NO331712B1 - Fremgangsmate for rensing av IL-18 BP samt anvendelse av et vandig tofasesystem for rensing eller innfanging av IL-18BP - Google Patents

Fremgangsmate for rensing av IL-18 BP samt anvendelse av et vandig tofasesystem for rensing eller innfanging av IL-18BP Download PDF

Info

Publication number
NO331712B1
NO331712B1 NO20070483A NO20070483A NO331712B1 NO 331712 B1 NO331712 B1 NO 331712B1 NO 20070483 A NO20070483 A NO 20070483A NO 20070483 A NO20070483 A NO 20070483A NO 331712 B1 NO331712 B1 NO 331712B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
phase
peg
aqueous
purification
protein
Prior art date
Application number
NO20070483A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20070483L (no
Inventor
Gianni Baer
Henri Kornmann
Original Assignee
Ares Trading Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ares Trading Sa filed Critical Ares Trading Sa
Publication of NO20070483L publication Critical patent/NO20070483L/no
Publication of NO331712B1 publication Critical patent/NO331712B1/no

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for rensing av IL-18 bindende protein (IL-18BP) fra en væske ved anvendelse av vandig tofasefordeling.

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for å rense IL-18BP samt anvendelse av et vandig tofasesystem for rensing eller innfanging av IL-18BP.
OPPFINNELSEN BAKGRUNN
Proteiner har blitt kommersielt viktige som medikamenter som også generelt betegnes "biologiske midler". En av de største utfordringene er utvikling av kostnadsbesparende og effektive prosesser for rensing av proteiner i kommersiell skala. Mens mange fremgangsmåter nå er tilgjengelige for fremstilling i stor skala av proteiner, inneholder råproduktene for eksempel kroppsvæsker eller høstete celler ikke bare det ønskete produkt, men også urenheter som er vanskelige å skille fra det ønskete produkt. Biologiske proteinkilder inneholder også ofte kompliserte blandinger av materialer.
Biologiske kilder som kondisjonert celledyrkingsmedium fra celler som uttrykker et ønsket proteinprodukt kan inneholde færre urenheter, særlig om cellene dyrkes i serumfritt medium. Helsemyndighetene krever imidlertid høye renhetsstandarder for proteiner beregnet for tilførsel til mennesker. I tillegg kan mange rensefremgangsmåter omfatte trinn som krever anvendelse av lav eller høy pH, høye saltkonsentrasjoner eller andre ekstreme betingelser som kan ødelegge den biologiske aktiviteten til et gitt protein. For ethvert protein er det således en utfordring å etablere en effektiv renseprosess som tillater tilstrekkelig renhet, samtidig som proteinets biologiske aktivitet bevares.
Proteinrensing omfatter generelt minst tre faser eller trinn, nemlig et innfangingstrinn der det ønskete proteinet separeres fra andre bestanddeler som foreligger i væsken, for eksempel DNA eller RNA, som ideelt sett også fører til en midlertidig rensing, et mellomliggende trinn der proteiner isoleres fra kontaminanter med liknende størrelse og/eller fysikalske/kjemiske egenskaper, og endelig et poleringstrinn som fører til den høye grad av renhet som for eksempel kreves for proteiner beregnet for terapeutisk tilførsel til mennesker eller dyr.
Proteinrensetrinnene bygges typisk på kromatografisk separasjon av forbindelsene som foreligger i en gitt væske. Hyppig anvendte kromatografiske fremgangsmåter er for eksempel gélfiltrering, ionebytterkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi, affinitetskromatografi og reversfasekromatografi.
Vandige tofasesystemer (A2PS) er et alternativ til klassisk kromatografiske fremgangsmåter. A2PS-prosesser har blitt anvendt innenfor teknikkens stand for rensing av proteiner (se tabell 1).
Rensing av interferon-beta (IFN-P) fra et produksjonsmedium inneholdende et delvis renset serum førte til en 350-ganger renset og opptil 10-ganger konsentrert IFN-P prøve med en spesifikk aktivitet på 3-7,10 x IO6 IU/mg (Menge et al., 1987). Anvendelse av A2PS for rensing av terapeutiske proteiner i industriell skala er imidlertid fortsatt begrenset.
A2PS bygger på fordeling av målmolekylet mellom to ikke blandbare vandige faser (for eksempel et PEG/saltsystem). Dette systemet er tilpasset proteinekstraksjon da det høye vanninnholdet i de to fasene (70-80 % , vekt/vekt) betyr høy biokompabilitet og lav interfasespenning, noe som minimaliserer degradering av proteinet. Prinsippet for proteinrensing med A2PS kan for eksempel eksemplifiseres ved rensing av den insulinliknende vekstfaktor IGF-1 i US 5 695 958.
Valg av egnet fasesystem (polymér/polymér; polymér/salt...) er nøkkeltrinnet i en renseprosess basert på A2PS. Dette systemet må vise en høy selektiv fordeling av målproteinet mellom fasene. Eksempler på fasepar anvendt for A2PS rensing av proteiner fra forskjellige biologiske kilder er vist i tabell 2.
Sammensetningen av vandige polymér tofasesystemer representeres vanligvis i den rektangulære form av et fasediagram, som vist i figur 5, tatt fra Hatti-Kaul, 2000. Vertikalaksen anvendes vanligvis for den bestanddel som er anriket i toppfasen. Mengden polymér/salt X, polymer/salt Y og S av vann blandes. Den totale sammensetning av en blanding representeres ved et av punktene Al, A2 eller A3 i fasediagrammet. Blandingen separeres i to faser. Sammensetningen av disse to fasene representeres ved punktene T og B, som kalles knuter, og som bygger på den binodale linje. Den binodale kurven er linjen som separerer to doméner i sammensetninger: Ett hvor systemet er monofasisk (til venstre for og under kurven), og ett hvor faseseparasjon kan observeres (over og til høyre for kurven). Linjen som sammenbinder punktene B og T, og som representerer sammensetningene av de samtidig foreliggende fasene, betegnes en forbindelseslinje. Punktene Al, A2 eller A3 som representerer totalblandingen, må ligge på den samme forbindelseslinje som noden B og T, som karakteriserer sammensetningen av de samtidig foreliggende fasene med opphav i disse blandingene.
Som vist i figur 5 gir blandinger av forskjellige totalsammensetninger, representert ved forskjellige punkter på den samme forbindelseslinjen, opphav til tofasesystemer med identiske sammensetninger, men med forskjellige volumer av de samtidig foreliggende fasene. Volumfoholdet mellom de to fasene kan tilnærmes grafisk ved forholdet mellom segment AB (toppfase) og segment AT (bunnfase). Mekanismene som styrer fordelingen av biologiske materialer er imidlertid fortsatt ikke godt forstått. Fordelingen avhenger av mange faktorer som er opplistet i tabell 3 nedenfor. De mest anvendte i dagens praksis er konsentrasjon og molekylvekt av fasedannende polymerer, salttype og mengde, og type og konsentrasjoner av tilsettingsstoffer (vanligvis uorganiske salter). Disse faktorene anses generelt som de viktigste for manipulering av fordeling av protein for å oppnå bedre separasjon. Det er derfor ekstremt vanskelig å finne et A2PS-system for et gitt protein som skal renses fra en gitt kilde, også fordi proteinet beregnet for terapeutisk anvendelse må forbli fullstendig funksjonelt, både når det gjelder struktur (for eksempel ingen aggregering, ingen avkortninger) og når det gjelder funksjon.
a I vandige systemer med en enkelt polymer og salt er type og konsentrasjon av fasedannende salt den
faktor som tilsvarer type og konsentrasjon av fasedannende polymér i to-polymér systemer.
b Tilsettingsstoff med lav molekylvekt, for eksempel uorganiske salter, urea, osv., uten noen spesifikk
affinitet for det oppløste materialet.
c Affinitetsligander, for eksempel medikamenter, triazin fargestoffer, organiske kompleksdannende
midler, fettsyrer, osv.
d Modifisering ved kjemisk, enzymatisk osv. behandling som fører til fjerning, inkorporering eller endring av topografien av løsemiddeltilgjengelige grupper i det oppløste molekylet.
Interleukin-18 bindingsprotein (IL-18BP) er et naturlig forekommende, løselig protein som først ble affinitetsrenset på en IL-18-kolonne fra urin (Novick et al., 1999). IL-18BP forhindrer IL-18 induksjon av IFN-y og IL-18-aktivering av NF-kB in vitro. I tillegg inhiberer IL-18BP induksjon av IFN-y i mus injisert med LPS. IL-18BP-genet ble lokalisert i det humane kromosom 11, og intet exon som koder for et transmembrandoméne kunne finnes i den genomiske sekvens på 8,3 kb som omfatter IL-18BP-genet. Fire isoformer av IL-18BP, dannet ved alternativt mRNA-spleising, har til nå blitt påvist i mennesker. Disse ble betegnet IL-18BP a, b, c og d, og alle har den samme N-enden og er forskjellige i C-enden (Novick et al., 1999). Disse isoformene er forskjellige når det gjelder evne til å binde IL-18BP (Kim et al, 2000). Av de fire humane IL-18BP (hIL-18BP)-isoformene, er isoformene a og c kjent for å ha en nøytraliserende virkning på IL-18BP. Den mest forekommende IL-18BP isoformen er isoform a som viser fremviser høy affinitet for IL-18 med en hurtig på-hastighet og langsom av-hastighet og en dissosiasjonskonstant (Kd) på tilnærmet 0,4 nM (Kim et al., 2000). IL-18BP uttrykkes konstitutivt i milt, og tilhører immunglobulin superfamilien. Aminosyrerestene som deltar i interaksjonen mellom IL-18 og IL-18BP er beskrevet gjennom anvendelse av datamaskinbasert modellering (Kim et al., 2000) og basert på interaksjonen mellom det liknende protein IL-ip og IL-IR type I (Vigers et al., 1997). IL-18BP foreligger konstitutivt i mange celler (Puren et al., 1999) og i sirkulasjonen hos friske mennesker (Urushihara et al., 2000), og som representerer et unikt fenomen i cytokin biologi. Grunnet den høye affinitet av IL-18BP for IL-18 (Kd = 0,4 nM), så vel som den høye konsentrasjonen av IL-18BP som foreligger i sirkulasjonen (20 gangers molart overskudd over IL-18), har det blitt foreslått at de fleste, om ikke alle IL-18 molekyler i sirkulasjonen er bundet til IL-18BP. Det sirkulerende IL-18BP som konkurrerer med celleoverflatereseptorer, kan således fungere som et naturlig antiinflammatorisk og immunundertrykkende molekyl. IL-18BP har blitt foreslått som et terapeutisk protein i mange sykdommer og forstyrrelser, slik som psoriasis, Crohns sykdom, reumatoid artritt, psoriatisk artritt, leverskader, sepsis, aterosklerose, iskemiske hjertesykdommer, allergier osv., se for eksempel WO99/09063, WO01/07480, WO01/62285, WO01/85201, WO02/060479, WO02/096456, WO03/080104, WO02/092008, WO02/101049, WO03/013577.
Teknikkens stand beskriver ingen prosess for IL-18BP.
OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse bygger på utviklingen av et effektivt rensetrinn for IL-18-bindingsprotein (IL-18BP) som baseres på vandig tofasefordeling.
Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å rense IL-18BP fra en væske, kjennetegnet ved at den omfatter minst ett trinn som benytter vandig tofasefordeling, hvori vandig tofasesystemet omfatter en polyetylenglykol (PEG)-fase og en saltfase som omfatter (NH4)S04eller Na2S04.
Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et vandig tofasesystem for rensing av IL-18BP, hvori det vandige tofasesystemet omfatter en polyetylenglykol (PEG)-fase og en saltfase som omfatter (NH4)S04eller Na2S04.
Et tredje aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et vandig tofasesystem for innfanging av IL-18BP fra en væske, hvori det vandige tofasesystemet omfatter en polyetylenglykol (PEG)-fase og en saltfase som omfatter (NH4)S04eller Na2S04.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1 viser resultatene fra kappilarsone elektroforese (CZE) profiler for prøverensinger identifisert fra den statistiske modell.
Figur 2 viser forbindelseslinjen for betingelsene Val2-1.
Figur 3 viser forbindelseslinjen for betingelsene Val2-2.
Figur 4 viser forbindelseslinjen for betingelsene Val2-5.
Figur 5 illustrerer prinsippet for etablering av en forbindelseslinje i et vandig tofasesystem (tatt fra Hatti-Kaul, 2000).
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Oppfinnelsen gjelder en fremgangsmåte for å rense IL-18BP fra en væske, omfattende minst ett trinn som benytter vandig tofasefordeling, hvori vandig tofasesystemet omfatter en polyetylenglykol (PEG)-fase og en saltfase som omfatter (NH4)S04eller Na2S04. Et slikt vandig tofasesystem kan anvendes som et enkelt rensetrinn for IL-18BP, men det kan også anvendes som ett trinn blant andre trinn basert på andre rensefremgangsmåter. Det kan også anvendes i flere trinn i renseprosessen, dvs. to, tre eller flere trinn basert på vandig tofasefordeling. Skulle renseprosessen omfatte mer enn ett trinn basert på vandig tofasesystem, kan de enkelte vandige tofasesystemene være det samme systemet eller basert på forskjellige systemer, ulike polymérer, salter eller liknende.
Den PEG som skal anvendes i henhold til renseprosessen ifølge oppfinnelsen kan ha en hvilken som helst egnet molekylvekt. I en foretrukket utførelsesform har PEG en molekylvekt i området fra omkring 2000 til omkring 12000, den kan være omkring 3000, eller omkring 4000, eller omkring 5000, eller omkring 6000, eller omkring 7000, eller omkring 8000, eller omkring 9000, eller omkring 10000, eller omkring 11000. Mer foretrukket har PEG en molekylvekt på omkring 10000.
Konsentrasjonen av polymeren i polymérfasen kan variere. I en foretrukket utførelsesform er utgangskonsentrasjonen av PEG lavere enn omkring 35 %
(vekt/vekt),, lavere enn omkring 30 % (vekt/vekt), 29 % (vekt/vekt), 28 % (vekt/vekt), 27 % (vekt/vekt), 26 % (vekt/vekt), 25 % (vekt/vekt), 24 % (vekt/vekt), 23 %
(vekt/vekt), 22 % (vekt/vekt), 21 % (vekt/vekt), 20 % (vekt/vekt), 19 % (vekt/vekt), 18 % (vekt/vekt), 17 % (vekt/vekt), 16 % (vekt/vekt), 15 % (vekt/vekt), 14 % (vekt/vekt), 13 % (vekt/vekt), 12 % (vekt/vekt), 11 % (vekt/vekt), 10 % (vekt/vekt),
9 % (vekt/vekt), 8 % (vekt/vekt), 7 % (vekt/vekt), 6 % (vekt/vekt), 5 % (vekt/vekt),
4 % (vekt/vekt), 3 % (vekt/vekt), 2 % (vekt/vekt) eller 1 % (vekt/vekt).
Saltkonsentrasjonen i saltfasen kan også variere, særlig avhengig av konsentrasjonen som anvendes for polymérfasen. I en foretrukket utførelsesform anvendes Na2S04i en konsentrasjon lavere en omkring 30 % (vekt/vekt), 25 % (vekt/vekt), 20 % (vekt/vekt), 16 % (vekt/vekt), 15 % (vekt/vekt), 14 % (vekt/vekt), 13 % (vekt/vekt), 12 % (vekt/vekt), 11 % (vekt/vekt), 10 % (vekt/vekt), 9 % (vekt/vekt), 8 % (vekt/vekt),
7 % (vekt/vekt), 6 % (vekt/vekt), 5 % (vekt/vekt), 4 % (vekt/vekt), 3 % (vekt/vekt),
2 % (vekt/vekt) eller 1 % (vekt/vekt).
I en svært foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen beregnes konsentrasjonene av de to fasene fra den følgende formel: y=-2,5108x +35,159
hvori y = PEG i % [vekt/vekt] og x = (Na)2S04i % [vekt/vekt].
I en annen svært foretrukket utførelsesform beregnes konsentrasjonene i de to fasene i henhold til den følgende formel: y=-2,5573x +35,757
hvori y = PEG i % [vekt/vekt] og x = Na2S04i % [vekt/vekt].
I en annen svært foretrukket utførelsesform beregnes konsentrasjonene i de to fasene i henhold til den følgende formel: y= -2,1182x + 35,355
hvori y = PEG i % [vekt/vekt] og x = Na2S04i % [vekt/vekt].
I samsvar med foreliggende oppfinnelse utføres fremgangsmåten ved en pH i området mellom pH 4 og 9, men kan utføres ved omkring pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, eller pH 9. Den utføres fortrinnsvis ved omkring pH 5 eller ved omkring pH 7.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres ved enhver passende temperatur, for eksempel i 4 °C, 6,5 °C, 13 °C, 19,5 °C eller 30 °C, men fortrinnsvis utføres fremgangsmåten i romtemperatur.
I en foretrukket utførelsesform er trinnet som anvender et vandig tofasesystem ifølge oppfinnelsen et innfangingstrinn, dvs. et innledende trinn i en rensefremgangsmåte, som omfatter ett eller flere ytterligere trinn.
Rensetrinnet ifølge oppfinnelsen kan fjerne > 10 %, > 20 % , > 30 % , > 40 %, > 50 % eller > 60 % eller til og med > 70 % av den totale mengde av forurensninger som foreligger i råmaterialet. Det oppnåelige utbytte med rensetrinnet ifølge oppfinnelsen kan være > 50 %, > 60 %, > 70 % eller > 80 % eller til og med > 90 %.
I en ytterligere foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ytterligere ett eller flere rensetrinn.
De ytterligere rensetrinnene velges fortrinnsvis fra metallion affinitetskromatografi, ionebytterkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og reversfasekromatografi.
Hydrofob ladningsinduksjonskromatografi utføres fortrinnsvis på et resin med 4-merkaptoetylpyridin (MEP) som immobilisert ligand. "MEP-Hypercel" er et resin som er spesielt godt egnet i forbindelse med foreliggende oppfinnelse.
Ionebytterkromatografitrinnet utføres fortrinnsvis ved anvendelse av et karboksymetyl (CM)-resin.
Affinitetskromatografitrinnet er fortrinnsvis immobilisert
metallionaffinitetskromatografi, og chelatbindende sefarose er et eksempel på et resin som kan anvendes for utførelse av dette kromatograiftrinnet.
Hydrofob interaksjonskromatografi (HIC) kan utføres på et hvilket som helst kjent HIC-resin, for eksempel et resin med alkyl- eller arylrester som immobilisert ligand. Butyl-, oktyl- eller fenyl-sefarose (agarose) er eksempler på slike HIC-resiner.
Et foretrukket materiale som er anvendbart for reversfasetrinnet er reversfase-source 30
RPC.
I en svært foretrukket utførelsesform følges rensetrinnet ifølge oppfinnelsen av trinnene: a) behandling av væsken ved immobilisert metallionaffinitetskromatografi; b) behandling av eluatet fra metallionaffinitetskromatografien ved hydrofob ladningsinteraksj onskromatografi; c) behandling av eluatet fra hydrofob ladningsinteraksj onskromatografien ved ionebytterkromatografi; d) behandling av ubundet materiale fra ionebytterkromatografien ved hydrofob interaksjonskromatografi; e) behandling av eluatet fra hydrofob interaksjonskromatografi ved reversfasekromatografi.
Væsken behandles fortrinnsvis ved ultrafiltrering eller diafiltering før trinn (a).
Selv om rekkefølgen av de ovenfor nevnte trinn (a) til (e) foretrekkes, kan trinnene i prosessen ifølge oppfinnelsen utføres i hvilken som helst rekkefølge som fører til renset proteinprodukt.
Trinn (a) utføres fortrinnsvis på en chelatbindende sefarosekolonne, som en chelatbindende sefarose-fast flow-kolonne med chelatbindende Zn<2+->ioner. Binding av IL-18BP utføres fortrinnsvis ved pH 8,5 ±0,1, fortrinnsvis i 50 mM natriumfosfat og 0,5 M NaCl ved denne pH. Eluering utføres fortrinnsvis med pH på 9,0 ±0,1, for eksempel i 0,075 M ammoniumacetat med denne pH.
Trinn (b) utføres fortrinnsvis på en MEP (4-merkaptoetylpyridinderivat)-kolonne, som "MEP HyperCel" (LifeSciences). Binding av IL-18BP utføres fortrinnsvis vedpH 6,1 0,1, for eksempel i 1 x PBS + 1 NaCl med denne pH. Elueringen utføres fortrinnsvis ved pH 8,4 ±0,1, for eksempel med 20 mM fosfatbuffer pluss 35 % propylenglykol hvor blandingen har pH 8,4 ± 0,1.
Trinn (c) utføres fortrinnsvis på en karboksymetylsefarose (CM)-kolonne. Dette er et trinn hvor ubundet materiale oppsamles for videre rensing. Dette trinnet bygger på det faktum at under spesielle omstendigheter når det for eksempel gjelder salt- og pH-betingelser bindes IL-18BP ikke til resinet, mens urenheter bindes. Trinn (c) utføres fortrinnsvis ved pH 6,0 ± 0,2, for eksempel i nærvær av 1 mM MES (N-morfolinetansulfonsyre).
Trinn (d) utføres fortrinnsvis på en fenylsefarosekolonne, som en fenylsefarose fast
flow-kolonne. Bindingen av IL-18BP utføres fortrinnsvis ved omkring pH 9,1 ± 0,2, for eksempel i 50 mM natriumborat og 0,9 M ammoniumsulfat med denne pH. Elueringen fra fenylsefarosekolonnen utføres fortrinnsvis ved pH 9,1 ± 0,2 i nærvær av en forhøyet saltkonsentrasjon, for eksempel i 50 mM natriumborat pH 9,1 ± 0,2, 0,15 M ammoniumsulfat med denne pH.
Trinn (e) utføres fortrinnsvis på en Source 30 RPC-kolonne. Bindingen av IL-18BP til kolonnematerialet utføres fortrinnsvis ved pH 9,1 ± 0,2, for eksempel i 50 mM natriumboratbuffer. Elueringen utføres fortrinnsvis ved anvendelse av en gradient, hvor IL-18BP elueres ved tilnærmet 28-32 % 0,1 % trifluoreddiksyre (TFA) i acetonitril. Det bør forstas at betingelsene beskrevet ovenfor i forbindelse med trinnene (a) til (e) i rensingen også kan benyttes ved utførelse av enkelttrinn ifølge oppfinnelsen, eller (under)-kombinasjoner av trinnene.
I en ytterligere foretrukket utførelsesform av den foreliggende renseprosessen, utføres ett eller flere ultrafiltreringstrinn. Ultrafiltrering er for eksempel anvendbar for konsentrering av målproteinet, for bufferutbytting eller for fjerning av lavmolekylære bestanddeler i eluatene fra tidligere kromatografitrinn. Denne ultrafiltreringen tillater fjerning av organiske løsemidler, TF A og salter fra det foregående trinn, ekvillibrering av IL-18BP i den ønskete buffer og konsentrering av molekylet til ønsket konsentrasjon. Slik ultrafiltrering kan for eksempel utføres med ultrafiltreirngsmedier som uteslutter bestanddeler med molekylvekt under 5 kDa.
Ultrafiltrering utføres fortrinnsvis mellom trinn (b) og (c) og/eller etter trinn (e). mer foretrukket utføres to ultrafiltreringstrinn, ett mellom trinn (b) og (c) og ett etter trinn (e).
For å lette lagring og transport kan materialet nedfryses og tines før og/eller etter ethvert rensetrinn ifølge oppfinnelsen.
Dersom proteinet som renses i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er beregnet for tilførsel til mennesker, er det fordelaktig også å inkludere trinn med virusfjerning. Et virusfjernende filtreringstrinn utføres fortrinnsvis mellom trinn (d) og (e). det foretrekkes også at et virusfjernende filtreringstrinn utføres etter trinn (e). mer foretrukket omfatter fremgangsmåten to virusfjernende trinn, hvorav ett utføres mellom trinn (d) og (e), og det andre utføres etter trinn (e).
Væsken som IL-18BP renses ifra, i henhold til foreliggende oppfinnelse utvelges fortrinnsvis blant materiale høstet fra cellekultur, cellelysat, celleekstrakt, vevsekstrakt, blodplasma, serum, melk, urin, ascites, planteekstrakt eller en fraksjon avledet fra et tidligere proteinrensetrinn.
Væsken kan være uklarnet eller klarnet råmateriale fra cellekultur, og avledes fortrinnsvis fra kinahamster ovarie (CHO)-celler. Klarnet råmateriale fra cellekultur viser til et cellekulturkondisjonert medium som celler og cellerester er fjernet fra, for eksempel ved sentrifugering eller filtreringsteknikker. Dersom uklarnet råmateriale fra cellekultur anvendes som utgangsmateriale for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, foreligger celler og cellerester. Som vist i eksemplet nedenfor kan rensetrinnet ifølge oppfinnelsen innfange IL-18BP, selv fra uklarnet cellekulturmateriale som ikke er forbehandlet.
CHO-cellene som produserer IL-18BP kan dyrkes i suspensjon eller festes til overflaten av et bæremateriale, for eksempel en mikrobærer. Cellene dyrkes fortrinnsvis i suspensjon.
I henhold til foreliggende oppfinnelse kan det IL-18BP som skal renses være naturlig forekommende IL-18BP. Det kan således renses fra enhver naturlig kilde eller materiale, for eksempel fra kroppsvæsker som urin. IL-18BP kan også avledes fra enhver dyre- eller human kilde. Det IL-18BP som skal renses er fortrinnsvis humant, og mer foretrukket rekombinant IL-18BP. Rekombinant IL-18BP kan fremstilles i prokaryote ekspresjonssystemer, for eksempel i bakteriesystemer som escherichia coli. Det kan også produseres i eukaryote ekspresjonsvektorsystemer, for eksempel gjærceller, insektceller eller pattedyrceller. I henhold til foreliggende oppfinnelse foretrekkes det å uttrykke IL-18BP i pattedyrceller som dyrecellelinjer eller i humane cellelinjer. Kinahamster ovarieceller (CHO) er et eksempel på en cellelinje som er spesielt godt egnet for ekspresjon av IL-18BP.
Da IL-18BP er et løselig, utskilt protein, frigjøres det til celledyrkingssupernatanten, enten ved hjelp av sitt naturlige signalpeptid eller ved hjelp av et heterologt signalpeptid, dvs. et signalpeptid avledet fra et annet utskilt protein som kan være mer effektivt i det angjeldende ekspresjonssystem. Væske som IL-18BP renses fra er således fortrinnsvis celledyrkingssupernatant, for eksempel CHO-cellesupernatant. Det foretrekkes mer å rense proteinet fra supernatanten fra celler som ble dyrket i serumfritt medium, dvs. i dyrkingsmedium som ikke inneholder serum avledet fra kalvefoster eller andre animalske kilder.
Betegnelsen "IL-18 bindingsprotein" anvendes her synonymt med "IL-18BP". Begrepet gjelder IL-18 bindende proteiner som proteinene som defineres i WO99/09063 eller i Novick et al., 1999. betegnelsen IL-18BP omfatter spleisevarianter og/eller isoformer av IL-18 bindingsproteiner, for eksempel variantene som defineres i Kim et al., 2000, fortrinnsvis de humane isoformene a og c av IL-18BP. Betegnelsen "IL-18BP" slik den anvendes heri omfatter også muteiner, funksjonelle derivater, aktive fraksjoner, fusjonsproteiner, sirkulært permuterte proteiner og salter av IL-18BP, som definert i WO99/09063.
Det IL-18BP som behandles med rensefremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan være glykosylert eller ikke glykosylert, det kan være avledet fra naturlige kilder, som urin, eller det kan fortrinnsvis være fremstilt rekombinant. Rekombinant ekspresjon kan utføres i prokaryote ekspresjonssystemer som E. coli eller i eukaryote, fortrinnsvis pattedyrbaserte ekspresjonssystemer.
Som anvendt heri refererer betegnelsen "muteiner" til analoger av et IL-18BP eller analoger av et viralt IL-18BP, hvori én eller flere av aminosyrerestene i et naturlig IL-18BP eller viralt IL-18BP erstattes med andre aminosyrerester eller er slettet, eller hvori én eller flere aminosyrerester er lagt til den naturlige sekvensen til et IL-18BP eller et viralt IL-18BP uten å i vesentlig grad endre aktiviteten til de resulterende produktene, sammenliknet med villtype IL-18BP eller viralt IL-18BP. Disse muteinene fremstilles ved kjente teknikker for syntese og/eller ved setestyrt mutagenese, eller ved enhver annen kjent teknikk egnet for dette.
Muteiner i henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter proteiner som kodes av en nukleinsyre, for eksempel DNA eller RNA, som hybridiserer til DNA eller RNA som koder et IL-18BP, eller som koder et viralt IL-18BP (WO99/09063) under stringente betingelser. Betegnelsen "stringente betingelser" refererer til betingelser for hybridisering av påfølgende vask som gjennomsnittsfagfolk vanligvis betegner "stringent". Se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§ 6.3 og 6.4 (1987,1992). Uten å være begrenset til disse, omfatter eksempler på stringente betingelser vaskebetingelser 12-20 °C under den beregnete Tm for hybridet som undersøkes i for eksempel 2 x SSC og 0,5 % SDS i 5 minutter, 2 x SSC og 0,1 % SDS i 15 minutter; 0,1 x SSC og 0,5 % SDS ved 37 °C i 30-60 minutter, og så, 0,1 x SSC og 0,5 % SDS ved 68 °C i 30-60 minutter. Gjennomsnittsfagfolk vil vite at stringensbetingelser også avhenger av lengden av DNA-sekvensene, oligonukleotidprobene (for eksempel 10-40 baser) eller blandete oligonukleotidprober. Dersom blandete prober anvendes, foretrekkes det å anvende
tetrametylammoniumklorid (TMAC) i stedet for SSC. Se Ausubel, supra.
Identitet gjenspeiler et slektskap mellom to eller flere polypeptidsekvenser eller to eller flere polynukleotidsekvenser som bestemmes ved å sammenlikne sekvensene. Generelt viser identitet til et nøyaktig samsvar fra nukleotid til nukleotid eller fra aminosyre til aminosyre mellom de to polynukleotidsekvensene, henholdsvis polynukleotidsekvensene over hele lengden av sekvensene som sammenliknes.
For sekvenser hvor det ikke er fullstendig samsvar kan "% identitet" bestemmes. Generelt sammenstilles de to sekvensene som skal sammenliknes for å oppnå den maksimale korrelasjon mellom sekvensene. Dette kan omfatte innføring av "gap" i en eller begge sekvenser for å forhøye sammenstillingsgraden. En % identitet kan bestemmes over hele lengden av de to sekvensene som sammenliknes (såkalt global sammenstilling), noe som er spesielt godt egnet for sekvenser med samme lengde eller svært lik lengde, eller over kortere, definerte lengder (såkalt lokal sammenstilling), noe som er mer egnet for sekvenser av ulik lengde.
Fremgangsmåter for sammenlikning av identitet og homologi mellom to eller flere sekvenser er velkjent innen fagfeltet. Således kan for eksempel programmer som er tilgjengelige i Wisconsin Sequence Analysis Package, versjon 9.1 (Devereux, J. et al., 1984), for eksempel programmene BESTFIT og GAP anvendes for å bestemme % identitet mellom to polynukleotider og % identitet og % homologi mellom to peptidsekvenser. BESTFIT anvender "lokal homologi"-algoritmen til Smith og Waterman (1981) og finner det beste enkeltområdet med likhet mellom to sekvenser. Andre programmer for å bestemme identitet og/eller likhet mellom sekvenser, er også kjent innen fagfeltet, for eksempel BLAST-familien av programmer (Altschul, S. F. et al, 1990, Altschul, S. F. et al, 1997, tilgjengelig fra hjemmesiden til NCBI på www.ncbi.nlm.nih.gov) og FASTA (Pearson, W. R., 1990).
Ethvert slikt mutein har fortrinnsvis en sekvens av aminosyrer som i tilstrekkelig grad likner sekvensen til et IL-18BP eller i tilstrekkelig grad likner et viralt IL-18BP, slik at det har i det vesentlige samme aktivitet som IL-18BP. Én aktivitet forbundet med IL-18BP er evnen til å binde IL-18. så lenge muteinet har en vesentlig evne til å binde IL-18 kan det anvendes for rensing av IL-18, for eksempel ved affinitetskromatografi, og kan således anses å i det vesentlige ha aktivitet som IL-18BP. Det kan således fastslås hvorvidt et mutein har vesentlig den samme aktivitet som IL-18BP ved hjelp av rutinemessig eksperimentering som omfatter analyse av et slikt mutein, for eksempel en enkelt "sandwich"-konkurranseanalyse for å fastslå hvorvidt det bindes til et på egnet vis merket IL-18, for eksempel en radioimmunanalyse eller ELISA-analyse.
I en foretrukket utførelsesform har ethvert slikt mutein minst 40 % identitet eller homologi med sekvensen til enten et IL-18BP eller en viruskodet IL-18BP-homolog som definert i WO99/09063. Mer foretrukket har den minst 50 %, minst 60 %,
minst 70 %, minst 80 %, minst 90 % identitet eller homologi med dertil.
Muteiner av IL-18BP-polypeptider eller muteiner av virale IL-18BP som kan anvendes i henhold til foreliggende oppfinnelse eller nukleinsyrer som koder for slike, omfatter et begrenset sett av vesentlig samsvarende sekvenser som substitusjonspeptider eller -polynukleotider som rutinemessig kan oppnås av en fagperson uten omfattende eksperimentering, basert på læringen og retningslinjene som gis heri.
Foretrukne endringer for muteiner i henhold til foreliggende oppfinnelse er hva som betegnes som "konservative" substitusjoner. Konservative aminosyresubstitusjoner i IL-18BP-polypeptider eller -proteiner eller virale IL-18BP kan omfatte synonyme aminosyrer innen en gruppe som har tilstrekkelig like fysikalskkjemiske egenskaper til at substitusjon mellom medlemmer av gruppen vil bevare molekylets biologiske funksjoner (Grantham, 1974). Det er åpenbart at innsettinger og slettinger av aminosyrer også kan innføres i de ovenfor definerte sekvenser uten å endre deres funksjon, særlig dersom innsettingene eller slettingene omfatter noen få aminosyrer, for eksempel under tretti, og fortrinnsvis under 10, og ikke fjerner eller forskyver aminosyrer som er avgjørende for en funksjonell konformasjon, for eksempel cysteinrester. Proteiner og muteiner som fremstilles ved slike slettinger og/eller innsettinger faller innenfor foreliggende oppfinnelses område.
De synonyme aminosyregruppene er fortrinnsvis gruppene som defineres i tabell 4. Mer foretrukket er de synonyme aminosyregruppene som defineres i tabell 5, og mest foretrukket er de synonyme aminosyregruppene som defineres i tabell 6.
Eksempler på innføring av aminosyresubstitusjoner i proteiner som kan anvendes for å oppnå muteiner av IL-18BP polypeptider eller -proteiner, eller muteiner av viral IL-18BP, for anvendelse i foreliggende oppfinnelse omfatter alle kjente fremgangsmåtetrinn, for eksempel som presentert i US 4 959 314; 4 588 585; og 4 737 462; tilhørende Mark et al; 5 116 943; tilhørende Koths et al; 4 965 195 tilhørende Nåmen et al; 4 879 111 tilhørende Chong et al; og 5 017 691 tilhørende Lee et al; og lysinsubstituerte proteiner som presentert i US 4 904 584 (Shaw et al).
Betegnelsen "fusjonsprotein" refererer til et polypeptid som omfatter et IL-18BP, eller et viralt IL-18BP eller et mutein eller fragment derav, fusjonert til et annet protein som for eksempel har forlenget levetid i kroppsvæsker. Et IL-18BP eller et viralt IL-18BP kan således være fusjonert til et annet protein, polypeptid eller liknende, for eksempel et immunglobulin eller et fragment derav.
"Funksjonelle derivater" som anvendt heri dekker derivater av IL-18BP eller et viralt IL-18BP, og deres muteiner og fusjonerte proteiner, som fremstilles fra de funksjonelle gruppene som foreligger som sidekjeder på aminosyrerestene eller den N- eller C-terminale gruppen, med midler som er kjent i fagfeltet, og disse omfattes av oppfinnelsen så lenge de forblir farmasøytisk akseptable, dvs. at de ikke ødelegger aktiviteten av proteinet, som i det vesentlige tilsvarer aktiviteten av IL-18BP eller virale IL-18BP, og ikke innfører toksiske egenskaper i sammensetninger som inneholder dem.
Disse derivatene kan for eksempel inkludere polyetylenglykol sidekjeder, som kan maskere antigene seter og forlenge levetiden av et IL-18BP eller et viralt IL-18BP i kroppsvæsker. Andre derivater omfatter alifatiske estere av karboksylgruppene, amider av karboksylgruppene dannet ved reaksjon med ammoniakk eller primære eller sekundære aminer, N-acyl derivater av frie aminogrupper i aminosyrerestene, dannet med acylgrupper (for eksempel alkanoylgrupper eller karbosykliske aroylgrupper) eller O-acylderivater av frie hydroksylgrupper (for eksempel i seryl- eller treonylrester) dannet med acylgrupper.
Som "aktive fraksjoner" av et IL-18BP eller et viralt IL-18BP og muteiner og funksjonsproteiner derav, dekker foreliggende oppfinnelse ethvert fragment eller enhver forløper av polypeptidkjeden til proteinmolekylet, alene eller sammen med assosierte molekyler eller grupper koblet dertil, for eksempel sukker- eller fosfatrester, eller aggregater av proteinmolekylet eller sukkerrestene i seg selv, forutsatt at fraksjonene i det vesentlige her tilsvarende aktivitet som IL-18BP.
Betegnelsen "salter" heri refererer til salter av karboksylgrupper og til syreaddisjonssalter av aminogrupper av IL-18BP-inhibitormolekyl, eller analoger derav. Salter av en karboksylgruppe kan dannes ved hjelp av midler kjent innen fagfeltet, og omfatter uorganiske salter, for eksempel natrium-, kalsium-, ammonium-, jern(III)- eller sinksalter og liknende, og salter med organiske baser, for eksempel salter dannet med aminer som trietanolamin, arginin eller lysin, piperidin, prokain og liknende. Syreaddisjonssalter omfatter for eksempel salter med mineralsyrer, for eksempel saltsyre eller svovelsyre, og salter med organiske syrer, for eksempel eddiksyre eller oksalsyre. Naturligvis må alle slike salter opprettholde den biologiske aktivitet til IL-18BP-inhibitoren, for eksempel induksjon av IFN-y i blodceller.
Sekvensene til IL-18BP og dets spleisevarianter/isoformer kan tas fra WO99/09063 eller fra Novick et al., 1999, så vel som fra Kim et al., 2000.
Funksjonelle derivater av IL-18BP kan være konjugert til polymérer for å forbedre proteinets egenskaper, for eksempel stabiliteten, halveringstiden, biotilgjengeligheten, evnen til å tolereres av menneskekroppen eller immunogenisitet. For å oppnå dette kan IL-18BP kobles til for eksempel polyetylenglykol (PEG). PEGylering kan utføres ved kjente fremgangsmåter, som for eksempel beskrevet i WO92/13095.
I en foretrukket utførelsesform omfatter det funksjonelle derivat derfor minst én gruppe tilkoblet én eller flere funksjonelle grupper som foreligger som én eller flere sidekjeder på aminosyrerestene. En utførelsesform der gruppen er en polyetylenglykol (PEG)-gruppe er særlig foretrukket.
I en ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter IL-18BP en immunglobulinfusjon, dvs. at inhibitoren av IL-18 er et fusjonsprotein omfattende hele eller en del av et IL-18BP, fusjonert til det hele eller en del av et immunglobulin. Fremgangsmåter for fremstilling av immunglobulinfusjonsproteiner er velkjent i fagfeltet, for eksempel fremgangsmåtene som beskrives i WO01/03737. Fagpersonen vil forstå at det resulterende fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen opprettholder den biologiske aktiviteten av IL-18BP, særlig bindingen til IL-18. Fusjonen kan være dirkete eller via et kort linkerpeptid, som kan være så kort som 1 til 3 aminosyrerester i lengde eller lenger, for eksempel 13 aminosyrerester langt. Linkeren kan være et tripeptid, for eksempel med sekvensen E-F-M (Glu-Phe-Met), eller en linkersekvens på 13 aminosyrer som omfatter Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, innført mellom IL-18BP-sekvensen og immunglobulinsekvensen. Det resulterende fusjonsproteinet har forbedrete egenskaper, for eksempel forlenget levetid i kroppsvæsker (halveringstid), forhøyet spesifikk aktivitet, forhøyet ekspresjonsnivå eller forenklet rensing av fusjonsproteinet.
I en foretrukket utførelsesform er IL-18BP fusjonert til det konstante området fra et Ig-molekyl. Det fusjoneres fortrinnsvis til tungkjedeområder, for eksempel CH2- og CH3-doméner av humant IgGl. Fremstilling av spesifikke fusjonsproteiner som omfatter IL-18BP og en del av et immunglobulin er for eksempel beskrevet i eksempel 11 i WO99/09063. Andre isoformer av Ig-molekyler er også egnet for fremstilling av fusjonsproteiner ifølge foreliggende oppfinnelse, for eksempel isoformene IgG2eller IgG4, eller andre Ig-klasser, for eksempel IgM eller IgA. Fusjonsproteiner kan være monomere eller multimere og hetero- eller homomultimere. IL-18BP som renses i samsvar med foreliggende oppfinnelse har også en spesifikk isoformprofil, målt for eksempel med kapillærsone elektroforese. Det foretrekkes at det angjeldende IL-18BP inneholder mindre enn 5 % basiske isoformer, mindre enn 25 % av mindre sure isoformer, mer enn 45 % sure isoformer, og mer enn 15 % svært sure isoformer. Isoform klassifisering er som definert i eksemplet nedenfor.
Dersom ytterligere rensetrinn anvendes, fortrinnsvis ved anvendelse av de ytterligere trinnene som er beskrevet ovenfor, kan det oppnådde IL-18BP-preparat inneholde mindre enn 20 % urenheter, fortrinnsvis mindre enn omkring 15 %, eller omkring 14 %, eller omkring 13 %, eller omkring 12 %, eller omkring 11 % urenheter. Det inneholder fortrinnsvis mindre enn omkring 10 %, eller omkring 5 %, eller omkring 3%, 2% eller 1 % urenheter, eller det kan være renset til homogenitet, dvs. at det er vesentlig fritt for proteinforurensning.
Renset IL-18BP kan være beregnet for terapeutisk anvendelse, dvs. for tilførsel til pasienter. Dersom renset IL-18BP tilføres pasienter gjøres det fortrinnsvis systemisk, og fortrinnsvis subkutant eller intramuskulært, eller topisk, dvs. lokalt. Rektal eller intratekal tilførsel kan også være egnet, avhengig av den spesifikke anvendelsen av renset IL-18BP.
For dette formål kan renset IL-18BP utformes som et farmasøytisk sammensetning, dvs. sammen med et farmasøytisk akseptabel bærer, hjelpestoffer eller liknende.
Definisjonen av "farmasøytisk akseptabelt" er ment å omfatte alle bærestoffer som ikke interfererer med effektiviteten av den biologiske aktivitet til den aktive bestanddel, og som ikke toksisk for verten som det tilføres. For parenteral tilførsel kan for eksempel de(t) aktive protein(er) være utformet i en enhetsdoseform for injeksjon i bærestoffer som saltvann, dekstroseløsning, serumalbumin og Ringers løsning.
De aktive bestanddelene i den farmasøytiske sammensetning kan tilføres et individ på mange måter. Tilførselsveiene omfatter intradermal, transdermal (for eksempel i utforminger for langsom frigjøring), intramuskulær, intraperitoneal, intravenøs, subkutan, oral, intrakranial, epidural, topisk,, rektal og intranasal tilførsel. Enhver annen terapeutisk, effektiv tilførselsvei kan anvendes, for eksempel absorpsjon gjennom epitelvev eller endotelvev, eller ved genterapi, der et DNA-molekyl som koder det aktive middel tilføres pasienten (for eksempel ved hjelp av en vektor), slik at det aktive middel uttrykkes å utskilles in vivo. I tillegg kan proteinet/proteinene ifølge oppfinnelsen tilføres sammen med andre bestanddeler av det biologisk aktive middel, for eksempel farmasøytisk akseptable overflatemidler, hjelpestoffer, bærestoffer, fortynningsmidler og bærere.
For parenteral (for eksempel intravenøs, subkutan, intramuskulær) tilførsel kan de(t) aktive proteinet/proteinene utformes som en løsning, suspensjon, emulsjon eller et frysetørket pulver i assosiasjon med en farmasøytisk akseptabel, parenteral bærer (for eksempel vann, saltvann, dekstroseløsning) og med tilsettingsstoffer som opprettholder isotonisitet (for eksempel mannitol) eller kjemisk stabilitet (for eksempel konserveringsmidler og buffere). Utformingen steriliseres ved alminnelig anvendte teknikker.
Biotilgjengeligheten av de(t) aktive protein/proteinene ifølge oppfinnelsen kan også forbedres ved anvendelse av konjugasjonsfremgangsmåter som forlenger molekylets halveringstid i menneskekroppen, for eksempel ved å koble molekylet til polyetylenglykol (PEG), som beskrevet i PCT-søknad WO92/13095.
De terapeutisk effektive mengdene av de(t) aktive protein/proteinene vil være en funksjon av mange variabler, innbefattet typen antagonist, dens affinitet for IL-18, eventuelt gjenværende cytotoksisk aktivitet som vises av antagonistene, tilførselsveien, pasientens kliniske tilstand (innbefattet ønsket om å opprettholde et ikke-toksisk nivå av endogent IL-18-aktivitet).
En "terapeutisk effektiv mengde" er en slik at ved tilførsel fører IL-18-inhibitoren til inhibering av den biologiske aktiviteten til IL-18. Dosen som tilføres som en enkelt eller flere doser til et individ vil variere, avhengig av mange faktorer, inkludert IL-18-inhibitorens farmakokinetiske egenskaper, tilførselsveien, pasientens tilstand og egenskaper (kjønn, alder, kroppsvekt, helsetilstand, størrelse), symptomenes omfang, samtidige behandlinger, behandlingshyppighet og den ønskete vrikning. Justering og manipulering av etablerte doseringsområder ligger godt innenfor kunnskapsområdet til fagfolk, så vel som in vitro- og in v/vø-fremgangsmåter for bestemmelse av inhibering av IL-18 i et individ.
Renset IL-18BP kan anvendes i en mengde på fra omkring 0,001 til 100 mg/kg, fra omkring 0,01 til 10 mg/kg kroppsvekt, fra omkring 0,1 til 5 mg/kg kroppsvekt eller fra omkring 1 til 3 mg/kg kroppsvekt, eller i en mengde på omkring 2 mg/kg kroppsvekt.
det rensete IL-18BP kan tilføres daglig, annenhver dag, eller tre ganger ukentlig en gang pr. uke.
De daglige dosene gis vanligvis oppdelt på flere doser eller i en form for vedvarende frigjøring som effektivt gir de ønskete resultater. Andre gangs tilførsel eller påfølgende tilførsler kan utføres med en dose som er den samme, mindre enn eller større enn den innledende eller foregående dose som er tilført individet. En andre påfølgende tilførsel kan tilføres under eller før sykdommens begynnelse.
Renset IL-18BP kan tilføres forebyggende eller terapeutisk til et individ før, samtidig med eller sekvensielt med andre terapeutiske behandlingsformer eller midler (for eksempel flermedikamentsbehandling) i en terapeutisk effektiv mengde.
Renset IL-18BP kan anvendes for fremstilling av et medikament for behandling og/eller forebyggelse av mange forskjellige sykdommer eller forstyrrelser. Slike sykdommer eller forstyrrelser er fortrinnsvis IL-18-formidlete forstyrrelser. Nærmere bestemt kan renset IL-18BP anvendes for behandling og/eller forebygging av psoriasis, psoriatisk artritt, Crohns sykdom, inflammatorisk tarmsykdom, reumatoid artritt, leverskade, for eksempel alkoholisk levercirrhose, sepsis, aterosklerose, iskemiske hjertesykdommer, allergier, fortrinnsvis hypersensitivitet av forsinket type, og lukket hodeskade.
I et andre aspekt gjelder oppfinnelsen anvendelse av et vandig tofasesystem for rensing av IL-18BP, hvori det vandige tofasesystemet omfatter en polyetylenglykol (PEG)-fase og en saltfase som omfatter (NH^SC^eller Na2S04
I et andre aspekt gjelder oppfinnelsen anvendelse av et vandig tofasesystem for innfanging av IL-18BP fra en væske, hvori det vandige tofasesystemet omfatter en polyetylenglykol (PEG)-fase og en saltfase som omfatter (NH4)S04eller NaiSCv
EKSEMPEL:
Rensing av rekombinant, humant IL-18BP fra serumfritt materiale høstet fra CHO-celler
I det foreliggende eksempel har et rensetrinn basert på et vandig tofasesystem for rensing av IL-18BP fra materiale høstet fra CHO-celler blitt utviklet. For dette formål ble følgende trinn utført:
1. Valg av de fasedannende bestanddeler (par) som skal analyseres.
2. Første eksperimenter med faktoriell utforming. For hvert enkelt valgt par ble alle hovedfaktorer som påvirker fordelingen av proteinet analysert over et bredt eksperimentelt rom. 3. Andre eksperimenter med faktoriell utforming. Kun viktige faktorer som påvirker fordelingen av målproteinet ble analysert over et redusert eksperimentelt rom.
4. Hint prediket av modellen ble eksperimentelt bekreftet.
5. Hint ble optimalisert og finjustert.
6. Hint ble oppskalert til 1 liter skala.
Valg av tofasedannende bestanddeler
Ulike faktorer ble vurdert for valget av de fasedannende bestanddelene: (i) prosesskompatibilitet; (ii) bestanddelenes kostnad, (iii) bestanddelenes tilgjengelighet; (iv) litteraturverdier. Når det gjelder prosesskompatibilitet, pris og tilgjengelighet var paret PEG/salt egnet. PEG/(NH4)2S04, PEG/KH2P04og PEG/Na2S04ble utvalgt.
De tre parene som ble undersøkt var følgelig:
1. PEG/(NH4)2S04
2. PEG/KH2P04
3. PEG/Na2S04
Første syklus med eksperimenter med faktoriell utforming
Formålet med denne syklus av eksperimenter med faktoriell utforming var å velge de egnete, fasedannende komponentene som ga ekstrem proteinfordeling.
Det anvendt eksperiment var en sentralt sammensatt utforming som omfattet en 2<5>"<1>fraksjonell fakultetsverdi, 10 stjernepunkter og 2 senterpunkter. Utformingen tillot estimering av alle hovedvirkninger og tofaktor interaksjoner, og alle rent kvadratiske virkninger av de eksperimentelle faktorer. Tabell A oppsummerer typen eksperimentelle faktorer og nivåer som ble tatt i betraktning. Den tilsvarer 28 eksperimenter pr. valgt par.
De eksperimentelle betingelser anvendt er beskrevet i tabell B, C og D.
Responsen som ble målt var fordelingskoeffisienten K, definert som:
Resultater
De ubehandlete dataene er beskrevet i Tabell E.
En statistisk analyse ble utført på fordelingen av IL-18BP ved anvendelse av PEG/Na2S04eller PEG/KH2PO4. Faktorer med liten innflytelse på proteinfordelingen ble først fjernet fra den statistiske analysen. Denne analysen resulterte i matematiske (likning 2 og likning 3), som forutsier verdien av K, som tar i betraktning de faktorer som ble funnet å ha betydelig virkning på den målte K.
Prediktiv modell for IL-18BP-fordeling ved anvendelse av PEG/Na2S04
Prediktiv modell for IL-18BP-fordeling ved anvendelse av PEG/KH2P04
Maksimale K-verdier fra den predikete modell er vist i tabell G
Andre syklus av eksperimenter med faktoriell utforming
Formålet med denne syklusen av eksperimenter med faktoriell utforming var å velge egnete betingelser (pH, konsentrasjoner, osv.) som gir ekstrem proteinfordeling og gode rensefaktorer. Denne syklus ble utført ved å anvende PEG/Na2SC«4 som fasedannende bestanddeler.
Den eksperimentelle utformingen var en sentralt sammensatt utforming. Utformingen omfattet en full tonivå fakultetsverdi, stjernepunkter og et senterpunkt, med duplikater for hvert eksperimentelt oppsett. Dette førte til 52 eksperimenter, som vist i tabell H. Ulikt den første syklus av eksperimenter med faktoriell utforming, ble klarnet råmateriale anvendt som utgangsmateriale. Eksperimentene ble utført i 10 ml skala. To responser ble oppsamlet: IL-18BP-fordelingskoeffisienten K<il-i8bp) som er forbundet med prosessens kapasitet, og fordelingskoeffisienten for totalprotein K(totprot), som er forbundet med prosessens renseevne.
Resultater
De ubehandlete resultatene gis i tabell I.
Området av fordelingskoeffisientverdier observert fra eksperimentene med faktoriell utforming er vist i tabell J.
En statistisk analyse ble utført på fordelingen av IL-18BP og totalprotein. I motsetning til den første syklus med eksperimenter viser resultatene fra denne analysen, vist i tabell K og L, som indikerer at alle de fire hovedfaktorene so ble analysert var betydelige, og likeså mange annengrad interaksjoner.
De prediktive modellene fra den andre syklus av eksperimenter med faktoriell utforming tillot valg av 28 kandidatbetingelser som viser et prediket utbytte > 75 % og en renhet i fraksjonen etter A2PS som er større enn 50 %. Disse ble ansett som "hint" for ytterligere utvikling. Kandidatforbindelsene er opplistet i tabell M.
Eksperimentell bekreftelse av hintene oppnådd fra den prediktive modell
Formålet med disse eksperimenter var å bekrefte eksperimentelt yteevnen til hintene utledet fra den statistiske analyse. Klarnet råmateriale ble anvendt som utgangsmateriale. Eksperimentene ble utført i 10 ml skala. To responser ble oppsamlet: IL-18BP-fordelingskoeffisienten K(IL-i8bp), og fordelingskoeffisienten for totalprotein K(totProt)- De eksperimentelle betingelsene er beskrevet i tabell M ovenfor.
Resultater
Resultatene gis i tabell N. Konsentrasjonen av IL-18BP ble målt i et BIAcore-instrument med immobilisert monoklonalt antistoff som påviser IL-18BP, betegnet Mab 582.1. IL-18BP-konsentrasjonen ble målt ved "BIAcore"-fremgangsmåten i henhold til produsentens retningslinjer og anvendelse av følgende parametre: Tre hint ble identifiserte fra den statistiske modellen. Parametre forbundet med disse hintene er vist i tabell O nedenfor. Kapillærsone elektroforese (CZE) ble utført ved følgende fremgangsmåte:
Materialer og utstyr for kapillærsone elektroforese
Materialer
Utstyr
Løsninger for Sep-Pak
Sep-Pak kondisjonering: 100 % CH3CN
Sep-Pak ekvillibrering/vaskelosning: 25 % CH3CN i 0,1 % vandig TF A Sep-Pak elueringsløsning: 36 % CH3CN i 0,1 % vandig TFA (holdbarhet: to uker i 4 °C)
Løsninger for CZE
5 mM fosfat-CZE vaske/elektroforesebuffer
Fremstill ved 1:10 fortynning av 50 mM fosfatløsning pH 7,0. Filtrer gjennom 0,22fim filter. Fremstill umiddelbart før bruk.
0,5 M NaOH (CZE-vaskeløsning)
Tilsett 26,2 (4.150 % NaOH til vann, totalvolum 1 ml. Fremstill umiddelbart før bruk. IM NaOH (CZE-regenereringsløsning).
Tilsett 52,4 fil 50 % NaOH til vann, totalvolum 1 ml. Fremstill umiddelbart før bruk.
Nøytral markør (fortynning 1:10000)
Tilsett 10 fil lagerløsning av nøytral markør til vann, totalvolum 1 ml.
Tilsett 10 fil av denne 1:100 fortynning av nøytral markør til vann, totalvolum 1 ml. Kan lagres i tre måneder i 4 °C.
FREMGANGSMÅTE
CZE er en form for høyytelseskapillærelektroforese. Kapillæret er fylt med elektrolyttbuffer, og prøveseparasjonen skjer ved å påføre et elektrisk felt over kapillæret. Separasjonsmekanismen bygger på forskjeller i elektroforetisk mobilitet mellom analyttene. Den elektroforetiske mobilitet er en funksjon av analyttenes nettoladning og hydrodynamiske størrelse under et gitt sett av betingelser.
CZE-analyse av prøver som inneholder IL-18BP utføres ved anvendelse av et CE-system med et kvart kapillær (75 um LD. og effektiv lengde 50 cm) fylt med en buffer inneholdende 5 mM fosfat.
For å øke CZE-oppløsningen avsaltes standard referansen og hver prøve med Centricon 10 før CZE-analysen. Prøvene påsettes ved omkring 2,5 mg/ml IL-18BP konsentrasjon. Injeksjonen i kapillæret utføres vedd bruk av injeksjon ved lavt trykk (~ 0,5 psi) i 5 sekunder. Separasjonen utføres ved konstant spenning på 25 kV i 30 minutter i 25 °C. elektroforesen følges ved bruk av UV-absorbans på 214 nm.
For referansestandarden og prøvene omfatter fremgangsmåten to trinn: Prøveavsaltning og CZE-analyse.
For høstet råmateriale og prøver etter innfanging, fjernes høymatriks interferensen slik at glykoproteinprofilen til IL-18BP kan observeres. I dette tilfellet består fremgangsmåten av tre trinn: Et Sep-Pak innfangingstrinn for å fjerne den høye matriksinterferens, prøveavsaltning og ZCE-analyse av fraksjonen med innfanget IL-18BP.
IL-18BP innfanging ved Sep-Pak fremgangsmåte for CZE-analyse av høstet råmateriale og prøver etter innfanging
Sep-Pak patronen tilkobles en 5 ml sprøyte hvoretter fremgangsmåten nedenfor følges:
Den oppsamlete løsning fra trinn 6 (totalvolum 3 ml) konsentreres i en Speed-Vac sentrifuge for fjerning av CH3CN og reduksjon av totalvolumet til < 2,0 ml.
Prøveavsalting ved Centricon 10 ultrafiltrering
Referansestandarden, prøveløsningen eller Speed-Vac løsningen fra trinnet ovenfor overføres til Centricon 10 og konsentreres til omkring 100 fil ved ultrafiltrering i 5000 x g og 10 °C.
Avsalting utføres deretter med 4 x 1 ml H20-vask i 5000 x g og 10 °C, hver gang i 40 minutter.
Bortsett fra høstet råmateriale fortynnes det tilbakeholdte materialet og fordeles i porsjoner (hver på 30 ul) i en IL-18BP-konsentrasjon på 2,5 mg/ml.
Prøver med høstet råmateriale gjenvinnes i et sluttvolum på 40-50 (il. Denne mengden er tilstrekkelig for fremstilling av to uavhengige CZE-prøver. Prøvene er nå klare for CZE-analyse.
Alle prøver lagres i -20 °C frem til CZE-analysen.
CZE-analyse
> 20 ul prøve/referanse overføres til PCR-rør inneholdende 1/10 volumer nøytral markør (3.3.4) og sammenblandes ved revers pipettering og unngåelse av bobledannelse.
Anbefalte elektroforese parametre:
Følgende reagenser overføres til separate rørholdere mens bobledannelse unngås. Tidstabell for CZE-kapillær regenerering
Anbefalte injeksjonsfremgangsmåter
Minst tre injeksjoner av standard referansemateriale for kondisjonering av kapillæret.
Standard referanse 1 (start)
En gangs injeksjon av prøve 1
En gangs injeksjon av prøve 2
En gangs injeksjon av prøve 3
En gangs injeksjon av prøve 4
Standard referanse 2 (slutt)
Bemerk: For å øke reproduserbarheten kan maksimalt 4 prøver analyseres i en sekvens mellom referanse 1 og referanse 2 ved anvendelse av den samme CZE-elektroforesebufferen. Alternativt kan to referanser anvendes før og etter hver prøve, som beskrevet nedenfor.
Minst tre injeksjoner av standard referansemateriale utføres for kondisjonering av kapillæret.
Standard referanse (start 1)
En gangs injeksjon av prøve 1
Standard referanse (slutt l/start2)
En gangs injeksjon av prøve 2
Standard referansereplikat (slutt2/start3)
En gangs injeksjon av prøve 3
Standard referansereplikat (slutt3)
Dataanalyse
Standard referansematerialet anvendes for sammenlikning av prøveresultater.
Skriv ut overlagte og preparerte elektroferogrammer for prøver og de to referansestandardene (start/slutt) og arkiver disse i resultatfilene.
Bestemmelse av migrasjonstidene MT2 og MT3
Migrasjonstidene MT2 og MT3 bestemmes som den venstre og høyre bunn for -3 og +3 toppen i referansestandarden (start). 0-toppen er hovedtoppen i referansen.
Klassifisering av isoformer
Grunnet den høye surhet av IL-18BP-glykoproteinprofilen, betegnes isoformene mellom MT2 og MT3 " sure isoformer". Isoformer med migrasjonstider høyere enn MT3 betegnes " svært sure isoformer". Isoformer med migrasjonstider lavere enn MT2 betegnes " mindre sure isoformer".
I noen tilfeller kan det være nødvendig å innføre klassen " basiske isoformer", definert som isoformer med migrasjonstider lavere enn MT1.
Vurdering av mengden isoformer
Referanse av hver prøve analyseres ved anvendelse av funksjonene: manualpeak mellom MT1-M2, MT2-MT3 og MT3-MT4; manual baseline mellom 5 og 28 minutter og integration OFF mellom 0 og MT1 og mellom MT4 og 30 minutter. Funksjonene Width og Treshold modifiseres manuelt for å oppnå integrasjon av tre grupper av topper mellom MT1-M2 (mindre sure isoformer), MT2-MT3 (sure isoformer) og MT3-MT4 (svært sure isoformer), på liknende måte som vist ovenfor for referansestandarden. Når det er nødvendig innføres gruppen av topper som tilsvarer " basiske isoformer", definert som isoformer med migrasjonstider lavere enn MT1, og formelen ovenfor korrigeres tilsvarende.
Resultater fra CZE-analyse
CZE-profilene viste at sure isoformer så ut til å velges av A2PS. Resultatene for isoformprofilene er vist i figur 1.
Beregning av utbytte og renhet
Utbyttet og renhet av det rensete IL-18BP ble beregnet som følger:
Vfase: Volum av fasen av interesse
CfaseIL"I8BP: Konsentrasjon av IL-18BP i fasen av interesse
Cfase10'""^01": Konsentrasjon av totalprotein i fasen av interesse
Vo: Volum av utgangsmaterialet som skal renses
CoIL_18BP: Konsentrasjon av IL-18BP i utgangsmaterialet som skal renses
Resultater
Parametrene målt for de tre hintene er oppsummert i tabell O. Proteinfordelingen var reproduserbar (se verdiene for standardavvik). Ingen aggregater ble dannet under prosessen.
A2PS fremgangsmåte ved anvendelse av uklarnet, høstet materiale
I denne seksjonen ble direkte rensing av IL-18BP fra uklarnet, høstet råmateriale anslått. For å undersøke hvorvidt celler påvirker yteevnen til prosessen ble to sett av prosessbetingelser sammenliknet med og uten celler (for prosessbetingelser, se tabell
N).
Som vist i tabell P, ble prosessens yteevne relativt lite påvirket av nærvær av celler eller cellerester. Etter faseseparasjonen forelå de fleste av cellene og cellerestene som en tykk interfase.
Optimalisering av hintene
Formålet med disse eksperimentene var å optimalisere yteevnen til hintene som tidligere ble utvalgt (tabell O). Det er mulig å optimalisere utbyttet, renhet eller konsentrasjonsfaktoren for ekstraksjonstrinnet, basert på forbindelseslinjene.
Na2S04- konsentrasjon
Ledningsevne anvendes hyppig for bestemmelse av saltkonsentrasjonen i A2PS. Dyrkingsmediet inneholder imidlertid allerede noe salt som kan påvirke analysen, Følgelig ble det anvendt en kolorimetrisk analyse (Sett: Aquanal- plus Sulfate ( SO4) 50-330 mg/ l ( Fluka Nr. 3 7429- 1EA) som viste bedre resultater i dette tilfellet.
PEG konsentrasjon
Refraktometri kan anvendes for analyse av PEG-konsentrasjon. Imidlertid interfererer mange bestanddeler av dyrkingsmediet med analysen. Følgelig ble størrelseseksklusjonskromatografi anvendt for analyse av PEG-konsentrasjon under betingelsene angitt i tabell Q.
Forbindelseslinjer kan bestemmes ved å måle PEG og Na2S04i topp- og bunnfasene (se figur 4, 5 og 6). K<il-i8bp) og K/tot. prot) er konstante på den samme forbindelseslinjen. Derfor vil et optimal faseforhold utvalgt for renseprosessen gi balanse mellom utbytte og rensefaktor.
Klarnet, høstet råmateriale ble anvendt som utgangsmateriale, og eksperimentene ble utført i 10 ml skala. To responser ble oppsamlet: IL-18BP-fordelingskoeffisienten K(il-i8bp), og fordelingskoeffisienten for totalprotein, K(tot.prot).
Resultater
Fire optimaliserte eksperimentelle betingelser har blitt analysert. Tabell R oppsummerer yteevnen til den eksperimentelle prosess etter fordelingen.
Avhengig av nedstrømsprosessen og kvaliteten på det endelige materiale, kan mange flere optimaliserte betingelser utvelges, basert på forbindelseslinjene som er vist i figur 2, 3 og 4. Fleksibilitet vedrørende utbytte, renhet eller konsentrasjonsfaktoren basert på forbindelseslinjene er én av hovedfordelene ved A2PS-teknologi.
Direkte innfanging av IL- 18BP i 1- liter skala
Formålet med disse eksperimentene var å evaluere de viktigste faktorene forbundet med oppskalering av A2PS-teknologi. To betingelser fra tabell R og S ble valgt for en 100-gangers oppskalering (val2-5; val2-2 opt2). Resultatene er vist i tabell T. Ingen store forskjeller i prosessens yteevne kan observeres etter 100-gangers oppskalering.
Virkning av A2PS- prosessen på proteinintegritet og kvalitet
For å fastslå hvorvidt direkte innfanging av IL-18BP ved anvendelse av A2PS-teknologi påvirker kvaliteten av sluttproduktet, ble materialet etter A2PS innfanging fra oppskaleringseksperimentet val-2.5 renset ved anvendelse av ytterligere kromatografiske rensetrinn. Resultatene er gitt i tabell U. Sammenliknet med mange medikamentforbindelser oppnådd fra kromatografisk innfanging på "Fractogel" TMAE (trimetylaminoetyl ionebytterkromatografi, skaffet fra Merck), viser porsjon (7075-41-05 UF2) avledet fra A2PS-innfangingen tilsvarende kvalitetsresultater.
Konklusjoner
Tabell V oppsummerer resultatene oppnådd med tradisjonelle kromatografiske innfangingstrinn, og viser at A2PS-prosessen er enklere; kan gi bedre renhet og utbytte, og kan være hurtigere.
REFERANSER
1. Ageland, H., Nystrom, L., Persson, J., og Tjerneld, F. Process for purifying a protein. (US 6 559 284). 2003. Esperion Therapeutics, Inc. (Ann Arbor, MI).
2. Altschul SF et al., J Mol Biol, 215,403-410, 1990
3. Altschul SF et al., Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997
4. Ananthapadmanabhan, K. P. og Goddard, E. D. (US 4 743 550). 1988. ( tilhørende Union Carbide Corporation). 5. Balasubramaniam, D., Wilkinson, C, van Cott, K, & Zhang, C. (2003) Journal of Chromatography A 989,119. 6. Bamberger, S., Brooks, D. E., Sharp, K.A., van Alstine, J. M., & Webber, T. J.
(1985) in Partitioning in Aqueous Two- Phase Systems: Theory, Methods, Uses,
and Applications to Biotechnology (Walter, H., Brooks, D. E., & Fisher, D., red.)
s. 85 Academic Press, Orlando, Fla.
7. Baskir, J. N., Hatton, T. A., & Sutter, V. W. (1987) Macromolecules 20,1300. 8. Baskir, J. N., Hatton, T. A., & Sutter, V. W. (1989) Biotechnol. Bioeng. 34, 541.
9. Bierau, H., Hinton, R. J., & Lyddiatt, A. (2001) Bioseparation.
10. Bleier, J. E., Kim, E. H., & Chen, X. D. (2001) Biotechnol. Prog. 17, 697.
11. Bompensieri, S., Malher, G.F., Castaneda, N., Miranda, M.V., Cascone, O., &
Nudel, B.C. (1998) Biotechnology Techniques 12, 611.
12. Boschetti, E., Jungbauer, Sep. Sei. & Tech. 2 No. 15, Acad. Press (2000) 53
13. Boschetti et al., Genetic Engineering bind 20, No. 13, July, 2000
14. Braunstein, E. L., Becker, N. T., anshaw, G., og Raycar, T. P. (WO 96/23061). 1995. (tilhørende Genencor International, Inc.). 15. Brewer, J. W., Brothers, C. E., Farver, T. F., im, C. Y., and ee, E. (US 4728613). 1988. (tilhørende Miles Laboratories, Inc). 16. Builder, S. E., Hart, R. A., Lester, P. M., Ogez, J. R., og Reifsnyder, D. H. (US 5407819). 1995. (to Genentech, Inc.).
17. Cordes, A. & Kula, M. R. (1994) Methods Enzymol 228, 600.
18. Costa, M. J., Cunha, M. T., Cabral, J. M., & Aires-Barros, M. R. (2000)
Bioseparation 9,231.
19. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.
20. Diamond, A. D., Yu, K, & Hsu, J. T. (1990) ACS Symposium Series 427, 52. 21. Dos Reis Coimbra, J., Thommes, J., & Kula, M. R. (1994) Journal of
Chromatography A 668, 85.
22. Dove, G. B og Mitra, G. (US 4684723). 1988. (tilhørende Miles Laboratories,
Inc).
23. Duarte, M., Portugal, E. P., Ponezi, A. N., Bim, M. A., Tagliari, C. V., & Franco,
T. T. (2003) Biorescource Progress 68,49.
24. Eitman, M. A. & Gainer, J. L. (1990) Biotechnol. Prog. 6,479.
25. Eitman, M. A. & Gainer, J. L. (1991) Bioseparation 2, 31.
26. Enfors, S. O., Kolher, K, Ljundquist, Ch., Nilsson, B. og Veide, A. (WO 92/07868). 1992. (Pharmacia AB, Sweden). 27. Fernandes, S., Kim, H. S., & Hatti-Kaul, R. (2002) Protein Expr.Purif 24,460.
28. Grantham et al., Science, bind 185, s. 862-864 (1974)
29. Guan, Y., Wu, S. Y., Treffy, E., & Iley, T. H. (1992) Biotechnol. Bioeng. 40, 517. 30. Guiliano, K. A. og Szlag, D. C. (US 5093254). 1992. (tilhørende de forende stater). 31. Guinn, M. R. Aqueous two-phase metal affinity partitioning protein purification system. (US 5907035). 1997. (tilhørende Baxter Biotech Technology Sari,
Neuchatel, CH).
32. Guoqiang, D., Kaul, R., & Mattiasson (1994) Journal of Chromatography A 668, 145. 33. Gustafsson, S. J., Hedman, P. O., Ling, T. G. I., og Mattiasson, B. G. (US 4579661). 1986. (tilhørende Pharmacia AB, Sweden). 34. Hart, R. A., Lester, P.M., Reifsnyder, D. H., Ogez, J. R., & Builder, S. E. (1994)
Biotechnology ( N Y) 12, 1113.
35. Hatti-Kaul, R. (2000) i Aqueous Two- Phase Systems: Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey. 36. Hayenga, K. J., Valax, og P.P. Methods for protein purification using aqueous two-phase extraction. (US 6437101). 1999. (tilhørende Akzo Nobel N.V.,
Arnhem, NL).
37. Haynes, C. A., Beynon, R. A., King, R. S., Blanch, H. W., & Prausnitz, J. M. (1989a) Journal ofPhysical Chemistry 93, 5612. 38. Haynes, C. A., Blanch, H. W., & Prausnitz, J. M. (1989b) FluidPhase Equilibria 53, 463. 39. Heinsohne, H. G. og Hayenga, K. J. (EU 0 477284 Bl). 1995. (tilhørende
Smithkline Biologicals).
40. Heinsohne, H. G., Lorch, J. D., og Arnold, R. E. (US 5139943). 1992. (tilhørende
Genecor International, Inc.).
41. Johansson, G. & Reczey, K. (1998) Journal of Chromatography B 777,161.
42. Kim, C. Y., Farver, T. F., og Brewer, J. W. (US 4508825). 1985. (tilhørende
Miles Laboratories, Inc.).
43. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proe Nati Acad Sei U S A 2000;97:1190-1195. 44. King, R. S., Blanch, H. W., & Prausnitz, J. M. (1988) American Institute of
Chemical Engineers Journal 34,1585.
45. Kirchberger, J., Kopperschlager, G., Rockstroh, M., og Eisenbrandt, K. (DD 298 424). 1992. (tilhørende Universitåt Leipzig, Tyskland). 46. Lee, C. J. og Khan, P. (US 5407579). 1995. (tilhørende National Science Concil,
Taipei).
47. Li, Y. & Beitle, R. R. (2002) Biotechnol. Prog. 18, 1054.
48. Lorch, J. D., Clarkson, E., Larenas, B. S., Bower, B. S, og Weiss, G. L. (US 5328841). 1994. (tilhørende Genecore International, Inc.). 49. Menge, U., Fraune, E., Lehmann, J., & Kula, M. R. (1987) Dev Biol Stand 66, 391. 50. Menge, U., Morr, M., og Kula, M. R. (DE 2943026 C2). 1984. (tilhørende
Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung mbH).
51. Minami, N. M. & Kilikian, B. V. (1997) Journal of Chromatography 711, 309. 52. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, og Rubinstein, M
(1999). Immunity 10, 127-136.
53. Paul, F., Monsan, P., og Auriol, D. (US 4591563). 1986. (tilhørende Societe
Nationale Elf Aquitaine, France).
54. Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98
55. Persson, J., Johasson, H. O., & Tjerneld, F. (1999) Journal of Chromatography A 864, 31. 56. J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson og G. Belfrage, Nature (London) 258, 598-599
(1975)
57. J. Porath og B. Olin, Biochemistry 22,1621-1630 (1983)
58. Puren et al, Proe Nati Acad Sei USA. 1999 Mar 2;96(5):2256-61.
59. Schutte, H., Hummel, W., & Kula, M. R. (1984) Applied Microbiology and
Biotechnology 19, 167.
60. Schutte, H., Hummel, W., Tsai, H., & Kula, M.R. (1985) Applied Microbiology and Biotechnology 22, 306. 61. Sieron, R., Wondraczeck, R., Binder, K, Dittmar, H., Lambrecht, K., og Thessa, H. (DD 288837). 1994. (tilhørende Zentralinstitut fur Mikrobiologie und
experimentelle Therapie).
62. Suzuki, M., Kamihira, M., Shiraishi, T., Takeuchi, H., & Kobayashi, T. (1995)
Journal of Fermentation andBioengineering 80, 1%.
63. Tjerneld, F. & Johansson, G. (1987) Biotechnol. Bioeng. 30, 809-816.
64. Tjerneld, F., Persson, J., og Johansson, H. O. Separation method utilizing liquid-liquid partition. (US 6454950). 2002. (tilhørende Amersham Pharmacia Biotech
AB, Uppsala, SE).
65. Urushihara, J Pediatr Surg. 2000 Mar;35(3):446-9.
66. van Wijnendaele, F., Gilles, D., og Simonet, G. (EU 0199698 Bl). 1991. (tilhørende Smithkline Biologicals S.A.).
67. Vigers et al., Nature. 1997 Mar 13; 386(6621): 190-4.
68. Walter, H., Brooks, D. E., & Fisher, D. (1985) i Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems: Theory, Methods, Uses, and Applications to Biotechnology,
Academic Press, Orlando, Fla.
69. Zaslavsky, B. Y. (1995b) i Aqueous Two- Phase Partitioning (Zaslavsky, B.Y.,
Ed.) s. 503-667, Marcel Dekker, Inc, New York, Basel, Honk Hong.
70. Zaslavsky, B.Y. (1995a) i Aqueous Two- Phase Partitioning (Zaslavsky, B.Y., Ed.) s. 75-152, Marcel Dekker, Inc, New York, Basel, Honk Hong.

Claims (25)

1. Fremgangsmåte for å rense IL- 18BP fra en væske,karakterisertved at den omfatter minst ett trinn som benytter vandig tofasefordeling, hvori vandig tofasesystemet omfatter en polyetylenglykol (PEG)-fase og en saltfase som omfatter (NH4)S04eller Na2S04.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat PEG har en molekylvekt i området mellom 2000 og 12000.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat PEG har en molekylvekt på 10000.
4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat utgangskonsentrasjonen av Na2S04er lavere enn 20 % (vekt/vekt) eller 14 % (vekt/vekt) eller 12 % (vekt/vekt) eller 10 % (vekt/vekt) eller 8 % (vekt/vekt) eller 6 % (vekt/vekt) eller 4 % (vekt/vekt) eller 2 % (vekt/vekt).
5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat PEG anvendes i en konsentrasjon som er lavere enn omkring 35 % (vekt/vekt) eller 30 % (vekt/vekt) eller 25 % (vekt/vekt) eller 20 % (vekt/vekt) eller 15 % (vekt/vekt) eller 12 % (vekt/vekt) eller 10 % (vekt/vekt) eller 5 % (vekt/vekt).
6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat konsentrasjonen av de to fasene beregnes ut fra følgende formel: y = -2,5108x + 35,159; hvori y = PEG i % (vekt/vekt) og x = (Na2)S04i % (vekt/vekt).
7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-5,karakterisertved at konsentrasjonen av de to fasene beregnes ut fra følgende formel: y = -2,5573x +35,757; hvori y = PEG i % (vekt/vekt) og x = (Na2)S04i % (vekt/vekt).
8. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-5,karakterisertved at konsentrasjonen av de to fasene beregnes ut fra følgende formel: y = -2,1182x +35,355; hvori y = PEG i % (vekt/vekt) og x = (Na2)S04i % (vekt/vekt).
9. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den utføres ved en pH i området mellom pH 4 og 9.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat den utføres ved pH på 5.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat den utføres ved pH 7.
12. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den utføres ved romtemperatur.
13. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat trinnet som anvender et vandig tofasesystem er et innfangingstrinn.
14. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den omfatter ytterligere ett eller flere rensetrinn.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 14,karakterisert vedat de ytterligere rensetrinnene er utvalgt blant metallion affinitetskromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi, ionebytterkromatografi og reversfasekromatografi.
16. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den videre omfatter ett eller flere ultrafiltreringstrinn.
17. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den videre omfatter ett eller flere virusfjerning filtreringstrinn.
18. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat væsken er utvalgt blant materiale høstet fra cellekultur, cellelysat, celleekstrakt, vevsekstrakt, blodplasma, serum, melk, urin, ascites, planteekstrakt, eller en fraksjon oppnådd fra et tidligere proteinrensetrinn.
19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat materialet høstet fra cellekultur er uklarnet råmateriale høstet fra cellekultur.
20. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat materialet høstet fra cellekultur er klarnet råmateriale høstet fra cellekultur.
21. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 18 til 20,karakterisert vedat materialet høstet fra cellekultur er avledet fra kinahamsterovarie (CHO)-celler.
22. Fremgangsmåte ifølge krav 21,karakterisert vedatCHO-cellene er dyrket i suspensjon.
23. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat det angjeldende IL-18BP er humant, rekombinant IL-18BP.
24. Anvendelse av et vandig tofasesystem for rensing av IL-18BP, hvori det vandige tofasesystemet omfatter en polyetylenglykol (PEG)-fase og en saltfase som omfatter (NH4)S04eller Na2S04.
25. Anvendelse av et vandig tofasesystem for innfanging av IL-18BP fra en væske, hvori det vandige tofasesystemet omfatter en polyetylenglykol (PEG)-fase og en saltfase som omfatter (NH4)S04eller Na2S04.
NO20070483A 2004-06-29 2007-01-25 Fremgangsmate for rensing av IL-18 BP samt anvendelse av et vandig tofasesystem for rensing eller innfanging av IL-18BP NO331712B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04103047 2004-06-29
US58729604P 2004-07-12 2004-07-12
PCT/EP2005/053010 WO2006003134A1 (en) 2004-06-29 2005-06-27 Process for the purification of il-18 binding protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20070483L NO20070483L (no) 2007-03-14
NO331712B1 true NO331712B1 (no) 2012-03-05

Family

ID=39124614

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20070483A NO331712B1 (no) 2004-06-29 2007-01-25 Fremgangsmate for rensing av IL-18 BP samt anvendelse av et vandig tofasesystem for rensing eller innfanging av IL-18BP

Country Status (11)

Country Link
US (2) US7439336B2 (no)
EP (1) EP1761552B1 (no)
JP (1) JP5043654B2 (no)
AT (1) ATE408616T1 (no)
AU (1) AU2005259269B2 (no)
CA (1) CA2569795C (no)
DE (1) DE602005009827D1 (no)
ES (1) ES2313367T3 (no)
IL (1) IL179997A (no)
NO (1) NO331712B1 (no)
WO (1) WO2006003134A1 (no)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101111103B1 (ko) * 2000-02-10 2012-02-13 아보트 러보러터리즈 사람 인터류킨-18에 결합하는 항체 및 이를 제조하고 사용하는 방법
SI1601776T1 (sl) 2003-03-11 2008-10-31 Serono Lab Ekspresijski vektorji, ki vsebujejo mcmv ie2 promotor
CA2524403C (en) * 2003-05-13 2013-07-09 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Active variants of the il-18 binding protein and medical uses thereof
ES2354160T3 (es) 2003-10-21 2011-03-10 Merck Serono Sa Secuencia de adn mínima que actúa como un aislante de cromatina, y su uso en la expresión de proteínas.
ATE360647T1 (de) 2003-11-05 2007-05-15 Ares Trading Sa Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
ME01218B (me) * 2004-03-01 2013-06-20 Ares Trading Sa Upotreba podloge za ćelijsku strukturu bez sadrzaja seruma za produkciju il-18bp u ćelijama sisara
ATE408616T1 (de) * 2004-06-29 2008-10-15 Ares Trading Sa Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein
US7691611B2 (en) * 2005-06-03 2010-04-06 Ares Trading S.A. Production of recombinant IL-18 binding protein
JP5091127B2 (ja) * 2005-06-10 2012-12-05 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Il−18結合タンパク質の精製のための方法
CN101679481A (zh) * 2007-06-19 2010-03-24 通用电气健康护理生物科学股份公司 使用聚合物多相系统的分离方法
US9176105B2 (en) 2010-08-20 2015-11-03 President And Fellows Of Harvard College Density-based separation of biological analytes using multiphase systems
CN101962635B (zh) * 2010-10-20 2012-02-15 山东农业大学 生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法
CN111363024A (zh) * 2018-12-26 2020-07-03 深圳翰宇药业股份有限公司 多肽的纯化方法

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4508825A (en) * 1983-03-30 1985-04-02 Miles Laboratories, Inc. Method for the separation of extracellular amylase and protease produced during the fermentation of enzyme producing microorganisms
SE8302483L (sv) * 1983-05-02 1984-11-03 Pharmacia Ind Forfarande vid rening av biologiskt aktiva substanser
FR2545501B1 (fr) * 1983-05-06 1985-08-02 Elf Bio Rech Procede de purification de la dextrane-saccharase
US4743550A (en) * 1985-04-29 1988-05-10 Union Carbide Corporation Method for improving the partition coefficient in enzyme-containing systems having at least two phases
US4728613A (en) * 1985-09-04 1988-03-01 Miles Laboratories, Inc. Method for the recovery of extracellular enzymes from whole fermentation beer
US4684723A (en) * 1985-09-11 1987-08-04 Miles Laboratories, Inc. Method of separating proteins from aqueous solutions
ATE126531T1 (de) * 1989-06-13 1995-09-15 Genencor Int Verfahren zur gewinnung von natürlich hergestelltem chymosin.
US5139943A (en) * 1989-06-13 1992-08-18 Genencor International, Inc. Processes for the recovery of microbially produced chymosin
US5093254A (en) * 1990-01-23 1992-03-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Commerce Aqueous two-phase protein extraction
US5328841A (en) * 1990-10-05 1994-07-12 Genencor International, Inc. Methods for isolating EG III cellulase component and EG III cellulase in polyethylene glycol using inorganic salt and polyethylene glycol
SE9003534D0 (sv) 1990-11-06 1990-11-06 Kabigen Ab A method for isolating and purifying peptides and proteins
US5407579A (en) * 1993-07-02 1995-04-18 National Science Council Hemoglobin purification
US5407810A (en) * 1993-08-20 1995-04-18 Genentech, Inc. Aqueous multiple-phase isolation of polypeptide
BR9606987A (pt) 1995-01-27 1997-11-04 Genencor Int Processos para a recuperação de um produto de fermentação desejado a preparação de um pó detergente
US5907035A (en) * 1996-05-23 1999-05-25 Baxter Biotech Technology Sarl Aqueous two-phase metal affinity partitioning protein purification system
SE9603303D0 (sv) * 1996-09-11 1996-09-11 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a protein
ZA986162B (en) * 1997-07-11 1999-01-28 Euresys Sa Image acquisition and processing method and apparatus
IL121860A0 (en) 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
EP1110969A4 (en) * 1998-09-01 2002-01-09 Hayashibara Biochem Lab INTERLEUKIN 18 BINDING PROTEIN
JP4216950B2 (ja) * 1998-09-01 2009-01-28 株式会社林原生物化学研究所 インターロイキン−18結合蛋白質
US6454950B1 (en) * 1998-12-30 2002-09-24 Amersham Pharmacia Biotech Ab Separation method utilizing liquid-liquid partition
US6437101B1 (en) * 1999-05-07 2002-08-20 Akzo Nobel N.V. Methods for protein purification using aqueous two-phase extraction
SI1601776T1 (sl) * 2003-03-11 2008-10-31 Serono Lab Ekspresijski vektorji, ki vsebujejo mcmv ie2 promotor
CA2524403C (en) 2003-05-13 2013-07-09 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Active variants of the il-18 binding protein and medical uses thereof
ES2354160T3 (es) * 2003-10-21 2011-03-10 Merck Serono Sa Secuencia de adn mínima que actúa como un aislante de cromatina, y su uso en la expresión de proteínas.
ATE360647T1 (de) 2003-11-05 2007-05-15 Ares Trading Sa Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein
ME01218B (me) * 2004-03-01 2013-06-20 Ares Trading Sa Upotreba podloge za ćelijsku strukturu bez sadrzaja seruma za produkciju il-18bp u ćelijama sisara
ATE408616T1 (de) * 2004-06-29 2008-10-15 Ares Trading Sa Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein
US7691611B2 (en) 2005-06-03 2010-04-06 Ares Trading S.A. Production of recombinant IL-18 binding protein
JP5091127B2 (ja) 2005-06-10 2012-12-05 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Il−18結合タンパク質の精製のための方法

Also Published As

Publication number Publication date
US7943746B2 (en) 2011-05-17
AU2005259269A1 (en) 2006-01-12
DE602005009827D1 (de) 2008-10-30
EP1761552B1 (en) 2008-09-17
IL179997A (en) 2015-10-29
CA2569795A1 (en) 2006-01-12
WO2006003134A1 (en) 2006-01-12
JP5043654B2 (ja) 2012-10-10
US20090054627A1 (en) 2009-02-26
AU2005259269B2 (en) 2010-12-09
JP2008504346A (ja) 2008-02-14
IL179997A0 (en) 2007-05-15
ES2313367T3 (es) 2009-03-01
US20070293658A1 (en) 2007-12-20
US7439336B2 (en) 2008-10-21
EP1761552A1 (en) 2007-03-14
CA2569795C (en) 2013-08-13
NO20070483L (no) 2007-03-14
ATE408616T1 (de) 2008-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO331712B1 (no) Fremgangsmate for rensing av IL-18 BP samt anvendelse av et vandig tofasesystem for rensing eller innfanging av IL-18BP
JP6913066B2 (ja) 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト
AU2004291341B2 (en) Process for the purification of IL-18 binding protein
JP2003501035A (ja) 安定性に関して改変されたサイトカイン
NO340957B1 (no) Anvendelse av IL-18 bindende protein samt fremgangsmåte for rensing av proteinet
US10988527B2 (en) Method for preparing TNFR-Fc fusion protein containing target content of impurities
JP2010516744A (ja) 油体技術を用いたFc−融合タンパク質の精製
WO2023060165A2 (en) Interleukin-10 muteins and fusion proteins thereof