KR20180114966A - 글루타민-비함유 세포 배양 배지에서의 단백질의 생성 - Google Patents

글루타민-비함유 세포 배양 배지에서의 단백질의 생성 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 아스파라긴이 보충된 글루타민-비함유 세포 배양 배지에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아스파라긴-보충된 글루타민-비함유 포유동물 세포 배양물에서 재조합 단백질, 예컨대 항체의 생성에 관한 것이다.

Description

글루타민-비함유 세포 배양 배지에서의 단백질의 생성{PRODUCTION OF PROTEINS IN GLUTAMINE-FREE CELL CULTURE MEDIA}
본 발명은 일반적으로 글루타민-비함유 세포 배양 배지에 관한 것이다. 본 발명은 또한 글루타민-비함유 포유동물 세포 배양물에서의 재조합 단백질, 예컨대 항체의 생성에 관한 것이다.
포유동물 세포는, 주로 이들이 절적하게 폴딩 및 조립된 이종 단백질을 생성하는 능력, 및 이들의 번역후 변형에 대한 능력 때문에, 임상 용도를 위한 포유동물 단백질의 생성을 위한 우세한 시스템이 되었다. 항체를 비롯한 이종 단백질의 재조합 생성 동안 세포 배양 배지에 글루타민을 갖는 것은 통상적인 것이다. L-글루타민은 필수 아미노산으로, 배양시 세포를 위한 주요 에너지 및 질소 공급원으로 여겨진다. 대부분의 시판 배지는 기본 제제에 포함되거나 또는 사용시 액체 배지 제제에 첨가되는 유리 L-글루타민으로 제제화된다. 따라서, 모든 포유동물 세포 배양 배지는 글루타민 신테타제 형질감염된 세포주, 예컨대 GS NS0 및 GS CHO 세포주 (여기서 세포 자체가 성장에 필요한 글루타민을 생성함)에 대한 것을 제외하고는 글루타민을 함유한다. 글루타민은 기본 배지에서는 전형적으로 1 내지 20 mM의 다양한 농도에서 널리 사용되고, 유가 방법을 위한 공급물에서는 훨씬 더 높은 농도에서 사용된다. 예를 들어, L-글루타민의 농도는 아메스(Ames) 배지에서는 0.5 mM이고, MCDP 배지 131에서는 10 mM이다. DMEM/햄(Ham) 영양소 혼합물 F-12 (50:50)이 종종 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 사용되는 독점적인 배지를 위한 출발 제제로 사용된다. DMEM/햄 영양소 혼합물 F-12에서의 L-글루타민은 2.5 mM이다. 혈청-비함유/단백질 비함유 하이브리도마 배지에서의 L-글루타민 농도는 2.7 mM이다. DMEM, GMEM, IMDM 및 H-Y 배지에서의 L-글루타민은 4 mM이고, 이 중 IMDM은 종종 독점적인 하이브리도마 세포 배양 배지를 위한 출발 제제로 사용된다. 일반적으로, 하이브리도마 세포는 배지에서 발견되는 평균 수준보다 높은 L-글루타민의 농도에서 더 잘 성장하는 것으로 나타났다. ([Dennis R. Conrad, Glutamine in Cell Culture, Sigma-Aldrich Media Expert]).
글루타민은 세포 배양물에 축적되는 암모니아의 주요 공급원인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Markus Schneider, et al. 1996, Journal of Biotechnology 46:161-185]에 의한 검토 참조). 따라서, 세포 배양 배지 중에서 글루타민을 저하시키는 것은 NH4 + 축적 수준을 유의하게 감소시켜, 세포독성을 저하시킨다 ([Markus Schneider, et al. 1996, 상기 문헌] 참조). 감소된 NH4 + 세포독성은 세포 생존율을 보다 높이고, 이에 따라 배양 수명이 연장된다. CHO 세포를 사용한 추정 글루타민 소비 연구에 기초하여, 세포는 글루타민을 0.3-0.4 mM/일의 속도로 소비할 수 있다고 제안되었다 (문헌 [Miller, et al. 1988, Biotechnol. Bioeng. 32: 947-965)]. 알타미라노(Altamirano) 등 ([2001, J. Biotechnol. 110:171-9])은 재조합 인간 조직 플라스미노겐 활성화제 (rhut-PA)를 생성하는 CHO 세포의 재분포에 대한 글루타민의 글루타메이트로의 교체 및 글루타메이트와 글루코스 대사 사이의 균형의 효과를 연구하였다. 글루타민을 글루타메이트로 교체하고, 글루코스 이화작용과 균형을 이루었을 때 (탄소 및 질소 비율, C/N 비율), 세포 대사는 rhut-PA의 생성을 위해 탄소 및 에너지원을 보다 유리하게 사용하도록 재분포 및 강화되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 점착성 배양물 중의 CHO 세포는 세포가 배지 중의 글루탐산으로부터 글루타민을 합성하도록 허용하는 내인성 글루타민 신테타제로 인해 글루타민을 첨가하지 않고 성장할 수 있다고 보고되었다 (문헌 [Sanfeliu and Stephanopoulos, 1999, Biotechnol. Bioeng. 64:46-53]). 그러나, 글루타민-함유 배지에서의 대조군 배양물과 비교하여, 글루타민-비함유 배지에서의 세포 성장 속도는 G0/G1 단계에 분포된 세포의 비율이 증가하면서 보다 느려졌다. 글루타민 및 글루탐산 둘 모두의 고갈은 세포 사멸을 초래하였다.
<발명의 개요>
본 발명은 적어도 부분적으로 글루타민-비함유 생성 배지를 사용하여 임의의 중요한 역효과 없이 재조합 단백질이 포유동물 숙주 세포에서 생성될 수 있다는 것 뿐만 아니라, 실제로 생성 단계에서 글루타민-비함유 배지의 사용이 세포 생존율, 배양 수명, 비생산성 및/또는 최종 재조합 단백질 역가를 유의하게 증가시킨다는 예상하지 못한 발견을 기초로 한다.
본 발명은 또한 글루타민-비함유 생성 배양 배지에 아스파라긴을 첨가하는 것이 임의의 중요한 역효과 없이 글루타민-비함유 생성 배양 배지를 사용한 포유동물 숙주 세포에서의 세포 생존율, 배양 수명, 비생산성 및/또는 최종 재조합 단백질 역가를 추가로 향상시킬 수 있다는 예상하지 못한 발견을 기초로 한다.
한 측면에서, 본 발명은 아스파라긴이 보충된 글루타민-비함유 생성 배지 중에서 배양물의 생성 단계에서 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 폴리펩티드를 상기 포유동물 숙주 세포에서 생성하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.
또 다른 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포는 dhfr- CHO 세포이다.
또 다른 실시양태에서, 생성 배지는 혈청-비함유 배지이다.
추가의 실시양태에서, 생성 배양 배지는
1) 에너지원;
2) 필수 아미노산;
3) 비타민;
4) 유리 지방산; 및
5) 미량 원소
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다.
다른 추가의 실시양태에서, 생성 배양 배지는
1) 호르몬 및 다른 성장 인자;
2) 염 및 완충제; 및
3) 뉴클레오시드
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다.
모든 실시양태에서, 생성 단계는 예를 들어 회분 또는 유가 배양 단계일 수 있다.
모든 실시양태에서, 방법은 상기 폴리펩티드를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 단리는 이후에 단리 후의 세포 생존율, 배양 수명, 비생산성 및 최종 재조합 단백질 역가 중 하나 이상을 결정할 수 있다.
다른 추가의 실시양태에서, 세포 생존율, 배양 수명, 비생산성 및 최종 재조합 단백질 역가 중 하나 이상이 동일한 조성물의 글루타민-함유 생성 배지에서 생성된 동일한 폴리펩티드와 비교하여 증가된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 생성 단계에서 폴리펩티드의 생성을 위한 즉시 사용가능한 글루타민-비함유 세포 배양 배지에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 포유동물 당단백질이다.
다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체, 항체 단편 및 이뮤노어드헤신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
모든 실시양태에서, 폴리펩티드는, 예를 들어 항체 또는 항체의 생물학적 기능성 단편일 수 있다. 대표적인 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 미니바디, 디아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
다른 추가의 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다.
치료 항체는 항-HER2 항체; 항-CD20 항체; 항-IL-8 항체; 항-VEGF 항체; 항-CD40 항체, 항-CD11a 항체; 항-CD18 항체; 항-IgE 항체; 항-Apo-2 수용체 항체; 항-조직 인자 (TF) 항체; 항-인간 α4β7 인테그린 항체; 항-EGFR 항체; 항-CD3 항체; 항-CD25 항체; 항-CD4 항체; 항-CD52 항체; 항-Fc 수용체 항체; 항-암배아성 항원 (CEA) 항체; 유방 상피 세포에 대해 지시된 항체; 결장 암종 세포에 결합하는 항체; 항-CD38 항체; 항-CD33 항체; 항-CD22 항체; 항-EpCAM 항체; 항-GpIIb/IIIa 항체; 항-RSV 항체; 항-CMV 항체; 항-HIV 항체; 항-간염 항체; 항-CA 125 항체; 항-αvβ3 항체; 항-인간 신세포 암종 항체; 항-인간 17-1A 항체; 항-인간 결장직장 종양 항체; GD3 강글리오시드에 대해 지시된 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평세포 암종; 및 항-인간 백혈구 항원 (HLA) 항체, 및 항-HLA DR 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
다른 실시양태에서, 치료 항체는 HER 수용체, VEGF, IgE, CD20, CD11a, CD40, 또는 DR5에 결합하는 항체이다.
다른 실시양태에서, 치료 항체는 항-BR3 항체 또는 BR3-Fc 이뮤노어드헤신이다.
본 발명의 방법의 다른 실시양태에서, 재조합 숙주 세포에서 발현된 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드이다. 예를 들어, 치료 폴리펩티드는 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (정상적으로 T-세포 발현 및 분비된 활성화에 대한 조절); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러-억제 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양 인자, 예컨대 골-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 예컨대 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, 및 CD40; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥시드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 가속화 인자; 바이러스 항원, 예컨대, 예를 들어 AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 폴리펩티드의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
모든 실시양태에서, 재조합 숙주 세포는 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유동물 숙주 세포, 예컨대 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포일 수 있다.
이들 및 다른 측면은 실시예 및 첨부된 특허청구범위를 포함하여, 하기 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1. 상이한 농도의 글루타민, 글루타메이트, 아스파라긴 및 아스파르테이트의 효과를 평가하는 완전 요인 실험 설계 (DOE)로부터의 역가 결과의 아포맙 항체 큐브 플롯 분석. 모델은 최고 역가가 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배지에서 달성될 것으로 예측하였다.
도 2. 상이한 농도의 글루타민, 글루타메이트, 아스파라긴 및 아스파르테이트의 효과를 평가하는 완전 요인 DOE로부터의 역가 결과의 BR3-Fc 이뮤노어드헤신 큐브 플롯 분석. 모델은 최고 역가가 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배지에서 달성될 것으로 예측하였다.
도 3. 상이한 농도의 글루타민, 글루타메이트, 아스파라긴 및 아스파르테이트의 효과를 평가하는 완전 요인 DOE로부터의 역가 결과의 항-VEGF 항체 큐브 플롯 분석. 모델은 최고 역가가 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배지에서 달성될 것으로 예측하였다.
도 4. 글루타민-비함유, 낮은 글루타메이트 및 높은 아스파르테이트 조건하에 아포맙 항체 역가에 대한 아스파라긴의 효과. 글루타민-비함유 배지에서, 아포맙 항체 역가는 아스파라긴이 없는 글루타민-비함유 배양물과 비교하여 2.5-15 mM 아스파라긴의 존재하에 유의하게 증가하였다. 이들 조건하에, 글루타메이트의 존재 또는 부재는 역가에 영향을 미치지 않았다.
도 5. 글루타민-비함유 및 낮은 글루타메이트 조건에서 다양한 아스파라긴 및 아스파르테이트 농도에 걸친 아포맙 항체 역가 생성. 양성 적정 효과는 이들 조건하에 아스파르테이트를 0 mM에서 10 mM으로 증가시켰을 때 관찰되었다.
도 6a-c. 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배지의 역가에 대한 효과. 아포맙 항체, 항-VEGF 항체 및 BR3-Fc 이뮤노어드헤신에 대한 최종 역가는 글루타민-함유 배지와 비교하여 글루타민-비함유 배지에서 유의하게 더 높았다.
도 7a 및 b. 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 DMEM/F12 글루타민-비함유 배지의 역가에 대한 효과. 아포맙 항체 및 항-VEGF 항체에 대한 최종 역가는 글루타민-함유 DMEM F12 배지와 비교하여 글루타민-비함유 DMEM/F12 배지에서 유의하게 더 높았다.
도 8a-c. 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배지의 세포 비생산성 (Qp)에 대한 효과. 아포맙 항체, 항-VEGF 항체 및 BR3-Fc 이뮤노어드헤신에 대한 세포 비생산성은 글루타민-함유 배지와 비교하여 글루타민-비함유 배지에서 유의하게 더 높았다.
도 9a 및 b. 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 DMEM/F12 글루타민-비함유 배지의 세포 비생산성 (Qp)에 대한 효과. 아포맙 항체 및 항-VEGF 항체에 대한 세포 비생산성은 글루타민-함유 DMEM/F12 배지와 비교하여 글루타민-비함유 DMEM/F12 배지에서 유의하게 더 높았다.
도 10a-c. 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배지의 세포 생존율에 대한 효과. 아포맙 항체, 항-VEGF 항체 및 BR3-Fc 이뮤노어드헤신에 대한 세포 생존율은 글루타민-함유 배지와 비교하여 글루타민-비함유 배지에서 더 높았다.
도 11a 및 b. 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 DMEM/F12 글루타민-비함유 배지의 세포 생존율에 대한 효과. DMEM/F12 배지에서, 세포 생존율은 글루타민-비함유 배지에서 일관되게 개선되지 않았다. 글루타민 함유 배지와 비교하여 아포맙 항체의 경우 생존율이 더 높았으나, 항-VEGF 항체의 경우 더 낮았다.
도 12a-c. 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배지의 암모니아 형성에 대한 효과. 암모니아는 통상적으로 글루타민-함유 배양물과 비교하여 글루타민-비함유 배양물에서 더 낮았다.
도 13a 및 b. 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 DMEM/F12 글루타민-비함유 배지의 암모니아 형성에 대한 효과. 암모니아는 글루타민-함유 DMEM/F12 배지와 비교하여 글루타민-비함유 DMEM/F12 배지에서 유의하게 감소하였다.
A. 정의
용어 "세포 배양 배지", "배양 배지", 및 "영양소 혼합물"은 전형적으로 하기 카테고리 중 하나 이상으로부터 하나 이상의 성분을 제공하는 포유동물 세포를 성장시키는데 사용되는 영양소 용액을 나타낸다:
1) 에너지원, 일반적으로 탄수화물, 예컨대 글루코스의 형태;
2) 필수 아미노산 중 일부 또는 이들 전부, 및 일반적으로 20개 아미노산의 기본 세트 및 시스틴;
3) 비타민 및/또는 전형적으로 낮은 농도에서 요구되는 다른 유기 화합물;
4) 유리 지방산; 및
5) 미량 원소, 여기서 미량 원소는 전형적으로 매우 낮은 농도, 일반적으로 마이크로몰 범위에서 요구되는 무기 화합물 또는 천연 발생 성분으로 규정된다.
영양소 혼합물은 하기 카테고리 중 어느 하나로부터의 하나 이상의 성분으로 임의로 보충될 수 있다:
1) 호르몬 및 다른 성장 인자, 예를 들어 인슐린, 트랜스페린 및 표피 성장 인자;
2) 염 및 완충제, 예를 들어 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트; 및
3) 뉴클레오시드, 예컨대, 예를 들어 아데노신 및 티미딘.
세포 배양 배지는 일반적으로 배지가 임의의 포유동물 공급원으로부터의 혈청 (예를 들어, 태아 소 혈청 (FBS))이 본질적으로 비함유인 경우 "혈청 비함유"이다. "본질적으로 비함유"는 세포 배양 배지가 약 0-5％ 혈청, 바람직하게는 약 0-1％ 혈청, 가장 바람직하게는 약 0-0.1％ 혈청을 포함하는 것을 의미한다. 유리하게는, 혈청-비함유 "한정" 배지가 사용될 수 있고, 여기서 배지의 각각의 성분의 동일성 및 농도는 공지되어 있다 (즉, 비한정 성분, 예컨대 소 뇌하수체 추출물 (BPE)은 배양 배지에 존재하지 않음).
본 발명의 문맥에서 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 이러한 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 (숙주) 세포"는 1차 대상 세포 및 전달 횟수와는 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손은 의도적이거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해 DNA 내용물이 정확히 일치하지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도되는 경우, 이는 문맥으로부터 명백할 것이다.
용어 "동물 숙주 세포", "동물 세포", "동물 재조합 숙주 세포" 등은 무척추동물, 비-포유동물 척추동물 (예를 들어, 조류, 파충류 및 양서류) 및 포유동물 세포를 포함한다. 무척추동물 세포의 예는 하기 곤충 세포를 포함한다: 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (쐐기벌레), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori). 예를 들어, 문헌 [Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 (1988)]; [Miller et al., in Genetic Engineering, Setlow, J. K. et al., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279]; 및 [Maeda et al., Nature, 315:592-594 (1985)]을 참조한다.
용어 "포유동물 숙주 세포," "포유동물 세포," "포유동물 재조합 숙주 세포" 등은 적절한 영양소 및 성장 인자를 함유하는 배지 중 단일층 배양물 또는 현탁액 배양물에 놓여있는 경우 성장 및 생존할 수 있는 포유동물로부터 유래된 세포주를 나타낸다. 특정 세포주에 대한 필수 영양소 및 성장 인자는 과도한 실험없이 경험적으로 용이하게 결정된다 (예를 들어, 문헌 [Mammalian Cell Culture (Mather, J. P. ed., Plenum Press, N. Y. (1984))] 및 [Barnes and Sato (Cell, 22:649 (1980))]에 기재된 바와 같음). 전형적으로, 세포는 많은 양의 관심있는 특정 단백질 (전형적으로, 재조합 단백질)을 배양 배지로 발현 및 분비할 수 있고, 이 목적을 위해 배양된다. 그러나, 세포는 다양한 다른 목적을 위해 배양될 수도 있고, 본 발명의 범위는 세포 배양 뿐만 아니라 재조합 단백질의 생성으로 제한되지는 않는다. 본 발명의 배지에서 성장할 수 있는 적합한 포유동물 세포주의 예는, SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVI 세포주 (COS-7, ATCC® CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 293S (문헌 [Graham et al., J. Gen. Virolo., 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC® CCL 10); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod., 23:243 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CVI-76, ATCC® CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC® CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC® CCL 2); 개과동물 신장 세포 (MDCK, ATCC® CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC® CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC® CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 세포 (MMT 060562, ATCC® CCL 5I); 래트 간세포암 세포 (HTC, MI.54, 문헌 [Baumann et al., J. Cell Biol., 85:1 (1980)]); 및 TR-1 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44 (1982)]) 및 하이브리도마 세포주를 포함한다. 차이니즈 햄스터 난소 세포 (문헌 [Urlab and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)])는 본 발명의 실시에 바람직한 세포이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 CHO 세포는 또한 하기 문헌에 기재되어 있다: EP 117,159 (1989년 8월 29일 공개); 미국 특허 번호 4,766,075; 4,853,330; 5,185,259; 문헌 [Lubiniecki et al., in Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, Spier et al., eds. (1989), pp. 442-451]. 본원에 사용하기에 적합한 공지된 CHO 유도체는, 예를 들어 CHO/-DHFR (문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)]), CHO-K1 DUX B11 (문헌 [Simonsen and Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499(1983)]; [Urlaub and Chasin, 상기 문헌]), 및 dp 12.CHO 세포 (EP 307,247, 1989년 3월 15일 공개))를 포함한다. 바람직한 숙주 세포는 CHO-K1 DUX B11 및 dp 12.CHO 세포를 포함한다.
"dhfr- CHO 세포"는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 결핍 CHO 세포를 나타낸다. 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 생성은 임상적 적용을 위한 다수의 크고, 복잡한 글리코실화 폴리펩티드의 제조를 허용한다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) DHFR- 세포 및 증폭가능한 선택 마커 DHFR은 일상적으로 임상적으로 유용한 양의 생성물을 생성하는 세포주를 구축하는데 사용된다. (문헌 [Urlab, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220]; [Kaufman, R. J. and Sharp, P. (1982) J. Mol. Biol., 159, 601-621]; [Gasser, C. S., Simonsen, C. S., Schilling, J. W. and Schmike, R. T. (1982) Proc. Natl Sci. USA, 79, 6522-6526]).
"단계"는 전문가에 의해 널리 인식된 바와 같이 세포의 배양의 특정 단계를 의미한다.
세포 배양물의 "성장 단계"는 세포가 일반적으로 빠르게 분할하는 지수 세포 성장 (log 단계) 기간을 나타낸다. 이 단계 동안, 세포는 소정의 기간 동안, 일반적으로 1 내지 4일 동안, 세포 성장이 최대화되는 조건하에 배양된다. 숙주 세포에 대한 성장 주기는 과도한 실험없이 계획된 특정 숙주 세포에 대해 결정될 수 있다. 성장 단계 동안, 세포는 일반적으로 약 30-40℃, 바람직하게는 약 37℃에서, 습윤 제어된 대기 중에서 필요한 첨가제를 함유한 영양소 배지에서 특정 세포주에 대한 최적의 성장이 달성되도록 배양된다. 세포는 약 1 내지 4일, 일반적으로 약 2 내지 3일의 기간 동안 성장 단계에서 유지된다.
세포 배양의 "전이 단계"는 생성 단계를 위한 배양 조건이 사용되는 동안의 기간을 나타낸다. 전이 단계 동안 환경 요인, 예컨대 온도는 성장 조건에서 생성 조건으로 이동한다.
세포 배양의 "생성 단계"는 세포 성장이 안정상태에 도달한 동안의 기간을 나타낸다. 생성 단계 동안, 대수 세포 성장은 종결되고, 단백질 생성이 가장 우선이다. 이 기간 동안 배지는 일반적으로 계속된 단백질 생성을 지지하고 바람직한 단백질 생성물을 달성하기 위해 보충된다.
본원에 사용된 경우 어구 "유가 세포 배양"은 동물 (예를 들어, 포유동물) 세포 및 배양 배지가 초기에 배양 용기에 공급되고, 추가의 배양 영양소가 배양 종결 전에 주기적으로 세포 및/또는 생성물을 수확하거나 수확하지 않으면서 배양 동안 배양물에 연속적으로 또는 불연속적인 증가량으로 공급되는 회분 배양을 나타낸다. 유가 배양은 주기적으로 전체 배양물 (세포 및 배지 포함)을 제거하고, 새로운 배지로 대체하는 "반연속 유가 배양"을 포함한다. 유가 배양은 세포 배양을 위한 모든 성분 (동물 세포 및 모든 배양 영양소 포함)이 배양 방법을 시작할 때 배양 용기에 공급되는 단순한 "회분 배양"과 구별된다. 방법 동안 배양 용기로부터 상청액이 제거되지 않는 한, 유가 배양은 관류 배양과 또한 구별될 수 있다 (관류 배양에서는, 세포가 예를 들어 여과, 캡슐화, 미세담체에의 고착 등에 의해 배양물에서 구속되고, 배양 배지가 연속적으로 또는 간헐적으로 도입되고 배양 용기로부터 제거됨). 그러나, 유가 세포 배양 동안 시험 목적을 위한 샘플의 제거가 고려된다.
본원에 사용된 경우, 용어 "글루타민"은 단백질 합성을 위한 아미노산 빌딩 블록 및 세포 배양의 에너지원 둘 모두로 인식되는 아미노산 L-글루타민 (또한, 각각 3-문자 및 단일-문자 명명법에 의해 "Gln"과 "Q"로 공지됨)을 나타낸다. 따라서, 용어 "글루타민" 및 "L-글루타민"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
단어 "글루코스"는 독립적으로 또는 함께 α-D-글루코스 또는 β-D-글루코스를 나타낸다. α 및 β 글루코스 형태는 용액에서 호환가능하다는 것에 주목한다.
표현 "오스몰랄농도"는 수용액 내의 용해된 용질 입자의 삼투압의 척도이다. 용질 입자는 이온 및 비-이온화된 분자 모두를 포함한다. 오스몰랄농도는 1 kg의 물에 용해된 삼투 활성 입자의 농도 (즉, 오스몰)로서 표현된다 (38℃에서 1 mOsm/kg H2O는 19 mmHg의 삼투압과 동등함). "오스몰농도"는 1 리터의 용액에 용해된 용질 입자의 수를 의미한다. 그의 오스몰랄농도를 증가시키도록 배양 배지에 첨가될 수 있는 용해질은 단백질, 펩티드, 아미노산, 비-대사 중합체, 비타민, 이온, 염, 당, 대사물, 유기산, 지질 등을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 배양 배지에서 아미노산 및 NaCl의 농도는 본원에 열거된 바람직한 오스몰랄농도 범위를 달성하기 위해 증가된다. 본원에 사용될 때, 약어 "mOsm"은 "밀리오스몰/kg H2O"를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "세포 밀도"는 주어진 부피의 배지 중에 존재하는 세포의 수를 나타낸다.
본원에 사용된 "세포 생존율"은 주어진 일정 배양 조건 또는 실험 변수하에 생존하는 배양 중의 세포의 능력을 나타낸다. 본원에 사용된 이 용어는 또한 특정 시간에 배양물 중에 살아있는 세포와 사멸한 세포의 총 수와 비교한, 상기 시간에 살아있는 세포의 분율을 나타낸다.
용어 "아미노산들" 및 "아미노산"은 이들의 D 및 L 입체이성질체 형태 둘 모두 및 이들의 유사체 및 유도체의 모든 천연 발생 알파 아미노산을 나타낸다. 유사체는 일반적으로 유사한 특성을 갖는 상이한 원자를 갖는 아미노산의 원자의 치환물로 규정된다. 유도체는 또 다른 분자 또는 원자를 이에 부착된 아미노산으로 규정된다. 유도체는 예를 들어 시스틴을 형성하기 위한 아미노 기의 아세틸화, 카르복실 기의 아미노화 또는 2개 시스테인 분자의 황 잔기의 산화를 포함할 것이다.
용어 "단백질"은 보다 높은 수준의 3차 및/또는 4차 구조를 생성하는데 충분한 쇄 길이의 아미노산들의 서열을 나타낸다. 이는 이같은 구조가 없는 "펩티드" 또는 분자량이 작은 다른 약물과 구별되어야 한다. 전형적으로, 본원에서의 단백질은 분자량이 약 15-20 kD 이상, 바람직하게는 약 20 kD 이상일 것이다. 본원에서의 정의에 포함되는 단백질의 예로는 모든 포유동물 단백질, 특히, 치료 및 진단 단백질, 예컨대 치료 및 진단 항체가 포함되고, 일반적으로, 하나 이상의 쇄간 및/또는 쇄내 디술피드 결합을 포함하는 다중쇄 폴리펩티드가 포함되는, 하나 이상의 디술피드 결합을 함유하는 단백질이 포함된다.
용어 "치료 단백질" 또는 "치료 폴리펩티드"는, 그의 적응증 또는 작용 메커니즘과 상관 없이, 질환의 치료에서 사용되는 단백질을 나타낸다. 치료 단백질이 임상에서 유용하기 위해서, 이는 대량으로 제작되어야 한다. 치료 단백질 또는 다른 단백질의 "제작 규모" 생성은 생성될 단백질 및 필요에 따라 약 400 L 내지 약 80,000 L 범위의 세포 배양물을 이용한다. 전형적으로, 이같은 제작 규모 생성은 약 400 L 내지 약 25,000 L 범위의 세포 배양 크기를 이용한다. 이러한 범위 내에서, 4,000 L, 약 6,000 L, 약 8,000 L, 약 10,000 L, 약 12,000 L, 약 14,000 L, 또는 약 16,000 L와 같은 특정 세포 배양 크기가 이용된다.
본원에 사용된 "관심있는 폴리펩티드"는 일반적으로 약 10개 초과 아미노산을 갖는 펩티드 및 단백질을 나타낸다. 폴리펩티드는 숙주 세포와 동종일 수 있거나, 또는 바람직하게는 외인성일 수 있고, 이는 그들이 사용될 숙주 세포에 이종, 즉 외래물질이라는 것을 의미한다 (예컨대, 인간 단백질이 비-인간 포유동물, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 의해 생성됨). 바람직하게는, 포유동물 폴리펩티드 (본래 포유동물 유기체로부터 유래된 폴리펩티드)가 사용되고, 보다 바람직하게는 직접적으로 배지에 분비되는 것이 사용된다. 용어 "폴리펩티드" 또는 "관심있는 폴리펩티드"는 구체적으로 항체, 특히 아래 열거된 임의의 포유동물 폴리펩티드와 같은 포유동물 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 이들의 단편, 뿐만 아니라 이뮤노어드헤신 (폴리펩티드-Ig 융합), 예컨대 아래 열거된 임의의 포유동물 폴리펩티드를 포함하는 것 또는 이들 단편을 포함한다.
포유동물 폴리펩티드의 예는 비제한적으로 막횡단 분자 (예를 들어 수용체) 및 리간드, 예컨대 성장 인자를 포함한다. 예시적 폴리펩티드는 분자, 예컨대 레닌; 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β, 및 -γ; 지단백질; α-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA), 예컨대 t-PA 변이체; 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (정상적으로 T-세포 발현 및 분비된 활성화에 대한 조절); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-α); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러-억제 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 β-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양 인자, 예컨대 골-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β, 예컨대 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, CD40; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β, 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥시드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 가속화 인자; 바이러스 항원, 예컨대, 예를 들어 AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER1 (EGFR), HER2, HER3 또는 HER4 수용체; Apo2L/TRAIL, 헤지호그(hedgehog), 미토겐 활성화 단백질 키나제 (MAPK), 및 임의의 상기-열거된 폴리펩티드의 단편을 포함한다. Apo2L (TRAIL) 및 변이체는 예를 들어 미국 출원 공보 번호 20040186051에 개시되어 있다. 항-VEGF 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 8,994,879; 7,060,269; 7,169,901; 및 7,297,334에 개시되어 있다. 항-CD20 항체는 예를 들어 미국 출원 공보 번호 20060246004에 개시되어 있다. BR3 폴리펩티드, 항-BR3 항체 및 BR3-Fc 이뮤노어드헤신은 예를 들어 미국 출원 공보 번호 20050070689에 기재되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "이뮤노어드헤신"은 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합한 항체-유사 분자를 나타낸다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외 (즉, "이종")의 바람직한 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 수용체 또는 리간드의 적어도 결합 부위를 포함하는 인접한 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 내의 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 단백질은 항체이다. "항체" (Ab) 및 "이뮤노글로불린" (Ig)은 구조적 특성이 동일한 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 대해 결합 특이성을 나타내지만, 이뮤노글로불린은 항체, 및 일반적으로 항원 특이성이 결여된 다른 항체 유사 분자 둘다를 포함한다. 상기 항체 유사 분자의 폴리펩티드는 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로, 골수종에 의해 증가된 수준으로 생성된다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체 (이뮤노글로불린 Fc 영역이 있는 전장 항체 또는 무손상 모노클로날 항체 포함), 폴리에피토프 특이성이 있는 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 다가 항체, 2개 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 디아바디, 및 단일쇄 분자, 예컨대 scFv 분자, 뿐만 아니라 항체 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 구체적으로 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 표현 "다가 항체"는 본 명세서 전반에 걸쳐 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 나타내는데 사용된다. 다가 항체는 전형적으로 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 조작되고, 일반적으로 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아니다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "온전한 항체"는 본원에서 구별없이 사용되며, 하기 정의된 바와 같은 항체 단편이 아니라 실질적으로 무손상인 형태의 항체를 나타낸다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다.
"항체 단편"은 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하여 항원에 결합하는 능력을 보유하는, 무손상 항체의 일부만을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하여 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 항체 단편은, 본래 항체 내에 존재하는 경우에 Fc 영역과 통상적으로 연관된 생물학적 기능들, 예를 들어 FcRn 결합성, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합성 중의 적어도 하나의 기능을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암(arm)을 포함할 수 있다.
항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편 (각각 단일 항원-결합 부위를 가짐) 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 용이하게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. 펩신 처리하면, 2개의 항원-결합 부위를 갖고 항원과 여전히 가교 결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)에 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는, Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다. 본 발명의 정의에 포함되는 항체 단편의 예는 다음을 포함한다: (i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fab 단편, (ii) CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fab 단편인 Fab' 단편, (iii) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편, (iv) VH 및 CH1 도메인을 갖고 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fd' 단편, (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편, (vi) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)]), (vii) 단리된 CDR 영역, (viii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편, (ix) 단일 쇄 항체 분자 (예를 들어, 단일 쇄 Fv; scFv) (문헌 [Bird et al., Science 242:423-426 (1988)]; 및 [Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)]), (x) 동일 폴리펩티드 쇄로 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 "디아바디" (예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조), (xi) 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 병렬식 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 "선형 항체" (문헌 [Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057 1062 (1995)]; 및 미국 특허 번호 5,641,870).
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 회합된 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv (scFv) 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합에 의해 연결될 수 있다. 이러한 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면의 항원 결합 부위를 규정한다. 전체적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 이들이 단일 폴리펩티드 쇄로 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 동일 폴리펩티드 쇄 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타낸다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO93/1161; 문헌 [Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134]; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 상세하게 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디가 또한 [Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 별개의 항체의 혼합물이 아니라는 것으로 나타낸다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원에 대하여 지시된다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 전형적으로 표적과 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서의 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수 개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열을 선별하는 것을 포함하는 공정으로 수득된 것이다. 예를 들어, 선별 방법은 복수개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화도 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양물 중 그의 생성 개선, 생체내에서의 그의 면역원성 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해해야 한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단결정자에 대해 지시된다. 모노클로날 항체 제제는 이것의 특이성에 더하여 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않았다는 점에서 유리하다.
수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 참조), 및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생성하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다.
구체적으로, 본원에서의 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄 (들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 바람직한 특이성, 친화도 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 치환된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비인간 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되게 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409를 참조한다. 또한 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는 항원을, 항원 시험감염에 반응하여 항체를 생성시키도록 변형시켰지만, 그의 내인성 유전자좌는 무력화시킨 트랜스제닉(transgenic) 동물, 예를 들어 면역화시킨 제노마우스(xenomouse) (예를 들어, XENOMOUSETM 기술에 관한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 참조)에 투여함으로써 제조할 수 있다. 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관해서는 예를 들어 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]을 참조한다. 인간화 항체는 또한 항체의 항원-결합 영역이 마카쿠 원숭이를 관심있는 항원으로 면역화시킴으로써 생성된 항체로부터 유도된 프리마티즈드(Primatized)TM 항체를 포함할 수 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외된다. 인간 항체는 다양한 당업계의 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되는데, 이러한 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다 (문헌 [Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)]: [Sheets et al. PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998)]; [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]). 인간 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 내인성 이뮤노글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스에 도입시켜 제조될 수도 있다. 시험접종시에, 인간 항체 생성이 관찰되고, 이것은 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하다. 이러한 접근법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 및 하기 학술 간행물에 기재되어 있다: 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368:812-13 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]. 대안적으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생성하는 인간 B 림프구를 불멸화시킴으로써 제조될 수 있다 (이러한 B 림프구는 개체로부터 회수될 수도 있고, 또는 시험관내 면역화되었을 수도 있음). 예를 들어, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991)] 및 미국 특허 번호 5,750,373을 참조한다.
"친화도 성숙된" 항체는 그의 하나 이상의 CDR/HVR 내에 하나 이상의 변경이 있어 이러한 변경(들)이 없는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도가 개선된 것이다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어는 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 제조된다. 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있다. CDR/HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이 유발이 다음 문헌에 기재되어 있다: 문헌 [Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)].
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 나타낸다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로서 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타낸다는 사실을 나타내고, 각 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성이 항체 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역 (HVR)으로 불리는 3개의 절편에 농축시켰다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, β-시트 형태를 주로 채택하는 4개의 FR을 포함하고, 이들은 상기 β-시트 구조를 연결하며 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접 수반되지는 않지만, 항체-의존적 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"가 본원에 사용되는 경우, 이들은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 예를 들어, 용어 초가변 영역은 서열 내에 초가변적이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는, 항체 가변 도메인의 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 정밀한 특이성을 부여하는데 특유의 역할을 수행한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)]; [Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 천연 발생 카멜리드(camelid) 항체는 경쇄의 부재하에 기능적이고 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]; [Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.
임의의 척추동물 종의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)라고 불리는 2개의 분명하게 상이한 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 다양한 클래스로 배정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이중 몇 가지는 하위클래스 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 이뮤노글로불린의 상이한 클래스들의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 주지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 일반적으로 기재되어 있다. 항체는 항체 및 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성되는, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "Fc 영역"은 무손상 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인인 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다.
본원에서의 "Fc 영역 쇄"는 Fc 영역의 2개의 폴리펩티드 쇄 중 하나를 의미한다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" ("Cg2" 도메인으로 또한 지칭됨)은 다른 도메인과 밀접하게 쌍 형성되지 않는 유일한 것이다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 배치된다. 탄수화물이 도메인-도메인 쌍 형성에 대한 대체물을 제공할 수 있고 CH2 도메인의 안정화를 도울 수 있다고 추정되었다. 문헌 [Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)]. 본원에서의 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다.
"CH3 도메인"은 Fc 영역에서 CH2 도메인에 대해 C-말단인 잔기의 스트레치를 포함한다. 본원에서 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인일 수 있다 (예를 들어, 그의 하나의 쇄에 도입된 "돌출부"를 포함하고 그의 다른 쇄에 상응하는 도입된 "공동"을 포함하는 CH3 도메인; 본원에서 명백하게 참고로 포함된 미국 특허 5,821,333 참조). 이러한 변이체 CH3 도메인을 사용하여 본원에서 기재된 바와 같은 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체를 제조할 수 있다.
본원에서의 "힌지 영역"은 천연 서열 힌지 영역 또는 변이체 힌지 영역일 수 있다. 변이체 힌지 영역의 2개의 폴리펩티드 쇄는 일반적으로 폴리펩티드 쇄 1개 당 하나 이상의 시스테인 잔기를 보유하고, 이에 따라 변이체 힌지 영역의 2개의 폴리펩티드 쇄는 2개의 쇄 사이에서 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 본원에서의 바람직한 힌지 영역은 천연 서열 인간 힌지 영역, 예를 들어 천연 서열 인간 IgG1 힌지 영역이다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합, 보체-의존적 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC), 식작용, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체, BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능에는 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것이 요구되고, 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위해 당업계에 공지된 다양한 검정을 이용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 이들의 천연 발생 변이체를 포함한다.
"무손상" 항체는 항원-결합 가변 영역, 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이것의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는 것이 바람직하다.
"모 항체" 또는 "야생형" 항체는 본원에 개시된 항체 변이체와 비교하여 하나 이상의 아미노산 서열 변경이 없는 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 따라서, 일반적으로 모 항체는 본원에 개시된 바와 같은 항체 변이체의 상응하는 초가변 영역의 아미노산 서열과 아미노산 서열 면에서 상이한 하나 이상의 초가변 영역을 갖는다. 모 폴리펩티드는 천연 서열 (즉, 천연 발생) 항체 (천연 발생 대립유전자 변이체 포함), 또는 천연 발생 서열의 선재성 아미노산 서열 변형 (예컨대 삽입, 결실 및/또는 다른 변경)이 있는 항체를 포함할 수 있다. 명세서 전반에 걸쳐, "야생형", "WT", "wt", 및 "모" 또는 "모의" 항체는 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 "항체 변이체" 또는 "변이체 항체"는 아미노산 서열이 모 항체의 아미노산 서열과 상이한 항체를 나타낸다. 바람직하게는, 항체 변이체는 자연에서 발견되지 않는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 그러한 변이체는 모 항체와의 서열 동일성 또는 유사성이 반드시 100％ 미만이다. 바람직한 실시양태에서, 항체 변이체의 아미노산 서열은 모 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 중 하나의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성이 약 75％ 내지 100％ 미만이고, 보다 바람직하게는 약 80％ 내지 100％ 미만, 보다 바람직하게는 약 85％ 내지 100％ 미만, 보다 바람직하게는 약 90％ 내지 100％ 미만, 및 가장 바람직하게는 약 95％ 내지 100％ 미만이다. 일반적으로 항체 변이체는 그의 하나 이상의 초가변 영역 내에 또는 이에 인접하여 하나 이상의 아미노산 변경을 포함하는 것이다.
"변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교해서 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 전형적으로, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 예를 들어 약 80％ 이상의 서열 동일성, 또는 약 90％ 이상의 서열 동일성, 또는 약 95％ 이상 또는 그보다 높은 서열 동일성을 가질 것이다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예에는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비된 Ig가 이러한 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하여 이후에 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 나타낸다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 다르게는 또는 추가로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 생체내 평가할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 이펙터 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 일반적으로 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원으로부터, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 PBMC 또는 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위클래스의 수용체를 포함하며, 이들은 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하는데, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (예를 들어, 문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 예를 들어 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함하는 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 및 이뮤노글로불린의 항상성 조절을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)]; [Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)]; [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)]; WO 2004/92219 (Hinton 등) 참조).
인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 인간 FcRn에 대한 생체내 결합 및 혈청 반감기는, 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 투여한 영장류에서 검정할 수 있다. WO 2000/42072 (Presta)에는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 또한 예를 들어 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조한다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재하에 표적 세포의 용해를 나타낸다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 서브클래스의 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재되어 있는 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 변이체 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가되거나 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 또한 참조한다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 하나 이상의 CDR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 제조된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이 유발은 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
용어 "치료 항체"는 질환의 치료시에 사용되는 항체를 나타낸다. 치료 항체는 다양한 작용 메카니즘을 가질 수 있다. 치료 항체는 항원과 관련된 표적에 결합하여 그의 정상적인 기능을 중화할 수 있다. 예를 들어, 암 세포의 생존에 필요한 단백질의 활성을 차단하는 모노클로날 항체는 암 세포의 사멸을 유발한다. 또 다른 치료적 모노클로날 항체는 항원과 관련된 표적에 결합하여 그의 정상적인 기능을 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 세포상의 단백질에 결합하여 세포자멸 신호를 촉발할 수 있다. 또 다른 모노클로날 항체는 질환에 걸린 조직에서만 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있고; 모노클로날 항체에 대한 독성 페이로드(payload) (효과적인 작용제), 예컨대 화학요법제 또는 방사선 작용제의 접합으로 독성 페이로드를 질환에 걸린 조직에 특이적으로 전달하기 위한 작용제가 생성될 수 있고, 이는 건강한 조직에 대한 피해를 감소시킨다. 치료 항체의 "생물학적 기능적 단편"은 무손상 항체에 귀착되는 생물학적 기능들 중 일부 또는 전체는 아니지만 하나 이상을 나타내고, 적어도 상기 활성은 표적 항원에 대한 특이적 결합을 포함한다.
항체는 임의의 단백질, 예컨대 비제한적으로 다수의 HER 수용체 부류, 예컨대 HER1 (EGFR), HER2, HER3 및 HER4; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD21, CD22, 및 CD34; 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mol, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 av/p3 인테그린, 예컨대 α 또는 β 또는 이들의 서브유닛 (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; 및 단백질 C에 결합할 수 있다. 다른 예시적 단백질은 성장 호르몬 (GH), 예컨대 인간 성장 호르몬 (hGH) 및 소 성장 호르몬 (bGH); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; α-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 , 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 우로키나제 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄바진; 트롬빈; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나제; RANTES (정상적으로 T-세포 발현 및 분비된 활성화에 대한 조절); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-α); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA); 뮐러-억제 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; DNase; 인히빈; 액티빈; 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양 인자, 예컨대 골-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β, 예컨대 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I); 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); 에리트로포이에틴 (EPO); 트롬보포이에틴 (TPO); 골유도성 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β, 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥시드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 가속화 인자 (DAF); 바이러스 항원, 예컨대, 예를 들어 AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 이뮤노어드헤신; 항체; 및 임의의 상기-열거된 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다. 다수의 다른 항체 및/또는 다른 단백질이 본 발명에 따라 사용될 수 있고, 상기 목록은 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
특히 관심있는 치료 항체는 임상적 종양학적 실시 또는 개발 중인 것, 예컨대 시판되는 아바스틴(AVASTIN)® (베바시주맙), 헤르셉틴(HERCEPTIN)® (트라스투주맙), 루센티스(LUCENTIS)® (라니비주맙), 랍티바(RAPTIVA)® (에팔리주맙), 리툭산(RITUXAN)® (리툭시맙), 및 졸레어(XOLAIR)® (오말리주맙), 뿐만 아니라 항-아밀로이드 베타 (A베타), 항-CD4 (MTRX1011A), 항-EGFL7 (EGF-유사-도메인 7), 항-IL13, 아포맙 (항-DR5-표적화된 전-아폽토시스 수용체 효능제 (PARA), 항-BR3 (CD268, BLyS 수용체 3, BAFF-R, BAFF 수용체), 항-베타 7 인테그린 서브유닛, 다세투주맙 (항-CD40), GA101 (항-CD20 모노클로날 항체), MetMAb (항-MET 수용체 티로신 키나제), 항-뉴로필린-1 (NRP1), 오크렐리주맙 (항-CD20 항체), 항-OX40 리간드, 항-산화된 LDL (oxLDL), 페르투주맙 (HER 이량체화 억제제(HDI)), 및 rhuMAb IFN 알파를 포함한다.
항체의 "생물학적 기능적 단편"은 무손상 항체의 일부만을 포함하고, 이때 이 부분은 무손상 항체 내에 존재할 때 이 부분과 정상적으로 관련된 기능을 하나 이상, 많게는 대부분 또는 전부 유지한다. 한 실시양태에서, 항체의 생물학적 기능적 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 유지한다. 또 다른 실시양태에서, 항체의 생물학적 기능적 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 기능, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 하나 이상을 유지한다. 한 실시양태에서, 항체의 생물학적 기능적 단편은 생체내 반감기가 무손상 항체와 실질적으로 유사한 일가 항체이다. 예를 들어, 이같은 항체의 생물학적 기능적 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
용어 "진단 단백질"은 질환의 진단에서 사용되는 단백질을 나타낸다.
용어 "진단 항체"는 질환에 대한 진단 시약으로서 사용되는 항체를 나타낸다. 진단 항체는 특정 질환과 특이적으로 관련된 또는 특정 질환에서 증가된 발현을 나타내는 표적 항원에 결합할 수 있다. 진단 항체는, 예를 들어 환자로부터의 생물학적 샘플 중의 표적 검출 또는 또는 환자 내 질환 부위, 예컨대 종양의 진단 영상화에 사용될 수 있다. 진단 항체의 "생물학적 기능적 단편"은 무손상 항체에 귀착되는 생물학적 기능들 중 일부 또는 전체는 아니지만 하나 이상을 나타내고, 적어도 상기 활성은 표적 항원에 대한 특이적 결합을 포함한다.
"정제된"은 분자가 함유된 샘플의 80-90 중량％ 이상의 농도로 분자가 샘플 내에 존재한다는 것을 의미한다. 정제된 단백질 (항체 포함)은 바람직하게는 본질적으로 순수하고, 바람직하게는 본질적으로 균질하다 (즉, 오염 단백질 등이 없음).
"본질적으로 순수한" 단백질은 조성물의 전체 중량을 기초로 약 90 중량％ 이상, 바람직하게는 약 95 중량％ 이상의 단백질을 포함하는 단백질 조성물을 의미한다.
"본질적으로 균질한" 단백질은 조성물의 전체 중량을 기초로 약 99 중량％ 이상의 단백질을 포함하는 단백질 조성물을 의미한다.
본원에 사용될 때, "가용성"은 수용액에서 완전히 용해되어 육안 검사로 평가할 때 가시적인 입자가 존재하지 않는 투명 내지 경미한 유백색 용액을 생성시키는 폴리펩티드를 의미한다. 용액의 혼탁도 (또는 단백질의 용해도)에 대한 추가의 검정은 20 mg/ml에서의 혼탁도가 0.05 흡광 단위 미만인 1 cm 통과거리 셀을 사용하여 340 nm 내지 360 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 수행할 수 있다.
"단리된" 항체 또는 폴리펩티드는 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 이것의 천연 환경의 오염물 성분은 항체의 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 여기에는 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리(Lowry) 방법으로 측정시에 95 중량％ 초과의 항체로, 일부 실시양태에서는 99 중량％ 초과로, (2) 예를 들어 스피닝 컵 서열분석기를 이용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들어 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 나타날 정도로 정제하였다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.
용어 "단백질 A" 및 "ProA"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 그의 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성에 의해 (예를 들어, 펩티드 합성에 의해 또는 재조합 기술에 의해) 생성된 단백질 A, 및 CH2/CH3 영역, 예컨대 Fc 영역이 있는 단백질에 결합하는 능력이 유지된 그의 변이체를 포함한다. 단백질 A는 레플리겐 (Repligen), 파마시아 (Pharmacia) 및 페르마테크 (Fermatech)로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 일반적으로 단백질 A는 고체 상 지지체 물질 상에 고정된다. 용어 "ProA"는 단백질 A가 공유결합에 의해 부착된 크로마토그래피 고체 지지체 매트릭스를 함유하는 친화도 크로마토그래피 수지 또는 칼럼을 또한 나타낸다.
용어 "크로마토그래피"는 혼합물의 개별적인 용질들이 이동 상의 영향하에 정지 매질을 통과하여 이동하는 속도에서의 차이의 결과로서, 또는 결합 및 용리 방법에서, 혼합물 내의 관심있는 용질이 혼합물 내의 다른 용질로부터 분리되는 방법을 나타낸다.
용어 "친화도 크로마토그래피" 및 "단백질 친화도 크로마토그래피"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 관심있는 단백질 또는 관심있는 항체가 생체특이적 리간드에 가역적으로 및 특이적으로 결합되는 단백질 분리 기술을 나타낸다. 바람직하게는, 생체특이적 리간드는 크로마토그래피 고체상 물질에 공유결합으로 부착되고, 용액이 크로마토그래피 고체상 물질에 접촉함에 따라 용액 내의 관심있는 단백질에 접근가능하다. 관심있는 단백질 (예를 들어, 항체, 효소, 또는 수용체 단백질)은 크로마토그래피 단계 동안 생체특이적 리간드 (예를 들어, 항원, 기질, 보조인자 또는 호르몬)에 대한 그의 특이적 결합 친화도를 유지하는 한편, 혼합물 내의 다른 용질 및/또는 단백질은 리간드에 감지할 수 있을 정도로 또는 특이적으로 결합하지 않는다. 고정된 리간드에 대한 관심있는 단백질의 결합은 관심있는 단백질은 고체상 매질 상의 고정된 리간드에 특이적으로 결합되어 유지되는 반면 오염 단백질 또는 단백질 불순물은 크로마토그래피 매질을 통과하도록 한다. 그후, 특이적으로 결합된 관심있는 단백질이 낮은 pH, 높은 pH, 높은 염, 경쟁 리간드 등으로 고정된 리간드로부터 활성 형태로 제거하고, 앞서 칼럼을 통과하도록 허용된 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 없이, 용리 완충제와 함께 크로마토그래피 칼럼을 통과한다. 임의의 성분이 그의 개별적인 특이적 결합 단백질, 예를 들어 항체를 정제하기 위한 리간드로서 사용될 수 있다.
용어 "비-친화도 크로마토그래피" 및 "비-친화도 정제"는 친화도 크로마토그래피가 사용되지 않은 정제 방법을 나타낸다. 비-친화도 크로마토그래피는 관심있는 분자 (예컨대 단백질, 예를 들어 항체)와 고체상 매트릭스 간의 비-특이적 상호작용에 의존하는 크로마토그래피 기술을 포함한다.
"양이온 교환 수지"는 음성 전하를 띠고, 따라서 고체상 상에 또는 이를 지나서 통과되는 수성 용액 내의 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온이 있는 고체상을 나타낸다. 고체상에 부착되어 양이온 교환 수지를 형성하는 음성 전하를 띠는 리간드는, 예를 들어, 카르복실레이트 또는 술포네이트일 수 있다. 시판되는 양이온 교환 수지에는 카르복시-메틸-셀룰로스, 아가로스 상에 고정된 술포프로필 (SP) (예를 들어, 파마시아의 SP-SEPHAROSE FAST FLOWTM 또는 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCETM), 및 아가로스 상에 고정된 술포닐 (예를 들어, 파마시아의 S-SEPHAROSE FAST FLOWTM)이 포함된다. "혼합 방식 이온 교환 수지"는 양이온성, 음이온성 및 소수성 잔기로 공유결합적으로 변형된 고체상을 나타낸다. 시판되는 혼합 방식 이온 교환 수지는 실리카 젤 고체상 지지 매트릭스에 부착된 약한 양이온 교환 기, 낮은 농도의 음이온 교환 기 및 소수성 리간드를 함유하는 BAKERBOND ABXTM (J.T. 베이커(Baker), 미국 뉴저지주 필립스버그)이다.
용어 "음이온 교환 수지"는 양성 전하를 띠는, 예를 들어 하나 이상의 양성 전하를 띠는 리간드, 예컨대 4급 아미노 기가 부착된 고체상을 지칭하도록 본원에 사용된다. 시판되는 음이온 교환 수지에는 DEAE 셀룰로스, QAE SEPHADEXTM 및 FAST Q SEPHAROSETM (파마시아)이 포함된다.
"완충제"는 짝산-짝염기 성분의 작용에 의해 pH의 변화에 내성이 있는 용액이다. 예를 들어, 완충제의 바람직한 pH에 따라 사용될 수 있는 다양한 완충제가 문헌 [Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)]에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 완충제의 pH는 약 2 내지 약 9, 대안적으로는 약 3 내지 약 8, 대안적으로는 약 4 내지 약 7, 대안적으로는 약 5 내지 약 7의 범위이다. 이러한 범위에서 pH를 제어할 완충제의 비-제한적인 예로는 MES, MOPS, MOPSO, 트리스(Tris), HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 및 암모늄 완충제, 뿐만 아니라 이들의 조합물이 포함된다.
"로딩(loading) 완충제"는 관심있는 폴리펩티드 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성물을 이온 교환 수지 상에 로딩하는데 사용되는 것이다. 로딩 완충제는 관심있는 폴리펩티드 분자 (및 일반적으로 하나 이상의 불순물)가 이온 교환 수지에 결합하도록 하거나 또는 관심있는 단백질은 칼럼을 통과하여 유동하는 한편 불순물은 수지에 결합하도록 하는 전도성 및/또는 pH를 갖는다.
"중간체 완충제"는 관심있는 폴리펩티드 분자를 용리시키기 전에 하나 이상의 불순물을 이온 교환 수지로부터 용리시키는데 사용된다. 중간체 완충제의 전도성 및/또는 pH는 하나 이상의 불순물은 이온 교환 수지로부터 방출되지만 유의한 양의 관심있는 폴리펩티드는 그렇지 않도록 하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "세정 완충제"는 관심있는 폴리펩티드 분자를 용리시키기 전에 이온 교환 수지를 세정 또는 재-평형화시키는데 사용된 완충제를 나타낸다. 편리하게, 세정 완충제 및 로딩 완충제가 동일할 수 있지만, 이것이 필수적이지는 않다.
"용리 완충제"는 관심있는 폴리펩티드를 고체상으로부터 용리시키는데 사용된다. 용리 완충제의 전도성 및/또는 pH는 관심있는 폴리펩티드가 이온 교환 수지로부터 용리되도록 하는 것이다.
"재생 완충제"는 이온 교환 수지가 재사용될 수 있도록 이온 교환 수지를 재생시키는데 사용될 수 있다. 재생 완충제는 실질적으로 모든 불순물 및 관심있는 폴리펩티드를 이온 교환 수지로부터 제거하는데 필요한 전도성 및/또는 pH를 갖는다.
본원에 사용되는 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 당업자가 2개의 수치값 (예를 들어, 하나는 본 발명의 항체와 관련이 있고, 다른 하나는 참조/비교 항체와 관련이 있음) (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 값의 함수로서 예를 들어 약 50％ 미만, 약 40％ 미만, 약 30％ 미만, 약 20％ 미만 및/또는 약 10％ 미만이다.
양 또는 수치와 관련하여 (화학적 환원 방법에 관해서는 아님) 본원에 사용된 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"이라는 구절은 2개의 수치 (일반적으로, 한 분자와 관련된 것 및 기준/비교물 분자와 관련된 다른 것) 간의 차이 정도가 충분히 높아서, 당업자가 2개의 값 간의 차이가 상기 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정되는 생물학적 특징의 정황에서 통계학적으로 유의한 것으로 간주하는 것을 의미한다. 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 예를 들어 약 10％ 초과, 약 20％ 초과, 약 30％ 초과, 약 40％ 초과 및/또는 약 50％ 초과이다.
용어 "벡터"는 본원에 사용된 그가 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 나타내고자 한 것이다. 한 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터", 또는 간단히 "발현 벡터"라 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(％)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭(gap)을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 ％ 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청(Copyright Office) (미국 20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재의 제넨테크, 인크.를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작업 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 ％ (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 ％를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
100 x X/Y의 분율
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 (프로그램의 정렬 A 및 B)에 의해 동일한 매치로 스코어링되는 아미노산 잔기의 개수이고,
Y는 B 내의 아미노산 잔기의 전체 개수이다.
아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 ％가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 ％와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 ％ 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 앞 단락에서 기재한 바와 같이 구한다.
"핵산 서열 동일성 (％)"은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일성을 달성한 후에, 기준 인자 D-코딩 서열 내의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드 비율 (％)로서 규정된다. 핵산 서열 동일성(％)을 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린 (디엔에이스타) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교될 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬 결정에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그 후, 더 긴 서열에 관하여 서열 동일성이 계산되고, 즉, 더 짧은 서열이 더 긴 서열의 일부분과의 100％ 서열 동일성을 나타내더라도, 전체적인 서열 동일성은 100％ 미만일 것이다.
"치료"는 치료 처치 및 예방 또는 방지 조치 둘 다를 나타낸다. 치료를 필요로 하는 대상에는 이미 장애가 있는 대상, 뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 대상이 포함된다. 본원에서의 "치료"는 질환의 완화 및 특정 질환의 징후 및 증상의 완화를 포함한다.
"장애"는 단백질로의 치료가 이로울 임의의 상태이다. 여기에는 만성 및 급성 장애 또는 질환 (포유동물이 당해 장애에 걸리기 쉬운 병리 상태 포함)이 포함된다. 본원에서 치료될 장애의 비-제한적인 예로는 암종 및 알레르기가 포함된다.
치료의 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 비-인간 고등 영장류, 다른 척추동물, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등이 포함되는, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 나타낸다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
B. 본 발명을 수행하기 위한 예시적인 방법 및 물질
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업계의 기술 내에 속하는 분자 생물학 등의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이와 같은 기술들에 대해서는 문헌에 완전하게 설명되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다:
Figure pat00001
1. 글루타민-비함유 세포 배양 배지를 사용하는 포유동물 숙주 세포에서의 단백질의 재조합 생성
본 발명은 아스파라긴이 보충된 글루타민-비함유 세포 배양 배지를 사용하는, 포유동물 숙주 세포에서의 단백질의 대규모 재조합 생성에 관한 것이다. 포유동물 세포는, 주로 적절하게 폴딩되고 조립된 이종 단백질을 생성하는 그의 능력 및 번역후 변형에 대한 그의 역량으로 인해, 임상 용도를 위한 포유동물 단백질의 생성을 위한 우세한 시스템이 되었다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 및 다양한 다른 포유동물원으로부터 수득한 세포주, 예를 들어, 마우스 골수종 (NS0), 베이비 햄스터 신장 (BHK), 인간 배아 신장 (HEK-293) 및 인간 망막 세포는 생물의약 제품, 예를 들어 치료 항체의 생성을 위해 규제 당국에서 승인을 받았다. 이들 중에서, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)가 가장 일반적으로 사용되는 산업용 숙주 중 하나이고, 이는 이종 단백질의 생성을 위해 널리 사용된다. 따라서, 디히드로폴레이트 리덕타제 음성 (DHFR-) CHO 세포를 포함한 CHO에서 항체의 대규모 생성을 위한 방법이 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Trill et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):553-60 (1995)] 및 미국 특허 번호 6,610,516 참조).
제1 단계로서, 바람직한 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)는 클로닝 (DNA의 증폭)을 위한 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터에 삽입될 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 (이들은 각각이 하기 기재됨). 사용될 수 있는 임의의 신호 서열, 복제 기점, 마커 유전자, 인핸서 요소 및 전사 종결인자 서열은 당업계에 공지되어 있고, PCT 공보 WO 97/25428에 더욱 상세히 기재되어 있다.
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 단백질-코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터는 구조 유전자의 시작 코돈의 상류 (5')에 위치한 미번역 서열 (일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내)로서 이들이 작동가능하게 연결된 특정 핵산 서열의 전사 및 번역을 제어한다. 이러한 프로모터는 전형적으로 두 가지 프로모터, 유도성 및 구성적 프로모터로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 몇몇 변화, 예를 들어 영양소 또는 온도 변화의 존재 또는 부재에 반응하여 그의 제어 하에서 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시하는 프로모터이다. 현재, 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 주지되어 있다. 이들 프로모터는 제한 효소 분해에 의해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고, 단리된 프로모터 서열을 벡터에 삽입하여 바람직한 단백질을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다.
원핵 및 진핵 숙주와 사용하기에 적합한 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, PCT 공보 번호 WO97/25428에서 더욱 상세히 기재되어 있다.
상기 나열한 성분들 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 표준 라이게이션 기법을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편은 필요한 플라스미드를 생성하기 위해 바람직한 형태로 절단, 재단, 및 재-라이게이션된다.
구축된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하기 위한 분석의 경우, 라이게이션 혼합물을 사용하여 이. 콜라이(E. coli) 세포, 예컨대 이. 콜라이 K12 균주 294 (ATCC® 31,446) 및 적절한 경우 암피실린 또는 테트라시클린 내성에 의해 선택된 성공적인 형질전환체를 형질전환시킬 수 있다. 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하고/거나, 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 분석하고/거나, 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 서열분석한다. (예를 들어, 문헌 [Messing et al., Nucleic Acids Res. 1981, 9:309]; [Maxam et al., Methods in Enzymology 1980, 65:499] 참조).
포유동물 세포에서 일시적 발현을 공급하는 발현 벡터가 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포에 다수의 카피의 발현 벡터가 축적되고, 다시 발현 벡터 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 의해 코딩된 바람직한 폴리펩티드의 높은 수준을 합성하도록, 일시적 발현은 숙주 세포에서 효율적으로 복제할 수 있는 발현 벡터의 사용을 포함한다. 적합한 발현 벡터 및 숙주 세포를 포함하는 일시적 발현 시스템이 바람직한 생물학적 또는 생리학적 특성에 대해 이러한 폴리펩티드의 빠른 스크리닝 뿐만 아니라 클로닝된 DNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 편리한 양성 확인을 허용한다.
재조합 척추동물 세포 배양물에서 바람직하나 이종 단백질의 합성에 적용하기에 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포가 문헌 [Gething et al., Nature 1981, 293:620-625]; [Mantei et al., Nature 1979, 281:40-46]; EP 117,060; 및 EP 117,058에 기재되어 있다.
대규모 생성을 위해, 본 발명에 따라 포유동물 숙주 세포는 형질감염되고, 바람직하게는 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 바람직한 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절한 것으로 변형된 영양소 배지내에서 배양된다.
형질감염은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되는지 여부와 상관 없이 숙주 세포 내로 발현 벡터가 들어가는 것을 나타낸다. 다수의 형질감염 방법, 예를 들어, CaPO4 및 전기천공이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 벡터의 작동의 임의의 지시가 숙주 세포 내에서 일어나는 경우 성공적인 형질감염이 일반적으로 인지된다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 구성요소에 의해 복제가능하도록 DNA를 생물 내로 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 그 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같은 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리, 또는 전기천공은 일반적으로 원핵세포 또는 실질적인 세포-벽 장벽을 함유하는 다른 세포에 대해 사용된다. 문헌 [Shaw et al., Gene 1983, 23:315] 및 PCT 공보 번호 WO 89/05859에 기재된 바와 같이, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 또한 식물은 초음파 처리 (PCT 공보 번호 WO 91/00358 (1991년 1월 10일 공개))을 사용하여 형질감염될 수 있다.
이러한 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 인산칼슘 침전 방법 (문헌 [Graham and van der Eb, Virology 1978, 52:456-457])이 사용될 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 측면은 미국 특허 번호 4,399,216에 기재되어 있다. 형질전환 포유동물 세포를 위한 다양한 기술에 대해, 또한 문헌 [Keown et al. Methods in Enzymology 1990, 185:527-537] 및 [Mansour et al. Nature 1988, 336:348-352]을 참조한다.
대규모 생성 동안, 생성 주기를 시작하기 위해, 일반적으로 적은 수의 형질전환된 재조합 숙주 세포를 수일 동안 배양액 내에서 성장시킨다. 일단 세포에 수회 라운드의 복제가 진행되면, 세포를 더 큰 용기로 옮겨서, 발효되도록 제조시킨다. 세포가 성장되는 배지, 및 생성 주기 동안 존재하는 산소, 질소 및 이산화탄소의 수준이 생성 방법에 유의하게 영향을 미칠 수 있다. 각각의 세포주에 대해 특이적으로 성장 파라미터가 결정되고, 최적의 성장 및 생성 조건을 확실히 하기 위해 이러한 파라미터들을 자주 측정한다.
세포가 충분한 수로 성장하면, 이를 대규모 생성 탱크로 옮겨 생성 단계를 시작하고, 더 오랜 기간 동안 성장시킨다. 방법에서의 이러한 시점에, 재조합 단백질을 수확할 수 있다. 전형적으로, 세포 배양 배지 내로 폴리펩티드를 분비하도록 세포가 조작되어서, 정제 방법에서의 첫번째 단계는 세포를 배지로부터 분리하는 것이다. 수확은 대체로 수확된 세포 배양 유체 (HCCF; Harvested Cell Culture Fluid)를 생성하는 원심분리 및 여과를 포함한다. 그후, 배지를 임의의 세포 잔해물, 원치 않는 단백질, 염, 무기물 또는 다른 바람직하지 않은 요소를 제거하는 여러 추가적인 정제 단계에 적용한다. 정제 방법의 말기에, 재조합 단백질은 고도로 순수하고, 인간 치료 용도에 적절하다.
이 방법이 지난 수십년에 걸쳐 많은 연구 및 개선의 대상이었을지라도, 재조합 단백질, 예컨대 항체의 대규모 상업적 생성의 추가의 개선이 요구된다. 따라서, 포유동물 숙주 세포 배양물의 세포 생존율, 수명 및 비생산성의 증가, 및 생성된 재조합 단백질의 역가의 개선은 생성된 재조합 단백질의 가격에 실제로 영향을 미치고, 치료 단백질의 경우 약품의 가격 및 유용성에 영항을 미친다.
본 발명은 세포 배양 방법의 생성 단계에서 아스파라긴이 첨가된 글루타민-비함유 배양 배지를 사용하여 포유동물 세포 배양물에서 이종성 단백질을 생성하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 사용되는 배양 배지는 포유동물 숙주 세포, 특히 CHO 세포에서 단백질의 재조합 생성을 위한 임의의 시판되는 배지에 기초할 수 있다.
시판되는 배양 배지의 예는 햄의 F10 (시그마), 최소 필수 배지 ("MEM", 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코의 변형된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ("DMEM", 시그마)를 포함한다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오시드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 겐타마이신(Gentamycin)TM 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물을 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함시킬 수도 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 이용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 본 발명의 배양 배지는 문헌 [Ham and McKeehan, Meth. Enz., 58: 44 (1979)]; [Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102: 255 (1980)]; 미국 특허 번호 4,767,704; 미국 특허 번호 4,657,866; 미국 특허 번호 4,927,762; 미국 특허 번호 5,122,469 또는 미국 특허 번호 4,560,655; WO 90/03430; 및 WO 87/00195에 기재된 임의의 배지에 기초할 수 있고, 단 글루타민은 성분으로부터 생략된다.
글루타민-비함유 조건하에, 포유동물 세포는 글루타민의 존재하에서만 아스파라긴을 합성할 수 있기 때문에 아스파라긴이 요구된다. 아스파라긴은 아스파라긴 신테타제의 존재하에 글루타민으로부터 아미드 전달에 의해 합성된다. 아스파라긴은 바람직하게는 2.5 mM 내지 15 mM 범위의 농도로 배양 배지에 첨가된다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 아스파라긴의 바람직한 농도는 2.5 mM 이상이어야 한다. 바람직한 실시양태에서, 아스파라긴은 10 mM의 농도에서 첨가된다.
일반적으로, 포유동물 세포 배양의 생산성을 극대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 실시 기술은 본원의 세포 배양 배지를 사용하는 재조합 단백질의 생성에서 찾아볼 수 있고, 이에 적합할 수 있다.
특정 세포주를 위한 배지 배지에 사용되는 필요 영양소 및 성장 인자 (이들의 농축물 포함)는, 예를 들어 문헌 [Mammalian Cell Culture, Mather, ed. (Plenum Press: NY, 1984)]; [Barnes and Sato, Cell, 22: 649 (1980)] 또는 [Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)]에 기재된 바와 같이 과도한 실험없이 경험적으로 결정된다. 적합한 배지는 기본 배지 성분, 예컨대 DMEM/HAM F-12-기재의 제제 (DMEM 및 HAM F12 배지 및 특히 혈청-비함유 배지의 조성물의 경우, 문헌 [American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Sixth Edition, 1988, pages 346-349]의 배양 배지 제제 참조)를, 변형된 농도의 일부 성분, 예컨대 아미노산, 염, 당, 및 비타민을 함유하고, 임의로 글리신, 하이포크산틴 및 티미딘; 재조합 인간 인슐린, 가수분해된 펩톤, 예컨대 PRIMATONE HSTM 또는 PRIMATONE RLTM (세필드, 영국), 또는 등가물; 세포 보호제, 예컨대 플루로닉 F68TM 또는 등가물 플루로닉 폴리올; 겐타마이신TM 및 미량 원소를 함유한다. 미국 특허 번호 5,122,469에 기재된 바와 같은 배지의 제제는 높은 수준의 특정 아미노산의 존재를 특징으로 할 뿐만 아니라, 하기 기재된 바와 같은 PS-20이 특히 적절하다.
본 발명의 당단백질은 다양한 세포 배양 조건하에 바람직한 당단백질을 발현하는 세포를 성장시켜 생성될 수 있다. 예를 들어, 당단백질의 대규모 또는 소규모 생성을 위한 세포 배양 절차는 본 발명의 맥락 내에서 잠재적으로 유용하다. 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병 배양 또는 교반 탱크 생물반응기 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않는 절차는 이후의 2가지 시스템에서 마이크로캐리어의 존재하에 또는 부재하에 사용될 수 있고, 대안적으로 유가 또는 연속 방식으로 작동될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양은 교반 탱크 생물반응기 시스템에서 수행하고, 유가 배양 절차를 사용한다. 바람직한 유가 배양에서, 포유동물 숙주 세포 및 배양 배지를 초기에 배양 용기에 공급하고, 배양 종결 전에 주기적으로 세포 및/또는 생성물을 수확하거나 수확하지 않으면서 배양 동안 배양물에 연속적으로 또는 불연속적인 증가량으로 추가의 배양 영양소를 공급한다. 유가 배양은 주기적으로 전체 배양물 (세포 및 배지 포함)을 제거하고, 새로운 배지로 대체하는 "반연속 유가 배양"을 포함할 수 있다. 유가 배양은 세포 배양을 위한 모든 성분 (동물 세포 및 모든 배양 영양소 포함)이 배양 방법을 시작할 때 배양 용기에 공급되는 단순한 회분 배양과 구별된다. 방법 동안 배양 용기로부터 상청액이 제거되지 않는 한, 유가 배양은 관류 배양과 또한 구별될 수 있다 (관류 배양에서는, 세포가 예를 들어 여과, 캡슐화, 미세담체에의 고착 등에 의해 배양물에서 구속되고, 배양 배지가 연속적으로 또는 간헐적으로 도입되고 배양 용기로부터 제거됨).
추가적으로, 구현되는 특정 숙주 세포 및 특정 생성 계획에 적절할 수 있는 임의의 체계 또는 관례에 따라 배양물의 세포가 증식될 수 있다. 따라서, 본 발명은 단일-단계 또는 배수-단계 배양 절차를 예상한다. 단일 단계 배양에서는, 숙주 세포가 배양 환경 내로 접종되고, 세포 배양물의 단일 생성 단계 동안 본 발명의 방법이 사용된다. 선택적으로, 다중-단계 배양은 계획된다. 다단계 배양에서는, 포가 다수의 단계 또는 기에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포 (가능하게는 저장물로부터 꺼내짐)가 성장 및 높은 생육력을 촉진하는데 적절한 배지 내로 접종되는 제1 단계 또는 성장 단계에서 세포가 성장될 수 있다. 숙주 세포 배양물에 신선한 배지를 첨가함으로써 적절한 기간 동안 세포가 성장 단계에서 유지될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에 따라, 세포 배양물의 성장 단계에서 포유동물 세포의 성장을 향상시키도록 유가 또는 연속 세포 배양 조건이 설계될 수 있다. 성장 단계에서, 성장용으로 최대화된 조건 및 기간으로 세포가 성장된다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH, 용해 산소 (DO2) 등은 특정 숙주와 함께 사용된 것이며, 당업자에게 명백할 것이다. 일반적으로, 산 (예를 들어, CO2) 또는 염기 (예를 들어, Na2CO3 또는 NaOH)를 사용하여 pH가 약 6.5 내지 7.5의 수준으로 조정된다. 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포를 배양하기 위한 적합한 온도 범위는 약 30℃ 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이고, 적합한 DO2는 공기 포화의 5-90％이다.
특정 기에서, 세포 배양물의 생성 기 또는 단계에 접종하는데 세포가 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 기술된 바와 같이, 생성 기 또는 단계는 접종 또는 성장 기 또는 단계와 연속적일 수 있다.
포유동물, 예를 들어 CHO 세포에서의 표적 단백질의 생성은 전형적으로 세포를 다양한 기간 동안 "시드-트레인(seed-train)" 중에서 배양하고, 접종 발효조에 주기적으로 전달하여 보다 큰 규모로 생성 발효조에 접종하기에 충분한 세포 집단을 생성하는 반-연속적 방법을 사용한다. 따라서, 바람직한 단백질의 생성을 위해 사용되는 세포는 다양한 기간 동안 최대 미리 규정된 세포 연령까지 배양된다. 세포 배양 방법의 파라미터, 예컨대 시드 밀도, pH, DO2 및 배양 동안의 온도, 생성 배양물의 지속 기간, 수확의 작업 조건 등은 사용되는 특정 세포주 및 배양 배지의 기능이고, 과도한 실험없이 경험적으로 결정될 수 있다.
본 발명에 따르면, 세포 배양물의 생성 단계 동안 세포-배양 환경은 제어된다. 바람직한 측면에서, 세포 배양 방법의 생성 단계는 세포 배양물의 생성 단계를 위한 파라미터가 사용되는 세포 배양물의 전이 단계에 앞선다.
바람직한 폴리펩티드, 예컨대 항체는 바람직하게는, 그것이 분비 신호 없이 직접적으로 생성되는 경우에 또한 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있더라도, 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수된다. 폴리펩티드가 막-결합된 경우, 이는 적절합 세제 용액 (예를 들어, 트리톤-X 100)을 사용하여 막으로부터 방출될 수 있거나 또는 그의 세포외 영역이 효소 절단에 의해 방출될 수 있다.
폴리펩티드가 인간 기원 중 하나가 아닌 재조합 세포에서 생성되는 경우, 이는 인간 기원의 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하지 않는다. 그러나, 바람직한 폴리펩티드에 대해 실질적으로 동종인 제제를 수득하기 위해 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 재조합 단백질을 회수 또는 정제하는 것이 일반적으로 필요하다. 제1 단계로서, 배양 배지 또는 용해물은 미립자 세포 잔해물을 제거하기 위해 원심분리될 수 있다. 이종 폴리펩티드는 그 후에 하기 절차가 적합한 예시적 정제 절차인 절차에 따라 오염 가용성 단백질 및 폴리펩티드로부터 정제된다: 이온-교환 칼럼, 예컨대 SP-세파로스TM 또는 CM-세파로스TM 히드록시아파타이트 상에서의 분별 증류; 소수성 상호작용 크로마토그래피; 에탄올 침전; 크로마토포커싱; 황산암모늄 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75TM를 사용하는 겔 여과 및/또는 정용여과.
재조합 폴리펩티드는 예를 들어 친화도 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다.
프로테아제 억제제, 예컨대 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF)는 또한 정제 동안 단백질분해 열화를 억제하는데 유용할 수 있고, 항생제는 부정 오염물질의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다. 당업자는 항체를 포함하는 재조합 단백질의 정제 및 단리에 적합한 정제 방법이 여기서 사용될 수 있고, 필요한 경우 표준 기술을 사용하여 변형될 수 있다는 것을 알 것이다.
바람직한 이종 단백질의 발현은 본원에 제공된 서열을 기반으로 적절하게 표지된 프로브를 사용하여 샘플에서 직접적으로, 예를 들어 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량화하기 위한 노던 블롯팅 (문헌 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77:5201-5205]), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 계내 혼성화에 의해 측정할 수 있다. 다양한 표지가 사용될 수 있고, 가장 통상적으로 방사성동위원소, 특히 32P가 사용될 수 있다. 그러나, 다른 기술, 예컨대 폴리뉴클레오티드로의 도입을 위한 비오틴-변형된 뉴클레오티드를 사용하는 기술이 또한 사용될 수 있다. 이어서, 비오틴은 아비딘 또는 항체에 대한 결합을 위한 부위를 제공하고, 이는 매우 다양한 표지, 예컨대 방사성뉴클레오티드, 형광물질 또는 효소로 표지될 수 있다. 대안적으로, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함한 특정 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 다시, 항체를 표지할 수 있고, 듀플렉스가 표면에 결합하는 검정을 수행하여, 표면 상에 듀플렉스가 형성되었을 때 듀플렉스에 결합된 항체의 존재가 검출될 수 있도록 할 수 있다.
대안적으로 유전자 발현은 유전자 생성물의 발현을 직접적으로 정량화하기 위해, 면역학적 방법, 예컨대 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 검정에 의해 측정될 수 있다. 면역조직화학 염색 기술을 사용하여, 세포 샘플을 전형적으로 탈수 및 고정, 이어서 커플링된 유전자 생성물에 특이적인 표지된 항체와의 반응에 의해 제조하고, 여기서 표지는 일반적으로 시각적으로 검출가능하며, 예컨대 효소 표지, 형광 표지, 발광 표지 등이다. 면역조직화학 염색 및/또는 샘플 유체의 검정에 유용한 항체는 모노클로날이거나 폴리클로날일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조될 수 있다.
2. 항체
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 치료 및 진단 항체를 포함한 항체의 재조합 생성에 사용된다. 본 발명의 범위 내의 항체는 항-HER2 항체, 예컨대 트라스투주맙 (헤르셉틴®) (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992)], 미국 특허 번호 5,725,856); 항-CD20 항체, 예컨대 키메라 항-CD20 "C2B8" (미국 특허 번호 5,736,137) (리툭산®), 2H7 항체의 키메라 또는 인간화 변이체 (미국 특허 번호 5,721,108B1), 또는 토시투모맙 (벡사르(BEXXAR)®); 항-IL-8 (문헌 [St John et al., Chest, 103:932 (1993)], 및 국제 공보 번호 WO 95/23865); 항-VEGF 항체, 예컨대 인간화 및/또는 친화도 성숙 항-VEGF 항체, 예컨대 인간화 항-VEGF 항체 huA4.6.1 아바스틴® (문헌 [Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992)], 국제 공보 번호 WO 96/30046, 및 WO 98/45331, 1998년 10월 15일 공개); 항-PSCA 항체 (WO01/40309); 항-CD40 항체, 예컨대 S2C6 및 이들의 인간화 변이체 (WO00/75348); 항-CD11a (미국 특허 번호 5,622,700, WO 98/23761, 문헌 [Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991)], 및 [Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)]); 항-IgE (문헌 [Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993)], 및 국제 공보 번호 WO 95/19181); 항-CD18 (미국 특허 번호 5,622,700, 1997년 4월 22일 허여, 또는 WO 97/26912, 1997년 7월 31일 공개); 항-IgE (예컨대, E25, E26 및 E27; 미국 특허 번호 5,714,338, 1998년 2월 3일 허여, 또는 미국 특허 번호 5,091,313, 1992년 2월 25일 허여, WO 93/04173 1993년 3월 4일 공개, 또는 국제 출원 번호 PCT/US98/13410, 1998년 6월 30일 출원, 미국 특허 번호 5,714,338); 항-Apo-2 수용체 항체 (WO 98/51793, 1998년 11월 19일 공개); 항-TNF-α 항체, 예컨대 cA2 (레미카데(REMICADE)®), CDP571 및 MAK-195 (미국 특허 번호 5,672,347, 1997년 9월 30일 허여, 문헌 [Lorenz et al., J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996)], 및 [Dhainaut et al., Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)] 참조); 항-조직 인자 (TF) (유럽 특허 번호 0 420 937 B1, 1994년 11월 9일 등록); 항-인간 α4β7 인테그린 (WO 98/06248, 1998년 2월 19일 공개); 항-EGFR (키메라 또는 인간화 225 항체 (WO 96/40210, 1996년 12월 19일 공개); 항-CD3 항체, 예컨대 OKT3 (미국 특허 번호 4,515,893, 1985년 5월 7일 허여); 항-CD25 또는 항-tac 항체, 예컨대 CHI-621 (시뮬렉트(SIMULECT)®) 및 (제나팍스(ZENAPAX)®) (미국 특허 번호 5,693,762 참조, 1997년 12월 2일 허여); 항-CD4 항체, 예컨대 cM-7412 항체 (문헌 [Choy et al., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)]); 항-CD52 항체, 예컨대 CAMPATH-1H (문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988)]); 항-Fc 수용체 항체, 예컨대 FcγRI에 대해 지시된 M22 항체 (문헌 [Graziano et al., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)]); 항-암배아성 항원 (CEA) 항체, 예컨대 hMN-14 (문헌 [Sharkey et al., Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995)]); 유방 상피 세포에 대해 지시된 항체, 예컨대 huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6 (문헌 [Ceriani et al., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995)]; 및 [Richman et al., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)]); 결장 암종 세포에 결합하는 항체, 예컨대 C242 (문헌 [Litton et al., Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996)]); 항-CD38 항체, 예를 들어 AT 13/5 (문헌 [Ellis et al., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)]); 항-CD33 항체, 예컨대 Hu M195 (문헌 [Jurcic et al., Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)]) 및 CMA-676 또는 CDP771; 항-CD22 항체, 예컨대 LL2 또는 림포시드(LymphoCide) (문헌 [Juweid et al., Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995)]); 항-EpCAM 항체, 예컨대 17-1A (파노렉스(PANOREX)®); 항-GpIIb/IIIa 항체, 예컨대 아브식시맙 또는 c7E3 Fab (레오프로(REOPRO)®); 항-RSV 항체, 예컨대 MEDI-493 (시나기스(SYNAGIS)®); 항-CMV 항체, 예컨대 프로토비르(PROTOVIR)®; 항-HIV 항체, 예컨대 PRO542; 항-간염 항체, 예컨대 항-Hep B 항체 오스타비르(OSTAVIR)®; 항-CA 125 항체 오바렉스; 항-이디오타입 GD3 에피토프 항체 BEC2; 항-αvβ3 항체 비탁신(VITAXIN)®; 항-인간 신세포 암종 항체, 예컨대 ch-G250; ING-1; 항-인간 17-1A 항체 (3622W94); 항-인간 결장직장 종양 항체 (A33); GD3 강글리오시드에 대해 지시된 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평세포 암종 (SF-25); 및 항-인간 백혈구 항원 (HLA) 항체, 예컨대 Smart ID10 및 항-HLA DR 항체 온콜림(Oncolym) (Lym-1)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원의 항체에 대한 바람직한 표적 항원은 HER2 수용체, VEGF, IgE, CD20, CD11a, 및 CD40이다.
이러한 항체들 중 다수가 암이 포함되는 다양한 질환을 치료하기 위해 임상 실습에서 광범위하게 사용된다.
특정한 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하기의 항체 및 재조합 단백질의 생성에 사용된다.
항-CD20 항체
리툭시맙 (리툭산®)은 CD20 항원에 대해 지시된, 유전자 조작된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체이다. 리툭시맙은 미국 특허 번호 5,736,137 (1998년 4월 7일 허여, Anderson 등)에서 "C2B8"으로 칭해진 항체이다. 리툭시맙은 재발된 또는 난치성의 저등급 또는 소포형, CD20 양성, B-세포 비-호지킨 림프종 환자의 치료에 지시된다. 시험관내 작용 메커니즘 연구는 리툭시맙이 인간 보체에 결합하여 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 통해 림프모양 B-세포주를 용해시킨다는 것을 실연하였다 (문헌 [Reff et al., Blood 83(2):435-445 (1994)]. 추가로, 이는 항체-의존성 세포매개 세포독성 (ADCC)에 대한 검정에서 유의한 활성을 가진다. 더욱 최근에는, 리툭시맙은, 다른 항-CD19 및 항-CD20 항체와는 달리, 삼중수소화 티미딘 혼입 검정에서 항-증식 효과가 있고 아폽토시스를 직접적으로 유도하는 것으로 나타났다 (문헌 [Maloney et al., Blood 88(10):637a (1996)]). 리툭시맙과 화학요법 및 독소 간의 상승작용이 또한 실험적으로 관찰되었다. 특히, 리툭시맙은 약물-내성 인간 B-세포 림프종 세포주를 독소루비신, CDDP, VP-16, 디프테리아 독소 및 리신(ricin)의 세포독성 효과에 민감하게 한다 (문헌 [Demidem et al., Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186 (1997)]). 생체내 임상전 연구는 리툭시맙이 사이노몰거스 원숭이의 말초혈, 림프절, 및 골수로부터, 아마도 보체 및 세포-매개 방법을 통해, B 세포를 고갈시킨다는 것을 나타냈다 (문헌 [Reff et al., Blood 83(2):435-445 (1994)]).
CD20 항체에 관한 특허 및 특허 공보는 하기를 포함한다: 미국 특허 번호 5,776,456, 5,736,137, 6,399,061, 및 5,843,439, 뿐만 아니라 미국 특허 출원 번호 US 2002/0197255A1, US 2003/0021781A1, US 2003/0082172 A1, US 2003/0095963 A1, US 2003/0147885 A1 (Anderson 등); 미국 특허 번호 6,455,043B1 및 WO00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO00/27428 (Grillo-Lopez 및 White); WO00/27433 (Grillo-Lopez 및 Leonard); WO00/44788 (Braslawsky 등); WO01/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter 및 White); WO01/10460 (White 및 Grillo-Lopez); 미국 출원 번호 US2002/0006404 및 WO02/04021 (Hanna 및 Hariharan); 미국 출원 번호 US2002/0012665 A1 및 WO01/74388 (Hanna, N.); 미국 출원 번호 US 2002/0058029 A1 (Hanna, N.); 미국 출원 번호 US 2003/0103971 A1 (Hariharan 및 Hanna); 미국 출원 번호 US2002/0009444A1, 및 WO01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO01/97858 (White, C.); 미국 출원 번호 US2002/0128488A1 및 WO02/34790 (Reff, M.); WO02/060955 (Braslawsky 등); WO2/096948 (Braslawsky 등); WO02/079255 (Reff 및 Davies); 미국 특허 번호 6,171,586B1, 및 WO98/56418 (Lam 등); WO98/58964 (Raju, S.); WO99/22764 (Raju, S.); WO99/51642, 미국 특허 번호 6,194,551B1, 미국 특허 번호 6,242,195B1, 미국 특허 번호 6,528,624B1 및 미국 특허 번호 6,538,124 (Idusogie 등); WO00/42072 (Presta, L.); WO00/67796 (Curd 등); WO01/03734 (Grillo-Lopez 등); 미국 출원 번호 US 2002/0004587A1 및 WO01/77342 (Miller 및 Presta); 미국 출원 번호 US2002/0197256 (Grewal, I.); 미국 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L.); 미국 특허 번호 6,090,365B1, 6,287,537B1, 6,015,542, 5,843,398, 및 5,595,721 (Kaminski 등); 미국 특허 번호 5,500,362, 5,677,180, 5,721,108, 및 6,120,767 (Robinson 등); 미국 특허 번호 6,410,391B1 (Raubitschek 등); 미국 특허 번호 6,224,866B1 및 WO00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO00/67795 (Goldenberg); 미국 출원 번호 US 2003/01339301 A1 및 WO00/74718 (Goldenberg 및 Hansen); WO00/76542 (Golay 등); WO01/72333 (Wolin 및 Rosenblatt); 미국 특허 번호 6,368,596B1 (Ghetie 등); 미국 출원 번호 US2002/0041847 A1 (Goldenberg, D.); 미국 출원 번호 US2003/0026801A1 (Weiner 및 Hartmann); WO02/102312 (Engleman, E.); 미국 특허 출원 번호 2003/0068664 (Albitar 등); WO03/002607 (Leung, S.); WO 03/049694 및 US 2003/0185796 A1 (Wolin 등) ; WO03/061694 (Sing 및 Siegall); US 2003/0219818 A1 (Bohen 등); US 2003/0219433 A1 및 WO 03/068821 (Hansen 등) (이들 각각은 명백하게 본원에 참고로 포함됨). 또한, 미국 특허 번호 5,849,898 및 유럽 출원 번호 330,191 (Seed 등); 미국 특허 번호 4,861,579 및 EP332,865A2 (Meyer 및 Weiss); 미국 특허 번호 4,861,579 (Meyer 등) 및 WO95/03770 (Bhat 등)을 참조한다.
리툭시맙을 사용한 치료에 관한 간행물은 다음 문헌을 포함한다:
Figure pat00002
문헌 [Sarwal et al., N. Eng. J. Med. 349(2):125-138 (July 10, 2003)]에서는 DNA 마이크로어레이 프로파일링에 의해 확인된 급성 신장 동종이식 거부에서 분자 비균질성을 보고하고 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명은 인간화 항-CD20 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체 조성물은 IgG Fc에 아미노산 변경을 추가로 포함하고, 야생형 IgG Fc를 갖는 항체에 비해 인간 FcRn에 대한 결합 친화도가 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 더욱 바람직하게는 100배 이상, 바람직하게는 125배 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 150배 이상 내지 약 170배 증가된다.
IgG의 N-글리코실화 부위는 CH2 도메인에서 Asn297이다. 본 발명의 인간화 항체 조성물은 Fc 영역을 갖는 상기 인간화 항체들 중 임의의 것의 조성물을 포함하고, 여기서 조성물 중 항체의 약 80％ 내지 100％ (바람직하게는 약 90％ 내지 99％)는 당단백질의 Fc 영역에 부착된, 푸코스가 없는 성숙 코어 탄수화물 구조를 포함한다. 이러한 조성물은 본원에서 인간 IgG와의 상호작용시에 FcγRIIIA (V158)만큼 효과적이지 않은 FcγRIIIA (F158)와의 결합에 있어서 놀라울 정도의 개선을 나타내는 것으로 입증되었다. FcγRIIIA (F158)은 정상적인 건강한 아프리카계 미국인 및 백인에서 FcγRIIIA (V158)보다 더 흔하다. 문헌 [Lehrnbecher et al., Blood 94:4220 (1999)]을 참조한다. 역사적으로, 가장 통상적으로 사용되는 산업용 숙주들 중 하나인 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)에서 생성된 항체는 집단 내에 약 2％ 내지 6％의 비-푸코실화 항체를 함유한다. 그러나, YB2/0 및 Lec13은 78％ 내지 98％ 비푸코실화 종을 갖는 항체를 생성할 수 있다. 문헌 [Shinkawa et al., J Bio. Chem. 278 (5), 3466-347 (2003)]은, FUT8 활성이 더 적은 YB2/0 및 Lec13 세포에서 생성된 항체가 유의하게 증가된 시험관내 ADCC 활성을 나타낸다고 보고하였다. 푸코스 함량이 감소된 항체의 생성이, 예를 들어, [Li et al., (GlycoFi) "Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris" in Nature Biology online publication 22 Jan. 2006]; [Niwa R. et al., Cancer Res. 64(6):2127-2133 (2004)]; US 2003/0157108 (Presta); US 6,602,684 및 US 2003/0175884 (Glycart Biotechnology); US 2004/0093621, US 2004/0110704, US 2004/0132140 (모두 교와 하꼬 고교(Kyowa Hakko Kogyo))에 또한 기재되어 있다.
이중특이적 인간화 항체는 항체의 한쪽 아암에는 적어도 본 발명의 인간화 항체의 H 및/또는 L 쇄의 항원 결합 영역이 있고, 다른쪽 아암에는 제2 항원에 대한 V 영역 결합 특이성이 있는 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원은 CD-20, CD3, CD64, CD32A, CD16, NKG2D 또는 다른 NK 활성화 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항-HER2 항체
뮤린 HER2 항체 4D5의 재조합 인간화 버전 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, 트라스투주맙 또는 헤르셉틴®; 미국 특허 번호 5,821,337)은 종래 항암 요법을 광범위하게 받은 바 있는, HER2-과다발현 전이성 유방암 환자에서 임상적으로 활성을 띤다 (문헌 [Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)]). 트라스투주맙은 종양이 HER2 단백질을 과발현하는 전이성 유방암 환자의 치료에 대해 1998년 9월 25일 식품 의약청 (FDA)에서 시판이 허가되었다. 2006년 11월에, FDA는 헤르셉틴을 HER-2-양성, 결절-양성 유방암 환자의 아주반트 치료용으로, 독소루비신, 시클로포스파미드 및 파클리탁셀을 함유하는 치료 요법의 일부로서 허가하였다.
다양한 실시양태에서, 본 발명은 인간화 항-HER2 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 다양한 특성을 갖는 HER2 항체는 문헌
Figure pat00003
에 기재되어 있다.
항-VEGF 항체
인간화 및/또는 친화도 성숙 항-VEGF 항체, 예컨대 인간화 항-VEGF 항체 huA4.6.1 아바스틴®을 포함한 항-VEGF 항체 (문헌 [Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992)], 국제 공보 번호 WO 96/30046, 및 WO 98/45331, 1998년 10월 15일 공개)는 암 치료에 대해 FDA 승인을 받았다. 다양한 실시양태에서, 본 발명은 인간화 항-VEGF 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
항-CD11a 항체
인간화 항-CD11a 항체 에팔리주맙 또는 랍티바® (미국 특허 번호 6,037,454)는 건선의 치료에 대해 2003년 10월 27일 식품 의약청에서 시판이 허가되었다. 한 실시양태는 항-인간 CD11a 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
아포맙 항체
DR5 수용체 (항-DR5) 항체에 대한 항체는 또한 본 발명에 따라 생성될 수 있다. 이러한 항-DR5 항체는 특히 PCT 공보 번호 WO 2006/083971에 개시된 모든 항체 변이체, 예컨대 아포맙 1.1, 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 5.2, 5.3, 6.1, 6.2, 6.3, 7.1, 7.2, 7.3, 8.1, 8.3, 9.1, 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2, 8.2, 9.2, 1.3, 2.2, 3.3, 4.3, 5.3, 6.3, 7.3, 8.3, 9.3, 및 25.3, 특히 아포맙 8.3 및 아포맙 7.3, 바람직하게는 아포맙 7.3으로 명명된 항-DR5 항체를 포함한다. WO 2006/083971의 전체 내용은 명백하게 본원에 참고로 포함된다. 아포맙은 특히 아폽토시스를 유도하도록 설계된 DR5-표적화된 전-아폽토시스 수용체 길항제 (PARA)인 완전 인간 모노클로날 항체이다. 아폽토시스는 손상되거나 원치않는 세포 (암성 세포 포함)가 사멸되어 인체로부터 제거되는 자연적인 방법이다. 전-아폽토시스 수용체 DR5는 광범위한 악성 종양에서 발현된다.
항-BR3 항체 및 이뮤노어드헤신
BR3 (항-BR3) 항체 및 BR3-Fc 이뮤노어드헤신에 대한 항체가 또한 본 발명에 따라 생성될 수 있다. 이러한 항-BR3 항체 및 이뮤노어드헤신은 특히 미국 출원 공보 번호 20050070689에 개시된 모든 변이체를 포함한다. 미국 출원 공보 번호 20050070689의 전체 내용은 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
3. 항체의 재조합 생성을 위한 일반적 방법
본원에서의 항체 및 다른 재조합 단백질은 재조합 DNA 기술의 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 상기에서 구체적으로 확인된 항체들을 제외하고, 예를 들어, 하기에 기술된 기술들을 사용하여, 당업자는 관심있는 항원에 대해 지시된 항체를 생성시킬 수 있다.
항원 선택 및 제조
본원에서의 항체는 관심있는 항원에 대해 지시된다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 질환 또는 장애로 고통받는 포유동물에게 항체를 투여하는 것은 이러한 포유동물에서 치료 이점을 유도할 수 있다. 그러나, 비-폴리펩티드 항원 (예컨대 종양-관련 당지질 항원; 미국 특허 5,091,178 참조)에 대해 지시된 항체가 또한 고려된다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 이는 막횡단 분자 (예를 들어 수용체) 또는 리간드, 예컨대 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원에는 하기 섹션 (3)에서 기술된 단백질들이 포함된다. 본 발명에 의해 포함되는 항체들에 대한 예시적인 분자 표적에는 CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD40; ErbB 수용체 부류의 구성원, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린 (이의 α 또는 β 서브유닛 포함) (예를 들어 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예컨대 VEGF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체: 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C, 또는 본원에서 언급된 다른 항원들 중 임의의 것이 포함된다. 상기 열거된 항체들이 결합하는 항원이 본원에서의 범주 내에 특히 포함된다.
가용성 항원 또는 그의 단편 (다른 분자에 임의로 접합됨)이 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 막횡단 분자, 예컨대 수용체의 경우에는, 그의 단편 (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 막횡단 분자를 발현하는 세포가 면역원으로 사용될 수 있다. 이같은 세포는 자연 공급원 (예를 들어, 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 막횡단 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다.
항체의 제조에 유용한 다른 항원 및 그의 형태가 당업자에게 명백할 것이다.
폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게 생성된다. 이관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (식 중, R 및 R1은 상이한 알킬기임)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
예를 들어 단백질 또는 접합체 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 상기 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화한다. 1개월 후, 프로인트 완전 아주반트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10으로 다중 부위에 피하 주사하여 동물을 부스팅시킨다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 정체기(plateau)에 도달할 때까지 동물을 부스팅한다. 바람직하게는, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교제를 통해 접합된 동일한 항원의 접합체로 동물을 부스팅한다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합체로서 제조될 수도 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 향상시킨다.
모노클로날 항체
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수도 있고, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)으로 제조할 수도 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터 또는 마카쿠 원숭이를 상기 기술된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유발시킨다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 그 후, 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포가 형성된다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게는 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체-생성 세포에 의한 높은 수준의 안정적인 항체 생성을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 특히 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 살크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 및 미국 메릴랜드주 록크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 역시 인간 모노클로날 항체 생성과 관련하여 기재된 바 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사선면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)으로 결정한다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다. 바람직하게는, 본원에 기술된 단백질 A 크로마토그래피 절차가 사용된다.
통상적인 절차 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함)을 이용하여 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 용이하게 단리하고 서열분석한다. 하이브리도마 세포는 이같은 DNA의 바람직한 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 후 이러한 벡터를 형질감염되지 않으면 이뮤노글로불린 단백질을 생성하지 않는 이. 콜라이 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득하였다.
DNA는 또한 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환시키거나 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 연결함으로써 변형시킬 수 있다.
전형적으로, 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인 대신 사용되거나 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신 사용되어, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.
추가적인 실시양태에서, 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기술된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 모노클로날 항체가 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]은 파지 라이브러리를 사용한 뮤린 및 인간 항체 각각의 단리를 기재한다. 이후의 간행물은 쇄 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생성 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 (문헌 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)])을 기재한다. 따라서, 이러한 기술들은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
인간화 및 인간 항체
인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "도입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열 대신 치환함으로써 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용되는 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적 맞춤(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체를 위한 인간 FR로서 수용된다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)]). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 이용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)]).
추가로, 항체가 항원에 대해 높은 친화도를 보유하고 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화하는 것이 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 방법에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 바람직한 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 CDR 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
대안적으로, 면역화시에 내인성 이뮤노글로불린 생성의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어 마우스)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생성이 완전히 억제된다는 것이 기재되어 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이같은 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 접종 시 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 및 [Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)]을 참조한다. 파지-디스플레이 라이브러리로부터 인간 항체가 또한 유래될 수 있다 (문헌 [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]; [Vaughan et al., Nature Biotech 14:309 (1996)]).
항체 단편
항체 단편 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들이 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되어 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 또 다른 기술들이 당업자에게 명백할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185 참조).
다중특이적 항체
다중특이적 항체에는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성이 있다. 이러한 분자들은 일반적으로는 오직 2종의 항원과만 결합할 것이지만 (즉, 이중특이적 항체, BsAb), 추가의 특이성을 갖는 항체, 예컨대 삼중특이적 항체가 본원에 사용되는 경우에는 이러한 표현에 포함된다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 통상적인 생성법은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 기초로 하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중에서 오직 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
WO 96/27011에 기재된 또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율(％)을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 1차 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동"이 2차 항체 분자의 계면에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치않는 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체들은, 예를 들어 원치않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089)를 위해서 제안되었다. 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 이종접합체 항체가 제조될 수 있다. 적합한 가교제가 당업계에 주지되어 있고, 다수의 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질분해에 의해 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원시켜, 인접한 디티올들을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그 후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생성된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용할 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]은 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2분자의 생성을 기재한다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 따로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관내 유도 화학 커플링 반응을 실시하였다. 이로써 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수도 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생성되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결되었다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후, 다시 산화되어 항체 이종이량체가 형성되었다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생성에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 상기 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루게 되어, 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다. 대안적으로, 항체가 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]에 기술된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 간략하게, 이들 항체는 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 병렬식 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)].
이뮤노어드헤신
가장 단순하고 가장 간단한 이뮤노어드헤신 디자인은 어드헤신의 결합 도메인(들) (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인 (ECD))을 이뮤노글로불린 중쇄의 힌지 및 Fc 영역과 조합시키는 것이다. 통상적으로, 본 발명의 이뮤노어드헤신을 제조할 때, 어드헤신의 결합 도메인을 코딩하는 핵산이 C-말단에서 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 융합될 것이지만, N-말단 융합체 또한 가능하다.
전형적으로, 이러한 방식으로, 코딩된 키메라 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 중쇄의 불변 영역의 적어도 기능적으로 활성인 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 보유할 것이다. 융합은, 불변 도메인의 Fc 부분의 C-말단에, 또는 중쇄의 CH1 또는 경쇄의 상응하는 영역에 대한 N-말단 바로 근처에서도 이루어진다. 융합체가 제조되는 정확한 부위는 중요하지 않다. 특정 부위들이 공지되어 있고, 이뮤노어드헤신의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특징을 최적화하도록 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 어드헤신 서열이 이뮤노글로불린 G1 (IgG1)의 Fc 도메인의 N-말단에 융합된다. 전체 중쇄 불변 영역을 어드헤신 서열에 융합시키는 것이 가능하다. 그러나, 더욱 바람직하게는, IgG Fc를 화학적으로 한정하는 파파인 절단 부위 (즉, 중쇄 불변 영역의 첫번째 잔기를 114로 간주했을 때 잔기 216), 또는 다른 이뮤노글로불린의 유사 부위의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작되는 서열이 융합에 사용된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 어드헤신 아미노산 서열은 IgG 중쇄의 (a) 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 또는 (b) CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 융합된다.
이중특이적 이뮤노어드헤신의 경우, 이뮤노어드헤신은 다량체로서, 특히 이종이량체 또는 이종사량체로서 조립된다. 일반적으로, 이러한 조립된 이뮤노글로불린은 공지된 단위 구조를 가질 것이다. 기본적인 4쇄 구조 단위는 IgG, IgD 및 IgE가 존재하는 형태이다. 더 높은 분자량의 이뮤노글로불린에서는 4쇄 단위가 반복되고, IgM은 일반적으로 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 4개의 기본 단위의 오량체로서 존재한다. IgA 글로불린, 및 때때로 IgG 글로불린은 혈청 내에서 다량체 형태로 존재할 수도 있다. 다량체의 경우, 각각의 4개 단위는 동일하거나 상이할 수 있다.
본원의 범위 내에 속하는 다양한 예시적인 조립된 이뮤노어드헤신을 아래에서 요약적으로 나타냈다:
Figure pat00004
여기서, 각각의 A는 동일하거나 상이한 어드헤신 아미노산 서열을 나타내고,
VL은 이뮤노글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
VH는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
CL은 이뮤노글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
CH는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
n은 1 초과의 정수이고;
Y는 공유 가교제의 잔기를 나타낸다.
간결하게 나타내기 위해, 상기 구조는 주요 특징만을 제시하고, 이뮤노글로불린의 연결 (J) 또는 다른 도메인은 나타내지 않았으며, 디술피드 결합도 제시되지 않았다. 그러나, 이러한 도메인이 결합 활성에 필요한 경우, 이들은 이뮤노글로불린 분자 내에서 차지하는 통상적인 위치 내에 존재하도록 구축될 것이다.
대안적으로, 키메라 중쇄를 포함하는 이뮤노글로불린이 수득되도록 어드헤신 서열이 이뮤노글로불린 중쇄 서열과 경쇄 서열 사이에 삽입될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 힌지와 CH2 도메인 사이 또는 CH2 도메인과 CH3 도메인 사이에서 이뮤노글로불린의 각 아암 내의 이뮤노글로불린 중쇄의 3' 말단에 어드헤신 서열이 융합된다. 유사한 구축물이 문헌 [Hoogenboom, et al., Mol. Immunol. 28:1027-1037 (1991)]에서 보고되었다.
이뮤노글로불린 경쇄의 존재가 본 발명의 이뮤노어드헤신에 필요하지는 않지만, 이뮤노글로불린 경쇄가 어드헤신-이뮤노글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유 결합되거나 어드헤신에 직접 융합되어 존재할 수 있다. 전자의 경우, 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 어드헤신-이뮤노글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 전형적으로 동시-발현된다. 분비시, 하이브리드 중쇄 및 경쇄가 공유 결합되어 2개의 디술피드-연결 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 이뮤노글로불린-유사 구조가 제공될 것이다. 이러한 구조의 제조에 적합한 방법은 예를 들어 1989년 3월 28일자로 허여된 미국 특허 번호 4,816,567에 개시되어 있다.
가장 편리하게는, 이뮤노어드헤신은 어드헤신 부분을 코딩하는 cDNA 서열을 이뮤노글로불린 cDNA 서열에 인-프레임(in-frame) 융합시켜 구축된다. 그러나, 게놈 이뮤노글로불린 단편에 대한 융합이 또한 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990)]; 및 [Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)] 참조). 후자 유형의 융합에는 발현을 위한 Ig 조절 서열의 존재가 필요하다. 혼성화 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술에 의해 비장 또는 말초혈 림프구로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터의 공개된 서열을 기초로 하여 IgG 중쇄 불변 영역을 코딩하는 cDNA를 단리할 수 있다. 이뮤노어드헤신의 "어드헤신" 및 이뮤노글로불린 부분을 코딩하는 cDNA는 선택된 숙주 세포에서 효율적인 발현을 지시하는 플라스미드 벡터 내로 직렬로 삽입된다.
본 발명의 추가의 상세사항들이 하기의 비-제한적인 실시예에서 제공된다.
모든 특허, 특허 출원, 간행물, 생성물 설명 및 프로토콜은 본원 전체에서 인용되고, 그 개시 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시 목적으로만 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 달리 나타내지 않는 한, 본 실시예에서 언급되는 시판 시약은 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 하기의 실시예에서, 및 명세서 전반에 걸쳐 ATCC® 접속 번호에 의해 확인되는 세포들의 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 매나서스)였다.
실시예 1
글루타민-비함유 생성 배지에서 폴리펩티드의 생성
물질 및 방법:
세포주. 이들 연구에서, 각각 아포맙 항체, 항-VEGF 항체, 및 융합 단백질 BR3-Fc를 발현하는 CHO 숙주 세포를 사용하였다. 숙주 세포를 현탁액 및 혈청 비함유 배양물에 적용하였다. 동결된 원액을 하기 기재된 배지 중 마스터 또는 워킹 셀 뱅크로 제조하였다.
37℃ 및 5％ CO2에서 유지되는 써모 사이언티픽 포르마(Thermo Scientific Forma)® 진열용 CO2 습윤 인큐베이터에 유지된 250-mL 또는 1-L 코닝(Corning)® 벤티드 진탕 플라스크를 사용하여 세포주를 유지시켰다. 플라스크를 주문형 알루미늄-기판 플랫폼을 갖는 뉴 브런즈윅 사이언티픽 이노바(New Brunswick Scientific Innova)®-2100 플랫폼 진탕기 상에서 150 rpm의 속도로 교반하였다. 세포 배양물은 매 3일 또는 4일 마다 새로운 배지로 통과시키고, 0.11％ 또는 0.20％ 패킹된 세포 부피 (PCV)로 시딩하였다. 유리 10-mL KIMAX® USA PCV 튜브를 사용하여 PCV를 얻었다.
배양 배지 및 조건. 배지 연구를 모든 경우에 500-mL 작업 부피를 갖는 공급원1-L 코닝® 벤티드 진탕 플라스크로부터의 세포 배양물을 사용하여 0.20％ PCV에서 100 mL 작업 부피로 1회, 2회 또는 3회 접종된 250-mL 코닝 벤티드 진탕 플라스크를 사용하여 개시하였다. 유리 10-mL KIMAX® USA PCV 튜브를 사용하여 PCV를 얻었다.
연구 시작 전에 각각의 시험 배지와 함께 글루타민을 함유하는 접종물 배지의 100％ 배지 교환을 완료하기 위해 세포 배양물을 소르볼(Sorvall)® RT 6000B 원심분리기에서 5분 동안 1000 rpm으로 원심분리하였다. 상이한 농도의 글루타민, 글루타메이트, 아스파라긴 및 아스파르테이트를 상이한 시험 배지에서 평가하였다. 하기 농도가 시험되었다: 글루타민 0-10 mM, 글루타메이트 1-10 mM, 아스파라긴 0-15 mM, 아스파르테이트 1-10 mM. 배지 조건은 완전 요인 DOE 연구에서 평가하였다.
글루타민-비함유 배지의 효과를 또한 시판되는 DMEM/F12 배지에서 시험하였다. 배지는 5x 농도 (7.05 g/L)에서 여분의 아스파라긴 (총 10 mM), 아스파르테이트 (총 10 mM), 글루타민 (글루타민-함유 배지의 경우 총 10 mM), 글루타메이트 (총 1 mM), 및 글루코스 (총 8 g/L)와 함께 사용하였다. 아포맙 및 항-VEGF 항체 발현 세포를 사용하여 글루타민-비함유 및 글루타민-함유 배지를 비교하였다.
진탕 플라스크를 37℃ 및 5％ CO2에서 유지되는 써모 사이언티픽 포르마® 진열용 CO2 습윤 인큐베이터에서 유지시켰다. 플라스크를 주문형 알루미늄-기판 플랫폼을 갖는 뉴 브런즈윅 사이언티픽 이노바®-2100 플랫폼 진탕기 상에서 150 rpm의 속도로 교반하였다.
사용된 배지는 하기 성분을 함유하였다:
Figure pat00005
Figure pat00006
하기 성분을 갖는 시판되는 DMEM/F-12 배양 배지를 또한 시험하였다:
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
접종물 배양을 위한 배지는 (생성 단계와는 반대로) 일반적으로 5 mM 글루타민, 8 g/L 글루코스 및 75-2000 nM 메토트렉세이트를 보충하였다.
연구를 위해, pH 조정은 1M 탄산나트륨을 사용하여 pH 값을 7.00±0.10으로 유지하기 위해 필요에 따라 수행하였다. pH 값은 0.10 위로 pH 단위를 올리기 위해 1M 탄산나트륨 1 mL/L를 첨가하여 조정하였다.
세포 배양물은 3.5-mL 샘플을 취하여 14일까지 분석하고, 베크만 코울터(Beckman Coulter) ViCellTM-1.0 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포 수, 생존율 및 세포 크기를 분석하였다. 영양소 분석은 노바 400 바이오메디컬 바이오프로파일(Nova 400 Biomedical Bioprofile)®을 사용하여 수행하였다. 오스몰랄농도는 어드밴스드® 인스트루먼트((Advanced® Instrument) 다중-샘플 삼투압계 (모델 3900)를 사용하여 측정하였다. 재조합 생성물 역가 농도는 애질런트 1100 시리즈(Agilent 1100 Series) HPLC를 사용하여 수득하였다.
재조합 단백질. 생성된 재조합 단백질은 아포맙 (TRAIL), 항-VEGF, 및 이뮤노어드헤신 BR3-Fc였다.
데이터 분석. 데이터의 통계적 분석을 완전 요인 실험 설계를 사용하여 수행하였고, 이는 그의 설계가 각각 별개의 가능한 값 또는 "수준"을 갖는 둘 이상의 인자로 구성되고, 그의 실험 장치가 이러한 인자 모두에 걸쳐 이들 수준의 모든 가능한 조합을 사용하는 실험이다. 완전 요인 설계는 또한 완전-교차 설계로 지칭될 수 있다. 이러한 실험은 반응 변수에 대한 각각의 인자의 효과 뿐만 아니라 반응 변수에 대한 인자들 사이의 상호작용의 효과를 연구하도록 한다.
결과
도 1-5에 나타낸 바와 같이, 글루타민-비함유 생성 배지의 사용은 아포맙 항체, BR3-Fc 이뮤노어드헤신 및 항-VEGF 항체의 최종 재조합 단백질 역가를 증가시켰다. 각각의 경우에, 상이한 농도의 글루타민, 글루타메이트, 아스파라긴 및 아스파르테이트의 효과를 평가하는 완전 요인 DOE를 사용한 역가 결과의 큐브 플롯 분석은 최고 역가가 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배지에서 달성될 것으로 예측하였다 (도 1-3).
글루타민-비함유, 낮은 글루타메이트 및 높은 아스파르테이트 조건하에 아스파라긴의 아포맙 항체 역가에 대한 효과를 도 4에 나타내었다. 글루타민-비함유 배지에서, 아포맙 항체 역가는 아스파라긴이 없은 글루타민-비함유 배양물과 비교하여 2.5-15 mM 아스파라긴의 존재하에 유의하게 증가하였다. 이들 조건하에, 글루타메이트의 존재 또는 부재는 역가에 영향을 미치지 않았다.
글루타민-비함유 및 낮은 글루타메이트 조건에서 다양한 아스파라긴 및 아스파르테이트 농도에 걸친 아포맙 항체 역가 생성을 도 5에 도시하였다. 양성 적정 효과는 이들 조건하에 아스파르테이트를 0 mM에서 10 mM로 증가시켰을 때 관찰되었다.
10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배지의 역가에 대한 효과가 도 6a-c에서 입증되었으며, 여기서 아포맙 항체, 항-VEGF 항체 및 BR3-Fc 이뮤노어드헤신 (각각 a-c)에 대한 최종 역가는 글루타민-함유 배지와 비교하여 글루타민-비함유 배지에서 유의하게 더 높았다.
시판 DMEM/F-12 배양 배지를 사용하여 유사한 결과를 얻었다. 도 7a 및 b에 나타낸 바와 같이, 아포맙 항체 및 항-VEGF 항체 (각각 a 및 b)에 대한 최종 역가는 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-함유 DMEM F12 배지와 비교하여 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 DMEM/F12 배지에서 유의하게 더 높았다.
도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, 글루타민-비함유 생성 배지의 사용은 또한 Qp (mg/mL-세포/일)로 측정된 비생산성을 증가시켰다. 도 8a-c는 아포맙 항체, 항-VEGF 항체 및 BR3-Fc 이뮤노어드헤신 (각각 a-c)에 대한 세포 비생산성 (Qp)이 글루타민-함유 배지와 비교하여 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배지에서 유의하게 더 높다는 것을 보여준다. 도 9a 및 b는 아포맙 항체 및 항-VEGF 항체 (각각 a 및 b)에 대한 세포 비생산성이 글루타민-함유 DMEM/F12 배지와 비교하여 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 DMEM/F12 배지에서 유의하게 더 높다는 것을 보여준다.
도 10 및 11에 나타낸 바와 같이, 글루타민-비함유 생성 배지의 사용은 유의하게 세포 생존율을 개선시키고, 배양 수명을 연장시키는 것으로 나타났다. 도 10a-c는 아포맙 항체, 항-VEGF 항체 및 BR3-Fc 이뮤노어드헤신 (각각 a-c)에 대한 세포 생존율이 글루타민-함유 배지와 비교하여 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배지에서 더 높다는 것을 보여준다. 도 11a 및 b는 DMEM/F12 배지에서, 세포 생존율이 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배지에서 일관되게 개선되지 않았다는 것을 나타낸다. 중요하게는, 생존율은 글루타민 함유 배지와 비교하여 아포맙 항체의 경우 더 높았으나 (도 11a), 항-VEGF 항체의 경우 더 낮았다 (도 11b).
도 12 및 13에 나타낸 바와 같이, 글루타민-비함유 생성 배지의 사용은 글루타민-함유 배지와 비교하여 NH4 + 축적을 유의하게 감소시켰다. 도 12a-c는 암모니아 수준이 통상적으로 글루타민-함유 배양물과 비교하여 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 배양물에서 더 낮다는 것을 보여준다. 도 13a 및 b는 암모니아 수준이 글루타민-함유 DMEM/F12 배지와 비교하여 10 mM 아스파라긴, 10 mM 아스파르트산 및 1 mM 글루탐산이 보충된 글루타민-비함유 DMEM/F12 배지에서 유의하게 감소하였다는 것을 보여준다.
본원에서 설명적으로 기술된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재하에 적절하게 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어 용어 "구성(comprising)", "포함(including)", "함유(containing)" 등은 제한 없이 광범위하게 이해되어야 한다. 추가적으로, 본원에 사용된 용어 및 표현은 설명의 의미로 사용되었고, 제한적이지 않으며, 이같은 용어 및 표현의 사용에는 제시된 본 발명 또는 그의 일부분의 임의의 등가물을 배제하려는 의도가 없고, 청구된 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형이 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시양태 및 선택 사항들에 의해 구체적으로 개시되었지만, 개시된 본원에서 구현된 본 발명의 변형 및 변동이 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있고, 이같은 변형 및 변동이 본원에 개시된 본 발명의 범주 내인 것으로 간주된다는 것을 이해하여야 한다.
본원에서의 본 발명의 설명으로부터, 다양한 등가물들이 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 본 발명의 개념을 실행하는데 사용될 수 있다는 것이 명백하다. 또한, 본 발명이 특정 실시양태들을 구체적으로 참조하여 기술되었지만, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에서 변화가 이루어질 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 기술된 실시양태들은 모든 면에서 설명적이고, 제한적이지 않은 것으로 간주된다. 본 발명이 본원에 기술된 특정 실시양태에 한정되지 않고, 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 다수의 등가물, 재배열, 변형 및 치환이 가능하다는 것을 또한 이해하여야 한다. 따라서, 부가 실시양태는 본 발명의 범위 및 하기 특허청구범위 내에 있다.
본원에서 언급된 모든 미국 특허 및 출원; 외국 특허 및 출원; 과학 문헌; 도서; 및 간행물은, 각각의 개별적인 특허 또는 간행물 (도면, 도 및 표 포함)이 완전하게 기재된 것처럼 거명에 의해 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것과 같이, 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.

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  1. 인간에 대한 치료방법.
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