PL213501B1

PL213501B1 - Wodny preparat bialka wiazacego czynnik martwicy nowotworu i sposób jego wytwarzania

Info

Publication number: PL213501B1
Application number: PL378290A
Authority: PL
Inventors: Fabrizio Samaritani; Rio Alessandra Del; Rita Agostinetto
Original assignee: Ares Trading Sa
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2004-02-11
Publication date: 2013-03-29
Also published as: MXPA05009135A; EA009079B1; US8937045B2; DE602004013557D1; ATE394123T1; CA2515539A1; US9512215B2; RS51041B; US20170020960A1; BRPI0407649A; AR043418A1; PL378290A1; ES2304602T3; RS20050662A; US20070053906A1; EP1603596A1; JP2006519210A; AU2004216483A1; WO2004075918A1; NO20054440L

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wodny preparat białka wiążącego czynnik martwicy nowotworu (TNF) i sposób jego wytwarzania.

Czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α), silna cytokina, wywołuje szerokie spektrum odpowiedzi biologicznych, które odbywają się za pośrednictwem wiązania do receptora na powierzchni komórki. Stauber i wsp. „Human tumor necrosis factor-alfa receptor: purification by immunoaffinity chromatography and initial characterization (J. Biol. Chem. 263: 19098-19104, 1988) wyizolowali receptor ludzkiego TNF-alfa z ludzkiej linii komórkowej chłoniaka histiocytarnego. Hohmann i wsp. „Two different cell types have different major receptors for human tumor necrosis factor (TNF-alfa) (J. Biol. Chem. 264: 14927-14934, 1989) stwierdzili, że istnieją 2 różne białka, które służą jako główne receptory dla TNF-alfa, jeden związany z komórkami podobnymi do szpiku i jeden związany z komórkami nabłonkowymi.

Używając przeciwciał monoklonalnych, Brockhaus i wsp. „Identification of two types of tumor necrosis factor receptors on human cell lines by monoclonal antibodies (Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 3127-3131, 1990) otrzymali dowód na 2 różne białka wiążące TNF, z których oba wiążą TNF-alfa i TNF-beta specyficznie i z wysokim powinowactwem. Gray i wsp. „Cloning of human tumor necrosis factor (TNF) receptor cDNA and expression of recombinant soluble TNF-binding protein (Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 7380-7384, 1990) wyizolowali cDNA dla jednego z receptorów. Stwierdzili oni, że koduje on białko z 455 aminokwasów, które jest podzielone na zewnątrzkomórkową domenę o 171 resztach i cytoplazmatyczną domenę o 221 resztach. Aggarwal i wsp. „Characterization of receptors for human tumour necrosis factor and their regulation by gamma-interferon (Nature 318: 665-667, 1985) wykazali, że czynniki martwicy nowotworów alfa 1 beta rozpoczynają swoje odddziaływania na funkcjonowanie komórki przez wiązanie się do wspólnych receptorów na powierzchni komórki. Receptory TNFA i TNFB mają różne wielkości i ulegają zróżnicowanej ekspresji w różnych liniach komórkowych (zob. Hohmann i wsp., 1989; i Engelmann i wsp. „Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine: evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors. (J. Biol. Chem. 265: 1531-1536, 1990)).

TNF -α-R, określany przez niektórych jako TNFR55, jest mniejszym z 2 receptorów. cDNA dla obu receptorów zostały sklonowane i określona ich sekwencja kwasu nukleinowego (zob. Loetscher i wsp. „Molecular cloning and expression of the human 55 kd tumor necrosis factor receptor. (Cell 61: 351-359, 1990); Nophar i wsp. „Soluble forms of tumor necrosis factor receptors (TNF-Rs) : the cDNA for the type I TNF-R, cloned using amino acid sequence data of its soluble form, encodes both the cell surface and a soluble form of the receptor (EMBO J. 9: 3269-3278, 1990); Schall i wsp. „Molecular cloning and expression of a receptor for human tumor necrosis factor. (Cell 61: 361-370, 1990); Smith i wsp. „A receptor for tumor necrosis factor defines an unusual family of cellular and viral proteins. (Science 248: 1019-1023, 1990)).

WO 97/41895 dotyczy białka wiążącego TNF, tj. TNFR-Ig, sformułowanego w preparacie z buforem cytrynianowym, pH6.

WO 94/06476 dostarcza rozpuszczalnych receptorów TNFR w niespecyficznym buforze soli. Przedstawia ogólne wytyczne dotyczące kompozycji zawierającej rozpuszczalny receptor TNF i ponadto zawierającej fizjologicznie dopuszczalne nośniki, zaróbki lub rozcieńczalniki.

US 2002/077294 ujawnia preparaty inhibitora IL-1, inhibitora TNF (takich jak onercept lub etanercept) i/lub agonisty receptora erytropoetyny (EPO). Kompozycje takie obejmują, na przykład, bufor fosforanowy jako rozcieńczalnik. Wskazano tam, że dowolna spośród wyżej wymienionych cząsteczek terapeutycznych może być formułowana z rozcieńczalnikiem, takim jak Tris, octan lub fosforan, o różnych wartościach pH i siłach jonowych, oraz z substancjami zwiększającymi rozpuszczalność, nośnikami, konserwantami, itp.

Wiadomo, że białka podlegają szeregowi szlaków degradacyjnych, zwłaszcza deamidacji, agregacji, przycinaniu szkieletu peptydowego i utlenianiu. Wiele z tych reakcji może zostać spowolnionych znacząco przez usunięcie wody z białka.

Jednak, opracowanie wodnego preparatu dla leków białkowych wykazuje zalety eliminacji błędów związanych z odtwarzaniem, w ten sposób podnosząc dokładność dawkowania, jak również upraszczając zastosowanie kliniczne produktu, tym samym zwiększając dostosowywanie się pacjenta. Zatem, celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie wodnego preparatu białek wiążących TNF, który zapewnia możliwą do akceptacji kontrolę produktów degradacji, jest stabilna wobec silnego miePL 213 501 B1 szania (które powoduje agregację) i jest odporna na zanieczyszczenie drobnoustrojami (co dopuszcza zastosowanie opakowań „wielokrotnego użycia albo „wielokrotnego dawkowania).

Stabilny, farmaceutycznie dopuszczalny, wodny preparat według wynalazku obejmuje białko wiążące TNF, bufor i czynnik izotoniczności, przy czym białkiem wiążącym TNF jest TBP-1, którego stężenie jest zawarte pomiędzy 5 a 170 mg/ml, buforem jest bufor fosforanowy utrzymujący pH w zakresie pomiędzy 6 i 7, którego stężenie wynosi od 5 do 150 mM, a czynnik izotoniczności, którego stężenie wynosi od 5 do 50 mM, jest wybrany z grupy składającej się z chlorku sodu i mannitu.

W korzystnej postaci wykonania czynnikiem izotoniczności w preparacie według wynalazku jest chlorek sodu. W innej korzystnej postaci według wynalazku czynnikiem izotoniczności jest mannit.

Korzystnie preparat według wynalazku zawiera 0,1 M bufor fosforanu sodu przy pH=6,5 i 0,025 M chlorek sodu.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania preparatu według wynalazku, który obejmuje rozcieńczanie białka wiążącego TNF roztworem zaróbek z wytworzeniem preparatu według wynalazku.

Środek konserwujący może zostać włączony do preparatu, aby opóźnić wzrost drobnoustrojów i w ten sposób umożliwić zastosowanie opakowań „wielokrotnego użycia albo „wielokrotnego dawkowania białka wiążącego TNF. Środki konserwujące obejmują fenol, alkohol benzylowy, meta-krezol, metyloparaben, propyloparaben, chlorek benzalkonium i chlorek benzetonium. Korzystne środki konserwujące obejmują m-krezol i alkohol benzylowy.

Preparat według wynalazku może również być liofilizowany, jeśli jest to potrzebne.

Stosowany w niniejszym opisie termin „białka wiążące TNF oznacza dowolne białko, które posiada powinowactwo wobec TNF-alfa albo TNF-beta i/albo białka, które zawierają w całości albo w części zewnątrzkomórkowy, rozpuszczalny fragment białka, należącego do rodziny receptorów TNF.

Niektóre przykłady przedstawicieli rodziny receptorów TNF są następujące:

> Receptor czynnika martwicy nowotworu 1 (TNFR1), również nazywany przedstawicielem 1A nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSFlA), albo receptorem czynnika martwicy nowotworu alfa (TNFAR), albo TNFR 55-KD, albo TNFR 60-KD (zob. opis w OMIM*191190 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM) > Receptor czynnika martwicy nowotworu 2 (TNFR2), również nazywany przedstawicielem 1B nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF1B), albo receptorem czynnika martwicy nowotworu-beta (TNFBR), albo TNFR 75-KD albo TNFR 80-KD (zob. opis na OMIM*191191);

> Antygen OX40 (OX40), również nazywany przedstawicielem 4 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF4), albo receptorem glikoproteiny 1 aktywowanym transkrypcyjnie przez Tax (TXGP1L, ang. Tax-Transcriptionally Activated Glycoprotein 1), albo antygenem aktywacji limfatycznej ACT35 (ACT35), albo CD134 (zob. opis na OMIM*600315);

> Receptor CD40L (CD40), również nazywany przedstawicielem 5 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF5), albo antygenem powierzchniowym komórek B CD40, albo CDw40, albo Bp50 (zob. opis na Swiss-Prot, zgłoszenie nr P25942);

> Receptor FASL (FAS), również nazywany przedstawicielem 6 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworów (TNFRSF6), albo antygenem powierzchniowym pośredniczącym w apoptozie FAS, albo antygenem Apo-1, albo CD95 (zob. opis na Swiss-Prot, zgłoszenie nr P25445);

> Receptor Decoy 3 (DcR3), również nazywany przedstawicielem 6B nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF6B), albo receptorem Decoy dla ligandu FAS, albo M68 (zob. opis na Swiss-Prot, zgłoszenie nr 095407);

> Antygen CD27 (CD27), również nazywany przedstawicielem 7 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworów (TNFRSF7), albo antygenem aktywacji komórek T S152 (S152) (zob. opis na OMIM*602250);

> Antygen aktywacji limfatycznej CD30 (CD 30), również nazywany przedstawicielem 8 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF8) (zob. opis na OMIM*153243)

PL 213 501 B1 > Indukowany przez aktywację limfocytów (ILA), również nazywany przedstawicielem 9 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF9), albo CD137 (zob. opis na OMIM* 602250);

> Receptor Death 4 (DR4), również nazywany przedstawicielem 10A nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF10A), albo receptorem 1 związanego z TNF liganda indukującego apoptozę (TRAILR1, ang. TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptor 1), albo APO2 (zob. opis na OMIM* 603611);

> Receptor Death 5 (DR5), również nazywany przedstawicielem 10B nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF10B), albo receptorem 2 związanego z TNF liganda indukującego apoptozę (TRAILR2), albo Killer/DR5, albo TRICK2 (zob. opis na OMIM *603612);

> Receptor Decoy 1 (DCR1), również nazywany przedstawicielem 10C nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF10C), albo receptorem 3 związanego z TNF liganda indukującego apoptozę (TRAILR3), albo receptorem TRAIL bez domeny wewnątrzkomórkowej (TRID) (zob. opis na OMIM*603613);

> Receptor Decoy 2 (DCR2), również nazywany przedstawicielem 10D nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF10D) albo receptorem 4 związanego z TNF liganda indukującego apoptozę (TRAILR4), albo receptorem TRAIL ze skróconą domeną Death (TRUNDD, ang. TRAIL Receptor With A Truncated Heath Domain)) (zob. opis na OMIM*603014);

> Receptor aktywujący NF-KAPPA-B (RANK), również nazywany przedstawicielem 11A nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF11A), albo receptorem czynnika różnicowania osteoklastów (ODFR), albo PDB2, albo TRANCER (zob. opis na

OMIM* 603499);

> Osteoprotegeryna (OPG), również nazywana przedstawicielem 11B nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF11B), albo czynnikiem hamującym tworzenie osteoklastów (OCIF) (zob. opis na OMIM*602643);

> Receptor Death 3 (DR3), również nazywany przedstawicielem 12 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF12), albo APO3, albo receptorem Death związanym z limfocytami (LARD) (zob. opis na OMIM*603366);

> Transmembranowy aktywator odziałujący z Caml (TACI, ang. Transmembrane Activator And Caml Interactor), również nazywany przedstawicielem 13B nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF13B) (zob. opis na OMIM*604907);

> Receptor BAFF (BAFFR), również nazywany przedstawicielem 13C nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF13C), albo receptorem czynnika aktywującego komórki B (zob. opis na OMIM*606269);

> Czynnik pośredniczący w wejściu wirusa opryszczki (HVEM, ang. Herpesvirus Entry Mediator), również nazywany przedstawicielem 14 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF14), albo czynnik A pośredniczący w wejściu wirusa opryszczki (HVEA), albo TR2 (zob. opis na OMIM* 602746);

> Receptor czynnika wzrostu nerwów (NGFR), również nazywany przedstawicielem nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF16), albo p75 (NTR) (zob. opis na OMIM*162010);

> Czynnik dojrzewania komórek B (BCMA), również nazywany przedstawicielem nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF17), albo BCM (zob. opis na OMIM*109545);

> Związany z TNFR gen indukowany glukokortykoidami (GITR), również nazywany przedstawicielem 18 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF18), albo przedstawicielem rodziny TNFR indukowanych przez aktywację (AITR, ang. ActivationInducible TNFR Family Member) (zob. opis na OMIM* 603905);

> TRADE, również nazywany przedstawicielem 19 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF19), albo induktorem toksyczności i JNK, albo TROY, albo TAJ (zob. opis na Swiss-Prot, zgłoszenie nr Q9NS68);

> Receptor ektodyplazyny-A2 sprzężony z X (XEDAR, ang. X-linked Ectodyplasin-A2 Receptor), również nazywany receptorem EDA-A2 (zob. opis na Swiss-Prot, zgłoszenie nr Q9HAV5);

PL 213 501 B1 > RECEPTOR DEATH 6 (DR6), również nazywany przedstawicielem 21 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF21) (zob. opis na OMIM*605732).

Według korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, białko TBP-1 stanowi rekombinowane h-TBP-1 (rekombinowany, zewnątrzkomórkowy, rozpuszczalny fragment ludzkiego receptora I TNF, obejmujący sekwencję aminokwasową, odpowiadającą 20-180 aminokwasowemu fragmentowi wg Nophar i wsp.), którego krótka niezastrzeżona nazwa międzynarodowa (INN, ang. International Nonproprietry Name) to „Onercept.

W celu ustalenia stabilnego, ciekłego preparatu, został oceniony wpływ pH/buforu, siły jonowej i zaróbek. Opis, który następuje, przedstawia doświadczenia, przeprowadzone z TBP-1 (Onercept).

P r z y k ł a d y

Materiały

Substancja terapeutyczna Onercept (dostarczona przez Istituto di Ricerca Cesare Serono, Ardea, IT)

Acetonitril (Merck)

Kwas octowy lodowaty (Merck)

Siarczan amonu (Merck)

Kwas cytrynowy (Merck)

D(+)-Glukoza monohydrat (Merck)

D(+)-Mannit (Merck)

Kwas ortofosforowy (Merck)

Sacharoza (Merck)

Azydek sodu (Merck)

Chlorek sodu (Merck)

Wodorotlenek sodu (Merck)

Siarczan sodu bezwodny (Merck) diwodorofosforan sodu monohydrat (Merck) dihydrat di(wodorofosforanu sodu) (Merck)

Kwas trifluorooctowy (Baker)

Wyposażenie

Systemy HPLC (Waters)

Kalibrowane pipety (Gilson)

Statywy ze stali nierdzewnej (Sartorius) pH-metry (mod. 713, Metrohm)

Osmometr (Osmomat 030-D, Gonotec)

Filtry membranowe 0,45 μm i 0,22 μm (kod. HVLP04700 i GWVP04700, Millipore)

Kolumna żelowa TSK G2000 SWXL (kod. 08540, TosoHaas)

Kolumna żelowa TSK Phenyl-5PW szkło 0,8 ID x 7,5 cm (kod 08804, TosoHaas)

Wyjściowy materiał do pakowania

Fiolki szklane borokrzemianowe typu I (DIN 2R, Nuova Ompi)

Zatyczki gumowe Flurotec (S2F452, D777-1, B2-40, Daikyo Seiko)

Strzykawki szklane borokrzemianowe typu I (HYPAK SCF zbiorniczki strzykawki z umocowaną igłą i osłona igły - SCF

1,0 ml długości W 7974 szare - Becton Dickinson)

Zatyczki Flurotec, 1 ml - 1 BG B2-40c FLT 4023/50 gr (Daykio)

Zatyczki bromobutylowe (HYPAK SCF zatyczki wciskane - BSCF 1,0 ml 4023/50 szare Becton Dickinson)

Analityczne testy i sposoby

Następujące analityczne testy i sposoby były używane:

• pH (potencjometryczne) • wygląd (kolor, przejrzystość/matowość, cząstkowość) (ocena wizualna) • czystość i oznaczenie przez SE-HPLC (instrukcja obsługi TF 08/01) • czystość przez HI-HPLC (instrukcja obsługi TF 09/01) • osmolowość (pomiar krioskopowy), wyłącznie w czasie zero • oznaczenie biologiczne.

PL 213 501 B1

Przede wszystkim, został oceniony wpływ pH/buforu, siły jonowej i zaróbek. Zgodność z zatyczkami (powlekanymi i niepowlekanymi) została również oceniona. Gdy wybrano najlepsze warunki, następujące trzy stężenia zostały zbadane w uprzednio napełnionych strzykawkach:

• 10 mg/ml • 50 mg/ml • 60 mg/ml

Badanie stabilności było przeprowadzone aż do 3 miesięcy po przechowywaniu w +5±3°C; +25±2°C i +40±2°C oraz zostały wykonane następujące testy:

• pH • wygląd (kolor, przejrzystość/matowość, cząstkowość; przez ocenę wizualną) • oznaczenie (przez SE-HPLC) • czystość (przez SE-HPLC) • czystość (przez HI-HPLC) • osmolowość (wyłącznie w czasie zero) • oznaczenie biologiczne.

Wpływ pH

W celu zbadania wpływu pH/buforu, roztwory Onerceptu o stężeniu 5 mg/ml i 50 mg/ml zostały przygotowane przez rozcieńczenie substancji terapeutycznej w następujących 10 mM buforach o różnych pH:

1. octan sodu o pH 4, 5 i 6

2. cytrynian sodu o pH 4, 5, 6 i 7

3. fosforan sodu o pH 5, 6, 7 i 8

Roztwory (około 20 ml/partia) zostały umieszczone w 3 ml szklanych fiolkach (1 ml objętość napełniająca), zamknięte, zatkane i przechowywane w +5±3°C, +25±2°C i +40±2°C, aby być analizowane co tydzień aż do 1 miesiąca.

Wyniki były jak przedstawione przez wykresy na Fig. 1, 2 i 3 oraz w Tabeli 1:

T a b e l a 1 - partia Onercept przygotowana w stężeniu 5 mg/ml i 50 mg/ml w 10 mM buforach (utraty czystości przez SE-HPLC w + 40±2°C)

Preparat	Nachylenia krzywej (% stopni/tydzień)	Utrata czystości (%) po 1 miesiącu
PHO*	CITR.*	ACE*	PHO*	CITR.*	ACE*
5 mg/ml przy pH=4,0	/	-0,07	-0,10	/	-0,3%	-0,4%
5 mg/ml przy pH=5,0	-0,33	-0,24	-0,32	-1,3%	-0,9%	-1,3%
5 mg/ml przy pH=6,0	-0,17	-0,10	-0,17	-0,7%	-0,4%	-0,7%
5 mg/ml przy pH=7,0	-0,40	-0,15	/	-1,6%	-0,6%	/
5 mg/ml przy pH=8,0	-8,45	/	/	-33,8%	/	/
50 mg/ml przy pH=4,0	/	-0,68	-1,56	/	-2,7%	-6,2%
50 mg/ml przy pH=5,0	-1,79	-0,95	-1,79	7,2%	-3,8%	-7,2%
50 mg/ml przy pH=6,0	-0,65	-0,50	-0,70	-2,6%	-2,0%	-2,8%
50 mg/ml przy pH=7,0	-0,86	-0,78	/	-3,4%	-3,1%	/
50 mg/ml przy pH=8,0	-10,88	/	/	-43,5%	/	/

* PHO = bufor fosforanu sodu, CITR. = bufor cytrynianu sodu, ACE = bufor octanu sodu

Jak przedstawiono przez wyniki w tabeli powyżej i wykresy, zależność od pH jest obserwowana zarówno przy 5 mg/ml i 50 mg/ml: mała utrata % czystości została zaobserwowana przy pH 6,0 i 7,0 dla obu stężeń. Również bufor cytrynianowy i octanowy przy pH 4,0 miał dodatni wpływ na zawartość agregatów, podczas gdy przy pH 8,0 w buforze fosforanowym została zaobserwowana szybka ścieżka degradacji.

PL 213 501 B1

Nie zaobserwowano żadnego utleniania przy pomocy HI-HPLC albo zmiany w pH, albo wyglądzie po 1 miesiącu przechowywania w +40±2°C.

Wpływ siły jonowej

W celu zbadania wpływu różnych sił jonowych, roztwory Onerceptu o 5 mg/ml i 50 mg/ml zostały przygotowane w buforze fosforanowym o trzech różnych stężeniach molarnych (10 mM, 50 mM i 100 mM), o pH 6,0, 6,5, i 7,0 każdy. Roztwory (około 20 ml/partia) zostały umieszczone w 3 ml szklanych fiolkach (1 ml objętość napełniająca), zamknięte, zatkane i przechowywane w +5±3°C, +25±2°C i +40±2°C, do analizy w reżimie tygodniowym aż do 1 miesiąca.

Wyniki były jak przedstawione przez wykresy na Fig. 4 i 5 oraz w Tabeli 2:

T a b e l a 2 - partia Onercept przygotowana w stężeniu 5 mg/ml i 50 mg/ml przy różnych siłach jonowych (utraty czystości przez SE-HPLC w +40±2°C)

Preparat	Nachylenia krzywej (% stopni/tydzień)	Utrata czystości % po 1 miesiącu
pH 6,0	PH 6,5	pH 7,0	pH 6,0	pH 6,5	pH 7,0
5 mg/ml w fosforanowym 10 mM buforze	-0,18	-0,17	-0,48	-0,7%	-0,7%	-1,9%
5 mg/ml w fosforanowym 50 mM buforze	-0,15	-0,17	-0,33	-0,6%	-0,7%	-1,3%
5 mg/ml w fosforanowym 100 mM buforze	-0,13	-0,16	-0,37	-0,5%	-0,6%	-1,5%
50 mg/ml w fosforanowym 50 mM buforze	-0,53	-0,57	-1,07	-2,1%	-2,3%	-4,3%
50 mg/ml w fosforanowym 100 mM buforze	-0,39	-0.50	-1,21	-1,6%	-2,0%	-4,5%

Jak przedstawiono przez wyniki w tabeli powyżej i wykresy, stopień agregacji nie zależy od stężenia buforu: pH 7,0 posiada ujemny wpływ na % czystości przy każdej mocy buforu, podczas gdy mała utrata w czystości została zaobserwowana zarówno przy pH 6,0 i 6,5. Nie zaobserwowano w badaniach HI-HPLC żadnego utleniania albo zmiany w pH, albo wyglądzie po 1 miesiącu przechowywania w +40±2°C.

Wpływ innych zaróbek (czynników stabilizujących)

W celu zbadania wpływu różnych zaróbek, roztwory Onerceptu o stężeniu 5 mg/ml i 50 mg/ml zostały przygotowane w buforze fosforanowym 40 mM o pH 6,0 i 6,5 i doprowadzone do izotoniczności chlorkiem sodu, mannitem, glukozą i sacharozą. Roztwory (około 20 ml/partia) zostały umieszczone w 3 ml szklanych fiolkach (1 ml objętość napełniająca), zamknięte, zatkane i przechowywane w +5±3°C, +25±2°C i +40±2°C do analizy w reżimie tygodniowym, aż do 1 miesiąca.

Wyniki były jak przedstawione przez wykresy na Fig. 6 i 7 oraz w Tabeli 3:

T a b e l a 3 - partia Onercept przygotowana w stężeniu 5 mg/ml i 50 mg/ml z zaróbkami (utrata czystości w SE-HPLC w +40±2°C)

Preparat	Nachylenia krzywej (% stopni/tydzień)	Utrata czystości (%) po 1 miesiącu
pH = 6,0	pH = 6,5	pH = 6,0	pH= 6,5
5 mg/ml z chlorkiem sodu	-0,10	-0,10	-0,4%	-0,4%
5 mg/ml z mannitem	-0,10	-0,08	-0,4%	-0,3%
5 mg/ml z sacharozą	-0,17	-0,20	-0,7%	-0,8%
5 mg/ml z glukozą	-1,09	-2,7	-4,4%	-10,8
50 mg/ml z chlorkiem sodu	-0,44	-0,42	-1,8%	-1,7%
50 mg/ml z mannitem	-0,48	-0,43	-1,9%	-1,7%
50 mg/ml z sacharozą	-0,63	-0,54	-2,5%	-2,2%
50 mg/ml z glukozą	-4,66	-6,97	-18,6%	-27,9%

PL 213 501 B1

Jak przedstawiono przez wyniki w tabeli powyżej i wykresy, chlorek sodu i mannit posiadały takie samo działanie jako czynniki izotoniczności. W konsekwencji, chlorek sodu został wybrany, będąc już obecny w roztworze substancji terapeutycznej. Ponadto, nie wystąpiło żadne przesunięcie pH po jednym miesiącu przechowywania w +40±2°C, podczas gdy zmieniony wzór na profilu chromatograficznym został zaobserwowany w analizie HI-HPLC dla preparatów Onerceptu zawierających glukozę i sacharozę jako czynniki stabilizujące.

Z tych wszystkich wyników można wyciągnąć zaskakujący wniosek, że najbardziej stabilnymi ciekłymi preparatami są te zawierające zaróbki, które są zazwyczaj używane jako czynniki stabilizujące. Zatem, najbardziej stabilnymi preparatami są te, zawierające jedynie odpowiedni bufor do rozcieńczenia aktywnej substancji i czynnik izotoniczności.

W tych warunkach, zakres pH możliwy do zastosowania w celu uzyskania dobrych wyników stabilności jest 6,0 do 7,0, korzystnie od 6 do 6,5. Izotoniczność może zostać uzyskana przez dodanie odpowiednich ilości chlorku sodu albo mannitu, korzystnie chlorku sodu.

Ponadto, analogiczne doświadczenia potwierdziły zasadniczo takie same wyniki dla stężeń TBP-1 aż do 170 mg/ml, jak również dla TBP-2.

P r z y k ł a d y wytworzenia farmaceutycznego

Materiały

Substancja terapeutyczna r-h TBP-1; chlorek sodu (Merck); diwodorofosforan sodu monohydrat (Merck); dihydrat di(wodorofosforanu sodu) (Merck) ); kwas orto-fosforowy 85% (Merck); WFI,

Pojemnik/Zamknięcie

Wyjściowym pojemnikiem jest szklana strzykawka z igłą ze stali nierdzewnej i gumowym tłoczkiem. Jest ona złożona z:

STRZYKAWKI

Opis:

SCF 1,0 ml długości W7974 szara (Becton Dickinson)

Materiał, kompozycja:

strzykawka: szkło borosilikatowe typu I igła: stal środek poślizgowy: DC360, olej silikonowy - dimetikon osłona igły: elastomer

ZATYCZKI WCISKANEJ

Opis:

HYPAK SCF zatyczka wciskana; BSCF 1,0 mil 4023/50 szary (Becton Dickinson)

Materiał, kompozycja:

elastomer: bromobutyl, obojętny minerał, nietypowy układ utwardzający środek poślizgowy: DC360, olej silikonowy - dimetikon

Przykład przygotowania roztworów r-h TBP-1 w 0,1 M buforze fosforanu sodu, pH =6,5; chlorek sodu 0,025 M

A) Roztwór r-h TBP-1 o 14,3 mg/ml

W celu przygotowania 1 I partii produktu końcowego, zostały zastosowane następujące ilości:

r-h TBP-1

Chlorek sodu

Dihydrat di(wodorofosforan sodu)

Diwodorofosforan sodu monohydrat

B) Roztwór r-h TBP-1 o

W celu przygotowania 1 I partii produktu końcowego, r-h TBP-1 Chlorek sodu

Dihydrat di(wodorofosforan sodu)

Diwodorofosforan sodu monohydrat

C) Roztwór r-h TBP-1 o

W celu przygotowania 1 I partii produktu końcowego, r-h TBP-1 Chlorek sodu

Dihydrat di(wodorofosforan sodu)

Diwodorofosforan sodu monohydrat

14,3 g 1,46 g 10,5 g 5,68 g 71,4 mg/ml zostały zastosowane następujące ilości: 71,4 g 1,46 g 10,5 g 5,68 g 142,9 mg/ml zostały zastosowane następujące ilości: 142, 9 g 1,46 g

10,5 g 5,68 g

PL 213 501 B1

Sposób przygotowania • Ciekła substancja terapeutyczna, zawierająca r-h TBP-1 jest liofilizowana i otrzymany proszek jest zbierany w celu ustalenia miana.

• Wymagane ilości chlorku sodu, dihydratu di(wodorofosforanu sodu) i monohydratu diwodorofosforanu sodu są rozpuszczane w przybliżeniu 800 g WFI. Ich ilości są obliczane, biorąc pod uwagę udział soli, pochodzących z liofilizowanej substancji terapeutycznej.

• pH jest sprawdzane i doprowadzane do wartości 6,5 ± 0,2 rozcieńczonym (1:10) kwasem ortofosforowym 85%.

• Wymagana ilość liofilizowanej substancji leczniczej jest dodawana bardzo powoli z mieszaniem i WFI jest dodawane, aby osiągnąć końcową wagę (obliczoną z uwzględnieniem końcowej gęstości roztworu). pH jest sprawdzane i doprowadzane do pH 6,5 ± 0,2 rozcieńczonym kwasem ortofosforowym, na różnych etapach podczas przygotowywania.

• Roztwór r-h TBP-1 jest najpierw wstępnie filtrowany przez filtr membranowy 0,45 μm, następnie przez jałową filtrację na filtrze membranowym 0,22 μm (DURAPORE) pod ciśnieniem 1,0 atm azotu (roztwór o 14,3 mg/ml nie jest wstępnie filtrowany). Jałowy roztwór jest zbierany do kolby szklanej.

Claims

1. Stabilny, farmaceutycznie dopuszczalny, wodny preparat, znamienny tym, że obejmuje białko wiążące TNF, bufor i czynnik Izotoniczności, przy czym białkiem wiążącym TNF jest TBP-1, którego stężenie jest zawarte pomiędzy 5 a 170 mg/ml, buforem jest bufor fosforanowy utrzymujący pH w zakresie pomiędzy 6 i 7, którego stężenie wynosi od 5 do 150 mM, a czynnik izotoniczności, którego stężenie wynosi od 5 do 50 mM, jest wybrany z grupy składającej się z chlorku sodu i mannitu.

2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnikiem izotoniczności jest chlorek sodu.

3. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnikiem izotoniczności jest mannit.

4. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera 0,1 M bufor fosforanu sodu przy pH=6,5 i 0,025 M chlorek sodu.

5. Sposób wytwarzania wodnego preparatu farmaceutycznego, znamienny tym, że obejmuje rozcieńczanie białka wiążącego TNF roztworem zaróbek z wytworzeniem preparatu określonego w jednym z zastrz. od 1 do 4.

PL 213 501 B1

Rysunki

Fig. 1

Wykres 1 - Wykresy regresji liniowej dla partii Onerceptu przygotowanej w stężeniu 5 mg/ml i 50 mg/ml w 10 mM buforze fosforanowym. (Dane stabilności w +40+2°C)