NO164037B - Fremgangsm te ved fremstilling av et polypeptid av ron alfa (ifnalfa)-type. - Google Patents

Abstract

DNA-sekvenser, rekombinante DNA-molekyler og verter transformert med disse som produserer polypeptider som utviser en biologisk eller immunologisk aktivitet tilsvarende den for humaninterferon. Det beskrives gener som koder for disse polypeptider og fremgangsmåter ved fremstilling og utnyttelse av disse DNA-molekyler, verter og polypeptider. DNA-sekvensene er særpreget ved at de koder for et polypeptid som utviser en biologisk eller immunologisk aktivitet som tilsvarer den for humaninterferon. I passende verter vil disse DNA-sekvenser og rekombinante DNA-molekyler tillate fremstilling og identifisering av gener og polypeptider som utviser den ovenfor nevnte aktivitet, og som kan utnyttes som midler med antiviral-, antitumor- og anti-kanseraktivitet.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider av a-interferon-type. Mere spesielt vedrører oppfinnnelsen dyrking.av vertsorganismer inneholdende rekombinante DNA-molekyler som koder for polypeptider av interferon-cx-(IFNcx) -type. Som det vil fremgå av det etterfølgende, kan de rekombinante DNA-molekyler anvendes ved fremstillg av IFN-a polypeptider som er nyttige som antivirale og antitumor- eller antikreftmidler.

I den etterfølgende beskrivelse vil den interferonnomenklatur som er publisert i Nature, 286, side 2421 (10. juli 1980) bli anvendt. Denne nomenklatur erstatter den som er anvendt i den prioritetsbegrunnende søknad, eksempelvis er IF nå betegnet IFN og lekocyttinterferon er nå betegnet IFN-a.

Det er kjent at det eksisterer to klasser av interferoner ("IFN"). Interferoner i klasse I er små, syrestabile (glyko)-proteiner som gjør celler motstandsdyktige mot viral infeksjon (A. Isaacs og J. Lindenmann, "Virus Interference I. The Interferon", Proe. Royal Soc. Ser. B., 147, sidene 258-67

(1957) og W. E. Stewart, II, The Interferon System, Springer Verlag (1979) (i det etterfølgende betegnet som "The Interferon System")). Selv om cellespesifikke (The Interferon System) IFNer i en viss grad ikke er virusspesifikke, vil IFNer likevel beskytte cellene mot et bredt spektrum av vira.

Human interferonner ("HuIFN") er klassifisert i tre grupper, nemlig a, p og t. HuIFN-oc, eller leukocyttinterferon, produseres i menneskeleukocyttceller og sammen med mindre mengder HuIFN-P (fibroblast interferon) i lymfoblastoidcel-lene. HuIFN-a er renset til homogenitet og karakterisert (eks. M. Rubenstein et al., "Human Leukocyte Interferon: Production, Purification To Homogeneity And Initial Characterization". Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, sidene 640-644

(1979). Det er heterogent med hensyn til størrelse, antagelig på grunn av dets karbohydratkjerne. To komponenter er beskrevet, en ired molekylvekt i området 21000-22000 og den andre i området 15000-18000. Komponenten med lavere molekylvekt er rapportert å representere en ikke-glykosylert form. Den mindre form av HuIFN-a er også rapportert å bibeholde alt eller mesteparten av dets HuIFN-cx aktivitet (W.E. Stewart, II et al., "Effeet Of Glycosylation Inhibitors On The Production And Properties Of Human Leukocyte Interferon", Virology, 97, sidene 473-476 (1979). En del av aminosyrefrekvensen for HuIFN-oc fra lymfoblastceller og deres aminosyresammensetning er rapportert (K. C. Zoon et al., "Amino Terminal Sequence Of The Major Component Of Human Lymphoblastoid Interferon", Science, 207, sidene 527-528 (1989) og M. Hunkapiller og L. Hood, personlig kommunikasjon (1980)).

HuIFN-cx er også rapportert å eksistere i flere forskjellige former, se eksempelvis britisk patentsøknad nr.

2.037.296A. Disse former synes å adskille seg fra hverandre både strukturelt og fysiologisk. Ingen akseptert nomenklatur er godkjent for disse former av HuIFN-cx. I den etterføl-gende beskrivelse vil derfor hver form bli betegnet med et tall etter den generelle HuIFN-cx-betegnelse, eksempelvis HuIFN-cxl eller HuIFN-a3.

HuIFN-cx kan, som mange andre humanproteiner, også være poly-morft. Derfor kan spesielle individuelle celler damne HuIFN-cx typer innen den mere generelle HuIFN-cx gruppe eller former innen denne gruppe som er fysiologisk tilsvarene, men strukturelt noe forskjellig fra gruppen eller formen hvorav den er en del. Selv om proteinstrukturen av HuIFN-cx generelt er veldefinert, kan derfor spesielle individer produsere en HuIFN-cx som er en ubetydelig variant av denne, idet denne arvelige variasjon trolig er mindre alvorlig enn forskjellen mellom de forskjellige former av HuIFN-cx.

HuIFN er vanligvis ikke påvisbar i normale eller sunne celler (The Interferon System, sidene 55-57). I stedet vil proteinet fremstilles som følge av at cellen utsettes for et IFN-induk-sjonsmiddel. IFN-induksjonsmidler er vanligvis vira, men kan også være av ikke-viral karakter, såsom naturlig eller syntetisk dobbeltkjedet RNA, intracellulære mikrober, mikro-bielle produkter og forskjellige kjemiske midler. Mange forsøk er utført for å utnytte disse ikke-virale induksjonsmidler for å gjøre menneskeceller resistende mot oral infeksjon (S. Baron og F. Dianzani (eds.), Texas Reports On Biology And Medicine, 35 ("Texas Reports"), sidene 528-540

(1977)). Disse forsøk har ikke vært særlig vellykkede. I stedet foretrekker man nå anvendelse av eksogent HuIFN som sådant.

Interferonterapi mot vira og tumorer eller kreft er utført i forskjellige doseområder med forskjellige administrasjonsmåter (The Interferon System, sidene 305-321). Eksempelvis har interferoin blitt administrert effektivt oralt eller ved inokulering, såsom intravenøs, intramuskulær, intranasal, indradermal og subkutan inokulering, og i form av øyendråper, salver og dusjer. Det administreres én til tre ganger daglig i doser på 10<4->1+<7> enheter. Dem terapeutiske behandling kan være avhengig av pasienten og den tilstand som behandles. For eksempel blir virusinfeksjoner vanligvis behandlet med doser en til to ganger daglig over flere dager til flere uker og tumorer og kreft blir vanligvis behandlet med daglige eller flere daglige doser over flere måneder eller år. Den mest effektive terapi for en spesiell pasient må naturligvis bestemmes av den behandlende lege, som vil ta i betraktning velkjente faktorer med hensyn til sykdommens utvikling, tidligere terapi og pasientensrespons til inteferon ved valg av administrasjonsmåte og dosemengde.

Som antiviralt middel er HuINF anvendt for behandling av luftveisinfeksjoner (Texas Reports, siden 486-496), herpes simplex keratitis (Texas Reports, sidene 497-500), akutt hemorrhagia conjunctivitis (Texas Reports, sidene 501-510) , varicella zoster (Texas Reports, sidede 511-515) cyto-megalovirus-infeksjon (Texas Reports, sidene 523.527), og hepatitis B (Texas Reports, sidene 516-522). Se også The Interferion System, sidene 307-319. Imidlertid vil anvendelse i stor skal av IFN som antiviralt middel kreve større mengder IFN enn det som til nå har vært tilgjengelig.

HuIFN har også andre effekter i tillegg til den antivirale virkning. For eksempel antagoniserer den effekten av koloni-st imulerende faktor, inhiberer vekst av hemopoetisk kolonidan-nende celler og virker inn på den normale differensiering av granulocytter og makrofag-forløpere (Texas Reports, sidene 343-349). Den inhiberer også erytroid diferensiering i DMSO-behandlede Friend leukémiceller (Texas Reports, sidene 320-28) HuIFN kan også spille en stor rolle ved regulering av immunresponsen. Avhengig av dosen og anvendelsestidspunktet i forhold til et antigen kan HuIFN-oc både være iiranunopoten-sierende og immunohemmende in vivo og in vitro (Texas Reports, sidene 357-369). I tillegg er det observert at spesielt sensitiviserte lymfocytter vil danne HuINF-cx etter kontakt med et antigen. Slik atigenindusert HuIFN-cx kan derfor være en regulator for immunresponsen og påvirke både de sirku-lerende antigennivåer og uttrykket for cellulær immunitet (Texas Reports, sidene 370-374). HuIFN er også kjent for å forsterke aktiviteten av drepende lymfocytter og antistoffav-hengig cellebetinget cytotoksisitet (R. R. Herberman et al., "Augumentation By Interferon Of Human Natural And Antibody Depentent Cell-Mediated Cytotoxicity", "Killing Comes

Nat rally", Nature, 278, sidene 119-120 (1979). Texas Reports, sidene 375-380). Begge disse typer er sannsynligvis involvert ved immunologisk angrep på tumorceller.

I tillegg til anvendelse som human antiviralt middel, utviser HuIFN derfor potensiell anvendelse ved antitumor- og anti-kreftterapi (The Interferon System, sidene 319-321). Det er nå kjent at IFNer påvirker veksten av mange klasser av tumorer i mange dyr. (The Interferon System, sidene 292-304). Lik mamge andre antitumormidler synes de meste effektive når de anvendes mot små tumorer. Antitumoreffektene for animalsk IFN er avhengig av dosen og tidspunktet, men er påvist ved konsentrasjoner under toksiske nivåer. Følgelig er mange forsøk og kliniske prøver blitt og blir utført for å klarlegge antitumor- og antikreftegenskapene for.IFNer. Disse innbefatter behandling av mange ondartede sykdommer såsom østrosar-coma, akutt myeloid leukemi, multippel myeloma og Hodgkin's sykdom (Texas Reports, sidene 429-235). I tillegg er HuIFN nylig rapportert å bebirke lokal tumorhemming når det inj iseres i subkutane tumormoduler i melanoma- og bryst- carcinoma-bærende pasienter (T. Nemoto et al., "Human Interferons And Interalesional Therapy Of Melanoma And Brest Carcinoma", Amer. Assoc. For Cancer Research, Abs. nr. 994, s. 246

(1979)). Selv om resultatene av disse kliniske forsøk er oppmuntrende, har antitumor og antikreft-anvendelse av IFN blitt alvorlig hemmet på grunn av mangel av en tilstrekkelig tilførsel av renset IFN. Idag fremstilles HuIFN-cx enten ved vekst av menneskeceller i vevkultur eller fra humanleukocytter eller oppsamlet fra blodgivere. Det er rapportert 2,6 x IO<9 >IU rå HuIFN-cx erholdt fra 800 1 kultiverte Namalvaceller (P. J. Bridgen et al., supra). I meget store blodsentra, eksempelvis det finske Røde Korssenter i Helsingfors er den årlige produksjonskapasitet ca 10<11> IU rå HuIFN-cx. Da dosen typisk er 3 x IO<6> IU pr. pasient pr. dag, er disse kilder ikke tilstrekkelige til å tilveiebringe de nødvendige kommer-sielle mengder av HuIFN-cx. Derfor er fremstilling av HuIFN-cx ved hjelp av andre fremgangsmåter ønskelig. Som følge av at den spesielle aktivitet av IFN-cx er meget høy, av størrel-sesorden 4 x IO<8> til IO<9> IU/mg, er mengden av HuINF-cx for kommersiell anvendelse liten. For eksempel vil 100 g ren HuIFN-cx og 3-30 millioner doser.

Nylige fremskritt innen molekylærbiologien har gjort det mulig å introdusere DNA-koding for spesifikke ikke-bakterielle eukaryotiske proteiner i bakterieceller. Generelt for DNA andre enn de fremstilt via kjemisk syntese, vil konstruksjon av slike rekombinante DNA-molekyler omfatte trinnene å fremstille en enkeltkjedet DNA-kopi (cDNA) av et renset budbringer RNA (mRNA) templat for det ønskede protein, omdanne cDNA til den dobbeltkjedede DNA, sammenføye den erholdte DNA på et passende sted i en passende kloningsvektor til å gi et DNA-molekyl og transformere en passende vert med det reko™-binante DNA-molekyl. En slik transformering kan muliggjøre at verten produserer det ønskede protein.

Flere ikke-bakterielle proteiner og gener er erholdt i E. coli ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi. Disse innbefatter et protein som utviser rotte proinsulin antigendeterminanter (L. Villa-Komaroff et al., "A Bacterial Clone Synthetizing Proinsulin", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75, sidene 3727-3731 (1978)), rotteveksthormon (P.H. Seeburg et al., "Synthesis Of Growth Hormone By Bacteria", Nature, 276, sidene 795-98 (1978)), mus dihydrofolatreduktase (A.C.Y. Chang et al., "Phenotypic Expression In E. coli Of A DNA Sequence Coding For Mouse Dihydrofolate Reductase", Nature, 275, sidene 617-62:4 (1978)), human somatostatin (K. Itakura et al., "Expression In Escherichia coli Of A Chemically Synthesized Gene For The Hormone Somatostatin", Science, 198, sidene 1056-1063 (1977), europeiske patentsøknader nr. 0.001.929, 0.001.9*30 og 0.001.931, samt beslektede søknader i andre land), A og B polypeptidkjeder i humaninsulin (D.V. Goeddel et al., "Expression In Escherichia coli Of Chemically Synthesized Genes For Human Insulin", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, sidene 106-110 (1979), samt de europeiske og beslektede patentsøknader som ovenfor nevnt), antigener for human hepatitt B virus (C. J. Burrell et al., "Expression In Escherichia coli; Of Hepatitis B Virus DNA Sequences Cloned In Plasmid pBR322", Nature, 279, sidene 43-47 (1979) og M. Pasek et al., "Hepatitis B Virus Genes And Their Expression In E. coli", Nature, 282, sidene 575-579 (1979)), human veksthormon (D. V. Goeddel et al. "Direct Expression In Escherichia coli Of A DNA Sequence Coding For Human Growth Hormone", Nature, 281, sidene 544-551 (1979) , SV40 t Antigen (T. M. Roberts et al., "Synthesis Of Simian Virus 40 t Antigen In Escherichia coli", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, sidene 5596-5600

(1979)), og human fibroblast interferon (HuIFN-P) (T. Tani-guchi et al., "Construction And Identification Of A Bacterial Plasmid Containing The Human Fibroblast Interferon Gene Sequence", Proe. Japan Acad., 55, Ser. B, sidene 464-469

(1979), samt personlig kommunikasjon (1980).

Ingen av disse rekombinante DNA fremgangsmåter er imidlertid, slik som foreliggende oppfinnelse, rettet mot fremstil-

ling av HuIFN-cx. Dette er det problem som foreliggende oppfinnelse vedrører. Dets løsning er ikke funnet, slik som for de ovenfor beskrevne rekombinante DNA-systemer, ved tilgjengelighet av sekvensinformasjon som er nødvendig for å fremstille et syntetisk gen, (såsom somatostatin) eller av en celletype eller virus som er rik på en spesiell DNA-sekvens (eksempelvis hepatitt viral antigen) eller mRNA typer (eksempelvis rotteinsulin) som muliggjør valg av E.coli verter som uttrykker det ønskede protein (eksempelvis musedi-hydrofolat-reduktase). Heller ikke lettes problemet ved rapportering av et plasmid som er sagt å inneholde en DNA-sekvens som hybridiserer til en mRNA fra poly(A) RNA, hvilket mRNA fremkommer HuIFN-e aktivitet i oocytter (eksempelvis fibroblast-interferon). Heller ikke er løsningen ifølge oppfinnelsen rettet mot det tilsynelatende forslag i Research Disclosure No. 18309, sidene 361-362 (1979) for fremstilling av rent eller i det vesentlige rent HuIFN-cxmRNA før kloning av HuIFN-cx genet.

Endelig bør det forstås at valg av en DNA-sekvens eller konstruksjon av et rekombinant DNA-molekyl som hybridiserer til mRNA fra polyA RNA, hvilket mRNA danner HuIFN aktivitet i oocytter, ikke er tilstrekkelig for å demonstrere at DNA-sekvensen eller hybridinnskuddet i det rekombinante DNA-molekyl korresponderer til HuIFN. I stedet kan kun fremstilling av et polypeptid som utviser en immunologisk og biologisk aktivitet for HuIFN virkelig demonstrere at den valgte DNA-sekvens eller det konstruerte rekombinante DNA-molekyl korresponderer til HuIFN. Viktig er det ytterligere at kun etter at HuIFN aktivitet er vist kodet fra DNA-sekvensen, kan det rekombinante DNA-molekyl eller tilhørende sekvens anvendes for å velge andre sekvenser tilsvarende HuIFN.

Det vil derfor forstås av det foregående at problemer vedrø-rende fremstilling av HuIFN-cx ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi adskiller seg vesentlig fra de ovenfor beskrevne prosesser. I foreliggende tlfelle må det finnes en spesiell DNA-sekvens med ukjent struktur, dvs. som koder for HuIFN-cx i en passende vert, og denne må separeres fra en meget kompleks blanding av DNA-sekvenser for at den kan anvendes ved fremstilling av HuIFN-cx. Ytterligere blir dette lokaliserings- og separasjonsproblem vanskeliggjort ved den forutsigbare og uhyre lave konsentrasjon av den ønskede DNA-sekvens i den 3complekse blanding og mangel på effektive midler for raskt å analysere de mange DNA-sekvenser i blandingen for å velge og separere den ønskede sekvens.

Løsning av problemene vedrørende lokalisering og separering av DNA-sekvenser som koder for uttrykket HuIFN-cx i en passende vert og derved tilveiebringer DNA-sekvenser, rekombinante DNA-molekyler og fremgangsmåter og midler ved hjelp av hvilke en vert transformeres til å produsere et polypeptid som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet tilsvarende den for human leukocyttinterferon, beskrives nedenfor.

Som følge av foreliggende oppfinnelse er det mulig å fremstille et polypeptid som utviser en HuIFN-cx immunologisk eller biologisk aktivitet for anvendelse som antivirale, antitumor-eller antikreftmidler.■ Oppfinnelsen tillater også fremstilling av disse polypeptider i mengder og ved hjelp av metoder som hittil ikke har vært tilgjengelige.

Som det vil forsås av den etterfølgende beskrivelse, vil DNA-sekvensene og de rekombinante DNA-molekyler være istand til å rette produksjonen, i en passende vert, mot fremstilling av et polypeptid som utviser en HuIFN-cx immunologisk eller biologisk aktivitet. Replikering av disse DNA-sekvenser og rekombinante DNA-molekyler i en passende vert muliggjør også fremstilling av store mengder gener som koder for disse polypeptider. Molekylærstrukturen og egenskapene for disse polypeptider og gener kan lett bestemmes. Polypeptidene og genene er nyttige, enten slik de er produsert i en vert eller etter passende derivatomdannelse eller modifisering, i blandinger og til anvendelse i metoder for å påvise og forbedre produksjonen av disse produktene i seg selv og for anvendelse som antivirale og antitumor- eller antikreftmidler og fremgangsmåter hvori slike midler anvendes.

Foreliggende fremgangsmåte adskiller seg som tidligere nevnt fra de kjente fremgangsmåter, ved at i henhold til foreliggende fremgangsmåte, og i motsetnng til de ovenfor omtalte fremgangsmåter, innbefattes fremstilling og valg av en DNA-sekvens og rekombinante DNA-molekyler som inneholder passende DNA-sekvenser som koder for i det minste ett polypeptid som utviser en HuIFN-cx immunologisk eller biologisk aktivitet.

Det vil forstås av det foregående at de grunnleggende trekk ved foreliggende oppfinnelse er dyrking av en vertsorganisme transformert med en DNA-sekvens som er særpreget ved at den koder for et polypeptid som utviser en HuIFN-cx immunologisk eller biologisk aktivitet, og er valgt fra en gruppe omfattende DNA-innskuddene Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h, Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35, Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN42, Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6, hvor DNA-sekvensene til de rekombinante DNA-molekyler i vertsorganismen er identifisert ved hhv. reg. nr. DSM 1700-1703, DNA-sekvenser som hybridiserer med hvike som helst av de foregående DNA-innskudd, og som koder for et polypeptid av IFN-cx- type, eller DNA-sekvenser som er degenerterte som et resultat av den genetiske kode i forhold til ovennevnte DNA-sekvenser og -innskudd og som koder for et polypeptid av IFN-cx-type. Fig. 1 viser skjematisk en utførelsesform av foreliggende fremgangsmåte ved fremstilling av en blanding av rekombinante-DNA-molekyler, hvorav noen er særpreget ved innskutte DNA-sekvenser som koder for polypetidene fremstilt ifølge oppfinnelsen. Fig. 2 viser skjemstisk den initiale kloneutsiktningsprosess. Fig. 3 viser skjematisk en utførelsesform av kloneutsiktnings-prosessen under anvendelse av DNA-sekvenser som koder for

polypeptider fremstilt i henhold til oppfinnelsen.

Fig. 4 viser et restriksjonskart for en av klonene ifølge oppfinnelsen, den absolutte posisjon for hvert av restrik-sjonsstedene for dette klon er ikke vist. Figurene 8-10 viser mere absolutte posisjoner for disse restriksjonsposisjoner. Fig. 5 viser skjematisk fremgangsmåten for å bestemme orienteringen for et DNA-innskudd i et rekombinant DNA-molekyl. Fig. 6 viser den partielle nukleotidsekvens for visse kloningsvektorer som er nyttige for fremstilling av IFN-oc-type polypeptider ifølge oppfinnelsen. Fig. 7 viser resultater for en "Sephadex G-100" fraksjonering av en supernatant fremstilt fra en bakteriekultur. Figurene 8-10 viser nukleotidsekvenser cxl for et DNA-innskudd i et rekombinant molekyl. Sekvensen er nummerert fra nukleotidet etter polyG 5<1> hale til nukleotidet før polyA restene og polyC halene. Nukleotidene 57-125 representerer en signalsekvens og nukleotidene 125-626 representerer det "modne" interferon og stoppkodonet.

Aminosyresekvensen for signalsekvensen er vist ovenfor dets nukleotidsekvens og aminosyresekvensen for det "modne" interferon er vist over dets nukleotidsekvens. Forskjellige restriksjonsendonuklease-gjenkjenningsposisjoner i dette gen er også angitt i figurene 8-10. Disse posisjoner er mere absolutt lokalisert enn de som er vist i figur 4. Fig. 11 er en skjematisk sammenligning av restriksjonsmåtene for de to DNA-innskudd av rekombinante DNA-molekyler. Fig. 12-16 viser nukleotidsekvenser for to DNA-innskudd for a2 rekombinante DNA-molekyler. Sekvensene er nummerert fra nukleotidet etterfølgende polyG 5' hale og til nukleotidet før polyA restene og polyC 3' haler. Aminosyresekvensene for signalsekvensen i hvert av disse inskudd er vist over deres respektive nukleotidsekvenser og aminosyresekvensen for det "modne" i interferon er angitt over dets nukleinsekvens. Fig. 17 viser et delrestriksjonskart av Z-pBR322(Pst)/HcIF-11- 206 og rekkefølgestrategien som anvendes for å bestemme nukleotidsekvensen av Hif-II-206 fragmentet vist i figurene 12- 16. Fig. 18 viser delvis restriksjonskart av en serie hybridfager som hybridiserer til Hif-2h fragmentet. Fig. 19 viser et delrestriksjonskart av et hybridinnskudd i Z-pBR322(Pst)/HchrIF-3 5HBoc og rekkefølgestrategien som anvendes for å bestemme dets nukleotidsekvens. Fig. 20-2 3 viser nukleotidsekvensen for HchrIF-35HBcx fragmentet og aminosyresekvensen avledet derav. Fig. 2 4 viser deltilknytningskart for HuIFN-cx beslektede gener. Pilene viser områder som danner R-løkker som induserer leukocytt poly(A) RNA. Den stiplede boks (chr-16) indikerer at denne sekvens var dedusert fra "blotting" eksperimenter, men ikke var åpenbart ved R-løkkekartlegging. Fig. 25 er et skjematisk riss av konstruksjonen av plasmid C8-IFN-cxl. Fig. 2 6 er et skjematisk riss av konstruksjonen av plasmidet LAC-AUG(cx2) . Fig. 27 viser konstruksjonen av det AUG initierende kodon og CYS initialkodonet i konstruksjonen av LAC-AUG(cx2) . Fig. 28 er et skjematisk riss av konstruksjonen av plasmidet C8-IFN-cx2 og hybridmolekylene I, II, III og IV. Fig. 29-32 viser nukleotidsekvensen og aminosyresekvensen kodet derav for IFN-cx4b ug dets signalsekvens.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere i det etterfølgende og i denne beskrivelse anvendes de følgende betegnelser: Nukleotid. en monomerenhet av DNA eller RNA bestående av en sukkerrest (pentose), et fosfat og en nitrogenholdig hetero-cyklisk base. Basen er forbundet til sukkerresten via glykosidkarbonet (l<1> karbonet i pentosen) og kombinasjonen av basen og sukkeret er et nukleotid. Basen karakteriserer nukleotidet. De fire DNA-baser er adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C") og tymin ("T"). De fire RNA-baser er A, G, C og uracil ("U").

DNA- sekvens. en lineær serie av nukleotider forbundet til hverandre via fosfodiesterbindinger mellom 3'- og 5'-karbonatomene i tilstøtende pentoser.

Kodon. en DNA-sekvens av tre nukleotider (en triplett) som via mRNA koder for en aminosyre, et translasjonsstartsignal eller et translasjonsstoppsignal. For eksempel koder nukleotidtriplettene TTA, TTG, CTT, CTC, CTA og CTG for aminosyren leucin ("Leu"), TAG, TAA og TGA er translasjons-stoppsignaler og ATG er et translasjonsstartsignal.

Leseramme. grupperingen av kodoner under translasjonen av mRNA til aminosyresekvenser. Under translasjon må den riktige leseramme bibeholdes. For eksempel kan sekvensen GCTGGTTGTAAG translateres til tre leserammer eller faser, som hver gir en forskjellig aminosyresekvens:

GCT GGT TGT AAG—Ala-Gly-Cys-Lys

G CTG GTT GTA AG—Leu-Val-Val

GC TGG TTG TAA A—Trp-Leu-(STOP)

Polypeptid. en lineær serie av aminosyrer forbundet med hverandre ved peptidbindinger ,mellom cx-amino- og karboksy-gruppene av tilstøtende aminosyrer.

Genom. alt DNA i en celle eller virus. Det innbefatter

bl.a. strukturelle gener som koder for polypeptidene i

stoffet, såvel som operator, promoter og samspillsekvenser innbefattende sekvenser som "Shine-Dalgarno"-sekvenser.

Strukturelt aen, en DNA-sekvens som via dets "budbringer"-RNA ("mRNA") koder for en sekvens av aminosyrer som er karakteristiske for et spesifikt polypeptid.

Transkripsi on. prosessen for dannelse av mRNA fra et strukturelt gen.

Translasjon, prosessen ved fremstilling av et polypeptid fra mRNA. Ekspresi on. prosessen som et strukturelt gen undergår for

å danne et polypeptid. Dette er en kombinasjon av transkripsjon og translasjon.

Plasmid. en ikke-kromosomal dobbeltkjedet DNA-sekvens omfattende en intakt "replicon" slik at plasmidet dupliseres i vertscellen. Når plasmidet plasseres inne i en encelleor-ganisme, vil organismens egenskaper forandres eller omdannes som følge av plasmidets DNA. For eksempel et plasmid som bærer et gen for tetracyklinresistens (Tet<R>), omdanner en celle som tidligere var følsom for tetracyklin til en som er resistent mot tetracyklin. En celle omdannet av et plasmid kalles en "transformant".

Fag eller bakteriofag. bakteriell virus hvorav mange innbefatter DNA-sekvenser innkapslet i en proteinkappe eller et proteinbelegg ("capsid").

Vektor, et plasmid, fag DNA eller andre DNA-sekvenser som er i stand til å duplisere seg i en vertscelle og er særpreget ved et eller et lite antall endonukleasegjenkjennende posisjoner,

i hvilke slike DNA-sekvenser kan føres inn på en bestemt måte uten at det oppstår tap av DNA<1>s nødvendige biologiske funksjon, dvs. duplisering, produksjon av dekkende proteiner eller tap av promoter eller bindingsposisjoner, og som inneholder en markør som er egnet for anvendelse ved identifikasjon av omdannede celler, eksempelvis tetracyklinresis-

tens eller ampicillinresistens.

Kloning, prosessen for å erholde en populasjon av organismer eller DNA-sekvenser avledet fra en slik organisme eller sekvens ved aseksuell reproduksjon.

Rekombinant DNA- molekyl eller hybrid DNA, et molekyl som består av segmenter av DNA fra forskjellige genomer som er forenet ende-til~ende utenfor levende celler og som har evnen til å infisere visse vertsceller og opprettholdes deri.

Ekspresions- kontrollsekvens, en nukleotidsekvens som kontrollerer og regulerer ekspresjon av strukturelle gener når den er operativt forbundet med disse gener, De innbefatter lac-systemet, tr<p->systemet, hovedoperator- og promoterområdene for fag A, kontrollområdet for fd kappeproteinet og andre sekvenser som er kjent for å kontrollere ekspresjonen av gener av prokaryote eller eukariote celler og deres vev.

Under henvisning til fig. 1 er det vist skjematisk en ut-førelsesform av fremgangsmåten ved fremstiling av en blanding av rekombinante DNA-molekyler hvorav visse er særpreget ved innskutte DNA-sekvenser som koder for polypeptider som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet tilsvarende den for human leukocyttinterferon.

FREMSTILLING AV POLYfA) RNA- INNEHOLDENDE HUMAN INTERFERON

mRNA ( IFN- ocmRNA)

Human leukocytter ble indusert i 5 t ved 37°C med Sendai virus og ekstrahert til å gi en poly(A) RNA-blanding inneholdende human leukocyttinterferon mRNA ("HuIFN-cxmRNA") . Induk-sjonen ble utført ved hjelp av Cantell-prosedyren (The Interferon System, sidene 130-131 og i henhold til de deri angitte referanser). Poly(A) RNA-blandingen er vist i fig. 1 uten hensyntagen til dens aktuelle proposjoner. Induserte leukocytter ble oppsamlet og 10<11> celler ble resuspendert i 1 1 av en oppløsning inneholdende 8 g NaCl, 0,2 g KC1, 1,15 g Na2HP042H20 og 2,0 g KH2P04 oppløst ill vann ("PBS") og tilsatt langsomt under kraftig omrøring til 17 1 20 mM Tris-HC1 (pH 7,5), 1 mM EDTA ("TE buffer"), 2% natriumdodecyl-sulfat ("SDS") i 50 1 skilletrakt. "Self-digested" Pronase ble tilsatt til 200 pg/ml og oppløsningen omrørt ilt ved romtemperatur. IO6 tellinger/min ("cpm") av <125>I-globin mRNA ble tilsatt som markør for gjenvinning av poly(A) RNA og for å kontrollere mRNA-nedbrytningen under de etterfølgende trinn.

2M Tris-HCl (pH 9) i en mengde tilsvarende 1/2 0 av det totale volum ble tilsatt og blandingen ekstrahert under kraftig omrø-ring med 15 1 omdestillert fenol ved 10 min. 3 1 kloroform ble tilsatt og blandingen omrørt i 5 min. Etter henstand i 30 min for faseseparasjon ble den vandige fase gjenvunnet og igjen ekstrahert med fenol og kloroform. Den resulterende vandige fase på i alt 19,1 1 ble kombinert med 60 g SDS. Nukleinsyrer ble presipitert fra den vandige fase med 1/10 vol 3N natriumacetat (pH 5,5) og 2 vol etanol.

Etter lagring over natten ved -20°C ble det fibrøse nuklein-syrepresipitat fjernet ved filtrering gjennom en plasttesil. Dette materialet ble deretter omrørt med 200 ml TNE (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM EDTA) inneholdende 0,5% SDS. Dette ble til slutt oppløst ved tilsetning av ytterliere 350 ml av denne oppløsning. Det ikke-fibrøse presipitat ble oppsamlet ved sentrifugering ill "Sorvall" flasker i en "Sorvall RC-3" sentrifuge i 15 min ved 50000 omdr/min og gjenoppløst i 3 50 ml TNE inneholdende 0,5% SDS. De to TNE-oppløsinger ble kombinert, ekstrahert 3 ganger med 1 vol fenol, 3 ganger med 1/2 vol eter og 3 ganger med 1 vol eter. RNA-gjenvinningen fra den vandige fase utgjorde totalt 775 mg, bestemt ved adsorpsjon ved 260 nm.

Isolering av poly(A) RNA-blandingen ble oppnådd ved gjentatte satsvise adsorpsjoner til oligo(dT) cellulose ("type 7"), 2,7 g oligo(dT) cellulose ble tilsatt til 500 ml, dvs. ca. halvparten av den ovenfor beskrevne RNA-inneholdende oppløs-ning. Etter omrøring ilt ved romtemperatur for å tilveiebringe adsorpsjon av poly(A) RNA til oligo(dT) cellulosen, hvoretter cellulosen og blandingen av mRNAer bundet til denne ble oppsamlet ved sentrifugering og vasket en gang med 50 ml TNE og en gang til med 15 ml TNE. Den bundne poly(A) RNA ble deretter eluert med fem på hverandre følgende vaskinger med 2 ml H20. Utbyttet var 860 pg poly(A) RNA bestemt ved dets optiske densitet (Fremstilling A). Den supernatante RNA-oppløsning fra den første adsorpsjon ble underkastet to ytterligere adsorpsjonscykler på samme måte som beskrevet ovenfor. Den andre og den tredje adsorpsjon ga henholdsvis 600 pg og 170 pg RNA, som ble kombinert (Fremstilling B).

RNA ble analysert med hensyn til Hu I FN - ocmRN A ved injeksjon i Xenopus laevis oocytter (The Interferon Systemm, sidene 93-95): RNA ble oppløst i 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 88 mM

NaCl ("TNK buffer") til å gi en konsentrasjon på ca. 1 mg/ml. 50 ni av denne oppløsning ble injisert i hver av 50 oocytter. Oocyttene ble inkubert over natten ved romtemperatur i et "Barth" medium ftGurdon, J. Embryol. and Exper. Morph., 20, sidene 401-414 (1968) og Barth, J. Embryol. and Exper. Morph., 7, sidene 210-222 (1959)). De inkuberte oocytter ble deretter renset og homogenisert med en Pasteur pipette i et 1,5 ml Eppendorf-sentrifugerør i 0,5 ml 52 mM Tris glycinbuffer (pH 8,9). Blandingen ble sentrifugert i 2 min i en Eppendorf sentrifuge og supernatanten ble fjernet og frosset ved -20°C for analyse. IFN-a aktiviteten ble bestemt ved plaque reduksjsonsbestemmelsen beskrevet av H. Strander og K. Cantell, "Production Of Interferon By Human Leukocytes In Vitro", Ann. Med. Exp. Fenn., 44, sidene 265-273 (1966). En enhet IFN-a preparat uttrykkes i forhold til human referanse HuIFN-A 69/19 (International Symposium on Standardization of Interferon and Interferon Inducers, 19 69). Alternativt kan bestemmelsen basert på reduksjon av den cytopatiske effekt, dvs. i det vesentlige slik som beskrevet av W. E. Stewart, II og S. E. Sulkin, "Interferon Production In Hamsters Experi-mentally Infected With Rabies Virus", Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 123, sidene 650-653 (1966), anvendes, bortsett fra at humane CCL-23 celler ble anvendt og infisert med Mengo virus. Oocyttekstraktene utviste 300 IU av IFN-a aktivitet pr. jjg injisert RNA. I senere bestemmelser var inkubasjonstiden for injisert oocytter 48 t og kun inkubasjonsmediet ble under-søkt, fordi størstedelen av interferonet ble utskilt av oocyttene (A. Colman og J. Morser, "Export Of Proteins From Oocytes Of Xenopus laevis", Cell, 17, sidene 517-526 (1979).

For ytterligere rensing av poly(A) RNA ble tilstrekkelig 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) tilsatt til poly(A) RNA-preparatet A for å bringe konsentrasjonen til 5 mM EDTA. Den erholdte oppløsning ble ekstrahert to ganger med et tilsvarende volum TNE mettet med fenol og 5 ganger med et tilsvarende volum etere. Oppløsningen ble deretter ført gjennom en 0,1 ml "Chelex-100 Bio-Rad" kolonne, oppvarmet i 90 s ved 100'C og lagt på en 13 ml 5-23% sukrosegradient inneholdende 50 mM Tris-HCl (oH 7,5), 1 mM EDTA, 0,2 M NaCl. 10000 cpm 5'-terminert <32>p-merkede DNA-fragmenter fremstilt ved en samtidig behandling av pBR322 med restriksjonsenzymene Hindlll og Pstl, ble tilsatt som størrelsesmarkører. Sentrifugering ble utført i en "SW40" rotor ved 10°C og 35000 omdr/min i 16 t.

Fraksjoner (0,6 ml) ble oppsamlet med en "ISCO" gradientkol-lektor ved 1 ml/min. Fraksjonene ble undersøkt med hensyn til HuIFN-cxmRNA som beskrevet ovenfor og deres posisjon relativt til <32>p-DNA-markørene ble notert for fremtidig referanse. I

de etterfølgende sentrifugeringer ble HuIFN-AmRNA-inneholdende fraksjoner identifisert i forhold til markørene. Fraksjonene med HuIFN-cxmRNA-aktivitet inneholdt 80 pg av poly(A) RNA. Det ble blandet med 2 vol TNE inneholdende 0,5% SDS og 0,02% polyvinyl-sulfat (i senere fremstillinger ble polyvinylsulfat utelatt) og tilført en 50 jil oligo(dT) cellulosekolonne. Etter vasking av kolonnen som ovenfor beskrevet, ble 4 0 jjg av RNA-blandingen eluert med 4 vaskinger med 0,6 ml sterilt destillert vann. Etter etanolutfelling ble v RNA oppløst til å gi 1 mg/ml i 0,5 mM EDTA.

En bestemmelse av HuIFN-cxmRNA-aktivitet ble utført som

ovenfor beskrevet på en del av poly(A) RBA presipitatet. Det utviste en spesifikk aktivitet på 3 600 IU interferon/pg injisert RNA. Sukrosegradienten hadde derfor anriket poly(A) RNA ca. 10 ganger med hensyn til HuIFN-cxmRNA. I en etter-følgende tilsvarende fremstilling ble en 40 gangers anrikning

oppnådd. Preparat B ble renset på tilsvarende måte og da den utvisre en tilsvarende spesifikk aktivitet som preparat A, ble de to preparater slått sammen.

Det bør understrekes at selve poly(A) RNA produktet erholdt fra sukrosegradienten inneholdt et meget stort antall forskjellige mRNA'er. Bortsett fra mRNA spesifikk for IFN-cx, utgjør de andre mRNA'er uønskede forurensninger (fig. 1). Uheldigvis vil disse forurensende RNA'ere oppføre seg tilsvarende som HuIFN-cxmRNA gjennom den gjenværende kloningsfgrem-gangsmåte. Derfor vil deres tilstedeværelse i poly(A) RNA føre til en endelig fremstilling av et stort antall uønskede bakteriekloner som inneholder gener som koder for polypeptider andre en IFN-cx. Denmne forurensning fører til komplekse skjermingsproblemer ved isolering av de ønskede IFN-a hybridkloner. For tilfellet av IFN-a blir skjermingsproblemet ytterligere komplisert som følge av mangel på en tilstrekkelig renset prøve av HuIFN-amRNA eller DNA eller deler derav som kan virke som en skjermingsprobe for identifikasjon av de ønskede kloner. Derfor er skjermingsprosessen for IFN-a klonene meget tidskrevende og vanskelig. Videre, fordi kun en meget liten prosentandel av IFN-a klonene i seg selv er forventet å uttrykke IFN-a i en biologisk aktiv eller immunologisk aktiv form, er isoleringen av en aktiv klon en "nål i en høystakk"-skjermingsprosess.

Fordelaktig kan det anvendes rekombinant DNA-teknologi for å tilveiebrnge en ytterligere renset prøve av HuIFN-amRNA eller CDNA eller en del derav. Denne rensede mRNA eller cDNA kan anvendes for raskt å skjerme et stort antall bakteriekloner, og derved øker i vesentlig grad sannsynligheten for å isolere en klon som uttrykker IDFN-a i en aktiv form.

Poly(A) RNA anriket med hensyn til IFN-amRNA (Preparatene A+B), ble anvendt som en mal for å fremstille enkeltkjedet komplementært DNA (cDNA) (Fig. 1) (cf. A. Efstradiatis et al., "Full Length And Discrete Partial Reverse Transcripts Of Globin And Chlorion mRNAs", Cell, 4, sidene 367-378 (1975) og deri anførte referanser). 800 pl av reaksjonsblandingen inneholdende 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 20 pg oligo(dT) 12-18, 5 mM dGTP, dCTP og dTTP, 5 mM <32>p-dATP, spesifikk aktivitet 100 000 cpm/nmol) , 60 pg/ml poly(A) RNA og 280 enheter fjærfe myeloblastosevirus (AMV) reverse transcriptase (gave fra Life Scienses, Inc., St. Petersburg, Florida), ble inkuberti 1 t ved 37°C, og

tilsatt 0,5 M EDTA og 20% SDS (omkrystallisert) til 10 mM EDTA og 0,1% SDS. Blandingen ble ekstrahert med 1 vol fenol (destillert). Fenolfasen ble vasket med 200 pl 200 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA og 0,1% SDS, og de vandige faser kombinert. Disse ble ekstrahert med et likt volum eter og kromatografert på en 5 ml "Sephadex G-100" kolonne i TNE. Fraksjoner som utviste radioaktivitet, (målt ved Cerenkov stråling) ble kombinert og 3M natriumacetat ble tilsatt til 0,3 M. Nukleinsyrene ble presipitert med 2,5 vol etanol. Etter lagring over natten ved -20°C ble prøvene sentrifugert og supernatanten kastet. Presipitatet ble oppløst i 18 0 Ml destillert vann og overført til et silikonbehandlet "Eppen-dorfrør". 20 pl 5M natriumacetat, 100 pl destillert vann og 500 pl etanol ble tilsatt. Etter avkjøling over natten ved -20°C ble det dannede presipitatet oppsamlet ved sentrifugering ved 10000 ganger tyngdekraften (10000 G) i 20 min ved 0°C. Utbyttet av enkeltkjedet cDNA var 10 pg.

Igjen må det forstås at det enkeltkjedede cDNA-produkt fremstilt som angitt ovenfor, i realiteten er en kompleks blanding av et stort antall forskjellige cDNA'ar transkribert fra de tilsvarende mRNA'er tilstede i poly(A) RNA-blandingen.

(Fig. 1). Kun et meget lite antall av disse cDNA' er er IFN-cx-relaterte, dvs. HuIFN-cxcDNA'er. En annen faktor som virker til å komplisere cDNA-blandingen, er at hver mRNA-type i poly(A) RNA-blandingen vanligvis ikke er fullstendig transkribert. I stedet kan, for hver mRNA-type, transkriberings-prosessen være stoppet før enden av mRNA er nådd. Derfor kan et stort antall cDNA-typer fremstilles fra hver mRNA-type (ikke vist i fig. 1). Hver type vil oppføre seg mer eller mindre likt i de etterfølgende kloningsprosesser, slik at det

vil bli fremstilt bakteriekloner som inneholder rekombinante DNA-molekyler som kun har ett fragment av genet for et spesielt protein. Tilstedeværelse av disse fragmentinneholdende kloner vil ytterligere komplisere den endelige klonesiktnings-prosess.

Størrelsen for de forskjellige enkeltkjedede cDNA1 er ble bestemt ved elektroforese av en liten del av en alkalisk 2% agarosegel under anvendelse av 30 mM NaOH, 2 mM EDTA som elektrolytt (M. W.. McDonell et al., "Analysis Of Restriction Fragments Of T7 DNA And Determination Of Molecular Weights By Electrophoresis In Neutral And Alkaline Gels", J. Mol. Biol., 110, side 119-146 (1977)). <32>p-cDNA hadde en lengde på 600-100 nukleotider i forhold til det enkeltkjedede globulin cDNA, og <32>p-merkede DNA-fragmenter ble anvendt som størrelses-markører.

Det enkeltkjedede cDNA kan gjøres dobbeltkjede ved behandling med DNA-polymerase I (T. Maniatis et al., "Amplification And Characterization Of A P-Globin Gene Synthesized In Vitro", Cell, 8, s. 163-182 (1976)). Det presipiterte enkeltkjedede cDNA erholdt som ovenfor angitt, ble oppløst i 2 00 pl H20, oppvarmet til 100"C i 2 min og inkubert i 500 pl 0,1 M varmedenaturert kaliumfosfatbuffer (pH 6,9), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM <3>H-dTTP (NEN, spesifikk aktivitet

100 000 cpm/nmol og 150 enheter/ml E. coli DNA-polymerase I. Etter 6,5 t ved 15°C ble 0,5 M EDTA og 20% SDS tilsatt til 10 mM EDTA og 0,1% SDS. Blandingen ble ekstrahert med 500 pl fenol og fenolfasen ble omekstrahert med 250 Ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA ("TE buffer"). De to vandige faser ble kombinert og kromatografert på en 5 ml "Sephadex G-100" kolonne under de samme betingelser som tidligere beskrevet. Natriumacetat (3M) ble tilsatt til 0,3 M og 2,5 vol etanol ble innblandet for å presipitere DNA. En totalmengde på 13 pg DNA ble gjenvunnet.

Det erholdte DNA ble behandlet med nuklease S^, fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til R.C. Wiegand et al., "Specificity

Of The S;l Nuclease From Aspergillus oryzal", J. Biol. Chem. , 250, s. 8848-8855 (1975). Det presipiterte DNA

ble oppløst i 250 pl S-^ buffer (0,2 M NaCl, 50 mM natriumacetat (pH 4,5), 10 mM sinksulfat) og oppvarmet ved 37'C i 30 min. 1,5 pl Si enzym (11 enheter/pl) ble tilsatt blandingen, og denne ble inkubert ved 37°C i 430 min. SDS og EDTA ble tilsatt til 0,1% SDS og 5 mM EDTA og blandingen ekstrahert med 250 pl fenol. Fenolfasen ble vasket med 100 pl TE-buffer. De vandige faser ble kombinert og kromåtografert på "Sephadex G-100" kolonne i TNE. 0,1 ml fraksjoner ble oppsamlet ved 0,3 ml/min og "Cerenkov" strålingen ble bestemt for hver fraksjon. 8 pg dobbelkjedet cDNA ble gjenvunnet etter presipitering med etanol og natriumacetat som angitt ovenfor.

Det må igjen forstås at det dobbelkjedede cDNA fremstilt som ovenfor angitt er en blanding av et stort antall cDNA1 er og fragmenter derav, mens ganske få utgjøres av HuIFN-cxcDNA eller dets fragmenter (fig. 1).

Et stort antall vert/vektorkombinasjoner kan anvendes ved kloning av det dobbeltkjedede cDNA fremstilt som beskrevet ovenfor. F.eks. kan gunstige vektorer bestå av segmenter av kromosomale, ikke-kromosomale og syntetiske DNA-sekvenser, såsom forskjellige kjente bakterie-plasmider, eksempelvis plasmider av E. coli-innbefattende col El, pCRl, pBR322 og deres derivater, brede vertsområdeplasmider, eksempelvis RP4, fag DNA, eksempelvis de mange derivater av fag A, eksempelvis NM 989, og vektorer avledet fra kombinasjoner av plasmider og fag DNA, såsom plasmider som er modifisert for anvendelse av fag DNA eller andre ekspresjonskontrollsekvenser eller gjærplasmider såsom 2 p plasmid eller derivater derav. Nyttige verter kan innbefatte bakterieverter såsom stammer av E. coli, eksempelvis E. coli HB101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli MRCI (og stammer av Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus og andre bakterier, gjærtyper og sopp, dyr- eller planteverter såsom dyre- (innbefattende mennesker) eller planteceller i kultur eller andre verter). Naturligvis vil ikke alle vert/vektorkombinasjoner være like effektive. Det spesielle valg av vert/vektorkom-binas jon kan gjøres av en fagmann etter vurdering av de fremlagte prinsipper, spesielt fremstilles polypeptider av IFN-a-type ifølge oppfinnelsen ved de trekk og med de mikroorganismer som er angitt i krav 1's karakteriserende del.

Ytterligere innen hver spesifikke vektor kan forskjellige posisjoner velges for innføring av det dobbeltkjedede DNA. Disse posisjoner er vanligvis betegnet med det restriksjonsendonuklease som kutter- disse. F.eks. i pBR322 er Pstl-posisjonen lokalisert i genet for p<->laktamase, mellom nukleotid-triplettene som koder for aminosyrene 181 og 182 i dette protein. Denne posisjonen ble anvendt av Villa-Komaroff et al., som ovenfor angitt, ved deres syntese av protein som utviser rotte-proinsulin-antigendeterminanter. En av de to HindII-endonuklease-gjenkjennelsesposisjoner ligger mellom triplettene som koder for aminosyrene 101 og 102 og de andre av flere Tag-posisjoner ved tripletten som koder for aminosyre 45 i e-laktamase i pBR322. På samme måte ligger EcoRI-posisjonen og PvuII-posisionen i dette plasmid utenfor ethvert kodningsområde, EcoRI-posisjonen er lokalisert mellom henholdsvis genene som koder for resistens mot tetracyklin og ampicillin. Denne posisjonen ble anvendt av Itakura et al. og Goeddel et al. i deres rekombinante synteseskjemaer, nevnt ovenfor. Det må naturligvis forstås at en vektor som er nyttig ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse, ikke behøver en restriksjonsendonukelase-posisjon for innføring av det valgte DNA-fragment. I stedet kan vektoren forenes med fragmentet på andre kjente måter, eksempelvis dersom vektoren er lineær.

Vektoren og den spesielle posisjon valgt deri for tilknytning av et valgt DNA-fragment for å gi et rekombinant DNA-molekyl bestemmes av et antall forskjellige faktorer, eksempelvis antall posisjoner for et spesielt restriksjonsenzym, størrel-sen av proteinet som skal uttrykkes, følsomheten for det ønskede protein for proteolytisk degradering av vertscelle-enzymene, forurensninger av proteinet som skal uttrykkes av vertscelleproteinene som er vanskelige å fjerne under rensning, ekspresjonskarakteristika som posisjonen av start-og stoppkodonene i forhold til vektorsekvensene, samt andre faktorer som er kjente for en fagmann. Valg av vektor og innskuddsposisjon for et spesielt gen bestemmes av en balanse mellom disse faktorer, og ikke alle valg er like effektive for et gitt tilfelle.

Selv om et antall fremgangsmåter er kjent innen teknikken

for innføring av fremmed DNA i en vektor til å gi et rekombinant DNA-molekyl, er den foretrukne fremgangsmåte for den første konstruksjon i henhold til oppfinnelsen den som er beskrevet av Villa-Komaroff et al., supra, og vist i fig. 1. Denne fremgagngsmåte er særpreget ved behandling av plasmidet (særlig pBR322) med restriksjonsenzymet som er spesifikt for den valgte posisjon for innføringen (særlig Pstl) og andre dGMP-haler til endene ved terminal transferase. dGMP-haler adderes til 5'endene av det delte plasmid for å regenerere PstI-posisj onen og tillate tilknytning til et cDNA-fragment som bærer komplementære haler. På samme måte forlenges det dobbelkjedede cDNA ved tilsetning av dCMP-haler til 31 enden, for forening av det med haler forsynte plasmidet. Det sistnevnte og cDNA blir deretter forenet for å innføre cDNA i den passende posisjon av plasmidet og for å sirkularisere hybrid DNA, idet komplementariteten til halene muliggjør deres kohesjon (fig. 1)) Det resulterende rekombinante DNA-molekyl bærer et gen for den valgte restriksjonsposisjon (fig. 1).

Naturligvis kan andre kjente metoder for innføring av DNA-sekvenser i vektorer til å gi rekombinante DNA-molekyler være like nyttige ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse. Dette innbefatter eksempelvis direkte ligering, syntetiske ledd, eksonuklease og polymerase-forbundne reparasjonsreaksjoner fulgt av ligering, eller forlengelse av DNA-kjeden med DNA-polymerase og en passende enkeltkjedet mal etterfulgt av ligering. Det må naturligvis forstås at nuklcr.tidsekvensene eller cDNA-fragmentene innført i den valgte posisjon i vektoren kan innbefatte Nukleotider som ikke er endel av det aktuelle strukturelle gen for det ønskede polypeptid, eller kan innbefatte kun et fragment av det komplette strukturelle gen for det ønskede protein. Det er kun nødvendig at, ved hvilken som helst DNA-sekvens som innføres, den transformerte vert vil produsere et polypeptid som utviser en biologisk eller immunologisk aktivitet for HuIFN-cx, eller at DNA-sekvensen i seg selv anvendes som en hybridiseringssonde for å velge kloner som inneholder DNA-sekvenser som er nyttige ved fremstilling av polypeptider med en immunologisk eller biologisk aktivitet som HuIFN-cx.

Vektoren inneholdende det fremmede gen anvendes for å transformere en vert for å tillate at verten uttrykker proteinet eller en del derav som det hybride DNA koder for. Valget av passende vert kontrolleres også av et antall faktorer som er vekjente innen teknikkens stand. Disse innbefatter eksempelvis forenlighet med den valgte vektor, toksisiteten for proteinet innkodet av hybrid-plasmidet, rensingen av det ønskede protein, uttrykkskarakteristika, biosikkerhet og omkostninger. En balanse mellom disse faktorer må finnes, ut fra den forståelse at ikke alle verter vil være like effektive for å uttrykke et spesielt rekombinant DNA-molekyl.

Ved fremstilling av DNA-innskuddene angitt i kr av 1, er den foretrukne initiale vektor bakterielt plasmid pBR322 og den

foretrukne initiale restriksjonsendonuklease-posisjon deri er ps ti-posision (fig.i). Plasmidet er et lite (molekylvekt ca. 2,6 megadalton) plasmid som bærer resistensgenr for ampicillin (Amp) og tetracyklon (Tet) antibiotika. Plasmidet er fullstendig karakterisert (F. Bolivar etal., "Construction And Characterization Of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System", Gene, s. 95-113 (1977); J. G. Sutcliffe, "pBR3 22 Restriction Map Derived From the DNA Sequence: Accurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long", Nucleic Acids Research, 5,- s. 2721-2728 (1978)). Innføring av DNA-produktet i denne posisjonen gir et stort antall bakterielle kloner som hver inneholder en av DNA-genene eller fragmenter derav som er tilstede i det tidligere fremstilte

DNA-produkt. Igjen vil kun et lite antall av disse kloner inneholde genet for IFN-a eller fragmenter derav (fig. 1).

Den foretrukne vert for den initielle kloning i henhold til oppfinnelsen er E. coli HB 101. Andre forsøk ble utført med E. coli X1776, en vert beskrevet i engelsk patent nr. 1.516.458 og deponert i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, hvor det er betegnet med ATCC nr. 31244. 1. Fremstilling av Pstl- spaltet. dGPM- forlenget PBR322 Plasmid pBR3 2 2 (20 pg) ble behandlet med 21 enheter Pstl-endonuklease i 150 pl 20 mN Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 6 mM 2-merkaptoetanol, 200 pg/ml bovint serumalbumin ("BSA"). Etter 2 t ved 37°C ble blandingen ekstrahert med en fenol-kloroformblanding (1:1) og 1 vol eter og presipitert med etanol.

Addering av homopolymere dGMP-haler (fig. 1) ved terminal-transferase (TdT) (renset i henhold til F. J. Bollum, "Deoxynucleotide Polymerizing Enzymes From Calf Thymus Gland", i Methods in Enzymology, (L. Grossman and K. Moldave, eds.), Academic Press, New York, 128, s 591-611 (1968)), ble utført i et 328-pl reaksjonsvolum inneholdende 100 mM natriumkakodylat (pH 7,2), 10 mM NaH2P04, 5 mM MgCl2, 1 mM dGTP, 50 pg/pl BSA og 3-6 enheter TdT (renset som angitt ovenfor) pr. pg DNA. Inkubasjonen ble utført ved 37°C i 2 0 min. EDTA ble tilsatt til 10 mM og blandingen ekstrahert som angitt ovenfor og dialysert i 2 døgn mot TNE-buffer.

2. Fremstilling av dCMP- forlenget DNA

Dobbeltkjedet DNA ble forlenget med dCMP-rester ved hjelp av standard fremgangsmåter (eksempelvis Vil.la-Komaroff et al., supra). 150 ng av det dobbeltkjedede cDNA beskrevet ovenfor ble inkubert i 8 pl 100 mM natriumkakodylat (pH 7,2), 2,5 mM CaCl2, 50 pg/pl BSA, 0,1 mM dCTP inneholdende 3-6 enheter renset TdT pr. pg DNA i 8 min ved 27'C og deretter frosset ved

-20°C. Som tidligere nevnt er det erholdte dCMP-forlengede DNA en blanding av forskjellige typer, hvorav kun noen få er

IFN-relaterte (fig. 1) .

3 Fremstilling av Ca±±- behandlet E. coli X1776

En enkel koloni E. coli X1776 ble inokulert i 100 ml tryptonmedium (C. Weissmann og W. Boll, "Reduction Of Possible Hazards In The Preparation Of Recombinant Plasmid DNA", Nature, 261, sidene 428-429 (1976), supplementert med 100 pl/ml diaminopimelinsyre, 10 pg/ml nalidiksinsyre og 10 pg/ml tetracyklin. Kulturen ble dyrket ved 37'C til en optisk densitet på 0,6 ved 650 nm (OD550) og avkjølt i is i 30 min. Kulturen ble deretter sedimentert ved 4 000 omdr/min i en "Sorvall H4" svingende kuvetterotor, cellene ble vasket med 50 ml 10 mM NaCl, ompelletert ved sentrifugering og på nytt suspendert i 20 ml 100 mM CaCl2. Suspensjonen ble avkjølt i is i 30 min, pelletisert ved sentrifugering og på ny suspendert i 4 ml 100 mM CaCl2 og holdt avkjølt på is over natten for anvendelse, E.coli HB101 ble forbehandlet for transformering i henhold til fremgangsmåten til M. Mandel og A. Higa, "Calcium-Dependent Bacteriophage DNA Infection", J. Mol. Biol., 53, sidene 159-162 (1970). Allikvote deler (0,5 ml) ble holdt frosset ved -70°C og de bibeholdt sin aktivitet i minst 3 måner.

4. Forening av dGMP- forlenget pBR322 og dCNP- forlenget DNA

Foreingen av den med hale forsynte Pstl-spaltede pBR322 og med haleforsynt cDNA ble utført som beskrevet av J. Van den Berg et al., "Comparison Of Cloned Rabbit And Mouse e-globin Genes Showing Strong Evolutionary Divergence Of Two Homologous Pairs Of Introns", Nature, 276, sidene 37-44 (1978). 8 ng av det dCMP-forlengede DNA ble blandet med 2 2 ng dGMP-forlenget Pstl-spaltet pBR322 i 50 pl TNE buffer. Inkubasjon ble utført i 4 påhverandre følgende 1 timers trinn ved 65 °C, 46°C, 3 7°C og 20°C. 20 pl 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 og 50 pl TNE-buffer ble tilsatt og blandingen ble

avkjølt i is i 20 min.

Det erholdte produkt er naturligvis en blanding av et stort antall forskjellige rekombinante DNA-molekyler og noen vektorer uten innskutte DNA-sekvenser. Imidlertid inneholder hvert rekombinant DNA-molekyl et cDNA-segment ved Pstl-posisjonen. Hvert slikt cDNA-segment kan omfatte et gen eller et fragment derav. Kun noen meget få cDNA-segmenter koder for IFN eller en del derav (fig. 1). • Hoveddelen koder for en av de andre proteiner eller deler derav hvis mRNA'er var en del av poly(A) RNA anvendt ved fremstilling av vektorer som anvendes ved fremstilling av rekombinante IFN-a proteiner ifølge oppfinnelsen.

5. Transfeksjon av E. coli X1776 med de forenede hybridplasmider

Tranfeksjon av E. coli X1776 med blandingen av rekombnante DNA-molekyler ble utført som beskrevet av J. van den Berg et al., supra,. P3-vernetiltak ble anvendt ved transfeksjons-prosessen og alle etterfølgende trinn i hvilke de resulterende transformerte bakterier ble håndtert. De forende pBR322 rekombinante DNA-molekyler ble tilsatt til 100 pl Ca<++->behandlede E. coli X1776, fremstilt som ovenfor angitt, og blandingen avkjølt i is i 20 min., oppvarmet til 20°C i 10 min og 0,6 ml tryptonmedium tilsatt. Blandingen ble utspredd på 2 tryptonmedium agarplater behandlet som ovenfor angitt. Transfeksjonseffektiviteten var 3,3 x IO<4> kolonier pr. pg forenet pBR322 transfekterende DNA, nativt pBR322 ga 3 x IO<6 >kolonier pr. pg.

Da plasmidet pBR322 innbefatter genet for tetracyklinresistens, vil E. ccli verter som er transformert med et plasmid inneholdende dette gen intakt, vokse i kulturer inneholdende dette antibiotikum og således utelukke vekst av de bakterier som ikke er resistende for tetracyklin. Derfor vil vekst i tetracyklininneholdende kultur muliggjøre utvelgelse av verter som er transformert med et rekombinant DNA-molekyl eller recyklisert vektor.

Etter 48 t ved 37°C ble individuelle kolonier tatt opp og suspendert i 100 pl tryptonmedium (supplementert som ovenfor angitt) i brønnene i mikrotiterplater. Etter inkubasjon ved 37"C over natten ble 100 pl 40% glycerol iblandet i hver Ttrønn. Platene ble lagret ved -20"C og en samling av

100 000 individuelle kloner av transformert E. coli X1776

ble fremstilt,

Disse 100 000 kloner innholdt et antall rekombinante DNA-molekyler som representerte fullstendeig eller delvis kopier av blandingen av mRNA'er i poly(A) RNA-preparatene fra IFN-induserte leukocytter. (Fig. 2). Hoveddelen av disse vil inneholde kun et enkelt rekombinant DNA-molekyl, og ganske få av disse rekombinante DNA-molekyler er relaterte til IFN. Følgeølig må klonen skjermes for å separere IFN-relaterte kloner fra de andre.

Skjerming av et klon inneholdende HuIFN- cxDNA

Det er flere angrepsmåter for å skjerme bakteriekloner inneholdende human leukocyttinterferon cDNA ("HuIFN-acDNA"). Disse innbefatter eksempelvis RNA seleksjonshybridisering (Alwine et al., infra), Differential Hybridization (T. P. St. John og R. W. Davis, "Isolation Of Galactose-Inducible DNA Sequences From Saccharomyces Cerevisiae By Differential Plaque Filter Hybridization", Cell, 16, sidene 443-452 (1979), Hoeijmakers et al., irifra), hybridisering med en syntetisk prøve (probe) (B. Noyes et al., "Detection And Partial Sequence Analysis Of Gastrin mRNA By Using An Oligodeoxy-nucleotide Probe", Proe. Nati. Adad. Sei. USA, 76, sidene 1770-1774 (1979)) eller skjerming av kloner som fremstiller det ønskede protein ved immunbiologiske (L- Villa-Komaroff et al., supra, eller biologiske (A.C.Y. Chang et al., supra) bestemmelser. I foreliggende tilfelle ble RNA seleksjonshybridisering ansett for å være den mest velegnede og lovende metode for en primærutskillelse av kloner inneholdende IFN-CxcDNA.

RNA seleksj onshvbridiseringanalvse

1. Oversikt over initial analyse

Under henvisning til fig. 2 ble rekombinant DNA isolert fra en kultur av en blanding av 512 kloner fra den ovenfor nevnte samling av kloner (to blandinger av 2 kloner er vist i fig. 1)

(Trinn A). Grunner for å velge denne satsstørrelse vil bli forklart i det etterfølgende. De rekombinante DNA-molekyler ble spaltet, denaturert og hybridisert til leukocytt poly(A) RNA-inneholdende UFN-cxmRNA, fremstilt som tidligere angitt (Trinn B). Alle rekombinante DNA-molekyl-poly(A) RNA-hybrider ble separert fra ikke-hybridisert poly(A) RNA (Trinn C). Poly(A) RNA ble gjenvunnet fra hybridene og renset (Trinn D). Gjenvunnet RNA ble undersøkt med hensyn til dets IFN-cxmRNA aktivitet som angitt ovenfor (Trinn E). Hvis, og bare hvis, blandingen av rekombinante DNA-molekyler inneholder et rekombinant DNA-molekyl med en innskutt nukleotidsekvens i stand til hybridisering til IFN-mRNA i poly(A) RNA under stringente hybridiseringsbetingelser, vil mRNA frigjort fra dette hybrid forårsake dannelse av IFN-a i oocytter fordi mRNA frigjort fra eventuelle andre rekombinante DNA-molekyler-poly(A) RNA-hybrid ikke vil være IFN-a relatert. Hvis en gruppe på 512 kloner ga en positiv respons, ble klonene omgruppert i 8 porsjoner av 64, og hver porsjon undersøkt som ovenfor angitt. Denne prosess ble gjentatt inntil en enkel klon som gir respons til denne undersøkelse, var identifisert.

Det gis ingen sikkerhet for at rekombinante DNA-molekyler og bakteriekloner transformert med disse, som er identifisert på denne måte, inneholder den fullstendige IFN-acDNA-sekvens eller IFN-a eller til og med DNA-sekvensen som i realiteten koder for IFN-a. Imidlertid vil de rekombinante DNA-molekyler sikkert inneholde betydelige nukleotidsekvenser som er komplementære til den IFN-amRNA kodende sekvens. Derfor kan i det minste et rekombinant DNA-molekyl anvendes som en kilde for en prøve for raskt å skjerme av andre rekombinante DNA-molekyler og kloner transformert med disse for å identifisere ytterligere sett kloner som kan inneholde en autentisk og komplett IFN-a nukleotidkodende sekvens.

3. Teoretiske betraktninger

Betingelsene for hybridisering (trinn B) er kritiske. De absolutte konsentrasjoner og forholdet mellom rekombinant DNA-molekyl og poly(A) RNA må velges slik at det tas i betrakning reaksjonshastigheten og støkiometrien. Det er vanskelig å gjøre det rette valg, fordi andelen av IFN-cxmRNA i poly(A) RNA ikke er kjent. For å sikre kontrollert og riktig kinetikk, ble hybridiseringen utført under betingelser hvor konsentrasjonen av DNA-sekvensene fra de rekombinante DNA-molekyl ene var i overskudd sammenlignet med den antatte IFN-cxmRNA-konsentrasjon. I en blanding av 512 mulige forskjellige rekombinante DNA-molekyler vil en IFN-a relatert DNA-sekvens ("IFN-aR DNA") enten ikke være tilstede (i et negativt analyseresultat), eller vil utgjøre minst 1/512 av de rekombinante DNA-molekyler. Konsentrasjonen av den rekombinante DNA-molekylblanding, og følgelig konsentrasjonen av IFN-aR DNA, hvis noen, kan således justeres i hybridiseringstrinnet for å sikre passende hybridiseringshastigheter. I tillegg må mengden av IFN-aR DNA i reaksjonsblandingen være tilstrekkelig til å binde nok IFN-amRNA fra poly(A) RNA for å muliggjøre påvisning av IFN-a etter injeksjon i oocytter av mRNA gjenvunnet fra det rekombinante DNA-molekyl-poly(A) RNA-hybridet.

For å påvise IFN-a med de tilgjengelige analyser, bør konsentrasjonen være 100 IU/ml eller høyere. Fordi 0,5 ml alikvote deler er nødvendig for dobbeltbestemmelser, bør 50 IU genereres i oocyttene. Poly(A) RNA fra induserte tidligere anvendte leukocytter genererer ca. 500 IU IFN-a ved injeksjon av 1 pg i oocytter. Derfor må minst 0,1 pg poly(A) RNA injiseres for å generere de nødvendige IU. Modellforsøk med rotteglobulin mRNA og rotte P-globulin cDNA-kloner viste

at den totale gjenvinning av <125>I-globulin mRNA i oocytter i forhold til <125>I-globulin mRNA tilsatt til hybridiseringsblan-dingen var ca. 10% og gjenvinning av mRNA aktiviteten var ca. 5%. Derfor bør minst 0,1/0,05 = 2 pg leukocytt poly(A) RNA anvendes ved hybridiseringsanalysen. For å oppnå en tilstrekkelig sikkerhetsmargin ble 12 pg poly(A) RNA anvendt pr. analyse. For å beregne hvor meget DNA fra de rekombinante DNA-molekyler som er nødvendig for å binde IFN-amRNA i 12 pg Poly(A) TNA, ble IFN-amRNA-innholdet i poly(A) RNA estimert. 1 ug poly(A) RNA genererer 500 IU IFN-cx. Den spesifikke aktivitet for IFN-cx ligger mellom 2 x IO<8> og IO<9>IU/mg protein. 500 IU IFN-a svarer derfor til mellom 500/2 x 10<8> = 2,5 x 10~<6> mg (2,5 ng) og 500/10<9> = 5 x IO"<7> mg (0,5 ng) interferon.

Forholdet mellom injisert mengde IFN-amRNA til en oocytt dg mengden av produsert IFN-a er ukjent. For tilfellet 3-globulin mRNA produseres ca. 30 proteinmolekyler pr. mol mRNA pr. time Denne verdi er ca. 6 for |3-globulin (J.B. Gurdon et al., "Message Stability In Injected Frog Oocytes: Long Life Of Mammalian And ø-Globin Messages", J. Mol. Biol., 80, sidene 539-51 (1973)). Hvis det antas en midlere verdi på 20 for IFN-a f en molekylvekt på 18000 for IFN-a og en molekylvekt på 330 000 for IFN-amRNA,skulle 26 mg (18000/ 3330000 x 20 x 24) IFN-a produseres i 24 t pr. mg injisert IFN-amRNA. Hvis den spesifikke aktivitet for IFN-a er 2 x

o o 2 10 /mg (2 x 10 IU/ng). så vil 1 ng IFN-amRNA gi 26 x 2 x 10 = 5,2 x 10 3 IU IFN-a. Hvis den spesifikke aktivitet er 10 9/mg

3 4 (10 IU/ng)^vil den produserte mengde IFN-a være 2,6 x 10

IU. Fordi 1 ug leukocytt poly(A) RNA gir 500 IU IFN-a under de ovenfor antatte betingelser, burde konsentrasjonen av IFN-amRNA i 1 ug poly(A) RNA ligge i området 0,1-0,02 ng og andelen av IFN-amRNA i leukocytt poly(A) RNA ligge i området 1:10000 og 1:50000. Derfor inneholder 12 ug poly(A) RNA

0,2-1,2 ng IFN-amRNA.

Skulle tr&nslasjonsforholdet av IFN-amRNA i oocyttene være en størrelsesorden lavere enn det som er gjennomsnittlig for a-globulin mRNA(vil IFN-amRNA-inneholdet i poly(A) RNA være ca. 10 ganger høyere enn det som er beregnet ovenfor eiler ligge mellom 1:1000 til 1:5000. I dette tilfellet ville 12 ug poly(A) RNA inneholde 2-12 ng IFN-amRNA. På den annen side^hvis translasjonsforholdet for IFN-amRNA i oocyttene skulle være en størrelsesorden lavere enn det som er vanlig for globulin mRNA, ville IFN-amRNA-inneholdet i poly(A) RNA være 10 ganger lavere enn det som er beregnet ovenfor eller ligge 1 området 1:100 000 og 1:500 000. 12 poly(A) RNA vil da inneholde 0,02-0,1 ng IFN-amRNA.

Plasmid pBR322 har 4361 b.p. Det komplette cDNA i IFN-amRNA vil addere ca. 800-1000 b.p. til pBR322 ved dannelse av pBR322-IFN-acDNA til en total i området 5200-5400 b.p. Molekylvekten vil således være 12 ganger (2 x 5200/800) den for IFN-amRNA alene. Derfor, for å binde IFN-amRNA som ovenfor beregnet til å være tilstede i 12 ug poly(A) RNA nødvendig for analyse-vil det være nødvendig med en mengde rekombi-DNA-molekyler som er lik 12 ganger mengder av IFN-amRNA (støkiometrisk mengde).

Fordi IFN-amRNA-inneholdet i poly(A) RNA anvendt for fremstilling av rekombinante DNA-molekyler var øket 10-4 0 ganger over den for utgangs-poly(A) RNA, burde gruppen av 512 kloner inneholde 10-40 ganger flere kloner inneholdende det ønskede IFN-amRNA enn det som er beregnet fra det ovenfor angitte. Hvis IFN-amRNA er 1 del i 1000 deler utgangspoly(A) RNA, da vil 12 ug po ly (A) RNA inneholde 12 ng IFN-amRNA^, og den støkiometriske mengde IFN-acDNA plasmid er 144 ng. Da hver gruppe av 512 kloner vil inneholde minst 5 med IFN-acDNA-innskudd,vil totalmengden av hybridplasmid DNA kreve 14,8 ug (144 x 512/5 x 10~<3>)_. Hvis IFN-amRNA utgjør 1 del av 10 000 vil 12 ug poly(A) RNA inneholde 1,2 ng IFN-amRNA og mengden av IFN-acDNA plasmid som er nødvendig vil være 14,4 ng. En gruppe på 512 kloner vil inneholde enten 0 eller 1 IFN-acDNA-innskudd slik at den totale mengde hybridplasmid

-3

DNA som er nødvendig,er 7,4 ug (14,4 x 512 x 10 ). Hvis IFN-amRNA er 1 del i 100 000,vil totalmengden av hybridplas--3

mid DNA som er nødvendig, være 0,74 ug (1/44 x 512 x 10 ). For å sikre at hybridiseringsreaksjonen vil forløpe under DNA-overskuddsbetingelser (dvs. overskudd rekombinant DNA sammenlignet med poly(A) RNA); ble 20 ug av blandingen (ca. 1,4 til 30 gangers overskudd valgt for analysen..

Hybridiseringen må utføres under betingelser som sikrer (a) at den hybridiserte del av poly(A) RNA gjenvinnes intakt og i en biologisk aktiv form, (b) at ikke-spesifikk DNA-mRNA assosiering forhindres og (c) at hybridiseringsreaksjonen forløper til minst 75% fullstendighet. Disse betingelser vil mest. sannsynlig tilfredsstilles ved hybridisering i 80% formamid,0,4M NaCl (J. Casey og N. Davidson, "Rates Of For-mation And Thermal Stability Of RNA:DNA And DNA:DNA Duplexes At High Concentrations Of Formamide", Nucleic Acids Res., 4, sidene 1539-52 (1977)). I denne oppløsning kan hybridiseringen utføres ved ca. 40°C i stedet for 60-70°C som er nød-vendig når formamid utelates. Lavere temperaturer er foretrukket for å minimalisere ødeleggelse av poly(A) RNA. Den valgte hybridiseringstemperatur var 56°C. Dette er ca. 3° lavere enn ^ y/ 2L (J* Casey og N. Davidson, supra) og ca. 10-13°C under ^ 2./ 2d (Hamaguchi & Geidushek, J. Amer. Chem. Soc, 84, side 1329). Denne temperatur skulle derfor ikke tillate hybridisering av sekvenser med mindre enn ca. 87%'s homologi da 1%'s utilpasning senker T^^a me^ (T. F-Bonner et al., "Reduction In The Rate Of DNA Reassociation By Sequence Divergence", J. Mol. Biol. 81, sidene 123-35

(1973) ) .

Ved foreliggende hybridisering er selvhybridisering av DNA ikke noe hovedproblem fordi blandingen av DNA<1>er som anvendes består av den samme vektor (pBR322) og et antall cDNA-innskudd. Derfor vil de fleste DNA-sekvenser være heterodup-lekser hvori innskuddene er tilgjengelige for hybridisering til poly(A) RNA. Det er lite sannsynlig at komplementære cDNA innskudd som utgjør en del av de forskjellige duplekser, vil samreagere som følge av topografiske begrensninger. I alle tilfelle vil DNA:DNA reassosiasjon minimaliseres under de anvendte reaksjonsbetingelser (J. Casey og N. Davidson, supra).

For å bestemme den nødvendige hybrj-diseringstid for å sikre minst 75S omsetning,ble en annen ordensreaksjonsligning anvendt:

hvor i:

R = den molare nukleotidkonsentrasjon i hybridirert

RNA

Co= den molare nukleotidkonsentrasjon av det initiale

DNA som skal hybridiseres

Ro= der: velare nukleotidkonsentras jon av det initiale

RNA som skal hybridiseres

k = omsetningshastighetskonstant for RNA-DNA hybridisering

t = tid (f)

og:

^- = 0,75 (75% omsetning)

KO

k„ = 472 (kn = 1/12 k, (J. Casey og N. Davidson, supra)

K K Q

hvor: kd-, = annen ordens reaks jonskonstant for DNA under de valgte hybridisering sbe ting el sene

og: kd = 1,7 x IO<5> x L<1/2> x N_<1>

(J. R. Hutton og J. G. Wetmur, "Renaturation Of Bacteriophage 3 X17 4 DNA-RNA Hybrid: RNA Length

Effect And Nucleation Rate Con-stant", J. Mol. Biol., 77, sidene 495-500 (1973))

L = 900 (kjedelengde i b.p., ca. 900

er tilstede i det fullstendige IFN-acDNA-innskudd)

N 900 (kompleksitet i b.p. av hyb-ridkjeden. Her er kompleksiteten 900 fordi de 900 nukleotider av IFN-amRNA er forbundet med kom-lementære 9 00 nukleotider i 1FN-acDNA innskuddet)

-7

Co = 2,5 x 10 (Basert på 40 ul oppløsning inneholdende de tidligere be-

stemte 20 ug rekombinante DNA-molekyler som skal anvendes i analysen, igjen under forutset-ning av at IFN-acDNA innskuddet vil være 1/12 av det rekombinante DNA-molekyl og vil finne sted i det minste i 1 av 512 kloner og angi 662 som den midlere molekylvekt for et DNA-basispar)

Ro = 8,7 x 10 (Basert på 40 ul oppløsning inneholdende det tidligere bestemte 12 ug poly(A) RNA som anvendes ved analysen, igjen under antagelsen at poly(A) RNA inneholder 1:10 000 deler IFN-amRNA (utifrå at det store overskudd av DNA vil en forskjellig andel ha liten effekt på hybri-diseringshastigheten) og anta 3 43 som den midlere molekylvekt av et ribonukleotid i RNA)

3. Utførelse av den initiale analyse

Trinn A-Fremstilling og spaltning av blandingen av rekombinante DNA-molekyler

Det ønskede antall bakteriekloner ble inokulert på tryp-tonmeuiumagarplater supplementert som angitt ovenfor,

ved å overføre en alikvot del fra hver mikrotiterbrønn ved hjelp av en mekanisk anordning. Etter inkubasjon i 37°C hadde hver klon ført til en koloni med en diameter på flere millimeter. Alle kolonier ble vasket av platen(e) og forenet til å gi et inokulum anvendt for å inokulere 1 1 tryptonmedium, supplementert som angitt ovenfor, en

2 1 Erlenmeyer kolbe. Kulturen ble ristet ved 37'C

til en OD650 på ca. 0,8: Et volum supplementert tryptonmedium og kloramfenikol til 170 ug/ml ble tilsatt til kulturen, som ytterligere ble ristet ved 37<*>C i 16 t. """> ml kloroform ble tilsatt, og kulturen igjen ristet i 10

min. ved 3 7°C for å drepe bakteriene (C. Weissmann og W. Boll, supra). Kulturen ble dekantert fra kloroformen og cellene oppsamlet ved sentrifugering ("Sorvall GS3" rotor)

i 15 min. ved 6000 omdr.// min. ved 4 oC. Ca. 1-2 g celler ble erholdt ved hver liter av preparatet. Cellene ble suspendert i 30 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), sentrifugert i 20 min. ved 5000 omdr./min. og 4°C ("Sorvall SW" rotor) og resuspendert i 30 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,5). 0,25 vol lysozym-oppløsning (10 mg/ml i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)) ble tilsatt og etter avkjøling i 10 min ved 0°C ble 0,33 vol (regnet på volumet av den opprinnelige 50 mM Tris-HCl-kultursuspensjon), 0,5 M EDTA (pH 8,0) tilsatt og forsiktig blandet inn uten risting. Etter ytterligere 10 min ved 0°C ble 1/16 vol (igjen regnet på det opprinnelige volum) 2% "Triton X-100" tilsatt. Etter 60 min ble prøven sentrifugert i 60 min ved 10 000 omdr/min ved 0'C i en "Sorvall SW" rotor. Supernatanten ble overført til et beger inneholdende en magnetisk rører, og 3 M NaOH ble tilsatt under omrøring inntil en pH på 12,5 ble nådd, målt ved 20°C. Etter omrøring i 10 min ved 20°C ble pH justert til 8,5. Etter 3 minutters ytterligere omrøring ble 1/9 vol 5 M NaCl og 1 vol fenol (destillert og brakt i likevekt med 9,5 M NaCl) tilsatt og kraftig omrørt i 5 min. Fasene ble separert ved sentrifugering ("GSA Sorvall" rotor) ved 10 000 omdr/min ved 0°C i 10 min. Supernatanten som inneholdt Form I DNA (sirkulært dobbeltkjedet DNA), ble forsiktig fjernet fra mellomfasen (som inneholdt enkeltkjedet

DNA) og ekstrahert 3 ganger med kloroform. (Fenol må for en stor del fjernes ved dette trinn). Form I DNA-fraksjonen vil inneholde de rekombinante DNA-molekyler (pBR322-cDNA innskutt] som opprinnelig ble anvendt for å transformere de vertceller som utgjorde en del av de 512 kloner som ble valgt for under-søkelse.

Pankreas RNAase A (5 mg/ml, forvarmet 10 min ved 85°C) ble tilsatt til Form I DNA til en konsentrasjon på 20 pg/ml, og blandingen inkubert i 60 min ved 37°C. 1/5 vol 5 M

NaCl ble tilsatt, og blandingen justert med 30% polyetylen-glykol 6000 (autoklavert i 20 min ved 12CC) opp til en sluttkonsentrasjon på 7,5% PEG. Etter 2-16 t ved -10°C ble presipitatet oppsamlet i en "Sorvall SW" rotor i 20 min ved 8000 omdr/min ved 0°C, oppløst i 0,075 M NaCl, 0,0075 M Na-sitrat til en absorpsjon på 20 ved 260 nm og justert til 0,5% SDS. Oppløsningen ble inkubert i 30 min ved 37°C med 0,5 mg/ml pronase (nedbrutt ved 20 mg/ml i 2 t ved 37°C) og ekstrahert 3 ganger med 1 vol destillert fenol og 2 ganger med 1 vol kloroform. Prøven (opptil 2 ml av en 1 mg/ml DNA-oppløsning) ble sentrifugert gjennom en 5%-2 3% sukrosegradient i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA i 15 t ved 21 000 omdr/min ved 15'C under anvendelse av en "SW 27 Beckman Rotor". Fraksjonene ble oppsamlet og OD260 ble observert. DNA-inneholdende fraksjoner ble slått sammen og DNA presipitert med natriumacetat ogmetanol. 20 - 100 ug av Form I DNA-blandingen ble gjenvunnet ved sentrifugeringen. 20 ug renset Form I DNA ble behandlet i 150 ul 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl , 50 mM NaCl, 6 mM 2-merkaptoetanol, 200 pg/ml BSA eller gelatin og 20 enheter Hindlll.

HindiII restriksjonsenzymet spalter Form

1 DNA ved en posisjon inne i pBR322-enheten (det er lite trolig at også cDNA-enheten spaltes, men hvis den spaltes, vil bestemmelsen ikke påvirkes i vesentlig grad). Etter 2 t ved

o

37 C ble en alikvot (1%) analysert ved elektroforese igjennom en 1% agarosegel i 50 mM Tris-acetat (pH 7,8), 2 mM EDTA ilt ved 50 mA for å fastslå om spaltningen var fullstendig. Hvis dette ikke var tilfelle , ble mere Hindlll tilsatt og inkubasjonen fortsatt i 2 t. Når Form I DNA fullstendig var omdannet til lineære molekyler, ble pronase, EDTA og SDS tilsatt til henholdsvis 0,5 mg/ml, 10 mM og 0,5%. Etter 30 min. ved 37°C ble oppløsningen ekstrahert med 3 0 ul fenol-kloroform (1:1). Den organiske fase ble vasket med 50 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) 1 mM EDTA og de kombinerte vandige faser ekstrahert 3 ganger med eter, filtrert gjennom en 0rl-/ ml "Chelex"-kolonne, oppsamlet i et EDTA-kokt ,og nresipitert med 1/10 vol 3M natrium acetat og 2,5 vol etanol. Etter henstand over natten ved

-20°C ble DNA oppsamlet ved sentrifugering.

To hybridiseringsblandinger ble fremstilt.

Blanding I inneholdt 4 ul 10 ganger konsentrert hybridiser-ingsbuffer (4M NaCl, 0,1 PIPES (pH 6,4, 1,4 piperazin-

125 dietan-sulfonsyre, 50 mM EDTA, 0,5 ul (ca. 5 ng I-globin mRNA (5000 cpm) og 6 ul indusert leukocytt poly(A) RNA (2 ug/ul) i en mengde tilstrekkelig til å generere 6000 IU TFN ved injisering av oocytter.

Blanding II inneholdt 10 ug av det Hindlll-spaltede Form I DNA, som fremstilt ovenfor, og 0,1 ug Pstl-spaltet Z-pBR322-(H3)/Rc|3G-4 ,13 (et pBR322-derivat som inneholder B-globulin-sekvensen i Hindlll-posisjon) (Mantei et al., "Rabbit p-globin mRNA Production In Mouse L Cells Transformed With Cloned Rabbit p-globin Chromosomal DNA", Nature 281, sidene 40-46

12 5

(1979)). I-globulin mRNA i blanding I og p-globulin DNA i blanding II tjener som interne positive kontroller for hybridiseringsbestemmelsen. Begge blandinger ble tørket i en damp av nitrogengass. 40 ul 80% formamid ble tilsatt til residuet av blanding IIf og oppløsningen ble denaturert i 10 min. ved 100°C og avkjølt raskt i is. Den denaturerte oppløsning ble anvendt for å oppløse residuet fra blanding I og den erholdte oppløsning ble inkubert ved. 56° i 4 t.

Etter fortynning til 1 ml med kald 0,9 M NaCl, 0,09 M Na-sitrat og formamid (100%) til 4 volum%^ble oppløsningen filtrert ved 0,5 ml/min. gjennom et "Millipore"-filter (pore-størrelse 0,45 um), idet filteret på forhånd var undersøkt med hensyn til dets evne til å holde tilbake RNA-DNA-hybrider, fordi ikke alle filtere erholdt fra fabrikanten var like effektive.

Det ovenfor nevnte filter med tilknyttet poly(A) RNA-hybrid-

er ble neddykket i 1 ml 0,15 mM NaCl, 0,015 M Na-sitrat, 0,5

% SDS i 10 min. ved 37°C, renset med 3C raM Tris-HCl (pH 7,5),

10 mM MgCl2» 2 mM CaCl2 og plassert i 0,6 ml ny buffer.

Etter tilsetning av 5 ul jodacetat-behandlet DNAase (5mg/ml)

(S. B. Zimmermann og G. Sandeen, Anal. Biochem., 14, s. 269

,(1966); P. A. Price et al., "Alkylation Of A Histidine Resi-

due At The Active Site Of Bovine Pancreatic Deoxyribonuclea-

se", J. Biol. Chem., 244, sidene 924-32 (1969)), ble filter-

et inkubert ved 37 C i 10 min.

Filteret ble fjernet og oppløsningen ekstrahert med 1 vol

fenol og 1 vol eter og ført gjennom en 0,1 ml "Chelex"- i kolonne. 5 ug mRNA (renset gjær RNA) ble deretter tilsatt oppløsningen^og RNA presipitert med natriumacetat og etanol. Presipitatet ble oppsamlet ved sentrifugering ved 10 000 G, oppløst i 10 0 ul 1 mM EDTA, oppvarmet i °0 s ved 100°C og TNE og SDS ble tilsatt til henholds-

vis 2 ganger TNE og 0,5% SDS. RNA ble absorbert til 100 ul oligo(dT) cellulosekolonne, eluert med 4 vaskinger av 0,3

ml destillert vann og presipitert med natriumacetat og etan-

ol. Etter 16 t ved -20°C ble det presipiterte RNA separert ved sentrifugering og oppløst i 2 ul TNK-buffer.

Poly(A) RNA-oppløsningen erholdt fra det foregående trinn ble injisert i 40 oocytter (ca. 50 ni pr. oocyt). Oocytene ble inkubert ved 23°C i 24-48 t, homogenisert og sentrifugert (eller inkuberingsmediet ble gjenvunnet) og analysert slik som beskrevet tidligere for IFN-a.

4. Etterfølgende bestemmelse - hybridisering til filter-bundet DNA

De fleste etterfølgende analyser av et rekombinant DNA-molekyl fra en enkelt klon ble utført med DBM eller DPT papir-bundet DNA fordi analysebetingelsene ikke lenger var kritiske og bestemmelsen mere velegnet. DPT-papir ga lavere bak-grunnsstøy og ble fortrinnsvis anvendt. DBM-papir ble fremstilt som beskrevet av (J. C. Alwine et al., "Method For Detection Of Specific RNAs In Agarose Gels By Transfer To Diazobenzyl Oxymethyl-Paper And Hybridization With DNA Pro-bes", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 14,sidene 5350-54 (1977)). APT-papij- ble fremstilt ved fremgangsmåten ifølge B. Seed (personlig kommunikasjon): Ark av "Whatman 540" papir (20 g) ble omrørt i 16 t ved .20 oC med en blanding av 70 ml 0,5 M NaOH, 2 mg/ml NaBH^ og 30 ml 1,4 butandioldiglycidyleter. Papiret ble deretter overført til en oppløsning av 10 ml 2-aminotiofenol i 40 ml aceton og omrørt i 10 t. Papiret ble omhyggelig vasket med aceton, 0,1 N HC1, H20, 0,1 N HC1, H20 og tørket. APT papir ble diazotert til DPT papir slik som beskrevet for omdannelse av ABM til DBM papir (Alwine et al., supra).

2

DNA (opp til 15 ug) ble bundet til 50 mm diazotert ABM

(DBM) eller diazotert APT (DPT) papir slik som beskrevet av J.H.J. Hoeijmakers et al. "The Isolation Of Plasmids Containing DNA Complementary To Messenger RNA For Variant Surface Glycoproteins Of Trypanosoma Brucei", Gene, under trykking 1980), som angitt i det etterfølgende.

Hybrid plasmid DNA ble behandlet med endonuklease Pstl, behandlet med 500 pg pronase pr. ml, 0,5 % SDS og 10 mM EDTA i 30 min. ved 37°C, ekstrahert med fenol og eter, ført gjennom en 0,1 ml "Chelex"-kolonne og presipitert med etanol. Det varmedenaturerte DNA (opp til 5 pg med en liten mengde 3 2-merketP DNA tilsatt som markør) ble inkubert over natten ved 0°C med 1 cm2 DBM eller DPT papir i 200 pl 25 mM kaliumfosfatbuffer (pH 6,5). Filtrene ble vasket tre ganger i 5 min. ved romtemperatur ved 50 mM kaliumfosfatbuffer (pH 6,5) 1% glycin og tre ganger med 99% omkrystallisert formamid.

En ytterligere inkubasjon med 99% formamid i 2 min. ved 68°C ble etterfulgt av tre vaskinger i 50 mM kaliumfosfat-buf f er (pH 6,5) ved 20°C og to vaskinger i 0,4 M NaOH ved 37°C i 10 min. 40-60% av radioaktiviteten ble bibeholdt i filtrene. Disse filtere ble inkubert i 3 t ved 38°C i forhybridiseringsmediet A, som var tilsatt 1% glycin, under anvendelse av 330 ul'pr. filter. Medium A inneholder 50% formamid, 5 x SSC, 0,04% polyvinyipyrrolidon, 0,04% "Ficoll", 0,1% SDS, 25 ug poly(A) (P & L) og 100 ug gjær RNA (BDH, ekstrahert seks ganger med fenol og presipitert med etanol). Filtrene ble vasket to ganger i medium A og deretter hybridisert i 16 t ved 38 oC med poly(A) RNA som indikert (vanligvis 5-8 ug) i medium A under parafinolje. RNA ble tilsatt på følgende måte: et. vått DNA-filter ble presset og innført i en steril Petri-skål, 20-40 ul av RNA-oppløsningen ble pipettert på filteret og et andre DNA-filter (enten en duplikat eller en kontroll) ble lagt på toppen av det første og de to på hverandre filtere ble dekket med steril parafinolje. Etter hybridisering ble filtrene i rekkefølge vasket i medium A (2 ganger) i en opp-løsning inneholdende 1 x SSC, 0,2% SDS, 1 mM EDTA (3 ganger 10 min. ved 20°C hver gang), medium A (2 h ved 38°C) og i 50%<1>ig formamid, 5 x SSC, 0,1% SDS (3 ganger, 10 min. ved 20 C). Hybridisert RNA ble eluert ved oppvarmning i 1 min. ved 100°C i 200 ul 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA og 0,1% SDS. Elueringstrinnet ble gjentatt to ganger og elu-atene kombinert og RNA presipitert med etanol etter tilsetning av 2 ug gjær RNA (renset som angitt ovenfor). Den vaskede pellet ble vakuumtørket, oppløst i 3 ul H20 og injisert i oocyter. IFN-a-aktiviteten ble bestemt som angitt ovenfor. 5 . Resultater av RNA- seleks jonshybridiseringsbesteminelse Bestemmelsene fra 8 grupper av 512 kloner (dvs. gruppene T, Y, j, K, , 0, £ og 7t var negative. Bestemmelsene fra 4 grupper av 512 kloner (dvs. gruppene 1,6, N og A.) var positive men ikke konsistente. De positive resultater er rapportert: på følgende måte: IU/ml IFN-a produsert av RNA frigjort fra poly(A) RNA-DNA-hybrid (bestemmelse fra kontrollhybridisering under anvendelse av Z-pBR322(H3)/Rc3 G-4,13, supra), bestemmelsene hvor forsøksresultatene var høyere enn bakgrunnskontrollen er understreket.

Gruppe a ble oppdelt i 8 grupper av 64 kloner og hybridiseringen analysert som tidligere. Undergruppene ga de følgende resultater vist i samme format som ovenfor:

Undergruppene A-III ble oppdelt i 8 sett av 8 kloner og hybridisert og analysert:

Fordi de første positive resultater ble oppnådd med settet A-III-4, ble de individuelle kolonier i dette sett (betegnet A-H) hybridisert og analysert:

Derfor inneholder klon X-III-4-C et rekombinant molekyl som er i stand til å hybridisere IFN-amRNA.

Det rekombinante DNA-molekyl i dette klon er betegnet: Z-pBR322(Pst)/HcIF-4C ("Hif-4C"), og bakteriestammen inneholdende dette: E. coli X1776 (Z-pBR322 (Pst)/HcIF-4C) ("E. coli Hif-4C"). Denne nomenklatur indikerer at det rekombinante DNA-molekyl stammer fra Zurich (Z) og plasmidet pBR322 inneholder ved Pstl-posisjonen et HIFN-acDNA ("HcIF"). Det spesielle rekombinante DNA-molekyl er avledet fra klon

A- -III-4-C (("4C").

OMKLQNING OG KARAKTERISERING AV Z- pBR322( Pst)/ HcIF- 4C

Da primærkloner av transformerte celler ofte inneholder mere enn en type rekombinant DNA-molekyl (Efstratiadis et al., "The Primary Structure Of Rabbit 3-globin mRNA As Determined From Cloned DNA", Cell, 10, sidene 571-85 (1977)), ble Hif-4C isolert fra E. coli X1776 (Hif-4C) kloner og renset som DBM-papirmetoden ble anvendt ved denne bestemmelsen. beskrevet ovenfor. Prover av Hif-4C og pBR322 ble behandlet og spaltet med Pstl og analysert ved hjelp av elektroforese på en 1% agarosegel. Hif-4C ga to bånd, en med mobiliteten for Pst-spaltst pBR322 og den andre med mobiliteten tilsvarende ca. 320 b.p.

E. coli HB101 ble transformert med det isolerte Hif-4C som beskrevet ovenfor. Seks kloner tetracyklinresistente, transformerte bakterier ble plukket ut og små kulturer fremstilt og form I DNA renset og analysert ved Pstl-spaltning og agarosegelelektroforert som angitt. Alle prøver viste spaltningsmønstere identiske med Hif-4C. En av disse omklonede rekombinante DNA-molekyler ble betegnet Z-pBR322 (Pst)/HcIF-4c ("Hif-4c") og anvendt for ytterligere forsøk. Liten "c" betegner et omklonet DNA-molekyl.

For å bestemme kapasiteten for Hif-4c og dets cDNA-innskudd med hensyn til hybridisering til IFN-amRNA, ble Hif-4c (115 ug) fullstendig spaltet med 125 enheter Pstl. ekstrahert med fenol og kloroform og presipitert med etanol som beskrevet ovenfor. En alikvot (10 ug) ble 5' terminalt merket (for å tjene som markør i etterfølgende trinn) ved å oppløse det 100 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), føre oppløsningen gjennom en 0,1 ml "Chelex 100" kolonne og behandle det med 0,6 enheter bakteriell alkalinfosfatase ilt ved 65°C. Ti ganger konsentrert TNE (40 ul) ble tilsatt og oppløsningen ektrahert 3 ganger med 1 vol fenol og 3 ganger med 1 vol kloroform. DNA ble presipitert med 2 vol etanol ved -20°C over natten og oppsamlet ved sentrifugering. For ytterligere rensning ble en prøve på 0,5 ml TNA absorbert på 0,25 ml DEAE-cellulose ("Whatman DE52", forvasket med 2 ml 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM EDTA) ("NET-buffer"), vasket med 2 ml NET buffer, eluert med 0,4 ml 1,5 M NaCl, 2C mM Tris-HCl (pH 7,5), 2mM EDTA og presipitert med etanol som angitt tidligere. Det erholdte DNA ble inkubert med /<32>p_AT<p> (spesifikk aktivitet ca. 5000 Ci/mmol) og polynuk-leotidkinase, (A.M. Maxam og W. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA", Proe. nati. Acad. Sei. USA, 74, sidene 560-564 (1977)) og renset ved kromatografi på 3 ml "Sephadex-

G50" kolonne i TNE. De eluerte fraksjoner ble slått sammen

32

og P-DNA presipitert med etanol som angitt tidligere, ut-7

bytte ca. 10 dpm.

Det umerkede Pstl-spaltede Hif-4c DNA (90 ug) ble blandet

5 32

med 6 x 10 dpm P-merket, Pstl-spaltet Hif-4c DNA som erholdt ovenfor og elektroforert gjennom en 10 x 20 x 0,7 cm, 2%-ig horisontal agarosegel i 50 mM Tris-aceta<t>b uffer (pH 7,8) under anvendelse av en spalte på 2,5 cm. En rønt-genfilm ble eksponert for gelen og posisjonen av 320-bp-fragmentet bestemt. Gelstripen inneholdende det radioaktive bånd (1,3 x 10 5 dpm) ble skåret ut, knust ved pressing gjennom en plast- 2 ml injeksjonssprøyte og ekstrahert over natten ved 4°C ved omrøring med 10 ganger gelens volum med

NET buffer. DNA ble adsorbert på en 0,1 ml hydroksyapatitt-kolonne .(forvasket med 1 ml NET buffer). Kolonnen ble vasket med 1 ml 0,1 M K-fosfatbuffer (pH 7,5) og DNA eluert med 0,2 ml 1 M K-fosfatbuffer. (pH 7,5). Eluatet ble fortynnet 10 ganger med sterilt, destillert H20 og DNA adsorbert til og eluert fra DEAE og presipitert med etanol som beskrevet tidligere. Dette DNA ble betegnet "Hif-4c fragment".

Dette Hif-4c fragment (120 ng) ble bundet til DPT-papir (0,5 x 0,5 cm) som tidligere beskrevet. Som kontroll ble 120 ng 3~globulin cDNA-fragment eksitert med Hindlll fra hybridplasmidet Z-pBR322(H3)Rc3G-4,13 (F. Meyer et al., "Transposition Of AT-linked, Cloned DNA From One Vector To Another", Experimentia, 35, side 972 (1979), N. Mantei et al., supra) og behandlet på samme måte. Hybridiseringen av duplikatfilteret til poly(A) RNA (i 20 ul), vasking av filter ene og gjenvinning av RNA fra filterene ble utført som tidligere beskrevet. Etter injeksjon i oocytter ble de føl-gende IFN-a aktiviteter påvist:

Det kan således sees at Hif-4c inneholder et innskudd som er i stand til å hybridisere til IFN-amRNA.

IDENTIFISERING AV KLONER AV E. COLI INNEHOLDENDE REKOMBINANTE DNA- MOLEKYLER KRYSSHYBRIDISERT TIL INNSKUDDET I HIF- 4c

Da cDNA-innskuddet i det rekombinante DNA-molekyl Hif-4c kun var ca. 320 b.p. eller en tredjedel av den estimerte størr-else for IFN-amRNA, ble det rensede Hif-4c fragment, beskrevet ovenfor, anvendt som en prøve for å skjerme bakterielle kloner inneholdende rekombinante DNA-molekyler inneholdende beslektede hybrid DNA-innskudd (fig. 3).

64 bakteriekloner utgjørende undergruppe A.-III beskrevet ovenfor, ble trykket på en "Millipore" membran (diameter 8cm), plassert på en agarplate (supplementert med diaminopimelinsyre, nalidiksinsyre og tetracyklin, som tidligere angitt)

og inkubert i 24 t ved 37°C. Filteret ble plassert på en 0,7 5 ml dråpe 0,5 M NaOH og etter 2-3 min. overført til et papirhandkle for å fjerne overskuddsvæske, hvoretter trinnet ble gjentatt. Filteret ble nøytralisert under anvendelse av 1 M Tris-HCl (pH 7,5) og vasket med 1,5 M NaCl - 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) på samme måte som angitt ovenfor og luft-tørket. Filteret ble dyppet i 0,3 M NaCl, lufttørket og

varmet til 80°C i 2 t under vakuum. Hif-4c Pst fragmentet

3 2

(30 ng) ble P-merket ved "nick" translasjon (A.J. Jeffreys og R.A. Flavell, "The Rabbit e-Globin Gene Contains a Large Insert in The Coding Sequence", Cell, 12, sidene 1097-1108

(1977)) under anvendelse av e<32>P dATP og cx<32>P DCT<P >(spesifikk aktivitet, 40 Ci/mmol hver). Filteret som bar X-III koloniene ble forhybridisert i 4 x SETT (SETT er 0,15 M NaCl, 30 mM Tris-HCl (pH 8,0), ImM EDTA), 0,1% (w/v) "Ficoll", 0,1% polyvinylpyrrolidin, 0,1% (w/v) BSA, 0,5% SDS og 200 ug/ml denaturerte, fragmenterte laksesperm DNA i 7 t ved 68°C og hybridisert med 2 x IO<5> cpm p-merket Hif-4c i 4 x SETT 0,02% (w/v) "Ficoll", 0,02% polyvinylpyrrolidin, 0,02% w7v BSA, 0,5% SDS og 200 ug/ml denaturert laksesperm DNA ved 68°C i 16 t. Filteret ble vasket med SETT-0,5% SDS ved romtemperatur, vasket 2 x SETT-0,5% SDS i 5 t ved 68°C, utbytte oppløsningen en gang, og med 3mM "Trizma" base ved romtemperatur i 4 t, under erstatning av oppløsningen en gang. Etter tørking av filteret ble en røntgenfilm eksponert for dette i 8 t under anvendelse av et skjermfilter. Tre kolonier ga sterk positiv respons, nemlig X-III-7D, X-III-2H og X-III-4C og to ga en svak respons, nemlig X-III-1E, X-III-3D.

Små kulturer ble fremstilt fra Hif-4c beslektede kloner, form I DNA ble renset, spaltet med Pstl og analysert ved agarosegelelektroforese som tidligere beskrevet. Alle form I DNA'er ga et stort fragment (plasmid pBR32 2 kjerne) og et lite fragment (hybridinnskudd). Det rekombinante DNA-molekyl fra X-III-2H frigjorde det største innskudd, nemlig ca. 900 b.p. Dette rekombinante DNA-molekyl ble betegnet Z-pBR322(Pst)/HcIF-2H ("Hif-2H) og dets innskudd "Hif-2H fragment".

Hif-2H ble undersøkt med hensyn til dets evne til å binde IFN-cxmRNA ved å binde det til DPT-papir (4ug/mm<2>) og deretter hybridisere det til poly(A) RNA (0,3 um/ul), utført som tidligere beskrevet, i 16 t og deretter bestemme IFN-cxmRNA-aktiviteten.

Hif-2H ble omklonet som beskrevet for Hif-4C og betegnet med Hif-2h.

I et ytterligere eksperiment ble nok et sett E.coli kloner inneholdende rekombinante DNA-molekyler fremstilt, og koloniene hybridisert til merkede Hif-4c fragmenter ble identifisert. For å sikre et høyt,utbytte av plasmider med lange

\ .32 cDNA-innskudd, ble en del av det dobbeltkgedete P-merkede leukocytt-cDNA fremstilt enzymatisk fra leukocytt poly(A). RNA (det samme cDNA-preparat fremstilt som tidligere angitt) ble størrelsesfraksjonert ved sentrifugering gjennom en suk-krosedensitetsgradient under anvendelse av den samme fremgangsmåte som beskrevet for sentrifugering av poly(A) RNA. Fraksjonene inneholdende cDNA med en sedimentasjonshastighet tilsvarende et 600 b.p. DNA fragment eller større, ble slått sammen og cDNA gjenvunnet etter etanolpresipitering. cDNA ble forlenget med dCMP-rester, hybridisert til dGMP-forlenget Pstl-spaltet pBR322 og det erholdte hybrid-DNA anvendt for å transformere E. coli som tidligere angitt, bortsett fra at E. coli HB101 ble anvendt. Bakteriene ble fordelt på 8 cm diameter "Millipore" filtere plassert på "Tryptone" medium-agarplater (inneholdende 10 ug/ml tetracyklin) og dyrket inntil små kolonier kom til syne. Et duplikatfilter ble fremstilt ved å presse et nytt, fuktig "Millipore" filter på det kolonibærende filter, hvoretter filteret ble trukket av, plassert med oversiden opp på en agarplate inneholdende 4,4%

glycerol og inkubert inntil små kolonier kom til syne. Dette kolonibærende filter ble dekket med et ytterligere "Millipore" filter frosset ved -55°C og lagret (D. Hanahan og M. Meselson, "A Protocol For High Density Plasmid Screening", Sept. 1978, personlig kommunikasjon. I alt atten filtere med ialt ca. 5000 kolonier ble fremstilt. En replika av hvert filter ble

32

anvendt for hybridisering til P-merkede, Pstl-behandlete Hif-4c DNA-fragmenter, på samme måte som beskrevet ovenfor. Ca. 185 positive kolonier ble identifisert på et autoradiografi, omklonet på "Millipore" filteret og identifisert nok en gang ved hybridisering. 95 kloner som ga den kraftigste hybridiseringsresponse, ble betegnet Z-pBR322(Pst)/HcIF_SNl til SN95 og anvendt for ytterligere undersøkelser. Det er naturligvis åpenbart at når Hif-2H hår evnen til å produsere et polypeptid som utviser en immunologisk eller biologisk effekt av HuIFN (infra), så vil dette Hif-2h og andre4 DNA-sekvenser beslektet med dette, eksempelvis Hif-4c, kunne anvendes ved denne fremgangsmåte for kloneskjerming like godt på andre kloner inneholdende DNA-sekvenser erholdt ved rekombinante DNA-teknologi, synteser, naturkilder eller en kombinasjon derav eller kloner inneholdende DNA-sekvenser beslektet med hvilke som helst av de ovenfor nevnte DNA-sekvenser ved mutasjon, innebefattende enkle eller multiple basissubstitusjoner, innskudd, inversjoner eller utelatelser for å velge andre DNA-sekvenser og kloner som også koder for HuIFN. Det må også forstås at DNA-sekvenser som ikke er skjermet ved hjelp av de ovenfor nevnte DNA-sekvenser, men som likevel er et resultat av deres rearrangement av nukleotidkoden for uttrykket for polypeptider, vil kode, ved hjelp av ekspresjon, for de ovenfor nevnte DNA-sekvenser.

Ytterligere karakterisering av Hif- 2h DNA- innskuddet

Som beskrevet ovenfor inneholder det rekombinante DNA-molekyl Hif-2h et innskudd på ca. 900 b.p. og hybridiserer til human leukocyttinterferon mRNA. De følgende ytterligere karakteristika ble bestemt.

1. Hvbridarrestert translasjon

Hvis et mRNA hybridiseres til et klc-nst, komplementær cDNA, så forhindres translasjonen av mRNA. Imidlertid frigjør varmedenaturering av hybridet transelerbar mRNA (B.M. Paterson et al., "Structural Gene Identification and Mapping by DNA-mRNA Hybrid-Arrested Cell-Free Translation". Proe. nati. Acad. Sei. USA, 74, sidene 4370-74 (1977)). 2,2 ug Pstl-spaltet hif-2h og som kontroll 2 ug Hindlll-spaltet Z-pBFR322(H3)/RceG-4,13("RceG"), ble denaturert i 10 ul 80%-ig (vol/vol) deionisert formamid - 20 mM "PIPES" buffer (pH 6,4) i 10 min. ved 8 0'C. Oppløsningen ble ført inn i et Eppendorfrør inn i hvilket leukocytt poly(A) RNA (5pg), NaCl (4p mol) og EDTA (10 nmol) var tørket. Blandingen ble oppvarmet i 7 t ved 48°C under et lag parafinolje, avkjølt og fortynnet med 200 pl H20. De to prøver ble hver delt i to like deler hvorav en av hver av disse ble oppvarmet til 100°C i 3 0 s. Nukleinsyrene ble presipitert med etanol, oppløst i 3 pl H20 og undersøkt med hensyn til IFN-cxmRNA-aktivitet i oocytter som ovenfor angitt:

Derfor inhiberte Hif-2h, når det ble hybridisert med poly(A) RNA, translasjon av IFN-cxmRNA i poly(A) RNA, etter denature-ring av hybridet ble igjen IFN-cxmRNA translerbar. Dette forsøk bekrefter ytterligere at Hif-2h inneholder sekvenser komplementære til IFN-cxmRNA.

2. Analyse ved hjelp av restriksjonsenzymspaltning og bestemmelse av nukleotid/aminosyresekvenser og restriksj onskart

Spaltning av Hif-2h med forskjellige restriksjonsenzymer ble utført og de erholdte produkter analysert ved agarosegelelektroforese. De understrekede fragmenter er ikke felles for pBR322 og Hif-2h:

Restriksjonsenzym Fra<g>mentstørrelse Hif- 2h** PBR322<*** >Pstl 885 + 20,4361 4361 EcoRI 1426,3820 4361 BctIII 5246 ikke spaltet <*> Oocyttmediet ble analysert etter 48 t ved hjelp av cytopateffekt-inhiberingsmetoden. <*>* Selv om størrelsene internt var stort sett sammen-fallende, ville den absolutte størrelse av disse fragmenter best indikeres under henvisning til figurene 8-10.

*** Fra Sutcliffe (supra).

EcoRI + BgJ.II 336, 4960 4361

EcoRi + Pstl 209, 676,748 748,3611

3611

Bspl 921,587,540,504, 587,540

504,457

457,434,2 x 231, 434,267

234

+14 fragmenter +14 fragmenter 200 bp 200 bp MboII 1616, 884 ikke utført og andre

3 2

I tillegg ble 5' terminert P-merket Pstl spaltet Hif-2h i tillegg spaltet med flere restriksjonsenzymer og størrelsen av de radioaktive fragmenter avledes fra cDNA-innskudd idet rekombinante DNA-molekyl ble bestemt.

På basis av disse data ble et restriksjonskart for Hif-2h dedusert 8fig. 4). Kartet er ikke definitivt med hensyn til den absolutte plassering med hensyn til posisjonene og kan være ufullstendig med hensyn til MboII-posisjonene inne i innskuddet. Kun posisjonene nærmest innskuddet er gitt inne i pBR3 22-kjernen. Pilen indikerer orienteringen for IFN-cxcDNA-k j eden.

Selv om den aktuelle struktur av Hif-2h-fragmentet eller andre innskudd i klonene anvendt ifølge oppfinnelsen, eller for aminosyresekvensen eller strukturen av polypeptidene kodet derfra, ikke er nødvendig for en fagmann som skal utøve oppfinnelsen, så ble de ovenfor nevnte data og restriksjonskartet medtatt i den opprinnelige beskrivelse som den beste tilgjengelige informasjon med hensyn til fragmentets struktur på tidspunktet for innlevering av den opprinnelige søknad. Siden det tidspunkt er som ventet (supra, s 9, linjene 27-29) er disse data og restriksjonskartet for Hif-2h-fragmentet forbedret under anvendelse av velkjente teknikker for nukleotid-sekvensering og restriksjonsanalyse. Se eksempelvis A. M. maxam and W. Gilbert,

"A New Method for Sequencing DNA", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, sidene 560-64 (1977). Plasmid DNA ble fremstilt ved metode B (N. M. Wilkie, et al., "Hybrid Plasmids Containing an Active Thymidine Kinase Gene of Herpes Simple) Virus 1", Nucleic Acids Research, 7, sidene 859-77

(1979)) og fragmentert av forskjellige restriksjonsenzymer i det vesentlige i henhold til leverandøren, bortsett fra at 2 00 ug/ml gelatin erstattet C-serumalbuminet i enzymbuffer-ene. ( EcoRI var en gave fra W. Boll, Bspl en gave fra A. Kiss).

Fragmentert DNA (20 ug) ble ekstrahert med fenol, presipitert med etanol, oppløst i 0,05 M Tris-HCl (pH 8) og ført gjennom en liten kolonne "Chelex-100". Fragmenter med butte eller 5'-overhengende ender ble defosforylert ved behandling med 0,2 enheter kalv fordøyelsesalkalisk-fosfatase pr. pmol DNA 5'-ender i 200 ul 0,05 M Tris-HCl (pH 8) i 60 min ved 37°C. Enzymet ble inaktivert ved oppvarming i 60 min. ved 65°C. For DNA-fragmenter med 3'-overhengende ender ble bakteriell alkalisk fosfatase anvendt som beskrevet av (A. M. Maxam og W. Gilbert, supra) bortsett fra at inkubasjonen var ved 65° i 3 0 min. Det defosforylerte DNA ble renset ved absorpsjon på og eluering fra DEAE-cellulose (W. Muller et al., "Site-Directed Mutgenesis In DNA: Generation of Point Mutation in Cloned B-Globin Complementary DNA at The Positions Corresponding to Amino Acids 121-123", J. Mol. Biol., 124, sidene 343-58 (1978)) eller underkastet polyakrylamidgel-elektroforese når dette var nødvendig (se nedenfor). Fragmenter ble gjenvunnet fra polyakrylamid (eller agarose)-gelen i 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl (pH 8), ble absorbert på 0,1 ml hydroksyapatitt ("Biorad HTP")-kolonne, vasket 4 ganger med 1 ml 0,1 M kaliumfosfatbuffer (pH 7) og eluert med 0,3 ml i 1 M kaliumfosfatbuffer (pH 7). Oppløsningen ble fortynnet 10 ganger og DNA absorbert på DEAE-cellulose og gjenvunnet som beskrevet av W. Muller et al., supra.

Etter etanolpresipitering ble DNA 5'terminalmerket med [X-<32>P] ATP (12-34 uCi pr. pmol DNA 5'-ender) og polynukleotid-kinase i det vesentlige slik som beskrevet av A. M. Maxam og W. Gilbert, supra, bortsett fra at DNA ikke ble denaturert før kinasereaksjonen. Spesifikke aktiviteter på 1-1,5 uCi

32

[ P] fosfat pr. pmol DNA 5'-ender ble erholdt.

For sekvensering ble merkede fragmenter spaltet ved hjelp av et andre restriksjonsenzym og produktene separert ved elektroforese gjennom en 5%'ig polyakrylamidgel i tris-borat-EDTA-buffer. De ønskede fragmenter ble ekstrahert fra gelen og renset (Muller et al., supra). De forskjellige fragmenter for sekvensering ble fremstilt som følger (tallet indikerer den nominelle fragmentkjedelengde i basisparene, de merkede posisjoner er merket med en stjerne): (1) spaltning av Hif-2h med Bspl, isolering av BspI- BspI-232 og BspI- BspI-949 ved 5% polyakrylamidgel-elektroforese i "Loening's" buffer (U. E. Loening "The Fraction Of High Molecular Weight Ribonukleic Acid By Polyacrylamide Gel Elec-trophoreses", J. Biochem. side 102 (1967)); (2) spaltning av Hif-2h med Bspl, merking, spaltning med Pstl, isolering av Bsp_I<*->£stI-83 og BspI*- PstI-827; (3) spaltning av Hif-2h med Bglll, merking, spalting ved Pstl, isolering av BgJLII<*->PstI-336 og BglII*- PstI-570; (4) spaltning av Hif-2h med MboII, merking, nedbrytning med Pstl og Hindi! (for å spalte et interfererende 350 bp pBR322-fragment), isolering av MboII - PstI-519 og MboII - Pst1-351; (5) spaltning av Hif-2h med EcoRI, merking, spaltning med Pstl, isolering av EcoRI<*->PstI-708 og EcoRI*- PstI-198; (6) spaltning av Hif-2h med Pstl, merking, spaltning med Bglll, isolering av PstI*-Bg_lII-570 og PstI*- BglII-336; (7) spaltning av Hif-2h med Avall, merking, spaltning med Pstl og Bglll, isolering av AvalI<*->Pstl-186 og AvaII*- BglII-147; (8) spaltning av Hif-2h med PvuII, merking, spaltning med Pstl og Bglll, isolering av PvuII - PstI-486.

Fragmentene ble degradert i henhold til fremgangsmåten iføl-ge A. M. Maxam og W. Gilbert, supra, med de modifikasjoner som er beskrevet i protokollene tilveiebrakt av de samme forfattere i september 1978. Produktene ble fraksjonert på 0,1 x 25 x 36 cm 12%'ig polyakrylamidgeler (akrylamid/bisak-rylamid = 18/1) i 50 mM tris-borat, 1 mM EDTA (pH 8,3) med forsøk utført ved 2, 8, 18 og 26 t ved 900 V etter et 6 t's forelektroforese ved 700 V. Best resultater ble erholdt når gelene ble holdt ved romtemperatur 2-3 dager før anvend-elsen .

Hver utstrekning av cDNA-innskuddet ble sekvensert fra begge kjedene og hver restriksjonsposisjon, som tjente som merket terminal ble sekvensert under anvendelse av et fragment som omfattet dette. De således erholdte nukleotidsekvenser er gjengitt i figurene 8-10. Som forventet er posisjonene for de forskjellige restriksjonsposisjoner i dette innskudd lokalisert mere absolutt enn de som ble bestemt med restriksjonsenzym-spaltning alene,og er gjengitt i fig. 4.

Under henvisning til fig. 8-10 kan det ses at den heteropoly-mere del av innskuddet er flankert av 23G rester ved 5'-enden og med 7A-rester (muligens reflekterende poly(A)-av-slutningen av mRNA) fulgt av 15C-rester ved 3'-endedelen. For referanse er innskuddet nummerert fra det første nukleotid som følger dG-halen til den siste nukleotid før poly(A)-restene. En ATG-initierende triplett i posisjon 57-59 og en TAA terminerende triplett i posisjon 624-626 definerer en leseramme ikke avbrudt av intetsigende kodoner. Begge de to andre leserammer i dette området av innskuddet inneholder henholdsvis 18 og 12 intetsigende kodoner. Ytterligere,

de eneste andre sekvenser, dvs. i forskjellige leserammer som er flankert av ATG og GTG og et terminerende signal,

som koder for et polypeptid med 25 aminosyrer eller flere,

er lokalisert henholdsvis mellom nukleotidene 226 og 304,

640 og 778 og 683 og 743. Området mellom nukleotidene 57 og 626 vil derfor mest sannsynlig innbefatte nukleotidesekvens-ene for Hif-2h-fragmentet som koder for et polypeptid som utviser en biologisk og immunologisk aktivitet av IFN-a.

Det må naturligvis forstås at klonet cDNA fra poly(A) RNA

ved de vanlige fremgangsmåter (A. Efstratiadis et al., supra) mangler 5'terminal nukleotider og kan også inneholde kunst-ige sekvenser (R. I. Richards et al., "Molecular Cloning And Sequence Analysis Of Adult Chicken B-Globin cDNA", Nucleic Acids Research, 7, sidene 1137-46 (1979)). Det er derfor

ikke sikkert at ATG lokalisert i nukleotidene 57-59 i virke-ligheten er det første ATG i autentisk mRNA. Imidlertid, for formålet med den etterfølgende beskrivelse,er det antatt at ATG ved nukleotidene 57-59 er det første ATG i autentisk mRNA.

Ved å sammenligne polypeptidet kodet av dette området av innskuddet med sekvensen på 35 amino-terminal aminosyre i autentisk humant lymfoblastoid interferon —SerAspLeuProGlnThrHis-SerLeuGlyAsnArgArgAlaLeuIleLeuLeuAlaGlnMetGlyArglleSerLeu-PheSerCysLeuLysAspArgHisAsp—/bestemt av K. C. Zoon et al., supra og M. Hunkapiller and L. Hood, supra,så synes det som om den valgte leseramme er korrekt og at nukleotidene 57-124 kan kode for en signalsekvens som kommer forut for nukleotidsekvensen som koder for det "modne" polypeptid fordi en sammenholding av den publiserte sekvens med den bestemte sekvens (fra den 24. aminosyre og utover) viser en omfattende homologi (dvs. for 26 av 35 aminosyrer).

I eukaryotisk mRNA er den første AUG-triplett fra 5'-

ende vanligvis den initierende posisjon for proteinsyn-tesen (M. Kozak, "How Do Eukaryotic Ribosomes Select Ini-tiation Regions In Messenger RNA", Cell, 15, sidene 1109-25

(1978)). Kodonet i Hif-2h-fragmentet som tilsvarer den første aminosyre i lymfoblastoid-interferon,er 22 kodoner fra den første AUG (og 14 kodoner fra den andre),hvilket indikerer at sekvensen som koder for interferon kan ha e.fc forutgående for sekvensen bestemmende signalpeptid på 23 (eller mindre trolig 15) aminosyrer. Den lengste av de antatte signalsekvenser inneholder en uavbrutt serie på 11 hydrofobe aminosyrer (og den korteste har en serie på 6 hydrofobe aminosyrer). Denne akkumulering av hydrofobe rester er karakteristisk for en signalsekvens (cf., B. D. Davis and P. C. Tai, "The Mechanism Of Protein Secretion Across Membranes", Nature, 28.3, sidene 433-38 (1980)).

Sekvensen som tilsynelatende svarer til "moden" IFN-ct-polypeptidet omfatter 498 nukleotider som koder for 166 aminosyrer. Hvis det antas at det ikke skjer noen karboksyterminal avkutning (prosessing) t er molekylvekten for interferon-polypeptidet 19 388. Basesammensetningen for kodesekvensen er 50% GC. Kodonanvendelsen i interferonkodesekvensen er i rimelig overensstemmelse med den foreslåtte f or pattedyr^-

mRNA generelt. (R. Grantham, et al., "Codon Catalog Usa-ge And The Genome Hypothesis", Nucleic Acids Research, 8, sidene 49-62 (1980)). Eventuelle observerte avvik kan til-skrives det lille antall som er involvert.

Strukturen for polypeptidet gjengitt i fig. 8-10 for Hif-2h-fragmentet,tar naturligvis ikke hensyn til eventuelle modifikasjoner av polypeptidet forårsaket av samspillet med in vivo-enzymene (eksempelvis glykosyl. Het må derfor forstås at denne struktur ikke behøver å være identisk med det in vivo-dannede IFN-a,men har meget like,om ikke identiske, biologiske og immunologiske egenskaper. Heller ikke vil denne struktur utelukke sannsynligheten for at andre modifikasjoner, så som mutasjoner, innbefattende enkelte eller multiple, basesubstitusjoner, delesjoner, innskudd, eller inversjoner eller kjemiske avledninger fra denne struktur, ikke vil danne forbindelser som også utviser IFN-a-aktivitet.

3. Bestemmelse av pluss. kjeden i det innskutte IFN- acDNA

DNA kjeden som har den samme sekvens som mRNA,betegnes som pluss.kjeden og dets komplement som minuskjeden. Plusskjeden av IFN-acDNA innskuddet ble identifisert som indikert i fig.

5. Hif-2h DNA ble spaltet med restriksjonsenzymet Bglll,

3 2

endedelene merket med P-fosfat, slik som beskrevet oven-

for for Pstl-spaltede ender) og DNA ble behandlet med Pstl til å gi lengere (545 b.p. (570 b.p. bestemt ved den oven-

for rapporterte mere raffinerte analysemåte)) og kortere 340 bp (336 bp som bestemt ved den mere raffinerte analysemåte angitt ovenfor)) radioaktive fragmenter. Disse fragmenter ble denaturert og hybridisert til poly(A) RNA fra induserte leukocytter i 80 % formamid, 0,4 M NaCl, dvs. under betingelser hvor DNA-DNA reassosiasjon ikke finner sted (supra). Nukleinsyrene ble behandlet med nuklease Sl, som nedbryter alle enkeltkjedete nukleinsyrer, særlig ikke-hybri-3 2

disert P-DNA,og produktene ble separert på en polyakryl-amidgei (R. F. Weaver og C. Weissmann, "Mapping Of RNA By A Modification Of The Berk-Sharp Procedure", Nucleic Acid Research, 7, sidene 1175-93 (1979)). Et autoradiogram viste at kun det kortere nukleotidfragment var hybridisert og beskyttet av poly(A) RNA, hvilket identifiserer den 5'-merkede kortere nukleotidkjede som minuskjeden. Orienteringen av plusskjeden er derfor som gitt i fig. 4 og fig. 5 (høyre side).

4. Påvisning av at poly( A) RNA fra ikke- induserte huroan-leukocytter ikke hybridiserer til Hif- 2h DNA

Et forsøk, identisk til det beskrevet i det foregående avsnitt, ble utført .midlertid ble det anvendt poly(A) RNA fra ikke-induserte humanleukocytter, fremstilt ved den samme fremgangsmåte som beskrevet for Sendai virus-induserte leukocytter. Ingen påvisbare mengder merket DNA ble beskyttet. Ved sammenligning med resultatene fra det foregående avsnitt, inneholdt poly (A). RNA fra ikke-induserte celler mindre enn 1/2 0 av mengden av mRNA hybridisert til Hif-2h enn det som er tilfelle for poly(A) RNA induserte celler.

SYNTESE AV ET POLYPEPTID MED INTERFERONAKTIVITET VED HJELP

AV E. COLI INNEHOLDENDE REKOMBINANTE DNA- MOLEKYLER BESLEKTET

MFD Z- pBR322( Pst)/ HcIF- 4c

Pstl posisjonen for pBR322 ligger innen p-laktamase (penicillinase) genet. Når et kodende DNA-segment (eksempelvis en cDNA omfattende alt eller en del av et gen) innpodes i posisjonen i den riktige orientering og riktige leseramme, kan et sammensmeltet protein oppstå. Proteinet vil bestå av en amino-avsluttende del av B-laktamase etterfulgt av aminosyresekvensen for hvilken den innskutte DNA-sekvens koder

(L. Villa-Komaroff et al., supra). Hvis det innskutte DNA-segment omfatter en DI^A-sekvens inneholdende sitt eget ini-tieringssignal, og har en sekvens forut for dette med et terminerende signal i fase med B-laktamasesekvensen ,kan terminering og reinitiering finne sted ved det andre initie-ringssignal, og ét ikke-sammensmeltet, aktivt protein kan oppstå (A.C.Y. Chang et al., supra). For å sikre at DNA-

innskuddet beslektet med Hif-4c ble innskutt i den riktige leseramme for ekspresjon inne i Br-laktamasegenet, ble et sett... derivater av pBR322, nemlig pKT279, pKT280 og pKT287 , fremstilt (konstruert av K. Talmadge, personlig kommunikasjon 1979). "Hvert av disse derivater har en Pstl-posisjon lokalisert slik at et DNA-innskudd podet inn i denne posisjon, vil være i en annen leseramme i forhold til et innskudd ved Pstl-posisjonen for de andre derivater av settet (fig. 6). Derfor muliggjør settet innføring av DNA i B-laktamasegenet i alle tre leserammer. Det Pstl-utskårede innskudd fra Hif-2h ble fremstilt som beskrevet for fragmentet Hif-4c. Hif-2h Pst fragmentet (10 ng) ble blandet med Pstl-spaltet pBR322, pKT279, pKT280 eller pKT287 (10 ng i hvert tilfelle) i 20 ul 10 mM Tris-

HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM B-merkaptoetanol, 2 00 ug/ml gelatin og 0,1 mM ATP og inkubert med 0,1 enheter

T4 DNA-ligase i 16 t ved 10°C. De

resulterende rekombinante DNA-molekyler er betegnet Z-pBR322 (Pst)/HcIF-2h, Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h,Z-pKT280(Pst)/HcIF-2h og Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h. E. coli HB101. ble transformert med hver av disse rekombinante DNA-molekyler, og transf ormerte kolonier ble utvalgt på tetracyklininneholdende agarplater, som tidligere beskrevet. Da tetracyklinresistente kloner av transformerte bakterier også kan inneholde den recykliserte vektor, ble bakteriekoloniene fra hvert sett dyrket på "Milli-32

pore" filtere og kolonier hybridisert til P-merkede Hif-

4c fragmenter ble identifisert og valgt ut, som ovenfor beskrevet. Disse stammer ble betegnet som følger,

E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h-AHll til (-AH3),

E. coli HB101 (Z-pKT279 (Pst)/HcIF-2h-AHl)_ til (-AH8),

E. coli HB101 (Z-PKT280fPst)/HcIF-2h-AHl) til (-AH8),

E. coli HB101 (Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AHl) til (-AH8),

Ekstrakter av noen av de ovenfor nevnte stammer såvel som av de av stammene Z-pBR322(Pst)/HcIF-SNl til 95 ble undersøkt -med hensyn til IFN-a aktivitet. Bakteriene ble dyrket i et tryptonmedium til stasjonær fase, oppsamlet, vasket med 1/20 vol. ( regnet på volumet på kulturen). 50 mM Tris-HCl (pH 8),

30 mM NaCl og frosset. Etter tining ble cellene resuc-rr-fart i volumet indikert i det etterfølgende av den tidligere buffer og lysozym ble tilsatt til 1 mg/ml. Etter 60 min. ved 0°C ble suspensjonene frosset (i et etanoltørt isbad) og tinet (ved 37°C> 5 ganger og sentrifugert i 10 min. ved 12 000 omdr./min. i en "GSA Sorvall" rotor.

I visse tilfeller ble en del av supernatanten (S30) ytterligere sentrifugert ved 100 000 x g i en "Type 65 Spinco" rotor,og supernatantene (S100) gjenvunnet. Slike super-natanter ble undersøkt med hensyn til IFN-a aktivitet bestemt ved nedsettelse av den cytopatiske effekt (Eksperiment 1). Koloniene som viste en positiv respons i forsøk 1 ble igjen undersøkt såvel som 49 kloner fra settet Z-pBR322/ HcIF-SN-1 til SN-95 som beskrevet tidligere, ved en mindre fortynning (eksperiment 2)_.

Noen av de mest aktive produsenter fra de ovenfor nevnte produkter ble undersøkt mere detaljert. Kulturer ble dyrket til sen "logfase" OD650 ca" °'9^ og cellene lysert som angitt ovenfor i 1/5 0 av kulturvolumet. De følgende aktiviteter ble funnet under anvendelse av Z-pBR322 (Pst)./HcIF-

SN32 som negativ kontroll:

Det må forstås at det aktuelle protein produsert av disse stammer ikke er analysert strukturelt for å bestemme hvorvidt det er produsert sammensmeltet til aminosyrer som ikke er beslektet med IFN,eller med alt eller en del av IFN's signalsekvens. Imidlertid, uansett hvilket protein som er fremstilt, så utviser det en immunologisk og biologisk aktivitet som IFN. Derfor er proteinet som uttrykt nyttig. Viktigere

er at proteinets aktivitet demonstrerer at DNA-sekvensen som koder for det,er en DNA-sekvens beslektet med HuIFN-a. Det er derfor innen teknikkens stand å anvende denne DNA-sekvens, slik som vist,for å velge andre lignende HuIFN-a beslektede DNA-sekvenser og for å gi en basis for andre konstruksjoner som vil uttrykke moden interferon eller andre varianter derav.eller som vil forbedre utbyttet av det spesielle protein som er uttrykt.

Produksjonsnivået for et protein styres av to hovedfaktorer: antall kopier av dets gen inne i cellen og effektiviteten med hvilken disse genkopier er transkribert og translatert. Effektiviteten av transkripsjonen og translasjonen (som sammen utgjør ekspresjon), er på sin side avhengig av nukleotidsekvensene som normalt forekommer foran den ønskede kodesekvens.

Disse nukleotidsekvenser eller ekspresjonskontrollsekvenser definerer blant annet lokaliseringen ved hvilken RNA-polymerase som innvirker til å initiere transkripsjon (promotorsek-vensen),og til hvilke, ribosomer som bindes og innvirker med mRNA (produktet av transkripsjonen) for å initiere translasjon. Ikke alle slike ekspresjonskontrollsekvenser virker med den samme effektivitet. Det er således fordelaktig å separere de spesifikke kodesekvenser for det ønskede protein fra deres tilstøtende nukleotidsekvenser og sammensmelte dem, i steden for til andre kjente ekspresjonskontrollsekvenser, for således å fremme høye ekspresjonsnivåer.

Når dette er oppnådd,kan det nykonstruerte DNA-fragment inn-skytes i et multikopiplasmid eller et bakteriofagderivat for å øke antallet av genekopier inne i cellen og derved ytterligere forbedre utbyttet av det uttrykte protein.

Flere ekspresjonskontrollsekvenser kan anvendes som beskrevet ovenfor. Disse innebefatter operator, promotor og ribosom-binding og påvirkningssekvensene (innebefattende sekvenser såsom Shine-Dalgarno sekvensene) for laktose operon av

E. coli ("lac systemet"),de tilsvarende sekvenser for tryp-tofansyntetase-systemet av E. coli ("trp systemet"), hovedoperator og promotorområdene for fag ^-(0LPL 0<3 °rpr) ' kont- - rollområdet for fag fd kappeprotein, eller andre sekvenser som kontrollerer ekspresjonen av gener hos prokaryote. eller eukarybte celler og deres vira. Derfor,for å forbedre produksjonen av spesielle polypeptider i en passende vert,kan genet som koder for dette polypeptid fremstilles som tidligere, fjernes fra et rekombinant DNA-molekyl inneholdende dette og igjen innføres i et rekombinant DNA-molekyl nærmere dens tidligere ekspresjonskontrollsekvens eller under kontroll av en av de ovenfor nevnte ekspresjonskontrollsekvenser . Slike fremgangsmåter er kjent fra teknikkens stand.

Ytterligere forøkelse i cellulært utbytte av de ønskede produkter er avhengig av forøkelsen i antallet gener som kan utnyttes i cellen. Dette oppnås, eksempelvis, ved innføring av rekombinante DNA-molekyler konstruert som tidli-

gere beskrevet, i den tempererte bakteriofag A(NM989), enklest ved behandling av plasmidet med et restriksjonsenzym til å gi et lineært molekyl fsom deretter blandes med en fragmentert fag A vektor (eksempelvis typen beskrevet av N. E. Murray et al., "Lambdoid Phages That Simplify The Re-covery Of In Vitro Recombinants", Molec. gen. Genet. 150, sidene 53-61 (1977) og N. E. Murray et al., "Molecular Cloning Of The DNA Ligase Gene From Bacteriophage T4", J. Mol. Biol., 132, sidene 493-505 (1979).) og det rekombinante DNA-molekyl fremstilt ved inkubering med DNA-ligase. Den ønskede rekombinante fag velges som tidligere,og anvendes for å lysogenisere en vert av stammen E. coli.

Særlig nyttige A vektorer inneholder en temperaturføl-

som mutant av represjonsgenet cl og suppressible mutasjoner i genet S, produktet av hvilket er nødvendig for lyse av vertscellen og genet E, produktet av hvilket er hovedkapsid-proteinet for viruset. Med dette system dyrkes de lysogene celler ved 32°C og oppvarmes deretter til 45°C for a indu-sere avkutning av profagen. Forlenget vekst ved 37°C fører

til høye produksjonsnivåer av proteinet som bibeholdes inne i cellene da disse ikke er lysert av faggenproduktene på normal måte,og da faggeninnskuddene ikke er enkapsidert vil det forbli tilgjengelig for ytterligere transkripsjon. Kun-stig lyse av cellene vil derved frigjøre produktet i høyt utbytte.

I et første forsøk på å øke utbyttet av polypeptidet som utviser en biologisk eller immunologisk aktivitet som humanleukocyttinterferon, fremstilt fra verter transformert med Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35 ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, så ble et restriksjonskart for DNA-innskuddet for hybridet bestemt. Denne kartlegning viste at sammenlignet med Hif-2h,så manglet Hif-SN35 en Pstl-posisjon flankerende 3' enden av sekvensen, en del av signalsekvensen var borte (opptil og innebefattende kodon 7) og Avall-posisjonen i signalsekvensen var erstattet med en Bspl posisjon. Derfor er Hif-SN35 trolig en polymer eller arvelig variant av Hif-2h.

Plasmidet Hif-SN35 ble åpnet med Pstl og resulterende DNA-bånd avkuttet (chewed back) ved begge ender under anvendelse av standard prosedyre., LAC-Alu fragmentet (infra) ble innsatt deri og plasmidet på hytt lukket. Den aktuelle struktur av det modifiserte plasmid, identifisert som Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN3 5-AHL6, og aminosyresekvensen ved aminoterminalenden av proteinet produsert i E. coli,er bestemt. Nukleotidsekvensen av denne konstruksjon viser at LAC-Alu fragmentet var knyttet til en aminosyre borte fra den første aminosyre av IFN-al (SN3 5). Denne aminosekvens for aminoterminaldelen av proteinet uttrykt i E. coli viste at et sammensmeltet protein var fremstilt med seks aminosyrer sammensmeltet til IFN-ai (SN35) sekvensen. Imidlertid fremstilte verter transformert med det modifiserte plasmid, ca. 100 ganger mere polypeptid som utviste den biologiske eller immunologiske aktivitet for humanleukocyttinterferon , sammenlignet med verter transformert med umodifisert Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35.

Under henvisning til figur 25 så vises et annet forsøk på å forbedre utbyttet av polypeptidet som oppviser en immunologisk eller biologisk aktivitet for human leukocyttinterferon, fremstilt av verter transformert med Z-pBR322-(Pst)/HCIF-SN35 (SN35 i figur 25). Hybridplasmidet ble spaltet under anvendelse av standard fremgangsmåter med Bspl ( en gave fra Dr. Kiss). Etter varmeinaktivering (65°C, 30 min.) av restriksjonsenzymet, ble blandingen justert til 50 mM Tris-HCl (pH 8) og oppvarmet (37°C, 30 min.). Etter ekstraksjon med fenol og eter ble det største, nemlig alcDNA-fragmentet, isolert på lavtemperaturgelende agarose (0,8 %)

og Hindlll-linkere festet. Det modifiserte fragment ble forenet med Hindlll-spaltet plasmid HS-pBR322 (Eco)/lacUV5-150 ("LAC-150")<*> (en gave fra H. Schaller) ved å smelte fragmentinneholdende gelstykker (ca. 20 ul hver) ved 65°C, avkjøling til 37°C og tilsette 20 enheter/ul T4 DNA-ligase. Etter 16 t ved 15°C fant ligering.sted i den størknede

gel (H. Lehrach, (personlig meddelelse 1980). Et tiendedels volum 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 ble tilsatt til prøven, og den ble oppvarmet i 5 min. ved 65°C og avkjølt til 37°C. Prøvene ble deretter anvendt for a transformere en Ca ^-behandlet E. coli HB101, inkubert ved 0°C i 20 min., oppvarmet ved 42°C i 1 min. og i 10 min. ved 20°C. Etter tilsetning av 1 mol tryptonmedium ble prøvene inkubert i 60 min. ved 37°C og plassert på agarplater inneholdende ampicillin. Plasmid DNA ble separert fra disse kulturer som tidligere angitt, og hybridplasmidet inneholdende IFN-al-innskuddet ved dets 5'ende tilstøtende LAC-fragmenter, ble identifisert ved restriksjohsanalyse. Plasmidet ble deretter spaltet med EcoRI ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter og behandlet ved eksonuklease BAL-31 (0,06

<+> Dette plasmid inneholder lac-promotoren HaeIII-202 bp-fragmentet (W. Gilbert et al., "Lactose Operator Sequences And The Action Of Lac Repressor" in Protein Ligand Interactions, H. Sund and G. Blauer, eds. (Berlin, Walter de Gruyter), sidene 193-206 og. K. Backman et al., "Maximizing Gene Expression On A Plasmid Using Recombination In Vitro", Cell, 13, sidene 65-71 (1978) flankert av en EcoRI-tilknytter ved dets 31 ende.

enheter/ml, 2-4 min. ved 30°C) for å fjerne den overhengende EcoRI-hale av LAC-fi-sgmen^et og for å avkorte det B-galaktosidase-kodende segment.

For å sikre at det behandlede plasmid inneholdt en fullstendig IFN-al-kodende sekvens,ble plasmidet spaltet med Bglll, under anvendelse av vanlige fremgangsmåter, opparbeidet som tidligere og det største fragment ble separert på agarosegel (0,8 %). Dette fragment ble deretter kombinert med et BspI- BglII-fragment fra Z-pBR322 (Pst)/HcIF-SN35, og det resulterende hybridplasmid anvendt for å transformere E. coli HB101 som .tidligere angitt. De transformerte kolonier ble skjermet for IFN-aktivitet,og et klon med et høyt nivå for IFN-aktivitet ble valgt ut. Dette klon ble betegnet E. coli HB101 (C8-IFN-al) og dets hybridplasmid C8-IFN-al.

DNA-sekvensanalyse av C8-IFN-al viste at kodesekvensen etterfølgende initiator-tripletteh bestemmer de første 7 aminosyrer av B-galaktosidase, en Pro-rest generert ved sammensmeltning, aminosyrene 16-23 av IFN-al-signalsekvensen og IFN-al (SN35)-sekvensen. E. coli minicellestammer (DS410) transformert med hybridplasmidet c8-IFN-al produserer ca. 50 millioner enheter IFN pr. liter eller ca. 2500 ganger mere polypeptid som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet tilsvarende den for HuIFN, sammenlignet med miniceller transformert med umodifisert Z-pBR322(Pst)/Hif-SN35. Aminosyresekvensen for polypeptidet produsert av plasmidet C8-IFN-al, bekrefter at produktet er et sammensmeltet protein med 7 aminosyrer fra B-galaktosidase, en aminosyre generert ved smeltning av aminosyrene 16-23 i IFN-al-signalsekvensen smeltet til IFN-al.

Ytterligere eksempler på forskjellige konstruksjoner for å forbedre proteinutbyttet i henhold til foreliggende oppfinnelse er diskutert i forbindelse med andre former for IFN-a (infra) .

EGENSKAPER AV INTERFERONAKTIVITET PRODUSERT VED E. COLI TRANSFORMERT MED HYBRIDPLASMIDER

1. IFN- a- aktivitetens følsomhet mot trypsin

50 ul prøver autentisk HuIFN-a (spesifikk aktivitet 1,2 x 10^ enheter/mg, 50U) og SlOO-rekstraktene beskrevet ovenfor av E. coli HB101 (Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AG6) ("Hif-287-6-ekstrakter") (200 enheter/ml, 10 enheter) og av E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35) ("Hif-35-ekstrakter") (1000 enheter/ml, 50 enheter) ble inkubert med forskjellige mengder trypsin, slik som indikert nedenfor, i 30 min. ved 37°C.

Da SlOO-ekstraktene har et høyere proteininnhold, hvilken HuIFN-a ikke har, ble en blanding av HuIFN-a og kontroll SlOO-ekstrakter Hif-32 undersøkt parallelt:

Følgelig er IFN-a fra ekstraktene følsomme for trypsin og er følgelig et protein.

2. Oppførsel ved kromatografi på " Sephadex G- 100" Ekstraktet Hif-35 (1 ml) og S100-ekstraktet av E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HCIF-SN32) ("Hif-32-ekstrakter") ble kromatografert på en 32-ml Sephadex G-100 kolonne ved 4°C i 50mM K-fosfatbuffer (pH 7,4). Cytokrom c (0,2 mg) ble tilsatt som en intern markør. Strømningshastigheten var 2 ml/ t og 1 ml's fraksjoner ble oppsamlet. Absorpsjonen ved 280 nm og 405 nm (cytokrom c), og IFN-a-aktiviteten ble bestemt. Som det fremgår av fig. 7 var IFN-a-aktiviteten for Hif-35-ekstr.-.ktene eluert før cytokrom c, med en k^-verdi på ca. 0,45. Derfor er den observerte molekylvekt for substan-sen mellom 20 000 og 30 000 (Molekylvekten bestemt ved nuk-leotidesekvensering og forutsatt ingen karboksyterminal "prosessing" er 19 388). Ingen aktivitet ble påvist for fraksjoner av kontrollekstraktet Hif-32. 3. Inhibiering av interferonaktiviteten for Hif-35 og Hif-287-6 ved hjelp av antistoff mot human leukocyttinterferon.

HuIFN-a (spesifikk aktivitet 1,2 x IO<6> IU/mg), og Hif-35/ Hif-287-6 S100-ekstraktene ble inkubert med forskjellige fortynninger av saueantiserum mot HuIFN-a (fremstilt av K. Cantell, 24. februar 1976, spesifikk aktivitet 450 000 enheter/ml) i 100 ul "Modified Eagles Medium" (MEM) med 10 % kalveserum i 30 min. ved 37°C hvoretter 45 ul ble undersøkt med hensyn til IFN-a-aktivitet ved nedsettelse av den cytopatiske effekt. (Antistoff i seg selv forårsaker ikke noen cytopatisk effekt).

For å vise at virkningen av antistoffet ikke skyldtes en uspesifisert effekt, så som en proteolytisk degradering, ble tilsvarende forsøk .utført med museinterferonsystemet:

Således, antistoff virksomme mot HuIFN-a inhiberes spesielt IFN-a-aktiviteten for polypeptider fremstilt i E. coli transformert med visse rekombinante DNA-molekyler inneholdende HcIF-2h DNA-sekvensen. Den tilsynelatende lave affini-tet for antistoffet overfor IFN-a produsert av E. coli kan muligens reflektere strukturelle forskjeller mellom den sistnevnte og naturlig HuIFN-a, eksempelvis fravær av karbo-hydratenhet, tilstedeværelsen av en signalsekvens eller sammensmeltning av to deler av B-laktamasesekvensen.

4. Nedsatt aktivitet av Hif- 35 og Hif- 287- 6 ekstrakter overfor museceller

Human CCL23-celler eller Mus L929-celler ble behandlet med

E. coli ekstrakter, HuIFN-a (fremstilt av K. Cantell, spesifikk aktivitet 1,2 x IO<6> enheter/mg) eller mus IF (N.I.H.-standard) ble smittet med virus (Mengo-virus når det gjaldt humancellene og VSV når det gjaldt muscellene) og IFN-a-aktiviteten bestemt ved nedsettelse av den cytopatiske effekt-bestemmelse.

Resultatene viser at Hif-35 og Hif-287-6-ekstrakter har en beskyttende virkning for humanceller og kun en liten effekt (~10 %) på museceller, hvilket er typisk for humant interferon .

5■ Effekt på visse cellefunksjoner

Ekstrakter fra E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/Hif-SN35-AHL6)

ble sammenlignet med autentisk IFN for dens effekt på visse cellefunksjoner. IFN-a fremstilt av E. coli utviser de følg-ende egenskaper som for naturlig IFN-a: (1) forsterker den naturlige drepeaktivitet for humane lymfocytter, (2) det forsterker antistoff--avhengig celleformidl-et cytotoksisitet, .(3) det undertrykker antigen- og mitogen-indusert leukocyttmigreringsinhibering og (4) det inhiberer vekst av IFN-følsomme Burkitt lymfomaceller. Disse egenskaper er indikative for E. coli syntetisert. IFN-al1 s aktivitet mot humantumorer og kreft. 6. Aktivitet av IFN- a uten amino- terminalsekvenser IFN-a uten amino-terninalsekvenser er også fremstilt i E.

coli og er vist å utvise aktivitet i overensstemmelse med IFN-aktivitet.

For å konstruere det passende rekombinante DNA-molekyl ble plasmid Hif-2H (supra) delvis spaltet med EcoRI og BamHI og fragmentet inneholdende IFN-al kodesekvensen separert på agarosegel og kombinert med den ikke-IFN-al-kodende sekvens erholdt fra en EcoRI/ BamHI fragmentering av plasmidet Hif-

SN35 som mangler en Pstl posisjon tilstøtende 31 enden av hybridinnskuddet, sammenlignet med Hif-2h (supra). Det erholdte plasmid ble deretter fragmentert med Pstl/ Bgll for å fjerne en del av aminoendedelen av den IFN-al-kodende sekvens.

I dets sted ble innskutt en serie IFN-al-fragmenter fremstilt ved spaltning av plasmidet Hif-2h med PvuII, behandling med Bal eksonuklease, tilknytning av Pstl-linkere og fragmentering med Bglll. De resulterende plasmider inneholdt således en serie IFN-al-kodesekvenser som manglet forskjellige deler av sine aminoterminale sekvenser. Et av disse (plasmid 2H-M8) ble spaltet med Pstl og dets nukleotidsekvens bestemt. Sekvensen viste at plasmidet 2H-M8 inneholdt flere nukleotider mellom Pst-posisjonen og den første kodon (CYS) av IFN-al. Derfor ble Pstl-spaltede plasmid 2H-M8 behandlet med T4-polynuklease/dATP, sl eksonuklease og spaltet med Sali. Denne prosedyre genererte en serie fragmenter, hvis IFN-al-kodesekvenser manglet deler av sin aminoterminal-ende. Disse fragmenter ble deretter plassert under LAC-kontroll ved operativt å knytte disse til GUA-LAC-fragmentet fremstilt fra plasmid Lac3V8 ved spaltning med EcoRI, behandling med eksonuklease Sl og spaltning med Sali■ De resulterende fragmenterende serier av plasmider hadde således IFN-al-kodesekvenser som manglet forskjellige deler av sine aminoterminalender knyttet i en "mot urviseren" retning via en AUG til et fragment inneholdende LAC-promotoren.

Visse av disse plasmider ble sekvensert. Et begynte ved .den femte aminosyre i IFN-a og et ved den tiende aminosyre i

IFN-al. I E. coli miniceller (DS410) produserte begge disse plasmider polypeptider som utviste IFN-aktivitet. Derfor er ikke alt av IFN-al-proteinet nødvendig for IFN-aktivitet.

IDENTIFISERING AV KLONER AV E. COLI INNEHOLDENDE REKOMBINANTE DNA-MOLEKYLER, HVIS DNA-INNSKUDD TVERRHYBRIDISERER SVAKT TIL INNSKUDDET I Hif-4c OG SOM HAR ET FORSKJELLIG RESTRIKSJ JOJ^Sj(AJRT_EJJN_J^ifj^

Sammenligning av de første 35 aminosyrer i autentisk lymfoblastoidinterferon (Zoon et al., supra, og M. Hunkapiller og L. Hood, supra) og sekvensen dedusert fra Hif-2h-fragmentet viste 9 forskjeller. I alle tilfeller skulle kodonene for de adskillende aminosyrer være relatert av "one base" for-andringer. Aminosyresammensetningene bestemt direkte for autentisk lymfoblastoid-interferon på den ene side og dedusert fra sekvensen av Hif-2h-fragmentet på den annen side, utviser også bemerkelsesverdige forskjeller med hensyn til deres innhold av Gly, Pro, Cys og Met. Disse forskjeller er for store til at de kan forklares ved polymorfisme. I steden reflekterer de trolig eksistensen av minst to ulike gener, fordi graden av avvik for de to proteiner (26 % rr.istilpasning) tilsvarer den eksempelvis mellom menne-ske- og sau-B-globulin (23 % mistilpasning). Følgelig ble klonene som utviste svak hybridisering til fragment Hif-4c, tidligere identifisert (supra), undersøkt og en klon E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206) ble identifisert.

Hybridplasmidet Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206 ("HcIF-II-206") i denne klon og dens DNA-innskudd "Hif-II-206-fragment" hybridiseres svakt til Hif-4c og Hif-2h-fragmentet. E. coli transformert med plasmid Hif-II-206 produserer polypeptider som utviser en biologisk eller immunologisk aktivitet som for HuIFN-cx. Hif-II-206-fragmentet har et restriksjonskart

som er forskjellig fra det bestemt for Hif-2h-fragmentet.

En sammenligning av de to restriksjonskart er vist i fig. 11. Igjen er den absolutte lokalisering av seksjonsposisjonene for Hif-II-206-fragmentet ikke bestemt ved restriksjonskart-legning alene. Imidlertid, sekvensering av nukleotidsekvensene for dette innskudd, under anvendelse av de ovenfor beskrevne prosedyrer, muliggjør en mer absolutt bestemmelse av disse lokaliseringer. Imidlertid, på grunn av forskjellen i restriksjonskartet for Hif-II-206-fragmentet sammenlignet med det for Hif-2h-fragmentet er det klart at inter-ferongenene for disse to innskudd har forskjellige nukleotidsekvenser .

Under henvisning til figurene 12-16 er vist nukleotidsekvenser for den innskutte DNA-sekvens — Hif-II-206-fragmentet — av kultur HcIF-G og for den innskutte DNA-sekvens — Hif-2h-fragmentet — av kultur ' HcIF-E (infra), tidligere bestemt og tilsvarende aminosyresekvenser for proteiner kodes av disse nukleotidsekvenser. Nukleotidsekvensene av Hif-II-206-fragmentet, nemlig Pst I-fragmentet (790bp) av plasmid DNA, isolert under anvendelse av fremgangsmåten ifølge metode B beskrevet av N. M. Wilkie et al., Nucl. Acids Res., 7, sidene 859-77 (1979) fra kultur HcIF-G, ble bestemt under anvendel-* se av standard prosedyren til A. M. Maxam og W. Gilbert, supra. Den anvendte sekvenseringsstrategi er vist i figur 17 .

Fragmentert: DNA (vanligvis ca. 10 ug) ble 5 'terminalmerket slik som beskrevet av N. Mantei et el., Gene, 10, sidene 1-10 (1980). Merkede fragmenter ble spaltet med et andre restriksjonsenzym, produktene separert ved elektroforese gjennom en 5 % 1ig polyakrylamidgel i Tris-borat-EDTA-buffer (A.

C. Peacock og C. W. Dingman. Bioch., 6, sidene 1818-27

(1967)), ekstrahert fra gelen og renset som beskrevet av W. Muller et al., J. Mol. Biol., 124, sidene 343-58 (1978).

Under henvisning til fig. 17 ble de forskjellige fragmenter for sekvensering fremstilt som følger: 25 og 26 — spaltning av Hif-II-206 med Pstl, merkning, spaltning med Bglll, isolering av et PstI*-Bg_lII-f ragment (257bp) ("25") og et PstI<*->BglII-fragment (279bp) ("26"),

21, 22 og 23 — spaltning av Hif-II-206 med PvuII, merkning, spaltning med Bglll, isolering av et PvuII*- BglII-fragment (88bp) ("21"), et PvuII<*->BglII-fragment (176bp) ("22") og et PvuI<*->BglII-fragment (214bp) ("23"),

11, 12, 13 og 14 — spaltning av Hif-II-206 med Bglll, merkning, spaltning med Pstl, isolering av et Bglll - Pstl-fragment (27 9bp) ("14") og en sam-.migrerende blanding av et BglII*- PstI-fragment og et BglII*- BglII*-fragment. Spaltning av blandingen med PvuII og isolasjon av et Bglll - Pstl-fragment (257bp) ("13") og et BglII*- PvuII-fragment (176bp)

("12") og et BglII<*->PvuII-fragment (88bp) ("11").

27L, 27U, 41, 43, 44 og 45 — spaltning av Hif-II-206 med HinfI, merkning, isolering av forløperfragmentene: Hinfl - Hinfl<*> (113bp) ("27P"), HinfI*- HinfI* (146bp) ("28P"), HinfI*- HinfI* (159bp) ("30P"), HinfI*- HinfI* (397bp) ("31P") og HinfI*- HinfI* (1522bp) ("32P"). Spaltning av 28P med MboII og isolering av et fragment Hinfl *-MboII (112bp)

("41"). Spaltning av 30P med MboII og isolering av et fragment HinfI*- MboII (126bp) ("43"). Spaltning av 31P med Pstl og isolering av et fragment HinfI*- Pstl (151bp) ("44"). Spaltning av 32P med Pstl og isolering av et fragment Hinfl - Pstl (139bp) ("45"). Båndseparasjon av 27P til å gi to bånd

("27U" og "27L").

Alle segmenter, bortsett fra 27U og 27L ble sekvensert på begge bånd og over restriksjonsposisjonene som tjente som utgangssteder for sekvensering, bortsett fra for Bglll-still-ingen ved posisjon 185.

Fra en c-rrjnenligning av aminosyresekvensene kodet for av de to innskudd er det åpenbart at Hif-II-206-fragmentet koder for et interferonlignende protein som inneholder en aminosyre mindre enn Hif-2h-fragmentet (aminosyre 44 (Asp) tilstede i Hif-2h mangler i Hif-II-206). Ytterligere 10 % av nukleotidposisjonene og 17 % av de avledede aminosyrerester i de to fragmenter er forskjellige.

I tillegg når man sammenligner de 35 aminosyrer bestemt for aminoterminalen for lymfoblastoidinterferon (K. C. Zoon et

al., Science, 207, sidene 527-28 (1980)), koder innskuddet Hi Hif-ii-206 for et protein som adskiller seg i 5 rester fra de 35 aminosyrerester bestemt av Zoon et al., supra. Derfor må det eksistere minst 3 forskjellige IFN-gener av leukocytt-typen (a-typen) nemlig Hif-2h-fragmentet, Hif-II-206-fragmentet og genbelegget for Zoon's IFN. I henhold til den nylig foreslåtte nomenklatur for interferon vil. i de etter-følgende proteiner kodet for av disse gener bli identifisert som følger:

Forskjellen mellom IFN-al og IFN-a2 reflekteres også i deres varierende aktiviteter på human CCL23 og storfefosternyre (BEK)-celler:

Derfor er IFN-al ca. 30 ganger mindre aktiv på humanceller enn IFN-a2. De er likevel ca. like aktive på storfeceller. Derfor kan IFN' er, i tillegg til sine vanlige anvendelse som antiviral- og antitumor- eller anticancermidler for mennesker, også være nyttige ved behandling av disse tilstander hos storfe. F.eks. kunne fremstilling av HuIFN-«*■ anvendes på en standard måte. (supra) ved behandling av FMDV og andre velkjente virusinfeksjoner hos storfe. Dette er mere spesielt tilfellet for IFN-al da dets aktivitet på storfeceller er ca. 20 ganger større enn dets aktivitet på humanceller.

Som følge av det forbedrede utbyttet som oppnås i tilfellet for IFN-al med konstruksjonen C8 (supra), ble en tilsvarende konstruksjon gjort for IFN-a2. Z-pBR322 (Pst) /Hit-n-206 ble spaltet fullstendig med Bspl og delvis med PvuII (ved Pl) (fig. 28) og 867 bp-fragmenter ble isolert fra en 6 %'ig polyakrylamidgel. Dette fragment ble deretter oppdelt til et 2590 bp PvuII-fragment av C8-IFN-al. (CB-IFN-al har tre PvuII-restriksjonsposisjoner (fig- 28). 2590 bp-fragmentene ligge1- Tvilom P, og Pj-) Det resulterende hybrid-plasmid ble anvendt for å transformere E. coli HB101 og klonene siktet for IFN-aktivitet. En klon utviste en høy aktivitet og ble valgt og betegnet med E. coli HB101 (C8-IFN-a2).

DNA-sekvensering av hybrid-plasmidet C8-IFN-a2 viste at det lik C8-IFN-al, hadde en kodesekvens etterfølgende initiator-triplebcen som bestemte de første 7 aminosyrer av B-galaktosidase, en Pro-rest generert ved smeltning av aminosyrene 16 til 23 av IFN-a2-signalsekvensen. Derfor er det igjen trolig at et sammensmeltet protein inneholdende IFN-a2 er uttrykt.

Miniceller transformert med dette plasmid ga 100-200 millioner enheter pr. 1 av IFN eller 20000-40000 ganger høyere utbytter for IFN-a2 enn miniceller transformert med umodifisert Z-pBR322(Pst)/Hif-II-206.

En sammenligning av de relative utbytter for C8-IFN-al

(~50 x IO<6> enheter/liter) og C8-IFN-a2 (~100-200 millioner enheter pr. liter) er ved første øyekast overraskende fordi

IFN-a2 er vist å være ca. 30 ganger mere aktiv enn IFN-al på humanceller (supra). Imidlertid, kvantitativ analyse av mengden av de to proteiner fremstilt fra minicellene, transformert med de to C8 plasmider viser at det i C8-IFN-al er fremstilt 5-6 ganger mere protein enn i C8-IFN-a2. Derfor er utbyttene målt på basis av IFN-aktivitet forskjøvet som følge av den meget større mengde protein som er fremstilt for tilfellet C0-IFN-al.

Under henvisning til fig. 26 er det vist en annen konstruksjon i et forsøk på å forbedre utbyttet av IFN-a2. Først ble det fremstilt et ekspressjonsplasmid inneholdende LAC-Alu- f ragmentet med restriksjon av den kjente lac-promoter med Alul og forlengelse av fragmentet slik som vist (for 1 endedel) i fig. 27 med EcoRI-linkere . De forlengede fragment ble innført i pBR322 ved EcoRI-posisjonen og et lite EcoRI- EcoRI-fragment ble fjernet fra konstruksjonen. Det resulterende plasmid betegnet 404 i fig. 26, ble spaltet med et Hindlll og FvuII for innføring av det IFN-tx2-inneholdende fragment. Dette IFN-a2-fragment ble fremstilt ved partiell Sau3A-fraqmenterinq av Z-pBR322 (Pst)/HcIF-II-206 ("206" i fig. 26), forlengelse av Sau3A-fragmentet med HindiII-tilknyttere (fig. 27) og spaltning med Bspl. Etter innføring av dette fragment inn i det HindiII- PvulI-spaltede plasmid 4 04 ble det resulterende plasmid fragmentert med Hindlll og EcoRI, behandlet med Sl-nuklease for å bringe LAC-promoteren nærmere IFN-a2-genet og religert. Denne konstruksjon identifisert som plasmid LAC-AUG(a2)/ har IFN-a2 DNA-sekvensen under kontroll av LAC-promoteren. Videre følger IFN-ot2-sekv ensen umiddelbart etter den initierende AUG-kodon for denne promotor (se fig. 27). Derfor vil minst en del av IFN fremstilt.av disse plasmider være moden IFN (eksempelvis IFN uten noen aminosyrer fra signalsekvensen) '.

I miniceller var utbyttet av IFN-a2 erholdt med plasmid LAC-AUG(a2) 5-10 millioner enheter pr. liter.

En annen IFN-a2 konstruksjon basert på tilsvarende tilknyt-ningsprinsipper er også fremstilt. Her ble penicillinase ekspresjonskontrollsekvensen for pBR322 forbundet via et AUG initiator-kodon til IFN-a2 genet fra HIF-II-206.<*>

Denne konstruksjon kunne mest effektivt gjøres ved en partiell oppløsning av pBR322 med MboII, behandling med Sl, festing av EcoRI-tilknyttere som tidligere angitt og gjeninnføre fragmentet i EcoRI-posisjonen for pBR322 og utelate en EcoRI-posisjon. Det resulterende plasmid ("B-lac-AUG-plasmid") kunne deretter kombineres med en Sl behandlet (mildt) Hindlll tilknytter-Bspl fragment av 206, som tid-, ligere beskrevet. Etter spaltning med EcoRI og behandling med Sl og fosfatase isoleres ekspresjons-plasmidet 3-lac-AUG(a2).

Konstruksjonen med andre gener kunne utføres på samme måte ved å utnytte det konstruerte B-lac-AUG-plasmid for innføring av andre gener eller konstruksjoner eller mere foretrukket ved å anvende Sau3A-posisjonen i selve B-lac-AUG(a2) plasmidet.

Dette plasmid, betegnet som B-lac-AUG(a2\ muliggjør, når dette anvendes for å transformere vertsceller, produksjon av IFN-ct2 uten fusjon til andre proteinsekvenser. I miniceller er utb<y>tter på 50-100 millioner enheter pr. liter observert. Dette plasrr.id uct«l^». foretrukne plasmid for ar^cMelse i henhold til foreliggende oppfinnelse. Det er også foretrukket for anvendelse med andre IFN-a gener som er vist i foreliggende beskrivelse. Den foretrukne vert i henhold til oppfinnelsen er E. coli D34I0 (ara azide TonA lac y Tsx min a min b galAxyl step R). Denne stamme er deponert sammen med en prøve av det foretrukne plasmid p-lac-AUG(a2) som HcIF-K.

Andre konstruksjoner hvori anvendes forskjellige promoter-sekvenser, ribosombindingsposisjoner, Shine-Dalgarnosek-venser og DNA-sekvenser mellom promoteren og AUG initiator-kodonet og under anvendelse av forskjellige IFN-a gener vist ■'heri, kan også konstrueres under anvendelse av tilsvarende fremgangsmåteprinsipper.

HYBRIDMOLEKYLER AV IFN- al OG IFN- a2

Et antall hybridmolekyler av IFN-al og IFN-a2 er konstruert. Overraskende utviser disse hybridkonstruksjoner kvantitative forskjellige egenskaper og aktiviteter sammenlignet med hver av deres opphav nemlig IFN-al eller IFN-a2.

Under henvisning til fig.28 er det vist skjematisk konstruksjon av fire av disse hybridmolekyler. For letthets skyld er disse hybridmolekyler betegnet som plasmidene I, II, III og IV. I disse konstruksjoner ble spalting med rest-riks j onsenzymer (erholdt fra Biolabs, bortsett fra Bspl, en gave fra Dr. Kiss) utført i det vesentlige slik som an-befalt av leverandørene. Delvis DNA-spaltning ble utført med nedsatte enzymmengder. Etter varme-inaktivering (65°C, 30 min) av restriksjonsenzymet- ble prøvene justert til 50 mM Tris-HCl (pH 8) og om nødvendig med kalvetarm alkalisk fosfatase (1 vol pr. ug DNA) tilsatt. Etter 30 min ved 37°C ble prøvene ekstrahert med fenol og eter. I de fleste tilfeller ble DNA-fragmentene separert på lav-temperatur gelende agarose (0,8 %). For ligering ble fragmentinneholdende gelstykker (hver på ca. 2 0 ul) smeltet ved 65"C, avkjølt til 37°C og tilsatt 20 enheter pr. ul T4

DNA-ligase. Blandingen ble holdt ved 15°C i 16 h og ligering fcuiL sueu i den størknede gel (H. Lehrach, personlig meddelelse 1980). Et tiendedels vol 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 ble tilsatt, og prøven oppvarmet i 5 min. ved 65°C og deretter avkjølt til 37°C.

+2

Prøvene ble deretter tilsatt til Ca - behandlede miniceller, inkubert ved 0°C vi 20 min, oppvarmet i 1 min. ved 4 2°C og 10 min. ved 20°C og 1 ml tryptonmedium ble tilsatt. Etter inkubering i 60 min. ved 37°C ble kulturene påført agarplater inneholdende egnede antibiotika. Alle plasmidene ble karakterisert ved nukleotidsekvensanalyse over forenin-gen i IFN-sekvensen.

Hybridmolekyl I, et a-1( PvuII)a-2 hybrid, ble konstruert ved partiell spaltning av C8-IFN-al (supra) (C8-al i fig. 28) med P<y>uII, def osf orylert, spaltet med Pstl og P_stl-PvuII (P2 ) 1346 bp fragment isolert. Dette fragment ble ligert til et 2135 bp Pstl(a)-PvuII(P2) fragment fremstilt ved total spaltning av C8-IFN-a2 (supra) (C8-0.2 i fig. 28) med PvuII og delvis spalting med Pstl.

Hybridmolekyl II, et a-1( Bglll)a-2 hybrid, ble konstruert ved å spalte hybridmolekyl. I med Bglll. Etter defosfor-ylering ble det større Bglll fragment isolert og ligert til det mindre Bglll fragment av C8-IFN-a2. Etter kloning ble hybridplasmidet med det mindre Bglll fragment i den riktige orientering identifisert ved restriksjonsanalyse.

Hybridmolekyl III, et a-2( PvuII)a-1 hybrid, ble konstruert ved delvis spaltning av C8-IFN-al med PvuII, defosforyler-ing, spaltning med Aval og isolering av 1686 bp PvuIl(P.-,)-Aval og 3233 bp PvuTI(P^)-Aval fragmentene. Disse fragmenter ble deretter ligert til 300 bp PvuII( P^)- PvuII(P2) fragmentet i HcIF-II-206 (supra) (SN206 i fig. 28), og plasmidet inneholdende det mindre PvuII fragment ble identifisert ved å undersøke transformerte E. coli stammer for IFN-a aktivitet.

Hybridmolekylet IV, et a-2(Bglll)a-1 hybrid, ble konstruert ved å spalte C8-IFN-al med Bglll og Aval og 177 6 bp fragmentet isolert. Dette fragment ble deretter ligert til 3543 bp Bglll- Aval fragmentet i hybridmolekyl III.

De biologiske aktiviteter for de forskjellig interferontyper i forhold til hverandre ble også bestemt. Kulturer av miniceller (DS410), transformerte med de forskjellige plasmider, ble dyrket og bakteriene oppsamlet ved sentrifugering, vasket med PBS, suspendert i PBS (ca. 1/20 av det originale volum), inkubert i 60 min. ved 0°C med 1 mg/ml lysozym, 10 mM EDTA, fryse-tint 4 ganger, skjærbehandlet ved gjennom-føring 5 ganger gjennom en injeksjonssprøyte og adskilt ved sentrifugering.

Aktivitetene overfor human, mus, marsvin og storfeceller var som følger:

Overraskende utviser alle interferonene den tilnærmet samme aktivitet overfor kvegceller mens IFN-al og de to hybrid IFN'er (I og II) som har de samme aminoterminalgrupper av IFN-al,utviser 10 til 1000 ganger lavere aktivitet på humanceller enn IFN-a2 og de to hybrid IFN1 er (III og IV) som inneholder aminoterminalgruppene av IFN-a2. Det er ennå mere overraskende at de to hybrid IFN'er (I og II) med aminoterminaldelen av IFN-al utviser mere enn 10 ganger lavere aktivitet på humanceller enn IFN-al i seg selv. Likevel utviser en av hybridene (III), med aminoterminaldelen av IFN-a2, omtrent den samme aktivitet på humanceller som IFN-a2.

IDENTIFISERING AV KROMOSOMALGENER FOR IFN- g

En samling av hybridfag avledet fra menneskefoster kromosomal DNA som var generert ved delvis spaltning med Haelll og Alul og forenet med EcoRI linkere .. A-Charon 4A armer, er fremstilt av R. M. Lawn et al., Cell, 15, sidene 1157-74

(1978). Denne genbank ble skjermet ved en "in situ" fremgangsmåte (W. D. Benton og R. W. Davis, Science, 196, sidene 180-82 (1977); T. Maniatis et al., Cell, 15, sidene 687-701

32

(1978)) under anvendelse som "sonde" det P-merkede IFN-al cDNA innskudd fjernet fra pBR322(Pst)/Hif-2h. Seksten hybridiseringspositive fagkloner ble isolert fra 240 000 plater ved gjentatte platerensninger (T. Maniatis et al., supra). Ti av hybridfag DNA-preparåtene ble spaltet med henholdsvis Hindlll, Tad, Hhal, BamHI, EcoRI og Bglll, og fragmentene separert ved elektroforese på en agarosegel, overført til en "Millipore" membran (E. M. Southern, J. Mol. Biol., 98, sidene 503-17 (1975)) og hybridisert med <32>P-merket Hif-2h cDNA innskudd. Fig. 18 oppsummerer resultatene i form av partielle restriksjonskart og forskjellige tabeller. Som vist ble det for hvert hybridfag-DNA-preparat etablert minst noen få karakteristiske restriksjonsposisjoner og om-råd (er) som hybridiserer til den adskilte IFN-al gen "sonde"

(sort pil).*

Det skraverte området på chr-16 i figurene 18 og 24 representerer en sekvens som hybridiserer

svakt til Hif-2h cDNA, men som ikke utviste stor R-"looping").

Under henvisning til figurene 18 og 24 kan det sees at klonene chr-3 og chr-26 kan representere DNA-segmenter som overlapper meget fordi de har flere EcoRI og

Hindlll fragmenter felles. I tillegg kan den hybridiserende del av chr-1 og en av de hybridiserende deler av chr-10 være de samme fordi HindiII- HindIII og EcoRI- EcoRI fragmentene som hybridiserer med Hif-2h "sonden" har den samme lengde (henholdsvis 3,2kb og 0,95kb). Det synes også som om den "høyre hånd" hybridiserende del av chr-16 (merket "r" i fig.

18)kan være identisk med den hybridiserende del av chr-35, selv om den er orientert i motsatt retning, idet hver av de to kloner gir et l,4kb Bglll-Bglll fragment og et 2kb EcoRI-EcoRI fragment som hybridiserer med Hif-2h cDNA "sonden".

Det er derfor meget trolig at chr-16 og chr-35 innskuddene overlapper.

Følgelig synes det som om de 13. hybridiserende deler av de

11 hybridkromosoma1 DNA'er faller inn i ikke mindre enn 10 distinkte klasser — chr-1, chr-3, chr-12, chr-13, chr-16 (venstre hånd, merket "1" i fig. 18) chr-26, chr-30, chr-35, chr-19 og chr-27.

Under henvisning til fig. 24 er vist overlappingen av chr-1, chr-3, chr-10 og chr-26 og den for chr-16 og chr-35.

De ovenfor gitte data indikerer at genomet for et enkelt menneske.ikke inneholder mindre enn 10 forskjellige DNA-sekvenser som tverrhybridiserer til Hif-2h. Denne konklu-sjon forsterkes ved det faktum at andelen av Hif-2h beslektede sekvenser påvist i klonebanken er ca. 1 i 16000. Antas det en verdi på 3 x 10 9bp for det haploide humangenom er den forventede verdi for en enkelt genkopi' med en gjennomsnittlig DNA-fragmentstørrelse på 16kb (den midlere verdi for de undersøkte kloner) ca. 1:190000. Derfor er frek-vensen for Hif-2h beslektede fragmenter 12 ganger høyere enn det som er forventet for et enkelt gen.

Ved sammenligning av disse data, når Lawn et al (supra) skjermet 300000 plater fra den samme genbank - med en B-globulin cDNA-sonde, ble kun 2 positive kloner identifisert,idet den forventede verdi er 1,6:300000.

Derfor kan det være 10-15 distinkte kromosomale DNA-segmenter i humångenomet som tverrhybridiserer til Hif-2h fragmentet eller IFN-alcDNA.

YTTERLIGERE KARAKTERISERING AV Hif- chr3 5

Kun som illustrasjon ble hybridiseringssekvensen av chr-35 ("Hif-chr 35") ytterligere karakterisert. Det må forstås at hybridiseringsdelene av tidligere beskrevne kromosomalhyb-ridfager kunne karakteriseres og håndteres på samme måte.

Hybridiseringsdelen av chr-35 ("Hif-chr35") (og det høyre segment av Hif-chrl6 til hvilket det meget trolig er identisk, supra) er den eneste hybridiserende kromosomal DNA-del av en Bglll-posisjon. Da IFN-al og IFN-a2 cDNA1 er har henholdsvis 1 og 2 Bglll-posisjoner innen deres kodende sekvenser, så synes det trolig som om Hif-chr35 er et motstykke til en av de to tidligere klonede interferongener. Hif-chr 35's sterke hybridisering til 3' terminal Hif-2h cDNA-fragmentet (inneholdende kun det 3' ikke-kodende område) sammenlignet med den svakere hybridisering for de andre kromosomale DNA'er til denne "sonde',' underbygger sannsynligheten av korrespondanse mellom Hif-chr35 og Hif-2h (f. Kafatos et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA, 74, sidene 5618-22 (1977)).

For ytterligere å analysere Hif-chr35 fragmentet ble et Hindlll- BamHI fragment spaltet fra chr-3 5. Dette fragment (3,4kb) inneholdt den hybridiserende del ("Hif-chr35") av chr-35. Dette fragment ble subklonet inn i Pstl -posisjonen av pBR322 under anvendelse av de velkjente dC-dG vedhengnings-prosedyrer (L. Villa-Komaroff et al., supra) og E. coli HB101 ble transformert med det erholdte rekombinante DNA-molekyl, under anvendelse av velkjente fremgangsmåter (eksempelvis S. Nagata et al., Nature, 284, sidene 316-20 (1980)).

Kloner av disse transformanter ble skjermet ved in situ koloni-hybridisering (D. Hanahan og M. Meselson, Gene, 10, sidene

3 2

63-67 (1980)) med det P-merkede Hif-2h fragment (supra) og plasmid DNA, Z-pBR322 (Pst)/HchrI?-35HB "HchrIF-35HB" ble separert fra positive kloner (N. M. Wilkie et al., Nucleic Acids Res., 7, sidene 859-77 (1979); Metode B). Orienteringen av hybridinnskuddet "HchrIF-35HB fragmentet" i plasmidet i forhold til B-laktamasegenet av pBR322 ble bestemt ved EcoRI spaltning og størrelsesbestemmelse av de erholdte fragmenter. Innskuddet, orientert slik at det falt sammen med B-laktamase,ble betegnet med a og den motsatte orientering med B.

Kulturer av disse positive klonene ble dyrket til en observert OD650 = ^'^ °9 bakteriene oppsamlet og lysert ved lysozym-fryse-tine-metoden beskrevet av S. Nagata et al., supra. Syv av de undersøkte 10 kloner viste IFN-a aktivitet på 75-500 enheter/g celler bestemt ved nedsettelse .av den cytopatiske effekt.

DNA-innskuddet i en av disse 7 IFN-produserende kloner, nemlig E. coli HB 101 (Z-pBR322 (Pst)/HchrIF-35HBa), ble ytterligere karakterisert ved restriksjonsanalyse og bestemmelse av nukleotidsekvensen. ■ Plasmid DNA - (HchrIF-35HBa) ble fremstilt fra klonen som tidligere beskrevet og restriksjonsposisjoner bestemt ved Smith-Birnstiel kartlegning (H. O. Smith og M. L. Birnstiel, Nucl. Acids Res., 3, sidene 2387-98 (1976)); idet HchrIF-35HBa ble spaltet med EcoRI, merket ved 5' terminalen og spaltet med Bglll (og Pstl for å fjerne uønskede fragmenter på ca. lkb).

l,04kb EcoRI- Bglll (3<*> proximal) og 0,96kb EcoRI- Bglll (51 proximal) fragmenter ble isolert ved agarosegelelektroforese som beskrevet av A. C. Peacock og C. W. Dingman, Biochemis-try, 6, sidene 1818-27 (1967)). Begge fragmenter ble delvis spaltet med henholdsvis Hinfi, Bspl og MboII og produktene separert på' en 1 % agarosegel i. triacetatjguffer (pH 7,8) inneholdende 1 pg/ ml etidiumbromid. Etter farging ble de radioaktive bånd visualisert ved autoradiografi. BstNI og HgiAI-posisjonene ble bestemt på tilsvarende måte for l,04kb (3' proksimal) fragmentet. Resultatene av denne analyse er vist i fig. 19.

For nukleotidsekvens-bestemmelse ble HchrIF-35HBa spaltet med forskjellige restriksjonsenzymer og produktene separert ved elektroforese igjennom en 5 % ig polyakrylamidgel i Tris-borat-EDTA- buffer (A. C. Peacock og C. W. Dingman, supra) og ekstrahert fra gelen og renset slik som beskrevet av W. Muller et al., J. Mol. Biol., 124, sidene 343-58

(1978) .

Den anvendte sekvenseringsstrategi er vist i fig. 19 og kan

beskrives som følger:

I og 2, spaltning av HchrIF-35HBct med Bglll, merkning, spaltning med EcoRI og Pstl og isolering av et Bglll - EcoRI-fragment (940bp) ("1") og et BglII<*->EcoRI (360bp) ("2"), 3 og 4, — spaltning av HchrIF-35HBa med EcoRI, merkning, spaltning med Bspl og isolering av et EcoRI -Bspl-fragment (680bp) ("3") og et EcoRI*- BspI-fragment (880bp) ("4"), 5, 6, 7 og 8, — spaltning av HchrIF-35HBa med PvuII, merkning, spaltning med Bglll og EcoRI og isolering av PvuII ja-EcoRI-fragment (780bp) ("5"), et PvuII*- BglII (215bp) ("6"), et PvuII<*->BglTI-fragment (90bp) ("7"), og et PvuII<*->EcoRI-fragment (290bp) ("8"), 9 og 10, — spaltning av HchrIF-35HBa med EcoRI, isolering ved 1 % agarosegelelektroforese i Tris-borat EDTA-buffer av et 1300 bp EcoRI- EcoRI-fragment, videre spaltning med Hinfl og isolering av et HinfI- HinfI-fragment (450bp), og et HinfI- Hinfl-fragment (180bp).

Merkning av det større HinfI- HinfI-fragment og spaltning med MboII muliggjorde isolering av et HinfI*- MboII (190bp) ("9") . Merkning av det kortere HinfI- HinfI-fragment og spaltning med AvaII muliggjorde isolering av et Hinfl - Avall-fragment (150bp) ("10"),

II — spaltning av HchrIF-35HBcx med MboII, merkning, spaltning med Bglll, og isolering av et MboII - Bglll-fragment (465bp) ("11")

12, 13 og 14 — spaltning av HchrIF-35HBa med Bspl og Bglll, isolering ved agaroseelektroforese som ovenfor av et 1200bp Bspl- BglII-fragment og (a) spaltning med HgiAI, merkning, spaltning med MboII og isolering av et HgiAI - MboII-fragment (300bp) ("12") og et HgiAI<*->MboII-fragment (360bp) ("13"), eller (b) spaltning med BstNI, merkning, spaltning med EcoRI og isolering av et BstNI<*->EcoRI-fragment (380bp) ("14").

De forskjellige fragmenter ble sekvensert ved hjelp av Maxam-Gilbert-prosedyren (supra). Alle fragmenter ble sekvensert på begge bånd og over restriksjonsposisjonene som tjente som.utgangspunkt,for sekvensering.

En sammenligning av nukleotidsekvensene for det kodende området av HchrIF-35HBa og det for Hif-2h (kodeområde) (fig. 8-10, sammenlignet med figurene 20-23), viser at de er identiske. Spesielt er det overraskende at det ikke er noen in-dikasjon på tilstedeværelse av introner inne i kodesekvensen av .HchrIF-35HBa-£ragmentet, dvs. mellom HinfI-posisjonen og i det 5' ikke-kodende området og EcoRI-posisjonen i det 3' ikke-kodende området. Således kunne intet intron påvises i den kromosomale sekvens tilsvarende modent IFN-amRNA.

YTTERLIGERE KARAKTERISERING AV Hif- chr 26 OG Hif- chr 3

De geninneholdende segmenter av chr-3 og chr-26, som synes identiske med heteroduplexanalyse, adskiller seg i det minste med en Bglll-restriksj onsposisi on når de ble under-søkt med nukleotidsekvensering. Fem nukleotidforskjeller i 725 basepar ble funnet. Kun to av disse er tilstede i kodingssekvensene. Da ikke bare genene, men også i det minste 3,5 Kbp forutgående og 6,0 Kbp etter disse, dannet en perfekt heterodupleks og på grunn av den relativt lave sek-vensdivergens som omfatter kun to aminosyreforandringer, så synes det som om Hif-chr3 og Hif-chr26 tilsvarende former av det samme gen. Disse er betegnet IFN-a4a (Hif-chr3) og IFN-a4b (Hif-chr26). Nukleotidsekvensen og tilsvarende aminosyresekvens for IFN-a4b, bestemt ved de tidligere beskrevne konvensjonelle sekvenseringsteknikker, er vist i.figurene 29-32.

En sammenligning av figurene 29-32 med figurene 8-10, 12-16 og 20-23 viser at proteiner kodet ved hjelp av hver av disse sekvenser adskiller seg fra hverandre med ca. 15 % av sine residuer. Denne divergens er typisk for produkter av ikke - alleler som har divergert for 20 - 90 millioner år siden.

Ekspressjon av Hif- chr35 i museceller

Plasmid Z-pBR322(pst)/HchrIF-35HBa (supra) ble anvendt som kilde for et Hif-chr35-fragment for ekspressjon i museceller. Plasmidet ble spaltet med Pstl og behandlet med 5' eksonuklease for å fjerne 5<1->dG-halene. Dette fragment ble inn-ført i et 5'-dG-behengt Kpnl-fragment av et plasmid fremstilt ved å forene BamHI-BamHI-fragmenter fra pBR322 og polyoma DNA. Den resulterende vektor ble anvendt for å transformere muse-3T3-celler under anvendelse av kalsiumfos-fatteknikken (N. Mantei et al., Nature, 281 sidene 40-46

(1979)). Disse transformerte celler ble av bekvemmelighets-hensyn betegnet muse-3T3 (polynoma-Hif-chr35). Etter 20-40

t viste bestemmelser en IFN-a-aktivitet på 300 enheter/ml av IFN-a på humanceller og ca. 3000 enheter/ml IFN-a på storkvegceller.

Det bør naturligvis forstås at i nukleotidsekvensen beskrevet i figurene 8-10, 12-16, 20-23 og 29-32 ikke er tatt i betraktning eventuelle modifikasjoner i nukleotidsekvensene så som mutasjon, enkel eller multippel, basesubstitusjoner, innskudd, inversjoner eller delesjoner som allerede har funnet sted, eller som kan anvendes i det etterfølgende. Ytterligere, i sekvensen er det ikke tatt i betraktning en mulig substitusjon av andre kodoner for den samme aminosyre som et kodon avbildet i disse figurer. Det bør derfor forstås at anvendelse av slike modifiserte sekvenser som koder for polypeptider som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet for IFN-a også faller innenfor foreliggende oppfinnelse.

I tillegg må det forstås at i aminosyresekvensene avbildet

i figurene 8-10, 12-16, 20-23 og 29-32 ikke er tatt i betraktning eventuelle modifikasjoner i polypeptidene forårsaket av deres påvirkning av in vivo- eller in vitro- midler, f.eks. in vivo-glykosyleringsenzymer.

FREMSTILLING I BAKTERIEVERTER AV POLYPEPTIDER SOM UTVISER EN IMMUNOLOGISK ELLER BIOLOGISK AKTIVITET SOM FOR INTERFERON

Da bestemmelsen av nedsettelse av den cytopatiske effekt

(W. E. Stewart II og S. E. Sulkin, S. E. Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 123, sidene 650-53 (1966)) kan påvise uhyre små mengder IFN, nemlig mindre,en ett aktivt molekyl pr. bakter-iecelle, ble lysater av E. coli HB101 infisert med t.i. hybrid A, fager som tidligere beskrevet, og undersøkt med hensyn til tilstedeværelse av IFN. Sju av de elleve fager (alle unntatt chr-10, chr-12, chr-19 og chr-27) ga lysater inneholdende IFN-aktivitet i området 3 til 50 enheter/ml. For tilfellet chr-10 og chr-12, uttrykte hybridisering (til Hif-2h) av HindiII- HindiII eller EcoRi- EcoRI-fragmenter, subklonet inn i Pstl-posisjonen av pBR322, som tidligere beskrevet, IFN-i%-aktivitet i E. coli.

Da E. coli er antatt ikke å være i stand til å spleise mRNA (0. Mercereau-Puijalon og P. Kourilsky, Nature, 279, sidene 647-49 (1979)), inneholder trolig ikke disse IFN-a-kromosomale gener introner i sitt kodende område.

AVSLUTTENDE KONKLUSJONER

Det er isolert et sett rekombinante DNA-molekyler inneholdende cDNA fremstilt fra poly(A) RNA fra Sendai-virusbehand-lede (induserte) humanleukocytter, hvor representative slike utviser de følgende egenskaper: (1) De hybridiserer til poly(A) RNA fra induserte, men ikke fra ikke- induserte humanleukocytter. (2) De hybridiserer til IFN-amRNA, slik som vist ved deres evne til å velge denne RNA fra en blanding av RNA'er, samt ved deres evne til å inhibere (reversibel) translasjon av interferon mRNA ved hybridarrestert translasjonsbestemmelse. (3) E. coli inneholdende visse medlemmer av settet, produserer en forbindelse med de følgende egenskaper.

(a) Det er følsomt for trypsin.

(b) Det utviser IFN-a-aktivitet i humancellesystemet og kun

liten aktivitet i musecellesystemet.

(c) Det har en molekylvekt i området 20 000 - 30 000 (19 388

basert på nukleotidsekvenseringen i figurene 8 - 10).

(d) IFN-a-aktiviteten er spesifikt inhibert av antistoff

mot humanleukocyttinterferon.

(4 ) DNA-innskuddene av hybridplasmider anvendt ifølge oppfinnelsen er tilgjengelige, i tillegg til deres tilgjengelighet for å velge IFN-amRNA fra en blanding av RNA'er for å velge IFN-. aDNA fra blandinger av forskjellige kilder innbefattende cDNA'er og fra hybrid-'f age -genbanker av kromosoma! DNA.

(5) Et antall forskjellige kromosomale gener for IFN-a eksisterer. Det er uventet at disse gener mangler introner og tillater direkte ekspresjon for interferon og interferonlignende polypeptider i passende verter. (6) Minst tre av nukleotidsekvensene for disse rekombinante DNA-molekyler er forskjellige og indikerer eksistens av minst 3 ulike gener for IFN-ot. (7) Proteinene kodet for av disse tre nukleotidsekvenser er for skjellige fra de 35 aminosyrer bestemt fra autentisk lymfoblastoidinterferon. (8) Hybridproteiner fremstilt for forskjellige kombinasjoner av IFN-a-gensegmenter, utviser kvantitative forskjellige egenskaper fra hverandre eller deres "opphav"-, og proteinene har ytterligere aminosyrer koblet til IFN-a( eller proteiner omfatter IFN-a uten en del av dens aminoterminale sekvens og utviserIFN-aktivitet.

Disse egenskaper viser at rekombinante DNA-molekyler beskrevet tidligere inneholder minst

en del av kodesekvensen for humanleukocyttinterferon, og at noen av disse plasmider fører til ekspresjon i E. coli for et polypeptid som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet tilsvarende den for humanleukocyttinterferon. Det bør også være åpenbart at de viste polypeptider kan være

fragmentert, modifisert eller omdannet til derivater, slik som velkjent innen proteinteknikken.

Mikroorganismer og rekombinante DNA-

molekyler fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte er eksemplifisert med kulturer deponert i kulturkolleksjonen i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, i Gottingen, Vest-tyskland 7. januar 1980 og identifisert som HcIP-A til E:

A: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-4c)

B: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h)

C: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35

D: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN42

E: E. coli HB101 (Z-pKT322(Pst)/HcIF-2h-AH6

Disse kulturer ble henholdsvis gitt registreringsnummerene DSM 1699-1703.

I tillegg er mikroorganismene og de rekombinante DNA-molekyler fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte eksemplifisert ved hjelp av kulturer deponert i kultursamlingen i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 27. mars

1980 og identifisert som HcIF-G til H og gitt henholdsvis ATCC registreringsnummerene 3 1633 og 31634:

G: E.coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206)

H: E.coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35-AHL6)

Andre mikroorganismer fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte er eksemplifisert ved kulturer deponert i kultursamlingen i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, i Gottingen, Vest-Tyskland 1. oktober 1980 og identifisert som HchrIF-A til J og gitt registreringsnummerene DSM 1914-1923:

A. subklonet Hindlll fragment av chr 3 i E. coli HB101,

B. subklonet EcoRI fragment av chr 12 i E. coli HB101,

C. subklonet Hindlll fragment av chr 12 i E. coli HB101,

D. subklonet EcoRI fragment av chr 13 i E. coli HB101,

E. subklonet EcoRI fragment av chr 23 i E. coli HB101,

F. subklonet Hindlll fragment av chr 23 i E. coli HB101,

G. subklonet EcoRI fragment av chr 26 i E. coli HB101,

H. subklonet Hindlll fragment av chr 26 i E. coli HB101,

I. subklonet Hindlll/ BamHI fragment av chr 35 i E. coli

HB101,

J. subklonet BamHI fragment av chr 35 i E. coli HB101.

Avslutningsvis er mikroorganismene fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte eksemplifisert med kulturer deponert i American TypeCulture Collection, Rockville, Maryland, 15. dese-mber 1980 og identifisert som HchrIF-K til HchrIF-Q og HcIF-1 til HcIF-K og gitt ATTC registreringsnumrene:

31760 HchrIF-K

31761 HchrIF-L

31762 HchrIF-M

31763 HchrIF-N

31764 HchrIF-0

31765 HchrlF-P

31766 HchrIF-Q

31767 HcIF-I

31768 HcIF-J

31769 HcIF-K,

henholdsvis:

K. subklonet Tac- Tac fragment av chr 23 i E. coli

HB101. L. subklonet Bglll-Bglll fragment av chr 10 1 i E. coli HB101. M. subklonet Hindlll- Hindlll fragment av chr 10r i E.

coli HB101.

N. subklonet Bg_lII-BgJ.II fragment av chr 26 i E. coli

HB101.

O. subklonet HindiII- HindiII fragment av chr 30 i E.

coli HB101.

P. subklonet Bglll- Tac fragment av chr 13 i E. coli

HB101.

Q. subklonet Bglll- Tac fragment av chr 16 1 i E. coli

HB101.

HcIF-I: E. coli DS410 (C8-IFN-a2)

HcIF-J: E. coli DS410 (LAC-AUG(a2))

HcIF-K: E. coli DS410 (S-Lac-AUG(a2))

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid av IFN-cx type, karakterisert ved å dyrke en vertsorganisme transformert med et rekombinant DNA molekyl som består av en DNA sekvens valgt fra gruppen omfattende: (a) DNA innskuddene Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h, Z-pBR322-(Pst)/HcIF-SN35, Z-pBR322(Pst/HcIF-SN42 og Z-pKT287(Pst )/-HcIF-2h-AH6, hvor DNA sekvensene til de rekombinante DNA molekyler i mikroorganismene er identifisert henholdsvis ved registreringsnummeret DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) 1700-1703, (b) DNA sekvenser som hybridiserer til ethvert av de foregående DNA innskudd og som koder for et polypeptid av IFN-cx type, (c) DNA sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske kode i forhold til DNA sekvenser og innskudd angitt i (a) og (b) og som koder for et polypeptid av IFN-cx type.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA sekvensen (b) som hybridiserer til DNA innskudd (a) er valgt fra: (d) DNA innskuddene Z-pBR322(PST)/HcIF-II-206 og Z-pBR322(Pst/HcIF-SN35-AHL6, hvilke DNA innskudd er de rekombinante DNA molekyler som foreligger i mikroorganismene Identifisert ved henholdsvis registreringsnummeret ATCC (American Type Culture Collection) 31633-31634, (e) DNA sekvensene som hybridiserer til ethvert av de foregående DNA innskudd og som koder for et polypeptid av IFN-cx type, og (f) DNA sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske kode i forhold til DNA sekvensene og innskuddene definert i (d) og (e) og som koder for et polypeptid av IFN-cx type.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at DNA sekvens (b) eller (e) som hybridiserer til DNA innskudd (a) eller (d) er valgt fra: (g) Hindlll fragmentet av Hif-chr3, EcoRI fragmentet av Hif-chrl2, Hindlll fragmentet av Hif-chrl2, EcoRI fragmentet av Hif-chrl3, EcoRI fragmentet av Hif-chr23, Hindlll fragmentet av Hif-chr23, EcoRI fragmentet av Hif-chr26, Hindlll fragmentet av Hif-chr26, Hindlll-BamHI fragmentet av Hif-chr35, BamHi fragmentet av Hif-chr35, Tac-Tac fragmentet av Hif-chr23, Bglll- Bglll fragmentet av Hif-chrlO^, HindiII- HindiII fragmentet av Hif-chrlOr, Bglll-Bglll fragmentet av Hif-chr26, HindiII- HindiII fragmentet av Hif-chr30, Bglll- Tac fragmentet av Hif-chrl3, og Bglll-Tac fragmentet av Hif-chrl6^( hvilke hybridiserende deler er de DNA innskudd av de rekombinante DNA molekyler i mikroorganismene identifisert av registreringsnummeret DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) 1914-1923 og ATCC (American Type Culture Collection) 31760-31766, (h) DNA sekvenser som hybridiserer til enhver av de foregående DNA sekvenser og som koder for et polypeptid av IFN-a type, og (i) DNA sekvensér som er degenererte som et resultat av den genetiske kode til DNA innskuddene og sekvensene definert i (g) og (h) og som koder for et polypeptid av IFN-a type.

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at DNA sekvensene er valgt fra DNA sekvenser som koder for IFN-wl av formel:

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at DNA sekvensen er valgt fra DNA sekvenser som koder for IFN-^2 av formel: 94

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at DNA sekvenser er valgt fra DNA sekvenser som koder for IFN-cx4b av formel:

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-6, karakterisert ved at ekspresjonskontrollsekvenser er valgt fra gruppen bestående av et lac system, et 3-lac system, et trp system, hovedoperator og promoter regioner av fag X og kontrollregionen til fd kappeprotein.

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 7, karakterisert ved at vertsorganismen er valgt fra gruppen bestående av E. coli Psueudomonas. Bacillus gjær og pattedyrceller.

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-8, karakterisert ved at fremgangsmåten danner et IFN-cx 1 type polypeptid av formelen:

10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-8, karakterisert ved at fremgangsmåten danner et IFN-oi 2 type polypeptid av formelen:

11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 8, karakterisert ved at det fremstilles et IFN-cx4b type polypeptid av formelen: