして卵細胞上清中のインターフェロン活性を
測定することで定量した。注入された“１２Ｓ−ＲＮ
Ａ”の１μｇは、インターフェロンスタンダード６９／
１９をもとにして、平均して、約１０００インターフェ
ロン国際単位（Ｉ．Ｕ．）のタイターを与えた。
Ｎ−αおよびＩＦＮ−β−ｍＲＮＡ）の含量は、“１２
Ｓ−ＲＮＡ”をＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓの卵細胞
にミクロ注入し（Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．およびＥｘｐｅ
ｒ．Ｍｏｒｐｈ．２０，４０１−４１４（１９６８）を
みよ）、そして卵細胞上清中のインターフェロン活性を
測定することで定量した。注入された“１２Ｓ−ＲＮ
Ａ”の１μｇは、インターフェロンスタンダード６９／
１９をもとにして、平均して、約１０００インターフェ
ロン国際単位（Ｉ．Ｕ．）のタイターを与えた。
【００２６】
【表２】
【００２７】つまり、活性の約８０％はα−型インター
フェロンに対する抗血清により中和することができた
が、活性全体は抗−αおよび抗−β−インターフェロン
抗血清によってはじめて中和することができた。
フェロンに対する抗血清により中和することができた
が、活性全体は抗−αおよび抗−β−インターフェロン
抗血清によってはじめて中和することができた。
【００２８】例 Ｃ Ｎａｍａｌｗａ−ｃＤＮＡクローンバンクの調製 ６から１８Ｓのあいだの分子の大きさのポリ（Ａ）+ Ｒ
ＮＡ（“１２Ｓ−ＲＮＡ”）（例Ｂをみよ）を、一本鎖
ｃＤＮＡ調製のためのマトリックスとして用いた。つま
り５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，１０ｍＭの
ＭｇＣｌ2 ，１００ｍＭのＫＣｌ，１ｍＭのｄＮＴＰ
ｓ，０．４ｍＭのＤＴＴ，４ｍＭのＮａピロホスフェー
ト、２０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）12-18 （ＰＬ−Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），２５μｇ／ｍｌのアクチノ
マイシンＤ中、４０μｇ／ｍｌのポリ（Ａ）+ ＲＮＡ
を、１００単位／ｍｌのＡＭＶ逆転写酵素（Ｄｒ．Ｊ．
Ｂｅａｒｄ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．１
５０９ １／２ ４９ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓｏｕｔ
ｈ，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，Ｆｌｏｒｉｄａ ３
３７０７、ＵＳＡ）と共に、４４−４５℃で４５分イン
キュベートした。ついで、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリドの
ＲＮＡ部分を０．３ＭのＮａＯＨ中５０℃で１時間イン
キュベートして除き、そのあと、一本鎖ｃＤＮＡを中和
し、エタノールで沈殿させた。
ＮＡ（“１２Ｓ−ＲＮＡ”）（例Ｂをみよ）を、一本鎖
ｃＤＮＡ調製のためのマトリックスとして用いた。つま
り５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，１０ｍＭの
ＭｇＣｌ2 ，１００ｍＭのＫＣｌ，１ｍＭのｄＮＴＰ
ｓ，０．４ｍＭのＤＴＴ，４ｍＭのＮａピロホスフェー
ト、２０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）12-18 （ＰＬ−Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），２５μｇ／ｍｌのアクチノ
マイシンＤ中、４０μｇ／ｍｌのポリ（Ａ）+ ＲＮＡ
を、１００単位／ｍｌのＡＭＶ逆転写酵素（Ｄｒ．Ｊ．
Ｂｅａｒｄ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．１
５０９ １／２ ４９ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓｏｕｔ
ｈ，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，Ｆｌｏｒｉｄａ ３
３７０７、ＵＳＡ）と共に、４４−４５℃で４５分イン
キュベートした。ついで、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリドの
ＲＮＡ部分を０．３ＭのＮａＯＨ中５０℃で１時間イン
キュベートして除き、そのあと、一本鎖ｃＤＮＡを中和
し、エタノールで沈殿させた。
【００２９】一本鎖ｃＤＮＡに相補的の第２のＤＮＡ鎖
はつぎの条件で合成した。０．１２Ｍのリン酸カリウム
緩衝液、ｐＨ６．９，１０ｍＭのＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭ
のＤＴＴ，１ｍＭのｄＮＴＰ中、３０μｇ／ｍｌの一本
鎖ｃＤＮＡを３００単位／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼＩ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｎ）とインキ
ュベートし、ついでフェノール抽出しエタノール沈殿さ
せた。
はつぎの条件で合成した。０．１２Ｍのリン酸カリウム
緩衝液、ｐＨ６．９，１０ｍＭのＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭ
のＤＴＴ，１ｍＭのｄＮＴＰ中、３０μｇ／ｍｌの一本
鎖ｃＤＮＡを３００単位／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼＩ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｎ）とインキ
ュベートし、ついでフェノール抽出しエタノール沈殿さ
せた。
【００３０】このようにして製造した二本鎖ｃＤＮＡ混
合物の鎖の両端を変型して、はみ出している一本鎖領域
を除いた。そのためには、０．３ＭのＮａＣｌ，３０ｍ
Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５，１ｍＭのＺｎＣｌ2
中で、上記のＤＮＡを、１２５０単位／ｍｌのＳｌ−ヌ
クレアーゼ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
と、３０分３７℃でインキュベートし、フェノール抽出
し、エタノール沈殿させた。このようにして生成した
“平滑末端化した”二本鎖ｃＤＮＡは、１０ｍＭの酢酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５および１ｍＭのＥＤＴＡ
中、５−２０％スクロース勾配で分けた。少なくとも６
００の塩基対を有する分画が分離された。
合物の鎖の両端を変型して、はみ出している一本鎖領域
を除いた。そのためには、０．３ＭのＮａＣｌ，３０ｍ
Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５，１ｍＭのＺｎＣｌ2
中で、上記のＤＮＡを、１２５０単位／ｍｌのＳｌ−ヌ
クレアーゼ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
と、３０分３７℃でインキュベートし、フェノール抽出
し、エタノール沈殿させた。このようにして生成した
“平滑末端化した”二本鎖ｃＤＮＡは、１０ｍＭの酢酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５および１ｍＭのＥＤＴＡ
中、５−２０％スクロース勾配で分けた。少なくとも６
００の塩基対を有する分画が分離された。
【００３１】このｃＤＮＡ混合物のうちの０．５μｇ
を、各鎖の３′末端にオリゴデオキシシチジンを付加さ
せることにより約１５ヌクレオチド分、延ばした。この
ためには、０．５μｇ分を、１４０ｍＭのカリウムカコ
ジレート、ｐＨ６．９，３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ６．９，２ｍＭのＣｏＣｌ2 ，０．１ｍＭのＤＴＴ，
０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび５μｍのｄＣＴＰ中
で、５００単位／ｍｌの末端トランスフェラーゼと３７
℃で４分インキュベートした。この段階で、リコンビナ
ント分子のひとつの成分を形成するｃＤＮＡが用意され
る（図１の左側をみよ）。
を、各鎖の３′末端にオリゴデオキシシチジンを付加さ
せることにより約１５ヌクレオチド分、延ばした。この
ためには、０．５μｇ分を、１４０ｍＭのカリウムカコ
ジレート、ｐＨ６．９，３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ６．９，２ｍＭのＣｏＣｌ2 ，０．１ｍＭのＤＴＴ，
０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび５μｍのｄＣＴＰ中
で、５００単位／ｍｌの末端トランスフェラーゼと３７
℃で４分インキュベートした。この段階で、リコンビナ
ント分子のひとつの成分を形成するｃＤＮＡが用意され
る（図１の左側をみよ）。
【００３２】第２の成分は、環状の二本鎖ＤＮＡ分子で
ある、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉプラスミドｐ
ＢＲ３２２である。２μｇ ｐＢＲ３２２を、制限エン
ドヌクレアーゼＰｓｔ Ｉで直線状とし、ｃＤＮＡ混合
物と同様にして、突出するオリゴデオキシグアニジン末
端を生ずるように、分子の３′末端にオリゴデオキシグ
アニジンを付加させて変型した（図１の右側をみよ）。
これらのオリゴデオキシグアニジン末端は、ｃＤＮＡ分
子の遊離オリゴデオキシシチジン末端と塩基対を形成し
て安定なＤＮＡ二本鎖領域を生じうる。それには、反応
のそれら２つの成分を、０．１ＭのＮａＣｌ，１ｍＭの
ＥＤＴＡ，２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８中で６５
℃で１０分、ついで４５℃で２．５時間そして３７℃で
１夜インキュベートする。
ある、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉプラスミドｐ
ＢＲ３２２である。２μｇ ｐＢＲ３２２を、制限エン
ドヌクレアーゼＰｓｔ Ｉで直線状とし、ｃＤＮＡ混合
物と同様にして、突出するオリゴデオキシグアニジン末
端を生ずるように、分子の３′末端にオリゴデオキシグ
アニジンを付加させて変型した（図１の右側をみよ）。
これらのオリゴデオキシグアニジン末端は、ｃＤＮＡ分
子の遊離オリゴデオキシシチジン末端と塩基対を形成し
て安定なＤＮＡ二本鎖領域を生じうる。それには、反応
のそれら２つの成分を、０．１ＭのＮａＣｌ，１ｍＭの
ＥＤＴＡ，２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８中で６５
℃で１０分、ついで４５℃で２．５時間そして３７℃で
１夜インキュベートする。
【００３３】この方法で、Ｐｓｔ Ｉ制限エンドヌクレ
アーゼによる切れ目を生じ、ひきつづいて、ベクターハ
イブリドよりｃＤＮＡ挿入物を切り出すのに利用しう
る。ｐＢＲ３２２およびＮａｍａｌｗａ−ｃＤＮＡより
この方法で生成されるハイブリドプラスミドを用い、文
献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ
６９，２１１０−２１１４（１９７２））記載の方法
で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を
形質転換する。このようにして、転換されたＥ． ｃｏ
ｌｉ細胞の３０，０００クローンが得られるので、ミク
ロタイタープレート中で個別に分けた。
アーゼによる切れ目を生じ、ひきつづいて、ベクターハ
イブリドよりｃＤＮＡ挿入物を切り出すのに利用しう
る。ｐＢＲ３２２およびＮａｍａｌｗａ−ｃＤＮＡより
この方法で生成されるハイブリドプラスミドを用い、文
献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ
６９，２１１０−２１１４（１９７２））記載の方法
で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を
形質転換する。このようにして、転換されたＥ． ｃｏ
ｌｉ細胞の３０，０００クローンが得られるので、ミク
ロタイタープレート中で個別に分けた。
【００３４】例 Ｄ 合成トリデカヌクレオチド５′ｄＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡ
ＣＴＧ３′を用いる、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βＤＮ
Ａ配列に関して特異的であるハイブリダイゼーション標
品の調製 本発明が対象としている、インターフェロン配列含有転
換Ｅ．ｃｏｌｉクローンを選択する方法は、配列５′ｄ
ＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧ３′を有する合成トリデカ
ヌクレオチドの使用を基礎としている。この配列は、Ｉ
ＦＮ−αの遺伝子の大部分とＩＦＮ−β遺伝子とのあい
だで相同性の、切れ目のない、もっとも長いＤＮＡ部分
である。このトリデカヌクレオチドの合成はすでに開示
されている。
ＣＴＧ３′を用いる、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βＤＮ
Ａ配列に関して特異的であるハイブリダイゼーション標
品の調製 本発明が対象としている、インターフェロン配列含有転
換Ｅ．ｃｏｌｉクローンを選択する方法は、配列５′ｄ
ＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧ３′を有する合成トリデカ
ヌクレオチドの使用を基礎としている。この配列は、Ｉ
ＦＮ−αの遺伝子の大部分とＩＦＮ−β遺伝子とのあい
だで相同性の、切れ目のない、もっとも長いＤＮＡ部分
である。このトリデカヌクレオチドの合成はすでに開示
されている。
【００３５】このトリデカヌクレオチドを、５０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ2 ，
５ｍＭのＤＴＴ，０．１ｍＭスペルミジン、１μｍの32
Ｐ−ＡＴＰ中、６０単位／ｍｌのＴ４−ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と、３７℃で３０分インキュ
ベートし、分子の５′末端において５００Ｃｉ／ｍモル
の比活性にラベルした。この末端ラベルトリデカヌクレ
オチドを（一本鎖）ｃＤＮＡ合成のプライマーとして用
いた。他方、Ｓｅｎｄａｉウイルスで誘導したＮａｍａ
ｌｗａ細胞からのポリ（Ａ）+ ＲＮＡ（例Ｂをみよ）を
マトリックスとして用いた。
トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ2 ，
５ｍＭのＤＴＴ，０．１ｍＭスペルミジン、１μｍの32
Ｐ−ＡＴＰ中、６０単位／ｍｌのＴ４−ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と、３７℃で３０分インキュ
ベートし、分子の５′末端において５００Ｃｉ／ｍモル
の比活性にラベルした。この末端ラベルトリデカヌクレ
オチドを（一本鎖）ｃＤＮＡ合成のプライマーとして用
いた。他方、Ｓｅｎｄａｉウイルスで誘導したＮａｍａ
ｌｗａ細胞からのポリ（Ａ）+ ＲＮＡ（例Ｂをみよ）を
マトリックスとして用いた。
【００３６】反応は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ
８．３，６０ｍＭのＫＣｌ，５ｍＭのＤＴＴ，５０μｇ
／ｍｌのアクチノマイシンＤ、４ｍＭのＭｇＣｌ2 ，４
ｍＭのピロリン酸ナトリウムおよび０．５ｍＭのｄＮＴ
Ｐｓ，中、ＲＮＡに対しプライマーを５から１０倍モル
過剰とし、１００単位／ｍｌのＡＭＶ逆転写酵素を用
い、３７℃で９０分反応させた。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブ
リドのＲＮＡ成分を除くために、５０℃で０．３ＭのＮ
ａＯＨ中で１時間インキュベートし、ついで０．３Ｍの
酢酸で中和したあと、ｃＤＮＡをハイブリダイゼーショ
ンの標品として用いうる。このプロセスを図２に模式的
に示す。それで、このように製造したｃＤＮＡは、イン
ターフェロンに特異的なトリデカヌクレオチドをプライ
マーとして合成した分子中のみに放射ラベルを担ってお
り、したがってハイブリダイゼーションにおいて、イン
ターフェロン−ＤＮＡ配列の認識に高い特異性を示す。
８．３，６０ｍＭのＫＣｌ，５ｍＭのＤＴＴ，５０μｇ
／ｍｌのアクチノマイシンＤ、４ｍＭのＭｇＣｌ2 ，４
ｍＭのピロリン酸ナトリウムおよび０．５ｍＭのｄＮＴ
Ｐｓ，中、ＲＮＡに対しプライマーを５から１０倍モル
過剰とし、１００単位／ｍｌのＡＭＶ逆転写酵素を用
い、３７℃で９０分反応させた。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブ
リドのＲＮＡ成分を除くために、５０℃で０．３ＭのＮ
ａＯＨ中で１時間インキュベートし、ついで０．３Ｍの
酢酸で中和したあと、ｃＤＮＡをハイブリダイゼーショ
ンの標品として用いうる。このプロセスを図２に模式的
に示す。それで、このように製造したｃＤＮＡは、イン
ターフェロンに特異的なトリデカヌクレオチドをプライ
マーとして合成した分子中のみに放射ラベルを担ってお
り、したがってハイブリダイゼーションにおいて、イン
ターフェロン−ＤＮＡ配列の認識に高い特異性を示す。
【００３７】例 Ｅ トリデカヌクレオチドをプライマーとしたｃＤＮＡを用
いるコロニーハイブリダイゼーション ここに記載する方法を用いて、トリデカヌクレオチドの
に相補性のＤＮＡ配列を有するハイブリドプラスミドを
含有する転換細菌クローンを認識する。そのためには、
それぞれにクローン化された形質転換菌の細胞を２２×
１５ｃｍのニトロセルローズフィルター（孔のサイズ
０．４５μｍ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅまたはＳｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）上に移し、フィルター
上で培養して直径２ｍｍのコロニーとし、文献記載の方
法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７２，３９６１−３９６５（１９７５）およびＡｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９８，６０
−６３（１９７９））によるコロニーハイブリダイゼー
ションに用いた。
いるコロニーハイブリダイゼーション ここに記載する方法を用いて、トリデカヌクレオチドの
に相補性のＤＮＡ配列を有するハイブリドプラスミドを
含有する転換細菌クローンを認識する。そのためには、
それぞれにクローン化された形質転換菌の細胞を２２×
１５ｃｍのニトロセルローズフィルター（孔のサイズ
０．４５μｍ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅまたはＳｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）上に移し、フィルター
上で培養して直径２ｍｍのコロニーとし、文献記載の方
法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７２，３９６１−３９６５（１９７５）およびＡｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９８，６０
−６３（１９７９））によるコロニーハイブリダイゼー
ションに用いた。
【００３８】末端ラベルｃＤＮＡ（例Ｄをみよ）を用い
る核酸ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミ
ド、４×ＳＥＴ（１×ＳＥＴ＝０．１５ＭのＮａＣｌ，
５ｍＭのＥＤＴＡ，５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ
８）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（０．０２％ＢＳＡ，
０．０２％ｆｉｃｏｌｌ，０．０２％ポリビニルピロリ
ドン）、０．５ｍｇ／ｍｌの変性し、せん断したさけの
精子ＤＮＡ、０．１％ナトリウムピロホスフェートおよ
び０．１％ＳＤＳ中、３７℃で４８時間インキュベート
して実施した。
る核酸ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミ
ド、４×ＳＥＴ（１×ＳＥＴ＝０．１５ＭのＮａＣｌ，
５ｍＭのＥＤＴＡ，５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ
８）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（０．０２％ＢＳＡ，
０．０２％ｆｉｃｏｌｌ，０．０２％ポリビニルピロリ
ドン）、０．５ｍｇ／ｍｌの変性し、せん断したさけの
精子ＤＮＡ、０．１％ナトリウムピロホスフェートおよ
び０．１％ＳＤＳ中、３７℃で４８時間インキュベート
して実施した。
【００３９】ついで、フィルターを、５０％ホルムアミ
ドおよび０．２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌおよび０．０１５Ｍのくえん酸ナトリウム）より
成立つ溶液中で２０から２５℃で洗い、ついで１×ＳＳ
Ｃの溶液を用いてすすいだ。このフィルターを２０から
２５℃で乾燥し、マイナス７０℃で、Ｘ−線フィルム
（Ｋｏｄａｋ ＸＲ）にさらした。図３は、このような
試験の代表的結果を示している。
ドおよび０．２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌおよび０．０１５Ｍのくえん酸ナトリウム）より
成立つ溶液中で２０から２５℃で洗い、ついで１×ＳＳ
Ｃの溶液を用いてすすいだ。このフィルターを２０から
２５℃で乾燥し、マイナス７０℃で、Ｘ−線フィルム
（Ｋｏｄａｋ ＸＲ）にさらした。図３は、このような
試験の代表的結果を示している。
【００４０】示した表面上で１５３６個の細菌コロニー
を培養し、コロニーハイブリダイゼーションでスクリー
ニングした。矢印は、放射活性標品のシグナルを与える
ハイブリドプラスミドＤＮＡを有する転換細菌クローン
を示す。全体で約１３，０００個の転換細菌コロニーを
スクリーニングし、トリデカヌクレオチドで開始され、
Ｓｅｎｄａｉウイルスで誘導されたＮａｍａｌｗａ細胞
より得られた、ｃＤＮＡの含有する陽性シグナルを与え
る１９０個のクローンが得られた。これらは２個のミク
ロタイタープレート（Ｐ１およびＰ２）上に捕集され
た。つまり、このクローンバンク上のすべてのクローン
の約１％が特異的配列ｄＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧを
含有していた。
を培養し、コロニーハイブリダイゼーションでスクリー
ニングした。矢印は、放射活性標品のシグナルを与える
ハイブリドプラスミドＤＮＡを有する転換細菌クローン
を示す。全体で約１３，０００個の転換細菌コロニーを
スクリーニングし、トリデカヌクレオチドで開始され、
Ｓｅｎｄａｉウイルスで誘導されたＮａｍａｌｗａ細胞
より得られた、ｃＤＮＡの含有する陽性シグナルを与え
る１９０個のクローンが得られた。これらは２個のミク
ロタイタープレート（Ｐ１およびＰ２）上に捕集され
た。つまり、このクローンバンク上のすべてのクローン
の約１％が特異的配列ｄＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧを
含有していた。
【００４１】例 Ｆ トリデカヌクレオチドをプライマーとしたｃＤＮＡでハ
イブリダイゼーションしたクローンの配列の複雑さの分
析 １９０個のトリデカヌクレオチド陽性クローン（例Ｅを
みよ）中の種々の配列（配列の複雑さ）のクローンの数
を測定するために、種々のクローンより、Ｐｓｔ Ｉ消
化（例Ｃをみよ）、０．８％アガロースゲル中での電気
泳動、望むバンドの溶出（つまり、バンドを含有するゲ
ルのフラグメントを沈殿させそして透析チューブ中でア
ガロースよりＤＮＡを電気泳動的に溶出する）により望
むバンドを溶出しそしてこれらのｃＤＮＡ挿入物を、文
献（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３，２３７−２５１
（１９７７））既知の方法を用い32Ｐを用いニックトラ
ンスレーション（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）
でラベルした。
イブリダイゼーションしたクローンの配列の複雑さの分
析 １９０個のトリデカヌクレオチド陽性クローン（例Ｅを
みよ）中の種々の配列（配列の複雑さ）のクローンの数
を測定するために、種々のクローンより、Ｐｓｔ Ｉ消
化（例Ｃをみよ）、０．８％アガロースゲル中での電気
泳動、望むバンドの溶出（つまり、バンドを含有するゲ
ルのフラグメントを沈殿させそして透析チューブ中でア
ガロースよりＤＮＡを電気泳動的に溶出する）により望
むバンドを溶出しそしてこれらのｃＤＮＡ挿入物を、文
献（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３，２３７−２５１
（１９７７））既知の方法を用い32Ｐを用いニックトラ
ンスレーション（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）
でラベルした。
【００４２】トリデカヌクレオチド陽性クローン（ミク
ロピペットプレートＰ１およびＰ２）およびランダムに
選んだミクロタイタープレート（Ｅ５２）のインプレッ
ションをニトロセルローズフィルターに移し、培養し、
コロニーハイブリダイゼーションの準備をし（例Ｅをみ
よ）そして種々の32Ｐ−ラベルｃＤＮＡ挿入物でハイブ
リダイゼーションした。ハイブリダイゼーションは例Ｅ
のように実施した。ただし、５０μｇ／ｍｌのポリ
（Ｕ）および１０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）
もまたハイブリダイゼーション溶液に加え、ハイブリダ
イゼーションのあと、フィルターは５０％ホルムアミド
および１×ＳＳＣで洗った。
ロピペットプレートＰ１およびＰ２）およびランダムに
選んだミクロタイタープレート（Ｅ５２）のインプレッ
ションをニトロセルローズフィルターに移し、培養し、
コロニーハイブリダイゼーションの準備をし（例Ｅをみ
よ）そして種々の32Ｐ−ラベルｃＤＮＡ挿入物でハイブ
リダイゼーションした。ハイブリダイゼーションは例Ｅ
のように実施した。ただし、５０μｇ／ｍｌのポリ
（Ｕ）および１０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）
もまたハイブリダイゼーション溶液に加え、ハイブリダ
イゼーションのあと、フィルターは５０％ホルムアミド
および１×ＳＳＣで洗った。
【００４３】クローンＰ１Ｈ１およびＰ２Ｈ１０の挿入
物を試料とした、そのような実験の結果を第４図に示
す。（Ｐ１Ｈ１はミクロタイタープレートＰ１上の位置
Ｈ１上のクローンで、Ｐ２Ｈ１０はミクロタイタープレ
ートＰ２上の位置Ｈ１０である）。クローンＰ１Ｈ１
は、プレートＰ１およびＰ２上のトリデカヌクレオチド
陽性クローンの９０％以上とハイブリダイゼーション
し、プレートＥ５２（図４、パートＡ）上のクローンの
いくらかとハイブリダイゼーションすることが分った。
物を試料とした、そのような実験の結果を第４図に示
す。（Ｐ１Ｈ１はミクロタイタープレートＰ１上の位置
Ｈ１上のクローンで、Ｐ２Ｈ１０はミクロタイタープレ
ートＰ２上の位置Ｈ１０である）。クローンＰ１Ｈ１
は、プレートＰ１およびＰ２上のトリデカヌクレオチド
陽性クローンの９０％以上とハイブリダイゼーション
し、プレートＥ５２（図４、パートＡ）上のクローンの
いくらかとハイブリダイゼーションすることが分った。
【００４４】これらのクローン配列の多くのものは、あ
とで制限分析により同定確認された。クローンＰ２Ｈ１
０は、それ自体とハイブリダイゼーションするのみでな
く、位置１Ｃ１２，１Ｆ１２，およびＥ５Ｅ１（図４、
パートＢ）中のクローンともハイブリダイゼーションし
た。クローンＰ１Ａ６およびＰ２Ｂ１０もこのように分
析されたが、それぞれ、それ自身とだけハイブリダイゼ
ーションした。（この結果は表４に示してない）。この
ことから、１９０個のトリデカヌクレオチド陽性クロー
ンのうち、恐らく、１０より少ない、質的に異なる配列
が存在すると推定しうる。そのような異なる配列の４個
は、Ｐ１Ｈ１，Ｐ２Ｈ１０，Ｐ１Ａ６およびＰ２Ｂ１０
である。
とで制限分析により同定確認された。クローンＰ２Ｈ１
０は、それ自体とハイブリダイゼーションするのみでな
く、位置１Ｃ１２，１Ｆ１２，およびＥ５Ｅ１（図４、
パートＢ）中のクローンともハイブリダイゼーションし
た。クローンＰ１Ａ６およびＰ２Ｂ１０もこのように分
析されたが、それぞれ、それ自身とだけハイブリダイゼ
ーションした。（この結果は表４に示してない）。この
ことから、１９０個のトリデカヌクレオチド陽性クロー
ンのうち、恐らく、１０より少ない、質的に異なる配列
が存在すると推定しうる。そのような異なる配列の４個
は、Ｐ１Ｈ１，Ｐ２Ｈ１０，Ｐ１Ａ６およびＰ２Ｂ１０
である。
【００４５】例 Ｇ ＲＮＡトランスファーハイブリダイゼーション 特定のトリデカヌクレオチド−陽性細菌クローンがイン
ターフェロン配列を含みうるかどうかをみるために、そ
のプラスミドＤＮＡが、ＳｅｎｄａｉウイルスによりＮ
ａｍａｌｗａ細胞中に誘導されたｍＲＮＡとハイブリダ
イゼーションするかどうかをみるための試験を行なっ
た。この目的には、例Ｂ記載のようにして、ポリ（Ａ）
+ ＲＮＡを誘導および非誘導Ｎａｍａｌｗａ細胞より分
離し、１Ｍグリオギザール、５０％ＤＭＳＯ，１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７中で５０℃で１時間イ
ンキュベートし、１．４％アガロースゲル上で分け、ニ
トロセルロースフィルターに移した。
ターフェロン配列を含みうるかどうかをみるために、そ
のプラスミドＤＮＡが、ＳｅｎｄａｉウイルスによりＮ
ａｍａｌｗａ細胞中に誘導されたｍＲＮＡとハイブリダ
イゼーションするかどうかをみるための試験を行なっ
た。この目的には、例Ｂ記載のようにして、ポリ（Ａ）
+ ＲＮＡを誘導および非誘導Ｎａｍａｌｗａ細胞より分
離し、１Ｍグリオギザール、５０％ＤＭＳＯ，１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７中で５０℃で１時間イ
ンキュベートし、１．４％アガロースゲル上で分け、ニ
トロセルロースフィルターに移した。
【００４６】それには文献既知の方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，５２０１−５２
０５（１９８０））を用いた。そして、ニックトランス
レーションにより32ＰでラベルしたプラスミドＤＮＡと
ハイブリダイゼーションさせた（例Ｆをみよ）。この試
験の方式では、誘導遺伝子に由来するプラスミドＤＮＡ
は、誘導細胞よりのＲＮＡとのみハイブリダイゼーショ
ンし、非誘導細胞由来のＲＮＡとはハイブリダイゼーシ
ョンしないであろう。
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，５２０１−５２
０５（１９８０））を用いた。そして、ニックトランス
レーションにより32ＰでラベルしたプラスミドＤＮＡと
ハイブリダイゼーションさせた（例Ｆをみよ）。この試
験の方式では、誘導遺伝子に由来するプラスミドＤＮＡ
は、誘導細胞よりのＲＮＡとのみハイブリダイゼーショ
ンし、非誘導細胞由来のＲＮＡとはハイブリダイゼーシ
ョンしないであろう。
【００４７】図５は、この種の実験のオートラジオグラ
フィーを示す。誘導されたＲＮＡ（“ｉ”）はそれぞれ
の場合について、対の左欄にあり、非誘導ＲＮＡ
（“ｎ”）は右欄にある。ハイブリダイゼーションに用
いたプラスミドＤＮＡは、Ｐ１Ｈ１（Ａ），Ｐ１Ｆ１２
（Ｂ，Ｄ），Ｐ２Ｈ１０（Ｃ），Ｐ１Ａ６（Ｅ），Ｐ２
Ｂ１０（Ｆ）である。試験したプラスミドのうち、Ｐ１
Ｆ１２，Ｐ２Ｈ１０およびＰ１Ａ６が誘導された細胞よ
りのＲＮＡとのみハイブリダイゼーションし、Ｐ１Ｈ１
およびＰ２Ｂ１０は、非誘導細胞からのＲＮＡとのシグ
ナルも生成した。
フィーを示す。誘導されたＲＮＡ（“ｉ”）はそれぞれ
の場合について、対の左欄にあり、非誘導ＲＮＡ
（“ｎ”）は右欄にある。ハイブリダイゼーションに用
いたプラスミドＤＮＡは、Ｐ１Ｈ１（Ａ），Ｐ１Ｆ１２
（Ｂ，Ｄ），Ｐ２Ｈ１０（Ｃ），Ｐ１Ａ６（Ｅ），Ｐ２
Ｂ１０（Ｆ）である。試験したプラスミドのうち、Ｐ１
Ｆ１２，Ｐ２Ｈ１０およびＰ１Ａ６が誘導された細胞よ
りのＲＮＡとのみハイブリダイゼーションし、Ｐ１Ｈ１
およびＰ２Ｂ１０は、非誘導細胞からのＲＮＡとのシグ
ナルも生成した。
【００４８】Ｐ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０とハイブリダ
イゼーションするＲＮＡの分子のサイズは、１１−１２
Ｓであり、Ｐ１Ａ６とハイブリダイゼーションするＲＮ
Ａのサイズは１２から１４Ｓである。これらの分子の大
きさは、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−αｍＲＮＡについて
文献に記載されている。それで、プラスミドＰ１Ｆ１
２，Ｐ２Ｈ１０およびＰ１Ａ６について、それらのイン
ターフェロン−ＤＮＡ配列含有を明確に定めるためにさ
らに調べてみた。
イゼーションするＲＮＡの分子のサイズは、１１−１２
Ｓであり、Ｐ１Ａ６とハイブリダイゼーションするＲＮ
Ａのサイズは１２から１４Ｓである。これらの分子の大
きさは、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−αｍＲＮＡについて
文献に記載されている。それで、プラスミドＰ１Ｆ１
２，Ｐ２Ｈ１０およびＰ１Ａ６について、それらのイン
ターフェロン−ＤＮＡ配列含有を明確に定めるためにさ
らに調べてみた。
【００４９】例 Ｈ ハイブリド−分離ＲＮＡの翻訳生成物についてのインタ
ーフェロン活性の生物学的検出 特定のハイブリドプラスミドがインターフェロン−ＤＮ
Ａ配列を含有するかどうかをみるために、生物学的試験
を基礎とする証明を、プラスミドＰ１Ｆ１２，Ｐ２Ｈ１
０，Ｐ１Ｈ１およびＰ２Ｂ１０について実施した。この
証明の原理はつぎのようである。試験しようとするプラ
スミドＤＮＡをニトロセルローズフィルター上に固定
し、ついで、ハイブリダイゼーションの条件で、誘導さ
れたＮａｍａｌｗａ細胞よりのポリ（Ａ）+ ＲＮＡ（例
Ｂをみよ）とインキュベートした。結合ＤＮＡがインタ
ーフェロン配列を含有するなら、インターフェロン−ｍ
ＲＮＡはそれとハイブリダイゼーションするであろう。
ーフェロン活性の生物学的検出 特定のハイブリドプラスミドがインターフェロン−ＤＮ
Ａ配列を含有するかどうかをみるために、生物学的試験
を基礎とする証明を、プラスミドＰ１Ｆ１２，Ｐ２Ｈ１
０，Ｐ１Ｈ１およびＰ２Ｂ１０について実施した。この
証明の原理はつぎのようである。試験しようとするプラ
スミドＤＮＡをニトロセルローズフィルター上に固定
し、ついで、ハイブリダイゼーションの条件で、誘導さ
れたＮａｍａｌｗａ細胞よりのポリ（Ａ）+ ＲＮＡ（例
Ｂをみよ）とインキュベートした。結合ＤＮＡがインタ
ーフェロン配列を含有するなら、インターフェロン−ｍ
ＲＮＡはそれとハイブリダイゼーションするであろう。
【００５０】ついで、ハイブリダイゼーションしてない
ＲＮＡは洗い去り、ハイブリダイゼーションしたＲＮＡ
をＤＮＡより溶融し去り、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉ
ｓの卵細胞に注入した。この卵細胞は、注入されたｍＲ
ＮＡを蛋白質に翻訳しうる（例Ｂをみよ）。ハイブリダ
イゼーションされたＲＮＡがインターフェロン−ｍＲＮ
Ａならば、インターフェロン蛋白質が卵細胞中に生成
し、その抗ウイルス性をプラック減少試験（例Ａをみ
よ）において証明しうる。
ＲＮＡは洗い去り、ハイブリダイゼーションしたＲＮＡ
をＤＮＡより溶融し去り、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉ
ｓの卵細胞に注入した。この卵細胞は、注入されたｍＲ
ＮＡを蛋白質に翻訳しうる（例Ｂをみよ）。ハイブリダ
イゼーションされたＲＮＡがインターフェロン−ｍＲＮ
Ａならば、インターフェロン蛋白質が卵細胞中に生成
し、その抗ウイルス性をプラック減少試験（例Ａをみ
よ）において証明しうる。
【００５１】詳しくは、試験をつぎのように実施する。
１０μｇの直線状したプラスミドＤＮＡを２００μｌの
０．５ＮのＮａＯＨで変性し、０．５Ｎ酢酸＋２０×Ｓ
ＥＴ（ＳＥＴの組成については例Ｅをみよ）の２００μ
ｌで中和し、ニトロセルロースフィルター（２．５ｃｍ
直径）上で濾過して固定する。フィルターは常温で乾燥
し、８０℃で２時間加熱し、５０％ホルムアミド、２０
ｍＭのＰＩＰＥＳ，ｐＨ６．５，０．４ＭのＮａＣｌ，
５ｍＭのＥＤＴＡ，１０％デキストランスルフェート、
１％ＳＤＳ，２０μｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ
および５０μｇ／ｍｌのポリ（Ａ）中、５３℃または３
７℃で１時間プレハイブリダイゼーションに処し、誘導
Ｎａｍａｌｗａポリ（Ａ）+ ＲＮＡの１４から４０μｇ
を加えたあと同じ緩衝液中で５時間ハイブリダイゼーシ
ョンした。
１０μｇの直線状したプラスミドＤＮＡを２００μｌの
０．５ＮのＮａＯＨで変性し、０．５Ｎ酢酸＋２０×Ｓ
ＥＴ（ＳＥＴの組成については例Ｅをみよ）の２００μ
ｌで中和し、ニトロセルロースフィルター（２．５ｃｍ
直径）上で濾過して固定する。フィルターは常温で乾燥
し、８０℃で２時間加熱し、５０％ホルムアミド、２０
ｍＭのＰＩＰＥＳ，ｐＨ６．５，０．４ＭのＮａＣｌ，
５ｍＭのＥＤＴＡ，１０％デキストランスルフェート、
１％ＳＤＳ，２０μｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ
および５０μｇ／ｍｌのポリ（Ａ）中、５３℃または３
７℃で１時間プレハイブリダイゼーションに処し、誘導
Ｎａｍａｌｗａポリ（Ａ）+ ＲＮＡの１４から４０μｇ
を加えたあと同じ緩衝液中で５時間ハイブリダイゼーシ
ョンした。
【００５２】ついで、０．２−１×ＳＥＴ，０．２％Ｓ
ＤＳ，１％デキストランスルフェート、５μｇ／ｍｌの
ｔＲＮＡ中で２５℃で２０分宛３度洗い、ついで、２ｍ
ＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，０．２％ＳＤＳ，１％デキ
ストランスルフェートおよび５μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ中
２５℃で１０分間宛２度、ついで２ｍＭのＥＤＴＡ，ｐ
Ｈ８．０，０．２％ＳＤＳおよび５μｇ／ｍｌのｔＲＮ
Ａ中で６０℃で５分間１度洗った。ハイブリダイゼーシ
ョンされたＲＮＡは、１ｍｌのＨ2 Ｏ＋１０μｇのｔＲ
ＮＡ中で１００℃で４分間溶出した。オリゴ（ｄＴ）セ
ルロースのカラム上のクロマトグラフィー（例Ｂをみ
よ）のあと、ＲＮＡはエタノールで沈殿させ、５μｌの
Ｈ2 Ｏに取り、Ｘｏｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵細胞に
注射した。常温で２日インキュベーションしたあと、卵
細胞の上清を採取し、プラーク減少試験でインターフェ
ロン活性をみた。
ＤＳ，１％デキストランスルフェート、５μｇ／ｍｌの
ｔＲＮＡ中で２５℃で２０分宛３度洗い、ついで、２ｍ
ＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，０．２％ＳＤＳ，１％デキ
ストランスルフェートおよび５μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ中
２５℃で１０分間宛２度、ついで２ｍＭのＥＤＴＡ，ｐ
Ｈ８．０，０．２％ＳＤＳおよび５μｇ／ｍｌのｔＲＮ
Ａ中で６０℃で５分間１度洗った。ハイブリダイゼーシ
ョンされたＲＮＡは、１ｍｌのＨ2 Ｏ＋１０μｇのｔＲ
ＮＡ中で１００℃で４分間溶出した。オリゴ（ｄＴ）セ
ルロースのカラム上のクロマトグラフィー（例Ｂをみ
よ）のあと、ＲＮＡはエタノールで沈殿させ、５μｌの
Ｈ2 Ｏに取り、Ｘｏｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵細胞に
注射した。常温で２日インキュベーションしたあと、卵
細胞の上清を採取し、プラーク減少試験でインターフェ
ロン活性をみた。
【００５３】この結果は、ＲＮＡトランスファーハイブ
リダイゼーション（例Ｇ）より明らかな仮定を確証し
た。つまり、クローンＰ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０はイ
ンターフェロン−ＤＮＡ挿入物を担うが、クローンＰ１
Ｈ１およびＰ２Ｂ１０は担わなかった。ＩＦＮ−αまた
はＩＦＮ−βに対する特異的抗血清で生ずるインターフ
ェロン活性を中和することにより（例Ａをみよ）、クロ
ーンＰ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０中の挿入物がＩＦＮ−
βＤＮＡ配列であることが示された。
リダイゼーション（例Ｇ）より明らかな仮定を確証し
た。つまり、クローンＰ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０はイ
ンターフェロン−ＤＮＡ挿入物を担うが、クローンＰ１
Ｈ１およびＰ２Ｂ１０は担わなかった。ＩＦＮ−αまた
はＩＦＮ−βに対する特異的抗血清で生ずるインターフ
ェロン活性を中和することにより（例Ａをみよ）、クロ
ーンＰ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０中の挿入物がＩＦＮ−
βＤＮＡ配列であることが示された。
【００５４】
【表３】
【００５５】例 １ ＩＦＮ−β型のクローンの制限および配列分析 クローンＰ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０中のｃＤＮＡ挿入
物を制限エンドヌクレアーゼを用いて調べ、酵素Ｂａｍ
ＨＩ、Ｂｇ １ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎ ｄ
ＩＩＩ、Ｐｓｔ ＩおよびＰｖｕ ＩＩによる切れ目の
存在および可能な位置を決定した。Ｐ１Ｆ２およびＰ２
Ｈ１０の制限マップと文献記載のＩＦＮ−β遺伝子（Ｇ
ｅｎｅ １０、１１−１５（１９８０））との比較を図
６に示した。
物を制限エンドヌクレアーゼを用いて調べ、酵素Ｂａｍ
ＨＩ、Ｂｇ １ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎ ｄ
ＩＩＩ、Ｐｓｔ ＩおよびＰｖｕ ＩＩによる切れ目の
存在および可能な位置を決定した。Ｐ１Ｆ２およびＰ２
Ｈ１０の制限マップと文献記載のＩＦＮ−β遺伝子（Ｇ
ｅｎｅ １０、１１−１５（１９８０））との比較を図
６に示した。
【００５６】３個のクローンのすべてがＰｖｕ ＩＩ、
Ｐｓｔ ＩおよびＢｇ １ ＩＩにより切断され、それ
ぞれの切れ目のあいだの距離はそれぞれのクローンにつ
いて同じであった。クローンＰ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１
０中への挿入物がＩＦＮ−β遺伝子と同一であることの
最終的な証明として、ＤＮＡ配列の部分（Ｐｖｕ ＩＩ
およびＢｇ １ ＩＩの切れ目の“右側”（３′））を
ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ １．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４，５６０−５
６４（１９７７））を用いて同定し、報告されたＩＦＮ
−βの配列と比較した。Ｐ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０の
配列はＩＦＮ−β遺伝子に正確に同じであった。それら
は図７に示す。
Ｐｓｔ ＩおよびＢｇ １ ＩＩにより切断され、それ
ぞれの切れ目のあいだの距離はそれぞれのクローンにつ
いて同じであった。クローンＰ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１
０中への挿入物がＩＦＮ−β遺伝子と同一であることの
最終的な証明として、ＤＮＡ配列の部分（Ｐｖｕ ＩＩ
およびＢｇ １ ＩＩの切れ目の“右側”（３′））を
ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ １．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４，５６０−５
６４（１９７７））を用いて同定し、報告されたＩＦＮ
−βの配列と比較した。Ｐ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０の
配列はＩＦＮ−β遺伝子に正確に同じであった。それら
は図７に示す。
【００５７】いずれのクローンも５′末端において完全
なＩＦＮ−β配列を有していなかった。それらは、それ
ぞれ完成蛋白質をコードする約６０ヌクレオチド領域を
欠如する。３′末端において、Ｐ１Ｆ１２は完全で、Ｐ
２Ｈ１０はさらに、ポリ（Ａ）ＲＮＡ由来のポリ（ｄ
Ａ）を含む、ＩＦＮ−βｃＤＮＡの３′領域全体を含有
する。しかし、Ｐ２Ｈ１０はさらに著しく伸びる（１４
００塩基対）。つまりポリ（ｄＡ）より３′に、オリゴ
（ｄＣ）配列の部分があり、ついで、由来の分らない配
列がある。Ｐ２Ｈ１０のこの追加領域の種々のフラグメ
ントのＤＮＡ配列を分析してみると、それらは、ＩＦＮ
−β遺伝子と相同でない。
なＩＦＮ−β配列を有していなかった。それらは、それ
ぞれ完成蛋白質をコードする約６０ヌクレオチド領域を
欠如する。３′末端において、Ｐ１Ｆ１２は完全で、Ｐ
２Ｈ１０はさらに、ポリ（Ａ）ＲＮＡ由来のポリ（ｄ
Ａ）を含む、ＩＦＮ−βｃＤＮＡの３′領域全体を含有
する。しかし、Ｐ２Ｈ１０はさらに著しく伸びる（１４
００塩基対）。つまりポリ（ｄＡ）より３′に、オリゴ
（ｄＣ）配列の部分があり、ついで、由来の分らない配
列がある。Ｐ２Ｈ１０のこの追加領域の種々のフラグメ
ントのＤＮＡ配列を分析してみると、それらは、ＩＦＮ
−β遺伝子と相同でない。
【００５８】さらに、クローンＰ２Ｈ１０とクロス−ハ
イブリダイゼイションするクローンＰ１Ｃ１２およびＥ
５２Ｅ１（例Ｆ記載）は、Ｐ２Ｈ１０のそのような追加
の領域と正確にハイブリダイゼーションし、ＩＦＮ−β
部分とはハイブリダイゼーションしないことが分った。
イブリダイゼイションするクローンＰ１Ｃ１２およびＥ
５２Ｅ１（例Ｆ記載）は、Ｐ２Ｈ１０のそのような追加
の領域と正確にハイブリダイゼーションし、ＩＦＮ−β
部分とはハイブリダイゼーションしないことが分った。
【００５９】例 Ｊ ＩＦＮ−α−型クローンＰ１Ａ６の分析 クローンＰ１Ａ６は、１２−１４Ｓの領域（例Ｇ記載）
でウイルス−誘導Ｎａｍａｌｗａ ＲＮＡとハイブリダ
イゼーションする。それは、約９００塩基対のｃＤＮＡ
挿入物を含有し、制限分析の示すように、酵素Ｂａｍ
ＨＩ、Ｂｇ １ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎ ｄ ＩＩ
Ｉ、Ｐｓｔ ＩおよびＰｖｕ ＩＩに対する切れ目を有
していない（図６をみよ）。
でウイルス−誘導Ｎａｍａｌｗａ ＲＮＡとハイブリダ
イゼーションする。それは、約９００塩基対のｃＤＮＡ
挿入物を含有し、制限分析の示すように、酵素Ｂａｍ
ＨＩ、Ｂｇ １ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎ ｄ ＩＩ
Ｉ、Ｐｓｔ ＩおよびＰｖｕ ＩＩに対する切れ目を有
していない（図６をみよ）。
【００６０】クローンＰ１Ａ６がＩＦＮ−α配列を有す
ることの証明は、ふたたび、ＤＮＡ配列分析で与えられ
た。Ｐ１Ａ６のｃＤＮＡ挿入物の配列は、挿入物に隣接
するＰｓｔ Ｉ切れ目より内部に向けて決定され、Ｇｏ
ｅｄｄｅｌ等の記載したＩＦＮ−α配列と比較された
（Ｎａｔｕｒｅ２９０、２０−２６（１９８１））。ク
ローンＰ１Ａ６はＬｅＩＦＮ Ｃの変種であるが、４９
塩基対短かいことが分った。Ｐ１Ａ６の３′末端でのポ
リ（Ａ）配列の存在は、クローンＰ１Ａ６が、報告され
ているクローンＬｅＩＦＮ Ｃより短かいｍＲＮＡに由
来することを示す。ＬｅＩＦＮ Ｃ蛋白質をコードする
領域の全体が存在する。
ることの証明は、ふたたび、ＤＮＡ配列分析で与えられ
た。Ｐ１Ａ６のｃＤＮＡ挿入物の配列は、挿入物に隣接
するＰｓｔ Ｉ切れ目より内部に向けて決定され、Ｇｏ
ｅｄｄｅｌ等の記載したＩＦＮ−α配列と比較された
（Ｎａｔｕｒｅ２９０、２０−２６（１９８１））。ク
ローンＰ１Ａ６はＬｅＩＦＮ Ｃの変種であるが、４９
塩基対短かいことが分った。Ｐ１Ａ６の３′末端でのポ
リ（Ａ）配列の存在は、クローンＰ１Ａ６が、報告され
ているクローンＬｅＩＦＮ Ｃより短かいｍＲＮＡに由
来することを示す。ＬｅＩＦＮ Ｃ蛋白質をコードする
領域の全体が存在する。
【００６１】例 Ｋ 別のＩＦＮ−α−型クローン（１Ｆ７）の同定および分
析 クローンＰ１Ａ６は、１９０個のトリデカヌクレオチド
の陽性クローンより同定されたただひとつのＩＦＮ−α
−型クローンであった（例Ｅをみよ）。さらにＩＦＮ−
α−型クローンを見出だすために、もとのｃＤＮＡクロ
ーンバンク（例Ｃ）よりの１８００個のクローンを、コ
ロニーハイブリダイゼーション（例Ｆ記載）によりクロ
ーンＰ１Ａ６のｃＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ
た。もうひとつのＩＦＮ−αクローン（クローン１Ｆ
７）はこのようにして見出だされた。
析 クローンＰ１Ａ６は、１９０個のトリデカヌクレオチド
の陽性クローンより同定されたただひとつのＩＦＮ−α
−型クローンであった（例Ｅをみよ）。さらにＩＦＮ−
α−型クローンを見出だすために、もとのｃＤＮＡクロ
ーンバンク（例Ｃ）よりの１８００個のクローンを、コ
ロニーハイブリダイゼーション（例Ｆ記載）によりクロ
ーンＰ１Ａ６のｃＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ
た。もうひとつのＩＦＮ−αクローン（クローン１Ｆ
７）はこのようにして見出だされた。
【００６２】１Ｆ７のｃＤＮＡ挿入物の制限分析および
部分的ＤＮＡ配列の決定は、１Ｆ７がクローン型ＬｅＩ
ＦＮ Ａ（Ｇｏｅｄｄｅｌ等、上記引用文献）の変型で
あるが、１７５塩基対長いことを示した。ＬｅＩＦＮ
Ａと同様に、１Ｆ７は、酵素Ｂｇ１ ＩＩおよびＰｖｕ
ＩＩのそれぞれに対して２個の切断点を有し（図
６）；挿入物の５′および３′末端に見出だされるＤＮ
Ａ配列は図８に示してある。
部分的ＤＮＡ配列の決定は、１Ｆ７がクローン型ＬｅＩ
ＦＮ Ａ（Ｇｏｅｄｄｅｌ等、上記引用文献）の変型で
あるが、１７５塩基対長いことを示した。ＬｅＩＦＮ
Ａと同様に、１Ｆ７は、酵素Ｂｇ１ ＩＩおよびＰｖｕ
ＩＩのそれぞれに対して２個の切断点を有し（図
６）；挿入物の５′および３′末端に見出だされるＤＮ
Ａ配列は図８に示してある。
【００６３】さらに、ＩＦＮ−α−クローン（１Ｆ７）
のＤＮＡ−配列の諸部分は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−プラ
イマーを用い、ジデオキシ法で分析した（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ等、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｄ Ｒｅｓ．９、３０９（１９
８１）およびＧａｒｄｎｅｒ、Ｒ．Ｃ．等、Ｎｕｃ．Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓ．９、２８７１（１９８１）をみよ）。
１２０から３２７までの位置について、つぎの部分配列
が示された。
のＤＮＡ−配列の諸部分は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−プラ
イマーを用い、ジデオキシ法で分析した（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ等、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｄ Ｒｅｓ．９、３０９（１９
８１）およびＧａｒｄｎｅｒ、Ｒ．Ｃ．等、Ｎｕｃ．Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓ．９、２８７１（１９８１）をみよ）。
１２０から３２７までの位置について、つぎの部分配列
が示された。
【化３】
【００６４】ＩＦＮ−αＡ型の既知の配列（Ｄ．Ｖ．Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ等、Ｎａｔｕｒｅ２９０．２０（１９８
１））に比して、ＩＦＮ−α−型クローン（１Ｆ７）の
新しいＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の１２０から３２７ま
での位置において、つぎの差を示す。つまり、１３７お
よび１７０において、ヌクレオチドＡはヌクレオチドＧ
に代わっている。
ｏｅｄｄｅｌ等、Ｎａｔｕｒｅ２９０．２０（１９８
１））に比して、ＩＦＮ−α−型クローン（１Ｆ７）の
新しいＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の１２０から３２７ま
での位置において、つぎの差を示す。つまり、１３７お
よび１７０において、ヌクレオチドＡはヌクレオチドＧ
に代わっている。
【００６５】クローン１Ｆ７のＤＮＡ配列の残りの位置
はまた、開示されている標準方法（Ｍｅｓｓｉｎｇ等お
よびＧａｒｄｎｅｒ等の上記刊行物）によって、通常的
に決定された。これによって、１Ｆ７は３′および５′
末端にリーダー配列および非翻訳フランキング配列をさ
らに含有する、αタイプの成熟インタフェロンの完全配
列をコードするクローンであることが証明された。３′
末端の非コード領域はＧｏｅｄｄｅｌ上記文献からのＩ
ＦＡ−αＡに係る相当する配列よりも１６２ｂｐ長い。
はまた、開示されている標準方法（Ｍｅｓｓｉｎｇ等お
よびＧａｒｄｎｅｒ等の上記刊行物）によって、通常的
に決定された。これによって、１Ｆ７は３′および５′
末端にリーダー配列および非翻訳フランキング配列をさ
らに含有する、αタイプの成熟インタフェロンの完全配
列をコードするクローンであることが証明された。３′
末端の非コード領域はＧｏｅｄｄｅｌ上記文献からのＩ
ＦＡ−αＡに係る相当する配列よりも１６２ｂｐ長い。
【００６６】したがって、公知成熟ＩＦＮ−αＡの配
列、クローン１Ｆ７から誘導された配列、および一般的
遺伝子コードから、クローン１Ｆ７から得られた成熟イ
ンタフェロンのタンパク質構造は下記の通りである：
列、クローン１Ｆ７から誘導された配列、および一般的
遺伝子コードから、クローン１Ｆ７から得られた成熟イ
ンタフェロンのタンパク質構造は下記の通りである：
【化４】
【００６７】上記配列から明らかなように、２３位に、
ＬｅＩＦＮ−αＡはリジンを有するのに対し、クローン
１Ｆ７からのインタフェロンはアルギニンを有する。さ
らに、３４位に係り、ＬｅＩＦＮ−αＡはヒスチジンを
有するのに対し、クローン１Ｆ７から誘導されたインタ
フェロン−αはアルギニンを有する。したがって、この
クローン１Ｆ７から誘導されたインタフェロンをＩＦＮ
−α２（Ａｒｇ）と命名した。
ＬｅＩＦＮ−αＡはリジンを有するのに対し、クローン
１Ｆ７からのインタフェロンはアルギニンを有する。さ
らに、３４位に係り、ＬｅＩＦＮ−αＡはヒスチジンを
有するのに対し、クローン１Ｆ７から誘導されたインタ
フェロン−αはアルギニンを有する。したがって、この
クローン１Ｆ７から誘導されたインタフェロンをＩＦＮ
−α２（Ａｒｇ）と命名した。
【００６８】例 Ｌ ハイブリドプラスミド１Ｆ７で転換されたＥ．ｃｏｌ：
ＨＢ１０１融解物におけるインターフェロン活性 Ｐ１Ａ６または１Ｆ７で転換された細菌培養物の融解物
について、それらの中の生物活性インターフェロン含量
を調べた。それには、細菌培養物の１００ｍｌをＬブロ
ス中で培養し、０．６から０．８の光学密度とし、７０
００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分遠心して球粒とし、５０ｍＭ
のトリスＨＣｌ ｐＨ８中で洗い、ついで３０ｍＭのＮ
ａＣｌ中で洗い、同じ緩衝液１．５ｍｌ中に最終的に懸
濁させた。
ＨＢ１０１融解物におけるインターフェロン活性 Ｐ１Ａ６または１Ｆ７で転換された細菌培養物の融解物
について、それらの中の生物活性インターフェロン含量
を調べた。それには、細菌培養物の１００ｍｌをＬブロ
ス中で培養し、０．６から０．８の光学密度とし、７０
００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分遠心して球粒とし、５０ｍＭ
のトリスＨＣｌ ｐＨ８中で洗い、ついで３０ｍＭのＮ
ａＣｌ中で洗い、同じ緩衝液１．５ｍｌ中に最終的に懸
濁させた。
【００６９】１ｍｇ／ｍｌのリゾチームと３０分氷上で
インキュベートしたあとで、細菌の凍結融解を５度反復
し４０，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１時間遠心して細胞フラ
グメントを除いた。上清は濾過して無菌とし、プラック
減少試験でインターフェロンを試験した。このようにし
て得られたクローン１Ｆ７の融解物中に約５００単位／
ｍｌのインターフェロンを検出することができた。この
試験でクローン１Ａ６はなんらの活性を示さず、これは
恐らくプラスミドベクター中の挿入物の配向の異なるこ
とによるものであろう。
インキュベートしたあとで、細菌の凍結融解を５度反復
し４０，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１時間遠心して細胞フラ
グメントを除いた。上清は濾過して無菌とし、プラック
減少試験でインターフェロンを試験した。このようにし
て得られたクローン１Ｆ７の融解物中に約５００単位／
ｍｌのインターフェロンを検出することができた。この
試験でクローン１Ａ６はなんらの活性を示さず、これは
恐らくプラスミドベクター中の挿入物の配向の異なるこ
とによるものであろう。
【００７０】例 Ｍ １Ｆ７によりコードされる型のインターフェロンの発現
の改良 遺伝子を良好に発現するためには、ＤＮＡについて３つ
の条件を満さねばならない。第１に、遺伝子の前にプロ
モーター（ＲＮＡ−ポリメラーゼの結合場所）が存在せ
ねばならない。第２に、翻訳の開始コドンの前方におい
て読まれるＲＮＡはリボゾーム結合配列（ＲＢＳ）を担
わねばならない。第３に、ＲＢＳと開始コドンとのあい
だの距離は適当とせねばならない。
の改良 遺伝子を良好に発現するためには、ＤＮＡについて３つ
の条件を満さねばならない。第１に、遺伝子の前にプロ
モーター（ＲＮＡ−ポリメラーゼの結合場所）が存在せ
ねばならない。第２に、翻訳の開始コドンの前方におい
て読まれるＲＮＡはリボゾーム結合配列（ＲＢＳ）を担
わねばならない。第３に、ＲＢＳと開始コドンとのあい
だの距離は適当とせねばならない。
【００７１】１Ｆ７によりコードされるインターフェロ
ンを発現するために用いるプロモーター配列は、文献
（Ｎａｔｕｒｅ２７６、６８４−６８９（１９７８））
記載のＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのトリ
プトファンオペロンのプロモーターとした。そして用い
たＲＢＳは、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ７８，５５４３−５５４８（１９８
１））記載のＤＮＡ配列である。
ンを発現するために用いるプロモーター配列は、文献
（Ｎａｔｕｒｅ２７６、６８４−６８９（１９７８））
記載のＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのトリ
プトファンオペロンのプロモーターとした。そして用い
たＲＢＳは、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ７８，５５４３−５５４８（１９８
１））記載のＤＮＡ配列である。
【００７２】ＲＢＳと１Ｆ７の開始コドンの至適距離を
定めるために、つぎの工夫をした。二本鎖ＤＮＡに特異
的のエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１で１Ｆ７−ｃＤＮＡ
を短時間消化し、種々の長さの分子の混合物とした。つ
いでこれらの分子は、合成リンカー配列を適当な方法で
連結させて“発現プラスミド”、つまりプロモーターお
よびＲＢＳの両方を含有するプラスミドとした。Ｅ．ｃ
ｏｌ：ＨＢ１０１をこれらのプラスミドを用いて転換
し、転換物のそれぞれについてインターフェロン生産を
みた。
定めるために、つぎの工夫をした。二本鎖ＤＮＡに特異
的のエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１で１Ｆ７−ｃＤＮＡ
を短時間消化し、種々の長さの分子の混合物とした。つ
いでこれらの分子は、合成リンカー配列を適当な方法で
連結させて“発現プラスミド”、つまりプロモーターお
よびＲＢＳの両方を含有するプラスミドとした。Ｅ．ｃ
ｏｌ：ＨＢ１０１をこれらのプラスミドを用いて転換
し、転換物のそれぞれについてインターフェロン生産を
みた。
【００７３】詳細には、試験はつぎのように実施した。
０．５から１μｇの１Ｆ７挿入物を、２０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ．ｐＨ８．１、０．６ＭのＮａＣｌ、１２ｍＭのＭ
ｇＣｌ2 、１２ｍＭのＣａＣｌ2 および１ｍＭのＥＤＴ
Ａの１００μｌ中で３０℃で３分間、０．５単位のＢＡ
Ｌ３１（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベートした。ついで、
３００μｌの１５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８を加えて
反応を止め、反応混合物を６５℃で１０分加熱し、フェ
ノールおよびエーテル抽出し、エタノールで沈殿させ
た。
０．５から１μｇの１Ｆ７挿入物を、２０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ．ｐＨ８．１、０．６ＭのＮａＣｌ、１２ｍＭのＭ
ｇＣｌ2 、１２ｍＭのＣａＣｌ2 および１ｍＭのＥＤＴ
Ａの１００μｌ中で３０℃で３分間、０．５単位のＢＡ
Ｌ３１（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベートした。ついで、
３００μｌの１５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８を加えて
反応を止め、反応混合物を６５℃で１０分加熱し、フェ
ノールおよびエーテル抽出し、エタノールで沈殿させ
た。
【００７４】この沈殿を、７０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ
７．５、７ｍＭのＭｇＣｌ2 、１ｍＭのＤＴＴ、０．４
ｍＭのＡＴＰの１０μｌ中に取り、３０から６０ｐモル
のリン酸化Ｈｉｎｄ ＩＩＩリンカー（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
加え、０．５から１単位のＴ４リガーゼ（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
と共に１４℃で１夜インキュベートした。６５℃に１０
分加熱して反応を止め、２ＭのＮＨ4 アセテートを加
え、インターフェロン遺伝子より非連結リンカーを除く
ために０．６容量のイソプロパノールで沈殿させた。
７．５、７ｍＭのＭｇＣｌ2 、１ｍＭのＤＴＴ、０．４
ｍＭのＡＴＰの１０μｌ中に取り、３０から６０ｐモル
のリン酸化Ｈｉｎｄ ＩＩＩリンカー（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
加え、０．５から１単位のＴ４リガーゼ（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
と共に１４℃で１夜インキュベートした。６５℃に１０
分加熱して反応を止め、２ＭのＮＨ4 アセテートを加
え、インターフェロン遺伝子より非連結リンカーを除く
ために０．６容量のイソプロパノールで沈殿させた。
【００７５】この沈殿を、３３ｍＭのトリスアセテー
ト、ｐＨ７．９、６６ｍＭのカリウムアセテート、１０
ｍＭのマグネシウムアセテートおよび１００μｇ／ｍｌ
のＢＳＡの３０から５０μｌに溶解し、３０から５０単
位のＨｉｎｄ ＩＩＩで２から３時間消化した。６５℃
に１０分加熱して反応を止め２Ｍの酢酸アンモニウムを
加えたあとで、０．６容量のイソプロパノールでインタ
ーフェロン遺伝子を沈殿させた。
ト、ｐＨ７．９、６６ｍＭのカリウムアセテート、１０
ｍＭのマグネシウムアセテートおよび１００μｇ／ｍｌ
のＢＳＡの３０から５０μｌに溶解し、３０から５０単
位のＨｉｎｄ ＩＩＩで２から３時間消化した。６５℃
に１０分加熱して反応を止め２Ｍの酢酸アンモニウムを
加えたあとで、０．６容量のイソプロパノールでインタ
ーフェロン遺伝子を沈殿させた。
【００７６】この沈殿を７０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ
７．５、７ｍＭのＭｇＣｌ2 、１ｍのＤＴＴおよび０．
５ｍのＡＴＰの１０μｌ中に溶解し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
−直線化、ホスファターゼ処理発現プラスミドｐＥＲ１
０３の０．２μｇと、１０-2単位のＴ４リガーゼを用い
て１４℃で１夜処理した。ｐＥＲ１０３は、Ｓ．ｍａｒ
ｃｅｓ ｃｅｎｓのトリプトファンオペロンのプロモー
ター配列および上記の文献より知られるＲＢＳを含有す
る。ｐＢＲ３２２誘導体である。これは、ＲＢＳの付近
でＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて直線状となしうる。このよ
うにして得られたプラスミドをＥ．ｃｏｌ：ＨＢ１０１
の転換に用い、個々の転換物のインターフェロン生産
は、例Ｌ記載と同様にして調べた。自発的発現に比し
て、インターフェロンの発現は約１０4 倍となった。
７．５、７ｍＭのＭｇＣｌ2 、１ｍのＤＴＴおよび０．
５ｍのＡＴＰの１０μｌ中に溶解し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
−直線化、ホスファターゼ処理発現プラスミドｐＥＲ１
０３の０．２μｇと、１０-2単位のＴ４リガーゼを用い
て１４℃で１夜処理した。ｐＥＲ１０３は、Ｓ．ｍａｒ
ｃｅｓ ｃｅｎｓのトリプトファンオペロンのプロモー
ター配列および上記の文献より知られるＲＢＳを含有す
る。ｐＢＲ３２２誘導体である。これは、ＲＢＳの付近
でＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて直線状となしうる。このよ
うにして得られたプラスミドをＥ．ｃｏｌ：ＨＢ１０１
の転換に用い、個々の転換物のインターフェロン生産
は、例Ｌ記載と同様にして調べた。自発的発現に比し
て、インターフェロンの発現は約１０4 倍となった。
【００７７】上記した性質は、本発明により製造される
リコンビナントＤＮＡ−分子が、α−またはβ−インタ
ーフェロンをコードする配列を含有することを示す。本
発明に準じ得られるプラスミドのうちのひとつは、イン
ターフェロンαを発現することが示されている。
リコンビナントＤＮＡ−分子が、α−またはβ−インタ
ーフェロンをコードする配列を含有することを示す。本
発明に準じ得られるプラスミドのうちのひとつは、イン
ターフェロンαを発現することが示されている。
【００７８】つぎに示す微生物およびリコンビナントＤ
ＮＡ分子は、１９８２年５月１７日に“Ｄｅｕｔｓｃｈ
ｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ ＭｉＲｒｏ−Ｏｒｇａ
ｎｉｓｍｅｎ、Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒａｓｓｅ
８、３４００ Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ”に寄託され、つ
ぎのＤＳＭ番号を受けている。２３６２（１Ｆ７）、２
３６３（Ｐ１Ａ６）、２３６４（Ｐ１Ｆ１２）および２
３６５（Ｐ２Ｈ１０）これらはＢｕｄａｐｅｓｔ協約に
より入手しうる。
ＮＡ分子は、１９８２年５月１７日に“Ｄｅｕｔｓｃｈ
ｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ ＭｉＲｒｏ−Ｏｒｇａ
ｎｉｓｍｅｎ、Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒａｓｓｅ
８、３４００ Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ”に寄託され、つ
ぎのＤＳＭ番号を受けている。２３６２（１Ｆ７）、２
３６３（Ｐ１Ａ６）、２３６４（Ｐ１Ｆ１２）および２
３６５（Ｐ２Ｈ１０）これらはＢｕｄａｐｅｓｔ協約に
より入手しうる。
【００７９】使用用語および略称 （ｄ）Ａ：（デオキシアデノシン） 抗血清：抗体含有血清 ＡＴＰ：アデノシン三リン酸 オートラジオグラフ法：放射活性検出のための写真法 塩基対：２個の相補的ヌクレオチド、たとえばＡ−Ｔ、
Ｇ−Ｃ 平滑末端：一本鎖がはみ出している末端と区別して、二
本鎖ＤＮＡ分子の完全に塩基対となっている末端
Ｇ−Ｃ 平滑末端：一本鎖がはみ出している末端と区別して、二
本鎖ＤＮＡ分子の完全に塩基対となっている末端
【００８０】ＢＳＡ：牛血清アルブミン （ｄ）Ｃ：（デオキシ）シチジン ｃＤＮＡ：ＲＮＡに相補的のＤＮＡ ｃＤＮＡプール：種々の配列のｃＤＮＡの混合物 コードする：ある物についての情報を担うこと；ＤＮＡ
は、蛋白質のアミノ酸配列についての情報をヌクレオチ
ド配列中に担う。 ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキサイド ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
は、蛋白質のアミノ酸配列についての情報をヌクレオチ
ド配列中に担う。 ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキサイド ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
【００８１】ＤＮＡ配列：ホスホジエステル結合で連結
されたヌクレオチドの直鎖状配列 ＤＴＴ：ジチオスレイトール ＥＤＴＡ：エチレンジニトロテトラ酢酸 電気泳動：電場中、分子の大きさにより（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）分子を分けること 発 現：遺伝子の情報を転写によりｍＲＮＡに、つい
で翻訳によりポリペプチド（蛋白質）に変換すること フィルターハイブリダイゼーション：ひとつのパートナ
ーをフィルターに固定しておいて、核酸をハイブリダイ
ゼーションすること
されたヌクレオチドの直鎖状配列 ＤＴＴ：ジチオスレイトール ＥＤＴＡ：エチレンジニトロテトラ酢酸 電気泳動：電場中、分子の大きさにより（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）分子を分けること 発 現：遺伝子の情報を転写によりｍＲＮＡに、つい
で翻訳によりポリペプチド（蛋白質）に変換すること フィルターハイブリダイゼーション：ひとつのパートナ
ーをフィルターに固定しておいて、核酸をハイブリダイ
ゼーションすること
【００８２】（ｄ）Ｇ：（デオキシ）グアノシン 遺伝子（ジーン）：ひきつづき蛋白質に翻訳されうる特
異的転写（ＲＮＡ分子）に対する情報を担うＤＮＡフラ
グメント 遺伝子族：きわめて類似した生成物（サブ−タイプ）を
コードする遺伝子の一族 遺伝子生成物：ＲＮＡ（転写生成物）：蛋白質（翻訳生
成物） 勾 配：スクロース勾配の項参照 相同性（ＤＮＡ配列の）：類似したヌクレオチド配列を
示すＤＮＡ配列のあいだの関係
異的転写（ＲＮＡ分子）に対する情報を担うＤＮＡフラ
グメント 遺伝子族：きわめて類似した生成物（サブ−タイプ）を
コードする遺伝子の一族 遺伝子生成物：ＲＮＡ（転写生成物）：蛋白質（翻訳生
成物） 勾 配：スクロース勾配の項参照 相同性（ＤＮＡ配列の）：類似したヌクレオチド配列を
示すＤＮＡ配列のあいだの関係
【００８３】ハイブリド：少なくとも部分的に相補的の
ＤＮＡの２つの鎖の安定な複合物 ハイブリダイゼーション（核酸の）：相互に相補的のＤ
ＮＡまたはＲＮＡの個々の鎖のあいだの安定な複合物の
形成 ハイブリダイゼーション標品：相補的な配列を発見する
ために用いられる放射ラベル核酸 ハイブリドプラスミド：外来性ＤＮＡフラグメントを含
有するプラスミド
ＤＮＡの２つの鎖の安定な複合物 ハイブリダイゼーション（核酸の）：相互に相補的のＤ
ＮＡまたはＲＮＡの個々の鎖のあいだの安定な複合物の
形成 ハイブリダイゼーション標品：相補的な配列を発見する
ために用いられる放射ラベル核酸 ハイブリドプラスミド：外来性ＤＮＡフラグメントを含
有するプラスミド
【００８４】Ｉ：イノシン ＩＦＮ−α：白血球インターフェロン ＩＦＮ−β：繊維芽インターフェロン ＩＦＮ−γ：免疫インターフェロン インビトロ−：試験管内 誘導（インターフェロン生産の）：誘導物質（ウイル
ス、二本鎖ＲＮＡ）マイトジエン処理により、細胞がイ
ンターフェロンを生産するように刺激すること
ス、二本鎖ＲＮＡ）マイトジエン処理により、細胞がイ
ンターフェロンを生産するように刺激すること
【００８５】開始コドン：ｍＲＮＡ上にあり、翻訳の開
始を信号するＡＵＧ配列 開始複合体：ｃＤＮＡ合成を開始させる、逆転写酵素と
ｍＲＮＡとプライマーとの組合せ 挿入物、ｃＤＮＡ挿入物：ハイブリドプラスミド中に見
出だされる外来性ＤＮＡのフラグメント（つまりｃＤＮ
Ａ） クローン：１個だけの細菌に由来する細菌コロニークロ
ーンバンク、ｃＤＮＡ
始を信号するＡＵＧ配列 開始複合体：ｃＤＮＡ合成を開始させる、逆転写酵素と
ｍＲＮＡとプライマーとの組合せ 挿入物、ｃＤＮＡ挿入物：ハイブリドプラスミド中に見
出だされる外来性ＤＮＡのフラグメント（つまりｃＤＮ
Ａ） クローン：１個だけの細菌に由来する細菌コロニークロ
ーンバンク、ｃＤＮＡ
【００８６】クローンバンク：ｃＤＮＡ挿入物を有する
ハイブリドプラスミドを、すべてが含有する細菌クロー
ンのコレクション クローニング：クローンの生産；ふつうハイブリドプラ
スミドを含有するクローンの生産の意味にとられている コロニーハイブリダイゼーション：フィルターに補捉し
た変性細菌コロニーを用いるハイブリダイゼーション
ハイブリドプラスミドを、すべてが含有する細菌クロー
ンのコレクション クローニング：クローンの生産；ふつうハイブリドプラ
スミドを含有するクローンの生産の意味にとられている コロニーハイブリダイゼーション：フィルターに補捉し
た変性細菌コロニーを用いるハイブリダイゼーション
【００８７】相補性：相互に適合すること（ＤＮＡ中の
ヌクレオチドで：ＡはＴに相補性、ＧはＣに相補性） クロス−ハイブリダイゼーション：同じではないが相同
のＤＮＡ配列のあいだのハイブリダイゼーション リゲーション：酵素リガーゼによるＤＮＡ配列の共有結
合による連結 ミクロタイタープレート：１−１２およびＡ−Ｚの座標
を特徴とする９６のくぼみを含有するプレート
ヌクレオチドで：ＡはＴに相補性、ＧはＣに相補性） クロス−ハイブリダイゼーション：同じではないが相同
のＤＮＡ配列のあいだのハイブリダイゼーション リゲーション：酵素リガーゼによるＤＮＡ配列の共有結
合による連結 ミクロタイタープレート：１−１２およびＡ−Ｚの座標
を特徴とする９６のくぼみを含有するプレート
【００８８】マイトジエン：細胞の核分裂（細胞分裂）
を促進する物質 分子クローニング：クローニングをみよ ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ、蛋白質をコードする
ＲＮＡ 中 和：抗体を用いる抗原の不活化 ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＧおよびｄＧＴ
Ｐの４種のヌクレオチドの混合物 ヌクレオチド：ＤＮＡまたはＲＮＡの構成単位：（ｄ）
Ａ、（ｄ）Ｃ、（ｄ）Ｇ、（ｄ）Ｔ
を促進する物質 分子クローニング：クローニングをみよ ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ、蛋白質をコードする
ＲＮＡ 中 和：抗体を用いる抗原の不活化 ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＧおよびｄＧＴ
Ｐの４種のヌクレオチドの混合物 ヌクレオチド：ＤＮＡまたはＲＮＡの構成単位：（ｄ）
Ａ、（ｄ）Ｃ、（ｄ）Ｇ、（ｄ）Ｔ
【００８９】オリゴヌクレオチド：ホスホジエステル結
合で相互に連結された数個のヌクレオチド オリゴ（Ｃ）：ホスホジエステル結合で連結されたＣ残
基のオリゴマー オリゴ（ｄＴ）：ホスホジエステル結合で連結されたｄ
Ｔ残基のオリゴマー オリゴ（ｄＴ）セルロース：ポリ（Ａ）+ ＲＮＡのクロ
マトグラフィーのためにセルロースに結合されたオリゴ
（ｄＴ）残基
合で相互に連結された数個のヌクレオチド オリゴ（Ｃ）：ホスホジエステル結合で連結されたＣ残
基のオリゴマー オリゴ（ｄＴ）：ホスホジエステル結合で連結されたｄ
Ｔ残基のオリゴマー オリゴ（ｄＴ）セルロース：ポリ（Ａ）+ ＲＮＡのクロ
マトグラフィーのためにセルロースに結合されたオリゴ
（ｄＴ）残基
【００９０】ＰＩＰＥＳ：ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス
（２−エタンスルホン酸） プラスミド：自動的に増殖する、環状の、染色体外にあ
る細菌性ＤＮＡ ポリ（Ａ）または（ｄＡ）：ホスホジエステル結合で連
結された、ＡまたはｄＡ残基の重合体 ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ：核酸配列の３′末端にホモ重合体
性のポリ（Ａ）の領域を有するｍＲＮＡ ポリ（Ｃ）または（ｄＣ）：ホスホジエステル結合で連
結されたＣまたはｄＣ残基の重合体
（２−エタンスルホン酸） プラスミド：自動的に増殖する、環状の、染色体外にあ
る細菌性ＤＮＡ ポリ（Ａ）または（ｄＡ）：ホスホジエステル結合で連
結された、ＡまたはｄＡ残基の重合体 ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ：核酸配列の３′末端にホモ重合体
性のポリ（Ａ）の領域を有するｍＲＮＡ ポリ（Ｃ）または（ｄＣ）：ホスホジエステル結合で連
結されたＣまたはｄＣ残基の重合体
【００９１】ポリ（Ｉ）：ホスホジエステル結合で連結
されたＩ残基の重合体 ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）：鎖がポリ（Ｉ）およびポリ
（Ｃ）である二本鎖核酸 ポリ（Ｕ）：ホスホジエステル結合で結合されたＵ残基
の重合体 プライマー：ｃＤＮＡ合成が始まる、ＲＮＡ分子の部分
に対して相補的のオリゴヌクレオチド 標 品：ハイブリダイゼーション標品
されたＩ残基の重合体 ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）：鎖がポリ（Ｉ）およびポリ
（Ｃ）である二本鎖核酸 ポリ（Ｕ）：ホスホジエステル結合で結合されたＵ残基
の重合体 プライマー：ｃＤＮＡ合成が始まる、ＲＮＡ分子の部分
に対して相補的のオリゴヌクレオチド 標 品：ハイブリダイゼーション標品
【００９２】プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼが結合
するＤＮＡの配列 ＲＢＳ：リボゾーム結合配列をみよ リコンビナントＤＮＡ：インビトローで相互に結合され
た、種々の由来のＤＮＡフラグメントより成立つＤＮＡ
配列 複製（ＤＮＡの）：ＤＮＡ分子の複製 制限分析：制限エンドヌクレアーゼにより生ずる切れ目
に関連するＤＮＡ分子のマッピング（ｍａｐｐｉｎｇ）
するＤＮＡの配列 ＲＢＳ：リボゾーム結合配列をみよ リコンビナントＤＮＡ：インビトローで相互に結合され
た、種々の由来のＤＮＡフラグメントより成立つＤＮＡ
配列 複製（ＤＮＡの）：ＤＮＡ分子の複製 制限分析：制限エンドヌクレアーゼにより生ずる切れ目
に関連するＤＮＡ分子のマッピング（ｍａｐｐｉｎｇ）
【００９３】制限エンドヌクレアーゼ：あるＤＮＡ配列
の部分でＤＮＡ二本鎖を切断する酵素 制限マッピング：制限分析をみよ 逆転写：ＲＮＡ分子をマトリックスとしそしてオリゴヌ
クレオチドをプライマーとするｃＤＮＡコピーの製造 リボゾーム結合配列：リボゾームに結合しうるｍＲＮＡ
の部分 ＲＮＡ：リボ核酸 ＲＮＡポリメラーゼ：ＤＮＡに相補性のＲＮＡの一本鎖
を合成しうる酵素
の部分でＤＮＡ二本鎖を切断する酵素 制限マッピング：制限分析をみよ 逆転写：ＲＮＡ分子をマトリックスとしそしてオリゴヌ
クレオチドをプライマーとするｃＤＮＡコピーの製造 リボゾーム結合配列：リボゾームに結合しうるｍＲＮＡ
の部分 ＲＮＡ：リボ核酸 ＲＮＡポリメラーゼ：ＤＮＡに相補性のＲＮＡの一本鎖
を合成しうる酵素
【００９４】スクロース勾配：（ＲＮＡ）分子の混合物
をそれらの大きさに従って分割する手段 ＳＤＳ：ナトリウムドデシルスルフェート スクリーニング：特定の性質を求めて調べてゆくこと 配列の複雑さ：特定量のＤＮＡ中の質的に異なるＤＮＡ
配列の数を示す値 サブ−タイプ：遺伝子族をみよ （ｄ）Ｔ：（デオキシ）チミジン 形質転換菌：形質転換により外来性ＤＮＡを受け入れた
細菌
をそれらの大きさに従って分割する手段 ＳＤＳ：ナトリウムドデシルスルフェート スクリーニング：特定の性質を求めて調べてゆくこと 配列の複雑さ：特定量のＤＮＡ中の質的に異なるＤＮＡ
配列の数を示す値 サブ−タイプ：遺伝子族をみよ （ｄ）Ｔ：（デオキシ）チミジン 形質転換菌：形質転換により外来性ＤＮＡを受け入れた
細菌
【００９５】形質転換：外来性ＤＮＡを細菌に導入する
こと 転 写：ｍＲＮＡをそれに相補性のＤＮＡ配列でコピ
ーすること 翻 訳：ｍＲＮＡの情報をポリペプチド（翻訳生成
物）に変換すること トリデカヌクレオチド：１３個の成分を有するオリゴヌ
クレオチド トリデカヌクレオチドポジティブ：トリデカヌクレオチ
ドでハイブリダイゼーションすること
こと 転 写：ｍＲＮＡをそれに相補性のＤＮＡ配列でコピ
ーすること 翻 訳：ｍＲＮＡの情報をポリペプチド（翻訳生成
物）に変換すること トリデカヌクレオチド：１３個の成分を有するオリゴヌ
クレオチド トリデカヌクレオチドポジティブ：トリデカヌクレオチ
ドでハイブリダイゼーションすること
【００９６】トリス：トリスヒドロキシメチルアミノメ
タン Ｕ：ウリジン ベクター：外来性ＤＮＡを細菌中に加えるためのビヒク
ル、ふつうはプラスミド ベクターハイブリド：ハイブリドプラスミドをみよ
タン Ｕ：ウリジン ベクター：外来性ＤＮＡを細菌中に加えるためのビヒク
ル、ふつうはプラスミド ベクターハイブリド：ハイブリドプラスミドをみよ
【図１】ｃＤＮＡクローンバンク製造の模式図。
【図２】特異的トリデカヌクレオチドプライマーを用い
ることにより、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β−特異的Ｄ
ＮＡ配列をより高濃度とされたハイブリダイゼーション
標品としてのｃＤＮＡの調製を示す模式図。
ることにより、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β−特異的Ｄ
ＮＡ配列をより高濃度とされたハイブリダイゼーション
標品としてのｃＤＮＡの調製を示す模式図。
【図３】クローンバンクを、Ｎａｍａｌｗａ細胞からの
トリデカヌクレオチド−開始ｃＤＮＡとコロニーハイブ
リダイゼーションさせた結果を示し、１５３６個の異な
るクローンを担う、ニトロセルローズフィルターのオー
トラジオグラフィー。矢印は、トリデカヌクレオチド陽
性クローンの例を示す。
トリデカヌクレオチド−開始ｃＤＮＡとコロニーハイブ
リダイゼーションさせた結果を示し、１５３６個の異な
るクローンを担う、ニトロセルローズフィルターのオー
トラジオグラフィー。矢印は、トリデカヌクレオチド陽
性クローンの例を示す。
【図４】２つのトリデカヌクレオチド陽性クローン（ク
ローンＰ１Ｈ１およびＰ２Ｈ１０）と、１９０個のトリ
デカヌクレオチド陽性クローンのすべて（ミクロタイタ
ープレートＰ１およびＰ２）および対照としてのランダ
ムに選ばれたミクロタイタープレート（Ｅ５２）との、
コロニーハイブリダイゼーション反応を示すミクロタイ
タープレートの写真。
ローンＰ１Ｈ１およびＰ２Ｈ１０）と、１９０個のトリ
デカヌクレオチド陽性クローンのすべて（ミクロタイタ
ープレートＰ１およびＰ２）および対照としてのランダ
ムに選ばれたミクロタイタープレート（Ｅ５２）との、
コロニーハイブリダイゼーション反応を示すミクロタイ
タープレートの写真。
【図５】誘導および非誘導Ｎａｍａｌｗａ細胞からのポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡといくつかのプラスミドとのフィルタ
ーハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー。
ウイルス誘導ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ（各対の左側カラムの
“ｉ”）および非誘導Ｎａｍａｌｗａ細胞よりのポリ
（Ａ）+ ＲＮＡ（各対の右側カラム中の“ｎ”）は、電
気泳動で分子サイズに従って分けてからニトロセルロー
スフィルター上に移し、ついで、フィルターと放射ラベ
ルプラスミドＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせて
とった、オートラジオグラフィー。
リ（Ａ）+ ＲＮＡといくつかのプラスミドとのフィルタ
ーハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー。
ウイルス誘導ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ（各対の左側カラムの
“ｉ”）および非誘導Ｎａｍａｌｗａ細胞よりのポリ
（Ａ）+ ＲＮＡ（各対の右側カラム中の“ｎ”）は、電
気泳動で分子サイズに従って分けてからニトロセルロー
スフィルター上に移し、ついで、フィルターと放射ラベ
ルプラスミドＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせて
とった、オートラジオグラフィー。
【図６】本発明に係るリコンビナントＤＮＡ分子の４個
のＤＮＡ挿入物の制限マップの比較を示す模式図。プラ
スミドＰ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０のＤＮＡ挿入物は、
ＩＦＮ−βＤＮＡ制限パターンと相同であることが示さ
れ、プラスミドＰ１Ａ６および１Ｆ７のＤＮＡ挿入物
は、ＩＦＮ−αＤＮＡの２つの異なるサブタイプと相同
性を示す。
のＤＮＡ挿入物の制限マップの比較を示す模式図。プラ
スミドＰ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０のＤＮＡ挿入物は、
ＩＦＮ−βＤＮＡ制限パターンと相同であることが示さ
れ、プラスミドＰ１Ａ６および１Ｆ７のＤＮＡ挿入物
は、ＩＦＮ−αＤＮＡの２つの異なるサブタイプと相同
性を示す。
【図７】ＩＦＮ−βＤＮＡ特異性を示す２つのクローン
（クローンＰ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０）で同一の部分
のヌクレオチド配列。
（クローンＰ１Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０）で同一の部分
のヌクレオチド配列。
【図８】ＩＦＮ−α−ＤＮＡ特異性を示す２つの挿入物
（クローンＰ１Ａ６および１Ｆ７）の３′および５′末
端セグメントのヌクレオチド配列。下線を付した配列Ａ
ＴＧは翻訳のための開始コドン。
（クローンＰ１Ａ６および１Ｆ７）の３′および５′末
端セグメントのヌクレオチド配列。下線を付した配列Ａ
ＴＧは翻訳のための開始コドン。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図４】基板上に形成された微細なパターンを表わす写
真であって、２つのトリデカヌクレオチド陽性クローン
（クローンＰ１Ｈ１およびＰ２Ｈ１０）と、１９０個の
トリデカヌクレオチド陽性クローンのすべて（ミクロタ
イタープレートＰ１およびＰ２）および対照としてのラ
ンダムに選ばれたミクロタイタープレート（Ｅ５２）と
の、コロニーハイブリダイゼーション反応を示すミクロ
タイタープレート。
真であって、２つのトリデカヌクレオチド陽性クローン
（クローンＰ１Ｈ１およびＰ２Ｈ１０）と、１９０個の
トリデカヌクレオチド陽性クローンのすべて（ミクロタ
イタープレートＰ１およびＰ２）および対照としてのラ
ンダムに選ばれたミクロタイタープレート（Ｅ５２）と
の、コロニーハイブリダイゼーション反応を示すミクロ
タイタープレート。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 マーク − ブルース ドウオーキン アメリカ合衆国ニユーヨーク州ニユーヨー ク，アブト．６ − ジェイ．，モーニン グ サイド ドライブ 90 (72)発明者 ギユンター アドルフ オーストリア国ウイーン，ヨハナガツセ 20−７ (72)発明者 ペーター マインドル オーストリア国ウイーン，ホツケガツセ 63−１ (72)発明者 ゲルハルト ボドウ オーストリア国ウイーン，ベルゴフエルガ ツセ 27 (72)発明者 ペーター スウエトリイ オーストリア国ウイーン，ヒエツジンガー ハウプトストラーセ 40 ビー − ９
Claims (7)
- 【請求項１】 式 【化１】 を有するＩＦＮ−α２（Ａｒｇ）をコードするポリデオ
キシリボヌクレオチドであって、このポリデオキシリボ
ヌクレオチドがドイツ微生物寄託機関（Ｄｅｕｔｓｃｈ
ｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｅｎ）にＤＳＭ番号２３６２の寄託番号をもっ
てＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１として寄託されているｐＢ
Ｒ３２２（Ｐｓｔ）１Ｆ７で示されるプラスミドのＰｓ
ｔ Ｉ挿入体中に存在する配列に相当することを特徴と
する上記ポリデオキシリボヌクレオチド。 - 【請求項２】 ＩＦＮ−α２（Ａｒｇ）をコードする配
列が、式 【化２】 で示される部分配列を含有する請求項１のＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 Ｐｓｔ Ｉ挿入体中に請求項１または２
のＤＮＡ配列を含有するｐＢＲ３２２プラスミド。 - 【請求項４】 ドイツ微生物寄託機関に寄託番号ＤＳＭ
番号２３６２をもってＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１として
寄託されているｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）１Ｆ７で示され
る請求項３のプラスミド。 - 【請求項５】 プラスミド中に請求項１または２のＩＦ
Ｎ−α２（Ａｒｇ）をコードするポリデオキシリボヌク
レオチドを含有する微生物。 - 【請求項６】 請求項３または４のプラスミドで形質転
換した請求項５の微生物。 - 【請求項７】 請求項３または４のプラスミドで形質転
換したＥ．ｃｏｌｉである請求項５の微生物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19823220116 DE3220116A1 (de) | 1982-05-28 | 1982-05-28 | Mikrobiologisch hergestellte (alpha)- und ss-interferone, dna-sequenzen, die fuer diese interferone codieren, mikroorganismen, die diese genetische information enthalten, und verfahren zu ihrer herstellung |
| DE32201168 | 1982-05-28 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58093886A Division JPH0774238B2 (ja) | 1982-05-28 | 1983-05-27 | 微生物により生産されるα−およびβ−インタ−フエロン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0678774A true JPH0678774A (ja) | 1994-03-22 |
| JP2558422B2 JP2558422B2 (ja) | 1996-11-27 |
Family
ID=6164725
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58093886A Expired - Lifetime JPH0774238B2 (ja) | 1982-05-28 | 1983-05-27 | 微生物により生産されるα−およびβ−インタ−フエロン |
| JP5062065A Expired - Lifetime JP2558422B2 (ja) | 1982-05-28 | 1993-03-22 | インターフェロンをコードする遺伝子 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58093886A Expired - Lifetime JPH0774238B2 (ja) | 1982-05-28 | 1983-05-27 | 微生物により生産されるα−およびβ−インタ−フエロン |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4820638A (ja) |
| EP (1) | EP0095702B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0774238B2 (ja) |
| KR (1) | KR920006349B1 (ja) |
| AT (1) | ATE42114T1 (ja) |
| AU (1) | AU565479B2 (ja) |
| DD (1) | DD211359C4 (ja) |
| DE (2) | DE3220116A1 (ja) |
| DK (1) | DK164742C (ja) |
| ES (2) | ES8403522A1 (ja) |
| FI (1) | FI82072C (ja) |
| GR (1) | GR79236B (ja) |
| HK (1) | HK112893A (ja) |
| HU (1) | HU196452B (ja) |
| IL (1) | IL68790A (ja) |
| MX (1) | MX9202815A (ja) |
| NO (1) | NO168538C (ja) |
| NZ (1) | NZ204384A (ja) |
| SG (1) | SG38692G (ja) |
| SU (1) | SU1346048A3 (ja) |
| UA (1) | UA8037A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA833845B (ja) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3247922A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten |
| DE3515336C2 (de) * | 1985-04-27 | 1994-01-20 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon |
| US4709324A (en) * | 1985-11-27 | 1987-11-24 | Motorola, Inc. | Data processor control unit having an interrupt service using instruction prefetch redirection |
| CA2025180A1 (en) * | 1989-10-12 | 1991-04-13 | William G. Weisburg | Nucleic acid probes and methods for detecting pathogenic candida yeasts |
| US6685933B1 (en) * | 1998-07-28 | 2004-02-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Interferon α hybrids |
| AU2002225870B2 (en) * | 2000-11-03 | 2006-09-21 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Method for short-term and long-term drug dosimetry |
| FR2817559B1 (fr) * | 2000-12-06 | 2003-12-12 | Genodyssee | Procede de determination d'un ou plusieurs polymorphisme(s) fontionnel(s) dans la sequence nucleique d'un gene "candidat" fonctionnel preselectionne et ses applications |
| FR2821625B1 (fr) * | 2001-03-01 | 2003-05-16 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides comportant un polymorphisme de type snp fonctionnel dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-2 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques |
| FR2823220B1 (fr) * | 2001-04-04 | 2003-12-12 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo) |
| KR20040053291A (ko) * | 2001-11-09 | 2004-06-23 | 바이오메디신즈 인코포레이티드 | 오메가 인터페론을 이용한 질환 치료 방법 |
| US20040063912A1 (en) * | 2002-03-15 | 2004-04-01 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Central airway administration for systemic delivery of therapeutics |
| AU2002304965A1 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Zensun (Shanghai) Sci-Tech.Ltd | Neuregulin based methods and compositions for treating viral myocarditis and dilated cardiomyopathy |
| DE60332358D1 (de) * | 2002-09-09 | 2010-06-10 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
| CA2553040A1 (en) * | 2004-02-02 | 2005-08-18 | Ambrx, Inc. | Modified human four helical bundle polypeptides and their uses |
| US11246913B2 (en) | 2005-02-03 | 2022-02-15 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide |
| WO2006083761A2 (en) | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Alza Corporation | Solvent/polymer solutions as suspension vehicles |
| CN101453982B (zh) | 2006-05-30 | 2011-05-04 | 精达制药公司 | 两件式内部通道渗透递送系统流动调节器 |
| WO2008021133A2 (en) | 2006-08-09 | 2008-02-21 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Osmotic delivery systems and piston assemblies |
| US20080260820A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Gilles Borrelly | Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides |
| EP2157967B1 (en) | 2007-04-23 | 2013-01-16 | Intarcia Therapeutics, Inc | Suspension formulations of insulinotropic peptides and uses thereof |
| EP2240155B1 (en) | 2008-02-13 | 2012-06-06 | Intarcia Therapeutics, Inc | Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents |
| CN104323981B (zh) | 2009-09-28 | 2019-03-12 | 精达制药公司 | 基本稳态药物递送的快速建立和/或终止 |
| US20120208755A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-16 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers |
| WO2013024156A2 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Combinations of anti-hcv-entry factor antibodies and interferons for the treatment and the prevention of hcv infection |
| WO2013024158A1 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Combinations of protein kinase inhibitors and interferons or of protein kinase inhibitors and direct acting antivirals for the treatment and the prevention of hcv infection |
| WO2014033266A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-sr-bi antibodies for the inhibition of hepatitis c virus infection |
| US9889085B1 (en) | 2014-09-30 | 2018-02-13 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c |
| WO2016196851A2 (en) | 2015-06-03 | 2016-12-08 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant placement and removal systems |
| MX2018014016A (es) | 2016-05-16 | 2019-08-01 | Intarcia Therapeutics Inc | Polipéptidos selectivos del receptor de glucagón y métodos para utilizarlos. |
| USD860451S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-09-17 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant removal tool |
| USD840030S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-02-05 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant placement guide |
| CN110225762A (zh) | 2017-01-03 | 2019-09-10 | 因塔西亚制药公司 | 包括glp-1受体激动剂的连续施用和药物的共同施用的方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2906160A1 (de) * | 1979-02-17 | 1980-09-04 | Thomae Gmbh Dr K | Verbessertes verfahren zur herstellung von humaninterferon |
| AU538665B2 (en) * | 1979-10-30 | 1984-08-23 | Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research | Human interferon dna |
| IL58765A (en) * | 1979-11-21 | 1986-09-30 | Yeda Res & Dev | Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta |
| US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| NO164037C (no) * | 1980-01-08 | 1990-08-22 | Biogen Inc | Fremgangsmaate ved fremstilling av et polypeptid av interferon alfa (ifnalfa)-type. |
| GB2068970B (en) * | 1980-02-06 | 1983-06-22 | Searle & Co | Recombinant dna technique for the preparation of a protein resembling human interferon |
| DE3005843A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-10 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enthaltenden mikroorganismus |
| DE3005897A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-03 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus |
| ES506955A0 (es) * | 1980-11-10 | 1983-02-01 | Genentech Inc | Un procedimiento para producir un polipeptido antiviral. |
| DE3106982A1 (de) * | 1981-02-25 | 1982-09-09 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | "neues tridecadeoxynukleotid, verfahren zu seiner herstellung und verwendung" |
| IL63327A (en) * | 1981-07-16 | 1985-11-29 | Yeda Res & Dev | Production of interferon beta1 and alpha-phage recombinants for its production in host bacteria |
| GB2108510B (en) * | 1981-10-03 | 1984-12-12 | Ciba Geigy Ag | Dnas, recombinant dnas, hosts containing them, polypeptides and processes for the production thereof |
-
1982
- 1982-05-28 DE DE19823220116 patent/DE3220116A1/de active Granted
-
1983
- 1983-05-19 US US06/495,944 patent/US4820638A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-05-23 FI FI831818A patent/FI82072C/fi not_active IP Right Cessation
- 1983-05-24 DE DE8383105116T patent/DE3379591D1/de not_active Expired
- 1983-05-24 EP EP83105116A patent/EP0095702B1/de not_active Expired
- 1983-05-24 GR GR71447A patent/GR79236B/el unknown
- 1983-05-24 AT AT83105116T patent/ATE42114T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-05-26 IL IL68790A patent/IL68790A/xx unknown
- 1983-05-26 DD DD83251287A patent/DD211359C4/de not_active IP Right Cessation
- 1983-05-27 SU SU833598429A patent/SU1346048A3/ru active
- 1983-05-27 AU AU15044/83A patent/AU565479B2/en not_active Ceased
- 1983-05-27 HU HU831890A patent/HU196452B/hu not_active IP Right Cessation
- 1983-05-27 DK DK239383A patent/DK164742C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-05-27 ES ES522762A patent/ES8403522A1/es not_active Expired
- 1983-05-27 UA UA3598429A patent/UA8037A1/uk unknown
- 1983-05-27 NO NO831903A patent/NO168538C/no unknown
- 1983-05-27 JP JP58093886A patent/JPH0774238B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-05-27 NZ NZ204384A patent/NZ204384A/en unknown
- 1983-05-27 ZA ZA833845A patent/ZA833845B/xx unknown
- 1983-05-28 KR KR1019830002362A patent/KR920006349B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-02-01 ES ES529360A patent/ES8500321A1/es not_active Expired
-
1992
- 1992-04-07 SG SG386/92A patent/SG38692G/en unknown
- 1992-06-12 MX MX9202815A patent/MX9202815A/es unknown
-
1993
- 1993-03-22 JP JP5062065A patent/JP2558422B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-21 HK HK1128/93A patent/HK112893A/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| EUR J CELL BIOL=1981 * |
| NUCLEIC ACIDS RES=1981 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2558422B2 (ja) | インターフェロンをコードする遺伝子 | |
| US5541312A (en) | Production of interferon | |
| JP2501889B2 (ja) | α−インタ−フェロンを含有する薬学的組成物 | |
| US4530901A (en) | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides | |
| JP2612149B2 (ja) | α−インターフェロン及びその製造方法 | |
| EP0540064B1 (en) | Apoaequorin peptides, recombinant DNA vectors capable of expressing the same and microorganisms containing said vectors | |
| JPH0789934B2 (ja) | 構造遺伝子の製造および発現 | |
| PL149079B1 (en) | Method of obtaining polypeptides of ifn-beta type | |
| JP2566909B2 (ja) | 新規遺伝子配列、それによつてコ−ドされるｉ型インタ−フエロンペプチドおよびそのインタ−フエロンを産生する微生物 | |
| US4761375A (en) | Human interleukin-2 cDNA sequence | |
| JPS6156199A (ja) | 新規ヒトインタ−フエロンα類 | |
| US6835557B1 (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides | |
| EP0133321A1 (en) | DNA gene, process for production thereof and plasmid containing the same | |
| US4716217A (en) | Hybrid lymphoblastoid-leukocyte human interferons | |
| JPS60126299A (ja) | 新規インターフェロンγとその製造方法 | |
| Schoenberg | Albumin is encoded by 2 messenger RNAs in Xenopus laevis | |
| KR890001828B1 (ko) | 인터페론-α형의 폴리펩티드의 제조방법 | |
| JPS60126088A (ja) | 新規ｄνａおよびその用途 | |
| JPH07177888A (ja) | 牛疫ウィルスのフュージョン蛋白質をコードするｄｎａ |