NO330538B1 - Anvendelse av hydrofob ladningsinduksjonskromatografi for fremstilling av renset IL-18-bindende protein samt fremgangsmate for fremstilling av renset IL -18-bindende protein - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for rensing av IL-18-bindende protein (IL-18BP) fra en væske som omfatter hydrofob ladningsinduksjonskromatografi.

Description

O ppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder feltet proteinrensing. Nærmere bestemt gjelder den rensing av IL-18-bindende protein (IL-18BP) via hydrofob ladningsinduksjonskromatografi. Fortrinnsvis omfatter oppfinnelsen videre rensetrinn utvalgt blant immobilisert metallion-affinitetskromatografi, ionebytterkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og revers fase-kromatografi.

O ppfinnelsens bakgrunn

Proteiner har blitt kommersielt viktige som medikamenter som også generelt betegnes "biologiske midler". En av de største utfordringene er utvikling av økonomiske og effektive fremgangsmåter for rensing av proteiner i kommersiell skala. Selv om mange fremgangsmåter nå er tilgjengelige for fremstilling av proteiner i stor skala, inneholder råproduktene, for eksempel kroppsvæsker, ikke bare det ønskede produkt, men også urenheter som er vanskelige å separere fra det ønskede produkt. Videre inneholder biologiske proteinkilder vanligvis kompliserte blandinger av materialer.

Biologiske kilder, for eksempel celledyrkningssupernatanter fra celler som uttrykker et proteinprodukt på rekombinant måte, kan inneholde færre urenheter, særlig dersom cellene dyrkes i serumfritt medium. Helsemyndighetene stiller imidlertid høye krav til renheten av proteiner som er beregnet for tilførsel til mennesker. I tillegg kan mange rensefremgangsmåter omfatte trinn som krever anvendelse av lav eller høy pH, høye saltkonsentrasjoner eller andre ekstreme betingelser som kan ødelegge et gitt proteins biologiske aktivitet. For ethvert problem er det således en utfordring å etablere en rensefremgangsmåte som tillater tilstrekkelig renhet, samtidig som proteinets biologiske aktivitet bibeholdes.

Ionebytterkromatografisystemer har blitt hyppig anvendt for separasjon av proteiner, primært basert på forskjeller i ladning. I ionebytterkromatografi tiltrekkes ladede områder på overflaten av det oppløste materiale av motsatte ladninger koblet til et kromatografisk støttemiddel, forutsatt at ionestyrken i den omliggende buffer er lav. Eluering oppnås generelt ved å øke ionestyrken (dvs. konduktiviteten) av bufferen, slik at denne konkurrerer med det oppløste stoff om ladede seter på ionebytterstøttemidlet. Endring av pH, og derved endring av det oppløste stoffs ladning, er en annen måte å oppnå eluering av det oppløste stoff på. Endringen i konduktivitet eller pH kan skje gradvis (gradienteluering) eller trinnvis (trinneluering).

Anionebyttere kan klassifiseres som enten svake eller sterke. Den ladede gruppen på en svak anionbytter er en svak base som blir deprotonert og følgelig mister ladningen ved høy pH. DEAE-cellulose er et eksempel på en svak anionbytter, hvor aminogruppen kan være positivt ladet under pH~9 og gradvis mister ladningen ved høyere pH-verdier. Dietylaminoetyl (DEAE) eller dietyl-(2-hydroksy-propyl)aminoetyl (QAE) har for eksempel klorid som motion.

En kraftig anionbytter inneholder derimot en kraftig base som forblir positivt ladet gjennom hele pH-området som normalt anvendes for ionebytterkromatografi (pH 1-14). Q-sefarose (hvor Q står for kvaternært ammonium) er et eksempel på en kraftig anionbytter.

Kationbyttere kan også klassifiseres som enten svake eller kraftige. En kraftig kationbytter inneholder en sterk syre (for eksempel en sulfopropylgruppe) som forblir ladet fra pH 1-14, mens en svak kationbytter inneholder en svak syre (for eksempel en karboksymetylgruppe), som gradvis mister ladningen etter hvert som pH avtar under 4 eller 5. Karboksymetyl (CM) og sulfopropyl (SP) har for eksempel natrium som motion.

Kromatografisystemer med en hydrofob stasjonær fase benyttes også hyppig for rensing av proteiner. Innbefattet i denne gruppen er hydrofob interaksjonskromatografi (HIC) og revers fase-væskekromatografi (RPLC). Det fysikalsk-kjemiske grunnlag for separasjon ved HIC og RPLC er den hydrofobe virkningen: proteiner separeres på en hydrofob stasjonær fase basert på forskjeller i hydrofobisitet.

I HIC settes generelt prøvemolekyler i en buffer med høy saltkonsentrasjon på HIC-kolonnen. Saltet i bufferen interagerer med vannmolekyler og reduserer bindingen av vann til molekylene i løsningen, slik at hydrofobe områder i prøvemolekylene eksponeres og deretter adsorberes til HIC-kolonnen. Jo mer hydrofobt molekylet er, jo mindre salt er nødvendig for å fremme binding. Vanligvis anvendes en avtagende saltgradient for røring av prøver fra kolonnen. Etter hvert som ionestyrken avtar, øker eksponeringen av de hydrofile områdene i molekylene, og molekylene elueres fra kolonnen i en rekkefølge med økende hydrofobisitet. Prøveeluering kan også oppnås ved tilsetning av milde organiske modifiserende midler eller detergenter til elueringsbufferen. En oversikt over HIC gis blant annet i Protein Purification, 2. utgave, Springer-Verlag, New York, s. 176-179 (1988).

I HIC er forskjellige kromatografiske støttemidler som bærer forskjellige ligander tilgjengelig. Ligandene er forskjellige når det gjelder hydrofobisitet. Vanlig anvendte hydrofobe ligander er fenyl-, butyl- eller oktylrester.

Hydrofob ladningsinduksjonskromatografi er en undergruppe av HIC som benytter resiner som bærer ligander som 4-merkaptoetylpyridin-dereivater. Et resin for hydrofob ladningsinduksjonskromatografi er MEP-HyperCel® (Boschetti et al., Genetic Engineering, bind 20, nr. 13, juli 2000, Boschetti og Jungbauer, 2000).

Revers fase-kromatografi er en proteinrensefremgangsmåte som er nært beslektet med HIC, siden begge bygger på interaksjoner mellom løsemiddeltilgjengelige, upolare grupper på overflaten av biomolekyler og hydrofobe ligander på støttemidlet. Imidlertid er ligandene som anvendes i revers fase-kromatografi i større grad substituert med hydrofobe ligander enn HIC-ligander. Mens substitusjonsgraden for HIC-adsorbsjonsmidler kan ligge i området 10-50 umol/ml støttemiddel for C2-C8-aryl-ligander, anvendes vanligvis flere hundre umol/ml støttemiddel av C4-C8-alkyl-ligander for revers fase-kromatografi adsorbsjonsmidler.

Hydrofob interaksjonskromatografi og revers fase-kromatografi skiller seg også fra hverandre ved at hydrofob interaksjonskromatografi utføres i vandige løsemidler, og endringer i ionestyrke anvendes for eluering av kolonnen. Proteinet bindes typisk i nativ tilstand via hydrofobe grupper som er lokalisert til proteinets overflate, og den native tilstand bibeholdes under elueringsbetingelsene. I motsetning til dette, benytter revers fase-kromatografi et hydrofobt løsemiddel (vanligvis acetonitril) og bindingen av en ligand er en funksjon av fasefordelingen mellom løsemidlets hydrofobe natur og kolonnens funksjonelle grupper. Proteiner denatureres typisk i en viss grad i slike løsemidler og bindes grunnet hele polypeptidsekvensens hydrofobe natur. Siden de fleste hydrofobe grupper er lokalisert til kjernen av globulære proteiner, er bindingen forbundet med omfanget av denaturering av proteinet og tilgjengeligheten av disse gruppene for kolonnens funksjonelle grupper.

Source 30RPC-kolonnen er et polymert revers fase-støttemiddel. Den er basert på rigide polystyren/divinylbenzenkuler med en ensartet størrelse på 30 mikrometer diameter. Egenskapene kan oppsummeres som følger: Bemerkelsesverdig bredt pH-område (1-12), høy selektivitet, høy kjemisk motstandsevne, høy kapasitet og høy resolusjon ved høye elueringshastigheter.

Nok en kromatografitype som hyppig benyttes for rensing av proteiner betegnes immobilisert metallion-affinitetskromatografi (IMAC). 1 1975 innførte Porath immobilisert metallion-affinitetskromatografi (IMAC) for fraksjonering av proteiner [J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson og G. Belfrage, Nature (London) 258, 598-599 (1975)]. I Poraths arbeid omfatter IMAC derivatisering av et resin med iminodieddiksyre (IDA) og chelatbinding av metallioner til det IDA-derivatiserte resin. Proteinene separeres basert på affiniteten for metallioner, som har blitt immobilisert ved chelatbinding. Proteiner bindes til metallioner via ikke-okkuperte koordineringsseter og immobiliseres til kolonnen. Siden da, har andre ligander enn IDA blitt benyttet for chelatbinding av metallioner til resiner. Undersøkelser med serumproteiner har vist at IMAC er en ekstremt spesifikk og selektiv separasjonsteknikk [J. Porath og B. Olin, Biochemistrv, 22, 1621-1630 (1983)]. Adsorbsjonsmidlet fremstilles ved å koble en metallchelat-dannende ligand, for eksempel iminodieddiksyre, til Sepharose eller superose og behandle materialet med en løsning av et eller flere divalente metallioner, for eksempelZn2+, Cu<2+>, Cd<2+>, H<g2+,><Co2+,>Ni<2+>eller Fe<2+>. Bindingsreaksjonen er pH-avhengig, og elueringen utføres ved å redusere pH og øke bufferens ionestyrke eller ved å tilsette EDTA til bufferen.

De faktiske mekanismene som gir opphav til binding av proteiner til frie metallioner er ikke godt forstått og avhenger av en rekke faktorer, ikke minst det angjeldende proteins konformasjon. Når metallionene immobiliseres, inngår imidlertid minst tre begrensede faktorer, nemlig et redusert antall tilgjengelige koordineringsseter på metallet, begrenset tilgjengelighet av det bundne metall til bindingssetene på proteinet og, avhengig av resinets egenskaper, begrenset tilgang for proteinene til det immobiliserte metallion. Det er således ekstremt vanskelig å angi på forhånd hvilke proteiner som vil eller ikke vil vise affinitet for immobiliserte metallioner.

Interleukin-18-bindende protein (IL-18BP) er et naturlig forekommende, løselig protein som opprinnelig ble affinitetsrenset fra urin på en IL-18-kolonne (Novick et al. 1999). IL-18BP hindrer IL-18-induksjon av IFN-y og IL-18-aktivering av NF-kB in vitro. I tillegg inhiberer IL-18BP induksjon av IFN-y i mus injisert med LPS. IL-18BP-genet har blitt lokalisert til det humane kromosom 11, og intet exon som koder for et transmembrandomene kunne påvises i den genomiske sekvensen på 8,3 kb som omfatter IL-18BP-genet. Fire isoformer av IL-18BP, dannet ved alternativ mRNA-spleising, har blitt påvist til nå i mennesker. Disse ble betegnet IL-18BP a, b, c og d, og alle har den samme N-enden og forskjellige C-ender (Novick et al. 1999). Disse isoformene varierer når det gjelder evnen til å binde IL-18 (Kim et al. 2000). Av de fire humane IL-18BP (hIL-18BP)-isoformene vites isoformene a og c å ha en nøytraliserende kapasitet for IL-18. Den vanligste IL-18BP-isoformen, isoform a, viser høy affinitet for IL-18 med en rask på-hastighet og en langsom av-hastighet og en dissosiasjonskonstant (Kd) på tilnærmet 0,4 nm (Kim et al. 2000). IL-18BP uttrykkes konstitutivt i milten og tilhører immunoglobulin-superfamilien. Aminosyrerestene som deltar i interaksjonen mellom IL-18 og IL-18BP har blitt beskrevet ved anvendelse av datamaskinbasert modellering (Kim et al. 2000) og basert på interaksjonen mellom det lignende protein IL-16 og IL-IR type I (Vigers et al. 1997). IL-18BP foreligger konstitutivt i mange celler (Puren et al. 1999) og i sirkulasjonen hos friske mennesker (Urushihara et al. 2000), noe som representerer et unikt fenomen i cytokinbiologien. Grunnet den høye affinitet melllom IL-18BP og IL-18 (Kd=0,4 nm) så vel som den høye konsentrasjonen av IL-18BP som foreligger i sirkulasjonen (20 gangers molart overskudd relativt til IL-18), har det blitt foreslått at de fleste, om ikke alle IL-18-molekyler i sirkulasjonen er bundet til IL-18BP. Således kan sirkulerende IL-18BP som konkurrerer med celleoverflatereseptorer for IL-18 fungere som naturlig anti-inflammatorisk og immunsupprimerende molekyl. IL-18BP har blitt foreslått som et terapeutisk protein for en rekke sykdommer og forstyrrelser, for eksempel psoriasis, Crohns sykdom, reumatoid artritt, psoriatisk artritt, leverskade, sepsis, aterosklerose, iskemiske hjertesykdommer, allergier, osv., se for eksempel WO 9909063, WO 0107480, WO 0162285, WO 0185201, WO 02060479, WO 02096456, WO 03080104, WO 02092008, WO 02101049, WO 03013577. Siden IL-18BP har blitt foreslått som et terapeutisk protein for tilførsel til for eksempel mennesker, foreligger det et behov for tilstrekkelige mengder av IL-18BP med tilstrekkelig høy renhet.

Til nå er imidlertid ingen rensefremgangsmåte tilgjengelig som gir renset IL-18BP.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse bygger på utviklingen av en rensefremgangsmåte for IL-18-bindende protein (IL-18BP).

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av hydrofob

ladningsinduksjonskromatografi for fremstilling av renset IL-18-bindende protein (IL-18BP).

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte for fremstilling av renset IL-18BP, kjennetegnet ved at den omfatter å behandle en væske ved hydrofob ladningsinduksj onskromatografi.

Nærmere bestemt omfatter rensefremgangsmåten ifølge oppfinnelsen videre et trinn utvalgt blant immobilisert metallion-affinitetskromatografi, ionebytterkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og revers fase-kromatografi.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 viser en skjematisk oversikt over en foretrukket rensefremgangsmåte ifølge oppfinnelsen som fører til renset til IL-18BP ("IL-18BP BULK"). Fig. 2 viser dose-responskurver for IL-18BP-referansemateriale i Kg-l-m vitro-bioanalysen i 10 uavhengige eksperimenter.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse bygger på utvikling av en rensefremgangsmåte for IL-18BP som fører til renset IL-18BP.

I et første aspekt gjelder oppfinnelsen anvendelse av hydrofob ladningsinduksjonskromatografi for rensing av IL-18BP. I en foretrukket utførelse utføres dette trinnet med hydrofob ladningsinduksjonskromatografi i kombinasjon med et eller flere trinn utvalgt blant immobilisert metallion-affinitetskromatografi, ionebytterkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og revers fase-kromatografi.

Hydrofob ladningsinduksjons-trinnet utføres fortrinnsvis på et 4-merkaptoetylpyridin (MEP)-resin.

I en videre foretrukket utførelse utføres hydrofob ladningsinduksjons-trinnet i kombinasjon med et eller flere trinn utvalgt blant immobilisert metallion-affinitetskromatografi, ionebytterkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og revers fase-kromatografi. De enkelte kromatografi-trinnene kan utføres i hvilken som helst egnet rekkefølge.

I et andre aspekt gjelder opprinnelsen en fremgangsmåte for rensing av IL-18-bindende protein (IL-18BP) fra en væske som omfatter et trinn med hydrofob ladningsinduksj onskromatografi.

Begrepet "resin" som anvendt heri viser til hvilket som helst støttemiddel eller bærermateriale som anvendes i en kromatografikolonne, for eksempel agarose, sefarose, superose, dekstran, sefadeks, polypropylen eller lignende, som kan derivatiseres med ligander eller funksjonelle grupper, for eksempel DEAE, CM, MEP eller fenyl, som forklart i detalj i "Oppfinnelsens bakgrunn". Støttemiddelmaterialene kan foreligge i forskjellige kryssbundne former, avhengig av den spesifikke anvendelse. Volumet av resinet samt lengden og diameteren av kolonnen som skal anvendes avhenger av flere parametere, for eksempel væskevolumet som skal behandles, konsentrasjonen av proteinet i væsken som skal behandles ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, osv., og en fastsettelse av disse, ligger godt innenfor kunnskapsområdet til fagpersonen.

Hydrofob ladningsinduksjonskromatografi utføres fortrinnsvis på et resin med 4-merkaptoetylpyridin (MEP) som immobilisert ligand. MEP-HyperCel<®>er et resin som er spesielt godt egnet i forbindelse med foreliggende oppfinnelse.

Fremgangsmåten omfatter fortrinnsvis videre minst et trinn utvalgt blant immobilisert metallion-affinitetskromatografi, ionebytterkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og revers fase-kromatografi. De enkelte kromatografi-trinnene kan utføres i hvilken som helst rekkefølge. Hvert enkelt trinn kan også utføres mer enn en gang om nødvendig.

Immobilisert metallion-affinitetskromatografi utføres fortrinnsvis på et chelatbindende resin, for eksempel chelatbindende sefarose.

Ionebytterkromatografitrinnet kan omfatte en anionbytter eller en kationbytter. Det foretrekkes å anvende et kationionbytter-kromatografimateriale, fortrinnsvis et svakt kationbyttermateriale, og det foretrekkes i stor grad å anvende et karboksymetyl (CM)-resin, for eksempel CM sefarose FF, for utførelse av dette trinnet i rensefremgangsmåten.

Hydrofob interaksjonskromatografi (HlC)-trinnet kan utføres på hvilket som helst kjent HIC-resin, for eksempel et resin med alkyl- eller arylrester som immobilisert ligand. Butyl-, oktyl- eller fenyl-sefarose (agarose) er videre eksempler på slike HIC-resiner. Det foretrekkes å anvende et fenylresin, for eksempel fenyl-sefarose FF, for dette trinnet i rensefremgangsmåten.

Rensefremgangsmåten kan videre omfatte et revers fase-kromatografitrinn. Et foretrukket materiale for dette trinn er revers fase-source 30 RPC.

I en svært foretrukket utførelse omfatter fremgangsmåten for rensing av IL-18BP fra en væske følgende trinn: (a) Behandling av væsken ved immobilisert metallion-affinitetskromatografi, (b) Behandling av eluatet fra metallion-affinitetskromatografien ved hydrofob

ladningsinduksjonskromatografi,

(c) Behandling av eluatet fra hydrofob ladningsinduksjonskromatografi en ved

kationbytterkromatografi,

(d) Behandling av ubundet materiale fra kationbytterkromatografien ved

hydrofob interaksjonskromatografi,

(e) Behandling av eluatet fra hydrofob interaksjonskromatografien ved revers fase-kromatografi.

Selv om rekkefølgen av trinnene (a) til (e) foretrekkes, kan trinnene i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres i hvilken som helst rekkefølge som fører til et renset proteinprodukt. Hvilket som helst rensetrinn ifølge oppfinnelsen kan også utføres alene (isolert), for å oppnå en viss grad av renhet eller fjerning av urenheter avledet fra vertscellen eller mediet. Det bør bemerkes at i denne foretrukne rensefremgangsmåten bindes IL-18BP ikke til kationbytterresinet, og følgelig anvendes ubundet materiale fra denne kolonnen for videre behandling. De andre resinene som benyttes i forbindelse med rensefremgangsmåten ifølge oppfinnelsen binder IL-18BP, mens urenheter ikke bindes. Etter binde- og vasketrinnene, elueres IL-18BP under visse betingelser. I disse trinnene anvendes eluatet videre.

Trinn (a) utføres fortrinnsvis på en chelatbindende sefarose-kolonne, for eksempel en chelatbindende sefarose fast flow-kolonne med chelatbundne Zn<2+>ioner. Bindingen av IL-18BP utføres fortrinnsvis ved pH 8,5 ±0,1, fortrinnsvis i 50 mM natriumfosfat og 0,5 M NaCl med denne pH. Et vasketrinn kan utføres med 15 mM ammoniumklorid i ekvilibreirngsbuffer. Elueringen utføres fortrinnsvis ved pH 9,0 ± 0,5, f. eks. ved pH 8,7 eller pH 9, f. eks. i 0,075 M ammoniumacetat eller i 0,06 M ammoniumacetat med denne pH.

Trinn (b) utføres fortrinnsvis på en MEP (4-merkaptoetylpyridin-derivat) kolonne, for eksempel MEP-HyperCel<®>(LifeSciences). Binding av IL-18BP utføres fortrinnsvis ved pH 6,1 ± 0,1, f. eks. i IX PBS + 1 NaCl med denne pH. Elueringen utføres fortrinnsvis ved pH 8,4 ± 0,1, f. eks. med 20 mM fosfatbuffer pluss 35% propylenglykol, hvor blandingen har pH 8,4 ±0,1.

Trinn (c) utføres fortrinnsvis på en karboksymetyl-sefarose (CM) kolonne. Dette er et trinn hvori ubundet materiale oppsamles for videre rensing. Dette trinnet bygger på det faktum at under spesifikke omstendigheter når det for eksempel gjelder salt og pH, bindes IL-18BP ikke til resinet, mens urenheter (for eksempel vertscelleproteiner, serumavledede proteiner) bindes. Trinn (c) utføres fortrinnsvis ved pH 6,0 ± 0,2, for eksempel i nærvær av 1 mM MES (N-morfolinoetansulfonsyre).

Trinn (d) utføres fortrinnsvis på en fenyl-sefarose kolonne, for eksempel en fenyl-sefarose Fast Flow kolonne. Bindingen av IL-18BP utføres fortrinnsvis ved tilnærmet pH 9,1 ± 0,2, for eksempel i 50 mM natriumborat og 0,9 M ammoniumsulfat eller 0,10 M ammoniumsulfat med denne pH. Elueringen fra fenyl-sefarose kolonnen utføres fortrinnsvis ved pH 9,1 ± 0,2 i nærvær av en forhøyet saltkonsentrasjon, for eksempel med 50 mM natriumborat 9,1 ± 0,2, 0,15 M ammoniumsulfat med denne pH.

Trinn (e) utføres fortrinnsvis på en Source 30 RPC kolonne. Binding av IL-18BP til kolonnematerialet utføres fortrinnsvis ved pH 9,1 ± 0,2, f. eks. i 50 mM natriumborat-buffer. Elueringen utføres fortrinnsvis ved anvendelse av en gradient, hvor IL-18BP elueres rundt 28-32% 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) i acetonitril.

Det bør forstås at betingelsene beskrevet ovenfor i forbindelse med trinnene (a) til (e) i rensingen også kan benyttes dersom enkelttrinn eller underkombinasjoner av trinn av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres.

I en videre foretrukket utførelse av foreliggende rensefremgangsmåte utføres et eller flere ultrafiltreringstrinn. Ultrafiltrering er anvendbart for fjerning av lavmolekylære bestanddeler i eluatene som foreligger grunnet tidligere kromatografitrinn. Denne ultrafiltreringen tillater fjerning av organisk løsemiddel, TFA og salter fra det foregående trinn, ekvilibrering av IL-18BP i lagringsbufferen og oppkonsentrering av molekylet til den ønskede konsentrasjon. Slik ultrafiltrering kan for eksempel utføres ved ultrafiltreringsinnretninger som fjerner bestanddeler med en molekylvekt under 5 kDa.

Ultrafiltreringen utføres fortrinnsvis mellom trinnene (b) og (c) og/eller etter trinn (e). Mer foretrukket utføres to ultrafiltreringstrinn, et mellom trinnene (b) og (c) og et etter trinn (e).

Dersom proteinet som er renset ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er beregnet for tilførsel til mennesker, er det fordelaktig å videre innbefatte et eller flere trinn med virusfjerning i fremgangsmåten. Fortrinnsvis utføres et virusfjernende filtreringstrinn mellom trinnene (d) og (e). Det foretrekkes videre at et virusfjernende filtreringstrinn utføres etter trinn (e). Mer foretrukket omfatter fremgangsmåten minst to virusfjernende trinn, et som utføres mellom trinnene (d) og (e) og et som utføres etter trinn (e).

Dersom utgangsvæskevolumet som IL-18BP skal renses fra er stort, kan det være fordelaktig å redusere materialets volum ved å innfange proteinet og resuspendere det i et mindre buffervolum før den faktiske rensefremgangsmåte påbegynnes.

Følgelig omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis videre et innledende innfangingstrinn, dvs. et trinn som utføres før noen av de ovenfor nevnte rensetrinnene og fortrinnsvis før trinn (a) i fremgangsmåten beskrevet ovenfor.

I en foretrukket utførelse utføres innfangingstrinnet ved ionebytterkromatografi. Ionebytterresinet som anvendes for innfangingstrinnet er fortrinnsvis et kraftig anionbyttermateriale, for eksempel Q Sepharose Fast Flow. Det foretrekkes i stor grad å anvende trimetylaminoetyl-derivatisert resin, for eksempel TMAE Fractogel<®>(eller TMAE HiCap® som ionebyttermateriale. Innfangingstrinnet kan med fordel fjerne

>60% av den totale mengde kontaminanter som foreligger i råmaterialet.

For å lette for eksempel lagring eller transport, kan materialet nedfryses og opptines før og/eller etter hvilket som helst rensetrinn ifølge oppfinnelsen.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse kan IL-18BP som skal renses være nativt, dvs. naturlig forekommende i IL-18BP. Det kan således renses fra hvilken som helst naturlig kilde eller hvilket som helst naturlig materiale, for eksempel fra kroppsvæsker som urin. IL-18BP kan også være avledet fra hvilken som helst dyrekilde eller menneskekilde. IL-18BP som skal renses er fortrinnsvis humant IL-18BP, og mer foretrukket er det rekombinant IL-18BP. Rekombinant IL-18BP kan fremstilles i prokaryote ekspresjonssystemer, for eksempel i bakteriesystemer som Escherichia coli. Det kan også fremstilles i eukaryote ekspresjonssystemer, for eksempel gjær, insektceller eller pattedyrceller. I samsvar med foreliggende oppfinnelse foretrekkes det å uttrykke IL-18BP i pattedyrceller, for eksempel dyrecellelinjer eller humane cellelinjer. Kina-hamster ovarieceller (CHO) er et eksempel på en cellelinje som er spesielt godt egnet for ekspresjon av IL-18BP.

Dersom IL-18BP som skal renses uttrykkes av pattedyrceller som utskiller proteinet, er utgangsmaterialet for rensefremgangsmåten ifølge oppfinnelsen celledyrkningssupernatant, også kalt høstet materiale eller urent IL-18BP. Dersom cellene dyrkes i et medium som inneholder dyreserum, inneholder celledyrkningssupernatanten også serumproteiner som urenheter.

De IL-18BP-uttrykkende cellene dyrkes fortrinnsvis under serumfrie betingelser. I dette tilfelle er utgangsmaterialet for rensefremgangsmåten ifølge oppfinnelsen serumfri celledyrkningssupernatant som hovedsakelig inneholder vertscelleproteiner som urenheter. Dersom vekstfaktorer er tilsatt til celledyrkningsmediet, for eksempel insulin, vil disse proteinene fortrinnsvis også fjernes under rensefremgangsmåten.

Siden IL-18BP er et løselig, utskilt protein, frigjøres det til celledyrkningssupernatanten enten ved hjelp av det naturlige signalpeptid eller ved hjelp av et heterologt signalpeptid, dvs. et signalpeptid avledet fra et annet utskilt protein som kan være mer effektivt i det benyttede ekspresjonssystem. Væsken som IL-18BP renses fra er således fortrinnsvis celledyrkningssupernatant, for eksempel CHO-cellesupernatant. Celledyrkningssupernatant kan omfatte dyreavledet serum dersom cellene dyrkes i serumholdig medium. Det foretrekkes å rense proteinet fra supernatanten fra celler som ble dyrket i serumfritt medium, dvs. i dyrkningsmedium som ikke inneholder serum avledet fra nyfødt kalv eller andre dyrekilder.

Begrepet "IL-18-bindende protein" anvendes heri synonymt med "IL-18BP". Dette begrepet omfatter IL-18-bindende proteiner, for eksempel proteinene som er definert i WO 99/09063 eller i Novick et al, 1999. Begrepet IL-18BP omfatter spleisevarianter og/eller isoformer av IL-18-bindende proteiner, for eksempel variantene definert i Kim et al., 2000, nærmere bestemt de humane isoformene a og c av IL-18BP. Begrepet "IL- 18BP" som anvendt heri omfatter videre muteiner, funksjonelle derivater, aktive fraksjoner, fusjonsproteiner, sirkulært permuterte proteiner og salter av IL-18BP, som definert i WO 99/09063. IL-18BP som skal behandles ved rensefremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan være glykosylert eller ikke-glykosylert, det kan være avledet fra naturlige kilder som urin eller, fortrinnsvis, være fremstilt rekombinant. Rekombinant ekspresjon kan utføres i prokaryote ekspresjonssystemer, for eksempel E. coli, eller i eukaryote ekspresjonssystemer, fortrinnsvis pattedyrekspresjonssystemer.

Som anvendt heri, viser begrepet "muteiner" til analoger av et IL-18BP eller analoger av et viralt IL-18BP, hvori en eller flere av aminosyrerestene i et naturlig IL-18BP eller viralt IL-18BP er erstattet med andre aminosyrerester eller er deletert, eller hvori en eller flere aminosyrerester er addert til den naturlige sekvens av et IL-18BP, eller et viralt IL-18BP, uten i vesentlig grad å endre aktiviteten av de resulterende produktene, sammenlignet med villtype-IL-18BP eller viralt IL-18BP. Disse muteinene fremstilles ved kjente teknikker for syntese og/eller setestyrt mutagenese, eller hvilken som helst annen kjent teknikk som er egnet for dette.

Muteiner i samsvar med foreliggende oppfinnelse omfatter proteiner som kodes av en nukleinsyre, for eksempel DNA eller RNA, som hybridiserer til DNA eller RNA som koder for et IL-18BP eller et viralt IL-18BP (begge beskrevet i WO 99/09063) under stringente betingelser. Begrepet "stringente betingelser" viser til hybridiseringsbetingelser og påfølgende vaskebetingelser som gjennomsnitts-fagfolk konvensjonelt betegner "stringente". Se Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§ 6.3 og 6.4 (1987, 1992). Uten å være begrenset til disse, omfatter eksempler på stringente betingelser vaskebetingelser som ligger 12-20°C under den beregnede Tm for hybridet som undersøkes, i for eksempel 2 x SSC og 0,5% SDS i 5 minutter, 2 x SSC og 0,1% SDS i 15 minutter, 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 37°C i 30-60 minutter og så 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 68°C i 30-60 minutter. Gjennomsnitts-fagpersoner vil forstå at stringensbetingelser også vil avhenge av lengden av DNA-sekvensene, oligonukleotidprobene (for eksempel 10-40 baser) eller blandede oligonukleotidprober. Dersom blandede prober anvendes, foretrekkes det å benytte tetrametylammoniumklorid (TMAC) i stedet for SSC. Se Ausubel, supra.

Identitet gjenspeiler et forhold mellom to eller flere polypeptidsekvenser eller to eller flere polynukleotidsekvenser, som bestemmes ved å sammenligne sekvensene. Generelt viser identitet til et nøyaktig samsvar fra nukleotid til nukleotid eller aminosyre til aminosyre mellom de to polynukleotidene eller de to polypeptidsekvensene over hele lengden av sekvensene som sammenlignes.

For sekvenser hvor det ikke er et nøyaktig samsvar, kan "% identitet" bestemmes. Generelt sammenstilles de to sekvensene som skal sammenlignes, slik at det oppnås maksimal relasjon mellom sekvensene. Dette kan omfatte innføring av "gap" i en av eller begge sekvensene for å forbedre sammenstillingsgraden. % identitet kan bestemmes over hele lengden av de to sekvensene som sammenlignes (såkalt global sammenstilling), dette er spesielt godt egnet for sekvenser med samme lengde eller svært like lengder, eller over kortere, definerte lengder (såkalt lokal sammenstilling), noe som er bedre egnet for sekvenser med ulik lengde.

Fremgangsmåter for sammenligning av identitet og homologi mellom to eller flere sekvenser er velkjent innen faget. Således kan for eksempel programmene som er tilgjengelige i Wisconsin Sequence Analysis Package, versjon 9.1 (Devereux J. t al., 1984), for eksempel programmene BESTFIT og GAP, anvendes for å bestemme % identitet mellom to polynukleotider og % identitet og % homologi mellom to polypeptidsekvenser. BESTFIT anvender "lokal homologi"-algoritmen til Smith og Waterman (1981) og finner det beste enkeltområde med likhet mellom to sekvenser. Andre programmer for bestemmelse av identitet og/eller likhet mellom sekvenser er også kjente innen faget, for eksempel BLAST-familien av programmer (Altschul S. F. et al, 1990, Altschul S. F. et al, 1997, tilgjengelig fra hjemmesiden til NCBI ved www. ncbi. nlm. nih. gov). og FASTA (Pearson W. R., 1990).

Ethvert slikt mutein har fortrinnsvis en sekvens av aminosyrer som i tilstrekkelig grad ligner aminosyresekvensen til et IL-18BP, eller et viralt IL-18BP, til at muteinet har i det vesentlige samme aktivitet som IL-18BP. En aktivitet forbundet med IL-18BP er evnen til å binde IL-18. Så lenge som muteinet har vesentlig bindingsaktivitet overfor IL-18, kan det anvendes for rensing av IL-18, for eksempel ved hjelp av affinitetskromatografi, og kan følgelig anses å ha i det vesentlige samme aktivitet som IL-18BP. Det kan således fastslås hvorvidt et gitt mutein har i det vesentlige samme aktivitet som IL-18BP ved hjelp av rutinemessig eksperimentering som omfatter å analysere et slikt mutein, f. eks. ved en enkel "sandwich"-konkurranseanalyse, for å fastslå hvorvidt det bindes til et IL-18 merket på egnet vis, for eksempel ved en radioimmunanalyse eller ELISA-analyse.

I en foretrukket utførelse har hvilket som helst slikt mutein minst 40% identitet eller homologi med sekvensen til enten et IL-18BP eller en viruskodet IL-18BP-homolog, som definert i WO 99/09063. Mer foretrukket, har muteinet minst 50%, minst 60%, minst 70%, minst 80% eller, mest foretrukket, minst 90% identitet eller homologi med disse.

Muteiner av IL-18BP polypeptider eller muteiner av virale IL-18BP som kan anvendes i samsvar med foreliggende oppfinnelse eller nukleinsyrer som koder for disse utgjør et begrenset sett av i det vesentlige tilsvarende sekvenser som substitusjonspeptider eller - polynukleotider som kan erholdes rutinemessig av en gjennomsnittsfagperson uten omfattende eksperimentering, basert på den lære og de retningslinjer som gis heri.

Foretrukne endringer i muteiner i samsvar med foreliggende oppfinnelse er hva som betegnes "konservative" substitusjoner. Konservative aminosyresubstitusjoner av IL-18BP-polypeptider eller -proteiner eller virale IL-18BP kan omfatte synonyme aminosyrer innen en gruppe som har tilstrekkelig like fysikalsk-kjemiske egenskaper til at substitusjon mellom medlemmer av gruppen vil bevare molekylets biologiske funksjon (Grantham, 1974). Det er åpenbart at insersjoner og delesjoner av aminosyrer også kan innføres i de ovenfor definerte sekvenser uten å endre deres funksjon, særlig dersom insersjonene eller delesjonene kun omfatter noen få aminosyrer, f. eks. under 30 og fortrinnsvis under 10, og ikke fjerner eller forskyver aminosyrer som er avgjørende for en funksjonell konformasjon, for eksempel cysteinrester. Proteiner og muteiner fremstilt ved slike delesjoner og/eller insersjoner ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område.

De synonyme aminosyregruppene er fortrinnsvis gruppene definert i Tabell 1. Mer foretrukket er de synonyme aminosyregruppene gruppene som er definert i Tabell 2, og mest foretrukket er de synonyme aminosyregruppene gruppene som er definert i Tabell 3.

Eksempler på innføring av aminosyresubstitusjoner i proteiner som kan anvendes for erholdelse av muteiner av IL-18BP-polypeptider eller -proteiner eller muteiner av virale IL-18BP for anvendelse i foreliggende oppfinnelse omfatter hvilke som helst kjente fremgangsmåtetrinn, for eksempel som beskrevet i US patentskrifter 4.959.314, 4.588.585 og 4.737.462, tilhørende Mark et al, 5.116.943 tilhørende Koths et al, 4.965.195 tilhørende Nåmen et al, 4.879.111 tilhørende Chong et al. og 5.017.691 tilhørende Lee et al., og lysinsubstituerte proteiner presentert i US patentskrift 4.904.584 (Shaw et al).

Begrepet "fusjonsprotein" viser til et polypeptid som omfatter et IL-18BP, et viralt IL-18BP eller et mutein eller fragment derav fusjonert til et annet protein som f. eks. har forlenget levetid i kroppsvæsker. Et IL-18BP eller et viralt IL-18BP kan således være fusjonert til et annet protein, polypeptid eller lignende, f. eks. et immunglobulin eller et fragment derav.

"Funksjonelle derivater" som anvendt heri dekker derivater av IL-18BP eller et viralt IL-18BP og deres muteiner og fusjonsproteiner som kan fremstilles fra de funksjonelle gruppene som opptrer som sidekjeder i aminosyrerestene eller de N- eller C-terminale gruppene, ved fremgangsmåter som er kjente innen faget, og omfattes av oppfinnelsen så lenge som de forblir farmasøytisk aksepterbare, dvs. at de ikke ødelegger aktiviteten av proteinet, som i det vesentlige tilsvarer aktiviteten av IL-18BP eller virale IL-18BP, og ikke innfører toksiske egenskaper i preparater som inneholder dem.

Disse derivatene kan for eksempel omfatte polyetylenglykolsidekjeder, som kan maskere antigene seter og forlenge levetiden for et IL-18BP eller et viralt IL-18BP i kroppsvæsker. Andre derivater omfatter alifatiske estere av karboksylgruppene, amider av karboksylgruppene ved reaksjon med ammoniakk eller med primære eller sekundære aminer, N-acylderivater av frie aminogrupper i aminosyrerestene, dannet med acylgrupper (f. eks. alkanoylgrupper eller karbosykliske aroylgrupper) eller O-acylderivater av frie hydroksylgrupper (for eksempel i seryl- eller treonylrester) dannet med acylgrupper.

Som "aktive fraksjoner" av et IL-18BP eller et viralt IL-18BP eller muteiner og fusjonsproteiner derav dekker foreliggende oppfinnelse ethvert fragment eller enhver forløper av polypeptidkjeden til proteinmolekylet, alene eller sammen med assosierte molekyler eller rester som er koblet til denne, for eksempel sukkerrester eller fosfatrester, eller aggregater av proteinmolekylet eller sukkerrestene i seg selv, forutsatt at fraksjonen har i det vesentlige den samme aktivitet som IL-18BP.

Begrepet "salter" viser heri til både salter av karboksylgrupper og til syreaddisjonssalter av aminogrupper i IL-18BP-inhibitormolekyl eller analoger derav. Salter av en karboksylgruppe kan dannes ved midler som er kjente innen faget og omfatter uorganiske salter, for eksempel natrium-, kalsium-, ammonium-, jern(III)- eller sinksalter og lignende, og salter med organiske baser, for eksempel salter dannet med aminer som trietanolamin, arginin eller lysin, piperidin, prokain og lignende. Syreaddisjonssalter omfatter for eksempel salter med mineralsyrer, for eksempel saltsyre eller svovelsyre, og salter med organiske syrer, for eksempel eddiksyre eller oksalsyre. Naturligvis må alle slike salter bibeholde den biologiske aktiviteten til IL-18-inhibitoren, for eksempel induksjon av IFN-gamma i blodceller.

Sekvensene til IL-18BP og dets spleisevarianter/isoformer kan tas fra WO 99/09063 eller fra Novick et al, 1999, så vel som fra Kim et al., 2000.

Funksjonelle derivater av IL-18BP kan være konjugert til polymerer for å forbedre proteinets egenskaper, for eksempel stabiliteten, halveringstiden, biotilgjengeligheten, evnen til å tolereres av menneskekroppen eller immunogenisiteten. For å oppnå dette mål, kan IL-18BP for eksempel kobles til polyetylenglykol (PEG). PEGylering kan utføres kjente fremgangsmåter, for eksempel som beskrevet i WO 92/13095.1 en foretrukket utførelse omfatter det funksjonelle derivat derfor fortrinnsvis minst en gruppe som er koblet til en eller flere funksjonelle grupper som opptrer som en eller flere sidekjeder i aminosyrerestene. En utførelse hvori gruppen er en polyetylenglykol (PEG)-gruppe er svært foretrukket.

I en videre foretrukket utførelse av oppfinnelsen omfatter IL-18BP en immunglobulinfusjon, dvs. at inhibitoren av IL-18 er et fusjonsprotein som omfatter hele eller en del av et IL-18-bindende protein, fusjonert til hele eller en del av et immunglobulin. Fremgangsmåter for fremstilling av immunglobulinfusjoner er velkjente innen faget, for eksempel fremgangsmåtene som beskrives i WO 01/03737. Fagpersonen vil forstå at det resulterende fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen bibeholder den biologiske aktiviteten til IL-18BP, nærmere bestemt evnen til å bindes til IL-18. Fusjonen kan være direkte eller via et kort linkerpeptid, som kan være så kort som 1 til 3 aminosyrerester langt eller lenger, for eksempel 13 aminosyrerester langt. Linkeren kan for eksempel være et tripeptid med sekvensen E-F-M (Glu-Phe-Met) eller en 13 aminosyrer lang linkersekvens som omfatter Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, innsatt mellom IL-18BP-sekvensen og immunglobulinsekvensen. Det resulterende fusjonsprotein har forbedrede egenskaper, for eksempel forlenget levetid i kroppsvæsker (halveringstid), forhøyet spesifikk aktivitet eller forhøyet ekspresjonsnivå, eller rensingen av fusjonsproteinet er forenklet.

I en foretrukket utførelse er IL-18BP fusjonert til det konstante område fra et Ig-molekyl. Det er fortrinnsvis fusjonert til tungkjedeområder, for eksempel CH2- og CH3-domenet fra humant IgGl. Fremstilling av spesifikke fusjonsproteiner som omfatter IL-18BP og en del av et immunglobulin er for eksempel beskrevet i Eksempel 11 i WO 99/09063. Andre isoformer av Ig-molekyler er også egnede for fremstilling av fusjonsproteiner ifølge foreliggende oppfinnelse, for eksempel isoformene IgG2eller IgG4, eller andre Ig-klasser, for eksempel IgM eller IgA. Fusjonsproteiner kan være monomere eller multimere og hetero- eller homomultimere.

I et tredje aspekt gjelder oppfinnelsen et protein renset ved rensefremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I det påfølgende betegnes et slikt protein også "renset IL-18BP". Slik renset IL-18BP er fortrinnsvis svært renset IL-18BP. Svært renset IL-18BP bestemmes for eksempel ved forekomsten av et enkelt bånd i en sølvfarget PAGE-gel etter påsetting av protein i en mengde på 2 meg per spor. Renset IL-18BP kan også defineres ved at det beveger seg som en enkelt topp ved HPLC. Renset IL-18BP kan også defineres ved at det beveger seg som en enkelt topp ved HPLC. IL-18BP-preparatet som erholdes fra rensefremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan inneholde mindre enn 20% urenheter, fortrinnsvis mindre enn 10%, 5%, 3%, 2% eller 1% urenheter, eller det kan være renset til homogenitet, dvs. at det er fritt for alle proteinbaserte kontaminanter.

Renset IL-18BP kan være beregnet for terapeutisk anvendelse, dvs. for tilførsel til pasienter. Dersom renset IL-18BP tilføres til pasienter, tilføres det fortrinnsvis systemisk og fortrinnsvis subkutant eller intramuskulært, eller topisk, dvs. lokalt. Rektal eller intratekal tilførsel kan også være egnet, avhengig av den angjeldende anvendelse av renset IL-18BP.

For dette formål kan renset IL-18BP utformes som et farmasøytisk preparat, dvs. sammen med et farmasøytisk akseptabelt bærestoff, eksipienser eller lignende. Definisjonen av "farmasøytisk akseptabelt" er ment å omfatte ethvert bærestoff som ikke interfererer med virkningen av den biologiske aktivitet forbundet med den aktive bestanddel og som ikke er toksisk for verten som det tilføres til. For for eksempel parenteral tilførsel kan det eller de aktive proteinene utformet i en enhetsdoseform for injeksjon i bærestoffer som saltvann, dekstroseløsning, serumalbumin og Ringers løsning.

De aktive bestanddelene i det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen kan tilføres til et individ på en rekke forskjellige måter. Tilførselsveiene omfatter intradermal, transdermal (f. eks. i utforminger for langsom frigjøring), intramuskulær, intraperitoneal, intravenøs, subkutan, oral, intrakraniell, epidural, topisk, rektal og intranasal tilførsel. Alle andre terapeutisk virkningsfulle tilførselsveier kan anvendes, for eksempel absorpsjon gjennom epitelvev eller endotelvev eller ved genterapi, hvori et DNA-molekyl som koder for det aktive middel tilføres til pasienten (for eksempel via en vektor), noe som gjør at det aktive middel uttrykkes og utskilles in vivo. I tillegg kan proteinet eller proteinene ifølge oppfinnelsen tilføres sammen med andre bestanddeler som er biologisk aktive midler, for eksempel farmasøytisk akseptable surfaktanter, eksipienser, bærestoffer, fortynningsmidler og bærere.

For parenteral (f. eks. intravenøs, subkutan, intramuskulær) tilførsel kan det eller de aktive proteinene utformes som en løsning, suspensjon, emulsjon eller et frysetørket pulver sammen med et farmasøytisk akseptabelt, parenteralt bærestoff (f. eks. vann, saltvann, dekstroseløsning) og tilsetningsstoffer som opprettholder isotonisitet (f. eks. mannitol) eller kjemisk stabilitet (f. eks. konserveringsmidler og buffere). Utformingen steriliseres ved vanlig anvendte teknikker.

Biotilgjengeligheten av det eller de aktive proteinene ifølge oppfinnelsen kan også forbedres ved anvendelse av konjugasjonsfremgangsmåter som forlenger halveringstiden av molekylet i menneskekroppen, for eksempel ved å koble molekylet til polyetylenglykol, som beskrevet i PCT patentsøknad WO 92/13095.

De terapeutisk effektive mengdene av det eller de aktive proteinene vil være en funksjon av mange variabler, innbefattet typen av antagonist, affiniteten av antogonisten for IL-18, eventuell gjenværende cytotoksisk aktivitet som vises av antagonistene, tilførselsveien, pasientens kliniske tilstand (innbefattet ønskeligheten for å opprettholde et ikke-toksisk nivå av endogen IL-18-aktivitet).

En "terapeutisk effektiv mengde" er slik at når IL-18-inhibitoren tilføres, fører dette til inhibering av den biologiske aktiviteten til IL-18. Dosen som tilføres som en enkelt eller flere doser til et individ vil variere avhengig av en rekke faktorer, innbefattet IL-18-inhibitorens farmakokinetiske egenskaper, tilførselsveien, pasientens tilstand og egenskaper (kjønn, alder, kroppsvekt, helsetilstand, størrelse), omfanget av symptomene, samtidige behandlingsformer, behandlingshyppigheten og den ønskede virkning. Justering og manipulering av etablerte doseringsområder ligger godt innenfor kunnskapsområdet til fagpersonen, så vel som in vitro og in vivo fremgangsmåter for bestemmelse av inhibering av IL-18 i et individ.

Renset IL-18BP kan anvendes i en mengde på fra tilnærmet 0,001 til 100 mg/kg eller fra tilnærmet 0,01 til 10 mg/kg kroppsvekt, eller fra tilnærmet 0,1 til 5 mg/kg kroppsvekt eller fra tilnærmet 1 til 3 mg/kg kroppsvekt eller på tilnærmet 2 mg/kg kroppsvekt.

I videre foretrukne utførelser tilføres det rensende IL-18BP daglig, annenhver dag, tre ganger i uken eller en gang ukentlig.

De daglige dosene gis vanligvis i oppdelte doser eller i en form for vedvarende frigjøring som effektivt gir de ønskede resultater. Andre gangs tilførsel eller påfølgende tilførsler kan utføres i en dose som er den samme som, lavere enn eller høyere enn den innledende eller foregående dose som ble tilført til individet. En andre eller påfølgende tilførsel kan tilføres i løpet av sykdommen eller før sykdommen begynner.

Ifølge oppfinnelsen kan renset IL-18BP tilføres profylaktisk eller terapeutisk til et individ før, samtidig med eller sekvensielt med andre terapeutiske behandlingsformer eller midler (f. eks. flermedikamentregimer) i en terapeutisk effektiv mengde.

Renset IL-18BP kan anvendes for fremstilling av et medikament forbehandling og/eller forebyggelse av en rekke forskjellige sykdommer eller forstyrrelser. Slike sykdommer eller forstyrrelser er fortrinnsvis IL-18-formidlede forstyrrelser. Nærmere bestemt kan renset IL-18BP anvendes for behandling og/eller forebyggelse av psoriasis, psoriatisk artritt, Crohns sykdom, reumatoid artritt, leverskade, for eksempel alkoholisk lever-cirrhose, sepsis, aterosklerose, iskemiske hjertesykdommer, allergier, fortrinnsvis hypersensitivitet av forsinket type, og lukkede hodeskader.

Når nå foreliggende oppfinnelse er fullt ut beskrevet, vil fagpersonen forstå at den kan utføres innenfor et bredt område av ekvivalente parametere, konsentrasjoner og tilstandere uten å avvike fra oppfinnelsens ånd og område og uten omfattende eksperimentering.

Selv om foreliggende oppfinnelse har blitt beskrevet i forbindelse med spesifikke utførelser av den, vil det forstås at den kan modifiseres ytterligere.

Beskrivelsen ovenfor av de spesifikke utførelsene vil i så stor grad vise oppfinnelsens generelle natur at andre ved å benytte kunnskap innen teknikkens stand (innbefattet innholdet av referansene som siteres heri) lett vil kunne modifisere og/eller tilpasse slike spesifikke utførelser for forskjellige anvendelser uten omfattende eksperimentering, uten å avvike fra foreliggende oppfinnelses generelle konsept.

EKSEMPEL 1: Rensing av rekombinant, humant IL-18BP fra serumfri CHO-cellesupernatant

1. Innfangingstrinn

IL-18BP i 300 1 serumfri celledyrkningssupernatant fra IL-18BP-uttrykkende CHO-celler ble innfanget på Q Sepharose FF-resin. Det innfangede materiale ble justert til pH 8,5 ±0,1 og konduktiviteten til 50 ± 5 mS/cm ved tilsetning av noen få dråper 35% orto-fosforsyre (H3PO4) og fast NaCl i en mengde tilsvarende tilnærmet 0,35 M.

2. Rensefrem<g>an<g>småte

Rensefremgangsmåten med start fra det innfangede materiale ifølge trinn (1) ovenfor beskrives i detalj nedenfor. Et flytkart over rensefremgangsmåten gis i Fig. 1.

Generelt viser pH og konduktivitetsverdier til verdier ved en temperatur på +25°C.

Kolonnene ble kontinuerlig målt med UV-monitorer som måler absorbansen ved 280 nm.

2. 1. Trinn ( a) : IMAC på chelatbindende Sepharose Fast Flow Utstyr

• Kromatografikolonne: XK1.6 x 20 cm (Amersham Biosciences)

• UV-monitor (lysveiens lengde 2,5 mm) utstyrt med en to-kanalers registrator

(Amersham Biosciences eller tilsvarende)

Peristaltisk pumpe (Minipuls Gilson eller tilsvarende) UV-spektrofotometer (Shimadzu eller tilsvarende)

pH-meter (Metrohm eller tilsvarende)

Konduktometer (Metrohm eller tilsvarende)

Vekt (MettlerToledo eller tilsvarende)

Materialer

Chelatbindende Sepharose Fast Flow resin (Amersham Biosciences) Natriumhydroksidkuler - (Merck)

Kobbersulfat (Merck)

Iseddik (Merck)

Etylendiamintetraeddiksyre - EDTA (Fluka)

Natriumklorid - NaCl - Merck

Renset vann (Modulab eller tilsvarende)

Dinatriumhydrogenfosfat-dihydrat - Merck

Ammoniumacetat - Merck

25% ammoniakkløsning - Merck

85% orto-fosforsyre - Merck

50% natriumhydroksidløsning - Baker

Buffere og løsninger

Metalltilføirngsløsning: 0,2 M kobbersulfat

Surgjort vann

Ekvilibreringsbuffer: 50 mM natriumfosfat pH 8,5 ± 0,1, 0,5 M NaCl Elueringsbuffer: 0,075 M ammoniumacetat pH 9,0 ±0,1 Regenereringsløsning: 20 mM natriumfosfat pH 5,8 ± 0,3, 0,5 M NaCl, 50 mM

EDTA

Vaskeløsning: 0,5 M NaOH

Kolonnen ble pakket med chelatbindende Sepharose Fast Flow resin ifølge produsentens instruksjoner. For rengjøring ble kolonnen vasket med minst 3 kolonnevolumer 0,5 M NaOH og inkubert ved 1 time i romtemperatur, hvoretter kolonnen ble vasket med 3 kolonnevolumer renset vann.

220-300 mg konsentrert r-hIL-18BP erholdt fra innfangingstrinnet beskrevet ovenfor under (1) ble opptint og justert til pH 8,5 ± 0,1 og en konduktivitet på 50 ± 5 mS/cm ved tilsetning av noen få dråper 35% orto-fosforsyre (H3PO4) og fast NaCl i en mengde tilsvarende tilnærmet 0,35 M.

Kromatografikolonnen ble først vasket med 5-6 kolonnevolumer surgjort vann inntil pH var <4,5. Så ble kolonnen vasket med 3 kolonnevolumer 0,2 M kobbersulfat og 4 kolonnevolumer surgjort vann inntil absorbansen nådde basalnivået.

Kolonnen ble så ekvilibrert ved vask med 6 eller flere kolonnevolumer ekvilibreringsbuffer, 50 mM natriumfosfat pH 8,5 ± 0,1, 0,5 M NaCl, konduktivitet 50 ± 5 mS/cm. pH og konduktivitet ble kontrollert, og vasken ble fortsatt dersom parametrene i kolonnens eluat lå utenfor målverdiene, dvs. pH 8,5 ± 0,1, konduktivitet 50 ± 5 mS/cm.

Utgangsmaterialet, dvs. r-hIL-18BP etter innfanging, fremstilt som ovenfor, ble så satt på kolonnen. Etter fullført prøvepåsetting ble kolonnen vasket med 5-10 kolonnevolumer ekvilibreringsbuffer. Disse fraksjonene ble kastet, siden de kun inneholder urenheter fra celledyrkingen.

Elueringen ble påbegynt med 0,075 M ammoniumacetat pH 9,0 ±0,1, konduktivitet 7,6 ± 0,5 mS/cm. r-hIL-18BP begynte å elueres som en hovedtopp etter tilnærmet 0,5 kolonnevolumer fra påbegynt eluering.

3-5 kolonnevolumer av hovedtoppen ble oppsamlet, hvor hovedtoppens begynnelse ble satt hvor den direktemålte OD begynte å økes kraftig. Denne fraksjonen inneholdt delvis renset r-hIL-18BP.

Etter fullført eluering, ble kolonnen vasket med 3-5 kolonnevolumer regenereringsbuffer inneholdende EDTA. De oppsamlede fraksjonene inneholdt kobber frigjort fra resinet, så vel som urenheter fra celledyrkingen.

For rengjøring ble kolonnen vasket med minst 3 kolonnevolumer 0,5 M NaOH og inkubert i 1 time, hvoretter kolonnen ble vasket med 3 kolonnevolumer renset vann. Kolonnen ble så vasket med minst 3 kolonnevolumer lagringsbuffer, 10 mM NaOH, og kolonnen lagres ved romtemperatur inntil neste syklus.

2. 2 Trinn ( b) : HIC/ IEC på MEP Hypercel

Dette trinnet utføres på MEP-resin, et resin for hydrofob ladningsinduksjonskromatografi, som er en blanding mellom hydrofob interaksjonskromatografi (HIC) og ionebytterkromatografi (IEC).

Utstyr

Kromatografikolonne: XK1.6 x 20 cm (Amersham Biosciences)

UV-monitor (lysveiens lengde 2,5 mm) utstyrt med en to-kanalers registrator

(Amersham Biosciences eller tilsvarende)

Peristaltisk pumpe (Minipuls Gilson eller tilsvarende)

UV-spektrofotometer (Shimadzu eller tilsvarende)

pH-meter (Metrohm eller tilsvarende)

Konduktometer (Metrohm eller tilsvarende)

Vekt (MettlerToledo eller tilsvarende)

Materialer

r-hIL-18BP etter IMAC

MEP HyperCel<®>resin (BioSepra - Cypergen Biosystems) Natriumhydroksidkuler - (Merck)

Kaliumklorid - (Merck)

Etylendiamintetraeddiksyre - EDTA - (Fluka)

Natriumklorid - NaCl - Merck

Renset vann (Modulab eller tilsvarende)

Dinatriumhydrogenfosfat-heptahydrat - Merck

Dinatriumhydrogenfosfat, monobasisk dihydrat - Merck

Kaliumfosfat - Merck

1,2-propandiol (propylenglykol) - Merck

85% orto-fosforsyre - Meerck

50% natriumhydroksidløsning - Baker

Buffere og løsninger

Ekvilibreringsbuffer: IX fosfatbufret saltvann (PBS) pH 6,1 0,1,1 NaCl,

konduktivitet 95 ± 5 mS/cm

Vaskebuffer: IX PBS pH 6,1 ± 0,1, konduktivitet 16 ± 2 mS/cm Elueringsbuffer: 20 mM fosfatbuffer pH 8,4 ± 0,1, 35% propylenglykol,

konduktivitet 1,1 ± 0,3 mS/cm

RegenereringsLøsning 1: Renset vann

RegenereringsLøsning 2: 100 mM EDTA

RengjøringsLøsning: 1 M NaOH

Kolonnen ble pakket med MEP HyperCel<®>resin ifølge produsentens instruksjoner. IL-18BP etter IMAC, fremstilt i trinn (a), ble tilsatt IM NaCl under omrøring til en konduktivitet på 95 ± 5 mS/cm.

For rengjøring av kolonnen ble kolonnen vasket med minst 1 kolonnevolum 0,5M NaOH, og så vasket med 3-5 kolonnevolumer renset vann.

For kolonneekvilibrering ble kolonnen vasket med 6 eller flere kolonnevolumer ekvilibreirngsbuffer, IX PBS pH 6,1 ± 0,1,1 NaCl, konduktivitet 95 ± 5 mS/cm. pH og konduktivitet ble målt, og vasken ble fortsatt dersom parametrene i eluatet fra kolonnen lå utenfor målverdiene, dvs. pH 6,1 ± 0,1, 1 NaCl, konduktivitet 95 ± 5 mS/cm.

Kolonnen ble så påsatt materialet som ble fremstilt i trinn (a).

Etter påsettingen, ble kolonnen vasket med 6 kolonnevolumer ekvilibreringsbuffer, IX PBS pH 6,1 ± 0,1,1 NaCl, konduktivitet 95 ± 5 mS/cm. Denne fraksjonen ble kastet, siden den kun inneholdt urenheter fra cellecyrkningen. Dersom kolonnen overbelastes, kan denne fraksjonen inneholde noe r-hIL-18BP.

Kolonnen ble så vasket med 10 kolonnevolumer vaskebuffer, IX PBS pH 6,1 ± 0,1, konduktivitet 16 ± 2 mS/cm. Denne fraksjonen ble også kastet, siden den bare inneholder urenheter fra celledyrkningen. Denne fraksjonen kan inneholde noe r-hIL-18BP dersom kolonnen overbelastes.

Så ble elueringen påbegynt med elueringsbuffer, 20 mM fosfatbuffer pH 8,4 ±0,1, 35% propylenglykol, konduktivitet 0,8 ±0,1 mS/cm. r-hIL-18BP begynte å elueres som en hovedtopp etter tilnærmet 0,5 kolonnevolumer. 8-10 kolonnevolumer av hovedtoppen ble oppsamlet med begynnelse fra den raske økningen i absorbans, tilnærmet etter de første 0,5 kolonnevolumer (som kastes), ut fra kromatografiprofilen. Dette eluatet inneholdt delvis renset r-hIL-18BP.

For regenerering ble kolonnen vasket med minst 6 kolonnevolumer regenereringsløsning 1, fulgt av 10 kolonnevolumer regenereringsløsning 2. Kolonnen ble inkubert i regenereringsløsning over natten for ytterligere å forbedre regenererings-virkningen. Kolonnen ble så vasket med minst 6 kolonnevolumer renset vann. Disse fraksjonene som inneholdt urenheter fra celledyrkningen ble kastet.

For rengjøring ble kolonnen vasket med minst 6 kolonnevolumer IM NaOH, elueringen ble stoppet i 1 time, og kolonnen ble så vasket med minst 6 kolonnevolumer renset vann.

For lagring ble kolonnen vasket med minst 3 kolonnevolumer lagringsløsning, 0,1 M NaOH, og lagret ved romtemperatur inntil neste syklus.

2. 3. Mellomliggende trinn: Ultrafiltrering

Utstyr

Ultrafiltreringsinnretning Vivaflow 200, grenseverdi 5000D (RC, PES eller

HydroSart) - Sartorius eller tilsvarende

Peristaltisk pumpe type Masterflex eller tilsvarende

UV-spektrofotometer (Shimadzu eller tilsvarende)

pH-meter (Metrohm eller tilsvarende)

Konduktometer (Metrohm eller tilsvarende)

Vekt (MettlerToledo eller tilsvarende)

Materialer

Intermediært r-hIL-18BP etter MEP

Natriumhydroksidkuler - (Merck)

Renset vann (Modulab eller tilsvarende)

Løsninger for diafiltrering

Renset vann fra Modulab eller Milli Q system

Rengjøringsløsning: 0,5 M NaOH

Fremgangsmåte

Ultrafiltreringstrinnet ble utført ved romtemperatur (+20 ± 5°C).

For rengjøring av ultrafiltreringsenheten ble tilnærmet 500 ml 0,5 M NaOH filtrert i minst 30 minutter, hvoretter ultrafilteret ble vasket med renset vann inntil pH i eluatet er under 7,5.

Fraksjonen etter MEP ble fortynnet 1:2 med renset vann og filtrert gjennom ultrafilteret. Løsningen ble oppkonsentrert til tilnærmet 1-2/10 av utgangsvolumet, og den tilbakeholdte fraksjonen ble dialysert mot renset vann inntil konduktiviteten i den tilbakeholdte fraksjonen var <100 uS/cm. Konduktiviteten i det tilbakeholdte materiale ble justert etter fortynning med vann til et volum på tilnærmet 150-200 ml.

Den tilbakeholdte fraksjonen ble oppsamlet og ultrafilteret vasket med renset vann. Vaskefraksjonene ble oppsamlet og slått sammen med den tilbakeholdte fraksjonen (sluttvolum 200-250 ml).

Ultrafilteret ble rengjort ved filtrering av 500 ml 0,5 M NaOH i ikke mindre enn 30 minutter og påfølgende vask av ultrafilteret med renset vann inntil pH i eluatet var under 7,5.

Ultrafilteret ble lagret i 0,05M NaOH ved +4°C ± 3°C inntil neste syklus.

2. 4. Trinn ( c) : IEC på CM Sepharose Fast Flow

Utstyr

Kromatografikolonne: AC 10/20 cm (Amersham Biosciences)

UV-monitor (lysveiens lengde 2,5 mm) utstyrt med en to-kanalers registrator

(Amersham Biosciences eller tilsvarende)

Peristaltisk pumpe (Minipuls Gilson eller tilsvarende)

UV-spektrofotometer (Shimadzu eller tilsvarende)

pH-meter (Metrohm eller tilsvarende)

Konduktometer (Metrohm eller tilsvarende)

Vekt (MettlerToledo eller tilsvarende)

Materialer

Ultrafiltrert intermediært r-hIL-18BP etter MEP

CM Sepharose FF resin (Amersham Biosciences)

Natriumhydroksidkuler - (Merck)

MES (2-[N-morfolino]etansulfonsyre) (Sigma eller tilsvarende)

• Renset vann (Modulab eller tilsvarende)

• Natriumklorid - Merck

Buffere og løsninger

• Pre-ekvilibreringsbuffer: 20 mM MES pH 5,0 ± 0,5, konduktivitet 150 ± 50 uS/cm

Vaskebuffer: IX PBS pH 6,1 ± 0,1, konduktivitet 16 ± 2 mS/cm

Ekvilibrering: 1 mM MES, pH 6,0 ± 0,2, konduktivitet 45 ± 15 uS/cm Regenereringsløsning: 1,5 M NaCl

Rengjøringsløsning: 0,5 M NaOH

Lagringsløsning: 0,01 M NaOH

Kolonnen ble pakket med CM Sepharose Fast Flow resin ifølge produsentens instruksjoner.

Ultrafiltrert r-hIL-18BP etter MEP (se trinn (b)) ble justert til pH 6,0 ± 0,2 med noen dråper 20 mM MES pH 5 ± 0,5 og en konduktivitet på 100 ± 15 uS/cm like før påsetning på kolonnen.

For rengjøring av kolonnen ble kolonnen vasket med 1 kolonnevolum 0,5 M NaOH og vasket med 15-20 kolonnevolumer renset vann.

Kolonnen ble så pre-ekvilibrert ved vask med 15-20 kolonnevolumer 20 mM MES pH 5 ± 0,5, konduktivitet 150 ± 50 uS/cm. pH og konduktivitet ble kontrollert, og vasken ble fortsatt dersom parametrene i eluatet fra kolonnen lå utenfor målverdiene, dvs. pH 5,0 0,5, konduktivitet 150 ± 50 uS/cm.

Kolonnen ble så ekvilibrert ved vask av kolonnen med 5 eller flere kolonnevolumer ekvilibreirngsbuffer, 1 mM MES pH 6,0 ± 0,2, konduktivitet 45 ± 15 uS/cm. pH og konduktivitet ble kontrollert, og vaskingen fortsatte dersom parametrene i eluatet fra kolonnen lå utenfor målverdiene, pH 6,0 ± 0,2, konduktivitet 45 ± 15 uS/cm.

Etter ekvilibrering ble r-hIL-18BP, fremstilt som beskrevet ovenfor, satt på kolonnen. Ubundet materiale ble oppsamlet så snart som absorbansen begynte å øke, siden denne fraksjonen inneholder det delvis rensede r-hIL-18BP.

Etter fullført prøvepåsetting, ble kolonnen vasket med 3-4 kolonnevolumer ekvilibreirngsbuffer, 1 mM MES pH 6 ± 0,2, konduktivitet 45 ± 15 uS/cm, og ubundet materiale ble oppsamlet kontinuerlig inntil absorbansen nådde basalnivået.

Etter oppsamlingen ble løsningen umiddelbart brakt til pH 9,1 ± 0,1 ved tilsetning av 50 mM fast natriumtetraborat. De oppsamlede fraksjonene inneholder delvis renset r-hIL-18BP.

For regenerering av kolonnen ble den vasket med minst 4 kolonnevolumer regenereringsbuffer, 1,5 M NaCl. Prøver ble tatt og eluert materiale kastet. Denne fraksjonen inneholder urenheter fra celledyrkingen og mer basiske isoformer av r-hIL-18BP.

For rengjøring ble kolonnen vasket med minst 3 kolonnevolumer 0,5 M NaOH, hvoretter vaskingen ble stanset i 1 time og kolonnen så vasket med 3 kolonnevolumer renset vann.

For lagring ble kolonnen vasket med minst 3 kolonnevolumer lagringsbuffer og så lagret til neste syklus.

2. 5. Trinn ( d) : Hydrofob interaksjonskromatografi på fenvl Sepharose FF HS

Utstyr

Kromatografikolonne: XK16/20 (Amersham Biosciences)

UV-monitor (lysveiens lengde 2,5 mm) utstyrt med en to-kanalers registrator

(Amersham Biosciences eller tilsvarende)

Peristaltisk pumpe (Minipulse 2 Gilson eller tilsvarende)

UV-spektrofotometer (Shimadzu eller tilsvarende)

pH-meter (Metrohm eller tilsvarende)

Konduktometer (Metrohm eller tilsvarende)

Vekt (MettlerToledo eller tilsvarende)

Materialer

Intermediært r-hIL-18BP etter CM

Fenyl Sepharose FF HS resin (Amersham Biosciences)

Dinatriumtetraborat-dekahydrat - Merck

Ammoniumsulfat (Merck)

Renset vann fra ModuLab eller tilsvarende

Natriumhydroksidkuler - Merck

50% NaOH-løsning - J. T. Baker

Buffere og løsninger

Ekvilibreringsbuffer: 50 mM natriumborat pH 9,1 ± 0,2, 0,9M ammoniumsulfat,

konduktivitet 122 ± 6 mS

Elueringsbuffer: 50 mM natriumborat pH 9,1 ± 0,2, 0,15M ammoniumsulfat,

konduktivitet 30 ± 2 mS/cm

Regenereringsbuffer: Renset vann

Rengjøringsløsning: 0,5 M NaOH

Kolonnen ble pakket med fenyl Sepharose FF HS resin ifølge produsentens instruksjoner

For forberedelse av utgangsmaterialet, ble fast ammoniumsulfat tilsatt til en konsentrasjon på 0,9M til IL-18BP etter CM (resultat fra trinn (c)). Etter fullført oppløsning av saltet, ble materialet brakt til pH 9,1 ± 0,2 ved tilsetning av 50% NaOH i løsning.

For rengjøring av kolonnen ble den vasket med minst 1 kolonnevolum 0,5M NaOH og så vasket med 6 kolonnevolumer renset vann.

Kolonnen ble ekvilibrert ved vask med 5-7 eller flere kolonnevolumer ekvilibreringsbuffer: 50 mM natriumborat pH 9,1 ± 0,2, 0,9M ammoniumsulfat, konduktivitet 122 ± 6 mS. pH og konduktivitet ble kontrollert, og vaskingen fortsatte dersom parametrene i eluatet fra kolonnen lå utenfor målverdiene, dvs. pH 9,1 ± 0,2, konduktivitet 122 ± 6 mS.

Utgangsmaterialet, dvs. r-hIL-18BP etter CM, ble så satt på kolonnen. Etter fullført prøvepåsetting, ble kolonnen vasket 7-9 kolonnevolumer ekvilibreirngsbuffer. Denne fraksjonen inneholder gjenværende urenheter fra celledyrkingen.

Elueringen ble påbegynt med elueringsbuffer, 50 mM natriumborat pH 9,1 ± 0,2, 0,15M ammoniumsulfat, konduktivitet 30 ± 2 mS/cm. r-hIL-18BP begynte å elueres som en hovedtopp etter tilnærmet 0,5-0,8 kolonnevolumer. 6-8 kolonnevolumer av hovedtoppen ble oppsamlet etter at absorbansen begynte å øke. Denne eluerte fraksjonen inneholdt delvis renset r-hIL-18BP.

Etter fullført eluering ble kolonnen regenerert ved vask med minst 3 kolonnevolumer renset vann. Denne fraksjonen ble kastet, siden den inneholder urenheter fra celledyrkningen og aggregerte former av IL-18BP.

For rengjøring ble kolonnen vasket med minst 3 kolonnevolumer 0,5 M NaOH, hvoretter vaskingen ble stoppet i 1 time og kolonnen så vasket med 6 kolonnevolumer renset vann.

For lagring ble kolonnen vasket med minst 3 kolonnevolumer lagringsbuffer, 10 mM NaOH, og kolonnen ble lagret ved romtemperatur inntil neste syklus.

2. 6. Trinn 5 ( e) : Revers fase- kromatografi på Source 30 RPC

Utstyr

Kromatografikolonne: AC 10/20 (Amersham Biosciences)

UV-monitor (lysveiens lengde 2,5 mm) utstyrt med en to-kanalers registrator

(Amersham Biosciences eller tilsvarende)

Peristaltisk pumpe (Minipulse 2 Gilson eller tilsvarende) UV-spektrofotometer (Shimadzu eller tilsvarende)

FPLC-system eller tilsvarende for dannelse av den lineære gradient (Amersham

Biosciences)

pH-meter (Metrohm eller tilsvarende)

Konduktometer (Metrohm eller tilsvarende)

Materialer

IL-18BP etter HIC

Source 30 RPC resin (Amersham Biosciences)

Natriumklorid - Merck

Dinatriumtetraborat-dekahydrat - Merck

50% NaOH-løsning - Baker

Renset vann (ModuLab eller tilsvarende)

Acetonitril - Merck

Trifluoreddiksyre - J. T. Baker

Universalindikator pH 0-14 - Merck

Buffere og løsninger

Løsning A: 0,1% TF A i vann

Løsning B: 0,1% TF A i ACN

Ekvilibreringsbuffer: 50 mM natriumborat pH 9,1 ± 0,2, konduktivitet 5 ± 2

mS/cm

Rengjøringsløsning: 0,5 M NaOH

Kolonnen ble pakket med Source 30 RPC resin ifølge produsentens instruksjoner.

For rengjøring av kolonnen ble den vasket baklengs med minst 3 kolonnevolumer 0,5M NaOH og så vasket med 4-5 kolonnevolumer renset vann.

Kolonnen ble så ekvilibrert ved vask (eluering oppover) med 5-6 eller flere kolonnevolumer ekvilibreringsbuffer, 50 mM natriumborat pH 9,1 ± 0,2, konduktivitet 5 ± 2 mS/cm. pH og konduktivitet ble kontrollert, og vaskingen fortsatte dersom parametrene i eluatet fra kolonnen lå utenfor målverdiene, dvs. pH 9,1 ± 0,2 og konduktivitet 5 ± 2 mS/cm.

r-hIL-18BP etter HIC (resultat fra trinn (d)) ved pH 9,1 ± 0,2, konduktivitet 30 ± 2 mS/cm, var utgangsmaterialet fra dette trinnet. Materialet ble satt på kolonnen, og etter fullført prøvepåsetting ble kolonnen vasket med 2-3 kolonnevolumer ekvilibreringsbuffer. Denne fraksjonen ble kastet.

Kolonnen ble så vasket med løsning A inntil pH i eluatet fra kolonnen var under 4. Denne fraksjonen ble slått sammen med den første del av elueringsgradienten (før 28% ACN). Denne fraksjonen inneholder rester av urenheter fra celledyrkningen og kastes følgelig.

Eluering ble utført i gradientmodus ved anvendelse av en kombinasjon av elueringsløsning A og elueringsløsning B som følger:

r-hIL-18BP begynte å elueres ved tilnærmet 28-32% av løsning B (se ovenfor med uthevet skrift) og var fullstendig eluert i løpet av 60 minutter (35% B). Eluatet ble umiddelbart justert til pH 8,0 ± 0,5 ved fortynning 1:2 med 50 M natriumborat pH 9,1 0,2 og konduktivitet 5 ± 2 mS/cm.

Denne fraksjonen inneholder renset r-hIL-18BP.

Regenerering av kolonnen ble utført etter avsluttet gradienteluering. Regenereringsfraksjonen ble oppsamlet ut fra absorbansprofilen. Denne fraksjonen inneholder rester av urenheter fra celledyrkningen og aggregerte former av IL-18BP.

For rengjøring ble kolonnen vasket med 2-3 kolonnevolumer vann og så med minst 3-4 kolonnevolumer NaOH, hvoretter kolonne fikk stå i 1 time. Så ble kolonnen vasket med 3-4 kolonnevolumer rensen vann.

Kolonnen ble vasket med minst 3 kolonnevolumer lagringsløsning og lagret inntil neste syklus. 3. Oppsummering av fjerning av vertscelleproteiner fra IL- 18BP- preparatet Mengden av vertscelleproteiner ble målt ved ELISA og anvendelse av et polyklonalt antiserum dannet i kanin mot CHO-celleavledede kontaminanter som foreligger i serumfritt celledyrkningsmedium. Mengden av vertscelleproteiner uttrykkes som ppm (milliondeler) av kontaminerende proteiner relativt til renset IL-18BP. Mengden av IL-18BP ble målt ved bestemmelse av den optiske tetthet (OD) ved 280 nm (molar ekstinksjonskoeffisient s= 1,26) i det rensede preparat av IL-18BP, dvs. etter det endelige rensetrinn ved revers fase-kromatografi.

Denne analysen ble utført for tre uavhengige eksperimenter.

EKSEMPEL 2: Modifisert fremgangsmåte for rensing av rekombinant humant IL-18BP fra serumfri CHO-cellesupernatant

Eksempel 1 ble utført som angitt ovenfor med følgende modifikasjoner:

Innfangingstrinnet ble utført på Fractogel® TMAE HiCap<®>, erholdt fra Merck.

I trinn (a), IMAC-rensetrinnet på en chelatbindende Sepharose Fast Flow kolonne, ble et ekstra vasketrinn innført ved anvendelse av 15 mM ammoniumklorid i ekvilibreirngsbuffer.

I tillegg til dette, ble i trinn (a) elueringen utført ved anvendelse av 0,06 M ammoniumacetat pH 8,7.

I trinn (d) ble elueringen påbegynt med elueringsbuffer, 50 mM natriumborat pH 9,1 0,2, 0,10M ammoniumsulfat.

Fremgangsmåte: Bestemmelse av spesifikk aktivitet av IL-18BP

Bestemmelse av den biologiske aktivitet ved KG- l- cellebasert in vitro bioanalyse

Den biologiske karakteirseringen av et r-hIL-18BP-referansemateriale bygget på evaluering av proteinets evne til spesifikt å bindes til r-hIL-18 og nøytralisere faktorens biologiske aktivitet på den humane akutt myelogen leukemi-cellelinjen KG-1. Denne cellelinjen kan danne IFN-y som respons på humant IL-18 pluss humant TNF-a på en doseavhengig måte, slik at r-hIL-18BP vil undertrykke dannelsen av IFN-y.

Kort beskrevet ble KG-1-celler med lxl0<5>celler/brønn tilsatt til en 96-brønners plate som allerede inneholdt forskjellige konsentrasjoner av r-hIL-18BP i nærvær av en fast konsentrasjon av r-hIL-18 (40 ng/ml i brønnen) pluss en fast konsentrasjon av r-hTNF-a (10 ng/ml i brønnen). Konsentrasjonen av hver av disse to forbindelsene ville sammen gi submaksimal induksjon av dannelse av IFN-y i KG-1-celler. Etter 24 timer ved 37°C, 5% C02, ble platen inkubert ved -20°C for frysing/tining av de behandlede cellene, før utførelsen av immunanalysen for bestemmelse av mengden av IFN-y som forelå i cellesupernatanten. Cellesupernatantene ble oppsamlet og humant IFN-y målt ved hjelp av en spesifikk immunanalyse (ELISA h-IFN-y, Duo Set R&D Systems-sett). Mengden av IFN-y som var dannet av de behandlede cellene ble beregnet ved å interpolere y-verdiene (O.D.) på IFN-y-standardkurven som leveres med settet, tilpasset en sigmoidal-log/log-transformert dose-respons (4PL), for erholdelse av x-verdiene (IFN-y-konsentrasjonene) (GraphPad prisme). Den fortynning av r-hIL-18BP-referansemateriale (STlP01/r-hIL-18BP)-løsning som inhiberte IFN-y-produksjonen indusert ved en fast konsentrasjon av r-hIL-18 + en fast konsentrasjon av r-hTNF-a med 50% (EC50) ble definert som 1 enhet (U).

Ti uavhengige analyser ble utført, og hver av de 10 dose-responskurvene ble fremstilt ved å angi på y-aksen % dannelse av IFN-y og på x-aksen fortynningen av STlP01/r-ML-18BP. r-hIL-18BP-dose-responskurven erholdt fra hvert eksperiment ble først normalisert ved å sette den laveste og høyeste IFN-y-verdi til 0% henholdsvis 100%.

Den høyeste IFN-y-verdi ble oppnådd med r-hIL-18 pluss r-hTNF-a i fravær av r-hIL-18BP, mens den laveste verdien ble erholdt ved den høyeste analyserte r-hIL-18BP-konsentrasjon. En sigmoidal dose-responskurve med variabel vinkelkoeffisient algoritme (4PL) ble så benyttet for interpolering av de normaliserte verdiene og EC50bestemt for hvert eksperiment.

Titret av referansematerialet ble beregnet i hver analyse som følger:

Titer ( U/ ml) = den resiprokale verdi av fortynningen ved 50% respons x for- fortynning

Det endelige STlP01/r-hIL-18BP-titer ble beregnet som gjennomsnittet av de 10 enkelttitrene erholdt fra hvert eksperiment.

Fig. 2 viser dose-responskurvene for STlP01/r-hIL-18BP fra KG-l-/'« v/7rø-bioanalysen erholdt i 10 uavhengige eksperimenter.

Kurvene ble normalisert ved å sette den laveste IFN-y-verdien til 0% og den høyeste verdien av IFN-y til 100%. Den høyeste IFN-y-verdien ble oppnådd med r-hIL-18 pluss r-hTNF-a i fravær av r-hIL-18BP, mens den laveste ble erholdt ved den høyeste analyserte r-hIL-18BP-konsentrasjon. En sigmoidal dose-responskurve med variabel vinkelkoeffisient algoritme (4PL) ble så benyttet for interpolering av de normaliserte verdiene, og EC50ble bestemt for hvert eksperiment ved hjelp av GraphPad prisme.

Enkelttitrene for STlP01/r-hIL-18BP erholdt i hvert uavhengige eksperiment sammen med standardavviket, variasjonskoeffisienten (%) og 95% pålitelighetsgrense er rapportert nedenfor.

Den gjennomsnittlige beregnede aktivitet av referansematerialet STlP01/r-hIL-18BP viste seg å være 895869 U/ml med en CV% på 17,6.

KG- l- cellebasert in vitro bioanalyse

Analysen utføres i 96-brønners plater.

De angitte prøveposisjonene i platen er et eksempel.

Tilsett 50 ul dyrkingsmedium (500 ml MDM tilsatt 20% FBS, varmeinaktivert i 30 minutter ved 56°C, 5 ml 3 mM 2-merkaptoetanol, 5 ml 2 mM 1-glutamin og 5 ml Pen/Strep, 10.000 U/ml/10.000 ug/ml) til brønnene 2 til 12 i rad B-C.

Tilsett 150 ul r-hIL-18BP-referansemateriale med 1500 ng/ml (300 ng/ml i

brønnen) til den første brønnen i radene B-C.

Ved anvendelse av en flerkanalspipette utføres seriefortynninger 1:1,5 ved å

overføre 100 (il fra brønnen i kolonne 1 opp til brønnen i kolonne 9 (radene B-C) og kasting av overskuddet på 100 ul fra brønnen i kolonne 9.

Tilsett 50 ul r-hIL-18BP-prøve i en av de to konsentrasjonene som ligger i den lineære del av dose-responskurven (f. eks. Sl<1>med 600 ng/ml, tilsvarende 120 ng/ml i brønnen) til brønnene i kolonner 1-2 i rad D (2 replikater).

N.B. De angitte prøveposisjonene i platen gis som et eksempel.

• Gjenta trinn 4 for den andre prøvekonsentrasjonen (Sl<2>).

• Tilsett 50 ul r-hIL-18 med 200 ng/ml (40 ng/ml i brønnen) til alle brønner i radene B-C, bortsett fra brønnene i kolonne 12 og brønnene som inneholder prøven (f. eks. kolonne 1 og 2, rad D og E). • Tilsett 50 (il r-r-hTNF-a med 50 ng/ml (10 ng/ml i brønnen) til alle brønner i rad B og C, bortsett fra kolonne 11 og brønnene som inneholder prøven (f. eks. kolonne 1 og 2 i rad D og E).

Tilsett 50 (il dyrkningsmedium til brønnene i kolonne 11 og 12 i rad B og C. Tilsett 150 (il dyrkningsmedium til alle brønner i rad A (kontrollcellebrønner). Tilsett 100 (il av en KG-l-cellesuspensjon med lxl06 celler/ml til alle brønner i

96-brønners platen.

NB! Sluttvolumet i brønnen er 250 (il og den endelige fortynning av r-hIL-18BP 1:5. Cellesuspensjonen fremstilles fra en T75-flaske som ikke inneholder mindre enn 20-24xl0<6>celler (15 ml dyrkningsmedium).

Platen inkuberes i 24 timer ved 37°C, 5% C02.

Platen fjernes fra inkubatoren og lagres ved -20°C inntil immunanalysen for bestemmelse av mengden av IFN-y som foreligger i cellesupernatanten skal utføres.

Cellesupernatanten oppsamles og humant IFN-y måles ved hjelp av en spesifikk

immunanalyse (ELISA h-IFN-y, Duo Set R&D Systems-sett).

NB! Ut fra den tilsatte r-hIL-18BP-konsentrasjon utføres om nødvendig mer enn 1 fortynning av cellesupernatantprøven for å sikre at de målte O.D.-verdier kan kvantifiseres ut fra IFN-y-standardkurven.

ELISA ble utført ifølge den generelle fremgangsmåte som leveres med settet, med mindre modifikasjoner: Antall vasketrinn ble økt: fra 3 til 4 og fra 4 til 5 for siste gangs vask. Blokkeringsbuffer ble fremstilt ved å tilsette 1 % BSA til PBS (ikke tilsatt

sukrose eller NaNa).

Reagensfortynning fremstilt ved å tilsette 0,1% BSA og 0,05% Tween-20 i PBS

i stedet for Tris-bufret saltvann.

Mengden av IFN-y som ble dannet av de behandlede cellene ble beregnet ut fra IFN-y-standardkurven (levert med settet), log/log-transformert og interpolert ved hjelp av en sigmoidal dose-responskurve med variabel vinkelkoeffisient algoritme (GraphPad programvare).

Beregning av spesifikk aktivitet av IL- 18BP

Den spesifikke aktivitet av IL-18BP beregnes ut fra følgende formel:

Resultater:

De påfølgende tabeller viser resultatene erholdt for flere parametere i løpet av rensefremgangsmåten som beskrevet i dette eksempel.

REFERANSER

1. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410,1990

2. Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402,1997

3. Boschetti, E., Jungbauer, Sep. Sei. & Tech. 2 No. 15, Acad. Press (2000) 53

4. Boschetti et al., Genetic Engineering, bind 20, No. 13, July, 2000

5. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395,1984.

6. Grantham et al., Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974)

7. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding

protein to inhibit IL-18. Proe Nati Acad Sei U S A 2000;97:1190-1195.

8. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M

(1999). Immunity 10,127-136.

9. Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98.

10. J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, and G. Belfrage, Nature (London) 258, 598-599

(1975)

11. J. Porath and B. Olin, Biochemistry 22, 1621-1630 (1983)

12. Puren et al., Proe Nati Acad Sei USA. 1999 Mar 2;96(5):2256-61.

13. Urushihara, J Pediatr Surg. 2000 Mar;35(3):446-9.

14. Vigers et al., Nature. 1997 Mar 13;386(6621):190-4.

15. WO9909063 16. WO0107480 17. WO0162285 18. WO0185201 19. WO02060479 20. WO02096456 21. WO03080104 22. WO02092008 23. WO02101049 24. WO03013577 25. WO 92/13095 26. WO 01/03737 27. US 4,959,314 28. US 4,588,585 29. US 4,737,462 30. US 5,116,943 31. US 4,965,195 32. US 4,879,111 33. US 5,017,691 34. US 4,904,584

Claims (21)

1. Anvendelse av hydrofob ladningsinduksjonskromatografi for fremstilling av renset IL-18-bindende protein (IL-18BP).

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori den hydrofobe ladningsinduksjonskromatografien utføres på et 4-merkaptoetylpyridin (MEP) resin.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvori hydrofob ladningsinduksjonskromatografi anvendes i kombinasjon med et trinn utvalgt blant immobilisert metallion-affinitetskromatografi, ionebytterkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og revers fase-kromatografi.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av renset IL-18BP,karakterisert vedat den omfatter å behandle en væske ved hydrofob ladningsinduksj onskromatografi.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat den hydrofobe ladningsinduksjonskromatografien utføres på et 4-merkaptoetylpyridin (MEP) resin.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 4 og 5,karakterisert vedat den videre omfatter et trinn utvalgt blant immobilisert metallion-affinitetskromatografi, ionebytterkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og revers fase-kromatografi.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat metallion-affinitetskromatografien utføres på et chelatbindende resin.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat ionebytterkromatografien er kationbytterkromatografi.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat kationbytterkromatografien utføres på et karboksymetyl (CM) resin.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat den hydrofobe interaksjonskromatografi utføres på et fenylresin.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat trinnet med revers fase-kromatografi utføres på et polymert revers fase-støttemiddel.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert vedat det polymere revers fase-støttemiddel er revers fase-source 30 RPC.

13. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst kravene 4 til 12,karakterisert vedat den omfatter trinnene: (a) Behandling av væsken ved metallion-affinitetskromatografi, (b) Behandling av eluatet fra metallion-affinitetskromatografien ved hydrofob ladningsinduksjonskromatografi, (c) Behandling av eluatet fra den hydrofobe ladningsinduksjonskromatografi ved kationbytterkromatografi, (d) Behandling av ubundet materiale fra kationbytterkromatografien ved hydrofob interaksjonskromatografi, (e) Behandling av eluatet fra den hydrofobe interaksjonskromatografi ved revers fase-kromatografi.

14. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den videre omfatter et eller flere ultrafiltreringstrinn.

15. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den videre omfatter et eller flere filtreringstrinn for fjerning av virus.

16. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av foregående krav,karakterisert vedat den omfatter et innledende innfangingstrinn.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16,karakterisert vedat innfangingstrinnet utføres ved kromatografi på en kraftig anionbytter.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17,karakterisert vedat innfangingstrinnet utføres på et kvaternært ammonium (Q) resin.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 17,karakterisert vedat innfangingstrinnet utføres på et TMAE-resin.

20. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 eller fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 4 til 19, hvori det angjeldende IL-18BP er humant rekombinant IL-18BP.

21. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 eller fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 4 til 19, hvori væsken er serumfri celledyrkningssupernatant.