CN102498206A - 在无谷氨酰胺的细胞培养基中的蛋白质生产 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及补充精氨酸的无谷氨酰胺的细胞培养基。本发明还涉及在补充精氨酸的无谷氨酰胺的哺乳动物细胞培养物中生产重组蛋白质，例如抗体。

Description

在无谷氨酰胺的细胞培养基中的蛋白质生产
发明领域
本发明大体上涉及无谷氨酰胺的细胞培养基。本发明还涉及在无谷氨酰胺的哺乳动物细胞培养物中生产重组蛋白质，例如抗体。 
发明背景 
哺乳动物细胞已成为生产用于临床应用的哺乳动物蛋白质的主要系统，这主要是由于其产生正确折叠和组装的异源蛋白质的能力，及其翻译后修饰能力。通常在异源蛋白质(包括抗体)的重组生产期间，在细胞培养基中含有谷氨酰胺。L-谷氨酰胺是一种必需氨基酸，认为其是培养细胞的主要能量和氮来源。大多数市售的培养基的配方中含有游离的L-谷氨酰胺，其或者包含在基础配方中，或在使用时加入液体培养基制剂。因此，所有哺乳动物细胞培养基包含谷氨酰胺，但转染了谷氨酰胺合成酶的细胞系，例如GS NS0和GS CHO细胞系例外，其中细胞自身生产生长所需的谷氨酰胺。谷氨酰胺以多种浓度被广泛使用，一般在基础培养基中为从1至20mM，在用于补料分批方法的饲料中浓度高得多。例如，L-谷氨酰胺的浓度在Ames’培养基中为0.5mM，在MCDP培养基131中为10mM。DMEM/Ham营养混合物F-12(50∶50)经常被用作用于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的专用培养基的起始制剂。在DMEM/Ham营养混合物F-12中的L-谷氨酰胺是2.5mM。在无血清/无蛋白质的杂交瘤细胞培养基中的L-谷氨酰胺浓度是2.7mM。在DMEM，GMEM，IMDM和H-Y培养基中的L-谷氨酰胺是4mM，其中IMDM经常被用作杂交瘤细胞专用培养基的起始制剂。一般认为，杂交瘤细胞在高于培养基中可见的平均水平的L-谷氨酰胺浓度中生长得更好(Dennis R.Conrad，Glutamine in Cell Culture，Sigma-Aldrich Media  Expert)。 
据显示，谷氨酰胺是在细胞培养物中积累的氨的主要来源(见Markus Schneider，et.al.1996，Journal of Biotechnology 46：161-185的综述)。因此，降低细胞培养基中的谷氨酰胺显著减少NH4 +水平的积累，导致较低的细胞毒性(见Markus Schneider，et.al.1996，同上)。减少的NH4 +细胞毒性导致较高的细胞活力，因此延长了培养寿命。基于使用CHO细胞的估计的谷氨酰胺消耗研究，提出细胞可能以0.3-0.4mM/天的速度消耗谷氨酰胺(Miller，et.al.1988，Biotechnol.Bioeng.32：947-965)。Altamirano等人(2001，J.Biotechnol.110：171-9)研究了用谷氨酸替换谷氨酰胺的效果、和谷氨酸和葡萄糖代谢之间的平衡对生产重组人组织纤溶酶原激活物(rhut-PA)的CHO细胞的再分配的影响。当用谷氨酸替换谷氨酰胺和用葡萄糖分解代谢平衡(碳氮比，C/N比)时，发现细胞代谢发生再分配，且不得不以更有利于产生rhut-PA的方式利用碳和能量来源。也有报导，在粘附培养中的CHO细胞可在缺乏外加的谷氨酰胺的情况下生长，这是由于允许细胞从培养基中的谷氨酸合成谷氨酰胺的内源谷氨酰胺合成酶活性(Sanfeliu和Stephanopoulos，1999， Biotechnol.Bioeng.64：46-53)。然而，相比在含有谷氨酰胺的培养基中的对照培养物，在无谷氨酰胺的培养基中的细胞生长率较低，且分布在G0/G1期的细胞比例提高。谷氨酰胺和谷氨酸二者的耗尽的确导致细胞死亡。 
发明概述 
本发明是基于，至少部分基于以下意料之外的发现，即，使用无谷氨酰胺的生产培养基不仅可在哺乳动物宿主细胞中无任何显著副作用地生产重组蛋白质，而且实际上在生产期中使用无谷氨酰胺的培养基显著提高了细胞活力、培养寿命、单位生产率和/或最终的重组蛋白质滴度。 
本发明也基于以下意料之外的发现，即，在使用无谷氨酰胺的生产培养基的哺乳动物宿主细胞中，对无谷氨酰胺的生产培养基加入天冬酰胺可 进一步增强细胞活力、培养寿命、单位生产率和/或最终的重组蛋白质滴度，而无任何显著的副作用。 
在一个方面，本发明涉及在表达多肽的哺乳动物宿主细胞中生产所述多肽的方法，其包括在补充天冬酰胺的无谷氨酰胺生产培养基中培养处于培养生产期中的哺乳动物宿主细胞。 
在一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。 
在另一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞是dhfr-CHO细胞。 
在另一个实施方案中，生产培养基是无血清的。 
在另外的实施方案中，生产培养基包含一种或多种选自下述的成份： 
1)能量来源； 
2)必需氨基酸； 
3)维生素； 
4)游离的脂肪酸；和 
5)微量元素。 
在另外的实施方案中，其中生产培养基另外包含一种或多种选自下述的成份： 
a)激素和其他生长因子； 
b)盐和缓冲液；和 
c)核苷。 
在所有实施方案中，生产期可例如为分批或补料分批培养期。 
在所有实施方案中，所述方法可另外包括分离所述多肽的步骤。 
在另外的实施方案中，在分离后可测定分离后的细胞活力、培养寿命、单位生产率和最终的重组蛋白质滴度中的一项或多项。 
在另外的实施方案中，相比在含有谷氨酰胺的相同组成的生产培养基中生产的相同多肽，细胞活力、培养寿命、单位生产率和最终的重组蛋白质滴度中的至少一项提高。 
在另外的方面，本发明涉及用于在生产期生产多肽的立即可用的无谷氨酰胺细胞培养基。 
在另一个实施方案中，多肽是哺乳动物糖蛋白。 
在其他实施方案中，多肽选自抗体、抗体片段和免疫粘附素。 
在所有实施方案中，多肽可为例如抗体，或抗体的生物学功能片段。代表性抗体片段包括Fab，Fab′，F(ab′)2，scFv，(scFv)2，dAb，互补决定区(CDR)片段，线性抗体，单链抗体分子，微型抗体(minibody)，双抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。 
在另外的实施方案中，抗体或抗体片段是嵌合的、人源化的或人的。 
治疗抗体包括，但不限于，抗HER2抗体抗CD20抗体；抗IL-8抗体；抗VEGF抗体；抗CD40抗体，抗CD11a抗体；抗CD18抗体；抗IgE抗体；抗Apo-2受体抗体；抗组织因子(TF)抗体；抗人α4β7整联蛋白抗体；抗EGFR抗体；抗CD3抗体；抗CD25抗体；抗CD4抗体；抗CD52抗体；抗Fc受体抗体；抗癌胚抗原(CEA)抗体；针对乳腺上皮细胞的抗体；结合结肠癌细胞的抗体；抗CD38抗体；抗CD33抗体；抗CD22抗体；抗EpCAM抗体；抗GpIIb/IIIa抗体；抗RSV抗体；抗CMV抗体；抗HIV抗体；抗肝炎抗体；抗CA 125抗体；抗αvβ3抗体；抗人肾细胞癌抗体；抗人17-1A抗体；抗人结直肠肿瘤抗体；针对GD3神经节苷脂的抗人黑色素瘤抗体R24；抗人鳞状细胞癌；和抗人白细胞抗原(HLA)抗体，和抗HLA DR抗体。 
在其他实施方案中，治疗抗体是结合HER受体，VEGF，IgE，CD20，CD11a，CD40，或DR5的抗体。 
在其他实施方案中，治疗抗体是抗BR3抗体或BR3-Fc免疫粘附素。 
在本发明的方法的其他实施方案中，在重组宿主细胞中表达的多肽是治疗多肽。例如，治疗多肽可选自生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC，因子IX，组织因子，和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白质C；心房利钠因子(atrial natriuretic factor)；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿 瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(受活化调节，由正常T细胞表达和分泌的因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨源神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6)，或神经生长因子如NGF-β；血小板源生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD34，和CD40；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α，-β，和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF，GM-CSF，和G-CSF；白介素(IL)，例如，IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原如，例如，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER2，HER3或HER4受体；和所述多肽的片段。 
在所有实施方案中，重组宿主细胞可为真核宿主细胞，如哺乳动物宿主细胞，包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。 
这些和其他方面从包括实施例的以下描述和随附的权利要求书中将是显而易见的。 
附图简述 
图1.评估不同浓度的谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的效果的全因子实验设计(DOE)的滴度结果的Apomab抗体立方图分析。模型预测，在补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺 的培养基中获得最高滴度。 
图2.评估不同浓度的谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的效果的全因子实验设计的滴度结果的BR3-Fc免疫粘附素立方图分析。模型预测，在补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺的培养基中获得最高滴度。 
图3.评估不同浓度的谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的效果的全因子实验设计的滴度结果的抗VEGF抗体立方图分析。模型预测，在补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺的培养基中获得最高滴度。 
图4.在无谷氨酰胺、低谷氨酸和高天冬氨酸的条件下，天冬酰胺对Apomab抗体滴度的影响。在无谷氨酰胺的培养基中，相比无天冬酰胺的无谷氨酰胺培养，2.5-15mM天冬酰胺的存在显著提高了Apomab抗体滴度。在这些条件下，存在或缺乏谷氨酸对滴度没有影响。 
图5.在无谷氨酰胺和低谷氨酸条件下，在不同天冬酰胺和天冬氨酸浓度下产生的Apomab抗体滴度。当在这些条件下将天冬氨酸从0提高至10mM时，观察到正向滴定效果。 
图6.A-C.补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺培养基对滴度的影响。相比含有谷氨酰胺的培养基，在无谷氨酰胺的培养基中Apomab抗体、抗VEGF抗体和BR3-Fc免疫粘附素的最终滴度显著更高。 
图7A和B.补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的DMEM/F12无谷氨酰胺培养基对滴度的影响。相比含有谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，在无谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中Apomab抗体和抗VEGF抗体的最终滴度显著更高。 
图8A-C.补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺培养基对细胞单位生产率(Qp)的影响。相比含有谷氨酰胺的培养基，在无谷氨酰胺的培养基中Apomab抗体、抗VEGF抗体和BR3-Fc免疫粘附素的细胞单位生产率显著更高。 
图9A和B.补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的DMEM/F12无谷氨酰胺培养基对细胞单位生产率(Qp)的影响。相比含有谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，在无谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中Apomab抗体和抗VEGF抗体的细胞单位生产率显著更高。 
图10A-C.补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺培养基对细胞活力的影响。相比含有谷氨酰胺的培养基，在无谷氨酰胺的培养基中对于Apomab抗体、抗VEGF抗体和BR3-Fc免疫粘附素的细胞活力显著更高。 
图11A和B.补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的DMEM/F12无谷氨酰胺培养基对细胞活力的影响。在DMEM/F12培养基中，细胞活力在无谷氨酰胺的培养基中没有被一致地改善。相比含有谷氨酰胺的培养基，对于Apomab抗体，细胞活力较高，但对于抗VEGF抗体，细胞活力较低。 
图12A-C.补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺培养基对氨形成的影响。相比含有谷氨酰胺的培养物，在无谷氨酰胺的培养物中氨通常较低。 
图13A和B.补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的DMEM/F12无谷氨酰胺培养基对氨形成的影响。相比含有谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，在无谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中氨显著减少。 
发明详述 
A.定义
术语“细胞培养基”、“培养基”和“营养混合物”指用于培养哺乳动物细胞的营养液，其一般提供一种或多种以下类别中的至少一种成分： 
1)能量来源，通常以碳水化合物的形式，如葡萄糖； 
2)一些或所有必需氨基酸，和通常是20个氨基酸的基本集合加上胱氨酸； 
3)维生素和/或其他一般以低浓度需要的有机化合物； 
4)游离的脂肪酸；和 
5)微量元素，其中将微量元素定义为一般以极低浓度(通常在微摩尔范围内)需要的无机化合物或天然存在的元素。 
可任选地对营养混合物补充任意以下类别的一种或多种成分： 
a)激素和其他生长因子，例如胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子； 
b)盐和缓冲液，例如钙、镁和磷；和 
c)核苷，例如腺苷和胸苷。 
当培养基基本上不含任何哺乳动物来源的血清(例如胎牛血清(FBS))时，细胞培养基大体上是“无血清的”。“基本上不含”是指细胞培养基包含约0-5％之间的血清，优选地约0-1％之间的血清，和最优选地约0-0.1％之间的血清。有利地，可使用无血清的“成分明确的”培养基，其中培养基中的每种成分的身份和浓度是已知的(即在培养基中不存在如牛垂体提取物(BPE)的不明确的成分)。 
在本发明的上下文中，措辞“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且所有这些名称包括后代。因子，词语“转化体”和“转化的(宿主)细胞”包括原代所述细胞和源自其的培养物，与转移次数无关。也应当理解，由于故意或无意突变，所有后代在DNA含量上可能不完全相同。包括具有与用于筛选原始转化细胞的功能或生物学活性相同的突变的后代。当旨在表示不同的定义时，从上下文中将是显而易见的。 
术语“动物宿主细胞”、“动物细胞”、“动物重组宿主细胞”等等包含无脊椎动物、非哺乳动物脊椎动物(例如鸟、爬行动物和两栖动物)和哺乳动物细胞。无脊椎动物细胞的实例包括以下昆虫细胞：草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。见，例如Luckow等人，Bio/Technology，6：47-55(1988)；Miller等人，in Genetic Engineering，Setlow，J.K.等人，编，卷8(Plenum Publishing，1986)，第277-279页；和Maeda等人，Nature，315：592-594(1985)。 
术语“哺乳动物宿主细胞”、“哺乳动物细胞”、“哺乳动物重组宿主细胞”等等指源自哺乳动物的细胞系，当其被置于单层培养或悬浮培养中时能够在含有合适的营养物和生长因子的培养基中生长和存活。用于特定细胞系的必需营养物和生长因子是容易根据经验确定的，不需要过度的实验，如在例如Mammalian Cell Culture(Mather，J.P.编，Plenum Press，N.Y.(1984))，和Barnes和Sato(Cell，22：649(1980))中描述。一般细胞能够表达和分泌大量特定目的蛋白(一般是重组蛋白质)至培养基中，并为了此目的培养所述细胞。然而，也可为了多种其他目的培养细胞，且本发明的范围不局限于仅为了生产重组蛋白质培养细胞。能够在本发明的培养基中生长的合适的哺乳动物细胞系包括用SV40转化的猴肾CVI系(COS-7，ATCC 
Figure BDA0000135268550000091
CRL 1651)；人胚胎肾系293S(Graham等人，J.Gen.Virolo.，36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC 
Figure BDA0000135268550000092
CCL 10)；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243(1980))；猴肾细胞(CVI-76，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC 
Figure BDA0000135268550000094
CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC 
Figure BDA0000135268550000095
CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC 
Figure BDA0000135268550000096
CCL 34)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC 
Figure BDA0000135268550000097
CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC 
Figure BDA0000135268550000098
CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562，ATCC 
Figure BDA0000135268550000099
CCL 5I)；大鼠肝细胞瘤细胞(HTC，MI.54，Baumann等人，J.Cell Biol.，85：1(1980))和TR-1细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，383：44(1982))以及杂交瘤细胞系。中国仓鼠卵巢细胞(Urlab和Chasin， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))是实践本发明的优选细胞系。在以下文档中也描述了适用于本发明的方法的CHO细胞：1989年8月29日公开的EP 117,159；美国专利号4,766,075；4,853,330；5,185,259；Lubiniecki等人，在Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses，Spier等人，编(1989)，第442-451页中。适用于本文的已知CHO衍生物包括，例如CHO/-DHFR(Urlaub和Chasin，Proc.Nati.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))，CHO-K1DUX B11(Simonsen和Levinson， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2495-2499(1983)；Urlaub和Chasin，同 上)，和dp 12.CHO细胞(1989年3月15日公开的EP 307,247)。优选的宿主细胞包括CHO-K1 DUX B11和dp 12.CHO细胞。 
“dhfr-CHO细胞”指二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷的CHO细胞。在哺乳动物细胞中生产重组蛋白质允许制造许多用于临床应用的大的、复杂糖基化的多肽。中国仓鼠卵巢(CHO)DHFR-细胞和可扩增的选择标记物DHFR被常规地用于建立生产临床有用的大量产物的细胞系(Urlab，G.和Chasin，L.A.(1980)Proc.Natl Acad.Sci.USA，77，4216-4220；Kaufman，R.J.和Sharp，P.(1982)J.Mol.Biol.，159，601-621；Gasser，C.S.，Simonsen，C.S.，Schilling，J.W.和Schmike，R.T.(1982)Proc.NatlSci.USA，79，6522-6526)。 
“时期”指技术人员熟知的细胞培养的特定时期。 
细胞培养的“生长期”指细胞通常快速分裂的指数细胞生长期(对数期)。在这期间，在使细胞生长最大化的条件下培养细胞一段时间，通常在1-4天之间。无需过度实验可对预想的特定宿主细胞测定宿主细胞的生长周期。在生长期间，一般在约30-40℃，优选约37℃下，在潮湿的受控环境下，在含有必需添加剂的营养培养基中培养细胞，以致获得对特定细胞系的最优生长。在生长期维持细胞约1-4天之间，通常约2-3天之间的时期。 
细胞培养的“过渡期(Transition phase)”指这样的时期，期间采用生产期的培养条件。在过渡期间，将环境因素如温度从生长条件转变为生产条件。 
细胞培养的“生产期”指这样的时期，期间细胞生长达到稳定。在生长期间，对数细胞生长结束且蛋白质生产是主要的。在此时期中一般补充培养基以维持连续的蛋白质生产和获得预期的蛋白质产物。 
词组“补料分批细胞培养”当在本文中使用时指分批培养，其中最初对培养容器提供动物(例如哺乳动物)细胞和培养基，并在培养期间对培养物连续地或以不连续的增量供应另外的培养营养物，在培养终止前进行或不进行周期性的细胞和/或产物收获。补料分批培养包括“半连续补料分 批培养”，其中周期性地移除全部培养物(包括细胞和培养基)并用新鲜培养基替换。补料分批培养与简单的“分批培养”有区别，在后者中在培养过程的开始对培养容器提供用于细胞培养的所有成分(包括动物细胞和所有培养营养物)。在培养过程期间不从培养容器中取出上清的情况下，补料分批培养还可有别于灌注培养(在灌注培养中，通过例如过滤、封装、锚定在微载体上等等在培养中约束细胞，并连续或间歇地引入和从培养容器中取出培养基)。考虑，设想在补料分批细胞培养期间为了检测的目的取出样品。 
当在本文中使用时，术语“谷氨酰胺”指氨基酸L-谷氨酰胺(又被称为“Gln”和“Q”，分别为三字母和单字母名)，其被公认为用于蛋白质合成的氨基酸构件和在细胞培养中的能量来源二者。因此，术语“谷氨酰胺”和“L-谷氨酰胺”在本文中可互换使用。 
词语“葡萄糖”指单独或组合的α-D-葡萄糖或β-D-葡萄糖。值得注意的是，α和β葡萄糖形式在溶液中可互相转化。 
措辞“渗透压摩尔浓度”是在水溶液中溶解的溶质颗粒的渗透压的测量。溶质颗粒包括离子和非电离的分子二者。渗透压摩尔浓度以溶解在1kg水中的渗透活性颗粒(即渗透压摩尔)的浓度(在38℃的1mOsm/kg H2O相当于19mm kg的渗透压)。“渗透压摩尔浓度”指在1L溶液中溶解的溶质颗粒数。可加入培养基从而增加其渗透压摩尔浓度的溶质包括蛋白质、肽、氨基酸、非代谢的聚合物、维生素、离子、盐、糖、代谢物、有机酸、脂，等等。在优选的实施方案中，提高培养基中的氨基酸和NaCl浓度以获得本文陈述的预期渗透压摩尔浓度范围。当在本文中使用时，缩写“mOsm”描述“毫渗透压摩尔/kg H2O”。 
如本文使用的术语“细胞密度”指在给定体积的培养基中存在的细胞数。 
如本文使用的术语“细胞活力”指在给定的培养条件或实验变量的组合下培养细胞的存活能力。如本文使用的该术语也指相对在特定时间的培养中的活的和死的总细胞数，在该时间存活的细胞部分。 
术语“氨基酸”指所有天然存在的其D和L立体异构型二者的α氨基酸，及其类似物和衍生物。将类似物定义为将氨基酸中的原子取代为通常具有类似性能的不同原子。将衍生物定义为这样的氨基酸，其具有与其连接的另一种分子或原子。衍生物将包括，例如氨基的乙酰化，羧基的胺化或2个半胱氨酸分子的硫残基的氧化以形成胱氨酸。 
术语“蛋白质”旨在指这样的氨基酸序列，其链长度足以产生更高水平的三级和/或四级结构。其与不具有这样的结构的“肽”或其他小分子量药物有区别。本文的蛋白质一般具有至少约15-20kD，优选至少约20kD的分子量。在本文的定义中包含的蛋白质的实例包括所有哺乳动物蛋白质，特别是治疗和诊断蛋白质，例如治疗和诊断抗体，和一般含有一个或多个二硫键的蛋白质，包括包含一个或多个链间和/或链内二硫键的多链多肽。 
术语“治疗蛋白质”或“治疗多肽”指在疾病的治疗中使用的蛋白质，不考虑其适应症(indication)或作用机制。为了使治疗蛋白质可用于临床，其必须被大量制造。取决于生产的蛋白质和需求，治疗蛋白质或其他蛋白质的“制造规模”的生产利用范围从约400L至约80,000L的细胞培养物。一般这样的制造规模生产利用从约400L至约25,000L的细胞培养规模。在此范围内，利用特定的细胞培养规模，如4,000L，约6,000L，约8,000，约10,000，约12,000L，约14,000L，或约16,000L。 
如本文使用的，“目的多肽”一般指具有大于约10个氨基酸的肽或蛋白质。多肽对宿主细胞可为同源的，或优选地可为外源的，这表示其对利用的宿主细胞是异源的，即外来的，例如由非人哺乳动物，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产的人蛋白质。优选地，使用哺乳动物多肽(最初来源于哺乳动物生物的多肽)，更优选地所述多肽被直接分泌进培养基。术语“多肽”或“目的多肽”特别地包括抗体，特别是结合哺乳动物多肽，如以下列出的任意哺乳动物多肽或其片段的抗体，以及免疫粘附素(多肽-Ig融合物)，如包含以下列出的任意哺乳动物多肽或其片段的那些。 
哺乳动物多肽的实例包括，但不限于，跨膜分子(例如受体)和配体，如生长因子。示范性多肽包括以下分子，如肾素；生长激素，包括人生长 激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；干扰素如干扰素-α，-β，和-γ；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC，因子IX，组织因子，和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白质C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)，包括t-PA变体；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(受活化调节，由正常T细胞表达和分泌的因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨源神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6)，或神经生长因子如NGF-β；血小板源生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD34，和CD40；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α，-β，和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF，GM-CSF，和G-CSF；白介素(IL)，例如，IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原如，例如，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER2，HER3或HER4受体；Apo2L/TRAIL，hedgehog，分裂原活化蛋白激酶(MARK)和任意上述列出的多肽的片段。在例如美国申请公开号20040186051中公开了Apo2L(TRAIL)及其变体。在例如美国专利号8,994,879；7,060,269；7,169,901；和 7,297,334中公开了抗VEGF抗体。在例如美国申请公开号20060246004中公开了抗CD20抗体。在例如美国申请公开号20050070689中描述了BR3多肽、抗BR3抗体和BR3-Fc免疫粘附素。 
如本文使用的，术语“免疫粘附素”表示抗体样分子，其组合了异源蛋白(“粘附素”)的结合特异性和免疫球蛋白恒定结构域的效应功能。在结构上，免疫粘附素包含除了抗体的抗原识别和结合位点以外的具有预期结合特异性的氨基酸序列(即是“异源的”)，和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合。免疫粘附素分子的粘附素部分一般是至少包含受体或配体的结合位点的连续的氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可从任意免疫球蛋白获得，例如IgG-1，IgG-2，IgG-3，或IgG-4亚型，IgA(包括IgA-1和IgA-2)，IgE，IgD或IgM。 
如上文指出的，在某些实施方案中，蛋白质是抗体。“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同的结构特征的糖蛋白。抗体展示对特定抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和一般缺乏抗原特异性的其他抗体样分子二者。后一类的多肽由例如淋巴系统以低水平产生，和由骨髓瘤以提高的水平产生。 
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并特别包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体或完整的单克隆抗体)，具有多表位特异性的抗体组合物，多克隆抗体，多价抗体，由至少2种完整的抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，双抗体和单链分子如scFv分子，以及抗体片段(例如Fab，F(ab′)2，和Fv)。 
除非另外指出，在本说明书通篇中使用的措辞“多价抗体”表示包含3个或多个抗原结合位点的抗体。多价抗体一般被设计为具有3个或多个抗原结合位点，并一般不是天然序列IgM或IgA抗体。 
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用，指基本上为完整形式的抗体，不是如下定义的抗体片段。此术语特别指具有包含Fc区的重链的抗体。 
“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结 合位点并因此保留了结合抗原的能力。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点并因此保留了结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段保留至少一种通常与在完整抗体中存在的Fc区相关的生物学功能，如FcRn结合，抗体半衰期调节，ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是具有与完整抗体基本类似的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含与能够赋予片段体内稳定性的Fc序列连接的抗原结合臂。 
抗体的木瓜蛋白酶消化产生2个相同的抗原结合片段，被称为“Fab”片段，每个片段具有一个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有2个抗原结合位点且仍然能够交联抗原的F(ab’)2片段。 
Fab片段包含重链和轻链可变结构域并也包含轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的区别在于前者在重链CH1结构域的羧基端加入少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中指这样的Fab’，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离的巯基。F(ab’)2抗体片段最初以成对的Fab’片段产生，在片段间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学连接也是已知的。本定义包含的抗体片段的实例包括：(i)Fab片段，其具有VL，CL，VH和CH1结构域；(ii)Fab’片段，其是在CH1结构域的C-端具有1个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)具有VH和CH1结构域且在CH1结构域的C-端具有1个或多个半胱氨酸残基的Fd’片段；(v)具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(vi)dAb片段(Ward等人，Nature 341，544-546(1989))，其由VH结构域组成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab′)2片段，包含由铰链区的二硫键连接的2个Fab’片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)(Bird等人，Science 242：423-426(1988)；和Huston等人，PNAS(USA)85：5879-5883(1988))；(x)具有2个抗原结合位点的“双抗体”，其在同一多肽链中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可 变结构域(VH)(见，例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；(xi)包含一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，所述Fd片段与互补轻链多肽形成一对抗原结合区(Zapata等人Protein Eng.8(10)：1057 1062(1995)；和美国专利号5,641,870)。 
“Fv”是最小的抗体片段，其包含完整的抗原结合位点。在一个实施方案中，双链Fv类别由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)类别中，一个重链和一个轻链可变结构域可由易弯曲的肽接头共价连接，从而使轻链和重链可以类似在双链Fv类别中的“二聚体”结构结合。在此构型中，每个可变结构域的3个CDR相互作用，从而在VH-VL二聚体的表面上定义抗原结合位点。6个CDR共同赋予对抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含3个特异性针对抗原的CDR的Fv的一半)就具有识别和结合抗原的能力，尽管比完全的结合位点亲和力低。 
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域在单个多肽链上存在。一般scFv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成用于抗原结合的预期结构。有关scFv的综述，见luckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，卷113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)中。 
术语“双抗体”指具有2个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链(VH-VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生2个抗原结合位点。双抗体可为二价或双特异性的。在例如EP 404,097；WO93/1161；Hudson等人，(2003)Nat.Med.9：129-134；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)中更全面地描述了双抗体。在Hudson等人，(2003)Nat.Med.9：129-134中也描述了三链抗体和四链抗体。 
如本文使用的术语“单克隆抗体”指从基本上均质的抗体群体中得到的抗体，即组成群体的各个抗体除了可能的突变，例如可能以微量存在的天然发生的突变以外是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是不同的抗体的混合物。单克隆抗体是高度特异性的，并针对单个抗原。在某些实施方案中，单克隆抗体一般包括包含结合靶的多肽序列的抗体，其中所述结合靶的多肽序列通过下述过程得到，其中包括从多种多肽序列中选择单个结合靶的多肽序列。例如，选择过程可为从多个克隆，如杂交瘤细胞克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库中选择唯一的克隆。应当理解，可进一步改变选定的靶结合序列，例如改进对靶的亲和力、人源化靶结合序列、改善其在细胞培养中的生产、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体，等等，且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体制品的优势在于，其一般不被其他免疫球蛋白污染。 
修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本均质的抗体群体中得到，不应被视为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，可通过多种技术制备依照本发明使用的单克隆抗体，包括例如杂交瘤法(例如Kohler和Milstein，Nature，256：495-97(1975)；Hongo等人，hybridoma，14(3)：253-260(1995)，Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版1988)；Hammerling等人，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981))，重组DNA法(见，例如美国专利号4,816,567)，噬菌体展示技术(见，例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)，和用于在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的 基因的动物中产生人或类人抗体的技术(见，例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7：33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。 
本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体的对应序列相同或同源，而链的剩余部分与源自另一种物种或属于另一种抗体类型或亚类的抗体的对应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们展示预期的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。 
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体高变区的残基被具有预期特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区的残基替换。在有些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中找不到的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。大体上，人源化抗体将包含基本所有的至少一个和一般2个可变结构域，其中所有或基本所有的高变环对应非人免疫球蛋白的高变环，而所有或基本所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地也包含至少免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白恒定区的一部分。有关进一步的细节，见Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；和 Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。又见，例如Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；和美国专利号6,982,321和7,087,409。又见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-74(2001)。可通过对转基因动物施用抗原制备人抗体，所述动物已被改造为在响应抗原攻击后产生这样的抗体，但其内源基因座已失效，例如免疫的Xenomouse(见例如有关XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。又见，例如有关通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体的Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)。人源化抗体也可包括PrimatizedTM抗体，其中抗体的抗原结合区源自用目的抗原免疫猕猴产生的抗体。 
“人抗体”是具有对应人产生的抗体的氨基酸序列的抗体，和/或使用如本文公开的任意用于制备人抗体的技术制备的抗体。此人抗体的定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的多种技术产生人抗体。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中所述噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人Nature Biotechnology 14：309-314(1996)：Sheets等人PNAS(USA)95：6157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581(1991))。也可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如小鼠制备人抗体，在所述转基因动物中内源免疫球蛋白基因已被部分或全部失活。在攻击后，观察到人抗体的产生，其在各方面非常类似在人中观察到的，包括基因重排、组装和抗体库。在例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和以下科学论文中描述了此方法：Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg 和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。可选地，可通过永生化产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞(这样的B淋巴细胞可从个体中回收，或已在体外被免疫)制备人抗体。见，例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)；和美国专利号5,750,373。 
“亲和力成熟的”抗体是在一个或多个其CDR/HVR中具有一个或多个改变的抗体，相比不具有这些改变的亲本抗体，这导致抗体对抗原的亲和力的改进。优选的亲和力成熟的抗体将具有对靶抗原的纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的程序产生。Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域重排(shuffling)的亲和力成熟。Barbas等人，Proc Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier等人，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；和Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)描述了CDR/HVR和/或框架残基的随机突变。 
抗体的“可变区”或“可变结构域”指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可被称为“VH”。轻链的可变结构域可被称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最多变的部分并包含抗原结合位点。 
术语“可变”指以下事实，即可变结构域的一部分在抗体之间在序列上差异很大，且针对其特定抗原使用对每种特定抗体的结合和特异性。然而，可变性不是平均分布在抗体的可变结构域各处的。其集中在轻链和重链可变结构域二者中的3个被称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)的片段中。可变结构域的较高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然的重链和轻链的可变结构域分别包含4个主要采用β-折叠构型的FR，其通过3个高变区连接，高变区形成环连接β-折叠结构，并有时形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR维持靠近在一起，并与其他链的高变区共同促成抗体的抗原结合位点的形成(见Kabat等人，Sequences of  Proteins of Immunological Interest，第五版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展示了多种效应功能，如抗体在抗体依赖的细胞毒性中的参与。 
术语“高变区”、“HVR”或“HV”，当在本文中使用时指抗体负责抗原结合的氨基酸残基。例如，术语高变区指抗体可变结构域的序列高变和/或形成结构确定的环的区域。抗体一般包含6个HVR；3个在VH中(H1，H2，H3)，3个在VL中(L1，L2，L3)。在天然抗体中，H3和L3展示了6个HVR的最高的多样性，且H3被特别认为在赋予抗体的高度特异性中起独特作用。见，例如Xu等人，Immunity 13：37-45(2000)；Johnson和Wu，in Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo，编，Human Press，Totowa，NJ，2003)。事实上，天然存在的仅由重链组成的骆驼科抗体在缺乏轻链的情况下是有功能且稳定的。见，例如Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-448(1993)；Sheriff等人，Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。 
任意脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”基于其恒定结构域的氨基酸序列，可归属于被称为kappa(κ)和lambda(λ)的2种截然不同的类型之一。 
取决于其重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归属于不同的类型。有5种主要的免疫球蛋白类型：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，且其中的一些可被进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。对应不同类型免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ，和μ。不同类型免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的，并一般在例如Abbas等人，Cellular and Mol.Immunology，第四版(2000)中描述。抗体可为较大的融合分子的一部分，所述融合分子由抗体和一种或多种其他蛋白质或肽通过共价或非共价连接形成。 
使用术语“Fc区”定义免疫球蛋白重链的C-端区域，其可通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生。Fc区可为天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球 蛋白的Fc区一般包含2个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，任选地包含CH4结构域。 
在本文中，“Fc区链”指Fc区的2条多肽链之一。 
人IgG Fc区的“CH2结构域”(又被称为“Cg2”结构域)的独特之处在于，其不与另一个结构域紧密配对。并且，2个N-连接的分支碳水化合物链插入完整天然IgG分子的2个CH2结构域之间。推测碳水化合物可提供结构域-结构域配对的替代并帮助稳定CH2结构域。Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985)。本文中的CH2结构域可为天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。 
“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C-端的残基段。本文中的CH3区可为天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如，具有引入其一条链的“突起”和对应的引入其另一条链的“腔”的CH3结构域；见美国专利号5,821,333，在此明确引入作为参考)。这样的变体CH3结构域可用于产生如本文描述的多特异性(例如双特异性)抗体。 
本文中的“铰链区”可为天然序列铰链区或变体铰链区。变体铰链区的2条多肽链一般在每条多肽链中保留至少一个半胱氨酸残基，从而使变体铰链区的2条多肽链可形成2条链间的二硫键。本文中优选的铰链区是天然序列人铰链区，例如天然序列人IgG1铰链区。 
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种“效应功能”。示范性“效应功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调，等等。这些效应功能一般需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并可使用本领域已知的用于评估这样的抗体效应功能的多种测定评估。 
“天然序列Fc区”包含与在自然界发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包含天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区，及其天然存在的变体。 
“完整”抗体是包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域(CH1，CH2和CH3)的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应功能。 
“亲本抗体”或“野生型”抗体是与如本文公开的抗体变体相比，包含不具有一种或多种氨基酸序列改变的氨基酸序列的抗体。因此，亲本抗体一般具有至少一个这样的高变区，其与如本文公开的抗体变体的相应高变区的氨基酸序列具有氨基酸序列的差异。亲本多肽可包含天然序列(即天然存在的)抗体(包括天然存在的等位基因变体)，或具有天然存在序列的已有的氨基酸序列修饰(如插入、缺失和/或其他改变)的抗体。在本公开通篇中，“野生型”、“WT”、“wt”和“亲本”或“亲本的”抗体可互换使用。 
如本文使用的，“抗体变体”或“变体抗体”指具有与亲本抗体的氨基酸序列有差异的氨基酸序列的抗体。优选地，抗体变体包含具有在自然界中所没有的氨基酸序列的重链可变结构域或轻链可变结构域。这样的变体必须具有与亲本抗体的小于100％的序列同一性或相似性。在优选的实施方案中，抗体变体将具有与亲本抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列的从约75％至小于100％的氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列，更优选地从约80％至小于100％，更优选地从约85％至小于100％，更优选地从约90％至小于100％，和最优选从约95％至小于100％。抗体变体一般是在其一个或多个高变区中或附近包含一个或多个氨基酸改变的抗体。 
“变体Fc区”包含与天然序列Fc区具有至少一个氨基酸修饰的差异的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体Fc区相比天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中的从约1至约10个氨基酸取代，和优选地从约1至约5个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中的从约1至约10个氨基酸取代，和优选地从约1至约5个氨基酸取代。本文中的变体Fc区将一般具有例如与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区的至少约80％的序列同 一性，或与其的至少约90％的序列同一性，或与其的至少约95％或更高的序列同一性。 
抗体“效应功能”指归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并根据抗体同种型变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调；和B细胞活化。 
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指一种细胞毒性形式，其中分泌的IgG与特定细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合，使这些细胞毒性效应细胞特异性结合具有抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的第464页的表3中总结了在造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，如在美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的测定。可用于这些测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选地或另外地，可在体内，例如在如Clynes等人PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。 
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并行使效应功能的白细胞。在某些实施方案中，细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；PBMC和NK细胞是一般优选的。效应细胞可从其天然来源分离，例如从血液中或如本文描述的PBMC。 
“Fc受体”或“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，FcR是天然的人FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)并包括FcγRI，FcγRII，和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和其他剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受 体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有主要在其细胞质结构域中有差异的相似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA包含在其细胞质结构域中的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB包含在其细胞质结构域中的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(见，例如 
Figure BDA0000135268550000251
，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))在例如Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；和de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中综述了FcR。本文的术语“FcR”包括其他FcR，包括在将来鉴定的FcR。 
术语“Fc受体”或“FcR”也包括新生的受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))和调节免疫球蛋白的内稳态。测量与FcRn结合的方法是已知的(见，例如Ghetie和Ward.，Immunol.Today 18(12)：592-598(1997)；Ghetie等人，Nature Biotechnology，15(7)：637-640(1997)；Hinton等人，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。 
可在例如表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中，或已对其施用了具有变体Fc区的多肽的灵长类中测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述了具有与FcR的改进的或减弱的结合的抗体变体。又见，例如Shields等人J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。 
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在补体存在下靶细胞的裂解。通过补体系统的第一成分(C1q)与已结合其同源抗原的(合适亚类的)抗体的结合起始经典补体途径的活化。为了评估补体活化，可进行例如如在Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中描述的CDC测定。在例如美国专利号6,194,551B1和WO 1999/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变体Fc区的多肽)和提高或降低的C1q结合能力的多肽变体。又见，例如Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)。 
“亲和力成熟的”抗体是具有在其一个或多个CDR中的一个或多个改变的抗体，相比不具有这些改变的亲和抗体，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改进。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体具有针对靶抗原的纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的程序产生亲和力成熟的抗体。Marks等人Bio/Technology 10：779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域重排的亲和力成熟。Barbas等人Proc Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813(1994)；Schier等人Gene 169：147-155(1995)；Yelton等人J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；和Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)描述了CDR和/或框架残基的随机突变。 
术语“治疗抗体”指在疾病的治疗中使用的抗体。治疗抗体可具有不同的作用机制。治疗抗体可结合并中和与抗原有关的靶的正常功能。例如，阻碍癌细胞存活所需的蛋白质的活性的单克隆抗体导致细胞死亡。另一种治疗单克隆抗体可结合并激活与抗原有关的靶的正常功能。例如，单克隆抗体可结合细胞上的蛋白质并触发凋亡信号。另一种单克隆抗体可结合仅在病变组织上表达的靶抗原；毒性有效载荷(有效试剂)，例如化学治疗或放射性试剂与单克隆抗体的缀合可产生特异性递送毒性有效载荷至病变组织的试剂，减少对健康组织的伤害。治疗抗体的“生物学功能片段”将展示至少一种(如果不是展示一些或所有)完整抗体所拥有的生物学功能，所述功能至少包含与靶抗原的特异性结合。 
抗体可结合任意蛋白质，包括但不限于，HER受体家族的成员，如HER1(EGFR)，HER2，HER3和HER4；CD蛋白，如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD21，CD22，和CD34；细胞粘附分子，如LFA-1，Mol，p150，95，VLA-4，ICAM-1，VCAM和av/p3整联蛋白，包括α或β或其亚基(例如，抗CD11a，抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；和蛋白质C。其他示范性蛋白质包括生长激素(GH)，包括人生长激素(hGH)和牛生长激素(bGH)；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白 酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC，因子，组织因子，和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白质C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(受活化调节，由正常T细胞表达和分泌的因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白(HSA)；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；DNA酶；抑制素；激活素；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨源神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6)，或神经生长因子如NGF-β；血小板源生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；红细胞生成素(EPO)；促血小板生成素(TPO)；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α，-β，和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF，GM-CSF，和G-CSF；白介素(IL)，例如，IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子(DAF)；病毒抗原如，例如，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；免疫粘附素；抗体；和任意上面列出的多肽的生物学活性片段或变体。依照本发明可使用许多其他抗体和/或其他蛋白质，且以上列表无意为限制性的。 
特别吸引人的治疗抗体包括在临床肿瘤实践或开发中的抗体，如市售的AVASTIN 
Figure BDA0000135268550000271
(贝伐单抗(bevacizumab))，HERCEPTIN 
Figure BDA0000135268550000272
(曲妥珠单抗(trastuzumab))，LUCENTIS 
Figure BDA0000135268550000273
(兰尼单抗(ranibizumab))，RAPTIVA (依法珠单抗(efalizumab))，RITUXAN 
Figure BDA0000135268550000275
(利妥昔单抗(rituximab))，和XOLAIR 
Figure BDA0000135268550000276
(奥马佐单抗(omalizumab))，以及抗淀粉状蛋白β(Aβ)，抗CD4 (MTRX1011A)，抗EGFL7(EGF样结构域7)，抗IL13，Apomab(抗DR5靶向的促凋亡受体激动剂(PARA)，抗BR3(CD268，BLyS受体3，BAFF-R，BAFF受体)，抗β7整联蛋白亚基，dacetuzumab(抗CD40)，GA101(抗CD20单克隆抗体)，MetMAb(抗MET受体酪氨酸激酶)，抗神经纤毛蛋白-1(NRP1)，ocrelizumab(抗CD20抗体)，抗OX40配体，抗氧化型LDL(oxLDL)，帕妥珠单抗(pertuzumab)(HER二聚化抑制物(HDI)，和rhuMAb IFNα。 
抗体的“生物学功能片段”仅包含完整抗体的一部分，其中所述部分保留至少一种，和多达大多数或所有的当在完整抗体中存在时通常与该部分相关的功能。在一个实施方案中，抗体的生物学功能片段包含完整抗体的抗原结合位点，并因此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体的生物学功能片段，例如包含Fc区的片段保留至少一种当在完整抗体中存在时通常与Fc区相关的生物学功能，如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体的生物学功能片段是具有与完整抗体基本相似的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的抗体生物学功能片段可包含与能够赋予片段体内稳定性的Fc序列连接的抗原结合臂。 
术语“诊断蛋白质”指在疾病的诊断中使用的蛋白质。 
术语“诊断抗体”指被用作疾病的诊断试剂的抗体。诊断抗体可结合与特定疾病特异性相关的，或在特定疾病中显示提高的表达的靶抗原。诊断抗体可用于，例如在患者的生物样品中，或在患者的疾病位点如肿瘤的诊断成像中检测靶。诊断抗体的“生物学功能片段”将展示至少一种(如果不是展示一些或全部)完整抗体所拥有的生物学功能，所述功能至少包含与靶抗原的特异性结合。 
“纯化的”指分子在样品中以至少80-90％的以包含其的样品重量计的浓度存在。纯化的蛋白质(包括抗体)优选地为基本上纯的，和理想地基本上均质的(即不含污染蛋白质等等)。 
“基本上纯的”蛋白质指包含基于组合物总重量的至少约90％以重量计，优选至少约95％以重量计的蛋白质的蛋白质组合物。 
“基本上均质的”蛋白质指包含基于组合物总重量的至少约99％以重 量计的蛋白质的蛋白质组合物。 
如本文使用的，“可溶的”指当在水溶液中时完全溶解的多肽，得到通过目测评估没有可见微粒的澄清至略微乳白色的溶液。溶液浊度(或蛋白质溶解度)的另一种测定可通过用1cm路径长度(path-length)的小室测量340nm至360nm处的紫外吸收度，其中20mg/ml的浊度为小于0.05吸光度单位。 
“分离的”抗体或多肽是已从其天然环境的成分中鉴定和分离和/或回收的抗体或多肽。其天然环境的污染成分是将干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化为(1)如通过例如Lowry法测定的大于95％的以重量计的抗体，和在一些实施方案中，大于99％的以重量计的抗体；(2)通过使用例如旋转杯测序仪(spinning cup sequenator)足以获得至少15个残基的N端或内部氨基酸序列的程度，或(3)使用例如考马斯蓝或银染，在还原或非还原条件下的SDS-PAGE中的同质性。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为至少一种抗体天然环境的成分将不存在。但是，通常，将通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。 
术语“蛋白质A”和“ProA”在本文中可互换使用，并包含从其天然来源回收的蛋白质A，合成产生的蛋白质A(例如通过肽合成或通过重组技术)，和保留结合具有CH2/CH3区，如Fc区的蛋白质的能力的其变体。蛋白质A可从Repligen，Pharmacia and Fermatech商业购买。蛋白质A一般被固定在固相支持材料上。术语“ProA”也指亲和层析树脂或包含与蛋白质A共价连接的层析固体支持基质的柱。 
术语“层析”指这样的过程，通过层析将混合物中的目的溶质与混合物中的其他溶质分离，这是因为混合物中的各个溶质在流动相的影响下，或在结合和洗脱过程中迁移通过固定介质的速度的差异。 
术语“亲和层析”和“蛋白质亲和层析”在本文中可互换使用，并指一种蛋白质分离技术，其中目的蛋白或目的抗体与生物特异性配体可逆和特异性地结合。优选地，生物特异性配体与层析固相材料共价连接，并当 溶液接触层析固相材料时可接近目的蛋白。目的蛋白(例如抗体、酶或受体蛋白)在层析步骤中保持其对生物特异性配体(例如抗原、底物、辅因子或激素)的特异性结合亲和力，而混合物中的其他溶质和/或蛋白质不与配体明显地或特异性地结合。目的蛋白与固定化的配体的结合允许污染蛋白质或蛋白质杂质通过层析介质，而目的蛋白保持与固相材料上的固定化的配体的特异性结合。然后用低pH、高pH、高盐、竞争配体等等从固定化的配体上去除活性形式的特异性结合的目的蛋白，并用洗脱缓冲液使其通过层析柱，其中不含之前已通过柱的污染蛋白质或蛋白质杂质。可使用任何成分作为配体纯化其相应的特异性结合蛋白质，例如抗体。 
术语“非亲和层析”和“非亲和纯化”指一种纯化过程，其中不使用亲和层析。非亲和层析包括依赖于目的分子(如蛋白质，例如抗体)和固相基质间的非特异性相互作用的层析技术。 
“阳离子交换树脂”指一种固相，其是负电荷的，并因此其具有游离的阳离子用于交换经过或通过固相的水溶液中的阳离子。与固相连接以形成阳离子交换树脂的负电荷配体可为，例如羧酸盐或磺酸盐。市售的阳离子交换树脂包括羧甲基纤维素，固定在琼脂糖上的磺丙基(SP)(例如Pharmacia的SP-SEPHAROSE FAST FLOWTM或SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCETM)和固定在琼脂糖上的磺酰基(例如Pharmacia的S-SEPHAROSE FAST FLOWTM)。“混合模式离子交换树脂”指一种固相，其被阳离子、阴离子和疏水部分共价修饰。市售的混合模式离子交换树脂是BAKERBOND ABXTM(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)，其包含与硅胶固相支持基质连接的弱阳离子交换基团，低浓度的阴离子交换基团，和疏水配体。 
在本文中使用的术语“阴离子交换树脂”指一种固相，其是正电荷的，例如具有一种或多种正电荷配体，如与其连接的四元(quaternary)氨基。市售的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素，QAE SEPHADEXTM和FAST QSEPHAROSETM(Pharmacia)。 
“缓冲液”是一种溶液，其通过其中的酸碱缀合物成分的作用对抗pH 的变化。在Buffers.A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems，Gueffroy，D.，编Calbiochem Corporation(1975)中描述了取决于例如缓冲液的预期pH的可应用的多种缓冲液。在一个实施方案中，缓冲液具有范围从约2至约9，可选地从约3至约8，可选地从约4至约7，可选地从约5至约7的pH。将pH控制在此范围中的缓冲液的非限制性实例包括MES，MOPS，MOPSO，Tris，HEPES，磷酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐和铵盐缓冲液，以及其组合。 
“上样缓冲液”是用于将包含目的多肽分子和一种或多种杂质的组合物上样至离子交换树脂的缓冲液。上样缓冲液具有使目的多肽分子(和一般地一种或多种杂质)结合离子交换树脂，或使目的蛋白流经柱而使杂质结合树脂的电导率和/或pH。 
“中间缓冲液”用于在洗脱目的多肽分子前，从离子交换树脂上洗脱一种或多种杂质。中间缓冲液的电导率和/或pH是这样的，即，使一种或多种杂质从离子交换树脂上洗脱，而不是显著量的目的多肽。 
当在本文中使用时，术语“洗涤缓冲液”指用于在洗脱目的多肽分子前，洗涤或重新平衡离子交换树脂的缓冲液。便利地，洗涤缓冲液和上样缓冲液可为相同的，但这不是必需的。 
“洗脱缓冲液”用于从固相上洗脱目的多肽。洗脱缓冲液的电导率和/或pH是这样的，即，使目的多肽从离子交换树脂上洗脱。 
“再生缓冲液”可用于再生离子交换树脂，使其可被再次使用。再生缓冲液具有从离子交换树脂上去除基本上所有的杂质和目的多肽所需的电导率和/或pH。 
如本文中使用的，术语“基本相似”或“基本相同”表示2个数值间足够高的相似度(例如，1个数值与本发明的抗体有关，而另一个数值与参考/比较抗体有关)，以致本领域技术人员将认为，在通过所述值(例如Kd值)测量的生物学特征的上下文中，2个值之间的差异很小或没有生物学和/或统计学显著性。所述2个值之间的差异为，例如相对参考/比较值的小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，和/或小于约10％。 
如本文使用的，有关数量或数值的词组“显著减少”或“显著不同”(并不是指化学过程的还原)，表示2个数值间足够高的差异度(一般1个数值与分子有关，而另一个数值与参考/比较分子有关)，以致本领域技术人员将认为，在通过所述值(例如Kd值)测量的生物学特征的上下文中，2个值之间的差异具有统计学显著性。所述2个值之间的差异为，例如相对参考/比较分子的大于约10％，大于约20％，大于约30％，大于约40％，和/或大于约50％。 
如本文使用的术语“载体”旨在指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，其指其中可连接另外的DNA片段的环状双链DNA。另一种载体类型是噬菌体载体。另一种载体类型是病毒载体，其中可在病毒基因组中连接另外的DNA片段。某些载体能够在引入其的宿主细胞中自我复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后整合进宿主细胞的基因组，并因此与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够引导与其有效连接的基因的表达。这样的载体在本文中被称为“重组表达载体”，或简称“表达载体”。一般，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最普遍使用的载体形式。 
有关参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”被定义为在比对了序列和引入缺口(如果需要的话)以获得最大百分比序列同一性后，在候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，且不认为任意保守取代是序列同一性的一部分。可以多种本领域技术内的方式实现为了测定百分比氨基酸序列同一性的比对，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在比较的序列全长上获得最大比对的任意算法。然而，为了本发明的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.授权，其源代码和用户文档已在美国著作权局， 华盛顿，20559中存档，在那里以美国著作权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California出公开地获得，或可从源代码编译。ALIGN-2程序应当在UNIX操作系统，优选数字UNIX V4.0D上编译使用。所有序列比对参数由ALIGN-2程序设定且没有变化。 
在使用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，如下计算给定的氨基酸序列A相对，与，或针对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可被可选地表示为具有或包含相对，与，或针对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性的给定的氨基酸序列A)： 
100乘以分数X/Y 
其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在A和B的比对程序中计为相同匹配的氨基酸残基数，和 
其中Y是B中的氨基酸残基总数。 
应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对B的％氨基酸序列同一性不等于B相对A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别说明，在本文中使用的所有％氨基酸序列同一性是如在上面紧接的段落中描述的使用ALIGN-2计算机程序得到的。 
“百分比(％)核酸序列同一性”被定义为在比对了序列和引入缺口(如果需要的话)以获得最大百分比序列同一性后，在候选序列中与参考因子D编码序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。可以多种本领域技术内的方式实现为了测定百分比核酸序列同一性的比对，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括在比较的序列全长上获得最大比对的任意算法。然后相对较长的序列计算序列同一性，即，即使较短的序列显示了与较长序列的一部分的100％序列同一性，总序列同一性将小于100％。 
“治疗”指治疗处理和预防或预防性措施。需要治疗的个体包括已患有疾病的个体以及需要预防疾病的个体。本文中的“治疗”包括减轻疾病 和特定疾病的病症和症状。 
“疾病”是可从使用蛋白质的治疗中受益的任意病症。这包括慢性和急性疾病或病症，包括使哺乳动物易于患上讨论中的疾病的病理状态。本文中有待治疗的疾病的非限制性实例包括癌和过敏。 
用于治疗的“哺乳动物”指被归类为哺乳动物的任意动物，包括人、非人高等灵长类、其他脊椎动物、家畜和农场动物，和动物园、运动或宠物动物，如狗、马、猫、牛等等。优选地，哺乳动物是人。 
B.实施本发明的示范方法和材料
除了另外指出，本发明的实践将使用本领域技术内的常规分子生物学技术等等。在文献中充分解释了这样的技术。见，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(J.Sambrook等人，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)；Current Protocols in Molecular Biology(F.Ausubel等人，编，1987年更新的)；Essential Molecular Biology(T.Brown编，IRL Press 1991)；Gene Expression Technology(Goeddel编，Academic Press 1991)；Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes(A.Bothwell等人，编，Bartlett Publ.1990)；Gene Transfer and Expression(M.Kriegler，Stockton Press 1990)；Recombinant DNA Methodology II(R.Wu等人，编，Academic Press 1995)；PCR：A Practical Approach(M.McPherson等2 ，IRL Press at Oxford University Press 1991)；Oligonucleotide Synthesis(M.Gait编，1984)；Cell Culture for Biochemists(R.Adams编，Elsevier Science Publishers 1990)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.Miller&M.Calos编，1987)；Mammalian Cell Biotechnology(M.Butler编，1991)；Animal Cell Culture(J.Pollard等人，编，Humana Press 1990)；Culture of Animal Cells，第二版(R.Freshney等人，编，Alan R.Liss 1987)；Flow Cytometry and Sorting(M.Melamed等人，编，Wiley-Liss 1990)；Methods in Enzymology系列(Academic Press， Inc.)；Wirth M.和Hauser H.(1993)；Immunochemistry in Practice，第三版，A.Johnstone&R.Thorpe，Blackwell Science，Cambridge，MA，1996；Techniques in Immunocytochemistry，(G.Bullock&P.Petrusz编，Academic Press 1982，1983，1985，1989)；Handbook of Experimental Immunology，(D.Weir&C.Blackwell，编)；Current Protocols in Immunology(J.Coligan等人，编1991)；Immunoassay(E.P.Diamandis&T.K.Christopoulos，编，Academic Press，Inc.，1996)；Goding(1986)Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(第二版)Academic Press，New York；Harlow和Dayid Lane编，Antibodies A laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1988；Antibody Engineering，第二版(C.Borrebaeck，编，Oxford University Press，1995)；和Annual Review of Immunology系列；Advances in Immunology系列。 
1.使用无谷氨酰胺的细胞培养基在哺乳动物宿主细胞中重组生产蛋白质
本发明涉及使用补充天冬酰胺的无谷氨酰胺的细胞培养基，在哺乳动物宿主细胞中大规模重组生产蛋白质。哺乳动物细胞已成为生产用于临床应用的哺乳动物蛋白质的优势系统，这主要是由于其产生正确折叠和组装的异源蛋白质的能力，及其翻译后修饰的能力。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，和从多种其他哺乳动物来源，例如小鼠骨髓瘤细胞(NS0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、人胚胎肾细胞(HEK-293)和人视网膜细胞得到的细胞系已得到管理机构的认可，用于生产生物制药产品，包括治疗抗体。其中，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是最常用的工业宿主之一，其被广泛应用于异源蛋白质的生产。因此，在CHO中，包括在二氢叶酸还原酶阴性的(DHFR-)CHO细胞中大规模生产抗体的方法是本领域熟知的(见，例如Trill等人，Curr.Opin.Biotechnol.6(5)：553-60(1995)和美国专利号6,610,516)。 
作为第一步，可将编码预期重组蛋白质的核酸(例如cDNA或基因组 DNA)插入用于克隆(扩增DNA)或用于表达的可复制的载体中。多种载体是可公开获得的。载体成分一般包括，但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，其分别在下面描述。可使用的可选的信号序列、复制起点、标记物基因、增强子元件和转录终止序列是本领域已知的，并在PCT公开WO 97/25428中进一步详细描述。 
表达和克隆载体通常包含可被宿主生物识别的且与编码蛋白质的核酸序列有效连接的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(5’)(一般在约100-1000bp内)的非翻译序列，其控制与其有效连接的特定核酸序列的转录和翻译。这样的启动子一般分为2类，诱导型和组成型。诱导型启动子是在响应培养条件中的一些变化(例如营养物的存在或缺乏，或温度的改变)后，从其控制下的DNA中发起提高水平的转录的启动子。目前，被多种潜在的宿主细胞识别的大量启动子是熟知的。通过限制酶消化从来源DNA去除启动子并在载体中插入分离的启动子序列，将这些启动子与编码预期蛋白质的DNA有效连接。 
适用于原核和真核宿主的启动子是本领域已知的，并在PCT公开WO 97/25428中进一步详细描述。 
使用标准连接技术构建包含一种或多种上面列出的成分的合适载体。以预期的形式切割、剪裁和重新连接分离的质粒或DNA片段，以产生需要的质粒。 
为了分析确认在质粒构建体中的正确序列，可将连接混合物用于转化大肠杆菌(E.coli)细胞，如大肠杆菌K12菌株294(ATCC 
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31，446)，并适当地通过氨苄青霉素或四环素抗性选择成功的转化体。从转化体中制备质粒，通过限制性内切酶消化分析，和/或使用本领域已知的标准技术测序。(见，例如Messing等人，Nucleic Acids Res.1981，9：309；Maxam等人，Methods in Enzymology 1980，65：499)。 
可使用提供在哺乳动物细胞中瞬时表达的表达载体。一般，瞬时表达包括在宿主细胞中使用能够有效复制的表达载体，从而使宿主细胞积累许 多表达载体拷贝，并进而合成高水平的由表达载体编码的预期多肽(Sambrook等人，同上)。包含合适的表达载体和宿主细胞的瞬时表达系统允许方便的阳性鉴定由克隆的DNA编码的多肽，以及快速筛选这些多肽的预期生物学或生理学性能。 
在Gething等人，Nature 1981，293：620-625；Mantei等人，Nature 1979，281：40-46；EP 117,060；和EP 117,058中描述了适于在重组脊椎动物细胞培养物中合成预期异源蛋白质的合适的其他方法、载体和宿主细胞。 
用于大规模生产，根据本发明，用上述表达载体转染和优选地转化哺乳动物宿主细胞，并在适当修饰的用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码预期序列的基因的营养培养基中培养。 
转染指宿主细胞对表达载体的摄取，不管实际上是否表达任何编码序列。许多转染方法是本领域普通技术人员已知的，例如CaPO4和电穿孔。当在宿主细胞中出现任意此载体活动的迹象时，一般认可是成功转染。 
转化指将DNA引入生物从而使DNA可作为染色体外元件复制，或通过染色体整合体复制。取决于使用的宿主细胞，使用适合这些细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等人，同上中描述的使用氯化钙的钙处理，或电穿孔一般用于原核细胞或其他含有实质细胞壁障碍的细胞。如描述的(Shaw等人，Gene 1983，23：315和PCT公开号WO 89/05859)，使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的感染用于某些植物细胞的转化。另外，可使用超声处理(在1991年1月10日公开的PCT公开号WO 91/00358)转染植物。 
对没有这样的细胞壁的哺乳动物细胞，可使用磷酸钙沉淀法(Graham和van der Eb，Virology 1978，52：456-457)。在美国专利号4,399,216中已描述了哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面。有关用于转化哺乳动物细胞的多种技术，又见Keown等人Methods in Enzymology 1990，185：527-537和Mansour等人Nature 1988，336：348-352。 
在大规模生产中，为了开始生产周期，通常允许少量转化的重组宿主细胞在培养下生长几天。一旦细胞经历了几轮复制，就将其转移至较大的 容器，在那里使其准备好进入发酵。细胞生长的培养基和在生产周期中存在的氧气、氮气和二氧化碳的水平可对生产过程具有显著影响。对每种细胞系特别地决定生长参数，并频繁测量这些参数以保证最佳生长和生产条件。 
当细胞生长到足够的数量时，将其转移至大规模生产槽以开始生产期，并培养较长的时期。在过程中的此时可收获重组蛋白质。一般地，细胞被改造为将多肽分泌进细胞培养基中，所以在纯化过程中的第一步是从培养基中分离细胞。收获通常包括离心和过滤以产生收获的细胞培养液(HCCF)。然后使培养基经历若干另外的纯化步骤，以去除任意细胞碎片、不想要的蛋白质、盐、矿物质或其他不理想的成分。在纯化过程结束时，重组蛋白质是高纯度的且适于人治疗用途。 
尽管此方法是过去数十年间许多研究和改进的主题，在重组蛋白质，例如抗体的大规模商业生产中仍然存在进一步改进的空间。因此，哺乳动物宿主细胞培养物的细胞活力、寿命和单位生产率的提高，和生产的重组蛋白质的滴度的改进对生产的重组蛋白质的价格具有实质影响，并在治疗蛋白质的情况下，对药物产品的价格和实用性具有实质影响。 
本发明涉及在哺乳动物细胞培养中生产异源蛋白质的改进方法，在细胞培养过程的生产期中使用添加天冬酰胺的无谷氨酰胺的培养基。在本发明的方法中使用的培养基可基于用于在哺乳动物宿主细胞，特别是CHO细胞中重组生产蛋白质的任意市售的培养基。 
市售的培养基的实例包括Ham′s F10(Sigma)，基本必需培养基(Minimal Essential Medium)(“MEM”，Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)(“DMEM”，Sigma)。可对任意这些培养基按需补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)，缓冲液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸苷)，抗生素(如GentamycinTM药物)，微量元素(被定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等价的能量来源。任意其他的必需补充物也可以合适 的浓度被包括在内，这是本领域技术人员已知的。培养条件(如温度、pH等等)是以前用于选定的宿主细胞的用于表达的培养条件，并且对本领域普通技术人员是显而易见的。另外，本发明的培养基可基于在Ham和McKeehan，Meth.Enz.，58：44(1979)；Barnes和Sato，Anal.Biochem.，102：255(1980)；美国专利号4,767,704；美国专利号4,657,866；美国专利号4,927,762；美国专利号5,122,469或美国专利号4,560,655；WO 90/03430；和WO 87/00195中描述的任意培养基，只要省去谷氨酰胺成分。 
由于哺乳动物细胞仅可在谷氨酰胺的存在下合成天冬酰胺，在无谷氨酰胺的条件下需要天冬酰胺。在天冬酰胺合成酶的存在下，通过从谷氨酰胺转移酰胺合成天冬酰胺。优选地以2.5mM至15mM范围的浓度对培养基加入天冬酰胺。在本发明的不同实施方案中，优选的天冬酰胺浓度应为至少2.5mM。在优选的实施方案中，以10mM的浓度加入天冬酰胺。 
大体上，在使用本文的细胞培养基的重组蛋白质的生产中可找到用于最大化哺乳动物细胞培养的生产率的原理、方案和实用技术，且所述原理、方案和实用技术可改变以适合上述生产。 
用于特定细胞系的培养基的必需营养物和生长因子，包括其浓度是根据经验确定的，不需要过度的实验，如在例如Mammalian Cell Culture，Mather，编(Plenum Press：NY，1984)；Barnes和Sato，Cell，22：649(1980)或Mammalian Cell Biotechnology：A Practical Approach，M.Butler，编(IRL Press，1991)中描述。合适的培养基包含基础培养基成分如基于DMEM/HAM F-12的配方(有关DMEM和HAM F12培养基和特别是无血清培养基的成分，见American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas，第六版，1988，第346-349页中的培养基配方)，其具有修改浓度的一些成分，如氨基酸、盐、糖和维生素，任选地包含甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷；重组人胰岛素、水解蛋白胨如PRIMATONE HSTM或PRIMATONE RLTM(Sheffield，England)或等价物；细胞保护剂，如PLURONIC F68TM或等价的普朗尼克多醇；GENTAMYCINTM；和微量元素。如美国专利号5,122,469中描述的培养基配方是特别合适的，其特征在于存 在高水平的特定氨基酸，以及如下所述的PS-20。 
可通过在多种细胞培养条件下培养表达预期糖蛋白的细胞生产本发明的糖蛋白。例如，在本发明的上下文中，用于糖蛋白的大规模或小规模生产的细胞培养程序是可能有用的。程序包括，但不限于流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养，或可使用搅拌槽生物反应器，在后2种系统中，具有或不具有微载体，且可选地在分批、补料分批或连续模式下操作。 
在特定的实施方案中，在搅拌槽生物反应器系统中进行本发明的细胞培养，并使用补料分批培养程序。在优选的补料分批培养中，最初对培养容器提供哺乳动物宿主细胞和培养基，并在培养期间对培养物连续地或以不连续的增量供应另外的培养营养物，在培养终止前进行或不进行周期性的细胞和/或产物收获。补料分批培养可包括例如半连续补料分批培养，其中周期性地取出全部培养物(包括细胞和培养基)并用新鲜培养基替换。补料分批培养与简单的分批培养有区别，在后者中在培养过程的开始对培养容器提供用于细胞培养的所有成分(包括细胞和所有培养营养物)。在培养过程期间不从培养容器中取出上清的情况下，补料分批培养还可有别于灌注培养(在灌注培养中，通过例如过滤、封装、锚定在微载体上等等在培养中约束细胞，并连续或间歇地引入和从培养容器中取出培养基)。 
此外，可根据可适于特定宿主细胞的任意方案或程序和设想的特定生产计划增殖培养细胞。因此，本发明设想一步或多步培养程序。在一步培养中，将宿主细胞接种到培养环境中，并在细胞培养的单个生产期中应用本发明的方法。可选地，预想多阶段培养。在多阶段培养中，可在多个步骤或时期中培养细胞。例如，可在第一步或生长期培养中培养细胞，其中将(可能从储存器中移取的)细胞接种在适于促进生长和高活力的培养基中。通过对宿主细胞培养物加入新鲜的培养基，将细胞在生长期维持合适的时间。 
根据本发明的特定方面，设计补料分批或连续的细胞培养条件以提高哺乳动物细胞在细胞培养的生长期中的生长。在生长期，在最大化生长的 条件和时期中培养细胞。培养条件，如温度、pH、溶解的氧气(DO2)等等是根据特定宿主使用的，并且对普通技术人员是显而易见的。一般，使用酸(例如CO2)或碱(例如Na2CO3或NaOH)将pH调节至约6.5和7.5之间的水平。用于培养哺乳动物细胞如CHO细胞的合适温度范围在约30至40℃之间，和优选地约37℃。且合适的DO2在5-90％的空气饱和之间。 
在特定阶段，可使用细胞接种细胞培养的生产期或步骤。可选地，如上所述，生产期或步骤可与接种或生长期或步骤是连续的。 
在哺乳动物，例如CHO细胞中生产靶蛋白一般使用半连续过程，其中在“种子培养(seed-train)”中培养细胞不同的时间，并周期性地将细胞转移至接种发酵罐中以产生足够的细胞量用于接种较大规模的生产发酵罐。因此，用于生产预期蛋白质的细胞被培养多个时期，直到达到最大预定细胞年龄。细胞培养过程的参数，如种子密度，培养时的pH、DO2和温度，生产培养的持续时间，收获的操作条件等随使用的特定细胞系和培养基而变化，且可经验地测定，无需过度实验。 
根据本发明，控制细胞培养的生产期中的细胞培养环境。在优选的方面，在细胞培养过程的生产期之前为细胞培养的过渡期，其中采用细胞培养生产期的参数。 
优选地从培养基中以分泌的多肽形式回收预期多肽，如抗体，但当直接生产没有分泌信号的多肽时，也可从宿主细胞裂解液中回收。如果多肽是膜结合的，可使用合适的去垢剂溶液(例如Triton-X 100)将其从膜上释放，或通过酶切割释放其胞外区。 
当在一种非人来源的细胞之外的重组细胞中生产多肽时，其不含人来源的蛋白质或多肽。然而，通常必须从重组细胞蛋白质或多肽中回收或纯化重组蛋白质，以得到有关预期多肽的基本均质的制品。作为第一步，可离心培养基或裂解液以去除细胞碎片颗粒。然后用以下合适纯化程序的示范程序从污染的可溶性蛋白质和多肽中纯化异源多肽：通过在离子交换柱如SP-SepharoseTM或CM-SepharoseTM上分馏；羟磷灰石；疏水相互作用层析；乙醇沉淀；层析聚焦；硫酸铵沉淀；凝胶过滤，使用例如Sephadex G-75TM；和/或渗滤。 
可通过例如亲和层析分离重组多肽。 
也可使用蛋白酶抑制剂如苯甲基磺酰氟(PMSF)在纯化期间抑制蛋白水解降解，也可包含抗生素以避免外来污染物的生长。本领域技术人员将理解，在本文中可使用适于纯化和分离重组蛋白质(包括抗体)的纯化方法，且如果需要，可使用标准技术修改。 
可在样品中直接测量预期异源蛋白质的表达，例如通过常规的DNA印迹、RNA印迹定量mRNA的转录(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1980，77：5201-5205)，点印迹(DNA分析)，或原位杂交，基于本文提供的序列使用适当标记的探针。可使用多种标记物，最常用地放射性同位素，特别是32P。然而，也可使用其他技术，如使用用于引入多核苷酸的生物素修饰的核苷酸。然后生物素充当抗生物素蛋白或抗体的结合位点，其可被种类广泛的标记物标记，如放射性核苷酸、荧光剂或酶。可选地，可使用识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂交双链体或DNA-蛋白质双链体。抗体可进而被标记并进行测定，其中双链体结合至一种表面，从而当在表面上形成双链体时，可检测与双链体结合的抗体的存在。 
可选地，可通过免疫学方法如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液的测定测量基因表达，以直接定量基因产物的表达。使用免疫组化染色技术制备细胞样品，一般通过脱水和固定，接着用特异性针对配对的(coupled)基因产物的标记抗体进行反应，其中标记物通常是可目测的，如酶标记物、荧光标记物、发光标记物等等。用于免疫组化染色和/或样品液测定的抗体可为单克隆或多克隆的，且可在任意哺乳动物中制备。 
2.抗体
在优选的实施方案中，本发明的方法用于抗体，包括治疗和诊断抗体的重组生产。在本发明范围内的抗体包括，但不限于：抗HER2抗体，包括曲妥珠单抗(HERCEPTIN 
Figure BDA0000135268550000421
)(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)，美国专利号5,725,856)；抗CD20抗体，如在美国 专利号5,736,137中的嵌合的抗CD20“C2B8”(RITUXAN 
Figure BDA0000135268550000431
)，如在美国专利号5,721,108B1中的2H7抗体的嵌合或人源化变体，或托西莫单抗(BEXXAR 
Figure BDA0000135268550000432
)；抗IL-8(St John等人，Chest，103：932(1993)，和国际公开号WO 95/23865)；抗VEGF抗体，包括人源化和/或亲和力成熟的抗VEGF抗体，如人源化抗VEGF抗体huA4.6.1AVASTIN 
Figure BDA0000135268550000433
(Kim等人，GrowthFactors，7：53-64(1992)，国际公开号WO 96/30046，和1998年10月15日公开的WO 98/45331)；抗PSCA抗体(WO01/40309)；抗CD40抗体，包括S2C6及其人源化变体(WO00/75348)；抗CD11a(美国专利号5,622,700，WO98/23761，Steppe等人，Transplant Intl.4：3-7(1991)，和Hourmant等人，Transplantation 58：377-380(1994))；抗IgE(Presta等人，J.Immunol.151：2623-2632(1993)，和国际公开号WO 95/19181)；抗CD18(1997年4月22日公布的美国专利号5,622,700，或如1997年7月31日公开的WO 97/26912中的)；抗IgE(包括E25，E26和E27；1998年2月3日公布的美国专利号5,714,338或1992年2月25日公布的美国专利号5,091,313，1993年3月4日公开的WO 93/04173，或1998年6月30日申请的国际申请号PCT/US98/13410，美国专利号5,714,338)；抗Apo-2受体抗体(1998年11月19日公开的WO 98/51793)；抗TNF-α抗体，包括cA2(REMICADE 
Figure BDA0000135268550000434
)，CDP571和MAK-195(见，1997年9月30日公布的美国专利号5,672,347，Lorenz等人，J.Immunol.156(4)：1646-1653(1996)和Dhainaut等人，Crit.Care Med.23(9)：1461-1469(1995))；抗组织因子(TF)(1994年11月9日授予的欧洲专利号0420937B1)；抗人α4β7整联蛋白(1998年2月19日公开的WO 98/06248)；抗EGFR(如在1996年12月19日公开的WO 96/40210中的嵌合或人源化225抗体)；抗CD3抗体，如OKT3(1985年5月7日公布的美国专利号4,515,893)；抗CD25或抗tac抗体，如CHI-621(SIMULECT 
Figure BDA0000135268550000435
)和(ZENAPAX 
Figure BDA0000135268550000436
)(见1997年12月2日公布的美国专利号5,693,762)；抗CD4抗体，如cM-7412抗体(Choy等人，Arthritis Rheum 39(1)：52-56(1996))；抗CD52抗体，如CAMPATH-1H(Riechmann等人，Nature 332：323-337(1988))；抗Fc 受体抗体，如在Graziano等人，J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)中的针对FcγRI的M22抗体；抗癌胚抗原(CEA)抗体，如hMN-14(Sharkey等人，Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995)；针对乳腺上皮细胞的抗体，包括huBrE-3，hu-Mc 3和CHL6(Ceriani等人，Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；和Richman等人，Cancer Res.55(23Supp)：5916s-5920s(1995))；结合结肠癌细胞的抗体，如C242(Litton等人，EurJ.Immunol.26(1)：1-9(1996))；抗CD38抗体，例如AT 13/5(Ellis等人，J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；抗CD33抗体如Hu M195(Jurcic等人，Cancer Res 55(23Suppl)：5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771；抗CD22抗体如LL2或LymphoCide(Juweid等人，Cancer Res 55(23Suppl)：5899s-5907s(1995))；抗EpCAM抗体如17-1A(PANOREX 
Figure BDA0000135268550000441
)；抗GpIIb/IIIa抗体如阿昔单抗或c7E3Fab(REOPRO 
Figure BDA0000135268550000442
)；抗RSV抗体如MEDI-493(SYNAGIS 
Figure BDA0000135268550000443
)；抗CMV抗体如PROTOVIR 
Figure BDA0000135268550000444
抗HIV抗体如PRO542；抗肝炎抗体如抗Hep B抗体OSTAVIR 
Figure BDA0000135268550000445
抗CA 125抗体OvaRex；抗个体基因型GD3表位抗体BEC2；抗αv β3抗体VITAXIN 
Figure BDA0000135268550000446
抗人肾细胞癌抗体如ch-G250；ING-1；抗人17-1A抗体(3622W94)；抗人结直肠肿瘤抗体(A33)；针对GD3神经节苷脂的抗人黑色素瘤抗体R24；抗人鳞状细胞癌(SF-25)；和抗人白细胞抗原(HLA)抗体如Smart ID10和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。本文中的抗体的优选靶抗原是：HER2受体，VEGF，IgE，CD20，CD11a，和CD40。 
这些抗体中的许多广泛用于治疗多种疾病(包括癌症)的临床实践中。 
在某些特定的实施方案中，本发明的方法用于生产以下抗体和重组蛋白质。 
抗CD20抗体
利妥昔单抗(RITUXAN
Figure BDA0000135268550000447
)是遗传改造的针对CD20抗原的嵌合鼠/人单克隆抗体。利妥昔单抗是在1998年4月7日公布的美国专利号5,736,137中被称为″C2B8″的抗体(Anderson等人)。利妥昔单抗被指示用于患有复发的或轻度顽固性的或滤泡的CD20阳性B细胞非霍奇金氏淋巴瘤的患者的治 疗。体外作用机制研究已证明，利妥昔单抗结合人补体并通过补体依赖的细胞毒性(CDC)裂解淋巴B细胞系(Reff等人，Blood 83(2)：435-445(1994))。另外，其在抗体依赖的细胞毒性(ADCC)测定中具有显著活性。最近，利妥昔单抗显示了在氚标记的胸苷掺入测定中具有抗增殖作用，和直接诱导凋亡，而其他抗CD19和CD20抗体没有这些作用(Maloney等人， Blood 88(10)：637a(1996))。已经在实验观察到利妥昔单抗和化学疗法和毒素之间的协同作用。特别地，利妥昔单抗使药物抗性人B细胞淋巴细胞系对阿霉素，CDDP，VP-16，白喉毒素和蓖麻毒素的细胞毒性作用敏感(Demidem等人，Cancer Chemotherapy&Radiopharmaceuticals 12(3)：177-186(1997))。体内的临床前研究已显示，利妥昔单抗可从食蟹猴的外周血、淋巴结和骨髓中消耗B细胞，推测是通过补体和细胞介导的过程(Reff等人，Blood 83(2)：435-445(1994))。 
涉及CD20抗体的专利和专利公开包括美国专利号5,776,456，5,736,137，6,399,061，和5,843,439，以及美国专利申请号US 2002/0197255A1，US 2003/0021781A1，US 2003/0082172A1，US 2003/0095963A1，US 2003/0147885A1(Anderson等人)；美国专利号6,455,043B1和WO00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO00/27428(Grillo-Lopez和White)；WO00/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO00/44788(Braslawsky 等人)；WO01/10462(Rastetter，W.)；WO01/10461(Rastetter和White)；WO01/10460(White和Grillo-Lopez)；美国专利申请号US2002/0006404和WO02/04021(Hanna和Hariharan)；美国专利申请号US2002/0012665A1和WO01/74388(Hanna，N.)；美国专利申请号US 2002/0058029A1(Hanna，N.)；美国专利申请号US 2003/0103971A1(Hariharan和Hanna)；美国专利申请号US2002/0009444A1，和WO01/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO01/97858(White，C.)；美国专利申请号US2002/0128488A1和WO02/34790(Reff，M.)；W)02/060955(Bras lawsky等人)；WO2/096948(Braslawsky等人)；WO02/079255(Reff和Davies)；美国专利号6,171,586B1，和 WO98/56418(Lam等人)；WO98/58964(Raju，S.)；WO99/22764(Raju，S.)；WO99/51642，美国专利号6,194,551B1，美国专利号6,242,195B1，美国专利号6,528,624B1和美国专利号6,538,124(Idusogie等人)；WO00/42072(Presta，L.)；WO00/67796(Curd等人)；WO01/03734(Grillo-Lopez等人)；美国专利申请号US 2002/0004587A1和WO01/77342(Miller和Presta)；美国专利申请号US2002/0197256(Grewal，I.)；美国专利申请号US 2003/0157108A1(Presta，L.)；美国专利号6,090,365B1，6,287,537B1，6,015,542，5,843,398，和5,595,721，(Kaminski等人)；美国专利号5,500,362，5,677,180，5,721,108，和6,120,767(Robinson等人)；美国专利号6,410,391B1(Raubitschek等人)；美国专利号6,224,866B1和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO01/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO00/67795(Goldenberg)；美国专利申请号US 2003/01339301A1和WO00/74718(Goldenberg和Hansen)；WO00/76542(Golay等人)；WO01/72333(Wolin和Rosenblatt)；美国专利号6,368,596B1(Ghetie等人)；美国专利申请号US2002/0041847A1，(Goldenberg，D.)；美国专利申请号US2003/0026801A1(Weiner和Hartmann)；WO02/102312(Engleman，E.)；美国专利申请号2003/0068664(Albitar等人)；WO03/002607(Leung，S.)；WO 03/049694和US 2003/0185796A1(Wolin等人)；WO03/061694(Sing和Siegall)；US 2003/0219818A1(Bohen等人)；US 2003/0219433A1和WO 03/068821(Hansen等人)，其中每一个在此明确引入作为参考。又见，美国专利号5,849,898和EP申请号330,191(Seed等人)；美国专利号4,861,579和EP332,865A2(Meyer和Weiss)；美国专利号4,861,579(Meyer等人)和WO95/03770(Bhat等人)。 
涉及使用利妥昔单抗的治疗的出版物包括：Perotta和Abuel″Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab″摘要#3360 Blood 10(1)(part 1-2)：第88B页(1998)；Stashi等人，″Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for  adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura″Blood 98(4)：952-957(2001)；Matthews，R.″Medical Heretics″New Scientist(7 Apr.，2001)；Leandro等人，″Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with Blymphocyte depletion″Ann Rheum Dis 61：833-888(2002)；Leandro等人，″Lymphocyte depletion in rheuma toid arthritis：early evidence for safety，efficacy and dose response.Arthritis&Rheumatism 44(9)：S370(2001)；Leandro等人，″An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus″，Arthritis&Rheumatism 46(1)：2673-2677(2002)；Edwards和Cambridge″Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes″Rheumatology 40：205-211(2001)；Edwards等人，″B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders″Biochem.Soc.Trans.30(4)：824-828(2002)；Edwards等人，″Efficacy and safety of Rituximab，a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody：A randomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis.Arthritis&Rheumatism 46(9)：S197(2002)；Levine和Pestronk″IgM antibody-related polyneuropathies：B-cell depletion chemotherapy using Rituximab″Neurology 52：1701-1704(1999)；DeVita等人，″Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis″Arthritis&Rheumatism 46：2029-2033(2002)；Hidashida等人，″Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab.″在美国风湿病学院的年度科学会议上介绍；10月24-29日；New Orleans，La.2002；Tuscano，J.″Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab″在美国风湿病学院的年度科学会议上介绍；10月24-29日；New Orleans，La.2002。Sarwal等人，N.Eng.J.Med.349(2)：125-138(July 10，2003)报导了通过DNA微阵列谱分析鉴定在急性肾同种异体移植排斥中的分子异 质性。 
在多个实施方案中，本发明提供了包含人源化抗CD20抗体的药物组合物。在某些实施方案中，本发明的人源化抗体组合物还包含在IgG Fc中的氨基酸改变，并展示相对具有野生型IgG Fc的抗体的至少60倍，至少70倍，至少80倍，更优选地至少100倍，优选地至少125倍，甚至更优选地至少150倍至约170倍的对人FcRn的提高的结合亲和力。 
在IgG中的N-糖基化位点是在CH2结构域中的Asn297处。本发明的人源化抗体组合物包括任意前述的具有Fc区的人源化抗体的组合物，其中在组合物中的抗体的约80-100％(和优选地约90-99％)包含与糖蛋白的Fc区连接的缺乏岩藻糖的成熟的核心碳水化合物结构。在本文中证明，这样的组合物展示了与Fc(RIIIA(F158)结合的惊人改进，Fc(RIIIA(F158)在与人IgG的相互作用中不如Fc(RIIIA(V158)有效。在正常的健康非裔美国人和白种人中，Fc(RIIIA(F158)比Fc(RIIIA(V158)更常见。见Lehrnbecher等人，Blood 94：4220(1999)。历史上，在最常用的工业宿主之一的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中产生的抗体包含约2-6％的非岩藻糖化群体。然而，YB2/0和Lec13可产生具有78-98％非岩藻糖化类别的抗体。Shinkawa等人， J Bio.Chem.278(5)，3466-347(2003)，报导了在YB2/0和Lec13细胞中产生的具有较低FUT8活性的抗体显示了显著提高的体外ADCC活性。在例如Li等人，(GlycoFi)“Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichiapastoris”in Nature Biology电子出版物22 Jan.2006；Niwa R.等人，Cancer Res.64(6)：2127-2133(2004)；US 2003/0157108(Presta)；US 6,602,684和US 2003/0175884(Glycart Biotechnology)；US 2004/0093621，US 2004/0110704，US 2004/0132140(都属于Kyowa Hakko Kogyo)中也描述了具有减少的岩藻糖含量的抗体的产生。 
双特异性人源化抗体包含这样的抗体，其中抗体的一条臂至少具有本发明的人源化抗体的H和/或L链的抗原结合区，另一条臂具有对第二种抗原的V区结合特异性。在特定的实施方案中，所述抗原选自CD-20，CD3， CD64，CD32A，CD16，NKG2D或其他NK活化配体。 
抗HER2抗体
鼠HER2抗体4D5的重组人源化版本(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2，曲妥珠单抗或HERCEPTIN
Figure BDA0000135268550000491
；美国专利号5,821,337)在已接受了大量前期抗癌治疗的患有HER2过表达转移性乳腺癌的患者中临床有效。曲妥珠单抗在1998年9月25日获得食品和药物管理局(FDA)的上市许可，用于治疗患有转移性乳腺癌的其肿瘤过表达HER2蛋白的患者。在2006年11月，FDA批准赫塞汀(Herceptin)作为包含阿霉素、环磷酰胺和紫杉醇(paclitaxel)的治疗方案的一部分，用于患有HER2阳性、淋巴结阳性乳腺癌的患者的辅助治疗。 
在多个实施方案中，本发明提供了包含人源化抗HER2抗体的药物组合物。在Tagliabue等人，Int.J.Cancer 47：933-937(1991)；McKenzie等人，Oncogene 4：543-548(1989)；Maier等人，Cancer Res.51：5361-5369(1991)；Bacus等人，Molecular Carcinogenesis 3：350-362(1990)；Stancovski等人，PNAS(USA)88：8691-8695(1991)；Bacus等人，Cancer Research 52：2580-2589(1992)；Xu等人 ，Int.J.Cancer 53：401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等人，Cancer Research 52：2771-2776(1992)；Hancock等人，Cancer Res.51：4575-4580(1991)；Shawver等人，Cancer Res.54：1367-1373(1994)；Arteaga等人，Cancer Res.54：3758-3765(1994)；Harwerth等人，J.Biol.Chem.267：15160-15167(1992)；美国专利号5,783,186；和Klapper等人， Oncogene 14：2099-2109(1997)中描述了具有不同性能的HER2抗体。 
抗VEGF抗体
包括人源化和/或亲和力成熟的抗VEGF抗体如人源化抗VEGF抗体huA4.6.1AVASTIN (Kim等人，Growth Factors，7：53-64(1992)，国际公开号WO 96/30046，和在1998年10月15日公布的WO 98/45331)的抗VEGF抗体经FDA认可用于治疗癌症。在多个实施方案中，本发明提供了包含人源化抗VEGF抗体的药物组合物。 
抗CD11a抗体
人源化抗CD11a抗体依法利珠单抗或Raptiva 
Figure BDA0000135268550000501
(美国专利号6,037,454)在2003年10月27日获得食品和药物管理局的上市许可，用于治疗银屑病。一个实施方案提供了包含抗人CD11a抗体的药物组合物。 
Apomab抗体
也可依照本发明生产针对DR5受体的抗体(抗DR5)抗体。这样的抗DR5抗体特别包括在PCT公开号WO 2006/083971中公开的所有抗体变体，如名为Apomab 1.1，2.1，3.1，4.1，5.1，5.2，5.3，6.1，6.2，6.3，7.1，7.2，7.3，8.1，8.3，9.1，1.2，2.2，3.2，4.2，5.2，6.2，7.2，8.2，9.2，1.3，2.2，3.3，4.3，5.3，6.3，7.3，8.3，9.3，和25.3的抗DR5抗体，尤其是Apomab 8.3和Apomab 7.3，优选Apomab 7.3。WO 2006/083971的全部内容在此明确引入作为参考。Apomab是完全的人单克隆抗体，其是特别设计用于诱导凋亡的靶向DR5的促凋亡受体激动剂(PARA)。凋亡是一种自然过程，通过凋亡受损的或不需要的细胞(包括癌细胞)死亡并从身体中清除。促凋亡受体DR5在范围广泛的恶性肿瘤中表达。 
抗BR3抗体和免疫粘附素
依照本发明也可生产针对BR3(抗BR3)的抗体和BR3-Fc免疫粘附素。这样的抗BR3抗体和免疫粘附素特别包括在美国申请公开号20050070689中公开的所有变体。美国申请公开号20050070689的全部内容在此明确引入作为参考。 
3.用于抗体的重组生产的一般方法
可通过熟知的重组DNA技术生产本文中的抗体和其他重组蛋白。因此，除了上面特别鉴定的抗体外，技术技术人员可例如使用下述技术产生针对目的抗原的抗体。 
抗原选择和制备 
本文中的抗体针对目的抗原。优选地，所述抗原是在生物学上重要的多肽，且对患有疾病或病的哺乳动物施用所述抗体可在该哺乳动物中导致治疗益处。然而，也设想针对非多肽抗原(如肿瘤相关糖脂抗原；见美国 专利5,091,178)的抗体。当抗原是多肽时，其可为跨膜分子(例如受体)或配体如生长因子。示范性抗原包括在下面的章节(3)中描述的那些蛋白质。本发明包含的抗体的示范性分子靶包括CD蛋白，如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD22，CD34，CD40；ErbB受体家族成员，如EGF受体，HER2，HER3或HER4受体；细胞粘附分子，如LFA-1，Mac1，p150，95，VLA-4，ICAM-1，VCAM和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白质C，或任意其他本文中提及的抗原。在本文范围中特别包括上面列出的抗体所结合的抗原。 
可使用可溶性抗原或其片段(任选地与其他分子缀合)作为产生抗体的免疫原。对跨膜分子如受体，可使用其片段(例如受体的胞外结构域)作为免疫原。可选地，可使用表达跨膜分子的细胞作为免疫原。这样的细胞可来源于天然来源(例如癌细胞系)，或可为通过重组技术转化的表达跨膜分子的细胞。 
用于制备抗体的其他抗原及其形式对本领域人员将是显而易见的。 
多克隆抗体 
优选地通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中产生多克隆抗体。使用双功能或衍生剂将抗原与在待免疫的物种中有免疫原性的蛋白质例如钥孔虫戚血蓝素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂缀合可能是有效的，所述双功能或衍生剂为例如马来酰亚胺苯甲酰琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2，或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基。 
通过组合例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)和3倍体积的弗式完全佐剂并在多个位点皮内注射溶液，用抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。一个月后，用1/5至1/10初始量的在弗式完全佐剂中的抗原或缀合物通过在多个位点的皮下注射加强免疫动物。7至14天后，取动物血并测定血清的抗体滴度。加强动物直到达到滴度稳定水 平。优选地，用相同抗原的但与不同蛋白质缀合的和/或通过不同交联剂缀合的缀合物加强动物。也可在重组细胞培养物中以蛋白质融合物的形式制备缀合物。另外，可适当地使用聚集剂如矾增强免疫应答。 
单克隆抗体 
可使用由Kohler等人，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备单克隆抗体，或通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制备单克隆抗体。 
在杂交瘤方法中，如上文所述免疫小鼠或其他合适的宿主动物如仓鼠或猕猴，以引发产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。可选地，可体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。 
在合适的培养基中接种和培养这样制备的杂交瘤细胞，所述培养基优选地包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基一般将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻碍HGPRT缺陷细胞的生长。 
优选地骨髓瘤细胞是有效融合的，支持选定的抗体产生细胞稳定、高水平的产生抗体，并对培养基如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如可从Salk研究所细胞配送中心(Salk Institute Cell Distribution Center)，San Diego，California USA获得的来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤系，和可从美国典型培养物保藏所，Rockville，Maryland USA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也有描述将人骨髓瘤和小鼠-人种间骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系用于人单克隆抗体的产生(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。 
测定杂交瘤细胞生长的培养基中的针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。 
在鉴定出杂交瘤细胞产生了预期特异性、亲和力和/或活性的抗体后，可通过有限稀释程序亚克隆所述克隆并通过标准方法培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。用于此目的的合适的培养基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，可在体内培养杂交瘤细胞，如在动物的腹水肿瘤中。 
从培养基、腹水液或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化程序适当地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体，所述纯化程序为例如蛋白质A-Sepharose，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析。优选地使用本文描述的蛋白质A层析程序。 
使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞充当这些DNA的优选来源。一旦DNA被分离，可将其置于表达载体中，然后将所述表达载体转染进宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞(否则这些细胞不产生免疫球蛋白)，以在重组的宿主细胞中得到单克隆抗体的合成。 
也可通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源的鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison，等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列共价连接至全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列修饰DNA。 
一般用这样的非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或用其取代抗体的抗原结合位点的可变结构域以产生包含具有一种抗原特异性的抗原结合位点和具有另一种抗原特异性的另一个抗原结合位点的嵌合的二价抗体。 
在另一个实施方案中，可使用McCafferty等人，Nature，348：552-554 (1990)中描述的技术从抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体。Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库的鼠和人抗体的分离。随后的出版物描述了通过链重排产生高亲和力(nM范围)的人抗体(Marks等人，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及使用组合感染和体内重组的策略构建非常大的噬菌体文库(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于单克隆抗体分离的传统杂交瘤技术的可行的替代方案。 
人源化和人抗体 
人源化抗体具有一个或多个引入其的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常被称为“输入”残基，其一般取自“输入”的可变结构域。可基本上根据Winter及同事的方法(Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988))，通过用啮齿类CDR或CDR序列取代人抗体的对应序列进行人源化。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上不超过完整人可变结构域的序列已被非人物种的对应序列取代。在实践中，人源化抗体一般是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿类抗体中的类似位点的残基取代。 
将用于产生人源化抗体的人可变结构域(轻和重链二者)的选择对减少抗原性是非常重要的。根据所谓的“最适”方法，用啮齿类抗体的可变结构域的序列筛选已知的人可变结构域序列的整个文库。然后采用与所述啮齿类最近的人序列作为人源化抗体的人FR(Sims等人，J.Immunol.，151：2296(1993))。另一种方法使用来源于轻链或重链的特定亚群的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等人，J.Immnol.，151：2623(1993))。 
另外重要的是，被人源化的抗体保留对抗原的高亲和力和其他有利的 生物学性能。为了实现此目的，根据优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种设想的人源化产物的方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是现有的，且是本领域技术人员所熟悉的。说明和展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是现有的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列选择FR残基并组合，从而获得预期的抗体特征，如提高的对靶抗原的亲和力。一般，CDR残基直接和最主要地参与影响抗原结合。 
可选地，现在有可能产生在免疫后能够产生全部人抗体库的，且缺乏内源免疫球蛋白产生的转基因动物(例如小鼠)。例如，已有描述，在嵌合和种系突变小鼠中纯合缺失抗体重链连接区(JH)基因导致内源抗体产生的完全抑制。在这样的种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击后产生人抗体。见，例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，7：33(1993)；和Duchosal等人，Nature 355：258(1992)。人抗体也可来源于噬菌体展示文库(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Vaughan等人，Nature Biotech 14：309(1996))。 
抗体片段 
已开发了多种技术用于产生抗体片段。常规地，通过完整抗体的蛋白水解消化得到这些片段(见，例如Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等人，Science，229：81(1985))。然而，现在可通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可从上述抗体噬菌体文库中分离抗体片段。可选地，可从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段并化学连接形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一种方法，可从重组宿主细 胞培养物中直接分离F(ab′)2片段。用于产生抗体片段的其他技术对技术技术人员将是显而易见的。在另一个实施方案中，抗体的选择是单链Fv片段(scFv)(见WO 93/16185)。 
多特异性抗体 
多特异性抗体具有对至少2种不同抗原的结合特异性。尽管这样的分子通常仅结合2种抗原(即双特异性抗体，BsAb)，当在本文中使用时此措辞也包括具有另外特异性的抗体如三特异性抗体。 
产生双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的常规生产是基于2对免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中2条链具有不同的特异性(Millstein等人，Nature，305：537-539(1983))。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(quadromas)产生10种不同抗体分子的可能混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤纯化正确分子是非常困难的，且产量低。在WO 93/08829，和Traunecker等人，EMBO J.，10：3655-3659(1991)中公开了类似的程序。 
根据在WO96/27011中描述的另一个方法，可改造一对抗体分子间的界面以最大化从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的比例。优选的界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在此方法中，用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一抗体分子界面上的一个或多个小氨基酸侧链。通过用较小的侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链在第二抗体分子界面上创造与大侧链大小相同或相似的补偿性“腔”。这提供了提高异源二聚体(相比其他不需要的终产物如同源二聚体)的产量的机制。 
双特异性抗体包括交联的或“异源缀合物(heteroconjugate)”抗体。例如，异源缀合物中的抗体之一可连接抗生物素蛋白，而另一个连接生物素。例如，这样的抗体已被提议用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，和治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373，和EP 03089)。可使用任意便利的交联方法制造异源缀合物抗体。合适的交联剂是本领域熟知的，并在美国专利号4,676,980中与一些交联技术一起公 开。 
在文献中也公开了从抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等人，Science，229：81(1985)描述了一种程序，其中蛋白水解切割完整抗体以产生F(ab′)2片段。在二巯基化物络合剂亚砷酸钠的存在下，这些片段被还原以稳定邻位的二巯基化物和避免分子间二硫化物的形成。然后将生成的Fab′片段转化为三硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。然后用半胱胺将将一种Fab′-TNB衍生物恢复成Fab′-巯基，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。 
最新的研究进展促进了从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段，其可被化学连接以形成双特异性抗体。Shalaby等人，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的产生。从大肠杆菌中单独分泌每一种Fab′片段，并通过体外直接化学连接形成双特异性抗体。这样形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶的裂解活性。 
从重组细胞培养物直接制造和分离双特异性抗体片段的多种技术是已有描述的。例如，已使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。通过基因融合将Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与2种不同抗体的Fab′部分连接。在铰链区还原抗体同源二聚体以形成单体，并然后再次氧化以形成抗体异源二聚体。此方法也可用于产生抗体同源二聚体。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制造双特异性抗体片段的替代机制。所述片段包含通过太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成2个抗原结合位点。通过使用单链Fv(sFv)二聚体制造双特异性抗体片段的另一种策略也有报导。见Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994)。可选地，抗体可为如在Zapata等人，Protein Eng. 8(10)：1057-1062(1995)中描述的“线性抗体”。简而言之，这些抗体包含一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可为双特异性的或单特异性的。 
设想具有二价以上的抗体。例如，可制备三价抗体。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。 
免疫粘附素 
最简单和最直接的免疫粘附素设计组合了粘附素的结合结构域(例如受体的胞外结构域(ECD))和免疫球蛋白重链的铰链和Fc区。通常，当制备本发明的免疫粘附素时，将编码粘附素的结合结构域的核酸融合至编码免疫球蛋白恒定结构域N端序列的核酸的C端，然而N端融合也是可能的。 
一般，在这样的融合物中，编码的嵌合多肽将至少保留功能活性的免疫球蛋白重链恒定区的铰链、CH2和CH3结构域。也在恒定结构域的Fc部分的C端，或紧接着在重链CH1或轻链的相应区的N端进行融合。进行融合的确切位点不是关键的；特定的位点是熟知的并可选择，以优化免疫粘附素的生物学活性、分泌或结合特征。 
在优选的实施方案中，将粘附素序列融合至免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc结构域的N端。可以将整个重链恒定区与粘附素序列融合。然而，更优选地，在融合中使用的下述序列，其开始于恰好处于化学定义IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位点(即残基216，将重链恒定区的首个残基定为114)，或其他免疫球蛋白的类似位点上游的铰链区。在特别优选的实施方案中，将粘附素氨基酸序列融合至I gG重链的(a)铰链区和CH2和CH3或(b)CH1，铰链，CH2和CH3结构域。 
用于双特异性免疫粘附素，将免疫粘附素组装为多聚体，和特别是异源二聚体或异源四聚体。一般，这些组装的免疫球蛋白将具有已知的单位结构。基本的4链结构单位是IgG，IgD，和IgE存在的形式。4链单位在较高分子量的免疫球蛋白中重复；IgM一般以通过二硫键维持在一起的4个基本单位的五聚体形式存在。IgA球蛋白，和偶尔地IgG球蛋白也可以多 聚体形式存在于血清中。在多聚体的情况下，4个单位分别为相同或不同的。 
本文范围内的多种示范性组装的免疫粘附素图示如下： 
ACL-ACL； 
ACH-(ACH，ACL-ACH，ACL-VHCH，或VLCL-ACH)； 
ACL-ACH-(ACL-ACH，ACL-VHCH，VLCL-ACH，或VLCL-VHCH) 
ACL-VHCH-(ACH，或ACL-VHCH，或VLCL-ACH)； 
VLCL-ACH-(ACL-VHCH，或VLCL-ACH)；和 
(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2， 
其中，每个A代表相同或不同的粘附素氨基酸序列； 
VL是免疫球蛋白轻链可变结构域； 
VH是免疫球蛋白重链可变结构域； 
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域； 
CH是免疫球蛋白重链恒定结构域； 
n是大于1的整数； 
Y表示共价交联剂的残基。 
为了简明，前述结构仅显示了关键特征；其没有指示免疫球蛋白的连接(J)或其他结构域，也没有显示二硫键。然而，当结合活性需要这些结构域时，应当将其视为在其通常占据免疫球蛋白分子的位置上存在。 
可选地，可在免疫球蛋白重链和轻链序列之间插入粘附素序列，使得到包含嵌合重链的免疫球蛋白。在此实施方案中，将粘附素序列融合至免疫球蛋白每条臂的免疫球蛋白重链的3’端，或铰链和CH2结构域之间，或CH2和CH3结构域之间。Hoogenboom，等人，Mol.Immunol.28：1027-1037(1991)报导了类似的构建体。 
尽管在本发明的免疫粘附素中不需要存在免疫球蛋白轻链，可能存在 与粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽共价结合的，或直接与粘附素融合的免疫球蛋白轻链。在前一种情况下，一般共表达编码免疫球蛋白轻链的DNA和编码粘附素-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA。在分泌后，混合的重链和轻链将共价结合以提供包含2对二硫化物连接的免疫球蛋白重链-轻链对的免疫球蛋白样结构。适于制备这样的结构的方法是，例如，在1989年3月28日发布的美国专利号4,816,567中公开的方法。 
通过依读框的融合编码粘附素部分的cDNA序列和免疫球蛋白cDNA序列构建免疫粘附素最方便。然而，也可使用与基因组免疫球蛋白片段的融合(见，例如Aruffo等人，Cell 61：1303-1313(1990)；和Stamenkovic等人，Cell 66：1133-1144(1991))。后一种融合类型需要Ig调控序列的存在用于表达。通过杂交或通过聚合酶链式反应(PCR)技术，可基于公开的序列从来源于脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库中分离编码IgG重链恒定区的cDNA。将编码“粘附素”和免疫粘附素的免疫球蛋白部分的cDNA串联插入质粒载体，所述载体在选定的宿主细胞中引导有效的表达。 
本发明的进一步的细节在以下非限制性实施例中提供。 
在此申请通篇中引用所有专利、专利申请、出版物、产品描述和实验方案，其公开以其整体引入本文作为参考。 
实施例
仅为了说明的目的提供以下实施例，且所述实施例无意以任何方式限制本发明的范围。除非另外指出，根据制造商的说明书使用在实施例中提及的市售试剂。在以下实施例和说明书通篇中以ATCC 
Figure BDA0000135268550000601
登记号标识的这些细胞的来源是美国典型培养物保藏所，Manassas，Virginia。 
实施例1 
在无谷氨酰胺的生产培养基中生产多肽 
材料和方法 
细胞系。在这些研究中，分别使用表达Apomab抗体、抗VEGF抗体和 融合蛋白BR3-Fc的CHO宿主细胞。使宿主细胞适应悬浮和无血清培养。在下述培养基中制备冷冻的储液作为主细胞库或工作细胞库。 
使用维持在37℃和5％CO2下的Thermo Scientific Forma
Figure BDA0000135268550000611
大型CO2湿润培养箱中维持的250-mL或1升Corning
Figure BDA0000135268550000612
通气摇瓶进行细胞系维持。在具有定制的铝基质平台的New Brunswick Scientific Innova-2100平台摇床上以150rpm的速度摇动烧瓶。每3或4天用新鲜培养基传代细胞培养物，并以0.11％或0.20％的细胞压积(PCV)接种。使用10-mL玻璃KIMAX
Figure BDA0000135268550000614
USA PCV管得到PCV。 
培养基和条件。使用具有500-mL工作体积的1升来源Corning
Figure BDA0000135268550000615
通气摇瓶中的细胞培养物，使用单独、一式两份或一式三份的均以0.20％PCV接种的具有100mL工作体积的250-mL Corning通气摇瓶开始培养基研究。使用10-mL玻璃KIMAX
Figure BDA0000135268550000616
USA PCV管得到PCV。 
在开始研究前，在SorvallRT 6000B离心机中以1000rpm离心细胞培养物5分钟，以完成用各个试验培养基对含有谷氨酰胺的接种培养基的100％的培养基交换。在不同的试验培养基中评估谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的不同浓度。检测了以下浓度：谷氨酰胺0-10mM，谷氨酸1-10mM，天冬酰胺0-15mM，天冬氨酸1-10mM。在全因子DOE研究中评估培养基条件。 
也在市售的DMEM/F12培养基中检测了无谷氨酰胺的培养基的作用。以5倍浓度(7.05g/L)使用培养基，并额外添加天冬酰胺(共10mM)，天冬氨酸(共10mM)，谷氨酰胺(共10mM用于含谷氨酰胺的培养基)，谷氨酸(共1mM)和葡萄糖(共8g/L)。使用表达Apomab和抗VEGF抗体的细胞比较无谷氨酰胺和含谷氨酰胺的培养基。 
在维持在37℃和5％CO2下的Thermo Scientific Forma
Figure BDA0000135268550000618
reach-in CO2湿润培养箱中维持烧瓶。在具有定制的铝基质平台的New Brunswick Scientific Innova
Figure BDA0000135268550000619
-2100平台摇床上以150rpm的速度摇动烧瓶。 
使用的培养基包含以下成分： 
Figure BDA00001352685500006110
Figure BDA0000135268550000631
Figure BDA0000135268550000641
也检测了市售的DMEM/F-12培养基，其具有以下成分： 
Figure DEST_PATH_GDA0000145947890000011
Figure DEST_PATH_GDA0000145947890000031
用于接种培养(相对生产期)的培养基通常补充5mM谷氨酰胺，8g/L葡萄糖和75-2000nM甲氨蝶呤。 
用于研究，使用1M碳酸钠按需进行pH调节以维持7.00±0.10的pH值。通过加入1mL/L的1M碳酸钠进行pH值的调节，以升高0.10的pH。 
通过取出3.5-mL样品并使用Beckman Coulter ViCellTM-1.0细胞计数器分析活细胞数、活力和细胞大小分析细胞培养物达14天。使用Nova400 Biomedical Bioprofile
Figure BDA0000135268550000662
进行营养分析。使用Advanced
Figure BDA0000135268550000663
仪器多样品渗压计(型号3900)测量渗透压摩尔浓度。使用Agilent 1100系列HPLC得到重组产物的滴度浓度。 
重组蛋白质。产生的重组蛋白质是Apomab(TRAIL)，抗VEGF和免疫粘附素BR3-Fc。 
数据分析。使用全因子实验设计进行数据的统计学分析，所述实验设计由2种或多种因子组成，每种因子具有离散的可能值或“水平”，且所述实验单元采用在所有这些因子上的这些水平的所有可能组合。全因子设计又可被称作完全交叉设计。这样的实验允许研究每种因子对响应变量的影响，以及因子间的相互作用对响应变量的影响。 
结果 
如图1-5中所示，使用无谷氨酰胺的生产培养基提高了Apomab抗体、BR3-Fc免疫粘附素和抗VEGF抗体的最终重组蛋白质滴度。在每种情况下，使用全因子DOE评估不同浓度的谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸 的影响的滴度结果的立方图分析预测，在补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺培养基中获得最高的滴度(图1-3)。 
在图4中显示了在无谷氨酰胺、低谷氨酸和高天冬氨酸条件下天冬酰胺对Apomab抗体滴度的影响。在无谷氨酰胺的培养基中，相比无天冬酰胺的无谷氨酰胺培养物，在2.5-15mM天冬酰胺存在时，Apomab抗体滴度显著提高。在这些条件下，谷氨酸的存在或缺乏对滴度没有影响。 
在图5中说明了在无谷氨酰胺和低谷氨酸条件下，在不同天冬酰胺和天冬氨酸浓度下产生的Apomab抗体滴度。当在这些条件下将天冬氨酸从0提高至10mM时，观察到正向的滴定效果。 
在图6A-C中证明了补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺培养基对滴度的影响，其中相比含有谷氨酰胺的培养基，在无谷氨酰胺的培养基中Apomab抗体、抗VEGF抗体和BR3-Fc免疫粘附素(分别是A-C)的最终滴度显著更高。 
使用商业DMEM/F-12培养基得到类似的结果。如在图7A和B中所示，相比补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的含有谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，在补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中Apomab抗体和抗VEGF抗体(分别是A和B)的最终滴度显著更高。 
如在图8和9中所示，使用无谷氨酰胺的生产培养基也提高了以Qp(mg/mL-细胞/天)测量的单位产量。图8A-C说明，相比含有谷氨酰胺的培养基，在补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺的培养基中Apomab抗体、抗VEGF抗体和BR3-Fc免疫粘附素(分别是A-C)的细胞单位生产率(Qp)显著更高。图9A和B说明，相比含有谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，在补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中Apomab抗体和抗VEGF抗体(分别是A和B)的细胞单位生产率显著更高。 
如图10和11中所示，使用无谷氨酰胺的生产培养基显示显著提高了细胞活力和延长了培养物寿命。图10A-C说明，相比含有谷氨酰胺的培养 基，在补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺的培养基中Apomab抗体、抗VEGF抗体和BR3-Fc免疫粘附素(分别是A-C)的细胞活力更高。图11A和B表明，在DMEM/F12培养基中，细胞活力在补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺的培养基中没有被一致地改善。值得注意地，相比含有谷氨酰胺的培养基，Apomab抗体的细胞活力较高(图11A)，但抗VEGF抗体的细胞活力较低(图11B)。 
如图12和13中所示，相比含有谷氨酰胺的培养基，使用无谷氨酰胺的生产培养基显著减少了NH4 +积累。图12A-C说明，相比含有谷氨酰胺的培养物，在补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺的培养物中氨水平通常较低。图13A和B说明相比含有谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，在补充10mM天冬酰胺、10mM天冬氨酸和1mM谷氨酸的无谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中氨水平显著减少。 
本文说明描述的发明可在缺乏本文具体公开的任意元素或限制时适当地实践。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广义而非限制地解读。另外，本文使用的术语和措辞已被用作描述性而不是限制性的术语，且无意使用这些术语和措辞排除所示的本发明的任意等同物或其部分，然而应当认可在要求保护的本发明的范围内多种修饰是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征被具体公开，本领域技术人员可容易地进行公开的本文实施的发明的修改和改变，且认为这些修改和改变是本文公开的发明的范围内的。 
从本文的发明描述中显示，可使用多种等同物实施本发明的思想而不背离其范围。此外，尽管具体参考了特定实施方案描述本发明，本领域普通技术人员将认可，可在形式和细节中进行改变而不背离本发明的精神和范围。认为描述的实施方案在所有方面是说明性而不是限制性的。也应当理解，本发明不受限于本文描述的特定实施方案，而是能够在不背离本发明的范围下包括多种等同物、重新排列、修改和取代。因此，另外的实施方案是本发明的范围内和随附的权利要求内的。 
本文提及的所有美国专利和申请；国外专利和申请；科学文章；书和 出版物在此一起整体引入作为参考，就如同每一单个专利或出版物被明确和单独地说明被引用作为参考一样，包括任意附图、图和表，如同全部陈述的一样。 

Claims (40)

1.在表达多肽的哺乳动物宿主细胞中生产所述多肽的方法，其包括在含有天冬酰胺的无谷氨酰胺生产培养基中培养处于培养物的生产期的所述哺乳动物宿主细胞。
2.权利要求1的方法，其中以2.5mM至15mM的浓度加入所述天冬酰胺。
3.权利要求1的方法，其中以7.5mM至10mM的浓度加入所述天冬酰胺。
4.权利要求1的方法，其中以10mM的浓度加入所述天冬酰胺。
5.权利要求1的方法，其中以10mM的浓度加入所述天冬酰胺。
6.权利要求1的方法，其中所述重组宿主细胞是真核宿主细胞。
7.权利要求6的方法，其中所述真核宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
8.权利要求7的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
9.权利要求86的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是dhfr-CHO细胞。
10.权利要求1的方法，其中所述生产培养基是无血清的。
11.权利要求1的方法，其中所述生产培养基包含选自下述的一种或多种成分
1)能量来源；
2)必需氨基酸；
3)维生素；
4)游离脂肪酸；和
5)微量元素。
12.权利要求11的方法，其中所述生产培养基另外包含选自下述的一种或多种成分：
1)激素和其他生长因子；
2)盐和缓冲液；和 
3)核苷。
13.权利要求1的方法，其中所述生产期是分批或补料分批培养期。
14.权利要求1的方法，其还包括分离所述多肽的步骤。
15.权利要求14的方法，其还包括在分离后测定细胞活力、培养物寿命、单位生产率和最终重组蛋白质滴度中的一种或多种。
16.权利要求15的方法，其中相对在相同组成的含谷氨酰胺的生产培养基中生产的同一多肽，细胞活力、培养物寿命、单位生产率和最终重组蛋白质滴度中的至少一种提高。
17.权利要求1的方法，其中所述多肽是哺乳动物糖蛋白。
18.权利要求1的方法，其中所述多肽选自抗体、抗体片段和免疫粘附素。
19.权利要求18的方法，其中所述抗体片段选自Fab，Fab′，F(ab′)2，scFv，(scFv)2，dAb，互补决定区(CDR)片段，线性抗体，单链抗体分子，微型抗体(minibody)，双抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
20.权利要求18的方法，其中所述抗体或抗体片段是嵌合的、人源化的或人的。
21.权利要求18的方法，其中所述抗体或抗体片段是治疗抗体或其生物学功能片段。
22.权利要求21的方法，其中所述治疗抗体选自抗HER2抗体，抗CD20抗体；抗IL-8抗体；抗VEGF抗体；抗CD40抗体，抗CD11a抗体；抗CD18抗体；抗IgE抗体；抗Apo-2受体抗体；抗组织因子(TF)抗体；抗人α4β7整联蛋白抗体；抗EGFR抗体；抗CD3抗体；抗CD25抗体；抗CD4抗体；抗CD52抗体；抗Fc受体抗体；抗癌胚抗原(CEA)抗体；针对乳腺上皮细胞的抗体；结合结肠癌细胞的抗体；抗CD38抗体；抗CD33抗体；抗CD22抗体；抗EpCAM抗体；抗GpIIb/IIIa抗体；抗RSV抗体；抗CMV抗体；抗HIV抗体；抗肝炎抗体；抗CA 125抗体；抗αvβ3抗体；抗人肾细胞癌抗体；抗人17-1A抗体；抗人结直肠肿瘤抗体；针对GD3神经节苷脂的抗人黑色素瘤抗体R24；抗人鳞状细胞癌；和抗人白细胞抗原(HLA)抗体，和抗 HLA DR抗体。
23.权利要求21的方法，其中所述治疗抗体是结合HER受体，VEGF，IgE，CD20，CD11a，CD40，BR3或DR5的抗体。
24.权利要求23的方法，其中所述HER受体是HER1和/或HER2。
25.权利要求24的方法，其中所述HER受体是HER2。
26.权利要求25的方法，其中所述治疗抗体包含选自SEQ ID NO：16，17，18，和19的重链和/或轻链可变结构域序列。
27.权利要求23的方法，其中所述治疗抗体是结合CD20的抗体。
28.权利要求27的方法，其中所述治疗抗体包含选自SEQ ID NO：1-15的重链和/或轻链可变结构域序列。
29.权利要求23的方法，其中所述治疗抗体是结合VEGF的抗体。
30.权利要求29的方法，其中所述治疗抗体包含选自SEQ ID NO：20-25的重链和/或轻链可变结构域序列。
31.权利要求23的方法，其中所述治疗抗体是结合CD11a的抗体。
32.权利要求31的方法，其中所述治疗抗体包含选自SEQ ID NO：26-29的重链和/或轻链可变结构域序列。
33.权利要求23的方法，其中所述治疗抗体是结合DR5受体的抗体。
34.权利要求33的方法，其中所述治疗抗体选自Apomab 1.1，2.1，3.1，4.1，5.1，5.2，5.3，6.1，6.2，6.3，7.1，7.2，7.3，8.1，8.3，9.1，1.2，2.2，3.2，4.2，5.2，6.2，7.2，8.2，9.2，1.3，2.2，3.3，4.3，5.3，6.3，7.3，8.3，9.3，和25.3。
35.权利要求33的方法，其中所述治疗抗体是Apomab 8.3或Apomab 7.3。
36.权利要求35的方法，其中所述治疗抗体是Apomab 7.3。
37.权利要求23的方法，其中所述治疗抗体是抗BR3抗体或BR3-Fc免疫粘附素。
38.权利要求1的方法，其中所述多肽是治疗多肽。
39.权利要求38的方法，其中所述治疗多肽选自生长激素，包括人生 长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC，因子IX，组织因子，和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白质C；心房利钠(atrial natriuretic)因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(受活化调节，由正常T细胞表达和分泌的因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨源神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6)，或神经生长因子如NGF-β；血小板源生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD34，和CD40；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α，-β，和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF，GM-CSF，和G-CSF；白介素(IL)，例如，IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原如，例如，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER2，HER3或HER4受体；和所述多肽的片段。
40.用于在生产期生产多肽的立即可用的无谷氨酰胺细胞培养基。 
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