JP2020511516A - 組換え抗体断片の精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
バイオ医薬品の研究および開発における最近の傾向は、抗体断片の開発により集中している。多数のバイオシミラー治療用タンパク質がこれまでになく開発中であるが、バイオシミラー製品の開発における重大な課題は、下流工程の高いコスト、方法および製造物に関連する不純物の非選択的な除去、製造物のタンパク質分解などである。抗体断片は、全長モノクローナル抗体(mAb)治療剤と比べてある特定の利点、例えば、向上した腫瘍深部への侵入、全長mAbではアクセスできない特定のエピトープへの結合などの利点を提供する。Fabは、臨床開発に入った抗体断片候補の大部分を占め、3つが米国食品医薬品局により承認されている。上流工程における進歩、例えば、高力価クローンおよび連続的なバイオ製造は、バイオ医薬品産業の焦点を、全体的な下流工程経済の改善に移行させた。下流工程は、モノクローナル抗体治療剤の全製造コストの約60〜70%を占める。下流の捕捉、中間および最終精製工程は、様々なクロマトグラフィー操作の大規模な使用を伴う。
したがって、本発明の主な目的は、抗体断片を精製する方法を提供することである。
本発明は、組換え抗体断片の精製方法を提供する。
(i)濃縮したリフォールディングしたrHuラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィーに供し、20mM〜50mMのトリスHClおよび0mM〜150mMのNaClまたは20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜150mMのNaClを含む4.0〜10.0の範囲内のpHを有する緩衝液を用いて、4.0〜10.0の範囲内のpHを有する濃縮したリフォールディングしたrHuラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂にフィードし、rHuラニビズマブを捕捉し、かつ不純物を除去する工程;
(ii)20mM〜50mMのトリスHClおよび0mM〜1000mMの塩化ナトリウムまたは20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜1000mMのNaClを含む4.0〜10.0の範囲内のpHを有する溶出緩衝液の存在下で、rHuラニビズマブを溶出プール中に溶出させる工程、
ここで、精製されたラニビズマブが、5%未満のフォールディングしていないまたはミスフォールディングした形態のラニビズマブおよび2%未満の凝集形態のラニビズマブを有する;
(iii)20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜150mMのNaClを含む4.0〜6.5の範囲内のpHを有する緩衝液を用いて、4.5〜6.5の範囲内のpHを有する工程(ii)から得たrHuラニビズマブを、マルチモードクロマトグラフィー樹脂にフィードし、rHuラニビズマブを捕捉し、不純物をさらに除去する工程;
(iv)20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜1000mMのNaClを含む4.0〜6.5の範囲内のpHを有する溶出緩衝液の存在下でrHuラニビズマブを溶出する工程、
ここで、精製されたrHuラニビズマブが、0.1%未満のフォールディングしていないまたはミスフォールディングした形態のrHuラニビズマブおよび0.3%未満の凝集形態のrHuラニビズマブを有する;
を含む、マルチモードクロマトグラフィー精製を提供する。
これから、本発明をいくつかの好ましい任意の態様と結び付けて詳細に説明し、それにより、その様々な側面は、より充分に理解され、および認識されるであろう。
便宜上、本発明のさらなる説明の前に、本明細書、実施例および特許請求の範囲において用いられるいくつかの用語をここにまとめる。
(i)可溶化緩衝液を使用して組換え宿主細胞から得られた抗体断片を含有する封入体を可溶化し、可溶化した抗体断片を得ること;
(ii)リフォールディング緩衝液を使用して可溶化した抗体断片をリフォールディングし、リフォールディングした抗体断片を得ること;
(iii)限外濾過によりリフォールディングした抗体断片を濃縮し、濃縮した抗体断片を得ること;ならびに
(iv)濃縮した抗体断片を逐次的なマルチモードクロマトグラフィー精製に供して、製造物に関連する不純物、すなわち、宿主細胞のタンパク質、および宿主細胞の核酸を除去した後に、ダイアフィルトレーションおよび限外濾過を行って、精製されたrHu抗体断片を得ること
を含む。
(a)組換え宿主細胞からのrHuラニビズマブの軽鎖および重鎖を含有する封入体を可溶化し、可溶化したrHuラニビズマブを得ること;
(b)可溶化したrHuラニビズマブをリフォールディングし、リフォールディングしたrHuラニビズマブを得ること;
(c)限外濾過によりリフォールディングしたrHuラニビズマブを濃縮し、濃縮したリフォールディングしたラニビズマブを得ること;
(d)濃縮したリフォールディングしたrHuラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィーに供することであって、前記クロマトグラフィー工程が、
(i)20mM〜50mMのトリスHClおよび0mM〜150mMのNaClまたは20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜150mMのNaClを含む、4.0〜10.0の範囲内のpHを有する緩衝液を用いて、4.0〜10.0の範囲内のpHを有する工程(c)の濃縮したリフォールディングしたrHuラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂にフィードし、rHuラニビズマブを捕捉し、かつ不純物を除去すること;
(ii)20mM〜50mMのトリスHClおよび0mM〜1000mMの塩化ナトリウムまたは20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜1000mMのNaClを含む4.0〜10.0の範囲内のpHを有する溶出緩衝液の存在下で、rHuラニビズマブを溶出プール中に溶出させること、
ここで、精製されたラニビズマブが、5%未満のフォールディングしていないまたはミスフォールディングした形態のラニビズマブおよび2%未満の凝集形態のラニビズマブを有し;
(iii)20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜150mMのNaClを含む4.0〜6.5の範囲内のpHを有する緩衝液を用いて、4.5〜6.5の範囲内のpHを有する工程(ii)からのrHuラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂にフィードし、rHuラニビズマブを捕捉し、かつ不純物をさらに除去すること;
(iv)20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜1000mMのNaClを含む4.0〜6.5の範囲内のpHを有する溶出緩衝液の存在下でrHuラニビズマブを溶出させること、
ここで、精製されたrHuラニビズマブが、0.1%未満のフォールディングしていないまたはミスフォールディングした形態のrHuラニビズマブ、および0.3%未満の凝集形態のrHuラニビズマブを有する;
を含む、組換え宿主細胞からの組換えヒト化(rHu)ラニビズマブの抗体断片の精製方法を提供する。
第I相において利用されるマルチモードクロマトグラフィーモードは、結合溶出クロマトグラフィーモードまたはフロースルーモードから選択される。マルチモードクロマトグラフィー樹脂Iは、HEA Hypercel、PPA Hypercel、およびBAKERBOND(商標) XWP 500 Poly PEI−35またはCapto adhere樹脂からなる群から選択される。
(i)20mM〜50mMのトリスHClおよび0mM〜150mMのNaClを含む、8.0〜10.0の範囲内のpHを有する緩衝液を用いて、濃縮したリフォールディングしたrHuラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂Iに結合させ、rHuラニビズマブを捕捉し、かつ不純物を除去すること;
(ii)20mM〜50mMのトリスHClおよび0mM〜1000mMの塩化ナトリウムを含む、8.0〜10.0の範囲内のpHを有する溶出緩衝液の存在下でrHuラニビズマブを溶出プール中に溶出させること
を含む、クロマトグラフィーの結合溶出モードを伴うマルチモードクロマトグラフィー第I相を提供する。
(i)20mM〜50mMのトリス−HCl、および
(ii)0mM〜150mMの塩化ナトリウム
を含み、
8.0〜10.0の範囲内のpHを有する、rHuラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂Iに結合させるために使用される結合緩衝液を提供する。
(i)20mM〜50mMのトリス−HCl、および
(ii)0mM〜1000mMの塩化ナトリウム
を含み、
8.0〜10.0の範囲内のpHを有する、rHuラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂Iから溶出プール中に溶出させるために使用される溶出緩衝液を提供する。
(i)濃縮したリフォールディングしたrHuラニビズマブを、20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜150mMのNaClを含む、4.0〜6.5の範囲内のpHを有する緩衝液を用い、6.0mS/cm〜12mS/cmの範囲内のインプット電導度でマルチモードクロマトグラフィー樹脂Iにフィードし、rHuラニビズマブを捕捉し、かつ不純物を除去すること;ならびに
(ii)20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜1000mMの塩化ナトリウムを含む、4.0〜6.5の範囲内のpHを有する溶出緩衝液の存在下で、不純物を溶出プール中に溶出させること;
を含む、クロマトグラフィーのフロースルーモードを伴うマルチモードクロマトグラフィー第I相を提供する。
rHuラニビズマブを捕捉し、かつ不純物をさらに除去するために、マルチモードクロマトグラフィー第I相の溶出液から得られたrHuラニビズマブを4.5〜6.5の範囲内のpHに調整し、20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜150mMのNaClを含む4.0〜6.5の範囲内のpHを有する緩衝液を用いて、マルチモードクロマトグラフィー樹脂IIにフィードする。
(i)4.5〜6.5の範囲内のpHを有し、6.0mS/cm〜12mS/cmの範囲内のインプット電導度を有するマルチモードクロマトグラフィー第I相の溶出プールから得られたrHuラニビズマブを、20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜150mMのNaClを含む、4.0〜6.5の範囲内のpHを有する緩衝液を用いて、マルチモードクロマトグラフィー樹脂IIにフィードし、rHuラニビズマブを捕捉し、かつ不純物をさらに除去すること;
(ii)20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜1000mMのNaClを含む、4.0〜6.5の範囲内のpHを有する溶出緩衝液の存在下でrHuラニビズマブを溶出させること
を含む。
(i)8.0〜10.0の範囲内のpHを有するマルチモードクロマトグラフィー第I相の溶出プールから得られたrHuラニビズマブを、20mM〜50mMのトリス−HClおよび0mM〜150mMのNaClを含む、8.0〜10.0の範囲内のpHを有する緩衝液を用いて、マルチモードクロマトグラフィー樹脂IIにフィードし、rHuラニビズマブを捕捉し、かつ不純物をさらに除去すること;ならびに
(ii)20mM〜50mMのトリス−HClおよび0mM〜1000mMのNaClを含む、8.0〜10.0の範囲内のpHを有する溶出緩衝液の存在下でrHuラニビズマブを溶出させること
を含む。
(i)20mM〜50mMのアセテート、および
(ii)0mM〜150mMの塩化ナトリウム
を含み、
4.0〜6.0の範囲内のpHを有する、rHuラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂IIに結合させるために使用される結合緩衝液を提供する。
(i)20mM〜50mMのトリス−HCl、および
(ii)0mM〜1000mMの塩化ナトリウム
を含み、
4.0〜6.0の範囲内のpHを有する、rHuラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂IIから溶出プール中に溶出させるために使用される溶出緩衝液を提供する。
(i)封入体の形態で組換え宿主細胞からrHuラニビズマブを得ること;
(ii)可溶化緩衝液を使用して封入体を可溶化し、可溶化したrHuラニビズマブを得ること;
(iii)リフォールディング緩衝液を使用して可溶化したrHuラニビズマブをリフォールディングし、リフォールディングしたrHuラニビズマブを得ること;
(iv)限外濾過によりリフォールディングしたrHuラニビズマブを濃縮し、濃縮したrHuラニビズマブを得ること;
(v)濃縮したrHuラニビズマブを一連のマルチモードクロマトグラフィー精製工程に供し、製造物に関連する不純物、宿主細胞のタンパク質、および宿主細胞核酸を除去し、かつ精製されたrHuラニビズマブを得ること
を含む、精製方法により得られるラニビズマブを含む医薬組成物を提供する。
以下の実施例は、例による説明のためにのみ行うもので、したがって、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
(i)封入体の可溶化
本発明では、大腸菌中で発現させた組換えヒトラニビズマブを使用した。最初に、pH9.0の0.1Mのトリス、2mMのEDTAおよび変性剤として6Mのグアニジン塩酸を含有する40mlの可溶化緩衝液中で、0.8gの封入体を30分間可溶化した。マグネチック攪拌機を用い、25℃で30分間、封入体を可溶化した。可溶化後、IBを7000rpmで10分間遠心分離し、孔径1.0μmの濾紙を使用して濾過した。可溶化緩衝液中の0.5Mのジチオトレイトール(DTT)の濃度が5.0mMとなるように還元剤としてDTTを加えた。還元のために、25℃で30分間、溶液を撹拌し続けた。10.0mMの酸化グルタチオンを加えることにより、可溶性かつ還元された封入体溶液を3時間、酸化し続けた。
0.1Mのトリス、0.6Mのアルギニン、5.0%のソルビトールおよび2MMのEDTA、0.60mMのシスチンおよび0.75mMのシステインを含むpH9.0の960mLのリフォールディング緩衝液に、約40mLの可溶化、還元および酸化された封入体溶液を加えた。リフォールディング処理を10±2℃で120時間、50rpmで実行した。
リフォールディングしたラニビズマブタンパク質を5kDa Ultrasette(商標)Lab Tangential Flow Filtrationデバイスを使用する限外濾過により濃縮した。継続したダイアフィルトレーション操作を使用して、濃縮タンパク質の緩衝液をpH9.0の20mMのトリスに交換した。次いで、緩衝液を交換した試料をマルチモードクロマトグラフィーのインプットとして使用した。
マルチモードクロマトグラフィーIをpolyPEI−35樹脂を用いて行った。濃縮したリフォールディングしたラニビズマブのpHを9.0に調整し、フィード材料として使用した。リフォールディングしたrHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH9.0の20mMのトリス、続いて、1MのNaClを含有するpH9.0の20mMのトリスによる3CVの塩勾配で実行した。そのような条件下では、タンパク質はフロースルー中に観察されなかった。溶出ピークのRP−HPLC分析により、精製されたラニビズマブが溶出ピークIに観察されたことが確認された(純度38.79%)(図2)。溶出ピークIIは、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)ならびに処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)を含有する。図2において、マルチモードクロマトグラフィーの溶出ピーク1は、精製されたrHuラニビズマブを含有し、これは、図9のSDS PAGEのレーン番号3において48kDaで特徴付けられた。
マルチモードクロマトグラフィーIIをpolyCSX−35樹脂を使用して行った。rHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH5.50の10mMの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーIの溶出プールを、マルチモードクロマトグラフィーIIのフィード材料として使用した。フィード材料のpHを氷酢酸を用いてpH5.50に調整した。1MのNaClを含有するpH5.50の10mMの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。10%勾配での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なラニビズマブを45%の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのRP−HPLC分析により、処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)はフロースルーおよび溶出ピークI中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークII中に観察され(純度99.50%)、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)は溶出ピークIII中に観察されたことが確認された(図3)。製造物の品質をSDS PAGE分析を使用して検証し、標準的なラニビズマブの品質と良好に一致していた。(図7のレーン番号1、48kDa)
rHuラニビズマブのリフォールディングおよびその前処理
(i)封入体の可溶化
大腸菌中で発現された組換えヒトラニビズマブを含む0.4gのIBを、pH9.0の0.1Mのトリス、2.0mMのEDTAおよび変性剤として6.0Mのグアニジン塩酸を含有する20mLの可溶化緩衝液中に30分間溶解した。さらなる処理は、例1(i)の方法のとおりに行った。
リフォールディングは、例1(ii)に開示される方法にしたがって行った。
(iii)リフォールディングしたrHuラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーション
リフォールディングしたrHuラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーションは、例1(iii)に開示される方法のとおりに行った。
マルチモードクロマトグラフィーIをpolyPEI−35樹脂を用いて行った。濃縮したリフォールディングしたラニビズマブのpHを10.0に調整し、フィード材料として使用した。リフォールディングしたrHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH10.0の20.0mMのトリス、続いて、1.0MのNaClを含有するpH10.0の20.0mMのトリスによる5.0CVの塩勾配で実行した。タンパク質はフロースルー中に観察されなかった。溶出ピークのRP−HPLC分析により、精製されたラニビズマブが溶出ピークIに観察されたことが確認された(純度37.97%)。溶出ピークIIは、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)ならびに処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)を含有する。
マルチモードクロマトグラフィーIIをpolyCSX−35樹脂を使用して行った。rHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH5.5の10.0mMの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーIの溶出プールを、マルチモードクロマトグラフィーIIのフィード材料として使用した。フィード材料のpHを氷酢酸を用いてpH5.5に調整した。1.0MのNaClを含有するpH5.5の10mMの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。10%勾配での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なラニビズマブを45%の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのRP−HPLC分析により、処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)はフロースルーおよび溶出ピークI中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークII中に観察され(純度99.50%)(図3)、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)は溶出ピークIII中に観察されたことが確認された。
rHuラニビズマブのリフォールディングおよび前処理:
(i)封入体の可溶化
大腸菌中で発現された組換えヒトラニビズマブをこの研究において使用した。0.267gの封入体(IB)を13.3mLの可溶化緩衝液中に溶解させた。さらなる処理は、例1(i)において行った方法のとおりである。
(ii)可溶化した封入体のリフォールディング
13.3mLの可溶化、還元および酸化された封入体を986.7mLのリフォールディング緩衝液中に加え、その方法を例1(ii)のとおりに行った。
リフォールディングしたラニビズマブタンパク質を5kDa Ultrasette(商標)Lab Tangential Flow Filtrationデバイスを使用する限外濾過により濃縮した。継続したダイアフィルトレーション操作を使用して、濃縮タンパク質の緩衝液をpH8.0の20mMのトリスに交換した。次いで、緩衝液を交換した試料をマルチモードクロマトグラフィーのインプットとして使用した。
マルチモードクロマトグラフィーIをpolyPEI−35樹脂を用いて行った。濃縮したリフォールディングしたラニビズマブのpHを8.0に調整し、フィード材料として使用した。リフォールディングしたrHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH8.0の20.0mMのトリス、続いて、1.0MのNaClを含有するpH8.0の20.0mMのトリスによる5.0CVの塩勾配で実行した。そのような条件下では、リフォールディングしたrHuラニビズマブがフロースルー中に観察された。フロースルーのRP−HPLC分析により、精製されたラニビズマブがフロースルー中に観察されたことが確認された(純度31.24%)。溶出ピークIおよび溶出ピークIIは、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)ならびに処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)をそれぞれ含有する。
マルチモードクロマトグラフィーIIをpolyCSX−35樹脂を使用して行った。rHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH5.5の10.0mMの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーIのフロースルーを、マルチモードクロマトグラフィーIIのフィード材料として使用した。フィード材料のpHを氷酢酸を用いてpH5.5に調整した。1.0MのNaClを含有するpH5.5の10.0mMの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。10%勾配での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なラニビズマブを45%の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのRP−HPLC分析により、処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)はフロースルーおよび溶出ピークI中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークII中に観察され(純度99.50%)、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)は溶出ピークIII中に観察されたことが確認された。
(i)封入体の可溶化
可溶化を例2(i)の方法のとおりに行った。
(ii)可溶化した封入体のリフォールディング
リフォールディングを例2(ii)の方法のとおりに行った。
(iii)リフォールディングしたrHuラニビズマブの限外濾過
リフォールディングしたラニビズマブタンパク質を5kDa Ultrasette(商標)Lab Tangential Flow Filtrationデバイスを使用する限外濾過により濃縮させた。次いで、濃縮したタンパク質試料をマルチモードクロマトグラフィーIのインプットとして使用した。
マルチモードクロマトグラフィーIをpolyPEI−35樹脂を用いフロースルーモードで行った。濃縮したリフォールディングしたラニビズマブのpHを9.0に調整し、電導度を6.0mS/cmに調整し、フィード材料として使用した。フロースルー中のリフォールディングしたrHuラニビズマブを捕捉する実験は、不純物を除去するために、平衡緩衝液としてpH9.0の20.0mMのトリス、続いて、1.0MのNaClを含有するpH9.0の20.0mMのトリスによる5.0CVの塩勾配で実行した。この実験条件下では、リフォールディングしたrHuラニビズマブがフロースルー中に観察された。フロースルーのRP−HPLC分析により、精製されたラニビズマブがフロースルー中に観察されたことが確認された(純度29.69%。溶出ピークIおよび溶出ピークIIは、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)ならびに処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)を含有する。図4は、rHuラニビズマブの精製のために行ったマルチモードクロマトグラフィーIのクロマトグラムを示す。
マルチモードクロマトグラフィーIIをpolyCSX−35樹脂を使用して行った。rHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH5.50の10.0mMの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーIの溶出プールをマルチモードクロマトグラフィーIIのためのフィード材料として使用した。フィード材料のpHを氷酢酸を用いてpH5.5に調整した。1MのNaClを含有するpH5.5の10.0mMの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。10.0%の勾配中での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なラニビズマブを45.0%の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのRP−HPLC分析により、処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)はフロースルーおよび溶出ピークI中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークII中に観察され(純度99.50%)、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)は溶出ピークIII中に観察されたことが確認された。
(i)封入体の可溶化
封入体の可溶化を例2(i)の方法のとおりに行った。
(ii)可溶化した封入体のリフォールディング
リフォールディングを例2(ii)の方法のとおりに行った。
(iii)リフォールディングしたrHuラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーション
リフォールディングしたrHuラニビズマブの限外濾過を例4(iii)の方法のとおりに行った。
マルチモードクロマトグラフィーIをpolyPEI−35樹脂を用いフロースルーモードで行った。濃縮したリフォールディングしたラニビズマブのpHを9.0に調整し、電導度を12.0mS/cmに調整し、フィード材料として使用した。フロースルー中のリフォールディングしたrHuラニビズマブを捕捉する実験は、不純物を除去するために、平衡緩衝液としてpH9.0の20.0mMのトリス、続いて、1.0MのNaClを含有するpH9.0の20.0mMのトリスによる5.0CVの塩勾配で実行した。この実験条件下で、リフォールディングしたrHuラニビズマブがフロースルー中に観察された。フロースルーのRP−HPLC分析により、精製されたラニビズマブがフロースルー中に観察されたことが確認された(純度33.12%)(図5)。溶出ピークIおよび溶出ピークIIは、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)ならびに処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)を含有する。図5は、rHuラニビズマブの精製のために行ったマルチモードクロマトグラフィーIのクロマトグラムを示す。
マルチモードクロマトグラフィーIIをpolyCSX−35樹脂を使用して行った。rHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH5.5の10.0mMの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーIの溶出プールをマルチモードクロマトグラフィーIIのためのフィード材料として使用した。フィード材料のpHを氷酢酸を用いてpH5.5に調整した。1.0MのNaClを含有するpH5.5の10mMの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。10.0%勾配での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なラニビズマブを45.0%の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのRP−HPLC分析により、処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)はフロースルーおよび溶出ピークI中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークII中に観察され(純度99.50%)、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)は溶出ピークIII中に観察されたことが確認された。
(i)封入体の可溶化
可溶化工程を例1(i)の処理のとおりに行った。
(ii)可溶化した封入体のリフォールディング
リフォールディング工程を例1(ii)の方法のとおりに行った。
(iii)リフォールディングしたrHuラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーション
リフォールディングしたラニビズマブタンパク質を5kDa Ultrasette(商標)Lab Tangential Flow Filtrationデバイスを使用する限外濾過により濃縮させた。次いで、濃縮したタンパク質試料のpHを氷酢酸を用いpH5.5に調整した。濃縮したリフォールディングしたタンパク質試料の電導度を10.0mS/cmに調整した。宿主細胞のタンパク質をpH5.5で沈殿させた。沈殿した宿主細胞のタンパク質を、8000rpmでの15分間の遠心分離により除去し、その後、リフォールディングしたタンパク質の上清をマルチモードクロマトグラフィーIIのインプットとして使用した。
マルチモードクロマトグラフィーIIをpolyCSX−35樹脂を使用して行った。rHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH5.50の10.0mMの酢酸緩衝液を使用して実行した。1.0MのNaClを含有するpH5.5の10.0mMの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。10%勾配での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なラニビズマブを45%の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのRP−HPLC分析により、処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)はフロースルーおよび溶出ピークI中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークII中に観察され、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)は溶出ピークIII中に観察されたことが確認された。
マルチモードクロマトグラフィーIをpolyPEI−35樹脂を用いフロースルーモードで行った。マルチモードクロマトグラフィーIIのアウトプットのpHをpH9.0に調整した。フロースルー中のリフォールディングしたrHuラニビズマブを捕捉する実験は、不純物を除去するために、平衡緩衝液としてpH9.0の20.0mMのトリス、続いて、1.0MのNaClを含有するpH9.0の20.0mMのトリスを用いる5CVの塩勾配で実行した。この実験条件下で、リフォールディングしたrHuラニビズマブがフロースルー中に観察された。フロースルーのRP−HPLC分析により、精製されたラニビズマブはフロースルー中に観察されたことが確認された。溶出ピークIおよび溶出ピークIIは、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)ならびに処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)を含有する。
インビボでのrHuラニビズマブの可溶性発現および前処理:
(i)突然変異型大腸菌中での可溶性rHuラニビズマブの発現
発現した組換えヒトラニビズマブを含む大腸菌細胞を回収し、1:10(w/v)の細胞ペレット:緩衝液の比で、溶解緩衝液(20.0mMのトリス、0.1mMのEDTA、pH9.0)中に再懸濁した。細胞溶解は、高圧ホモジナイザーを使用し、15000barで20分間行った。細胞溶解液の上清を得るために、細胞溶解液を4℃で30分間10000rpmにおいて遠心分離した。
連続的なダイアフィルトレーション操作を使用して、可溶性rHuラニビズマブの緩衝液をpH9.0の20.0mMのトリスに交換した。緩衝液を交換した試料をマルチモードクロマトグラフィーのためのインプットとして使用した。
マルチモードクロマトグラフィーをpolyPEI−35樹脂を用いて行った。濃縮した可溶性rHuラニビズマブのpHを9.0に調整し、フィード材料として使用した。可溶性rHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH9.0の20.0mMのトリス、続いて、1.0MのNaClを含有するpH9.0の20.0mMのトリスによる5.0CVの塩勾配で実行した。この実験条件下では、タンパク質はフロースルー中に観察されなかった。溶出ピークのRP−HPLC分析により、精製されたラニビズマブは溶出ピークI中に観察されたことが確認された(純度38.79%)。溶出ピークIIは、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)ならびに処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)を含有する。
マルチモードクロマトグラフィーIIをpolyCSX−35樹脂を使用して行った。rHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH5.50の10.0mMの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーIの溶出プールを、マルチモードクロマトグラフィーIIのフィード材料として使用した。フィード材料のpHを氷酢酸を用いてpH5.50に調整した。1.0MのNaClを含有するpH5.50の10.0mMの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で、溶出を行った。10.0%塩勾配での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なrHuラニビズマブを45.0%の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのRP−HPLC分析により、処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)はフロースルーおよび溶出ピークI中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークII中に観察され(図3)、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)は溶出ピークIII中に観察されたことが確認された。製造物の品質をSDS PAGE分析を使用して検証し、標準的なラニビズマブの品質と良好に一致していた。(図10のレーン番号3、48kDa)
(i)封入体の可溶化
可溶化を例1(i)のとおりに行った。
(ii)可溶化した封入体のリフォールディング
リフォールディングを例1(ii)のとおりに行った。
(iii)リフォールディングしたrHuラニビズマブの限外濾過およびダイアフィルトレーション
濾過を例1(iii)のとおりに行った。
(iv)マルチモードクロマトグラフィーI
マルチモードクロマトグラフィーIをCapto adhere樹脂を用いて行った。濃縮したリフォールディングしたラニビズマブのpHを9.0に調整し、フィード材料として使用した。リフォールディングしたrHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH9.0の20.0mMのトリス、続いて、1.0MのNaClを含有するpH9.0の20.0mMのトリスを用いる5.0CVの塩勾配で実行した。この実験条件下では、タンパク質はフロースルー中に観察されなかった。溶出ピークのRP−HPLC分析により、精製されたラニビズマブは溶出ピークI中に観察されたことが確認された(純度38.79%)。溶出ピークIIは、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)ならびに処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)を含有する。
マルチモードクロマトグラフィーIIをCapto MMC樹脂を使用して行った。rHuラニビズマブを捕捉する実験は、平衡緩衝液としてpH5.50の10.0mMの酢酸緩衝液を使用して実行した。マルチモードクロマトグラフィーIの溶出プールを、マルチモードクロマトグラフィーIIのためのフィード材料として使用した。フィード材料のpHを氷酢酸を用いてpH5.50に調整した。1.0MのNaClを含有するpH5.50の10mMの酢酸緩衝液による塩ベースの段階勾配で溶出を行った。10.0%の塩勾配中での処理に関連する不純物の選択的な除去の後、純粋なrHuラニビズマブを45.0%の溶出段階勾配で溶出させた。これらのピークのRP−HPLC分析により、処理に関連する不純物(宿主細胞のタンパク質および核酸)はフロースルーおよび溶出ピークI中に観察された一方、精製されたラニビズマブは溶出ピークII中に観察され、製造物に関連する不純物(ミスフォールディングしたおよびフォールディングしていないラニビズマブ)は溶出ピークIII中に観察されたことが確認された。
(i)ラニビズマブ試料のA280での吸光度測定
280nmにおけるUV吸光度測定を使用して、リフォールディングし、クロマトグラフィーのアウトプット中に存在する総タンパク質を決定した。Nanodrop 2000とUV−1800 Shimadzu UV可視分光光度計を使用して、全ての回収画分を280nmで読み取った。
総タンパク質推定のために使用したオルソゴナルな技術は、Nanodrop 2000を使用した595nmにおけるブラッドフォードアッセイであった。5μlの試料を250μlのブラッドフォード試薬に加えた後、シェーカーで30秒間混合を行った。混合後、試料を色素の存在下で25分間インキュベートし、595nmの吸光度を測定した。
Agilent 1260 HPLCシステムにおいて4.6mm×150mmのAeris(商標)3.6um WIDEPORE XB C18カラムを使用して、様々なクロマトグラフィーのアウトプット中のrHuラニビズマブの濃度を決定した(図11)。移動相は、水中の0.1%(v/v)のTFA(溶媒A)および水中の0.1%(v/v)のTFA、70%(v/v)のアセトニトリル、20%(v/v)のイソプロパノール(溶媒B)からなるものであった。214nmの波長においてBに対するAの直線勾配を使用して流速を1ml/分に維持した。本発明の方法により得られた図11(b)の精製されたリフォールディングしたラニビズマブについて、ピーク(保持時間:28.1分)は、標準的なラニビズマブについて図11(a)において得られたピークに類似する。
濃縮ゲルは定電圧120V、分離ゲルは定電圧100V条件で、非還元(図7)および還元(図8)条件下において、12%(厚さ1mm)の分離ゲルを使用して、ラニビズマブについての方法および製造物に関連する不純物の同定のためのSDS PAGE分析を実行した。ゲルに試料を流す前に、各試料を開始緩衝液中で10分間煮沸した。ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動分離後、4:1:5(水:氷酢酸:メタノール)中の0.05%(w/v)のクマシーブリリアントブルーG−250をタンパク質の検出に使用した。図7におけるゲルの解析は、精製されたリフォールディングしたタンパク質についてレーン1では48kDaのタンパク質のバンドの存在を示し、それにより、rHuラニビズマブの存在が確認される。図8における還元ゲルの結果は、ラニビズマブの軽鎖および重鎖の存在を示す。図7および図8は、標準的なラニミズマブとのバイオシミラリティーを示す。
免疫酵素アッセイ(Alpha diagnostic international社, USAのヒト用のルセンティス/ラニミビズマブ、抗VEGF ELISA キット)。精製されたリフォールディングしたラニビズマブを含有する試料を、プレート上に被覆したVEGF抗原と反応させた。結合したラニビズマブを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)酵素標識抗ヒトIgGで検出した。免疫学的反応は、固相VEGF結合抗体−ラニビズマブ酵素標識抗体のサンドイッチ複合体の形成をもたらす。未結合の反応物を除去するために、マイクロタイターストリップを洗浄した。次いで、基質テトラメチルベンジジン(TMB)を反応させる。加水分解された基質の量を、450nmにおいてマイクロタイタープレートリーダーで読み取り、この量は存在するラニビズマブの濃度に直接的に比例する。
陰イオン交換クロマトグラフィーのフロースルー中の宿主細胞のタンパク質による汚染を二部位免疫酵素アッセイ(Cygnus E.coli HCP分析キットF410)を使用して分析した。アフィニティー精製した捕捉抗大腸菌抗体をコーティングしたマイクロタイターストリップ中で、大腸菌HCPを含有する試料をホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)酵素標識した抗大腸菌抗体と同時に反応させた。免疫学的反応は、固相抗体−HCP−酵素標識抗体のサンドイッチ複合体の形成をもたらす。未結合の反応物を除去するために、マイクロタイターストリップを洗浄した。次いで、基質テトラメチルベンジジン(TMB)を反応させた。加水分解された基質の量を、450nmにおいてマイクロタイタープレートリーダーで読み取り、この量は存在する大腸菌HCPの濃度に直接的に比例する。
様々なアウトプット中の凝集物含有量を、Yarra(商標)3um SEC−2000(300×7.8mm ID)カラムを使用して行ったSEC−HPLC分析を使用して決定した(図12)。移動相は、pH5.50における50mMの塩化ナトリウム緩衝剤を含む20mMの酢酸緩衝液からなる。分析をイソクラティックモードで0.5ml/分の流速を用いて25℃において行った。タンパク質の検出は、フォトダイオードアレイ検出器を使用して280nmにおいて行った。
アウトプット試料中のDNAの存在をQuant−iT(商標)ピコグリーンアッセイ(Invitrogen BioServices India Private Limited社、インド)を使用して推定した。標準曲線を二本鎖λDNAを使用して作製した。0.5mlのアウトプット試料を0.5mlの希釈したQuant−iT(商標) dsDNA BR試薬に加え、反応混合物を5分間インキュベートした。5分後、蛍光分光光度計(励起波長480nmおよび蛍光波長520nm)を使用して蛍光を測定した。
標準的なおよび精製されたrHuラニビズマブをシナピン酸マトリックスと1:1の比で混合してMALDI−TOF分析を行った。マトリックスシナピン酸(10mg/ml)は、高純度の水中の30%v/vのアセトニトリル、0.1%v/vのTFA中で調製した。試料とマトリックスとの1μlのホモジナイズ混合物を清浄な384ウェルMALDIプレート上に置いた。プレートをAB SCIEX TOF/TOF(商標)5800機器に挿入した。機器をポジティブイオンモードにおいて使用した。イオン化源として337nmの窒素レーザーを用いた。4000〜5000のレーザー強度を試料の分析のために使用した。結果の解析はProteinPilot(商標)ソフトウェアを使用して行った(図13)。図13は、開発した精製プラットフォームを使用して得られた精製されたrHuラニビズマブと標準的なラニビズマブ分子とのインタクト質量の比較を示す。
SDS−PAGE分析からのクマシー染色タンパク質バンドをガラスプレート上でメスを用いて切断し、小片に切り刻んだ。100mMのNH4HCO3を用いてゲル片を洗浄し、200μlの50%のアセトニトリルおよび50%の50mMのNH4HCO3を加えて留置し、ボルテックスし、10分間インキュベートした。液体を除去し、ゲル片を脱水するために、100%のアセトニトリルで再び洗浄した。アセトニトリルを除去し、ドラフトチャンバー中で10分間空気乾燥した。還元およびアルキル化のために、56℃で100mMのNH4HCO3中の50μl、10mMのDTTで45〜60分間ゲル片を覆った。DTT溶液を除去し、100mMのNH4HCO3中の50μlの55mMのヨードアセトアミドを加え、暗所・室温で45分間インキュベートした。ヨードアセトアミドを除去した。100μlの100mMのNH4HCO3を用いた後、ボルテックスと共に5分間50%のアセトニトリル+50%の50mMのNH4HCO3で5分間ボルテックスを2回行い、ゲル片を洗浄した。上記のように100μlのアセトニトリルを用いてゲルを脱水した。残った液体を除去し、speedvacを用いて乾燥させた。トリプシン消化のために、ゲル片をちょうど覆うまで20μlのトリプシン(12.5ng/μl)溶液を加えた。50mMのNH4HCO3およびトリプシンを含有する緩衝液中に、4℃で30分間ゲル片を再水和させた。ゲル片を37℃で終夜消化した。ペプチド抽出のために消化された上清を清浄な1.5mLのエッペンドルフチューブに移した。30μLの50%のアセトニトリルおよび2%のギ酸をゲル片に加え、20分間インキュベートした。ペプチド溶液を水浴中で加熱することなく5分間超音波処理した。上清を除去し、初期消化溶液と合わせた。次いで、speedvac濃縮装置でペプチド溶液を乾燥させた。ペプチド試料を高純水中の3.0%v/vのアセトニトリル、0.1%v/vのギ酸中に再構成させた。4μLの試料(2.5μg)をAgilent ZORBAX RRHD 300SB−C18、0.3×100mm、3μmカラムに流し、Q Exactive Orbitrap LC−MS/MSシステムにより分析した。
・既存の製造方法と比べて生産性のほぼ2倍の向上が、rHuラニビズマブの下流工程にマルチモードクロマトグラフィー精製工程を組み合わせることにより得られた。
・直交分析試験により、本発明を使用して得られた精製された薬物と標準的なラニミズマブとの間の分析学的同等性/同質性が確立された。
・開発された精製プラットフォームは、インビトロでリフォールディングした抗体断片と可溶性発現された抗体断片の両者に適用可能である。
Claims (10)
- 組換え宿主細胞において封入体または可溶性形態のいずれかとして発現された組換えヒト化(rHu)ラニビズマブの抗体断片を精製する方法であって、前記方法は以下の(a)〜(d)の工程を含む方法。
(a)組換え宿主細胞からのrHuラニビズマブの軽鎖および重鎖を含有する封入体を可溶化して、可溶化したrHuラニビズマブを得ること;
(b)工程(a)の可溶化したrHuラニビズマブをリフォールディングし、リフォールディングしたrHuラニビズマブを得ること;
(c)限外濾過により工程(b)のリフォールディングしたrHuラニビズマブを濃縮し、濃縮したリフォールディングしたラニビズマブを得ること;
(d)工程(c)の濃縮したリフォールディングした/可溶性形態のrHuラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィーに供することであって、前記クロマトグラフィー工程は以下の(i)〜(iv)の工程を含む;
(i)20mM〜50mMのトリスHClおよび0mM〜150mMのNaClまたは20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜150mMのNaClを含む4.0〜10.0の範囲内のpHを有する緩衝液を用いて、4.0〜10.0の範囲内のpHを有する工程(c)の濃縮したリフォールディングしたrHuラニビズマブをマルチモードクロマトグラフィー樹脂にフィードし、rHuラニビズマブを捕捉し、かつ、不純物を除去すること、
(ii)20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜1000mMの塩化ナトリウムまたは20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜1000mMの塩化ナトリウムを含む4.0〜10.0の範囲内のpHを有する溶出緩衝液の存在下で、rHuラニビズマブを溶出プール中に溶出すること;
ここで、精製されたラニビズマブは、5%未満のフォールディングしていないまたはミスフォールディングした形態のラニビズマブ、および2%未満の凝集形態のラニビズマブを有する;
(iii)20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜150mMのNaClを含む4.0〜6.5の範囲内のpHを有する緩衝液を用いて、4.5〜6.5の範囲内のpHを有する工程(ii)の溶出プールからのrHuラニビズマブを、マルチモードクロマトグラフィー樹脂にフィードし、rHuラニビズマブを捕捉すること;
(iv)20mM〜50mMのアセテートおよび0mM〜1000mMのNaClを含む4.0〜6.5の範囲内のpHを有する溶出緩衝液を用いてrHuラニビズマブを溶出すること;
ここで、精製されたrHuラニビズマブが、0.1%未満のフォールディングしていないまたはミスフォールディングした形態のrHuラニビズマブ、および0.3%未満の凝集形態のrHuラニビズマブを有する - マルチモードクロマトグラフィーのモードが、フロースルーマルチモードクロマトグラフィーおよび結合−溶出マルチモードクロマトグラフィーを含む群から選択される、請求項1に記載の方法。
- (i)マルチモードクロマトグラフィーの結合溶出モードのpH条件が8.0〜10.0の範囲内であり、かつ
(ii)マルチモードクロマトグラフィーのフロースルーモードのpH条件が4.0〜6.5の範囲内である、請求項2に記載の方法。 - フロースルーモードを利用するマルチモードクロマトグラフィーが、
(i)6.0mS/cm〜12mS/cmの範囲内のインプット電導度を工程(c)の濃縮したリフォールディングしたラニビズマブに適用すること、および
(ii)6.0mS/cm〜12mS/cmの範囲内のインプット電導度を工程(ii)において得られた組換えラニビズマブに適用すること
を含む、請求項2に記載の方法。 - 工程(i)における前記マルチモードクロマトグラフィー樹脂が、HEA Hypercel、PPA Hypercel、およびBAKERBOND(商標) XWP 500 Poly PEI−35および/またはCapto adhere樹脂を含む群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 工程(iii)における前記マルチモードクロマトグラフィー樹脂が、HEA Hypercel、PPA Hypercel、およびBAKERBOND(商標) XWP 500 PolyCSX−35および/またはCapto MMC樹脂を含む群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 工程(i)および工程(ii)が、それぞれ、工程(iii)および工程(iv)と交換可能である、請求項1に記載の方法。
- マルチモードクロマトグラフィーの第1の段階の後のrHuラニビズマブを含む前記溶出プールのpHが、逐次的なマルチモードクロマトグラフィー段階におけるpHの範囲に対応して調整され、前記工程が、
(a)マルチモードクロマトグラフィーの工程(i)および(ii)の第1の段階の後に前記溶出プールのpHを4〜6の範囲内のpHに調整すること、または
(b)マルチモードクロマトグラフィー方法の工程(iii)および(iv)の第1の段階の後に前記溶出プールのpHを8〜10の範囲内のpHに調整すること
を含む、請求項1または7に記載の方法。 - 請求項1に記載の方法により得られる組換えヒト化ラニビズマブ。
- 薬学的に許容される担体と共に、請求項9に記載のラニビズマブを含む医薬組成物。
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