CN101226138B - 一种促肝细胞生长素活性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促肝细胞生长素活性检测方法。该检测方法，采用RPMI-1640培养液，检测包括准备试剂步骤、供试品溶液制备步骤、测定供试品组3孔吸收度平均值、对照组3孔吸收度平均值和空白对照组3孔吸收度平均值步骤、计算刺激指数步骤，其特点是：所述的RPMI-1640培养液采用不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液。本发明克服了现有技术存在的测试不稳定，重复测定一致性差等缺陷，具有测定方法稳定，测定结果可靠，检测数据重复率较高、一致性较好等优点，测定结果能正确反映供试品的活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，特别是一种检测促肝细胞生长素活性的促肝细胞生长素活性检测方法。
背景技术
促肝细胞生长素是一种从新鲜的乳猪肝或小牛肝中提取的生化药品，作为治疗各种重症肝炎、慢性活动性肝炎和肝硬化的辅助用药，其活力测定即活性检测十分重要。中华人民共和国药品监督管理局的《促肝细胞生长素溶液》国家药品标准WS-10001-(HD-0860)-2002中规定促肝细胞生长素活力测定采用附一所列MTT法。该方法采用含谷氨酰胺成分的RPMI 1640培养基，包括试剂准备、供试品溶液制备、测定供试品组3孔吸收度平均值、对照组3孔吸收度平均值和空白对照组3孔吸收度平均值，最后计算出衡量供试品活性的刺激指数几个步骤。检测中发现现有技术检测方法由于RPMI 1640培养基中有谷氨酰胺成分，在活性检测过程中谷氨酰胺有促进肝癌细胞生长的作用，导致检测的细胞对照组吸收值偏高，进而导致检测计算出的刺激指数值较供试品实际具有的刺激指数值低，使测试不稳定，重复测定一致性差，从而不能正确判断供试品促肝细胞生长素的活性优劣。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的缺陷，提供一种测试方法稳定、测试结果可靠的促肝细胞生长素活性检测方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该促肝细胞生长素活性检测方法，使用RPMI-1640培养液，检测包括准备试剂步骤、供试品溶液制备步骤、测定供试品组3孔吸收度平均值、对照组3孔吸收度平均值和空白对照组3孔吸收度平均值步骤、计算刺激指数步骤，其特点是：所述的RPMI-1640培养液采用不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液。
本发明促肝细胞生长素活性检测方法所述的不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液采用不含谷氨酰胺成分的RPMI-1640培养基配制，所述的不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液配制方法为，取碳酸氢钠2.00g及不含谷氨酰胺成分的RPMI-1640培养基10.0g加超纯水800ml溶解后，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至6.9，加超纯水稀释至1000ml，过滤除菌备用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：由于本发明使用不含谷氨酰胺成分的RPMI-1640培养基，检测中不会因为谷氨酰胺促进肝癌细胞生长而影响测定结果，具有测定方法稳定、测定结果可靠等优点，测定结果能正确反映供试品的活性，对促肝细胞生长素的生产和试验有指导意义。使用本发明检测方法对同一促肝细胞生长素溶液进行3次测定，测得刺激指数2次为6.5、1次为6.7，测定误差仅为1.98％，测定一致性好，较为精确地测定了被测促肝细胞生长素溶液的活力。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明作进一步的阐述。
该促肝细胞生长素活性检测方法采用不含谷氨酰胺成分的RPMI-1640培养液，不含谷氨酰胺成分的RPMI-1640培养液可以选用成品试剂，也可选用不含谷氨酰胺成分的RPMI-1640培养基配制。
实施例促肝细胞生长素活性检测方法分试剂配制，供试品溶液制备，测定供试品组、对照组和空白对照组各3孔吸收度平均值，计算刺激指数四步骤：
1、0.01mol/L磷酸盐缓冲液、RPMI-1640培养液、10％小牛血清培养液、0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液和MTT噻唑蓝溶液等试剂配制：
①配制pH7.3的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠Na2HPO4 1.15g及磷酸二氢钾0.2g，加超纯水1000ml溶解后，高压灭菌备用。
②配制RPMI-1640培养液，取碳酸氢钠2.00g及不含谷氨酰胺成分的RPMI-1640培养基10.0g加超纯水800ml溶解后，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至6.9，加超纯水稀释至1000ml，过滤除菌备用。
③配制10％小牛血清培养液，取上述RPMI-1640培养液900ml，加已灭活的新生小牛血清100ml。
④配制0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液，取0.25g胰蛋白酶及0.02g乙二胺四醋酸二钠，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液100ml溶解后，用5.6％碳酸氢钠调节pH值至7.2，过滤除菌，-20℃保存备用。
⑤配制MTT噻唑蓝溶液，取MTT50mg，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液10ml溶解后，过滤除菌，保存于冷处，使用不超过两周。
2、供试品溶液制备：用不含谷氨酰胺成分的RPMI-1640培养液将供试品制成每1ml中含多肽100μg的溶液。
3、测定供试品组3孔吸收度平均值、对照组3孔吸收度平均值和空白对照组3孔吸收度平均值：
①用10％小牛血清培养液培养SMMC-7721细胞至对数增长期，用0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加10％小牛血清培养液稀释至每1ml中含2.5×104～5×104个细胞，将上述细胞悬液在96孔细胞培养板上铺板，每孔100μl，其中留3孔加10％小牛血清培养液100μl作为空白对照，置37℃、5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养3～4小时使铺在细胞培养板孔上的对照品和空白对照品贴壁。
②在细胞培养板每孔上加供试品溶液100μl，每批供试品均做3孔。
③细胞对照组和空白对照组每孔分别加不含谷氨酰胺成分的RPMI-1640培养基配制的RPMI-1640培养液100μl，置37℃、5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养48小时，结束培养前4小时取出细胞培养板，吸去培养液，每孔加入pH7.3的0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗一次，然后再在每孔中加入上述磷酸盐缓冲液100ul和MTT溶液20μl，继续培养。
④培养结束后，吸出培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜，摇匀，在酶标仪上以550nm的波长处分别测定供试品组3孔吸收度平均值对照组3孔吸收度平均值
和空白对照组3孔吸收度平均值
4、按照下面公式计算表示促肝细胞生长素活性的刺激指数值：
本实施例配制RPMI 1640培养液选用不含谷氨酰胺成分的RPMI 1640A型培养基，也可以选用不含谷氨酰胺的其他类似RPMI 1640的培养基配制。
本实施例使用的不含谷氨酰胺成分的粉末型RPMI 1640A型培养基和现有技术使用的含谷氨酰胺成分的粉末型RPMI 1640培养基成分分别见表1和表2。
表1 粉末型RPMI 1640A型培养基成分表
| 序号 | 化合物名称 | 含量(mg/L) | 序号 | 化合物名称 | 含量(mg/L) |
| 1 | L-精氨酸盐酸盐 | 240.00 | 21 | 硝酸钙 | 100.00 |
| 2 | L-门冬酰胺-水物 | 56.80 | 22 | 硫酸镁 | 48.80 |
| 3 | L-门冬氨酸 | 20.00 | 23 | 磷酸二氢钠 | 800.00 |
| 4 | L-半胱氨酸盐酸盐-水物 | 72.90 | 24 | 氯化钾 | 400.00 |
| 5 | L-谷氨酸 | 20.00 | 25 | 氯化钠 | 6000.00 |
| 6 | 甘氨酸 | 10.00 | 26 | 葡萄糖 | 2000.00 |
| 7 | L-组氨酸盐酸盐-水物 | 20.30 | 27 | 谷胱甘肽 | 1.00 |
| 8 | L-羟脯氨酸 | 20.00 | 28 | 酚红 | 5.00 |
| 9 | L-异白氨酸 | 50.00 | 29 | 丁二酸钠6水物 | 100.00 |
| 10 | L-白氨酸 | 50.00 | 30 | 丁二酸 | 75.00 |
| 11 | L-赖氨酸盐酸盐 | 40.00 | 31 | 生物素 | 0.20 |
| 12 | L-甲硫氨酸 | 15.00 | 32 | 泛酸钙 | 0.25 |
| 13 | L-苯丙氨酸 | 15.00 | 33 | 叶酸 | 1.00 |
| 14 | L-脯氨酸 | 20.00 | 34 | 肌醇 | 35.00 |
| 15 | L-丝氧酸 | 30.00 | 35 | 烟酰胺 | 1.00 |
| 序号 | 化合物名称 | 含量(mg/L) | 序号 | 化合物名称 | 含量(mg/L) |
| 16 | L-苏氨酸 | 20.00 | 36 | 氯化胆碱 | 3.00 |
| 17 | L-色氨酸 | 5.00 | 37 | 盐酸吡哆醇 | 1.00 |
| 18 | L-酪氨酸 | 20.00 | 38 | 核黄素 | 0.20 |
| 19 | L-缬氨酸 | 20.00 | 39 | 盐酸硫胺素 | 1.00 |
| 20 | 对氨基苯甲酸 | 1.00 | 40 | 维生素B 12 | 0.005 |
表2 粉末型RPMI 1640培养基成分表
采用本发明促肝细胞生长素活性检测方法和现有技术对同一促肝细胞生长素溶液进行3次对照检测，检测结果如表3所示：采用本发明不含谷氨酰胺成分的RPMI 1640A型培养基的检测方法检测数据重复率较高、一致性较好，而现有技术检测方法不稳定、一致性差。
表3 两种检测方法三次检测结果表
Claims (2)
1.一种促肝细胞生长素活性检测方法，使用RPMI-1640培养液，检测包括准备试剂步骤、供试品溶液制备步骤、测定供试品组3孔吸收度平均值、对照组3孔吸收度平均值和空白对照组3孔吸收度平均值步骤、计算刺激指数步骤，其特征在于：所述的RPMI-1640培养液采用不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液，所述的促肝细胞生长素活性检测方法分以下步骤：
A、试剂配制：
a、配制pH7.3的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠Na2HPO4 1.15g及磷酸二氢钾0.2g，加超纯水1000ml溶解后，高压灭菌备用；
b、配制10％小牛血清培养液，取不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液900ml，加已灭活的新生小牛血清100ml；
c、配制0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液，取0.25g胰蛋白酶及0.02g乙二胺四醋酸二钠，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液100ml溶解后，用5.6％碳酸氢钠调节pH值至7.2，过滤除菌，-20℃保存备用；
d、配制MTT噻唑蓝溶液，取MTT50mg，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液10ml溶解后，过滤除菌，保存于冷处，使用不超过两周；
B、供试品溶液制备：用不含谷胺酰胺的RPMI-1640培养液将供试品制成每1ml中含多肽100μg的溶液；
C、测定供试品组3孔吸收度平均值、对照组3孔吸收度平均值和空白对照组3孔吸收度平均值：
a、用10％小牛血清培养液培养SMMC-7721细胞至对数增长期，用0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加10％小牛血清培养液稀释至每1ml中含2.5×104～5×104个细胞，将上述细胞悬液在96孔细胞培养板上铺板，每孔100μl，其中留3孔加10％小牛血清培养液100μl作为空白对照，置37℃、5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养3～4小时使铺在细胞培养板孔上的对照品和空白对照品贴壁；
b、在细胞培养板每孔上加供试品溶液100μl，每批供试品均做3孔；
c、细胞对照组和空白对照组每孔分别加不含谷胺酰胺的RPMI-1640培养液100μl，置37℃、5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养48小时，结束培养前4小时取出细胞培养板，吸去培养液，每孔加入pH7.3的0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗一次，然后再在每孔中加入上述磷酸盐缓冲液100ul和MTT溶液20μl，继续培养；
d、培养结束后，吸出培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜摇匀，在酶标仪上以550nm的波长处分别测定供试品组3孔吸收度平均值
对照组3孔吸收度平均值和空白对照组3孔吸收度平均值
D、按照下面公式计算表示促肝细胞生长素活性的刺激指数：
2.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素活性检测方法，其特征在于：所述的不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液采用不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培养基配制，所述的不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液配制方法为，取碳酸氢钠2.00g及不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培养基10.0g加超纯水800ml溶解后，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至6.9，加超纯水稀释至1000ml，过滤除菌备用。
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| 徐仁应等.谷氨酰胺对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖影响的体外研究.胃肠病学10 3.2005,10(3),148-152. |
| 徐仁应等.谷氨酰胺对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖影响的体外研究.胃肠病学10 3.2005,10(3),148-152. * |
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