JP2012513200A - 組換え製造インターフェロンの精製 - Google Patents

Abstract

本発明は、非所望インターフェロンアイソフォームから所望インターフェロンアイソフォームを分離する方法を提供する。該方法は、該アイソフォームをアニオン交換カラムクロマトグラフィーおよび二相溶出法に付すことを含む。該カラムからの所望アイソフォームの溶出を促進するために第１溶出相において強溶出溶液を使用し、該所望アイソフォームの溶出を抑制するために第２相において弱溶出溶液を使用する。

Description

本発明は、組換え生物により産生されたインターフェロンの精製に関する。特に、本発明は、所望のインターフェロンアイソフォーム、例えば、所望の二次ジスルフィド結合構造を有し化学的付加体を欠くアイソフォームを、そのような生物により産生される非所望インターフェロンアイソフォームからクロマトグラフィーにより分離することに関する。

インターフェロンは、抗ウイルス、抗増殖および免疫調節活性を示すサイトカインである。そのような活性のため、肝炎、種々の癌および多発性硬化症のような疾患の治療に関して種々のタイプのインターフェロンが承認されている。

インターフェロン（ＩＦＮ）は、その生物学的および物理学的特性に基づいて３つの主要グループに分類されうる。ヒトにおいては、Ｉ型ＩＦＮは５つのクラス、すなわち、アルファ（ＩＦＮ−α）、ベータ（ＩＦＮ−γ）、イプシロン（ＩＦＮ−ε）、カッパ（ＩＦＮ−κ）およびオメガ（ＩＦＮ−ω）からなる。インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）は唯一の公知ＩＩ型インターフェロンである。ＩＩＩ型はＩＦＮ−ラムダを含む。例えば、Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ，Ｇ．，Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：３０５−３１８（２００８）を参照されたい。

ＩＦＮ−αタンパク質の多数のサブタイプがヒトおよび多数の他の種において発現され、１２の異なる成熟サブタイプがヒトにおいて特定されている（Ｂｅｋｉｓｚ，Ｊ．ら，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２２（４）：２４３−２５１（２００４）；Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ，Ｇ．，前掲；Ｐｅｓｔｋａ，Ｓ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０２：８−３２（２００４）；Ｄｉａｚ，Ｍ．Ｏ．ら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ １６：１７９−１８０（１９９６））。ヒトＩＦＮ−αサブタイプは互いに７５〜９９％のアミノ酸配列同一性および１６６アミノ酸の成熟配列（ただし、ＩＦＮ−α２は、４４位における欠失のため、１６５アミノ酸）を共有する。また、幾つかのＩＦＮ−αサブタイプは、少なくとも３つの対立遺伝子形態：ＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂおよびＩＦＮ−α２ｃを有するＩＦＮ−α２のように、変異体として存在する。

Ｉ型ＩＦＮにより互いに共有されている最も保存されている特徴はジスルフィド結合であり、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γでは２つのジスルフィド結合が存在し、ＩＦＮ−βでは１つのジスルフィド結合が存在する。ＩＦＮ−αにおけるジスルフィド結合はＣｙｓ１−Ｃｙｓ９９（９８）およびＣｙｓ２９−Ｃｙｓ１３９（１３８）間に存在する（括弧内の残基番号はＩＦＮ−α２に関するものである）。ＩＦＮ−βにおける単一のジスルフィド結合はＣｙｓ３１−Ｃｙｓ１４１間に存在する。ＩＦＮ−α Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ１３９（１３８）およびＩＦＮ−β Ｃｙｓ３１−Ｃｙｓ１４１結合はＩ型ＩＦＮ受容体複合体へのこれらのＩＦＮの結合において、したがってそれらの生物活性の維持において決定的なものではないらしい（Ｂｅｋｉｓｚら，前掲）。

ＩＦＮはそれらの天然源から入手可能であるが、組換え技術は非天然源（例えば、所望のＩＦＮタンパク質をコードするＤＮＡ分子で形質転換された細菌および他の微生物）からの大量のこれらのタンパク質の製造を可能にする。組換え生物によるＩＦＮの製造は、典型的には、宿主生物または培地に由来する汚染物および製造を意図するＩＦＮタンパク質の構造アイソフォームを除去するための種々の媒体上のクロマトグラフィーを含む多工程の精製法を含む。例えば、米国特許第４７６５９０３号、第５１９６３２３号；欧州特許番号ＥＰ １０８５８５、ＥＰ １１０３０２；ＥＰ １１８８０８およびＥＰ ０６７９７１８；Ｓｔａｅｈｅｌｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２５６：９７５０−９７５４（１９８１）；ならびにＳｅｃｈｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ２８５：４４６−４５０（１９８０）を参照されたい。

例えば、未精製および部分精製組換えＩＦＮ−α調製物は、しばしば、製造すべきＩＦＮ−αサブタイプの構造アイソフォームの混合物を含有する。構造アイソフォームは以下の３つの主要クラスに分類されうる：（１）ジスルフィド結合アイソフォーム、（２）化学付加体、ならびに（３）改変されたジスルフィド結合構造および１以上の化学付加体を含有する混合アイソフォーム。ジスルフィド結合アイソフォームには、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ９９（９８）およびＣｙｓ２９−Ｃｙｓ１３９（１３８）ジスルフィド結合のそれぞれを有する酸化ＩＦＮ−α単量体アイソフォーム；これらのジスルフィド結合の一方または両方を欠くそれぞれ部分的および完全還元型単量体ＩＦＮ−αアイソフォーム；ＩＦＮ−α単量体の断片；ならびにＩＦＮ−αオリゴマー、すなわち、分子間ジスルフィド結合により形成される二量体、三量体および四量体が含まれる。ＩＦＮ−αアミノ酸鎖に結合した１以上の化学基を含有する化学付加アイソフォームには、ＩＦＮ−αタンパク質のＮ末端アミノ酸残基のアルファ−アミノ基がピルビン酸のカルボニル基と縮合しているピルビン酸付加ＩＦＮ−αアイソフォーム、およびメチオニン付加アイソフォームが含まれる（国際特許出願公開ＷＯ ００／２９４４０；米国特許第５，１９６，３２３号）。組換えＩＦＮ−α−２ｂの構造アイソフォームの具体例を図１に示す。

治療用インターフェロン組成物の場合、酸化型単量体ＩＦＮアイソフォーム以外のアイソフォームの有意量の存在は、そのようなアイソフォームが該インターフェロン組成物の治療または免疫原性特性に負の影響を及ぼしうる懸念のため、典型的には望ましくない。非所望構造アイソフォームを所望アイソフォームに変換するための種々の技術が記載されている。例えば、米国特許第４，４３２，８９５号は、レドックス試薬を使用してオリゴマーインターフェロンを単量体に変換することに言及しており、ＷＯ ００／２９４４０は、化学付加アイソフォームからのピルビン酸基の連続的切断、および還元型スルフヒドリル基からジスルフィド結合への酸化を記載している。しかし、そのようなアイソフォーム変換技術は典型的には所望ＩＦＮアイソフォームの収率を改善するものの、該変換工程後にアニオン交換クロマトグラフィーを行ったとしても有意量の非所望構造アイソフォームが尚も存在する可能性がある。したがって、組換えＩＦＮ調製物における非所望アイソフォームからの所望天然アイソフォーム（例えば、酸化型）の分離を改良することが必要とされている。本発明はこの要求に対処するものである。

発明の概括
本発明は、標準的な単相溶出法の代わりに新規二相溶出法を用いるジエチルアミノエチルアニオン交換（ＤＥＡＥ）クロマトグラフィーに、実質的に精製された組換えＩＦＮ−α−２ｂ調製物を付すことが、非所望アイソフォーム、特に、ピルビン酸付加完全還元型単量体（図１におけるアイソフォーム４）から所望の酸化型ＩＦＮ−α−２ｂ単量体（図１におけるアイソフォーム１）を効率的に分離することを可能にするという本発明者らの驚くべき知見に基づくものである。第１溶出相は所望ＩＦＮ−α−２ｂアイソフォームの溶出を促進し、一方、第２溶出相は非所望アイソフォームの溶出を抑制する。この二相溶出法は、低い溶出液体積および高い所望アイソフォーム収率で、高精製ＩＦＮ−α−２ｂ調製物を与える。本発明者らは、この場合、この新規クロマトグラフィー法が、他のＩＦＮ−αサブタイプの構造アイソフォームおよび他のＩＦＮの効率的分離にも使用可能であると予想している。

したがって、１つの態様においては、本発明は、ＩＦＮの酸化型単量体アイソフォームを、該ＩＦＮの組換え製造アイソフォームの混合物において、そのＩＦＮの非所望アイソフォームから分離する方法を提供する。

該方法は、第１バッファー溶液中のＩＦＮ混合物と、第１または第２バッファー溶液で平衡化されたアニオン交換樹脂が充填された１５ｃｍより長いクロマトグラフィーカラムを準備することを含む。

該緩衝化ＩＦＮ溶液を該カラム上にローディングし、ついで該ロード化カラムを洗浄溶液で洗浄する。

つぎに、１〜１０カラム体積の強溶出溶液を該洗浄カラムに適用することにより、第１溶出相を実施する。該強溶出溶液は１０〜３０ｍＭの濃度の第１ホスファートで緩衝化されており、５．４〜６．６のｐＨを有する。

ついで、２〜２０カラム体積の弱溶出溶液を適用することにより、第２溶出相を実施する。該溶出溶液は、該強溶出溶液におけるホスファート（リン酸塩）濃度より低い濃度の第２ホスファートで緩衝化されている。

高精製所望ＩＦＮアイソフォームを得るために、該所望アイソフォームを含有する複数の溶出画分を集める。場合によっては、非所望インターフェロンアイソフォームの量が所望純度基準より低い溶出画分を合わせる。

１つの好ましい実施形態においては、本発明は、ＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム１を、ＩＦＮ−α２ｂの組換え製造アイソフォームの混合物におけるＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム４から分離する方法を提供する。

該ＩＦＮ−α２ｂ溶液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ＮａＣｌから実質的になり７．５〜８．０のｐＨを有するローディングバッファー中の平衡化ＤＥＡＥクロマトグラフィーカラム上にローディングする。該ＤＥＡＥカラムは長さが少なくとも約２０ｃｍであり、１０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび８．０のｐＨから実質的になるバッファー溶液で平衡化されている。該ローディング流量は２ｃｍ／分である。

該ローディングカラムを２ｃｍ／分の流量で３カラム体積の洗浄溶液で洗浄する。該洗浄溶液は１０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび１３ｍＭ ＮａＣｌから実質的になり、８．０のｐＨを有する。

つぎに、６カラム体積の強溶出溶液を１ｃｍ／分の流量で該カラムに適用し、ついで弱溶出溶液を１ｃｍ／分の流量で適用する。該強溶出溶液はｐＨ５．８５の１７．５ｍＭ リン酸ナトリウムからなり、該弱溶出溶液はｐＨ５．８５の５ｍＭ リン酸ナトリウムから実質的になる。

ＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム１を含有するカラム溶出液の画分を集め、場合によっては、ＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム４が所望純度基準より低い収集画分のみを合わせる。

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解されうるよう、いくつかの用語を以下に詳細に定義する。以下または本明細書のどこかに特に示されていない限り、本明細書中で用いる全ての他の用語、特に科学技術用語は、本明細書中で用いられるものに類似した文脈で用いられる場合には、本発明が属する分野の当業者に一般に理解される意味を有する。

添付の特許請求の範囲を含む本出願において用いる単数形の語は、文脈に明らかに矛盾しない限り、それらの対応複数形を含む。

数的に定義されるパラメーター、例えば流量、ｐＨ、リン酸ナトリウム濃度を修飾するために用いる「約」は、該パラメーターが、示されている数値の上下１０％変動しうることを意味する。したがって、例えば、約２ｃｍ／分の流量は、該流量が１．８ｃｍ／ｍ〜２．２ｃｍ／分の任意の値を有しうることを意味する。同様に、「約１０ｍＭ Ｔｒｉｓ」なる語は、該Ｔｒｉｓ濃度が９．９ｍＭ〜１０．１ｍＭの任意の値を有しうることを意味する。

本明細書および特許請求の範囲の全体において用いる「から実質的になる」および例えば「から実質的になり」のような派生表現は、任意の列挙されている要素または要素群の包含、および特定されている組成物または項目の基本的特性を実質的に変化させない、該列挙要素と類似の又は異なる性質の他の要素の随意的包含を示す。非限定的な例としては、５ｍＭ リン酸ナトリウムおよび５．８５のｐＨからなる弱溶出溶液は、非所望アイソフォームからの所望ＩＦＮアイソフォームの分離に関して、該溶出溶液のｐＨ、緩衝能または他の特性に実質的に影響を及ぼさない例えば少量の他の物質、例えばリン酸カリウムをも含有しうる。

「Ｉｓｏ１」または「ＩＳＯ１」は、図１に示すＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム１を意味する。

「Ｉｓｏ４」または「ＩＳＯ４」は、図１に示すＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム４を意味する。

「ＮａＰｉ」はリン酸ナトリウムを意味する。

「酸化型ＩＦＮ単量体アイソフォーム」は、該ＩＦＮの天然ジスルフィド結合構造を有する単一ポリペプチドであって、該ポリペプチド鎖内のいずれのアミノ酸上にも化学的付加体を有さないものを意味する。天然ジスルフィド結合構造は、該アイソフォームにおけるＣｙｓ−Ｃｙｓ結合の数および位置が、天然で発現されるインターフェロンの場合と同じであることを意味する。したがって、例えば、酸化型ＩＦＮ−β単量体アイソフォームはＣｙｓ３１−Ｃｙｓ１４１間に単一ジスルフィド結合を有し、一方、酸化型ＩＦＮ−α２ａ単量体アイソフォームはＣｙｓ１−Ｃｙｓ９９結合およびＣｙｓ２９−Ｃｙｓ１３９結合を有する。

「還元型ＩＦＮ単量体アイソフォーム」は、該ＩＦＮのジスルフィド結合の天然の数より少ないジスルフィド結合を有する単一ポリペプチド鎖であって、該ポリペプチド鎖内のいずれのアミノ酸上にも化学的付加体を有さないものを意味する。還元型ＩＦＮ単量体アイソフォームは、天然に生じるジスルフィド結合の数に応じて、部分的または完全に還元されていることが可能である。したがって、例えば、部分的還元型ＩＦＮ−α２ｂ単量体アイソフォームはＣｙｓ１−Ｃｙｓ９８結合またはＣｙｓ２９−Ｃｙｓ１３８結合のいずれかを欠き、一方、完全還元型ＩＦＮ−α２ｂアイソフォームはこれらの結合の両方を欠く。

「混合型ＩＦＮ単量体アイソフォーム」は、該ＩＦＮのジスルフィド結合の天然の数より少ないジスルフィド結合を有する単一ポリペプチド鎖であって、該ポリペプチド鎖内の少なくとも１つのアミノ酸が化学的付加体で修飾されているものを意味する。

ＩＩ．好ましい実施形態の説明
本発明は、組換えＩＦＮ調製物において、所望ＩＦＮアイソフォーム、例えば酸化型単量体アイソフォームを、非所望ＩＦＮアイソフォーム、例えば還元型ＩＦＮアイソフォームから分離するためのクロマトグラフィー法を提供する。該方法は、任意のヒトまたは非ヒト動物種により天然で発現される任意の組換え製造ＩＦＮ（任意のＩ型、ＩＩ型もしくはＩＩＩ型 ＩＦＮ、または例えば安定性もしくは活性を増強するための配列修飾が導入されているそれらのキメラもしくは突然変異形態、例えば、米国特許第５，５４１，２９３号、第４，８９７，４７１号および第４，６９５，６２９号に記載されているコンセンサスインターフェロンならびに米国特許第４，４１４，１５０号、第４，４５６，７４８号および第４，６７８，７５１号に記載されている異なるサブタイプ配列の組合せを含有するハイブリッドインターフェロンを含む）からの所望アイソフォームの精製に適している。

好ましくは、本発明方法は、所望および非所望アイソフォームを組換え製造Ｉ型ＩＦＮから分離するために使用される。特に好ましいＩ型ＩＦＮは、天然に存在するサブタイプＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−α４、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α７、ＩＦＮ−α８、ＩＦＮ−α１０、ＩＦＮ−α１３、ＩＦＮ−α１４、ＩＦＮ−α１６、ＩＦＮ−α１７、ＩＦＮ−α２１、これらのサブタイプのいずれかの対立遺伝子変異体またはいずれかのコンセンサスＩＦＮ−αタンパク質（このタンパク質においては、種々の天然ＩＦＮ−αサブタイプにおける当該位置に最も一般的に存在するアミノ酸を各位置において選択することによりアミノ酸配列が設計されている）のいずれかを含む組換え製造ＩＦＮ−αタンパク質である。より好ましくは、本発明において使用される組換え製造ＩＦＮ−αタンパク質はＩＦＮ−α２（２ａ、２ｂまたは２ｃ）であり、最も好ましくは、それはＩＦＮ−α２ｂである。

組換えＩＦＮを発現させるために使用する宿主生物は原核生物または真核生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でありうる。種々の宿主生物のための培養条件は当業者によく知られており、例えばＭａｎｉａｔｉｓら（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）のテキストに詳細に記載されている。特に、ヒトＩＦＮ−α２タンパク質の組換え製造はＰｅｓｔｋａ，Ｓ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２１：１−３７（１９８３）；国際特許出願公開ＷＯ ２００４／０３９９９６；米国特許番号ＵＳ ５６６１００９、ＵＳ ５５４１２９３、ＵＳ ４８９７４７１、ＵＳ ４７６５９０３およびＵＳ ４５３０９０１；ならびに欧州特許出願公開ＥＰ ０３２，１３４に記載されている。

該組換えＩＦＮタンパク質は、当技術分野で公知の種々の方法のいずれかを用いて、組換え宿主または培地から抽出されうる。例えば、ＩＦＮ−αを微生物から抽出するための適当な方法は米国特許番号ＵＳ ４３１５８５２、ＵＳ ４３６４８６３およびＵＳ ５１９６３２３；欧州特許番号ＥＰ ０６７９７１８；ならびにＷＯ ２００４／０３９９９６に記載されている。

抽出後、構造アイソフォームの混合物を含む組換えＩＦＮ調製物を、好ましくは、一連の精製工程に付して、実質的に純粋なＩＦＮ調製物（これは、該調製物が非ＩＦＮタンパク質ならびに例えば細胞残渣および核酸のような他の汚染物を実質的に含有しないが、非所望構造ＩＦＮアイソフォームの２０％までを含有しうることを意味する）を得る。当技術分野で公知の多数の精製方法がこの目的に適している。そのような方法は、典型的には、Ｕ．Ｓ．５１９６３２３、ＵＳ ４７６５９０３、ＥＰ ０６７９７１８およびＷＯ ２００４／０３９９９６に記載されている２以上の異なるタイプの樹脂上の縦列クロマトグラフィーを含む。

そのような縦列クロマトグラフィーにより得られる実質的に純粋なＩＦＮタンパク質調製物は、典型的には、緩衝化溶液を含む。この溶液の組成およびそれにおけるＩＦＮ濃度に応じて、アニオン交換クロマトグラフィーに適したローディングバッファーの成分を含むように該溶液を調節することにより、本発明において使用されるアニオン交換カラム上にローディングするためのこのＩＦＮ溶液を調製することが必要かもしれない。この調節は、当技術分野で公知の技術、例えば透析または限外濾過により行われうる。

該ローディングバッファーは、アニオン交換樹脂へのＩＦＮタンパク質の結合に影響を及ぼさない任意の生物学的に許容されるバッファーでありうる。例えば、該ローディングバッファーは０〜１００ｍＭの塩、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌおよび酢酸ナトリウムを含有しうる。好ましいローディングバッファーは約１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０〜４０ｍＭ ＮａＣｌから実質的になり、７．０〜８．５のｐＨを有する。特に好ましいローディングバッファーは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ＮａＣｌからなり、８．０のｐＨを有する。

該ローディングバッファー中のＩＦＮの濃度は相当に変動しうる。典型的には、該ローディングバッファーの体積は、簡便なローディング体積（例えば、クロマトグラフィーカラムの０．５〜１カラム体積）が得られるように、そしてＩＦＮの沈殿が回避されるように調節される。幾つかの実施形態においては、約１〜約５ｍｇ／ｍｌのＩＦＮ濃度が用いられる。ＩＦＮ−ａ２調製物では、アイソフォーム１の好ましい濃度は約３．５ｍｇ／ｍｌである。組換えＩＦＮ調製物中に存在する種々のアイソフォームは、当技術分野で公知の技術、例えばＲＰ−ＨＰＬＣおよびピルビン酸アッセイ（ＷＯ ００／２９４４０に記載されている）を用いて特定され定量されうる。

アニオン交換クロマトグラフィー用の樹脂としては、ジエチルアミノエチルアニオン交換（ＤＥＡＥ）媒体が好ましく、特に好ましい樹脂は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ ＳｗｅｄｅｎまたはＰｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ ＵＳＡ）のＱ−セファロース・ファーストフロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）（ＦＦ）を伴うＤＥＡＥ（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ）である。ＤＥＡＥに実質的に類似した特性を有する他の弱アニオン交換樹脂も使用されうる。

該アニオン交換樹脂は、長さ１５ｃｍ以上のクロマトグラフィーカラム内に充填される。１つの好ましい実施形態においては、該カラムは長さが少なくとも２０ｃｍである。本発明における使用に適した他のカラムサイズには、１×２９ｃｍカラムが含まれる。

ＩＦＮ溶液のローディングの前に、該アニオン交換樹脂およびＩＦＮに適した適した水性バッファーで該アニオン交換カラムを平衡化する。該平衡化バッファーは該ローディングバッファーと同じである又は異なることが可能である。１つの好ましい実施形態においては、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０〜４０ｍＭ ＮａＣｌおよび７．０〜８．５のｐＨから実質的になるバッファーで該カラムを平衡化する。もう１つの好ましい実施形態においては、該平衡化バッファーは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）からなる。該カラムが既に使用されている場合には、３カラム体積（Ｂ．Ｖ．）の０．５Ｎ ＮａＯＨ／１Ｍ ＮａＣｌ；５Ｂ．Ｖ．のＨ_２Ｏ；３Ｂ．Ｖ．の０．１Ｎ ＨＣｌ；６Ｂ．Ｖ．の０．２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および１５Ｂ．Ｖ．の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）（全て、５ｃｍ／ｍｌの流量を用いる）での連続的洗浄により、それは簡便に再生され、平衡化される。

該緩衝化ＩＦＮ溶液を該カラム上にローディングした後、未結合汚染物を除去するために該カラムに洗浄溶液を適用する。該洗浄溶液は、該カラムへのＩＦＮの結合に影響を及ぼさない生物学的に許容されるバッファーを含有する。例えば、幾つかの実施形態においては、該洗浄バッファーは、該カラム平衡化バッファーまたはローディングバッファーと同じ組成を有し、例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０〜４０ｍＭ ＮａＣｌおよび７．０〜８．５のｐＨから実質的になる。好ましい実施形態においては、該洗浄溶液は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３ｍＭ ＮａＣｌからなり、８．０のｐＨを有する。

ついで、二相溶出系を用いて、該所望アイソフォームを該カラムから溶出する。この二相系は、２つの緩衝化溶液を適用することにより、すなわち、強溶出溶液（例えば、高いイオン強度および／または低いｐＨを有するもの）を適用し、ついで弱溶出バッファー（例えば、該強溶出溶液より弱いイオン強度および／またはより高いｐＨを有するもの）を適用することにより確立される。

簡便には、これらの溶出溶液はホスファートで緩衝化されるが、他の生物学的に許容されるバッファーも使用されうる。該強溶出溶液中のホスファート濃度は１０ｍＭ〜３０ｍＭであり、該弱溶出溶液ではそれより低い（例えば、２．５〜７．５ｍＭ）。該強溶出溶液と該弱溶出溶液とのホスファート濃度の差は、イオン強度に影響を及ぼす他の物質（例えば、ＮａＣｌまたは他の塩）が一方または両方の溶出溶液中に存在するかどうか及び各溶出溶液のｐＨによって変動するであろう。例えば、該強溶出溶液が該弱溶出溶液より低いｐＨを有する場合には、該ホスファートの差は若干小さいかもしれない。典型的には、該強および弱溶出溶液のそれぞれは酸性ｐＨ、好ましくは５．４〜６．６の範囲のｐＨを有するであろう。当業者は、個々のタイプのＩＦＮに使用するための二相系を得るために、該強および弱溶出溶液のそれぞれに関して、バッファー、塩およびｐＨの種々の組合せを容易に試験することが可能である。

リン酸緩衝溶出溶液を調製するために、リン酸一ナトリウムおよびリン酸二ナトリウムの一方または両方を使用することが可能であり、適当な酸または塩基、例えばＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調節することが可能である。リン酸ナトリウムに加えて又はその代わりに、他のリン酸塩、例えばリン酸カリウムも使用されうる。

好ましい実施形態においては、１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８５）から実質的になる強溶出溶液および５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８５）から実質的になる弱溶出溶液を使用して該二相溶出を行う。

該弱溶液に変換する前に使用する強溶出溶液の量は、典型的には、１〜１０カラム体積（Ｂ．Ｖ．）であるが、任意の特定のＩＦＮおよび溶出溶液の組合せに関して実験的に決定されうる。試験クロマトグラフィーは、選択された強溶出溶液のみを使用して行われ、ＩＦＮの存在に関して溶出画分がモニターされる。単相溶出において第１ＩＦＮ含有画分を溶出するのに必要な強溶出溶液のカラム体積の数より１小さいカラム体積が、典型的には、該二相系において使用される強溶出溶液の最大体積となるであろう。１つの実施形態においては、４〜８Ｂ．Ｖ．の強溶出溶液を適用する。より好ましい実施形態においては、約６Ｂ．Ｖ．の強溶出溶液の存在下で第１溶出相を使用する。

第２溶出相は、所望アイソフォームの十分な収量を溶出するのに必要な量に応じて２〜２０Ｂ．Ｖ．の該弱溶液を使用して行われうる。例えば、幾つかの場合には、還元型または化学付加ＩＦＮアイソフォームをその特性の研究のために集めることが望ましいかもしれない。１つの好ましい実施形態においては、６Ｂ．Ｖ．の該強溶出溶液の後で約１５Ｂ．Ｖ．の該弱溶液を該カラムに適用する。

前記溶液およびバッファーの全ては、典型的には、０．２〜１０ｃｍ／分の流量で該アニオン交換カラムに適用される。用いられる流量は、該クロマトグラフィーを行うための設備、アニオン交換樹脂のタイプ、該カラムのサイズ、該ＩＦＮ溶液中のタンパク質濃度および該溶出溶液の組成のような幾つかの要因に左右されるであろう。各工程のための適当な流量は当業者により容易に決定されうる。幾つかの実施形態においては、該ローディングバッファー、洗浄溶液および溶出溶液は１〜５ｃｍ／分の流量で適用される。他の実施形態においては、該流量は０．５〜２．５ｃｍである。好ましくは、該ローディングバッファーおよび洗浄溶液を適用するためには２ｃｍ／分の流量を用い、一方、該溶出溶液のそれぞれを１ｃｍ／分の流量で適用する。

図１は、組換えＩＦＮ−α−２ｂ調製物において典型的に見出される４つの構造アイソフォームを示す。 図２は、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６）を溶出バッファーとして使用するＤＥＡＥセファロース・ファーストフローカラム（１ｃｍ×２３ｃｍ）からのＩＦＮ−α２ｂアイソフォームの標準的な単相溶出の実施の結果を示し、図２Ａは、該溶出工程を構成するｐＨ勾配を示し、図２Ｂは、アイソフォーム１（ＩＦＮ−α）およびアイソフォーム４（ＩＳＯ４）に関する溶出プロファイルを示し、図２Ｃは個々の画分の純度を示す。 図３は、ローディングバッファーのみ（対照）または同じローディングバッファー中の実質的に精製されたＩＦＮ−α−２ｂ調製物（ＩＦＮ）を供給物として使用する標準的なＤＥＡＥクロマトグラフィー中に得られたｐＨプロファイルを示す。 図４は、特定された溶出条件を用いるＤＥＡＥセファロース・ファーストフローカラムからのＩＦＮ−α−２ｂ溶出の内部ｐＨ勾配の効果を示し、左側のグラフはＡ２８０吸光度、伝導度およびｐＨプロファイルの重ね合わせを示し、右側のグラフは、ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイにより判定された場合のアイソフォーム１およびアイソフォーム４の分離を示す。 図５は、実質的に精製されたＩＦＮ−α−２ｂ調製物の標準的なＤＥＡＥクロマトグラフィー中に溶出されなかった物質の特徴づけを示し、図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、該カラムから取り出された画分の分析を示す。 図６は、該カラムから取り出され、示されているｐＨにさらされた未溶出物質のＯＤ３２０およびＯＤ３２０／２８０における吸光度を示す。 図７は０．５ｃｍ×２０ｃｍカラム上のＩＦＮα−２ｂ調製物のＤＥＡＥクロマトグラフィーを示し、図７ＡはｐＨ勾配および吸光度プロファイルを示し、図７Ｂはアイソフォーム１および４の溶出プロファイルを示し、図Ｃは種々の溶出画分におけるアイソフォーム１およびアイソフォーム４の百分率を示す。 図８は、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／２０ｍＭ ＮａＣｌ（２０／２０）、１０ｍＭ リン酸ナトリウム／２０ｍＭ ＮａＣｌ（１０／２０）または５ｍＭ リン酸ナトリウム／２０ｍＭ ＮａＣｌ（５／２０）を含有するｐＨ６．０の溶出バッファー中でＤＥＡＥクロマトグラフィーカラムからＩＦＮα−２ｂを溶出させることにより得られた吸光度、ｐＨおよび伝導度プロファイルを示す。 図９はＩＦＮα−２ｂのＤＥＡＥクロマトグラフィーに対する溶出バッファー濃度の影響を示す。 図１０は、２０ｍＭ リン酸ナトリウムおよび塩濃度２０ｍＭ ＮａＣｌ（２０／２０）、１０ｍＭ ＮａＣｌ（２０／１０）、５ｍＭ ＮａＣｌ（２０／５）を含有する又は２０ｍＭ リン酸ナトリウムを含有しＮａＣｌを含有しない（２０／０）ｐＨ６．０の溶出バッファー中のＤＥＡＥクロマトグラフィーカラムからＩＦＮα−２ｂを溶出させることにより得られた吸光度、ｐＨおよび伝導度プロファイルに対する塩濃度の影響を示す。 図１１は、ＤＥＡＥクロマトグラフィーカラムからのＩＦＮα−２ｂアイソフォーム１および４の溶出に対する、種々の塩濃度により得られた種々のイオン強度の影響を示す。 図１２は、１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中のＩＦＮα−２ｂアイソフォーム１および４の溶出に対するＮａＣｌの効果を示す。 図１３は、ＩＦＮα−２ｂアイソフォーム１および４の分離に対するバッファーおよび塩濃度の効果を示す。 図１４は、標準的な単相溶出法を用いるＩＦＮα−２ｂ溶出に対するｐＨの効果を示す。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。 図１５〜２７は実施例中に説明されている。

実施例
以下の実施例は、本発明をより明らかに説明するために記載されており、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

本発明者らは、ＤＥＡＥ−セファロース・ファーストフロークロマトグラフィーを用いて、組換え製造ＩＦＮ−α２ｂアイソフォームの分離に関与するメカニズムを調べるための一連の実験を行った。ＤＥＡＥセファロースとのＩＦＮ−α２ｂアイソフォームの相互作用を解明するために、バッファー濃度、塩濃度およびｐＨを含む種々の溶出条件を試験した。アイソフォーム１および４の分離には２つの異なるメカニズムが関与していることが判明した。

第１のメカニズムはクロマトフォーカシングの原理に合致し、これは、カラム内のｐＨ勾配の形成により特徴づけられ、種々のタンパク質、特に密接に関連したアイソフォームをそれらの等電点精製するために広く用いられている。後記の標準的な方法を用いるＩＦＮ−α２ｂ精製のためのＤＥＡＥクロマトグラフィーにおいては、バッファー種とＤＥＡＥ樹脂との相互作用の結果として、溶出中にカラムの長さに沿って内部ｐＨ勾配が生じる。本発明者らは、アイソフォーム１および４が該ｐＨ勾配に沿って異なるｐＨで溶出されることを見出した。アイソフォーム１およびアイソフォーム４の分離は、通常のクロマトフォーカシングにおけるバッファー濃度、ｐＨ勾配の傾き及びカラム分離能の間の関係に合致して、ｐＨ勾配の傾きを減少させるために、より低い濃度のホスファート溶出バッファーを使用することにより改善されうる。

第２のメカニズムは、アイソフォーム１の溶出中のカラムへのアイソフォーム４の選択的結合を含む。本発明者らは、アイソフォーム４が、塩の非存在下、バッファー濃度が低くなるほどより強固に該カラムに結合し、したがって、これらの条件下でアイソフォーム１から効果的に分離されうることを見出した。しかし、アイソフォーム１の溶出効率は、バッファー濃度が低くなるほど減少した、したがって、アイソフォーム１を含有するプール化画分の体積は、効率的な工業的タンパク質製造方法で望まれるものより常に大きかった。

したがって、本発明者らは、ＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム４の溶出を抑制しつつＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム１の確固たる且つ効率的な溶出を可能にする条件を特定することが可能かどうかを調べるために、第２の一連の実験を行った。

これらの２つの一連の実験を以下に更に詳しく説明し、結果を図２〜２７に示す。これらの図において、ＩＦＮ、ＩＦＮ−ａまたはＩＦＮ−アルファなる語は、図１に示すＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム１を意味し、ｉｓｏ４およびＩＳＯ４なる語は、図１に示すＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム４を意味する。

Ｉ．実験方法
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
４℃でＤＥＡＥクロマトグラフィーを実施するためにＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ ＳｗｅｄｅｎまたはＰｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用した。０．５×２０ｃｍカラム（３．９ｍｌ）または１×２９ｃｍカラム（２３ｍｌ）にＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した。十分な樹脂を該カラム内に注ぎ、重力下で沈降させて、所望の高さより約１ｃｍ高い初期床高を得た。３カラム体積（Ｂ．Ｖ．）の０．５Ｎ ＮａＯＨ／１Ｍ ＮａＣｌ、５Ｂ．Ｖ．のＨ２Ｏ、３Ｂ．Ｖ．の０．１Ｎ ＨＣｌ、６Ｂ．Ｖ．の０．２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および１５Ｂ．Ｖ．の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を５ｃｍ／ｍｌの流量で使用して、該カラムを再生させ平衡化した。

組換えＩＦＮ−α２ｂの製造
本発明者らは、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において製造され一連の精製工程により実質的に精製されたＩＦＮ調製物を得た。該ＩＦＮ調製物は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５〜８．０）を含有するローディングバッファー中で提供された。

標準的なクロマトグラフィー法
該ＩＦＮ溶液を、３．９ｍｌカラムでは０．４ｍｌ／分または２３ｍｌカラムでは０．８ｍｌの流量で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で平衡化されたカラム上に注入した。ローディングしたＩＦＮ溶液の体積は該カラムＢ．Ｖ．の７５％であった。同じ流量で、未結合物質を該カラムから除去するために、３Ｂ．Ｖ．の洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））を使用した。最後に、９Ｂ．Ｖ．の２０／２０溶出バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０））を０．２ｍｌ／分の流量で使用して、該溶出工程を開始させた。画分当たり２０％ Ｂ．Ｖ．（０．８ｍｌ）で画分を集めた。アイソフォーム１および４をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。それらの２つのアイソフォームのピークの距離を半ピーク高におけるピーク幅の和で割り算することにより、該アイソフォームの分離能を計算した。

試験クロマトグラフィー法
ＩＦＮ溶出の挙動を調べるために、「結果および考察」の節に記載されているとおりに異なる溶出バッファーを使用すること以外は標準的な方法を用いてＤＥＡＥクロマトグラフィーを行った。該流量は、特に示さない限り、通常の方法におけるものと同じであった。

ＩＩ．結果および考察−実験系Ｉ
Ａ．ＩＦＮ ＤＥＡＥクロマトグラフィーにおける内部ｐＨ勾配の形成
標準ＤＥＡＥクロマトグラフィー法中のＵＶ吸光度、伝導度およびｐＨをモニターし、それを図２に示した。３つのＵＶピーク、すなわち、初期の小さいピークとしての細菌タンパク質、主要中央ピークとしてのＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム１、ならびにそれに続く後期の幅広い小さいピークとしてのＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム４および他の汚染物が観察された。

興味深いことに、カラムに沿って内的に非直線勾配を形成し始める前には、流出液のｐＨは溶出の最初の約３．２カラム体積にわたって比較的一定であった。１４．２カラム体積の溶出バッファーがカラムを通過した後で初めて、流出液は最終ｐＨ６に達した。ｐＨ勾配は、溶出バッファーとセファロース樹脂上のＤＥＡＥ部分との相互作用の結果として形成されたようであった。ｐＨ勾配の開始の前の溶出体積は、図２Ａにおいて矢印で示されている飽和体積と称される。飽和体積は緩衝強度およびｐＨならびに樹脂のタイプに関連づけられうるであろう。

ＩＦＮは内部ｐＨ勾配の形成に寄与しないようであった。なぜなら、ローディングバッファーのみが該カラムに適用された「ブランク」実施において、類似したｐＨプロファイルが観察されたからである（図３）。ｐＨ勾配形成の駆動力は溶出バッファー種とＤＥＡＥ部分との相互作用により支配され、ＩＦＮは有意な役割を果たしていないことを、この結果は示した。ｐＨとは異なり、流出液伝導度は約１カラム体積の溶出の直後に変化し始めたが、初期減少後は比較的一定であった（図２Ａ）。

これらのデータは、ｐＨ勾配形成がＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム１の適切な溶出に決定的に重要であることを示唆している。ＨＰＬＣアッセイによるＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム１および４の定量分析は、それらが完全には分離されないことを示した（図２Ｂおよび２Ｃ）。アイソフォーム１およびアイソフォーム４はそれぞれｐＨ約６．３および６．１で溶出された。

Ｂ．ＩＦＮ溶出に対するｐＨ勾配の影響
ＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム分離に対する内部ｐＨ勾配の重要性を評価するために、他のパラメーターを変化させることなく種々の溶出条件下でクロマトグラフィーを行った。１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１０ｍＭ クエン酸および２０ｍＭ ＮａＣｌを含有するｐＨ６．０の溶出バッファーの使用は、やや鋭いＳ字状のプロファイルを有するｐＨ勾配を与え、ＩＦＮ−α２ｂは２つの鋭いピークとして溶出した（図４Ａ、左グラフ）。

低濃度のシトラートおよびホスファートを含有するｐＨ６．０のバッファー（５ｍＭ リン酸ナトリウム、２．５ｍＭ クエン酸、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を使用して溶出を行った場合、ｐＨはより遅く減少し、該溶出バッファーのｐＨ（ｐＨ６．０）に達するために、ほぼ２倍の溶出体積が必要であった（図４Ｂ、左パネル）。さらに、該ｐＨプロファイルは２段階のカスケードとして現れたが、これは、より滑らか且つより浅い凹形勾配が見られた標準法で観察された１段階のものとは対照的であった。ピークＩＦＮは、該勾配のより後の部分においてｐＨが約６．２に低下するまで溶出しなかった（図４Ｂ、左パネル）。

ｐＨ勾配の傾きがｐＨ６．４〜６．０の領域で急に増加したため（図４Ａおよび４Ｂ、左パネル）、これらのシトラート／ホスファート溶出バッファーのいずれにおいてもアイソフォーム１および４の分離は、ほとんど、ないし全く観察されなかった（図３Ａおよび３Ｂ、右パネル）。

４０ｍＭ リン酸バッファー（４０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６））での溶出は鋭いＩＦＮピークを生成した（図４Ｃ、左パネル）。しかし、アイソフォーム１および４の分離は不良であり（図４Ｃ、右パネル）、該試験溶出バッファーおよび標準２０／２０バッファーが共にｐＨ６．０を有する場合であっても、ｐＨ勾配は標準的な実施の場合より顕著に急激なものであった。

これらのデータは、ＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム１および４の有効な分離には、適切なｐＨ勾配が決定的に重要であること、ならびにｐＨ勾配の傾きが該カラムの分離能に大きな影響を及ぼしうることを示唆している。より急激なｐＨ勾配は両方のアイソフォームの溶出を促進したが、その場合の分離は不良であった。

Ｃ．ＤＥＡＥセファロースカラム上のＩＦＮのクロマトフォーカシング
前記のとおり、本発明者らは、溶出工程中にＤＥＡＥセファロースカラム内に内部ｐＨ勾配が生じること、およびこのｐＨ勾配がカラムの性能に決定的に重要であることを見出した。したがって、本発明者らは、ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー上のＩＦＮアイソフォームのクロマトグラフィー分離が、クロマトフォーカシングと称される特有のクロマトグラフィー技術に合致した原理により生じると仮定した。クロマトフォーカシングは、多数のタンパク質の精製、特に、異なる等電点の密接に関連したアイソザイムの精製に使用される（例えば、Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ＴＷ，１９８９ Ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊａｎｓｏｎ ＪＣ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ Ｌ．編，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，ｐ．１４９−１７４；Ｇｉｒｉ Ｌ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ＭＰ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｖｏｌ １８２，ｐ．３８０−３９２を参照されたい）。

典型的なクロマトフォーカシング法においては、弱いアニオン交換カラムを、負荷電タンパク質の結合を促進する高ｐＨバッファーで平衡化する。ついで、商業的に入手可能な高分子両性電解質バッファーを通常は使用する低ｐＨバッファーを導入して、カラム内に内部直線ｐＨ勾配を生成させる。該タンパク質はそれらの等電点に従って該カラムから溶出されるであろう。タンパク質が、そのｐＩと同等の該カラム内のｐＨに達したら、該タンパク質の電荷は正味ゼロとなり、したがって該カラムへのその結合アフィニティーを喪失し、溶出し始めるであろう。それが該カラムの下方へ移動して、該カラムのｐＨが該タンパク質のｐＩより高くなると、該タンパク質の前方部は該カラムに再結合するであろう。一方、該サンプル領域の後方部のタンパク質は、それが尚も無荷電であるか又は正に荷電しているため、該カラムの下方へ流動し続けて、該タンパク質の前方部に追いつく。その結果、該タンパク質は集中（フォーカス）する。該タンパク質が最終的に該カラムが溶出するまで、該過程が絶えず反復されるであろう。

通常のクロマトグラフィーにおいて使用される両性高分子電解質バッファーとは異なり、ＩＦＮ ＤＥＡＥクロマトグラフィーにおける溶出バッファーはホスファートのみからなり、これは、ｐＫａ １２．３、７．３および２の３つの異なるイオン化コンジュゲートを含有する。しかし、本発明者らのデータは、標準的な方法における単純なリン酸バッファーが、溶出バッファーのｐＨと第２リン酸ｐＫａ（７．３）との間の範囲であるｐＨ６〜７における直線に近い又は凹形のｐＨ勾配を形成しうることを示した。ＩＦＮは該ｐＨ勾配のこの狭い範囲内で溶出した。

Ｄ．ＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム４の選択的結合
物質収支の結果により示されるとおり、該標準法における溶出工程の後、大きな比率のアイソフォーム４および他の汚染物が尚もカラムに結合していた。これらの未溶出物質の検査は、ＩＦＮ−α２ｂアイソフォームが溶出中に該カラム内でどのように挙動するのかに関する有益な情報を与えうるであろう。

この目的のために、低ｐＨバッファー（４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ４））を使用することにより未溶出物質を該カラムから取り出し、アイソフォーム１およびアイソフォーム４に関してＲＰ−ＨＰＬＣにより画分をアッセイした（図５Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるとおり（図５Ｂ）、これらの２つのアイソフォームは、該カラムから取り出された主要物質であった。溶出した及び取り出された画分に含有されるアイソフォーム１および４の量を決定した。全アイソフォーム１の大部分が該カラムから溶出し、一方、溶出したものよりほぼ２倍多いアイソフォーム４が尚もカラム内に残存していることを、結果は示した（データ非表示）。したがって、該標準方法を用いた場合、アイソフォーム４は、アイソフォーム１より大きな、ＤＥＡＥカラムに対するアフィニティーを有していた。

未溶出物質が、なぜ、そのように強固に該カラムに結合するのかを理解するために、これらの物質の幾つかの特性を調べた。図６は、取り出された物質を種々のｐＨにさらした後のＯＤ３２０およびＯＤ３２０／２８０における吸光度の決定を示す。ＯＤ３２０は、凝集または沈殿を示す有用なパラメーターである。ＯＤ３２０またはＯＤ３２０／ＯＤ２８０は、ｐＨが約６へと減少するにつれて顕著に増加したが、このことは、約６のｐＨにおいて凝集が生じていたことを示している。低いｐＨにおける凝集は、溶出中の該カラムへのこれらの物質の強力な結合を部分的に説明しうる。

前記データに基づいて、本発明者らは、ＤＥＡＥセファロースカラム上のＩＦＮ−α２ｂアイソフォームの分離が、２つの異なるメカニズム、すなわち、ｐＨ勾配の形成によるクロマトフォーカシング、および標準的な溶出条件下での該カラムへのアイソフォーム４の選択的結合により生じると結論づけた。

ローディング、洗浄および溶出工程のサイクル回数を減少させるために、より小さなＤＥＡＥセファロースＦＦカラム（０．５ｃｍ×２０ｃｍ、３．９ｍｌ）へとカラムサイズが小規模化されうる可能性を検討した。該小カラムは、２３ｍｌカラムに類似したｐＨ勾配を生成することが可能であり、ＩＦＮ−α２ｂに関するＵＶプロファイル、ならびに異なる溶出バッファーを使用した場合のアイソフォーム１および４の分離も、より大きなカラムで得られた結果に類似していた（図７）。したがって、後記の実験のほとんどは、０．５ｃｍ×２０ｃｍ、３．９ｍｌカラムを使用して行った。

Ｅ．バッファー濃度の効果：ｐＨ勾配の傾きと分離との関係
クロマトフォーカシング法においては、カラム性能は、しばしば、ｐＨ勾配の範囲および傾きを含む幾つかの変数を操作することにより最適化されうる。より浅い勾配を有する、より狭いｐＨ範囲が、アイソフォーム１および４の分離を改善するのに有用であるかどうかを調べるために、ｐＨ勾配の傾きおよびアイソフォーム分離に対する溶出バッファー中のホスファート濃度の効果を調べた。

２０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）の存在下、２０、１０または５ｍＭ リン酸ナトリウムを使用して溶出を行った。図８は、これらのバッファーのそれぞれで得られたクロマトグラフィープロファイルの重ね合わせを示す。明らかに、リン酸ナトリウム濃度が減少するにつれて、該カラムからのＩＦＮピークの溶出は遅延し、該ピークは広がった（上パネル）。予想どおり、低いバッファー濃度（１０または５ｍＭ リン酸ナトリウム）においては、ｐＨ勾配の形成も遅延し、傾きは、標準的な２０／２０溶出バッファーで観察されたものより浅かった（図８、中パネル）。

ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイは、溶出バッファーホスファート濃度が２０ｍＭから５ｍＭへと減少するにつれて、両方のアイソフォーム１および４に関するピークの広がりを示したが、これらのアイソフォームの分離の改善を示した（図９、上３つの左パネル）。溶出したアイソフォーム１およびアイソフォーム４の総量は、それらの３つのホスファート濃度のそれぞれで類似していた（図９、下左パネル）。

ホスファート濃度、ｐＨ勾配およびアイソフォーム分離の間の関係を図９の下左パネルに示す。ホスファート濃度の減少に伴うアイソフォームの分離における有意な改善は、最低移動バッファー濃度で最良の分離を示す通常のクロマトフォーカシングに合致する。この理由は、低いバッファー濃度が浅いｐＨ勾配の生成を助け、そしてそれが分離を向上させることにある。

Ｆ．ＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム４の結合に対する塩およびホスファート濃度の影響
本発明者らは、２０ｍＭ リン酸ナトリウムおよび２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭまたは０ｍＭのＮａＣｌ含有するｐＨ６．０の溶出バッファーを使用して溶出を行うことにより、ＩＦＮ溶出に対するイオン強度の効果を調べた。結果を図１０および１１に示す。

該２０ｍＭホスファート（リン酸塩）バッファーにおいては、アイソフォーム１の溶出は、ピークの位置および鋭さに関して、ＮａＣｌ濃度によってはほとんど影響されなかった（図１０、上パネル；図１１、左上の４つのパネル）。しかし、ＮａＣｌ濃度が減少するにつれて、アイソフォーム４のピークが次第に広がったが（図１１、左上の４つのパネル）、このことは、該カラムからのアイソフォーム４溶出の速度が塩の非存在下では減少したことを示している。該ｐＨは塩濃度によっては比較的変化しないようであった（図１０、中パネル）。集めた画分において、該カラムから溶出したアイソフォーム１および４の総量ならびにそれらの分離は、種々の塩条件下で類似していた。

本発明者らは、溶出中の低いバッファー濃度においてアイソフォーム１および４の分離が改善しうると判定していたため、１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）溶出バッファー中の漸減塩濃度（２０ｍＭ、１０ｍＭまたは０ｍＭのいずれかのＮａＣｌ）の効果を評価した。結果を図１２に示す。

２０ｍＭ リン酸ナトリウム溶出バッファーを使用して観察された結果と同様に、１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファーで溶出したアイソフォーム４のピークは、ＮａＣｌ濃度が２０ｍＭから１０ｍＭへと減少するにつれて広がり、一方、アイソフォーム１のピークはほとんど影響されなかった（図１２、上の２つの左および右パネル）。しかし、塩濃度が更に０ｍＭへと減少すると、アイソフォーム１は２つの異なるピークとして溶出したが（図１２、３番目の左および右パネル）、全アイソフォーム４の少量（１．６％）のみが最初のアイソフォーム１のピークと共に溶出したに過ぎなかった（図１２、３番目の右および左パネル）。これとは対照的に、標準的な２０ｍＭ リン酸ナトリウム／２０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ６．０溶出バッファーを使用した場合には、全アイソフォーム４の３６％がアイソフォーム１のピークと共に溶出した。

該カラムから溶出するアイソフォーム１の総量は１０ｍＭ リン酸ナトリウムにおける塩濃度によっては変化せず、一方、アイソフォーム４の溶出は、塩濃度が減少するにつれて著しく抑制されることを、定量分析は示した（図１２、下左パネル）。これらの結果は、塩の非存在下で低いバッファー濃度を使用して溶出を行う場合には、ＤＥＡＥセファロースＦＦカラムが、アイソフォーム４に対して、アイソフォーム１に対するより高いアフィニティを有することを示唆している。ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイによる純度分析は、ほぼ全てのＩＦＮ画分が低率（＜１％）のアイソフォーム４を含有することを示した（図１２、下右パネル）。

低いバッファー濃度における該カラムへのＩＦＮ−α２ｂアイソフォームの結合を更に調べるために、２０、１７．５、１５、１２．５または１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有し塩を含有しないｐＨ６．０のバッファーにおいて溶出を行った。結果を図１３に示す。

標準的な２０／２０バッファーでの溶出と比較して、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／０ｍＭ ＮａＣｌにおけるアイソフォーム４のピークは広がったが、その総溶出は影響されなかった。リン酸ナトリウムが２０ｍＭから１７．５、１５、１２．５および１０ｍＭへと減少するにつれて、アイソフォーム１のピークの対応する広がりと共に、アイソフォーム４の溶出は次第に遅延または阻止された（図１３、左パネル）。ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイは、低いバッファー濃度（＜１５ｍＭ リン酸ナトリウム）を用いて溶出したアイソフォーム１画分のほぼ全てが非常に低い比率のアイソフォーム４を含有することを示した。該カラムへのアイソフォーム４の結合の転移点はリン酸ナトリウムの１５ｍＭと２０ｍＭとの間で生じたが、これは恐らく、このホスファート（リン酸塩）濃度におけるアイソフォーム４の沈殿の増加によるものであろう。

Ｇ．ｐＨの効果
ｐＨはタンパク質分子上の表面電荷の正味電荷および分布に影響を及ぼし、移動性バッファーのアニオン構造を変化させ、アニオン交換樹脂の電荷状態をモジュレーションしうるため、本発明者らは、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／２０ｍＭ ＮａＣｌ（２０／２０）または１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム／０ｍＭ ＮａＣｌ（１７．５／０）溶出バッファーでのＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム１および４の溶出に対する、５．８から６．３へのｐＨの変化の効果を評価した。結果を図１４および１５に示す。

２０／２０バッファーを使用する溶出は、ｐＨ５．８、６．０および６．３において、両方のアイソフォームに関して、非常に類似したプロファイルを示したが、ｐＨ６．３において、それぞれのアイソフォームのピークの広がりが観察された（図１４）。該カラムから溶出した各アイソフォームの総量も各ｐＨにおいて非常に類似していた（データ非表示）。これらの結果は、標準的なバッファーおよび塩濃度を使用するＩＦＮ−α２ｂ溶出がバッファーのｐＨに対して比較的非感受性であることを示した。

これとは対照的に、１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム／０ｍＭ ＮａＣｌで溶出を行った場合には、５．８と６．３との間のｐＨの変化は有意な影響を及ぼした。アイソフォーム４はｐＨ６．０においてはほとんど溶出しなかった（図１５、中央パネル）。しかし、ｐＨ５．８においては、アイソフォーム１のピークがより鋭くなり、有意に多量のアイソフォーム４が該カラムから溶出した（図１５、上パネル）。ｐＨ６．３においては、アイソフォーム１は２つのピークとして溶出し、基本的にはアイソフォーム４は溶出しなかった（図１５、下パネル）。したがって、ＩＦＮ−α２ｂ溶出は、ＮａＣｌの非存在下、１７．５ｍＭ リン酸ナトリウムにおいては、比較的小さなｐＨ変化に対して非常に感受性であった。

Ｈ．全体的な及び収集可能な回収
前記の全ての条件下でのアイソフォーム１の総溶出は非常に類似しており１００％に近かったが、アイソフォーム４の溶出はＮａＣｌの非存在下の１７．５ｍＭ以下のリン酸ナトリウムにおいては劇的に減少した。しかし、標準的な２０／２０バッファーでの溶出と比較した場合の、１７．５ｍＭ以下のリン酸ナトリウム／０ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶出バッファーで達成されたこれらのアイソフォームの分離の改善は、効率を有意に低下させている。すなわち、ＩＦＮピークの溶出の減速または遅延のため、アイソフォーム４の混入を低下させて（例えば、３％未満）、アイソフォーム１の高い収率（例えば、９０％以上）を得るためには、有意に、より大きな体積の画分を集めることが必要であろう。

したがって、アイソフォーム１および４の高い分離能を達成する溶出条件を特定することを試みるために、追加的な実験を行った。

ＩＩＩ．結果および考察−実験系ＩＩ
第２の実験系においては、実質的に精製された幾つかの異なるＩＦＮ−α２ｂ調製物を使用した。それらを以下に一覧する。

Ａ．ｐＨ６．０における溶出体積に対するバッファーおよびＩＦＮ濃度の効果
ｐＨ６．０におけるバッファーおよびＩＦＮ濃度の溶出体積に対する効果を評価するために、標準的な２０ｍＭ リン酸ナトリウム／２０ｍＭ ＮａＣｌ溶出バッファーを使用して２つの異なるＩＦＮ−α２ｂ濃度（１．７７ｍｇ／ｍｌおよび３．４９ｍｇ／ｍｌ）に関して得られた溶出体積を、塩の非存在下、より低いバッファー濃度を用いてこれらのＩＦＮ濃度に関して得られた溶出体積と比較した。結果を以下の表ＩＩＩＡに示す。

ＩＦＮ調製物１の場合、アイソフォーム１ピークに関する溶出体積は、標準的な２０／２０バッファーを使用した場合の溶出体積と比較して、１５、１２．５および１０ｍＭ ホスファートで、それぞれ３５％、９５％および２２０％増加した（表ＩＩＩＡ、第２列）。リン酸ナトリウム濃度の減少と共に次第に増加する溶出体積の類似パターンが、ほぼ２倍のＩＦＮを含有するＩＦＮ調製物に関して観察された（表ＩＩＩＡ、第３列）。しかし、溶出体積に対するリン酸ナトリウム濃度のこの効果の大きさは、より高いＩＦＮ濃度において増加した。ＩＦＮ濃度は、ＮａＣｌを欠くバッファーにおいては、アイソフォーム１および４の分離に顕著な影響を及ぼさなかった。なぜなら、いずれのバッチからのアイソフォーム１も、アイソフォーム４（その大部分は該カラム上に残存していた）の共溶出をほとんど伴わない２つの幅広いピークとして溶出したからである（データ非表示）。

Ｂ．ＩＦＮ溶出体積はｐＨ５．８５においてはバッファー濃度に左右されない
前記ＩＩ．Ｇ節に記載したとおり、ｐＨは、該溶出バッファーにおいて、ＮａＣｌの非存在下の１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム濃度でのＩＦＮ溶出に対して顕著な効果を示した。この場合、ｐＨ５．８５の溶出バッファーはアイソフォーム１を鋭いピークとして示し、アイソフォーム４溶出を増加させ、一方、ｐＨ６．３の溶出バッファーはアイソフォーム４溶出を抑制したが、幅広いアイソフォーム１ピークを生成した。あるｐＨにおけるアイソフォーム溶出とバッファー濃度との関係を調べるために、塩を含有せず１７．５ｍＭ、１５ｍＭ、１２．５ｍＭまたは１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有するｐＨ５．８５の溶出バッファーを使用して、ＩＦＮ調製物１に関して標準的なＤＥＡＥクロマトグラフィー法を行った。結果を図１６Ａおよび１６Ｂに示す。

ホスファート（リン酸塩）バッファー濃度が１７．５ｍＭから１０ｍＭへと減少するにつれて、ＩＦＮの溶出は次第に遅くなった（図１６Ａ、上パネル）。予想どおり、より低いバッファー濃度においては、伝導度低下およびｐＨ勾配形成も遅くなった（図１６Ａ、中および下パネル）。しかし、それらのＩＦＮ溶出プロファイルを重ね合わせたところ（各バッファー濃度に関するＩＦＮピークを比較のために同一画分に対して正規化した）、アイソフォーム１ピークの形状は鋭く、試験したホスファート濃度間で顕著に類似しており、一方、アイソフォーム４は該ＩＦＮピークのより後の画分において漸増的に溶出したことを、本発明者らは観察した（図１６Ｂ）。低いｐＨ（５．８５）においてバッファー濃度を低下させても、より高いｐＨ（６．０〜６．２）の場合のようにはアイソフォーム１ピークを有意には広げなかったという観察は、より低いｐＨおよびより低い濃度のバッファーが、溶出体積の劇的な増加を伴わないアイソフォーム１の溶出に有用でありうることを示唆した。

ＩＶ．二相溶出−原理、結果および考察
前記試験法はいずれも、許容しうる小さな体積でのアイソフォーム１の溶出を伴う、アイソフォーム４からのアイソフォーム１の満足しうる分離をもたらさなかった。より大きなアイソフォーム１のプール体積は常に、アイソフォーム４の結合を促進する又はアイソフォーム１および４の分離を改善する、より低いホスファートバッファー濃度のような溶出条件で得られた。一方、より高いホスファートバッファー濃度またはより低いｐＨにおいて、より鋭いアイソフォーム１ピーク、したがってより小さな収集溶出体積を得ることができたが、より多量のアイソフォーム４がアイソフォーム１と共に溶出し、それにより、所望の純度基準を満たすアイソフォーム１の収率を減少させた。第１の実験系では、ほとんどの場合、アイソフォーム１のピークの最初の４分の１または半分が溶出してしまうまでは、アイソフォーム４は溶出し始めないことを、本発明者らは観察した。

これらの観察に基づいて、本発明者らは、最初の半分のアイソフォーム１ピークの溶出の後、溶出バッファーをより低い濃度のバッファーまたは高いｐＨのバッファーに変化させることにより、すなわち、２工程または「二相」溶出法により、アイソフォーム１のピークの後半においてアイソフォーム４の溶出の抑制が生じて、より小さな溶出体積でアイソフォーム１が溶出することを可能にすると仮定した。この仮定を試験するために、単一溶出工程の代わりに２工程溶出法、すなわち、二相溶出法を用いる前記の標準的なＤＥＡＥクロマトグラフィー法を３．９ｍｌカラム上で行った。工程１において、洗浄工程後に強溶出溶液を該カラムに適用し、工程２において、異なる組成を有する、より弱い溶出溶液を適用した。流量は、標準的な単一溶出工程に用いたものと同じであった。該強および弱溶出溶液に関する種々の組成で得られた結果を以下に記載する。

Ａ．同一ｐＨにおける種々のホスファート濃度での二相溶出
１．２０ｍＭ ホスファート（ｐＨ６．１）での第１相溶出；１５または１２．５ｍＭ ホスファート（ｐＨ６．１）での第２相溶出
６．７カラム体積の強溶出溶液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ６．１）およびそれに続く１９カラム体積の弱溶出溶液（１５ｍＭまたは１２ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ６．１）で、ＩＦＮ−α２ｂ（ＩＦＮ調製物２）の二相溶出を行った。結果を図１７に示す。

標準的な２０／２０条件を用いて行った溶出と比較して、アイソフォーム１は、アイソフォーム４からの有意に改善された分離を伴って、該カラムから効率的に溶出した（図１７、上の２つのパネル）。しかし、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析のプロファイルは、単一の高ホスファート（２０ｍＭ リン酸ナトリウム）溶出バッファー（ｐＨ６．１）を使用して得られたものに非常に類似しているようであった（図１７、下パネル）。幾らかのアイソフォーム４は、アイソフォーム１のピークの後半の、より後の画分において溶出し、このことは、所望の純度基準に応じて、それらの画分を収集不能にする可能性があった。種々の溶出溶液により得られたアイソフォーム溶出プロファイルにおける有意な相違は観察されなかった。ただし、１２．５ｍＭ リン酸ナトリウムで溶出したアイソフォーム１のピーク幅（図１７、中央パネル）は１５ｍＭ リン酸ナトリウムでの溶出より大きかった。したがって、ｐＨ６．１において２つの異なるホスファート濃度（１５または１２．５ｍＭ）を使用する二相溶出は最適ではないようであった。

２．１７．５ｍＭ ホスファート（ｐＨ５．８５）での第１相溶出；５ｍＭ ホスファート（ｐＨ５．８５）での第２相溶出
ｐＨ５．８５において２つの異なるホスファート濃度を使用してＩＦＮ−α２ｂ（ＩＦＮ調製物５、ローディング体積３．２ｍｌ）の二相溶出を行った場合、非常に異なるプロファイルが得られた。５または６Ｂ．Ｖ．の１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８５）で第１溶出相を実施し、ついで１９カラム体積の５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８５）で溶出を行った。結果を図１８に示す。

どちらの実験においても、アイソフォーム１のピークにわたって溶出した実質的に全ての画分は９７％以上の純度であり、アイソフォーム４は０．５％未満であった（図１８）。しかし、５Ｂ．Ｖ．ではなく６Ｂ．Ｖ．の強溶出溶液で第１相溶出を行った場合には、アイソフォーム１は遥かに鋭いピークとして溶出した。該アイソフォーム１ピーク画分は２．５ｍｇ／ｍｌ ＩＦＮ−α２ｂであり、標準的な方法で得られたピーク画分のＩＦＮ濃度（１．３ｍｇ／ｍｌ）の約２倍であった。以下の表は、標準的単相および二相実験（６Ｂ．Ｖ．の強溶出溶液を使用するもの）で得られた収率および純度を比較した場合の詳細な画分分析を示す。

６Ｂ．Ｖ．の強溶出溶液を使用する二相溶出法におけるｐＨプロファイルは、溶出中にカラムの長さに沿って形成される幾つかのｐＨ変位領域を示した（図１９）。これらの領域は溶出中の伝導度変化と相関した（図１９、下パネル）。鋭い変位フロントがｐＨ５．５とｐＨ６．１との間に存在する。アイソフォーム１はｐＨ５．５において急速に溶出し、カラムの下方へ移動し、該ｐＨ変位フロントにおいて集中した。したがって、離散的なｐＨフロントの形成は、二相溶出中にアイソフォーム１が鋭いピークとして溶出したことを説明するものであった。

ｐＨまたは塩濃度を調節することにより溶解可能な幾らかの沈殿が、高いＩＦＮ濃度を有する幾つかの画分において特に室温で生じることが認められた。これは恐らく、該溶出バッファー中の低い伝導性条件によるものであろう。所望の純度基準に従って収集された画分におけるアイソフォーム１の総回収率は９９％にも達した。異なるＩＦＮ−α２ｂ調製物およびカラム長で、類似した性能が得られた（データ非表示）。

Ｃ．同一ホスファート濃度における異なるｐＨでの二相溶出
本発明者らはまた、二相溶出法においてｐＨを変化させつつホスファートバッファーを一定に保持する効果を調べた。アイソフォーム１のピークの溶出を鋭いものにするために、低ｐＨバッファーを強溶出溶液として使用した。ついで、アイソフォーム４の溶出を抑制するために、高いｐＨのバッファーを使用した。

１．１７．５ｍＭ ホスファート（ｐＨ５．８５）での第１相溶出；１７．５ｍＭ ホスファート（ｐＨ６．３）での第２相溶出
ＤＥＡＥカラムにＩＦＮ調製物４を充填し、それを標準的な方法により洗浄した。６．５Ｂ．Ｖ．または５．０Ｂ．Ｖ．の１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８５）およびそれに続く１９Ｂ．Ｖ．の１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．３）をそれぞれ使用する二相溶出を行った。結果を図２０に示す。

６．５Ｂ．Ｖ．の強溶出溶液を使用するこの二相溶出法は、１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８５）のみで得られたプロファイルに類似したアイソフォーム１および４に関するＲＰ−ＨＰＬＣ分析プロファイルを与えた（図２０、パネルＡおよびＣ）。ＩＦＮ純度（＞９６％）および収集可能な収率は標準法と比べて改善したが、ＩＦＮピークの後期画分において少量のアイソフォーム４が溶出した。５Ｂ．Ｖ．への該強溶出工程の短縮はアイソフォーム分離を改善せず、それどころか、アイソフォーム１のピークの後期画分において、より多くのアイソフォーム４が溶出した（図２０、パネルＢ）。

２．１７．５ｍＭ ホスファート（ｐＨ５．８５）での第１相溶出；１７．５ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．９）での第２相溶出
高ｐＨホスファートバッファー（ｐＨ６．３）はＩＦＮピークの後期部分におけるアイソフォーム４溶出を克服しなかったため、該弱溶出工程のために更に高いｐＨを試した。この実験のために、ＩＦＮ−α２ｂ調製物５を使用した。充填され洗浄されたカラムを６．５Ｂ．Ｖ．の１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８５）、ついで１５Ｂ．Ｖ．の１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．９）で処理した。結果を図２１に示す。

アイソフォーム１は小さな体積で鋭いピークとして溶出したが、驚くべきことに、多量のアイソフォーム４もこのピークにおいて溶出した（図２１、パネルＡ）。より小さな体積の強溶出バッファー（ｐＨ５．８５）の使用がアイソフォーム４溶出を減少させるという本発明者らの仮定に反して、３．７Ｂ．Ｖ．の強溶出溶液のみを使用した場合には、アイソフォームＡの分離はより一層悪化した（図２１、パネルＢ）。

３．アイソフォーム４の溶出の抑制における低い伝導度の決定的な役割
ｐＨ６．３またはｐＨ７．９のいずれかにおける１７．５ｍＭ リン酸ナトリウムバッファーでの溶出がアイソフォーム４の溶出を減少させるどころか増加させたことは当惑させるものであった。なぜなら、高ｐＨ条件は、それ以外の点では、ＤＥＡＥ樹脂へのアイソフォーム４の結合を促進するはずだからである。図２２は幾つかの二相溶出実験の伝導度、ｐＨおよびＯＤ２８０の重ね合わせを示す。これらの実験においてＩＦＮは類似ｐＨ範囲で溶出したが、アイソフォーム１のピーク下の伝導度は、異なるプロファイルを示した。全ての場合において、溶出中の伝導度が、まず、減少し、横ばいになり、ついで増加して、アイソフォーム１のピークの内部またはその周辺にカップ形を形成する。しかし、該カップの底のサイズは該強溶出のカラム体積によって変動した。第１溶出工程の長さが増加するにつれて、特に、第２溶出工程にｐＨ７．９のバッファーを使用した場合に、該カップはより深く且つより大きくなった。より重要なことに、伝導度は、アイソフォーム１のピークの後半に、特に、短い第１溶出工程の後、上昇した（図２２、パネルＡ〜ＤおよびＥ）。該弱溶出工程中の伝導度の増加は、アイソフォーム１と共に溶出したアイソフォーム４の量と良く相関した。このことは、伝導度がｉｓｏ４の溶出において決定的な役割を果たしたことを示唆している。高ｐＨバッファー、特に、ｐＨ７．９のバッファーは、流出液の伝導度を有意に増加させ、したがってアイソフォーム４の溶出の速度を増加させた。

Ｄ．種々のｐＨ値における種々のホスファート濃度の使用
より高い伝導度がアイソフォーム４の溶出を説明するものと考えられたため、本発明者らは、種々の体積（２〜６Ｂ．Ｖ．）の強溶出溶液（１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ５．８５）を使用し、ついでｐＨ７．９における１５Ｂ．Ｖ．の遥かに低いホスファート濃度（５ｍＭ リン酸ナトリウム）での第２相溶出を用いて、ＩＦＮ−α２ｂ調製物５に関する二相溶出を行って、この溶出がアイソフォーム４の溶出を抑制する可能性を試験した。予想どおり、これらの条件下、第２溶出相中に、遥かに低い伝導度（０．７３ｍＳ／ｃｍ）が検出された（データ非表示）。該溶出結果を図２３に示す。

相対的に少量のアイソフォーム４が溶出し、一方、アイソフォーム１は鋭いピークとして有効に溶出した。より高い濃度のホスファート（１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ７．９）を弱溶出相に使用する二相溶出と比較して、該アイソフォーム分離効率は著しく改善された（図２０および２１を図２３と比較されたい）。これは更に、アイソフォーム４の溶出の抑制における低い伝導度の重要性を示している。

強バッファーを使用する第１相溶出工程の長さは、アイソフォーム１および４に関する溶出プロファイルを劇的には変化させなかった。ただし、第１相溶出工程の長さの増加は両方の該カラム上のアイソフォームに関する保持時間を減少させたようであり（図２３）、また、より短い長さ（３Ｂ．Ｖ．）の強バッファー溶出を用いた場合には、より多量（１２％）の未溶出アイソフォーム１が該カラム上に残存した。６Ｂ．Ｖ．のバッファーで強溶出を行った場合には、溶出したアイソフォーム１のピークはより鋭く、僅か３％の未溶出アイソフォーム１が存在したに過ぎなかった。

総合すると、１７．５ｍＭ ホスファート（ｐＨ５．８５）および５ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．９）での二相溶出法は、標準的なＤＥＡＥクロマトグラフィー法と比較して有意な改善をもたらした。しかし、アイソフォーム１のピークにおける最後の画分の１つ又は２つは尚も、それらの画分がより早期の画分において収集されることを可能にするのに許容されるものより高い比率のアイソフォーム４を含有していた。

Ｅ．１７．５ｍＭおよび５ｍＭホスファート（ｐＨ５．８５）を使用する二相溶出に対する追加的パラメーターの効果
カラムの性能に影響を及ぼしうる幾つかの追加的パラメーター、例えば、ＩＦＮの量、第２バッファー濃度、カラム長および流量を調べた。

１．ローディング
カラム体積の７５％である標準ローディング量（約３．５ｍｇ／ｍｌ）の０．５倍（０．５×）、１倍（１×）および１．５倍（１．５×）から供給量を変化させることにより、該カラム上にローディングされるＩＦＮ濃度の効果を調べた。６Ｂ．Ｖ．の１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８５）で第１相溶出を行い、ついで１５Ｂ．Ｖ．の５．０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８５）で第２相溶出を行った。結果を図２４に示す。

通常のローディングの０．５〜１．５倍のＩＦＮローディング量は類似溶出プロファイルを与えて、アイソフォーム１および４の、類似した分離効率をもたらした。予想どおり、０．５倍のローディング量においては、ピーク高が通常のローディング量（１倍）より低かった。しかし、１．５倍のローディング量におけるピーク高は１倍のローディング量の場合より高くはなく、幅広かった。また、ＯＤ３２０のピーク（ＯＤ２８０のピークの約２％）は１．５倍のローディング量では溶出したが、これは１倍のローディング量では観察されなかった。これは、１．５倍の溶出中に幾らかの沈殿が生じたことを示している。アイソフォーム１のピークの後期画分におけるアイソフォーム４の比率は、高ローディング（１．５倍）においては、低ローディングの場合（０．５倍および１倍においては０．６％未満のアイソフォーム４）より若干高い（１〜２％）ものの、これらのローディング条件下、アイソフォーム４はアイソフォーム１のピークにわたって低いことを、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は示した。これらのデータは、０．５〜１．５倍の範囲内の供給ローディング量においてはカラム性能が非常に一貫していることを示唆している。

２．弱溶出バッファーにおけるホスファート濃度
第１相溶出工程後のアイソフォーム１の溶出を更に調べるために、弱溶出バッファー中の種々の濃度のホスファート（リン酸塩）を調べた。結果を図２５に示す。興味深いことに、ｐＨ５．８５における１２．５〜５ｍＭの範囲のホスファート濃度は該カラムからのアイソフォーム４の溶出を抑制することが可能であった。アイソフォーム１画分のほとんどは０．５％未満のアイソフォーム４を含有していた。しかし、溶出バッファーの濃度が５ｍＭから１２．５ｍＭへと増加するにつれて、アイソフォーム１に関するピーク高は２．５ｍｇ／ｍｌから約０．８ｍｇ／ｍｌまで減少した。したがって、試験範囲（５〜１２．５ｍＭ）内の弱溶出バッファー濃度はアイソフォーム１のピークのフォーカシングまたは鋭さに影響を及ぼしたが、伝導度においては、アイソフォーム４の溶出を抑制するのに十分な程度に尚も低かった。

３．カラム長
３つの異なる長さ（５、１０および２０ｃｍ）の直径０．５ｃｍのカラムおよび直径１ｃｍ×長さ２９ｃｍのカラム上でＤＥＡＥクロマトグラフィーによる二相溶出を行った。結果を図２６に示す。

明らかに、該カラムの長さはアイソフォーム４の溶出に幾らかの影響を及ぼした。アイソフォーム１のピークの鋭さはこれらのカラムにおいて類似プロフィールを示したが、アイソフォーム１および４の分離効率はカラム長によって異なっていた。長さが減少するにつれて、アイソフォーム１の後期画分において溶出したアイソフォーム４の量は長さ２０ｃｍのカラムでの０．５％未満から長さ５または１０ｃｍのカラムでの約２．５％まで有意に増加した。より大きなカラム（１．０ｃｍ×２９ｃｍ）はアイソフォーム１および４の非常に有効な分離を示し、全てのアイソフォーム１ピーク画分は０．５％未満のアイソフォーム４を含有していた。また、アイソフォーム１ピーク画分の濃度は３．６ｍｇ／ｍｌにも達した。該濃度は、ＩＦＮの幾らかの沈殿が４℃においても生じるのに十分な程度に高かった。しかし、既に記載されているとおりにｐＨまたは塩濃度を調節することにより、この沈殿は溶解されうるであろう。これらの結果は、十分な性能のためには約２０ｃｍのカラム長が必要であることを示唆している。

４．流量
１７．５ｍＭ ホスファートでの第１相溶出および５ｍＭ ホスファート（ｐＨ５．８５）での第２相溶出を用いる二相溶出に対する流量の影響を、５ｃｍ／分または０．５ｃｍ／分でカラム（０．５×１０ｃｍ）内の流動を行うことにより調べた。結果は、流量が、これらの条件下の分離の予想を有意には変化させないことを示した（図２７）。しかし、より低い流量での流動は分離効率を改善するようであった。これは、より低い流量がカラム性能を改善するという一般的観察と合致する。

結論
これまでの報告における本発明者らのデータに基づき、小さな溶出体積におけるアイソフォーム４からのアイソフォーム１の有効な分離を可能にする、ＩＦＮ ＤＥＡＥクロマトフォーカシングのための２工程または「二相」溶出法を、本研究において開発した。アイソフォーム１のピークにおける幾らかの非常に後期の画分が比較的高い比率のｉｓｏ４を含有していたものの、ｐＨ６における高濃度および低濃度のホスファート（リン酸塩）バッファーまたは種々の濃度における低ｐＨおよび高ｐＨのバッファーの使用は、標準的なＤＥＡＥクロマトグラフィー法において用いられる１工程溶出と比較して有意な改善をもたらした。ｐＨ５．８５における１７．５ｍＭ ホスファートでの第１溶出相およびそれに続くｐＨ５．８５における５ｍＭ ホスファートでの第２溶出相の組合せが最終的なアイソフォーム１の純度、回収および収集体積の点で最も満足しうる結果を与えた。

溶出中に生じる伝導度はアイソフォームの溶出における決定的な役割を果たした。１ｍＳ／ｃｍの閾値を超える伝導度がアイソフォーム４の溶出を増加させるようであった。

該二相溶出法は、ＩＦＮローディング量（現在の方法の０．５〜１倍）、流量（０．５〜５ｃｍ／分）およびカラム長（１０〜３０ｃｍ）の試験範囲内で理論的に一貫した結果を与えた。カラムへの過剰ローディングはアイソフォーム１のピークの後期画分におけるアイソフォーム４の溶出を増加させた。カラム長はカラム性能に影響を及ぼし、より短い長さ（１０ｃｍ未満）のカラムは、アイソフォーム１および４の、より低い効率の分離をもたらした。

本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態により、範囲において限定されるものではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の種々の修飾が、前記説明から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。

特許、特許出願、刊行物、製品説明書およびプロトコール書が本出願の全体にわたって引用されているが、それらの開示の全体を、あらゆる目的で、参照により本明細書に組み入れることとする。

Claims (29)

1. インターフェロン（ＩＦＮ）の酸化型単量体アイソフォームを、該ＩＦＮの組換え製造アイソフォームの混合物において、そのＩＦＮの１以上の非所望アイソフォームから分離する方法であって、
   （ａ）第１バッファー溶液中にＩＦＮアイソフォームの混合物を準備し、
   （ｂ）第１または第２バッファー溶液で平衡化されたアニオン交換樹脂が充填された１５ｃｍより長いクロマトグラフィーカラムを準備し、
   （ｃ）該緩衝化ＩＦＮ溶液を該アニオン交換カラム上にローディングし、
   （ｄ）該ロード化カラムを洗浄溶液で洗浄し、
   （ｅ）１〜１０カラム体積の量の強溶出溶液（該強溶出溶液は１０〜３０ｍＭの濃度の第１ホスファート濃度を含み、５．４〜６．６のｐＨを有する）を該洗浄カラムに適用し、
   （ｆ）２〜２０カラム体積の量の弱溶出溶液（該弱溶出溶液は、第１ホスファート濃度より低い第２ホスファート濃度を含み、５．４〜６．６のｐＨを有する）を工程（ｅ）からのカラムに適用し、
   （ｇ）該酸化型ＩＦＮ単量体アイソフォームを含有する複数の溶出画分を集めることを含む方法。
2. 該アニオン交換樹脂がジエチルアミノエチルアニオン交換樹脂である、請求項１記載の方法。
3. 該アニオン交換樹脂がＤＥＡＥセファロース・ファーストフロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）である、請求項２記載の方法。
4. 該ＩＦＮがＩ型ＩＦＮである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 該ＩＦＮがインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）である、請求項４記載の方法。
6. 該ＩＦＮがＩＦＮ−α２であり、第１および第２バッファー溶液のそれぞれが１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０〜４０ｍＭ ＮａＣｌから実質的になり、７．０〜８．５のｐＨを有する、請求項５記載の方法。
7. 第１バッファー溶液が１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ＮａＣｌから実質的になり、８．０のｐＨを有し、第２バッファー溶液が１０ｍＭ Ｔｒｉｓから実質的になり、８．０のｐＨを有し、該洗浄溶液が１０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび１４ｍＭ ＮａＣｌから実質的になり、８．０のｐＨを有する、請求項６記載の方法。
8. 第１ホスファート濃度が約１７．５ｍＭであり、第２ホスファート濃度が約５ｍＭ〜約７ｍＭであり、該強および弱溶出溶液のそれぞれが５．８５のｐＨを有する、請求項６または７記載の方法。
9. 該ＩＦＮがＩＦＮ−α２であり、該強溶出溶液が１７．５ｍＭ リン酸ナトリウムから実質的になり、該弱溶出溶液が５ｍＭ リン酸ナトリウムから実質的になる、請求項８記載の方法。
10. 工程（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）のそれぞれを０．５〜２．５ｃｍ／分の流量で行う、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
11. 工程（ｃ）および（ｄ）のそれぞれを２ｃｍ／分の流量で行い、工程（ｅ）および（ｆ）のそれぞれを１ｃｍ／分の流量で行う、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
12. 該ＩＦＮがＩＦＮ−α２ｂであり、該ＩＦＮ溶液中のＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム１の濃度が約１．７５ｍｇ／ｍｌ〜約５．２５ｍｇ／ｍｌである、請求項１１記載の方法。
13. 該ＩＦＮ溶液中のＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム１の濃度が約３．５ｍｇ／ｍｌである、請求項１２記載の方法。
14. 工程（ｅ）において適用する強溶出溶液の量が６カラム体積であり、工程（ｆ）において適用する弱溶出溶液の量が１５カラム体積である、請求項１２記載の方法。
15. 工程（ｇ）において集める溶出画分のそれぞれの体積が該カラム体積の約２０％である、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
16. 該ＩＦＮがＩＦＮ−α２ｂであり、該ＩＦＮ溶液中のアイソフォームの約３％〜約２０％がＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム４を含む、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
17. 該ＩＦＮ溶液中のアイソフォームの６％〜１０％がＩＦＮ−α２ｂアイソフォーム４を含む、請求項１６記載の方法。
18. インターフェロンアルファ−２ｂ（ＩＦＮ−α２ｂ）のアイソフォーム１を、ＩＦＮ−α２ｂの組換え製造アイソフォームの混合物において、ＩＦＮ−α２ｂのアイソフォーム４から分離する方法であって、
    （ａ）１０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび８．０のｐＨから実質的になるバッファー溶液で平衡化された少なくとも約２０ｃｍの長さのジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）アニオン交換クロマトグラフィーカラムを準備し、
    （ｂ）１０ｍＭ Ｔｒiｓ、４０ｍＭ ＮａＣｌから実質的になり７．５〜８．０のｐＨを有するローディングバッファー中で該ＩＦＮ−α２ｂ混合物を該ＤＥＡＥカラム上にローディングし（ここで、該ＩＦＮ−α２ｂ混合物を２ｃｍ／分の流量でローディングする）、
    （ｃ）該ロード化カラムを３カラム体積の洗浄溶液（該洗浄溶液は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌおよび１３ｍＭ ＮａＣｌから実質的になり、８．０のｐＨを有する）で２ｃｍ／分の流量で洗浄し、
    （ｄ）６カラム体積の強溶出溶液（該強溶出溶液は１７．５ｍＭ リン酸ナトリウムから実質的になり、５．８５のｐＨを有する）を１ｃｍ／分の流量で該洗浄カラムに適用し、
    （ｅ）１５カラム体積の弱溶出溶液（該弱溶出溶液は５ｍＭ リン酸ナトリウムから実質的になり、５．８５のｐＨを有する）を１ｃｍ／分の流量で工程（ｄ）からのカラムに適用し、
    （ｆ）アイソフォーム１を含有する複数の溶出画分を集めることを含む方法。
19. アイソフォーム４の量が所望の純度基準未満である集めた溶出画分を合わせることを更に含む、請求項１８記載の方法。
20. 工程（ｆ）において集めた画分のそれぞれの体積が該カラム体積の約２０％である、請求項１８または１９記載の方法。
21. インターフェロン（ＩＦＮ）の所望アイソフォームを、該ＩＦＮの組換え製造アイソフォームの混合物において、そのＩＦＮの１以上の非所望アイソフォームから分離する方法であって、
    （ａ）バッファー溶液（該バッファー溶液は約１０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび約８．０のｐＨから実質的になる）で平衡化されたジエチルアミノエチルアニオン交換樹脂が充填された少なくとも約２０ｃｍの長さのクロマトグラフィーカラムを準備し、
    （ｂ）約８．０のｐＨを有する約１０ｍＭ Ｔｒiｓおよび約４０ｍＭ ＮａＣｌのローディングバッファー中で該ＩＦＮアイソフォーム混合物を該アニオン交換カラムに適用し、
    （ｃ）工程（ｂ）からのカラムを約３カラム体積の洗浄溶液（該洗浄溶液は約１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌおよび約１３ｍＭ ＮａＣｌから実質的になり、約８．０のｐＨを有する）で洗浄し、
    （ｄ）約６カラム体積の強溶出溶液（該強溶出溶液は１５〜２５ｍＭの第１ホスファート濃度を有し、５．７〜６．１のｐＨを有する）を０．５〜２．５ｃｍ／分の流量で該洗浄カラムに適用し、
    （ｅ）約１５カラム体積の弱溶出溶液（該弱溶出溶液は、第１ホスファート濃度より低い第２ホスファート濃度を有し、５．７〜６．１のｐＨを有する）を０．５〜２．５ｃｍ／分の流量で工程（ｄ）からのカラムに適用し、
    （ｆ）該所望ＩＦＮアイソフォームを含有する複数の溶出画分を集め、
    （ｇ）該非所望ＩＦＮアイソフォームの量が所望の純度基準未満である集めた溶出画分を合わせることを含む方法。
22. 該所望アイソフォームが該ＩＦＮの酸化型単量体アイソフォームである、請求項２１記載の方法。
23. 工程（ｂ）および（ｃ）のそれぞれを２ｃｍ／分の流量で行う、請求項２１または２２記載の方法。
24. 工程（ｄ）および（ｅ）のそれぞれを１ｃｍ／分の流量で行う、請求項２３記載の方法。
25. 該ＩＦＮがＩＦＮ−α２ｂであり、該強溶出溶液が１７ｍＭ リン酸ナトリウムから実質的になり、５．８５のｐＨを有する、請求項２１〜２４のいずれか１項記載の方法。
26. 該弱溶出溶液が５ｍＭ リン酸ナトリウムから実質的になり、５．８５のｐＨを有する、請求項２５記載の方法。
27. 該ＩＦＮ溶液中のＩＦＮ−α２の濃度が約１．７５ｍｇ／ｍｌ〜約５．２５ｍｇ／ｍｌである、請求項２６記載の方法。
28. 該ＩＦＮがＩＦＮ−α２ｂである、請求項２７記載の方法。
29. 該ＩＦＮを組換え細菌において製造する、請求項２１〜２８のいずれか１項記載の方法。

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