JP6913066B2 - 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト - Google Patents
高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト Download PDFInfo
- Publication number
- JP6913066B2 JP6913066B2 JP2018192476A JP2018192476A JP6913066B2 JP 6913066 B2 JP6913066 B2 JP 6913066B2 JP 2018192476 A JP2018192476 A JP 2018192476A JP 2018192476 A JP2018192476 A JP 2018192476A JP 6913066 B2 JP6913066 B2 JP 6913066B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- etanercept
- folded
- mixed mode
- protein
- resin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/165—Extraction; Separation; Purification by chromatography mixed-mode chromatography
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
この明細書において使用される用語は、本発明に関連して、および各用語が使用される具体的文脈において、概して当分野におけるこれらの普通の意味を有する。本発明を記載するために使用される特定の用語を、下記または本明細書の他のところで述べ、本発明の記載に関して施術者にさらなるガイダンスを提供する。特定の用語に関して同意語が提供される。1以上の同意語の説明部分は、他の同意語の使用を排除するものではない。本明細書に述べる任意の用語の例を含む、本明細書のいずれにおいても例の使用は、単なる例示であり、本発明またはいずれの例示的用語の範囲および意味を限定するものでは決してない。本発明は、本明細書に提供されるさまざまな実施形態に限定されない。
本発明のステップ(a)において、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質溶液は、CAPTO MMC混合モード樹脂に導入され、約4から約8のpH、好ましくは約4から約6のpHにおいてこれらに結合しなければならない。または、CAPTO ADHERE混合モード樹脂が使用される場合、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むステップ(a)のタンパク質溶液は、約6から約8.5のpH、好ましくは約7から約8のpHにおいてCAPTO ADHERE混合モード樹脂に導入され、これらに結合しなければならない。
ステップ(b)において、溶出媒体は、所定の濃度の塩を含み、正確に折り畳まれたエタネルセプトタンパク質の、不正確に折り畳まれたエタネルセプトに比べて優先的な溶出に有効な所定の様式でカラムに適用される。一般的に言って、溶出液は、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトより高い比率で含有しなければならないが、塩溶液およびこれらの樹脂に適用する様式は、ステップ(b)の溶出液中に、正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量をはるかに超えるように選択されることが好ましい。早期溶出分画は、基本的に100%の正確に折り畳まれたタンパク質を含有し得る。塩溶液溶出ステップは、塩溶液のモル濃度を、勾配などを通して変化(上昇)させることによって達成することができる。勾配は段階的に達成できるが、連続して線形であることが好ましい。好ましい実施形態において、塩溶液は塩化ナトリウム(「NaCl」)を含有する。NaCl線形勾配は、約0から約1Mであってよい。
エタネルセプトは、ヒトFcにC末端において融合されたヒトTNFR細胞外ドメインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた組換えCHO細胞の馴化培地(「CM」)において発現させる。エタネルセプトの哺乳動物発現に関する当分野における例は、下記の米国特許に見出すことができこれらは参照により本明細書に組み込まれる:RE36755;米国特許第5,605,690号明細書;EP464,533;EP417,563;米国特許第8.063,182号明細書;および米国特許第7,294,481号明細書。
上で得られたCMをプロテインAカラムおよび1ml HiTrap rプロテインAカラム(GE Healthcareから入手可能)を使用して、10mM ホスフェート、0.1M NaCl、pH7.0溶液により平衡化して、処理する。カラムを、1M 塩酸アルギニン(「アルギニン」)、0.1M シトレート、pH6.0溶液で洗浄後、結合されたタンパク質を、pH4.2、3.7および3.0の1Mアルギニンおよび0.1Mシトレート含有溶液により段階的に溶出する。またはカラムは、アルギニン非含有の漸減pHの0.1Mシトレート含有溶液により処理することができる。アルギニンの不在下で、大部分のエタネルセプトが、3.85のpHで溶出され、これより低いpHで溶出される、混入物質および不正確に折り畳まれたエタネルセプト、エタネルセプトの断片、エタネルセプトの凝集体などを含む溶出液が提供された。プロテインAの溶出液をその後、実施例において下記のようにHiTrapカラム(GE Healthcareから入手可能)において、Capto(商標)MMCまたはCapto(商標)Adhereに供する。
上で得られたプロテインAの溶出液の分析を、図2Aおよび2Bに示す。図2Aは、1M アルギニンを含有する低pHバッファーによるプロテインAからの溶出プロファイルを示す。大きなUV吸光度ピークが、pH6.0(6.0とマークされたピーク)において観察され、native−PAGE(レーン1)により検査された市販のエタネルセプトに対応するバンドは含有されず(図2B、レーン4):エタネルセプトがプロテインAカラムを貫流しなかったことに留意されたい(レーン2および3と比較)。タンパク質のバンドはpH6.0において観察されなかったが(レーン4)、観察された大きなUV吸光度は顔料の溶出を示している。ベースライン吸光度に到達後(図2A)、その後、カラムを0.1M アルギニン、0.1M シトレート、pH4.2で溶出し、鋭い溶出ピークを得た(図2A、4.2のマーク)。このピークのnative−PAGE分析により、エタネルセプトの強いバンドと不鮮明な低移動度のバンドとが一緒に示された(レーン5)。溶出タンパク質のHIC分析により2つのピークが示され、第1のピークは市販のエタネルセプトの主要ピークに対応し、第2のピークもまた市販のエタネルセプト中に存在する微量種に対応する。第2のピークの本質は明らかではないが、第2のピークはプロテインAに結合され、従ってFcドメインを含有するはずなので、エタネルセプトの異常に折り畳まれた種であると思われる。残りの結合タンパク質をpH3.7およびその後3.0で溶出し、両方とも1M アルギニンを含有した。これらの低pH溶媒は、図2A(3.7および3.0)に示す小さいピークの溶出をもたらした。pH3.7のピークは少量のエタネルセプト(レーン6)を含有したが、pH3.0のピークは主に、異常に折り畳まれた種および凝集していると思われる種に対応する低移動度種を含有した(レーン7)。同様の溶出パターンが、アルギニンの不在下において観察された。比較的低いpH、例えばpH3.85がエタネルセプトの溶出に必要であり、さらなるpHの低下が低移動度種の溶出をもたらした。これらの低移動度種がプロテインAに結合したという事実は、これらもまたFc融合タンパク質であったということを意味する。これらの種はエタネルセプトより低いpHにおいて溶出されたので、これらの種はプロテインAにより強固に結合されていた。これらの分析により、組換えCHO細胞におけるエタネルセプトの発現が、分析HICにより分析した場合、正確に折り畳まれた種に対応する天然(正確に折り畳まれた)エタネルセプトと、不正確に、異常に折り畳まれた種に対応する低移動度種との両方をもたらすことが確認された。異常に折り畳まれた種はHICにおいて後期に溶出されたので、異常に折り畳まれた種は天然のエタネルセプトより疎水性であるはずである。CHOクローンおよび発酵条件に依存して、正確に折り畳まれた種の量は、プロテインA溶出液の40から60重量5で変動した。下記の実施例において、混合モードクロマトグラフィーの、折り畳まれた種を異常に折り畳まれた種から分離する能力を評価する。
プロテインA、Capto(商標)MMCおよびCapto(商標)Adhere組成物から溶出された分画は、当分野において周知のさまざまな技術、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、変性SEC(dSEC)、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)およびnative−PAGEなどを使用して分析可能である。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーの技術は、Hawe et al,Pharm.Res.2011,28:2302および/またはvan Marrschalkerweerd et al.,Eur.J.Pharm.Biopharm.2011,78:213に記載されている。
例えば、プロテインA、Capto(商標)MMCおよびCapto(商標)Adhereから溶出された分画は、ドデシル硫酸ナトリウムまたはnativeポリアクリルアミドゲル電気泳動(それぞれ、SDS−PAGEまたはnative−PAGE)により分析可能である。SDS−PAGEおよびnative−PAGEは両方とも、6% Tris−Glycineゲル(Life Technologyから入手可能)を使用して実施した。SDS−PAGEは、ジスルフィド結合凝集体が観察できるように、非還元条件下で行った。
本発明の混合モードクロマトグラフィー方法を使用して得られた溶出液分画は、周知の技術である、被検体がサイズにより分離されるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)法(Rogner,M.(2000).Size Exclusion chromatography.Protein Liquid chromatography.M.Kastner.Amsterdam,Elsevier.61:89−145を参照されたい。)を使用して分析することができる。例えば、限定するものではないが、移動相バッファーは、50mMのリン酸一ナトリウム一水和物および150mM アルギニンを含有するように調製してよい。pHは、1M HClを使用して6.5に調整する。分離は、Tosoh TSK−Gel SWxl 6mm×4cmガードカラム(カタログ番号8543)を、Tosoh TSK−Gel G4000 SWxl 7.8mm×30cm(カタログ番号8542)に直線的に取り付けて使用して実施することができる。分離の実施のために、カラムを室温(23℃)にし、移動相で流速0.5mL/分において平衡化する。5マイクロリットルの50mg/mLのエタネルセプトを含む溶液を、オートサンプラーを使用してカラムに注入する。分離は、流速約0.5mL/分において約30分かけて達成することができる。カラム溶出剤を、波長280nmにおいてこの時間の間モニターした。積分は、Chromeleonソフトウェア(Dionex)を使用して実施可能である。積分の前に、エタネルセプトを含有しないバッファーに関するSECクロマトグラムを、すべてのクロマトグラムから差し引く。すべての積分は、12分から26分の保持時間の間に実施可能である。幾つかのパラメーターを使用してピークを定義する。検出ピークの最小面積を0.05mAu*分に設定する。ピーク検出の2次元感受性を0.01mAuおよび75秒に設定する。ピークショルダーを、手動積分ツールを使用して手動で加える。すべての検出ピークを2段階で、手動で調整する。第1に、ピークのベースライン(ピークの底部境界)を水平に調整する。第2に、ピークベースラインの垂直位置を、クロマトグラムのベースラインの垂直位置に調整する。クロマトグラムベースライン値を、被検体不在下のシグナルとして定義する。被検体不在下のシグナルを、12分の保持時間におけるmAuの吸光度として定義する。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)分析は、1.8から0Mの硫酸アンモニウム勾配を使用して、Butyl−Sepharose(R)において実施することができる。HICクロマトグラフィーは、米国特許第7,294,481号明細書(19列、49−55行を参照されたい。)に記載の様式で実施することもできる。米国特許第7,157,557号明細書;Chen J,Tetrault J,Ley A.(2008)J Chromatogr A.1177,272−81;Gagnon P.and Grund E.(1996)BioPharm,9,54−64;およびLu,Y.,Williamson,B.,and Gillespie,R.Recent advancement in application of hydrophobic interaction chromatography for aggregate removal in industrial purification process.Curr.Pharm.Biotechもまた参照されたい。
NaCl溶出を使用するCapto(商標)MMC混合モード精製
この実施例において、上記のように得られたプロテインA溶出液をCapto(商標)MMCクロマトグラフィーに供する。Capto(商標)MMCカラムを、5mMシトレート、pH4.5溶液により平衡化する。5mMシトレートによるプロテインA溶出液の適切な希釈(例えば、プロテインAステップの溶出バッファーに依存して3から6倍希釈)が、カラムへの完全な結合をもたらす。SDS−PAGE分析で示されたように、負荷試料(pH4.2、プロテインA溶出液)は高度に異種性であり、タンパク質はCapto(商標)MMCカラムを貫流しない。結合されたタンパク質をその後、10mM ホスフェート中0.15M NaCl、pH7.5溶液で溶出し、これによりpH(4.5から7.5)およびNaCl濃度(0から0.15M)の同時変化をもたらす。正確に折り畳まれたエタネルセプトを含有する鋭い溶出ピークが、溶出液の分析から観察された。しかし、回収は約40−50%であった。このような溶出ステップの後で、残りの結合タンパク質材料を含有する樹脂を、10mM ホスフェート中0.3M NaClおよび1M アルギニン、pH7.5溶液と接触させ、これにより主に異常に折り畳まれた種およびジスルフィド結合凝集体を含有する溶出がもたらされる。この実施例は、Capto(商標)MMCが、異常に折り畳まれた種を正確に折り畳まれた種から分離するために有効であることを実証している。異常に折り畳まれた種が、より高い塩濃度(0.3M対0.1M)において溶出されるという事実は、これらがより強い静電相互作用をカラムとの間に有することを意味する。加えて、1M アルギニンは、異常に折り畳まれた、およびさらに凝集されたタンパク質の溶出をさらに増加させ、これらのタンパク質が静電相互作用だけでなく、疎水性相互作用によってもCapto(商標)MMCに結合されていること、およびアルギニンが静電相互作用および疎水性相互作用の両方の崩壊を強化することを示している。この実施例において得られた溶出液分画の分析を、図3Aおよび3Bに提示する。
NaClを使用するCapto(商標)MMC混合モード精製
pH7.5に平衡化された樹脂
前述の実施例において、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質溶液を、まずpH4.5においてCAPTO MMC樹脂と接触させた。この実施例において、Capto(商標)MMCカラムをまず、10mM ホスフェート、pH7.5溶液で平衡化させ、その後NaCl、次いでアルギニンにより溶出した場合、実施例1において観察された溶出と同様の溶出が観察される。具体的には、このpH平衡化の間にエタネルセプトは溶出されない。エタネルセプトはpH7.5において負に帯電しており、エタネルセプトのpIは、重度のグリコシル化のため4.9から5.4の範囲なので、この結果は予想外である。従って、pH4.5以下において、エタネルセプトは正に帯電し、負に帯電したCapto(商標)MMCリガンドに結合するはずであるが、疎水性相互作用が結合に寄与可能である。pH7.5において、負に帯電したエタネルセプトは負に帯電したCapto(商標)MMCから解離しなければならないが、これが起こらないことが見出される。これは、負に帯電したカラムとエタネルセプトとの間の静電反発力を圧倒する、エタネルセプトとCapto(商標)MMCとの間の疎水性相互作用により説明することができる。または、Capto(商標)MMCは、タンパク質部分の局所正電荷(タンパク質部分のpIは約8.1である。)に結合することによって、結合タンパク質を保持することができる。
溶出のためにNaCl勾配を使用するCapto(商標)MMC混合モード精製
この実施例において、NaCl濃度勾配を使用する溶出の達成が成功した。具体的には、10mM ホスフェート、pH7.5溶液によりカラムを洗浄後、結合タンパク質は、0から0.5Mの線形塩勾配により溶出された。負荷試料(pH4.2プロテインA溶出液)は、先の場合と同様に極めて異種性であり(正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトの両方を含有する。)、結合タンパク質は、NaCl勾配の漸増イオン強度により溶出される。180分後、勾配は終了し、塩濃度は0.5Mに至り、これによりタンパク質溶出はわずかに強化された。後続の分析により決定されるように、低塩分画はより多くの正確に折り畳まれたエタネルセプトを含有し、高塩分画は低移動度(異常に折り畳まれた、および凝集された)種に富んでいた。最終的に、残りのタンパク質は1M アルギニン、10mM ホスフェート、pH7.5溶液で溶出される。この分画はエタネルセプトを含有せず、完全に低移動度(異常に折り畳まれた/凝集された)種を含有する。樹脂の予備平衡と組み合わせた、異なるプロテインA溶出液についてのCapto(商標)MMCのNaCl勾配溶出の使用は、正確に折り畳まれたエタネルセプトに関してより純粋な溶出液をもたらす。溶出媒体中低NaCl濃度において、溶出された試料は折り畳まれたエタネルセプトに富んでいる。異常に折り畳まれた種は、上記の塩勾配が樹脂に適用されると、溶出液中に徐々に増加する。塩勾配の完了後、樹脂を1M アルギニン溶液と接触させ、これによりもたらされた溶出液分画が、その後のSDS−PAGE分析で明らかなように、異常に折り畳まれた種(異常に折り畳まれただけでなく凝集された種も含む。)を含有することが見出される。低移動度種の幾つかは、SDS−PAGEにおいて不正確に折り畳まれた(しかし凝集されていない)エタネルセプトであると考えられ、異常に折り畳まれた種の一部が、正確に折り畳まれたエタネルセプトホモ二量体よりnative−PAGEにおいて遅い移動度を有する、異常に折り畳まれたエタネルセプトホモ二量体として移動することを示している。この実施例において得られた溶出液分画の分析を、図4A、4Bおよび4Cに提供する。
溶出のためにNa 2 SO 4 勾配を使用するCapto(商標)MMC混合モード精製
この実施例において、混合モード樹脂からの正確に折り畳まれたエタネルセプト溶出のための塩勾配として、NaClの代わりにNa2SO4勾配を使用する。NaClはIECにおいてタンパク質を溶出するために、概して排他的に使用されるが、さまざまな塩が、さまざまな程度の塩析(タンパク質の沈殿)効果を有することが一般に公知である。NaClは、MgCl2などの塩溶塩とNa2SO4などの塩析塩との中間物である。NaClは、エタネルセプトとCapto(商標)MMCとの間の静電相互作用を弱めるために有効であると思われるが、疎水性相互作用を弱めるためには中立であり得る。Na2SO4もまた、静電相互作用を弱めるために有効であるが、Na2SO4は強力な塩析塩として公知なので、疎水性相互作用も強化するはずであると本明細書において考えられた。従って、上記のように低移動度種が疎水性相互作用によりカラムに結合されている場合、これらの溶出は、Na2SO4により抑制することができる。このことを、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含有するタンパク質溶液を、10mM ホスフェート、pH7.5溶液によるCAPTO MMC樹脂カラムのpH平衡化の後で、0から0.4Mの間のNa2SO4勾配により溶出することによって試験する。タンパク質のNa2SO4勾配溶出が完了後、カラムを、1M アルギニン、pH7.5溶液で洗浄する。図5Aは、溶出クロマトグラムを示すが、図5Bは、溶出分画のSDS−PAGEおよびnative−PAGEを示す。正確に折り畳まれたエタネルセプトの比較的鋭いバンドが、低Na2SO4分画において観察され(レーン6および7、図5B)、これらの分画の純度は負荷(レーン1)より高い。より高いNa2SO4濃度により、native−PAGEにおいて低移動度種の溶出がもたらされる(レーン8および9、図5B)。最終のpH7.5における1M アルギニン溶出は、低移動度(異常に折り畳まれた/凝集された)種の溶出をもたらす。この分画中にエタネルセプトがいくらか存在すると思われ(レーン10、図5B)、Na2SO4もまた、天然のエタネルセプトの溶出を抑制可能であることを示している。Na2SO4は、折り畳まれた種を異常に折り畳まれた種から分離するために、少なくとも同等に有効であるが、天然のエタネルセプトの保持を引き起こし得る(レーン10)と結論付けることができる。
NaClおよびpH勾配による溶出を使用するCapto(商標)MMC混合モード精製
先行する実施例において、pH平衡化ステップ、即ち4.5(5mMシトレート)から7.5(10mM ホスフェート)へのpH変化の間にタンパク質の溶出は観察されない。タンパク質負荷量が10mg/1mlカラムを超えて増加される場合は、もはや当てはまらない。pH変化の間のタンパク質溶出の増加は、負荷量の増加において起こるが、この観察の理由は明らかではない。この溶出試料の純度は、負荷試料より高いが、低塩分画よりはるかに低い。例えば、負荷試料(プロテインA溶出液)がわずか51%の正確に折り畳まれたエタネルセプト種を含有する場合、pH平衡化の間に起こる溶出はわずか65%純粋であり、負荷よりは高いが、低塩分画よりはるかに低く、一方、上記の実施例における塩溶出は、分析的HICにより決定した場合、塩勾配の開始時に96%の純度を得ることができる(図6)。図6にプロットしたように、溶出分画の純度は、塩濃度の上昇とともに、96%から20%に徐々に低下し、Capto(商標)MMC(図3B、4B、5B)に関するnative−PAGEの結果と一致する。1M アルギニン分画の(正確に折り畳まれたエタネルセプトに関する)純度は低く(わずか11%)、これもまたnative−PAGE分析と一致した(図4B、レーン9および図5B、レーン10を参照されたい。)。前述の観察を考慮し、本明細書において具体化された発見に関連して、より大きなタンパク質負荷のためのカラムpH平衡の間、任意の正確に折り畳まれた種の潜在的喪失に対抗するために、pH勾配と塩勾配との組み合わせが有益であり得ると仮定する。従って、この実施例5の以下において、本方法の上で定義されたステップ(b)を実施する場合、pH勾配を塩勾配と組み合わせる。この実施例において、少量の適切に折り畳まれたエタネルセプトは、混合モード樹脂カラムの初期のpH平衡の間に不必要に溶出され得る可能性は、pH変化と塩勾配とを組み合わせることによって相殺される。具体的には、結合タンパク質は、pHおよびNaCl濃度両方の同時勾配、即ち、カラムを、NaClを含有する、5mM シトレート、pH4.5溶液から10mM ホスフェート、pH7.5溶液で展開することにより溶出される、これにより、pHおよび塩濃度の両方の同時変化がもたらされ、両方が、結合タンパク質の溶出を引き起こす。これは、低移動度種が、後期分画(即ち、より高いpHおよび塩濃度)および最終1M アルギニン、pH7.5による洗浄で溶出されたという点で、pH平衡が観察された後の塩溶出プロファイルと同様である。例えば、プロテインA溶出液(24mg)は、pH4.5においてカラムに結合され、0.5M NaClを含有する、5mM シトレート、pH4.5から10mM ホスフェート、pH7.5への勾配により溶出される。pH平衡によるこの大量の負荷は、pH移行の間に結合タンパク質の溶出をもたらし得ると仮定される。pHおよび塩勾配の間の溶出プロファイルは、実際に、勾配の開始時に小型のピークを示し、勾配の中間において、主要なピーク(所望の正確に折り畳まれたエタネルセプト)を示す。観察された小型のピークは、pH平衡が最初にpH/塩勾配なしで実施された場合、観察された溶出に対応すると思われる。NaCl/pH勾配溶出が完了後、その後、カラムを、低移動度種に対応する最終の鋭いピークをもたらす、1M アルギニン溶液によるさらなる溶出に供する。早期溶出の低塩および低pH分画はエタネルセプトに富んでおり、一方、高塩および高pH分画は、低移動度種の溶出を示し、pHは4.5から7.5、例えば、塩濃度の中間においてpH4.1−5.1および勾配の終わりにはpH6.6に徐々に上昇した。1M アルギニン、pH7.5溶液による最終洗浄は、native−PAGEにおいて不鮮明なバンドを示し、SDS−PAGEにおいて複数のバンドを示し、10mM ホスフェート、pH7.5洗浄による、pH移行を引き起こす初期カラム平衡化後にもたらされる溶出と、基本的に同一である。プール中の適切に折り畳まれたエタネルセプトの回収は約70%であった。同様の結果が、溶出を、10mM ホスフェート、pH7.5溶液までの同じpH/塩勾配であるが、0.25M NaClを含有するより低い塩において終了して実施した場合に得られる。より低い塩濃度を使用するこの勾配は、収率約50%のエタネルセプトの不完全な溶出をもたらす。先行する実施例のように、大きなピークが1M アルギニン洗浄により観察され、低移動度(異常に折り畳まれた/凝集された)エタネルセプト種に対応する。この実施例において得られた溶出液の分析を、図7Aおよび7Bに提示する。
溶出のために、Na 2 SO 4 /pH勾配を使用するCapto(商標)MMC混合モード精製
上記の実施例5に使用した手順と同様の手順で、pH/塩勾配溶出を、最終溶媒として0.5M Na2SO4溶液を使用して実施したが、これは、折り畳まれた種の、異常に折り畳まれたから種からの分割を改善すると考えられる。プール中のエタネルセプトの回収は約50%であり、回収の低さは、0.5M Na2SO4による疎水性相互作用の強化のためと考えられ、1M アルギニン洗浄において主に溶出される異常に折り畳まれた種の保持だけでなく、エタネルセプトの保持ももたらし、エタネルセプトは、1M アルギニン洗浄においても出現した。従って、Na2SO4の使用は、異常に折り畳まれた種の、正確に折り畳まれた種からの分離(即ち、分割)を強化できるが、さらに、エタネルセプトの回収を低下させもする。この実施例の溶出液の分析のために、図8Aおよび8Bを参照されたい。
Capto(商標)Adhere;pH7.5およびpH4.5におけるNaClによる溶出
この実施例において、正確に、および不正確に折り畳まれたエタネルセプト種の両方を含むプロテインA溶出液を、Capto(商標)Adhereを混合モード樹脂として使用する混合モードクロマトグラフィーに供する。正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプト種を含むタンパク質溶液の結合を、pH7.5において実施した。pH7.5においてエタネルセプトは負に帯電し、従って、正に帯電したCapto(商標)Adhereのリガンドに結合するはずである。pH4.2のプロテインA溶出液を10mM ホスフェート、pH7.5溶液に対して透析した場合、タンパク質の結合は完了するが、塩単独(pH7.5において)による溶出は、無効であることが見出されており、Capto(商標)Adhereは大幅に疎水性であることを示唆している。従って、エタネルセプトのpIは4.9−5.4であるので、より低い溶出pH、おそらくpH4.5において、エタネルセプト種は正に帯電しており、従って、pH4.5において正に帯電しているCapto(商標)Adhere樹脂に反発することが考えられる。この可能性を、エタネルセプト種の、pH4.5におけるCapto(商標)Adhereからの溶出を実施することにより調査する。pH4.2の(pH7.5に対して透析されている)プロテインA溶出液を、10mMホスフェート、pH7.5溶液で平衡化されたCapto(商標)Adhereに結合させる。タンパク質の負荷後、カラムを、同じバッファー中の0および0.2M NaClで洗浄し、これらの洗浄においてタンパク質は溶出していない。
Capto(商標)Adhere;pH4.5における、アルギニンを使用する/使用しない溶出
実施例7の結果を考慮すると、その後、結合タンパク質はアルギニンを含む、および含まない5mM シトレート、pH4.5溶液で溶出される。この実施例において、NaClの代わりにアルギニンを使用して、より多くの疎水性種(アルギニン)が溶出に影響を与える様式を、Capto(商標)Adhereリガンドの疎水性特質を考慮して調査する。低移動度(異常に折り畳まれた/凝集された)種と一緒に正確に折り畳まれたエタネルセプトが、5mM シトレート、pH4.5洗浄溶液(アルギニンを含有しない。)により溶出されることが見出されている。この分画中の低移動度種の溶出は、この分画の測定pHは3.0であったので、突然のpH変化による可能性がある。このステップを、5mM シトレート、pH4.5中0.1および0.2M アルギニン溶液により反復する場合、正確に折り畳まれたエタネルセプトは取るに足らない量だけが観察される。正確に折り畳まれたエタネルセプトの完全な溶出には0.5M アルギニンが必要とされるが、この溶出液は、望ましくない量の低移動度種を含む。従って、pH4.5であっても、低濃度のアルギニンは無効であり、より高いアルギニン濃度においても、折り畳まれた、および異常に折り畳まれた種の間の十分な分割はもたらされないことが見出される。この実施例において得られた溶出液の分析に関して図9を参照されたい。
Capto(商標)Adhere;2種のアルギニン勾配および7.5から4.5のpH勾配による溶出
次いで、pH/アルギニン勾配の組み合わせが、適切に折り畳まれた、および異常に折り畳まれた種の間のより優れた分割をもたらし得ると仮定する。CAPTO MMCに関する先行する実施例に見られるように、5mM シトレートを使用する7.5から4.5へのpH平衡の間のpH降下は、pHの同時勾配を適用することによって防止でき、pHの同時勾配はその後、アルギニン濃度勾配と併用することが可能である(例えば、10mM ホスフェート、pH7.5からアルギニンを含有する5mM シトレート、pH4.5への勾配)。2種のアルギニン勾配を、このpH勾配により調査した。0.25M アルギニンへのアルギニン勾配の場合(図10Aおよび10B)、最終の0.5M アルギニン洗浄により、低移動度種およびエタネルセプトの両方の溶出がもたらされることが見出され、わずか0.25M アルギニンのアルギニン濃度への勾配の使用は、正確に折り畳まれたエタネルセプトの完全な溶出には不十分であることを示している。従って、0−0.5Mのアルギニン勾配(上記の7.5から4.5へのpH勾配と併用)を調査した(図11Aおよび11B)。その後のnative−PAGE分析により、相対的ピーク高さが最終1M アルギニン洗浄より低く、アルギニン勾配が、先行する0.25M アルギニン勾配より大きいことが明らかである。第2のピークは観察されず、分割が損なわれたことを示唆している。pH勾配は、溶出分画のpHが7.5から6.0、5.7、5.2および最終的に4.5に徐々に低下するものである。0.5M アルギニンおよびpH勾配に関しては、主要な溶出ピークの2つの分画が正確に折り畳まれたエタネルセプトに富んでおり、タンパク質の回収は約65%である。勾配の後期は、エタネルセプトを含有する不鮮明なバンドを示した。従って、0.5M アルギニン勾配と一緒にpH勾配が、結合されたエタネルセプトの溶出を強化したが、正確に折り畳まれたエタネルセプトは、アルギニン/pH勾配の後期に異常に折り畳まれた種と共溶出された。最終1M アルギニン洗浄は、不鮮明なバンドだけを示した。
Capto(商標)Adhere;アルギニン勾配および7.5から4.5へのpH勾配による溶出
アルギニン勾配による溶出を、pH7.5においてCapto(商標)MMCプールを使用して実施する。結合タンパク質を、10mM ホスフェート、pH7.5から0.6M アルギニン、10mM ホスフェート、pH7.5への勾配により溶出した。SDS−PAGEおよびnative−PAGEプロファイルにより、中間の分画(0.2−0.4M アルギニン)において正確に折り畳まれたエタネルセプトの溶出が示される(図13)。両方のゲルにおいて見られるように、低移動度種が後期分画および最終1M アルギニンpH7.0洗浄において観察される。比較のため、pH7.5の勾配溶出において0.6M アルギニンを0.5M NaClと置き換えた場合、エタネルセプトの溶出は大幅に減少した。図14は、0.5M NaClへの塩勾配の間のpH7.5における溶出プロファイルを示す。勾配の間に2つのピークが観察され、主にエタネルセプトを含有したが、収率は低かった。大量のエタネルセプトが、最終1M アルギニン洗浄において溶出し、0.5M NaClの塩濃度とpH7.5との併用は、正確に折り畳まれたエタネルセプトの、異常に折り畳まれた/凝集された材料からの分離には最適ではなかったことが示された。上記のように、1M アルギニンは、正確に折り畳まれたエタネルセプトの溶出に非常に有効であるが、低移動度種の存在を伴った。塩溶出勾配を改変して、約0から約1M NaCalの勾配に適用して、pH8において溶出を実施することは、実施例12に示すように、このような勾配の早期溶出産物において正確に折り畳まれたエタネルセプトを、高い低移動度(異常に折り畳まれた/凝集された)種に対して非常に良く分割することに留意されたい。Capto Adhereに結合するエタネルセプトの疎水性基寄与は、pH8.0において減少し、NaCl単独による正確に折り畳まれたエタネルセプトの有効な溶出をもたらすと思われる。
Capto(商標)Adhere;pH7.5におけるアルギニン/Nacl勾配による溶出
この実施例において、NaCl/アルギニン勾配の組み合わせをpH7.5において調査した。2種のこのような勾配を調査した:溶出媒体に関して調査される第1の勾配は、最終NaClおよびアルギニン濃度がそれぞれ0.4および0.2である。最終NaClおよびアルギニン濃度が、それぞれ、0.25M NaClおよび0.5M アルギニンである第2の勾配を、その後調査する。両方の場合において、勾配は、10mM ホスフェート、pH7.5溶液に適用される。第1の勾配は疎水性相互作用を低下させるためにはまだ弱く、従って、エタネルセプトを溶出できなかった。最終1M アルギニン洗浄におけるより小さいピークにより示されるように、第2の勾配はより有効であった。特に、SDS−PAGEにより確認されたように、エタネルセプトの溶出は、0.25M NaCl、0.5M アルギニンまでの第2の被験勾配の全体を通して起こり、高分子量(低移動度/異常に折り畳まれた/凝集された)種は含まれない。この高分子量種はその後、最終1M アルギニン洗浄において溶出される。native−PAGEにおいて、大部分の天然の正確に折り畳まれたエタネルセプトが、中間分画に溶出されたことが示される。不鮮明なバンドが、1M アルギニン洗浄により観察された。従って、アルギニンおよびNaClの組み合わせが、エタネルセプトの溶出および異常に折り畳まれた種に対応する低移動度および高分子量の種の分離をもたらし得ることが明らかである。Capto(商標)MMCプール(60−80%純粋)に関するCapto(商標)Adhere分画のHIC分析は、勾配の間に溶出された分画(尾部分画を除き)が、通常95%を超える純度を得ることを示している。この実施例において得られた溶出液の分析を、図15Aおよび15Bに提示する。
Capto(商標)AdhereおよびCapto(商標)MMC
この実施例において、正確に折り畳まれた、および異常に折り畳まれたエタネルセプトを含むプロテインA溶出液を、上記のプロテインA方法と同様の方法により得た。次いで、溶出液をCapto(商標)MMCeカラムに適用し、産物プールをその後Capto(商標)ADHEREカラムに適用して、定量的および定性的両方において優れたエタネルセプト産物を提供した。
当分野において公知の様式で生産バイオリアクターへの植菌に十分な数の細胞を産生するために必要な細胞増殖を、エタネルセプト融合タンパク質を発現するCHO細胞のクローンを使用して実施する。この発現工程の産物(回収細胞培養流体)は、正確に折り畳まれたエタネルセプトならびに不正確に折り畳まれた、および/または凝集されたエタネルセプトを追加の不純物と併せた混合物をもたらす。このようなタンパク質混合を含む回収細胞培養流体を、洗浄剤ウイルス不活性化に供する。
アフィニティークロマトグラフィー。アフィニティークロマトグラフィーを、上記のステップ1において得られた回収細胞培養液に対して、従来のプロテインAアフィニティーカラムを使用して周知の様式で実施する。産物の回収はおよそ85%である。得られた産物は、正確に折り畳まれたエタネルセプト、不正確に折り畳まれたエタネルセプトならびに/または正確に、および/もしくは不正確に折り畳まれたエタネルセプトの凝集体またはタンパク質断片を含む複合タンパク質混合物である。このプロテインAアフィニティーカラム精製ステップから得られた産物をpH3.5に調整し、次いで、ウイルス不活性化ステップに供した。ウイルス不活性化後、産物をpH5.5に調整し、その後さらに公知の様式で市販のカプセルフィルターを使用して清澄化する。
混合モードカチオン交換クロマトグラフィー。31.8L(直径45cm×ベッド高さ20cm)の充填済みベッドGE Healthcare Capto MMCクロマトグラフィーカラムを使用して、上記のステップ2において得られた産物を精製する。使用前に、カラムを、2CVの25mM アセテート pH5.5で平衡化し、2CVの0.1N NaOH、1M NaClで衛生化し、2CVの25mMアセテート、0.7M NaCl、pH5.5で中和する。次いでこのカラムを、8−10CVの25mM アセテート pH5.5で、流出液がpH5.5および3.5mS/cmになるまで平衡化する。上記のステップ2によるプロテインAプールを、≦6mS/cmにWFIで希釈し、各サイクルに関してカラム負荷15g/L媒体まで適用する。カラムを200cm/時の線速度で操作して、滞留時間を6分にする。負荷後、カラムを、2CVの25mM アセテート pH5.5で洗浄する。産物をその後、8.5CV、15%から85%の勾配の25mM アセテート pH5.5から25mM アセテート、0.7M NaCl、pH5.5で溶出する。産物の収集を、0.15OD(A280、路程1.0cm)において開始して、収集を最大ピークの50%において終了する。溶出液体積はおよそ5CVである。残留産物および混入物は、2CVの10mM Tris 1M NaCl、pH8.0でカラムから取り除き、廃棄する。混合モードカラムにより得られた産物は、Millipore Opticap XL10、0.22μm Duraporeカプセルフィルター(0.69m2)を使用してろ過する。このステップにより得られた産物は、ステップ2で得られたプロテインA材料の約70%の回収を表す。
混合モードアニオン交換クロマトグラフィー。27.0L(直径45cm×ベッド高さ17cm)の充填済みベッドGE Healthcare Capto Adhereクロマトグラフィーカラムを使用して、上記のステップ3Aで得られた産物をさらに精製する。使用前に、カラムを、2CVの25mM Tris、pH8.0で平衡化し、2CVの0.1N NaOH、1M NaClで衛生化し、2CVの25mM Tris、pH8.0で中和および平衡化する。産物の負荷前に、カラムを、3CVの10mM Tris、pH8.0で平衡化する。上記のステップ3AによるCapto MMCプールを、約0.045kgの1M Tris、pH8.3/kgプールでpH8.1に調整する。上のステップ3Aによる産物を、WFIによりインラインで1:3.8に希釈し、伝導率を12.0mS/cmおよびpH8.0に調整した。得られた材料を、その後15g/L媒体までのカラム負荷に適用する。カラムを、線速度170cm/時で操作して、滞留時間を6分にする。負荷後、カラムを、2CVの25mM Tris、pH8.0で洗浄する。次いで、産物を、25mM Tris、pH8.0の10CV勾配(20%から90%)から10mM Tris、1M NaCl、pH8.0で溶出する。産物の収集を0.15OD(A280、路程1.0cm)において開始し、収集をピーク最大値の25%で終了する。溶出液体積は4−6CVである。溶出産物を、市販のカプセルフィルターを使用してろ過し、その後、公知の様式でウイルスろ過およびタンジェンシャルフローろ過ステップに供する。ステップ3B(最終のウイルスろ過およびタンジェンシャルフローろ過ステップを含む。)による全産物回収は、およそ68%であった。ろ過ステップ前に測定された産物回収は約75%であった。このステップから溶出分画において得られたHICデータの概略図を、図12に表す。
この実施例において得られた最終ろ過産物は、HICにより決定した場合、約90重量%を超える正確に折り畳まれたエタネルセプト;HICにより決定した場合、5重量%未満の不正確に折り畳まれたエタネルセプト種;HIC分析により約3重量%未満のクリップされた材料(これらのTNFR部分が切断されている、エタネルセプトの断片であると考えられる。)およびサイズ排除クロマトグラフィーにより決定して95重量%を超える正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量を有することが見出されている。
さらなる代表的実施形態
(優先出願USSN61/699,552に開示)
A.正確に折り畳まれたタンパク質を、不正確に折り畳まれたタンパク質から分離するための混合モードクロマトグラフィー方法であって、
(a)所与のタンパク質の正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれた立体構造両方を含む第1のタンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させるステップ;
(b)正確に折り畳まれたタンパク質を混合モード樹脂から溶出し、第1のタンパク質混合物より高い割合の正確に折り畳まれたタンパク質を含む第2のタンパク質混合物を得るステップ、
を含む方法。
(1)好ましくはプロテインAクロマトグラフィー精製ステップを含む、1以上の精製ステップであって、該ステップがエタネルセプト系タンパク質を含有する回収細胞培養流体を精製するために用いられ、該精製ステップが、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから明確に分離しない、1以上の精製ステップ、
(2)実施形態1に記載の混合モードクロマトグラフィーステップ(a)および(b);ならびに
(3)単に分析目的で実施されるSEC、HICまたは他の分析的クロマトグラフィーステップ、
以外の、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するための如何なるクロマトグラフィー分離または精製ステップも実施せずに、または実施の必要なく得られる、実施形態AからOのいずれかの方法。
(a)疎水性部分およびイオン交換部分を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂を、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトが、混合モードクロマトグラフィー樹脂に固定、結合または捕捉されるように、正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物を含有する溶液と接触させるステップ;ならびに
(b)該混合モード樹脂を、エタネルセプトタンパク質を混合モードクロマトグラフィー樹脂から溶出できる溶液と接触させ、溶出液を得、溶出液中の正確に折り畳まれたエタネルセプトの、不正確に折り畳まれたエタネルセプトに対する量の比が、ステップ(a)において樹脂に導入されたタンパク質混合物の比より大きいステップ、
を含む方法。
(A)不正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ(b)において得られた溶出液の約5重量%未満を構成し、正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ(b)において得られた溶出液の約90重量%より多くを構成し、ならびに正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量が、ステップ(b)において得られた溶出液の少なくとも約95重量%を構成する、または
(B)ステップ(b)において得られた溶出液もしくはこれらの一部が、正確に折り畳まれたエタネルセプトを含み、不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含まない、もしくは基本的に含まない、実施形態AからTの方法。
第1の混合モード分離(分離番号1)を、ステップ(a)および(b)を実施することによって実行し、次に、
第2の混合モード分離(分離番号2)を、ステップ(a)および(b)を再度実施することにより実行し、
分離番号1のステップ(b)において得られた溶出液を、分離番号2のステップ(a)において、タンパク質混合物を含む溶液として使用する、
方法を2回以上実行する、実施形態AからBBのいずれかの方法。
分離番号1がCAPTO MMCを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号2がCAPTO ADHEREを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する;
分離番号1がCAPTO ADHEREを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号2がCAPTO MMCを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する;
分離番号1がCAPTO MMCを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号2がCAPTO MMCを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する;または
分離番号1がCAPTO ADHEREを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号2がCAPTO ADHEREを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する;
から選択される方法で実施される、実施形態DDの方法。
(i)不正確に折り畳まれたエタネルセプトが、タンパク質混合物の約10重量%未満、好ましくは約8重量%未満、最も好ましくは約5重量%未満を構成し;
(ii)正確に折り畳まれたエタネルセプトが、タンパク質混合物の90重量%より多く、好ましくは約92重量%より多く、好ましくは約95重量%より多くを構成し、
(iii)正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの合計量(ただし、これらの凝集体は含まない。)が、タンパク質混合物の少なくとも95重量%、好ましくは少なくとも98重量%を構成し、
該製剤が、対象への投与に適切な製剤をもたらす医薬として許容される不活性成分、賦形剤またはキャリアをさらに含む、
医薬として許容される製剤。
(1)エタネルセプトを哺乳動物発現系において発現させ、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトの両方を含むエタネルセプト含有タンパク質混合物を含有する回収細胞培養流体を得るステップ;
(2)ステップ1において得られた回収細胞培養流体を精製工程に供し、これによってステップ(1)において生産された回収細胞培養流体中に存在する望ましくない不純物の量が減少した、または実質的に不純物を含まないエタネルセプト含有タンパク質混合物を得るステップ;
(3)ステップ(2)において得られたエタネルセプト含有タンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性相互作用部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂と、混合物中に含有されるタンパク質を樹脂に固定するために1回以上接触させるステップ;ならびに
(4)ステップ3によりこの上に結合されたタンパク質を有する樹脂と、正確に折り畳まれたエタネルセプトを混合モード樹脂から溶出する溶液とを接触させ、ステップ3において樹脂に導入されたエタネルセプト含有混合物よりも、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトに対して高い割合で有する、エタネルセプト含有タンパク質混合物を含む溶出液を得るステップ;
を含み、ここで;
(i)ステップ2の精製により得られたエタネルセプト含有タンパク質混合物中に存在するタンパク質の量が、ステップ1において得られた回収細胞培養流体中に存在するエタネルセプト系タンパク質混合物の量の少なくとも約80重量%であり;
(ii)ステップ4において溶出されたタンパク質混合物中に存在する正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトタンパク質の総量が、ステップ2から得られたタンパク質混合物中に存在するこれらの量の少なくとも約60重量%であり;
(iii)ステップ4の溶出液中に存在する正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、ステップ1において得られた回収細胞培養流体中に存在するエタネルセプト含有タンパク質混合物の量の少なくとも約30重量%、好ましくは少なくとも約35重量%であり、ならびに
(iv)前記正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ4において得られた溶出液の少なくとも約90重量%、好ましくは少なくとも約95重量%を構成する、
方法。
ステップ(5):ステップ4の溶出液中に得られたタンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性相互作用部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂と接触させ、混合物中に含有されるタンパク質を樹脂に固定するステップ、ならびに次に、
ステップ(6):前記樹脂を、正確に折り畳まれたエタネルセプトをそれから溶出する溶液と接触させ、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトに対して高い割合で有するタンパク質混合物を含む溶出液を得るステップ、を含み、
前記追加ステップ5および6に使用される混合モード樹脂がステップ3および4に使用される混合モード樹脂と同じである、または異なる、
実施形態JJまたはKKの方法。
(1)場合により、好ましくはプロテインAクロマトグラフィー精製ステップを含む、1以上の精製ステップであって、該ステップがエタネルセプト系タンパク質を含有する回収細胞培養流体を精製するために用いられ、該精製ステップが、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離しない、1以上の精製ステップ、
(2)実施形態A(または実施形態LLによるステップ3、4、5および6)に列挙した混合モードクロマトグラフィーステップ(3)および(4)の前記1以上の事象;ならびに
(3)場合により、単に分析目的で実施される1以上のSEC、HICまたは他のクロマトグラフィーステップ、
以外の、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するための如何なるクロマトグラフィー分離または精製ステップも実施せずに得られる、実施形態A−PPのいずれかの方法。
Claims (10)
- 正確に折り畳まれたエタネルセプトを、不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するための混合モードクロマトグラフィー方法であって、
(a)エタネルセプトの正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれた両方の立体構造を含む第1のエタネルセプト含有タンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させるステップであって、混合モードクロマトグラフィー樹脂が、Capto(商標)MMC混合モードクロマトグラフィー樹脂またはCapto(商標)Adhere混合モードクロマトグラフィー樹脂であるステップ;
(b)正確に折り畳まれたエタネルセプトを、混合モード樹脂を塩溶液と接触させることにより混合モード樹脂から溶出し、第1のエタネルセプト混合物より高い割合の正確に折り畳まれたエタネルセプトを含む第2のエタネルセプト含有タンパク質混合物を得るステップであって、塩溶液が塩化ナトリウム又は硫酸ナトリウムを含み、塩溶液が段階的にまたは0から1Mの線形濃度勾配にて適用されるステップ
を含む方法であって、
不正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ(b)において得られた溶出液の10重量%未満を構成し、正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ(b)において得られた溶出液の90重量%より多くを構成し、ならびに正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量が、ステップ(b)において得られた溶出液の少なくとも95重量%を構成し;
ステップ(a)およびステップ(b)が4.5から8.5の間のpHにおいて実施され;および
単に分析目的で実施する場合を除き、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップの使用を排除する、方法。 - 塩溶液が、アルギニンをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 混合モードクロマトグラフィー樹脂が、Capto(商標)MMC混合モードクロマトグラフィー樹脂である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)の間に、ステップ(b)において樹脂に接触させる塩溶液のpHが変化する、請求項1に記載の方法。
- 正確に折り畳まれたタンパク質の量が、ステップ(a)において樹脂に導入されたタンパク質混合物中に存在するタンパク質の量の少なくとも70重量%である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、
ステップ(b)の溶出液中に存在するタンパク質の量が、A280におけるUV吸光度により決定され、ステップ(b)の溶出液中の正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより決定され、ならびにステップ(b)の溶出液中に存在する、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量が、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定される、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
第1の混合モード分離(分離番号1)を、ステップ(a)および(b)を実施することによって実行し、次に、
第2の混合モード分離(分離番号2)を、ステップ(a)および(b)を再度実施することにより実行し、
分離番号1のステップ(b)において得られた溶出液を、分離番号2のステップ(a)において、タンパク質混合物を含有する溶液として使用する
方法を2回以上実行する、方法。 - 分離番号1において使用される混合モード樹脂が、分離番号2において使用される混合モード樹脂と同じである、または異なる、請求項7に記載の方法。
- 請求項8に記載の方法であって、
分離番号1および分離番号2が、下記の組み合わせ:
分離番号1がカチオン交換体を含む混合モードクロマトグラフィー樹脂を混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号2がアニオン交換体を含む混合モードクロマトグラフィー樹脂を混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する;
分離番号1がアニオン交換樹脂を含む混合モードクロマトグラフィー樹脂を混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、分離番号2がCAPTO MMCを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する;
分離番号1がCAPTO MMCを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号2がCAPTO MMCを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する;または
分離番号1がCAPTO ADHEREを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号2がCAPTO ADHEREを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する;
から選択される方法で実施される、方法。 - 請求項9に記載の方法であって、
分離番号1および分離番号2が、下記:分離番号1がCAPTO MMCを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、分離番号2がCAPTO ADHEREを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する;方法においてで実施される、方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2021025939A JP2021100929A (ja) | 2012-09-11 | 2021-02-22 | 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261699552P | 2012-09-11 | 2012-09-11 | |
US61/699,552 | 2012-09-11 | ||
JP2015531311A JP2015533797A (ja) | 2012-09-11 | 2013-09-10 | 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015531311A Division JP2015533797A (ja) | 2012-09-11 | 2013-09-10 | 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021025939A Division JP2021100929A (ja) | 2012-09-11 | 2021-02-22 | 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019038817A JP2019038817A (ja) | 2019-03-14 |
JP6913066B2 true JP6913066B2 (ja) | 2021-08-04 |
Family
ID=50233493
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015531311A Pending JP2015533797A (ja) | 2012-09-11 | 2013-09-10 | 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト |
JP2018192476A Active JP6913066B2 (ja) | 2012-09-11 | 2018-10-11 | 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト |
JP2021025939A Pending JP2021100929A (ja) | 2012-09-11 | 2021-02-22 | 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015531311A Pending JP2015533797A (ja) | 2012-09-11 | 2013-09-10 | 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021025939A Pending JP2021100929A (ja) | 2012-09-11 | 2021-02-22 | 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト |
Country Status (32)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US20140072560A1 (ja) |
EP (1) | EP2895188B1 (ja) |
JP (3) | JP2015533797A (ja) |
KR (2) | KR102250937B1 (ja) |
CN (2) | CN104902914B (ja) |
AR (1) | AR092532A1 (ja) |
AU (2) | AU2013315750B9 (ja) |
BR (1) | BR112015005161A2 (ja) |
CA (1) | CA2882551A1 (ja) |
CL (1) | CL2015000572A1 (ja) |
CO (1) | CO7400876A2 (ja) |
CY (1) | CY1120062T1 (ja) |
DK (1) | DK2895188T3 (ja) |
DO (1) | DOP2015000055A (ja) |
EA (1) | EA031324B1 (ja) |
EC (1) | ECSP15014138A (ja) |
ES (1) | ES2657377T3 (ja) |
HR (1) | HRP20180182T1 (ja) |
HU (1) | HUE036524T2 (ja) |
IL (2) | IL237311B (ja) |
IN (1) | IN2015KN00452A (ja) |
LT (1) | LT2895188T (ja) |
MX (2) | MX360044B (ja) |
NO (1) | NO2972131T3 (ja) |
PE (2) | PE20150996A1 (ja) |
PL (1) | PL2895188T3 (ja) |
PT (1) | PT2895188T (ja) |
RS (1) | RS57013B1 (ja) |
SG (1) | SG11201501460RA (ja) |
SI (1) | SI2895188T1 (ja) |
TW (2) | TWI716649B (ja) |
WO (1) | WO2014043103A1 (ja) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20080031684A (ko) | 2005-06-14 | 2008-04-10 | 암젠 인코포레이티드 | 자가 - 완충성 단백질 제형 |
KR20140079491A (ko) | 2011-10-18 | 2014-06-26 | 코히러스 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 | 당과 폴리올과의 배합물로 안정화된 에타너셉트 제형 |
US10493151B2 (en) | 2011-10-18 | 2019-12-03 | Coherus Biosciences, Inc. | Etanercept formulations stabilized with sodium chloride |
EP2895188B1 (en) * | 2012-09-11 | 2017-11-15 | Coherus Biosciences, Inc. | Correctly folded etanercept in high purity and excellent yield |
CN106536565A (zh) * | 2014-06-13 | 2017-03-22 | 鲁宾有限公司 | 一种用于纯化TNFR‑Fc融合蛋白的方法 |
ES2733298T3 (es) | 2014-07-18 | 2019-11-28 | Sandoz Ag | Cuantificación de TNFR2:Fc plegado erróneamente |
BR112017014224A2 (pt) * | 2014-12-31 | 2018-03-06 | Lg Chem, Ltd. | método para a preparação de proteína de fusão fc-tnfr que contém teor alvo de impurezas |
EP3268042A4 (en) | 2015-03-13 | 2018-08-01 | Samsung Bioepis Co., Ltd. | Anti-tnf-alpha polypeptide composition and use thereof |
CN108350027A (zh) * | 2015-11-18 | 2018-07-31 | 默克专利股份公司 | 用于改进的蛋白质分离的相反的pH-盐梯度 |
BR112018009881A2 (pt) * | 2015-11-18 | 2018-11-13 | Merck Patent Gmbh | separação de proteína aperfeiçoada em cromatografia de troca iônica |
EP3472177B1 (en) * | 2016-06-17 | 2024-08-14 | F. Hoffmann-La Roche AG | Purification of multispecific antibodies |
BR112019007858A2 (pt) * | 2016-10-21 | 2019-07-02 | Amgen Inc | formulações farmacêuticas e métodos para produzir as mesmas |
JP2020511516A (ja) * | 2017-03-24 | 2020-04-16 | カウンスィル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチCouncil Of Scientific & Industrial Research | 組換え抗体断片の精製方法 |
CA3042126A1 (en) | 2018-05-03 | 2019-11-03 | Michael A. Portman | Methods of treating kawasaki disease |
CN112876567A (zh) * | 2019-11-29 | 2021-06-01 | 广东菲鹏制药股份有限公司 | Fc融合蛋白及其纯化方法 |
WO2022195505A1 (en) * | 2021-03-16 | 2022-09-22 | Kashiv Biosciences, Llc | Novel formulation of fusion protein |
WO2022234412A1 (en) * | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Lupin Limited | A process for purification of fc-fusion proteins |
Family Cites Families (67)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5395760A (en) | 1989-09-05 | 1995-03-07 | Immunex Corporation | DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors |
US5605690A (en) | 1989-09-05 | 1997-02-25 | Immunex Corporation | Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor |
EP0939121B2 (de) | 1989-09-12 | 2007-12-26 | AHP Manufacturing B.V. | TFN-bindende Proteine |
IT1240314B (it) | 1989-09-28 | 1993-12-07 | Immunobiology Research Institutes, Inc. | Formulazioni acquose stabilizzate di piccoli peptidi. |
DE59109269D1 (de) | 1990-06-28 | 2005-12-15 | Hoechst Ag | Fusionsproteine mit Immunglobulinanteilen, ihre Herstellung und Verwendung |
EP0620739A4 (en) | 1992-09-15 | 1997-01-15 | Immunex Corp | Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists. |
EP0852951A1 (de) | 1996-11-19 | 1998-07-15 | Roche Diagnostics GmbH | Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von mono- oder polyklonalen Antikörpern |
US7294481B1 (en) | 1999-01-05 | 2007-11-13 | Immunex Corporation | Method for producing recombinant proteins |
US20010021380A1 (en) | 1999-04-19 | 2001-09-13 | Pluenneke John D. | Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders |
WO2000062790A2 (en) | 1999-04-19 | 2000-10-26 | Immunex Corporation | Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders |
US20040220103A1 (en) | 1999-04-19 | 2004-11-04 | Immunex Corporation | Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders |
BR0108193A (pt) | 2000-02-10 | 2003-02-25 | Wyeth Corp | Processo para tratamento ou inibição de dano celular ou morte celular |
JP5485489B2 (ja) | 2000-08-11 | 2014-05-07 | 中外製薬株式会社 | 抗体含有安定化製剤 |
PL374045A1 (en) | 2001-02-23 | 2005-09-19 | Immunex Corporation | Efficient recovery of correctly refolded proteins |
ES2311094T3 (es) | 2002-02-27 | 2009-02-01 | Immunex Corporation | Composicion estabilizada de tnfr-fc que comprende arginina. |
ATE464043T1 (de) * | 2002-08-22 | 2010-04-15 | Vasopharm Biotech Gmbh | Pharmazeutische zusammensetzung enthaltend l- arginin |
US20040115263A1 (en) | 2002-08-26 | 2004-06-17 | Robertson David W. | Use of bupropion for treating restless legs syndrome |
PL213501B1 (pl) | 2003-02-28 | 2013-03-29 | Ares Trading Sa | Wodny preparat bialka wiazacego czynnik martwicy nowotworu i sposób jego wytwarzania |
EP1607103A1 (en) | 2003-03-20 | 2005-12-21 | Eisai Co., Ltd. | Concomitant drug as therapeutic agent for inflammatory bowel disease |
WO2005012353A1 (en) | 2003-08-01 | 2005-02-10 | Amgen Inc. | Crystalline tumor necrosis factor receptor 2 polypeptides |
AP2287A (en) | 2003-10-14 | 2011-10-31 | Intermune Inc | Macrocyclic carboxylic acids and acylsulfonamides as inhibitors of HCV replication. |
US7750129B2 (en) * | 2004-02-27 | 2010-07-06 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Process for the purification of antibodies |
JP5554466B2 (ja) | 2004-03-01 | 2014-07-23 | 味の素株式会社 | 抗ヒトTNF−α抗体活性低下抑制剤 |
JP2007525984A (ja) | 2004-03-05 | 2007-09-13 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. | 連続的灌流および交互接線流による細胞培養の方法 |
US20070196364A1 (en) | 2004-07-27 | 2007-08-23 | Human Genome Sciences, Inc. | Pharmaceutical Formulation and Process |
US7300773B2 (en) | 2004-08-27 | 2007-11-27 | Wyeth Research Ireland Limited | Production of TNFR-Ig |
EP1885388B1 (en) | 2005-05-10 | 2013-09-11 | Biogen Idec MA Inc. | Treating and evaluating inflammatory disorders |
CA2610987C (en) | 2005-06-10 | 2013-09-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof |
PL1962886T6 (pl) | 2005-12-20 | 2023-03-13 | Bristol-Myers Squibb Company | Stabilne formulacje białkowe |
AU2006330858A1 (en) | 2005-12-21 | 2007-07-05 | Wyeth | Protein formulations with reduced viscosity and uses thereof |
KR20080098504A (ko) | 2006-02-03 | 2008-11-10 | 메디뮨 엘엘씨 | 단백질 제제 |
KR101516823B1 (ko) | 2006-03-17 | 2015-05-07 | 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 | 안정화된 폴리펩티드 조성물 |
AU2007240732B2 (en) | 2006-04-21 | 2013-07-04 | Amgen, Inc. | Buffering agents for biopharmaceutical formulations |
TW200831129A (en) | 2006-10-06 | 2008-08-01 | Amgen Inc | Stable formulations |
CL2007002881A1 (es) | 2006-10-20 | 2008-05-09 | Amgen Inc | Formulacion estable que comprende un tampon con un ph de aproximadamente 4 y menos de 6, un cation divalente de 5-150 mm, un excipiente que comprende un azucar o un poliol, y un anticuerpo anti-receptor del factor de crecimiento epidermico; y metodo |
JP5401319B2 (ja) | 2006-11-03 | 2014-01-29 | ワイス・エルエルシー | 細胞培養における解糖阻害物質 |
EP2129401B8 (en) | 2006-12-21 | 2020-01-15 | Amgen Inc. | Stable buffered formulations containing polypeptides |
US7691980B2 (en) | 2007-01-09 | 2010-04-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers |
US9012180B2 (en) | 2007-03-02 | 2015-04-21 | Wyeth Llc | Use of copper and glutamate in cell culture for production of polypeptides |
EP2014760A1 (en) | 2007-06-13 | 2009-01-14 | CMC Biopharmaceuticals A/S | A method for producing a biopolymer (e.g. polypeptide) in a continuous fermentation process |
CN101778640A (zh) | 2007-06-14 | 2010-07-14 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 抗体制剂 |
CA2707483A1 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-11 | Wolfgang Fraunhofer | Protein formulations and methods of making same |
JP2011514895A (ja) * | 2008-02-29 | 2011-05-12 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | 精製免疫グロブリン融合タンパク質およびその精製方法 |
WO2009146755A1 (en) * | 2008-06-05 | 2009-12-10 | Affibody Ab | Polypeptide |
WO2011015926A1 (en) * | 2009-08-03 | 2011-02-10 | Avesthagen Limited | A process of fermentation, purification and production of recombinant soluble tumour necrosis factor alfa receptor (tnfr) - human igg fc fusion protein |
WO2011017514A1 (en) | 2009-08-07 | 2011-02-10 | Millipore Corporation | Methods for purifying a target protein from one or more impurities in a sample |
KR20180114966A (ko) | 2009-08-11 | 2018-10-19 | 제넨테크, 인크. | 글루타민-비함유 세포 배양 배지에서의 단백질의 생성 |
US20120208986A1 (en) * | 2009-10-20 | 2012-08-16 | Wenger Marc D | Use of mixed mode chromatography for the capture and purification of basic antibody products |
EP2516467A2 (en) | 2009-12-23 | 2012-10-31 | Emergent Product Development Seattle, LLC | Compositions comprising tnf-alpha and il-6 antagonists and methods of use thereof |
US9428727B2 (en) | 2010-04-26 | 2016-08-30 | Novartis Ag | Cell culture medium |
CN102946858B (zh) * | 2010-05-10 | 2015-09-30 | 英塔斯制药有限公司 | 含有免疫球蛋白Fc的多肽的液体制剂 |
US20130209465A1 (en) | 2010-07-30 | 2013-08-15 | Arecor Ltd. | Stabilized Aqueous Antibody Compositions |
CA2807607A1 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-23 | Wyeth Llc | Cell culture of growth factor-free adapted cells |
CN103097516B (zh) | 2010-08-31 | 2015-09-09 | 菲仕兰品牌公司 | 真核细胞培养基 |
WO2012051147A1 (en) * | 2010-10-11 | 2012-04-19 | Abbott Laboratories | Processes for purification of proteins |
RU2614257C2 (ru) | 2011-04-20 | 2017-03-24 | Сандоз Аг | СТАБИЛЬНЫЕ ЖИДКИЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ СЛИТОГО БЕЛКА TNFR:Fc |
UY34105A (es) | 2011-06-03 | 2012-07-31 | Lg Life Sciences Ltd | Formulación líquida estable de etanercept |
CN103827292B (zh) | 2011-07-01 | 2018-01-26 | 安姆根有限公司 | 哺乳动物细胞培养 |
AU2012279205B2 (en) * | 2011-07-01 | 2017-08-31 | Biogen Ma Inc. | Arginine - free TNFR : Fc- fusion polypeptide compositions and methods of use |
US9556258B2 (en) * | 2011-07-08 | 2017-01-31 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Purification of fusion proteins |
JP6223338B2 (ja) * | 2011-08-17 | 2017-11-01 | アレス トレーディング ソシエテ アノニム | 活性型TNFR−Fc融合タンパク質を製造する方法 |
US10493151B2 (en) * | 2011-10-18 | 2019-12-03 | Coherus Biosciences, Inc. | Etanercept formulations stabilized with sodium chloride |
KR20140079491A (ko) * | 2011-10-18 | 2014-06-26 | 코히러스 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 | 당과 폴리올과의 배합물로 안정화된 에타너셉트 제형 |
AU2013290289B2 (en) * | 2012-07-09 | 2018-03-29 | Coherus Biosciences, Inc. | Etanercept formulations exhibiting marked reduction in sub-visible particles |
EP2895188B1 (en) * | 2012-09-11 | 2017-11-15 | Coherus Biosciences, Inc. | Correctly folded etanercept in high purity and excellent yield |
EP3879334B1 (en) * | 2014-07-31 | 2023-11-29 | Mtt Innovation Incorporated | Numerical approaches for free-form lensing: area parameterization free-form lensing |
US20160108634A1 (en) * | 2014-10-16 | 2016-04-21 | Ronald Uphold | Pool Cover Hanger Device |
-
2013
- 2013-09-10 EP EP13838016.7A patent/EP2895188B1/en active Active
- 2013-09-10 KR KR1020207019733A patent/KR102250937B1/ko active IP Right Grant
- 2013-09-10 SG SG11201501460RA patent/SG11201501460RA/en unknown
- 2013-09-10 CA CA2882551A patent/CA2882551A1/en active Pending
- 2013-09-10 DK DK13838016.7T patent/DK2895188T3/en active
- 2013-09-10 PL PL13838016T patent/PL2895188T3/pl unknown
- 2013-09-10 WO PCT/US2013/058994 patent/WO2014043103A1/en active Application Filing
- 2013-09-10 CN CN201380058650.5A patent/CN104902914B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2013-09-10 PE PE2015000316A patent/PE20150996A1/es unknown
- 2013-09-10 KR KR1020157009386A patent/KR102133699B1/ko active IP Right Grant
- 2013-09-10 EA EA201590542A patent/EA031324B1/ru unknown
- 2013-09-10 AU AU2013315750A patent/AU2013315750B9/en not_active Ceased
- 2013-09-10 CN CN201811633164.2A patent/CN110051823A/zh active Pending
- 2013-09-10 IN IN452KON2015 patent/IN2015KN00452A/en unknown
- 2013-09-10 PE PE2019002512A patent/PE20200607A1/es unknown
- 2013-09-10 SI SI201330936T patent/SI2895188T1/en unknown
- 2013-09-10 ES ES13838016.7T patent/ES2657377T3/es active Active
- 2013-09-10 HU HUE13838016A patent/HUE036524T2/hu unknown
- 2013-09-10 PT PT138380167T patent/PT2895188T/pt unknown
- 2013-09-10 RS RS20180095A patent/RS57013B1/sr unknown
- 2013-09-10 LT LTEP13838016.7T patent/LT2895188T/lt unknown
- 2013-09-10 BR BR112015005161A patent/BR112015005161A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-09-10 MX MX2015003090A patent/MX360044B/es active IP Right Grant
- 2013-09-10 JP JP2015531311A patent/JP2015533797A/ja active Pending
- 2013-09-11 US US14/023,736 patent/US20140072560A1/en not_active Abandoned
- 2013-09-11 TW TW106136921A patent/TWI716649B/zh active
- 2013-09-11 AR ARP130103250A patent/AR092532A1/es not_active Application Discontinuation
- 2013-09-11 TW TW102132831A patent/TWI609877B/zh active
-
2014
- 2014-03-13 NO NO14719160A patent/NO2972131T3/no unknown
-
2015
- 2015-02-19 IL IL237311A patent/IL237311B/en active IP Right Grant
- 2015-03-06 CL CL2015000572A patent/CL2015000572A1/es unknown
- 2015-03-10 MX MX2018012749A patent/MX2018012749A/es unknown
- 2015-03-10 DO DO2015000055A patent/DOP2015000055A/es unknown
- 2015-04-07 CO CO15076746A patent/CO7400876A2/es unknown
- 2015-04-10 EC ECIEPI201514138A patent/ECSP15014138A/es unknown
-
2017
- 2017-09-29 US US15/720,291 patent/US11001627B2/en active Active
-
2018
- 2018-01-31 HR HRP20180182TT patent/HRP20180182T1/hr unknown
- 2018-02-13 CY CY20181100172T patent/CY1120062T1/el unknown
- 2018-10-10 AU AU2018247244A patent/AU2018247244B2/en not_active Ceased
- 2018-10-11 JP JP2018192476A patent/JP6913066B2/ja active Active
-
2019
- 2019-06-17 US US16/443,688 patent/US10947306B2/en active Active
- 2019-06-17 US US16/443,594 patent/US10954294B2/en active Active
- 2019-06-17 US US16/443,721 patent/US10954295B2/en active Active
- 2019-06-17 US US16/443,514 patent/US10954293B2/en active Active
- 2019-06-18 IL IL267452A patent/IL267452B/en active IP Right Grant
-
2021
- 2021-02-22 JP JP2021025939A patent/JP2021100929A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6913066B2 (ja) | 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト | |
JP6220788B2 (ja) | 塩化ナトリウムによって安定化されたエタネルセプト製剤 | |
TWI691512B (zh) | Fc融合高親和性IgE受體α鏈 | |
US8217152B2 (en) | Process for the purification of IL-18 binding protein | |
CA3182314A1 (en) | An improved process of purification of protein | |
EP3241849A1 (en) | Method for producing tnfr-fc fusion protein containing target content of impurities |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181109 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181109 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191112 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200207 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200512 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20201027 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210222 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20210222 |
|
C11 | Written invitation by the commissioner to file amendments |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11 Effective date: 20210309 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210303 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20210420 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20210427 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210615 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210709 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6913066 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |