ES2313367T3 - Procedimiento para la purificacion de proteina de union al il-18. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para purificar IL-18BP de un fluido, que comprende al menos una etapa usando reparto 4 de dos fases acuosas, en el que el sistema de dos fases acuosas comprende una fase de polietilenglicol (PEG) y una fase de sal que comprende (NH4)SO4 o (Na2)SO4.
Description
Procedimiento para la purificación de proteína
de unión a IL-18.
La presente invención está en el campo de la
purificación de proteínas. Más específicamente, se refiere a una
etapa para la purificación de proteína de unión a
IL-18 (IL-18BP) de un fluido usando
reparto de dos fases acuosas.
Las proteínas se han hecho importantes
comercialmente como fármacos que se denominan también generalmente
"biológicos". Uno de los mayores retos es el desarrollo de
procedimientos de coste eficaz, y eficientes, para purificar
proteínas a escala comercial. Aunque se dispone ahora de muchos
métodos para preparación a gran escala de proteínas, productos
crudos, tales como fluidos corporales o cosechas de células,
contienen no sólo el producto deseado sino también impurezas, que
son difíciles de separar del producto deseado. Además, las fuentes
biológicas de proteínas contienen usualmente mezclas complejas de
materiales.
Las fuentes biológicas tales como medio
acondicionado de cultivo de células, de células que expresan un
producto proteínico deseado pueden contener menos impurezas, en
particular si se hacen crecer las células en medio exento de suero.
Sin embargo, las autoridades sanitarias piden altos estándares de
pureza para proteínas destinadas a administración humana. Además,
muchos métodos de purificación pueden contener etapas que requieran
aplicación de pH bajo o alto, altas concentraciones de sal u otras
condiciones extremas que puedan comprometer a la actividad
biológica de una proteína dada. Así, para cualquier proteína, es un
reto establecer un procedimiento de purificación eficaz que permita
suficiente pureza conservando al tiempo la actividad biológica de la
proteína.
La purificación de proteínas comprende
generalmente al menos tres fases o etapas, a saber, una etapa de
captura, en la que la proteína deseada se separa de otros
componentes presentes en el fluido tal como ADN o ARN, produciendo
también idealmente una purificación preliminar, una etapa
intermedia, en la que se aíslan proteínas de contaminantes de
tamaño y/o propiedades físicas/químicas similares, y finalmente una
etapa de afinado que produce el alto nivel de pureza que se
requiere, por ejemplo, en proteínas destinadas a administración
terapéutica en seres humanos o animales.
Típicamente, las etapas de purificación de
proteínas se basan en separación cromatográfica de los compuestos
presentes en un fluido dado. Son métodos cromatográficos aplicados
ampliamente, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba,
cromatografía de afinidad o cromatografía de fase inversa.
Los sistemas de dos fases acuosas (A2PS) son una
alternativa a los procedimientos cromatográficos clásicos. Se han
usado en la técnica anterior procedimientos de A2PS para la
purificación de proteínas (véase Tabla 1).
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La purificación de
interferón-beta (IFN-\beta) de un
medio de producción que contenía un suero parcialmente purificado
produjo una muestra de IFN-\beta purificada 350
veces y concentrada hasta 10 veces con una actividad específica de
3-7,10E10^{6} UI/mg (Menge et al., 1987).
Sin embargo, la aplicación de A2PS para la purificación de
proteínas terapéuticas a escala industrial está limitada
todavía.
El A2PS se basa en el reparto de la molécula
objetivo entre dos fases acuosas inmiscibles (por ejemplo, un
sistema de PEG/sal). Este sistema está adaptado para extracción de
proteínas porque el alto contenido de agua de ambas fases
(70-80% p/p) significa alta biocompatibilidad y baja
tensión interfacial que minimiza la degradación de la proteína. Es
un ejemplo del principio de purificación de proteínas por A2PS la
purificación del factor de crecimiento tipo insulina
IGF-1 en el documento US 5.695.958.
La elección de un sistema de fases adecuado
(polímero/polímero; polímero/sal...) es la etapa clave en un
procedimiento de purificación basado en A2PS. Este sistema debe
mostrar una alta distribución selectiva de la proteína objetivo
entre las fases. En la Tabla 2 se ilustran ejemplos de parejas
usadas para purificación por A2PS de proteínas de diversas fuentes
biológicas.
La composición de sistemas de dos fases de
polímeros acuosas se representa habitualmente en forma rectangular
de un diagrama de fases, como se ilustra en la Fig. 5, tomado de
Hatti-Kaul, 2000. El eje vertical se usa comúnmente
para el componente, que está enriquecido en la fase superior. Se
mezclan cantidades de polímero/sal X, polímero/sal Y y S de agua.
La composición total de una mezcla está representada por uno de los
puntos A1, A2 o A3 del diagrama de fases. Las mezclas se separan en
dos fases. Las composiciones de estas dos fases están representadas
por los puntos T y B, que se denominan nodos y están situados en la
línea binodal. La curva binodal es la línea que separa dos dominios
de composiciones: uno en el que el sistema es monofásico (izquierda
y parte inferior de la curva) y uno en el que puede observarse la
separación de fases (parte superior y derecha de la curva). La
línea que une los puntos B y T que representan las composiciones de
las fases coexistentes se denomina una línea de conexión. Los
puntos A1, A2 o A3, que representan la mezcla total, deben estar
situados en la misma línea de conexión que el nodo B y T que
caracterizan las composiciones de las fases coexistentes originadas
de estas mezclas.
Como se muestra en la Fig. 5, mezclas de
diferentes composiciones totales representadas por diferentes puntos
en la misma línea de conexión dan lugar a sistemas de dos fases con
composiciones idénticas pero diferentes volúmenes de las fases
coexistentes. La relación en volumen de las dos fases puede
aproximarse gráficamente por la relación del segmento AB (fase
superior) y AT (fase inferior).
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Sin embargo, el mecanismo que gobierna el
reparto de materiales biológicos no se comprende bien todavía.
Depende de muchos factores listados en la siguiente Tabla 3. Los
más usados comúnmente en la práctica actual son la concentración y
el peso molecular de polímeros formadores de fase, el tipo y
cantidad de la sal y el tipo y concentración de aditivos
(usualmente sales inorgánicas). Estos factores se consideran
generalmente como los más importantes para manipular el reparto de
proteína a fin de conseguir una separación mejor. Por tanto, es
extremadamente difícil encontrar el sistema A2PS apropiado para una
proteína dada a purificar de una fuente dada, también porque la
proteína destinada a uso terapéutico debe permanecer totalmente
funcional en términos de estructura (por ejemplo, sin agregación,
truncamientos) y en términos de función.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La proteína de unión a
interleuquina-18 (IL-18BP) es una
proteína soluble de origen natural que se purificó inicialmente por
afinidad, en una columna de IL-18, a partir de orina
(Novick et al., 1999). La IL-18BP anula la
inducción por IL-18 de IFN-\gamma
y la activación por IL-18 de
NF-\kappaB in vitro. Además,
IL-18BP inhibe la inducción de
IFN-\gamma en ratones inyectados con LPS.
El gen de IL-18BP se localizó en
el cromosoma humano 11, y no podía encontrarse un exón que
codificara un dominio transmembrana en la secuencia genómica de 8,3
kb que comprende el gen de IL-18BP. Se han
identificado hasta ahora en seres humanos cuatro isoformas de
IL-18BP generadas por empalme de mARN alternativo.
Se denominaron IL-18BP a, b, c y d, que comparten
todas el mismo término N y difieren en el término C (Novick et
al., 1999). Estas isoformas varían en su capacidad para unirse
a IL-18 (Kim et al., 2000). De las cuatro
isoformas de IL-18BP humana
(hIL-18BP), se sabe que las isoformas a y c tienen
capacidad neutralizante de IL-18. La isoforma de
IL-18BP más abundante, la isoforma a, presenta una
alta afinidad por IL-18, con una velocidad de
entrada rápida y una velocidad de salida lenta, y una constante de
disociación (kd) de aproximadamente 0,4 nM (Kim et al.,
2000). La IL-18BP se expresa constitutivamente en el
bazo, y pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas. Los
residuos implicados en la interacción de IL-18 con
IL-18BP se han descrito mediante el uso de
modelación por ordenador (Kim et al., 2000) y se basan en la
interacción entre la proteína similar IL-1\beta
con la IL-1R tipo I (Vigers et al.,
1997).
La IL-18BP está presente
constitutivamente en muchas células (Puren et al., 1999) y
circula en seres humanos sanos (Urushihara et al., 2000),
representando un fenómeno único en la biología de citoquinas. Debido
a la alta afinidad de IL-18BP por
IL-18 (kd = 0,4 nM) así como la alta concentración
de IL-18BP encontrada en la circulación (un exceso
molar de 20 veces sobre IL-18), se ha especulado con
que muchas, si no todas, las moléculas de Il-18 en
la circulación están unidas a IL-18BP. Así, la
IL-18BP en circulación que compite con receptores
de la superficie celular de IL-18 puede actuar como
una molécula anti-inflamatoria e inmunosupresora
natural.
Se ha sugerido IL-18BP como una
proteína terapéutica en un cierto número de enfermedades y
trastornos, tales como psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis
reumatoide, artritis psoriática, lesión del hígado, sepsis,
aterosclerosis, enfermedades cardíacas isquémicas, alergias, etc.,
véanse, por ejemplo, los documentos WO9909063, WO0107480,
WO0162285, WO0185201, WO02060479, WO02096456, WO03080104,
WO02092008, WO02101049 y
WO03013577.
WO03013577.
La técnica anterior no describe un procedimiento
de purificación de IL-18BP.
La presente invención se basa en el desarrollo
de una etapa de purificación eficaz para proteína de unión a
IL-18 (IL-18BP) que se basa en un
reparto en dos fases acuosas, en la que el sistema de dos fases
acuosas comprende una fase de polietilenglicol (PEG) y una fase de
sal que comprende (NH_{4})SO_{4} o Na_{2}SO_{4}.
Por tanto, en un primer aspecto, la invención se
refiere a un procedimiento para la purificación de proteína de
unión a IL-18 (IL-18BP) a partir de
un fluido, que comprende al menos una etapa que comprende este
sistema de dos fases acuosas.
Un segundo aspecto de la invención se refiere al
uso de este sistema de dos fases acuosas para la purificación de
IL-18BP de un fluido.
La Fig. 1 muestra los resultados de los perfiles
de Electroforesis de Zona Capilar (CZE) de indicaciones
identificadas del modelo estadístico.
La Fig. 2 muestra la línea de conexión para
condiciones Val2-1.
La Fig. 3 muestra la línea de conexión para
condiciones Val2-2.
La Fig. 4 muestra la línea de conexión para
condiciones Val2-5.
La Fig. 5 ilustra el principio de
establecimiento de una línea de conexión en un sistema de dos fases
acuosas (tomado de Hatti-Kaul, 2000).
La presente invención se basa en el desarrollo
de una etapa para el procedimiento de purificación de
IL-18BP.
La invención se refiere a un procedimiento para
purificar IL-18BP de un fluido que comprende al
menos una etapa que usa reparto de dos fases acuosas, en la que el
sistema de dos fases acuosas comprende una fase de polietilenglicol
(PEG) y una fase de sal que comprende (NH_{4})SO_{4} o
Na_{2}SO_{4}. Tal sistema de dos fases acuosas puede usarse
como una etapa simple de purificación de IL-18BP.
Puede usarse también como una etapa entre otras etapas basadas en
otros métodos de purificación. Puede usarse además en etapas
múltiples del procedimiento de purificación, es decir, dos, tres o
más etapas se basan en un reparto de dos fases acuosas. Si el
procedimiento de purificación comprende más de una etapa basada en
un sistema de dos fases acuosas, el sistema de dos fases acuosas
individual usado puede ser el mismo sistema, o basarse en sistemas
diferentes, por ejemplo, diferentes polímeros, sales o
similares.
Según la presente invención, el sistema de dos
fases acuosas comprende una fase de polietilenglicol (PEG) y una
fase de sal.
El PEG a usar según el procedimiento de
purificación de la invención puede tener cualquier peso molecular
adecuado. En una realización preferida, el PEG tiene un peso
molecular que varía entre alrededor de 2.000 y aproximadamente
12.000, puede ser aproximadamente 3.000, o aproximadamente 4.000, o
aproximadamente 5.000, o aproximadamente 6.000, o aproximadamente
7.000, o aproximadamente 8.000, o aproximadamente 9.000, o
aproximadamente 10.000, o aproximadamente 11.000. Se prefiere más
que el PEG tenga un peso molecular de aproximadamente 10.000.
La fase de sal comprende
(NH_{4})SO_{4}. Alternativamente, la fase de sal
comprende (Na_{2})SO_{4}.
Las concentraciones del polímero en la fase de
polímero pueden variar. En una realización preferida, la
concentración inicial del polímero, preferiblemente PEG, es menos
de aproximadamente 35% [p/p], menos de aproximadamente 30% [p/p],
29% [p/p], 28% [p/p], 27% [p/p], 26% [p/p], 25% [p/p], 24% [p/p],
23% [p/p], 22% [p/p], 21% [p/p], 20% [p/p], 19% [p/p], 18% [p/p],
17% [p/p], 16% [p/p], 15% [p/p], 14% [p/p], 13% [p/p], 12% [p/p],
11% [p/p], 10% [p/p], 9% [p/p], 8% [p/p], 7% [p/p], 6% [p/p], 5%
[p/p], 4% [p/p], 3% [p/p], 2% [p/p] o 1% [p/p].
La concentración de la sal en la fase de sal
también puede variar, en particular dependiendo de la concentración
usada para la fase de polímero. En una realización preferida, se usa
Na_{2}SO_{4} en una concentración inferior a aproximadamente el
30% [p/p], 25% [p/p], 20% [p/p], 16% [p/p], 15% [p/p], 14% [p/p],
13% [p/p], 12% [p/p], 11% [p/p], 10% [p/p], 9% [p/p], 8% [p/p], 7%
[p/p], 6% [p/p], 5% [p/p], 4% [p/p], 3% [p/p], 2% [p/p] o 1%
[p/p].
En una realización de la invención altamente
preferida, las concentraciones de las dos fases se calculan según la
siguiente fórmula:
y = -2,5108 x +
35,159
en la que Y = PEG en % [p/p] y x =
(Na_{2})SO_{4} en %
[p/p].
En una realización altamente preferida
adicional, las concentraciones de las dos fases se calculan según la
siguiente fórmula:
y = -2,5573 x +
35,757
en la que Y = PEG en % [p/p] y x =
(Na_{2})SO_{4} en %
[p/p].
En una realización altamente preferida adicional
todavía, las concentraciones de las dos fases se calculan según la
siguiente fórmula:
y = -2,1182 x +
35,355
en la que Y = PEG en % [p/p] y x =
(Na_{2})SO_{4} en %
[p/p].
Según la presente invención, el procedimiento se
realiza en un intervalo de pH entre pH 4 y 9, puede realizarse a
aproximadamente pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 o pH 9.
Preferiblemente, se realiza a aproximadamente pH 5 o a
aproximadamente pH 7.
El procedimiento según la invención puede
realizarse a cualquier temperatura adecuada, por ejemplo, a 4ºC,
6,5ºC, 13ºC, 19,5ºC, 30ºC, pero preferiblemente el procedimiento se
realiza a temperatura ambiente.
En una realización preferida, la etapa que usa
un sistema de dos fases acuosas de la invención es una etapa de
captura, es decir, una etapa inicial de un procedimiento de
purificación que comprende una o más etapas adicionales.
La etapa de purificación de la invención puede
separar > 10%, > 20%, > 30%, > 40%, > 50% o >
60%, o incluso > 70% de los contaminentes totales presentes en el
material crudo. El rendimiento obtenible con la etapa de
purificación de la invención puede ser > 50%, > 60%, > 70%
o > 80%, o incluso > 90%.
En una realización preferida adicional, el
procedimiento de la invención comprende además una o más etapas de
purificación adicionales.
Preferiblemente, las etapas de purificación
adicionales se seleccionan entre cromatografía de afinidad de ion
de metal, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
interacción hidrófoba y cromatografía de fase inversa.
La cromatografía de inducción de carga hidrófoba
se realiza preferiblemente en una resina que tenga como ligando
inmovilizado 4-mercaptoetilpiridina (MEP).
MEP-Hypercel® es una resina que es particularmente
adecuada en el marco de la presente invención.
La etapa de cromatografía de intercambio iónico
se realiza preferiblemente usando una resina de carboximetilo
(CM).
La etapa de cromatografía de afinidad es
preferiblemente cromatografía de afinidad de ion de metal
inmovilizado, y sefarosa de quelación es un ejemplo de una resina
que puede usarse para realizar esta etapa cromatográfica.
La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC)
puede realizarse en cualquier resina de HIC conocida, tal como una
resina que tenga como lingando inmovilizado residuos de alquilo o
arilo. Son ejemplos de tales resinas de HIC buti-, octil- o
fenil-sefarosa (agarosa).
Un material preferido útil para la etapa de fase
inversa es 30RPC de fuente de fase inversa.
En una realización altamente preferida, la etapa
de purificación de la invención es seguida por las etapas de:
- a)
- Someter el fluido a cromatografía de afinidad de ion de metal inmovilizado;
- b)
- Someter el eluato de la cromatografía de afinidad de ion de metal a cromatografía de interacción de carga hidrófoba;
- c)
- Someter el eluato de la cromatografía de interacción de carga hidrófoba a cromatografía de intercambio iónico;
- d)
- Someter el flujo a través de la cromatografía de intercambio iónico a cromatografía de interacción hidrófoba;
- e)
- Someter el eluato de la cromatografía de interacción hidrófoba a cromatografía de fase inversa.
El fluido se somete preferiblemente a
ultrafiltración o dafiltración antes de la etapa (a).
Aunque se prefiere el orden de las etapas
anteriores (a) a (e), las etapas del procedimiento de la invención
pueden realizarse en cualquier orden que conduzca a un producto
proteínico purificado.
La etapa (a) se realiza preferiblemente en una
columna de sefarosa de quelación, tal como una columna de flujo
rápido de sefarosa de quelación, que tenga iones Zn^{2+} quelados.
Preferiblemente, la unión de IL-18BP se realiza a
pH 8,5 \pm 0,1, preferiblemente en fosfato sódico 50 mM y NaCl 0,5
M que tengan este pH. La elución se realiza preferiblemente a pH
9,0 \pm 0,1, por ejemplo, en acetato amónico 0,075 M que tanga
este pH.
La etapa (b) se realiza preferiblemente en una
columna de MEP (derivado de 4-mercaptoetilpiridina),
tal como MEP HyperCel® (LifeSciences). La unión de
IL-18BP se realiza preferiblemente a pH 6,1 \pm
0,1, por ejemplo, en PBS 1X + 1 NaCl que tenga este pH. La elución
se realiza preferiblemente ba pH 8,4 \pm 0,1, por ejemplo, con
tampón fosfato 20 mM más propilenglicol del 35%, teniendo la mezcla
pH 8,4 \pm 0,1.
La etapa (c) se realiza preferiblemente en una
columna de carboximetilsefarosa (CM). Ésta es una etapa en la que
se recoge el flujo a través para purificación adicional. Esta etapa
se basa en el hecho de que, en circunstancias específicas
relativas, por ejemplo, a condicionres de sal y pH, la
IL-18BP no se une a la resina, mientras las
impurezas se unen. Preferiblemente, la etapa (c) se realiza a pH 6,0
\pm 0,2, por ejemplo en presencia de MES (ácido
N-morfolinoetanosulfónico) 1 mM.
La etapa (d) se realiza preferiblemente en una
columna de fenilsefarosa, tal como una columna
Phenyl-Sepharose Fast Flow. Preferiblemente, la
unión de IL-18BP se realiza a aproximadamente pH 9,1
\pm 0,2, por ejemplo, en borato sódico 50 mM y sulfato amónico
0,9 M que tenga este pH. La elución de la columna de fenilsefarosa
se realiza preferiblemente a pH 9,1 \pm 0,2 en presencia de una
concentración de sal elevada, tal como en borato sódico 50 mM 9,1
\pm 0,2, sulfato amónico 0,15 M que tenga este pH.
La etapa (e) se realiza preferiblemente en una
columna Source 30 RPC. La unión de IL-18BP al
material de la columna se realiza preferiblemente a pH 9,1 \pm
0,2, por ejemplo, en tampón de borato sódico 50 mM. La elución se
realiza preferiblemente usando un gradiente, eluyendo
IL-18BP alrededor del 28-32% de
ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% en acetonitrilo.
Se entiende que las condiciones descritas antes
en relación con las etapas (a) a (e) de la purificación pueden
aplicarse también cuando se realizan etapas simples de la invención,
o (sub)combinaciones de etapas.
En una realización preferida adicional del
presente procedimiento de purificación, se efectúan una o más etapas
de ultrafiltración. La ultrafiltración es útil, por ejemplo, para
la concentración de la proteína objetivo, para intercambio de
tampón, o para la separación de componentes de pequeño peso
molecular en los eluatos resultantes de etapas cromatográficas
previas. Esta ultrafiltración permite separar disolvente orgánico,
TFA y sales de la etapa previa, para equilibrar la
IL-18BP en el tampón en volumen y concentrar la
molécula a la concentración deseada. Tal ultrafiltración puede
efectuarse, por ejemplo, en medios de ultrafiltración que excluyan
componentes que tengan pesos moleculares por debajo de 5 kDa.
Preferiblemente, la ultrafiltración se realiza
entre las etapas (b) y (c), y/o después de la etapa (e). Más
preferiblemente, se realizan dos etapas de ultrafiltración, una
entre las etapas (b) y (c) y otra después de la etapa (e).
Con el fin de facilitar el almacenamiento o
transporte, por ejemplo, el material puede congelarse y
descongelarse antes y/o después de cualquier etapa de purificación
de la invención.
Si la proteína purificada según el procedimiento
de la invención se pretende para administración a seres humanos, es
ventajoso incluir además etapas de separación de virus.
Preferiblemente, se realiza una etapa de filtración para separación
de virus entre las etapas (d) y (e). Se prefiere además realizar una
etapa de filtración para separación de virus después de la etapa
(e). Más preferiblemente, el procedimiento comprende dos etapas de
separación de virus, una de las cuales se realiza entre las etapas
(d) y (e), y otra de las cuales se realiza después de la etapa
(e).
El fluido del que se purifica
IL-18BP según la presente invención se selecciona
preferiblemente entre cosecha de cultivo de células, lisado de
células, extracto de células, extracto de tejidos, plasma sanguíneo,
suero, leche, orina, ascites, extracto de plantas o una fracción
derivada de una etapa de purificación de proteína anterior.
El fluido puede ser cosecha de cultivo de
células crudo no clarificado o cosecha de cultivo de células crudo
clarificado, y se deriva preferiblemente de células de Ovario de
Hámster Chino (CHO). Cosecha de cultivo de células crudo
clarificado se refiere a un medio acondicionado de cultivo de
células del que se han separado células y residuos, por ejemplo,
por técnicas de centrifugación o filtración. Si se usa cosecha de
cultivo de células crudo no clarificado como material de partida
para el procedimiento de la invención, están presentes células y
residuos. Como se muestra en el ejemplo siguiente, la etapa de
purificación de la invención es capaz de capturar
IL-18BP incluso a partir de cosecha de cultivo de
células crudo no clarificado que no se ha pretratado.
Las células CHO que producen
IL-18BP pueden desarrollarse en suspensión, o
incorporarse a una superficie de un portador tal como, por ejemplo,
un microportador. Preferiblemente, las células se desarrollan en
suspensión.
Según la presente invención, la
IL-18BP a purificar puede ser nativa, es decir,
IL-18BP de origen natural. Puede purificarse así de
cualquier fuente o material natural, tal como, por ejemplo, de
fluidos corporales tales como
orina.
orina.
La IL18-BP puede derivarse
también de cualquier fuente animal o humana. Preferiblemente, la
IL-18BP a purificar es humana, y más
preferiblemente es IL-18BP recombinante. La
IL-18BP recombinante puede producirse en sistemas
de expresión procariotas, tal como en sistemas bacterianos como
Escherichia coli. Puede producirse también en sistemas de
expresión eucariotas, tales como células de levadura, insectos o
mamíferos. Según la presente invención, se prefiere expresar
IL-18BP en células de mamíferos tales como linajes
celulares de animales, o en linajes celulares humanos. Las células
de ovario de hámster chino (CHO) son un ejemplo de un linaje celular
que es particularmente adecuado para expresar
IL-18BP.
Puesto que la IL-18BP es una
proteína segregada soluble, se libera en el sobrenadante del cultivo
de células, bien mediante su péptido señal natural o bien mediante
un péptido señal heterólogo, es decir, un péptido señal derivado de
otra proteína segregada, que puede ser más eficaz en el sistema de
expresión particular usado. El fluido del que se purifica
IL-18BP es así preferiblemente sobrenadante de
cultivo de células, tal como, por ejemplo, sobrenadante de células
CHO. Es más preferido purificar la proteína del sobrenadante de
células que se desarrollaron en medio exento de suero, es decir, en
medio de cultivo que no contiene suero derivado de becerro fetal u
otras fuentes
animales.
animales.
La expresión "proteína de unión a
IL-18" se usa aquí de manera sinónima a
"IL-18BP". Esta expresión se refiere a
proteínas de unión a IL-18 tales como las definidas
en el documento WO 99/09063 o en Novick et al., 1999. El
término IL18-BP incluye variantes de empalme e/o
isoformas de proteínas de unión a IL-18, como las
definidas en Kim et al., 2000, en particular isoformas
humanas a y c de IL-18BP. El término
"IL-18BP", según se usa aquí, incluye además
muteínas, derivados funcionales, fracciones activas, proteínas
fusionadas, proteínas permutadas circularmente y costillas de
IL-18BP como se definen en el documento WO
99/09063.
La IL-18BP sujeta al
procedimiento de purificación según la presente invención puede ser
glicosilada o no glicosilada, puede derivarse de fuentes naturales,
tales como orina, o puede producirse de manera prefible
recombinantemente. La expresión recombinante puede realizarse en
sistemas de expresión procariotas como E. coli, o en
sistemas de expresión eucariotas, y preferiblemente en
mamíferos.
Según se usa aquí, el término "muteínas" se
refiere a análogos de una IL-18BP, o análogos de una
IL-18BP vírica, en la que uno o más de los residuos
de aminoácidos de una IL-18BP natural o
IL-18BP vírica están sustituidos con diferentes
residuos de aminoácidos, o están suprimidos, o se añaden uno o más
residuos de aminoácidos a la secuencia natural de una
IL-18BP, o una IL-18BP vírica, sin
cambiar considerablemente la actividad de los productos resultantes
en comparación con la IL-18BP de tipo natural o la
IL-18BP vírica. Estas muteínas se preparan por
síntesis conocidas y/o por técnicas de mutagénesis dirigida al
lugar, o cualquier otra técnica conocida adecuada para ello.
Las muteínas según la presente invención
incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como ADN
o ARN, que se hibrida con ADN o ARN, que codifica una
IL-18BP o codifica una IL-18BP
vírica (documento WO9909063) en condiciones rigurosas. La expresión
"condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones de
hibridación y lavado subsiguiente, a las que los de experiencia
ordinaria en la técnica se refieren convencionalmente como
"rigurosas". Véase Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y.,
\NAK\NAK6.3 y 6.4 (1987, 1992). Sin limitación, los ejemplos de
condiciones rigurosas incluyen condiciones de lavado
12-20ºC por debajo de la Tm calculada del híbrido en
estudio en, por ejemplo, 2 x SSC y 0,5% de SDS durante 5 minutos, 2
x SSC y 0,1% de SDS durante 15 minutos; 0,1 x SSC y 0,5% de SDS a
37ºC durante 30-60 minutos y después, un 0,1 x SSC
y 0,5% de SDS a 68ºC durante 30-60 minutos. Los de
experiencia ordinaria en esta técnica entienden que las condiciones
de rigor también dependen de la longitud de las secuencias de ADN,
sondas de oligonucleótidos (tales como 10-40 bases)
o sondas de oligonucleótidos mezcladas. Si se usan sondas
mezcladas, es preferible usar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en
lugar de SSC. Véase Ausubel, supra.
Identidad refleja una relación entre dos o más
secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de
polinucleótidos, determinada comparando las secuencias. En general,
la identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido
a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de las dos secuencias de
polinucleótidos o dos secuencias de polipéptidos, respectivamente,
sobre la longitud de las secuencias que se comparan.
Para secuencias en las que no hay una
correspondencia exacta, puede determinarse un "% de identidad".
En general, las dos secuencias a comparar se alinean para dar una
correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir
insertar "huecos" en una o ambas secuencias, para aumentar el
grado de alineamiento. Puede determinarse un % de identidad sobre
la longitud completa de cada una de las secuencias comparadas
(denominado alineamiento global), que es particularmente adecuado
para secuencias de la misma o muy similar longitud, o sobre
longitudes definidas, más cortas, (denominado alineamiento local),
que es más adecuado para secuencias de longitud
desigual.
desigual.
Los métodos para compara la identidad y
homología de dos o más secuencias son muy conocidos en la técnica.
Así, por ejemplo, pueden usarse programas disponibles en el
Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 9.1 (Devereux J et
al., 1984), por ejemplo los programas BESTFIT y GAP, para
determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de
identidad y el % de homología entre dos secuencias de polipéptidos.
El BESTFIT usa el algoritmo de "homología local" de Smith y
Waterman (1981) y encuentra la mejor región simple de similitud
entre dos secuencias. Otros programas para determinar la identidad
y/o similitud entre secuencias también son conocidos en la técnica,
por ejemplo la familia BLAST de programas (Altschul SF et
al., 1990, Altschul S F et al., 1997, accesible a través
de la página propia del NCBI en www.ncbi.nim.nih.gov) y FASTA
(Pearson WR, 1990).
Cualquiera de tales muteínas tiene
preferiblemente una secuencia de aminoácidos lo suficientemente
duplicativa de la de una IL-18BP, o lo
suficientemente duplicativa de una IL-18BP vírica,
para que tenga actividad sustancialmente similar a
IL-18BP. Una actividad de IL-18BP es
su capacidad de unirse a IL-18. Siempre que la
muteína tenga actividad de unión sustancial a
IL-18, puede usarse en la purificación de
IL-18, tal como mediante cromatografía de afinidad,
y puede considerarse así que tiene actividad sustancialmente similar
a IL-18BP. Así, puede determinarse si cualquier
muteína dada tiene sustancialmente la misma actividad que
IL-18BP mediante experimentación rutinaria que
comprende someter tal muteína, por ejemplo, a un ensayo de
competición sandwich simple para determinar si se une o no a una
IL-18 marcada apropiadamente, tal como
radioinmunoensayo o ensayo ELISA.
En una realización preferida, cualquiera de
tales muteínas tiene al menos un 40% de identidad u homología con
la secuencia de una IL-18BP o un homólogo de
IL-18BP codificado víricamente, como se define en el
documento WO 99/09063. Más preferiblemente, tiene al menos el 50%,
al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o, más
preferiblemente, al menos el 90% de identidad u homología con
él.
Las muteínas de polipéptidos de
IL-18BP o muteínas de IL-BPs
víricas, que pueden usarse según la presente invención, o el ácido
nucleico que las codifica, incluyen un conjunto finito de secuencias
sustancialmente correspondientes como péptidos de sustitución o
polinucleótidos que pueden obtenerse rutinariamente por alguien de
experiencia ordinaria en la técnica, sin experimentación indebida,
en base a las enseñanzas y guías presentadas aquí.
Los cambios preferidos para muteínas según la
presente invención son los que se conocen como sustituciones
"conservadoras". Las sustituciones de aminoácidos conservadoras
de polipéptidos de, o proteínas IL-18BP o
IL-18BPs víricas pueden incluir aminoácidos
sinónimos dentro de un grupo que tengan propiedades fisicoquímicas
lo suficientemente similares para que la sustitución entre miembros
del grupo conserve la función biológica de la molécula (Grantham,
1974). Es claro que pueden hacerse también inserciones y supresiones
de aminoácidos en las secuencias definidas antes sin alterar su
función, particularmente si las inserciones o supresiones sólo
implican unos pocos aminoácidos, por ejemplo, menos de treinta, y
preferiblemente menos de diez, y no separan o desplazan aminoácidos
que son críticos para una conformación funcional, por ejemplo,
residuos de cisteína. Las proteínas y muteínas producidas por tales
supresiones y/o inserciones entran dentro del alcance de la
presente invención.
Preferiblemente, los grupos de aminoácidos
sinónimos son los definidos en la Tabla 4. Más preferiblemente, los
grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla 5; y
aún más preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son
los definidos en la Tabla 6.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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\hskip4cm10
Los ejemplos de producción de sustituciones de
aminoácidos en proteínas que pueden usarse para obtener muteínas de
polipéptidos de, o proteínas IL-18BP, o muteínas de
IL-18BPs víricas, para su uso en la presente
invención, incluyen cualesquiera etapas del método conocidas, tal
como se presentan en las Patentes de los EE.UU. 4.959.314,
4.588.585 y 4.737.462, de Mark et al.; 5.116.943 de Koths
et al., 4.965.195 de Namen et al.; 4.879.111 de Chong
et al.; y 5.017.691 de Lee et al.; y proteínas
sustituidas con lisina presentadas en la Patente de los EE.UU. Nº
4.904.584 (Shaw et al.).
La expresión "proteína fusionada" se
refiere a un polipéptido que comprende una IL-18BP,
o una IL-18BP vírica, o una muteína o fragmento de
ella, fusionada con otra proteína, que, por ejemplo, tiene un tiempo
de permanencia extendido en fluidos corporales. Una
IL-18BP o una IL18-BP vírica puede
fusionarse así con otra proteína, polipéptido o similar, por
ejemplo, una inmunoglobulina o un fragmento de ella.
"Derivados funcionales" según se usa aquí
cubre derivados de IL-18BPs o una
IL-18BP vírica, y sus muteínas y proteínas
fusionadas, que pueden prepararse a partir de los grupos funcionales
que tienen lugar como cadenas secundarias en los residuos de los
grupos N- o C-terminales, por medios conocidos en la
técnica, y están incluidos en la invención en tanto permanezcan
aceptables farmacéuticamente, es decir, no destruyan la actividad de
la proteína que es sustancialmente similar a la actividad de
IL-18BP, o IL-18BPs víricas, y no
confieran propiedades tóxicas a las composiciones que los
contienen.
Estos derivados pueden incluir, por ejemplo,
cadenas secundarias de polietilenglicol, que pueden ocultar lugares
antígenos y extender la permanencia de una IL-18BP o
una IL18-BP vírica en fluidos corporales. Otros
derivados incluyen ésteres alifáticos de los grupos carboxilo,
amidas de los grupos carboxilo por reacción con amoníaco o con
aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo
de grupos amino libres de los residuos de aminoácidos formados con
restos acilo (por ejemplo, grupos alcanoilo o aroilo carbocíclico) o
derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres
(por ejemplo, de residuos serilo o treonilo) formados con restos
acilo.
Como "fracciones activas" de una
IL-18BP, o una IL-18BP vírica,
muteínas y proteínas fusionadas, la presente invención cubre
cualquier fragmento o precursores de la cadena de polipéptido de la
molécula de proteína sola o junto con moléculas asociadas o
residuos enlazados a ella, por ejemplo, residuos de azúcar o
fosfato, o agregados de la molécula de proteína o los residuos de
azúcar por sí mismos, siempre que dicha fracción tenga actividad
sustancialmente similar a IL-18BP.
El término "sales" se refiere aquí a sales
de grupos carboxilo y a sales de adición de ácido de grupos amino
de molécula de inhibidor de IL-18, o análogos de
ellos. Pueden formarse sales de un grupo carboxilo por medios
conocidos en la técnica e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo,
sales de sodio, calcio, amonio, férricas o de zinc, y similares, y
sales con bases orgánicas como las formadas, por ejemplo, con
aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina,
procaína y similares. Las sales de adición de ácido incluyen, por
ejemplo, sales con ácidos minerales, tales como, por ejemplo, ácido
clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos, tales
como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Por supuesto,
cualesquiera de tales sales debe conservar la actividad biológica
del inhibidor de IL-18, tal como inducción de
IFN-gamma en células sanguíneas.
Las secuencias de IL18-BP y sus
variantes de empalme/isoformas pueden tomarse del documento
WO99/09063 o de Novick et al., 1999, así como de Kim et
al., 2000.
Pueden conjugarse a polímeros derivados
funcionales de IL-18BP con el fin de mejorar las
propiedades de la proteína, tales como la estabilidad, la vida
media, la biodisponibilidad, la tolerancia por el cuerpo humano o
la inmunogenicidad. Para conseguir este objetivo, la
IL-18BP puede enlazarse a, por ejemplo,
polietilenglicol (PEG). La PEGilación puede realizarse por métodos
conocidos, descritos por ejemplo en el documento WO 92/13095.
Por tanto, en una realización preferida, el
derivado funcional comprende al menos un resto incorporado a uno o
más grupos funcionales, que tienen lugar como una o más cadenas
secundarias en los residuos de aminoácidos. Es altamente preferida
una realización en la que el resto es un resto de polietilenglicol
(PEG).
En una realización preferida adicional de la
invención, la IL18-BP comprende una fusión de
inmunoglobulina, es decir, el inhibidor de IL-18 es
una proteína fusionada que comprende la totalidad o parte de una
proteína de unión a IL-18, que está fusionada a la
totalidad o una porción de una inmunoglobulina. Los métodos para
producir proteínas de fusión de inmunoglobulina son muy conocidos en
la técnica, tal como los descritos en el documento WO 01/03737, por
ejemplo. La persona experta en la técnica entenderá que la proteína
de fusión resultante de la invención conserva la actividad
biológica de IL-18BP, en particular la unión a
IL-18. La fusión puede ser directa, o mediante un
péptido enlazador corto que puede ser tan corto como de 1 a 3
residuos de aminoácidos de longitud o más largo, por ejemplo, de 13
residuos de aminoácidos de longitud. Dicho enlazador puede ser un
tripéptido de la secuencia E-F-M
(Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una
secuencia enlazadora de 13 aminoácidos que comprende
Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met
introducida entre la secuencia de IL18-BP y la
secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante tiene
propiedades mejoradas, tal como un tiempo de permanencia extendido
en fluidos corporales (vida media), actividad específica aumentada,
nivel de expresión aumentado, o se facilita la purificación de la
proteína de fusión.
En una realización preferida, la
IL-18BP se fusiona a la región constante de una
molécula de Ig. Preferiblemente, se fusiona a regiones de cadena
pesada, como los dominios CH2 y CH3 de IgG1 humana, por ejemplo. La
generación de proteínas de fusión específicas que comprenden
IL-18BP y una porción de una inmunoglobulina se
describen en el ejemplo 11 del documento WO 99/09063, por ejemplo.
También son adecuadas otras isoformas de moléculas de Ig para la
generación de proteínas de fusión según la presente invención, tales
como isoformas IgG_{2} o IgG_{4}, u otras clases de Ig, como
IgM o IgA, por ejemplo. Las proteínas de fusión pueden ser monómeras
o multímeras, hetero u homomultímeras.
En un tercer aspecto, la invención describe una
preparación de proteína resultante del procedimiento de purificación
según la invención. Tal preparación de proteína contiene
preferiblemente IL-18BP con una pureza que es >
50%, más preferiblemente > 60% y aún más preferiblemente >
70%. La Il-18BP presente en esta preparación de
proteína tiene preferiblemente un bajo contenido de dímeros y
agregados, preferiblemente sin dímeros y agregados en absoluto. Se
prefiere adicionalmente que la extensión de la truncación de la
IL-18BP presente en la preparación de proteína de
la invención sea < 10%, puede ser < 9%, < 8%, < 7%, <
6% y preferiblemente < 5%, o incluso < 4%, < 3%, < 2%
o < 1%.
La IL-18BP que se ha purificado
según la presente invención tiene preferiblemente además un perfil
de isoformas específico, medido, por ejemplo, por electroforesis de
zona capilar. Se prefiere que la IL-18BP contenga
menos del 5% de isoformas básicas, menos del 25% de isoformas menos
ácidas, más del 45% de isoformas ácidas y más del 15% de isoformas
altamente ácidas. La clasificación de isoformas es como se define en
el Ejemplo siguiente.
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Si se usan etapas de purificación adicionales,
preferiblemente usando las etapas adicionales descritas antes, la
preparación de IL-18BP obtenida puede contener menos
del 20% de impurezas, preferiblemente menos de alrededor del 15%, o
aproximadamente el 14%, o aproximadamente el 13%, o aproximadamente
el 12%, o aproximadamente el 11% de impurezas. Preferiblemente,
contiene menos de aproximadamente el 10%, o aproximadamente el 5%,
3%, 2% o 1% de impurezas, o puede purificarse hasta homogeneidad,
es decir, estando esencialmente libre de contaminantes
proteínicos.
La IL-18BP purificada puede
proponerse para uso terapéutico, es decir, para administración a
pacientes. Si la IL-18BP purificada se administra a
pacientes, se administra preferiblemente sistémicamente, y
preferiblemente subcutánea o intramuscularmente, o tópicamente, es
decir, localmente. También puede ser adecuada la administración
rectal o intratecal, dependiendo del uso específico de la
IL-18BP purificada.
Para este fin, la IL-18BP
purificada puede formularse como una composición farmacéutica, es
decir, junto con un portador, excipientes o similares aceptables
farmacéuticamente.
La definición de "aceptable
farmacéuticamente" quiere decir abarcar cualquier portador que no
interfiera con la eficacia de la actividad biológica del
ingrediente activo y que no sea tóxico para el hospedante al que se
administra. Por ejemplo, para administración parenteral,
la(s) proteína(s) activa(s) puede(n)
formularse en una forma de dosificación unitaria para inyección en
portadores tales como solución salina, solución de dextrosa,
albúmina de suero y solución de Ringer.
Los ingredientes activos de la composición
farmacéutica según la invención pueden administrarse a un individuo
de una variedad de formas. Las vías de administración incluyen vías
intradérmica, transdérmica (por ejemplo, en formulaciones de
liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa,
subcutánea, oral, intracraneal, epidural, tópica, rectal e
intranasal. Puede usarse cualquier otra vía de administración eficaz
terapéuticamente, por ejemplo, absorción a través de tejidos
epiteliales o endoteliales o por terapia génica, en la que se
administra al paciente (por ejemplo, mediante un vector) una
molécula de ADN que codifica el agente activo, lo que hace que el
agente activo se exprese y segregue in vivo. Además, la(s)
proteína(s) según la invención puede(n) administrarse
junto con otros componentes de agentes activos biológicamente tales
como tensioactivos, excipientes, portadores, diluyentes y vehículos
aceptables farmacéuticamente.
Para administración parenteral (por ejemplo,
intravenosa, subcutánea, intramuscular), la(s)
proteína(s) activa(s) puede(n) formularse como
una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación
con un vehículo parenteral aceptable farmacéuticamente (por
ejemplo, agua, solución salina, solución de dextrosa) y aditivos
que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o la
estabilidad química (por ejemplo, agentes de conservación y
tampones). La formulación se esteriliza por técnicas usadas
comúnmente.
La biodisponibilidad de la(s)
proteína(s) activa(s) según la invención puede
mejorarse también usando procedimientos de conjugación que aumentan
la vida media de la molécula en el cuerpo humano, por ejemplo
enlazando la molécula a polietilenglicol (PEG), como se describe en
la Solicitud de Patente PCT WO 92/13095.
Las cantidades eficaces terapéuticamente de
la(s) proteína(s) activa(s) serán función de
muchas variables, incluyendo el tipo de antagonista, la afinidad
del antagonista por IL-18, cualquier actividad
citotóxica residual presentada por los antagonistas, la vía de
administración y el estado clínico del paciente (incluyendo lo
deseable de mantener un nivel no tóxico de actividad de
IL-18 endógena).
Una "cantidad eficaz terapéuticamente" es
tal que, cuando se administra, el inhibidor de IL-18
produce la inhibición de la actividad biológica de
IL-18. La dosificación administrada, como dosis
simples o múltiples, a un individuo variará dependiendo de una
variedad de factores, incluyendo las propiedades farmacocinéticas
del inhibidor de IL-18, la vía de administración,
los estados y características del paciente (sexo, edad, peso
corporal, salud, estatura), la extensión de los síntomas, los
tratamientos concurrentes, la frecuencia de tratamiento y el efecto
deseado. El ajuste y la manipulación de los intervalos de
dosificación establecidos están bien dentro de la capacidad de los
expertos en la técnica, así como los métodos in vitro e in vivo para
determinar la inhibición de IL-18 en un
individuo.
Puede usarse IL-18BP purificada
en una cantidad de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg o
aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente
0,1 a 5 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 1 a 3 mg/kg de
peso corporal o aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal.
En realizaciones preferidas adicionales, la
IL-18BP purificada se administra diariamente o cada
dos días o tres veces por semana o una vez por semana.
Las dosis diarias se dan usualmente en dosis
divididas o en forma de liberación sostenida eficaces para obtener
los resultados deseados. La segunda o subsiguientes administraciones
pueden realizarse con una dosificación que sea igual, menor o mayor
que la dosis inicial o previa administrada al individuo. Puede
administrarse una administración segunda o subsiguiente durante o
antes del ataque de la enfermedad.
Según la invención, puede administrarse
IL-18BP purificada profiláctica o terapéuticamente a
un individuo antes de, simultáneamente o secuencialmente con otros
regímenes o agentes terapéuticos (por ejemplo, regímenes de
fármacos múltiples), en una cantidad eficaz terapéuticamente.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La IL-18BP purificada puede
usarse para preparar un medicamento para el tratamiento y/o
prevención de un cierto número de enfermedades o trastornos. Tales
enfermedades o trastornos son preferiblemente trastornos mediados
por IL-18. En particular, puede usarse
IL-18BP purificada para tratamiento y/o prevención
de psoriasis, artritis psoriática, enfermedad de Crohn, enfermedad
intestinal inflamatoria, artritis reumatoide, daño al hígado tal
como cirrosis hepática alcohólica, sepsis, aterosclerosis,
enfermedades cardíacas isquémicas, alergias, en particular
hipersensibilidad de tipo retardado, y daño a la cabeza cerrado.
En un tercer aspecto, la invención se refiere al
uso de un sistema de dos fases acuosas para la purificación de
proteína de unión a IL-18 (IL-18BP).
Preferiblemente, el sistema de dos fases acuosas se usa para la
captura de IL-18BP desde un fluido.
Con referencia a etapas de métodos conocidos,
etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos
convencionales, no hay en modo alguno reconocimiento de que algún
aspecto, descripción o realización de la presente invención se
describan, enseñen o sugieran en la técnica relevante.
Ha de entenderse que la fraseología o
terminología aquí es con el fin de descripción y no de limitación,
de tal modo que la terminología o fraseología de la presente
memoria descriptiva ha de interpretarse por el técnico experto a la
luz de las enseñanzas y guía presentadas aquí, en combinación con el
conocimiento de alguien de experiencia ordinaria en la técnica.
En el presente ejemplo, se ha desarrollado una
etapa de purificación basada en un sistema de dos fases acuosas
para la purificación de IL-18BP de una cosecha de
células CHO. Con este fin, se realizaron las siguientes etapas:
- 1.
- Selección de los componentes formadores de fases (parejas) a examinar.
- 2.
- Primeros experimentos de diseño factorial. Para cada pareja seleccionada simple, se examinaron todos los factores principales que afectan al reparto de proteína en un espacio experimental amplio.
- 3.
- Segundos experimentos de diseño factorial. Sólo se examinaron factores importantes que afectan al reparto de la proteína objetivo en un espacio experimental reducido.
- 4.
- Se verificaron experimentalmente indicaciones predichas por el modelo.
- 5.
- Se optimizaron las indicaciones y se ajustaron con precisión.
- 6.
- Se aumentaron de escala las indicaciones hasta una escala de 1 litro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se consideraron diferentes factores para la
selección de los componentes formadores de fases: (i) compatibilidad
del procedimiento; (ii) precio de los componentes; (iii)
disponibilidad de los componentes; (iv) datos bibliográficos. En
términos de compatibilidad del procedimiento, precio y
disponibilidad, las parejas PEG/sal eran apropiadas. Se
seleccionaron las PEG/(NH_{4})_{2}SO_{4},
PEG/KH_{2}PO_{4} y PEG/Na_{2}SO_{4}.
Por tanto, las tres parejas estudiadas
fueron:
- 1.
- PEG/(NH_{4})_{2}SO_{4}
- 2.
- PEG/KH_{2}PO_{4}
- 3.
- PEG/Na_{2}SO_{4}
\vskip1.000000\baselineskip
El propósito de este ciclo de experimentos de
diseño factorial era seleccionar los componentes formadores de
fases apropiados que mostraban reparto de proteína extremo.
El experimento usado fue un diseño compuesto
central que incluía un factorial fraccionado de
2^{5-1}, 10 puntos estrella y 2 puntos centrales.
El diseño permitía la estimación de todos los efectos principales e
interacciones de dos factores y todos los efectos cuadráticos puros
de los factores experimentales. La Tabla A resume el tipo de
factores experimentales y los niveles considerados. Corresponde a 28
experimentos por pareja seleccionada.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones experimentales que se usaron se
describen en las Tablas B, C y D.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Debido al alto número de muestras generadas
durante este primer ciclo (3 parejas x 28 experimentos x 2 fases =
168), se usó IL-18BP purificada y se estimó la
concentración de proteína por absorbancia UV a 280 nm. Se
realizaron experimentos a escala de 2 ml. La respuesta recogida fue
el coeficiente de reparto K definido como:
Ecuación 1K =
\frac{C^{prote\text{í}na}{}_{fase \
superior}}{C^{prote\text{í}na}{}_{fase \
inferior}}
\newpage
Los datos brutos se describen en la Tabla E.
\vskip1.000000\baselineskip
El intervalo de valores del coeficiente de
reparto recogidos para los tres experimentos de diseño factorial se
ilustran en la Tabla F.
Se realizó un análisis estadístico sobre el
reparto de IL-18BP usando PEG/Na_{2}SO_{4} o
PEG/KH_{2}PO_{4}. Se eliminaron primero del análisis
estadístico los factores con pequeña influencia en el reparto de
proteína. Este análisis produce modelos matemáticos (Ecuación 2 y
Ecuación 3), que predicen el valor de K, que tienen en cuenta los
factores que se han encontrado tienen efectos significativos en la
respuesta K.
\vskip1.000000\baselineskip
| Ecuación 2 | |
| LnK(IL-18BP) = 4,11+0,26\cdotP.m.PEG-0,76\cdotP.m.PEG ^{2}+0,81\cdotTL-0,62\cdotTL^{2} | |
| R^{2}=0,81, D.T.=0,49 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Ecuación 3 | |
| cLnK(IL-18BP) = 0,085-0,42\cdot[NaCl]+0,31\cdotP.m.PEG+0,47\cdotpH+0,18\cdotpH^{2} | |
| R^{2}=0,80, D.T.=0,37 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores K máximos para el modelo predicho se
ilustran en la Tabla G.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La intención de este ciclo de experimentos de
diseño factorial era seleccionar las condiciones apropiadas (pH,
concentraciones, etc.) que muestran reparto de proteína extremo y
buenos factores de purificación. Este ciclo se realizó usando
PEG/Na_{2}SO_{4} como componentes formadores de fase.
El diseño experimental fue un diseño compuesto
central. El diseño incluía un factorial de dos niveles completo,
puntos estrella y un punto central, con duplicados de cada marco
experimental. Resultaron hasta 52 experimentos, como se muestra en
la Tabla H.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
A diferencia del primer ciclo de experimentos de
diseño factorial, la cosecha cruda clarificada se usó como material
de partida. Los experimentos se realizaron a escala de 10 ml. Se
recogieron dos respuestas: el coeficiente de reparto de
IL-18BP K_{(IL-18BP)}, relacionado
con la capacidad del procedimiento, y el coeficiente de reparto de
proteína total K_{(prot \ tot}), relacionado con la capacidad de
purificación del procedimiento.
Los datos brutos se presentan en la Tabla I.
Los intervalos de valores del coeficiente de
reparto observados para los experimentos de diseño factorial se
ilustran en la Tabla J.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un análisis estadístico sobre el
reparto de IL-18BP y de proteínas totales. En
contraste con el primer ciclo de experimentos, los resultados de
este análisis señalados en la Tabla K y la Tabla L indican que se
encontraron significativos los cuatro factores principales
ensayados, como lo fueron muchas interacciones de segundo
grado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los modelos que predicen el segundo ciclo de
experimentos de diseño factorial permitieron la selección de 28
condiciones candidatas, que mostraban un rendimiento predicho >
75% y una pureza en la fracción post-A2PS mayor del
50%. Las condiciones candidatas se listan en la Tabla M.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
El propósito de estos experimentos era verificar
experimentalmente el funcionamiento de las indicaciones predichas
por el análisis estadístico. Se usó la cosecha cruda clarificada
como material de partida. Los experimentos se realizaron a escala
de 10 ml. Se recogieron dos respuestas: el coeficiente de reparto de
IL-18BP K_{(IL-18BP)}, y el
coeficiente de reparto de proteína total K_{(prot \ tot}). Las
condiciones experimentales se describen en la anterior Tabla M.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se indican en la Tabla N. La
concentración de IL-18BP se midió por BIAcore con un
anticuerpo monoclonal inmovilizado que detecta
IL-18BP, denominado Mab 582.1. La concentración de
IL-18BP se midió por el método Biacore® según las
instrucciones del fabricante, usando los siguientes parámetros:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se han identificado tres indicaciones a partir
del modelo estadístico. Los parámetros relativos a estas
indicaciones se ilustran en la siguiente Tabla O. La Electroforesis
de Zona Capilar (CZE) se realizó según el siguiente método:
\vskip1.000000\baselineskip
- Agua purificada MilliQ
- Millipore o equivalente
- Ácido trifluoroacético (TFA) cod. 9470
- Baker o equivalente
- Acetonitrilo (CH_{3}CN) (nº de Cat. 30)
- Merck o equivalente
- NaOH 50% "Baker analyzed" nº de Cat. 7067
- Baker
- Tampón fosfato eCAP\registrado 50 mM, pH 7,0 (nº de Cat. 477423)
- Beckman Coulter
- Material de referencia Interim ST1P01/r-hIL-18BP
- Serono
- Marcador neutro (nº de Cat. 477434)
- Beckman Coulter
\vskip1.000000\baselineskip
- Sistema P/ACE MDQ
- Beckman Coulter
- Software 32 Karat\registrado versión 4.0
- Beckman Coulter
- Tubo capilar de 75 \mum de D.I. eCAP\registrado (nº de Cat. 338454)
- Beckman Coulter
- Viales de PCR (nº de Cat. 144709)
- Beckman Coulter
- Resortes de Viales Micro (nº de Cat. 358821)
- Beckman Coulter
- Tapones de Viales de PCR (nº de Cat. 144656)
- Beckman Coulter
- Soportes de Viales (nº de Cat. 144657)
- Beckman Coulter
- Cartucho P/ACE System MDQ (nº de Cat. 144738)
- Beckman Coulter
- Cartucho Sep-Pak Plus tC2 (nº de Cat. WAT052720)
- Waters
- Centricon YM-10 (nº de Cat. 4206)
- Millipore
Jeringas de 1 y 5 ml de Millipore o
equivalentes
\vskip1.000000\baselineskip
Acondicionamiento de Sep-Pak:
100% de CH_{3}CN
Solución de equilibrado/lavado de
Sep-Pak: 25% de CH_{3}CN en TFA acuoso al 0,1%
Solución de elución de Sep-Pak:
36% de CH_{3}CN en TFA acuoso al 0,1% (terminación: dos semanas a
4ºC)
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de lavado/prueba de CZE fosfato 5 mM
Se prepara por dilución 1:10 de solución madre
de fosfato 50 mM pH 7,0. Se filtra a través de filtro de 0,22
\mum. Se prepara reciente.
NaOH 0,5 M (solución de lavado de CZE)
Se añaden 26,2 \mul de NaOH del 50% a agua,
volumen total 1 ml. Se prepara reciente.
NaOH 1 M (solución de regeneración de CZE)
Se añaden 52,4 \mul de NaOH del 50% a agua,
volumen total 1 ml. Se prepara reciente.
Marcador neutro (dilución 1:10000)
Se añaden 10 \mul de solución madre de
marcador neutro a agua, volumen total 1 ml.
Se añaden 10 \mul de de este marcador neutro
dilución 1:100 a agua, volumen total 1 ml.
Se guarda durante tres meses a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La CZE es una forma de electroforesis capilar de
alta eficacia. Se llena el tubo capilar con tampón de electrolito y
tiene lugar la separación de la muestra aplicando un campo eléctrico
a través del tubo capilar. El mecanismo de separación se basa en
diferencias de movilidad electroforética entre analitos. La
movilidad electroforética es función de la carga neta de cada
analito y el tamaño hidrodinámico en una condición dada.
El análisis CZE de muestras que contienen
IL-18BP se realiza usando un sistema de CE con un
tubo capilar de sílice de pirólisis (D.I. 75 \mum y longitud
efectiva de 50 cm) lleno con un tampón que contiene fosfato 5
mM.
Para aumentar la resolución de CZE, se desalan
la Referencia patrón y cada volumen mediante Centricon 10 antes de
análisis CZE. Se cargan las muestras con una concentración de
IL-18BP de aproximadamente 2,5 mg/ml. La inyección
en el tubo capilar se realiza usando una inyección a baja presión
(\approx 35,2 g/cm^{2}) durante 5 segundos. La separación se
realiza con un voltaje constante de 25 kv durante 30 min a 25ºC. La
prueba se vigila usando absorbancia UV a 214 nm.
Para el Patrón de Referencia y las muestras en
volumen el procedimiento consiste en dos etapas: desalación de
muestra y análisis CZE.
Para cosecha cruda y muestras
post-captura se separa la alta interferencia de
matriz para permitir observar el perfil de glicoproteína
IL-18BP. En este caso, el procedimiento consiste en
tres etapas: Una etapa de captura Sep-Pak para
separar la alta interferencia de matriz, desalación de muestra y
análisis CZE de la fracción de IL-18BP
capturada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se monta el cartucho Sep-Pak con
una jeringa de 5 ml, y se sigue después el siguiente
procedimiento:
La solución recogida de la etapa 6 (volumen
total 3 ml) se concentra en una centrífuga Speed-Vac
para eliminar CH_{3}CN y reducir el volumen total a \leq 2,0
ml.
\vskip1.000000\baselineskip
El Patrón de Referencia, o el volumen de la
solución de Speed-Vac resultante de la etapa previa,
se transfieren en Centricon 10 y se concentran hasta
aproximadamente 100 \mul por ultrafiltración a 5.000 x g y
10ºC.
Se realiza después la desalación con cuatro
lavados con 1 ml de H_{2}O a 5.000 x g y temperatura de 10ºC,
durante 40 minutos cada uno.
Excepto la cosecha cruda, los retenidos se
diluyen y dividen en partes alícuotas (partes alícuotas de 30
\mul) con una concentración de IL-18BP de 2,5
mg/ml.
Las muestras de cosecha cruda se recuperan en un
volumen final de 40-50 \mul. Esta cantidad es
suficiente para preparar dos muestras de CZE independientes. Las
muestran están ahora listas para análisis CZE.
Se guardan todas las muestras a -20ºC hasta
análisis CZE.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfieren \geq 20 \mul de
muestra/referencia en viales de PCR que contienen 1/10 de volumen de
marcador neutro (3.3.4), se mezcla por pipeteado inverso y se evita
que se generen burbujas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden los siguientes reactivos en soportes
de viales separados y se evita que se generen burbujas.
Tabla de tiempos de análisis CZE
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla de tiempos de regeneración capilar de
CZE
- Longitud capilar a longitud de detector/total
- 50/60 cm
- Polaridad
- positivo a negativo (adelante)
- Temperatura
- capilar = 25 \pm 2ºC
- Bandeja de muestra
- = 10 \pm 2ºC
- Detección
- 214 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Al menos tres inyecciones del material de
Referencia Patrón con el propósito de acondicionamiento capilar.
Referencia Patrón 1 (inicio)
Inyección simple de muestra 1
Inyección simple de muestra 2
Inyección simple de muestra 3
Inyección simple de muestra 4
Referencia Patrón 2 (final)
Nota: Para aumentar la
reproductibilidad, puede analizarse un máximo de 4 muestras en una
secuencia entre la referencia 1 y la referencia 2 usando el mismo
tampón de prueba de CZE. Alternativamente, pueden usarse para cada
muestra dos referencias de enlace como se describe
después.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hacen al menos tres inyecciones del material
de Referencia Patrón con el fin de acondicionamiento capilar.
Referencia Patrón (inicio 1)
Inyección simple de muestra 1
Referencia Patrón (final 1/inicio 2)
Inyección simple de muestra 2
Replicado de Referencia Patrón (final 2/inicio
3)
\vskip1.000000\baselineskip
Inyección simple de muestra 3
Replicado de Referencia Patrón (final 3)
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa el material de Referencia Patrón para
comparación de datos de muestras.
Se imprimen los electroferogramas cubertos y
apilados de muestra/s y ambos patrones de referencia de enlace
(inicio/final) y se los archiva en los resultados de archivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinan los tiempos de migración MT2 y MT3
en los valles a izquierda y derecha de los picos -3 y +3 del Patrón
de Referencia (inicio). El pico 0 es el pico principal de la
referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a la alta acidez del perfil de
glicoproteína IL-18BP, las isoformas entre MT2 y MT3
se denominan "isoformas ácidas". Las isoformas con
tiempos de migración mayores que MT3 se denominan "isoformas
altamente ácidas". Las isoformas con tiempos de migración
más bajos que MT2 se denominan "isoformas menos
ácidas".
En algunas circunstancias, podría ser necesario
añadir la clase de "isoformas básicas" definidas como
isoformas con tiempos de migración más bajos que MT1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizan la referencia y cada muestra usando
las funciones: pico manual entre MT1-MT2,
MT2-MT3 y MT3-MT4; la línea de
base manual entre 5 y 28 minutos y la integración OFF
entre 0 y MT1 y entre MT4 y 30 minutos. Se modifican manualmente
las funciones Widthand Treshold para obtener una integración
de tres grupos de picos entre MT1-MT2 (isoformas
menos ácidas), MT2-MT3 (isoformas ácidas) y
MT3-MT4 (isoformas altamente ácidas) similar a la
mostrada antes para el Patrón de Referencia.
% de abundancia
de isoforma = \frac{área \ (MT1-MT2 \ o \
MT2-MT3 \ o \ MT3-MT4)}{Área \
total \
(MT1-MT4)}
Cuando sea necesario, se añade el grupo de picos
correspondiente a "isoformas básicas" definidas como
isoformas con tiempos de migración más bajos que MT1, y se corrige
en conformidad la fórmula anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Los perfiles de CZE mostraban que las isoformas
ácidas parecían ser seleccionadas por A2PS. Los resultados de los
perfiles de isoformas se representan en la Fig. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento y la pureza de la
IL-18BP purificada se calcularon como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Y =
\frac{V_{fase} \cdot C_{fase}{}^{IL18BP}}{V_{0}-V_{0}{}^{IL18BP}}
\cdot
100
Y =
\frac{V_{fase} \cdot C_{fase}{}^{IL18BP}}{V_{0}-V_{0}{}^{prot. \
total}} \cdot
100
V_{fase}: volumen de la fase de interés
C_{fase}^{IL18BP}: Concentración de IL18BP
en la fase de interés
C_{fase}^{prot. \ total}: Concentración de
proteína total en la fase de interés
V_{0}: volumen del material de partida a
purificar
C_{0}^{IL18BP}: Concentración de IL18BP en
el material de partida a purificar.
\vskip1.000000\baselineskip
Los parámetros medidos para las tres
indicaciones se resumen en la Tabla O. El reparto de proteína era
reproducible (véanse valores de desviación típica). No se formaron
agregados durante el procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En esta sección, se valoró la purificación
directa de IL-18BP a partir de cosecha no
clarificada cruda. Con el fin de comparar si las células afectan al
funcionamiento del procedimiento, se han comparado dos condiciones
de procedimiento con y sin células (para condiciones de
procedimiento, véase Tabla N).
Como se muestra en la Tabla P, los
funcionamientos del procedimiento eran afectados relativamente poco
por la presencia de células o residuos de células. Después de la
separación de fases, muchas de las células y residuos de células
estaban localizados en una interfase espesa.
\vskip1.000000\baselineskip
El propósito de estos experimentos era optimizar
el funcionamiento de las indicaciones seleccionadas previamente
(Tabla O). Es posible optimizar el rendimiento, la pureza o el
factor de concentración de la etapa de extracción basada en las
líneas de conexión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa comúnmente conductimetría para determinar
la concentración de sal en A2PS. Sin embargo, los medios de cultivo
ya contienen alguna sal que puede afectar al análisis. Por tanto, se
usó un ensayo colorimétrico (Juego: Aquanal-plus
Sulfate (SO_{4})50-330 mg/l (Fluka Nº
37429-1EA) y muestra mejores resultadosen ese
caso.
\vskip1.000000\baselineskip
Puede usarse refractometría para análisis de
concentración de PEG. Sin embargo, muchos componentes de medios de
cultivo interfieren con el análisis. Por tanto, se usó cromatografía
de exclusión por tamaño para análisis de concentración de PEG en
las condiciones indicadas en la Tabla Q.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden determinarse líneas de conexión midiendo
los PEG y Na_{2}SO_{4} en las fases superior e inferior (véanse
Figs. 4, 5 y 6). K_{(IL-18BP)} y K_{(prot. \
total)} son constantes en la misma línea de conexión. Por tanto,
una relación de fases óptima escogida para el procedimiento de
purificación proporcionaría un equilibrio entre rendimiento y
factor de purificación.
Se usó como material de partida cosecha cruda
clarificada y los experimentos se realizaron a escala de 10 ml. Se
recogieron dos respuestas: el coeficiente de reparto de
IL-18BP K_{(IL-18BP)}, y el
coeficiente de reparto de proteína total K_{(prot. \ total)}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han ensayado cuatro condiciones
experimentales optimizadas. La Tabla R resume el funcionamiento del
procedimiento experimental obtenido después de repartir.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Dependiendo del procedimiento aguas abajo y de
la calidad del volumen final, pueden seleccionarse muchas más
condiciones optimizadas basadas en las líneas de conexión que se
muestran en las Figs. 2, 3 y 4. La flexibilidad considerando el
rendimiento, la pureza o el factor de concentración basada en las
líneas de conexión es una de las principales ventajas de la
tecnología de A2PS.
El propósito de estos experimentos era evaluar
los resultados principales de aumento de escala relacionados con la
tecnología de A2PS. Se han seleccionado dos condiciones de la Tabla
R y la Tabla S para un aumento de escala de 100 veces
(val2-5; val2-2 opt 2). Los
resultados se ilustran en la Tabla T. No pueden observarse grandes
diferencias en el funcionamiento del procedimiento después de un
aumento de escala de 100 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de estimar si la captura directa de
IL-18BP usando tecnología de A2PS afecta a la
calidad en volumen final, se ha purificado material
post-captura de A2PS del experimento de aumento de
escala val-2.5 usando etapas de purificación
cromatográfica adicionales. Los resultados se ilustran en la Tabla
U. En comparación con un lote de sustancia fármaco obtenido con una
captura cromatográfica en Fractogel® TMAE (cromatografía de
intercambio iónico de trimetilaminoetilo, comprado a Merck), el lote
(7075-41-05 UF2) derivado de la
captura de A2PS muestra resultados de calidad comparables.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla V resume los resultados obtenidos con
las etapas de captura cromatográfica tradicional y muestra que el
procedimiento de A2PS es más simple; puede proporcionar mejor pureza
y rendimiento, y puede ser más rápido.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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York, Basel, Honk Hong.
Claims (25)
1. Un procedimiento para purificar
IL-18BP de un fluido, que comprende al menos una
etapa usando reparto 4 de dos fases acuosas, en el que el sistema de
dos fases acuosas comprende una fase de polietilenglicol (PEG) y
una fase de sal que comprende (NH_{4})SO_{4} o
(Na_{2})SO_{4}.
2. El procedimiento según la reivindicación 1ª,
en el que el PEG tiene un peso molecular variable entre 2.000 y
12.000.
3. El procedimiento según las reivindicaciones
1ª o 2ª, en el que el PEG tiene un peso molecular de 10.000.
4. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones precedentes, en el que la concentración inicial de
(Na_{2})SO_{4} es menos del 20% [p/p] o el 14% [p/p] o el
12% [p/p] o el 10% [p/p] o el 8% [p/p] o el 6% [p/p] o el 4% [p/p]
o el 2% [p/p].
5. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones precedentes, en el que el PEG se usa en una
concentración de menos del 35% [p/p] o el 30% [p/p] o el 25% [p/p]
o el 20% [p/p] o el 15% [p/p] o el 12% [p/p] o el 10% [p/p] o el 5%
[p/p].
6. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones precedentes, en el que las concentraciones de las
dos fases se calculan según la siguiente fórmula:
y = -2,5108x +
35,159
en la que y = PEG en % [p/p] y x =
(Na_{2})SO_{4} en %
[p/p].
7. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones 1ª a 5ª, en el que las concentraciones de las dos
fases se calculan según la siguiente fórmula:
y = -2,5573x +
35,757
en la que y = PEG en % [p/p] y x =
(Na_{2})SO_{4} en %
[p/p].
8. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones 1ª a 5ª, en el que las concentraciones de las dos
fases se calculan según la siguiente fórmula:
y = -2,1182x +
35,355
en la que y = PEG en % [p/p] y x =
(Na_{2})SO_{4} en %
[p/p].
9. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones precedentes, en el que el procedimiento se realiza
a un pH variable entre pH 4 y 9.
10. El procedimiento según la reivindicación
9ª, en el que se realiza a pH 5.
11. El procedimiento según la reivindicación
9ª, en el que se realiza a pH 7.
12. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones precedentes, en el que el procedimiento se realiza
a temperatura ambiente.
13. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones precedentes, en el que la etapa que usa un sistema
de dos fases acuosas es una etapa de captura.
14. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones precedentes, que comprende además una o más etapas
de purificación adicionales.
15. El procedimiento según la reivindicación
14ª, en el que las etapas de purificación adicionales se seleccionan
entre cromatografía de afinidad de ion de metal, cromatografía de
interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio iónico y
cromatografía de fase inversa.
16. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones precedentes, que comprende además una o más etapas
de ultrafiltración.
17. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones precedentes, que comprende además una o más etapas
de filtración para separación de virus.
18. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones precedentes, en el que el fluido se selecciona
entre cosecha de cultivo de células, lisado de células, extracto de
células, extracto de tejidos, plasma sanguíneo, suero, leche,
orina, ascites, extracto de plantas o una fracción derivada de una
etapa de purificación de proteína anterior.
19. El procedimiento según la reivindicación
18ª, en el que la cosecha de cultivo de células es cosecha de
cultivo de células cruda no clarificada.
20. El procedimiento según la reivindicación
18ª, en el que la cosecha de cultivo de células es cosecha de
cultivo de células cruda clarificada.
21. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones 18ª a 20ª, en el que la cosecha de cultivo de
células se deriva de células de ovario de hámster chino (CHO).
22. El procedimiento según la reivindicación
21ª, en el que las células CHO se desarrollan en suspensión.
23. El procedimiento según alguna de las
reivindicaciones precedentes, en el que la IL-18BP
es IL-18BP recombinante humana.
24. El uso de un sistema de dos fases acuosas
para la purificación de IL-18BP, en el que el
sistema de dos fases acuosas comprende una fase de polietilenglicol
(PEG) y una fase de sal que comprende (NH_{4})SO_{4} o
(Na_{2})SO_{4}.
25. El uso de un sistema de dos fases acuosas
para la captura de IL-18BP de un fluido, en el que
el sistema de dos fases acuosas comprende una fase de
polietilenglicol (PEG) y una fase de sal que comprende
(NH_{4})SO_{4} o (Na_{2})SO_{4}.
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