JP2022523063A - アフリベルセプトの属性、並びにその特性決定及び修飾方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、アフリベルセプト、具体的にはアフリベルセプトの属性に関する。本明細書では、アフリベルセプトの属性を特性決定及び修飾する方法、並びに特定の属性を備えるアフリベルセプトを含む組成物も提供される。
Description
関連出願
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１月３０日出願の米国仮特許出願第６２／７９８，９０３号明細書の利益を主張する。
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１月３０日出願の米国仮特許出願第６２／７９８，９０３号明細書の利益を主張する。
配列表
本願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、２０２０年１月２９日に作成された、サイズが２０．５ｋｂの、Ａ－２２８７－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔという名称のファイルとして提供される。電子フォーマットの配列表における情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、２０２０年１月２９日に作成された、サイズが２０．５ｋｂの、Ａ－２２８７－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔという名称のファイルとして提供される。電子フォーマットの配列表における情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、アフリベルセプト、具体的にはアフリベルセプトの属性に関する。本明細書では、アフリベルセプトの属性を特性決定及び修飾する方法、並びに特定の属性を備えるアフリベルセプトを含む組成物も提供される。
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ＶＥＧＦ－Ａとも称され、新しい血管の成長を促進し、ＶＥＧＦＲ－１及びＶＥＧＦＲ－２に結合するシグナルタンパク質である。ＶＥＧＦは、多くの腫瘍で上昇することが分かっており、血管新生における役割を有する。ＶＥＧＦは、滲出加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の有意な態様である、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）などの眼内血管新生において役割を有することも分かっている。
ＶＥＧＦ阻害剤、例えば抗ＶＥＧＦ抗体及び断片並びにデコイ受容体又はキメラ受容体は、様々な病態、例えば癌及び眼障害などを処置するための治療薬として開発されてきた。例えば、抗ＶＥＧＦ抗体及び抗ＶＥＧＦ Ｆａｂは、両方ともそれぞれベバシズマブ及びラニビズマブとして市販されている。また、アフリベルセプト、ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質又は「ＶＥＧＦ－ｔｒａｐ」は、市販されている。
アフリベルセプトは、ＶＥＧＦＲ－１のＩｇドメイン２及びＶＥＧＦＲ－２のＩｇドメイン３に融合したＩｇＧ１ Ｆｃドメインで構成される融合タンパク質である。アフリベルセプトは、滲出型ＡＭＤを含む様々な眼病態処置のためのＥｙｌｅａ（登録商標）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）として販売されており、硝子体内投与のために製剤化される。融合タンパク質は、特定の型の癌処置のためのＺａｌｔｒａｐ（登録商標）（ｚｉｖ－アフリベルセプト）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）としても販売されており、静脈内投与のために製剤化される。
タンパク質の属性は、少なくともタンパク質生成物の品質において重要な役割を有し得る。したがって、本明細書では、アフリベルセプトの属性を特性決定及び修飾する方法、並びに属性を備えるアフリベルセプトを含む組成物、並びに関連する利点が提供される。
本開示は、アフリベルセプト種の混合物を含有する組成物を含む、アフリベルセプトの組成物を提供する。本明細書ではアフリベルセプト種も提供される。一実施形態では、アフリベルセプトのある種は、アフリベルセプトの別の種よりも異なる１つ以上の属性を有する。いくつかの実施形態では、差異はある属性の有無である。別の実施形態では、その差異はある属性のレベル又は量である。本明細書では、アフリベルセプトの１つ以上の属性を特性決定する方法、並びにアフリベルセプトの１つ以上の属性を修飾する、アフリベルセプトを精製する、及びアフリベルセプトの組成物を生産する方法も提供される。
本開示の一態様は、アフリベルセプトのＹ９２Ｌクリッピング種（ｃｌｉｐｐｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）である、アフリベルセプト種である。Ｙ９２Ｌクリッピング種は配列番号３を含み得る。
本開示の別の態様は、Ｙ９２Ｌクリッピング種を含むアフリベルセプト種の混合物を含む組成物である。一実施形態では、組成物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は、還元キャピラリ電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ｒＣＥ－ＳＤＳ）により判定して５．０％未満である。一実施形態では、組成物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は、ｒＣＥ－ＳＤＳにより判定して０．８％未満である。いくつかの実施形態では、組成物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は、ｒＣＥ－ＳＤＳにより判定して、組成物の３．０％未満、１．０％～５．０％、若しくは１．０％～３．０％、約１．１％、約３．０％、又は約４．７％である。一実施形態では、組成物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は、ｒＣＥ－ＳＤＳにより判定して約０．４％である。
本開示の別の態様では、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物は、アフリベルセプトのＮ６８占有種（ｏｃｃｕｐｉｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）を含む。一実施形態では、アフリベルセプト種の少なくとも３０％が、ｒＣＥ－ＳＤＳにより判定して、Ｎ６８位で占有される。いくつかの実施形態では、アフリベルセプト種の少なくとも５０％、５０～６０％、約３９％、約５３％、約５４％、又は約５５％がＮ６８位で占有される。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の１％～３％、０．８％未満、約１．１％、又は約０．４％などのＹ９２Ｌクリッピング種を更に含む。
本開示は、アフリベルセプト種の合計シアル酸含量が、ＬＣ－ＭＳベースのペプチドマッピングにより判定して６．０～１０．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質である、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物を更に提供する。一実施形態では、合計シアル酸含量は、約６．８、約８．５、約９．５ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質である。いくつかの実施形態では、合計シアル酸含量は約９．５ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質であり、ここでアフリベルセプト種の５４～５５％がＮ６８位で占有され、混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は約１．１％である。
本開示の別の態様は、アフリベルセプト種がＦｃドメイン中に１３％未満のアフコシル化を含む、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物である。アフコシル化の割合は、ＬＣ－ＭＳベースのペプチドマッピングなどの当該技術分野で既知の任意の方法によって判定することができる。一実施形態では、アフリベルセプト種はＦｃドメイン中に１．０～１２％のアフコシル化を含む。別の実施形態では、アフリベルセプト種は、Ｆｃドメイン中に１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、又は５％未満のアフコシル化を含む。一実施形態では、アフリベルセプト種はＦｃドメイン中に１０％未満のアフコシル化を含む。別の実施形態では、アフリベルセプト種はＦｃドメイン中に５％未満のアフコシル化を含む。別の実施形態では、アフリベルセプト種は、Ｆｃドメイン中に約１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、又は４％のアフコシル化を含む。更に別の実施形態では、アフリベルセプト種はＦｃドメイン中に約４％のアフコシル化を含む。
本開示の別の態様は、アフリベルセプト種が、Ｎ６８に０．１～２．０（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）のシアル酸、Ｔ３３に１．０～２５．０％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に７０％～９９％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に２０％～７５％のＮ－グリコシル化、Ｆｃドメイン中に０．１～１．０％の高マンノース、Ｆｃドメイン中に約２６％のガラクトシル化、Ｆｃドメイン中に約１％のシアル化、又はこれらの任意の組み合わせを含む、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物である。アフリベルセプト種は、Ｆｃドメイン中に１３％未満のアフコシル化、例えばＦｃドメイン中に１．０～１２％のアフコシル化、又はＦｃドメイン中に約１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、又は４％のアフコシル化、例えばＦｃドメイン中に５％未満のアフコシル化を更に含み得る。一実施形態では、アフリベルセプト種はＦｃドメイン中に約４％のアフコシル化を含む。
混合物中のアフリベルセプト種は、Ｎ６８に約０．７（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）のシアル酸、Ｔ３３に約４％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に約９５％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に約２６％のＮ－グリコシル化、Ｆｃドメイン中に約１％の高マンノース、Ｆｃドメイン中に約２６％のガラクトシル化、Ｆｃドメイン中に約１％のシアル化、Ｆｃドメイン中に１３％未満のアフコシル化、例えばＦｃドメイン中に１．０～１２％のアフコシル化、若しくはＦｃドメイン中に約１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、又は４％のアフコシル化、又はこれらの任意の組み合わせを更に含み得る。一実施形態では、混合物中のアフリベルセプト種は、Ｎ６８に約０．７（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）のシアル酸、Ｔ３３に約４％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に約９５％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に約２６％のＮ－グリコシル化、Ｆｃドメイン中に約１％の高マンノース、Ｆｃドメイン中に約６％のアフコシル化、Ｆｃドメイン中に約２６％のガラクトシル化、Ｆｃドメイン中に約１％のシアル化、又はこれらの任意の組み合わせを含む。
混合物中のアフリベルセプト種は、Ｎ６８に約０．７（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）のシアル酸、Ｔ３３に約４％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に約９５％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に約２６％のＮ－グリコシル化、Ｆｃドメイン中に約１％の高マンノース、Ｆｃドメイン中に約２６％のガラクトシル化、Ｆｃドメイン中に約１％のシアル化、Ｆｃドメイン中に１３％未満のアフコシル化、例えばＦｃドメイン中に１．０～１２％のアフコシル化、若しくはＦｃドメイン中に約１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、又は４％のアフコシル化、０．８％未満、例えば約０．４％のＹ９２Ｌクリッピング種、又はこれらの任意の組み合わせを更に含み得る。
混合物中のアフリベルセプト種は、Ｎ６８に約０．８（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）のシアル酸、Ｔ３３に約８．３％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に約９０．９％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に約５１．９％のＮ－グリコシル化、Ｆｃドメイン中に約０．４％の高マンノース、Ｆｃドメイン中に約２４．４％のガラクトシル化、Ｆｃドメイン中に約３．８％のシアル化、Ｆｃドメイン中に１３％未満のアフコシル化、例えばＦｃドメイン中に１．０～１２％のアフコシル化、若しくはＦｃドメイン中に約１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、又は４％のアフコシル化、又はこれらの任意の組み合わせを更に含み得る。一実施形態では、混合物中のアフリベルセプト種は、Ｎ６８に約０．８（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）のシアル酸、Ｔ３３に約８．３％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に約９０．９％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に約５１．９％のＮ－グリコシル化、Ｆｃドメイン中に約０．４％の高マンノース、Ｆｃドメイン中に約４％のアフコシル化、Ｆｃドメイン中に約２４．４％のガラクトシル化、Ｆｃドメイン中に約３．８％のシアル化、又はこれらの任意の組み合わせを含む。
混合物中のアフリベルセプト種は、Ｎ６８に約０．８（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）のシアル酸、Ｔ３３に約８．３％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に約９０．９％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に約５１．９％のＮ－グリコシル化、Ｆｃドメイン中に約０．４％の高マンノース、Ｆｃドメイン中に約２４．４％のガラクトシル化、Ｆｃドメイン中に約３．８％のシアル化、Ｆｃドメイン中に１３％未満のアフコシル化、例えばＦｃドメイン中に１．０～１２％のアフコシル化、若しくはＦｃドメイン中に約１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、又は４％のアフコシル化、０．８％未満、例えば約０．４％のＹ９２Ｌクリッピング種、又はこれらの任意の組み合わせを更に含み得る。一実施形態では、混合物中のアフリベルセプト種は、Ｎ６８に約０．８（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）のシアル酸、Ｔ３３に約８．３％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に約９０．９％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に約５１．９％のＮ－グリコシル化、Ｆｃドメイン中に約０．４％の高マンノース、Ｆｃドメイン中に約４％のアフコシル化、Ｆｃドメイン中に約２４．４％のガラクトシル化、Ｆｃドメイン中に約３．８％のシアル化、約０．４％のＹ９２Ｌクリッピング種、又はこれらの任意の組み合わせを含む。一実施形態では、混合物中のアフリベルセプト種は、Ｎ６８に約０．８（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）のシアル酸、Ｔ３３に約８．３％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に約９０．９％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に約５１．９％のＮ－グリコシル化、Ｆｃドメイン中に約０．４％の高マンノース、Ｆｃドメイン中に約４％のアフコシル化、Ｆｃドメイン中に約２４．４％のガラクトシル化、Ｆｃドメイン中に約３．８％のシアル化、及び約０．４％のＹ９２Ｌクリッピング種を含む。
本開示は、混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量を低減することを含む、又はアフリベルセプトのＮ６８占有率を低減することによる、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）及び／又はＶＥＧＦ－Ａに対するアフリベルセプト種の混合物を含む組成物の結合を増加させる方法を更に提供する。ＰｌＧＦはＰｌＧＦ－１又はＰｌＧＦ－２であり得る。一実施形態では、混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量を低減する方法は、アニオン交換クロマトグラフィー工程、続いて疎水性相互作用クロマトグラフィー工程でアフリベルセプトを精製することを含む。
本開示の別の態様は、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物を生産する方法である。方法は、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）工程、続いて疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程を含む、アフリベルセプト種の混合物を含む細胞培養液を精製プロセスに供することを含み得、ここでは、ＡＥＸ工程、続いてカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）工程を含む精製プロセスと比較して、より少ない量のＹ９２Ｌクリッピング種が生産される。いくつかの実施形態では、精製プロセスはＣＥＸ工程を含まない。
アフリベルセプト種の混合物を含む組成物を生産する別の方法は、アフリベルセプトを生産する細胞を収穫すること、収穫した細胞培養液をタンパク質Ａカラムに供すること、及びアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、続いてカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を実施することを含む。いくつかの実施形態では、ＡＥＸの後にＨＩＣが続き、且つ任意選択的に、方法はＣＥＸを含まない。いくつかの実施形態では、ＡＥＸの後にＣＥＸが続く。一実施形態では、細胞は、灌流又はフェドバッチによって成長可能なチャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ、ＣＨＯ）細胞である。細胞は、酸析出、遠心分離、精密濾過、深層濾過、又はこれらの任意の組み合わせによって収穫することができる。方法は、１つ以上のウイルス不活性化及び／若しくはウイルス濾過工程、又は限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程を更に含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＥＸ、ＨＩＣ、及び／又はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施する前にＣＥＸを実施することを含まない。
本開示は、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物、及びアフリベルセプトの様々な種を提供する。いくつかの実施形態では、アフリベルセプトのある種は、アフリベルセプトの別の種よりも異なる１つ以上の属性を有する。本明細書では、アフリベルセプトの１つ以上の属性を特性決定する方法、及びアフリベルセプトの１つ以上の属性を修飾する方法も提供される。
一実施形態では、アフリベルセプトは、Ｃ末端リジンが存在しない配列番号１のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、アフリベルセプトは、Ｃ末端リジンが存在する配列番号２のアミノ酸配列を含む。
配列番号１
配列番号２
配列番号１
本明細書では、アフリベルセプトの１つ以上の属性も提供される。属性は、脱アミド化、グリコシル化（例えば、Ｏ－グリコシル化、Ｎ－グリコシル化）、シアル化（例、ＮＡＮＡ又はＮＧＮＡシアル化）、アフコシル化、マンノシル化（例えば、高マンノース）、ガラクトシル化、又はクリッピング（例えば、Ｃ末端又はＮ末端）を含み得る。一実施形態では、アフリベルセプトの属性は、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物の、脱アミド化、グリコシル化（例えば、Ｏ－グリコシル化、Ｎ－グリコシル化）、シアル化（例、ＮＡＮＡ又はＮＧＮＡシアル化）、アフコシル化、マンノシル化（例えば、高マンノース）、ガラクトシル化、クリッピング（例えば、Ｃ末端又はＮ末端）、又はこれらの任意の組み合わせのレベル又は量によって特性決定される。
いくつかの実施形態では、アフリベルセプトの属性の特性決定は、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物のＶＥＧＦＲドメインの、脱アミド化、グリコシル化（例えば、Ｏ－グリコシル化、Ｎ－グリコシル化）、シアル化（例、ＮＡＮＡ又はＮＧＮＡシアル化）、アフコシル化、マンノシル化（例えば、高マンノース）、ガラクトシル化、クリッピング（例えば、Ｃ末端又はＮ末端）、又はこれらの任意の組み合わせのレベル又は量による。別の実施形態では、アフリベルセプトの属性の特性決定は、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物のＦｃドメインの、脱アミド化、グリコシル化（例えば、Ｏ－グリコシル化、Ｎ－グリコシル化）、シアル化（例、ＮＡＮＡ又はＮＧＮＡシアル化）、アフコシル化、マンノシル化（例えば、高マンノース）、ガラクトシル化、クリッピング（例えば、Ｃ末端又はＮ末端）、又はこれらの任意の組み合わせのレベル又は量による。一実施形態では、属性は、ＶＥＧＦＲドメインのシアル化及び／又はグリコシル化のレベル又は量である。一実施形態では、属性は、ＶＥＧＦＲドメインのシアル化、Ｎ－グリコシル化、Ｏ－グリコシル化、又はこれらの任意の組み合わせのレベル又は量である。別の実施形態では、属性は、Ｆｃドメインの高マンノース、シアル化、アフコシル化、ガラクトシル化、又はこれらの任意の組み合わせのレベル又は量である。
別の実施形態では、アフリベルセプトの属性の特性決定は、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物の、脱アミド化、グリコシル化（例えば、Ｏ－グリコシル化、Ｎ－グリコシル化）、シアル化（例、ＮＡＮＡ又はＮＧＮＡシアル化）、アフコシル化、マンノシル化（例えば、高マンノース）、ガラクトシル化、クリッピング（例えば、Ｃ末端又はＮ末端）、又はこれらの任意の組み合わせの割合による。別の実施形態では、アフリベルセプトの属性の特性決定は、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物のアフリベルセプト又はアフリベルセプト種１モル当たりのグリカン（例えばシアル酸）のモル数による。
いくつかの実施形態では、属性は、アフリベルセプトの特定のアミノ酸位置におけるものである。例えば、属性は、Ｎ８４及び／若しくはＮ９９における脱アミド化、Ｎ３６、Ｎ８８、Ｎ１２３、Ｎ１９６、若しくはこれらの任意の組み合わせにおけるシアル酸、Ｔ３３におけるＯ－グリコシル化、Ｎ３６、Ｎ６８、Ｎ１２３、Ｎ１９６、若しくはこれらの任意の組み合わせにおけるＮ－グリコシル化、Ｙ９２Ｌにおけるクリッピング（例えば、配列番号１の最初の９２個のアミノ酸（配列番号５）を欠く、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト種をもたらす）、Ｒ１５３Ｄにおけるクリッピング（例えば、配列番号１の最初の１５３個のアミノ酸（配列番号８）を欠く、配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト種をもたらす）、又はこれらの任意の組み合わせのレベル又は量であり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ１５３Ｄにおけるクリッピングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をもたらし、ここでクリッピングされる最初の１５３個のアミノ酸（配列番号８）は、ジスルフィド結合を介してタンパク質と結合される。
配列番号３
配列番号４
配列番号５（配列番号１のアミノ酸１～９２）
配列番号６
配列番号７
配列番号８（配列番号１のアミノ酸１～１５３）
配列番号３
したがって、本明細書では、本明細書で開示される属性のうちの１つ以上を備えるアフリベルセプトも提供される。いくつかの実施形態では、アフリベルセプトのある種は、アフリベルセプトの別の種よりも異なる１つ以上の属性を有する。差異は、属性の有無、又は属性のレベル若しくは量であり得る。一実施形態では、アフリベルセプト種は、Ｎ８４及び／若しくはＮ９９において脱アミド化されるか、Ｎ３６、Ｎ８８、Ｎ１２３、Ｎ１９６、若しくはこれらの任意の組み合わせにおいてシアル化されるか、Ｔ３３においてＯ－グリコシル化されるか、Ｎ３６、Ｎ６８、Ｎ１２３、Ｎ１９６、若しくはこれらの任意の組み合わせにおいてＮ－グリコシル化されるか、又はこれらの任意の組み合わせを受ける。
別の実施形態では、アフリベルセプト種は、Ｙ９２Ｌにおいてクリッピングされる（例えば、配列番号１の最初の９２個のアミノ酸（配列番号５）を欠く、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト種をもたらす）。いくつかの実施形態では、クリッピングされるＹ９２Ｌ種は、Ｎ９９において脱アミド化されるか、Ｎ１２３及び／若しくはＮ１９６においてシアル化されるか、Ｎ１２３及び／若しくはＮ１９６においてＮ－グリコシル化されるか、又はこれらの任意の組み合わせを受ける。
別の実施形態では、アフリベルセプト種は、Ｒ１５３Ｄにおいてクリッピングされる（例えば、配列番号１の最初の１５３個のアミノ酸（配列番号８）を欠く、配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト種をもたらす）。いくつかの実施形態では、クリッピングされたＲ１５３Ｄ種は、Ｎ１９６においてシアル化され、且つ／又はＮ１９６においてＮ－グリコシル化される。
本明細書では、特定の属性を備えるアフリベルセプト種の混合物を含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、アフリベルセプト種の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０．８％未満が、クリッピング種である（例えば、Ｙ９２Ｌ又はＲ１５３Ｄクリッピング種）。クリッピング種の量は、ｒＣＥ－ＳＤＳ又はトリプシンペプチドマッピングなどの当該技術分野で既知の任意の方法によって判定することができる。一実施形態では、組成物は、アフリベルセプト種の５．０％未満がＹ９２Ｌクリッピング種である、アフリベルセプト種の混合物を含む。いくつかの実施形態では、アフリベルセプト種の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０．８％未満が、Ｙ９２Ｌクリッピング種である。一実施形態では、組成物は、アフリベルセプト種の０．８％未満がＹ９２Ｌクリッピング種である、アフリベルセプト種の混合物を含む。別の実施形態では、組成物は、アフリベルセプト種の０．５％未満がＹ９２Ｌクリッピング種である、アフリベルセプト種の混合物を含む。いくつかの実施形態では、組成物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は１％～１０％、１．０％～５．０％、又は１．０％～３．０％である。いくつかの実施形態では、組成物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は、組成物の約１．０％、約２．０％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、又は約６．０％である。いくつかの実施形態では、組成物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は、組成物の約１．１％、約３．０％、又は約４．７％である。一実施形態では、組成物は、アフリベルセプト種の約０．４％がＹ９２Ｌクリッピング種である、アフリベルセプト種の混合物を含む。
本明細書では、アフリベルセプト種の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％がＮ６８位において占有される（すなわち、グリコシル化される）、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物も提供される。Ｎ６８位において占有されるアフリベルセプト種の量は、ｒＣＥ－ＳＤＳ又はペプチドマッピングなどの当該技術分野で既知の任意の方法によって判定することができる。いくつかの実施形態では、アフリベルセプト種の１０％～９０％、２０％～７０％、３０％～６０％、又は５０～６０％が、Ｎ６８位において占有される。いくつかの実施形態では、Ｎ６８位において占有されるアフリベルセプト種の量は、約３９％、約５３％、約５４％、又は約５５％である。
本明細書では、アフリベルセプト種の合計シアル酸含量が、１．０～２０．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質、２．０～１５．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質、５．０～１２．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質、又は６．０～１０．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質である、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物も提供される。シアル酸の量は、質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）ベースのペプチドマッピング、合計シアル酸法、又は合計親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）グリカンマッピングと組み合わせた、任意のペプチドマッピング又はグリカン分析法、例えば液体クロマトグラフィーなどの、当該技術分野で既知の任意の方法で判定することができる。一実施形態では、合計シアル酸含量は、約６．８、約８．５、又は約９．５ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質である。
別の実施形態では、組成物は、混合物のグリカンプロファイルが、Ｎ８８に約０．７のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｔ３３に約４％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に約９５％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に約２６％のＮ－グリコシル化、そのＦｃドメインに約１％の高マンノース、そのＦｃドメインに約６％のアフコシル化、そのＦｃドメインに約２６％のガラクトシル化、そのＦｃドメインに約１％のシアル化、又はこれらの任意の組み合わせを含む、アフリベルセプト種の混合物を含む。いくつかの実施形態では、グリカンプロファイルは、Ｎ３６に約３．２のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｎ１２３に約１．６のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｎ１９６に約１．９のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、そのＶＥＧＦＲドメインに約７．４の合計シアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｎ１２３に約１００％のＮ－グリコシル化、Ｎ１９６に約９９％のＮ－グリコシル化、又はこれらの任意の組み合わせを更に含み得る。
一実施形態では、組成物は、混合物のグリカンプロファイルが、Ｎ３６に約３．２のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｎ８８に約０．７のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｎ１２３に約１．６のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｎ１９６に約１．９のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、そのＶＥＧＦＲドメインに約７．４の合計シアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｔ３３に約４％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に約９５％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に約２６％のＮ－グリコシル化、Ｎ１２３に約１００％のＮ－グリコシル化、Ｎ１９６に約９９％のＮ－グリコシル化、そのＦｃドメインに約１％の高マンノース、そのＦｃドメインに約６％のアフコシル化、そのＦｃドメインに約２６％のガラクトシル化、そのＦｃドメインに約１％のシアル化、又はこれらの任意の組み合わせを含む、アフリベルセプト種の混合物を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量が、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．８％未満、１％～１０％、１．０％～５．０％、若しくは１．０％～３．０％、約１．０％、約２．０％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、若しくは約６．０％、又は約１．１％、約３．０％、約４．７％、若しくは約０．４％である、アフリベルセプト種の混合物を含み、アフリベルセプトの混合物のグリカンプロファイルは、Ｎ８８に約０．７のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｔ３３に約４％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に約９５％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に約２６％のＮ－グリコシル化、そのＦｃドメインに約１％の高マンノース、そのＦｃドメインに約６％のアフコシル化、そのＦｃドメインに約２６％のガラクトシル化、そのＦｃドメインに約１％のシアル化、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、グリカンプロファイルは、Ｎ３６に約３．２のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｎ１２３に約１．６のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｎ１９６に約１．９のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、そのＶＥＧＦＲドメインに約７．４の合計シアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｎ１２３に約１００％のＮ－グリコシル化、Ｎ１９６に約９９％のＮ－グリコシル化、又はこれらの任意の組み合わせを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、アフリベルセプト種の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％、１０％～９０％、２０％～７０％、３０％～６０％、若しくは５０～６０％、又は約３９％、約５３％、約５４％、若しくは約５５％がＮ６８位において占有される（すなわち、グリコシル化される）、アフリベルセプト種の混合物を更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１．０～２０．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質、２．０～１５．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質、５．０～１２．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質、６．０～１０．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質、約６．８、約８．５、又は約９．５ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質である、アフリベルセプト種の合計シアル酸含量を更に含む。
一実施形態では、組成物は、アフリベルセプト種の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％、１０％～９０％、２０％～７０％、３０％～６０％、若しくは５０～６０％、又は約３９％、約５３％、約５４％、若しくは約５５％がＮ６８位において占有される（すなわち、グリコシル化される）、アフリベルセプト種の混合物を含み、組成物中のアフリベルセプト種のグリカンプロファイルは、Ｎ８８に約０．７のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｔ３３に約４％のＯ－グリコシル化、Ｎ３６に約９５％のＮ－グリコシル化、Ｎ６８に約２６％のＮ－グリコシル化、そのＦｃドメインに約１％の高マンノース、そのＦｃドメインに約６％のアフコシル化、そのＦｃドメインに約２６％のガラクトシル化、そのＦｃドメインに約１％のシアル化、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、グリカンプロファイルは、Ｎ３６に約３．２のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｎ１２３に約１．６のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｎ１９６に約１．９のシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、そのＶＥＧＦＲドメインに約７．４の合計シアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、Ｎ１２３に約１００％のＮ－グリコシル化、Ｎ１９６に約９９％のＮ－グリコシル化、又はこれらの任意の組み合わせを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１．０～２０．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質、２．０～１５．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質、５．０～１２．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質、６．０～１０．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質、約６．８、約８．５、又は約９．５ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質である、アフリベルセプト種の合計シアル酸含量を更に含む。
一実施形態では、組成物は、混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量が１％～３％（例えば、約１．１％、０．８％未満、又は約０．４％）であり、アフリベルセプト種の５３～５５％（例えば約５４～５５％）がＮ６８位で占有され、合計シアル酸含量が約９．５ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質である、アフリベルセプト種の混合物を含む。
本明細書では、アフリベルセプト種の混合物を含む組成物を生産する方法も提供される。アフリベルセプトは哺乳動物の宿主細胞などの宿主細胞によって生成され得る。哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり得る。一実施形態では、方法は、アフリベルセプトを生産する宿主細胞を培養して収穫し、プロテインＡ、それに続いてアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、次いでカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）でタンパク質を精製することを含む。別の実施形態では、方法は、フェドバッチによって宿主細胞を培養し、細胞を収穫し、プロテインＡ、それに続いてアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）でタンパク質を精製することを含む。いくつかの実施形態では、ＡＥＸ、それに続いてＨＩＣを含む方法は、ＨＩＣの代わりにＣＥＸを含む以外は同じ方法と比較して、より少ない量のＹ９２Ｌクリッピング種を生産する。いくつかの実施形態では、ＡＥＸ、それに続いてＨＩＣを含む方法は、ＨＩＣの代わりにＣＥＸを含む以外は同じ方法と比較して、１／２未満のＹ９２Ｌクリッピング種を生産する。いくつかの実施形態では、ＡＥＸ、それに続いてＨＩＣを含む方法は、ＣＥＸ工程を含まない。いくつかの実施形態では、方法は、任意のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）工程を含まない。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＥＸの前に任意のＣＥＸ工程を含まない。
いくつかの実施形態では、方法は、フェドバッチ又は灌流によって宿主細胞を培養することを含む。灌流を含む方法によって培養する場合などのいくつかの実施形態では、細胞は、軟凝集、精密濾過、又はこれらの任意の組み合わせによって収穫することができる。フェドバッチによって培養する場合などのいくつかの実施形態では、細胞は、析出、遠心分離、深層濾過、又はこれらの任意の組み合わせによって収穫することができる。一実施形態では、細胞は、酸析出によって収穫される。酸は、酢酸又はクエン酸などの、当該技術分野で既知の任意のものであってよい。一実施形態では、酸析出は、約５．５、約５．０、約４．５、約４．０、約３．５、又は約３．０のｐＨにおけるものである。一実施形態では、酸析出は、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、又は約５．０のｐＨにおけるものである。一実施形態では、酸析出は、３．０～４．０又は３．５～４．０のｐＨにおけるものである。別の実施形態では、ｐＨは５．５±０．２、５．４±０．２、５．３±０．２、５．２±０．２、５．１±０．２、５．０±０．２、４．９±０．２、４．８±０．２、４．７±０．２、４．６±０．２、４．５±０．２、４．４±０．２、４．３±０．２、４．２±０．２、４．１±０．２、４．０±０．２、４．０±０．２、３．９±０．２、３．８±０．２、３．７±０．２、３．６±０．２、３．５±０．２、３．４±０．２、３．３±０．２、３．２±０．２、３．１±０．２、又は３．０±０．２である。酸析出は、約２０℃、１５℃、１０℃、又は５℃の温度であってもよい。一実施形態では、温度は約２０±３℃、１９±３℃、１８±３℃、１７±３℃、１６±３℃、１５±３℃、１４±３℃、１３±３℃、１２±３℃、１１±３℃、１０±３℃、９±３℃、８±３℃、７±３℃、６±３℃、５±３℃、又は４±３℃である。酸析出プロセスは、約３０分、約４５分、約６０分、約７５分、約９０分、又は約１０５分間であってもよい。
別の実施形態では、細胞は、酸析出、それに続いて深層濾過によって収穫される。深層濾過中の温度は、約２０±３℃、１９±３℃、１８±３℃、１７±３℃、１６±３℃、１５±３℃、１４±３℃、１３±３℃、１２±３℃、１１±３℃、１０±３℃、９±３℃、８±３℃、７±３℃、６±３℃、５±３℃、又は４±３℃で実施され得る。一実施形態では、深層濾過の後にｐＨ中和が続く。中和は、Ｔｒｉｓ塩基などの任意の塩基を用いて実施され得る。中和は、約２０±３℃、１９±３℃、１８±３℃、１７±３℃、１６±３℃、１５±３℃、１４±３℃、１３±３℃、１２±３℃、１１±３℃、１０±３℃、９±３℃、８±３℃、７±３℃、６±３℃、５±３℃、又は４±３℃の温度で実施され得る。中和の標的ｐＨは、約８．０、約７．５、約７．０、約６．５、又は約６．０であり得る。一実施形態では、ｐＨは約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、又は約７．９である。一実施形態では、ｐＨは６．０～８．０、６．５～８．０、又は７．０～８．０である。別の実施形態では、ｐＨは、８．０±０．２、７．９±０．２、７．８±０．２、７．７±０．２、７．６±０．２、７．５±０．２、７．４±０．２、７．３±０．２、７．２±０．２、７．１±０．２、７．０±０．２、６．９±０．２、６．８±０．２、６．７±０．２、６．６±０．２、６．５±０．２、６．４±０．２、６．３±０．２、６．２±０．２、６．１±０．２、又は６．０±０．２である。
別の実施形態では、深層濾過の後に、ｐＨ中和、及び洗剤（例えばＴｒｉｔｏｎ）を使用したウイルス不活性化などのウイルス不活性化が続く。ウイルス不活性化は、２０±３℃、１９±３℃、１８±３℃、１７±３℃、１６±３℃、１５±３℃、１４±３℃、１３±３℃、１２±３℃、１１±３℃、１０±３℃、９±３℃、８±３℃、７±３℃、６±３℃、５±３℃、又は４±３℃で実施され得る。いくつかの実施形態では、深層濾過の後にウイルス不活性化は実施されない。
したがって、一実施形態では、宿主細胞はフェドバッチ又は灌流によって培養され、続いて酸析出、それに続いて深層濾過及びｐＨ中和によって収穫される。別の実施形態では、宿主細胞はフェドバッチ又は灌流によって培養され、続いて酸析出、それに続いて深層濾過、ｐＨ中和、及びウイルス不活性化によって収穫される。
収穫後、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、それに続いてアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、次いでカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によりアフリベルセプトを細胞溶解物から精製してよい。別の実施形態では、精製は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、それに続いてアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるものである。いくつかの実施形態では、ＡＥＸ、それに続いてＨＩＣを含む方法は、ＨＩＣの代わりにＣＥＸを含む以外は同じ方法と比較して、より少ない量のＹ９２Ｌクリッピング種を生産する。いくつかの実施形態では、ＡＥＸ、それに続いてＨＩＣを含む方法は、ＨＩＣの代わりにＣＥＸを含む以外は同じ方法と比較して、１／２未満のＹ９２Ｌクリッピング種を生産する。いくつかの実施形態では、ＡＥＸ、それに続いてＨＩＣを含む方法は、ＣＥＸ工程を含まない。いくつかの実施形態では、方法は、任意のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）工程を含まない。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＥＸの前に任意のＣＥＸ工程を含まない。
いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化及び／又は濾過工程は、プロテインＡ工程とＡＥＸ工程との間に実施される。いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化及び／又はウイルス濾過工程は、最後のカラム精製（例えばＣＥＸ又はＨＩＣ）の後に実施される。一実施形態では、ウイルス濾過は、最後のカラム精製（例えばＣＥＸ又はＨＩＣ）の後に実施される。
いくつかの実施形態では、プロテインＡ精製後などのウイルス不活性化は低ｐＨによるものである。一実施形態では、ウイルス不活性化は、約４．０、約３．９、約３．８、約３．７、約３．６、約３．５、約３．４、約３．３、約３．２、約３．１、又は約３．０のｐＨにおけるものである。一実施形態では、酸析出は、３．０～４．０又は３．５～４．０のｐＨにおけるものである。別の実施形態では、ｐＨは４．０±０．２、３．９±０．２、３．８±０．２、３．７±０．２、３．６±０．２、３．５±０．２、３．４±０．２、３．３±０．２、３．２±０．２、３．１±０．２、又は３．０±０．２である。いくつかの実施形態では、低ｐＨウイルス不活性化の次は中和であり、中和の標的ｐＨは、約５．５、約５．０、又は約４．５である。一実施形態では、ｐＨは、４．５～６．０、４．５～５．５、５．０～６．０、又は５．０～５．５である。別の実施形態では、ｐＨは、６．０±０．２、５．９±０．２、５．８±０．２、５．７±０．２、５．６±０．２、５．５±０．２、５．４±０．２、５．３±０．２、５．２±０．２、５．１±０．２、５．０±０．２、４．９±０．２、４．８±０．２、４．７±０．２、４．６±０．２、又は４．５±０．２である。いくつかの実施形態では、深層濾過は中和後に実施される。
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー、並びに／又はウイルス不活性化／濾過、及び／若しくは深層濾過の後に、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）が実施される。いくつかの実施形態では、界面活性剤（例えばポリソルベート）などの賦形剤が、ＵＦ／ＤＦ回復プール（ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｐｏｏｌ）に添加され、任意選択的に濾過される。
クロマトグラフィー、ウイルス不活性化、ウイルス濾過、及び／又は限外濾過／透析濾過工程は、２５±５℃、２４±５℃、２３±５℃、２２±５℃、２１±５℃、２０±５℃、１９±５℃、１８±５℃、１７±５℃、１６±５℃、１５±５℃、１４±５℃、１３±５℃、１２±５℃、１１±５℃、又は１０±５℃で実施され得る。
したがって、一実施形態では、アフリベルセプトは、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、それに続いてウイルス不活性化（例えば、低ｐＨ、それに続いて中和、及び任意選択的に深層濾過による）、ＡＥＸ、ＨＩＣ、ウイルス濾過、及びＵＦ／ＤＦによって、収穫された細胞から精製され得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤（例えばポリソルベート）が添加される。いくつかの実施形態では、精製されたアフリベルセプトは、界面活性剤が添加された後に濾過される。
本明細書では、ＰｌＧＦ（例えばＰｌＧＦ－１又はＰｌＧＦ－２）及び／又はＶＥＧＦ－Ａに対するアフリベルセプト種の混合物を含む組成物の結合を増加させる方法であって、混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量を低減することを含む、方法も提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、アニオン交換クロマトグラフィー工程、続いて疎水性相互作用クロマトグラフィー工程でアフリベルセプトを精製することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、図４に示す第２のプロセスなど、本明細書に記載される通りである。
本開示は、アフリベルセプトのＮ６８占有率を低減することを含む、ＰｌＧＦ（例えばＰｌＧＦ－１又はＰｌＧＦ－２）に対するアフリベルセプト種の混合物を含む組成物の結合を増加させる方法も提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、図４に示す第１又は第２のプロセスなど、精製中のプロテインＡに続くクロマトグラフィー工程を含む。
詳細な説明及び以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明は、それに限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の説明に基づき、当業者によって様々な変更形態及び修正形態がなされ得、そうした変更形態及び修正形態は本発明に含まれる。
実施例１：アフリベルセプトの属性の影響
表１に示す方法によってアフリベルセプトの様々な属性を分析した。図１は、アフリベルセプト構造上にマッピングされたこれらの属性を示す。ＶＥＧＦ－Ａ及びＰｌＧＦ－１を結合するアフリベルセプトの能力に対する様々な属性の影響を判定し、結果を表１に示す。
表１に示す方法によってアフリベルセプトの様々な属性を分析した。図１は、アフリベルセプト構造上にマッピングされたこれらの属性を示す。ＶＥＧＦ－Ａ及びＰｌＧＦ－１を結合するアフリベルセプトの能力に対する様々な属性の影響を判定し、結果を表１に示す。
化学的及び翻訳後修飾の潜在的な存在を評価することに加えて、アフリベルセプトのアミノ酸配列を確認するために、ペプチドマッピングの特性決定、又は還元されたペプチドマッピングを実施した。ジチオスレイトールでの還元及びヨード酢酸ナトリウムでのアルキル化の後に、ペプチドマッピング分析をトリプシンでの酵素消化法により実施した。得られた切断断片を、水中アセトニトリルの増加勾配を用いた逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）によって分離し、ペプチドを、高分解能線形イオントラップ質量分析計を用いたオンライン液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって同定した。
親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）グリカンマッピングを用いて、アフリベルセプトのＮ結合グリカンを評価した。アフリベルセプトは５個のＮ結合グリコシル化部位を有し、１つは保存Ｆｃ領域上で主に二分岐複合体型であり、他の４個の部位はＶＥＧＦ受容体領域上で主にシアル化グリカン種を含む二分岐複合体型である。アフリベルセプトのＮ結合グリカンを、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）ＵＨＰＬＣグリカンマップ分析によって評価した。この手順は、アフリベルセプトの還元及び変性、ペプチドＮグリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）を用いたＮ結合グリカンの放出、蛍光標識を用いた誘導体化、並びに、増加する水中ギ酸アンモニウムの勾配を用いたＨＩＬＩＣ ＵＨＰＬＣにより分離される標識化グリカンの蛍光検出を伴う。
合計シアル酸法を実施して、シアル酸含量を判定した。アフリベルセプトのＮ結合グリカン由来の末端シアル酸を、酸性条件下で加水分解する。加水分解溶液中のシアル酸を、１，２－ジアミノ－４，５－メチレンオキシベンゼン（ＤＭＢ）で標識化する。放出され、標識化されたシアル酸の調製物を水で希釈し、続いて、蛍光検出を用いた超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）により分析する。同じ方法で調製された既知の量のＮＡＮＡ標準の一連の注入及び対応するピーク面積を用いて、線形回帰分析を用いた標準曲線を生成する。続いて、生成された線形標準曲線を用いてシアル酸含量を判定する。
中性被覆キャピラリを装備する高分解能キャピラリ電気泳動分離機器を用いて、アフリベルセプトのキャピラリ等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）分析を実施した。キャピラリ中のｐＨ勾配を介したアフリベルセプトの電気泳動により、アフリベルセプトはｐＨ値がそのｐＩと等しくなるまで移動する。続いてアフリベルセプトは化学的に動化され（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）、キャピラリ内の検出窓を通る際にＵＶ吸光度（２８０ｎｍ）によって検出される。
還元キャピラリ電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウムｒＣＥ－ＳＤＳを用いて、アフリベルセプトの純度を評価した。試料を、β－メルカプトエタノールを用いて還元し、ＳＤＳで変性させた。還元及び変性させたタンパク質を、流体力学的サイズに基づき分離し、ここで小径のタンパク質はより速く移動し、より大径のタンパク質はより遅く移動する。分析質をＵＶ吸光度によって監視した。
ＰｌＧＦ－１又はＰｌＧＦ－２の結合を、生体分子相互作用を検出するビーズベースの増幅発光近接均質アッセイスクリーン（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ Ｓｃｒｅｅｎ）（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて判定した。このアッセイは、２つのビーズ型、アクセプタービーズ及びドナービーズを含む。ドナービーズは、フタロシアニン、光増感剤、及びストレプトアビジンを含有するヒドロゲルでコーティングされている。アクセプタービーズは、チオキセン誘導体及びマウスモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を含有するヒドロゲルでコーティングされている。ドナービーズは、ストレプトアビジンとビオチンとの間の相互作用を介してビオチン化ＰｌＧＦに結合し、アクセプタービーズは、ＦＩＴＣ標識化アフリベルセプトに結合する。このＦＩＴＣ標識化アフリベルセプトは、アフリベルセプト試験試料の競合者としての役割を果たす。ＦＩＴＣ標識化アフリベルセプト及びビオチン化ＰｌＧＦが互いに結合すると、アクセプタービーズ及びドナービーズは近接させられる。この錯体にレーザーを照射すると、ドナービーズによって周囲酸素が一重項酸素に変換される。ビーズが近接していると、アクセプタービーズへのエネルギー移動が起こってルミネセンス生成をもたらし、これを、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）シグナル検出能力を備えるマイクロプレートリーダーで測定する。非結合アフリベルセプト試験試料が、ビオチン化ＰｌＧＦに対するＦＩＴＣ標識化アフリベルセプトの結合を阻害するのに十分な濃度で存在する場合、ルミネセンス出力の用量依存性の減少が起きる。試験試料の活性は、相対効力又は相対結合（例えば相対結合％）を表す、対照標準の応答に対する試験試料の応答の比較によって判定する。
ＶＥＧＦＡの結合を、生体分子相互作用を検出するビーズベースの増幅発光近接均質アッセイスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて判定した。このアッセイは、２つのビーズ型、アクセプタービーズ及びドナービーズを含む。ドナービーズは、フタロシアニン、光増感剤、及びストレプトアビジンを含有するヒドロゲルでコーティングされている。アクセプタービーズは、チオキセン誘導体及びニッケルキレートを含有するヒドロゲルでコーティングされている。ドナービーズは、ストレプトアビジンとビオチンとの間の相互作用を介してビオチン化ＶＥＧＦＡ－１６５に結合し、アクセプタービーズは、ニッケルキレートとヒスチジンとの間の相互作用のためにヒスチジン標識化ＶＥＧＦＲ２に結合する。ＶＥＧＦＲ２－Ｈｉｓ及びビオチン化ＶＥＧＦＡ－１６５が互いに結合すると、アクセプタービーズ及びドナービーズは緊密に近接させられる。この錯体にレーザーを照射すると、ドナービーズによって周囲酸素が一重項酸素に変換される。ビーズが近接していると、アクセプタービーズへのエネルギー移動が起こってルミネセンス生成をもたらし、これを、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）シグナル検出能力を備えるマイクロプレートリーダーで測定する。アフリベルセプトはビオチン化ＶＥＧＦＡ－１６５に結合して、これがＶＥＧＦＲ２－Ｈｉｓに結合することを防ぎ、それにより用量依存的にルミネセンス出力を減少させる。試験試料の活性は、相対効力又は相対結合（例えば相対結合％）を表す、対照標準の応答に対する試験試料の応答の比較によって判定する。
表１に示すように、シアル化の他に、ＶＥＧＦ－Ａ及びＰｌＧＦ－１に結合するアフリベルセプトの能力に影響を与える属性は、Ｙ９２Ｌクリッピング及びＮ６８グリコシル化占有率である。
図２に示すように、Ｙ９２Ｌのクリッピングは、ＶＥＧＦ－Ａに結合するアフリベルセプトの能力に著しい影響を与える。また、１％のＹ９２Ｌクリッピングは、２％のＶＥＧＦ－Ａ結合損失をもたらすが、これは、アフリベルセプトの両方のＶＥＧＦＲ領域がＶＥＧＦ－Ａ結合における役割を有することを示唆する。図３に示すように、Ｎ６８占有率の１０％の増加は、アフリベルセプトのＰｌＧＦ－１結合活性の４～５％の低下をもたらす。
実施例２：アフリベルセプトのＹ９２Ｌクリッピング及びＮ６８占有率に影響を及ぼすプロセス工程
Ｙ９２Ｌクリッピングの増加は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ－Ａ、ＰｌＧＦ－１、及びＰｌＧＦ－２結合活性を低下させ、Ｎ６８占有率の増加は、アフリベルセプトのＰｌＧＦ－１及びＰｌＧＦ－２結合活性を低下させるため、プロセスの特定の工程が、アフリベルセプトのＹ９２Ｌクリッピング種のレベル及びＮ６８占有率の量に影響を与え得るか否かを判定するためにアフリベルセプトの精製プロセスを調査した。
Ｙ９２Ｌクリッピングの増加は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ－Ａ、ＰｌＧＦ－１、及びＰｌＧＦ－２結合活性を低下させ、Ｎ６８占有率の増加は、アフリベルセプトのＰｌＧＦ－１及びＰｌＧＦ－２結合活性を低下させるため、プロセスの特定の工程が、アフリベルセプトのＹ９２Ｌクリッピング種のレベル及びＮ６８占有率の量に影響を与え得るか否かを判定するためにアフリベルセプトの精製プロセスを調査した。
アフリベルセプトを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現させ、フェドバッチによって生産した。続いて、細胞を、酸析出、それに続いて深層濾過によって収穫した。続いて、ウイルス不活性化工程の前にｐＨを中和した。続いて、収穫した細胞培養液からタンパク質Ａカラムでアフリベルセプトを精製し、次いで、ウイルス不活性化工程に供した。
この第２のウイルス不活性化工程の後に、１つのプロセスは、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、それに続いてカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用い、第２のプロセスは、ＡＥＸ、それに続いて疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いた（図４）。どちらのプロセスでも、これらのクロマトグラフィー工程の後に、ウイルス濾過プールのウイルス濾過及び限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）が続いた。続いてポリソルベートをＵＦ／ＤＦ回収プールに添加し、続いて容器内に濾過した。
フェドバッチプロセスから、特定の品質属性を満たす約６０％のアフリベルセプトを得た。第１の精製プロセス（ＡＥＸ、続いてＣＥＸ）は、第２のプロセス（ＡＥＸ、続いてＨＩＣ）よりも高い収率を有した。表２は、ＡＥＸ前の、第１のプロセス後の、及び第２のプロセス後の、アフリベルセプトの、Ｙ９２Ｌクリップ種の割合、Ｎ６８占有率によるアフリベルセプトの割合、合計シアル酸濃度（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）、及びｃＩＥＦピーク１（アフリベルセプトの低シアル酸含有バージョンであるｃＩＥＦピークの群を指す）の割合を示す。表２には、カラム２及びカラム３クロマトグラフィー工程にわたるアフリベルセプトの収率パーセントも含まれる（第１のプロセスにはＡＥＸ及びＣＥＸ、第２のプロセスにはＡＥＸ及びＨＩＣ）。
表２に示すように、ＡＥＸ工程はアフリベルセプトのＮ６８占有率を増加させ、ＨＩＣ工程は、アフリベルセプトのＹ９２Ｌクリッピング種を著しく減少させる。ＡＥＸはｃＩＥＦピーク１を減少させ、且つＮ６８占有率を増加させ得、一方でＨＩＣはＹ９２Ｌクリップを減少させ、且つＮ６８占有率を増加させ得る。
実施例３：アフリベルセプトのｒＣＥ－ＳＤＳ分析
アニオン交換クロマトグラフィー、続いてカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いるプロセスで製造されたアフリベルセプトの試料（ＤＳ）をＨＩＣ分析ＨＰＬＣに供し、ＨＩＣ溶出ピーク全体にわたり５つの画分を回収した。これらの画分を、還元キャピラリ電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ｒＣＥ－ＳＤＳ）によって分析し（図５）、これは、ＨＩＣ ＨＰＬＣは、クリッピングされたアフリベルセプト種及びＮ６８グリコシル化種を部分的に分解することを示す。
アニオン交換クロマトグラフィー、続いてカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いるプロセスで製造されたアフリベルセプトの試料（ＤＳ）をＨＩＣ分析ＨＰＬＣに供し、ＨＩＣ溶出ピーク全体にわたり５つの画分を回収した。これらの画分を、還元キャピラリ電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ｒＣＥ－ＳＤＳ）によって分析し（図５）、これは、ＨＩＣ ＨＰＬＣは、クリッピングされたアフリベルセプト種及びＮ６８グリコシル化種を部分的に分解することを示す。
第２のプロセスによって生産されたアフリベルセプトと比較した、第１のプロセスによって生産されたアフリベルセプトのｒＣＥ－ＳＤＳを図６に示し、これは、Ｙ９２Ｌクリッピング種の収率は、第２のプロセスを用いると第１のプロセスと比較してより低くなり、一方で、第２のプロセスは第１のプロセスと比較してより高いＮ６８占有率を有したことを示す。
実施例４：ＶＥＧＦ－Ａ、ＰｌＧＦ－１、及びＰｌＧＦ－２結合アフリベルセプトに対する属性の影響
Ｙ９２Ｌで切断された、プロテインＡ及びカラム並びにカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いるプロセスから精製したアフリベルセプトの割合、並びにＮ６８がグリコシル化されている、プロテインＡ及びカラム並びにカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いるプロセスから精製したアフリベルセプトの割合（Ｎ６８占有率）を、ｒＣＥ－ＳＤＳを用いて、図５に示す分析ＨＰＬＣ ＨＩＣ画分のそれぞれに関して判定した。各画分を更に、ＶＥＧＦ－Ａ並びにＰｌＧＦ－１及びＰｌＧＦ－２結合アッセイに供した。結果を表３に示す。
Ｙ９２Ｌで切断された、プロテインＡ及びカラム並びにカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いるプロセスから精製したアフリベルセプトの割合、並びにＮ６８がグリコシル化されている、プロテインＡ及びカラム並びにカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いるプロセスから精製したアフリベルセプトの割合（Ｎ６８占有率）を、ｒＣＥ－ＳＤＳを用いて、図５に示す分析ＨＰＬＣ ＨＩＣ画分のそれぞれに関して判定した。各画分を更に、ＶＥＧＦ－Ａ並びにＰｌＧＦ－１及びＰｌＧＦ－２結合アッセイに供した。結果を表３に示す。
表３に示すように、Ｙ９２Ｌにおけるアフリベルセプトのクリッピングは、ＶＥＧＦ－Ａ及びＰｌＧＦ結合に影響を及ぼす。Ｙ９２Ｌクリッピング種の割合がより高い画分は、ＶＥＧＦ－Ａ並びにＰｌＧＦ－１及びＰｌＧＦ－２に対するより低い結合を示した。一方で、表３に示すように、Ｎ６８占有率はＰｌＧＦ結合には影響を及ぼすが、ＶＥＧＦ－Ａ結合には影響を及ぼさない。Ｎ６８がグリコシル化されている種の割合がより高い画分は、ＰｌＧＦ－１及びＰｌＧＦ－２に対するより低い結合を示した。
実施例５：アフリベルセプトのグリカンプロファイル
プロテインＡ、続いてカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いるプロセスから精製されたアフリベルセプトのグリカンプロファイルを、ｒＣＥ－ＳＤＳ（Ｎ６８におけるＮ－グリコシル化％）及びＬＣ－ＭＳベースのペプチドマッピング（例えば、表４に列挙されるその他の属性）によって判定した。
プロテインＡ、続いてカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いるプロセスから精製されたアフリベルセプトのグリカンプロファイルを、ｒＣＥ－ＳＤＳ（Ｎ６８におけるＮ－グリコシル化％）及びＬＣ－ＭＳベースのペプチドマッピング（例えば、表４に列挙されるその他の属性）によって判定した。
プロテインＡ、続いてアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いるプロセスから精製されたアフリベルセプトのグリカンプロファイルを、ｒＣＥ－ＳＤＳ（Ｎ６８におけるＮ－グリコシル化及びＹ９２Ｌクリッピング種％）及びＬＣ－ＭＳベースのペプチドマッピング（例えば、表５に列挙されるその他の属性）によって判定した。
実施例６：Ｙ９２Ｌクリッピングに対する温度及びｐＨシフトの影響
アフリベルセプトを発現するＣＨＯ細胞のフェドバッチバイオリアクタ培養液を、培養６日目に温度及び／又はｐＨのシフトに供し、シフトされていない培養液と比較した。それぞれ異なるバイオリアクタ中の２つの対照培養液（図７、対照Ａ、対照Ｂ）を、収穫するまで３６℃、ｐＨ６．９で成長させた。それぞれ異なるバイオリアクタ中の２つの培養液（図７、温度シフトＡ、温度シフトＢ）を、３６℃、ｐＨ６．９で成長させ、培養６日目に両方の温度を３２．５℃に低下させ、収穫するまで３２．５℃、ｐＨ６．９に維持した。１つの培養液（図７、ｐＨシフト）を、３６℃、ｐＨ６．９で成長させ、培養６日目にｐＨを６．８に低下させ、収穫するまで３６℃、ｐＨ６．８に維持した。１つの培養液（図７、温度シフト及びｐＨシフト）を３６℃、ｐＨ６．９で成長させ、培養６日目に両方の温度及びｐＨを３２．５℃、ｐＨ６．８に低下させ、収穫するまで３２．５℃、ｐＨ６．８に維持した。
アフリベルセプトを発現するＣＨＯ細胞のフェドバッチバイオリアクタ培養液を、培養６日目に温度及び／又はｐＨのシフトに供し、シフトされていない培養液と比較した。それぞれ異なるバイオリアクタ中の２つの対照培養液（図７、対照Ａ、対照Ｂ）を、収穫するまで３６℃、ｐＨ６．９で成長させた。それぞれ異なるバイオリアクタ中の２つの培養液（図７、温度シフトＡ、温度シフトＢ）を、３６℃、ｐＨ６．９で成長させ、培養６日目に両方の温度を３２．５℃に低下させ、収穫するまで３２．５℃、ｐＨ６．９に維持した。１つの培養液（図７、ｐＨシフト）を、３６℃、ｐＨ６．９で成長させ、培養６日目にｐＨを６．８に低下させ、収穫するまで３６℃、ｐＨ６．８に維持した。１つの培養液（図７、温度シフト及びｐＨシフト）を３６℃、ｐＨ６．９で成長させ、培養６日目に両方の温度及びｐＨを３２．５℃、ｐＨ６．８に低下させ、収穫するまで３２．５℃、ｐＨ６．８に維持した。
アフリベルセプトを、プロテインＡを用いて各培養液の清浄化培養液ブロスから精製し、１０、１１、及び１２日目にｒＣＥ－ＳＤＳによってＹ９２Ｌクリッピング種の割合を判定した（図７）。全ての培養液で、Ｙ９２Ｌクリッピング種の割合は培養時間と共に増加した。６日目における値を低下させるための培養液温度及び／又はｐＨのシフトは、Ｙ９２Ｌクリッピング種の割合を対照（対照Ａ、対照Ｂ）と比較して低下させた。温度シフトは、Ｙ９２Ｌクリッピング種の割合を低下させる上でｐＨシフトよりも効果的であり、Ｙ９２Ｌクリッピング種の割合を更に低下させるためのｐＨシフト及び温度シフトの組み合わせで効果は増加しなかった。
本発明が様々な実施形態の観点から記載されたが、当業者であれば変形及び修正を想到するであろうことは理解されよう。したがって、添付の特許請求の範囲は、特許請求される本発明の範囲内にあるそのような均等な変形の全てを包含することを意図する。加えて、本明細書で使用される項目見出しは、構成を目的としているに過ぎず、記載される主題を限定するものと解釈すべきではない。
本出願に引用された全ての参考文献は、あらゆる目的のために参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
Claims (44)
- 配列番号３を含むアフリベルセプトのＹ９２Ｌクリッピング種。
- アフリベルセプト種の混合物を含む組成物であって、前記組成物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は、ｒＣＥ－ＳＤＳによって判定して５．０％未満である、組成物。
- 前記組成物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量が０．８％未満である、請求項２に記載の組成物。
- 前記組成物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量が約０．４％である、請求項３に記載の組成物。
- アフリベルセプト種の混合物を含む組成物であって、前記アフリベルセプト種の少なくとも３０％が、ｒＣＥ－ＳＤＳによって判定して、Ｎ６８位において占有されている、組成物。
- 前記アフリベルセプト種の少なくとも５０％がＮ６８位において占有されている、請求項５に記載の組成物。
- 前記アフリベルセプト種の５０～６０％がＮ６８位において占有されている、請求項６に記載の組成物。
- 前記アフリベルセプト種の約３９％、５３％、５４％、又は５５％がＮ６８位において占有されている、請求項５に記載の組成物。
- 前記混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量が１％～３％である、請求項８に記載の組成物。
- 前記混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量が０．８％未満である、請求項８に記載の組成物。
- 前記混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量が約０．４％である、請求項８に記載の組成物。
- 前記アフリベルセプト種の５４～５５％がＮ６８位で占有されており、前記混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は約１．１％である、請求項９に記載の組成物。
- 前記アフリベルセプト種の５４～５５％がＮ６８位で占有されており、前記混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は約０．４％である、請求項１１に記載の組成物。
- アフリベルセプト種の混合物を含む組成物であって、アフリベルセプト種の合計シアル酸含量が、ＬＣ－ＭＳベースのペプチドマッピング法により判定して６．０～１０．０ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質である、組成物。
- 前記合計シアル酸含量が約６．８、８．５、又は９．５（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）である、請求項１４に記載の組成物。
- 前記合計シアル酸含量は約９．５ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質であり、前記アフリベルセプト種の５４～５５％がＮ６８位で占有され、前記混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は約１．１％である、請求項１５に記載の組成物。
- 前記合計シアル酸含量は約９．５ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質であり、前記アフリベルセプト種の５４～５５％がＮ６８位で占有され、前記混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量は約０．４％である、請求項１５に記載の組成物。
- アフリベルセプト種の混合物を含む組成物であって、前記アフリベルセプト種はＦｃドメイン中に１．０～１２％のアフコシル化を含む、組成物。
- 前記アフリベルセプト種は前記Ｆｃドメイン中に１０％未満のアフコシル化を含む、請求項１８に記載の組成物。
- 前記アフリベルセプト種は前記Ｆｃドメイン中に約６％のアフコシル化を含む、請求項１９に記載の組成物。
- 前記アフリベルセプト種は前記Ｆｃドメイン中に５％未満のアフコシル化を含む、請求項１９に記載の組成物。
- 前記アフリベルセプト種は前記Ｆｃドメイン中に約４％のアフコシル化を含む、請求項１９に記載の組成物。
- 前記アフリベルセプト種は、
ａ）Ｎ６８に０．１～２．０（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）のシアル酸、
ｂ）Ｔ３３に１．０～２５．０％のＯ－グリコシル化、
ｃ）Ｎ３６に７０～９９％のＮ－グリコシル化、
ｄ）Ｎ６８に２０～７５％のＮ－グリコシル化、
ｅ）前記Ｆｃドメイン中に０．１～１．０％の高マンノース、
ｆ）前記Ｆｃドメイン中に約２６％のガラクトシル化、
ｇ）前記Ｆｃドメイン中に約１％のシアル化、又は
ｈ）これらの任意の組み合わせを含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記アフリベルセプト種は、
ａ）Ｎ６８に約０．７（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）のシアル酸、
ｂ）Ｔ３３に約４％のＯ－グリコシル化、
ｃ）Ｎ３６に約９５％のＮ－グリコシル化、
ｄ）Ｎ６８に約２６％のＮ－グリコシル化、
ｅ）前記Ｆｃドメイン中に約１％の高マンノース、
ｆ）前記Ｆｃドメイン中に約２６％のガラクトシル化、
ｇ）前記Ｆｃドメイン中に約１％のシアル化、又は
ｈ）これらの任意の組み合わせを含む、請求項２３に記載の組成物。 - 前記アフリベルセプト種は、
ａ）Ｎ６８に約０．８（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）のシアル酸、
ｂ）Ｔ３３に約８．３％のＯ－グリコシル化、
ｃ）Ｎ３６に約９０．９％のＮ－グリコシル化、
ｄ）Ｎ６８に約５１．９％のＮ－グリコシル化、
ｅ）前記Ｆｃドメイン中に約０．４％の高マンノース、
ｆ）前記Ｆｃドメイン中に約２４．４％のガラクトシル化、
ｇ）前記Ｆｃドメイン中に約３．８％のシアル化、又は
ｈ）これらの任意の組み合わせを含む、請求項２３に記載の組成物。 - 前記混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量が約０．４％である、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の組成物。
- ＰｌＧＦ及び／又はＶＥＧＦ－Ａに対するアフリベルセプト種の混合物を含む組成物の結合を増加させる方法であって、前記混合物中のＹ９２Ｌクリッピング種の量を低減することを含む、方法。
- ＰｌＧＦに対するアフリベルセプト種の混合物を含む組成物の結合を増加させる方法であって、アフリベルセプトのＮ６８占有率を低減することを含む、方法。
- 前記ＰｌＧＦはＰｌＧＦ－１である、請求項２７又は２８に記載の方法。
- 前記ＰｌＧＦはＰｌＧＦ－２である、請求項２７又は２８に記載の方法。
- アニオン交換クロマトグラフィー工程、続いて疎水性相互作用クロマトグラフィー工程でアフリベルセプトを精製することを含む、請求項２７に記載の方法。
- アフリベルセプト種の混合物を含む組成物を生産する方法であって、
アフリベルセプト種の混合物を含む細胞培養液を、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）工程、続いて疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程を含む精製プロセスに供することを含み、
ＡＥＸ工程、続いてカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）工程を含む精製プロセスと比較してより少ない量のＹ９２Ｌクリッピング種が生産される、方法。 - 前記精製プロセスはＣＥＸ工程を含まない、請求項３２に記載の方法。
- アフリベルセプト種の混合物を含む組成物を生産する方法であって、
ａ）アフリベルセプトを生産する細胞を収穫することと、
ｂ）収穫した細胞培養液をタンパク質Ａカラムに供することと、
ｃ）アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、それに続いてカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を実施することと、を含む、方法。 - ＡＥＸの後にＨＩＣが続く、請求項３４に記載の方法。
- 前記方法はＣＥＸを含まない、請求項３５に記載の方法。
- ＡＥＸの後にＣＥＸが続く、請求項３６に記載の方法。
- 前記細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は灌流又はフェドバッチによって成長する、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、酸析出、遠心分離、深層濾過、又はこれらの任意の組み合わせによって収穫される、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。
- １つ以上のウイルス不活性化及び／又はウイルス濾過工程を更に含む、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の方法。
- 限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程を更に含む、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の方法。
- ＡＥＸを実施する前にＣＥＸを実施することを含まない、請求項３４～４２のいずれか一項に記載の方法。
- サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施することを含まない、請求項３４～４３のいずれか一項に記載の方法。
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