JP2501889B2 - α−インタ−フェロンを含有する薬学的組成物 - Google Patents

α−インタ−フェロンを含有する薬学的組成物

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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の要約〕 α−型インターフェロン、その産生方法、α−型ヒブ
リドインターフェロン、およびこれらα−型インターフ
ェロンを含有する処置組成物につき開示する。また、本
発明で用いるDNA配列は、ひとインターフェロンの生物
学的もしくは免疫学的活性を示すポリペプチドをコード
することを特徴とする。適当な宿主において、これらの
DNA配列および組替えDNA分子は、ひとインターフェロン
の生物学的もしくは免疫学的活性を示す遺伝子およびポ
リペプチドの生産および同定を可能にすると共に、抗ウ
イルスおよび抗腫瘍もしくは抗癌剤におけるその使用を
可能にする。
本発明は、α−型インターフェロン、その産生方法、
α−型ヒブリドインターフェロンおよびこれらα−型イ
ンターフェロンを含有する処置組成物に関するものであ
る。本明細書中に開示する組替えDNA分子は、ひと白血
球インターフェロンの免疫学的もしくは生物学的活性を
有するポリペプチドをコードするDNA配列を特徴とす
る。以下の記載から明らかになるように、本発明のDNA
配列、組替えDNA分子およびその製造方法は、抗ウイル
ス剤および抗腫瘍もしくは抗癌剤ならびにその製造方法
に有用なポリペプチドを製造するのに使用することがで
きる。
本出願においては、ネイチャー誌第286巻、第2421頁
（1980年７月10日）に発表されたインターフェロンとい
う名称を使用する。この名称により、本出願の優先権と
なる原出願において使用された名称を置き換える。たと
えば、IFはここではIFNで表わされ、白血球インターフ
ェロンはここではIFN−αで表わされる。
インターフェロン（“IFN"）は２種類存在することが
知られている。種類Ｉのインターフェロンは小さい酸安
定性の（グリコ）−蛋白質であって、細胞をウイルス感
染耐性にするものである〔エー・イサークスおよびジェ
ー・リンデンマン「ウイルス干渉Ｉ。インターフェロ
ン」、プロシーディング・ロイヤル・ソサイエティ・シ
リーズＢ、第147巻、第258〜267頁（1957）およびダブ
リュー・イー・スチュアート・II、「ザ・インターフェ
ロン・システム」、スプリンガー出版（1979）（以下、
「ザ・インターフェロン・システム」と云う）〕。IFN
は、或る程度、細胞特異性である（ザ・インターフェロ
ン・システム第135〜145頁）が、ウイルス特異性でな
い。寧ろ、IFNは広範囲のウイルスに対して細胞を保護
する。
ひとインターフェロン（“HuIFN"）は３つの群α，β
およびγに分類されている。HuIFN−αすなわち白血球
インターフェロンはひと白血球中において、リンパ芽球
細胞中の少量のHuIFN−β（繊維芽細胞インターフェロ
ン）と共に生産される。HuIFN−αは均質になるまで精
製されかつ特性化されている〔たとえば、エム・ルーベ
ンスタイン等、「ひと白血球インターフェロン：生産、
均質までの精製および初期特性化」、プロシーディング
・ナショナル・アカデミー・サイエンスUSA、第76巻、
第640〜644頁（1979）〕。これは、恐らく炭水化物成分
のため、寸法に関しては不均質である。２種の成分が記
載されており、その一方は21,000〜22,000の分子量を有
し、他方は15,000〜18,000の分子量を有する。低分子量
の方の成分は非グリコシル化型を示すことが報告されて
いる。また、より小さいHuIFN−αの型がHuIFN−α活性
の大部分または全てを保持することも報告されている
〔ダブリュー・イー・スチュアート・II等、「ひと白血
球インターフェロンの生産および性質に対するグリコシ
ル化抑制剤の効果」、ビロロジー、第97巻、第473〜476
頁（1979）〕。リンパ芽球細胞からのHuIFN−αのアミ
ノ酸配列の一部およびそのアミノ酸組成も報告されてい
る〔ケー・シー・ズーン等、「ひとリンパ芽球細胞イン
ターフェロンの主成分のアミノ末端配列」、サイエン
ス、第207巻、第527〜528頁（1980）ならびにエム・ハ
ンカピラーおよびエル・フード、私的通信（1980）〕。
さらに、HuIFN−αは幾つかの異なる型として存在す
ることも報告されている（たとえば、英国特許出願第2,
037,296A号）。これらの型は、構造的におよび生理学的
に互いに異なっていると思われる。HuIFN−αのこれら
型に関し、まだ認められた名称は採用されていない。し
たがって、本出願においては、各型を、一般的なHuIFN
−αの名称の後に数字を付して、すなわちHuIFN−α１
またはHuIFN−α３のように記載する。
HuIFN−αは、多くのひと蛋白質と同様に、多形質で
ある。したがって、特定個人の細胞はより一般的なHuIF
N−α群内におけるHuIFN−α種を生成することができ、
或いはその群内において生理学的には同じであるがその
群とはもしくはその一部である形態とは構造上僅かに異
なる形態を生成することができる。したがって、HuIFN
−αの蛋白質構造は一般的には良く規定されているが、
特定個人はそれと僅かに異なるHuIFN−αを生成するこ
とができ、この対立形質的変化は恐らくHuIFN−αの種
々の形態間における相違ほど大きいものでない。
HuIFNは、通常、正常もしくは健全な細胞には検出さ
れない（ザ・インターフェロン・システム、第55〜57
頁）。寧ろ、細胞をIFN誘発体に曝す結果、蛋白質が生
成される。IFN誘発体は一般にウイルスであるが、性質
上非ウイルス性のもの、たとえば天然もしくは合成の二
重鎖RNA、細胞内微生物、微生物生成物および各種の化
学薬剤とすることもできる。ひと細胞をウイルス感染耐
性にすべく、これら非ウイルス性誘発体を利用する多く
の試みがなされている〔エス・バロンおよびエフ・ジア
ンザニ編、テキサス・レポート・オン・バイオロジー・
アンド・メディスン、第35号（「テキサスレポー
ト」）、第528〜540頁（1977）〕。これらの試みは大し
て成功を収めていない。寧ろ、現在では外来性HuIFNの
使用が好まれている。
ウイルスおよび腫瘍もしくは癌に対するインターフェ
ロン治療が、種々異なる投与量にてかつ幾つかの投与様
式にて行なわれている〔ザ・インターフェロン・システ
ム、第305〜321頁〕。たとえば、インターフェロンは、
経口的に或いは接種（静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内お
よび皮下）により、或いは点眼薬、軟膏および噴霧剤の
形態で効果的に投与されている。通常104〜107単位の投
与量で毎日１〜３回投与される。治療程度は、患者およ
び処置すべき状態に依存する。たとえば、ウイルス感染
は通常数日間乃至２週間にわたり毎日もしくは１日２回
投与することにより処置され、腫瘍および癌は通常数ケ
月乃至数年間にわたり毎日または１日多数回投与するこ
とにより処置される。勿論、或る患者に対し最も有効な
治療は、投与様式および投与量を選択するにあたり、た
とえば病気、従前の治療およびインターフェロンに対す
る患者の反応など周知の因子を考慮する担当医師により
決定されねばならない。
抗ウイルス剤として、HuIFNは次の病気を処置するた
めに使用されている：呼吸器感染症（テキサスレポー
ト、第486〜496頁）、単純疱疹性角膜炎（テキサスレポ
ート、第497〜500頁）、急性出血性結膜炎（テキサスレ
ポート、第501〜510頁）、水痘性帯状疱疹（テキサスレ
ポート、第511〜515頁）、巨大ウイルス感染症（テキサ
スレポート、第523〜527頁）、およびＢ型肝炎（テキサ
スレポート、第516〜522頁）。ザ・インターフェロン・
システム、第307〜319頁も参照できる。しかしながら、
抗ウイルス剤としてのIFNの大規模な使用は、従来入手
し得るよりも多量のIFNを必要とする。
HuIFNは、その抗ウイルス作用に加えて、他の効果を
も有する。たとえば、これはコロニー刺戟因子の結果に
拮抗し、造血性コロニー形成細胞の成長を抑制し、かつ
また顆粒球および大食球先駆体の正常分化を阻害する
（テキサスレポート、第343〜349頁）。さらに、これは
DMSO処理されたフレンド白血病細胞における赤血球分化
を抑制する（テキサスレポート、第420〜428頁）。ま
た、HuIFNは、免疫反応の調整に役割を演ずる。抗原に
対する施用の量と時間とに応じて、HuIFN−αは生体内
および試験管内において免疫促進的にも或いは免疫抑制
的にもなりうる（テキサスレポート、第357〜369頁）。
さらに、特異的に感応されたリンパ芽細胞は、抗原に接
触すると、HuIFN−αを生成することが観察された。し
たがって、この種の抗原誘発されたHuIFN−αは免疫反
応の調節体となり、循環抗原レベルと細胞免疫性の発現
との両者に作用することができる（テキサスレポート、
第370〜374頁）。さらに、HuIFNはキラーリンパ球の活
性および抗体依存性の細胞媒介される細胞毒性を高める
ことも知られている〔アール・アール・ハーバーマン
等、「ひと天然および抗体依存性細胞媒介細胞毒性のイ
ンターフェロンによる促進」、ネイチャー誌、第277
巻、第221〜223頁（1979）；ピー・ビバリーおよびディ
ー・ナイト、「死亡は自然に起こる」、ネイチャー誌、
第278巻、第119〜120頁（1979）；テキサスレポート、
第375〜380頁〕。これらの両種類は恐らく、腫瘍細胞に
対する免疫学的攻撃に含まれる。
したがって、ひと抗ウイルス剤としての使用に加え、
HuIFNは抗腫瘍および抗癌治療において有力な用途を有
する（ザ・インターフェロン・システム、第319〜321
頁）。現在、IFNは多くの動物における多くの種類の腫
瘍の成長に影響を与えることが知られている（ザ・イン
ターフェロン・システム、第292〜304頁）。それらは、
他の抗腫瘍剤と同様、小腫瘍に対して使用された場合、
特に効果的であると思われる。動物IFNの抗腫瘍効果は
投与量と時間とに左右されるが、これは毒性レベル以下
の濃度で示されたものである。したがって、IFNの抗腫
瘍および抗癌性につき多くの研究および臨床試験が過去
に行なわれ、現在も行なわれ続けている。これらには、
たとえば骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫およ
びホジキンス病のような幾つかの悪性疾患の処置が包含
される（テキサスレポート、第429〜435頁）。さらに、
HuIFNは、黒腫症および胸部癌に侵された患者における
皮下腫瘍結節に注射すると、局部腫瘍退化をもたらすこ
とが最近示された〔ティー・ネモト等、「黒腫症および
胸部癌のひとインターフェロンおよび内部治療」、アメ
リカン・アソシエーション・フォー・カンサー・リサー
チ、アブストラクト、第994号、第246頁（1979）〕。こ
れら臨床試験の結果は好ましいものであったが、IFNの
抗腫瘍および抗癌用途は、精製IFNの充分な供給が得ら
れないため、著しく妨げられている。
今日、HuIFN−αは、組織培養で増殖させたひと細胞
を介して、或いは供血者から集めたひと白血球を介して
生産される。2.6×109IUの粗製HuIFN−αが800lの培養
ナマルバ（Namalva）細胞から得られることが報告され
ている（ピー・ジェー・ブリッジェン等、上記）。極め
て大きな血液センター、たとえばフインランド国ヘルシ
ンキ在のフインランド赤十字センターでは、その生産能
力は年間約1011IUの粗製HuIFN−αである。投与量は典
型的には１患者当り毎日３×106IUであるから、これら
供給源はHuIFN−αの必要市販量をまかなうには不充分
である。したがって、他の方法によるHuIFN−αの生産
が望まれる。IFN−αの比活性は高く、4.0×108〜109IU
/mgの程度であるため、一般用途に必要とされるHuIFN−
αの量は少なくなる。たとえば、100gの純HuIFN−αは
３〜30×100万回の投与量をまかなうであろう。
分子生物学における最近の進歩により、特異性の非細
菌性成熟核蛋白質をコード化するDNAを細菌細胞中に導
入することが可能となった。一般に、化学合成により製
造されたもの以外のDNAによれば、この種の組替えDNA分
子の製造は、所望蛋白質に対する精製メッセンジャーRN
A（mRNA）雛型の単一鎖DNAコピー（cDNA）を生成させ、
このcDNAを二重鎖DNAに変え、このDNAを適当なクローン
化ベヒクルにおける適当な部位に結合させて組替えDNA
分子を形成させかつこの組替えDNA分子により適当な宿
主を形質転換させるという過程からなっている。このよ
うな形質転換は、宿主が所望蛋白質を生産するのを可能
にする。
数種の非細菌性蛋白質および遺伝子が、大腸菌（イー
・コリ）において組替えDNA技術を用いて得られてい
る。これらには、ラッテプロインシュリン抗原決定因子
を示す蛋白質〔エル・ビラ−カマロフ等、「プロインシ
ュリンを合成する細菌クローン」、プロシーディング・
ナショナル・アカデミー・サイエンス・USA、第75巻、
第3727〜3731頁（1978）〕、ラッテ成長ホルモン〔ピー
・エッチ・シーブルグ等、「細菌による成長ホルモンの
合成」、ネイチャー誌、第276巻、第795〜798頁（197
8）〕、ねずみジヒドロ葉酸レダクターゼ〔エー・シー
・ワイ・チャング等、「ねずみジヒドロ葉酸レダクター
ゼを暗号化するDNA配列の、大腸菌（イー・コリ）にお
ける発現型」、ネイチャー誌、第275巻、第617〜624頁
（1978）〕、ひとソマトスタチン〔ケー・イタクラ等、
「ソマトスタチンホルモンに対する化学合成遺伝子の大
腸菌における発現」、サイエンス誌、第198巻、第1056
〜1063頁（1977）、およびヨーロッパ特許出願第0,001,
929号、第0,001,930号および第0,001,931号ならびに他
国における対応出願〕、ひとインシュリンのＡおよびＢ
ポリペプチド鎖〔ディー・ヴィー・ゲデル等、「ひとイ
ンシュリンに対する化学合成遺伝子の大腸菌における発
現」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第76巻、第106〜110頁（1979）、なら
びにヨーロッパおよび関連特許出願明細書（上記）〕、
ひとＢ型肝炎ウイルスの抗原〔シー・ジェー・バレル
等、「プラスミドpBR322においてクローン化されたＢ型
肝炎ウイルスDNA配列：大腸菌における発現」、ネイチ
ャー誌、第279巻、第43〜47頁（1979）ならびにエム・
パセク等、「Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子および大腸菌にお
けるその発現」、ネイチャー誌、第282巻、第575〜579
頁（1979）〕、ひと成長ホルモン（ディー・ヴィー・ゲ
デル等、「ひと成長ホルモンをコードするDNA配列の大
腸菌における直接的発現」、ネイチャー誌、第281巻、
第544〜551頁（1979）〕、SV40t抗原（ティーエム・ロ
バーツ等、「大腸菌における猿ウイルス40t抗原の合
成」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第76巻、第5596〜5600頁（1979）〕、
ならびにひと繊維芽細胞インターフェロン（HuIFN−
β）〔ティー・タニグチ等、「ひと繊維芽細胞インター
フェロン遺伝子配列を含有する細菌プラスミドの製造お
よび同定」、プロシーディング・ジャパン・アカデミ
ー、第55巻Ｂ号、第464〜469頁（1979）および私的通信
（1980）〕が包含される。
しかしながら、これら組替えDNA法のいずれも、本発
明におけるように、HuIFN−αの合成に向けられていな
い。これが、本発明の目標とする課題である。この解決
は、合成遺伝子（たとえばソマトスタチン）を調製する
のに必要とされる配列情報を入手することによる、或い
は特定DNA配列の豊富な細胞型もしくはウイルス（たと
えば肝炎ウイルス抗原）または所望ヒブリドDNAを含有
する細菌クローンの調製および同定を可能にするmRNA種
（たとえばラッテインシュリン）を入手することによ
る、或いは所望蛋白質（たとえばねずみジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ）を発現する大腸菌宿主の選択を可能にする
系を入手することによる上記の組替えDNA系におけるよ
うには簡単でない。さらに、卵母細胞においてHuIFN−
β活性（たとえば、繊維芽細胞インターフェロン）をも
たらすmRNAにポリ（Ａ）RNAからヒブリド化するようなD
NA配列を含有すると云われるプラスミドの報告は、何ら
役に立たない。また、本発明の解決法は、純粋もしくは
ほぼ純粋なHuIFN−αmRNAをHuIFN−α遺伝子のクローン
化前に調製するための研究報告第18309号、第361〜632
頁（1979）における示唆とは異なる目的を有する。
最後に、DNA配列の選択または卵母細胞においてHuIFN
活性をもたらすようなmRNAにポリ（Ａ）RNAからヒブリ
ド化する組替えDNA分子の調製は、DNA配列または組替え
DNA分子のヒブリド挿入物がHuIFNに相当することを示す
には充分でないことを認めるべきである。寧ろ、HuIFN
の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドの
生成によってのみ、選択DNA配列もしくは構成組替えDNA
分子がHuIFNに相当することが実際に示される。さらに
重要なことは、HuIFN作用の後にのみDNA配列、組替えDN
A分子またはそれに関連する配列を用いて本発明のHuIFN
に対応する他の配列を選択しうることが示される点であ
る。
したがって、組替えDNA技術を使用してHuIFN−αを生
産する問題は上記した方法のいずれとも極めて異なるこ
とが、上記から判るであろう。ここでは、未知構造の特
定DNA配列（適当な宿主においてHuIFN−αの発現をコー
ドする）を、極めて複雑なDNA配列の混合物において見
出しかつそこから分離してこれをHuIFN−αの生産に使
用する。さらに、この位置決定および分離の問題は、複
合混合物において所望DNA配列の著しい低濃度が予想さ
れること、および所望配列を選択しかつ分離するため混
合物の多くのDNA配列を迅速分析する有効手段がないこ
とにより悪化される。
本発明は、適当な宿主においてHuIFN−αの発現をコ
ードするDNA配列を決定しかつ分離しそれによりDNA配列
と、組替えDNA分子と、宿主を形質転換させてひと白血
球インターフェロンの免疫学的もしくは生物学的活性を
示すポリペプチドを生産する方法とを提供することによ
り、上記の問題を解決する。
本発明により、抗ウイルス剤、抗腫瘍または抗癌剤お
よび方法に使用するための、HuIFN−αの免疫学的もし
くは生物学的活性を示すポリペプチドを得ることができ
る。本発明は、従来不可能であった量および方法でこれ
らポリペプチドの生産を可能にする。
以下の開示から判るように、本発明のDNA配列および
組替えDNA分子は、HuIFN−αの免疫学的もしくは生物学
的活性を示すポリペプチドの、適当な宿主における生産
を方向付けることができる。適当な宿主におけるこれら
DNA配列と組替えDNA分子との複製は、これらポリペプチ
ドをコードする遺伝子を多量に生産することを可能にす
る。これらポリペプチドおよび遺伝子の分子構造および
性質は、容易に決定することができる。ポリペプチドお
よび遺伝子は、宿主で生産されたまま或いは適当な誘導
化もしくは改変の後、組成物中におよびこれらの生産物
自身の生産を検知かつ改善する方法に使用することがで
き、かつ抗ウイルス剤および抗腫瘍もしくは抗癌剤およ
び方法に用することができる。
したがって、この方法は、上記の従来方法とは異な
り、DNA配列とHuIFN−αの免疫学的もしくは生物学的活
性を示す少なくとも一種のポリペプチドをコードする適
当なDNA配列を含んだ組替えDNA分子との調製および選択
を含む点において、上記従来方法と区別できる。
上記から判るように、本発明の基本的局面は、HuIFN
の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを
コードすることを特徴としかつＺ−pBR322（Pst）/HcIF
-4c、Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-2h、Ｚ−pBR322（Pst）/
HcIF-SN35、Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-SN42、Ｚ−pKT287
（Pst）/HcIF-2h-AH6のDNA挿入物と、これらDNA挿入物
のいずれかにヒブリド化するDNA配列と、これらDNA配列
もしくは挿入物のいずれかに対し単一もしくは多重のベ
ース置換、欠失、挿入および転位を含め突然変異に関連
して得られる天然、合成もしくは半合成の供給源を包含
するあらゆる供給源からのDNA配列と、前記DNA配列およ
び挿入物のいずれかのコドンの発現においてコードされ
るポリペプチドに類似した免疫学的もしくは生物学的活
性を発現においてコードするコドンの配列からなるDNA
配列とよりなる群から選択されるDNA配列を提供するこ
とであり、これらの配列は宿主においてインターフェロ
ンおよびインターフェロン様ポリペプチドの生産を可能
にする。
ここに記載した本発明をより充分に理解するため、以
下詳細に説明する。
本明細書中において、次の用語を使用する。
ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸塩と含窒素
複素環塩基とからなるDNAもしくはRNAの単量体単位。塩
基は、グルコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介し
て糖成分に結合される。塩基と糖との結合体はヌクレオ
シドと呼ばれる。各ヌクレオチドはその塩基を特徴とす
る。４種のDNA塩基はアデニン（“A"）、グアニン
（“G"）、シトシン（“C"）およびチミン（“T"）であ
る。４種のRNA塩基はA.G.Cおよびウラシル（“U"）であ
る。
DNA配列：燐酸ペントース３′炭素と５′炭素との間の
ホスホジエステル結合により互いに結合されたヌクレオ
チドの線状列。
コドン:mRNAを介してアミノ酸と翻訳開始信号と翻訳終
了信号とをコードする３種のヌクレオチド（トリプレッ
ト）のDNA配列。たとえばヌクレオチドトリプレットTT
A、TTG、CTT、CTC、CTAおよびCTGはアミノ酸ロイシン
（“Leu"）をコードし、TAG、TAAおよびTGAは翻訳停止
信号であり、ATGは翻訳開始信号である。
解読枠：アミノ酸配列までmRNAを翻訳する際のコドンの
グループ化。翻訳の際、適切な解読枠を維持せねばなら
ない。たとえば、配列GCTGGTTGTAAGは３つの解読枠（す
なわち相）において翻訳することができ、その各々は異
なるアミノ酸配列 を与える。
ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカル
ボキシル基との間のペプチド結合により互いに結合され
たアミノ酸の線状列。
ゲノム：細胞もしくはウイルスの全DNA。これは、特に
物質のポリペプチドをコードする構造遺伝子、ならびに
オペレータ、プロモータおよびリボソーム結合ならびに
たとえばシャイン−ダルガーノ配列のような配列を含め
て相互作用配列を包含する。
構造遺伝子：雛型もしくはメッセンジャーRNA（“mRN
A"）を介して、特定ポリペプチドに特徴的なアミノ酸配
列をコードするDNA配列。
転写：構造遺伝子からmRNAを生成する過程。
翻訳:mRNAからポリペプチドを生成する過程。
発現：ポリペプチドを生成するため構造遺伝子により受
ける過程。これは、転写と翻訳との組合せである。
プラスミド：安全「レプリコン」からなる非クロモソー
ム二重鎖DNA配列であり、これによりプラスミドは宿主
細胞内で複製される。プラスミドを単細胞微生物に入れ
ると、その生物の特性がプラスミドのDNA挿入の結果と
して変化または形質転換する。たとえば、テトラサイク
リン耐性（TetR）についての遺伝子を担持するプラスミ
ドは従前テトラサイクリンに感受性であった細胞をこれ
に対し抵抗性の細胞に形質転換させる。プラスミドによ
り形質転換された細胞を「（形質転換体）」と呼ぶ。
ファージまたはバクテリオファージ：細菌性ウイルスで
あり、その多くは蛋白質エンベロプもしくは被覆（「カ
プシド」）中にカプセル化されたDNA配列からなってい
る。
クローン化ベヒクル（cloning vehicle）：宿主細胞中
で複製しうるプラスミド、ファージDNAまたはその他のD
NA配列であり、これは１個または少数のエンドヌクレア
ーゼ認識部位を特徴とし、この部位においてこのDNA配
列はDNAの本質的な生物学的機能（たとえば再現性）、
被覆蛋白質の生成の喪失またはプロモータもしくは結合
部位の喪失を伴わずに決定可能に切断され、またこの部
位は形質転換細胞の同定（たとえばテトラサイクリン耐
性またはアンピシリン耐性）に使用するのに適する標識
を有する。クローン化ベヒクルはしばしばベクター（Ve
ctor）と呼ばれる。
クローン化：微生物またはDNA配列の増殖を得る過程で
あって、無性増殖によりこの種の一種の微生物または配
列から得られる。
組替えDNA分子すなわちヒブリドDNA:生体細胞の外部で
末端−末端結合されかつ宿主細胞に感染してそこに維持
される能力を有する、異なるゲノムからのDNA断片より
なる分子。
発現制御配列：構造遺伝子と作用結合した場合これら遺
伝子の発現を制御および調製するヌクレオチドの配列。
それらには、lac系、trp系、ファージλの主要オペレー
タおよびプロモータ領域、fdコート蛋白質の制御領域な
らびに原核もしくは真核細胞およびウイルスの遺伝子の
発現を制御することが知られたその他の配列が包含され
る。
IFN−α型のポリペプチドすなわちα型インターフェロ
ン：ひと白血球インターフェロンの免疫学的または生物
学的活性を有するポリペプチド 第１図について述べれば、これは組替えDNA分子の混
合物の製造方法における一実施態様の概略図であり、こ
こで組替えDNA分子の幾つかはひとつ白血球インターフ
ェロンの免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペ
プチドをコードする挿入DNA配列を特徴とする。
ひとインターフェロンmRNA（IFN−αmRNA）を含有する
ポリ（Ａ）RNAの製造 センダイ（Sendai）ウイルスを用いてひと白血球を37
℃で５時間誘発させ、次いで抽出してひと白血球インタ
ーフェロンmRNA（“HuIFN−αmRNA"）を含有するポリ
（Ａ）RNA混合物を得た。誘発はカンテル法によって行
なった〔ザ・インターフェロン・システム、第130〜131
頁およびそこに挙げられた引用文献〕。ポリ（Ａ）RNA
混合物を、その実際の割合とは無関係に第１図に示す。
誘発白血球を収穫し、1011個の細胞を水１中NaCl 8g
とKCl 0.2gとNa2HPO4・2H2O1.15gとKH2PO40.2gとを溶解
含有する溶液（“PBP"）１に再懸濁させ、これを激し
く攪拌しながら50l分液濾斗中の20mMトリス−HCl（pH7.
5）と1mM EDTA（“TE緩衝液”）と２％ドデシル硫酸ナ
トリウム（“SDS"）の17lに加えた。自己消化したプロ
ナーゼ（カルビオケム社）を200μg/mlまで加え、そし
てこの溶液を室温で１時間攪拌した。106カウント／分
（“cpm"）のＩ125−グロビンmRNAを、ポリ（Ａ）RNAを
回収しかつ次工程におけるmRNA分解を管理するための標
識として加えた。全容量の1/20に等しい量（“1/20容
量”）の2Mトリス−HCl（pH9）を加え、そして混合物を
15lの再蒸留フェノールにより激しく攪拌しながら10分
間抽出した。3lのクロロホルムを加えて混合物を５分間
攪拌した。30分間相分離させた後、水相を除去して再び
フェノールとクロロホルムとで抽出した。得られた水相
は全部で19.1であり、これを60gのSDSと合した。この
水相から、1/10容量の3M酢酸ナトリウム（pH5.5）と２
容量のエタノールとによって核酸を沈澱させた。
−20℃で一晩保存した後、プラスチック製篩を通して
の濾過により繊維状の核酸沈澱を取出した。次いでこの
物質を、0.5％SDSを含有する200mlのTNE〔50mMトリス−
HCl（pH7.5）、100mM NaCl、5mM EDTA〕と共に攪拌し
た。次いでこれを、さらにこの溶液350mlの添加により
溶解させた。非繊維状沈澱を、ソルバールRC−３型遠心
分離器において１ソルバール瓶中に5000rpmにて15分
間遠心分離することにより集め、0.5％SDSを含有するTN
E350ml中に溶解させた。２つのTNE溶液を合し、そして
１容量のフェノールで３回、1/2容量のエーテルで３回
および１容量のエーテルで３回それぞれ抽出した。水相
からのRNA回収は、260nmでの吸光度により測定して全部
で775mgであった。
ポリ（Ａ）RNA混合物の単離は、オリゴ（dT）セルロ
ース（タイプ７、Ｐ−Ｌビオケミカル社）に対する反復
バッチ吸着により行なった。2.7gのオリゴ（dT）セルロ
ースを、500mlすなわち上記のRNA含有溶液の約半量に加
えた。室温で１時間攪拌してポリ（Ａ）RNAをオリゴ（d
T）セルロースに吸着させた後、セルロースとこれに結
合されたmRNAの混合物とを遠心分離によって集め、50ml
のTNEで１回、次いで15mlのTNEで１回洗浄した。次い
で、結合したポリ（Ａ）RNAを、Ｈ2O 2mlでの５回連続
洗浄によって溶出させた。収量は、光学密度で測定して
ポリ（Ａ）RNA860μｇであった（調製物Ａ）。第一吸着
から得た上澄RNA溶液を、正確に上記と同様にしてさら
に２回の吸着サイクルにかけた。第二および第三吸着
は、それぞれ600μｇおよび170μｇのRNAを与え、これ
らを合した（調製物Ｂ）。
RNAをクセノプス・レビス（Xenopus laevis）の卵母
細胞に注入してHuIFN−αmRNAにつき分析した（ザ・イ
ンターフェロン・システム、第93〜95頁）。RNAを15mM
トリス−HCl（pH7.5）、88mM NaCl（“TNK緩衝液”）に
溶解させて約1mg/mlの濃度を得た。この溶液50nlを各50
個の卵母細胞中に注入した。これら卵母細胞をバース
（Barth）培地において室温で一晩培養した〔ゴード
ン、ジャーナル・エムブリオール・アンド・エキスペリ
メンタル・モーホロジー、第20巻、第401〜414頁（196
8）および同第７巻、第210〜222頁（1959）〕。次い
で、培養卵母細胞を洗浄し、パッスールピペットを用い
1.5mlエッペンドルフ遠心分離管中で0.5mlの52mMトリス
グリシン緩衝液（pH8.9）中においてホモジナイズし
た。混合物をエッペンドルフ遠心分離器にて２分間遠心
分離し、上澄液を抜き取りそして−20℃で凍結させて分
析した。IFN−α活性はプラーク減少分析によって測定
した〔エッチ・ストランダーおよびケー・カンテル、
「試験管中におけるひと白血球によるインターフェロン
の生産」、Ann.Med.exp.Fenn.、第44巻、第265〜273頁
（1966）〕。１単位のIFN−αはウイルスプラークを50
％減少させる。IFN−α調製物の活性は、ひと基準HuIFN
−α69/19に関して表わす〔インターフェロンおよびイ
ンターフェロン誘発剤の基準化に関する国際シンポジュ
ウム、1969〕。代案として、分析は主として次の文献に
記載された細胞病理学的効果の減少に基づいて行ない
〔ダブリュー・イー・スチュアート・IIおよびエス・イ
ー・スルキン、「ラビースウイルスを実験的に感染させ
たハムスターにおけるインターフェロン生産」、プロシ
ーディング・ソサイエティ・エキスペリメンタル・バイ
オロジカル・メディスン、第123巻、第650〜653頁（196
6）〕、ただしのこの場合ひとCCL-23細胞を使用しかつ
メンゴウイルスを用いて実験した。卵母細胞抽出物は、
注入RNAの１μｇ当り300IUのIFN−α活性を有した。後
者の分析においては、注入卵母細胞の培養を48時間行な
い、大部分のインターフェロンが卵母細胞により分泌さ
れるため、培養培地のみを分析した〔エー・コールマン
およびジェー・モルサー、「キセノプス・レビスの卵母
細胞からの蛋白質の分泌」、セル誌、第17巻、第517〜5
26頁（1979）〕。ポリ（Ａ）RNAをさらに精製するた
め、充分量の0.5Mエチレンジアミンテトラ酢酸（“EDT
A"）をポリ（Ａ）RNA調製物Ａに加えて濃度を5mM EDTA
にした。得られた溶液を等容量のTNE−飽和フェノール
で２回および等容量のエーテルで５回抽出した。次い
で、これを0.1mlのチエレックス−100のビオ−ラドカラ
ム（Chelex-100Bio-Rad column）に通し、100℃にて90
秒間加熱し、そして50mMトリス−HCl（pH7.5）と1mM ED
TAと0.2M NaClとを含有する13mlの５〜23％蔗糖濃度勾
配に曝した。制限酵素HindIIIとPstＩとによりpBR322を
同時切断して生成させた５′−末端Ｐ32ラベルしたDNA
断片（ニューイングランドビオラブス社）の10,000cpm
をサイズ標識として加えた。SW40型ロータで10℃かつ3
5,000rpmにて16時間遠心分離した。フラクション（0.6m
lづつ）をISCOグラジエントコレクターにより1ml/min.
の速度で集めた。これらのフラクションを上記したよう
に、HuIFN−αmRNAにつき分析し、P32-DNA標識に対する
それらの位置を、後の参考のため記録した。後の遠心分
離において、HuIFN−αmRNA含有フラクションを標識と
比較して同定した。HuIFN−αmRNA活性を有するフラク
ションは80μｇのポリ（Ａ）RNAを含有した。これら
を、0.5％SDSおよび0.02％ポリビニルサルフエート（後
の調製においてはポリビニルサルフエートを省略した）
を含有する２容量のTNEと混合し、50μｌのオリゴ（d
T）セルロースカラムに加えた。上記したようにカラム
を洗浄した後、RNA混合物40μｇを0.6mlの無菌蒸留水で
４回洗浄して溶出させた。エタノール沈澱させた後、RN
Aを0.5mMのEDTA中に1mg/mlとなるよう溶解させた。
HuIFN−αmRNA活性の分析を、上記したように、ポリ
（Ａ）RNA沈澱の一部について行なった。これは、注入R
NA1μｇ当り3600IUのインターフェロンの比活性を有し
た。したがって、蔗糖濃度勾配は、ポリ（Ａ）RNAをHuI
FN−αmRNAに関し約10倍濃化させた。次の同様な調製に
おいて、約40倍の濃化が得られた。調製物Ｂを同様に精
製し、そしてこれは調製物Ａと同様な比活性を有したの
で、両者をプールした。
この時点において、蔗糖濃度勾配処理から得られたポ
リ（Ａ）RNA生成物でさえ極めて多数の異なるmRNAを含
有することを認めるべきである。IFN−αに対して特異
的なmRNAを除き、他のmRNAは望ましくない汚染物である
（第１図）。不都合なことに、これら汚染RNAは、本発
明の残余のクローン化過程全体においてHuIFN−αmRNA
と同様に挙動する。したがって、ポリ（Ａ）RNA中にそ
れらが存在すると、IFN−α以外のポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含有する多数の望ましくない細菌クロー
ンの最終的調製物が生ずる。この汚染は、所望のIFN−
αヒブリドクローンの単離において複雑な選別問題を提
起する。IFN−αの場合、この選別問題は、所望クロー
ンを同定するための選別比較試料として作用するHuIFN
−αmRNAまたはDNAもしくはその一部の精製試料が充分
存在しないためさらに悪化する。したがって、IFN−α
クローンの選別過程は極めて時間がかかりかつ困難とな
る。さらに、極めて少割合のIFN−αクローンしか生物
学的活性型または免疫学的活性型においてIFN−αを発
現することが期待されないので、活性クローンの単離は
わら山から針を探すような選別過程になる。
有利なことに、本発明は組替えDNA技術を用いて、HuI
FN−αmRNAまたはcDNAもしくはその一部の精製試料を得
ることができる。この精製mRNAまたはcDNAを使用して極
めて多数の細菌クローンを迅速に選別しかつそれにより
活性型でIFN−αを発現するクローンを単離する確率が
著しく増大する。
HuIFN−αcDNAを含有するcDNA混合物の合成 IFN−αmRNAが濃化されたポリ（Ａ）RNA調製物（Ａ＋
Ｂ）を雛型として使用して、単一鎖の相補DNA（cDNA）
を調製した（第１図）〔エー・エフストラチアジス等、
「グロビンおよびコリオンmRNAの全体的および個々の部
分的な逆転写」、セル誌、第４巻、第367〜378頁（197
5）およびそこに引用されている文献〕。800μｌの反応
混合物は40mMのトリス−HCl（pH7.5）と、30mMのNaCl
と、5mMのMgCl2と、0.5mMのDTT（カルビオケム社）と、
20μg/mlのオリゴ（dT）12〜18（Ｐ＆Ｌビオケミカルス
社）と、5mMのdGTP（シュワルツ社）、dCTP（レボサン
社）およびdTTP（シグマ社）と、5mMのP32-dATP（NEN、
比活性100,000cpm/nモル）と、60μg/mlのポリ（Ａ）RN
Aと、280単位の鳥類骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写
酵素〔フロリダ州セントピータースブルグ在ライフサイ
エンス社から寄贈〕とを含有した。37℃で１時間培養し
た後、0.5MのEDTAと20％のSDS（再結晶したもの）を10m
MのEDTAおよび0.1％のSDSまで加えた。この混合物を１
容量のフェノール（蒸留物）で抽出した。フェノール相
を200μｌの200mMトリス−HCl（pH7.5）と1mM EDTAと0.
1％SDSとで洗浄し、水相を合した。これらを等容量のエ
ーテル（フルカ社、プロアナル）で抽出し、TNE中5mlの
セファデックスＧ−100カラムにてクロマトグラフにか
けた。0.1mlづつのフラクションを0.3ml/min.の速度で
集めた。放射能（セレンコフ放射線により測定）を示す
フラクションを合し、3Mの酢酸ナトリウムを0.3Mまで加
えた。この核酸を2.5容量のエタノールで沈澱させた。
−20℃で一晩保存した後、試料を遠心分離しそして上澄
液を捨てた。この沈澱を180μｌの蒸留水中に溶解さ
せ、シリコーンライニングしたエッペンドルフ管に移し
た。20μｌの5M NaOHを加え、混合物を室温で40分間保
った。20μｌの5M酢酸ナトリウムと100μｌの蒸留水と5
00μｌのエタノールとを加えた。−20℃にて一晩冷却し
た後、生じた沈澱を重力の10,000倍（10,000xg）に相当
する力で０℃にて20分間遠心分離することにより、回収
した。単一鎖cDNAの収量は10μｇであった。
ここでも、上記のように調製した単一鎖cDNA精製物は
実際的に、ポリ（Ａ）RNA混合物中に存在する対応のmRN
Aから転写された多数の異なるcDNAの複合混合物である
ことを理解すべきである（第１図）。これらcDNAのうち
極めて少量のみがIFN−α関連性、すなわちHuIFN−αcD
NAである。他の要因も作用してcDNA混合物を複雑化さ
せ、ポリ（Ａ）RNA混合物の各mRNA種は通常完全には転
写されない。寧ろ、各mRNA種に関し、転写過程はmRNAの
末端に達する前に停止すめことがある。したがって、各
mRNA種から多種類のcDNAが生成されうる（第１図に示さ
ず）。各種類は後のクローン化過程において多かれ少な
かれ同様に挙動し、したがって特定蛋白質に関する遺伝
子の断片のみを有する組替えDNA分子を含有した細菌ク
ローンが生産されるであろう。これら断片含有クローン
の存在は、さらに最終的なクローン選別過程を複雑化さ
せる。
各種の単一鎖cDNAの寸法は、少量をアルカリ性２％ア
ガロースゲル上に、電解質として30mMのNaOHと2mMのEDT
Aとを使用して電気泳動させることにより測定した〔エ
ム・ダブリュー・マクドネル等、「T7DNAの制限断片の
分析ならびに中性およびアルカリ性ゲルにおける電気泳
動による分子量の測定」、ジャーナル・モレキュラー・
バイオロジー、第110巻、第119〜146頁（1977）〕。P32
-cDNAは、サイズ標識として使用した単一鎖グロビンcDN
AおよびＰ32−標識したDNA断片に比べ、600〜1000ヌク
レオチドの長さを有した。
二重鎖cDNAの調製 単一鎖cDNAは、DNAポリメラーゼＩで処理して二重鎖
にすることができる〔ティー・マニアチス等、「試験管
中で合成したβ−グロビン遺伝子の拡大および特性
化」、セル誌、第８巻、第163〜182頁（1976）〕。上記
からの沈澱した単一鎖cDNAを200μｌのＨ2Ｏ中に溶解さ
せ、100℃にて２分間加熱し、そして50μｌの0.1M熱変
性燐酸カリウム緩衝液（pH6.9）とし10mMのMgCl2と10mM
のDTT（カルビオケム社）と各1mMのdATP（メルク社）、
dGTP（シュワルツ社）およびdCTP（レボサン社）と1mM
のＨ3-dTTP（NEN、比活性100,000cpm/nモル）と150単位
/mlのイー・コリDNAポリメラーゼＩ（ベーリンガー・マ
ンハイム社）とにおいて培養した。15℃にて6.5時間の
後、0.5MのEDTAと20％のSDSを10mMのEDTAおよび0.1％の
SDSまで加えた。次いで混合物を500μｌのフェノールで
抽出し、フェノール相を250μｌの20mMトリス−HCl（pH
7.5）と5mM EDTA（“TE緩衝液”）とで再抽出した。２
つの水相を合し、前記したと同じ条件下で5mlのセファ
デックスＧ−100カラム上でクロマトグラフにかけた。
酢酸ナトリウム（3M）を0.3Mまで加え、2.5容量のエタ
ノールを混合してDNAを沈澱させた。全部で13μｇのDNA
が回収された。
DNAをヌクレアーゼＳ1で処理した〔このヌクレアーゼ
Ｓ1は、アール・シー・ビーガンド等、「アスペルギル
ス・オリゼーからのＳ1ヌクレアーゼの特異性」、ジャ
ーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第250巻、第8
848〜8855頁（1975）の方法により調製した〕。沈澱し
たDNAを250μｌのＳ1緩衝液（0.2MのNaCl、50mMの酢酸
ナトリウム（pH4.5）、10mMの硫酸亜鉛）に溶解させ、3
7℃にて30分間加温した。1.5μｌのＳ1酵素（11単位／
μｌ）を加え、混合物を37℃で30分間培養した。SDSとE
DTAとを0.1％SDSおよび5mM EDTAまで加え、そして混合
物を250μｌのフェノールで抽出した。フェノール相を1
00μｌのTE緩衝液で洗浄した。水相を合し、TNEにおい
てセファデックスＧ−100（ファーマシア社）カラム上
でクロマトグラフにかけ、0.1mlづつのフラクションを
0.3ml/min.の速度で集めそして各フラクションノセレン
コフ放射線を測定した。上記したようにエタノールと酢
酸ナトリウムとで沈澱させた後、８μｇの二重鎖cDNAを
回収した。
ここでも、上記で生産した二重鎖cDNAは多数のcDNAと
その断片との混合物であり、その極く少数のみがHuIFN
−αcDNAもしくはその断片であることを認めねばならな
い（第１図）。
二重鎖DNAのクローン化 多種類の宿主／クローン化ベヒクルの組合せ物を使用
して、上記のように調製された二重鎖cDNAをクローン化
させた。たとえば、有用なクローン化ベヒクルは染色
体、非染色体および合成DNA配列の断片、たとえば各種
公知の細菌プラスミド、たとえばcolE1、pCR1、pBR322
およびそれらの誘導体を含む大腸菌（イー・コリ）から
のプラスミド、広範囲の宿主のプラスミド、たとえばRP
4、ファージDNA、たとえばファージλの多数の誘導体、
たとえばNM989、ならびにプラスミドとファージDNAとの
組合せから生じたベクター、たとえばファージDNAもし
くは他の発現制御配列を用いて改変させたプラスミドま
たは酵母プラスミド、たとえば２μプラスミドもしくは
その誘導体から構成することができる。有用な宿主は細
菌宿主、たとえば大腸菌の菌株、たとえばイー・コリHB
101、イー・コリX1776、イー・コリX2282、イー・コリM
RCIおよびシュードモナス（Pseudomonas）、枯草菌（Ba
cillus subtilis）、高熱菌（Bacillus stearothermoph
ilus）およびその他バチルスの菌株、酵母およびその他
の真菌類、動物もしくは植物宿主、たとえば動物（人間
を含む）もしくは培養した植物細胞またはその他の宿主
を包含する。勿論、必らずしも全ての宿主／ベクター組
合せ物が同等に有効ではない。宿主／クローン化ベヒク
ル組合せの特定の選択は、示した原理を適当に考慮して
当業者により、本発明の範囲を逸脱することなく行なう
ことができる。
さらに、各特定クローン化ベヒクル内において、種々
の部位を選択して二重鎖DNAを挿入することもできる。
これらの部位は通常、これらを切断する制限エンドヌク
レアーゼにより命名することができる。たとえば、pBR3
22においてPstＩ部位は、β−ラクタマーゼ用の遺伝子
において、その蛋白質のアミノ酸181および182をコード
するヌクレオチドトリプレットの間に位置する。この部
位は、ラッテのプロインシュリン抗原決定因子を示す蛋
白質の合成において、ビラーカマロフ等（上記）によっ
て用いられた。２つのHindIIエンドヌクレアーゼ認識部
位の一方はアミノ酸101および102をコードするトリプレ
ットの間に存在し、また数個のTaq部位の一つはpBR322
におけるβ−ラクタマーゼのアミノ酸45をコードするト
リプレットに存在する。同様に、このプラスミドにおけ
るEcoRI部位およびPvuII部位は、コード化域の外部に存
在し、EcoRI部位はそれぞれテトラサイクリンおよびア
ンピシリン耐性をコードする遺伝子の間に位置する。こ
の部位は、イタクラ等およびゲデル等により、組替え合
成法（上記）において使用された。これらの部位は当業
者により充分認識されている。勿論、本発明に有用なク
ローン化ベヒクルは、選択DNAを挿入するための制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を有する必要のないことを理解す
べきである。寧ろ、ベヒクルは別の手段により断片に結
合させうるであろう。
ベクター、すわちクローン化ベヒクル、特に選択DNA
断片を結合させて組替えDNA分子を生成させるためそこ
に選択される部位は、種々の要因たとえば特定制限酵素
に対し感受性部位の数、発現すべき蛋白質の大きさ、宿
主細胞酵素により蛋白質分解を受ける所望蛋白質の感受
性、精製の際除去困難な宿主細胞蛋白質により発現すべ
き蛋白質の汚染、たとえばベクター配列に関する開始お
よび停止コドンの位置のような発現特性ならびに当業者
により認められるその他の要因のような各種の要因によ
り決定される。ベクターおよび特定遺伝子用の挿入部位
は、これら要因のバランスにより決定され、必らずしも
全ての選択が一定の場合に対し同等に有効であると限ら
ない。
外来DNAをクローン化ベヒクルすなわちベクター中に
挿入して組替えDNA分子を生成させるには幾つかの方法
が当分野で知られているが、本発明による第一の構成に
好ましい方法はビラーカマロフ等（上記）により記載さ
れ、第１図に示されている。この方法は、プラスミド
（特にpBR322）を挿入用に選択された部位（特にPst
Ｉ）に特異的な制限酵素により切断し、そしてdGMP末端
を末端トランスフェラーゼにより末端付加させることを
特徴とする。dGMP末端は切断プラスミドの５′末端に付
加されて、PstＩ部位を再生すると共に、相補的末端を
有するcDNA断片への結合を可能にする。同様に、二重鎖
cDNAは、dCMP末端を処理プラスミドに対する結合を可能
にする３′末端に付加させて伸長される。次いで処理プ
ラスミドとcDNAとをアニールして、プラスミドの適当な
部位にcDNAを挿入すると共にヒブリドDNAを環化させ、
末端の相補的性質はそれらの凝集を可能にする（第１
図）。かくして、生じた組替えDNA分子は、選択制限部
位に遺伝子を有する（第１図）。
勿論、DNA配列をクローン化ベヒクル中に挿入して組
替えDNA分子を生成させるその他の公知方法も、同等に
本発明において有用である。これらは、たとえば直接的
結合、合成リンカー、エキソヌクレアーゼおよびポリメ
ラーゼ結合修復反応に続く結合、或いはDNAポリメラー
ゼと適当な単一鎖雛型とによるDNA鎖の伸長に続く結合
を包含する。
勿論、クローン化ベヒクルの選択位置に挿入されたヌ
クレオチド配列まはcDNA断片は、所望ポリペプチド用の
実際の構造遺伝子の一部でないヌクレオチドも包含する
ことができ、或いは所望蛋白質用の完全構造遺伝子の断
片のみも包含することができることを了解すべきであ
る。何らかのDNA配列が挿入されて形質転換した宿主がH
uIFN−αの生物学的もしくは免疫学的活性を有するポリ
ペプチドを生産すること、或いはHuIFN−αの免疫学的
もしくは生物学的活性を有するポリペプチドの生産に有
用なDNA配列を含んだクローンを選択するためDNA配列自
身がヒブリド化試料として使用できることのみが必要と
される。
外来遺伝子を含有するクローン化ベヒクルすなわちベ
クターを使用して、ヒブリドDNAによりコードされる蛋
白質またはその一部を宿主が発現しうるようこの宿主を
形質転換させる。適当な宿主の選択も、当分野で知られ
た多くの要因により管理される。これら要因には、たと
えば選択ベクターとの適合性、ヒブリドプラスミドによ
りコードされる蛋白質の毒性、所望蛋白質の回収の容易
さ、発現特性、生物安全性および価格が包含される。こ
れら要因をバランスさせるには、必らずしも全ての宿主
が特定の組替えDNA分子を発現するのに同等に有効でな
いと云う理解を考慮せねばならない。
この合成において、好適な初期クローン化ベヒクルは
細菌性プラスミドpBR322であり、好適な初期制限エンド
ヌクレアーゼ部位はPstＩ部位である（第１図）。この
プラスミドは、抗生物質アンピシリン（Amp）およびテ
トラサイクリン（Tet）に対する耐性遺伝子を有する小
型（分子量約2.6メガダルトン）のプラスミドである。
プラスミドは完全に特性化されている〔エフ・ボリバー
ル等、「新規クローン化ベヒクルIIの構成および特性
化。多目的クローン化システム」、ジーン誌、第95〜11
3頁（1977）；ジェー・ジー・サットクリッフ、「DNA配
列から生ずるpBR322制限地図。4361ヌクレオチド対の長
さまでの正確なDNAサイズ標識」、ヌクレイック・アシ
ッド・リサーチ、第５巻、第2721〜2728頁（1978）〕。
この部位におけるDNA生産物の挿入は多数の細菌クロー
ンを与え、その各々は予め調製されたDNA生産物を存在
するDNA遺伝子もしくはその断片の一つを含有する。こ
こでも、これらクローンの極く少数のみがIFN−αもし
くはその断片用の遺伝子を含有する（第１図）。本発明
における初期クローン化用の好適宿主はイー・コリHB10
1である。イー・コリX1776を用いて他の実験を行なった
が、この宿主は英国特許第1,516,458号に記載されてお
り、アメリカ合衆国、メリーランド州ロックビル在のア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）
に寄託され、ATCC番号第31244号が付与されている。
1.PstＩ−開裂され、dGMP−伸長されたpBR322の調製 プラスミドpBR322（20μｇ）を21単位のPstＩエンド
ヌクレアーゼ（MREポートンダウンス社またはニューイ
ングランド・ビオラブス社）により、150μｌの10mMト
リス−HCl（pH7.5）と6mMのMgCl2と50mMのNaClと6mMの
２−メルカプトエタノールと200mg/μｌの牛血清アルブ
ミン（“BSA"）（カルビオケム社）との中で切断した。
37℃にて２時間の後、混合物を１容量のフェノール−ク
ロロホルム（1:1）と１容量のエーテルとで抽出しそし
てエタノールにより沈澱させた。
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Td
T）〔エフ・ジェー・ボルム、「子牛胸腺からのデオキ
シヌクレオチド重合酵素」、メソッド・イン・エンチモ
ロジー（エル・グロスマンおよびケー・モルデーブ
編）、アカデミック・プレス社、ニューヨーク、第128
巻、第591〜611頁（1968）により精製〕による単独重合
dGMP末端の付加（第１図）を、100mMのカコジル酸ナト
リウム（pH7.2）と10mMのNaH2PO4と5mMのMgCl2と1mMのd
GTPと50μg/μｌのBSAと３〜６単位のTdT（上記のよう
に精製）とをDNA1μｇ当りに含有する328μｌの反応容
量にて行なった。培養を37℃にて20分間行なった。EDTA
を10mMまで加えそして混合物を上記のように抽出し、TN
E緩衝液に対し２日間透析した。
2.dCMP伸長させたDNAの調製 二重鎖DNAを標準法（たとえば、ビラーカマロフ等、
上記）によりdCMP残基で伸長された。上記の二重鎖cDNA
150ngを、100mMのカコジル酸ナトリウム（pH7.2）と2.5
mMのCoCl2と50μg/μｌのBSAとDNA1μｇ当り３〜６単位
の精製TdTを含む0.1mMのdCTPとの８μｌ中で27℃にて８
分間培養し、次いで−20℃にて凍結させた。前記と同
様、dCMP伸長させたDNAは種々異なる種類の混合物であ
り、そのうち極く少数のみがIFN関連性であった（第１
図）。
3.Ca++処理されたイー・コリX1776の調製 イー・コリX1776の単一コロニーを、100μg/mlのジア
ミノピメリン酸（コッホライト・ラボラトリース社）と
10μg/mlのナリジキシン酸（カルビオケム社）と10μg/
mlのテトラサイクリン（アクロマイシン、アメリカン
シアナミド社）とが加えられた100mlのトリプトン培地
中に接種した〔シー・ワイスマンおよびダブリュー・ボ
ル、「組替えプラスミドDNAの調製における起こりうる
害の減少」、ネイチャー誌、第261巻、第428〜429頁（1
976）〕。培養物を、650nm（OD650）にて0.6の見掛け光
学密度（ベックマンDB型分光光度計にて測定）まで37℃
にて生育させ、氷中で30分間冷却させた。次いで、培養
物をソルバールH4型スウイングバケットロータにて400r
pmで沈降させ、細胞を50mlの10mM NaClで洗浄し、遠心
分離によって分離除去しそして20mlの100mM CaCl2中に
再懸濁させた。懸濁物を氷中で30分間冷却し、遠心分離
により粒状化させて4mlの100mM CaCl2中に再懸濁させ、
そして氷上で一晩放置した後使用した。形質転換用とし
てイー・コリHB101をエム・マンデルおよびエー・ヒガ
の方法〔「カルシウム依存性バクリテオファージDNA感
染」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第53
巻、第159〜162頁（1970）〕により調製した。一部（0.
5ml）を−70℃で凍結状態に保ち、少なくとも３ケ月間
その活性を保持した。
4.dGMP伸長されたpBR322およびdCMP伸長されたDNAのア
ニール化末端PstＩ−開裂pBR322と末端 cDNAとのアニール化を文献〔ジェー・ファン・デン・
ベルグ等、「２つの同族対のイントロンの強力な多様性
を示すクローン化された兎とねじみとのβ−グロビン遺
伝子の比較」、ネイチャー誌、第276巻、第37〜44頁（1
978）〕に記載されているように行なった。8ngのdCMP伸
長されたDNA生成物を22ngのdGMP伸長されたPstＩ−開裂
pBR322と、TNE緩衝液50μｌ中で混合した。培養を65
℃、46℃、37℃および20℃にて順次に４段階で１時間づ
つ行なった。100mMのトリス−HCl（pH7.5）と100mMのCa
Cl2と100mMのMgCl2と50μｌのTNE緩衝液とを含有する20
μｌを加えそして混合物を氷中で20分間冷却した。
勿論、生成物は種々異なる組替えDNA分子と、挿入DNA
配列のない若干のクローン化ベヒクルとの混合物であ
る。しかしながら、各組替えDNA分子はPstＩ部位にcDNA
断片を含有する。この種のcDNAの各々は遺伝子またはそ
の断片からなることができる。cDNA断片の極く少数のみ
がIFNまたはその部分をコードする（第１図）。大多数
は他の蛋白質またはその部分の一種をコードし、それら
のmRNAは本発明の方法に使用されるポリ（Ａ）RNAの一
部であった（第１図）。
5.アニールされたヒブリドプラスミドによるイー・コリ
X1776の形質転換 組替えDNA分子の混合物によるイー・コリX1776の形質
転換はシェー・ファン・デン・ベルグ等（上記）により
記載されているように行なった。P3封鎖手段を用いて形
質転換過程と全ての次工程とを行ない、そこにおいて得
られた形質転換細菌を処理した。アニールしたpBR322組
替えDNA分子を100μｌの予め調製されたCa++処理したイ
ー・コリX1776に加え、混合物を氷中で20分間冷却し、2
0℃にて10分間加熱し、そして0.6mlのトリプトン培地を
加えた。混合物を、上記のように添加された２枚のトリ
プトン培地寒天板に接種した。形質転換効率はアニール
pBR322の１μｇ当り3.3×104個のコロニーであり、原pB
R322は１μｇ当り３×106個のコロニーを与えた。
プラスミドpBR322はテトラサイクリン耐性に関する遺
伝子を含むので、その完全遺伝子を有するプラスミドで
形質転換させたイー・コリ宿主は、そのように形質転換
させてない細菌を除き、その抗生物質を含有する培養物
において増殖するであろう。したがって、テトラサイク
リン含有培養物における増殖は、組替えDNA分子または
再使用ベクターにより形質転換させた宿主の選択を可能
にする。
37℃にて48時間の後、個々のコロニーを採取してこれ
らをミクロ測定板（ダイナテク社）の穴部における100
μｌのトリプトン培地（上記のように添加したもの）に
懸濁させた。37℃にて一晩培養した後、100μｌの40％
グリセリンを各穴中に混入した。測定板を−20℃に保存
し、そして形質転換イー・コリX1776の100,000個の個々
のクローンを調製した。
これら100,000個のクローンは、IFN生成性白血球から
のポリ（Ａ）RNA調製物においてmRNAの混合物の完全も
しくは部分的コピーを示す各種の組替えDNA分子を含有
する（第２図）。これらの大多数は単一の組替えDNA分
子のみを含有するであろう。これら組替えDNA分子の極
く少数のみがIFNに関連する。したがって、クローンを
選別してIFN関連クローンを他のものから分離せねばな
らない。
HuIFN−αcDNAを含有するクローンの選別 ひと白血球インターフェロンcDNA（“HuIFN−αcDN
A"）を含有する細菌クローンを選別するための幾つかの
方法がある。これらには、たとえばRNA選択ヒブリド化
〔アルウイン等、（下記）〕、差別ヒブリド化〔ティー
・ピー・セントジョーンおよびアール・ダブリュー・デ
ービス、「差別プラークフイルターヒブリド化によるサ
ッカロミセス・セレビシェからのガラクトース誘発DNA
配列の単離」、セル誌、第16巻、第443〜452頁（197
9）；ヘージメーカース等、下記〕、合成試料によるヒ
ブリド化〔ビー・ノイエス等、「オリゴデオキシヌクレ
オチド試料を使用するガストリンmRNAの検出および部分
的配列分析」、プロシーディング・ナショナル・アカデ
ミー・サイエンス・USA、第76巻、第1770〜1774頁（197
9）〕または免疫学分析（エル・ビラーカマロフ等、上
記）もしくは生物学的分析（エー・シー・ワイ・チャン
グ等、上記）による所望蛋白質を生成するクローンの選
別が包含される。本発明は、IFN−αcDNAを含有するク
ローンの第一次選別のための最も便利かつ有望な方法と
してRNA選択ヒブリド化を選択した。
A.RNA選択ヒブリド化分析 1.初期分析の概要 次に第２図について述べれば、組替えDNAを、上記ク
ローン貯蔵物（第２図に示した２クローンの２つの混合
物）における512個のクローンの混合物の培養物から単
離した（工程Ａ）。このバッチサイズを選別する理由を
以下に説明する。組替えDNA分子を開裂させ、変性させ
そして前記したように調製したIFN−αmRNAを含有する
白血球ポリ（Ａ）RNAまでヒブリド化させた（工程
Ｂ）。全ての組替えDNA分子−ポリ（Ａ）RNAヒブリドを
非ヒブリド化ポリ（Ａ）RNAから分離した（工程Ｃ）。
ポリ（Ａ）RNAをヒブリドから回収しかつ精製した（工
程Ｄ）。回収したRNAを上記のようにIFN−αmRNA活性に
つき分析した（工程Ｅ）。もしも組替えDNA分子の混合
物が厳格なヒブリド化条件の下でポリ（Ａ）RNA中のIFN
−mRNAにヒブリド化しうる挿入ヌクレオチド配列を持っ
た組替えDNA分子を含有するならば、そのヒブリドから
遊離されたmRNAは卵母細胞中においてIFN−αの生成を
もたらすであろう。何故なら、その他の如何なる組替え
DNA分子−ポリ（Ａ）RNAヒブリドから遊離されたmRNAも
IFN−α関連性でないからである。512個のクローンの群
が正の反応を示せば、これらクローンを64個づつの８ロ
ットに再組分けして、各ロットにつき上記のように分析
した。この処理を、この分析に応答する単一のクローン
が同定されるまで続けた。
形質転換されかつこのように同定された組替えDNA分
子および細菌クローンがIFN−αの完全なIFN−αcDNA配
列を含有したり、或いはDNA配列が実際にIFN−αをコー
ドする保証はない。しかしながら、組替えDNA分子はIFN
−αmRNAコード配列に相補的な広汎なヌクレオチド配列
を確実に含有する。したがって、組替えDNA分子は、他
の組替えDNA分子およびそれにより形質転換されたクロ
ーンを迅速選別するための試料の供給源として使用する
ことにより、標準的および完全なIFN−αヌクレオチド
コード配列を含有しうる別の群のクローンを同定するこ
とができる。
2.理論的考察 ヒブリド化（工程Ｂ）の条件は臨界的である。組替え
DNA分子とポリ（Ａ）RNAとの絶縁濃度および比は、反応
速度と化学量論とを考慮して選択せねばならない。適正
な選択は、ポリ（Ａ）RNAにおけるIFN−αmRNAの割合が
未知であるため、困難である。制御されかつ充分な速度
を確保するため、組替えDNA分子からのDNA配列の濃度が
推定IFN−αmRNA濃度に比較して過剰となる条件の下で
行なった。512個の可能な種々異なる組替えDNA分子の混
合物において、IFN−α関連DNA配列（“IFN−αRDNA"）
は全く生じない（負の分析値を与える）か、或いは組替
えDNA分子の少なくとも約1/512を構成する。組替えDNA
分子混合物の濃度およびしたがってIFN−αRDNAの濃度
をヒブリド化工程で調製して、充分なヒブリド化割合を
確保することができる。さらに、反応混合物中のIFN−
αRDNAの量は、ポリ（Ａ）RNAからの充分な量のIFN−α
mRNAを結合して、組替えDNA分子−ポリ（Ａ）RNAヒブリ
ドから回収されたmRNAを卵母細胞に注入した後にIFN−
αの検出を可能にするのに足る量でなければならない。
用いうる分析によりIFN−αを検出するには、その濃
度は100IU/mlもしくはそれ以上にしなければならない。
反復測定のためには0.5mlづつを必要とするので、50IU
を卵母細胞中に発生させるべきである。前記で使用した
誘発白血球からのポリ（Ａ）RNAは、その１μｇを卵母
細胞中に注入すると、約500IUのIFN−αを発生する。し
たがって、必要とする50IUを発生させるには、少なくと
も0.1μｇのポリ（Ａ）RNAを注入せねばならない。兎グ
ロビンmRNAと兎β−グロビンcDNAクローンとを用いたモ
デル実験は、ヒブリド化ミックスに加えたＩ125−グロ
ビンmRNAに対し卵母細胞中のＩ125−グロビンmRNAの全
回収率が約10％であり、かつmRNA活性の回収率が約５％
であることを示した。したがって、ヒブリド化分析用に
は少なくとも0.1/0.05＝２μｇの白血球ポリ（Ａ）RNA
を使用すべきである。充分安全な限界を確保するには、
１回の分析当り12μｇのポリ（Ａ）RNAを使用した。
12μｇのポリ（Ａ）RNA中のIFN−αmRNAを結合させる
には、組替えDNA分子からのどの程度のDNAが必要とされ
るかを計算するため、ポリ（Ａ）RNAのIFN−αmRNA含有
量を推定した。１μｇのポリ（Ａ）RNAは500IUのIFを発
生させる。IFN−αの比活性は２×108〜109IU/mg蛋白質
である。したがって、500IUのIFN−αは500/2×108＝2.
5×10-6mg（2.5ng）〜500/109＝５×10-7mg（0.5ng）の
インターフェロンに対応する。
卵母細胞中に注入したIFN−αmRNAの量と生成されたI
FN−αの量との間の関係は未知である。β−グロビンmR
NAの場合、mRNA1分子当り約30分子の蛋白質が１時間当
りに生成され、この値はβ−グロビン対し約６である
〔ジェー・ビー・グルドン等、「注入フロッグ卵母細胞
における伝達安定性：長寿命の哺乳動物およびβ−グロ
ビン伝達」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジ
ー、第80巻、第539〜551頁（1973）〕。IFN−αに関し
平均値が20であり、IFN−αに関し分子量が18,000であ
りかつIFN−αmRNAに関し分子量が330,000であると仮定
すれば、26mg（18,000/330,000×20×24）のIFN−αが
注入IFN−αmRNA1mg当りに24時間で生成される筈であ
る。もしIFN−αの比活性が２×108/mg（２×102IU/n
g）であるとすれば、1ngのIFN−αmRNAは26×２×102＝
5.2×103IUのIFN−αを生成するであろう。比活性が109
/mg（103IU/ng）であるとすれば、生成するIFN−αの量
は2.6×104IUとなるであろう。１μｇの白血球ポリ
（Ａ）RNAは上記の仮定条件の下で500IUのIFN−αを生
成するので、１μｇのポリ（Ａ）RNA中のIFN−αmRNAの
濃度は0.1ng〜0.02ngに低下し、白血球ポリ（Ａ）RNAに
おけるIFN−αmRNAの割合は1:10,000〜1:50,000となる
であろう。したがって、12μｇのポリ（Ａ）RNAは約1.2
ng〜0.2ngのIFN−αmRNAを含有する。
卵母細胞中のIFN−αmRNAの翻訳比がグロビンmRNAに
対する平均値よりも大きさの次数（order of magnitud
e）だけ低ければ、ポリ（Ａ）RNAのIFN−αmRNA含量
は、上記計算値よりも10倍高くなるか、あるいは約1:10
00〜1:5000となるであろう。その場合、12μｇのポリ
（Ａ）RNAは約12ng〜2ngのIFN−αmRNAを含有するであ
ろう。他方、卵母細胞中のIFN−αmRNAの翻訳比がグロ
ビンmRNAの平均値よりも大きさの次数だけ高ければ、ポ
リ（Ａ）RNAのIFN−αmRNA含量は上記計算値よりも10倍
低くなるか、或いは約1:100,000〜1:500,000となるであ
ろう。その場合、12μｇのポリ（Ａ）RNAは0.1ng〜0.02
ngのIFN−αmRNAを含有するであろう。
プラスミドpBR322は4361b.p.を有する。IFN−αmRNA
の完全cDNAは、全部で約5200〜5400b.p.となるようpBR3
22-IFN−αcDNAの生成の際、pBR322に対し約800〜1000
b.p.を付加するであろう。したがって、その分子量はIF
N−αmRNA単独のそれの約12倍（２×5200/800）となる
であろう。したがって、上記に計算したIFN−αmRNAを
結合して分析に必要な12μｇのポリ（Ａ）RNA中に存在
させるには、IFN−αmRNAの量の12倍に等しい組替えDNA
分子の量が必要となるであろう（化学量論量）。
組替えDNA分子を調製するのに使用されるポリ（Ａ）R
NAのIFN−αmRNA含量は粗ポリ（Ａ）RNAのそれよりも10
〜40倍増大したので、512個のクローンの群は、上記か
ら計算したよりも10〜40倍多い所望IFN−αmRNA含有の
クローンを有する筈である。
IFN−αmRNAが1000の粗ポリ（Ａ）RNAのうち１部であ
れば、12μｇのポリ（Ａ）RNAは12ngのIFN−αmRNAを含
有しかつ化学量論量のIFN−αcDNAプラスミドは144ngで
ある。512個のクローンの群は少なくとも５個のIFN−α
cDNA挿入物を含有するので、必要とされる全ヒブリドプ
ラスミドDNAは14.8μｇ（144×512/5×10-3）である。I
FN−αmRNAが10,000のうち１部であれば、12μｇのポリ
（Ａ）RNAは1.2ngのIFN−αmRNAを含有しかつ必要とさ
れるIFN−αcDNAの量は14.4ngである。512個のクローン
の群は０もしくは１個のIFN−αcDNA挿入物を含有し、
したがって必要とされる全ヒブリドプラスミドDNAの量
は7.4μｇ（14.4×512×10-3）である。IFN−αmRNAが1
00,000のうち１部であれば、必要とされる全ヒブリドプ
ラスミドDNAの量は0.74μｇ（1.44×512×10-3）であ
る。ヒブリド化反応がDNA過剰条件下（すなわち、ポリ
（Ａ）RNAに比較して過剰の組替えDNA）で進行するよう
確保するため、20μｇの混合物（約1.4〜30倍過剰）を
分析用に選択した。
ヒブリド化は、（ａ）ポリ（Ａ）RNAのヒブリド化さ
れた部分が完全かつ生物学的活性の型で回収されるこ
と、（ｂ）非特異的なDNA-mRNA結合が防止されることお
よび（ｃ）ヒブリド化反応が少なくとも75％完結まで進
行することを確保するような条件下で行なわねばならな
い。これらの条件は、特に80％ホルムアミド、0.4M NaC
l中におけるヒブリド化により満たされると思われる
〔ジェー・カセイおよびエヌ・ダビドソン、「高濃度の
ホルムアミドにおけるRNA:DNAおよびDNA:DNA複合体の生
成速度および熱安定性」、ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ、第４巻、第1539〜1552頁（1977）〕。この溶液
において、ヒブリド化は約40℃で行なうことができる
（ホルムアミドを省略すると、60〜70℃が必要とされ
る）。ポリ（Ａ）RNAに対する損害を最小にするには、
より低温度が好適である。本発明は56℃のヒブリド化温
度を選択する。これはT1/2iより約３℃低く〔ジェー・
カセイおよびエヌ・ダビドソン、上記〕かつT1/2dより
約10〜13℃低い〔ハマグチおよびガイヅシエク、ジャー
ナル・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ、第84巻、
第1329頁〕。したがって、この温度は約87％以下のホモ
ロジーをもって、配列をヒブリド化させない筈である。
何故なら、１％の差はT1/2dを１℃だけ低下させるから
である〔ティー・エフ・ボナー等、「配列多様化による
DNA再結合の速度低下」、ジャーナル・モレキュラー・
バイオロジー、第81巻、第123〜135頁（1973）〕。
このヒブリド化において、DNAの自己ヒブリド化は主
たる問題でない。何故なら、使用されるDNAの混合物は
同じベクター（pBR322）および各種のcDNA挿入物よりな
るからである。したがって、大抵のDNA配列はヘテロ複
合体となり、ここで挿入物はポリ（Ａ）RNAにヒブリド
化させるのに使用することができる。異なる複合体の一
部を形成する相補的cDNA挿入物は、トポロジー的拘束に
より殆んど相互作用することがない。いずれにせよ、DN
A:DNA再結合は、使用反応条件下で最小化される（ジェ
ー・カセイおよびエヌ・ダビドソン、上記）。
少なくとも75％反応を確保するのに必要とされるヒブ
リド化時間を決定するため、２次速度式を使用した： 〔式中、 R ＝ヒブリド化RNAのヌクレオチドモル濃度、 Co＝ヒブリド化すべき初期DNAのヌクレオチドモル濃
度、 Ro＝ヒブリド化すべき初期RNAのヌクレオチドモル濃
度、 ＫR＝RNA-DNAヒブリド化に関する速度恒数、 t ＝時間（秒）、 R/Ro＝0.75（75％反応完結）、 ＫR＝472〔ＫR＝1/12Kd（ジェー・カセイおよびエヌ・
ダビドソン、上記）であり、ここで Kd＝ヒブリド化の選択条件下におけるDNAの２次速度恒
数、かつ Kd＝1.7×105×L 1/2×Ｎ-1 〔ジェー・アール・ハットンおよびジェー・ジー・ウ
エウトムア、「バクテリオファージX174 DNA-RNAヒブリ
ドの変性:RNA長さ効果および核化速度恒数」、ジャーナ
ル・モレキュラー・バイオロジー、第77巻、第495〜500
頁（1973）〕、 Ｌ＝900〔b.p.における鎖長；約900は完全IFN−αcDNA
挿入物中に存在する〕 Ｎ＝900〔ヒブリド鎖のb.p.における複合度；ここで複
合度が900である理由は、IFN−αmRNAの900個のヌクレ
オチドがIFN−αcDNA挿入物の900個の相補的ヌクレオチ
ドと結合するからである〕 Co＝2.5×10-7〔分析に使用すべき予め測定された20μ
ｇの組替えDNA分子を含有する40μｌの溶液に基づいて
おり、ここでもIFN−αcDNA挿入物は組替えDNA分子の1/
12でありかつ512個のクローンの少なくとも１個に生ず
ると仮定し、一つのDNA塩基対の平均分子量として662を
与える〕 Ro＝8.7×10-8〔分析に使用すべき予め測定された12μ
ｇのポリ（Ａ）RNAを含有する40μｌの溶液に基づいて
おり、ここでもポリ（Ａ）RNAは1:10,000部のIFN−αmR
NAを含有すると仮定し（大過剰のDNAを与えれば異なる
比率はヒブリド化の割合に対し殆んど影響を与えない）
かつRNAの１個のリボヌクレオチドの平均分子量として3
43を与える〕 である〕。
3.初期分析の実施 工程A:組替えDNA分子混合物の調製および開裂 所望数の細菌クローンを、上記のように添加されたト
リプトン培地寒天板の上に接種し、これは機械用具を使
用して各ミクロ測定穴から一部を寒天板上に移して行な
った。37℃で培養した後、各クローンは直径数mmのコロ
ニーを形成した。全てのコロニーを寒天板から洗い取っ
て保存し、これを接種物として使用して上記のように添
加されたトリプトン培地１に三角フラスコ2l中にて接
種した。この培養物を37℃にて約0.8の見掛けOD650（肉
眼推定）まで振とうした。１容量の添加トリプトン培地
と170μg/mlまでのクロラムフェニコールを培養物に加
え、これをさらに37℃にて16時間振とうした。20mlのク
ロロホルムを加え、培養物を37℃にてさらに10分間振と
うすることにより細菌を殺した（シー・ワイスマンおよ
びダブリュー・ボル、上記）。培養物をクロロホルムか
らデカントしそして細胞を6000rpmから４℃にて15分間
遠心分離（ソルバールGS3型ロータ）して集めた。各１
の調製物につき約１〜2gの細胞が得られた。細胞を30
mlの20mMトリス−HCl（pH7.5）中に懸濁させ、5000rpm
かつ４℃にて20分間遠心分離し（ソルバールSW型ロー
タ）、そして30mlの50mMトリウ−HCl（pH7.5）中に再懸
濁させた。0.25容量のリゾチーム溶液〔50mMトリス−HC
l（pH7.5）中10mg/ml〕を加え、０℃にて10分間冷却し
た後0.33容量（初期50mMトリス−HCl培養物懸濁液の容
量に対し）の0.5M EDTA（pH8.0）を振とうなしに静かに
混入させた。０℃でさらに10分間の後、1/16容量（初期
容量に対し）の２％トリトンＸ−100を加えた。60分
後、試料をソルバールSW型ロータにて10,000rpmかつ０
℃で60分間遠心分離した。上澄液を磁気攪拌機を備えた
ビーカー中に移し、3MのNaOHを攪拌下に加えてpH12.5に
到らしめた〔ガラス電極と、オリオンリサーチ601型pH
計とを使用し、ベックマンpH10炭酸塩緩衝液（No.350
5）にて較正し、20℃にて測定した〕。20℃にて10分間
攪拌した後、pHを8.5に調整した。さらに３分間攪拌し
た後、1/9容量の5M NaClと１容量のフェノール（蒸留し
かつ9.5M NaClで平衡化させたもの）とを加えて激しく
攪拌を５分間続けた。10,000rpmかつ０℃にて10分間遠
心分離（ソルバールGSA型ロータ）して相分離させた。
型ＩのDNA（環状二重鎖DNA）を含有する上澄液を中間相
（単一鎖DNAを含有する）から注意して取り出し、クロ
ロホルムで３回抽出した（フェノールは大部分がこの工
程で除去された）。型ＩのDNAフラクションは、分析用
に選択された512個のクローンの一部を構成するような
宿主細胞を形質転換させるのに最初に使用した組替えDN
A分子（pBR322-cDNA挿入物）を含有するであろう。
パンクレアチンRNAアーゼＡ（5mg/ml、85℃にて10分
間予備加熱）を型ＩのDNAに20μg/mlの濃度まで加え、
混合物を37℃にて60分間培養した。1/5容量の5M NaClを
加え、この混合物を30％ポリエチレングリコール6000
（ユニオンカーバイド社、120℃にて20分間オートクレ
ーブにかけたもの）により最終濃度7.5％PEGまで調整し
た。−10℃にて２〜16時間の後、沈澱を8000rpmかつ０
℃にて20分間ソルバールSW型ロータで遠心分離して集
め、0.075MのNaClと0.0075Mのクエン酸ナトリウムとの
中に吸光度20（260nmにて）まで溶解させ、そして0.5％
SDSに調整した。この溶液をプロナーゼ0.5mg/ml（20mg/
mlにて37℃で２時間自己消化させたもの）と共に37℃に
て30分間培養し、１容量の蒸留フェノールで３回および
１容量％のクロロホルムで２回抽出した。試料（1mg/ml
DNA溶液の2mlまで）を50mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM
EDTA中の５〜23％蔗糖濃度勾配にて、ベックマンSW27型
ロータにより21,000rpmかつ15℃で15時間遠心分離し
た。フラクションを集めてOD260を測定した。DNA含有フ
ラクションを集め、DNAを酢酸ナトリウムとエタノール
とにより沈澱させた。遠心分離により20〜100μｇの型
ＩのDNA混合物が回収された。
20μｇの精製された型ＩのDNAを、150μｌの10mMトリ
ス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2、50mM NaCl、6mM2−メル
カプトエタノール、200μg/ml BSAもしくはゼラチン、
および20単位のHindIII（ニューイングランド・ビオラ
ブ社）の中で切断した。このHindIII制限酵素はpBR322
成分内の部位において型ＩのDNAを開裂させる（cDNA成
分も開裂されるとは思われず、もしそうならば分析は実
質的に影響を受けない筈である）。37℃で２時間の後、
一部（１％）を50mMトリス−酢酸（pH7.8）2mM EDTA中
の１％アガロースゲルにより50mAで１時間電気泳動して
分析し、切断が完結したかどうか確認した。切断が未完
結であれば、さらにHindIIIを加えて培養を２時間続け
た。型ＩのDNAが完全に線状分子まで変換されたら、プ
ロナーゼ（カルビオケム社）とEDTAとSDSとをそれぞれ
0.5mg/ml、10mMおよび0.5％となるまで加えた。37℃で3
0分間の後、溶液を30μｌフェノール−クロロホルム
（1:1）にて抽出した。有機相を50μｌの20mMトリス−H
Cl（pH7.5）、1mM EDTAで洗浄し、そして合した水相を
エーテルで３回抽出し、0.1mlチエレックスカラムを通
して濾過し、EDTA−煮沸したパイレックスチューブに集
めて、1/10容量の3M酢酸ナトリウムと2.5容量のエタノ
ールとにより再沈澱させた。−20℃にて一晩静置した
後、DNAを遠心分離により集めた。
工程B:ポリ（Ａ）RNAによるDNAのヒブリド化 ２種のヒブリド化混合物を調製した。混合物Ｉは、４
μｌの10倍濃度のヒブリド化緩衝液（4M NaCl、0.1パイ
プス（pH6.4、1,4ピペラジン−ジエタンスルホン酸、シ
グマ社）と、50mM EDTAと、0.5μｌの約5ngのＩ125−グ
ロビンmRNA（5000cpm）、６μｌの誘発白血球ポリ
（Ａ）RNA（２μg/μｌ）とを、卵母細胞中に注入した
場合、6000IUのIFNを発生するに足る量で含有した。混
合物IIは、10μｌの上記からのHindIIIで切断された型
ＩのDNAと、0.1μｇのPstＩ−切断されたＺ−pBR322（H
3）/RcβＧ−4.13（HindIII部位にβ−グロビン配列を
含有するpBR322誘導体）〔マンティ等、「クローン化し
た兎β−グロビン染色体DNAにより形質転換させたねず
みＬ細胞における兎β−グロビンmRNAの生産」、ネイチ
ャー誌、第281巻、第40〜46頁（1979）〕とを含有し
た。混合物ＩにおけるＩ125−グロビンmRNAおよび混合
物IIにおけるβ−グロビンDNAは、ヒブリド化分析に対
する内部陽性比較として作用する。両混合物を窒素ガス
流中にて乾燥した。40μｌの80％ホルムアミドを混合物
IIの残部に加え、溶液を100℃にて10分間変性させて、
氷中にて迅速に冷却した。変性溶液を使用して混合物Ｉ
の残部を溶解させ、得られた溶液を56℃にて４時間培養
した。
工程C:非ヒブリド化ポリ（Ａ）RNAからのヒブリド化ポ
リ（Ａ）RNA-DNAの分離 1mlを冷0.9M NaClと0.09Mクエン酸ナトリウムとホル
ムアミド（100％）とで４％（容量で）まで希釈した
後、溶液をミリポアフイルター（0.45μｍ孔径）にて0.
5ml/min.の速度で濾過し、フイルターを先ずRNA-DNAヒ
ブリドを保持する能力について試験した。何故なら、製
造業者から得られたフイルターは必ずしも全てが同等に
効果的でないからである。
工程D:ヒブリド化ポリ（Ａ）RNAの精製 ポリ（Ａ）RNAヒブリドを付着した上記のフイルター
を1mlの0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、0.5％
SDSに37℃にて10分間浸漬し、50mMトリス−HCl（pH7.
5）、10mM MgCl2、2mM CaCl2で洗浄しそして0.6mlの新
たな緩衝液中に入れた。５μｌのヨード酢酸処理したDN
Aアーゼ（5mg/ml）を添加した後〔エス・ビー・チンメ
ルマンおよびジー・サンディーン、アナリティカル・バ
イオケミストリー、第14巻、第269頁（1966）、ピー・
エー・プライス等、「牛膵臓デオキシリボヌクレアーゼ
の活性部位におけるヒスチジン残基のアルキル化」、ジ
ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第244巻、
第924〜932頁（1969）〕、フイルターを37℃にて10分間
培養した。
フイルターを除去し、溶液を１容量のフェノールと１
容量のエーテルとで抽出しそして0.1mlチエレックスカ
ラムに通した。５μｇのキャリヤRNA（精製酵母RNA）を
溶液に加え、RNAを酢酸ナトリウムとエタノールとで沈
澱させた。10,000xgでの遠心分離により沈澱を集め、10
0μｌの1mM EDTA中に溶解させ、100℃にて90秒間加熱
し、TNEとSDSとを2xTNEおよび0.5％SDSになるまで加え
た。RNAを100μｌのオリゴ（dT）セルロースカラムに吸
着させ、0.3mlの蒸留水で４回洗浄して溶出させ、酢酸
ナトリウムとエタノールとで沈澱させた。−20℃で16時
間の後、沈澱したRNAを遠心分離により分離し、２μｌ
のTNK緩衝液中に溶解させた。
工程E:IFN−αmRNA活性の測定 上記からのポリ（Ａ）RNA溶液を40個の卵母細胞中に
注入した（卵母細胞１個当り約50nl）。卵母細胞を23℃
にて24〜48時間培養し、ホモジナイズしそして遠心分離
し（または培養培地を回収し）、前記したようにIFN−
αにつき分析した。
4.後分析：フイルター結合したDNAに対するヒブリド化 単一クローンからの組替えDNA分子の後分析は大部
分、DBMもしくはDPT紙結合したDNAについて行なった。
何故なら、分析条件はもはや臨界的でなくかつ分析がよ
り便利となるからである。DPT紙はより低い誤差を与
え、したがって優先的に使用した。DBM紙は文献〔ジェ
ー・シー・アルウイン等、「ジアゾベンジルオキシメチ
ル紙への移行によるアガロースゲルにおける特定RNAの
検出およびDNA試料によるヒブリド化の方法」、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・US
A、、第14巻、第5350〜5354頁（1977）〕に記載されて
いるように調製した。APT紙はビー・シード（ペルス・
コミューニケーション）の方法により調製した：ワット
マン540の紙片（20g）を70mlの0.5M NaOH、2mg/ml NaBH
4および30mlの1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテ
ルの混合物と共に20℃にて16時間攪拌した。次いで、こ
の紙をアセトン40ml中の２−アミノチオフェノール10ml
の溶液に移し、10時間攪拌した。紙をアセトン、0.1N H
Cl、Ｈ2Ｏ、0.1N HCl、Ｈ2Ｏで徹底的に洗浄しそして乾
燥させた。APT紙を、ABM紙からDBM紙への変換について
記載されていると同様に、DPT紙に対しジアゾ化させた
〔アルウイン等、上記〕。
DNA（15μｇまで）を50mm2のジアゾ化ABM（DBM）また
はジアゾ化APT（DPT）紙に結合させ〔ジェー・エッチ・
ジェー・ヘイジメーカー等、「トリパノソマ・ブルセイ
の表面グリコ蛋白変種のためのメッセンジャーRNAに相
補的なDNAを含有するプラスミドの単離」、ジーン誌、
印刷中（1980）〕、これを下記に示す。
ヒブリドプラスミド誌をエンドヌクレアーゼPstＩで
切断し、1ml当り500μｇのプロナーゼと0.5％のSDSと10
mMのEDTAとで37℃にて30分間処理し、フェノールとエー
テルとで抽出し、0.1mlのチエレックスカラムに通しそ
してエタノールで沈澱させた。熱変性したDNA（５μｇ
まで、少量のP32-DNAをトレーサーとして加えた）を1cm
2のDBMもしくはDPT紙と共に200μｌの25mM燐酸カリウム
緩衝液（pH6.5）中で０℃にて一晩培養した。濾紙を、5
0mM燐酸カリウム緩衝液（pH6.5）、１％グリシンにて室
温で５分間３回および99％再結晶化ホルムアミドで３回
洗浄した。99％ホルムアミドと共に68℃にて２分間さら
に培養した後、50mM燐酸カリウム緩衝液（pH6.5）中で2
0℃にて３回および0.4M NaOH中で37℃にて10分間２回洗
浄した。約40〜60％の放射能がフイルター上に保持され
た。フイルターを、１％グリシンを添加した予備ヒブリ
ド化培地Ａ中で38℃にて３時間培養し、この場合フイル
ター１個当り330μｌを使用した。培地Ａは、50％ホル
ムアミドと、5xSSCと0.04％ポリビニルピロリドンと0.0
4％フイコール（ファーマシア社）と0.1％SDSと25μｇ
ポリ（Ａ）（ピー・アンド・エル社）と100μｇ酵母RNA
（BDH、フェノールで６回抽出し、エタノールで沈澱さ
せたもの）とを含有する。フイルターを培地Ａ中で２回
洗浄し、次いで培地Ａ中にてパラフイン油の下で上記し
たようにポリ（Ａ）RNAにより（通常５〜８μｇ）38℃
にて16時間ヒブリド化させた。RNAは次のようにして付
加させた。一枚の濡れたDNAフイルターを吸水させ、無
菌ペトリ皿中に入れ、このフイルター上に20〜40μｌの
RNA溶液をピペットで載置し、第二のDNAフイルター（再
現または比較）をその上に載せ、そしてこのサンドイッ
チを無菌パラフイン油で覆った。ヒブリド化の後、フイ
ルターを順次に培地Ａ（２回）、1xSSCと0.2％SDSと1mM
EDTAとを含有する溶液（それぞれ20℃で10分間３
回）、培地Ａ（38℃で２時間）および50％ホルムアミ
ド、5xSSC、0.1％SDS（20℃で10分間３回）で洗浄し
た。ヒブリド化したRNAを、200μｌの10mMトリス−HCl
（pH7.4）、1mM EDTAおよび0.1％SDS中で100℃にて１分
間加熱することにより溶出させた。溶出工程を２回反復
し、溶出液を合し、そしてRNAを２μｇの酵母RNA（上記
のように精製したもの）の添加の後、エタノールにて沈
澱させた。洗浄したペレットを減圧乾燥し、３μｌのＨ
2Ｏ中に溶解させそして卵母細胞中に注入した。IFN−α
活性を上記のように分析した。
5.RNA選択ヒブリド化分析の結果 512個のクローンの８群（すなわち、群Ｔ、Ｙ、Ｊ、
Ｋ、・、Ｏ、εおよびπ）の分析は陰性であった。512
個のクローンの４群（すなわち、Ｉ、δ、Ｎおよびλ）
の分析は陽性であり、ただし同一でなかった。陽性分析
は次のように記録される：ポリ（Ａ）RNA-DNAヒブリド
から遊離されたRNAにより生成されたIFN−αのIU/ml
〔Ｚ−pBR322（H3）/RcβＧ−4.13（上記）を使用する
比較ヒブリド化の分析〕；ここで実験結果が比較よりも
高い分析値には下線を施こした。
群λを64個のクローンの８つのサブグループに分割
し、ヒブリド化させ、そして前記のように分析した。サ
ブグループは上記と同様に表わして、次の結果を与え
た： サブグループλ−IIIを８個のクローンの８組に分割
し、ヒブリド化させそして分析した。
第一の陽性結果は組λ−III−４により達成されたの
で、この組の個々のコロニー（Ａ〜Ｈと云う）をヒブリ
ド化させかつ分析した。
λ−III−４−Ｂ ＜35＊（＜35）；＜20（60） λ−III−４−Ｃ 35（60）；60＊（＜35）；111＊（＜
11）;11＊（＜11）；20（＜20） ＊ DBM紙をこの分析に使用した。
したがって、クローンλ−III−４−Ｃは、IFN−αmR
NAをヒブリド化しうる組替えDNA分子を含有する。
このクローンにおける組替えDNA分子は次の通りであ
る:Z−pBR322（Pst）/HcIF-4C（“Hif-4C"）およびこれ
を含有する細菌菌株：イー・コリX1776（Ｚ−pBR322（P
st）/HcIF-4C）（“イー・コリHif-4C"）。この名称
は、組替えDNA分子がチューリッヒ（Ｚ）に起源しかつP
stI部位にHIFN−αcDNA（“HcIF"）を含有するプラスミ
ドpBR322であることを示し、特定の組替えDNA分子はク
ローンλ−III−４−Ｃ（“4C"）に由来する。
Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-4Cの再クローン化および特性
化 形質転換細胞の第一次クローンはしばしば２種以上の
組替えDNA分子を含有するので〔エフストラチアジス
等、「クローン化DNAから決定された兎β−グロビンmRN
Aの第一次構造」、セル誌、第10巻、第571〜585頁（197
7）〕、Hif-4Cをイー・コリX1776（Hif-4C）クローンか
ら単離して上記のように精製した。Hif-4CおよびpBR322
の試料をPstＩで切断し、１％アガロースゲル上での電
気泳動により分析した。Hif-4Cは２つのバンドを与え、
１つはPst−開裂pBR322の移動度を有し、他方は約320b.
p.に相当する移動度を有した。
イー・コリHB101を上記のように単離Hif-4Cにより形
質転換させた。テトラサイクリン耐性かつ形質転換した
細菌の６個のクローンを採取し、小培養物を調製し、型
ＩのDNAを精製しそしてPstＩ開裂およびアガロースゲル
電気泳動により前記と同様に分析した。全ての試料は、
Hif-4Cと同一の開裂様式を示した。これらの再クローン
化した組替えDNA分子の１つはＺ−pBR322（Pst）/HcIF-
4C（“Hif-4C"）と呼ばれ、後の実験用に使用した。小
文字“c"は再クローン化したDNA分子を意味する。
IFN−αmRNAにヒブリド化するHif-4cおよびcDNA挿入
物の能力を測定するため、Hif-4c（115μｇ）を125単位
のPstＩにより完結するまで切断し、フェノールとクロ
ロホルムとで抽出しそして上記したようにエタノールで
沈澱させた。１部（10μｇ）を５′末端標識した（後の
工程におけるトレーサーとして役立つ）が、これは100
μｌの50mMトリス−HCl（pH7.5）中に１部を溶解させ、
これを0.1mlのチエレックス100型カラムに通しそしてこ
れを0.6単位の細菌性アルカリホスファターゼにより65
℃で１時間処理して行なった。10倍濃度のTNE（40μ
ｌ）を加え、この溶液を１容量のフェノールで３回およ
び１容量のクロロホルムで３回抽出した。DNAを２容量
のエタノールで−20℃にて一晩沈澱させ、遠心分離によ
って回収した。さらに精製するため、0.5mlTNA中の試料
を0.25mlのDEAEセルロース（ワットマンDE52、2mlの150
mM NaCl、50mMトリス−HCl（pH7.5）、2mM EDTAにて予
備洗浄）（“NET−緩衝液”）に吸着させ、2mlのNET緩
衝液で洗浄し、0.4mlの1.5M NaCl、20mMトリス−HCl（p
H7.5）、2mM EDTAにて溶出させそして上記のようにエタ
ノールで沈澱させた。DNAをγ−P32-ATP（比活性約5000
Ci/ミリモル）およびポリヌクレオチドキナーゼと共に
培養し〔エー・エム・マクサムおよびダブリュー・ギル
バート、「DNAの新規な配列決定方法」、プロシーディ
ング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・USA、第7
4巻、第560〜564頁（1977）〕、そしてTNE中3mlのセフ
ァデックス−G50カラムでクロマトグラフにかけて精製
した。溶出させたフラクションを集め、P32-DNAを上記
のようにエタノールで沈澱させた。収量は約107dpmであ
った。
未標識PstＩ−開裂Hif-4cDNA（90μｇ）を上記からの
６×105dpmのＰ32−標識PstＩ−開裂Hif-4cDNAと混合
し、50mMトリス−酢酸緩衝液（pH7.8）中の10×20×0.7
cmの２％水平アガロースゲルに2.5cmスロットにより通
して電気泳動させた。Ｘ線フイルムをゲルに露出させ、
320bp断片の位置を決定した。放射能バンドを有するゲ
ル片（1.3×105dpm）を切り取り、プラスチック製2ml注
射器で圧砕し、ゲル容積の10倍量のNET緩衝液と共に攪
拌することにより４℃で一晩抽出した。DNAを0.1mlのヒ
ドロキシアパタイトカラム（1mlのNET緩衝液で予備洗
浄）に吸着させた。カラムを1mlの0.1M燐酸カリウム緩
衝液（pH7.5）で洗浄し、DNAを0.2mlの1M燐酸カリウム
緩衝液（pH7.5）で溶出させた。溶出液を滅菌蒸留水で1
0倍に希釈し、DNAをDEAEに吸着させかつそこから溶出さ
せそして上記したようにエタノールで沈澱させた。この
DNAを“Hif-4c断片”と呼ぶ。
Hif-4c断片（120ng）をDPT紙（0.5×0.5cm）に上記の
ようにして結合させた。比較としては、120ngのβ−グ
ロビンcDNA断片をヒブリドプラスミドＺ−pBR322（H3）
RcβＧ−4.13からHindIIIにより切断し〔エフ・マイヤ
ー等、「ベクトルからベクトルへの、AT結合したクロー
ン化DNAの転位」、エキスペリメンチア、第35巻、第972
頁（1979）；エヌ・マンティ等、上記〕、そして同様に
処理した。ポリ（Ａ）RNA（20μｌ）に対する複製フイ
ルターのヒブリド化と、フイルターの洗浄と、フイルタ
ーからのRNAの回収とは上記と同様にして行なった。卵
母細胞中に注入した後、次のIFN−α活性が検出され
た。
かくして、Hif-4cはIFN−αmRNAにヒブリド化しうる
挿入物を含有する。
Hif-4c中の挿入物にクロスヒブリド化する組替えDNA分
子を含有する大腸菌のクローンの同定 組替えDNA分子Hif-4cにおけるcDNA挿入物は僅か約320
b.p.であったか、または、IFN−αmRNAの第三の推定寸
法であったので、上記の精製Hif-4c断片を試料として使
用し、関連ヒブリドDNA挿入物を有する組替えDNA分子を
含有する細菌クローンを選別した。
上記したサブグループλ−IIIを構成する64個の細菌
クローンをミリポア膜（直径8cm）上にスタンプし、寒
天板（ジアミノピメリン酸、ナリジキシン酸およびテト
ラサイクリンを上記のように添加）上に載置しそして37
℃で24時間培養した。フイルターを0.75ml液滴の0.5M N
aOH上に載せ、２〜３分間後に紙タオル上に移して過剰
の液体を除去し、工程を反復した。1Mトリス−HCl（pH
7.5）を用いてフイルターを中和し、上記と同様にして
1.5M NaCl-0.5Mトリス−HCl（pH7.4）で洗浄し、そして
風乾させた。フイルターを0.3M NaCl中に浸漬し、風乾
し、そして80℃にて減圧下に２時間加熱した。
Hif-4c Pst断片（30ng）を、β−P32-dATPとα−P32-
dCTP（それぞれ、比活性40Ci/ミリモル）とを用いてニ
ック翻訳〔エー・ジェー・ジエフリーおよびアール・エ
ー・フラベル、「兎β−グロビン遺伝子はコード配列中
に大きな挿入物を含有する」、セル誌、第12巻、第1097
〜1108頁（1977）〕によりＰ32−標識した。λ−IIIコ
ロニーを有するフイルターを４セット〔セットは0.15M
NaCl、30mMトリス−HCl（pH8.0）、1mM EDTAである〕と
0.1％（W/V）フイコールと、0.1％ポリビニルピロリジ
ンと0.1％（W/V）BSAと、0.5％SDSと200μg/ml変性断片
化鮭精子DNAとにおいて68℃で７時間予備ヒブリド化さ
せ、次いで４セットと0.02％（W/V）フイコールと0.02
％ポリビニルピロリジンと0.02％（W/V）BSAと0.5％SDS
と200μg/ml変性鮭精子DNAとにおいて２×105cpmのＰ32
−標識Hif-4c断片にて68℃で16時間ヒブリド化させた。
このフイルターをセット−0.5％SDSにより室温で洗浄
し、２セット−0.5％SDSにて68℃で５時間洗浄し、溶液
を１回交換し、3mMトリズマベースにより室温で４時間
洗浄し、溶液を１回交換した。フイルターを乾燥した
後、Ｘ線フイルムをスクリーンによりフイルターに80時
間露出させた。３つのコロニー、すなわちλ−III-7D、
λ−III-2Hおよびλ−III-4Cは強力な陽性反応を示し、
そして２つのコロニー、すなわちλ−III-1Eおよびλ−
III-3Dは弱い反応を示した。
Hif-4c関連クローンから小培養物を調製し、型ＩのDN
Aを精製し、PstIで開裂させそして上記のようにアガロ
ースゲル電気泳動により分析した。全ての型ＩのDNAは
大きな断片（プラスミドpBR322成分）と小さい断片（ヒ
ブリド挿入物）とを生じた。λ−III-2Hからの組替えDN
A分子は、最大の挿入物、すなわち約900b.p.を遊離し
た。この組替えDNA分子をＺ−pBR322（Pst）/HcIF-2H
（“Hif-2H"）と名付け、その挿入物を、“Hif-2H断
片”と名付ける。
Hif-2Hを、そのIFN−αmRNAを結合する能力につき試
験し、これは全て上記したようにDPT紙（４μg/100m
m2）に結合させてポリ（Ａ）RNA（0.3μg/μｌ）に16時
間ヒブリド化させ、そしてIFN−αmRNA活性を測定する
ことにより行なった。
Hif-2Hを、Hif-4Cについて記載したと同様に再クロー
ン化させ、これをHif-2hと名付ける。
別の実験において、組替えDNA分子を含有するさらに
一組の大腸菌クローンを調製し、標識Hif-4c断片にヒブ
リド化するコロニーを同定した。長cDNA挿入物を有する
プラスミドの高収量を確保するため、白血球ポリ（Ａ）
RNAから酵素的に調製した二重鎖Ｐ32−標識白血球cDNA
の１部を、ポリ（Ａ）RNAの遠心分離について記載した
と同じ手順で蔗糖濃度勾配により遠心分離して寸法的に
分別した。600b.p.DNA断片もしくはそれ以上に対応した
沈降速度を有するcDNAを含有するフラクションを集め、
エタノール沈澱の後にcDNAを回収した。cDNAをdCMP残部
により伸長させ、dGMP伸長したPstI開裂pBR322にヒブリ
ド化させそしてこのヒブリドDNAを使用して前記のよう
に大腸菌を形質転換させ、この場合大腸菌としてイー・
コリHB101を使用した。細菌を直径8cmのミリポアフイル
ター上に分布させ、トリプトン培地寒天板（10μg/mlの
テトラサイクリンを含有する）の上に載置しそして小コ
ロニーが出現するまで生育させた。新たな濡れたミリポ
アフイルターをコロニー保持フイルターの上に押圧さ
せ、剥離し、その面を上に向けて4.4％グリセリン含有
の寒天板の上に載置しそして小コロニーが出現するまで
培養することにより、複製フイルターを調製した。この
コロニー保持フイルターをさらにミリポアフイルターで
覆い、−55℃にて凍結させて貯蔵した〔ディー・ハナハ
ンおよびエム・メセルソン、「高密度プラスミド選別に
関する記録」、1978年９月私的通信〕。全部で約5000個
のコロニーを保持する15枚のフイルターを調製した。各
フイルターの一複製物を用いて、上記したと正確に同様
に、Ｐ32−標識PstＩ−切断Hif-4cDNA断片にヒブリド化
させた。約185個の陽性コロニーが放射能写真上で同定
され、ミリポアフイルター上で再クローン化させそして
ヒブリド化により再度同定した。最強のヒブリド化反応
を示す95個のクローンをＺ−pBR322（Pst）/HcIF-SN1乃
至SN95と名付け、後の研究に使用した。
勿論、HuIFNの免疫学的もしくは生物学的活性（下
記）を示すポリペプチドを生産する能力がHif-2hに与え
れているので、このHif-2hおよびその他のこれに関連す
るDNA配列、たとえばHif-4cをこのクローン選別法に使
用することができ、さらに組替えDNA技術、合成、天然
源もしくはそれらの組合せから生ずるDNA配列を含有す
る他のクローン、或いは単一もしくは多重のベース置
換、挿入、転位もしくは欠失を含む突然変異により他の
DNA配列を選別するよう上記DNA配列のいずれかに関連す
るクローンおよびHuIFNをコードするクローンについて
も全く同様に使用できることが明らかである。したがっ
て、この種のDNA配列およびそれらの同定も本発明の範
囲内である（たとえば下記）。また、上記DNA配列によ
り選別されず、しかもそれらのヌクレオチド配列の結
果、上記DNA配列の発現によりコードされたポリペプチ
ドを発現においてコードするようなDNA配列も本発明の
範囲内である。
Hif-2hDNA挿入物の他の特性化 上記したように組替えDNA分子Hif-2hは約900b.p.の挿
入物を含有し、ひと白血球インターフェロンmRNAにヒブ
リド化する。下記の付加的特性にさらに決定した。
1.ヒブリド抑制翻訳 mRNAをクローン化された相補的cDNAにヒブリド化させ
れば、mRNAの翻訳は抑制されるが、ヒブリドの熱変性は
翻訳可能なmRNAを遊離する。〔ビー・エー・パターソン
等、「DNA−mRNAヒブリド−抑制された無細胞翻訳によ
る構造遺伝子同定および地図化」、プロシーディング・
ナショナル・アカデミー・サイエンス・USA、第74巻、
第4370〜4374頁（1977）〕。2.2μｇのPstＩ−切断Hif-
2hおよび比較として２μｇのHindIII−切断Ｚ−pBR322
（H3）/RcβＧ−4.13（“RcβG"）を、10μｌの80％（v
/v）脱イオン化ホルムアミド−20mMパイプス緩衝液（pH
6.4）において80℃で10分間変性させた。溶液をエッペ
ンドルフ管に加え、ここには予め白血球ポリ（Ａ）RNA
（５μｇ）とNaCl（４μモル）とEDTA（10nモル）とを
乾燥させておいた。混合物をパラフイン油層の下で48℃
にて７時間加熱し、冷却しそして200μｌのＨ2Ｏで希釈
した。２つの試料を等部に分割し、それぞれの一方を10
0℃にて30秒間加熱した。核酸をエタノールにより沈澱
させ、３μｌのＨ2Ｏ中に溶解させそして上記のように
卵母細胞中でIFN−αmRNA活性につき分析した。
したがってHif-2hは、ポリ（Ａ）RNAにヒブリド化さ
せると、ポリ（Ａ）RNAにおけるIFN−αmRNAの翻訳を抑
制し、そしてヒブリドを変性させるとIFN−αmRNAは再
び翻訳可能になった。この実験により、Hif-2hがIFN−
αmRNAに相補的な配列を含有することが確認される。
2.制限酵素開裂による分析ならびにヌクレオチド／アミ
ノ酸配列および制限地図の決定 各種制限酵素（ニューイングランド・ビオラブ社）に
よるHif-2hの切断を行ない、生じた生成物をアガロース
ゲル電気泳動により分析した。下線を施こした断片はpB
R322およびHif-2hに対し共通でない。
さらに、５′末端Ｐ32−標識PstＩ切断Hif-2hを数種
の制限酵素で開裂させ、組替えDNA分子中のcDNA挿入物
から生じた放射性断片の寸法を測定した。制限酵素 Ｐ32−断片＊Eco RI 676、209Hind III 開裂せずBsp Ｉ 799、86Hpa II 開裂せずHha Ｉ 開裂せずBam HI 開裂せずHin ｆ 210、62Bgl II 545、340 ＊ 内部的に一致しているが、これら断片の絶対寸法は
第８〜10図を参照して最も良く示される。
これらのデータから、Hif-2hの制限地図を推定した
（第４図）。この地図は部位の絶対位置に関し決定的で
なく、挿入物内のMboII部位に関し不完全であろう。挿
入物に最も近い部位のみがpBR322成分内に示されてい
る。矢印はIFN−αcDNAコードストランドの方向性を示
している。
本発明のクローンにおけるHif-2h断片もしくはその他
挿入物の実際的構造またはそれからコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列もしくは構造は本発明を実施する
上で当業者に必要とされないが、上記データおよび制限
地図を本願出願時における断片構造に関し最も良く利用
しうる情報として本出願中に含ませる。爾来、期待され
るように（上記）、Hif-2h断片に関するこれらデータお
よび制限地図は、ヌクレオチド配列決定および制限分析
の周知技術を用いて精選されている〔たとえば、エー・
エム・マクサムおよびダブリュー・ギルバート、「DNA
の新規な配列決定方法」、プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミー・サイエンス・USA、第74巻、第560〜56
4頁（1977）〕。プラスミドDNAをウイルキーの論文第86
1〜862頁に記載された方法Ｂにより調製し〔エヌ・エム
・ウイルキー等、「単純疱疹ウイルスＩの活性チミジン
キナーゼ遺伝子を含有するヒブリドプラスミド」、ヌク
レイック・アシッド・リサーチ、第７巻、第859〜877頁
（1979）〕、業者により推奨されるように各種制限酵素
で制限化し、ただし200μg/mlのゼラチンを牛血清アル
ブミンの代りに酵素緩衝液中に使用した。〔EcoRIはダ
ブリュー・ボルから寄贈され、BspＩはエー・キスから
寄贈され、その他の酵素はニューイングランド・ビオラ
ブ社から得られた〕。
制限DNA（20μｇ）をフェノールで抽出し、エタノー
ルで沈澱させ、0.05Mトリス−HCl（pH8）中に溶解させ
そしてチエレックス100の小カラムに通した。フラッシ
ュ（flush）もしくは５′−結合末端を有する断片を、2
00μｌの0.05Mトリス−HCl（pH8）中においてDNA5′末
端ｐモル当り0.2単位の子牛腸アルカリホスファターゼ
（ベーリンガー社）により37℃で60分間処理して脱燐酸
化させた。酵素を65℃で60分間加熱することにより失活
させた。３′結合末端を有するDNA断片については、細
菌性アルカリホスファターゼ（ワーシングトン社）を文
献〔エー・エム・マキサムおよびダブリュー・ギルバー
ト、上記〕に記載されているように使用し、ただし培養
は65℃にて30分間行なった。脱燐酸化DNAはDEAE−セル
ロースに吸着および溶出させて精製し〔ダブリュー・ミ
ューラー等、「DNAにおける部位指向性変異：アミノ酸1
21〜123に対応する位置におけるクローン化β−グロビ
ン相補DNAのポイント変異の発生」、ジャーナル・モレ
キュラー・バイオロジー、第124巻、第343〜358頁（197
8）〕、或いはこれを必要に応じポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけた（下記参照）。ポリアクリルアミド
（もしくはアガロース）ゲルから0.15M NaCl、0.05Mト
リス−HCl（pH8）中に回収した断片を0.1mlのヒドロキ
シアパタイト（ビオラドHTP社）カラムに吸着させ、0.1
M燐酸カリウム緩衝液（pH7）1mlで４回洗浄しそして0.3
mlの1M燐酸カリウム緩衝液（pH7）で溶出させた。この
溶液を10倍希釈し、DNAをDEAE−セルロースに吸着さ
せ、上記のように回収した〔ダブリュー・ミューラー
等、上記〕。
エタノール沈澱の後、DNAを〔γ−Ｐ32〕ATP（DNA5′
末端ｐモル当り12〜34μCi）およびポリヌクレオチドキ
ナーゼ（ニューイングランド、ビオラブ社またはＰ−Ｌ
ビオケミカルス社）にて、実質的にエー・エム・マキサ
ムおよびダブリュー・ギルバート（上記）により記載さ
れているように５′末端標識したが、ただしキナーゼ反
応の前にDNAを変性させなかった。DNA5′末端ｐモル当
り１〜1.5μCi〔Ｐ32〕ホスフェートの比活性が得られ
た。
配列決定のため、標識断片を第二の制限酵素で開裂さ
せ、そして生成物をトリス−硝酸−EDTA緩衝液における
５％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離し
た。所望の断片をこのゲルから抽出して精製した〔ミュ
ーラー等、上記〕。配列決定用の各種断片を次のように
して調製した〔数は、ベース対における名目断片鎖長を
示し、標識部位は星印により示される〕。
（１）BspＩによるHif-2hの開裂ならびに、レーニング
緩衝液における５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よるBspI-BspI-232およびBspI-BspI-949の単離〔ユー・
イー・レーニング、「ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による高分子量リボ核酸の分別」、ジャーナル・バイオ
ケミストリー、第102頁（1967）〕、 （２） BspＩによるHif-2hの開裂、標識化、PstＩによ
る開裂ならびにBspＩ＊−PstI-83およびBspI＊−PstI-8
27の単離、 （３） BglIIによるHif-2hの開裂、標識化、PstＩによ
る開裂ならびにBglII＊−PstI-336およびBglII＊−PstI
-570の単離、 （４） MboIIによるHif-2hの開裂、標識化、PstＩおよ
びHindIIによる切断（阻害性350bp pBR322断片を開裂さ
せる）、ならびにMboII＊−PstI-519およびMboII＊−Ps
tI-351の単離、 （５） EcoRIによるHif-2hの開裂、標識化、PstＩによ
る開裂、ならびにEcoRI＊−PstI-708およびEcoRI＊−Ps
tI-198の単離、 （６） PstＩによるHif-2hの開裂、標識化、BglIIによ
る開裂ならびにPstＩ＊−BglII-570およびPstＩ＊−Bgl
II-336の単離、 （７） AvaIIによるHif-2hの開裂、標識化、PstＩおよ
びBglIIによる開裂ならびにAvaII＊−PstI-186およびAv
aII＊−BglII-147の単離、 （８） PvuIIによるHif-2hの開裂、標識化、PstＩおよ
びBglIIによる開裂ならびにPvuII＊−PstI-486の単離。
断片を、エー・エム・マキサムおよびダブリュー・ギ
ルバート（上記）の方法により減成させたが、この場合
同著者により1978年９月に示された報告の変性を用い
た。生成物を、50mMトリス−硝酸、1mM EDTA（pH8.3）
中で0.1×25×36cmの12％ポリアクリルアミドゲル（ア
クリルアミド／ビスアクリルアミド＝18/1）により分別
化させ、その際700ボルトで６時間の予備処理の後、900
ボルトで2,8,18および26時間処理した。最良の結果は、
ゲルを使用前２〜３日間にわたり室温に維持した場合に
得られた。
かく長さのcDNA挿入物を両ストランドから配列決定
し、標識末端として役立つ各制限部位を緊張させた断片
により配列決定した。かく得られたヌクレオチド配列を
第８〜10図に示す。予期されるように、この挿入物にお
ける各制限部位の位置は、制限酵素開裂のみにより測定
される位置よりも完全に位置決定され、これを第４図に
示す。
第８〜10図について見ると、挿入物のヘテロ重合部分
は５′末端における23G残基および7A残基（恐らくmRNA
のポリ（Ａ）末端を反映する）により、ならびに３′末
端における15C残基により示される。参考のため、挿入
物は、dG末端に続く第一ヌクレオチドからポリ（Ａ）残
基の前の最終ヌクレオチドまで番号が付けられる。位置
57〜59におけるATG開始トリプレットおよび位置624〜62
6におけるTAA停止トリプレットは、ナンセンスコドンに
より中断されない解読枠を規定する。挿入物におけるこ
の領域内の２つの他の解読枠はそれぞれ18個および12個
のナンセンスコドンを有する。さらに異なる解読枠にお
けるATGもしくはGTGおよび停止信号により示されて25個
以上のアミノ酸のポリペプチドをコードする他の配列
は、それぞれヌクレオチド226と304との間、640と778と
の間および683と743との間に存在する。したがって、ヌ
クレオチド57と626との間の領域は、恐らく本発明にお
けるIFN−αの生物学的もしくは免疫学的活性を示すポ
リペプチドをコードするようなHif-2h断片のヌクレオチ
ド配列を含むと思われる。
勿論、通常の方法〔エー・エフストラチアジス等、上
記〕によるポリ（Ａ）RNAからのクローン化cDNAは５′
末端ヌクレオチドを欠失しかつ人工的配列さえ含みうる
ことを了解すべきである〔アール・アイ・リチヤード
等、「成鶏β−グロビンcDNAの分子クローン化および配
列分析」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第７
巻、第1137〜1146頁（1979）〕。したがつて、ヌクレオ
チド57〜59に位置するATGが標準mRNAの最初のATGである
とは限らない。しかしながら、以下の説明の目的で、ヌ
クレオチド57〜59におけるATGが標準mRNAの最初のATGで
あると仮定する。
挿入物のこの領域によりコードされるポリペプチドを
標準ひとリンパ芽球細胞インターフェロンの35個末端ア
ミノ酸、すなわち、−− SerAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgArgAlaLeuIleLe
uLeuAlaGlnMetGlyArgIleSerLeuPheSerCysLeuLysAspArgH
isAsp−−〔ケー・シー・ズーン等（上記）およびエム
・フンカピラーおよびエル・フード（上記）により決
定〕と比較すれば、選択解読枠は適正であり、ヌクレオ
チド57〜124は「成熟」ポリプチドをコードするヌクレ
オチド配列に先立つ信号配列をコードしうるものと思わ
れる。何故なら、公表された配列と決定された配列とを
並べて見ると（第24番目以降のアミノ酸）、顕著な一致
性を示すからである（すなわち26〜35アミノ酸）。
成熟核mRNAにおいて、５′末端からの第一AUGトリプ
レットは通常、蛋白合成に対する開始部位である〔エム
・コザック、「成熟核リボソームはどのようにしてメツ
センジャーRNAにおける開始域を選択するか」、セル
誌、第15巻、第1109〜1125頁（1978）〕。リンパ芽球細
胞インターフェロンの第一アミノ酸に対応するHif-2h断
片中のコドンは第一AUGからの22個のコドン（および第
二AUGからの14個のコドン）であり、これはインターフ
ェロンをコードする配列に先立って、23個（もしくはそ
れ以下の恐らく15個）のアミノ酸の信号ペプチドを決定
する配列があることを示している。長い方の推定信号配
列は11個の疎水性アミノ酸の非中断系列を含有し、短い
方のものは６個の疎水性アミノ酸のものを含有する。疎
水性残基のこの蓄積が信号配列の特徴である〔ビー・デ
イー・デビスおよびピー・シー・タイ、「膜を透過する
蛋白質分泌のメカニズム」、ネイチヤー誌、第283巻、
第433〜438頁（1980）〕。
「成熟」IFN−αポリペプチドに明らかに対応するヌ
クレオチド配列は498個のヌクレオチドからなり、166個
のアミノ酸をコードする。カルボキシ末端処理がないと
仮定すれば、インターフェロンポリペプチドの分子量は
19,388である。コード配列の基本組成は50％GCである。
インターフェロンコード配列内のコドン使用は、一般に
哺乳類mRNAに対して示されたものとよく一致する〔アー
ル・グランタム等、「コドンカタログ使用およびゲノム
仮説」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第８巻、
第49〜62頁（1980）〕。観察される全ての変化は、関与
する少数に起因する。
勿論、Hif-2h断片につき第８〜10図に示されたポリペ
プチドの構造は、生体内酵素との相互作用、たとえばグ
リコソレーション（glycosolation）によりもたらされ
たポリペプチドに対する変更を何も考慮に入れていな
い。したがって、この構造は生体内で生産されるIFN−
αとは同一でないが、たとえ同一でないにしろ極めて類
似した生物学的および免疫学的性質を有すると理解せね
ばならない。さらに、この構造は、たとえば単一もしく
は多重のベース置換、欠失、挿入もしくは転位を含む突
然変異またはこの構造の化学的誘導化のような他の変化
がIFN−α活性をも示す化合物を生成させうることを示
唆する。
3.挿入IFN−αcDNAプラスストランドの決定 mRNAと同じ配列を有するDNA鎖をプラスストランドと
名付け、その相補体をマイナスストランドと名付ける。
IFN−αcDNA挿入物のプラスストランドは第５図に示す
ように同定された。Hif-2hDNAを制限酵素BglIIによって
開裂させ、末端をＰ32−燐酸によって標識し（PstＩ−
開裂末端について記載したように）そしてDNAをPstＩに
より切断して、より長い（545b.p.（上記した精度のよ
り大きい分析法により測定して570b.p.））放射性断片
と、より短い（340b.p.（上記した精度のより大きい分
析により測定して336b.p.））ものとを生成させた。こ
れら断片を変性させそして誘発白血球からポリ（Ａ）RN
Aに対し80％ホルムアミド、0.4M NaCl中において、すな
わちDNA-DNA再結合が生じないような条件（上記）の下
でヒブリド化させた。核酸をヌクレアーゼS1で切断し、
これは全ての単一鎖核酸、特に非ヒブリド化P32-DNAを
減成し、そして生成物をポリアクリルアミドゲルで分離
した〔アール・エフ・ウイーバーおよびシー・ワイスマ
ン、「バークーシャープ法の変法によるRNAの地図
化」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第７巻、第
1175〜1193頁（1979）〕。放射能写真は、短い方のヌク
レオチド断片のみがヒブリド化されかつポリ（Ａ）RNA
により保護されていることを示し、この５′−標識短ヌ
クレオチド鎖をマイナスストランドと同定した。プラス
トランドの方向性は、したがって、第４図および第５図
（右手側）に示される通りである。
4.非誘発ひと白血球からのポリ（Ａ）RNAはHif-2hDNAに
ヒブリド化しない例 前節には記載したと同じ実験を行なったが、ポリ
（Ａ）RNAは、センダイウイルス誘発白血球の場合と同
じ手順により調製した非誘発ひと白血球からのものとし
た。検出しうる量の標識DNAは保護されなかった。前節
の結果と比較して、非誘発細胞からのポリ（Ａ）RNA
は、誘発細胞からのポリ（Ａ）RNAにおけるよりも約1/2
0以下の量の、Hif-2hにヒブリド化しうるmRNAを含有す
る。
Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-4cに関連した組替えDNA分子を
含有する大腸菌による、インターフェロン活性を有する
ポリペプチドの合成 pBR322のPstＩ部位は、β−ラクタマーゼ（ペニシリ
ナーゼ）遺伝子内に存在する。したがって、コードDNA
断片（たとえば、遺伝子の全部または一部からなるcDN
A）を適正方向および適正解読枠における位置に結合す
れば、融合蛋白質が得られる。この蛋白質は、β−ラク
タマーゼのアミノ末端部分からなり、それに続いて挿入
DNA配列がコードするアミノ酸配列が存在する（エル・
ビラーカマロフ等、上記）。挿入DNA断片がそれ自身の
開始信号を含むDNA配列からなりかつβ−ラクタマーゼ
配列と一致する停止信号を備えた配列を有すれば、停止
および再開始が第二開始信号において起こり、非融合活
性蛋白質が生ずるであろう（エー・シー・ワイ・チャン
グ等、上記）。Hif-4cに関連したDNA挿入物が適正解読
枠中に挿入されてβ−ラクタマーゼ遺伝子内で発現する
のを確保するため、一組のpBR322の誘導体、すなわちpK
T279、pKT280およびpKT287〔ケー・タルマッジ等、「信
号配列コード化領域における独特なPstＩクローン化部
位を有するプラスミドベクターの作成」、ジーン誌、第
12巻、第235〜241頁（1980）に記載された手法により作
成〕を使用した。これら誘導体の各々はPstＩ部位を有
し、その位置はその部位に結合されたDNA挿入物が他の
誘導体のPstＩ部位における挿入物からの異なる解読枠
中に存在するような位置である。すなわち、第６図から
判るように、pKT279をプラスミドのプレペニシリナーゼ
遺伝子のヌクレオチド74に位置するPstＩ部位を有し、p
KT280はヌクレオチド75に、またpKT287はヌクレオチド8
2にそれぞれPstＩ部位を有する。各プラスミドの残余の
配列はpBR322における周知配列である。したがって、こ
の組みは、全ての３つの解読枠におけるβ−ラクタマー
ゼ遺伝子中へのＤの挿入を可能にする。Hif-2hからのPs
tＩ切断挿入物を、Hif-4c断片について記載したように
調製した。Hif-2hPstＩ断片（10ng）を、20μｌの10mM
トリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2、100mM NaCl、6mM
β−メルカプトエタノール、200μg/mlゼラチンおよび
0.1mM ATPの中でPstＩ開裂pBR322、pKT279、pKT280また
はpKT287（それぞれ10ng）と混合し、0.1単位のＴ4DNA
リガーゼ（ニューイングランド・ビオラブ社）と共に10
℃にて16時間培養した。得られた組替えDNA分子をＺ−p
BR322（Pst）/HcIF-2h、Ｚ−pKT279（Pst）/HcIF-2h、
Ｚ−pKT280（Pst）/HcIF-2hおよびＺ−pKT287（Pst）/H
cIF-2hと名付ける。イー・コリHB101をこれら組替えDNA
分子のそれぞれにより形質転換させ、そして形質転換し
たコロニーを前記したようにテトラサイクリン含有寒天
板の上で選択した。形質転換細菌のテトラサイクリン耐
性クローンは循環ベクターを含有するので、各組の細菌
コロニーをミリポアフイルター上で生育させ、そしてＰ
32−標識Hif-4c断片にヒブリド化するコロニーを上記の
ように同定しかつ選択した。これらの菌株は次のように
名付けられた：イー・コリ HB101（Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-2h-AH1）乃
至（−AH3）；イー・コリ HB101（Ｚ−pKT279（Pst）/HcIF-2h-AH1）乃
至（−AH8）；イー・コリ HB101（Ｚ−pKT280（Pst）/HcIF-2h-AH1）乃
至（−AH8）；イー・コリ HB101（Ｚ−pKT287（Pst）/HcIF-2h-AH1）乃
至（−AH8） 上記菌株の幾種かならびに菌株Ｚ−pBR322（Pst）/Hc
IF-SN1〜95の幾種かの抽出物を、IFN−α活性につき試
験した。細菌をトリプトン培地において固定相で増殖さ
せ、回収し、1/20容量（培養物の容量に対し）の50mMト
リス−HCl（pH8）、30mM NaClで洗浄しそして凍結させ
た。解凍後、細胞を下記容量の前記緩衝液に再懸濁させ
そしてリゾチームを1mg/mlまで加えた。０℃にて60分間
の後、懸濁物を凍結させ（エタノール−ドライアイス
浴）、５回解凍させ（37℃にて）、ソルバールGSA型ロ
ータで12000rpmにて10分間遠心分離した。或る場合には
上澄液（S30）の一部をさらにスピンコ65型ロータで10
0,000xgにて遠心分離し、上澄液（S100）を回収した。
このような上澄液を、細胞病理学的効果減少分析により
IFN−α活性について選別した（実験１）。実験１にお
いて陽性反応を示すコロニーならびに上記の組Ｚ−pBR3
22/HcIF-SN1〜SN95からのクローンを、より低希釈にて
再分析した（実験２）。
抽出物源： イー・コリHB101（下記により形質転換） 抽出物源： イー・コリHB101（下記により形質転換） 上記からの、より活性の大きいものの幾つかをさらに
詳細に検査した。培養物を対数相の後期まで増殖させ
（見掛けOD650は約0.9）＊、細胞を1/50の培養物容量に
て上記のように溶菌させた。若干活性を有するが陰性比
較（S30;S100:0;0）としてＺ−pBR322（Pst）/HcIF-SN3
2を用いれば、次の結果が得られる： これら菌株により生産されたれ実際の蛋白質は、IFN
に無関係にアミノ酸に融合してまたはIFNの信号配列の
全部もしくは一部を含んで生産されたかどうか決定する
よう構造的に分析しなかったことを了解すべきである。
しかしながら、少なくとも蛋白質が生産されれば、これ
はIFNの免疫学的もしくは生物学的活性を示す。したが
って、この発現した蛋白質は有用である。この蛋白質を
コードするDNA配列がHuIFN−αに関連するDNA配列であ
ることを蛋白質の活性が示すことは特に重要である。か
くして、例示したようなDNA配列を使用して他の同様なH
uIFN−α関連DNA配列を選択すること、および成熟イン
ターフェロンもしくはその変種を発現し或いは特定の発
現蛋白質の収量を向上させるような他の構成に対し基礎
を与えることは当業者の範囲内にある。
蛋白質の生産レベルは２つの要因により支配される：
すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数とそれら遺伝子コ
ピーが転写されかつ翻訳される効率とである。転写およ
び翻訳（これらは共同して発現となる）の効率は次いで
ヌクレオチド配列に依存し、これは通常所望のコード配
列の前方に位置する。これらのヌクレオチド配列すなわ
ち発現制御配列は、特にRNAポリメラーゼが相互作用し
て転写を開始させる（プロモータ配列）と共にリボソー
ムがmRNA（転写の生成物）と結合し、かつ相互作用して
翻訳を開始させる位置を規定する。必ずしもこの種の全
ての発現制御配列が同等の効率をもって作用するとは限
らない。したがって、所望蛋白質に対する特異的コード
配列をその隣接するヌクレオチド配列から分離し、これ
らを寧ろ他の公知の発現制御配列に融合させてより高レ
ベルの発現に好適とするのが有効である。これも達成さ
れるが、新たな処理されたDNA断片を多重コピープラス
ミドまたはバクテリオファージ誘導体に挿入して細胞内
の遺伝子コピーの数を増加させ、それによりさらに発現
蛋白質の収量を向上させることもできる。
幾つかの発現制御配列を上記のように使用することが
できる。これらには、イー・コリのラクトースオペロン
のオペレータ，プロモータおよびリボソーム結合かつ相
互作用配列（たとえばシャイン−ダルガルノ配列のよう
な配列を含む）（“lac系”）、イー・コリのトリプト
ファン合成酵素系の対応配列（“trp系”）、ファージ
λの主要なオペレータおよびプロモータ域（ＯLＰLおよ
びＯRＰR 1）、ファージfdコート蛋白の制御域、或いは
原子核（原核）もしくは成熟核（真核）細胞およびその
ウイルスの遺伝子の発現を制御するその他の配列が包含
される。したがって、適当な宿主において特定ポリペプ
チドの生産を向上させるには、そのポリペプチドをコー
ドする遺伝子を前記のように調製し、これを含有する組
替えDNA分子から取出して、前記発現制御配列に一層近
接して或いは上記発現制御配列の一つを管理しながら組
替えDNA分子中に再挿入する。この種の方法は当分野で
公知である。
所望生成物の細胞収量の増加は、細菌中で使用しうる
遺伝子数の増加に依存する。これは、たとえば組替えDN
A分子を前記したように中庸のバクテリオファージλ（N
M989）中に挿入することにより、特に簡単には制限酵素
でプラスミドを切断することにより達成され、それによ
り線状分子を生産させて、これを次いで制限ファージλ
クローン化ベヒクル〔たとえばエヌ・イー・ムレイ等、
「試験管内組替え遺伝子の回収を簡単にするλファー
ジ」、モレキュラー・ジーン・ゲネチックス、第150
巻、第53〜61頁（1977）およびエヌ・イー・ムレイ等、
「バクテリオファージＴ4からのDNAリガーゼ遺伝子の分
子クローン化」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロ
ジー、第132巻、第493〜505頁（1979）に記載されてい
る種類〕と混合し、そしてDNAリガーゼと共に培養して
組替えDNA分子を生成させる。次いで、所望の組替えフ
ァージを前記のように選択しかつ使用して宿主菌株の大
腸菌を溶菌させる。
特に有用なλクローン化ベヒクルは、抑圧遺伝子cIに
おける感温性突然変異と遺伝子sにおける抑圧性突然変
異とを含み、その生成物は宿主細胞の溶菌に必要であり
かつ遺伝子Ｅ、すなわちその生成物はウイルスの主要な
カプシド蛋白質である。この系を用いて、溶菌細胞を32
℃で生育させ、次いで45℃まで加熱してプロファージの
切断を誘導させる。37℃における長期生育は高レベルの
蛋白質生産をもたらし、これらは細胞内に保持される。
何故なら、これらは通常の方法でファージ遺伝子生成物
によって溶菌されずかつファージ遺伝子挿入物はカプセ
ル化されていないで転写用に利用され続けるからであ
る。次いで、細胞の人工的溶菌は所望生成物を高収量で
遊離する。
上記した過程によりＺ−pBR322（Pst）/HcIF-SN35で
形質転換させた宿主から生産されてひと白血球インター
フェロンの生物学的もしくは免疫学的活性を示すような
ポリペプチドの収量を増加させる初期の試みにおいて、
ヒブリド中のDNA挿入物の制限地図を決定した。この地
図は、Hif-2hと比較して、Hif-SN35が配列の３′末端を
示すPstＩ部位を欠失しており、信号配列の一部が欠失
しており（コドン７まで）かつ信号配列によるAvaII部
位がBspＩ部位により交換されていることを示した。し
たがって、Hif-SN35はHif-2hの多形的もしくは対立的変
種であると思われる。
プラスミドHif-SN35をPstＩにより開裂させ、得られ
たDNA鎖を標準法により両端部で復帰（chew back）さ
せ、そしてそこにLAC-Alu断片（下記）を挿入してプラ
スミドを再び閉環させた。Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-SN3
5-AHL6と同定された変型プラスミドの実際の構造および
大腸菌中に生産された蛋白質のアミノ末端におけるアミ
ノ酸配列を決定した。この構造のヌクレオチド配列は、
LAC-Alu断片がIFN−α１（SN35）の第一アミノ酸から離
れた１個のアミノ酸を結合したことを示している。大腸
菌で発現された蛋白質のアミノ末端部のアミノ酸配列
は、IFN−α１（SN35）配列に融合した６個のアミノ酸
を有する融合蛋白質が生産されたことを示している。し
かしながら、変型プラスミドにより形質転換された宿主
は、未改変Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-SN35により形質転
換された宿主と比較して、ひと白血球インターフェロン
の生物学的もしくは免疫学的活性を示す約100倍多いポ
リペプチドを生産する。
第25図を参照すれば、Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-SN35
（第25図におけるSN35）で形質転換させた宿主により生
産されて、ひと白血球インターフェロンの免疫学的もし
くは生物学的活性を示すようなポリペプチドの収量を向
上させる他の試みが図示されている。BspＩ（キツス博
士より寄贈）により標準法を用いてヒブリドプラスミド
を開裂させた。なお、このBspＩは当業界で既知の容易
に入手しうる制限酵素であって、たとえばA.キッス等
「バチルス・スファエリクスからの新配列−特異性エン
ドヌクレアーゼ（Bsp）」、ジーン誌、第１巻、第323〜
329頁（1977）の論文に詳述されている。このBspＩは、
第８図に示すように、DNAを配列GGCCにて切断する。制
限酵素を熱失活（65℃、30分）させた後、混合物を50mM
トリス−HCl（ph8）に調製して加熱した（37℃、30
分）。フェノールとエタノールとで抽出した後、最大の
或る1cDNA断片を低温ゲル化アガロース（0.8％）上で単
離しそしてHindIIIリンカーを結合させた。次いで、こ
の変型断片をHindIII−開裂プラスミドHS-pBR322（Ec
o）/lacUV5-150（“Lac-150"）＊（エッチ・シャーラー
により寄贈）に結合させたが、これは断片含有ゲル片
（それぞれ約20μｌ）を65℃にて溶融させ、37℃まで冷
却しかつ１μｌ当り20UのT4DNAリガーゼを加えて行なっ
た〔＊このプラスミドはlacプロモータHaeIII-202b.p.
断片を含有し〔ダブリュー・ギルバート等、「Lac抑圧
剤のラクトースオペレータ配列および作用」、蛋白質リ
ガンド相互作用、エッチ・スンドおよびジー・ブラウア
ー編（ベルリン、ワルター・デ・グルイター）、第193
〜206頁およびケー・バックマン等、「試験管内におい
て組替え処理を使用するプラスミドに対する遺伝子発現
の量大化」、セル誌、第13巻、第65〜71頁（1978）〕、
その３′末端にてEcoRIリンカにより示される〕。15℃
にて16時間の後、固化ゲルにおいて結合が生じた〔エッ
チ・レーラッハ、私的通信、1980〕。
1/10容量の100mMトリス−HCl（pH7.5）、100mM CaC
l2、100mM MgCl2を試料に加え、これを65℃にて５分間
加熱し、37℃まで冷却した。次いで、この試料を使用し
てCa++処理イー・コリHB101を形質転換させ、０℃にて2
0分間培養し、42℃にて１分間および20℃にて10分間加
熱した。１モルのトリプトン培地を加えた後、試料を37
℃にて60分間培養しそしてアンピシリンを含有する寒天
板上に接種した。プラスミドDNAをこれら培養物から前
記のように分離しそしてLAC断片に隣接する５′末端を
持ったIFN−α１挿入物を含有するヒブリドプラスミド
を制限分析により同定した。次いで、プラスミドを常法
によりEcoRIで開裂させかつエンドヌクレアーゼBAL-31
で切断させ（0.06U/ml、30℃で２〜４分間）、LAC断片
の結合EcoRI末端を除去しかつβ−ガラクトシダーゼコ
ード部分を短縮させた。
処理プラスミドが完全なIFN−α１コード配列を含有
するのを確実にするため、次いでプラスミドを常法によ
りBglIIで開裂させ、上記のように後処理しそして最大
断片をアガロースゲル（0.8％）上で分離した。次い
で、この断片をＺ−pBR322（Pst）/HcIF-SN35からのBsp
Ｉ-BglII断片と合し、得られたヒブリドプラスミドを使
用して上記のようにイー・コリHB101を形質転換させ
た。この形質転換したコロニーをIFN活性につき選別
し、高レベルのIFN活性を有する１つのクローンを選択
した。このクローンをイー・コリHB101（C8-IFN−α
１）およびそのヒブリドプラスミドC8-IFN−α１と名付
けた。
C8-IFN−α１のDNA配列分析は、開始トリプレットの
後のコード配列がβ−ガラクトシダーゼの最初の７個の
アミノ酸と、融合により生成したPro残基と、IFN−α１
信号配列およびIFN−α１（SN35）配列のアミノ酸16〜2
3とを決定したことを示している。ヒブリドプラスミドC
8-IFN−α１で形質転換させたイー・コリミニセル菌株
（DS410）は、未改変Ｚ−pBR322（Pst）/Hif-SN35で形
質転換させたミニセルと比較し、HuIFNの免疫学的もし
くは生物学的活性を示すポリペプチドを１当り約5000
万単位すなわち約2500倍多く生産する。プラスミドC8-I
FN−α１により生産されたポリペプチドのアミノ酸配列
は、生産物がβ−ガラクトシダーゼからの７個のアミノ
酸と融合により生じた１個のアミノ酸とIFN−α１に融
合されたIFN−α１信号配列のアミノ酸16〜23とを有す
る融合蛋白質であることを確認させた。
さらに、本発明により蛋白質収量を向上させる種々の
構成の例を、他の型のIFN−αに関連して検討した（下
記）。
ヒブリドプラスミドで形質転換させた大腸菌により生産
されるインターフェロン活性の性質 1.トリプシンに対するIFN−α活性の感受性 標準HuIFN−α（比活性、1.2×105U/mg、50U）ならび
にイー・コリHB101（Ｚ−pKT287（Pst）/HcIF-2h-AH6）
のS100抽出物（“Hif-287−６抽出物”）（200U/ml、10
U）およびイー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-S
N35）のS100抽出物（“Hif-35抽出物”）（1000U/ml、5
0U）の試料50μｌを、下記のように種々な量のトリプシ
ンと共に、37℃にて30分間培養した。S100抽出物は高蛋
白質含量を有する一方、HuIFN−αはそうでないので、H
uIFN−αと比較S100抽出物Hif-32との混合物を並行的に
試験した。
2.セファデックスＧ−100上のクロマトグラフィーにお
ける挙動 抽出物Hif-35（1ml）およびイー・コリHB101（Ｚ−pB
R322（Pst）/HcIF-SN32）のS100抽出物（“Hif-32抽出
物”）を32mlのセファデックスＧ−100カラム上で、50m
M燐酸カリウム緩衝液（pH7.4）にて４℃でクロマトグラ
フにかけた。チトクロームｃ（0.2mg）を内部標識とし
て加えた。流速を2ml/hrとし、10mlづつのフラクション
を集めた。280nmおよび405nm（チトクロームｃ）におけ
る吸光度とIFN−α活性とを測定した。第７図に示すよ
うに、Hif-35抽出物のIFN−α活性は、チトクロームｃ
の前に、約0.45のＫD値をもって溶出された。したがっ
て、この物質の見掛け物質量は約20,000〜30,000〔ヌク
レオチド配列決定により、カルボキシ末端収量なしと仮
定して測定した分子量は19,388〕であり、比較抽出物Hi
f-32のフラクションには活性が検出されなかった。
3.ひと白血球インターフェロンに対する抗体による、Hi
f-35およびHif-287−６のインターフェロン活性の阻害 HuIFN−α（比活性1.2×106IU/mg）とHif-35/Hif-287
−６のS100抽出物とを、10％子牛血清を含む100μｌの
改変イーグル培地（MEM）中において、HuIFN−α〔ケー
・カンテル、1976年２月24日に調製、比活性450,000単
位/ml〕に対する羊抗血清の種々な希釈により37℃で30
分間培養し、45μｌを細胞病理学的効果減少分析により
IFN−α活性につき分析した〔抗体自身は細胞病理学的
効果を起こさなかった〕。
抗体の作用が、たとえば蛋白質分解のような非特異的
作用を基づくものでないことを示すため、ねずみインタ
ーフェロン系を用いて同様な実験を行なった。
かくして、特にHuIFN−αに向けられた抗体は、HcIF-
2h DNA配列を含有する或る種の組替えDNA分子により形
質転換させた大腸菌で生産されるポリペプチドのIFN−
α活性を阻害する。大腸菌で生産されたIFN−αに対す
る抗体の明らかな低親和性は、これと天然HuIFN−αと
の間の構造上の相違を反映し、たとえば炭水化物成分の
不存在、信号配列の存在またはβ−ラクタマーゼ配列の
一部に対する融合を反映する。
4.ねずみ細胞に対するHif-35およびHif-287−６抽出物
の活性低下 ひとCCL23細胞またはねずみL929細胞をイー・コリ抽
出物、HuIFN−α〔ケー・カンテルの方法により調製、
比活性1.2×106単位/mg〕またはねずみIF（N.I.H.標
準）で処理し、これにウイルスを接種し（ひと細胞の場
合はメンゴウイルスを用い、ねずみ細胞の場合はVSVを
用いた）、そしてIFN−α活性を細胞病理学的効果減少
分析によって測定した。
これらの結果は、Hif-35およびHif-287−６抽出物が
ひと細胞に対し保護作用を有しかつねずみ細胞に対し極
く僅かの効果（〜10％）しか持たないことを示してお
り、これはひとインターフェロンに対し典型的なことで
ある。
5.幾つかの細胞機能に対する効果 イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）/Hif-SN35-AHL
6）からの抽出物を、幾つかの細胞機能に対する効果に
つき、標準IFNと比較した。イー・コリ製のIFN−αは、
天然IFN−αの次の性質を示した：（１）ひとリンパ球
の自然致死活性を高め、（２）抗体依存性の細胞媒介さ
れる細胞毒性を高め、（３）抗原−およびミトゲン−誘
発される白血球移動阻害を抑制し、かつ（４）IFN−感
受性バーキット（Burkitt）リンパ腫細胞の成長を抑制
する。これら性質は、ひと腫瘍および癌に対する大腸菌
合成されたIFN−α１活性を示唆する。
6.アミノ末端配列のないIFN−αの活性 アミノ末端配列のないIFN−αもまた大腸菌で作ら
れ、IFN活性と一致する活性を有することが示された。
適当な組替えDNA分子を作成するため、プラスミドHif
-2h（上記）をEcoRIおよびBamHIにより部分的に切断
し、そしてIFN−α１コード配列を含有する断片をアガ
ロースゲルで分離し、Hif-2h（上記）と比較してヒブリ
ド挿入物の３′末端に隣接したPstＩ部位を欠失するプ
ラスミドHif-SN35のEcoRI/BamHI制限から得られた非−I
FN−α１コード配列と混合した。次いで、得られたプラ
スミドをPstI/BglIIにより処理してIFN−α１コード配
列のアミノ末端部分を除去した。その個所に、PvuIIに
よるプラスミドHif-2hの切断と、Balエンドヌクレアー
ゼによる処理と、PstＩリンカーの結合と、BglIIによる
制限とにより調製された一連のIFN−α１断片を挿入し
た。このようにして得られたプラスミドは、そのアミノ
末端配列の種々な部分を欠失した一連のIFN−α１コー
ド配列を含有していた。これらの１種（プラスミド2H-M
8）をPstＩで切断して、そのヌクレオチド配列を決定し
た。この配列は、プラスミド2H-M8がPst部位とIFN−α
１の第一コドン（CYS）との間に数個のヌクレオチドを
有することを示した。したがって、PstＩ切断されたプ
ラスミド2H-M8をT4ポリヌクレアーゼ/dATP、S1エキソヌ
クレアーゼで処理しそしてSalＩにより切断させた。こ
の過程は一連の断片を形成し、そのIFN−α１コード配
列はアミノ末端部分を欠失していた。次いで、これらの
断片をEcoRIによる切断とエキソヌクレアーゼS1による
処理とSalＩによる切断とでプラスミドLac3V8から調製
したGUA-LAC断片に作用結合させることにより、LAC制御
下に置いた。かく得られた一連のプラスミドは、LACプ
ロモータを含有する断片にAUGを介して反時計方向に結
合したアミノ末端の種々な部分を欠失するIFN−α１コ
ード配列を有した。
これらプラスミドの幾つかを配列決定した。一つはIF
N−α１の第５番目のアミノ酸から開始し、一つはIFN−
α１の第10番目のアミノ酸から開始した。イー・コリ・
ミニセル（DS410）において、これらプラスミドの両者
はIFN活性を示すポリペプチドを生産した。したがっ
て、必ずしも全てのIFN−α１蛋白質がIFN活性のため必
要とされるとは限らない。
配列は次のように作成した： （１） Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-2h（プラスミド Hif
-2h）をEcoRIおよびBamHIで部分制限した。これによりp
BR322のBamHI部位からDNA断片を作成し（第１図）、こ
れはれIFN−α信号を介して延びかつプラスミドHif-2h
の配列をコードすると共にプラスミドHif-2hのIFN−α
挿入物における３′非コード化領域に位置するEcoRI部
位で終端する（第４図および第10図のヌクレオチド685-
690を参照）。
（２） 次いで、この断片をプラスミドHif-SN35のEcoR
I/BamHI断片と結合させた。このEcoRI/BamHI断片は最初
の断片の逆であって、IFN−αの３′非コード領域にお
けるEcoRI部位から初期のpBR322を介してpBR322のBamHI
部位まで延在する。プラスミドHif-2hからの断片と結合
させれば、得られるプラスミド（Hif-SN35）はIFN−α
配列の３′末端におけるPstＩ部位を欠失し、Hif-2hのI
FN−α信号配列に対する完全なコード配列を有する。
（３） 次いで、得られたプラスミドをPstＩおよびBgl
IIで制限してIFN−αコード領域におけるBglII部位（第
４図および第９図のヌクレオチド313-318を参照）からp
BR322由来の配列を介してPstＩ部位まで延びる断片を作
成した。かくしてこの配列は、IFN−αの５′非コード
領域とIFN−αの信号配列をコードする領域とIFN−αの
５′コード領域の１部とを欠失する。
（４） IFN−αのアミノ末端をコードする配列の１部
を欠失したDNA配列を作成するには、上記（３）で作成
した配列をアミノ末端コード領域の１部を欠失するよう
に作成した一連の配列と組合せる必要がある。
これを行うため本発明はPvuIIでHif-2hを開裂させ、
このエンドヌクレアーゼはプラスミドをIFN−αの信号
配列をコードする領域の中間で開裂する（第８図のヌク
レオチド97-103を参照）。次いで、この配列をBalエキ
ソヌクレアーゼによって処理した。この処理により一連
のDNA配列が生ずると思われ、その幾つかはIFN−αコー
ド配列のアミノ末端領域における種々の部位から開始す
る。これはPvuII部位とIFN−αコード領域の開始部位と
の間に位置する信号配列の25個以上のヌクレオチドを切
断する必要がある（第８図を参照）。
このBal切断の結果につき分析するため、切断配列の
両末端に対しPstＩリンカを最初に付着させ、次いでBgl
IIで制限した。この結果、このBal切断の際に除去され
なかったIFN−α配列の第１ヌクレオチドにPstＩリンカ
が接続した小型のDNA配列が生じ、この配列はIFN−αコ
ード領域からBglII部位まで存在する。要するに、これ
らの断片を上記（３）の配列に結合させると、IFN−α
配列がBglII部位で再構成され、PstＩリンカは前記小型
断片の他端部を上記（３）のDNA配列のPstＩ制限断片に
結合せさる。その結果、Hif-2hと比較して、PvuII部位
からIFN−αのコード領域まで存在するヌクレオチドの
幾つかを欠失する（Bal切断のため）プラスミドが作成
される。
（５） このように作成されたプラスミドの１種（2H-M
8）を分析用に選択した。しかしながら、このプラスミ
ドにおいてはBal切断が充分に行われておらず、信号配
列の幾つかのヌクレオチドがまだ残存していた。従っ
て、これをPstＩで開裂させかつ再び切断して信号配列
に残存する全てのヌクレオチドとIFN−αのアミノ末端
部分をコードする少なくとも幾つかのヌクレオチドとを
除去した。この切断には、S1エキソヌクレアーゼを使用
した。次いで、得られた切断断片をLac3V8からの発現制
御配列の前記下において発現させた。
Hif-4c中の挿入物に弱くクロスヒブリド化しかつHif-2h
断片とは異なる制限地図も有するDNA挿入物を含む組替
えDNA分子を含有する大腸菌のクローンの同定 標準リンパ芽球細胞インターフェロン〔ズーン等（上
記）ならびにエム・フンカピラーおよびエル・フード
（上記）〕とHif-2h断片から推定された配列との最初の
35個のアミノ酸を比較すると９個の相違が示される。全
ての場合、相違するアミノ酸に対するコドンは、ワンベ
ース（one-base）変化により関連させうるであろう。一
方の標準リンパ芽球細胞インターフェロンについて直接
に決定されたアミノ酸組成と、他方のHif-2h断片の配列
から推定されるものとでは、それらのGly、Pro、Cysお
よびMetの含有量に関して顕著な相違を示す。これらの
相違は多形現象では説明し得ない程大きい。寧ろ、それ
らは、少なくとも２つの非対立遺伝子の存在を反映して
いると思われる。何故なら、これら２種の蛋白質の相違
程度（26％差）は、たとえばひとと羊との間のβ−グロ
ビンのそれ（23％差）に近似する。したがって、前記に
同定された（上記）断片Hif-4cに対する弱いヒブリド化
を示したクローンを検査し、クローン・イー・コリHB10
1（Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-II-206）を同定した。
このクローンのヒブリドプラスミドＺ−pBR322（Ps
t）/HcIF-II-206（“HcIF-II-206"）およびそのDNA挿入
物（“Hif-II-206断片”）は、Hif-4cおよびHif-2h断片
に弱くヒブリド化している。プラスミドHif-II-206で形
質転換させた大腸菌（イー・コリ）はHuIFN−αの生物
学的もしくは免疫学的活性を示すポリペプチドを生産す
る。Hif-206断片は、Hif-2h断片について決定されるも
のとは異なる制限地図を有する。これら２種の制限地図
の比較を第11図に示す。ここでも、Hif-II-206断片にお
ける制限部位の絶対的位置は、制限地図化だけでは決定
されない。しかしながら、上記した標準法を用いる、こ
の挿入物のヌクレオチド配列に関する配列決定は、これ
ら位置の一層絶対的な決定を可能にする。しかしなが
ら、Hif-2h断片と比較してHif-II-206断片の制限地図に
は差があるので、これら２種の挿入物のインターフェロ
ン遺伝子は異なるヌクレオチド配列を有することが明ら
かである。
第12〜16図を参照すれば、培養物HcIF−Ｇの挿入DNA
配列（Hif-II-206断片）と培養物HcIF−Ｅ（下記）の挿
入DNA配列（Hif-2h断片）との上記で決定されたヌクレ
オチド配列ならびにこれらヌクレオチド配列によりコー
ドされた蛋白質の対応アミノ酸配列が示されている。Hi
f-II-206断片、すなわち文献〔エヌ・エム・ウイルキー
等、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第７巻、第85
9〜877頁（1979）〕に記載された方法Ｂの手順を使用し
て培養物HcIF−Ｇから単離したプラスミドDNAのPstＩ断
片（790bp）のヌクレオチド配列を、エー・エム・マキ
サムおよびダブリュー・ギルバートの標準法（上記）を
用いて決定した。用いた配列決定法を第17図に示す。
制限DNA（通常約10μｇ）を、文献〔エヌ・マンティ
等、ジーン誌、第10巻、第１〜10頁（1980）〕により記
載されているように５′末端標識した。標識断片を第二
の制限酵素で開裂させ、生成物をトリス−硼酸−EDTA緩
衝液における５％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳
動にかけて分離し〔エー・シー・ピーコックおよびシー
・ダブリュー・ジングマン、バイオケミストリー、第６
巻、第1818〜1827頁（1979）〕、ゲルから抽出しそして
文献〔ダブリュー・ミューラー等、ジャーナル・モレキ
ュラー・バイオロジー、第124巻、第343〜358頁（197
8）〕に記載されているように精製した。
第17図を参照して、配列決定用の各種断片を次のよう
に調製した： 25および26−−PstＩによるHif-II-206の開裂、標識
化、BalIIによる開裂、ならびにPstＩ＊−BalII断片（2
57bp）（“25"）とPstＩ＊−BalII断片（279bp）（“2
6"）との単離； 21、22および23−−PvuIIによるHif-II-206の開裂、
標識化、BglIIによる開裂、ならびにPvuII＊−BglII断
片（88bp）（“21"）とPvuII＊−BglII断片（176bp）
（“22"）とPvuＩ＊−BglII断片（214bp）（“23"）と
の単離； 11、12、13および14−−BglIIによるHif-II-206の開
裂、標識化、PstＩによる開裂ならびにBglII＊−PstＩ
断片（279bp）（“14"）およびBglII＊−PstＩ断片とBg
lII＊−BglII＊断片との共移動性混合物の単離。PvuII
によることの混合物の開裂ならびにBglII＊−PstＩ断片
（257bp）（“13"）とBglII＊−PvuII断片（176bp）
（“12"）とBglII＊−PvuII断片（88bp）（“11"）との
単離； 27L、27U、41、43、44および45−−HinfＩによるHif-
II-206の開裂、標識化ならびに先駆体断片；HinfＩ＊−
HinfＩ＊（113bp）（“27P"）、HinfＩ＊−HinfＩ＊（1
46bp）（“28P"）、HinfＩ＊−HinfＩ＊（159bp）（“3
0P"）、HinfＩ＊−HinfＩ＊（397bp）（“31P"）、およ
びHinfＩ＊−HinfＩ＊（1522bp）（“32P"）の単離。Mb
oIIによる28Pの開裂ならびに断片HinfＩ＊−MboII（112
bp）（“41"）の単離。MboIIによる30Pの開裂ならびに
断片HinfＩ＊-MboII（126bp）（“43"）の単離。PstＩ
による31Pの開裂ならびに断片HinfＩ＊−PstＩ（151b
p）（“44"）の単離。PstＩによる32Pの開裂ならびに断
片HinfＩ＊−PstＩ（139bp）（“45"）の単離。２種の
ストランド（“27U"および“27L"）を得るための27Pの
ストランド分離。
27Uおよび27L以外の全ての断片を、両ストランドに関
し配列決定し、しかも位置185におけるBglII部位以外に
つき配列決定用の起源として役立つ制限部位にわたって
決定した。
２種の挿入物によりコードされたアミノ酸配列を比較
すれば明らかなように、Hif-II-206断片はHif-2h断片に
おけるよりもアミノ酸の１個少ないインターフェロン状
蛋白質をコードする〔Hif-2hに存在するアミノ酸44（As
p）がHif-II-206には欠如している〕。さらに、２種の
断片におけるヌクレオチド位置の10はと誘導アミノ酸残
基の17％とが異なる。
さらに、リンパ芽球細胞インターフェロンのアミノ末
端につき決定された35個のアミノ酸〔ケー・シー・ズー
ン等、サイエンス、第207巻、第527〜528頁（1980）〕
と比較して、挿入物Hif-II-206はズーン等（上記）によ
り決定された35個のアミノ酸残基とは５個の残基におい
て異なる蛋白質をコードする。したがって、白血球型
（α型）の少なくとも３種の異なるIFN遺伝子、すなわ
ちHif-2h断片とHif-II-206断片とズーン等のIFNに対す
る遺伝子被覆とが存在する筈である。インターフェロン
の新たに提案された命名法によれば、以下、これら遺伝
子によりコードされる蛋白質を次のように同定する：IFN遺伝子源 蛋白質 Hif-2h IFN−α１ Hif-II-206 IFN−α２ リンパ芽球細胞からの IFN−α３ IFN（ズーン等、上記） IFN−α１とIFN−α２との間の差は、ひとCCL23と牛
胎生腎（BEK）細胞とに対するそれらの異なる活性にも
反映される。
＊ ヒブリドプラスミドを含有するイー・コリHB101
を、トリプトン培地において振とうしながら約１〜２の
OD650まで増殖させた。細胞を収穫し、秤量し、初期培
養容量の1/100もしくは1/20に再懸濁させそしてリゾチ
ーム−凍結−解凍法により溶菌させた〔エス・ナガタ
等、ネイチャー誌、第284巻、第316〜320頁（198
0）〕。ミクロ測定板におけるCPE減少分析法によりＳ−
30上澄液を試験した。比較細胞からの抽出物は陰性であ
った（＜1 IU/ml）。ひとCCL23細胞と生胎生腎（BEK）
細胞（フロー）とをMEM-10％胎生牛血清中で生育させ
た。IFN含有抽出物に対する露出を24時間行なった。細
胞をメンゴウイルスの適当な希釈物によって処理し、24
時間後に染色した。数値を、既知測定値の部分精製され
た白血球IFN（調製物PIF、ケー・カンテルにより寄贈）
と比較して肉眼的に推定した。この調製物は牛細胞に対
するよりもひと細胞に対し約３倍活性が大であった。
＊＊ Hif-SN35とHif-2hとの制限地図を比較すれば、そ
れらが相互の多形質変種であることが示唆される（上
記）。
したがって、IFN−α１はIFN−α２よりも、ひと細胞
に対して約30倍低い活性を有する。しかしながら、これ
ら両者は共に、牛細胞に対しほぼ同等の活性を有する。
したがって、IFNは、ひとにおける抗ウイルス剤および
抗腫瘍もしくは抗癌剤としての使用に加え、牛における
これらの病状を処置するにも有用である。たとえば、Hu
IFN−αの調製物は、牛におけるFMDVおよびその他周知
のウイルス感染を処置する際、標準法（上記）で使用す
ることができるであろう。このことは特にIFN−α１に
ついて云えることである。何故なら、牛細胞に対するそ
の活性がひと細胞に対する活性よりも約20倍高いからで
ある。
次に、第28図を参照して、プラスミドC8-IFN−α２を
高収率で作成する手順を示す。
構成C8（上記）を有するIFN−α１の場合改善された
収量が得られたので、IFN−α２についても同様な構成
を作成した。Ｚ−pBR322（Pst）/Hif-II-206をBspＩに
より完全にかつPvuIIにより部分的に（P1にて）開裂さ
せ（第28図）、867bpの断片を６％ポリアクリルアミド
ゲルで単離した。次いで、この断片を、PvuII切断プラ
スミドC8-IFN−α１から単離された2590bpの断片に結合
させた。得られたヒブリドプラスミド（C8-IFN−α２）
を使用してイー・コリHB101を形質転換させ、クローン
をIFN活性につき選別した。高活性を示す１つのクロー
ンを選択し、イー・コリHB101（C8-IFN−α２）と名付
けた。
ヒブリドプラスミドC8-IFN−α２のDNA配列決定は、
このプラスミドがC8-IFN−α１と同様に開始コドンに続
いてβ−ガラクトシダーゼの最初の７個のアミノ酸と２
個のDNA断片の融合により生じたPro残基とIFN−α２信
号配列のアミノ酸16〜23をコードするDNA配列とに関す
るDNA配列を有することを示した。したがって、ここで
もIFN−α２を含有する融合蛋白質が発現されると思わ
れる。この事実は、このプラスミドで形質転換された宿
主により発現されるIFN−αが融合蛋白であることを示
唆する。
このプラスミドにより形質転換されたミニセルはIFN
の１当り100〜200×100万単位を与え、或いは未改変
Ｚ−pBR322（Pst）/Hif-II-206により形質転換されたミ
ニセルよりも20,000〜40,000倍高いIFN−α２の収量を
与える。
C8-IFN−α１（50×106単位/l）とC8-IFN−α２（100
〜200×100万単位/l）との相対的収量を比較すると、先
ず驚くことに、IFN−α２はひと細胞（上記）に対しIFN
−α１よりも約30倍高い活性を示した。しかしながら、
これら２種のC8プラスミドで形質転換させたミニセルに
より生産される２種の蛋白質の量の定量分析は、C8-IFN
−α１においてはC8-IFN−α２におけるよりも約５〜６
倍多い蛋白質が生産されていることを示した。したがっ
て、IFN活性を基準として測定した収量は、C8-IFN−α
１の場合生産された蛋白質がずっと多い量だけずれてい
た。
次に第26図を参照して、IFN−α２の収量を向上させ
る試みの他の構成を記載する。先ず、公知lacプロモー
タをAluＩで制限しかつ第27図に示したような断片（１
つの末端につき）をEcoRIリンカー（共同研究により調
製）で伸長させることにより、LAC Alu断片を含有する
発現プラスミドを調製した。次いで伸長した断片をpBR3
22のEcoRI部位に挿入し、そしてEcoRI-EcoRI断片を構造
から削除した。第26図に404として示された得られたプ
ラスミドをHindIIIおよびPvuIIで開裂させてIFN−α２
含有断片を挿入した。このIFN−α２断片は、Ｚ−pBR32
2（Pst）/HcIF-II-206（第26図における“206"）の部分
的Sau3A制限と、HindIIIリンカーによるSau3A断片の伸
長（第27図）と、BspＩでの開裂とにより調製した。こ
の断片をHindIII-PvuII開裂されたプラスミド404に挿入
した後、得られたプラスミドをHindIIIとEcoRIとで制限
し、S1ヌクレアーゼで処理してLACプロモータをIFN−α
２遺伝子に近接させかつ再結合させた。この構造は、LA
Cプロモータの制御下においてIFN−α2DNA配列を有す
る。さらに、IFN−α２配列は、そのプロモータの開始A
UGコドンの直後となる（第27図参照）。したがって、こ
れらプラスミドにより生産されたIFNの少なくとも一部
は成熟IFN、たとえば信号配列からの如何なるアミノ酸
をも含まないIFNである。ミニセルにおいて、これらプ
ラスミドの１種であるLAC-AUG（α２）により得られたI
FN−α２の収量は１当り５〜10×100万単位であっ
た。
同様な結合原理に基づいて他のIFN−α２構造をも作
成した。ここでは、pBR322のペニシリナーゼ発現制御配
列は、AUG開始コドンを介してHif-II-206＊からのIFN−
α２遺伝子に結合されている。
＊ この構造は、MboIIによるpBR322の部分的切断とS1
での処理と上記したようなEcoRIリンカーの結合とpBR32
2のEcoRI部位に対する断片の再挿入と１つのEcoRI部位
の削除とにより最も効果的に作成できる。次いで、得ら
れたプラスミド（“β−lac-AUGプラスミド”）を、前
記したような206のS1処理（緩和に）されたHindIIIリン
カー−BspＩ断片と組合せることができる。EcoRIで開裂
させかつS1とホスファターゼとで処理した後、発現プラ
スミドβ−lac-AUG（α２）を単離する。他の遺伝子に
よる構成は、単に構成β−lac−AUGプラスミドを使用し
て他の遺伝子もしくは構造を挿入させることにより、或
いはより好ましくはプラスミドβ−lac-AUG（α２）自
身にSau3A部位を使用することにより、同様に行なうこ
とができる。
このプラスミドは、β−lac-AUG（α２）と名付けら
れ、宿主細胞を形質転換させるため使用すると、他の蛋
白質配列に融合することなくIFN−α２の生産をもたら
す。ミニセルにおいて、１当り50〜100×100万単位の
収量が観察された。このプラスミドは、本発明により使
用するのに最も好適なプラスミドである。これはまた、
本明細書中に記載した他のIFN−α遺伝子と共に使用す
るにも好適である。本発明において好適な宿主は、イー
・コリDS410（ara azide TonA lac y Tsx min a min b
gal λ xyl stepR）である。この菌株は、好適プラスミ
ドβ−lac-AUG（α２）の例と共にHcIF−Ｋとして寄託
されている。各種のプロモータ配列と、リボソーム結合
部位と、シャイン−ダルガルノ配列と、プロモータとAU
G開始コドンと間のDNA配列とを使用しかつ本明細書中に
記載した各種のIFN−α遺伝子とを使用する他の構成を
も、同様の方法と原理とにより作成できる。勿論、これ
らの構成も本発明により実現され、本発明の範囲内であ
る。
IFN−α１およびIFN−α２のヒブリド分子 IFN−α１およびIFN−α２の多数のヒブリド分子を作成
した。驚くことに、これらヒブリド構造体は、それらの
親であるIFN−α１またはIFN−α２のいずれかと比較し
て、定量的に異なる性質と活性とを有する。
第28図を参照すれば、４種のこれらヒブリド分子の構
造の略図が示されている。便宜上、これらヒブリド分子
をプラスミドＩ、II、IIIおよびIVと名付ける。これら
の構造体において、制限酵素（BspＩはキツス博士から
寄贈され、その他のものはビオラブ社から得られた）に
よる切断を、供給者により推奨されているように行なっ
た。部分的DNA開裂は酵素量を減少させて行なった。制
限酵素を熱失活（65℃、30分間）させた後、試料を50mM
トリス−HCl（pH8）にて調製し、必要に応じ子牛腸アル
カリホスファターゼ（ベーリンゲン社）（DNA1μｇ当り
１容量）を加えた。37℃で30分間の後、試料をフェノー
ルとエタノールとで抽出した。大抵の場合、DNA断片を
低温度ゲル化アガロース（0.8％）にて分離させた。結
合のため、断片含有のゲル片（それぞれ約20μｌ）を65
℃で溶融させ、37℃に冷却しそして１μｌ当り20UのT4D
NAリガーゼを加えた。混合物を15℃にて16時間保ち、固
化ゲルにおいて結合を生ぜしめた〔エッチ・レーラッ
ハ、私的通信（1980）〕。1/10容量の100mMトリス−HCl
（pH7.5）と100mMのCaCl2と100mMのMgCl2とを加え、試
料を65℃にて５分間加熱しそして37℃まで冷却した。次
いで試料をCa++処理されたミニセルに加え、０℃にて20
分間培養し、42℃にて１分間および20℃にて10分間加熱
し、そして1mlのトリプトン培地を加えた。37℃にて60
分間培養した後、適当な抗生物質を含有する寒天板の上
に培養物を載置した。全てのプラスミドをIFN配列にお
ける接合部にわたりヌクレオチド配列を分析して特性化
した。
ヒブリド分子Ｉ、すなわちα−１（PvuII）α−２ヒ
ブリドをPvuIIによるC8-IFN−α１（上記）（第28図に
おけるC8−α１）の部分的開裂により作成し、脱燐酸化
させ、PstＩにより開裂させそしてPstＩ-PvuII（Ｐ2）1
346bpの断片を単離した。この断片を、PvuIIでのC8-IFN
−α２（上記）（第28図におけるC8−α２）の完全開裂
とPstＩでの部分開裂とにより調製された2135bpのPstＩ
（ａ）−PvuII（Ｐ2）断片に結合させた。
ヒブリド分子II、すなわちα−１（BglII）α−２ヒ
ブリドは、ヒブリド分子ＩをBglIIにより開裂させて作
成した。脱燐酸化の後、大きなBglII断片を単離してこ
れをC8-IFN−α２の小さなBglII断片に結合させた。ク
ローン化の後、正しい方向性にて小さなBglII断片を有
するヒブリドプラスミドを制限分析により同定した。
ヒブリド分子III、すなわちα−２（PvuII）α−１ヒ
ブリドは、C8-IFN−α１をPvuIIで部分開裂させ、脱燐
酸化し、AvaＩで開裂させ、次いで1686bpのPvuII
（Ｐ2）−AvaＩ断片と3233bpのPvuII（Ｐ1）−AvaＩ断
片とを単離することにより作成した。次いでこれら断片
をHcIF-II-206（上記）（第28図におけるSN206）の300b
pのPvuII（Ｐ1）−PvuII（Ｐ2）断片に結合させ、そし
て小さなPvuII断片を含有するプラスミドを形質転換大
腸菌菌株のIFN−α活性を分析して同定した。
ヒブリド分子IV、すなわちα−２（BglII）α−１ヒ
ブリドは、Bg1IIおよびAvaＩでのC8-IFN−α１の開裂に
よって作成し、そして1776bpの断片を単離した。次い
で、この断片をヒブリド分子IIIの3543bpのBglII-AvaＩ
断片に結合させた。
互いに異なるインターフェロン種類の生物学的活性を
も測定した。各種のプラスミドで形質転換させたミニセ
ル（DS410）の培養物を増殖させ、細菌を遠心分離によ
り収穫し、PBSで洗浄し、PBS中に懸濁させ（初期容量の
約1/20）、1mg/mlのリゾチームおよび10mMのEDTAと共に
０℃で60分間培養し、４回凍結・解凍を反復し、注射器
中に５回通して剪断しそして遠心分離により開裂させ
た。
ひと、ねずみ、モルモットおよび牛の細胞に対する活
性は次の通りであった： 驚くことに、全てのインターフェロンは牛細胞に対し
ほぼ同じ活性を示したが、IFN−α１とIFN−α１のアミ
ノ末端成分を有する２つのヒブリドIFN（ＩおよびII）
とは、IFN−α２およびIFN−α２のアミノ末端成分を有
する２つのヒブリドIFN（IIIおよびIV）よりも、ひと細
胞に対し約10〜1000倍低い活性を示す。さらに驚くこと
に、IFN−α１のアミノ末端部を有する２つのヒブリドI
FN（ＩおよびII）は、IFN−α１自身よりも10倍以上低
い活性をひと細胞に対して示す。しかしながら、IFN−
α２のアミノ末端部を有する１つのヒブリド（III）
は、ひと細胞に対しIFN−α２とほぼ同じ活性を示す。
IFN−αに対する染色体遺伝子の同定 HaeIIIおよびAluＩでの部分開裂により生成させかつE
coRIリンカーによりλチヤロン4Aアームに結合させたひ
と胎児染色体DNAの断片から得られたヒブリドファージ
の集団をアール・エム・ローン等、セル誌、第15巻、第
1157〜1174頁（1978）に従って調製した。この遺伝子集
団を、Ｚ−pBR322（Pst）/Hif-2hから切断されたＰ32−
標識IFN−α1cDNA挿入物を試料として使用する「現場」
での方法により選別した〔ダブリュー・ディー・ベント
ンおよびアール・ダブリュー・デビス、サイエンス、第
196巻、第180〜182頁、（1977）；ティー・マニアチ
ス、セル誌、第15巻、第687〜701頁（1978）〕。反復プ
ラーク精製により240,000個のプラークから16個のヒブ
リド化陽性ファージクローンを単離した〔ティー・マニ
アチス等、上記〕。10種のヒブリドファージDNA調製物
をそれぞれHindIII、TacI,HhaＩ、BamHI、EcoRIおよびB
glIIによって開裂させ、そしてアガロースゲル上での電
気泳動により断片を分離してこれをミリポア膜に移し
〔イー・エム・サウザーン、ジャーナル・モレキュラー
・バイオロジー、第98巻、第503〜517頁（1975）〕、そ
してＰ32−標識Hif-2hcDNA挿入物でヒブリド化させた。
第18図は、部分制限地図および種々の表として結果を要
約している。そこに示されているように、各ヒブリドフ
ァージDNA調製物については、少なくとも二三の特徴的
制限部位が確立され、さらにIFN−α１遺伝子試料にヒ
ブリド化する領域が描写されている（黒矢印）＊。
＊ 第18および24図におけるchr16上の陰影区域は、Hif
-2hcDNAに弱くヒブリド化するがＲ−ループ化を示さな
かった配列を示す。
次に第18図および第24図を参照すれば、クローンchr
−３およびchr-26は、幾つかのEcoRIおよびHindIIIの断
片を共有するので、それらの長さの多くにわたって重複
するDNA断片を示しうることが判るであろう。さらに、c
hr−１のヒブリド化部分とchr-10のヒブリド化部分の１
つは、Hif-2h試料にヒブリド化するHindIII-HindIIIお
よびEcoRI-EcoRIの断片が同じ長さ（それぞれ3.2kbおよ
び0.95kb）を有するので同じになるであろう。また、ch
r-16の「右手側」のヒブリド化部分（第18図において
“r"と標識する）はchr-35のヒブリド化部分と同一であ
ると思われるが、これら２つのクローンの各々はHif-2h
cDNA試料にヒブリド化する1.4kbのBglII-BglII断片と2k
bのEcoRI-EcoRI断片とをもたらすので反対方向に配向す
る。したがって、恐らくchr-16とchr-35との挿入物は重
なるであろう。
したがって、11個のヒブリド染色体DNAの13個のヒブ
リド化部分は10種類以上、すなわちchr−１、chr−３、
chr-12、chr-13、chr-16（左手側、第18図において“1"
と標識する）、chr-26、chr-30、chr-35、chr-19および
chr-27になると思われる。
次に第24図を参照すれば、chr−１とchr−３とchr-10
とchr-26との重複およびchr-16とchr-35との重復が示さ
れている。
上記のデータが示唆するところでは、個々のひとのゲ
ノムはHif-2hにクロスヒブリド化する10種以上の異なる
DNA配列を含有する。この結論は、クローン集団中に検
出された断片Hif-2h関連の配列の割合が約16,000中１で
あるという事実により裏付けられる。半数体ひとゲノム
に対し３×109bpの値を仮定すれば、16kb（検査された
クローンの平均値）という平均DNA断片寸法を有する単
一遺伝子コピーに対する予測値は約1:190,000である。
したがって、Hif-2h関連断片の頻度は単一遺伝子に対す
る予測値よりも12倍高いものである。
これらデータと比較して、ローン等（上記）がβ−グ
ロビンcDNA試料につき同じ遺伝子集団から300,000個の
プラークを選別した際、僅か２つの陽性クローンのみが
同定され、この場合予測値は1.6:300,000であった。し
たがって、ひとゲノムには、Hif-2h断片もしくはIFN−
α1cDNAにクロスヒブリド化する10〜15個の明確な染色
体DNA断片が存在するであろう。
Hif-chr35の別の特性化 説明の目的として、chr-35ヒブリド化配列（“Hif-ch
r35"）をさらに特性化した。前記した染色体ヒブリドフ
ァージのヒブリド化部分は同様に特性化されかつ本発明
の範囲を逸脱することなく取扱いうることを了解すべき
である。
chr-35のヒブリド化部分（“Hif-chr35"）（Hif-chr1
6の右手断片と恐らく同一である、上記）は、BglII部位
を有する唯一のヒブリド化染色体DNA部分である。IFN−
α１およびIFN−α２のcDNAはそれらのコード配列内に
それぞれ１個および２個のBglII部位を有するので、恐
らくHif-chr35は２つの予めクローン化したインターフ
ェロン遺伝子の１つの相手方になると思われる。３′末
端Hif-2hcDNA断片（３′非コード域のみを含有する）へ
のHif-chr35の強力なヒブリド化は、この試料に対する
他の染色体DNAの弱いヒブリド化と比較して、Hif-chr35
とHif-2hとの対応性を裏付けている〔エフ・カフアトス
等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイ
エンス・USA、第74巻、第5618〜5622頁（1977）〕。
Hif-chr35断片をさらに分析するため、HindIII-BamHI
断片をchr35から切除した。この断片（3.4kb）は、chr-
35のヒブリド化部分（“Hif-chr35"）を含有する。この
断片を、周知のdC-dG末端化方法（エル・ビラーカマロ
フ等、上記）を用いてpBR322のPstＩ部位にクローン化
させ、そしてイー・コリHB101を得られた組替えDNA分子
により周知方法〔たとえばエス・ナガタ等、ネイチャー
誌、第284巻、第316〜320頁（1980）〕を用いて形質転
換させた。
これら形質転換体のクローンをその場でのコロニーヒ
ブリド化〔ディー・バナハンおよびエム・メセルソン、
ジーン誌、第10巻、第63〜67頁（1980）〕によりＰ32−
標識Hif-2h断片（上記）で選別し、プラスミドDNA、す
なわちＺ−pBR322（Pst）/HchrIF-35HB（“HchrIF-35H
B"）を陽性クローンから分離した〔エヌ・エム・ウイル
キー等、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第７巻、
第859〜877頁（1979）、方法Ｂ〕。pBR322のβ−ラクタ
マーゼ遺伝子に関しプラスミド中のヒブリド挿入物“Hc
hrIF-35HB断片”の方向性を、EcoRI開裂および得られた
断片の寸法決定により決定した。β−ラクタマーゼのそ
れと一致するよう配向した挿入物をαと呼び、反対の配
向をβと呼ぶ。
これら陽性クローンの培養物を見掛けOD650＝0.8にな
るまで増殖させ、そして細菌を収穫しかつエス・ナガタ
等（上記）に記載されたリゾチーム−凍結−解凍方法に
より溶菌させた。検査した10種のクローンのうち７種が
75〜500単位／細胞ｇのIFN−α活性を示した（細胞病理
学的効果減少分析）。
これら７種のIFN生産性クローンのうちの１つのDNA挿
入物、すなわちイー・コリHB101〔Ｚ−pBR322（Pst）/H
chrIF-35HBα〕を、制限分析およびヌクレオチド配列決
定によりさらに特性化した。プラスミドDNA（HchrIF-35
HBα）を前記したようにクローンから調製し、制限部位
をスミス−ビルンスチールの地図化により決定した〔エ
ッチ・オー・スミスおよびエム・エル・ビルンスチー
ル、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第３巻、第23
87〜2398頁（1976）〕。HchrIF-35HBαをEcoRIで切断
し、５′末端を標識しそしてBglIIで切断した〔かつPst
Ｉにより約1kbの望ましくない断片を開裂させた〕。1.0
4kbのEcoRI-BglII（３′近位）断片と0.96kbのEcoRI-Bg
lII（５′近位）断片とを、文献〔エー・シー・ピーコ
ックおよびシー・ダブリュー・ディングマン、バイオケ
ミストリー、第６巻、第1818〜1827頁（1967）〕に記載
されているようなアガロースゲル電気泳動により単離し
た。両断片をHinfＩ、BspＩおよびMboIIによりそれぞれ
部分開裂し、生成物を１μg/mlの臭化エチジウムを含有
するトリス−酢酸緩衝液（pH7.8）における１％アガロ
ースゲルにて分離した。染色後、放射能バンドを放射能
写真により可視化させた。BstNIおよびHgiAI部位も、1.
04kb（３′近位）断片について同様に決定した。分析の
結果を第19図に示す。
ヌクレオチド配列決定のため、HchrIF-35HBαを種々
の制限酵素で開裂させ、生成物をトリス−硼酸−EDTA緩
衝液における５％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳
動により分離し（エー・シー・ピーコックおよびシー・
ダブリュー・ディングマン、上記）、そしてゲルから抽
出し、ダブリュー・ミューラー等、ジャーナル・モレキ
ュラー・バイオロジー、第124巻、第343〜358頁（197
8）に記載されているように精製した。
使用した配列決定方法を第19図に示し、下記に説明す
る。
１および2:BglIIによるHchrIF-35HBαの開裂、標識
化、EcoRIおよびPstＩによる開裂ならびにBglII＊−Eco
RI断片（940bp）（“1"）およびBglII＊−EcoRI断片（3
60bp）（“2"）の単離； ３および4:EcoRIによるHchrIF-35HBαの開裂、標識
化、BspＩによる開裂ならびにEcoRI＊−BspＩ断片（680
bp）（“3"）およびEcoRI＊−BspＩ断片（880bp）
（“4"）の単離； ５、６、７および8:PvuIIによるHchrIF-35HBαの開
裂、標識化、BglIIおよびEcoRIによる開裂ならびにPvuI
I＊−EcoRI断片（780bp）（“5"）、PvuII＊−BglII断
片（215bp）（“6"）、PvuII＊−BglII断片（90bp）
（“7"）およびPvuII＊−EcoRI断片（290bp）（“8"）
の単離； ９および10:EcoRIによるHchrIF-35HBαの開裂、1300b
p EcoRI-EcoRI断片のトリス−硼酸EDTA緩衝液における
１％アガロースゲル電気泳動による単離、さらにHinfＩ
による開裂ならびにHinfＩ-HinfＩ断片（450bp）および
HinfＩ-HinfＩ断片（180bp）の単離。より大きなHinfＩ
-HinfＩ断片の標識化とMboIIによる開裂とはHinfＩ＊−
MboII（190bp）（“9"）の単離を可能にした。より短い
HinfＩ-HinfＩ断片の標識化とAvaIIによる開裂とはHinf
Ｉ＊−AvaII断片（150bp）（“10"）の単離を可能にし
た； 11:MboIIによるHchrIF-35HBαの開裂、標識化、BglII
による開裂ならびにMboII＊−BglII断片（465bp）（“1
1"）の単離； 12、13および14:BspＩおよびBglIIによるHchrIF-35HB
αの開裂、上記のように1200bp BspＩ-BglII断片のアガ
ロース電気泳動による単離、ならびに（ａ）HgiAIによ
る開裂、標識化、MboIIによる開裂およびHgiAI-MboII断
片（300bp）（“12"）とHgiAI＊−MboII断片（360bp）
（“13"）との単離または（ｂ）BstＩによる開裂、標識
化、EcoRIによる開裂およびBstNI＊−EcoRI断片（380b
p）（“14"）の単離。
マキサム−ギルバート法（上記）により、各種の断片
を配列決定した。全ての断片を両ストランドに関しかつ
配列決定用の原点として役立つ制限部位にわたって配列
決定した。
HchrIF-35HBαにおけるコード域のヌクレオチド配列
とHif-2hにおけるそれ（コード域）との比較（第８〜10
図と第20〜23図との比較）は、それらが同一であること
を示す。特に、驚くことに、HchrIF-35HBα断片のコー
ド配列内、すなわち５′非コード域におけるHinfＩ部位
と３′非コード域におけるEcoRI部位との間には、イン
トロンの存在が示されない。したがって、成熟IFN−αm
RNAに対応する染色体配列にはイントロンを検出するこ
とができなかった。
Hif-chr26およびHif-chr3の特性化 chr−３およびchr-26の遺伝子含有断片は、ヘテロブ
ュプレックス分析により同一と思われるが少なくとも１
つのBglII制限部位において異なり、これらをヌクレオ
チド配列決定により検査した。725ベース対における５
つのヌクレオチドの相違が見出された。これらのうち２
つのみがコード配列にあると思われる。遺伝子だけでな
くそれらに先立つ少なくとも3.5Kbpとそれらに続く6.0K
bpとは完全なヘテロデュプレックスを形成しかつ僅か２
つのアミノ酸変化を伴う比較的少ない配列差しかないの
で、Hif-chr3とHif-chr26とは同一遺伝子の対立形態で
あると思われる。これらはIFN−α4a（Hif-chr3）およ
びIFN−α4b（Hif-chr26）と名付けられる。前記した慣
用の配列決定技術により決定されたIFN−α4bのヌクレ
オチド配列と対応アミノ酸配列とを第29〜32図に示す。
第29〜32図を第８〜10図、第12〜16図および第20〜23
図と比較すれば、各配列によりコードされる蛋白質はそ
れらの残基の約15％において互いに相違することが示さ
れる。この相違は、2000〜9000万年前に分化した非対立
遺伝子の生成物に対して典型的である。
ねずみ細胞におけるHif-chr35の発現 ねずみ細胞において発現させるため、Hif-chr35断片
の供給源としてプラスミドＺ−pBR322（Pst）/HchrIF-3
5HBα（上記）を使用した。プラスミドをPstＩで制限し
かつ５′エキソヌクレアーゼで処理して５′dG末端を除
去した。次いで、この断片を、pBR322のBamHI、BamHI断
片とポリオーマDNAとの結合により調製されたプラスミ
ドの５′dG−末端化KpnＩ断片に挿入した。得られたベ
クトルを使用してねずみ3T3細胞を形質転換させ、この
場合燐酸カルシウム技術を使用した〔エヌ・マンテイ
等、ネイチャー誌、第281巻、第40〜46頁（1979）〕。
これら形質転換細胞は便宜上ねずみ3T3（ポリオーマ−H
if-chr35）と名付けられる。20〜40時間後、分析はひと
細胞に対し300単位/IFN−α1mlのIFN−α活性を示し、
牛細胞に対しては約3000単位/IFN−α1ml活性を示し
た。
勿論、第８〜10図、第12〜16図、第20〜23図および第
29〜32図に示したヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配
列に対し、たとえば既に起こったまたは続いて用いうる
単一もしくは多重のベース置換、挿入、転位もしくは欠
失を含む突然変異のような如何なる変化をも考慮に入れ
てないことを了解すべきである。さらに、この配列はこ
れら図面に示されたコドンと同じアミノ酸をコードする
他のコドンの可能な置換をも考慮に入れてない。したが
って、IFN−αの免疫学的もしくは生物学的活性を示す
ポリペプチドをコードするような改変配列も本発明の範
囲内にあることを了解すべきである。
さらに、第８〜10図、第12〜16図、第20〜23図および
第29〜32図に示されたアミノ酸配列は、生体内もしくは
試験管内試剤、たとえば生体内グリコシル化酵素との相
互作用により惹起されるポリペプチドに対し如何なる変
化をも考慮に入れてないことを了解すべきである。した
がって、IFN−αの免疫学的もしくは生物学的活性を示
すこれらポリペプチドの断片および誘導体も本発明の一
部であることを了解せねばならない。
細菌宿主におけるインターフェロンの免疫学的もしくは
生物学的活性を示すポリペプチドの産生 細菌病理学的効果減少分析〔ダブリュー・イー・スチ
ュアート・IIおよびエス・イー・スルキン、S.E.Proc.S
oc.Exp.Biol.Med、第123巻、第650〜653頁（1966）〕は
少量のIFN（細菌細胞１個当り１個以下の活性分子）を
検出しうるので、上記した10種のヒブリドλファージで
感染させたイー・コリHB101の溶菌物をIFNの存在につき
分析した。11種のファージのうち７種（chr-10、chr-1
2、chr-19およびchr-27を除く全て）は、３〜５単位/ml
の範囲のIFN活性を有する溶菌物を与えた。chr-10およ
びchr-12の場合、前記したようにpBR322のPstＩ部位に
サブクローン化させたヒブリド化（Hif-2hに対する）Hi
ndIII-HindIIIもしくはEcoRI-EcoRI断片は大腸菌におい
てIFN−α活性を表わした。大腸菌mRNAをスプライスし
得ないと思われるので〔オー・メルセロー−プイジャロ
ンおよびピー・クーリルスキー、ネイチャー誌、第279
巻、第647〜649頁（1979）〕、これらIFN−α染色体遺
伝子は恐らくそれらのコード領域中にイントロンを含有
しないと思われる。
最終結論 本発明によりポリ（Ａ）RNAから調製されたcDNAを含
有する一群の組替えDNA分子がセンダイウイルス処理
（誘発）されたひと白血球から単離され、その代表的な
ものは次の性質を有している： （１） 誘発されたひと白血球からのポリ（Ａ）RNAに
はヒブリド化するが、非誘発のものからのポリ（Ａ）RN
Aにはヒブリド化しない、 （２） RNAの混合物からIFN−αmRNAを選択する能力に
よりおよびヒブリド抑制翻訳分析においてインターフェ
ロンmRNAの翻訳を抑制（可逆的に）する能力により示さ
れるように、IFN−αmRNAにヒブリド化する、 （３） この群の或る種のものを含有する大腸菌は、次
の性質を有する化合物を生産する： （ａ） トリプシンに対し感受性であり、 （ｂ） ひと細胞系においてIFN−α活性を示すが、ね
ずみ細胞系においてはほんの僅かの活性しか示さず、 （ｃ） 20,000〜30,000の分子量を有し（第８〜10図の
ヌクレオチド配列に基づけば19,388である）、 （ｄ） IFN−α活性は、ひと白血球インターフェロン
に対する抗体により特異性に抑制される、 （４） 本発明のヒブリドプラスミドのDNA挿入物は、I
FN−αmRNAをRNA混合物から選択する能力に加え、IFN−
αDNAをcDNAを包含する各種供給源の混合物からおよび
染色体DNAのヒブリドファージ遺伝子集団から選択する
ことができる、 （５） IFN−αに対する多数の異なる染色体遺伝子が
存在し、しかもこれら遺伝子がイントロンを欠失すると
共に適当な宿主におけるインターフェロンおよびインタ
ーフェロン様ポリペプチドの直接的発現を可能にするこ
とは予想外である、 （６） これら組替えDNA分子のDNA挿入物における少な
くとも３種のヌクレオチド配列が異なっており、これは
IFN−αに関し少なくとも３種の非対立遺伝子が存在す
ることを示唆している、 （７） これら３種のヌクレオチド配列によりコードさ
れる蛋白質に標準リンパ芽球細胞インターフェロンから
決定された35個のアミノ酸とは異なっている、 （８） IFN−α遺伝子断片の各種組合せ物に対し調製
されたヒブリド蛋白質は、相互にまたはそれらの親とは
定量的に異なる性質を示し、さらにIFN−αに融合した
付加的アミノ酸を有する蛋白質またはアミノ末端配列の
一部を含まないIFN−αからなる蛋白質はIFN活性を示
す。
これらの性質は、本発明により示された組替えDNA分
子がひと白血球インターフェロンに関するコード配列の
少なくとも１部を含有しかつこれらプラスミドの幾つか
がひと白血球インターフェロンの免疫学的もしくは生物
学的活性を有するポリペプチドの大腸菌における発現を
もたらすことを示している。また明らかなように、本明
細書に示したポリペプチドは蛋白質技術分野で周知され
ているように、本発明の範囲を逸脱することなく断片
化、改変もしくは誘導体化させることもできる。
本明細書に記載した方法により調製される微生物およ
び組替えDNA分子は、西ドイツ連邦共和国ゲッチンゲン
所在のドイツチエ・ザンムルンク・フォン・ミクロオル
ガニスメンに1980年１月７日に寄託した培養物を例と
し、HcIF A〜Ｅとして次のように同定されている： A:イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-4c） B:イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-2h） C:イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-SN35） D:イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-SN42） E:イー・コリHB101（Ｚ−pKT287（Pst）/HcIF-2h-AH6） これらの培養物はそれぞれ寄託番号DSM1699〜1703が
付与されている。
さらに、本明細書に記載した方法により調製された微
生物およびDNA分子は、アメリカ合衆国メリーランド
州、ロックビル所在のアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに1980年３月27日に寄託された培養物を
例としHcIF-Ｇ〜Ｈとして同定され、それぞれATCC寄託
番号31633〜31634が付与されている： G:イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-II-206） H:イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）/HcIF-SN35-AHL
6） 本明細書中に記載した方法により調製したその他の微
生物は、西ドイツ連邦共和国ゲッチンゲン所在のドイツ
チエ・ザンムルンク・フォン・ミクロオルガニスメンに
1980年10月１日に寄託した培養物を例とし、HchrIF−Ａ
〜Ｊとして同定されかつ寄託番号DSM1914〜1923が付与
されている： A.イー・コリHB101におけるchr3のサブクローン化HindI
II断片； B.イー・コリHB101におけるchr12のサブクローン化EcoR
I断片； C.イー・コリHB101におけるchr12のサブクローン化Hind
III断片； D.イー・コリHB101におけるchr13のサブクローン化EcoR
I断片； E.イー・コリHB101におけるchr23のサブクローン化EcoR
I断片； F.イー・コリHB101におけるchr23のサブクローン化Hind
III断片； G.イー・コリHB101におけるchr26のサブクローン化EcoR
I断片； H.イー・コリHB101におけるchr26のサブクローン化Hind
III断片； I.イー・コリHB101におけるchr35のサブクローン化Hind
III-BamHI断片； J.イー・コリHB101におけるchr35のサブクローン化BamH
I断片。
最後に、本明細書中に記載した方法により調製された
れ微生物は、アメリカ合衆国メリーランド州、ロックビ
ル所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンに1980年12月15日に寄託され、HchrIF−Ｋ〜HchrIF−
ＱおよびHcIF−Ｉ〜HcIF−Ｋとして同定されかつそれぞ
れATCC寄託番号31760HchrIF−Ｋ、31761HchrIF−Ｌ、31
762HchrIF−Ｍ、31763HchrIF−Ｎ、31764HchrIF−Ｏ、3
1765HchrIF−Ｐ、31766HchrIF−Ｑ、31767HcIF−Ｉ、31
768HcIF−Ｊ、31769HcIF−Ｋが付与されている： K.イー・コリHB101におけるchr23のサブクローン化Tac-
Tac断片； L.イー・コリHB101におけるchr10lのサブクローン化Bgl
II-BglII断片； M.イー・コリHB101におけるchr10rのサブクローン化Hin
dIII-HindIII断片； N.イー・コリHB101におけるchr26のサブクローン化BglI
I-BglII断片； O.イー・コリHB101におけるchr30のサブクローン化Hind
III-HindIII断片； P.イー・コリHB101におけるchr13のサブクローン化BglI
I-Tac断片； Q.イー・コリHB101におけるchr16lのサブクローン化Bgl
II-Tac断片； HcIF−I:イー・コリDS410（C8-IFN−α２） HcIF−J:イー・コリDS410（LAC-AUG（α２）） HcIF−K:イー・コリDS410（β−Lac-AUG（α２）） 以上、本発明を多くの具体例につき説明したが、この
基本的構成を変化させて、本発明の方法および組成物を
利用する他の具体例を提供しうることが明白である。し
たがって、本発明の範囲は例をもって前記した特定具体
例でなく、寧ろ特許請求の範囲により規定されるべきで
あることが了解されよう。
【図面の簡単な説明】
第１図はその幾つかが本発明のポリペプチドをコードす
る挿入DNA配列を特徴とするような組替えDNA分子の混合
物を製造するための、本発明の方法の一実施態様を示す
概略図、第２図は本発明の初期クローン選別法の概略
図、第３図は本発明により調製されたDNA配列を使用す
るクローン選別法の一実施態様を示す概略図、第４図は
本発明のクローンの一つの制限地図であって、ただしこ
のクローンの各制限部位の絶対的位置は示さず、第８〜
10図においてこれら制限部位のより絶対的な位置を示
し、第５図は本発明の一つの組替えDNA分子におけるDNA
挿入物の方向性を決定する方法の概略図、第６図は本発
明により使用しうる幾つかのクローン化ベヒクルの部分
的ヌクレオチド配列を示す図、第７図は本発明の細菌培
養から調製された上澄液のセファデックスＧ−100分別
化の結果を示す図、第８〜10図は本発明の組替えDNA分
子に対するDNA挿入物のヌクレオチド配列を示す図であ
って、この配列はポリG5′末端に続くヌクレオチドから
ポリＡ残基およびポリC3′末端の前のヌクレオチドまで
番号を付け、ヌクレオチド57〜125は信号配列を示し、
かつヌクレオチド126〜626は「成熟」インターフェロン
および停止コドンを示し、信号配列のアミノ酸配列は下
部文字においてそのヌクレオチド配列の上方に示されか
つ「成熟」インターフェロンのアミノ酸配列は上部文字
においてそのヌクレオチド配列の上方に示され、この遺
伝子における各種の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を
も第８〜10図に示し、これら部位は第４図に示されるも
のよりも絶対的に位置決定され、第11図は本発明の組替
えDNA分子の２つのDNA挿入物の制限地図に関する略比較
図、第12〜16図は本発明の組替えDNA分子の２つのDNA挿
入物のヌクレオチド配列を示す図であって、この配列は
ポリG5′末端に続くヌクレオチドからポリＡ残基および
ポリC3′末端の前のヌクレオチドまで番号を付け、これ
ら挿入物の各々に対する信号配列のアミノ酸配列は下部
文字においてその各ヌクレオチド配列の上方に示されか
つ「成熟」インターフェロンのアミノ酸配列は上部文字
においてそのヌクレオチド配列の上方に示され、第17図
はＺ−pBR322（Pst）/HcIF-II-206の部分制限地図およ
び第12〜16図に示されたHif-II-206断片のヌクレオチド
配列を決定するのに使用される配列決定方法を示す図、
第18図はHif-2h断片にヒブリド化する一連のヒブリドフ
ァージの部分制限地図を示す図、第19図はＺ−pBR322
（Pst）/HchrIF-35HBαのヒブリド挿入物の部分制限地
図およびそのヌクレオチド配列を決定するのに使用する
配列決定方法を示す図、第20〜23図はHchrIF-35HBα断
片のヌクレオチド配列およびそれから生ずるアミノ酸配
列を示す図、第24図はHuIFN−α関連遺伝子に対する部
分結合地図を示す図であって、矢印は誘発白血球ポリ
（Ａ）RNAと共にＲ−ループを形成する領域を示し、ハ
ッチングした枠（chr-16）はブロッチング実験から推定
されたれが、Ｒ−ループ地図では示されなかった配列を
示し、第25図はプラスミドC8-IFN−α１の構成の概略
図、第26図はプラスミドLAC-AUG（α２）の構成の概略
図、第27図はLAC-AUG（α２）の構成、特にAUG開始信号
およびCYSN−末端アミノ酸におけるプラスミドの構成を
示す図、第28図はプラスミドC8-IFN−α２の構成および
ヒブリド分子Ｉ、II、IIIおよびIVの概略図、第29〜32
図はヌクレオチド配列とそれによりIFN−α4bに対して
コードされるアミノ酸配列およびそのシグナル配列を示
す図である。

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも１種の薬学的に有効量のα−型
    インターフェロンと、薬学的に許容し得る担体とから成
    る、ヒトウィルス感染の処置またはヒト癌もしくは腫瘍
    の処置に用いる薬学的組成物であって、前記組成物は、
    前記α−型インターフェロンが組換えDNA分子によって
    形質転換された微生物を培養して抗ウィルス活性を有す
    るポリペプチドを回収することより成る方法によって生
    産されることを特徴とし、前記組換えDNA分子は、 （ａ） 塩基配列： を有するDNA、 （ｂ） 塩基配列： を有するDNA、 （ｃ） 塩基配列： を有するDNA、 （ｄ） 塩基配列： を有するDNA、 （ｅ） 塩基配列： を有するDNA、 （ｆ） 塩基配列： を有するDNA、 （ｇ） 前記（ａ）〜（ｆ）のDNAのいずれかに、次の
    条件： ４×SET、0.1％（W/V）フィコール、0.1％ポリビニルピ
    ロリドン、0.1％（W/V）BSA、0.5％SDS中にて200μg/ml
    の変性断片化サケ精子DNAを用いて68℃で７時間DNAを担
    持するニトロセルロースフィルタを予備ヒブリド化し、
    ４×SET、0.02％（W/V）フィコール、0.02％ポリビニル
    ピロリドン、0.02％（W/V）BSA、0.5％SDS中並びに200
    μg/mlの変性断片化サケ精子DNAを用いて68℃で16時間
    標識DNAを用いてヒブリド化し、SET−0.5％SDSを用いて
    室温で前記フィルタをリンスし、２×SET−0.5％SDSを
    用いて68℃で５時間これを洗浄し、溶液を１回交換し、
    室温で４時間3mMのトリズマベースで洗浄し、溶液を１
    回交換する、 の下でヒブリド化し、かつ抗ウィルス活性を有するポリ
    ペプチドをコードするDNA、および （ｈ） １つ以上のコドンを縮重コドンで置換すること
    により前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかと縮重関係にある
    DNA よりなる群から選択されるDNAから成ることを特徴とす
    る、薬学的組成物。
  2. 【請求項２】少なくとも１種の薬学的に有効量のα−型
    インターフェロンと、薬学的に許容し得る担体とから成
    る、ヒトウィルス感染の処置またはヒト癌もしくは腫瘍
    の処置に用いる薬学的組成物であって、前記α−型イン
    ターフェロンが組換えDNA技術によって生産され、かつ
    式： （ａ） （ｂ） および、 （ｃ） のポリペプチドから選択されることを特徴とする、薬学
    的組成物。
  3. 【請求項３】少なくとも１種の薬学的に有効量のα−型
    インターフェロンと、薬学的に許容し得る担体とから成
    る、ウシウィルス感染の処置に用いる薬学的組成物であ
    って、前記組成物は、前記α−型インターフェロンが組
    換えDNA分子によって形質転換された微生物を培養して
    抗ウィルス活性を有するポリペプチドを回収することよ
    り成る方法によって生産されることを特徴とし、前記組
    換えDNA分子は、 （ａ） 塩基配列： を有するDNA、 （ｂ） 塩基配列： を有するDNA、 （ｃ） 塩基配列： を有するDNA、 （ｄ） 塩基配列： を有するDNA、 （ｅ） 塩基配列： を有するDNA、 （ｆ） 塩基配列： を有するDNA、 （ｇ） 前記（ａ）〜（ｆ）のDNAのいずれかに、次の
    条件： ４×SET、0.1％（W/V）フィコール、0.1％ポリビニルピ
    ロリドン、0.1％（W/V）BSA、0.5％SDS中にて200μg/ml
    の変性断片化サケ精子DNAを用いて68℃で７時間DNAを担
    持するニトロセルロースフィルタを予備ヒブリド化し、
    ４×SET、0.02％（W/V）フィコール、0.02％ポリビニル
    ピロリドン、0.02％（W/V）BSA、0.5％SDS中並びに200
    μg/mlの変性断片化サケ精子DNAを用いて68℃で16時間
    標識DNAを用いてヒブリド化し、SET−0.5％SDSを用いて
    室温で前記フィルタをリンスし、２×SET−0.5％SDSを
    用いて68℃で５時間これを洗浄し、溶液を１回交換し、
    室温で４時間3mMのトリズマベースで洗浄し、溶液を１
    回交換する、 の下でヒブリド化し、かつ抗ウィルス活性を有するポリ
    ペプチドをコードするDNA、および （ｈ） １つ以上のコドンを縮重コドンで置換すること
    により前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかと縮重関係にある
    DNA よりなる群から選択されるDNAから成ることを特徴とす
    る、薬学的組成物。
  4. 【請求項４】少なくとも１種の薬学的に有効量のα−型
    インターフェロンと、薬学的に許容し得る担体とから成
    る、ウシウィルス感染の処置に用いる薬学的組成物であ
    って、前記α−型インターフェロンが組換えDNA技術に
    よって生産され、かつ式： （ａ） （ｂ） および、 （ｃ） のポリペプチドから選択されることを特徴とする、薬学
    的組成物。
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