ES2281342T3 - Proceso de cultivo de celulas para la produccion de glicoproteinas. - Google Patents

Abstract

Un proceso para producir el activador de tejido de plasminógeno humano (t-PA), que consta de un cultivo de células de ovario de hámster chinos que expresan dicho ácido nucleico que codifica para t-PA en medio libre de suero en la fase de producción a una temperatura entre 30 °C y 35 °C, en el que el proceso produce un aumento en la proporción de moléculas de t-PA tipo I para t-PA tipo II en comparación con un proceso idéntico efectuado a 37 °C.

Description

Proceso de cultivo de células para la producción de glicoproteínas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención trata de un proceso para la producción de glicoproteínas en cultivo de células de mamíferos. Específicamente, la invención proporciona un proceso para producir glicoproteínas en células de mamíferos que resulta en la mejora de la ocupación de un sitio de unión de N-glicosilación ocupado solamente en una fracción de una glicoproteína. Específicamente se revela un proceso para incrementar la fracción del activador de tejido de plasminógeno humano tipo I (t-PA) en un cultivo de células de mamífero.

Descripción de las divulgaciones y tecnología relacionadas Glicoproteínas

Glicoproteínas, muchas de las cuales han sido producidas por técnicas de tecnología de ADN recombinante, son de gran importancia como agentes diagnósticos y terapéuticos. En un medio de células eucariotas, la glicosilación está ligada a una proteína que se extiende a lo largo de la membrana secretada por una modificación post-trasduccional. Las proteínas destinadas a la superficie celular son primero translocadas trasduccionalmente en el lumen del retículo endoplasmático (ER) mediado por una secuencia señal cercana al extremo amino terminal de la cadena naciente. Dentro de ER (retículo endoplasmático) la secuencia señal es usualmente eliminada y una unidad central del oligosacárido de alta manosa esta enlazado al residuo de asparagina (N) residuo(s) presentes como parte de la secuencia Asn-X-Se/Thr, donde X es cualquier aminoácido excepto, quizás, prolina.

La eficiencia de este paso de glicosilación trasduccional depende de la presentación de una conformación apropiada de la cadena de péptido en función de la entrada en el retículo endoplasmático (Imperiali y O'Connor. Pure & Applied Chem., 70: 33-40 (1998)). Los sitios de glicosilación N-enlazados potenciales pueden ser accesibles después de que la proteína se ha foldeado (Kornfeld & Kornfeld. Ann Rev. Biochem. 54: 631-664 (1985)). Las proteínas se mueven desde el ER hasta el aparato de Golgi donde modificaciones adicionales, tales como sulfonación y procesamiento de la cadena de oligosacárido de alta manosa por un oligosacárido tipo complejo, ocurre y la proteína se dirige a sus propios destinos.

Los oligosacáridos N-enlazados pueden tener un impacto profundo en las propiedades farmacéuticas y terapéuticas de las glicoproteínas (por ej. tiempo de vida útil in vivo y bioactividad). Los parámetros de diferentes bioprocesos (por ej. tipo bioreactor, pH, composición del medio, y amonío) han sido demostrado que afectan la glicosilación significativamente de la proteína. Los cambios en el extremo de glicosilación (sialisación y galactosilación y ramificaciones de N-glucano son las alteraciones más frecuentes observadas.

Estructura del Carbohidrato del activador del plasminógeno tisular

El activador de tejido de plasminógeno humano (t-PA), una glicoproteína, es una proteasa serina de multidominio cuyo papel fisiológico es convertir plasminógeno en plasmina, e iniciar o acelerar el proceso de fibrinólisis. El interés clínico inicial de t-PA se eleva debido a su relativa alta actividad en presencia de fibrina, comparado con la ausencia de fibrina. La t-PA tipo salvaje es una enzima pobre en ausencia de fibrina, pero con la presencia de fibrina aumenta su capacidad de activar el plasminógeno sorprendentemente. El t-PA humano recombinante es usado terapéuticamente como un agente fibrinolítico en el tratamiento del infarto agudo del miocardio y la embolia pulmonar, ambas condiciones resultan normalmente desde una obstrucción de un vaso sanguíneo por un trombos que contienen generalmente fibrina.

Además de la especificidad impresionante de fibrina, t-PA presenta varias características adicionales que lo distinguen:

(a) t-Pa difiere de otras proteasas de serina en que la forma de cadena simple de la molécula tiene una apreciable actividad enzimática. Para algunos sustratos pequeños, y para plasminógeno en ausencia de fibrina, t-PA de dos cadenas tiene más actividad que t-PA de simple cadena. En presencia de fibrina, sin embargo, las dos formas de t-PA son equitativamente activas (Rijken et al., J Biol. Chem. 257: 2920-2925 (1982): Lijnen et al., Thromb. Haemost., 64: 61-68 (1990): Bennett et al., J Biol. Chem., 266: 5191-5201 (1991)). La mayoría de las otras proteasas de serina existen como zimogenes y requieren de división proteolítica para una forma de dos cadenas para releva la actividad enzimática completa.

(b) La acción de t-PA in vivo e in vitro puede ser inhibida por un serpin. PAI-I (Vaughan et al., J Clin. Invest. 84: 586-591 (1989): Wiman et al., J. Biol. Chem. 259: 3644-3647 (1984)).

(c) t-PA se une a fibrina in vitro con un K_{d} en el rango de \muM.

(d) t-PA tiene una rápida eliminación in vivo que es mediada por uno o más receptores en el hígado (Nilsson et al., Thromb. Res. 39: 511-521 (1985): Bugelski et al., Throm. Res., 53: 287-303 (1989): Morton et al., J Biol. Chem., 264: 7228-7235 (1989)).

Una forma considerablemente pura de t-PA fue producida de una fuente natural y probada por actividad in vivo por Collen et al., Patente de los EE.UU. No. 4.752.603 publicada 21 Junio 1988 (ver también Rijken et al., J Biol. Chem., 256: 7035 (1981)). Pennica et al.. (Nature. 301: 214 (1983)) determina la secuencia de ADN de t-PA y deduce la secuencia de aminoácido de esta secuencia de ADN (Patente de los EE.UU. No. 4.766.075 publicada 23 Agosto 1988).

El t-PA tipo humano natural tiene sitios de glicosilación N-enlazado potenciales de aminoácidos en las posiciones 117, 184, 218 y 448. El t-PA humano recombinante (t-PA ACTIVASE ®) producido por la expresión en células de CHO fue reportado que contiene aproximadamente el 7% por peso de carbohidrato, que consta de un oligosacárido de alta-manosa en la posición 117, y oligosacáridos complejos en Asn -184 y Asn -448 (Vehar et al., "Estudios de caracterización del Activator del Plasminógeno tisular humano producido por la tecnología de ADN Recombinante" Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, L1:551-562 (1986)).

La posición 218 no se ha encontrado que esta glicosilada en t-PA nativa o t-PA tipo natural ó recombinante. Los sitios 117 y 448 parecen siempre que estan glicosilados, mientras en el sitio 184 se piensa que esta glicosilado solamente en una fracción de las moléculas. Las moléculas de t-PA son glicosiladas en la posición 184 son llamados t-PA de tipo I y las moléculas que no son glicosiladas en la posición 184 son llamados t-PA de tipo II. En el t-PA obtenido de melanoma, la proporción de t-PA tipo I y de tipo II es aproximadamente 1:1. El análisis más exhaustivo de la estructura de carbohidratos de t-PA humano obtenido de células de CHO fue llevado a cabo por Spellman et al. J Biol. Chem., 264: 14100-14111 (1989), quien muestra al menos 17 formas diferentes de estructuras de carbohidrato enlazados a Asn que podrían ser detectados sobre la proteína. Esto pone en orden la estructura de alta-manosa en la posición 117 para estructuras de tipo di-, tri-, y tetra antennary N-acetilacrosamina en las posiciones 184 y 448. Las t-PAs del tipo I y tipo II fueron reportados ser N-glicosilada de una manera idéntica en las posiciones Asn-117 y Asn-448, cuando se aisla de la misma línea de células. Para detalles adicionales, vea también Parekh et al., Biochemistry. 28: 7644-7662 (1989). La actividad fibrinolítica específica de t-PA de tipo II ha sido demostrada ser aproximadamente 50 veces mayor que t-PA de tipo I (Einarsson et al., Biochim. Biophys. Act. 830: 1-10 (1985)). Además, el tipo I se correlaciona con el aumento de la vida media (Cole et al., Fibrinolysis. 7: 15-22 (1993)). Sin embargo, t-PA de tipo II, carece de una parte de carbohidrato asociado con t-PA del tipo I tan bien como t-PA desialisado demostrando un T^{1/2} beta más que t-PA estandar (Beebe y Aronson. Thromb. Res. 51: 11-22 (1988)).

El análisis de la secuencia de t-PA ha identificado la molécula como que tiene cinco dominios. Cada dominio ha sido definido con referencia a homológos estructurales o regiones funcionales en otras proteínas tales como tripsina, quimotripsina, plasminógeno, protrombina, fibronectina, y factor de crecimiento de epidérmico (EGF). Estos dominios han sido designados, comenzando en el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácido de t-PA, como el dominio señalado (F) desde el aminoácido 1 sobre el aminoácido 44, el dominio factor de crecimiento (G) sobre el aminoácido 45 sobre el aminoácido 91 (basado en homología con EGF), el dominio kringle-1 (K1) sobre el aminoácido 92 sobre el aminoácido 173, el dominio kringle-2 (K2) sobre el aminoácido 180 sobre el aminoácido 261, y el dominio de proteasa serina (P) sobre el aminoácido 264 hasta el extremo carboxilo al aminoácido 527. Estos dominios están situados esencialmente adyacente entre sí, y son enlazadoss por regiones de "Enlazador". Estas regiones de enlace traen el número total de aminoácidos del polipéptido natural hasta el 527, aunque tres residuos adicionales (Gly-Arg-Ala) son encontrados ocasionalmente en el extremo amino terminal. Este tripéptido adicional generalmente se piensa que es el resultado del procesamiento del precursor incompleto en general, y no es conocido como imparte la funcionalidad. La t-PA nativa puede ser dividida entre la posición 275 y 276 (ubicada en el dominio de proteasa serina para generar las dos formas de cadena de la molécula.

Cada dominio contribuye de una forma diferente a las propiedades biológicamente importante y global de la molécula de t-PA. Los estudios de supresión del dominio muestran la pérdida del dedo, el factor de crecimiento, o dominio kringle-2 resulta en una unión de baja afinidad de la variante t-PA para fibrina (Van Zonneveld et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 4670-4677 (1986): Verheijen et al., EMBO J. 5: 3525-3530 (1986)) los resultados; sin embargo, más mutantes recientes obtenidas por sustitución indican que el dominio kringle-2 está menos involucrado en la unión de fibrina con lo antes esperado (Bennett et al., Supra). Los estudios de supresión del dominio han implicado los dominios del factor de crecimiento y señala en la eliminación por el hígado (Collen et al., Blood, 71: 216-219 (1988): Kalyan et al., J Biol. Chem., 263: 3971-3978 (1988): Fu et al., Thromb. Res., 50: 33-41 (1988): Refino et al., Fibrinolysis. 2: 30 (1988): Larsen et al., Blood, 73: 1842-1850 (1989): Browne et al., J Biol. Chem., 263: 1599-1602 (1988)). El dominio kringle-2 es responsable para la unión a lisina. El dominio de proteasa de serina es responsable por la actividad enzimática de t-PA y contiene regiones específicas donde las mutaciones fueron demostradas que afectan tanta la unión de fibrina, como la especificidad de fibrina (las interacciones posiblemente directas con fibrina), y otras regiones donde solamente la especificidad de fibrina se altera (posiblemente las interacciones indirectas con fibrina) (Bennen et al., Supra). Estudios con mutantes resultan alteraciones dirigidas al sitio que demuestran la participación de la glicosilación de t-PA en la eliminación (Lau et al., BioTechnology, 5: 953-958 (1987): Lau et al., BioTechnology 6: 734 (1988)).

Una variante no glicosilada de t-PA consta de los dominios de kringle-2 y proteasa fueron descritos por tener una eliminación más lenta en el plasma que la t-PA natural (Martin et al., Fibrinolysis, 4: (Suppl. 3): 9 (abstract 26) (1990)). El efecto de la alteración de las estructuras del oligosacárido en los sitios 184 y 448 de t-PA también fueron revisados por Howard et al., Glycobiology. 1: 411-418 (1991). Hotchkiss et al (Thromb. Haemost., 60: 255-261 (1988)) selectivamente elimina los residuos del oligosacárido de la molécula de t-PA, y demuestra que la eliminación de estos residuos reduce la razón de eliminación de t-PA. Estos investigadores, y Lau et al. ((1987), Supra, (1988), Supra) también genera la variante del t-PA N117Q (en el que la asparagina en la posición 117 del t-PA humano tipo salvaje se sustituye por glutamina) para prevenir la glicosilación en la posición 117. Esta variante, de forma semejante es obtenida por la eliminación enzimática del oligosacárido de alta manosa en esta posición, presenta aproximadamente la eliminación dos veces más lenta que el t-PA humano natural. Vea también EP-A 238.304 publicado 23 septiembre 1987 y EP-A 227.462 publicado 1 de julio 1987.

Varios informes han sugerido que la mitad del carbohidrato de t-PA influye en la actividad in vitro de esta enzima (Einarsson et al., Supra: Opdenakker et al., Proc. Sci. Exp. Biol. Med., 182: 248-257 (1986)). El t-PA es endocitosado por receptores de manosa de células de endotelio del hígado y por receptores de galactosa de células de tejido básico. Efectivamente, la eliminación in vivo de t-PA humano recombinante producida en los cultivos de células de mamíferos fue influida por la estructura de carbohidrato, particularmente por los oligosacáridos alta-manosa (Hotchkiss et al., Supra). Una variante de t-PA (designado t-PA de TNK) que tiene un sitio de glicosilación adicional a la posición de aminoácido 103. El sitio de glicosilación natural eliminado en la posición del aminoácido 117, y la secuencia de aminoácido 296-299 de t-PA humano natural es reemplazado por AAAA, ha sido demostrado que tiene un incremento en la vida útil en circulación notablemente mejor a la especificidad de fibrina que t-PA humano natural (Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 3670-3674 (1994)).

Otra Glicoproteínas t-PA natural con más que un Glicoformo

Células que expresan tPA-6, una molécula compuesta de los dominios de kringle-2 y proteasa serina de t-PA, lo procesan en dos glicoforma, una forma monoglicosilada con Asn-448 ocupado, y una forma diglicosilada con Asn-448 y Asn 184 ocupados (Berg et al., Blood. 81: 1312-1322 (1993)).

El plasminógeno existe en dos glicoformas. La forma más glicosilada, comúnmente referido como "Plasminógeno-1", "Plasminógeno I", o "Plasminógeno Tipo 1" tiene un oligosacárido como base galactosamina enlazado al aminoácido en la posición 345 (Thr 345) y un oligosacárido glicosamina complejo ubicado en posición aminoácido 288 (Asn 288) de una molécula de plasminógeno humano natural. La forma menos glicosilada, comúnmente referida como "plasminógeno-2", "plasminógeno II", o "Plasminógeno Tipo 2", tiene una cadena simple de oligosacárido adjunta en la posición del aminoácido 345 (Thr345) (Hayes and Castellino, J Biol. Chem., 254 (18): 8772-8776. 8777-8780 (1979); Lijnen et al., Eur. J. Biochem. 120: 149-154 (1981): Takeda et al., Trombosis Research. 39: 289-296 (1985)).

Otras glicoproteínas que se indican ocupan sitios variables (variaciones en la ocupación de N- y O-glicosilación) incluyendo el factor estimulante de colonia de macrófago y granulocitos (Okamoto et al., Archives of Biochemistry and Biophysics. 286: 562-568 (1991)), interferón ganma (Curling et al., Biochem. J. 272: 333-337 (1990)), proteína C (Miletich y Broze. J Biol. Chem., 265: 11397-11404 (1990)), e interleukin-2. Glicosilación de interferón ganma es estable durante una estrategia de diseño de cultivo optimizada usando cultivo de lote alimentado, con la exposición a inacisión de la glucosa posiblemente dirigida en un cambio dramático de la eficiencia de glicosilación (Xie et al., Biotechnol. Bioeng., 56: 577-582 (1997)).

Los factores diferentes que han sido discutidos ser potencialmente responsable de la ocupación del sitio variable, incluyen la disponibilidad de dolicol fosfato y azucares del nucleótido (Nyberg et al., Biotechnol. Bioeng., 62: 336-347 (1998)), la actividad de glicosiltransferasa (Hendrickson and Imperiali. Biochemistry, 34: 9444-9450 (1995); Kaufman et al., Biochemistry. 33: 9813-9819 (1994)), y la accesibilidad del sitio de glicosilación variable atribuible a la competición con la proteína plegada (Holst et al., EMBO.J. 15: 3538-3546 (1996): Imperiali, Acc. Chem. Res. 30: 452-459 (1997); Shelikoff et al. Biotechnol. Bioeng., 50: 73-90 (1996)). Ningunos de estos factores pueden ser influidos por las condiciones del cultivo de células. Ocupación del sitio t-PA generalmente varía dentro de un rango estrecho (\pm 5%).

Estudios de Catiónes de metal Oligosacariltransferasa en la Glicosilación

Glicosilación unida a Asparagina involucra la modificación de la enzima catalizada de una cadena lateral de asparagina en un polipéptido nasciente con una mitad del tetradeca-sacárido de tri-antennary. Este primer paso comprometido en los biosintésis de N-glicoproteínas enlazadas es catalizado por oligosacariltransferasa, un complejo de enzima asociado a la membrana heteromerica se encontró en el lumen del retículo endoplasmático de células eucariotas. Ver Imperiali. Supra: Allen et al. J. Biol. Chem., 270: 4797-4804 (1995): Sharma et al. Eur. J. Biochem., 116: 101-108 (1981): Silberstein y Gilmore FASEB Journal. 10: 849-858 (1996): Kumar et al., Biochem. Mol. Biol. Intl., 36: 817-826 (1995): Bause et al.., Biochem. J. 312: 979-985 (1995): Xu y col. Biochemistry. 36: 14683-14689 (1997): Kumar et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 247: 524-529 (1998): Watt et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7: 652-660 (1997).

Para la actividad óptima, la oligosacariltransferasa requiere de una pequeña cantidad del catión divalente de manganeso, con una configuración de coordinación octaédrica soportará la transferencia, aunque en proporciones reducidas (Hendrickson e Imperiali, Supra: Kaufman et al., Supra: Kumar et al., Biochem. & Mol. Biol. International. 36: 817-826 (1995)).

El papel de la temperatura en los cultivos de células de mamíferos

Para simular el ambiente normal del cuerpo, la temperatura de fermentador en los cultivos de células de mamíferos se controla casi exclusivamente en 37ºC. Este dogma es tan aceptado ampliamente que, hasta ahora, poca atención ha sido pagada para variar la temperatura en el proceso de cultivo de células. Los datos escasos en la literatura indican que la temperatura del fermentador reducida resulta en una mejora de la viabilidad de células y la resistencia de cizallamiento de la densidad de células más alta y los títulos en cultivos por lotes, y una reducción en el metabolismo de glucosa/lactato (Chuppa et al., Biotechnol. Bioeng., 55: 328-338 (1997)).

Específicamente, Reuveny et al.. J Immunol Methods, 86: 53-59 (1986) estudió el efecto de las temperaturas en el rango de 28ºC para 37ºC en cultivos por lotes de células de hibridomas. Ellos descubrieron que aunque a bajas temperaturas la viabilidad de células fue mejorada, esto fue acompañado por un decrecimiento en el consumo de glucosa y un decrecimiento en la producción de anticuerpo específico. Por lo tanto, en el caso particular de las temperaturas más bajas no aumentan el rendimiento global del proceso de cultivo de células.

Sureshkuman and Mutharasan, Biotechnol. Bioeng. 32: 292-295 (1991) investigó el efecto de la temperatura en el rango de 29ºC hasta 42ºC sobre el proceso de cultivo de células, y descubrió que la densidad de células máxima fue conseguida en 33ºC. Por contraste, el consumo de la glucosa y la velocidad específica de producción de lactato fue dramáticamente más bajas a 33ºC que en 39ºC. Estos resultados mostraron que las temperaturas óptimas para el crecimiento y la productividad podrían ser considerablemente diferentes. Mientras el aumento de viabilidad a temperaturas por debajo del 37ºC y parece ser un fenómeno general, el efecto de la temperatura sobre la productividad específica y ha sido demostrada ser dependiente a la línea celular (Chuppa et al., Supra).

Weidemann et al., Cytotechnology. 15: 111-116 (1994) cultiva células de riñón de hámster bebé recombinante (BHK) a las temperaturas entre 30 y 37ºC. El cultivo a bajas temperaturas por lote y el modo de lote repetido que el de un bioreactor de dos litros indica que velocidades más baja de crecimiento y de consumo de glucosa más baja (es decir menos producción de lactato). Por otro lado, la densidad de células máxima y la productividad no se afectan por la reducción de temperatura.

Kretzmer et al., "Cultivation Temperatura-Efect on Cell Culture Procesess and Their Optimization" (American Chemical Society Meeting, San Francisco. CA), abstract 138, presentado el 16 de abril de 1997, descubrió el efecto de la temperatura en el proceso de cultivo celular y su optimización, pero aparentemente sin ningún análisis de glicosilación específica.

Ha sido indicado que la temperatura del fermentador se reduce y podría tener otra ventaja relacionada con la calidad de producto e integridad, pero el efecto de las temperaturas bajas sobre la calidad del producto, y en particular no, sobre la glicosilación de la proteína, ha sido escasamente estudiada. Chuppa et al., Supra, ha reportado que la temperatura de fermentación no tiene un efecto importante sobre el contenido de ácido siálico de las glicoproteínas. Aunque el contenido de azúcar total es algo más bajo a 37ºC que a 34ºC ó 33,5ºC, los autores revisaron esta diferencia como "No considerable."

Sin embargo, en la Patente de los EE.UU. No. 5.705.364 se describe la preparación de glicoproteínas desde cultivos de células de mamíferos en el que el contenido de ácido siálico de la glicoproteína producida es controlado sobre un amplio rango de valores manipulando el ambiente del cultivo de células, incluyendo la temperatura. La célula del hospedero fue cultivada en fase de producción del cultivo adicionando un ácido alquanoico o sal de esta al cultivo en cierto rango de concentración, manteniendo la osmolalidad del cultivo aproximadamente a 250 hasta 600 mOsm, y manteniendo la temperatura del cultivo entre aproximadamente 30 y 35ºC.

Bahr-Davidson "Factors Affecting Glycosylation Site Occupancy of ASN-184 of Tissue-Type Plasminogen Activator Produced in Chinese Hamster Ovary." Una disertación propuesta por el Departamento de Ingeniería Química y el Comité de Estudios de Diplomados de Universidad Stanford en el cumplimiento parcial de los requisitos para el título de Doctor en Filosofía, mayo 1995, investigó los efectos de la temperatura sobre la ocupación del sitio de glicosilación y reportó que la ocupación del sitio se incrementa por exposición de células hasta 26ºC. (Ver páginas 50-51).

Otros tratamientos hormonales como influye en la Glicosilación

El efecto de varios aditivos tales como componentes de plasma para medios de cultivos sobre la producción de proteína y glicosilación han sido estudiados en la literatura, por ejemplo, los efectos de los tratamientos hormonales sobre la membrana exterior de riñón de rata cepilladas se glicosila la membrana (Mittal et al., Indian Exper. Biol., 34: 782-785 (1996)). Los estudios de la expresión de Muc-I Mucin establecieron la base hormonal para la expresión de mRNA (Parry et al., J. Cell Sci., 101: 191-199 (1992)). La regulación de la hormona tiroides de alfa lactalbumina con glicosilación diferencial ha sido reportado (Ziska et al., Endocrinology, 123: 2242-2248 (1988)). La respuesta celular para la N-glicosilación de la proteína fue incrementada en presencia de tirosina, insulina, y trombina, y el efecto es dependiente a la dosis. (Oliveira y Banerjee. J. Cells Physiol., 144: 467-472 (1990)). Tirosina se encuentra para producir cambios en el patrón de glicosilación de la fetoproteína alfa de rata (Naval et al., Int. J. Biochem., 18: 115-122 (1986)).

Además de los tratamientos hormonales, la deficiencia de glutationa y glucosa 6-fosfato dehidrogenasa incrementó la glicosilación de la proteína (Jain. Free Radical Biology & Medicine 24: 197-201 (1998)). Tirotropina se encuentra para controlar la actividad de oligosacariltransferasa en células de tiroides (Desruisseau et al., Mol. Cell. Endocrinol., 122: 223-228 (1996)). La adición de glucosa y tri-iodotironina (T_{1}) para un medio que produce un derivado de uroquinasa mejoró la productividad (Hosoi et al., Cytotechnology. 19: 1-10 (1996)). También, la actividad de fucosiltransferasa en el intestino delgado de rata fue receptiva para regular hidrocortisona durante el período que estan mamando (Biol et al., Biochim. Biophys. Acta. 1133: 206-212 (1992)). El tratamiento con Hidrocortisona también produce alteraciones cuantitativas en glicosilación de los precursores del virus de tumor mamarios ratón (Maldarelli and Yagi. JNCI, 77: 1109-1115 (1986)). Glicosilación de glicoconjugados celulares en una línea celular de carcinoma aumentó junto a un ácido retinoico (Sacks et al., Glycoconjugate J, 13: 791-796 (1996)). Además, el ácido retinoico tenía efectos reversibles sobre la glucosalino y puede la síntesis durante la diferenciación de células de leucemia HL-60 (Reiss et al., Can. Res., 45: 2092-2097 (1985)). El ácido retinoico adicional, tanto como hidrocortisona, fue encontrado en modular la síntesis de glucosaminoglucano de queratinocitos malignos humanos (Reiss et al., J. Invest. Dermatol., 86: 683-688 (1986)).

La competición entre la glicosilación y el plegable en el retículo endoplasmático ha sido descrito (Holst et al., Supra) como tiene un choque de calor agudo induciendo el fenómeno de aviso de glicosilación (Jethmalani et al., J Biol. Chem., 269: 23603-23609 (1994)).

Existe una necesidad para incrementar la ocupación del sitio de glicosilación creciente en glicoproteínas que tienen glicoformas múltiples que producen glicoproteínas terapeúticas de calidad del producto consistente. Por ejemplo, hay una necesidad de incrementar la fracción de tipo t-PA I en el proceso de producción de t-PA. Tal incremento en la ocupación del sitio genera t-PA con la actividad más estrecha semejante al patrón internacional de t-PA humano, y por lo tanto, parece estar más estrechamente a t-PA humano. El t-PA tipo I es también más soluble que el tipo II por lo cual puede ser de algún valor en los pasos del proceso. Además, aumenta el tipo I y se correlaciona con el aumento del tiempo de vida en circulación, como se menciona arriba.

Resumen de la invención

Se ha encontrado que durante la producción de una glicoproteína de tipo salvaje, llamado t-PA humano, en células de mamíferos, particularmente células de ovario de hámster chinos (CHO), el uso de ciertos metales divalentes, hormonas, o factores que manipulan la distribución del ciclo celular para controlar o influir significativamente en la glicosilación, incrementa la ocupación del sitio de glicosilación de la glicoproteína. Por ejemplo, reducir la temperatura del cultivo a 37ºC a aproximadamente 30-35ºC en la fase de producción significativamente aumenta la ocupación del sitio de glicosilación en la posición del aminoácido 184, e incrementa la proporción de t-PA tipo I en t-PA tipo II. Específicamente, disminuir la temperatura de 37 a 33 ó 31ºC incrementó la ocupación del sitio de t-PA hasta un 6%. Las temperaturas por debajo de 37ºC se espera de forma similar que facilite la ocupación de sitios de no glicosilación fácilmente en N-enlazado a otras glicoproteínas. Por lo tanto, la temperatura puede ser usado como una herramienta delicada para poner a punto la proporción de las formas glicosiladas de varias glicoproteínas teniendo uno o más sitios de glicosilación de N-enlazados ocupando solamente una fracción de la proteína.

Además, otros factores ambientales incluyen aquellos que manipulan el estado de crecimiento del cultivo y correspondiente al ciclo de distribución celular, tales como butirato, o un inhibidor del ciclo celular que incrementa la proporción de células en la fase G1 como quinidina, componentes de plasma tales como hormonas de tiroides del G0, y en consecuencia, y/o cationes de metales divalente significativamente elevado el contenido de t-PA del tipo I (sobre 1-2,5%) comparado con las condiciones control, y se esperan hechos similares con respecto a otras glicoproteínas. Por lo contrario, la adición del precursor de moléculas del nucleósido relevante (por ej. uridina, guanosina, manosa) no resulta mejorando la ocupación del sitio.

En un aspecto, la invención trata de un proceso para producir una glicoproteína que comprenden cultivos de células de hospederos de mamíferos que producen glicoproteína (i.e., Células que expresan el ácido nucleico que codifica la glicoproteína) en la presencia de (a) un factor que modifica el estado de crecimiento en un cultivo celular. (b) un catión de metal divalente que puede adoptar y prefiere una configuración de coordinación octaédrica, o (c) un componente de plasma, así como la ocupación de uno de los N-enlazados de los sitios de glicosilación solamente en una tracción de la glicoproteína aumenta en la glicoproteína que se produce. Preferentemente, el factor es un inhibidor del ciclo celular que bloquea las células en la fase de G0/G1, una sal de butirato, y/o una temperatura del cultivo entre aproximadamente 30 y 35ºC, el catión divalente es manganeso o hierro, y el componente de plasma es una hormona. Preferentemente, el procedimiento de cultivo celular incluye una fase de crecimiento, seguida por una fase de transición y una fase de producción. En una realización preferida, en la fase de crecimiento las células del hospedero mamífero son cultivadas aproximadamente 37ºC, whereupon, durante la fase de transición, la temperatura se baja entre aproximadamente 30ºC y 35°C. Las células del hospedero preferentemente son células CHO, y la glicoproteína preferentemente es t-PA.

En otro aspecto, la invención proporciona un proceso para producir t-PA humano que comprende el cultivar células de CHO que expresan el ácido nucléico que codifica a t-PA en un medio libre de suero en una fase de producción a una temperatura aproximadamente de 30ºC y 35ºC en presencia de aproximadamente 0 a 2 mM de sal de butirato, por lo cual la ocupación de uno de los sitio de glicosilación N-enlazado solamente en una fracción del t-PA se incrementa el t-PA producido.

En un aspecto adicional, la invención suministra un proceso para la producción de t-PA humano que consta de un cultivo de células CHO que expresan el ácido nucléico que codifica el llamado t-PA en medio libre de suero en una fase de crecimiento a una temperatura aproximadamente de 37-40°C, en el que dicho medio consta de aproximadamente 10 nM hasta 100 \muM de un catión metal divalente que puede adoptar y preferir una configuración geometríca octaédrica; cultivar dichas células en la fase de transición a temperaturas de aproximadamente 37-40ºC; y cultivar dichas células en la fase de producción en el que después de aproximadamente 48 horas la temperatura se baja aproximadamente 30ºC y 35°C y sobre 0,75 hasta 1,5 mM de una sal de butirato y se adiciona al medio, por lo cual la ocupación del sitio de glicosilación N-enlazado solamente en una fracción del t-PA y se incrementa el t-PA producido. En este proceso, un componente de plasma como una hormona de tiroides. Por ej. tirosina o tri-iodotironina o un inhibidor del ciclo celular que bloquea las células en la fase de G0/G1 como quinidina se adiciona al medio de cultivo opcionalmente antes o durante la fase de crecimiento.

Por lo tanto, el proceso aquí facilita la producción de una glicoforma preferida de una glicoproteína, como t-PA de tipo I. En un cultivo de células de mamífero, y también incrementa la proporción de glicoproteínas preferidas ó no preferidas, como la proporción de t-PA de tipo I para tipo II en un cultivo de células de mamífero.

Descripción breve de los dibujos

Figura 1 indica una descripción de t-PA tipo I y t-PA tipo II y un cromatograma de las mismas.

Figura 2 muestra que los porcentajes de t-PA humano tipo I en cultivos de células CHO cultivadas a varias escalas a 37ºC.

Figura 3 muestra los gráficos de los porcientos de t-PA humano de tipo I en cultivos de células CHO a 37ºC como una función del tiempo de ejecución de fermentación, cada línea del gráfico representa una corrida diferente.

Figura 4A y 4B muestran los porcientos de t-PA humano tipo I en cultivos de células CHO a escala de laboratorio (en matraces de 25 cm^{2} y matraces spinner de 100 ml Figura 4A) o en un bioreactor de 5 litros (Figura 4B) durante 5-7 días a 33°C comparado al control (el cultivo de células se mantiene a 37ºC).

La figura indica los porcientos de t-PA humano tipo I en cultivos de células de células CHO cultivadas en T-matraces a 37ºC durante 3-4 días en el que el butirato de sodio se adiciona en la cantidad indicada en el momento de la inoculación. Los valores son de experimentos por triplicados.

Figura 6 muestra los porcientos de t-PA humano tipo I en cultivos de células CHO cultivadas en placas de cultivo de 60 mm a 37ºC durante 4-6 días en el que los cambios de temperatura con ó sin butirato de sodio son comparados (en el que 37ºC 1 representa el control a 37ºC sin butirato: 37ºC 11X es a 37ºC con 0,75 mM butirato. 37ºC, 12X es a 37ºC con 1,5 mM butirato. 33ºCI - es a 33ºC sin butirato, 33ºCHX es a 33ºC con 0,75 mM butirato. 33ºC12X es a 33ºC con 1,5 mM butirato. 31ºCI es a 31ºC sin butirato. 31C11X es a 31ºC con butirato 0,75 mM, y 31ºC12X es a 31ºC con 1,5 mM butirato).

Figura 7 muestra los porcientos de t-PA-tipo I humano y se comparan en cultivos de células CHO cultivadas en bioreactores de 5 litros después de 5-7 días, en el que la temperatura cambia con ó sin butirato de sodio (donde el control es a 37ºC sin butirato. 33ºC es a 33ºC sin butirato. 2X butr es a 37ºC con 1,5 mM butirato, y 33ºC2X es a 33ºC con 1.5 mM butirato).

Figura 8 indica los porcientos de t-PA humano tipo I en cultivos de células CHO cultivadas en fermentadores demasiado tiempo a 37ºC en el que butirato de sodio fue añadido a una concentración de 0,75 mM en aproximadamente 48 horas, y los porcientos de células en la fase de G1/G0 en los puntos de tiempo correspondientes. Estos resultados reflejan los promedios de tres cultivos por separado.

Figura 9 indica los porcientos de t-PA humano tipo I en cultivos de células de CHO cultivadas en matraces T a 37ºC durante 3-4 días en el que al momento de la inoculación ningún inhibidor del ciclo celular se adiciona (control), es añadido timidina (250 pg/ml), o es añadido quinidina (90 \muM). Los valores son de los experimentos por triplicados.

Figura 10A y 10B muestran los porcientos de t-PA humano tipo I en cultivos de células CHO cultivadas en placas de cultivo de 60 mm durante 4-6 días a 37ºC en el que al momento de la inoculación se adiciona 3 nM de MnCl_{2} (control), o se adiciona MnCl_{2} 10 nM, 100 nM, 1 \muM, 10 \muM y 100 \muM. Los valores son expresados por triplicado para Figura 10A y como un promedio de los triplicados para Fig. 10B.

Figura 11 muestra los porcientos de t-PA humano del tipo I en cultivos de células CHO cultivadas en placas de cultivo de 60 mm a 37ºC durante 4-6 días en el que al momento de la inoculación se adiciona ningún citrato férrico (control), o se adiciona citrato férrico de 10 \muM de citrato férrico, 50 \muM citrato férrico, ó 100 \muM de citrato férrico.

Figura 12 muestra que los porcientos de t-PA humano tipo I en los cultivos de células CHO cultivadas en placas de cultivo de 60 mm a 37ºC durante 4-6 días en el que las células están cultivadas en presencia de las cantidades aumentadas de moléculas del precursor de azúcar nucleotido especificadas.

Figura 13A y 13B muestran los porcientos de t-PA humano tipo I en placas de cultivo de 60 mm a 37ºC en cultivos de células CHO cultivadas durante 7 días en el que al momento de la inoculación ninguna hormona se añade (control), o se adiciona 1 nm, 10nM, ó 100 nM de tri-iodotironina (Triiod.) ó de tirosina (Thyrox.). Los valores son expresados por triplicado para Figura 13A y como un promedio de triplicados para Fig. 13B.

Descripción detallada de la invención 1. Definiciones

Como se usa aquí, la palabra "Aumentada" cuando se relaciona la ocupación del sitio de glicosilación N-enlazado solamente a la fracción de la glicoproteína se refiere al respectivo valor obtenido practicando la invención en curso versus el valor de control obtenido por no usar los parámetros de esta invención. El valor está calculado sobre la base de los porcientos de los sitios de glicosilación ocupados en la posición particular de la glicoproteína en cuestión versus un valor de línea base, la que se determina sin usar los factores, catiónes, o componentes de plasma que aquí se reivindican. Por ejemplo, t-PA es secretado como una mezcla de dos glicoformas muy importante. Tipo I (todos los tres N-sitios de glicosilación estan ocupados) y Tipo II (Asn 184 no esta ocupado), y la mejora en el nivel de ocupación representa un sitio de ocupación de forma que la mezcla ha incrementado las cantidades de Tipo I en comparación con t-PA Tipo II versus el control. El nivel de esta ocupación puede ser medido, por ejemplo, usando cromatografía líquida de alta presión (RP-HPLC) que eluye los fragmentos de los diferentes tipos de glicoproteína (los tipos que tienen niveles de ocupación diferentes del sitio de glicosilación) integran las áreas máximas para cada tipo de glicoproteína para determinar las respectivas cantidades. La manera más típica de expresar estas cantidades es por los porcientos del tipo de ocupación de la glicoproteína por el total de glicoproteína. Un ejemplo concreto de un ensayo usado para la medir el aumento para t-PA Tipo II y Tipo I se coloca debajo en el Ejemplo 1.

Como se usa aquí, "Glicoproteína" se refiere a péptidos y en general a proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos y al menos un sitio de glicosilación que es ocupado solamente en la fracción del producto de glicoproteína. Ellos exhiben la ocupación del sitio variable o las variaciones en la ocupación del N– y O- sitio de glicosilación. Las glicoproteínas podrían ser homológos a las células del hospedero, o preferentemente, son heterologas. i.e. foráneas, a las células del hospedero que esta utilizando, tales como una proteína humana producida por una célula CHO. Preferentemente las glicoproteínas de mamíferos (glicoproteínas que fueron obtenidos originalmente de un organismo mamífero que es usado, preferentemente, aquellos que son directamente secretados en el medio, y más preferentemente, aquellos en el que la ocupación del N-sitio de glicosilación, se involucra.

Específicamente las glicoproteínas preferidas aquí es el t-PA, plasminógeno, interferón-ganma. Proteína C, IL-2, y CSF. Por ejemplo. GM-CSF. La glicoproteína más preferida es t-PA o plasminógeno, y la más preferida es t-PA. Y la más notable t-PA humano.

Los términos "activador de tejido de plasminógeno", y "t-PA" se refiere a extrínseco humano (el tipo tisular), el activador de plasminógeno que tiene actividad fibrinolítico que tiene una estructura típicamente con cinco dominios (Finger, factor de crecimiento, kringle-1, kringle-2, y dominios de proteasa), pero podría tener menos dominios no obstante podría tener algunos de sus dominios repetidos si todavía funciona como un agente trombolítico y conserva los sitios de glicosilación N-enlazado a las posiciones 117, 184, y 448. El mínimo, el t-PA consta de un dominio de proteasa que es capaz de cambiar plasminógeno por plasmina, y una región N-terminal que se cree que por lo menos es parcialmente responsable de la unión de fibrina, y conserva los sitios de glicosilación N-enlazados en las posiciones que se corresponden a las posiciones de los aminoácidos 117, 184, y 448 del t-PA humano de tipo natural. La retención de estos sitios de glicosilación es debido a que la ocupación del sitio variable de t-PA tipo natural humano derivado de melanoma y recombinante resulta en la producción de dos variantes, designado como "t-PA tipo I" y "t-PA tipo II", respectivamente. El t-PA tipo I contiene N-oligosacáridos enlazados en posiciones 117, 184, y 448. El t-PA tipo II contiene N-oligosacáridos enlazados en posiciones 117 y 448. Ver Figura 1. Se comprende que las diferencias alélicas naturales existen y pueden ocurrir entre personas individuales, como demostrar por una o más diferencias de aminoácido en la secuencia de aminoácido de t-PA de cada individuo.

El término "Activador del plasminógeno tisular humano de tipo natural", "activador de plasminógeno tisular humano nativo" y "t-PA humano nativo", donde "t-PA humano" puede ser abreviado como "ht-PA", referido a la secuencia de t-PA humano, es decir, que codifica para la secuencia de cADN reportada en Patente de los EE.UU. No. 4,766,075, hecha publica el 23 Agosto 1988. Los números de los sitio de aminoácido o posiciones en la molécula de t-PA son identificados de acuerdo con la Patente de los EE.UU. No. 4,766,075. El t-PA puede ser de cualquier fuente nativa. Además, el t-PA puede ser obtenido desde cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo, por ejemplo. Células CHO ó células 293 de riñón embrionarias humanas.

Como se usa aquí, las referencias para varios dominios de t-PA significan los dominios de t-PA humano natural como el definido arriba, y empleando porciones equivalentes de t-PA humano que tiene alteraciones de aminoácido cuando se compara con la secuencia de t-PA humana nativa, o de t-PA de otras fuentes (natural ó variante), como el activador de plasminógeno tisular de murciélago (bat-PA). Por lo tanto, como el usado aquí, el término "Dominio de proteasa" se refiere a la región que se extiende de la posición de aminoácido 264 a la posición de aminoácido 527, inclusivo, de la forma madura y natural el t-PA del tipo humano como el que, y a partes en la práctica equivalentes ser t-PA humano que tiene alteraciones de aminoácido comparado con la secuencia de t-PA humana nativa, o de t-PA de otros orígenes, como bat-PA.

Como se usa aquí, "El factor que modifica el estado de crecimiento de un cultivo de células" se refiere a un factor que incrementa la proporción de células en la fase de crecimiento G0/G1 tales como un inhibidor del ciclo celular que causa que las células se acumulen o bloquean las células en la fase G0/G1. Tales factores manipulan la distribución del ciclo celular para controlar o influir en la glicosilación. Tal factor podría afectar la glicosilación además del mecanismo del estado del crecimiento, pero esta definido aquí como se afecta al menos el estado de crecimiento.

Como se usa aquí "Un inhibidor del ciclo celular que bloquea las células en la fase de crecimiento G0/G1". Esto puede estar determinado por el análisis del ciclo celular. Es decir, suspensiones uniformes de nucleicos son teñidos con Ioduro de propidio (PI) usando el método con detergente tripsina de Vindelov et al., Cytometry, 3: 323-327 (1983) determina el respectivo contenido de ADN celular por el análisis de flujo citométrico. Los eventos son gated usando un par de discriminación que excluye el par, y los datos son modelados usando el software ModFit LT Cell Cycle Análisis™ (Verita Software House). Un inhibidor preferido aquí es quinidina.

Por "Butirato" o "Sal de butirato" se representa como alguna sal correspondiente del ácido butirico, como butirato de sodio o butirato de potasio.

Por "Fase" se representa cierta fase del cultivo de las células como es reconocido por los practicantes. Por ejemplo, "Fase de crecimiento" del cultivo celular refiere el período de crecimiento exponencial de las células (fase logarítmica) donde las células en general se dividen rápidamente. Durante esta fase, las células son cultivadas por un período de tiempo, generalmente entre 1-4 días, y bajo tales condiciones que el crecimiento celular está maximizado. El ciclo de crecimiento de las células del hospedero puede ser determinado por la célula del hospedero en particular visualizado sin la inmerecida experimentación. Durante la fase de crecimiento, las células son cultivadas en el medio con nutriente que contiene los aditivos necesarios en general sobre 30-40ºC, preferentemente sobre 37ºC, en una atmósfera controlada humidificada, de forma que el crecimiento óptimo se alcanza para la línea de células en particular. Las células son mantenidas en la fase de crecimiento entre aproximadamente uno y cuatro días, generalmente entre aproximadamente dos y tres días.

"Fase de transición" del cultivo celular se refiere al período de tiempo durante el cual las condiciones de cultivo para la fase de producción están comprometidas. Durante la fase de transición, los factores ambientales como la temperatura son cambiados desde condiciones de crecimiento a condiciones de producción.

"Fase de producción" del cultivo celular se refiere al período de tiempo durante el cual el crecimiento celular se ha estancado. Durante la fase de producción el crecimiento celular logarítmico ha terminado y la producción de la glicoproteína es principal. Durante este período de tiempo el medio es complementado en general proporcionar la producción de glicoproteína continua y alcanza el producto glicoproteína deseado.

Por "Catión de metal divalente que puede adoptar y prefiere una configuración de coordinación octaédrica" representa un catión de metal con dos valencias que es capaz, y en realidad muestra la preferencia para, adoptar una configuración de coordinación octaédrica. Tales catiónes también son caracterizado en lo que respecto a que puede funcionar oligosacariltransferasa (es decir, esta activado) en su presencia. Ejemplos de tales iones de metal incluyen manganeso (Mn^{2+}), hierro (Fe^{2+}), calcio (Ca^{2+}) y magnesio (Mg^{2-}). Cationes divalentes que indican las preferencias de otras configuraciones de coordinación, incluyendo níquel (Ni^{2-}), cobre (Cu^{2-}), cadmio (Cd^{2-}), y zinc (Zn^{2-}), falla el activar la enzima y a altas concentraciones también inhibe la actividad competitivamente en la presencia de manganeso. Por lo tanto, estos cationes últimos son excluidos desde la definición.

Por "componente de plasma" se representa un componente de plasma normal. Esto incluirá promotores de crecimiento y agentes promotores de tumor de células de endotelio, reguladores de la diferenciación tisular del epitelio, glucagon, glucagon, heparina, acetato de miristato forbol, PRL, tiroglobulina, 8Br-cAMP, trombina, vitamina A y sus derivados (retinoides como el ácido de retinoico. Por ej. el ácido retinoico de trans-beta), glutationa, esteroides como corticosterona, cortisol, y corticoides. Por ej. glucocorticoides como hidrocortisona, y hormonas, preferentemente ésas que son hormonas esenciales del metabolismo como estrógeno, insulina, y las hormonas de tiroides. Por ej. tirosina y tri-iodotironina (T_{3}). Las hormonas de tiroides son acciones preferentes, y más preferentemente tirosina y tri-iodotironina. Debido a que el suero, incluye suero fetal de ternera, que contiene hormonas de tiroides y la hormona de tiroides que se une a la proteína en niveles nanomolar, se prefiere usar medio libre de suero, particularmente si las hormonas de tiroides están empleadas para aumentar el sitio.

El término "medio de cultivo celular," "medio de cultivo," y "medio de fermentación" se refiere para una solución de nutrientes usados para crecimiento de células de mamíferos que normalmente proporcionan al menos un componente de una o más de las siguientes categorías.

1) como fuente de energía, usualmente en forma de carbohidrato, tal como glucosa;

2) todo aminoácido esencial, usualmente set básico de veinte aminoácidos más cisteína;

3) vitaminas y/o otros compuestos orgánicos requeridos a bajas concentraciones;

4) ácidos grasos libres; y

5) elementos trazas, que son definidos como compuestos inorgánicos o elementos naturales que son normalmente requeridos a bajas concentraciones, usualmente en el rango de micromolar.

El medio de cultivo de célula es en general "Suero libre" cuando el medio está esencialmente libre del suero de cualquier fuente de mamífero (por ejemplo suero fetal bovino (FBS)). Por "Esencialmente libre" se representa que el medio de cultivo de célula consta de aproximadamente 0-5% de suero, preferentemente aproximadamente 0-1% de suero, y más preferentemente sobre 0-0,1% de suero. Ventajosamente, medio libre de suero "Definido" puede ser usado, en el que la identidad y la concentración de cada uno de los componentes en el medio son conocidos (es decir, un componente indefinido como extracto pituitario bovino (BPE) no está presente en el medio de cultivo).

En el contexto de la presente invención la expresión "Células", "Línea celular", y "Cultivo de células" son usadas indistintamente, y tales designaciones incluyen progeni. Por lo tanto, las palabras "Transformantes" y "Células transformadas del hospedero" incluyen el sujeto principal de células y cultivos obtenidos sin considerar el número de transferencias. Es también comprendido que toda la progenis no podría ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la Progenis de mutante que tiene la misma función o actividad biológica para seleccionar la célula transformada original. Donde son previstas designaciones distintas que estarán claro en el contexto.

Los términos "Célula del hospedero mamífero", "Células del hospedero" "Célula mamífero" "Célula del hospedero recombinante mamífero", y semejante, se refieren a líneas de células obtenidas de mamíferos que son capaces del crecimiento y la supervivencia cuando se ponen en cualquier cultivo de monocapa o en cultivo de sumergido en un medio que contiene los nutrientes apropiados y los factores de crecimiento. Los factores de crecimiento necesarios para una línea celular en particular son determinados fácil y empíricamente sin un exceso de experimentación, como se describe, por ejemplo, Mammalian Cell Culture, Mather. J.P. Ed. (Plenum Press: N.Y., 1984), y Barnes and Sato Cells 22; 649 (1980). Normalmente, las células son capaces de expresar y secretar cantidades grandes de una glicoproteína en particular de interés en el medio de cultivo. Ejemplos de células del hospedero mamíferos apropiadas dentro del contexto de la presente invención podrían incluir las células CHO (EP117.159 publicado el 29 de Agosto de 1989: Patente de los EE.UU. No. 4.766.075; 4.853.330: 5.185.259: Lubiniecki et al., Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses Spier et al. Eds. (1989), pp. 442-451), por ejemplo, derivados de CHO como CHO-DHFR (Urlaub y Chasin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77; 4216 (1980), CHO-K1 DUX B11 (Simonsen y Levinson Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 2495-2499 (1983); Urlaub y Chasin. Supra), y dp 12. Células CHO (EP 307.247 publicada 15 marzo 1989): Mieloma de rata YB2 '3. oAg20 (WO 86.00127 publicada el 1 de abril 1985); Fibroblastos de ratón C127 (Reddy et al., DNA. 6: 461-472 (1987)): células de ratón sertoli (TM4. Mather. Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)): células de carcinoma del cuello de útero humano (HELA. ATCC CCL 2) células de pulmón humano (W138. ATCC CCL 75) células de hígado humano (Hep G2. HB 8065, tumor mamario de Ratón (MMT 060562. ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)): células MRC 5; células FS4; y células de melanoma humano (Browne et al., Thromb. Haemost., 54: 422-424 (1985)). Las células del hospedero preferido incluyen CHO-K1 DUX B11 y células CHO dp12.

Células CHO desarrolladas para la producción a gran escala de t-PA es mantenida criogenicamente en un sistema de banco maestro-banco de células de trabajo (WCB) como se describe por Wiebe et al., Large scale Mammalian Cell Culture Tecnhology, Lubiniecki Ed., (Marcel Dekker: Nueva York. 1990). Pp. 147-160. Las células CHO K1+ DHFR transfectada con el ADN que codifica para t-PA humano ha sido depositada en el American Type Culture Collection, Manassas, Virginia (ATCC), y están disponible bajo el número de acceso CCL 61. Una muestra de otra línea de otras células CHO que producen t-Pa (línea de células CHO 1-15_{15}) ha sido depositada bajo el número de acceso CRL 9606 a la ATCC. La línea de células última fue reportada por resultar en que niveles de t-PA en humanos aproximados a 50 pg/células/día.

II. Modos para llevar la invención Aspectos generales y específicos de la invención

Ha sido descubierto que utilizar un factor que modifica el estado de crecimiento en un cultivo de células (tales como inhibidor del ciclo celular, una sal de butirato, o bajando la temperatura durante la producción de una glicoproteína en un cultivo de células de mamífero de 37ºC a aproximadamente 30-35ºC), o utilizando un catión de metal divalente puede adaptarse y preferir una configuración de coordinación octaédrica, o utilizar un componente de plasma, que aumenta la ocupación del sitio de glicosilación en una posición del aminoácido seleccionado y deseado de la glicoproteína del tipo salvaje.

Por ejemplo, esta elevación de la temperatura aumenta la ocupación del sitio de glicosilación en la posición del aminoácido 184 de t-PA humano tipo salvaje y, en consecuencia, incrementa la proporción de t-PA de Tipo I en t-PA de Tipo I. La capacidad de ajustar, e incrementar la proporción de t-PA de Tipo I en del Tipo II son importante, debido a que permite al fabricante producir una proteína recombinante en la que esta proporción se aproxima a la proporción presente en el t-PA nativo (aproximadamente 1:1). Además, la proporción para t-PA de Tipo I a Tipo II afecta la solubilidad y la velocidad de liquidación de t-PA, existen evidencias de que un aumento en la concentración de t-PA Tipo I aumenta el tiempo de vida útil de t-PA en circulación. Se conoce que oligosacárido con alta manosa en la posición del aminoácido 117 es el principal responsable de la eliminación rápida de t-PA humano nativo. Cuando este oligosacárido es retirado, se ha observado que t-PA del Tipo I tiene un tiempo de vida útil mayor que el tiempo de vida del t-PA Tipo II, indicando que hay un mecanismo secundario sobre el que el oligosacárido adicional presente sobre t-PA del Tipo I tiene un efecto seguro. Las conclusiones experimentales de aquí pueden ser extendidas a otras glicoproteínas que (como el t-PA) tienen al menos un sitio de glicosilación que es ocupado solamente en una tracción del producto glicoproteína.

Si el factor es una sal de butirato, en general el butirato está presente en una concentración de hasta aproximadamente 2 mM. Más preferente entre 0,35 a 2 mM aproximadamente. A pesar de eso es preferido a aproximadamente 0,75 a 1,5 mM. La concentración de la misma de ser seleccionada dentro de este rango depende de la temperatura a la que el cultivo está principalmente sometido y el tipo de glicoproteína. Por lo tanto, si para t-PA la temperatura permanece en aproximadamente 37ºC o es bajada a aproximadamente 33-35ºC. La concentración de butirato es preferida más baja aproximadamente 1,5 mM y más preferida aproximadamente 0,3 a 1 mM. Más preferentemente 0,75 mM. Sin embargo, si para t-PA la temperatura es bajada a aproximadamente 30-31°C. Preferentemente la concentración de butirato es aproximada 1-2 mM. Más preferida aproximadamente 1,5 mM. Esta ilustración muestra que más de uno de estos factores puede estar operando o presente en el cultivo de células.

En un aspecto preferido, la elevación de la temperatura y/o teniendo lugar la adición de butirato durante la fase de producción del ciclo de crecimiento. En tal escenario, la temperatura es bajada entre aproximadamente 30 y 35ºC y/o la sal de butirato es añadida aproximadamente a las 48 horas en la fase de producción. La fase de producción esta adecuadamente precedida de una fase de crecimiento y de una fase de transición del ciclo de crecimiento. Durante la fase de crecimiento la temperatura es mantenida preferentemente en aproximadamente 37ºC y/o durante la fase de transición la temperatura del cultivo es preferentemente bajada aproximadamente entre 30ºC-35ºC. Más preferida aproximadamente 31-33ºC y más preferida aproximadamente 31ºC.

Por otra parte, o adicionalmente a los factores anteriores, las células son cultivadas en presencia de un catión divalente como se define arriba. La selección del catión divalente usado, tanto como la concentración específica de este, depende, entre todo, sobre el tipo de glicoproteína que esta siendo producida y los cationes del metal y otros componentes ya presente en el medio de cultivo y sus respectivas concentraciones. Por ejemplo, si la glicoproteína tiene varios grupos "tio", es preferido usar un metal tiofílico como manganeso y hierro, con el hierro es más metal tiofílico. Por lo contrario, si la glicoproteína contiene más grupos oxígeno, luego son preferidos los cationes oxofílicos, magnesio y calcio, Si el ión de calcio ya está presente en las cantidades suficientes en el medio, no se usa para los propósitos normales en el que un catión de metal diferente. Posteriormente, el tamaño del catión de metal podría tener una influencia, con hierro y magnesio por ser más pequeño y calcio y manganeso por ser más grandes. Los efectos estéricos debido a los grupos azufres sobre la glicoproteína pueden determinar un catión de radio iónico más pequeño. El catión de metal divalente preferido aquí es manganeso, magnesio, o hierro, más preferentemente manganeso o hierro, y más preferentemente manganeso.

El catión de metal divalente que está presente preferentemente en el medio de cultivo durante el tiempo completo de cultivo, y es adicionado por lo menos durante la fase de crecimiento. La concentración del mismo generalmente esta en el rango aproximadamente de 10 nM a 150 \muM, preferentemente para manganeso entre aproximadamente desde 10 nM hasta 100 nM, y aproximadamente desde 20 \muM hasta 100 \muM para el hierro en general.

En otra alternativa, solo ó conjuntamente con el catión divalente y/o factor, un componente de plasma está presente durante el cultivo. El componente de plasma está normalmente presente en una cantidad aproximadamente de 1 nM a 15-20 \muM dependiendo principalmente del tipo de glicoproteína que esta siendo producida, el tipo de componente de plasma utilizado, y la escala de fermentación. Por ejemplo, si el componente de plasma es una hormona tiroides, está preferentemente presente en una cantidad de aproximadamente 1-150 nM, preferentemente aproximadamente a 10-100 nM. Si el componente de plasma es glutaniona, está preferentemente presente a aproximadamente 1-10 \muM, y si es hidrocortisona, está preferentemente presente en aproximadamente 5-15 nM, preferentemente sobre 10 nM. Preferentemente, el componente de plasma es una hormona, más preferentemente una hormona tiroides, y más preferentemente tirosina o tri-iodotironina.

El grado de ocupación del sitio será conseguido para la glicoproteína y esta balanceado contra el grado de secreción de la glicoproteína, el que es generalmente tenido en cuenta en la selección en la cual los factores y otros componentes se emplean, y a qué concentraciones o temperaturas. Por ejemplo, la ocupación del sitio es en general controlada en un rango selecto de aproximadamente \pm 5% sin afectar la secreción de t-PA.

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Procedimientos de cultivo de células

De acuerdo con la presente invención las células de mamíferos son cultivadas para producir un producto glicoproteína deseado. En la selección de las células del hospedero por la producción de la glicoproteína dentro del contexto de la presente invención, es importante reconocer que diferentes células de hospedero tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento de traducción y post-traducción y la modificación de las proteínas expresadas (ej. Glicosilación, corte). Las líneas de células apropiadas deben ser seleccionada para asegurar que las modificaciones post-traducción deseadas sean posibles. Por otra parte, las células del hospedero pueden ser modificadas para expresar un gen producto deseado con la requerida modificación de trasducción específica.

\newpage

En particular, células de mamífero que expresan la glicoproteína deseada deben expresar o ser manipuladas para expresar tales enzimas particulares bajo las condiciones apropiadas, las modificaciones post-traduccionales apropiadas y ocurre in vivo. Las enzimas incluyen algunas enzimas necesarias para la adición y la terminación de carbohidratos enlazados N-O y como aquellas descritas en Hubbard and Ivatt. Ann., Rev. Biochem., 50: 555-583 (1981) para oligosacáridos N-enlazados. Las enzimas incluyen oligosacariltransferasa, alfa-glucosidasa I. alfa-glucosidasa, II. ER alfa (1,2) manosidasa, alfa Golgi manodasa 1, N-acetilliglucosaminil transferasa I, alfa Golgi manodasa II, N-aceriliglucosaminiltransferasa II, (1,6) alfa fucosiltransferasa, \beta(1,4)galactosiltransferasa, y un sialiltransferasa apropiado.

Para cultivo de células de mamíferos que expresan la glicoproteína deseada y son capaces de adicionar el carbohidrato deseado en la posición específica y enlazada, se usan numerosas condiciones de cultivo, prestando especial atención a las células del hospedero. Las condiciones de cultivo apropiadas para las células de mamíferos son conocidas en el estado de la técnica (J. Immunol. Methods. 56: 221-234 (1983)) o puede ser fácilmente determinado por expertos (ver, por ejemplo. Animal Cell Culture A practical approach 2nd Ed. Rickwood. D. y Hames. B.D. Eds. (Oxford University Press: Nueva York. 1992)), y varia de acuerdo con la células del hospedero en particular
seleccionado.

El cultivo de células mamífero de la presente invención es preparado en un medio adecuado siendo cultivada para la célula en particular. La solución de nutriente opcionalmente puede ser complementada con uno o más componentes desde cualquiera las siguientes categorías:

1) componentes de plasma como es definido arriba y o factores de crecimiento tales como, por ejemplo, insulina, transferina, y EGF;

2) sales y tampones como, por ejemplo, cloruro de sodio, calcio, magnesio, fosfato, y HEPES;

3) nucleosidos y bases como, por ejemplo, adenosina, timidina, y hipoxantina;

4) proteína e hidrolisados de tejido;

5) antibióticos tales como el medicamente GENTAMICINA™; y

6) lípidos les como linoleico y otros ácidos grasos y sus portadores adecuados.

Cualquier otro suplemento necesario también podría estar incluídas a las concentraciones apropiadas que son conocidas por aquellos expertos.

Medio comercialmente disponible como Ham's F10 (Sigma). Medio Esencial Mínimo (MEM. Sigma). RPMI-1640 (Sigma), Medio Eagle's Modificado Dulbecco's (DMEM, Sigma) son ejemplos de soluciones de nutrientes. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham's y Wallace. Meth. Enz., 58: 44 (1979); Barnes y Sato. Anal. Biochem., 102: 255 (1980); No. de Patente de los EE.UU. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 5.122.469 o 4,560,655; WO 87/00195 de WO 90 03430; y; puede ser usado como medio de cultivo. Cualquiera de estos medios pueden ser complementados con componentes tan necesarios como se mencionan anteriormente.

El uso de un medio particular que carece de suero de animal (medio libre de suero) es presentado para evitar la interferencia o la acción de cuantificación de los componentes del suero con uno o más factores, cationes de metal divalente, componentes de plasma, u otros ingredientes empleados de acuerdo con la presente invención. Además, la concentración de los grupos aminos debe ser suficientemente alta para guardar t-PA en solución cuando la concentración aumenta. Esto puede ser conseguido usando concentraciones de lisina más grande que 1 mM, por la presencia de HEPES, o por el uso de concentraciones suficientemente altas de cloruro de amonio, aunque se hace con cualquier otra amina o fuente de amonio.

Si el objetivo es producir t-PA considerable en forma de simple cadena, el medio de cultivo (como el medio usado en los pasos de recobrado y purificación ulterior) contiene un inhibidor de proteasa, como aprotinina, alfa-1, antitripsina alfa-1, macroglobulina alfa-2, tripsina de frijol de soja, etc. Preferentemente, aprotinina es empleada en una concentración de aproximadamente de 5 a 100 KIU/ml, más preferentemente aproximadamente 10 KIU/ml en el medio de producción de t-PA.

En una realización preferida en particular, la célula del hospedero mamífero son células CHO, preferentemente CHO-K1 DUX B11. Los nutrientes necesarios y los factores de crecimiento para el medio, incluyendo sus concentraciones, para una línea celular en particular, son determinados empíricamente sin la debida experimentación como se describe, por ejemplo, en Mammalian Cell Culture. Mather. Ed. (Plenum Press: NY, 1984) y por Barnes y Sato Cell, 22: 649 (1980). Un medio apropiado que contiene un componente medio fundamental tal como una formulación basada DMEM/HAM F12 (para composición de medio DMEM y HAM F12 y especialmente medio libre de suero, ver formulaciones de medios de cultivo en American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas. Sexta edición. 1988 pag 346-349), con las concentraciones modificadas de algunos componentes tales como aminoácidos, sales, azúcar, y vitaminas, y opcionalmente contiene glicina, hipoxantina, y timidita: insulina humano recombinante, peptona hidrolizada como PRIMATONE HS™ o PRIMATONE RL™ (Sheffield. Inglaterra), o el agente protector celular equivalente: tal como PLURONIC F68™ o el poliol pluronico equivalente; GENTAMYCIN™; y elementos trazas. Las formulaciones del medio como son descritas en Patente de los EE.UU. No. 5.122.469, caracterizado por la presencia de niveles altos de ciertos aminoácidos, tan bien también como PS-20 como se describe abajo, son particularmente apropiadas.

Las glicoproteínas de la presente invención pueden ser producidas por células en crecimiento que expresan la glicoproteína deseada bajo una variedad de condiciones de cultivo de células. Por ejemplo, procedimientos de cultivo de células para la producción de glicoproteínas a escala pequeña son potencialmente útiles dentro del contexto de la presente invención. Los procedimientos que se incluyen, pero no están limitados pueden ser usados un bioreactor de cama fluidizada, bioreactor de fibra hueca botella de cultivo de rodillo, o un sistema de bioreactor de tanque agitado, en los últimos dos sistemas, con ó sin microcarriers, y operados por otra parte de un modo por lote, lote alimentado ó continuo.

En una realización preferida el cultivo de células de la presente invención es llevada a cabo en un sistema de bioreactor de tanque agitado y es empleado un procedimiento de cultivo alimentado. En los cultivo del hospedero de células de mamíferos es preferido el lote alimentado y medio de cultivo es suministrado al vaso del cultivo inicialmente y nutrientes adicionales del cultivo son alimentados, continuamente o en incrementos discontinuos, el cultivo durante la fase cultivo con ó sin células periódicas y/o cosecha de productos antes de la terminación del cultivo. El cultivo por lote alimentado puede incluir por ejemplo, un cultivo de lote alimentado semicontinuo, en el que periódicamente el cultivo entero (incluyendo células y medio) es removida y reemplazada por el medio fresco. El cultivo de lote alimentado se distingue desde cultivo por perfusión a tal grado que del sobrenadante no es removido del vaso de cultivo durante el proceso, en el cultivo de perfusión las células son confinadas en el cultivo por ej. la filtración, la encapsulación, sujeta a microcarriers etc y el medio de cultivo es continuamente o intermitentemente introducido y retirado del vaso de cultivo).

Además, las células del cultivo pueden ser propagadas de acuerdo con cualquier esquema o rutina que pueda ser apropiada para las células del hospedero en particular y el plan de producción en particular es considerado. Por lo tanto, la presente invención considera un procedimiento de cultivo de paso simple o en múltiples pasos. En un cultivo de paso simple las células del hospedero son inoculadas al ambiente del cultivo y los procesos de la invención inmediata son empleados durante una fase de producción simple del cultivo de células. Alternativamente un cultivo de múltiples pasos esta previsto en un cultivo de células en multietapas puede ser cultivado en varios pasos o fases. Por ejemplo, las células podrían ser crecidas en un primer paso o el cultivo de fase de crecimiento en el que las células, posiblemente es retirado desde el almacenamiento, son inoculadas en un medio adecuado para promover el crecimiento y la alta viabilidad. Las células pueden ser mantenidas en la fase de crecimiento por un período de tiempo apropiado por la adición de medio fresco al cultivo de células del hospedero.

De acuerdo con un aspecto preferido de la invención, las condiciones del cultivo celular continuo o de lote alimentado son creadas para aumentar las células de mamíferos en la fase de crecimiento del cultivo de células. En la fase de crecimiento las células son crecidas bajo las condiciones y por un período de tiempo que se maximiza el crecimiento. Condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH, oxígeno disuelto (DO_{2}), y el semejante, son aquellos usados con el hospedero particular y será aparente por artesanos ordinarios y expertos. En general, el pH es ajustado a un nivel entre 6,5 y 7,5 usando un ácido (por ej. CO_{2}) o una base (por ej. Na_{2}CO_{3} o NaOH). Un rango de temperatura apropiada para cultivos de células de mamíferos tales como células CHO entre aproximadamente 30 a 40ºC y preferentemente aproximadamente 37ºC y un DO_{2} apropiado están entre 5-90% de la saturación de aire.

En una etapa particular las células pueden ser usadas para inocular una fase de producción o el paso del cultivo de células. Por otra parte, como se describe arriba en la fase de producción podría ser continúa con inoculación ó la fase de crecimiento o paso.

De acuerdo con la presente invención el medio de cultivo de células durante la fase de producción del cultivo de células es controlado. En un aspecto preferido, la fase de producción del proceso de cultivo de células es precedida de una fase de transición del cultivo de células en la que los parámetros por la fase de producción del cultivo de células están ocupados.

La producción de t-PA en mamífero. Por ejemplo, células CHO, se emplean normalmente en un proceso semi continuo por medio del cuál las células son cultivadas en un "Semillero" por varios períodos de tiempo y son transferidas periódicamente para inocular fermentadores para iniciar el proceso de amplificación celular en la ruta de la producción de t-PA a escala mayor. Por lo tanto, las células usadas para la producción de t-PA están en el cultivo por varios períodos de tiempo máximos hasta una predeterminada edad de las células. Los parámetros del proceso de cultivo de células, como la densidad de semillas, el pH, DO_{2} y la temperatura durante la cultivo, la duración del cultivo de producción, las condiciones de operaciones de la cosecha, etc, son una función de la línea de células en particular y el medio del cultivo usado, y pueden ser determinado empíricamente, sin la debida experimentación.

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Recobrado de la Glicoproteína desde el cultivo de células

Luego de la fase de producción del polipéptido, la glicoproteína de interés es recuperada del ambiente del cultivo usando una técnica bien conocida en la técnica. La glicoproteína de interés es recuperada preferentemente del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también puede ser recobrada de lisados de células del hospedero.

Como un primer paso, el medio de cultivo o lisados es centrifugado para eliminar los restos de células particuladas. La glicoproteína se purifica desde proteínas solubles contaminante y polipéptidos, con los procedimientos siguientes siendo por ejemplo los procedimientos de purificación apropiados: fraccionamiento sobre inmunoafinidad o columnas de intercambio iónico: precipitación por etanol; HPLC de fase reversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónica como DEAE; cromatoenfoque; SDSPAGE; precipitación de sulfato de amonio; usando gel filtración, por ejemplo. Columnas de SEPHADEX G-75™; columna de proteína A SEPHAROSE™; para eliminar contaminantes como IgG. Un inhibidor de proteasa como fluoruro de sulfonilmetilfenilo (PMSF) puede ser también útil para impedir la degradación proteolítica durante la purificación. Un experto en la técnica apreciará que los métodos de purificación apropiados para la glicoproteína de interés pueden requerir que la modificación responsable que cambie la calidad de la glicoproteína sobre la expresión en el cultivo de células recombinante.

También de utilidad en el contexto de la presente invención es una técnica de purificación y de procesos que selecciona los carbohidratos de la invención. Tales técnicas incluyen, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico en resinas y geles blando o HPLC usando una resina de intercambio aniónica y catiónica, en el que la fracción más acídica o más básica es colectada, dependiendo sobre cuál carbohidrato está esta seleccionado.

En una realización preferida, las células de CHO capaces de producir t-PA humano son crecidas como una suspensión en un medio de CHO a una densidad de células predeterminadas. La suspensión de células puede ser concentrada por filtración cruzada. El t-PA humano activo es producido posteriormente como una suspensión en medio CHO a una predeterminada densidad celular. El t-PA humano por lo tanto, es producido y secretado por células CHO en un medio de expresión libre de suero y puede ser separado desde técnicas estandar.

Varias técnicas pueden ser usados para recobrar el t-PA. Por ejemplo, al final del cultivo, la filtración de flujo tangencial, incluyendo filtración de flujo tangencial cruzado a alta presión, puede ser usada para eliminar el medio que contiene t-PA de las células.

Los sobrenadantes de células de cultivo pueden ser concentrados, diafiltradas, y cargadas en una columna de afinidad capaz de unir específicamente t-PA, normalmente una columna de afinidad de lisina. Bajo las condiciones de la cromatografía empleadas, t-PA se adhiere selectivamente a la columna de afinidad desde la cual puede ser recobrado y sometido a la purificación posterior.

En el paso de diafiltración, el sobrenadante del cultivo de células sobre una membrana de diálisis puede ser diafiltrada con un tampón de diálisis que consta de propilenglicol, la solución obtenida por diafiltración y puede ser cargada sobre una columna de afinidad capaz de la unión selectiva de t-PA, y t-PA puede ser eluidos de la columna de afinidad con un tampón de pH aproximadamente 5,0 hasta 9,0. La columna de afinidad es una columna de afinidad de lisina preferentemente, que es preferentemente eluida en un pH aproximadamente de 5,0 hasta 8,5, más preferentemente desde aproximadamente 6,0 hasta aproximadamente 8,5. Columnas de afinidad de lisina son conocidas en la técnica y están comercialmente disponibles. Las columnas apropiadas incluyen Lisina CPG™ (Bioproceso). ECH Lisina CL™ (Pharmacia), Lisina Hyper D™ (Biosepra). El gel es equilibrado preferentemente con 50 mM Na_{2}HPO_{4} o solución de K_{2}HPO_{4} (pH = 7,5) antes de la carga de la solución de t-PA. El tampón de elución contiene 200 mM Arginina, y 50 mM Na_{2}HPO_{4} o K_{2}HPO_{4} (pH = 7,0). Preferentemente, el tampón de elución contiene propilenglicol a una concentración de aproximadamente 2,5 hasta 20%.

Después de la inicial recuperación precedente de los pasos de purificación, la corriente de alimentación que contiene 0,5 a 3,0 mg/mL de t-PA simultáneamente en general contiene sobre 0,05 a 5 ng ml de ADN como determinado por un ensayo dot blot usando ^{32}P-marcado, el ADN obtenido de la misma línea de célula, resulta en una liquidación calculada de aproximadamente 2 x 10^{4} veces (dependiendo de la fuente de la resina de lisina y sobre las condiciones del lavado usado). Para reducir el nivel de ADN en el producto menor que un picogramo por dosis en humano, un paso de intercambio iónico específico puede ser incorporado en el procedimiento de purificación usando comercialmente la columna de intercambio iónico disponible tales como columna DE - 52™ (Whatman) ó columna
DEAE - SEPHAROSE FAST FLOW™ (Pharmacia).

El protocolo de purificación adicional incluye los pasos adicionales que inactivan y/o eliminan retrovirus que puede estar presente potencialmente en el fluido de cultivo de células de líneas de células de mamíferos continuos. Un número importante de los pasos de eliminación virales están disponibles, incluyen los pasos de ultrafiltración/diafiltración adicional, el tratamiento con agentes caotrópicos como urea o guanidio, los pH extremos, los detergentes, el calor, derivatización química, tales como formaldehído, proteasas, separación convencional, como la cromatografía de intercambio iónico o exclusión molecular, solventes orgánicos, etcétera. El paso en particular seleccionado por eliminación viral, aspecto no crítico de la presente invención, y la necesidad de conocer los siguientes criterios para t-PA: 1. t-PA debe ser estable bajo las condiciones del tratamiento mientras el virus diana debe ser consciente del tratamiento, y 2, la "Ventana de de eliminación" debe ser máximo. La "Ventana de la eliminación" es definida por este propósito como la razón de título del virus inicial (spike) en el fluido de proceso antes del tratamiento a un título de virus después del tratamiento del fluido de proceso.

El t-PA humano recombinante que se recuperó y purificó luego del protocolo precedente normalmente es al menos sobre 97-99,9% de puro (dependiendo de la resina de lisina). Si es necesaria una purificación adicional puede ser conseguida por pasos adicionales, como cromatografía de intercambio catiónico. Por lo tanto, el producto esta disponible para aplicaciones terapéuticas apropiados. Varias variantes de t-PA humano nativo pueden ser purificadas esencialmente por el que el mismo procedimiento, y otras glicoproteínas pueden ser purificadas por los procedimientos usados por homólogos de tipo salvaje, usando procedimientos bien conocidos en la técnica.

La presente invención es ilustrada por los siguientes ejemplos, no limitados. Es notado que el método de la presente invención es equitativamente aplicable a la producción de otras glicoproteínas que tienen más que un glucoforma en cultivos de células mamíferos, y las modificaciones que pueden ponerse necesario en el transcurso de la adaptación del método ejemplificado de producción de diferentes glicoproteínas y son buenas dentro de la destreza de un artesano corriente.

Ejemplo 1

Elevación de la temperatura en la producción de rht-PA Materiales y métodos

Células de CHO: la línea de células de CHO usada cuando la línea de células del hospedero mamífero fue obtenida desde CHO-K1 (ATCC No. CCL61 CHO-K1) y un CHO es mutante reductasa dihidrofolato (DHFR) la línea de células deficiente nombrada CHO-K1 DUX-BII (DHFR-) (obtenida desde Dr. L Chasin de Universidad de Columbia: Simonsen y Levinson, Supra: Urlaub y Chasin. Supra).

Medio PS-20 base: los componentes de este medio son listados en Tabla 1 de abajo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Por la conveniencia, los ingredientes sólidos del medio pueden ser combinados juntos con los aminoácidos, y esta mezcla puede ser almacenada como una sola unidad.

Ensayos t-PA Tipo I, Tipo II

1. Descongelar la muestra de sobrenadante de cultivo de células (si el medio entero, las células se hacen girar en centrífuga.)

2. Añada 2 \mul descongelado del plasminógeno fresco a 400 \mul de muestra.

3. Incube a 37ºC durante 60 minutos.

4. Añadir 20 \mul del descongelado fresco DTT 1M y 400 \mul de solución de 8M guanidio-HCl/50 mM Tris 3,2 mM EDTA

5. Incube a 37ºC durante 15 minutos.

6. Transferir al vial y cargar 250 \mul para ensayo sobre HP1090™ HPLC usando las siguientes condiciones:

Columna C8 ZORBAX™ a 40°C:

Monitoreo de eluentes por fluorescencia (excitación a 275 nm, emisión a 340 nm):

Corrida cada muestra con el siguiente método de 70 minutos donde el eluente A es 0,1% ácido trifluoroacético (TFA) en agua y el eluente B es 0,1% TFA en acetonitrilo:

0 a 5 minutos-75% A (y 25% B)

5 a 35 minutos - un gradiente lineal desde 75% A hasta 60% A

35,1 a 45 minutos-0% A

45 minutos a 70 minutos-75% A para reequilibrar la columna

Fragmentos de eluatos Tipo I, Tipo II después de aproximadamente 25 minutos, las áreas del pico son integradas para determinar las cantidades relativas.

Protocolo

Células de CHO produciendo t-PA humano recombinante fueron llevados en matraces pasados cada 3 o 4 días (a una densidad de 0,1% volumen de células empacado (PCV)) en medio selectivo (medio suplementado PS-20 con 500mM de metotrexato 10 mg/L insulina humano recombinante (rh-insulina). 0,1 mL/L elementos trazas, y 0,05 ml/L de etanol-lípido). Cultivo suficiente fue removido para alimentar 15 ml de medio a 0,2% PCV y colocado en tubo estéril Falcon de 50 ml. El cultivo fue centrifugado durante 10 minutos a 700-1000 rpm y el sobrenadante fue vertido. Sobre la adición de 15 ml de medio selectivo fresco, el cultivo fue agitado suavemente para resuspender las células. Cinco ml de cultivo fueron colocados en tres matraces T-25 (matraces T-25 cm^{2}). Las tapas fueron dejadas flojas para admitir el equilibrio con la atmósfera de la incubadora y los matraces fueron colocados en una incubadora de 33ºC a 31ºC con 5% dióxido de carbono. Después de 5 a 8 días de incubación, las células fueron contadas usadas en un hemacitometro y/o por el volumen de células empacada, y la viabilidad fue verificada usando azul tripan. El cultivo fue retirado de los matraces, centrifugando durante 10 minutos a 2000-2200 rpm, y el sobrenadante fue ensayado por glicosilación de rht-PA. Por otra parte los matraces T-25, las células fueron cultivadas usando placas de cultivo de células de 60 mm por triplicados.

Los sobrenadantes fueron congelados a -20ºC ó -70ºC hasta el análisis de t-PA de Tipo I/II tiene lugar.

Para los experimentos en spinner, el protocolo precedente fue usado, excepto las células que fueron pasadas a 200 ml de medio fresco (con 0,1% PCV inicial), en un matraz de 250 ml spinner. Las tapas fueron cerradas fuertemente sobre el matraz, los que fueron luego colocados en incubadora a 33ºC o 31ºC sobre un plato magnético agitado a 60 rpm.

Los experimentos en mini-fermentador fueron llevados a cabo bajo las condiciones de producción de t-PA estandar en el modo de lote alimentado como se nota en bioreactores de tanque agitado de 5 litros (Applikon. Foster City. CA). La temperatura fue elevada a 33ºC a 31ºC en día de la fase de producción.

Para los experimentos control, fueron seguidos de los experimentos precedentes, excepto que la incubación tuvo lugar a 37ºC. Además, los experimentos fueron llevados a cabo en fermentadoras 12-K como los de arriba sobre el curso de 200 horas y los porcientos de t-PA Tipo I fueron calculados.

Para los experimentos de aquí y abajo, las condiciones de cultivo fueron generalmente cambiadas sobre el día 1 (por ej. la adición de diferentes componentes de medio en el día 2 (por ej. elevación de la temperatura).

Resultados

La ocupación del sitio de t-PA en el Asn 184 fueron encontrados ser relativamente consistente a través de una a variedad de escalas (matraz T, spinner, y fermentadores de 80 L, 400 L, 2000 L, y 12,000 L) (Figura 2) de corrida a corrida en la producción. Los factores que pueden afectar la ocupación del sitio incluyen esos factores que afectan la disponibilidad del oligosacárido de dolicol (fosfato de dolicol, lípidos, y hormonas), factores que afectan la proporción de alargamiento de la traducción de la proteína (por ej. ciclohexamida), los factores que afectan la actividad de oligosacariltransferasa o la razón de proteína foldeada (por ej. ditiotreitol), y los factores que actúan a través de mecanismos desconocidos, como el tiempo en cultivo. Ilustrando el fenómeno último en aparecer, la Figura 3 muestra los cultivos de células CHO a 37ºC como una función del tiempo de corrida en fermentación 12-K, cada línea del gráfico representa diferentes corridas. Estos resultados indican que la ocupación del sitio se incrementa sobre el cultivo por lote (la duración de cultivo).

La Figura 4 muestra que reducir la temperatura incrementa la ocupación del sitio de t-PA. Específicamente la figura 4A muestra los resultados de los experimentos a escala de laboratorio que se llevan a cabo durante 5-7 días (T-matraces y matraces spinner). En los experimentos control, donde la fase de producción la temperatura se mantiene a 37ºC. El producto contiene aproximadamente 38% de t-PA de Tipo I. Por lo contrario en los experimentos donde en la fase de producción la temperatura fue bajada a 33ºC. El producto de t-PA obtenido t-PA de contiene aproximadamente 43-46% del Tipo I. La Figura 4B muestra los resultados de los experimentos de bioreactor, indicando que la temperatura más baja produce de forma similar unos porcientos más altos de t-PA de Tipo I.

Ejemplo 2

Adición de Butirato en la producción de rht-PA Materiales y métodos

La cantidad de células necesarias para una densidad de semillas de 0,2% de volumen de células empacadas fueron centrifugado en aproximadamente 700 x g durante 10 minutos, y resuspendidos en matraces T-25 cm^{2} con medio fresco apropiado para cada caso de prueba. Los matraces T se colocan por triplicado con 5 ml en cada matraz y se incuban durante 3 a 4 días a 37ºC y 95% de aire/5% CO_{2}. Butirato de sodio fue añadido a una concentración de 0,375 mM, 0,75 mM, ó 1,5 mM al tiempo de inoculación para los matraces de 25 cm^{2}. Las células fueron cultivadas en los matraces spinner en volúmenes de 100 ml con las concentraciones de butirato similares a los matraces T. Para los experimentos de fermentador, el butirato fue añadido en el segundo día de los experimentos. Los cultivos en matraces T también se llevan cabo a 33ºC y 37ºC sin adiciones de butirato. Los datos indicados para los cultivos de matraces T a 33ºC son de dos experimentos por triplicados (n = 6). La ocupación del sitio de t-PA fue analizada usando el método del Ejemplo 1.

Resultados

La Figura 5 muestra que la presencia de butirato de sodio a las concentraciones de 0,375 a 1,5 mM al tiempo de inoculación incrementó la ocupación del sitio de t-PA en matraces T a 37ºC. El mismo efecto aumentado fue observado para los experimentos de matraces spinner y fermentador.

La Figura 6 muestra que para los experimentos en placas de cultivo de 60 mm, la temperatura se eleva a 33°C y 31ºC tenía el efecto más grande e incrementa la ocupación del sitio de t-PA gradualmente hasta 6%, 0,75 mM de butirato incrementó ligeramente el contenido de Tipo I (aproximadamente 1%) comparado con ningún butirato (Figura 6). Por lo contrario, un aumento adicional de la concentración de butirato (1,5 mM) bajó la ocupación del sitio a 37ºC y 33ºC pero incrementa a 31ºC (Figura 6).

La Figura 7 indica el efecto de la temperatura y el butirato sobre la ocupación del sitio de t-PA bioreactores de 5 litros. El contenido de Tipo I fue analizado sobre los 5-7 días. Al reducir la temperatura desde 37ºC a 33ºC se incrementa la ocupación del sitio de t-PA. Sin embargo, incrementar la concentración de butirato de 0,75 a 1,5 mM disminuyó el contenido de Tipo 1 a ambas temperaturas. Esto confirma los datos obtenidos en experimentos en placas 60 mm (ver Fig. 6).

Ejemplo 3

Adición de Inhibidor del ciclo celular en la producción de rht-PA Introducción

La reducción de temperatura, la duración del cultivo, y la adición de butirato se encontraron que incrementa la glicosilación de t-PA en el sitio Asn 184, como se menciona en los Ejemplos 1 y 2. Todos estos factores corresponden con la disminución de la velocidad de crecimiento celular, resultando en la hipótesis de que la glicosilación y la ocupación del sitio son dependientes del ciclo celular. Esta hipótesis fue probada llevando a cabo dos experimentos adicionales reflejados en este ejemplo usando inhibidores del ciclo celular (quinidina y timidina).

Materiales y métodos

Las células son cultivadas en cuanto a lo que se refiere en los experimentos de butirato de sodio descritos en Ejemplo 2. Timidina fue disuelto en el agua y filtrado estéril por una solución de 33-36X. Quinidina fue hecha en sulfoxido de dimetil (DMSO) y se hace filtrar por un stock 1000-1800X. Timidina y quinidina fueron añadidos a los cultivos al tiempo de la inoculación a las concentraciones finales de 250 \mug/ml y 90 \muM respectivamente. La ocupación del sitio de t-PA fue analizada usando el método del Ejemplo 1.

Resultados

El análisis del ciclo celular para el control, la quinidina, y la timidina son mostrados en la Tabla 2, esta determinado por el modelo F__ANI__T3.MOD.

2

La Figura 8 que muestra que la ocupación del sitio y la posición del ciclo celular varía de forma similar con el tiempo de un cultivo. La Figura 9 muestra que quinidina bloquea las células en la fase de G0'G1 (con 67° en la fase G0'G1 y los resultados de aumento en el sitio de ocupación comparado con el control sin inhibidor del ciclo celular (54% en la fase G0/G1), y timidina provoca que en las células se acumulen en las fases S/G^{2} (con 33% en la fase G0/G1; y resulta en la disminución de la ocupación del sitio comparado con el control. Estos resultados confirmaron que los factores que incrementan la proporción de células en la fase G0/G1 incrementan la ocupación del sitio.

Ejemplo 4

Catión metal Divalente, precursor de azúcar de nucleótido, y adición de hormona en la producción de rht-PA Materiales y métodos

Todos los experimentos fueron hechos en placas de cultivo de 60 mm que usan el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 excepto que las sales Mn. Sal de Fe, precursor de azúcar de nucleotido, o hormona fue adicionado al medio de crecimiento durante la fase de crecimiento, con sales de Mn o Fe o adicionando precursor de azúcar de nucleotido en el día 1. Todas las placas fueron inoculadas a una densidad de semillas de 0,1% PCV y un volumen de trabajo 6-8 ml. Todos los casos fueron hechos por triplicados. Las placas fueron incubadas a 37ºC en incubadoras de CO_{2}.

Las cantidades de MnCl_{2} o citrato de férrico en el medio de crecimiento durante la fase de crecimiento fueron incrementados. Para MnCl_{2} 3 nM fue el control, con las cantidades crecientes de MnCl_{2} a las concentraciones de 10 nM, 100 nM, 1 \muM, 10 \muM y 100 \muM. Para citrato férrico, el control no era la sal, con cantidades crecientes en 10, 50, y 100 \muM.

Las cantidades de uridina, adenosina, y guanosina fueron 0,5 mM cada y la cantidad de manosa fue 5 g/l (guanosina y manosa fueron combinados), y GHT es un medio selectivo menos glicina, hipoxantina y timidina.

Las cantidades de tri-iodotironina y tirosina empleado en el medio de cultivo fueron incrementados en comparación con un control sin hormona, con las cantidades de 1 nM, 0 nM, o 100 nM tri-iodotironina, o tirosina 1 nM, 10 nM, o 100 nM.

La ocupación del sitio de t-PA fue analizado en 4-6 días (manganeso, hierro, o precursor de azúcar de nucleotido) o en el día 7 (hormonas) usando el método descrito en el Ejemplo 1.

Resultados

El efecto de aumento de la concentración de manganeso sobre la ocupación del sitio de t-PA (corridas triplicadas) se muestra en las figuras 10A y 10B. Suplementar el medio con manganeso adicional sobre el valor control de 3 nM significativamente incrementó el contenido de Tipo I de t-PA aproximadamente 2,5% (ocupación del sitio mejorado). Un efecto de utración seguro fue observado entre 3 nM y 100 nM. Mejora adicional ocurre cuando incrementa la concentración hasta 100 \muM la que es una concentración efectiva.

Oligosacariltransferasa requiere iones Mn^{2-} para la actividad máxima, pero otros cationes de metal divalente con una geometría de coordinación octaédrica, incluyendo Mg, Ca, y Fe soportará la transferencia, a pesar de reducir en proporción (Hendrickson e Imperiali, Supra, y Kaufman et al., Supra). Por lo tanto, el efecto de Fe^{2-} sobre la ocupación del sitio de t-PA fue investigado. Como es evidente la Figura 11, la adición de 10-100 \muM de Fe^{2-} (citrato férrico) incrementa la ocupación del sitio de t-PA gradualmente hasta aproximadamente 4%.

Incrementar la disponibilidad de precursores de azúcar de nucleotido (por ej. nucleosidos, manosa, glicina, timidina, o hipoxantina) no mejoró la ocupación del sitio. Además, la adición de uridina y guanosina reduce la ocupación del sitio de t-PA aproximadamente 2% (ver Figura 12).

El efecto de hormonas tiroides (tirosina y tri-iodotironina) sobre la ocupación del sitio t-PA se muestra en la Figuras 13A y 13B. Estas hormonas incrementaron la ocupación del sitio sobre un 2%, y se espera que otros componentes de plasma como se define arriba tendrán similar efecto.

Como conclusión, varias condiciones de cultivo han sido identificadas que afectan la ocupación del sitio de N-glicosilación de t-PA. Estos factores son potencialmente útiles para mejorar la consistencia del producto. La ocupación del sitio Asn-184 de t-PA es relativamente consistente a través de varias condiciones, incluyendo varias escalas (matraces T, matraces spinner, 80 litros, 400 litros, 2000 litros, y 12.000 litro), y de corrida en corrida en la producción. Los factores que incrementan la proporción de células en la fase de G0/G1, tal como la temperatura, butirato, y los inhibidores del ciclo celular, incrementan la ocupación del sitio, como hacen las cantidades de ciertos cationes de metal divalente y/o componentes de plasma preferentemente presentes durante el tiempo completo del cultivo.

La divulgación entera de todas las citas citadas a lo largo de las especificaciones, y las referencias citadas allí, están expresamente incluidas por referencia.

Aunque las referencias precedentes hagan referencia a las realizaciones presentes en particular, que no estan limitada en la presente invención serán comprendidas. Ocurre que algunos expertos en la técnica pueden hacer varias modificaciones sin que se desvíen del concepto total de la invención. Todas estas modificaciones se pretenden que estén dentro del alcance de la presente invención.

Claims (6)

1. Un proceso para producir el activador de tejido de plasminógeno humano (t-PA), que consta de un cultivo de células de ovario de hámster chinos que expresan dicho ácido nucleico que codifica para t-PA en medio libre de suero en la fase de producción a una temperatura entre 30ºC y 35ºC, en el que el proceso produce un aumento en la proporción de moléculas de t-PA tipo I para t-PA tipo II en comparación con un proceso idéntico efectuado a 37ºC.

2. El proceso de la reivindicación 1 en el que el medio en la fase de producción consta de hasta 2 mM de una sal de butirato y en el que el proceso produce un aumento en la proporción de moléculas t-PA del tipo I para t-PA del tipo II en comparación con un proceso idéntico efectuado en ausencia de butirato.

3. El proceso de la reivindicación 2 en el que la sal de butirato está presente en una concentración de 0,35 a 2 mM.

4. Un proceso para producir activador de tejido de plasminógeno humano (t-PA) que consta de un cultivo de células de ovario de hámster chinos que expresan dicho ácido nucleico que codifica para t-PA en un medio libre de suero en la fase de producción a temperatura de 37-40ºC, en el que dicho medio contiene desde 10 nM hasta 100 \muM de un catión de metal divalente que puede adoptar y preferir una configuración de geometría octaedríca; cultivando dichas células en la fase de transición a temperatura de 37-40ºC; y cultivando dicha células en una fase de producción en el que después de 48 horas dentro de una fase de producción en el que la temperatura es bajada entre 30°C y 35°C y 0,75 hasta 1.5 mM de sal de butirato es adicionada al medio, en el que el proceso produce un aumento en la proporción de moléculas t-PA del tipo I para t-PA tipo II en comparación con un proceso idéntico ejecutado a 37°C en la ausencia de butirato ó el catión.

5. El proceso de la reivindicación 4 en el que un componente de plasma o de inhibidor del ciclo celular que bloquea las células en la fase de G0/G1 que se añaden al medio de cultivo antes o durante la fase de crecimiento.

6. El proceso de reivindicación 5 en qué la tirosina tri-iodotironina, o quinidina se añada al medio de cultivo.